FR2620941A1

FR2620941A1 - Vaccin contenant des adjuvants et des antigenes tumoraux

Info

Publication number: FR2620941A1
Application number: FR8812793A
Authority: FR
Inventors: John Leonard Cantrell
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Current assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1988-09-30
Publication date: 1989-03-31
Anticipated expiration: 2008-09-30
Also published as: GB8822749D0; GB2210557B; NL8802393A; IT8822145A0; GB2210557A; BE1001634A4; JPH01163130A; IT1226861B; CA1333152C; US4877611A; DE3833319C2; DE3833319A1; JPH0575731B2; CH678492A5; FR2620941B1

Abstract

Vaccins contenant des adjuvants et des antigènes tumoraux, des vaccins sont prévus qui sont composés de a des adjuvants non toxiques et hautement efficaces obtenus à partir de sources microbiennes ainsi que b des antigènes tumoraux. Une grande variété d'antigènes peut être employée dans les vaccins et comprend des antigènes obtenus à partir de tumeurs ou de cultures de cellules tumorales, telles des cancers de l'ovaire, des mélanomes, des cancers colorectaux, des cancers pancréatiques, des cancers rénaux et similaires. En ajoutant des antigènes tumoraux à des immunostimulants puissants mais non toxiques, on peut obtenir une immunité protectrice et durable contre les tumeurs.

Description

VACCIN CONTENANT DES ADJUVANTS ET DES ANTIGENES TUMORAUX

Cette invention a pour objet, en général, des vaccins tumoraux. Selon l'un de ses aspects, cette invention a pour objet un vaccin composé d'adjuvants non toxiques et hautement efficaces provenant de sources microbiennes et des antigènes associés à la tumeur. Selon un autre aspect, cette invention concerne un procédé pour la préparation de vaccins tumoraux et une méthode pour leur utilisation dans le traitement et la prévention des tumeurs par renforcement de l'efficacité des

antigènes tumoraux immunogènes.

L'endotoxine a été reconnue depuis plus de quatre-vingt

dix ans comme un immuno-activateur puissant. W.B. Coley men-

tionne dans Ann. Sura. 14, 199 (1891) l'usage de "toxines bactériennes" dans le traitement du cancer. Il mentionne également dans JAMA 54, 250 (1919) que le taux de rémission

chez les patients inopérables utilisant de tels vaccins micro-

biens mixtes était de 4 à 7%. Des extraits d'endotoxine ont été ensuite étudiés sur différents modèles animaux. Gratia et Linz dans Comp. Rend. Soc. de Biol. 108, 427 (1931) décrivent

la nécrose hémorragique et la régression tumorale concomit-

tantes dans un modèle de liposarcome transplantable sur les cobayes. D'autres modèles de tumeurs rongeantes ont suivi: le sarcome 180 chez la souris (Shwartzman G. et Michailovsky N., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 29, 737, 1932), des carcinomes de Ehrlich sur la souris (Berendt M.J. et North R.J., Exp. Med., 151, 69, 1980), et des tumeurs transplantables chez le rat

(Berendt M.J. et North R.J., communication privée).

Des travaux récents sur l'observation de nécroses tumo-

rales chez les animaux traités à l'endotoxine démontrent que

la fraction endotoxique elle-même n'est pas directement res-

ponsable des nécroses (Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L., Green S., Liore N. et Williamson B., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975). Au lieu de cela, les nécroses peuvent se former par l'intermédiaire d'un facteur appelé le facteur de

nécrose tumorale (FNT) qui a été isolé chez la souris préala-

blement stimulée par des activateurs macrophages, tels que BCG, C. parvum ou zymosan. De plus, le FNT s'est révélé être cytotoxique à l'encontre de certaines lignes de tumeur in vitro, et l'activité antitumorale a été attribuée à cette

substance in vivo.

Antérieurement à la présente invention et pendant une recherche sur des composants microbiens ayant une activité antitumorale, on a trouvé que, quand certaines préparations d'endotoxine étaient combinées avec du dimycolate de tréhalose (DMT) et des gouttes d'huile et injectées dans des tumeurs malignes établies de ligne 10 sur des cobayes de souche 2, étaient développées un taux élevé de rémissions et une immunité tumorale systémique. Ceci a conduit à de nouvelles investigations sur la valeur de l'endotoxine comme agent immunothérapeutique. Les adjuvants d'endotoxine les plus puissants sont l'eau phéniquée (EP) ou du méthanol chloroformé (MC) extraits de bactéries gram-nëgatives mutantes Re (sans heptose). Ces extraits contiennent des lipopolysaccharides endotoxiques (LPS) préparés par extraits à l'eau phéniquée à partir de bactéries de type sauvage. A la fois ReGl et le lipopolysaccharide qui ont été injectés en combinaison avec le DMT et les gouttes d'huile ont causé une réaction nécrotique de type Shwartzman se développant rapidement dans les tumeurs. A la suite de cette réaction, la combinaison de LPS a conduit seulement à une régression partielle des tumeurs injectées et leur croissance a continué après environ 2 semaines. Par contre, l'injection de la combinaison ReG1- DMT a conduit à des taux élevés de régression permanente et de développement d'une immunité systémique contre une inoculation témoin avec des tumeurs de ligne 10. La régression tumorale avec ReGl + DMT ou SPC (structure de paroi cellulaire) + DMT a été obtenue et l'on

peut traiter des tumeurs plus avancées avec grand succès.

Dans l'article du Dr. J.L. Cantrell et al. publié dans Cancer Research 39, 1159-1167, avril (1979), il a été indiqué qu'une combinaison de chimiothérapie et d'immunothérapie était hautement efficace pour provoquer la régression d'une tumeur établie chez la souris, alors que le traitement par l'une ou

par l'autre était inefficace. Dans cette étude, l'immunothé-

rapie utilisée impliquait l'injection d'antigènes tumoraux extraits au KC1 dans des émulsions huile dans eau avec ou sans

dimycolate de tréhalose.

Egalement, dans les brevets américains 4 436 727 et 4 505 903, sont décrites différentes combinaisons d'endotoxine

détoxiquée raffinée ou d'extraits solubles de pyridine puri-

fiée de micro-organismes avec la structure de la paroi cellu-

laire et/ou du dimycolate de tréhalose qui sont considérés

comme étant utiles pour le traitement de tumeurs cancéreuses.

Cependant, antérieurement à la présente invention, l'immuno-

thérapie était appliquée avec des modificateurs de réponses biologiques, comme l'immunothérapie non spécifique ou avec seulement des antigènes tumoraux. Cependant, l'immunothérapie non spécifique n'a qu'un court effet sur les tumeurs et les antigènes tumoraux sont d'une immunogénicité faible. De plus, les adjuvants antérieurement disponibles pour l'usage dans les vaccins humains présentent une basse activité et, de ce fait,

l'immunothérapie ne s'est pas révélée entièrement satisfai-

sante. Ainsi, tandis qu'il existe un art antérieur considé-

rable en ce qui concerne les adjuvants et les antigènes tumo-

raux, il n'y a pas d'art antérieur sur l'utilisation d'adju-

vants biologiques non toxiques pour renforcer l'immunité

protective utilisée en combinaison avec des antigènes tumo-

raux. Ainsi, avait-on besoin d'un immunostimulant puissant mais non toxique qui pourrait être utilisé en conjonction avec des antigènes associés à la tumeur pour fournir une immunité

tumorale protective et durable.

Ainsi, un ou plusieurs des buts suivants sont atteints en faisant appel à l'invention. L'un des buts de cette invention est de fournir un vaccin qui soit efficaGe dans ie traitement et la prévention des tumeurs. Un autre but de cette invention est de fournir un vaccin comprenant des adjuvants hautement efficaces et non toxiques provenant de sources microbiennes et des antigènes tumoraux. Un autre but de cette invention est d'obtenir une méthode pour le renforcement de l'activité antitumorale des antigènes tumoraux immunogènes. Un autre but de cette invention est de fournir un procédé pour la préparation de vaccins tumoraux. Encore un autre but est de fournir un procédé pour la préparation de vaccins tumoraux comprenant des adjuvants et des antigènes tumoraux. Un autre but également est de fournir un procédé pour la préparation de vaccins comprenant des endotoxines raffinées détoxiquées et

des antigènes tumoraux.

Un nouveau but est de fournir une méthode pour l'utili-

sation des vaccins dans le traitement et la prévention des

tumeurs. Ces buts et d'autres apparaîtront clairement à l'hom-

me de l'art à la lumière de la description qui va suivre.

La présente invention a pour objet des vaccins compre-

nant des adjuvants non toxiques et hautement actifs, obtenus à

partir de sources microbiennes, et des antigènes tumoraux.

Cette invention a également trait à des procédés pour la préparation de vaccins et leur utilisation dans le traitement

et la prévention de tumeurs.

Les vaccins selon la présente invention comprennent: (a) au moins un antigène associé à la tumeur; (b) un immunostimulant d'endotoxine détoxiquée raffinée; (c) au moins un immunostimulant additionnel choisi dans le groupe consistant en: 1) une structure de paroi cellulaire microbactérienne; 2) du dimycolate de tréhalose; et 3) un extrait d'un micro-organisme soluble dans la pyridine; et

(d) un support pharmaceutiquement acceptable.

Les vaccins selon la présente invention comprennent un

antigène associé à la tumeur ci-après dénommé ATA, un immuno-

stimulant d'endotoxine détoxiquée et raffinée ci-après dénommé

LMP et au moins un autre immunostimulant bactérien. Les anti-

gènes associés à la tumeur, qui sont employés dans les vaccins conformes à la présente invention, peuvent être des cellules entières, des fractions de cellule ou des extraits de cellule tumorale préparés par des techniques connus. Dans quelques cas, il peut être désirable d'utiliser deux antigènes ou plus

dans le même vaccin.

Des antigènes associés à la tumeur comprennent, mais n'y sont pas limités, des antigènes obtenus à partir de tumeurs d'animaux à sang chaud, telles que des carcinomes oculaires, des sarcoides, des cancers ovariens, des tumeurs mammaires,

des adénocarcinomes, des carcinomes pancréatiques, des carci-

nomes rénaux, des carcinomes pulmonaires et équivalents.

L'immunostimulant d'endotoxine détoxiquée et raffinée

employé selon la présente invention est le lipide monophos-

phoryle A (LMP), et est préparé de la manière décrite dans les brevets américains 4 436 727 et 4 436 728, qui sont inclus en référence dans les présentes. Des extraits d'endotoxine du type utilisé comme matériau de départ pour produire le LMP peuvent être obtenus à partir de mutants ou d'organismes apparentés comprenant les Entérobactériacées. Les brevets cidessus indiqués décrivent le type de micro-organismes qui peuvent être utilisés pour obtenir le matériau de départ et plusieurs procédés pour la préparation de ce matériau de départ. L'endotoxine détoxiquée peut également être préparée

de façon synthétique ou par les techniques de génie génétique.

Le procédé préféré selon l'invention pour obtenir l'extrait

endotoxique est celui décrit par Chen et al., J. infect. Dis.

128, 543 (1973).

Le lipide monophosphoryle A (LMP) est une composition caractérisée comme présentant du di-céto-3-désoxyoctanoate non détectible entre 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/mg d'acides gras. La structure

complète du lipide monophosphoryle A obtenu à partir de lipo-

polysaccharides de Salmonella minnesota R595 est représentée comme suit:

Z620941

HOp _0.

o -P- 0\T-

Ho Oj4100 is Lipide monosphosphoryle A

LMP est un perfectionnement significatif dans les ex-

traits endotoxiques obtenus à partir des Entérobactériacées car le LMP est détoxiqué et, de ce fait, ne contient pas les composants hautement toxiques qui ont rendu les extraits endotoxiquesiulsaes inutilisables pour l'usage thérapeutique (voir Peptides as Requirements for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line-10 Tumor with Endotoxins; Ribi et al. Cancer Immunol.

Immmunother. Volume 7, pp 43-57, 1979, inclus ici comme réfé-

rence. Les effets bénéfiques du LMP sur d'autres extraits

endotoxiques sont décrits par exemple dans les brevets améri-

cains 4 436 727 et 4 436 728 et dans Ribi E., Journal of Biological Response Modifiers, volume 3, pp 1-9, 1984, inclus

ici comme références).

Comme indiqué ci-dessus, l'immunostimulant d'endotoxine employé dans les vaccins conformes à l'invention est détoxiqué selon le procédé présenté dans les brevets américains 4 436 727 et 4 436 728. Par "détoxiqué", on entend que la toxicité {valeur de dose léthale 50, DL50) de l'endotoxine, basée sur l'essai de léthalité de l'embryon de poulet, est inférieure à jg que l'on peut comparer à l'endotoxine toxique dans

laquelle la valeur DL50 est approximativement de 0,001 g.

En plus de l'immunostimulant lipide monophosphoryle A employé dans le vaccin conforme à l'invention, est également présent au moins un adjuvant bactérien additionnel. Comme indiqué ci-dessus, de tels adjuvants comprennent: (a) ia structure de paroi cellulaire mycobactérienne, (b) du dimycolate de tréhalose, et (c) un extrait de micro-organisme

soluble dans la pyridine.

Le premier adjuvant bactérien qui peut être employé avec l'antigène et le LMP est la structure de paroi cellulaire consistant essentiellement en une paroi cellulaire qui con- tient la plupart des protéines et des lipides que l'on trouve

normalement dans une paroi cellulaire isolée. C'est un arabino-

galactane-mucopeptide d'acide mycolique polymère contenant des

restes de mycolates de tréhalose ("P3") et des tuberculo-

protéines non digérées. La structure de paroi cellulaire est obtenue à partir de tout micro-organisme comprenant, sans y être limité, M. smegmatis, M. Phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium parvum, M. kansaii, M. tuberculosis (souche H 37 et RV et Ayoma B), et souche M. bovis BCG. De plus, la structure de paroi cellulaire peut être obtenue à partir d'autres micro-organismes, tels que

E. coli, B. abortus et Coxiella burnettii.

La structure de paroi cellulaire peut être produite en

faisant tout d'abord se développer et en récoltant des bacté-

ries telles que la souche BCG de M. bovis (bacille Calmette-

Guérin). Le résidu de cellule total résultant est traité par un fractionneur de cellules [Fractioneur de cellules Ribi (Modèle Sorvall. RF-1)] qui rompt les cellules, séparant la

membrane externe ou la paroi cellulaire des impuretés proto-

plasmiques. Les parois cellulaires résultantes sont alors

soumises à une série d'extractions par solvant et de traite-

ments enzymatiques (par exemple à la trypsine et/ou à la chymotrypsine) pour obtenir la structure de paroi cellulaire purifiée.

Des seconds adjuvants bactériens qui peuvent être utili-

sés dans les vaccins conformes à l'invention sont les dimyco-

lates de tréhalose (DMT) qui peuvent être obtenus à partir de microorganismes comme, par exemple, M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (souche H 37 RV et Ayoma B), BCG de M. bovis,

M. smegmatis, M. kansaii, Nocardia rubra, M. bovinis et Coryne-

bacterium diphtheriae.

On développe des bactéries telles que M. avium, on les

récolte et ensuite on les tue à la chaleur. La masse cellu-

laire est alors extraite avec différents solvants et on extrait une fraction active soluble dans un solvant. Cet extrait est ensuite purifié par une série d'extractions par solvant pour obtenir le DMT brut (voir Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. 1. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component, P. 3; Azuma et al., Journal of the National Cancer Institute, volume 52, pp 95- 101, 1974) inclus ici à titre de référence. Comme décrit par Azuma et

al., le DMT brut peut alors être ensuite purifié par chroma-

tographie centrifuge sur gel de silice en microparticules pour obtenir du DMT purifié. Le DMT peut également être préparé comme décrit dans le brevet américain 4 505 900, qui a été

publié le 19 mars 1985.

Le troisième adjuvant bactérien qui peut etre inclus dans les vaccins conformes à l'invention est un extrait de micro-organisme soluble dans la pyridine contenant entre environ 3 à 20% en poids de protéine, entre environ 10 à 40%

en poids de sucre et environ 35 à 60% en poids d'acides gras.

L'extrait contient de préférence environ 5% en poids de chaque protéine, environ 35% en poids de sucre et environ 5% en poids

d'acides gras.

La protéine contient des acides aminés et de l'ammoniac et les acides aminés comprennent par exemple les suivants: asparginine.............. 0, 273 thréonine................ 0,108 25. sérine ................... 0,585 acide muramique.......... 0,219 acide glutamique......... 0,267 glycine...

............. 0,39 alanine.................. 0,173 Les quantités exprimées ci-dessus sont des pourcentages..DTD: en poids et les protéines totales sont de 6,34% en poids.

L'extrait soluble dans la pyridine préparé selon la

présente invention s'est révélé répondre à l'analyse élémen-

- taire suivante: Elément Pourcentage en poids Carbone 60,35 Hydrogène 9, 47 oxygène 23,91

De plus, l'extrait est caractérise par un spectre infra-

rouge dans lequel les pics importants utiles pour identifier l'extrait sont représentés dans le tableau 1 ci-dessous: Fréquence de pic* (cm1) Identification 3400(b) Raie NH

3200-2500(b) Pic OH à liaison intra-

moléculaire hydrogène 2920(s) Raie CH 1710(s) Raie ester-carbonyle 1675(s) Raie amide-carbonyle (bande I amide) 1541(m) Bande II amide *(b) = large (s) = fort (m) = modéré Tout micro-organisme peut être utilisé pour obtenir l'extrait soluble dans la pyridine, ce qui comprend par exemple le BCG de M. bovis, M. phlei, M. smegmatis, M. kansaji, Nocardia rubra, Corynebacterium diphtheriae et Corynebacterium parvum. On préfère tout particulièrement Corynebacterium parvum. Les cellules entière de microorganisme, de préférence

sous forme de pâte, sont mélangées avec la pyridine. Le mé-

lange résultant est séparé pour obtenir une fraction surna-

geante qui contient l'extrait soluble dans la pyridine et un résidu de pyridine. Eventuellement, le résidu de pyridine peut être sujet à des processus de séparation répétés, comme décrit ci-dessus, en utilisant la pyridine pour extraire de nouvelles

quantités de l'extrait désiré.

La pyridine est alors extraite de l'extrait et l'extrait

sec est dialysé à un liquide adéquat, tel que l'eau distillée.

L'absence de contaminants de cellule totale ou de fragment

cellulaire est confirmée par la microscopie électronique.

L'extrait purifié résultant peut alors être lyophilisé par des

procédés connus pour obtenir un produit stable.

Les adjuvants immunologiques selon la présente invention

dans le mélange avec des antigènes associés à la tumeur ren-

forcent la réponse immune contre de tels antigènes et sont donc utiles dans divers cas de tumeurs de type vaccine, à la fois chez des hôtes animaux ou humains. En pratique, on a trouvé que l'endotoxine détoxiquée raffinée (LMP) est utilisée en concentration d'environ 10 à environ 500 gg par dose avec

une réponse immune renforcée correspondant à des concentra-

tions d'environ 10 à environ 50 gg par dose. La structure de paroi cellulaire est de préférence utilisée en concentration d'environ 275 à environ 325 gg par dose. Les dimycolates de

tréhalose sont de préférence utilisés en concentration d'envi-

ron 50 à environ 300 gg par dose, et de préférence d'environ à 175 gg par dose. L'extrait soluble dans la pyridine peut être utilisé en concentration d'environ 500 à environ 2 400 gq par dose, et de préférence d'environ 750 à environ 1 200 ug par dose. Si on le désire, d'autres composants ou additifs peuvent être employés en conjonction avec les adjuvants selon

la présente invention.

Dans d'autres cas o seulement une ou deux des trois classes d'adjuvants sont employées avec l'antigène et le LMP, les concentrations de tels adjuvants peuvent être réglées à des niveaux plus élevés. Tout ce dont on a besoin, cependant, est une quantité d'adjuvant(s) qui renforcera la réponse immune du vaccin contre le ou les antigène(s) associé(s) à la tumeur.

La quantité optimale d'antigène employée dans les vac-

cins conformes à l'invention variera bien entendu pour chaque tumeur particulière. En principe, cependant, on a trouvé que l'antigène est généralement présent dans le vaccin à une concentration d'environ à environ 100 mg par dose, et de

préférence d'environ 2 à environ 10 mg par dose.

Les antigènes associés à la tumeur et les adjuvants sont de préférence employés sur un support pharmaceutiquement

acceptable pour constituer le vaccin conforme à l'invention.

Des supports illustratifs qui peuvent être employés compren-

nent une solution physiologique ou des émulsions à gouttes d'huile. La quantité d'huile utilisée est dans la gamme comprise entre environ 0,5 et environ 3,0% en volume, basé sur

le volume total de la composition.

La préparation des vaccins conforme à l'invention peut être effectuée en mélangeant l'ATA, le LMP et les adjuvants

biologiques selon les techniques adoptées.

Comme décrit ci-dessus, la composition pour le traite-

ment d'humains ou d'animaux à sang chaud peut être utilisée pour la forme d'une émulsion à gouttes d'huile. La quantité d'huile utilisée est dans la gamme comprise entre environ 0,5

et 3,0% en volume, basé sur le volume total de la composition.

On préfère utiliser entre environ 0,75 et 1,5% en volume d'huile. Des exemples de telles huiles comprennent l'huile minérale légère, le squalane, le 7-n-hexyloctadécane, la

superhuile de Conoco et l'huile minérale Drakeol 6 VR (pro-

duite par Pennreco Company, Butler, Pennsylvania).

Le mélange homogénéisé contenant l'huile est alors combiné avec un détergent qui peut, éventuellement, être dissous dans une solution saline avant mélange. La quantité de détergent est de façon typique comprise entre 0,02 et 0,20% en volume, et de préférence entre environ 0,10 et 0, 20% en volume, basé sur le volume total de la composition. Tout matériau détergent commun peut être utilisé, comprenant Tween-80 et

Arlacel (produit par Atlas Chemical Company).

Le mélange résultant de l'addition de détergent est alors homogénéisé pour former une suspension qui a un haut pourcentage en gouttelettes d'huile, recouvert de LMP et de

SPC comme le montre une observation au microscope.

Selon une variante, des suspensions aqueuses d'ATA peuvent être ajoutées aux émulsions lyophilisées contenant les adjuvants biologiques et mélangées ou émulsifiées en mélangeur à tourbillon, jusqu'à ce qu'une suspension légèrement laiteuse soit obtenue. Des émulsions lyophilisées sont préparées comme

antérieurement décrit (voir brevet américain 4 520 019).

Les vaccins conformes à la présente invention sont habi-

tuellement administrés aux animaux à sang chaud par injection intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée, une fois par semaine, jusqu'à un total de 15 injections dans les doses

indiquées ci-dessus.

On a trouvé que les vaccins conformes à l'invention renforcent grandement la réponse immune contre une large variété d'antigènes associés à des tumeurs naturelles et des antigènes synthétiques et viraux, bactériens, fongiques ou

protozoaires. La seule exigence des antigènes qui sont emplo-

yés dans les vaccins conformes à l'invention est d'être capa-

S ble d'émettre une réponse immune dans un hôte et que cette réponse soit renforcée par les adjuvants de l'invention avec

lesquels ils sont combinés. Ainsi, les vaccins selon la pré-

sente invention ont une activité antitumorale puissante et, de ce fait, sont utiles pour le traitement et la prévention de

différentes tumeurs à la fois chez les animaux et les humains.

Les tumeurs incluant les cancers, qui peuvent être traitées par les vaccins, comprennent les tumeurs animales telles que les carcinomes à cellules squameuses du bovin, le fibrosarcome du bovin, le sarcoîde de l'équidé, le mélanome de l'équidé, le carcinome de cellules squameuses de l'équidé, les tumeurs mammaires canines, l'adénome canin et le mélanome canin, et les tumeurs humaines telles que les cancers de l'ovaire, les mélanomes, les cancers colorectaux, les cancers pancréatiques,

les cancers rénaux et similaires.

Bien que ne souhaitant pas être lié par le mécanisme selon lequel les vaccins conformes à la présente invention

assurent la régression de la tumeur, on estime que la combi-

naison des antigènes associés à la tumeur et de l'adjuvant stimule à la fois une réponse non spécifique et une réponse

immune spécifique.

Bien que les vaccins conformes à l'invention soient efficaces dans le traitement de tumeurs, en pratique, ces vaccins antitumoraux peuvent être utilisés dans un processus clinique comme traitement d'accompagnement d'autres formes de thérapie. Ceci est dû au fait que l'immunothérapie peut être la plus efficace quand la charge tumorale est suffisamment faible pour qu'elle puisse être prise en charge par le système immune du patient. Ainsi, un patient avec un désordre avancé devra probablement subir quelques sortes de traitement pour réduire la charge tumorale et, ensuite, recevra le vaccin antitumorale de façon à éliminer les cellules tumorales résiduelles. Le traitement d'accompagnement peut être la chirurgie, la chimiothérapie ou la radiothérapie, ou tout

autre méthode pour la réduction efficace de la charge tumo-

rale. Le traitement d'accompagnement peut même affecter une

autre forme d'immunothérapie, telle que par exemple l'adminis-

tration d'interleucine-2.

Dans les exemples qui suivent, les composants bacté- riens, les tumeurs et les cellules tumorales, et les vaccins de cellules tumorales sont préparés et évalués en employant

des procédés connus dans l'art antérieur.

EXEMPLE 1

Préparation de composants bactériens

1. Préparation de lipide monophosphoryle A (LMP) et d'endo-

toxine détoxiquée L'endotoxine brute est isolée du mutant Re dans heptose

déficient en polysaccharide extrait par solvant orga-

nique de Salmonella minnesota (souche R595). Cette souche provient de NIH, NIAID, Rocky Mountain Laboratory, Hamilton, Montana. Cette endotoxine qui consiste seulement en KDO et en lipide A, est un glycolipide plutôt qu'un lipopolysaccharide endotoxique typique et est purifiée par précipitation fractionnée

avec des solvants organiques de polarités appropriées.

Elle est alors traitée avec de l'acide chlorhydrique 0,1N bouillant pour obtenir un mélange complexe consistant en acides gras libres et en homologues structurels du lipide monophosphoryle A non toxique (LMP). Ces composants sont séparés par élution sous pression en colonne chromatographique. Les fractions séparées correspondent aux homologues structurels du LMP, comme identifié par chromatographie en couche mince, puis sont rassemblées et testées quant à leur toxicité. On les qualifie pour expérimentation sur l'animal quand leur dose léthale à 50% sur embryons de poulet (DLEP50) inoculés par voie intraveineuse est supérieure à 10 Fg (la dose léthale pour l'endotoxine

apparentée est inférieure à 0,001 gg).

2. Préparation de structure de paroi cellulaire mycobacté-

rienne (SPC) Des parois cellulaires de mycobacterium bovis, souche BCG que l'on obtient de NIH, NIAID, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana, sont préparées à l'aide

de fractionneur de cellules Sorvall-Ribi (modèle RF-1).

En utilisant une pression de 35 000 psi (2 415 000 hPa), à une température de 10 à 15 C, les parois de cellules mycobactériennes sont craquées et le protoplasme est extrudé à l'état soluble. Les enveloppes de parois cellulaires sont alors récoltées par centrifugation et purifiées par centrifugation et resuspension dans l'eau répétées. Les parois cellulaires sont alors traitées à

l'ANR-ase et l'ADN-ase pour éliminer les acides nucléi-

ques, ce qui est suivi par des séries d'enzymes protéo-

lytiques et un traitement au détergent pour éliminer

respectivement les protéines et les peptides. Finale-

ment, la préparation est totalement extraite avec des solvants organiques pour éliminer les "lipides libres".

La SPC résultante est composée d'un complexe polymère

d'acide mycolique et d'arabinogalactanmucopeptide.

3. Isolation et purification de dimycolate de tréhalose

(DMT)

Les cellules totales de mycobactérie sont extraites d'abord à l'éthanol puis à l'acétone, et finalement avec

un mélange de chloroforme et d'éthanol (MC à 2 chloro-

forme pour 1 méthanol). L'extrait MC contient le DMT plus des lipides contaminants ayant des polarités plus hautes et plus basses que le DMT. Ces lipides sont

séparés sélectivement en les précipitant avec des compo-

sitions de solvants organiques dans lesquels ils sont insolubles, tandis que le DMT est retenu dans la phase

soluble. Le DMT brut résultant est purifié par chroma-

tographie à élution sous pression. Les fractions sépa-

rées contiennent un seul composant de DMT, comme cela est déterminé par chromatographie en couche mince CCM,

puis elles sont rassemblées et utilisées pour étude.

4. Extraction de pyridine du Corynebacterium Parvum (PE) Les cellules totales tuées à la chaleur de C. parvum VPI reçu du Dr. C. Cummings, Virginia Polytechnic Institute, sont extraites trois fois avec de la pyridine à 37 C et les extraits combines solubles dans la pyridine sont

concentrés par évaporation éclair, dialysés et lyophi-

lisés. Une substance avec une activité antitumorale renforcée et une toxicité largement réduite est ainsi obtenue.

EXEMPLE 2

Préparation de modèles de tumeurs de muridés pour évaluation 1. Animaux Toutes les expériences sur des tumeurs sont effectuées sur des souris femelles de 6 à 8 semaines, de type C3HB/FeJ ou sur des souris des deux sexes C57BL/10 ou DBA/2. Les souris sont obtenues à partir des colonies de production de Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamiltor., Montana. Les lignées parentales de souris DBA/2 et C3HB/FeJ sont achetées auprès de Jackson Laboratory (Bar

Harbor, Maine).

Des cobayes Sewell-Wright de souche-2 consanguins sont obtenus à partir de la colonie de production de Ribi ImmunoChem Research. Des cobayes des deux sexes pèsent

de 350 à 500 g à leur arrivé en expérimentation.

2. Tumeurs La leucémie EL-4 (fournie par le Dr. Bruce Chesebro, NIAID, Rocky Mountain Laboratory, Hamilton, Montana), TOM (tumeur de l'ovaire de muridé) de l'ovaire (du Dr. J. Berek, UCLA, Los Angeles, Ca.) et des cellules lymphome P3888 obtenues de ATCC, sont maintenus sous

forme ascitique par des transferts en série respective-

ment sur des souris C57BL/10, C3HB/FeJ et DBA/2. Les

cellules tumorales sont récoltées dans la cavité péri-

tonéale et lavées avec 20 ml de solution saline tampon-

née de phosphate (STP). Les globules rouges du sang

(GRS) sont lysés avec 10 ml d'oxalate d'ammonium à 1%.

Après 30 secondes, le caractère osmotique physiologique est restauré par addition de 40 ml de STP. Les cellules sont transformées en paillette par centrifugation, et la dose cellulaire est ajustée de sorte qu'un inoculum de 2

à 5 x 104 cellules soit administré dans 0,1 ml de STP.

Des cellules hépatomes de ligne 10 sont maintenues sous forme ascitique dans une souche congénitale 2 de cobayes

par une série de transferts i.p. (intraperitonéales).

Les cellules de tumeurs sont récoltées des donneurs porteurs d'ascite, lavées trois fois en solution saline stérile, et ajustées à 20 x 106 cellules tumorales

par ml.

3. Protocole d'expérimentation immunothérapique Des cellules tumorales EL4, TOM ou P388 obtenues à partir des mêmes sources qu'indiquées ci-dessus, sont

préparées comme décrit ci-dessus, et 0,2 ml d'une sus-

pension de cellules tumorales est inoculé par voie intrapéritonéale dans une souche consanguine appropriée

de souris au jour 0. Les contrôles de tumeur ne reçoi-

* vent ensuite plus de traitement. A des temps variés (du jour 1 au jour 6), après la transplantation de la tumeur, on donne aux souris une seule injection intrapéritonéale de la composition immunothérapeutique. Les animaux de

chaque groupe sont observés journellement et l'on déter-

mine le pourcentage de la survivance et/ou de la réduc-

tion de la masse tumorale. La tumeur de ligne 10 est établie sur des cobayes par injection intradermique de cellules tumorales à croissance à 106 ascites. Les compositions immunothérapeutiques sont administrées à

raison de 0,4 ml en volume par inoculation intralésion-

nelle après 6 jours, temps au bout duquel les tumeurs

ont de 9 à 11 mm de diamètre.

EXEMPLE 3

Procédé de formulation pour la préparation de vaccins cellu-

laires tumoraux 1. Préparation d'antigène(s) solubilisé(s) associés à des tumeurs Un antigène tumoral est préparé par un procédé modifié utilisant l'extraction 3M KC1. En bref, 3M KC1 dans le STP sont ajoutés à une paillette cellulaire de cellules tumorales vivantes à une concentration de 5 ml par 3 x 108 cellules. La suspension est agitée pendant 18 à

24 heures à 4 après laquelle les paillettes sont dé-

chargées et le fluide surnageant est dialysé à l'eau distillée pendant 24 heures à 43 puis centrifucgé 000 x g pendant 2 heures à 4 . Le dialysat est finalement centrifugé à 100 000 x g pendant 2 heures à 4 pour éliminer le précipité gélatineux fin qui se forme après la dialyse. Le matériau soluble est alors lyophilisé. La tumeur de cobaye de ligne 10; P388, TOM, et EL-4 de muridés; ainsi que le carcinome de cellules squameuses oculaires de bovins (CCSOB) et le sarcoYde d'équidés (SE) obtenus à partir d'hôtes portant des tumeurs sont extraits de cette manière. De plus, des suspensions salines de SE et de CCSOB homogénéisés sont extraites

par un procédé modifié au phénol.

2. Préparation de l'émulsion à gouttes d'huile Des émulsions à gouttes d'huile contenant des extraits solubles des tumeurs sont préparées par différentes combinaisons de SPC, de DMT et de LMP, comme décrit

précédemment (brevet américain 4 520 019).

3. Essai préliminaire de vaccins tumoraux Les méthodes de thérapie sont pratiquement telles que décrites précédemment. Essentiellement, on crée des tumeurs par injection sous-cutanée sur la souris ou des cobayes avec 2 à 5 x 104 cellules tumorales développées en ascite. Des quantités de 25 ou 100 gg de mitomycine C sont administrées par voie intralésionnelle 7 jours après l'implantation, quand les tumeurs ont environ 4 mm de diamètre. Deux jours plus tard, les vaccins sont injectés par diverses voies. Les taux de rémission sont comparés avec la survivance des animaux non traités. Les animaux traités sont testés quant à leur capacité à résister à une épreuve subséquente par des cellules

tumorales homologues.

4. Immunothérapie spécifique de tumeurs spontanées sur des bovins et des chevaux Le carcinome à cellules squameuses oculaires du bovin (CCSOB) est un carcinome autochtone potentiellement métastatique qui se produit naturellement sur environ

4,7% des bovins Hereford et sur 0,8% à 1,6% de la popu-

lation de bovins en général. Le sarcolde de l'équidé (SE) est une tumeur cutanée localement agressive et est la tumeur spontanée la plus commune chez le cheval. Ces tumeurs ne donnent pas immédiatement de métastases mais

envahissent localement et sont non agressives.

EXEMPLE 4

Isolation des antigènes associés aux tumeurs Deux modèles de tumeurs expérimentaux, (a) le carcinome hépatocellulaire de ligne 10 sur des cobayes de souche 2 consanguins et (b) des tumeurs de l'ovaire de muridés sur des

souris C3HB/FeJ consanguines, sont obtenus à partir de colo-

nies de développement existantes de ces animaux récepteurs

provenant de Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana.

Les trois tumeurs de muridés suivantes additionnelles sur des lignes cellulaires sont obtenues: leucémie L-1210 a été reçue du Dr. Jerry Killion, Oral Roberts Université, Tulsa, OK; les cellules tumorales de lymphome EL-4 du Dr. Bruce Chesebro, NIAID, Rocky Mountain Laboratory, Hamilton, Montana; et les cellules tumorales de lymphome P-388 ont été achetées à 1'ATCC. Des souris B6D2F1 et C3HB/FeJ pour l'entretien de ces lignes cellulaires tumorales et pour des études de régression tumorale ont été acquises auprès de

Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine.

Des antigènes associés aux tumeurs (AAT) pour l'utilisa-

tion en combinaison avec le LMP et d'autres composants bactérioantitumoraux conformes à l'invention ont été isolés à partir de cellules de tumeur de l'ovaire TOM, du lymphome EL-4, du lymphome P388 et de la leucémie L-1210 par le procédé

d'extraction 3M KC1. En bref, à des groupes de souches appro-

priées de souris, on donne par injection intrapéritonéale 0,5 à 1 x 105 de cellules tumorales viables. On recueille le fluide ascite 8 ou 10 jours plus tard et l'on extrait les cellules par centrifugation. Des cellules tumorales marquées sont extraites pendant la nuit avec 3M KC1. L'extrait soluble

aqueux est obtenu par centrifugation, il est dialysé et lyo-

philisé. De plus, l'AAT est aussi obtenu à partir de cellules tumorales ligne 10 développées dans l'ascite sur des souches 2

de cobayes en utilisant la procédure ci-dessus.

Des extraits AAT ont été également obtenus à partir de

tumeurs sarcoldes se développant spontanément sur des chevaux.

Les tumeurs sarcoides solides sont homogénéisées dans 3M KC1 et extraites pendant la nuit à 4 C. L'extrait aqueux est collecté par centrifugation, dialysé et lyophilise.

EXEMPLE 5

Activité antitumorale de l'endotoxine détoxiquée (LMP) seule ou combinée avec l'extrait à la pyridine de P. acnes (EP-PA) Des expériences ont été menées pour démontrer que le EP-PA et le dimycolate de tréhalose mycobactérien (DMT) sont efficaces comme structure de paroi cellulaire (SPC) pour faire régresser des tumeurs de ligne 10 sur des cobayes de souche 2, quand ils sont combinés avec le LMP. Les résultats obtenus sont présentés au tableau 1 ci-dessous:

TABLEAU 1

Activité antitumorale d'émulsions d'huile contenant le LMP seul ou combiné avec EP-PA + DMT sur un modèle tumoral ligne 10a Nombre de rémission/ % de Composition injectée Dose Total rémission PE C. parvum + LMP + DMT 500+50+100 17/19 89,5 PE C. parvum + LMP + DMT 100+50+50 5/10 50 PE C. parvum + DMT 500+100 3/9 33 PE C. parvum + LMP 500+50 1/9 il PE C. parvum seul 500 0/7 0

LMP + DMT 500+100 0/6 0

Tumeur de référence - 0/18 0

a des cobayes de souche 2 ont été inoculés par voie intra-

dermique avec 2 x 106 cellules tumorales de ligne 10 le jour 0. On a administré des immunostimulants par voie intralésionnelle (0,4 ml/animal) au jour 6 quand les

tumeurs avaient de 8 à 10 mm de diamètre.

EXEMPLE 6

Les études suivantes ont été définies pour déterminer l'aptitude de solutions aqueuses contenant du LMP seul ou en combinaison avec du EP-PA de faire régresser des cellules de l'ovaire TOM chez la souris C3HB/FeJ. On a inoculé des souris

femelles avec 2 x 10 cellules TOM au jour 0 et on a adminis-

tré la composition immunothérapeutique 24 heures après. Comme représenté au tableau 2, on a observé une activité faiblement antitumorale ou non antitumorale chez les souris auxquelles on avait donné soit 1 200 gg de EP-PA, soit 240 gg de LMP. Cepen- dant, une activité antitumorale significative (88% exempt de

tumeur) a été observée chez la souris traitée avec la combi-

naison de EP-PA + LMP. De plus, la réponse était dépendante de la dose en ce qu'on notait un nombre plus faible d'animaux

exempts de tumeurs pur des doses décroissantes d'immunostimu-

lant. Les résultats sont donnés au tableau 2 ci-dessous:

TABLEAU 2

Activité antitumorale de l'endotoxine détoxiquée (LMP) seule ou en combinaison avec l'extrait à la pyridine de P. acnes (EP-PA)a Nombre de sujets Pourcentage exempts de tumeurb/ de sujets Composition Dosage Nombre total de sujets exempts de injectée (Lg) ayant reçu l'injection tumeurs

EP-PA + LMP 1200 + 240 43/49 88

EP-PA + LMP 600 + 120 4/8 50

EP-PA + LMP 350 + 75 0/5 0

LMP 240 2/8 25

EP-PA 1200 0/8 0

rien - 0/54 0

a On a inoculé par voie intrapéritonéale des souris fe-

melles C3HB/FeJ avec de 1 à 2 x 104 cellules tumorales TOM au jour 0. On a administré par voie intrapéritonéale des immunostimulants (0,5 mg/souris) 24 heures suivant

la transplantation tumorale.

b Le nombre de sujets exempts de tumeurs a été déterminé

jours après la transplantation de tumeurs.

EXEMPLE 7

Pour déterminer si des antigènes tumoraux solubilisés

(AAT) pourraient renforcer ou ajouter à l'activité antitumo-

rale de EP-PA + LMP, des souris porteuses de tumeurs TOM ont reçu du TOM + AAT seul ou en combinaison avec une dose non

efficace de EP-PA + LMP (tableau 3). Aucune activité anti-

tumorale n'a été observée chez la souris traitée avec 500 ou 350 Fg d'AAT seul. Cependant, quand 500 gg d'AAT étaient combinés avec EP-PA + LMP, 100% des souris étaient exemptes de tumeurs 60 jours après la transplantation tumorale. Le temps de survie moyen pour le groupe de référence de tumeurs non traitées était de 21 jours. Les résultats sont présentés au

tableau 3.

TABLEAU 3

Efficacité des antigènes associés à la tumeur (AAT) seul ou en combinaison avec EP-PA + LMP pour la régression de tumeurs TOM chez la souris C3HB/FeJa Nombre de sujets Pourcentage exempts de tumeurb/ de sujets Composition Dosage Nombre total de sujets exempts de injectée (g) ayant reçu l'injection tumeurs

AAT 500 0/8 0

AAT 350 0/5 0

EP-PA + LMP 350+75 0/5 0

AAT+EP-PA+LMP 350+350+75 2/5 40

AAT±EP-PA+LMP 500+300+60 8/8 100

a On a inoculé sur des souris femelles C3HB/FeJ par voie intrapéritonéale de 1 à 2 x 104 cellules tumorales TOM au jour 0. On a administré par voie intrapéritonéale des immunostimulants (0,5 ml/souris) 24 heures suivant la

transplantation tumorale.

b Le nombre de sujets exempts de tumeurs a été déterminé

jours après la transplantation tumorale.

EXEMPLE 8

Bien qu'une activité antitumorale significative ait été

observée avec l'AAT combiné avec EP-PA + LMP, il était inté-

ressant de déterminer son effet antitumorale lorsqu'il était administré à des temps croissants après la transplantation tumorale. On a administré à des souris 2 x 104 cellules TOM au jour 0 puis la thérapie (EP-PA + LMP ou AAT + EP-PA + LMP) au jour 1, 2, 3 ou 4. La thérapie efficace avec EP- PA + LMP seul

ou en combinaison avec AAT a été observée quand on l'adminis-

trait au jour 1 ou 2 après l'inoculation de cellules tumorales.

Cependant, aux jours 3 et 4, l'importance de l'activité anti-

tumorale telle que mesurée par le nombre d'animaux exempts de tumeurs était réduite de façon significative. La décroissance de l'activité antitumorale semble être due à une augmentation de la charge tumorale. Ainsi, des études ont été conçues pour réduire la charge tumorale par chimiothérapie en utilisant la

mytomycine C. Les résultats sont résumés au tableau 4 ci-

dessous:

TABLEAU 4

Activité antitumorale de LMP + EP-PA ou de AAT + LMP + EP-PA administré à différents moments après la transplantation tumoralea Temps Nombre de sujets Pourcentage après exempts de tumeurb/ de sujets Composition la tumeur Nombre total de sujets exempts de injectée (jours) ayant reçu l'injection tumeurs

EP-PA + LMP

(1200 + 250 gg) 1 5/6 83

2 4/6 67

3 1/6 17

4 0/6 0

AAT+EP-PA+LMP

(500 + 300 + 60) 1 5/6 83

2 4/6 67

3 1/6 17

4 0/6 0

AAT seul

(500) 1 0/6 0

Rien - 0/6 0

a On a inoculé par voie intrapéritonéale des souris fe-

melles C3HB/FeJ avec de 1 à 2 x 104 cellules tumorales TOM au jour 0. Des immunostimulants ont été administrés par voie intrapéritonéale (0,5 ml/souris) 24 heures

après la transplantation tumorale.

b Le nombre de sujets exempts de tumeurs a été déterminé

jours après transplantation tumorale.

EXEMPLE 9

Pour tester l'effet de la combinaison chimiothéra-

pie/immunothérapie, on a administré à des souris des cellules

23 2620941

tumorales TOM au jour 10 et par voie intrapéritonéale de la

mitomycine C aux jours 2 à 6. L'immunothérapie a été adminis-

trée 30 à 36 heures après l'administration du médicament. Le dosage de mitomycine C utilisée était prédéterminé en traitant la souris porteuse de la tumeur au jour 6 en faisant varier

des dosages de médicament administrés par voie intrapérito-

néale. Une dose de 100 mg a été choisie pour son manque de toxicité et son effet thérapeutique minimal (20% de taux de régression). Le tableau 5 représente les résultats d'une étude dar.s laquelle on a traité des souris porteuses de tumeurs avec la mitomycine C au jour 6 et l'immunothérapie 31 heures plus tard. Toutes les souris traitées par immunothérapie sans

chimiothérapie préalable sont mortes d'une croissance progres-

sive de la tumeur (données non représentées). Cependant, un taux de réponse de 50% a été observé sur le groupe recevant la drogue et AAT + EPPA + LMP à haute dose avec une activité

minimale représentée à dosage plus bas.

TABLEAU 5

Effet de la chimiothérapie suivie de EP-PA + LMP + TOM-AAT sur la souris C3HB/FeJ porteuse de TOMa Nombre de sujets à Composition tumeur en régression/ Pourcentage injectée Nombre total de sujets de réponses 31 heures après Dose ayant reçu l'injection chimiothérapie (09) Jour 34 Jour 63 Jour 34 Jour 63

AAT 500 0/6 0 0

AAT + EP-PA + LMP 500 + 300 + 60 3/6 1/6 50 17

AAT + EP-PA + LMP 500 +1200 + 240 3/6 3/6 50 50

EP-PA + LMP 300 + 60 0/6 0 0

EP-PA + LMP 1200 + 240 2/6 1/6 33 17

Cellules TOM seu-

lement, dO - 0/6 0 0 a On a inoculé des souris C3HB/FeJ femelles par voie intrapéritonéale avec 1 à 2 x 104 cellules tumorales TOM au jour 0. La chimiothérapie a été appliquée par voie intrapéritonéale au jour 6 suivie par

l'immunothérapie 31 heures.plus tard.

24 2620941

EXEMPLE 10

La procédure de l'exemple 9 a été répétée à l'exception

du fait que l'on a fait varier le temps entre la transplanta-

tion tumorale et la chimiothérapie. On a administré l'immuno-

thérapie 33 heures après le médicament mitomycine. Les résul-

tats sont représentés au tableau 6 ci-dessous.

TABLEAU 6

Effet de la chimiothérapie au jour 2, 4 ou 6 suivie de EP-PA + LMP + TOMAAT sur la souris C3HB/FeJ porteuse de TOMa Nbre de sujets ne répondant pas au Composition injectée jour 54 par rapport au % de 33 heures après Nbre total de sujets sujets Groupe chimiothérapie Dose (ug) ayant reçu l'injectionrépondant MST

A EP-PA + LMP 300 + 60 4/6 67 >54

B EP-PA + LMP 1200 + 240 5/6 83 "

C AAT + EP-PA + LM4P 500 + 300 + 60 5/6 83 "

D " ' " 500 + 1200 + 240 6/6 100 "

E " " " 1000 + 300 + 60 4/6 67 "

F " " 1000 + 1200 + 240 5/6 83 "

G Contrôle, cellules TOM seulement - 4/6 67 "

H EP-PA + LMP 1200 + 240 5/6 83 >54

I AAT + EP-PA + LMP 500 + 300 + 60 5/6 83 "

J " " " 500 + 1200 + 240 6/6 100 "

K " " " 1000 + 300 + 60 4/6 67 "

L " " " 1000 + 1200 + 240 5/6 83 "

M Contrôle, cellules TOM seulement - 0/6 0 28

N AAT 1000 1/6 17 35

O AAT + EP-PA + LMP 500 + 1200 + 240 3/6 50 37

P " " " 1000 + 300 + 60 3/6 50 43

Q " " " 1000 + 1200 + 240 4/6 67 >54

R Contrôle, cellules TOM seulement - 0/6 0 24

S Cellules TOM seule-

ment (pas de médication) - 0/6 22 Les groupes A à G, mitomycine au jour 2; les groupes H à M, mitomycine au jour 4;

les groupes M à R, mitomycine au jour 6.

Quand on a administré la mitomycine C au jour 2, on n'a pas observé de différence significative dans les groupes recevant à la fois la chimiothérapie/immunothérapie d'une part et ceux recevant la chimiothérapie seule d'autre part. Ainsi, la chimiothérapie a un effet très important quand elle est donnée plus tôt. A l'inverse, on n'a pas observé d'effet chimiothérapique sur les animaux auxquels on a administré la drogue seulement au jour 4 ou 6 mais l'on a observé d'effet

antitumeur marqué qu'en combinaison avec l'immunothérapie.

Cette activité antitumorale est observée sur les souris aux-

quelles on a administré EP-PA + LMP seul ou en combinaison

avec AAT.

EXEMPLE 11

Activité antitumorale de l'AAT en combinaison avec d'autres

composants antitumoraux microbiens sur la régression de tu-

meurs de ligne 10 sur des cobayes de souche 2 Des études précédentes ont montré que la combinaison de LMP et de structure de paroi cellulaire (SPC) a une activité antitumorale significative comme le mesure la régression de tumeurs de ligne 10 créée sur des cobayes de souche 2. L'étude suivante a été définie pour déterminer si l'addition de AAT

solubilisé au LMP + SPC renforcerait son activité antitumo-

rale. Des cobayes de souche 2 consanguins ont été inoculés avec 2 x 106 de cellules tumorales viables de ligne 10 au jour 0. On a administré l'immunothérapie directement dans les tumeurs sous forme d'émulsions huile dans l'eau au jour 6

quand les tumeurs avaient de 8 à 10 mm de diamètre. Les résul-

tats sont représentés au tableau 7.

TABLEAU 7

Activité antitumorale d'antigène associé à des tumeurs e combinaison avec différentes compositions de BRM sur l'hépatocarcinome de ligne 10 sur des cobayes de souche 2 Nombre de sujets % de sujets exempts de tumeur/ exempts de Composition Dosage Nombre total de sujets tumeurs injectée (gg) ayant reçu l'injection au jour 84 Mélange triple

(SPC+LMP+DMT) 50+50+50 3/7 43

L10-AAT+ 1000 5/7 71

TABLEAU 7 (suite) Nombre de sujets % de sujets exempts de tumeur/ exempts de Composition Dosage Nombre total de sujets tumeurs injectée (ig) ayant reçu l'injection au jour 84 Mélange triple 50+50+50 DETOX

(SPC+LMP) 200+20 1/7 14

L10-AAT+ 1000 2/7 29

DETOX 200+20

L10-AAT seul 1000 0/7 0 Les résultats représentés correspondent à une injection intratumorale. Aucune activité antitumorale n'a été

observée (0/7) quand ces compositions ont été adminis-

trées dans le flanc controlatéral.

Bien que l'invention ait été illustrée par les exemples précédents, elle n'est pas censée être limitée aux éléments décrits par les présentes mais l'invention est plutôt orientée vers le domaine générique comme indiqué ci-dessus. Diverses modifications et modes de réalisation peuvent être faits sans

se départir de l'esprit ou du cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1.- Un vaccin utile pour le traitement et la prévention de tumeurs chez un hôte, ledit vaccin étant caractérisé en ce qu'il comprend: (a) au moins un antigène associé à la tumeur; (b) un immunostimulant d'endotoxine détoxiquée raffinée; et (c) au moins un immunostimulant biologique choisi dans le groupe consistant en: 1) la structure de paroi cellulaire mycobactérienne, 2) un dimycolate de tréhalose, et

3) un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-

organisme; et

(d) un support pharmaceutiquement acceptable.

2.- Le vaccin selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'endotoxine détoxiquée raffinée n'a pas de 2-céto-3-désoxyoctanoate détectable entre environ 350 et 475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmoles/mg d'acides gras et en ce que l'extrait soluble dans la pyridine dudit micro-organisme contient entre environ 7 à 20% en poids de protéine, entre environ 10 à 16% en poids

de sucre et entre environ 35 à 55% en poids d'acide gras.

3.- Le vaccin selon l'une des revendications 1 ou 2,

caractérisé par le fait que l'endotoxine détoxiquée raffinée est le lipide monophosphoryle A.

4.- Le vaccin selon l'une quelconque des revendications

précédentes, caractérisé par le fait que le composant (c) est

une structure de paroi cellulaire mycobactérienne, du dimy-

colate de tréhalose, un extrait soluble dans la pyridine d'un microorganisme, une combinaison d'une structure de paroi cellulaire mycobactérienne et de dimycolate de tréhalose, une combinaison de structure de paroi cellulaire mycobactérienne et d'extrait d'un microorganisme soluble dans la pyridine, une combinaison de dimycolate de tréhalose et d'un extrait de micro-organisme soluble dans la pyridine, ou une combinaison

de structure de paroi cellulaire mycobactérienne, de dimyco-

late de tréhalose et d'un extrait de micro-organisme soluble

dans la pyridine.

5.- Un procédé pour la préparation d'un vaccin pour le

traitement et la prévention de tumeurs chez un hôte, caracté-

risé par le fait qu'il comprend la réalisation d'un mélange de: (a) au moins un antigène associé à la tumeur; (b) une endotoxine détoxiquée raffinée; (c) au moins un immunostimulant biologique choisi dans le groupe consistant en: 1) la structure de paroi cellulaire mycobactérienne, 2) un dimycolate de tréhalose, et

3) un extrait soluble dans la pyridine d'un micro-

organisme; et

(d) un support pharmaceutiquement acceptable.

6.- Le procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait que l'endotoxine détoxiquée raffinée ne présente pas de 2-céto-3désoxyoctanoate détectable entre environ 350 et

475 nmoles/mg de phosphore et entre environ 1 700 et 2 000 nmo-

les/mg d'acides gras, l'endotoxine détoxiquée raffinée étant

le lipide monophosphoryle A, le composant (c) étant une struc-

ture de paroi cellulaire mycobactérienne ou du dimycolate de

tréhalose, ou un extrait soluble dans la pyridine d'un ricro-

organisme, ou une combinaison d'une structure de paroi cellu-

laire mycobactérienne et de dimycolate de tréhalose, ou une combinaison de structure de paroi cellulaire mycobactérienne et d'extrait d'un microorganisme soluble dans la pyridine, ou une combinaison de dimycolate de tréhalose et d'un extrait de micro-organisme soluble dans la pyridine, ou une combinaison

de structure de paroi cellulaire mycobactérienne, de dimyco-

late de tréhalose et d'un extrait de micro-organisme soluble

dans la pyridine.