KR100617495B1 - 한국산 파래 유래의 면역증강용 추출물, 그 추출방법 및 이를 함유하는 약제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 녹조류 유래의 면역증강용 녹조류 엑스(추출물), 이의 추출방법 및 이를 함유하는 면역증강용 약제에 관한 것으로, 구체적으로 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역력을 효과적으로 활성화시키는 본 발명의 녹조류 추출물은 한국산 녹조류에 증류수를 가하여 교반한 후 이를 원심분리하여 상등액을 취하는 수용성 성분의 추출방법 또는 상기 상등액에 황산암모늄을 가하여 단백질 성분을 침전시킨 후, 크로마토그래피법에 의해 렉틴 분획 물질을 분리하는 렉틴 성분의 추출방법에 의해 수득할 수 있으며, 전기 방법들에 의해 추출된 녹조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 약제는 세포독성 없이 강력한 면역증강작용을 나타내는 바, 면역증강용 약제로 효과적으로 사용할 수 있다.

한국산 녹조류, 녹조류 엑스(추출물), 증류수 추출방법, 렉틴 분획 추출방법, 한국산 녹조류 렉틴, 면역증강용 약제

Description

한국산 파래 유래의 면역증강용 추출물, 그 추출방법 및 이를 함유하는 약제{EXTRACT OF KOREAN ENTEROMORPHA HAVING IMMUNO-POTENTIATING ACTIVITY, METHOD FOR EXTRACTING THE SAME AND MEDICAMENT COMPRISING THE SAME}

도 1은 본 발명의 추출방법에 따라 한국산 녹조류(Korean Green Algae)로부터 실시예 1에 의해 추출한 수용성 성분 추출물(이하, 'KGA1'라 함) 및 실시예 2에 의해 추출한 렉틴 성분 추출물(이하, 'KGA2'라 함)의 전기영동 결과를 나타내는 그림으로, St(standard)는 표준 단백질, A는 환원 겔, B는 비환원 겔을 표시한다.

도 2는 본 발명의 추출방법에 따라 실시예 1에서 추출한 KGA1 분획의 UV(280nm) 분광분석 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 추출방법에 따라 실시예 2에서 추출한 KGA2 분획의 UV(280nm) 분광분석 크로마토그램를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 추출물 KGA2의 B형 혈액 응집반응에 있어서 농도 의존성 효과를 나타낸 그림으로서 농도는 우로부터 10, 20, 40, 80, 160, 320 ㎍/㎖이다.

도 5는 실험예 1에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 대식세포(Macrophage)에 있어서 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α: TNF-α)의 분비유도능에 관한 결과를 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)기법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 6은 실험예 1에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 대식세포에 있어서 interleukin-1β(이하, 'IL-1β'라 함)의 분비유도능에 관한 결과를 ELISA기법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 실험예 1에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 대식세포에 있어서 TNF-α의 분비유도능에 관한 결과를 면역블로팅(immunoblotting) 기법으로 실험한 결과를 나타낸 그림으로, M은 표준 단백질, Con은 대조군(control)을 표시한다.

도 8은 실험예 1에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 대식세포에 있어서 IL-1β의 분비유도능에 관한 결과를 면역블로팅 기법으로 실험한 결과를 나타낸 그림으로, M은 표준 단백질, Con은 대조군을 표시한다.

도 9는 실험예 2에 따라 RT-PCR 기법을 이용하여 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 대식세포에 있어서 TNF-α와 IL-1β의 유전자 발현능에 관한 결과를 나타낸 그림으로, Con은 대조군을 표시한다.

도 10은 실험예 3에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 소장상피세포 (IEC-6)에 있어서 IL-1β의 분비능에 관한 결과를 ELISA기법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 11은 실험예 3에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 소장상피세포 (IEC-6)에 있어서 interleukin-6(IL-6)의 분비능에 관한 결과를 ELISA기법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 12는 실험예 4에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2에 의해 자극된 IEC-6의 배양 상등액이 대식세포에서의 TNF-α의 분비능에 관한 결과를 ELISA기법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 13은 실험예 4에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2에 의해 자극된 IEC-6의 배양 상등액이 대식세포에서의 IL-1β의 분비능에 관한 결과를 ELISA기법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 14는 실험예 5에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2가 오발부민(ovalbumin) 항원에 의한 보조 T 림프구(CD4＋) 및 살해 T 림프구(CD8＋) 증식에 미치는 영향에 관한 FACScan 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 15는 실험예 6에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2가 ovalbumin 항원에 의한 B 림프구 증식에 미치는 영향에 관한 FACScan 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 16은 실험예 7에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2가 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhol limpet hemocyanin, 이하 'KLH'라 함) 항원에 대한 항체생산 유도에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 17은 실험예 8에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 비장세포에 대한 독성유무를 검사한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 18은 실험예 9에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 간조직에 대한 독성유무를 검사(GOT, GPT)한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 19는 실험예 9에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2의 신장조직에 대한 독성유무를 검사(CRE, BUN)한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 20은 실험예 10에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2가 미성숙 마우스에 미치는 독성유무를 체중변화로 검사한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 21은 실험예 10에 따라 본 발명의 추출물 KGA1과 KGA2가 성숙 마우스에 미치는 독성유무를 체중변화로 검사한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 한국산 녹조류인 파래(Enteromorpha)로부터 면역증강용 물질을 추출하는 증류수 추출방법 및 렉틴 분획 추출방법, 이와 같은 방법으로 추출되어 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역증강 효과를 나타내는 파래 추출물(Extract, 이하 '엑스'라 하기도 함) 및 전기 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약제에 관한 것이다.

파래(Enteromorpha)는 독특한 맛과 향을 가진 해산식물의 한 종류로 한국과 일본 등지에서 많이 소비된다. 창자파래(E. intestinalis), 납작파래(E. compressa), 잎파래(E. linza), 가시파래(E. prolifera), 격자파래(E. clathrata) 등이 이에 속하며, 그 밖에 홑파래류(Monostroma)를 포함시키기도 한다. 파래는 인체에 해로운 각종 산(酸)을 없애 주고 담배 성분인 니코틴을 중화시키는데 효과가 있다고 알려져 있다. 한편, 청각(Codium fragile)은 한국의 전연안에 분포하며, 떡청각(C. adhaerens), 구슬청각(C. mamillosum), 개청각(C. dichotomum), 애기청각(C. tenue), 누운청각(C. coarctatum), 뭉우리청각(C. contractum), 밀청각(C. divaricatum), 말청각(C. latum) 등이 이에 속한다. 청각은 주로 수심 1∼20m의 깊은 곳, 파도의 영향을 적게 받는 곳에서 자라며, 식물체는 짙은 녹색을 띠고 차상(叉狀)으로 갈라져 부채꼴이며, 15 ∼ 40cm길이의 몸체는 융처럼 부드럽고, 내부에는 무색 투명한 사상조직이 불규칙하게 엉켜 있다. 클로렐라(Chlorella)는 녹조식물 클로렐라과에 속하는 담수조류로 적당한 조건하에서는 하루에 약 10배나 증가하기 때문에 연간 유기물의 생산량이 벼의 약 8배에 해당하며, 배양조건에 따라서 지방은 20∼80%, 단백질은 90%, 그리고 탄수화물은 37%까지 함량을 높일 수 있어서, 이를 대량으로 배양하여 인간의 식량문제를 해결하려는 시도가 있어 왔다.

그러나, 지금까지의 해조류에 대한 연구는 주로 영양학적인 측면에서 이루어졌으며, 최근에 와서 해조류의 생체 기능성 효과에 대한 연구가 이루어지고 있다. 구체적으로, 해조류 추출물의 항암효과(Perryet al. J. Nat. Prod. (미국) 54(4)978-985. 1992; Inagawa, et al., Chem Pharm Bull (일본) 40(4) 994-997, 1992)와 혈전용해효과(Nishino, et al., Carbohydrate Res(Netherlands) 214(1) 193-197, 1991) 등이 보고되고 있으며, 동물실험에 있어서 해조류가 비루스에 대한 항병성 증가(Babe et al., Proc. Natl. Acad. (미국) 85:6132-6136, 1988), 암발생의 억제효과(Teas, J, Hypotheses, 7:601-613, 1981), 고지혈증의 치료효과(Murata et al. J. Nutr., 129:146, 1998)가 있다는 것이 발표되었다. 그러나, 현재까지 해조류 중에서도 특히 녹조류로부터 추출한 물질이 면역증강 효과를 갖는지에 대해서 나 이러한 녹조류 추출물을 함유하는 면역증강용 약제에 대해서는 보고된 바가 없다.

로만(Roman)에 의해 제시된 면역증강제의 개념은 어떠한 증강물질을 백신과 함께 투여했을 때 백신만을 투여한 경우에 비해 백신의 효과가 더 증진되는 것을 밝혀내면서 알려지기 시작했다(Roman, G., Bull. Soc. Centr. Med. Vet., 101, 277 (1925)). 따라서, 면역증강제란 숙주의 특이 또는 비특이, 세포성 및 체액성 면역반응을 상승시키는 모든 물질을 말하는데(Rajesh K. Gupta et., Vaccine, 11 : 293 (1993)), 최근에 감염이나 종양의 치료에 면역강화가 이용되면서 많은 관심을 불러일으키고 있다. 면역강화에 이용되는 제제들은 특이성에 따라 일반면역강화제와 특이면역강화제로 구분되며, 또 기능에 따라 능동면역강화제와 수동면역강화제로 구분할 수 있다. 면역원성은 없으면서 생체내에서 일어나는 여러가지 면역작용을 상승시키는 면역증강제의 작용방식은 면역증강제에 따라 다양한데, 몇 가지 열거하면, 첫째 항원에 대한 저장효과(depot effect)을 일으키거나, 둘째 대식세포를 활성화하여 그 표면의 항원의 발현량을 증가시킴으로서 림프구에 대한 제시효율을 향상시키고, 셋째 림프구에 대한 특이적 효과(Bomford, R., Clin. Exp. Immunol. 39: 435(1980))를 나타내거나, 마지막으로 항종양효과를 나타낸다.

그러나, 이러한 면역증강제는 그 자체의 독성, 면역반응의 차이 등 여러 가지 부작용으로 인해 현재 인간에게 사용할 수 있는 물질은 극히 제한된 실정이고 그 효능도 매우 미미한 것으로 알려져 면역증강제 개발에 있어서 커다란 장벽이 되어 왔다. 이러한 부작용을 구체적으로 살펴보면, 오일 에멀젼(oil emulsion) 형태의 면역증강제로서 가장 대표적인 프로인트 완전 보조액(Freund complete adjuvant: FCA)은 동물실험결과 주사부위의 강력한 염증반응으로 인한 고통, 발열, 여러기관에서의 전신화된 육아종성증식(generalized granulomatous proliferation)에 의한 영구적 상태, 자가면역질병, 아밀로이드증(amyloidosis), 아쥬번트 관절염(adjuvant arthritis) 및 과민증을 동반하므로 인간에게 사용할 수 없다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 개발된 FIA(Freund's incomplete adjuvant)는 마이코박테리아를 첨가하지 않는 것으로, 항원이 면역담당 세포에 노출되는 시간을 연장함으로서 효과를 얻으려 하였으나, 아데노바이러스 백신(adenovirus vaccine)등에 응용하였을 경우에는 면역반응을 매개하지 못하였을 뿐 아니라 조직 중에 기름이 평생 잔존하며 주사부위의 국소적 발열반응 및 파라핀 오일에 의한 종양의 유기로 인하여 특수한 경우를 제외하고는 인간에 적용하지 못하는 실정이다(Kimura,J. et al., Jpn. J. Exp. Med. 48: 149(1978)). 또한, 무기화합물 면역증강제로 인간에게 허용될 수 있는 면역증강제인 알루미늄은 항원에 결합하여 침전됨으로서 주사부위에서 지속적인 면역반응이 일어나게 하고, 보체를 활성화시킴으로서 B세포의 작용을 높이는 역할을 하지만, 세포성 면역반응에는 영향을 미치지 못하는 것으로 알려져 있다. 또한, 홍반, 피하결절, 접촉성 과민반응, 육아종성 염증 등의 부작용을 수반한다.

한편, 불활성화시킨 박테리아나 박테리아 대사산물이 항원에 대한 면역반응을 상승시킨다는 것은 잘 알려져 있고, 따라서 이들을 면역증강제로 이용하려는 시도는 오랫동안 계속되어 왔다. 그러나, 리포폴리사카라이드(LPS), 마이코박테리아(Mycobacteria spp.), 마이코박테리아성 화합물(Mycobacteria compounds), 코리네박테리움 파룸(Corynebacterium paruum), 코리네박테리움 그래뉼로섬(Corynebacterium granulosum) 등은 그 자체를 항원으로 이용할 경우 부작용을 일으키지 않지만 다른 백신에 대한 면역증강제를 사용할 경우 큰 부작용을 일으키고 있는 실정이다.

따라서, 부작용이 없으면서 유용한 면역증강효과를 나타내는 신물질의 개발은 의약분야에 있어서 대단히 중요한 의미를 가진다. 천연물질로부터 이러한 면역증강효과를 나타내는 물질을 개발한 기존 특허의 예로, 러시아연방 특허 제2125460C1호는 이노노투스 오브리쿠우스 버섯의 추출물이 면역증강 및 강장효과를 가지는 천연물 복합체의 첨가물로서 이용된 경우를 개시하고 있으며, 미국특허 제5547674호는 유럽지역에 서식하는 겨우살이가 동물 및 인간에 대한 임상 실험결과 종양 세포에 대하여 직접, 간접적으로 대응하는 대식세포 및 자연살해세포의 활성을 증가시킴으로서 종양세포의 성장을 억제하여 암환자의 생존율을 높이는 효과를 개시하고 있다. 또한, 한국특허공개 제2003-0028009호는 홍화로부터 분리한 대식세포 활성화 다당류 및 그 제조 방법을, 한국특허 제397793호는 느릅나무로부터 분리된 신규의미생물 및 그를 이용한 항암 면역활성의 세포밖 당화합물의 제조방법 을, 한국특허 제207293호는 황백피와 마타리 식물의 혼합수 추출물을 함유하는 면역증강제 조성물을 각각 개시하고 있다. 그러나, 지금까지 해조류 중 특히 녹조류로부터 면역증강 효과를 나타내는 신물질을 개발한 예는 없었으며, 따라서 바다나 습지에서 쉽게 구할 수 있는 녹조식물로부터 면역활성 효과를 나타내는 유용한 신물질을 추출하여 이를 약제로 개발하는 것은 의약분야에 있어서 시급히 요구되는 사항이다.

이에, 본 발명자들은 천연물질인 녹조류를 대상으로 하여 면역증강 효과를 나타내는 물질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 한국의 해안 또는 습지에서 쉽게 발견할 수 있는 녹조류인 파래, 청각, 클로렐라 등으로부터 증류수 추출방법 또는 렉틴 분획 추출방법에 의해 분리해 낸 추출물이 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역계를 강력하게 자극하여 면역세포를 활성화시키고, 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시킴을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 상기한 바와 같이 기존의 면역증강제의 한계를 극복하여 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역활성 효과를 나타내는 면역증강용 파래 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 한국산 녹조류로부터 면역증강용 파래 엑스를 추출하는 과정인 증류수 추출방법 및 렉틴 분획 추출방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 상기 방법으로 추출된 파래 엑스를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 면역증강용 녹조류 엑스의 추출방법 중 일태양인 증류수 추출방법은 한국산 파래(Enteromorpha)를 4℃의 저온상태에서 분쇄한 후 증류수를 가하여 교반하고 이를 원심분리한 후 상등액을 취하여 동결건조시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 면역증강용 녹조류 엑스의 추출방법 중 다른 태양인 렉틴 분획 추출방법은, (1)한국산 파래를 4℃의 저온상태에서 분쇄한 후 증류수를 가하여 교반하고, (2)이를 원심분리하여 수득한 상등액에 황산암모늄을 가하여 단백질 성분을 침전시키고, (3)상기 분리된 침전물 중의 황산암모늄을 인산염 완충용액(PBS)으로 투석시켜 제거하고, α-락토스-아가로스(α-lactose-agarose) 칼럼에 적용시킨 후 갈락토스(galactose) 용액으로 용출시켜, (4)UV 분광광도계로 280nm에서 흡광도를 나타내는 분획을 분리하여 동결건조시키는 것을 포함한다.

한편, 상기의 방법 중 어느 한 방법에 의해 추출된 본 발명의 면역증강용 녹조류 추출물은 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역활성 효과를 나타내어 면역증강제로서의 용도를 제공한다.

또한 본 발명은, 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역활성 효과를 나타내며, 상기 파래 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역증강용 약제를 또 다른 특징으로 한다. 이와 같은 본 발명의 약제에 있어서, 파래의 함량은 0.01 ∼ 50 중량％이고, 약제의 제형은 정제, 캡슐제 또는 수액제 중 어느 하나인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에는 녹조류로서 파래, 청각 또는 클로렐라가 단독 또는 혼합으로 사용되며, 특히 한국 연안 또는 습지에 서식하는 한국산 파래, 청각, 클로렐라를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 추출방법 중 일태양인 증류수 추출방법으로 추출한 수용성 추출물(Korean Green Algae 1, 이하 'KGA1'이라 함)에는 녹조류에 포함된 수용성 성분, 예를 들면 단백질류, 당류, 일부 지질 및 비타민류 등이 포함되어 있는 것으 로 추정된다.

한편, 본 발명의 추출방법 중 다른 태양인 렉틴 분획 추출방법으로 추출한 렉틴 성분 추출물(Korean Green Algae 2, 이하 'KGA2'라 함)은 그 주성분이 녹조류의 당단백질인 렉틴인 것으로 추정된다. 이와 같은 KGA2는, 상기 KGA1의 추출을 위한 상등액에 황산암모늄을 70%의 농도가 되도록 가하여 교반함으로서 상등액 중의 단백질 성분을 침전시키고 다시 이를 원심분리하여, 회수한 침전물 중의 황상암모늄을 PBS로 투석하여 제거한 후에 α-락토스-아가로스, D-만노스-아가로스, N-아세틸-D-갈락토사민-아가로스 및 N-아세틸-D-글루코사민-아가로스 중 선택된 하나 이상의 칼럼에 적용시킨 후, 컬럼을 PBS로 세척하고 갈락토스, 만노스, N-아세틸-D-갈락토사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 중 하나 이상의 용액으로 용출하여 용출되는 물질중 UV 분광광도계에 의해 280nm에서 흡광도를 나타내는 물질의 분획을 분리하여 동결 건조시킴으로서 수득할 수 있다.

이와 같은 방법으로 추출된 본 발명의 면역증강용 녹조류 추출물 KGA1과 KGA2의 분자량을 알아보기 위한 전기영동 실험 결과, 수용성 성분인 KGA1은 환원상태에서 넓은 범위(15∼100kD)의 단백질 밴드가 관찰되었고, 특히 30kD와 31kD 범위의 단백질이 뚜렷하게 나타났으나, 렉틴 분획인 KGA2에서는 상기 단백질 밴드만 나타났다. 또한, 비환원상태에서 KGA2는 약 61kD인 하나의 밴드만이 나타났다. 이로부터 상기 30kD와 31kD 단백질 밴드의 물질은 이황화결합을 형성하고 있는 이형이합체(heterodimer) 단백질로 판단된다.

본 발명은 또한, KGA1과 KGA2의 신규한 용도를 제공하는데, 하기의 실험예에서 입증되는 바와 같이 KGA1과 KGA2는 마우스에 대한 강력한 면역증강작용을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 추출물인 KGA1과 KGA2를 임상적인 목적으로 면역증강제로서 사용하고자 하는 경우, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 이들 추출물을 유효성분으로 유효량 함유하는 적절한 약제학적 제제 형태로 제형화시켜 이용할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 이들 추출물의 함량은 전체 약제의 0.01 ∼ 50 중량％이 바람직하며, 이러한 목적에 적합한 약제학적 제제로 경구투여를 위해서는 정제, 캡슐제 또는 수액제 등이 바람직하고, 비경구투여를 위한 제제로는 정맥 또는 피하 주사용 액제 또는 현탁제 등이 포함될 수 있겠다. 또한 본 발명에 의한 녹조류 추출물의 임상학적 용량은 환자의 건강상태, 체중, 연령, 성별 등에 따라 달라질 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예 및 실험예에만 한정되는 것이 아님은 당업자에게 있어서 자명한 사실이다.

＜실시예＞

실시예 1: KGA1의 추출 및 물리화학적 특성 조사

1. 파래(Enteromorpha)로부터 수용성 성분 추출

본 실시예에서는 녹조류로서 한국산 파래를 이용하였으며, 수득한 파래를 일광건조하는 것 외에 거의 모든 과정은 물질의 변성을 막기 위해 저온(4℃)에서 이루어졌다. 건조된 파래를 찬 이차증류수(double distilled water)로 2회 세척한 후, 이차증류수를 시료중량 10배로 첨가하여 저온실에 12시간 배양했다. 배양한 후 저온실에서 2분 동안 2회씩 믹서기(솔잎8282A, 대구)로 분쇄한 후 저온실에서 12시간 교반기(제일과학, 서울)를 사용해 저속으로(40V) 교반하였다. 그 후 30분간 원심분리(20,000g, Rotor A6.14, Kontron, 이태리)한 후, 수득한 상등액을 공극크기(pore size)를 달리하는 여과막(60㎛ ∼ 0.45㎛, Millipore)에 통과시킨 후, 폴리마이신-B 컬럼(polymyxin-B column)(Biorad, Hercules, 미국)을 사용해 오염된 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 제거한 후 PBS로 투석하였다. 투석 후 동결건조하여 얻은 연녹색분말을 'KGA1' 이라 칭하였다. KGA1 내의 LPS 잔유량 검사는 Limulus ES II kit(Wako, 일본)으로 검사하였으며, 잔유량은 42 endotoxin units(EU)/ml 이였다. 유럽국가에 있어 시약의 LPS 잔유량 허용범위가 350 EU/ml(Scheer, Arzenimittelforschung, Jul;43(7), 975-800. 1993)인 것을 참조할때, 본 실시예의 KGA1은 허용범위의 1/8 이하에 불과하므로 추후 실험에 있어 아무런 문제가 없었다. KGA1은 다음 실험 때까지 -20℃에 보관하였다.

2. KGA1의 전기영동

전기영동은 Laemmli방법에 따라 환원 및 비환원 폴리아크릴아미드겔을 전기영동기(Hoefer, 미국)에 장착해 이루어졌으며, 간단히 설명하면 다음과 같다. 상기 추출물 KGA1에 대해 16% 분리 겔과 3% 상단 겔을 상용해 수행했으며, 시료는 전기영동 시료완충액에 혼합(시료:시료완충액 = 1:3)한 후 100℃에 5분간 열을 가하였다. 열을 가한 후 얼음물에 2 내지 3분간 배양한 후 시료는 그룹당 30㎕씩 겔에 적용하였으며, 열안정 순환기(thermostatic circulator: LKB, Bromma, 스웨덴)를 이용해 전기영동완충액은 4℃를 유지하도록 하면서 50㎃로 4시간 전류를 흘려 각 시료내의 단백질을 분리하였다. 겔의 염색은 은염색법(silver staining)을 사용해 이루어졌으며, 분리된 단백질은 단백질 표준시약(Sigma, 미국)에 의해 분자량이 측정되었다. 도 1에 나타나 바와 같이 수용성 추출물인 KGA1은 환원상태에서 넓은 범위(15∼100kD)에서 단백질 밴드가 관찰되었으며, 특히 30kD와 31kD 범위의 단백질이 뚜렸하게 나타났다.

3. KGA1의 크로마토그래피

동결건조된 분말 KGA1을 1mg/ml 농도가 되도록 PBS로 녹여 0.45㎛ 여과막(Milipore, 미국)을 이용해 여과하였다. 여과된 KGA1용액을 30㎕ 분취해서 Protein-Pak column(7.8mm x 300mm, 10,000∼300,000 Daltons, Waters, 미국)이 장착된 HPLC(Alliance 2690, Waters, 미국)에 적용하였다. 동상액은 PBS(pH 6)로 하였으며, 유속은 1ml/min하여 UV검출기(Waters 2487, 미국)내에서 흡광도(280nm)를 측정하였다. KGA1 분획을 흡광도 280nm에서 검사한 크로마토그램을 도 2에 나타내었으며, 그 결과는 전기영동에서 얻은 결과와 아주 유사함을 알 수 있었다. 즉, 본 실시예의 KGA1 분획은 단백질류, 당류, 일부 지질 및 비타민류 등 여러 물질이 포 함되어 있음을 추측할 수 있다.

실시예 2: KGA2의 추출 및 물리화학적 특성 조사

1. 파래(Enteromorpha)로부터 렉틴 분획 추출

본 실시예에서는 녹조류로서 한국산 파래를 이용하였으며, 수득한 파래를 일광건조하는 것 외에 거의 모든 과정은 물질의 변성을 막기 위해 저온(4℃)에서 이루어졌다. 건조된 파래를 찬 이차증류수로 2회 세척한 후, 이차증류수를 시료중량 10배로 첨가하여 저온실에서 12시간 배양하였다. 배양한 후 저온실에서 2분 동안 2회씩 믹서기(솔잎8282A, 대구)로 분쇄한 후 12시간 교반기(제일과학, 서울)를 사용해 저속으로(40V) 교반하였다. 그 후 30분 간 원심분리(4℃, 20,000g, Rotor A6.14, Kontron, 이태리)한 후, 수득한 상등액을 Whatman filter(NO2(11㎛), NO3(6㎛), NO5(2.5㎛))로 순차적적으로 여과한 후 황산암모늄을 70%의 농도가 되도록 가하여 저온실에서 4시간정도 저속으로 교반배양하였다. 교반배양 후 30분간 원심분리한 후 얻은 침전물에 PBS(인산염 완충용액)을 첨가하여 투석여과막(Spectra/Por-CE, MWCO 3,500)에 주입한 후 PBS로 저온실(4℃)에서 6시간씩 교환하면서 4회 투석하여 황산암모늄을 제거시켰다. 투석한 용액을 원심분리(10,000g, 30분, 4℃)한 후 상층액을 동결건조하여 -20℃에 보관하였다. 동결건조된 연녹색분말을 PBS로 녹여 0.45㎛로 여과한 후 α-락토스-아가로스 칼럼에 적용시켜 1시간 반동안 고정시켰다. 고정 후 찬 PBS로 세척하고, 0.1M의 갈락토스 용액으로 용출시켜 280nm의 UV분광계로 흡광도를 측정하였다. 피크가 높은 분획을 회수하여, 갈락토즈를 제거하기 위해 투석여과막(Spectra/Por-CE, MWCO 3,500)에 주입한 후 이차증류수로 저온실(4℃)에서 6시간씩 교환하면서 4회 투석하였다. 투석한 후, 원심분리(10,000g, 30분, 4℃)하여 상층액을 polymyxin-B column(Biorad, Hercules, USA)을 사용해 오염된 lipopolysaccharide(LPS)를 제거한 후 PBS로 투석하였다. 투석 후 동결건조하여 수득한 분말을 'KGA2'라 칭하였다. KGA2 내의 LPS 잔유량 검사는 Limulus ES II kit(Wako, 일본)로 검사하였으며, 잔유량은 40 endotoxin units(EU)/ml 였다. 유럽국가에 있어 시약의 LPS 잔유량 허용범위는 350 EU/ml이므로, 본 실시예의 KGA2는 허용범위의 1/8.8 이하에 불과해 추후 실험에 아무런 문제가 없었다. KGA2는 다음 실험 때까지 -20℃에 보관하였다.

2. KGA2의 전기영동

상기 추출물 KGA2에 대한 전기영동은 상기 실시예 1의 KGA1의 전기영동 실험과 동일한 방식으로 진행되었으며, 특히 비환원 겔은 환원을 위해 사용하는 물질을 사용하지 않았으며, 비환원 겔에 적용하는 시료는 열을 가하지 않았고 환원물질도 첨가하지 않았다. 이와 같은 전기영동의 결과를 살펴보면 도 1에 나타나 바와 같이 30kD와 31kD 범위의 단백질 밴드만 나타났다. 또한, 비환원상태에서 KGA2는 약 61kD인 하나의 밴드만이 나타났다. 이로부터 상기 30kD와 31kD 단백질 밴드의 물질은 이황화결합을 형성하고 있는 이형이합체(heterodimer) 단백질로 판단된다.

3. KGA2의 크로마토그래피

상기 추출물 KGA2에 대한 크로마토그래피는 상기 실시예 1의 KGA1의 크로마토그래피 실험과 동일한 방식으로 진행되었으며, KGA2 분획에 대한 흡광도 280nm에서의 크로마토그램을 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이 전기영동에서 얻은 결과와 아주 유사하며, 따라서 KGA2 분획은 단일 단백질인 이형이합체(33kD와 32kD)인 것으로 판명되어졌다.

4. KGA2의 적혈구 응집반응을 통한 렉틴 확인

KGA2가 렉틴으로서의 기능을 가지는지에 대해 조사하고자 B형 적혈구 응집반응을 실시하였다. 간단히 설명하면, 먼저 B형 적혈구를 취하여 PBS에서 2%가 되게 현탁시킨 후 정해진 농도의 KGA2와 96 well round microtiter plate에서 1시간 동안 배양하여 응집을 위해 요구되는 최소의 농도를 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이 한국산 녹조류 추출물인 KGA2는 렉틴들이 가지는 적혈구 응집작용을 나타냈으며, 이때 응집 최소 농도는 10㎍/㎖였다. 따라서, 본 발명의 KGA2를 한국산 녹조류 렉틴(Korean Green Algae Lectin)으로 칭하기로 한다.

＜실험예＞

본 실험예에서는 상기의 실시예 1에 의한 KGA1과 실시예 2에 의한 KGA2의 (1)일차면역 반응세포인 대식세포로부터 TNF-α의 분비유도능 및 IL-1β의 분비유도능 (2)RT-PCR을 이용한 대식세포에 있어 TNF-α와 IL-1β의 유전자 발현능 (3)소장상피세포들로부터 면역활성인자 사이토카인 IL-1β와 IL-6의 분비능 (4)소장상피 세포와 대식세포의 상호작용에 미치는 면역능 (5)말초혈액내 T-림프구의 증가능 (6)말초혈액내 B-림프구의 증가능 (7)항원 KLH에 대한 항체생산능 (8)정상세포에 대한 세포독성유무검사 (9)생체에 미치는 독성검사를 위해 독성에 민감한 장기인 간과 신장에 미치는 영향 (10)안정성 검사를 위해 미숙한 혹은 성숙한 마우스의 체중증감 효과를 조사하였다.

실험예 1: KGA1과 KGA2의 일차면역 반응세포인 대식세포(Macrophage)부터 TNF-α의 분비유도능과 IL-1β의 분비유도능에 대한 실험

상기 실시예 1 및 2에 의한 각 추출물 KGA1과 KGA2가 면역계의 일차적인 면역반응에 주요한 대식세포의 활성화에 미치는 영향을 검사하였다. 본 실험예에서는 대식세포 활성화의 지표로서 대식세포가 분비하는 주요한 사이토카인인 종양괴사인자인 TNF-α의 분비유도능과 T-림프구 및 B-림프구의 증식, 분화, 활성화에 관여하는 IL-1β의 분비유도능을 검사하였다. 대식세포를 추출하기 위해 사육된 동물은 6∼10주령의 Balb/c 마우스였으며, 2개월 이상 배양된 티오글리콜레이트 배지 (thioglycollate medium; Gibco, 미국)을 마우스에 투여한지 4일 후 마우스를 경추 탈골시켜 희생시켰다. 희생시킨 마우스의 복강에 incomplete RPMI-1640 medium(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 추가, Gibco, 미국)을 주입하여 복강 내에 있던 대식세포를 추출하고 원심분리한 후, 24 well plate에 1×10⁶ cell/well으로 분주하였다. 이것을 약 1시간 가량 CO₂ 배양기에서 배양한 후, 플레이트에 부 착하지 않은 세포와 다른 부유물들을 incomplete RPMI-1640을 사용하여 2번 세척하였다. 그 후 1.5㎖/well complete RPMI-1640 medium(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소태아 혈청(FBS)을 추가, Gibco, 미국)을 주입하고 3일간 CO₂ 배양기(100% 습도, 37℃, 5％ CO₂)에서 배양하였다. 대식세포의 순수도 측정은 부착된 세포들을 분리한 후, Cytospin-Ⅲ(500rpm, 5분)을 이용해 슬라이드 글라스에 부착시켜 Wright's and Giemsa 염색법으로 염색하여 측정하였으며, 순수도는 95%이상이었다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 incomplete RPMI-1640 배지조건하에서 대식세포들을 KGA1과 KGA2를 농도별 및 시간별로 자극시켰다. 이때 양성대조군으로는 기존에 잘 알려진 LPS(10㎍/㎖, Sigma, 미국)를 사용하였다. 자극을 위한 배양이 끝난 즉시 각 배양액을 채취한 후 원심분리(1000g, 4℃, 5분)하여 배양상등액을 수거하여 ELISA kit(Chemicon, 미국)을 사용해 배양상등액에 존재하는 TNF-α와 IL-1β의 양을 조사하였다. ELISA kit에 의한 검사결과를 재검증하기 위해 면역블로팅(immunoblotting) 방법을 이용해 검증하였다.

(1) ELISA를 이용한 TNF-α와 IL-1β assay

준비된 5종류의 TNF-α와 IL-1β 표준용액(standard solution)을 96 well(precoated with rat anti-마우스 TNF-α와 IL-1β)에 100㎕ 넣었고, 100㎕ 대식세포 배양상등액을 각 designed well에 넣었다. 그 후 1차 항체(primary antibody)인 rabbit anti-마우스 TNF-α와 IL-1β 각각 25㎕을 pre-coated 96well에 첨가하여 믹싱한 뒤, 4시간 동안 실온에서 배양한 후, 세척 완충액(250㎕/well) 로 5번 세척하였다. 그 후 2차 항체(second antibody)인 50㎕ goat anti-rabbit conjugated alkaline phosphatase를 pre-coated 96well 넣어 45분간 배양하였고, 세척 완충액(250㎕/well)로 5번 세척한 후, color reagent 200㎕을 pre-coated 96well에 넣고 각 well별로 차별성이 있는 붉은 색깔이 나타나면(약 35분간 배양) 정지용액(stop solution) 50㎕를 넣어 color reagent의 반응을 고정시키고, 490nm에서 ELISA reader(Bio-tek, 미국)로 측정하여 TNFα와 IL-1β의 양을 분석하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 도 5 및 도 6에 도시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 KGA1과 KGA2는 대식세포 자극제로서 우수한 효과를 가짐이 입증되었으며, 대식세포 활성화에 있어서 농도에 의존하는 경향을 보였다. 또한, KGA1 분획의 최고 효과적인 농도는 300㎍/㎖였고, KGA2 는100㎍/㎖였다. 이 두 발명물질은 TNF-α분비에 있어서는 양성대조군으로 사용한 세균내독소인 LPS보다는 낮았지만(도 5), IL-1β분비에 있어서는 비슷했다(도 6). 이 두 발명물질이 TNF-α의 분비작용에 있어서 LPS보다는 약한 작용을 하는 것은 생체 면역반응에 있어서 아주 좋은 현상으로, 적당한 TNF-α분비는 생체방어기전에 유익하지만, 과다한 분비는 생체에 치명적인 Septic shock을 일으키게 하는 등 부작용이 크기 때문이다.

(2) 면역블로팅을 이용한 TNF-α와 IL-1β assay

본 실험예에서는 도 5 및 도 6의 ELISA 기법에 의한 결과가 확실한 것인지 그리고 이후 모든 실험을 ELISA 실험기법에서 얻은 결과만으로 의심 없이 결론을 내릴 수 있는 지 등을 검증하기 위해 면역블로팅 기법을 이용하여 재검사하였다. 실험과정을 간단히 설명한다면 다음과 같다. 0.1% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 분리겔과 상단겔은 각각 16%, 3%였으며, 전기영동시 current는 55mA(Powersupply, Pharmacia; Uppsala, 스웨덴), 온도는 cooling system (LKB; Bromma, 스웨덴)으로 4℃를 유지하면서 약 4∼5시간 running하였다. 여기에 사용된 전기영동 system은 Hoefer SE 600(Hoefer-Pharmacia, 미국)제품을 사용하였다. 전기영동이 끝난 겔은 transfer buffer(39mM glycin 2.9g, 48mM tris-base 5.8g, 0.037% SDS, 20% methanol; pH8.3)에 미리 적셔진 nitrocellulose membrane(NC)을 올려놓은 후 fiber pad에 넣고 조립하였다. 그 후 immunoblotting transfer cassette를 nitrocellulose membrane이 양전하 방향으로, 겔이 음전하 방향으로 오게 하여 transfer chamber에 넣었고, current는 1A, 온도는 cooling system으로 4℃를 유지하면서 1시간 30분간 transfer시켰다. 그 후, NC는 blocking buffer(5% nonfat dry milk in TBS-T (20mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20) 약 200㎖에 1시간 동안 Red-Rocker(Hoefer, 미국)에서 rocking하여 항체의 비특이적 결합(non-specific binding)을 blocking한 후, TBS-T buffer로 다시 세척(15분간 1회, 10분간 2회)하였다. 그 후, 3㎖ TBS-T buffer를 siliconized bottle에 분주하고 여기에 rabbit anti-murine TNF-α polyclonal 1차 항체(500㎍/1.5㎖ in PBS) 30㎕(1:300 dilution)와 rabbit anti-mouse IL-1β polyclonal 1차 항체(10㎍/200㎕ in PBS) 30㎕(1:2000 dilution)를 각각 첨가한 후, NC를 siliconized bottle에 넣었고 4℃, hybridization incubator(Robbins, 미국; speed 10rpm)에서 12시간동안 배양하였다. 그 후, 70㎖ TBS-T로 20분간 각각 3번 hybridization incubator(speed : 12rpm)에서 씻어낸 후, 2차 항체(goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody; stock solution-0.02mg/4㎖ in PBS)를 3㎖ TBS-T에 30㎕(1:20,000 dilution)를 첨가하여 4℃, hybridization incubator에서 3시간 동안 배양하였고, 70㎖ TBS-T로 20분간 각각 4번 씻어내었다. 그 후, NC를 얇고 투명한 비닐에 넣고 ECL(peroxidase substrate) reagents 1과 2를 50%씩 혼합한 3㎖을 NC에 분주한 후, 5분간 배양하였다. 그 후, 암실(10W safety lamp; Kodak, USA)에서 NC가 들어있는 cassette에 X-ray film을 넣고 5분 또는 10분 이상 감광 시킨 후 X-ray film을 현상용 box의 develop solution에 약 3분간 넣고 반응시켰다. 그 후, 이 X-ray film을 다시 물에서 2분간 washing한 후, fixing solution에서 3분간 반응시키고 다시 2분간 물로 washing 하고 난 뒤 band를 분석하였다. 도 7 및 도 8에 나타난 결과로 알 수 있는 바와 같이 ELISA기법에서 얻은 결과 즉 추출물 KGA1과 KGA2가 대식세포을 활성화시켜 사이토카인 TNF-α와 IL-1β를 분비하게 한다는 것을 재확인했다. 이러한 실험결과로서 추후 실험에서 검사한 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6 측정은 ELISA기법만으로 수행하기로 하였다.

실험예 2: RT-PCR를 이용한 KGA1과 KGA2의 대식세포에 있어 TNF-α와 IL-1β의 유전자 발현능에 대한 실험

상기 실시예 1 및 2에 의한 추출물 KGA1과 KGA2가 면역계의 일차적인 면역반응에 주요한 대식세포의 활성화의 지표인 TNF-α의 유전자 발현유도능과, T-림프구 및 B-림프구의 증식, 분화, 활성화에 관여하는 IL-1β의 유전자 발현유도능을 검사하였다.

(1) Total RNA분리

실험과정을 간단히 기술하면 다음과 같다. 상기의 마우스 대식세포 분리과정에서 얻은 대식세포를 6 well plate(3x10⁶/well; Falcon, 미국)에 도말하여 complete RPMI-1640(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소태아 혈청을 추가, Gibco, 미국)를 사용해 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 incomplete RPMI-1640 배지조건하에서 대식세포들을 KGA1과 KGA2로 자극시켰다. 자극이 끝난 후, 찬 PBS로 2회 씻고 PBS를 제거한 후 각 well에 1ml의 Trisol을 투여하고 5분간 항온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, Trizol로 녹인 세포용액을 3회 pipetting을 한 후 E-tube에 넣고, 0.2㎖ 클로로포름을 첨가한 후, 10초 정도 vortex하고 충분히 믹싱하여 원심분리하였다.(12,000 rpm/60min, 4℃). Total RNA층인 상층액만을 떠내 E-tube에 옮긴 후, cold 100% isoprophanol을 넣은 후 적어도 하루 침전을 시키고, 다시 같은 조건에서 20분 정도 원심분리를 한 다음 supernatant을 버렸다. 순수한 total RNA를 분리하기 위해 상기 과정을 반복하였다. 그 후, 75% E-OH을 넣고 손으로 잘 믹싱해서 원심분리를 한 후 원심분리가 끝나면 supernatant을 버리고 0.1% DEPC-H₂O을 넣고 65℃에서 10분간 가열한 후 -20℃에서 다음 사용할 때까지 저장하였다.

(2) RT-PCR

이하 모든 primer는 주식회사 바이오니아(청원, 충북)에 의뢰 주문해 합성했다. TNF-α의 forward primer는 5'-GGCAGGTCTTTGGAGTCATTGC-3'이고, reverse primer는 5'-CATTCGAGGCTCCAGTGAATTCCAG-3'이였다. IL-1β forward primer는 5'-ATGGCCAACTGTTCCTGAACTCAAC-3'이고 IL-1β reverse primer는 5'-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3'였다. β-actin forward primer는 5`-CAAAGAAAATGGACGCCGCCGAACTTGG-3`이고 β-actin reverse primer는 5`-CCTGCTTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG-3`였다. cDNA를 합성하기 위해 5x reverse transcriptase buffer, 2.5mM dNTP, 500ng primer/㎕, 200U/㎕ MMLV resverse trancriptiase(Takara, 일본), total RNA, 0.1% DEPC treated DDW를 사용하여 reaction mixture를 준비하였다. 이때 사용한 primer는 reverse primer였다. 그 후, 42℃에서 30분간 배양, 75℃에서 30분간 배양을 하여 cDNA를 얻고, Reverse transcription반응과정에서 생성된 cDNA가 있는 RT mixture, 10x Taq polymerase buffer, 2.5mM dNTP, forward primer(25pmol/㎕), reverse primer(25pmol/㎕), Taq polymerse(2.5units/㎕; Takara, 일본), DDW을 잘 섞은 후 반응조건 95℃에서 30초 55℃에서 1분 72℃에서 30초를 30 cycle로 하여 cDNA를 증폭하였다. 검사결과는 도 9에 나타내었으며, 도시된 바와 같이 본 발명의 추출물인 KGA1과 KGA2는 TNF-α와 IL-1β의 유전자발현 효과가 우수함을 보여준다. 또한, ELISA(도 5 및 6)와 면역블로팅(도 7 및 8)에서 얻은 결과와 같이 KGA2가 KGA1보다 강한 면역활성을 보임을 알 수 있었다. 또한, 실험예 1의 ELISA와 면역블로팅의 결과 및 결론들을 재입증해 주었다.

실험예 3: KGA1과 KGA2의 소화기면역계통에 주요한 소장상피세포들로부터 면역활성인자 시토카인 IL-1β와 IL-6의 분비능에 대한 실험

약물이란 주사제로서의 효과도 중요하지만 경구투여제로서의 약리효과도 매우 중요한다. 본 발명 추출물인 KGA1과 KGA2가 경구면역촉진제 즉 소화기면역활성제로서 면역효능을 알아보기 위한 목적으로 이 실험을 수행했으며, 이를 위해 KGA1과 KGA2가 소화기면역계에 주요한 장상피세포의 활성화에 미치는 영향을 검사하였다. 본 실험에 사용된 소장상피세포는 쥐 소장상피세포인 IEC-6(intestinal epithelial cell-6, ATCC CRL-1592)였으며, 이 IEC-6의 활성화의 지표로서 T-림프구, B-림프구, NK 세포의 증식, 분화, 활성화에 관여하는 IL-1β와, T-림프구, B-림프구, 대식세포의 증식, 분화, 활성화에 관여하는 IL-6의 분비유도능을 검사하였다. IEC-6을 24 well plate에 분주하여 세포가 well 바닥에 완전히 깔리도록(confluent condition) 3일정도 complete DMEM(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소태아 혈청을 추가, Gibco, 미국)으로 배양하였다. 배양이 끝난 후, 배양배지를 제거하고 새로운 incomplete DMEM(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 추가, Gibco, USA) 배지조건하에서 대식세포들을 KGA1과 KGA2를 농도별 및 시간별로 자극시켰다. 이때 양성대조군으로는 기존에 잘 알려진 LPS(10㎍/㎖; Sigma, USA)를 사용하였다. 자극을 위한 배양이 끝난 즉시 각 배양액을 채취한 후 원심분리(1000g, 4℃, 5분)하여 배양상등액을 수거하여 ELISA kit(Chemicon; Temecula, CA, USA)을 사용해 배양상등액에 존재하는 IL-1β와 IL-6의 양을 조사하였다. ELISA kit에 의한 검사결과의 신뢰도가 대식세포의 실험에서 높게 입증되었기에 이 실험결과에 대한 면역블로팅과 RT-PCR에 의한 재검증은 생략하였다. 준비된 5종류 의 IL-1β와 IL-6의 표준용액을 96 well(precoated with rat anti-mouse IL-1β와 IL-6)에 100㎕ 넣었고, 100㎕ IEC-6의 배양상등액을 각 designed well에 넣었다. 그 후 1차 항체인 rabbit anti-mouse IL-1β와 IL-6를 각각 25㎕을 pre-coated 96well 에 첨가하여 믹싱한 뒤, 4시간 동안 실온에서 배양한 후, 세척 완충액(250㎕/well)으로 5번 세척하였다. 그 후, 2차 항체인 50㎕ goat anti-rabbit conjugated alkaline phosphatase를 pre-coated 96well 넣어 45분간 배양하였고, wash buffer (250㎕/well)로 5번 씻어낸 후, color reagent 200㎕을 pre-coated 96well에 넣고 각 well별로 차별성이 있는 붉은 색깔이 나타나면(약 35분간 배양) stop solution 50㎕를 넣어 color reagent의 반응을 고정시키고, 490nm에서 ELISA reader로 측정하여 IL-1β와 IL-6의 양을 분석하였다. 결과는 도 10 및 도 11에 나타내었으며, 도시된 바와 같이 본 발명 추출물인 KGA1과 KGA2가 장기면역(gut immunity)에서 주요한 세포인 소장상피세포(IEC-6)를 활성화시켰으며, 활성화의 표지인 IL-1β(도면 10)와 IL-6(도면 11)를 많이 분비하게 했음을 알 수 있다. 이 두 사이토카인은 1차면역세포인 T림프구, B 림프구, 각종 항원제공세포들을 활성화시키는 물질이기에, 본 발명물질이 소장상피세포로 하여금 이들 사이토카인들을 많이 분비하게 함으로서 장기면역을 증가시킨다고 판단되었다.

실험예 4: KGA1과 KGA2가 소화기면역계통에 주요한 소장상피세포와 대식세포의 상호작용에 미치는 면역능에 대한 실험

소장상피세포 부위에는 생체방어를 위한 체액성과 세포성 면역활성을 위해 많은 항원제공 세포들이 있는데 이 중에서 대식세포가 중요한 항원제공세포이다. 따라서, 소장상피세포가 상기 실험예 3에서 본 것처럼 본 발명 추출물에 의해 활성화된다면 연이여 대식세포활성화에 기여하는지도 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다. 실험예 3에서 얻은 IEC-6 배양상등액을 대식세포에 자극시킨 후 각 배양액을 채취하여 원심분리(1000g, 4℃, 5분)하고 배양상등액을 수거하여 ELISA kit(Chemicon, 미국)을 사용해 배양상등액에 존재하는 TNF-α와 IL-1β의 양을 조사하였다. 도 12 및 도 13에 도시된 바와 같이 본 발명 추출물에 의해 자극된 IEC-6 세포의 배양액이 대식세포로부터 TNF-α(도 12)와 IL-1β(도 13)를 분비하게 했다. 실험예 3과 본 실험예의 결과들을 종합해보면 본 발명의 추출물은 면역증강용 경구투여제로서도 훌륭한 역할을 할 수 있음을 예시해 주었다.

실험예 5: KGA1과 KGA2의 말초혈액내 T-림프구의 증가에 대한 효과

평상시에 조직이 아닌 혈관에 존재하는 T-림프구의 활성화에 본 발명물질이 어떠한 효과를 가지고 있는지 알아보기 위해 그리고 생체외가 아닌 생체내에서 어떻게 기여하는지 알아보기 위해 본 실험을 실시하였다. Ovalbumin을 항원으로 하여 6주령-마우스(Blab/c; 대한실험동물센타, 음성)에 마우스당 ovalbumin 30㎍을 단독으로 또는 ovalbumin 30㎍과 KGA1 50㎍ 또는 KGA2를 피하주사하였다. 주사 7일 후에 마우스를 경추탈골하여 희생하여 무균상태에서 비장을 수거하였다. 얼음을 이용하여 PBS를 4℃로 유지하면서 homogenizer(Daunce, 미국)를 이용해 비장으로부터 세포를 분리하였다. 분리한 후 anti-CD4 antibody-FITC(Serotec, UK)와 anti-CD8 antibody-PE(Serotec, 영국)를 세포에 loading하고 1시간 배양한 후 2회 원심분리하여 PBS로 씻은 후, FACScan(Becton and Dickinson, 미국)을 이용하여 T-림프구 수를 검사하였다. 그 결과는 도 14에 나타내었으며, 도시된 바와 같이 본 발명 추출물인 KGA1과 KGA2가 외부 항원, 즉 ovalbumin이 투여되었을 때 보조 T 림프구(helper T cell)와 살해 T 림프구(cytotoxic/suppressive T cell)를 증가시켰음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명물질이 병원체 감염시 보조 T 림프구와 살해 림프구를 활성화 시키고 증식시켜 세포성 및 체액성 면역을 활성화함을 예시해 주고 있다.

실험예 6: KGA1과 KGA2의 말초혈액내 B-림프구의 증가에 대한 효과

특히 보조 T 림프구의 활성화는 B 림프구의 활성화를 불러오기에 상기 실험예 5에서 보여 준 결과가 연쇄 면역반응을 일으키는지 알아보기 위해 본 발명물질인 KGA1과 KGA2를 투여한 후 B 림프구의 증감을 조사하였다. 특히 B 림프구는 비장에 많이 모여 있으므로 비장을 이용해 검사하였다. Ovalbumin을 항원으로 하여 6주령-마우스(Blab/c; 대한실험동물센타, 음성)에 마우스당 ovalbumin 30㎍을 단독으로 또는 ovalbumin 30㎍과 KGA1 50㎍ 또는 KGA2 1㎍을 피하주사하였다. 주사 7일 후에 마우스를 경추탈골하여 희생하여 무균상태에서 비장을 수거하였다. 얼음을 이용하여 PBS를 4℃로 유지하면서 homogenizer(Daunce, 미국)을 이용해 비장으로부터 세포를 분리하였다. 분리한 후 anti-mouse CD40 antibody-PE(Serotec, 영국)를 세포에 loading하고 1시간 배양한 후 2회 원심분리하여 PBS로 씻은 후, FACScan(Becton and Dickinson, 미국)을 이용하여 B-림프구 수를 검사하였다. 그 결과는 도 15에 대조군, KGA1 투여군, KGA2 투여군으로 나타내었으며, 도시된 바와 같이 KGA1과 KGA2가 대조군(ovalbumin 단독투여)보다 B 림프구를 많이 증가시키고, 또한 KGA2가 KGA1보다 더 좋은 효과를 보였음을 알 수 있다.

실험예 7: KGA1과 KGA2의 항원 keyhol limpet hemocyanin (KLH)에 대한 항체생산능에 대한 실험

항체 생산에 있어 다당류인 항원 외에는 보조 T cell에 의존성이다. 그러면 본 발명 단백질(KGA2) 혹은 단백질과 여러 혼합물질(KGA1)이 T cell 의존성 항체생산에 관여할 것으로 판단되어, 상기 실험예 5 및 6에서 보여준 바와 같이 KGA1과 KGA2가 T, B 림프구들을 활성화시키고, 또한 실험예 1 및 2 등에서 본 바와 같이 주요한 항원제공세포인 대식세포도 활성화시시켜 항체생산에 많이 기여하리라 예견하고, 본 실험을 수행하였다. 본 발명 추출물인 KGA1과 KGA2의 항원에 대한 특이적 면역능의 증진효과를 조사하였다. 이 실험은 항원특이적인 면역반응에 관한 것으로서, 특히 항체 생산과 관련이 있는 B세포에 의한 체액성 면역반응(humoral immune response)에 미치는 영향을 조사한 것이다. 즉, KLH를 항원으로 하여 Blab/c 마우스(6 주령)에 마우스당 KLH 20㎍을 단독으로 하는 대조군과 KLH 20㎍과 KGA1 50㎍ 또는 KGA2 1㎍을 혼합해 피하주사로 투여한 실험군으로 나눈 후, 각 주별로 마우스의 혈청을 채취하여 혈청중의 KLH에 대한 항체의 역가(titer)를 ELISA법으로 측정하였다. 항원 KLH, 혈청, 효소(HRP, Horse raddish peroxidase)가 부착된 2차 항체 rabbit-anti-mouse IgG-HRP, 이 효소에 대한 기질인 ABTS (2,2-azinobis (3-ethylben- zthiazolinesulfonic acid))를 이용한 ELISA에서 항체의 역가를 구하였다. 항체의 역가는 대조군보다 2배 이상의 발색광을 나타내는 최대 희석비로 결정하였다. 항체역가는 도 16에 도시된 바와 같이 부스터 주사는 2주 후에 1차와 같이 시행하였으며 부스터 3∼5주후에는 KLH 단독투여한 대조군에 비해서 약 90 ∼180배 가량의 높은 항체역가를 보였다. 그리고 항체역가 상승에 대한 지속성을 최초 주사 후 최소한 10주까지는 대조군에 비하여 유의하게 증진된 결과를 보였다. 그리고 B세포에 관련된 체액성 면역의 상승효과에는 KGA2가 KGA1보다 더 높았다.

실험예 8: KGA1과 KGA2의 정상세포에 대한 세포독성유무검사를 위한 실험

본 발명 추출물이 세포성 및 체액성 면역에 우수한 효과가 있다하여도 생체내에 독성이 있으면 안된다. 따라서, 하기와 같이 세포 독성에 대한 안정성 검사를 실시하였다. 본 추출물인 KGA1과 KGA2가 정상세포에 대한 세포독성 유무를 알기 위해 마우스의 비장세포를 가지고 연구를 수행하였다. 세포독성검사 방법은 다음과 같다. 7 주령의 Balb/c 마우스(대한실험동물센타, 음성)를 경추탈골해서 희생시킨 후, 비장을 무균상태에서 회수하여 cold incomplete RPMI-160 medium((100U/ml 페니실린-스트렙토마이신 추가, Gibco, 미국)로 2회 씻은 후, cold incomplete RPMI-160 medium을 첨가하여 Daunce 균질기(Wheaton, 미국)로 하나의 세포를 만든 후 얼음물에 10분간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 상층만 수집하여 원심분리(1000g, 5분, 4℃)한 후 상등액을 버리고 세포를 수득하였다. 비장세포를 96-well 플레이트(1.5x10⁵splenocytes/well; Falcon, 미국)에 분주하여 complete RPMI-1640 배지액(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소태아 혈청을 추가, Gibco, 미국)으로 배양하였다. 배양 1시간 후, B 및 T 세포의 자극물질(mitogen)로 알려진 ConA (Concanavallin A)를 10㎍/㎖가 되도록 각 well에 첨가하였다. 그리고 각 well에 시료로서 KGA1과 KGA2를 농도별로 첨가하고 3일간 배양하였다. 비교구에는 KGA1 또는 KGA2를 첨가하지 않고 3일간 배양하였다. 3일간 배양 후 현미경하에서 관찰한 사진을 도 17에 나타내었다. 도 17에 도시된 바와 같이 검사결과는 본 발명 추출물이 높은 농도(100㎍/㎖)에서도 정상세포에 세포독성효과가 없음을 보여주었다.

실험예 9: KGA1과 KGA2의 생체에 미치는 독성검사를 위해 독성에 민감한 장기인 간과 신장에 미치는 영향을 알기 위한 실험

상기 실험예 8에서 보여준 KGA1과 KGA2의 세포독성결과만으로 안정성에 안심할 수 없어 다음과 같이 생체 신진대사와 독성에 민감한 주요한 장기인 간 및 신장에 대한 검사를 실시하였다. 신장기능은 CRE(blood creatin)와 BUN(blood urea nitrogen)의 혈중농도를 측정하여 조사하고, 간기능은 간세포가 함유하는 GOT(glutamic-oxalacetate transaminase)와 GPT(glutamic pyruvic transaminase)의 두 효소의 혈중농도를 측정하였다. 7주령의 마우스(Balb/c; 대한동물실험센타, 음성)에 실험군에는 KGA1과 KGA2의 분획 10㎍과 100㎍을 0.01M PBS 1㎖에 용해시켜 정맥에 2㎖ 투여하고, 정상군에는 PBS 2㎖만을 투여하여 동일한 실험을 수행하였 다. 정맥주사 1, 2, 5, 10일 후에 마우스의 눈으로부터 채혈해서 얻은 혈청 10㎕를 다층필름(multilayerfilm)상에 취하고, 후지 드라이 켐 시스템(Fugi Dry Chem System; Fugi Photo Film Co., Ltd., 일본)을 이용해 CRE, BUN, GOT, GPT를 측정하였다. 검사결과는 도 18 및 19에 나타내었으며, 도시된 바와 같이 본 발명의 KGA1과 KGA2의 분획은 GOT, GPT, CRE, BUN들의 혈중농도가 정상군에 비하여 유의한 차이를 보이지 않았으므로, 본 발명 추출물인 KGA1과 KGA2가 두 장기 세포에 유해한 독성영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

실험예 10: KGA1과 KGA2의 안정성 검사를 위해 미성숙 쥐 혹은 성숙한 쥐의 체중증감조사

본 발명 추출물인 KGA1과 KGA2의 안정성 검사의 한 일환으로 신체발육에 미치는 영향을 알기 위해 미성숙한 쥐 혹은 성숙한 쥐의 체중증감조사를 실시하였다. KGA1과 KGA2를 300㎍/㎖ 농도가 되도록 0.01M PBS에 녹여 생후 1일째의 미성숙 마우스는 피하주사하고, 생후 7주령된 성숙 마우스는 복강내 주사하였다. 본 실험에서 대조군은 0.01M PBS를 피하주사 혹은 복강내 주사하였다. 검사 결과는 도 20(미성숙 쥐) 및 도 21(성숙 쥐)에 나타내었으며, 도시된 바와 같이 대조군보다 유의한 차이를 보이고 않았으므로, 본 발명 추출물인 KGA1과 KGA2는 신체발육에 유해한 독성영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 한국산 녹조류로부터 추출한 녹조류 엑스 KGA1 및 KGA2는 면역계를 강력하게 자극시키는 효과가 있을 뿐만 아니라 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시키는 효과가 있으며, 정상세포에 대해서는 세포독성이 없어 면역증강용 신약으로 유용하게 이용될 수 있을 것이며, 또한 본 발명의 추출방법은 다른 자원으로부터 면역증강제 및 유사물질을 추출하는데 필요한 추출 및 분리기법을 확립하는데 유용하게 이용될 수 있다.

한편, 상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (7)

1. 한국산 파래(Enteromorpha)를 4℃의 저온상태에서 분쇄한 후 증류수를 가하여 교반하고 이를 원심분리한 후 상등액을 취하여 동결건조시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 한국산 파래 엑스의 추출방법.
2. 제1항의 방법으로 추출되어, 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역활성 효과를 나타내는 면역증강용 한국산 파래 추출물.
3. (1) 한국산 파래를 4 ℃ 저온상태에서 분쇄한 후 증류수를 가하여 교반하고,

   (2) 이를 원심분리하여 수득한 상등액에 황산암모늄을 가하여 단백질 성분을 침전시키고,

   (3) 상기 분리된 침전물 중의 황산암모늄을 인산염 완충용액으로 투석시켜 제거하고 α-락토스-아가로스 칼럼에 적용시킨 후, 갈락토스 용액으로 용출시켜,

   (4) 분광광도계로 280nm에서 흡광도를 나타내는 분획을 분리하여 동결건조시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 한국산 파래 엑스의 추출방법.
4. 제3항의 방법으로 추출되어, 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역활성 효과를 나타내는 면역증강용 한국산 파래 추출물.
5. 정상세포에 대한 세포독성 없이 면역활성 효과를 나타내며, 제2항 또는 제4항의 한국산 파래 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역증강용 약제.
6. 제5항에 있어서,

   상기 한국산 파래 추출물의 함량이 0.01 ∼ 50 중량％인 것을 특징으로 하는 면역증강용 약제.
7. 제5항에 있어서,

   상기 약제의 제형이 정제, 캡슐제 또는 수액제 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역증강용 약제.

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