JP2709979B2 - マイコバクテリウムケロナエの極性糖ペプチド脂質に基づく免疫刺激薬 - Google Patents
マイコバクテリウムケロナエの極性糖ペプチド脂質に基づく免疫刺激薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、活性成分としてマイコバクテリウム ケロ
ナエ(Mycobacterium chelonae)の極性糖ペプチド脂質
（GPLp）を有する新規な免疫刺激薬に関する。
ナエ(Mycobacterium chelonae)の極性糖ペプチド脂質
（GPLp）を有する新規な免疫刺激薬に関する。
発明の背景 本発明は、活性成分としてマイコバクテリウム ケロ
ナエ(Mycobacterium chelonae)の極性糖ペプチド脂質
（GPLp）を有する新規な免疫刺激薬に関する。
ナエ(Mycobacterium chelonae)の極性糖ペプチド脂質
（GPLp）を有する新規な免疫刺激薬に関する。
非定型マイコバクテリアの細胞壁に存在するGPLpは、
高い種特異性を有することが知られている。
高い種特異性を有することが知られている。
GPLは脂肪酸、ペプチドおよび糖を結合する化合物で
ある。
ある。
GPLについての広範囲な研究が、マイコバクテリアを
分類しかつ同定することを目指して行われてきた。
分類しかつ同定することを目指して行われてきた。
研究者らは、マイコバクテリウム アビウム(Mycobac
terium avium)のGPLpで処理したマウスの脾細胞におい
て、非特異的マイトジェン（mitogen）によって引き起
こされた増殖応答の減少を示した（ブラウンバックおよ
びバロウ（Brownback and Barrow）、インフェクション
アンド イムニティ、第56巻、1044〜1050頁、1988年
(Infectionand Immunity,56,1044−1050,1988）参
照）。同じ研究者らは、細胞がイン ビトロ(in vitro)
で上記のGPLpおよびマイトジェンで共同刺激された（co
−stimulated）ときに、これらの細胞の増殖応答の減少
を示した。
terium avium)のGPLpで処理したマウスの脾細胞におい
て、非特異的マイトジェン（mitogen）によって引き起
こされた増殖応答の減少を示した（ブラウンバックおよ
びバロウ（Brownback and Barrow）、インフェクション
アンド イムニティ、第56巻、1044〜1050頁、1988年
(Infectionand Immunity,56,1044−1050,1988）参
照）。同じ研究者らは、細胞がイン ビトロ(in vitro)
で上記のGPLpおよびマイトジェンで共同刺激された（co
−stimulated）ときに、これらの細胞の増殖応答の減少
を示した。
免疫適格細胞における生きたM.ケロナエの免疫刺激特
性が証明された（ビオツィ（Biozzi）ら、Rev.Franc.Et
udes Clin.Biol.,5,867−890（1960）；ピレットおよび
ゴレット（Pilet and Goret）、J.Reticuloendoth.So
c.,3,305−309（1966）；ならびにニューウェイ（Newa
y）ら、Comp.Immunol.Infect.Dis., 12,63−70（198
9）参照）。
性が証明された（ビオツィ（Biozzi）ら、Rev.Franc.Et
udes Clin.Biol.,5,867−890（1960）；ピレットおよび
ゴレット（Pilet and Goret）、J.Reticuloendoth.So
c.,3,305−309（1966）；ならびにニューウェイ（Newa
y）ら、Comp.Immunol.Infect.Dis., 12,63−70（198
9）参照）。
発明の要約 本発明に関連して、M.アビウムとは違ってM.ケロナエ
のGPLpが免疫刺激特性を有することを発見した。M.アビ
ウムはそのような特性を有しない。
のGPLpが免疫刺激特性を有することを発見した。M.アビ
ウムはそのような特性を有しない。
ほとんどの非定型マイコバクテリアのGPLは、共通し
て次のような構造を有することが知られている： Phe−aThr−Ala−Alaninol ここで、PheのＮ−末端アミノ基は長鎖脂肪酸でアシ
ル化されており，アラニノール基は糖に結合しており、
そしてアロ（allo）−スレオニン基（aThr）は糖に結合
しているか（非極性GPLの場合）、またはオリゴ糖に結
合している（GPLpの場合）。この糖ペプチド脂質構造は
同じであり、特にMAIS（マイコバクテリウム アビウム
細胞内 スクロフラセウム（scrofulaceum））複合体
におけるすべてのマイコバクテリアおよびマイコバクテ
リウム ケロナエの２つの亜種においてそうである（ブ
レナンおよびゴーレン（Brennan and Goren）、J.Biol.
Chem.,254,4205−4211（1979）；ブレナン（Brenna
n）、Rev.Infect.Dis.,３,905−913（1981）；ブレナン
（Brennan）、ザ マイコバクテリア：ア ソース ブ
ック、パートＡ(The Mycobacteria:A Source Book,Part
Ａ）、クビカ アンド ウェイン（Kubica and Way
ne）編、マーセル デッカー（Marcel Dekker）、ニュ
ーヨーク アンド バーゼル（New York and Basel）、
467−489（1984）；ツアン（Tsang）ら、Int,J.Syst.Ba
cteriol.,34,35−44;ならびにアセリニューアンド ア
セリニュー（Asselineau and Asselineau）、ザ マイ
コバクテリア：ア ソース ブック、クビカ アンド
ウェイン編、マーセル デッカー、ニューヨーク アン
ド バーゼル、345−360、（1984）参照）。
て次のような構造を有することが知られている： Phe−aThr−Ala−Alaninol ここで、PheのＮ−末端アミノ基は長鎖脂肪酸でアシ
ル化されており，アラニノール基は糖に結合しており、
そしてアロ（allo）−スレオニン基（aThr）は糖に結合
しているか（非極性GPLの場合）、またはオリゴ糖に結
合している（GPLpの場合）。この糖ペプチド脂質構造は
同じであり、特にMAIS（マイコバクテリウム アビウム
細胞内 スクロフラセウム（scrofulaceum））複合体
におけるすべてのマイコバクテリアおよびマイコバクテ
リウム ケロナエの２つの亜種においてそうである（ブ
レナンおよびゴーレン（Brennan and Goren）、J.Biol.
Chem.,254,4205−4211（1979）；ブレナン（Brenna
n）、Rev.Infect.Dis.,３,905−913（1981）；ブレナン
（Brennan）、ザ マイコバクテリア：ア ソース ブ
ック、パートＡ(The Mycobacteria:A Source Book,Part
Ａ）、クビカ アンド ウェイン（Kubica and Way
ne）編、マーセル デッカー（Marcel Dekker）、ニュ
ーヨーク アンド バーゼル（New York and Basel）、
467−489（1984）；ツアン（Tsang）ら、Int,J.Syst.Ba
cteriol.,34,35−44;ならびにアセリニューアンド ア
セリニュー（Asselineau and Asselineau）、ザ マイ
コバクテリア：ア ソース ブック、クビカ アンド
ウェイン編、マーセル デッカー、ニューヨーク アン
ド バーゼル、345−360、（1984）参照）。
M.ケロナエのGPLpは、上記引用文中にツァン（Tsan
g）らによって述べられた。非定型マイコバクテリアに
おけるGPLpの種の変化はオシド部分（osidic part）に
関係するので、同じ著者はM.ケロナエにおけるオシド部
分を研究し、オリゴ糖について次の構造を提示した:3,4
−ジ−０−メチルラムノース−（１７）−ラムノース
−（α−１２）−６−デソキシタロース。
g）らによって述べられた。非定型マイコバクテリアに
おけるGPLpの種の変化はオシド部分（osidic part）に
関係するので、同じ著者はM.ケロナエにおけるオシド部
分を研究し、オリゴ糖について次の構造を提示した:3,4
−ジ−０−メチルラムノース−（１７）−ラムノース
−（α−１２）−６−デソキシタロース。
GPLpは、薄層クロマトグラフィー（上記引用文中ツァ
ンら）およびELISA法（ヤナギハラら、1985 J.Clin.Mic
robiol.,21,569−574）によって、M.フォーツイタイム
（M.fortuitum）−M.ケロナエ複合体においてM.ケロナ
エを同定および区別する際に用いられた。
ンら）およびELISA法（ヤナギハラら、1985 J.Clin.Mic
robiol.,21,569−574）によって、M.フォーツイタイム
（M.fortuitum）−M.ケロナエ複合体においてM.ケロナ
エを同定および区別する際に用いられた。
本質的に、M.ケロナエのGPLpは、式１に一致する： ここで、Pheはフェニルアラニンを表し、 aTrはアロ（allo）−スレオニンを表し、 Alaはアラニンを表し、 糖は3,4−ジ−０−メチルラムノースであり、 オリゴ糖は次の構造を有する： 3,4−ジ−０−メチルラムノース−ラムノース−６−
デソキシタロース、および Ｒ−CO−は脂肪酸のアシル基であり、 ここで、3,4−ジ−０−メチルラムノース基は、aThr
およびアラニノールのそれぞれにグリコシド結合によっ
て結合され、そしてアラニンのＣ末端COOH基はアミド結
合によってアラニノールに結合される。
デソキシタロース、および Ｒ−CO−は脂肪酸のアシル基であり、 ここで、3,4−ジ−０−メチルラムノース基は、aThr
およびアラニノールのそれぞれにグリコシド結合によっ
て結合され、そしてアラニンのＣ末端COOH基はアミド結
合によってアラニノールに結合される。
オリゴ糖についての最も正確な構造は、上記したよう
にツァンらによって与えられたものであるが、それにお
いてラムノースとジメチルラムノースの間の結合の位置
は知られていない。
にツァンらによって与えられたものであるが、それにお
いてラムノースとジメチルラムノースの間の結合の位置
は知られていない。
天然のGPLpにおいては、オリゴ糖部分の糖はアセチル
化されている。
化されている。
M.ケロナエのGPLpにおいては、他のマイコバクテリア
のGPLにおけるように、脂肪酸の性質は培地、温度およ
び培養期間に依存する（例えばラトレッジ（Ratledg
e）、1982、「リピッド：セル コンポジション、ファ
ティ アシッド バイオシンセシス（Lipids: Cell com
position,Fatty Acid Biosyntheses）」、「ザ バイオ
ロジー オブ ザ マイコバクテリア（The Biology of
the Mycobacteria）」中、第１巻、ラトレッジ アン
ド スタンフォード（Ratledge and Stanford）編、ア
カデミック プレス（Academic Press）、ロンドン（Lo
ndon）（1982）、53−93;および上記に引用した参考文
献を参照）。
のGPLにおけるように、脂肪酸の性質は培地、温度およ
び培養期間に依存する（例えばラトレッジ（Ratledg
e）、1982、「リピッド：セル コンポジション、ファ
ティ アシッド バイオシンセシス（Lipids: Cell com
position,Fatty Acid Biosyntheses）」、「ザ バイオ
ロジー オブ ザ マイコバクテリア（The Biology of
the Mycobacteria）」中、第１巻、ラトレッジ アン
ド スタンフォード（Ratledge and Stanford）編、ア
カデミック プレス（Academic Press）、ロンドン（Lo
ndon）（1982）、53−93;および上記に引用した参考文
献を参照）。
天然GPLpは実際には式１の成分の混合物であり、ここ
で脂肪酸のアシル基Ｒ−CO−は可変性である。これらの
脂肪酸は少なくとも16個のＣ原子、かつ一般には36個よ
り少ないＣ原子を有する。
で脂肪酸のアシル基Ｒ−CO−は可変性である。これらの
脂肪酸は少なくとも16個のＣ原子、かつ一般には36個よ
り少ないＣ原子を有する。
したがって、本発明の原則特許請求をした内容は、活
性成分として少なくとも１の、M.ケロナエのGPLpまたは
その誘導体が免疫刺激剤として活性なM.ケロナエのGPLp
の誘導体を含む免疫刺激薬を含む。
性成分として少なくとも１の、M.ケロナエのGPLpまたは
その誘導体が免疫刺激剤として活性なM.ケロナエのGPLp
の誘導体を含む免疫刺激薬を含む。
本発明の薬に存在するGPLpは、少なくとも部分的に精
製された、公知の方法にしたがって得られたM.ケロナエ
の細胞壁からのGPLpの抽出画分を含むことができる。但
し、本発明を、M.ケロナエからのGPLpの唯一の供給源と
して、生きているもしくは殺したM.ケロナエ、またはM.
ケロナエの細胞壁全体または細胞壁の断片を含む薬に広
げるものではない。
製された、公知の方法にしたがって得られたM.ケロナエ
の細胞壁からのGPLpの抽出画分を含むことができる。但
し、本発明を、M.ケロナエからのGPLpの唯一の供給源と
して、生きているもしくは殺したM.ケロナエ、またはM.
ケロナエの細胞壁全体または細胞壁の断片を含む薬に広
げるものではない。
少なくとも部分的に精製されたGPLpの抽出画分（この
画分は本発明の薬において活性成分として使用される）
は、M.ケロナエの細胞壁からのGPLpの抽出物であること
ができ、この抽出物は例えば冷メタノール、特に＋４℃
のメタノールに可溶である。
画分は本発明の薬において活性成分として使用される）
は、M.ケロナエの細胞壁からのGPLpの抽出物であること
ができ、この抽出物は例えば冷メタノール、特に＋４℃
のメタノールに可溶である。
これらは特に、18〜50℃でクロロホルム対メタノール
の比2:1の混合物の助けによってM.ケロナエの細胞もし
くは細胞壁から抽出により得ることができるGPL画分で
あり、この画分は冷メタノールに可溶である。例えばメ
タノール対クロロホルムの体積比が少なくとも5:1であ
るように、冷メタノール（４℃）の添加後に可溶なまま
である。これらの画分はまた、先に示したように抽出と
それに続くシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによ
る精製によって得ることができる。
の比2:1の混合物の助けによってM.ケロナエの細胞もし
くは細胞壁から抽出により得ることができるGPL画分で
あり、この画分は冷メタノールに可溶である。例えばメ
タノール対クロロホルムの体積比が少なくとも5:1であ
るように、冷メタノール（４℃）の添加後に可溶なまま
である。これらの画分はまた、先に示したように抽出と
それに続くシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによ
る精製によって得ることができる。
本発明の目的は特に、活性成分として少なくとも１の
式１の化合物またはその活性誘導体を含む薬である。
式１の化合物またはその活性誘導体を含む薬である。
本発明の薬に存在するGPLpは、単に天然にアセチル化
されたGPLpである必要はなく、GPLpの活性誘導体、特に
対応する脱アセチル化（de−acetylated）誘導体である
ことができる。
されたGPLpである必要はなく、GPLpの活性誘導体、特に
対応する脱アセチル化（de−acetylated）誘導体である
ことができる。
本発明の薬の活性成分を構成するGPLpまたはGPLpの誘
導体は、M.ケロナエの培養物から調製できる。
導体は、M.ケロナエの培養物から調製できる。
M.ケロナエの培養物は以下のような公的なコレクショ
ンから得られる： −−NCTC（ナショナル コレクション オブ タイプ
カルチャーズ（Nat.Collection of Type Cultures））
（英国）、寄託番号（Deposit No.）946（M.ケロナエ
サブスピーシーズ．ケロナエ(M.chelonae subsp.chelon
ae））； −−ATCC（アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン（Amer.Type Culture Collection））（米国）、寄
託番号19977（M.ケロナエ サブスピーシーズ アブセ
ッシュス(M.chelonae subsp.abscessus)）； −−CIPT（コレクション インスティテュート パスツ
ール テューバーキュロース（Collection Institut Pa
steur Tuberculose））、（パリ、フランス）、寄託番
号140420019（M.ケロナエ サブスピーシーズ ケロナ
エ(M.chelonae subsp.chelonae））； −−CIPT（コレクション インスティテュート パスツ
ール テューバーキュロース（Collection Institut
Pasteur Tuberculose））、（パリ、フランス）、寄託
番号140420020（M.ケロナエ サブスピシーズ アブセ
ッシュス(M.chelonae subsp.abscessus）） M.ケロナエは、ローエンシュタイン−イェンセン培地
（Lowenstein−Jensen medium）（パリのインスティテ
ュート パスツール）に保持することができ、ルーボト
ル（Roux bottle）においたサウトン培地（Sauton medi
um）に培養することができ、次いで、1.5％のバクト−
アガー（Bacto−ager）（ディフコ（Difco））を添加す
ることにより凝固させることができる。M.ケロナエはま
た、発酵装置で、またはフィルム培養の助けによって、
または任意の他の類似の方法でも培養することができ
る。
ンから得られる： −−NCTC（ナショナル コレクション オブ タイプ
カルチャーズ（Nat.Collection of Type Cultures））
（英国）、寄託番号（Deposit No.）946（M.ケロナエ
サブスピーシーズ．ケロナエ(M.chelonae subsp.chelon
ae））； −−ATCC（アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン（Amer.Type Culture Collection））（米国）、寄
託番号19977（M.ケロナエ サブスピーシーズ アブセ
ッシュス(M.chelonae subsp.abscessus)）； −−CIPT（コレクション インスティテュート パスツ
ール テューバーキュロース（Collection Institut Pa
steur Tuberculose））、（パリ、フランス）、寄託番
号140420019（M.ケロナエ サブスピーシーズ ケロナ
エ(M.chelonae subsp.chelonae））； −−CIPT（コレクション インスティテュート パスツ
ール テューバーキュロース（Collection Institut
Pasteur Tuberculose））、（パリ、フランス）、寄託
番号140420020（M.ケロナエ サブスピシーズ アブセ
ッシュス(M.chelonae subsp.abscessus）） M.ケロナエは、ローエンシュタイン−イェンセン培地
（Lowenstein−Jensen medium）（パリのインスティテ
ュート パスツール）に保持することができ、ルーボト
ル（Roux bottle）においたサウトン培地（Sauton medi
um）に培養することができ、次いで、1.5％のバクト−
アガー（Bacto−ager）（ディフコ（Difco））を添加す
ることにより凝固させることができる。M.ケロナエはま
た、発酵装置で、またはフィルム培養の助けによって、
または任意の他の類似の方法でも培養することができ
る。
M.ケロナエからGPLpを抽出する方法は、上記したよう
にそれ自体公知である。それは、生きているもしくは殺
したバクテリアまたはバクテリアの壁から脂質複合体の
全体を抽出することから成る。抽出は、ドクテリアまた
は凍結乾燥したバクテリアに接触される、例えばクロロ
ホルムとメタノールの混合物の助けによって、成し遂げ
ることができる。
にそれ自体公知である。それは、生きているもしくは殺
したバクテリアまたはバクテリアの壁から脂質複合体の
全体を抽出することから成る。抽出は、ドクテリアまた
は凍結乾燥したバクテリアに接触される、例えばクロロ
ホルムとメタノールの混合物の助けによって、成し遂げ
ることができる。
次に少なくとも部分的に糖脂質、カロチノイドおよび
遊離の脂質を除去することができる、例えば、すべての
脂質複合体のクロロホルム溶液に、多量の冷メタノール
を添加することにより進めることができる。これによっ
て、いくらかの糖脂質、カロチノイドおよび遊離の脂質
の沈殿が引き起こされる。GPLpおよび非極性GPL、リン
脂質および残留している遊離の脂質が溶液中に残る。
遊離の脂質を除去することができる、例えば、すべての
脂質複合体のクロロホルム溶液に、多量の冷メタノール
を添加することにより進めることができる。これによっ
て、いくらかの糖脂質、カロチノイドおよび遊離の脂質
の沈殿が引き起こされる。GPLpおよび非極性GPL、リン
脂質および残留している遊離の脂質が溶液中に残る。
この段階で、公知のやり方で、希釈したまたは穏やか
なアルカリで処理すること（NaOHのメタノール溶液の添
加）によって脱アセチル化を進めることは有効である。
例えば0.2MのNaOHのメタノール溶液を、複合体がクロロ
ホルムとメタノールの混合物（2:1）の溶液中にあると
ころの前段階から得た脂質複合体に添加する。ここで、
添加するNaOH−メタノール溶液の体積は、脂質複合体の
溶液の体積に等しい。脱アセチル化は、マイコバクテリ
アのGPLに特異的であり、これは脱アセチル化をさらに
越えた分解（degradation）に抵抗する。一方、除去し
たい他の脂質（リン脂質、カロチノイドおよび他の望ま
しくない脂質）は分解される。このように脱アセチル化
は、カラムもしくは薄層クロマトグラフィーにより所望
のGPLの分離およびさらに精製を促進する。アルカリ処
理の後、混合物を酸、例えば濃酢酸で中和する。この段
階で有機相を、クロロホルム、メタノールおよび水（4:
2:1）の混合物または同様の混合物で洗浄することは有
利である。次に、洗浄した有機相を、カラムクロマトグ
ラフィーにより、または上記引用文中のツァンらの方法
により、またはJ.Chromato.,377,345−349（1986）のデ
ィミトリヤビッチ（Dimitrijevich）の方法により、精
製に供することができる。
なアルカリで処理すること（NaOHのメタノール溶液の添
加）によって脱アセチル化を進めることは有効である。
例えば0.2MのNaOHのメタノール溶液を、複合体がクロロ
ホルムとメタノールの混合物（2:1）の溶液中にあると
ころの前段階から得た脂質複合体に添加する。ここで、
添加するNaOH−メタノール溶液の体積は、脂質複合体の
溶液の体積に等しい。脱アセチル化は、マイコバクテリ
アのGPLに特異的であり、これは脱アセチル化をさらに
越えた分解（degradation）に抵抗する。一方、除去し
たい他の脂質（リン脂質、カロチノイドおよび他の望ま
しくない脂質）は分解される。このように脱アセチル化
は、カラムもしくは薄層クロマトグラフィーにより所望
のGPLの分離およびさらに精製を促進する。アルカリ処
理の後、混合物を酸、例えば濃酢酸で中和する。この段
階で有機相を、クロロホルム、メタノールおよび水（4:
2:1）の混合物または同様の混合物で洗浄することは有
利である。次に、洗浄した有機相を、カラムクロマトグ
ラフィーにより、または上記引用文中のツァンらの方法
により、またはJ.Chromato.,377,345−349（1986）のデ
ィミトリヤビッチ（Dimitrijevich）の方法により、精
製に供することができる。
この方法でM.ケロナエのGPLpを含む、部分的に精製さ
れた画分を得ることができる。カラムクロマトグラフィ
ーにより、次のものを分離できる：アルカリ処理による
分解を逃れた望ましくない脂質、GPLpおよび、場合によ
り、トレハロースを含む糖脂質（これらは冷メタノール
での沈殿を行わなかった場合に存在する）。
れた画分を得ることができる。カラムクロマトグラフィ
ーにより、次のものを分離できる：アルカリ処理による
分解を逃れた望ましくない脂質、GPLpおよび、場合によ
り、トレハロースを含む糖脂質（これらは冷メタノール
での沈殿を行わなかった場合に存在する）。
M.ケロナエの非極性糖ペプチド脂質は、溶媒の最前部
近くの画分であり、TLCのオルシノール試験で桃色がか
った黄色に着色される。それらは種特異的ではない（例
えば上記引用文中のツァンら参照）。
近くの画分であり、TLCのオルシノール試験で桃色がか
った黄色に着色される。それらは種特異的ではない（例
えば上記引用文中のツァンら参照）。
種特異的であるM.ケロナエのGPLpは、溶媒の最前部か
ら遠い画分であり、薄層クロマトグラフィー（TIC）で
のオルシノール試験において、M.クロナエ サブスピー
シーズ ケロナエ(M.chelonae subsp.chelonae）の場合
は金色がかった栗色に着色され、M.クロナエ サブスピ
ーシーズ アブセッシュス(M.chelonae subsp.abscessu
s)の場合は暗橙色に着色される（例えば上記引用文中の
ツァンら参照）。
ら遠い画分であり、薄層クロマトグラフィー（TIC）で
のオルシノール試験において、M.クロナエ サブスピー
シーズ ケロナエ(M.chelonae subsp.chelonae）の場合
は金色がかった栗色に着色され、M.クロナエ サブスピ
ーシーズ アブセッシュス(M.chelonae subsp.abscessu
s)の場合は暗橙色に着色される（例えば上記引用文中の
ツァンら参照）。
本発明の組成物の活性成分はまた、少なくとも１の、
ペプチドおよび糖合成の古典的手法にしたがう合成もし
くは半合成によって得られた式１の化合物であり得る。
ペプチドおよび糖合成の古典的手法にしたがう合成もし
くは半合成によって得られた式１の化合物であり得る。
本発明の組成物は慣用のカレヌスの方法（galenic me
thod）にしたがって調製される。
thod）にしたがって調製される。
GPLpもしくはこれを含む抽出画分は、適当な液体媒質
中で、波長８ミクロンおよびGPLp濃度１〜20mg/mlで20
〜50分間、超音波の作用にさらして生成物を均質化する
ことができる。
中で、波長８ミクロンおよびGPLp濃度１〜20mg/mlで20
〜50分間、超音波の作用にさらして生成物を均質化する
ことができる。
本発明の組成物における活性成分（GPLp）は一般に、
組成物の総重量に対して0.07〜８重量％の量で存在す
る。
組成物の総重量に対して0.07〜８重量％の量で存在す
る。
本発明の組成物は、特に、適当な液体薬剤媒質中の懸
濁物として提供され得る。この懸濁物は、薬剤に使用し
得る界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、例えばソ
ルビタンポリオキシシエチレンモノオレエート（例えば
商標Tween80）を含むことができる。液体組成物は、任
意的に凍結乾燥剤を添加して凍結乾燥に供することがで
き、凍結乾燥した形で貯蔵することができ、そして使用
時に再構成をすることができる。使用の準備ができた時
の液体組成物は一般に、0.2〜80mg/mlのGPLpを含む（使
用する投与の方法に依存する）。
濁物として提供され得る。この懸濁物は、薬剤に使用し
得る界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、例えばソ
ルビタンポリオキシシエチレンモノオレエート（例えば
商標Tween80）を含むことができる。液体組成物は、任
意的に凍結乾燥剤を添加して凍結乾燥に供することがで
き、凍結乾燥した形で貯蔵することができ、そして使用
時に再構成をすることができる。使用の準備ができた時
の液体組成物は一般に、0.2〜80mg/mlのGPLpを含む（使
用する投与の方法に依存する）。
懸濁物はまた、0.2体積％までの界面活性剤を含むこ
とができる。本発明の組成物は一般に、有効量の通例の
防腐剤、例えばメルチオレート（merthiolate）を含む
ことができる。
とができる。本発明の組成物は一般に、有効量の通例の
防腐剤、例えばメルチオレート（merthiolate）を含む
ことができる。
本発明の組成物は、特に、飲用に適したもしくは注射
可能な懸濁物の形状のまたは局所用の施与のための組成
物、または鼻もしくは結膜による投与のための組成物で
あり得る。
可能な懸濁物の形状のまたは局所用の施与のための組成
物、または鼻もしくは結膜による投与のための組成物で
あり得る。
本発明の組成物はまた、ゲルカプセル、錠剤、粉末、
坐薬、歯肉のペースト、またはクリームの形状でも提供
され得る。
坐薬、歯肉のペースト、またはクリームの形状でも提供
され得る。
以下の実施例の欄においてわかるように、M.ケロナエ
のGPLpは、有機体の非特異的防御の刺激剤である。それ
はまたは、特異的な免疫反応を非特異的に刺激すること
ができる（補足の効果）。
のGPLpは、有機体の非特異的防御の刺激剤である。それ
はまたは、特異的な免疫反応を非特異的に刺激すること
ができる（補足の効果）。
本発明の組成物はこのように、人間または動物におい
て免疫刺激薬として使用可能である。それはまた、特
に、ワクチンにより与えられた免疫を促進するためのア
ジュバントとして、および抗生物質療法の強化剤として
も使用可能である。
て免疫刺激薬として使用可能である。それはまた、特
に、ワクチンにより与えられた免疫を促進するためのア
ジュバントとして、および抗生物質療法の強化剤として
も使用可能である。
本発明の組成物はまた、動物および人間における成長
因子および／または同化因子として使用できる。
因子および／または同化因子として使用できる。
それは特に、非経口の方法（例えば腹膜組織内の、皮
下の、筋肉内の、静脈の、経皮の方法）により、口によ
り、鼻により、結膜的に、直腸により、または舌により
（perlingually）投与され得る。
下の、筋肉内の、静脈の、経皮の方法）により、口によ
り、鼻により、結膜的に、直腸により、または舌により
（perlingually）投与され得る。
それはまた、特に口内の空洞の疾患（歯槽膿漏、歯肉
炎、歯根膜炎（peridontitis）等）の非特異的免疫療法
において、口内に入れると分解する歯肉のペーストまた
は錠剤の助けによって、局所的に使用されることもでき
る。
炎、歯根膜炎（peridontitis）等）の非特異的免疫療法
において、口内に入れると分解する歯肉のペーストまた
は錠剤の助けによって、局所的に使用されることもでき
る。
通常の薬量学では、１回以上の投与で例えば１日当た
り0.1〜12、好ましくは0.5〜10mg/kg体重でありうる。
例えば最も頻繁の投与では、非経口投与について0.5〜3
mg/kg、口によれば４〜10mg/kg、および鼻への投与では
２〜4mg/kgである。本発明の薬は、特に、二次的な免疫
疾患の場合に免疫刺激処置として；局所または全身の伝
染病において補助薬処置として；特に抗ウィルス処置に
関連してエイズの補助薬処置として；寄生虫病または癌
の状態の場合の補助薬処置として；および抗癌療法の免
疫抑制効果（特に白血球減少症により証明されたもの）
のための矯正的処置として、効果的な投与量で投与され
る。
り0.1〜12、好ましくは0.5〜10mg/kg体重でありうる。
例えば最も頻繁の投与では、非経口投与について0.5〜3
mg/kg、口によれば４〜10mg/kg、および鼻への投与では
２〜4mg/kgである。本発明の薬は、特に、二次的な免疫
疾患の場合に免疫刺激処置として；局所または全身の伝
染病において補助薬処置として；特に抗ウィルス処置に
関連してエイズの補助薬処置として；寄生虫病または癌
の状態の場合の補助薬処置として；および抗癌療法の免
疫抑制効果（特に白血球減少症により証明されたもの）
のための矯正的処置として、効果的な投与量で投与され
る。
本発明の薬はまた、上記した種々の場合において、予
防法として、特に耳鼻咽喉科学領域での再発感染防止の
ために、また慢性病状態における感染の危険防止のため
に、ならびにワクチンにおけるアジュバントとしても投
与され得る。
防法として、特に耳鼻咽喉科学領域での再発感染防止の
ために、また慢性病状態における感染の危険防止のため
に、ならびにワクチンにおけるアジュバントとしても投
与され得る。
それはまた、動物および人間の体重の増加または減少
を促進するために使用することもできる。
を促進するために使用することもできる。
M.ケロナエのGPLpは、特に、成長および／または感染
への抵抗を促進することを意図して、動物に食物添加物
として使用することもできる。
への抵抗を促進することを意図して、動物に食物添加物
として使用することもできる。
本発明の主に特許請求された内容のさらなる要素は、
非特異的免疫刺激薬または同化作用薬の調製における活
性成分としての、またはワクチン製造の際のもしくは栄
養組成物製造の際のアジュバントとしての、前記したよ
うなM.ケロナエのGPLpの使用である。
非特異的免疫刺激薬または同化作用薬の調製における活
性成分としての、またはワクチン製造の際のもしくは栄
養組成物製造の際のアジュバントとしての、前記したよ
うなM.ケロナエのGPLpの使用である。
本発明は特に、抗癌療法の免疫抑制効果（例えば化学
的に誘発された白血球減少症）を正すことを意図して、
非特異的免疫刺激薬の調製における活性成分として、M.
ケロナエのGPLpを使用することに関する。
的に誘発された白血球減少症）を正すことを意図して、
非特異的免疫刺激薬の調製における活性成分として、M.
ケロナエのGPLpを使用することに関する。
以下の実施例により本発明を説明するが、いかなるや
り方でも本発明を限定するものではない： 実施例1: M.ケロナエのGPLpを含む画分の精製： バクテリアの培養 マイコバクテリウム ケロナエ サブスピーシーズ
ケロナエ(Mycobacterium chelonae subsp.chelonae)
を、上記した培地で35℃で、安定した状態になるまで培
養した。次に、5600×ｇでの遠心分離によりこれを集
め、洗浄した。次いで細胞を乾燥しもしくは凍結乾燥
し、その後できるだけ短い時間内に抽出を行った。
り方でも本発明を限定するものではない： 実施例1: M.ケロナエのGPLpを含む画分の精製： バクテリアの培養 マイコバクテリウム ケロナエ サブスピーシーズ
ケロナエ(Mycobacterium chelonae subsp.chelonae)
を、上記した培地で35℃で、安定した状態になるまで培
養した。次に、5600×ｇでの遠心分離によりこれを集
め、洗浄した。次いで細胞を乾燥しもしくは凍結乾燥
し、その後できるだけ短い時間内に抽出を行った。
すべての脂質化合物の抽出： M.ケロナエの細胞壁からの全脂質の抽出は、ブレナン
およびゴーレン（Brennan and Goren）、J.Biol.Chem.,
vol.254,No.10,4205−4211（1979）により述べられたの
と同様の手法で行った。
およびゴーレン（Brennan and Goren）、J.Biol.Chem.,
vol.254,No.10,4205−4211（1979）により述べられたの
と同様の手法で行った。
抽出には、凍結乾燥したマイコバクテリア グラム当
たり混合物40mlの量で、クロロホルム：メタノール 2:
1混合物を使用し、熱水浴中に浸したフラスコ中で50℃
で18時間行った。抽出物は、ワットマイ紙No.3で過す
ることにより回収した。残渣を、同様の方法だがたった
４時間続けただけの方法により、二次的な抽出に供し
た。抽出物を一緒にして、溶媒を蒸発させた。乾燥抽出
物を次の段階まで＋４℃で貯蔵した。
たり混合物40mlの量で、クロロホルム：メタノール 2:
1混合物を使用し、熱水浴中に浸したフラスコ中で50℃
で18時間行った。抽出物は、ワットマイ紙No.3で過す
ることにより回収した。残渣を、同様の方法だがたった
４時間続けただけの方法により、二次的な抽出に供し
た。抽出物を一緒にして、溶媒を蒸発させた。乾燥抽出
物を次の段階まで＋４℃で貯蔵した。
糖脂質、カロチノイドおよび遊離の脂質の除去 全脂質複合体を十分な量のクロロホルムで溶解し、実
質量のメタノールを＋４℃で添加した。沈殿が観察され
た。メタノールの量は、さらにメタノールを添加しても
さらに沈殿を引き起こさないほど十分でなければならな
い。この沈殿は糖脂質、カロチノドおよび遊離の脂質を
含む。GPLp、非極性GPL、リン脂質および他の遊離の脂
質が溶液中に残存した。
質量のメタノールを＋４℃で添加した。沈殿が観察され
た。メタノールの量は、さらにメタノールを添加しても
さらに沈殿を引き起こさないほど十分でなければならな
い。この沈殿は糖脂質、カロチノドおよび遊離の脂質を
含む。GPLp、非極性GPL、リン脂質および他の遊離の脂
質が溶液中に残存した。
遠心分離により沈殿を除去した後、上澄の溶媒を蒸発
させた。
させた。
脱−アセチル化および洗浄： 先の段階で生成物を蒸発して得られた残渣を、穏やか
なアルカリ処理（脱−アセチル化）に供し、得られた混
合物を、クロロホルム、メタノールおよび水の混合物で
洗浄した。
なアルカリ処理（脱−アセチル化）に供し、得られた混
合物を、クロロホルム、メタノールおよび水の混合物で
洗浄した。
この目的のために、前の段階で得られた残渣を、クロ
ロホルム：メタノール 2:1の混合物に再び溶解させ、
等量の0.2MのNaOHメタノール溶液を添加した。37℃で30
分後、この混合物を12.5μl/mlの濃酢酸で中和し、次い
で洗浄した。洗浄混合物は、クロロホルム：メタノー
ル：水 4:2:1であった。攪拌および生成した気体の放
出後、この混合物を１時間静置した。水性相を捨て、有
機相を抜き、蒸発に供した。残渣を４℃で貯蔵した。
ロホルム：メタノール 2:1の混合物に再び溶解させ、
等量の0.2MのNaOHメタノール溶液を添加した。37℃で30
分後、この混合物を12.5μl/mlの濃酢酸で中和し、次い
で洗浄した。洗浄混合物は、クロロホルム：メタノー
ル：水 4:2:1であった。攪拌および生成した気体の放
出後、この混合物を１時間静置した。水性相を捨て、有
機相を抜き、蒸発に供した。残渣を４℃で貯蔵した。
シリカゲルのカラムクロマトグラフィーによるGPLの分
離と精製 脂質複合体ｇ当たりシリカゲル60（粒子径0.063−0.2
00mm）100gを含むガラスカラムを精製した。方法は、上
記引用文中のツァンらの方法と同様であり、ここで、純
クロロホルムから始めてクロロホルム中のメタノールの
割合を増やしたものを使用することによって、成分を分
離した。上記引用文中のディミトリヤビッチらの方法を
使用することも可能であり、そこでは、クロロホルム中
のメタノールの割合を固定して（10％）、クロマトグラ
フィーを行う。流速は約1.5ml/分に固定した。画分を分
析的TLCにて分析した。同じ移動性の画分を合わせ、重
量を測定し、そして好ましくは４℃で貯蔵した。
離と精製 脂質複合体ｇ当たりシリカゲル60（粒子径0.063−0.2
00mm）100gを含むガラスカラムを精製した。方法は、上
記引用文中のツァンらの方法と同様であり、ここで、純
クロロホルムから始めてクロロホルム中のメタノールの
割合を増やしたものを使用することによって、成分を分
離した。上記引用文中のディミトリヤビッチらの方法を
使用することも可能であり、そこでは、クロロホルム中
のメタノールの割合を固定して（10％）、クロマトグラ
フィーを行う。流速は約1.5ml/分に固定した。画分を分
析的TLCにて分析した。同じ移動性の画分を合わせ、重
量を測定し、そして好ましくは４℃で貯蔵した。
薄層クロマトグラフィー（TLC）： 使用前に110℃で30分間加熱して活性化したTLCプレー
ト（20×20cmで厚さ1mmのガラスプレート）（メルク（M
erk））を使用した。
ト（20×20cmで厚さ1mmのガラスプレート）（メルク（M
erk））を使用した。
先の段階で得られた画分を、クロロホルム：メタノー
ル 2:1の混合物中に10mg/mlに調整した。次にこの調製
品を、プレートの低い方の端から１〜2cmの位置に、等
距離（最短で1cmの距離）の点に置いた。この点は、両
端を引き伸し、曲げたパスツールピペット用いて形成し
た。このプレートを次に、移動溶媒（60:12:1/クロロホ
ルム：メタノール：水）を含むトレーに置いた。この溶
媒がプレート上の端より１または2cm下に移動したと
き、移動を終えた。プレートを空気を通したフード中で
乾燥し、現像試薬（developing reagent）を噴霧した。
GPLpのための試薬は、２度蒸留した水での40％硫酸水溶
液中の0.1％の微粉状オルシノールである。加熱キャビ
ネット中で110〜130℃で３〜10分間加熱した後、M.ケロ
ナエの特異的GPLpが金色がかった栗色に着色された。な
お、非極性糖ペプチド脂質は桃色がかった黄色に着色さ
れた。クロマトグラフィーにより、単離した抽出物の純
度を監視することができる。
ル 2:1の混合物中に10mg/mlに調整した。次にこの調製
品を、プレートの低い方の端から１〜2cmの位置に、等
距離（最短で1cmの距離）の点に置いた。この点は、両
端を引き伸し、曲げたパスツールピペット用いて形成し
た。このプレートを次に、移動溶媒（60:12:1/クロロホ
ルム：メタノール：水）を含むトレーに置いた。この溶
媒がプレート上の端より１または2cm下に移動したと
き、移動を終えた。プレートを空気を通したフード中で
乾燥し、現像試薬（developing reagent）を噴霧した。
GPLpのための試薬は、２度蒸留した水での40％硫酸水溶
液中の0.1％の微粉状オルシノールである。加熱キャビ
ネット中で110〜130℃で３〜10分間加熱した後、M.ケロ
ナエの特異的GPLpが金色がかった栗色に着色された。な
お、非極性糖ペプチド脂質は桃色がかった黄色に着色さ
れた。クロマトグラフィーにより、単離した抽出物の純
度を監視することができる。
GPLpの同定および純度の監視のために、以下の分析的
方法を使用することができる： IN HClでの酸加水分解 IN HClの存在下でのM.ケロナエの特異的GPLpの酸加水
分解により、（ワットマンNo.1での）ペーパクロマトグ
ラフィーおよびガスフェーズクロマトグラフィーによっ
て同定することができる特定の糖（メチルラムノース、
ラムノースおよびデソキシタロース）を遊離させること
ができる。
方法を使用することができる： IN HClでの酸加水分解 IN HClの存在下でのM.ケロナエの特異的GPLpの酸加水
分解により、（ワットマンNo.1での）ペーパクロマトグ
ラフィーおよびガスフェーズクロマトグラフィーによっ
て同定することができる特定の糖（メチルラムノース、
ラムノースおよびデソキシタロース）を遊離させること
ができる。
6N HClでの酸加水分解 先の段階の残渣の6N HClでの加水分解により、マイコ
バクテリアのGPLの特定のアミノ酸を遊離させることが
できる。このアミノ酸はTCLにより同定することができ
る。M.ケロナエの場合、非定型のマイコバクテリアの場
合のように、これらのアミノ酸はフェニルアラニン、ア
ラニン、アラニノールおよびアロスレオニンである。
バクテリアのGPLの特定のアミノ酸を遊離させることが
できる。このアミノ酸はTCLにより同定することができ
る。M.ケロナエの場合、非定型のマイコバクテリアの場
合のように、これらのアミノ酸はフェニルアラニン、ア
ラニン、アラニノールおよびアロスレオニンである。
IRスペクトルによるGPLpの分析 M.ケロナエの脱アセチル化したGPLpの分析は、上記引
用文中のブレナンおよびゴーレン（1979）により、およ
び上記引用文中のブレナン（1984）により記載されたも
のと類似して、糖ペプチド脂質のペプチド結合の特性ピ
ークを示す。
用文中のブレナンおよびゴーレン（1979）により、およ
び上記引用文中のブレナン（1984）により記載されたも
のと類似して、糖ペプチド脂質のペプチド結合の特性ピ
ークを示す。
実施例２ 注射可能な懸濁物の製造 実施例１で得たGPLpをクロロホルムに再度溶解し、超
音波処理管中で、窒素雰囲気下で２度蒸発した。
音波処理管中で、窒素雰囲気下で２度蒸発した。
生理的血清（例えば無発熱源の（apyrogenic）8.5％N
aCl溶液）のような注射可能な溶液の製造のために適し
た液体に残渣を懸濁した。非経口投与に適合性の界面活
性剤、例えばTween80（商標）もまた、0.1−0.2体積％
の量で添加できる。この界面活性剤を添加する目的は、
材料の懸濁を促進するためである。
aCl溶液）のような注射可能な溶液の製造のために適し
た液体に残渣を懸濁した。非経口投与に適合性の界面活
性剤、例えばTween80（商標）もまた、0.1−0.2体積％
の量で添加できる。この界面活性剤を添加する目的は、
材料の懸濁を促進するためである。
このようにして得られた懸濁物を次に、生成物を均質
化する目的で、GPLp濃度１〜20mg/mlで、振幅８ミクロ
ンにて約20〜50分間超音波処理に供した。
化する目的で、GPLp濃度１〜20mg/mlで、振幅８ミクロ
ンにて約20〜50分間超音波処理に供した。
注射可能な懸濁物は、他の許容できる媒質、例えば標
準リン酸塩緩衝液または同様の媒質を用いて調製するこ
ともできる。
準リン酸塩緩衝液または同様の媒質を用いて調製するこ
ともできる。
GPLpの濃度は、投与に依存して、例えば0.2〜80mg/ml
に調製される。長期の貯蔵のためには、調製物は凍結乾
燥した後、認め得る活性の損失なしに生理的血清中に再
構成されることができる。
に調製される。長期の貯蔵のためには、調製物は凍結乾
燥した後、認め得る活性の損失なしに生理的血清中に再
構成されることができる。
実施例３ M.ケロナエのGPLpの薬理学的試験 実施例１で得られたGPLpを用いてこれらの試験を行っ
た。
た。
1.リンパ球芽球転換（lymphoblastic transformation）
のための刺激的効果 この効果は、細胞における直接的効果（M.ケロナエの
GPLpであらかじめ処理したマウスの脾細胞および胸腺細
胞のリンパ球芽球転換における増加によって）または間
接的効果（マイトジェンに対する増殖応答における増
加）によって評価される。これらの効果は、トリチウム
化したチミジンの組み込みを経て測定される。
のための刺激的効果 この効果は、細胞における直接的効果（M.ケロナエの
GPLpであらかじめ処理したマウスの脾細胞および胸腺細
胞のリンパ球芽球転換における増加によって）または間
接的効果（マイトジェンに対する増殖応答における増
加）によって評価される。これらの効果は、トリチウム
化したチミジンの組み込みを経て測定される。
この試験は、メスのBalb/cマウスに行った。
生成物を、動物５体の群に、経口により12mg/kgで、
または皮下に2.5mg/kgで、各３日間隔で４投与（経口）
または３日間隔で３投与（皮下）の方針で投与した。対
照群は溶媒のみで処理した。
または皮下に2.5mg/kgで、各３日間隔で４投与（経口）
または３日間隔で３投与（皮下）の方針で投与した。対
照群は溶媒のみで処理した。
結果： GPLpは、皮下の処理（Ｐ≦0.001）および経口処理
（Ｐ≦0.05）においてマウスの脾細胞のリンパ球芽球転
換を刺激した。
（Ｐ≦0.05）においてマウスの脾細胞のリンパ球芽球転
換を刺激した。
マイトジェンに対するマウス脾細胞の応答は、コンカ
ナバリンＡ（ConA;IBF−LKB）（Ｐ≦0.02）；植物性血
球凝集素（PHA;Difco）（Ｐ≦0.01）；およびリポ多糖
Ｂ（LPS、Difco）（Ｐ≦0.001）について、皮下刺激に
おいて増加した。
ナバリンＡ（ConA;IBF−LKB）（Ｐ≦0.02）；植物性血
球凝集素（PHA;Difco）（Ｐ≦0.01）；およびリポ多糖
Ｂ（LPS、Difco）（Ｐ≦0.001）について、皮下刺激に
おいて増加した。
そのような増加はまた、同じ３種のマイトジェンにつ
いて、経口刺激においても観察された（ConA、PHAおよ
びLPSについてＰ≦0.001）。
いて、経口刺激においても観察された（ConA、PHAおよ
びLPSについてＰ≦0.001）。
マイトジェンに対するマウスの胸腺細胞の応答もま
た、コンカナバリンＡおよびLPSについて、著しく増加
した（ConA,PHAおよびLPSについてＰ≦0.001）。
た、コンカナバリンＡおよびLPSについて、著しく増加
した（ConA,PHAおよびLPSについてＰ≦0.001）。
2.処理されたBalb/cマウスの腹膜マクロファージによる
モノカイン（monokine）の誘導能力： マクロファージが免疫効果を有する抗原またはマイト
ジェンと接触すると、モノカイン（インターロイキン−
１および腫瘍壊死因子、TNF）の分泌により応答する。
腹膜マクロファージによるモノカインの誘発の試験はこ
のように、これらの細胞における免疫刺激生成物の効果
を評価する方法である。
モノカイン（monokine）の誘導能力： マクロファージが免疫効果を有する抗原またはマイト
ジェンと接触すると、モノカイン（インターロイキン−
１および腫瘍壊死因子、TNF）の分泌により応答する。
腹膜マクロファージによるモノカインの誘発の試験はこ
のように、これらの細胞における免疫刺激生成物の効果
を評価する方法である。
結果： あらかじめGPLpで処理したマウスからの腹膜マクロフ
ァージのLPSでの活性化は、C3H/Hejマウス（LPSに敏感
でないマウス）の胸腺細胞の転換において、インターロ
イキン−１（IL−１）の活性の非常に著しい誘発（107
単位/mlに等しい）を示した。
ァージのLPSでの活性化は、C3H/Hejマウス（LPSに敏感
でないマウス）の胸腺細胞の転換において、インターロ
イキン−１（IL−１）の活性の非常に著しい誘発（107
単位/mlに等しい）を示した。
これらのマクロファージの上澄はまた、TNFの作用に
敏感である、腫瘍系統1929の細胞に毒性効果を有する
（20000単位/mlに等しい量）。
敏感である、腫瘍系統1929の細胞に毒性効果を有する
（20000単位/mlに等しい量）。
３日間隔で各３投与で、2.5mg/kgの投与量でのGPLpに
よるBalb/cマウスの腹膜組織内刺激は、これらの動物の
血清にTNF活性の著しい誘発をもたらし、これは腫瘍系
統1929の細胞への毒性（34000単位/mlに等しいTNFの量
に対応する毒性）により評価した。
よるBalb/cマウスの腹膜組織内刺激は、これらの動物の
血清にTNF活性の著しい誘発をもたらし、これは腫瘍系
統1929の細胞への毒性（34000単位/mlに等しいTNFの量
に対応する毒性）により評価した。
3.Balb/cマウスの脾細胞によるリンホカイン（lymphoki
ne）の誘発能力： イン ビボまたはイン ビトロで、脾細胞を免疫刺激
効果を有する抗原またはマイトジェンと接触させると、
リンホカインの分泌により応答する。
ne）の誘発能力： イン ビボまたはイン ビトロで、脾細胞を免疫刺激
効果を有する抗原またはマイトジェンと接触させると、
リンホカインの分泌により応答する。
最も知られているリンホカインはインターロイキン−
２（IL−２）であり、これはIL−２依存性細胞毒性Ｔリ
ンパ球の系統（マウス胸腺腫）（CTLL−２）の生存およ
び繁殖のために不可欠である。
２（IL−２）であり、これはIL−２依存性細胞毒性Ｔリ
ンパ球の系統（マウス胸腺腫）（CTLL−２）の生存およ
び繁殖のために不可欠である。
結果： 2.5mg/kgの投与量（３日間隔で各３投与）でのGPLpに
よるBalb/cマウスの皮下の刺激は、48時間後に脾細胞の
上澄に測定されるIL−２活性の著しい徴候を与えた（5.
55単位/mlに等しい量）。
よるBalb/cマウスの皮下の刺激は、48時間後に脾細胞の
上澄に測定されるIL−２活性の著しい徴候を与えた（5.
55単位/mlに等しい量）。
4.マウスにおける遅延形過敏性（delayed hypersensiti
vity）の試験 遅延形過敏性反応（HSR）は、所期の静脈感作に続い
て、（足底の肉趾に）局所的に注入されたアレルゲンに
より誘発される。動物が、Ｔリンパ球に作用する非特異
的免疫刺激剤で処理されると、アレルゲンが２回目に局
所的に導入されたときに、遅延型過敏性が増加すること
が観察される。
vity）の試験 遅延形過敏性反応（HSR）は、所期の静脈感作に続い
て、（足底の肉趾に）局所的に注入されたアレルゲンに
より誘発される。動物が、Ｔリンパ球に作用する非特異
的免疫刺激剤で処理されると、アレルゲンが２回目に局
所的に導入されたときに、遅延型過敏性が増加すること
が観察される。
この試験では、アレルゲンの第２の注入に続く足底の
肉趾の体積の増加を分析する。使用したアレルゲンは羊
の赤血球であった。（腹膜組織内または皮下に）研究し
た生成物でマウスを最後に刺激した２日後、およびDHR
試験４日前に、これらを静脈に注射した。刺激したマウ
スは試験生成物を（腹膜組織内または皮下に）、−８
日、−５日および−２日の各日に2.5mg/kgの投与量で受
けた。対照マウスは、標準食塩水のみを受け入れた。０
日には、すべてのマウスが静脈に百万の羊赤血球の単一
投与を受けた。＋４日には、マウスは足底の肉趾に注入
した羊赤血球108を受けた。
肉趾の体積の増加を分析する。使用したアレルゲンは羊
の赤血球であった。（腹膜組織内または皮下に）研究し
た生成物でマウスを最後に刺激した２日後、およびDHR
試験４日前に、これらを静脈に注射した。刺激したマウ
スは試験生成物を（腹膜組織内または皮下に）、−８
日、−５日および−２日の各日に2.5mg/kgの投与量で受
けた。対照マウスは、標準食塩水のみを受け入れた。０
日には、すべてのマウスが静脈に百万の羊赤血球の単一
投与を受けた。＋４日には、マウスは足底の肉趾に注入
した羊赤血球108を受けた。
結果： ３日間隔で３回投与した生成物によるC57BL/6マウス
の腹膜組織内および皮下刺激は、（72時間で１リーディ
ング（reading）を除いた）対照マウスに関してDHRを増
加させ（Ｐ≦0.001）、その増加量は、BCGによるものに
匹敵した。
の腹膜組織内および皮下刺激は、（72時間で１リーディ
ング（reading）を除いた）対照マウスに関してDHRを増
加させ（Ｐ≦0.001）、その増加量は、BCGによるものに
匹敵した。
5.羊赤血球に対するマウスの抗体応答の増加 抗体応答の程度は、抗原の性質および免疫系の性質お
よび条件に依存する。免疫系が免疫刺激剤によって、ま
たはアジュバントの存在下での抗原によって刺激される
と、抗体応答は増加する。行った試験において、GPLpの
この性質を、C47BL/6マウスの羊赤血球に対する抗体応
答により分析した。ここで、マウスは試験生成物であら
かじめ刺激しておいた。処理されたマウスは、−８日、
−５日および−２日の各日に2.5mg/kgの投与量で、腹膜
組織内および皮下に試験生成物を受けた。対照マウスは
生理的血清のみを受けた。
よび条件に依存する。免疫系が免疫刺激剤によって、ま
たはアジュバントの存在下での抗原によって刺激される
と、抗体応答は増加する。行った試験において、GPLpの
この性質を、C47BL/6マウスの羊赤血球に対する抗体応
答により分析した。ここで、マウスは試験生成物であら
かじめ刺激しておいた。処理されたマウスは、−８日、
−５日および−２日の各日に2.5mg/kgの投与量で、腹膜
組織内および皮下に試験生成物を受けた。対照マウスは
生理的血清のみを受けた。
０日には、各マウスは羊赤血球106の単一静脈内投与
を受けた。次いで０日〜＋43日に血清試験を取り、これ
らを羊赤血球溶血能について試験した。
を受けた。次いで０日〜＋43日に血清試験を取り、これ
らを羊赤血球溶血能について試験した。
結果： ３日間隔で３回投与したGPLpによるC57BL/6マウスの
静脈および皮下刺激は、腹膜組織内刺激の場合には７、
11および25日に取った血清試料について、また皮下刺激
の場合には７、20および25日に取った血清試料につい
て、羊赤血球の抗体応答の非常に著しい増加を引き起こ
した。
静脈および皮下刺激は、腹膜組織内刺激の場合には７、
11および25日に取った血清試料について、また皮下刺激
の場合には７、20および25日に取った血清試料につい
て、羊赤血球の抗体応答の非常に著しい増加を引き起こ
した。
6.全身性防護の試験 ａ）マウスにおけるクレブジーラ ニューモニアエ（kl
ebsiella pneumoniae）による感染に対する防護試験： マウスに特に適合したK.ニューモニアエ(K.pneumonia
e)の腹膜組織内への注入は、24−48時間以内に致命的な
敗血症を引き起こす。試験は、対照に比べて処理したマ
ウスの生存時間を測定することにある。処理マウスは、
−８日，−５日および−２日の各日に2.5mg/kgの投与量
で、腹膜組織内に試験生成物を受けた。対照マウスは生
理的血清のみを受けた。０日に、すべてのマウスは１つ
の適当なK.ニューモニアエの腹膜組織内投与を受けた。
その後、続く５日間に死亡数を観察した。
ebsiella pneumoniae）による感染に対する防護試験： マウスに特に適合したK.ニューモニアエ(K.pneumonia
e)の腹膜組織内への注入は、24−48時間以内に致命的な
敗血症を引き起こす。試験は、対照に比べて処理したマ
ウスの生存時間を測定することにある。処理マウスは、
−８日，−５日および−２日の各日に2.5mg/kgの投与量
で、腹膜組織内に試験生成物を受けた。対照マウスは生
理的血清のみを受けた。０日に、すべてのマウスは１つ
の適当なK.ニューモニアエの腹膜組織内投与を受けた。
その後、続く５日間に死亡数を観察した。
結果： ３日間隔で３回それぞれ2.5mg/kgの投与量でのGPLpに
よる腹膜組織内刺激は、K.ニューモニアエの50×LD50で
感染したCDIマウスを非常に著しく防護した。事実、動
物は試験中病気の徴候を全く示さなかった。
よる腹膜組織内刺激は、K.ニューモニアエの50×LD50で
感染したCDIマウスを非常に著しく防護した。事実、動
物は試験中病気の徴候を全く示さなかった。
ｂ）マウスにおけるL1210細胞の注入により誘発される
白血病に対する防護： 試験は、対照マウスに対して処理したB6D2/F1マウス
の生存時間を測定することからなる。
白血病に対する防護： 試験は、対照マウスに対して処理したB6D2/F1マウス
の生存時間を測定することからなる。
Ｌ−1210白血病細胞は、試験に先立って適切な培地で
培養した。
培養した。
処理マウスは、−８日，−５日および−２日の各日に
2.5mg/kgの投与量で、腹膜組織内に試験生成物を受け
た。対照マウスは生理的血清のみを受け入れた。０日に
各マウスは、生存能力のあるＬ−1210細胞を106の投与
量で腹膜組織内への１回投与を受けた。生存時間を測定
した。
2.5mg/kgの投与量で、腹膜組織内に試験生成物を受け
た。対照マウスは生理的血清のみを受け入れた。０日に
各マウスは、生存能力のあるＬ−1210細胞を106の投与
量で腹膜組織内への１回投与を受けた。生存時間を測定
した。
結果： ３日間隔で３回それぞれ2.5mg/kgの投与量でのGPLpに
よる腹膜組織内刺激は、Ｌ−1210白血病細胞を接種した
B6D2/F1マウスの生存時間を非常に著しく延長した。延
長は、対照マウスの生存時間に関して33％であった。
よる腹膜組織内刺激は、Ｌ−1210白血病細胞を接種した
B6D2/F1マウスの生存時間を非常に著しく延長した。延
長は、対照マウスの生存時間に関して33％であった。
7.マウスへの皮下投与における同化作用の効果（anabol
ic effect）の評価 ３日間隔で３回それぞれ2.5mg/kgの投与量で、生成物
を皮下に注入した。マウスの重量を10日間毎日記録し、
全体の重量増加を評価した。処理マウスは、−10、−７
および−４の各日に2.5mg/kgの投与量でGPLpを受けた。
対照マウスは生理的血清のみを受けた。
ic effect）の評価 ３日間隔で３回それぞれ2.5mg/kgの投与量で、生成物
を皮下に注入した。マウスの重量を10日間毎日記録し、
全体の重量増加を評価した。処理マウスは、−10、−７
および−４の各日に2.5mg/kgの投与量でGPLpを受けた。
対照マウスは生理的血清のみを受けた。
結果： ３日間隔で３回それぞれ2.5mg/kgの投与量でのGPLpに
よる皮下刺激は、Balb/cマウスにおいて著しい同化作用
効果を有していた（Ｐ≦0.02）。
よる皮下刺激は、Balb/cマウスにおいて著しい同化作用
効果を有していた（Ｐ≦0.02）。
8.マウスの化学的に誘発された白血球減少症におけるGP
Lpの抗白血球減少症効果 この試験は、まずアドリブラスチン（Adriblastine）
（ドクソルビシン クロロハイドレート ラクトース
（doxorubicin chlorhydrate lactose）、アンスラサイ
クリン（anthracycline）類の群の細胞増殖抑制性の生
成物）の助けにより、マウスに白血球の凅渇（depletio
n）を誘発することからなる。その後、同じマウスを、
これらの血液細胞が標準状態に復帰するまで、GPLpおよ
び正の対照として使用した他の生成物（ゲンザイム（Ge
nzyme）により提供されたマウスのGM−CSF）で処理し
た。
Lpの抗白血球減少症効果 この試験は、まずアドリブラスチン（Adriblastine）
（ドクソルビシン クロロハイドレート ラクトース
（doxorubicin chlorhydrate lactose）、アンスラサイ
クリン（anthracycline）類の群の細胞増殖抑制性の生
成物）の助けにより、マウスに白血球の凅渇（depletio
n）を誘発することからなる。その後、同じマウスを、
これらの血液細胞が標準状態に復帰するまで、GPLpおよ
び正の対照として使用した他の生成物（ゲンザイム（Ge
nzyme）により提供されたマウスのGM−CSF）で処理し
た。
Balb/cマウスを、０および＋１の各日に、5mg/kg/日
（体積50μＬ）の量で静脈内に、アドリブラスチンで処
理した。同じマウスは次に、0.15mlの体積で、GPLp、GM
−CSFまたは生理的血清を受けた。この処理は、２、
５、８、11、14、17、および20日に行われた。それぞれ
の動物において、０、２、５、８、11、14、17、20およ
び28日に、循環する白血球の計測を行った。
（体積50μＬ）の量で静脈内に、アドリブラスチンで処
理した。同じマウスは次に、0.15mlの体積で、GPLp、GM
−CSFまたは生理的血清を受けた。この処理は、２、
５、８、11、14、17、および20日に行われた。それぞれ
の動物において、０、２、５、８、11、14、17、20およ
び28日に、循環する白血球の計測を行った。
結果： Balb/cマウスのGPLpでの腹膜組織内刺激は、アドリブ
ラスチンでの前処理により誘発された白血球減少症を、
マウスGM−CSFの場合に匹敵する程度に非常に著しく緩
和した。
ラスチンでの前処理により誘発された白血球減少症を、
マウスGM−CSFの場合に匹敵する程度に非常に著しく緩
和した。
9.食細胞作用の試験−−−コロイド状炭素の除去におけ
るGPLpの活性 この試験は、食細胞による血液からのコロイド状炭素
の粒子の除去の動力学の研究を可能にする。処理マウス
は、−８日、−５日および−２日の各日に12mg/kgの経
口投与で試験生成物を受けた。対照マウスは生理的血清
のみを受けた。０日に、各マウスはゼラチン中４％の懸
濁物においてコロイド状炭素（ペリカン「エンクレ デ
キネ」ブラック（Pelikan“Encre de Chine",blac
k））の単一静脈内投与を受けた。投与量は、16mg/体重
100gであった。０、２、４、６、８、10および12分の時
間に、血液試料（各0.025ml）を取った。試料は、分光
光度計により630ミクロンの波長で測定した。これは血
液中の懸濁物に残存する炭素粒子の測定を可能にする。
るGPLpの活性 この試験は、食細胞による血液からのコロイド状炭素
の粒子の除去の動力学の研究を可能にする。処理マウス
は、−８日、−５日および−２日の各日に12mg/kgの経
口投与で試験生成物を受けた。対照マウスは生理的血清
のみを受けた。０日に、各マウスはゼラチン中４％の懸
濁物においてコロイド状炭素（ペリカン「エンクレ デ
キネ」ブラック（Pelikan“Encre de Chine",blac
k））の単一静脈内投与を受けた。投与量は、16mg/体重
100gであった。０、２、４、６、８、10および12分の時
間に、血液試料（各0.025ml）を取った。試料は、分光
光度計により630ミクロンの波長で測定した。これは血
液中の懸濁物に残存する炭素粒子の測定を可能にする。
結果： −８日、−５日および−２日の各日に12mg/kgの経口
投与で、GPLpでのGDIマウスの刺激は、コロイド状炭素
の清掃に著しい増加を引き起こした。
投与で、GPLpでのGDIマウスの刺激は、コロイド状炭素
の清掃に著しい増加を引き起こした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 ピレー，シャルル フランス国，94100 セント モール, アブニイ ド ブイソン ８ (56)参考文献 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａ ｃｔｓ，Ｖｏｌ．89，Ｎｏ．１（1990年 １月）Ｐ．ＡＢ−438〜439，ａｂｓｔｒ ａｃｔ ｎｕｍｂｅｒ 4236
Claims (19)
- 【請求項１】活性成分として、少なくとも部分的に精製
された、マイコバクテリウム ケロナエ（Mycobacteriu
m chelonae）からのGPLpの抽出画分または、免疫刺激剤
として活性な誘導体であるM.ケロナエのGPLpの誘導体を
含むことを特徴とする免疫刺激組成物。 - 【請求項２】少なくとも部分的に精製された画分が＋４
℃でメタノールに可溶な画分であることを特徴とする請
求項１記載の組成物。 - 【請求項３】上記画分が、18〜50℃の温度でクロロホル
ム：メタノール2:1の混合物の助けによって、M.ケロナ
エの細胞もしくは細胞壁の抽出によって得ることができ
る画分であり、この画分は４℃のメタノールに可溶であ
ることを特徴とする請求項１記載の組成物。 - 【請求項４】前記画分が、2:1のクロロホルム／メタノ
ール混合物を用いて抽出し、次いで、４℃に冷却したメ
タノールを、メタノール／クロロホルムの体積比が少な
くとも5:1に等しいように十分な量で添加し、そして溶
液中に残留する画分を集めることによって得られる請求
項３記載の組成物。 - 【請求項５】さらに、溶液中に残留する該画分を、溶媒
を蒸発除去した後に、2:1のクロロホルム／メタノール
混合物中に溶解し、NaOHの0.2Mメタノール溶液を添加す
ることによって、脱アセチル化に供し、そして37℃で30
分間後、混合物を酢酸で中和し、溶媒の割合を、4:2:1
の比でクロロホルム／メタノール／水混合物を得るよう
に調整して洗浄し、混合物を攪拌した後、１時間そのま
ま保持し、そして有機相を集め、蒸発に供するか、また
はカラムクロマトグラフィーによる精製に供する請求項
４記載の組成物。 - 【請求項６】活性成分として、少なくとも１つの次式1: ここで、Pheはフェニルアラニンを表し、 aThrはアロ−スレオニンを表し、 Alaはアラニンを表し、 糖は3,4−ジ−０−メチルラムノースであり、 オリゴ糖は次の構造を有する： 3,4−ジ−０−メチルラムノース−ラムノース−６−デ
ソキシタロース、そして Ｒ−CO−は脂肪酸のアシル基であり、 ここで、3,4−ジ−０−メチルラムノース基は、aThrお
よびアラニノールのそれぞれにグリコシド結合によって
結合され、そしてアラニンのＣ末端COOH基はアミド結合
によってアラニノールに結合される の糖ペプチド脂質を含むことを特徴とする前記請求項１
〜５のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項７】Ｒ−CO−が、少なくとも16個の炭素原子を
有する脂肪酸のアシル基を表すことを特徴とする請求項
６記載の組成物。 - 【請求項８】Ｒ−CO−が、36個未満の炭素原子を有する
脂肪酸のアシル基を表すことを特徴とする請求項７記載
の組成物。 - 【請求項９】該脂肪酸が、１以上の二重結合および／ま
たは分枝および／またはベータ−ヒドロキシもしくはベ
ータ−メトキシ置換基を含むことを特徴とする請求項７
または８に記載の組成物。 - 【請求項１０】該誘導体が、脱アセチル化された誘導体
であることを特徴とする前記請求項１〜９のいずれか１
項に記載の組成物。 - 【請求項１１】上記の少なくとも１つの式（１）の化合
物が、合成または半合成によって得られるものであるこ
とを特徴とする請求項６〜10のいずれか１項に記載の組
成物。 - 【請求項１２】ゲルカプセル、錠剤、粉末、坐薬、歯肉
のペースト、もしくはクリームまたは、鼻もしくは結膜
による投与に適した組成物の形状に製造されることを特
徴とする前記請求項１〜11のいずれか１項に記載の組成
物。 - 【請求項１３】液体薬剤媒体中の懸濁物の形状または凍
結乾燥物の形状に製造される請求項１〜11のいずれか１
項に記載の組成物。 - 【請求項１４】有効量の防腐剤および／または界面活性
剤をさらに含むことを特徴とする前記請求項１〜13のい
ずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項１５】活性成分を、組成物全重量に対して0.02
〜８％の量で含むことを特徴とする前記請求項１〜14の
いずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項１６】非特異的免疫刺激薬としての請求項１〜
15のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項１７】ワクチンにおけるアジュバントとしての
請求項１〜16のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項１８】抗癌材の免疫抑制作用に対抗する剤とし
ての請求項１〜16項のいずれか１項に記載の組成物。 - 【請求項１９】活性成分として、少なくとも部分的に精
製された、マイコバクテリウム ケロナエ（Mycobacter
ium chelonae）からのGPLpの抽出画分または、免疫刺激
剤として活性な誘導体であるM.ケロナエのGPLpの誘導体
を含むことを特徴とする同化促進作用組成物。
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| FR90/06997 | 1990-06-06 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0485577B1 (ja) |
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| JP2001517223A (ja) * | 1997-04-02 | 2001-10-02 | バイオニケ ライフ サイエンシーズ インコーポレイテッド | 原生動物性または寄生生物性疾患の予防、治療または排除のための細菌細胞壁抽出物の使用 |
| US7135191B2 (en) * | 1997-09-04 | 2006-11-14 | Zsolt Istvan Hertelendy | Urogenital or anorectal transmucosal vaccine delivery system |
| GB9822619D0 (en) * | 1998-10-19 | 1998-12-09 | Porter William L | Immune response stimulation |
| IL148247A0 (en) | 1999-08-24 | 2002-09-12 | Teva Pharma | A vaccine composition and method of using the same |
| US6592869B2 (en) | 1999-08-24 | 2003-07-15 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Vaccine composition and method of using the same |
| AU2002353366A1 (en) * | 2001-12-10 | 2003-06-23 | Bakulesh Mafatlal Khamar | The process of manufacturing a pharmaceutical composition useful for management of cancer |
| TWI745278B (zh) | 2014-10-10 | 2021-11-11 | 以色列商艾畢克生物實驗有限公司 | 發泡性降低之疫苗組合物 |
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- 1991-06-06 ES ES91910767T patent/ES2080320T3/es not_active Expired - Lifetime
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-
1995
- 1995-11-29 GR GR950403365T patent/GR3018244T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．１（１９９０年１月）Ｐ．ＡＢ−４３８〜４３９，ａｂｓｔｒａｃｔ ｎｕｍｂｅｒ ４２３６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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