KR100204365B1

KR100204365B1 - 한국산 겨우살이로부터 면역증강용 조성물의 추출방법 및 그 추출물

Info

Publication number: KR100204365B1
Application number: KR1019960005732A
Authority: KR
Inventors: 김종배; 도명술; 최옥병; 유영춘; 윤택준
Original assignee: 김광순; 태림제약주식회사; 김종배
Priority date: 1996-03-05
Filing date: 1996-03-05
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR970064612A

Abstract

본 발명은 한국산 겨우살이{Viscum album coloratum}로부터 면역증강용 조성물의 추출방법 및 그 추출물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 한국산 겨우살이의 잎, 줄기, 눈 및 열매로 부터의 수용성 추출물 KM110,중탕후 탈지성분 KM11C 또는 당단백질 성분 KML-1을 유효성분으로서 함유하여 생체의 면역기전을 증강시키는 면역증강제 조성물에 관한 것이다.

Description

한국산 겨우살이로부터 면역증강용 조성물의 추출방법 및 그 추출물

제1도는 본 발명에 따라 실시예 1,2 및 3에서 수득된 한국산 겨우살이 추출물 KM110, KM11C 및 KML-1분획의 전기영동 결과를 나타내는 것이다.

제2도는 본 발명에 따라 실시예 1 및 2에서 수득된 한국산 겨우살이 추출물 KM110 및 KM11C 분획의 겔여과에 의한 U.V.분광분석 크로마토그램이다.

제3도는 본 발명의 추출물 KM110분획과 유럽산 겨우살이 추출물인 헬릭서(Helixor)의 IL-1 유도능을 흉선세포에 의한 [³H]-티미딘 흡수량으로 비교하여 나타낸 그래프이다.

제4도는 본 발명의 추출물 KM110분획과 유럽산 겨우살이 추출물인 헬릭서(Helixor)의 TNF-α 유도능을 L929 세포 증식저해율로 비교하여 나타낸 그래프이다.

제5도는 본 발명의 추출물 KML-1분획의 농도에 따른 IL-1유도능을 흉선세포에 의한 [³H]-티미딘 흡수량으로 나타낸 그래프이다.

제6도는 본 발명의 추출물 KM11C 분획의 농도에 따른 TNF-α 유도능을 L929세포 증식저해율로 나타낸 그래프이다.

제7도는 본 발명의 추출물 KM110 분획이 각 면역담당세포에 미치는 영향을 시간 경과에 따라 [³H]-티미딘 흡수량으로 비교하여 나타낸 그래프이다[PL: 혈액, LN: 임파절, SP: 비장, BM: 골수].

제8도는 본 발명의 추출물 KM110 분획의 NK(natural Killer) 세포활성 증진효과를 NK세포에 민감한 YAC-1 세포의 용해율로 나타낸 그래프이다.

제9도는 본 발명의 추출물 KM110 및 KML-1 분획이 KLH(Keyhol Limpet Hemocyanin) 항원에 대한 항체 유도에 미치는 영향을 비교하여 나타낸 그래프이다.

제10도는 본 발명의 추출물 KM110 및 KML-1 분획이 KLH에 대한 지연성과민 반응에 미치는 영향을 비교하여 나타낸 그래프이다.

제11도는 본 발명의 추출물 KM110 분획이 생후 1일된 미성숙 마우스에 미치는 독성효과를 체중변화로 나타낸 그래프이다.

제12도는 본 발명의 추출물 KM110 분획이 성숙 마우스에 미치는 독성효과를 체중변화로 나타낸 그래프이다.

제13도는 정상세포로서 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 마우스 비장세포에대한 본 발명의 추출물 KM110, KM11C 및 KML-1 분획의 독성효과를 세포의 [³H]-티미딘 흡수량으로비교하여 나타낸 그래프이다.

제14도는 정상세포로서 ConA(concanavallin A)에 의해 활성화된 마우스 비장세포에 대한 본 발명의 추출물 KM110, KM11C, KML-1 분획의 독성효과를 세포의 [³H]-티미딘 흡수량으로 비교하여 나타낸 그래프이다.

제15도는 본 발명의 추출물 KM110 분획과 유럽산 겨우살이 추출물 헬릭서(Helixor)의 간 및 신장에 대한 영향을 비교하여 나타낸 그래프이다.

본 발명은 항원에 대한 면역반응을 증진시키는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 한국산 겨우살이(viscum album coloratum)로부터 면역증강용 조성물의 추출방법 및 그 추출물에 관한 것이다.

면역증강제의 개념은 60여년 전에 로만(Roman)이 파상풍(tetanus)이나 디프테리아(diphtheria)균을 그에 대한 불활성화된 항원백신과 함께 투여하였을 경우, 항원 백신만을 투여한 경우에 비해 백신의 효과가 더 중진되는 것을 밝혀내면서 알려지기 시작했다[참조:Roman, G., Bull. Soc. Centr. Med. Vet., 101, 277(1925)]. 면역증강제는 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시킬 수 있는 모든 물질을 의미한다.[참조: Rajesh K. Gupta et., Vaccine, 11 : 293 (1993)]. 이와 같이 항원에 대하여 생체내에서 일어나는 여러 가지 면역작용을 상승시키는 면역증강제의 작용방법을 요약하면 다음과 같다.

첫째로 항원에 대한 저장효과(depot effect)를 들 수 있다.[참조: Edelman, R., Rev. Infect. Dis., 2: 370 (1980)]. 대개의 경우, 유리 항원(free antigen)은 주사부위의 국소조직으로 부터 급속히 확산되는데, 이때 면역증강제는 세포 또는 대식세포내에 항원이 장시간 저장되는 장소를 제공함으로써 그 확산을 막는다. 둘째로는 대식세포의 활성화를 들 수 있다.[참조: Waksman, B. H., Springer Semin, Immunopathol. 2: 5(1979)]. 저장작용에 의해 세포내에 항원이 장시간 존재하게 되면 그세포는 계속적으로 활성화되며 특히 항원에 의해 감작된 세포의 경우에는 계속 분열함으로써 그 딸세포들은 항원에 의해 더욱 확실히 자극받게 된다. 활성화된 대식 세포는 그 표면의 항원의 발현량을 증가시킴으로서 림프구에 대한 제시효율을 향상시키며 림프구의 면역응답을 유도하게 된다. 또한, 항원제시 세포 등에 의해 분비되는 IL-1이 이러한 작용을 향상시킨다. 셋째로 림프구에 대한 특이적인 효과이다[참조 :Bomford, R., Clin. Exp. Immunol. 39: 435(1980)]. 즉, 기존의 프로인트 완전보조액(Freund complete adjuvant)은 T-세포에, BCG는 T- 및 B-세포에 작용하게 된다. 마지막으로 면역증강제는 항종양효과가 있다[참조: Yoo, Y. C., Vaccine 10: 792 (1992)]. 즉, 면역증강제는 대식세포 또는 T-세포를 자극, 활성화 시킴으로서 종양에 대한 비특이적 또는 특이적인 면역응답을 증가시키게 된다. 그러나 면역증강제 개발에 있어서 커다란 장벽으로서, 이들 면역증강제에 의한 면역반응의 차이 또는 그 자체의 독성 등 여러 가지 부작용 때문에 현재 인간에게 사용할 수 있는 물질은 극히 제한된 실정이고 그 효능도 매우 미미한 것으로 알려져 있다. 현재 사용되고 있는 면역증강제를 살펴보면 다음과 같다.

(1) 오일 에멀젼(oil emulsion)

이런 형태의 면역증강제로서 가장 대표적인 것은 프로인트 완전보조액(Freund complete adjuvant: FCA)이다. 그러나, 실험실에서의 동물실험 결과 죽은 마이코박테리아에 광유인 파라핀을 혼합하여 제조한 FCA 는 가장 강력한 면역증강제로서 알려져 있지만 인간에게는 그 부작용 때문에 사용하지 못하고 있다. 즉, 주사부위의 강력한 염증반응으로 인한 고통, 발열, 여러기관에서의 전신화된 육아종성증식(generalized granulomatous proliferation)에 의한 영구적 상태, 자가면역질병, 아밀로이드증(amyloidosis), 아쥬번트 관절염(adjuvant arthritis) 및 과민증을 동반하게 된다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 개발된 FIA(Freund's incomplete adjuvant)는 마이코박테리아를 첨가하지 않는 것으로 항원이 면역담당 세포에 노출되는 시간을 연장함으로서 효과를 얻으려 하였다. 그러나 FIA는 아데노바이러스 백신(adenovirus vaccine)등에 응용하였을 경우에는 면역반응을 매개하지 못하였을 뿐 아니라 조직중에 기름이 평생 잔존하며 주사부위의 국소적 발열반응 및 파라핀 오일에 의한 종양의 유기로 인하여 특수한 경우를 제외하고는 인간에 적용하지 못하는 실정이다[참조:Kimura, J. et al., Jpn. J. Exp. Med. 48: 149(1978)].

(2) 무기화합물

인간에게 허용될 수 있는 면역증강제로서 무기화합물에는 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄이 포함된다. 면역증강제로서 알루미늄은 약 60년전에 글레니(Glenny) 등 [참고: J. Pathol. Bacterial 29:38(1926)]에 의하여 디프테리아 독소의 백신 제조시에 사용된 이래로 사람에게 일반적으로 알룸 면역증강제(alum adjuvant)가 사용되어 왔으나 백신에 대한 면역증강제로서 큰 효과가 없는 것으로 보고되고 있다[참고: April, M. A. and Wardlaw, Can, J. Pibl. HITH., 57, 343(1966)]. 알루미늄 면역증강제는 알루미늄이 항원에 결합하여 침전됨으로서 주사부위에서 지속적인 면역반응이 일어나게 하고, 보체를 활성화시킴으로서 B세포의 작용을 높이는 역할을 한다. 즉, 알루미늄 화합물은 체액성 면역상승은 유도할 수 있으나, 세포성 면역반응에는 영향을 미치지 못하는 것으로 알려져 있다. 그리고 몇가지 부작용, 즉 홍반, 피하결절, 접촉성 과민반응, 육아종성 염증 등의 부작용을 수반하게 된다. 따라서, 이러한 알룸 면역증강제는 인간에게 사용할 수 있으나 그 효과는 미미하다.

(3) 박테리아 생성물(bacterial products)

불활성화시킨 박테리아나 박테리아 대사산물이 항원에 대한 면역반응을 상승시킨다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 이들을 면역증강제로 이용하려는 시도는 오랫동안 계속되어 왔다. 즉, 리포폴리사카라이드(LPS), 마이코박테리아(Mycobacteria spp.) 마이코박테리아성 화합물(Mycobacteria compounds), 코리네박테리움 파룸(Corynebacterium paruum), 코리네박테리움 그래뉼로섬(Corynebacterium granulosum)등은 그 자체를 항원으로 이용할 경우 부작용을 일으키기 않지만 다른 백신에 대한 면역증강제를 사용할 경우 큰 부작용을 일으키고 있는 실정이다. 따라서, 박테리아 생성물을 이용한 면역증강제는 주사제가 아닌 경구투여용 형태로의 개발에 초점을 맞추고 현재 연구를 계속하고 있는 실정이다[참고: Azuma, I., Vaccine 10: 1000(1992)].

(4) 기타

이들 이외에도 포유동물 세포막 유래의 리포좀이나 사포닌, 콜레스테롤, 항원복합체로 만들어진 면역자극성 복합체(immunostimulaticy complexes: ISCOMS)등을 이용하여 면역증강제로 사용하고 있으나 면역증강능이 기존의 것들 보다 약하고 부작용이 있기 때문에 아직 개발단계에 있는 실정이다[참고: Lovgren, K., Scand. J. Immunol. 27: 241(1988)].

따라서, 부작용이 없으면서 유용한 면역증강효과를 나타내는 신물질의 개발은 유효한 백신의 개발과 관련하여서도 대단히 중요한 의미를 가진다. 이에 본 발명자들은 천연물질을 대상으로 하여 상기한 바와 같은 목적을 달성할 수 있는 물질을 검색하였으며, 그 결과 한국산 겨우살이로부터 추출한 추출물이 강력하게 면역계를 자극할 뿐 아니라 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시킴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 유효성분으로 한국산 겨우살이(viscum album coloratum)의 추출물을 함유하는 면역증강제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 한국산 겨우살이는 겨우살이속의 식물이다. 겨우살이속의 식물들은 은 세계 전역에 분포하여 자라는 다년셍의 반기생 식물로서 세계 전역에는 30 속 1500종의 식물이 있는 것으로 알려져 있으며, 로란타세(Loranthaccae), 비스카세(Viscaccae) 및 에레몰레피다세(Eremolepidaccae)의 3개의 과로 나누어진다. 로란타세과에 속하는 것으로 특히 한국 등 아시아 지역에서 자라는 겨우살이를 비스컴 알붐 콜로라툼(viscum album coloratum)이라 분류하며 우리나라 한방에서는 곡기생으로 알려져 있다. 일반적으로 겨우살이 식물들은 렉틴(lectin)이라는 당단백질과 탄수화물, 비스코톡신(viscotoxin A₂, A₃, B), 비신(viscine), 루에페올(luepeol), 이노시톨(inositol), 트리테르페노이드(triterpenoid), 올레아놀산(oleanolicacid), 플라보야도리닌(Flavoyadorinin A, B), 루페올(lupeol), 알카로이드(alkaloids), 비타민류(vitamin E, C)등의 여러 성분을 함유하고 있으며, 이들의 화학적 조성은 각 식물의 생장지역 및 기생 숙주 등에 따른 특이성이 있는 것으로 알려져 있다[참조: H. Becter, Oncology, 43, suppl. 1:2 (1986)]. 예를들어, 유럽산 겨우살이(viscum album loranthacea)는 지금까지 주로 항암작용 및 비특이적인 면역체계에 미치는 영향 등에 관하여 연구되어 왔으며, 이러한 작용을 나타내는 그의 활성물질은 주로 렉틴, 다당류, 비스코톡신 등이고, 특히는 렉틴에 의한 활성인 것으로 보고 되고 있다. 한편, 한국산 겨우살이에 대해서는 1981 년과 1986 년에 가와자(Khwaja) 등에 의해 항종양효과에 대한 연구가 유럽산 겨우살이의 경우와 비교하여 수행되었으며, 그 실험결과의 보고에 따르면 유럽산 겨우살이가 렉틴에 의하여 항종양효과가 나타나는데 반해, 한국산 겨우살이는 강한 독성 알카로이드에 의하여 항종양효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다[참조: Khwaja et al., Oncology. 1986. Experimentia. 1981]. 즉, 이러한 실험결과에 따라. 한국산 겨우살이와 유럽산 겨우살이는 모두 겨우살이속의 식물이지만 그의 아속명이 상이한 겨우살이 식물로서 구성성분 및 약효활성을 나타내는 성분면에서 모두 명백한 차이를 나타내고 있음을 알 수 있었다.

이러한 실험결과를 바탕으로 하여, 본 발명자들은 한국산 겨우살이 식물의 활성성분과 그의 약물학적 효과를 밝히기 위하여 집중적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 이하에서 언급하는 바와 같이 한국산 겨우살이의 특정 추출물은 유럽산 겨우살이 추출물에 비해 월등히 우수한 면역증강 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명에서 사용할 수 있는 한국산 겨우살이 추출물에는 한국산 겨우살이 (viscum album coloratum)의 잎과 줄기 및 열매를 물로 추출한 수용성 성분(이하에서는 KM110 분획이라 칭함). 수용성 추출물을 중탕후 클로로포름 및 헥산에 의해 오일 등의 비극성성분을 제거한 추출물(이하에서는 KM11C 분획이라 칭함) 및 당단백질인 렉틴 영역(이하에서는 KML-1 분획이라 칭함)이 포함된다.

본 발명에 따르는 겨우살이 추출물중의 KM110 분획은 겨우살이 식물의 수용성 성분으로서 한국산 겨우살이에 물을 가하여 교반하고, 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 동결건조시킴으로써 수득되는 갈색 분말상 분획이다. 이 KM110분획에는 한국산 겨우살이의 성분중에서 수용성인 모든 성분, 예를 들면 단백질류, 당류, 일부 지질 및 비타민류 등이 포함되어 있는 것으로 추정된다.

또한 본 발명에서 이용할 수 있는 한국산 겨우살이 추출물로서 KM11C분획은 한국산 겨우살이에 물을 가하여 비등시키고 클로로포름을 가하여 층을 분리시키고 수층을 취하여 여기에 헥산을 가하여 층을 분리시키고 수층을 분리하여 동결건조시킴으로써 수득되는 황갈색 분말상 분획이다. 이렇게 하여 수득되는 KM11C 분획은 KM110의 성분중에서 지질, 알카로이드 등의 비극성물질은 제거되고 폴리펩타이드류 및 열에 안정한 성분 등과 열에 불안정한 렉틴 등의 물질이 변성 또는 분해되어 형성된 성분들이 포함되어 있는 것으로 추정되며, 전기영동에 의해 KM11C분획은 분자량 10000 이하의 물질을 함유하는 것으로 확인되었다.

본 발명에서 사용할 수 있는 한국산 겨우살이 추출물로는 또한 KML-1분획이 있다. KML-1분획은 겨우살이의 당단백질 물질인 렉틴의 분획으로서, 한국산 겨우살이를 냉동상태에서 분쇄한 후, 0.01M PBS(phosphate buffered saline)용액에 넣고 교반한 후, 원심분리하여 침전물을 분리시키고, 수득된 상등액에 황산암모늄을 70%의 농도가 되도록 가하여 교반함으로서 상등액중의 단백질 성분을 침전시키고, 원심분리하여 회수한 침전물중의 황상암모늄을 투석에 의해 제거한 후에 가수 분해된 세파로즈(Sepharose) 4B칼럼에 적용시키고 칼럼을 PBS 로 세척하고 락토즈 용액으로 용출되는 물질(분광광도계에 의해 280nm에서 흡광도 측정)을 분리하여 동결건조시킴으로써 수득된다. 이 분획은 한국산 겨우살이 식물의 당단백질인 렉틴이 주성분인 것으로 추정되었다.

상기한 바와 같이 추출하여 분리된 한국산 겨우살이 식물의 KM110, KM11C 및 KML-1 분획은 모두 이하의 실시예에서 입증되는 바와 같이 강력한 면역증강작용을 가지고 있다. 따라서, 임상적인 목적으로 면역증강제로서 사용하고자하는 경우에 이들 추출물은 각각 유효용량을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 약제학적 체제의 형태로 제형화시켜 이용할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 약제학적 제제로는 경구투여에 적하한 정제, 캅셀제, 액제 등, 및 비경구투여에 적합한 정맥 또는 피하 주사용 액제 또는 현탁제 등이 포함될 수 있다. 또한 본 발명에 따르는 한국산 겨우살이 추출물의 각각의 분획의 유효용량 범위는 사용하고자 하는 각 분획의 종류 및 환자의 연령, 성별, 건강상태 등에 따라 달라 질 수 있으나, 일반적으로는 성인에게 1일에 체중 kg 당 20μg 내지 1000μg, 바람직하게는 100μg 내지 500μg의 용량범위로 투여할 수 있다.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

[실시예1: KM110분획의 추출방법]

한국산 겨우살이를 수집하여 증류수로 세척한 후에 -20℃에서 진공포장하여 -20℃에서 동결시킨 겨우살이의 세순 두마디(100g)까지를 세절하고 이온교환 수지를 통과한 증류수를 시료중량에 대하여 10배로 첨가하고 2분 동안 믹서기로 분쇄한 후에 4℃에서 16시간 동안 교반하였다. 그후 원심분리(15,000g/20분, 4℃)하여 얻은 상등액을 공극크기를 달리하는 막여과기(membrane filter)에 의해 순차적으로 여과(60μm, 20μm, 7.2μm, 0.45μm 및 0.22μm)한 후에 여액을 동결건조시켜 갈색 동결건조물로서 KM110 분획 9g을 수득하였다. 이하의 실험에서는 수득된 KM110분획의 동결건조물을 인산염완충액(PBS)으로 10mg/mℓ의 농도로 현탁시킨 것을 원액으로 하여 사용하였다.

[실시예2 : KM11C분획의 추출방법]

한국산 겨우살이 500g을 세절하고 증류수 1ℓ를 가하여 2시간 동안 비등시켰다. 원심분리(5000g, 20분)하여 상등액을 취하고, 그 상등액을 분액여두(separatory funnel)에 넣고 헥산 1ℓ를 첨가한 후, 약 1시간 동안 격렬하게 진탕하였다. 이 혼합물을 정치시켜 헥산층과 수층을 분리시키고, 상층부인 헥산층을 분리하였다. 잔류 수층을 사용하여 이 공정을 3회 반복해서 수행하였다. 최종적으로 얻은 수층에 클로로포름 1ℓ를 가하고 격렬하게 진탕한 다음 정치시켜 두층으로 분리시킨 후 , 하층부인 클로로포름층을 제거하는 공정을 역시3회 반복 수행하였다. 마지막에 남은 수층을 동결건조시켜 황갈색분말로서 KM11C 분획 27g을 수득하였다.

전기영동에 의해 KM11C 분획은 분자량 10000 이하에서 밴드를 나타내었으며, 따라서 KM11C 는 최소한 지질 및 알카로이드 계통의 성분은 제거되고 분자량 10000 이하의 다양한 분자량을 가지는 폴리펩타이드류 및 열에 안정한 여러물질을 함유하는 것으로 추정되었다.

[실시예 3 : KML-1분획의 추출방법]

KM110중의 하나의 활성물질로서 당단백질 분획인 KML-1은 가수분해된 세파로즈 4B(Pharmacia)컬럼을 이용하여 분리하였다. 즉, 겨우살이 21g을 세절하고 액체질소내에서 완전히 냉동시킨 후에 시약사발에서 미세한 입자(20.8g)가 되도록 분쇄하였다. 이 분쇄물에 0.5M NaCl 200mℓ를 가하고 4℃에서 3내지 5시간 동안 교반하였다. 교반 후에 원심분리(15000g/30분)하여 침전물을 회수하였다. 침전물을 분리시켜 얻은 상등액에 황산암모늄을 70%의 농도가 되도록 가하여 교반함으로서 상등액중의 단백질 성분을 침전시켰다. 윈심분리시켜 침전물을 회수한후에, 침잔물중의 황산암모늄은 증류수중에서 투석시켜 제거하고 10mM 인산염완층액에 용해시켜 0.2N HC1용액으로 가수분해된 세퍼로즈 4B 칼럼에 적용시켜 2시간동안 고정시켰다. 그후 10mM 인산염완층액으로 충분히 세척하고 0.2M 락토즈 용액으로 용출시켜 U.V.분광광도계로 280nm에서 흡광도를 나타내는 분획을 분리하였다. 분리된 분획을 증류수에서 2 일 동안 투석시킨 후에 동결건조시켜 회색 분말로서 KML-1 분획 9mg을 수득하였다.

[실시예 4 :겨우살이 추출물의 겔여과 레 전기영동]

상기 실시예 1 내지 3에서 추출된 각각의 겨우살이 추출물 KM110, KM11C 및 KML-1 분획을 확인하기 위하여 각각에 대하여 전기영동 및 겔여과를 수행하였다. 추출물 KM110, KM11C 및 KML-1 에 대한 잔기영동은 회퍼(Hoefer) SE 600 모델을 이용하여 레믈리(Laemmli) 방법에 의한 SDS-PAGE 법으로 실시하였다. 시료의 분석은 11.5%의 분리용 겔을 사용하여 수행하였으며, KM110은 20mg/ml,KM11C 는 30mg/ml,그리고 KML-1의 경우에는 27mg/ml(PBS)의 농도로 조정된 시료 100㎕ 와 2-머캅토에탄올을 함유하는 전기영동 시료완충액 100㎕를 혼합하고,가열(100℃,2분)하여 환원(단백질내의 디설파이드 결합이 끊어진 상태) 시킨 시료를 웰당 50㎕ 씩 넣어 80 내지 90V 로 5시간 동안 전류를 흘려주어 전기영동을 실시하였다. 전기영동후에 쿠마시(Coomasie)R-250을 이용하여 겔을 염색하고, 2ℓ 의 탈염완충액(메탄올600㎖, 아세트산200㎖, DDW 1200㎖)를 이용하여 탈염과정을 수행하였다. 이렇게 하여 수득된 각 추출물의 전기영동 결과는 제1도에 나타내었다.

제1도에서는 보는바와같이 KM110은 겨우살이의 물추출물로서 200KD내지 14.3KD의 전영역에서 밴드가 관찰되었다. 따라서 무수히 많은 여러 단백질들이 존재하는 것으로 사료된다. 시료를 환원 및 비환원상태로 처리를 하여 전기영동한 결과에서 약 30KD를 기준으로 그 이상의 분자량을 나타내는 비환원상태하에서의 밴드가 환원상태에서는 30KD 이하에서 나타나는 경향을 보였다. 따라서 본 결과는 KM110 내의 분자량30KD 이상의 단백질은 최소한 디설파이드 결합에 의한 다이머 이상의 형태로 존재하는 것으로 판단된다. 특히, 유효한 활성물의 하나로 판단되어 분리된 KML-1 의경우도 분자량 약29KD 및 33KD의 쇄가 디설파이드 결합한 형태의 구조를 가지는 분자량 약 65KD 의 물질로 사료되었다. 그리고 KM11C의 경우에는 제조과정에서 이상의 단백질 등의 물질이 제거되었거나 분자량 10KD이하로 분해된 형태를 포함하는 물질로 구성되어 있는 것으로 판단될 수 있었다.

한편, 겔여과는 KM110과 KM11C 분획에 대하여 수행하였는데, 분리용 겔로는 세파덱스(Sephadex) LH-20 겔을 2X120cm 의 파이렉스(Pyrex) 칼럼에 충진하여 사용하였다. 각각의 시료 20mg씩을 증류수 1㎖에 용해시켜 칼럼에 적용하고 증류수를 용출제로 사용하여 물질의 분리를 실시하였다. 용출완충액의 유속(flow rate)은 800㎕/분 이었고, 분획수집기(fraction collector, LKB, U.S.A)내에서 3㎖/시험관 씩의 양으로 칼럼을 통과한 용출완충액을 수집하였다. 각 분획은 분획수집기와 연결된 U.V. 검출기(LKB)내에서 흡광도(280nm)를 측정하였다. 측정된 결과는 제2도에 나타내었다.

U.V. 스펙트럼 280nm의 흡광도에서 측정한 KM110 과 KM11C의 크로마토그램을 비교하여 보면 KM110의 분획 1은 KM11C에서는 완전히 제거되었고, KM110의 분획 2, 3, 4는 KM11C에서도 존재함과 동시에 분해되어 새로운 분자량을 가지는 분획이 생성됨을 알 수 있었다. 이결과 KM110의 분획1은 열에 매우 불안정한 물질이며 KM11C의 전기영동 결과와 비교하여 판단하면 분자량 10KD이상의 물질로 보이고, 분자량 10이하의 물질은 열에 비교적 안정된 것과 불안정한 것을 동시에 함유하는 것으로 사료되었다. 동시에 열에 불안정한 분획은 분해되어 새로운 분자량의 물질이 생성됨을 관찰할 수 있었다.

[실시예 5 : 본 발명의 한국산 겨우살이 추출물 KM110 분획과 유럽산 겨우살이 추출물의 면역증강능 비교]

실시예1에서 수득된 본 발명에 따르는 한국산 겨우살이 추출물 KM110분획과 유럽산 겨우살이 추출물로서 유럽에서 시판중인 헬릭서(Helixor: HELIXOR Heimittel GmbH Co.)의 면역증강능을 비교하기 위하여 이들이 면역계의 일차적인 응답체계인 마우스 대식세포의 활성화에 미치는 영향을 비교하였다. 이를 위한 지표로서 대식세포가 분비하는 사이토킨(cytokine)으로서 종양괴사인자인 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 T세포의 분화를 촉진하는 IL-1(interleukine-1)의 유도능에 대한 실험을 실시하였다.

Balb/c 마우스에 1% 티오글리콜레이트(Amersham) 1㎖를 복강내 주사하고 72시간 후에 마우스의 복강으로부터 대식세포를 회수하였다. 대식세포를 24웰 플레이트에 도말하기 위하여 스트렙토마이신(0.1mg/㎖),페니실린(100 유니트/㎖)을 함유하는 RPMI-1640배지를 이용하여 1X10⁶/웰의 세포밀도로 조정한 후 2시간 동안 5% CO2, 37℃(100% 습도)의 조건하에서 배양하였다. 배양종료후에 배양배지를 제거하고 FBS(Fetal Bovine Serum: 7.5%)를 함유하는 RPMI-1640배지로 ㎖당 10μg 및 100μg의 농도로 희석한 KM110 및 헬릭서(Helixor)를 각각 웰당 1㎖씩 가하여 1시간 동안 대식세포를 자극하였다. 이때 KM110 및 헬릭서에 대한 양성 대조군으로는 LPS(lipopolysaccharide)를 10μg/㎖의 농도로 사용하였다. 그후, 각웰을 FBS-비함유 RPMI 1640 배지로 3회 세척하고 신선한 RPMI-1640배지를 웰당 1㎖의 양으로 가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 원심분리(900g/5분)하여 각각의 배양상등액을 회수하고 -20℃에서 보관하면서 이하의 실험을 수행하였다.

1. IL-1의 분석:

대식세포 배양상등액중의 IL-1 분석은 미젤(Mizel) 등의 방법[참조: J. Immunol. 120, 1497 (1978)]에 준하여 실시하였다. 즉4-6 주령의 C3H/HeJ 마우스로부터 회수한 흉선세포(thymocyte)를 96웰 플레이트(Costar, Cambridge, MA)에 1.5X10⁶/100㎕/웰 씩의 양으로 도말하고, 각 웰에 상기에서 수득한 대식세포 배양상등액과 PHA(phytohemagglutinin: Gibco)용액(최종농도 0.25%)을 각각 50㎕씩 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 배양 종료 5시간 전에 0.5μCi의 [³H]-티미딘을 웰당 50㎕씩의 양으로 첨가하고, 배양이 끝난 후에 배양세포를 필터메이트(Filtermate) 196(Packard Instrument, Meriden, CT)에 의해 유리필터에 흡착시켜 매트릭스 96 직접 베타계수기(Matrix 96^TMDirect Beta Counter)(Packard Instrument Company)를 이용하여 각 웰의 방사선 활성을 조사함으로써 흉선세포가 흡수한 [³H]-티미딘을 양을 측정하였다. 측정된 결과는 제3도에 나타내었다.

제3도에 도시된 결과로 부터 알 수 있는 바와 같이 IL-1의 분비유도는 대식세포를 자극하는 KM110분획의 농도에 의존적인 겨로가를 나타내었다. 특히, 100μg의 KM110분획에 의한 자극은 양성대조군으로 사용한 LPS(10μg/㎖)이상으로 IL-1을 유도하는 결과를 나타내었다. 이결과에 비하여 헬릭서의 경우는 최소한 대식세포로 부터IL-1을 유도하는 것과는 관계가 없는 것으로 나타났다.

[TNF-α의 분석:]

TNF-α분석은 피쉬(Fish) 와 지포드(Gifford)등의 방법[참조: J. Immuno. Methods 57, 311 (1983)]에 준하여 TNF-α에 감수성을 나타내는 L929세포를 이용한 생물학적검정법(bioassay)에 의해 실시하였다. L929 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 1X10⁴/100㎕/웰의 세포밀도로 도말한 후에 상기에서 수득한 대식세포 배양 상등액을 각 웰당 50 ㎕씩 첨가하였다. 이웰에 악티노마이신 D를 최종농도 0.1㎍/㎖이 되도록 50㎕/웰의 양으로 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 배양종료 5시간 전에 0.5μCi의 [³H]-티미딘을 웰당 50㎕의 양으로 첨가하고, 배양이 끝난 후에 상기 IL-1의 경우와 동일한 방식으로 각 웰의 방사선 활성을 조사하였다. 배양상등액중의 TNF-α의 활성은 L929세포의 증식저해율로 나타내었으며, 계산식은 다음과 같다

측정된 결과는 제4도에 도시하였다. 제4도에 도시된 결과에 따르면 본 발명의 KM110분획과 유럽산 겨우살이 추출물인 헬릭서는 모두 마우스의 대식 세포를 자극하여 TNF-α를 유도하는 것으로 나타났다. 그러나 KM110분획의 경우가 헬릭서의 경우에 비하여 통계적으로 유의하게 더 많은 TNF-α를 유도하는 결과를 나타내었으며, 이것은 KM110분획의 IL-1유도능과 상관관계가 있는 것으로 판단된다.

[실시예 6]

실시예3에서 수득한 KML-1 분획을 사용하여 상기 실시예 5와 동일한 방법에 따라 IL-1 유도능에 대하여 실험하였다. 이 실험에서 KML-1의 농도는 웰당, Ong(대조군), 0.64ng, 3ng. 2ng, 16ng, 80ng 및 400ng 으로 하여 실험하였다.

이 실험에 의해 측정된 결과는 제5도에 나타내었다. 제5도에 도시된 결과로부터 본 발명의 추출물 KML-1 분획은 마우스 대식세포를 자극하여 IL-1의 분비를 유도하는 것으로 나타났다. 즉 400, 80, 16, 3.2 및 6.4ng/㎖의 농도로 대식 세포를 자극한 배양상등액을 4주령의 C57BL/6 의 흉선세포에 첨가하여 시험관내에서 배양한 결과 60 내지 3.2ng/㎖ 의 농도로 자극된 대식세포의 배양상등액의 경우는 대조군에 비하여 [³H]-티미딘의 흡수량이 월등하게 상승된 결과를 얻었다. 따라서 KML-1 로 자극된 대식세포의 배양상등액은 IL-1을 함유하는 것을 확인할 수 있었다. 400ng 의 KML-1로 처리한 경우에, IL-1의 유도가 나타나지 않은 것은 KML-1 의 세포독성으로 인하여 대식세포에 의한 자극 중에 대식세포가 손상되었기 때문인 것으로 사료되며, 대식세포를 자극하여 유의하게 IL-1을 유도케하는 KML-1의 적정농도는 60 내지16ng/㎖임을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로서 활성화된 T-세포는 TNF-α, IL-2등의 면역기전에 관련된 사이토킨을 분비하여 생체의 면역능 증진에 중추적인 역할을 수행하게 된다. 따라서 KML-1에 의한 IL-1의 유도는 차후에 일어나는 면역계의 활성화를 예견할 수 있는 결과로 사료된다.

[실시예 7]

마우스 유래의 섬유아세포 세포주인 L929는 TNF-α에 가장 민감한 세포주로 알려져 있으며, 활성화된 대식세포의 배양상등액중에서의 TNF-α의 유도를 확인하는 방법으로 L929 세포주에 대식세포의 배양상등액을 첨가하여 배양후 L929세포주의 생존율을 측정하는 방법은 잘 알려진 사실이다. 따라서, 실시예 2에서 수득한 KM11C 분획을 이용하여 상기 실시예 5와 동일한 방법에 따라 L929세포에 대한 증식저해율을 측정함으로써 KM11C분획의 대식세포 활성화에 의한 TNF-α 유도능에 대하여 실험하였다. 이 실험에서 KM11C의 농도는 웰당, 0㎍(대조군), 0.02㎍, 0.2㎍, 2㎍, 20㎍, 200㎍ 및 2000㎍ 으로 하여 실험하였다.

이 실험에 의해 측정된 결과는 제6도에 나타내었다. 제6도에 도시된 결과로부터 본 발명의 추출물 KM11C분획은 마우스 대식세포를 자극하여 TNF-α의 분비를 유도하는 것으로 나타났다. 즉 KM11C 0.2㎍/㎖의 농도로 대식세포를 자극한 배양상등액은 L929 세포주의 증식을 유의하게 억제하기 시작하였으며 20㎍/㎖의 농도에서 약78%의 L929세포의 증식억제율을 나타내었다. 그후 200㎍/㎖의 농도로부터 저해율은 떨어지기 시작하였다. 이상의 결과로서 KM11C는 대식세포를 자극하여 THF-α를 유도하는 것을 추정할 수 있었고, TNF-α에 대한 항체를 첨가하였을 경우, 세포억제율이 완전히 해소되는 것으로서 TNF-α의 유도를 확인할 수 있었다. 따라서 KM11C는 대식세포를 강하게 자극한다는 것이 인정되었다.

[실시예 8]

본 발명에 따르는 한국산 겨우살이 추출물 KM110분획이 생체내(in vivo)에서의 비특이적인 면역반응에 미치는 영향을 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 6내지 8주령의 Balb/c(Sizuoka Laboratory Animal Center, Hamamatsu, Japan)마우스를 이용하여 실험을 실시하였다. KM110을 투여하고 투여시간의 경과에 따라서 KM110이 면역담당세포에 미치는 영향을 조사하기 위하여 마우스를 4개의 그룹(5마리/그룹)으로 나누었다. 대조군은 PBS 처리군으로 하였고, 각각의 면역담당기관을 취하여 면역담당기관에 미치는 영향을 분석하기 5 일전, 3일전, 그리고 1일전에 각각의 마우스에 100㎍/200㎕(PBS) 의 KM110을 정맥주사 하였으며, 대조군의 마우스에는 동일한 시기에 KM110 을 첨가하지 않은 PBS 200㎕를 정맥주사하였다. 실질적으로는 KM110을 투여한 후 1, 3, 5일후에 비특이적으로 면역담당기관에 미치는 영향을 조사하는 것이다. 회수한 면역담당세포는 골수(bone marrow: BW), 비장(spleen: SP), 혈액(peripheral blood: PL) 및 임파절(lymphnode: LN)로 부터의 임파구였다. 이들 각 기관을 멸균적으로 회수하여 FBS-비함유 RPMI-1640 배지(Gibco)에 넣고 균질화기를 이용하여 하나의 세포를 만든 다음에 5X10⁵/100㎕/웰이 되도록 96 웰 배양플레이트(Costar, Cambridge, MA)에 첨가하였다. 그후, B 및 T 세포의 자극물질로 알려진 LPS(lipopolysaccharide) 와 ConA(Concanavallin A)를 각각 5㎍/㎖의 농도로 각 웰에 첨가하여 37℃(5%, CO₂)에서 3일 동안 배양하였다. 배양종료 6시간 전에 0.5μCi/웰의 [³H]-티미딘(비활성 23Ci/밀리몰; Amersham International, Budkinghamshire)을 첨가하였다. 배양종료후에, 세포를 수집하여(Filtermate 196; Packard Instrument Company, Meriden CT)살아있는 세포가 흡수한 [³H]-티미딘의 양을 매트릭스 96 직접 베타계수기로 측정하였다. 측정된 결과는 제7도에 나타내었다.

제7도에서 보는 바와 같이 KM110은 조혈전구세포인 골수에 대해서는 LPS 와 ConA의 자극에 대하여 감수성을 나타내지 못했지만 임파절, 혈액, 비장으로 부터의 임파구에 대해서는 대조군에 비하여 각각의 자극물질에 대하여 통계적으로 유의한 높은 반응성을 나타내었다. 이결과로부터 KM110은 임파구를 자극하여 자극물질에 대한 반응성을 높이는 효과가 있는 것으로 판단되었다.

[실시예 9]

본 발명의 한국산 겨우살이 추출물 KM110 이 비특이적인 면역체계에서 중요한 역할을 담당하는 자연살해세포(Natural Killer Cell, NK)에 미치는 영향을 조사하였다. NK세포는 생체내에서 바이러스에 감염된 세포의 표면 당단백을 인지하여 세포간의 접촉에 의해 C9 보체 성분 및 퍼포린(perforin)과 같은 과립방출물을 유리하면서 감염세포를 살상하게 된다. 또한, NK세포는 종양에 대해서는 비특이적으로 살해기능을 가지므로 NK세포의 활성화는 면역능의 비특이적인 상승에 있어서 중요한 의미를 갖는다 하겠다.

NK 세포활성분석은 사토(Sato)의 방법[참조: Jan. J. Cancer Res. 1992; 83: 1081-1087]에 의하여 실시하였다. 6 내지 8주령의 Balb/c 마우스에 PBS에 용해시킨 KM110분획을 정맥내 주사하고, 시간의 경과에 따른 NK세포활성을 조사하였다. 즉 3마리의 마우스를 한 그룹으로 하여 KM110을 마우스당 12.5㎍, 25㎍, 50㎍ 및 100㎍의 양으로 정맥주사한 다음에 1일, 3일, 5일후에 마우스의 비장을 멸균적으로 FBS-비함유 RPMI-1640배지에 취하였다. 그후, 96-웰 U 버텀 플레이트(bottom plate)(Corning)에서 마우스로 부터의 비장을 균질화기를 이용하여 하나의 세포로 만들고 배지의 세포농도를 혈구계(Hemacytometer; Hausser Scientific, USA)로 확인하고 원심분리(900g, 5분)하여 배지를 RPMI-1640로 바꾸고 4℃에서 보관하였다.

NK세포에 민감하게 반응하는 세포로 알려진 YAC-1세포를 크롬-51(⁵¹Cr)로 표지하였다. 세포의 표지는 FBS-비함유 RPMI-1640 배지에서⁵¹Cr(DuPont, France; 25mR/hr/mCi)원액 200㎕를 YAC-1 세포(5X10⁵/㎖)에 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 표지하였다. YAC-1세포를⁵¹Cr표지한 후에 배지 100㎕당 1X10⁴세포의 농도로 조정하여(표적세포) 96-웰 배양플레이트에 첨가하였다. 그후, 상기에서 수득된 비장세포(효과세포)를 표적세포에 대하여 100:1, 50:1, 25:1 및 12.5:1의 비가 되도록 조정하여 표적세포 위에 넣어 주었다. 표적세포와 효과세포가 잘 접촉되도록 원심분리(900g/5분)한 후에 37℃의 배양기(5% CO₂)에서 6시간 동안 배양하였다. 배양종료후에 배양혼합물을 원심분리하여 배양상등액을 분리하고 감마계수기(gamma counter,; Packard, U.S.A.)로 표적세포로 부터의⁵¹Cr의 양을 측정하였다. NK세포의 활성측정은 다음 식에 의하여 구하였다.

NK 세포활성 = YAC-1 세포 용해율(%)

이렇게 하여 측정된 결과는 제8도에 나타내었다. 제8도에 도시된 결과는 KM110 투여후 시간 경과에 따른 NK세포활성의 변화를 나타낸 것으로, KM110 분획 투여후 1, 3일까지 NK세포활성은 대조군에 비해서 유의하게 증가하는 결과가 관찰되어, KM110의 비특이적인 면역상승효과가 인정되었다.

[실시예 10]

본 발명에 따르는 한국산 겨우살이 추출물 KM110 및 KML-1 분획의 항원에 대한 특이적 면역능의 증진효과를 조사하였다. 이 실험은 항원특이적인 면역반응에 관한 것으로서, 특히 항체 생산과 관련이 있는 B세포에 의한 체액성 면역반응(humoral immune response)에 미치는 영향을 조사한 것이다. 즉 KLH(Keyhol Limpet Hemocyanin)을 항원으로 하여 Blab/c 마우스(6 주령)에 마우스당 KLH 20㎍을 단독으로 또는 KLH 20㎍과 KM110분획 100㎍ 또는 10㎍또는 KML-1분획 20ng을 피하주사에 의해 동시 투여한 후에 각주별로 마우스의 혈청을 채취하여 혈청중의 KLH에 대한 항체의 역가(titer)를 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)법으로 측정하였다.

즉, 항원으로 사용한 KLH를 5㎍/100㎕의 농도로 ELISA플레이트에 코팅하고 상기한 바와 같은 양으로 각 시료를 1회 주사후 1및 2주일 간격으로 채혈한 항혈청을 0.01M PBS를 사용하여 2-배 희석법으로 희석하여 첨가하였다. 그후, 마우스 면역글로부린에 효소(HRP, Horse raddish peroxidase)가 부착된 2차 항체 래빗트-안티-마우스 IgG 를 100㎕/웰의 양으로 첨가하고 이 효소에 대한 기질인 ABTS(2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid))를 가하여 ABTS의 분해에 의한 발색광을 측정하였다. 항체의 역가는 대조군(정상 마우스)보다 2배 이상의 발색광을 나타내는 최대 희석비로 결정하였다. 겨로가는 제9도에 나타내었다.

제9도에서 보는 바와 같이 KM110 100㎍과 10㎍ 을 KLH와 동시 투여 결과 2주째부터 유의한 항체역가의 상승이 관찰되었으며 부스터(booster)주사(2주째)후 3주후에는 KLH 단독투여인 대조군에 비해서 약 1000배 가량의 높은 항체역가가 관찰되었다. 그리고 항체역가 상승에 대한 지속성을 최초 주사후 최소한 10주 까지는 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 증진된 결과를 보였다. KML-1의 경우도 KM110의 경우와 같이 부스터 주사후 3주째에 최고의 상승효과를 가졌고 10주째 까지 항체생산 지속효과를 보여주었다. 이상의 결과로부터 KM110에 의한 B세포에 관련된 체액성 면역의 상승효과에는 KM110에서 분리한 KML-1이 관여하는 것으로 판단되었다.

[실시예11]

본 실시예는 본 발명에 따르는 추출물 KM110 및 KML-1 분획이 항원에 대한 특이적 면역반응중에서 세포성 면역반응에 미치는 영향을 조사한 것이다.

실시예 10의 마우스를 이용하여 최초 주사후 14주째에 항원으로 사용한 KLH를 발바닥(footpad)에 50㎍씩 주입하고 지연성 과민반응이 일어나는 것을 관찰하였다. 지연성 과민반응은 체액성 보다는 오히려 세포성 면역이 관여하는 것으로서, 이것은 이전의 감염에 대하여 감작된 T-세포에 의하여 IL-1,IL-2,IFN-г등의 사이토킨이 유도되고 또한 대식세포 등을 자극하여 국소부위에 모이게 함으로써 유도되는 숙주의 항원에 대한 방어기작이다. 항원(KLH)에 대한 마우스의 지연성 과민반응은 KLH를 주입한 후 항원 주사부위의 피부두께를 시간의 경과에 따라 측정하여 항원주사부위의 주사전 정상적인 피부두께에 대한 백분율로 나타내었다. 측정된 결과는 제10도에 나타내었다.

제10도에서 KLH 와 KM110 및 KML-1이 동시 투여된 마우스 그룹이 KLH단독 투여 그룹의 대조군에 비하여 발바닥 팽윤이 증진되었으며, 이러한 증진 효과는 KM110 의 투여량에 의존하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에 따르는 한국산 겨우살이 추출물 KM110 및 KML-1분획은 이미 감작된 항원에 대한 면역 기능을 증진시켜 동일 항원에 의한 2차 침입에 대한 강한 세포성 면역응답을 유도하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

[실시예 12]

본 발명에 따르는 한국산 겨우살이 추출물인 실시예1에서 수득된 KM110 분획의 독성을 조사하기 위하여 생체기능이 미숙한 생후 1일째의 마우스(Balb/c)에 KM110(100㎍, 10㎍ 또는 1㎍)을 0.01M PBS에 용해시켜 피하주사방법으로 투여한 후 체중의 변화를 측정하였다. 측정된 결과는 제11도에 나타내었다.

제11도에 도시된 결과로부터 미성숙 마우스에 KM110 을 10㎍ 이하의 용량으로 투여한 경우는 생후 1일째 마우스의 성장에 있어서 무처리 대조군의 마우스에 비하여 영향을 미치지 않는 반면에, 100㎍ 투여의 경우는 미성숙 마우스에 있어서는 직접적인 독성을 나타내어 주사한지 1일만에 사망하는 것을 관찰할 수 있었다.

KM110 의 안정성 문제를 상세히 조사하기 위하여 생후 6주령의 성숙 마우스에 KM110 분획 100㎍을 0.01M PBS 에 용해시켜 5일동안 연속해서 복강내 투여하면서 체중의 변화를 관찰하였다. 측정된 결과는 제12도에 나타내었다.

제12도에 도시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, KM110을 투여한 후 3일째부터 체중의 변화가 관찰되었고, 최종 투여 5일 후 에는 다시 정상체중으로 회복되는 것을 알 수 있었다. 따라서 성숙 마우스에 있어서는 마우스당 100㎍ 까지의 투여는 안정한 것으로 판단된다.

[실시예 13]

본 발명에서 사용한 겨우살이 추출물 KM110, KM11C 및 KML-1 의 정상세포에 대한 직접적인 세포독성 효과를 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

6 내지 8 주령의 Balb/c 마우스( Sizuoka Laboratory Animal Center, Hamamatsu, Japan)에서 멸균적으로 비장을 회수하여 FBS-비함유 RPMI-1640 배지(Gibco)에 넣고 균질화기를 이용하여 하나의 셀을 만든 다음에 웰당 5X10⁵/100㎕(7.5% FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지)가 되도록 96-웰 배양플레이트(Costar, Camnridge, MA)에 첨가하였다. 그리고 B 및 T 세포의 자극물질(mitogen)로 알려진 LPS(lipopolysaccharide) 및 ConA(Concanavallin A)를 5㎍/㎖가 되도록 각 웰에 첨가하였다. 그후에 각 웰에 시료로서 KM110, KM11C 및 KML-1을 첨가하였다. KM110 과 KM11C 의 경우는 최고농도 100㎍/㎖부터 5배 희석법으로 1.3ng/㎖까지 0.01M PBS로 희석하여 각 웰에 첨가하였고, KML-1의 경우는 160 ng/㎖를 최고농도로 하여 5배 희석법으로 1.3 ng/㎖까지 0.01M PBS로 희석하여 각 웰에 첨가한 후에 각각 37℃, 5% CO₂하에서 3일 동안 배양하였다. 배양종료 6시간 전에 0.5μCi/웰의 [³H]-티미딘(비활성 23Ci/밀리몰; Amersham International, Buckinghamshire)을 첨가하고 세포를 수집하여(Filtermate 196; Packard Instrument Company, Meriden CT) 살아있는 세포가 흡수한 [³H]-티미딘을 매트릭스 96직접베타계수기로 측정하였다. 측정된 결과는 제13도 및 제14도에 나타내었다.

제13도 및 제14도에서 보는 바와 같이 KM110 및 KML-1은 각각 10㎍/㎖ 및 10ng/㎖ 이하의 농도에서 정상세포에 세포독성 효과를 주지 않으며, KM11C는 최고농도에서도 정상세포에 미치는 영향이 없는 것으로 나타났다.

[실시예 14]

본 발명의 KM110분획의 생체에 미치는 독성을 좀더 상세히 조사하기 위하여 체내의 신진대사에 관여하는 두가지 장기, 즉 간 및 신장에 미치는 영향을 검토하였다. 간기능은 간세포가 함유하는 GOT(glutamic-oxalacetate transaminase)의 두 효소를 측정하고, 신장기능은 CRE(blood creatin)와 BUN(blood urea nitrogen)의 혈중농도를 측정하여 조사하였다. 8 주령의 Balb/c 마우스에 KM110 분획 100㎍ 및 10㎍ 과 대조군으로 동량의 헬릭서(Helixor)를 0.01M PBS에 용해시켜 정맥주사법으로 투여하고 1, 3 및 5일 후에 마우스의 눈으로부터 혈액을 수집하고, 분리한 혈청 10㎕를 다층필름(multilayer film)상에 취하고, 후지 드라이 켐 시스템(Fugi Dry Chem System; Fugi Photo Film Co., Ltd., Japan)하에서 각 효소의 측정을 실시하였다. 정상군에는 PBS 200㎖만을 투여하여 동일한 실험을 수행하였다. 측정된 결과는 제15도에 나타내었다. 제15도에서 보는 바와 같이 본 발명의 KM110분획은 헬릭서 투여군과는 달리 생체내에서 대사가 가장 빠른 정맥주사로 투여하였을 경우에도 GOT, GPT 그리고 CRE 및 BUN 각 효소의 혈중농도가 정상군에 비하여 상승되지 않은 것을 보아, 두 장기 세포에는 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

Claims

한국산 겨우살이 비스쿰 알붐 콜로라툼(Viscum album coloratum)으로부터 얻을 수 있는 면역증강용 추출물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 상기 한국산 겨우살이에 물을 가하여 교반하고, 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 동결건조시켜 수득함을 특징으로 하는 수성 추출물(KM110 분획).
제1항에 있어서, 상기 추출물이 한국산 겨우살이에 물을 가하여 비등시키고 클로로포름을 가하여 층을 분리시키고 수층을 취하여 여기에 헥산을 가하여 층을 분리시키고 수층을 분리하여 동결건조시켜 수득함을 특징으로 하는 추출물(KM11C 분획)
제1항에 있어서, 상기 추출물이 한국산 겨우살이를 냉동상태에서 분쇄한 후, 인산염 완충식염수에 가하여 교반하고 원심분리하여 침전물을 분리하고 상등액에 황산암모늄을 가하여 단백질 성분을 침전시키고 분리된 침전물중의 황산암모늄을 투석시켜 제거하고 가수분해된 세파로즈(Sepharose) 4B 칼럼에 적용시켜 락토즈 용액으로 용출시켜 U.V. 분광광도계에 의해 280nm에서 흡수광도를 나타내는 물질의 분획을 분리하여 동결건조시킴을 특징으로 하는 추출물(KML-1 분획).
한국산 겨우살이에 물을 가하여 교반하고, 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 동결건조시킴을 특징으로 하는 면역증강용 조성물(KM110 분획)의 추출방법.
한국산 겨우살이에 물을 가하여 비등시키고 클로로포름을 가하여 층을 분리시키고 수층을 취하여 여기에 헥산을 가하여 층을 분리시키고 수층을 분리하여 동결건조시킴을 특징으로 하는 면역증강용 조성물(KM110 분획)의 추출방법.
한국산 겨우살이를 냉동상태에서 분쇄한 후, 인산염 완충식염수에 가하여 교반하고 원심분리하여 침전물을 분리하고 상등액에 황산암모늄을 가하여 단백질 성분을 침전시키고 분리된 침전물중의 황산암모늄을 투석시켜 제거하고 가수분해된 세파로즈(Sepharose) 4B 칼럼에 적용시켜 락토즈 용액으로 용출시켜 U.V. 분광광도계에 의해 280nm에서 흡광도를 나타내는 물질의 분획을 분리하여 동결건조시킴을 특징으로 하는 면역증강용 조성물(KML-1 분획)의 추출방법.