DE10132502A1

DE10132502A1 - Angriff auf Tumorzellen mit fehlender, niedriger oder anormaler MHC-Expression durch kombinieren von nicht MHC-Restringierten T-Zellen/NK-Zellen und MHC-Restringierten Zellen

Info

Publication number: DE10132502A1
Application number: DE10132502A
Authority: DE
Inventors: Dolores Schendel; Christine Falk; Elfriede Noessner; Elisabeth Weiss
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2001-07-05
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2003-01-23
Also published as: US20030095955A1; ES2231616T3; US8142772B2; DE60201783T2; US7731950B2; JP2003113118A; ATE281180T1; US20100203086A1; EP1275400B1; EP1275400A1; DE60201783D1

Abstract

Diese Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen, die nicht-MHC-restringierte T-Zellen/NK-Zellen in Kombination mit MHC-restringierten T-Zellen enthalten und betrifft insbesondere therapeutische Zusamensetzungen, die LAK-Zellen umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der vorgenannten Kombination in der Behandlung von Tumoren bei Menschen, wobei die Tumore eine fehlende, niedrige oder anormale Expression von MHC Klasse Ia- oder Ib-Molekülen zeigen. Durch Anwendung der vorgenannten Zusammensetzungen/Kombinationen ist es möglich, einen ausgewogenen selektiven Druck gegen die Entstehung von Tumorzell-Varianten bereitzustellen, die sich ansonsten einer Erfassung durch das Immunsystem entziehen würden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen, die nicht MHC- restringierte T-Zellen/NK-Zellen in Kombination mit MHC-restringierten T-Zellen enthalten und betrifft insbesondere therapeutische Zusammensetzungen, die LAK-Zellen enthalten. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf die Verwendung der oben genannten Zusammensetzungen bei der Behandlung von Tumoren beim Menschen gerichtet, wobei die Tumore eine fehlende, niedrige oder anormale Expression von MHC-Molekülen zeigen.
Die Immunerkennung durch die meisten T-Lymphozyten erfolgt durch Oberflächeninteraktionen, die einen spezifischen T-Zellrezeptor (T cell receptor = TCR) auf dem Lymphozyten und ein Antigen auf der Zielzelle einschließen. Anders als Antikörper erkennen TCR keine intakten Antigene. Mit wenigen Ausnahmen erkennen sie nur Bruchstücke von Antigenen in der Form von Peptiden, die auf der Zelloberfläche durch Moleküle des Haupthistokompatibiltätskomplexes (major histocompatibility complex = MHC) präsentiert werden. Die Fähigkeit von T-Zellen, ein Antigen nur zu erkennen, wenn es durch MHC-Moleküle präsentiert wird, wird als "MHC-Restriktion" bezeichnet. Die reagierenden T Zellen werden als MHC-restringierte Lymphozyten bezeichnet. Es existieren zwei Klassen von MHC-Molekülen, nämlich die der Klasse I und Klasse II, die funktionell durch die Antigenart unterschieden werden, an die sie binden und durch die Untergruppe an T Zellen, mit denen sie in Wechselwirkung stehen. Die Trennung zwischen Klasse I und Klasse II-Molekülen steht im Zusammenhang mit ihren unterschiedlichen Rollen bei der T Zell-Aktivierung. Klasse I-Moleküle präsentieren Peptide für MHC-restringierte CD8 positive cytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Diese Zellen lysieren Zielzellen direkt; die Annahme ist deswegen in biologischer Hinsicht angebracht, daß sie Peptide erkennen, die von intrazellulären Antigenen abgeleitet sind bzw. abstammen, die durch Klasse I-Moleküle präsentiert werden. Weil darüber hinaus Klasse I-Moleküle von fast allen kernhaltigen Zellen exprimiert werden, sind CTL dazu in der Lage, nahezu jede Zelle zu erkennen und zu zerstören, wenn sie den geeigneten MHC/Peptid-Komplex präsentiert. Andererseits präsentieren Klasse II-Moleküle Peptide an CD4 positive T-Helferzellen, deren primäre Funktion es ist, Cytokine zu sezernieren, die die Aktivitäten anderer Lymphozyten, einschließlich B-Zellen, Makrophagen und CTL, unterstützen. Sie spielen eine dominante Rolle beim sorgfältigen Organisieren der Immunreaktion bzw. Immunantwort.
MHC-Moleküle sind durch ihre hochpolymorphe Natur gekennzeichnet und viele unterschiedliche Varianten wurden definiert, die durch unterschiedliche Genorte und Allele kodiert sind. Viele der Aminosäurevariationen, durch die sich MHC-Allele unterscheiden, sind in der Bindungsfurche (binding groove) lokalisiert, wo sie deren Form und Ladung modulieren. Peptide, die dazu in der Lage sind, ein spezielles MHC-Molekül zu binden, müssen zur Konfiguration beziehungsweise zum Aufbau dieser Molekülbindungsfurche passen. Innerhalb der menschlichen Bevölkerung existieren viele unterschiedliche MHC- Allele und ein Individuum exprimiert im Allgemeinen sechs unterschiedliche Klasse Ia- Moleküle (kodiert durch die HLA-A, -B, und C Genorte), von denen jedes ein unterschiedliches Repertoir an Peptiden bindet, was auf die unterschiedliche Aminosäure- Zusammensetzung der Peptidbindungsfurche zurückzuführen ist. Zusätzlich weist ein Individuum HLA-Allele auf, die eine Anzahl von Klasse Ib-Molekülen kodieren, die HLA- E, F und G einschließen.
Für MHC-restringierte Zellen, die auf eine Antigen-Stimulierung reagieren sollen, müssen MHC/Peptidkomplexe an der Oberfläche einer Zielzelle exprimiert werden und die T- Zellen müssen ein verwandtes TCR exprimieren. Die spezifische Fähigkeit von T-Zellen, spezifische Antigene zu erkennen, die über MHC-Moleküle präsentiert werden, wurde in einer Vielzahl von therapeutischen Ansätzen verwendet, beispielsweise in der Anti- Tumortherapie.
Jedoch haben die bekannten Strategien bisher nicht berücksichtigt, daß das Immunsystem ein beträchtliches Repertoire von nicht-MHC-restringierten T Zellen aufweist, die zur Eliminierung von Tumorzellen verwendet werden können. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, daß Versuche, diese in der Anti-Tumortherapie zu verwenden, einfach nicht erfolgreich waren. Im allgemeinen bekämpft der nicht-MHC-restringierte Typ an T-Lymphozyten Tumoren durch die Erkennung von Tumorzellen, die unabhängig von der MHC-Peptidliganden-Expression eintritt.
Beispiele von Zellen, die eine nicht-MHC-restringierte Immunreaktion zeigen, sind Lymphokin aktivierte Killer-(Lymphokine Activated Killer = LAK)Zellen. Diese stellen ein Gemisch von aktivierten natürlichen Killerzellen (natural killer cells = NK) und nicht MHC-restringierten T-Zellen dar, die verschiedene Tumorzellen ebenso wie HLA Klasse I negative Zielzellen lysieren bzw. auflösen. Aktivierte NK-Zellen wie diejenigen, die in LAK-Populationen vorliegen, werden in ihrer zytolytischen Funktion im Anschluß an eine Interaktion mit MHC Klasse I-Molekülen gehemmt. Die Regulation von LAK-T Zellen ist jedoch bis jetzt niemals geklärt worden.
Das entstehende Verständnis der Rolle der Negativregulierung der Lymphozytenfunktion durch hemmende Rezeptor-Interaktionen mit MHC-Klasse I-Molekülen liefert neue Einsichten in die Mechanismen, die die LAK-Funktion beeinflussen. Während aktivierende Rezeptoren, wie beispielsweise natürliche Zytotoxizitäts-Rezeptoren für die Induktion einer NK-vermittelten Lyse verantwortlich sind, wird die zytolytische Kapazität von NK-Zellen letztendlich durch ihre Expression von inhibitorischen Rezeptoren bestimmt.
Ausgedehnte Untersuchungen unterschiedlicher Quellen an NK-Zellen haben gezeigt, daß im wesentlichen alle menschlichen NK-Zellen hemmende bzw. inhibitorische Rezeptoren tragen, die mit Klasse I-Molekülen interagieren und deren Zytotoxizität hemmen, wodurch normale somatische Zellen vor einem NK-vermittelten Angriff bewahrt werden (zusammengefaßt in (1-3)). Zwei Formen von inhibitorischen Rezeptoren werden durch NK-Zellen exprimiert: die inhibitorischen Killerzellrezeptoren (killer cell inhibitory receptors = KIR) gehören zur Immunglobulin-Superfamilie und interagieren mit klassischen MHC Klasse Ia(HLA-A, -B, -C)-Molekülen, wohingegen die inhibitorischen Rezeptoren der C-Typ Lektin-Superfamilie aus CD94/NKG2A Heterodimeren zusammengesetzt sind, die nicht klassische MHC Klasse Ib(HLA-E)-Moleküle binden (4; 5). Durch Expression von Klasse Ia und Ib-Molekülen tragen kernhaltige Zellen zwei Arten von Liganden, die unabhängig einen Angriff durch NK-Zellen verhindern können, die jeden dieser inhibitorischen Rezeptortypen tragen.
Jedoch wurde, wie oben festgestellt, die Regulation von LAK-abgeleiteten T(LAK-T)- Zellen niemals aufgeklärt.
In den letzten Jahren wurden neue therapeutische Ansätze, die sich das Immunsystem zu Nutze machen, zur Behandlung von Tumoren untersucht, die nicht durch geläufige Chemotherapien oder Bestrahlungs-Therapien eliminiert werden können. Die ersten Immuntherapien verwendeten eine systemische Verabreichung von Interferonen, entweder IFNα oder IFNγ, oftmals in Kombination mit IL-2 (6-9).
Rosenberg und Kollegen waren die ersten, die das Antitumor-Potential von LAK-Zellen für die Immuntherapie von Krebspatienten erforschten (10; 11). Im Anschluß an eine adoptive Übertragung von LAK-Zellen an Patienten mit einer fortgeschrittenen Erkrankung zeigten einige Patienten dramatische Reaktionen, viele Tumoren gingen jedoch nicht zurück. Zahlreiche Tierversuche und in vitro-Analysen von menschlichen LAK-Zellen zeigten aktivierte NK-Zellen als die Haupt-Effektorkomponente auf, die die Tumorregression bzw. den Tumorrückgang vermittelten, obwohl eine schwächere zytotoxische Funktion ebenfalls in der T-Zellfraktion gefunden wurde. Jedoch versagten klinische Versuche unter Verwendung von LAK-Zellen, entweder alleine verabreicht oder in Kombination mit hochdosiertem IL-2 zur Aufrechterhaltung der NK-Lebensfähigkeit darin, die klinische Wirksamkeit zu verbessern. Darüber hinaus wurden klinische Vorteile in ernsthafter Weise durch eine gleichzeitig auftretende Toxizität eingeschränkt, insbesondere, wenn IL-2 gleichzeitig mit den LAK-Zellen verabreicht wurde.
Weitere klinische Versuche untersuchten die Kapazität bzw. Fähigkeit von ungetrennten LAK-Zellen, eine Antitumor-Aktivität in vivo im Anschluß an den adoptiven Transfer großer Anzahlen von Zellen an Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung (10; 12-20) zu vermitteln. Während ein dramatischer Rückgang einiger krankhafter Tumor-Gewebsveränderungen beobachtet wurde, traten diese selten ein, waren nur von kurzer Dauer und mit einer hohen Toxizität verbunden. Bei Patienten, die hohe systemische Dosen einer IL-2 Therapie empfingen, wurde eine Induktion von LAK-Zellen bei den meisten Individuen unabhängig von deren klinischen Reaktionen in vivo und in vitro beobachtet, was zeigt, daß die Wirksamkeit von LAK-Zellen am wahrscheinlichsten auf der Ebene der Interaktion zwischen Effektorzellen und Tumorzellen reguliert wurde. Der vergebliche Versuch, die Grundlage der LAK-vermittelten Tumorregression auszumachen, um dadurch zu ermöglichen, daß Patienten identifiziert werden können, die von dieser Therapie abgesehen von der damit verbundenen Toxizität profitieren können, beschränkte eine weitere klinische Entwicklung.
Die Toxizität zusammen mit der Unfähigkeit zu verstehen, warum nur einige Tumoren zurückgingen, führte zum Fallenlassen von nicht-MHC restringierten T Zellen wie LAK- Zellen zu Gunsten von therapeutischen Strategien, die zum adoptiven Transfer von tumorinfiltrierenden Lymphozyten oder zur Induktion von Reaktionen von MHC- restringierten T Zellen konzipiert wurden. Diese neueren Strategien sind auch vielversprechend, jedoch wurde wiederum ein Tumorrückgang nur bei einigen Patienten beobachtet. Interessanterweise wurde in mehreren gut untersuchten Beispielen herausgefunden, daß Tumorvarianten entstanden, die einen teilweisen oder vollständigen Verlust einer MHC Klasse I-Expression bei Patienten zeigten, die starke Klasse I- restringierte CTL Reaktionen in vivo erzeugt hatten.
Es erscheint somit, daß selektiver Druck durch die CTL zur Entstehung von Tumorvarianten führte, die nicht mehr länger die entsprechenden MHC-Peptidkomplexe exprimieren, die von den TCR der CTL erkannt werden.
Umfassende immunohistochemische Studien von Tumoren zeigten eine hohe Prävalenz von Zellen, die eine anormale bzw. aberrante Expression von HLA-Molekülen zeigten, die oftmals auf ausgewählte HLA-Allotypen beschränkt ist. Während derartige Tumore noch Pan Klasse I-Antikörper binden, wie W6/32, könnte es ihnen ihre gestörte MHC- Expression ermöglicht haben, der Vernichtung durch MHC-restringierte CTL zu entgehen.
Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Strategie zur Behandlung von Tumoren bereitzustellen, die eine niedrige, fehlende oder anormale Expression von MHC Klasse I-Molekülen zeigen.
Dieses Problem wird durch die in den unabhängigen Ansprüchen dargelegten Merkmale gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Die Probleme, die mit den bis jetzt verwendeten Therapien/Zusammensetzungen verbunden sind, sind einerseits auf den oben beschriebenen Escapemechanismus zurückzuführen, der eine reduzierte Zugänglichkeit von Tumorzellen gegenüber einem Angriff von MHC-restringierten T-Zellen verursacht. Andererseits zeigten, wie oben beschrieben, Therapien, die nicht MHC-restringierte T Zellen einschlossen, keine lang anhaltenden, reproduzierbaren und effektiven therapeutischen Ergebnisse.
In vor kurzem erfolgten Experimenten haben die Erfinder gezeigt, daß nicht MHC- restringierte T-Zellen, beispielsweise LAK-T Zellen, genauso wie aktivierte NK-Zellen durch Interaktionen mit HLA Klasse I-Molekülen gehemmt werden. LAK T-Zellen lysieren Klasse I positive Tumorzellen, jedoch wird die Lyse unterdrückt, wenn Tumorzellen mit Interferon-gamma stimuliert werden, um deren Klasse I-Expression zu erhöhen. Die Hemmung der Zytotoxizität wird jedoch in Gegenwart von Klasse I- spezifischen monoklonalen Antikörpern umgekehrt. HLA negative Zielzellen können teilweise vor der Lyse durch LAK-T Zellen im Anschluß an ihre Transfektion, durch die sie HLA Klasse Ia oder Klasse Ib-Moleküle exprimieren, geschützt werden. Das Prinzip der Negativ-Regulierung durch HLA-Moleküle ist somit auf nicht-MHC-restringierte T- Zellen, wie beispielsweise LAK-T Zellen anwendbar, die vom Tumorpatienten und gesunden Kontroll-Spendern erzeugt werden. Obwohl LAK T-Zellen durch Klasse Ia und Klasse Ib-Moleküle gehemmt werden, exprimieren sie nicht die bekannten inhibitorischen NK-Rezeptoren. Offensichtlich werden sie durch bisher nicht definierte inhibitorische Rezeptoren negativ reguliert. Durch die Erfinder durchgeführte Experimente zeigten, daß diese T-Zellen äußerst effektiv bei der Erkennung von Tumorzellvarianten sind, die eine niedrige oder gestörte MHC Klasse I-Expression zeigen, weil ihre zytotoxische Funktion nicht wirksam durch Interaktionen mit Klasse I-Molekülen gehemmt werden konnte. Diese Ergebnisse haben zu einem neuen Ansatz geführt, der eine effektive Verwendung von nicht-MHC restringierten T-Zellen, beispielsweise LAK T-Zellen, in der Therapie von Tumorerkrankungen ermöglicht, indem Tumorvarianten bekämpft werden, die eine geringe oder anormale Expression von spezifischen HLA-Allotypen zeigen.
Auf Grundlage dieser Forschungsarbeit ergibt die Verwendung von therapeutischen Zusammensetzungen, die Immunzellen enthalten, die die Tumorzellen in einer nicht- MHC-restringierten Weise angreifen in Kombination mit MHC-restringierten T-Zellen einen ausgewogenen selektiven Druck gegen das Auftreten von Tumorzell-Varianten, die anderenfalls einer Immunerfassung entgehen könnten.
Im allgemeinen enthält eine therapeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung folgendes:

a) aktivierte nicht-MHC-restringierte T-Zellen und/oder natürliche Killerzellen (NK)- Zellen in Kombination mit
b) MHC-restringierten T-Zellen oder
c) therapeutischen Mitteln, die Immunreaktionen von MHC-restringierten T-Zellen induzieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden Lymphokin aktivierte Killerzellen (LAK)-Zellen als aktivierte nicht-MHC-restringierte T-Zellen und/oder natürliche Killerzellen verwendet.
LAK Zellen repräsentieren eine Mischpopulation von CD3^- NK Zellen und CD3⁺ T-Zellen, von sowohl CD4 als auch CD8-Untergruppen. Charakteristisch für LAK-Zellen ist ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Tumorzellen in einer nicht-MHC-restringierten Weise zu lysieren. Zusätzlich können LAK-Zellen Klasse I-negative Zielzellen, wie beispielsweise Daudi und K562 abtöten, die als allgemeine Standards für die Identifizierung von nicht- MHC-restringierten zytotoxischen Effektorzellen dienen. Eine Trennung von LAK- Populationen in CD3^- und CD3⁺-Fraktionen zeigte, daß sowohl NK-Zellen als auch T- Zellen Klasse I negative Zielzellen und eine Vielzahl von unterschiedlichen Tumorzellen lysieren konnten.
In der Praxis zeigen LAK-Zellen einen bedeutenden Vorteil gegenüber anderen nicht- MHC-restringierten T-Zellen/NK Zellen, der in der relativ einfachen Art und Weise besteht, in der diese Zellen in vitro erzeugt werden können. Wie oben beschrieben, und wie es ausführlich in den Beispielen beschrieben ist, werden LAK-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells = PBMC) durch in vitro- Kultur in Gegenwart hoher Dosen Interleukin-2 (IL-2) gewonnen. Dieser Weg ist den anderen Wegen zur Herstellung von menschlichen NK-Zellen ebenso wie CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen überlegen, das heißt durch allogene Stimulation von gemischten peripheren Blutlymphozyten (PBL) Populationen.
Tumorspezifische CTL können durch unterschiedliche Ansätze erzeugt werden, indem entweder frisches Tumormaterial oder bekannte, rekombinante Tumorantigene verwendet werden, abhängig vom Wesen des Tumors und der Verfügbarkeit von Gewebsmaterial. Weitere Einzelheiten bezüglich der Erzeugung von tumorspezifischen CTL sind in den Beispielen dargelegt.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können als eine Kombination von aktivierten nicht-MHC-restingierten T-Zellen und/oder natürlichen Killer-(NK)-Zellen in Kombination mit MHC-restringierten T-Zellen oder alternativ in Kombination mit therapeutischen Mitteln verabreicht werden, die Immunreaktionen von MHC-restringierten T-Zellen induzieren.
Gemäß eines Grundgedankens der vorliegenden Erfindung ist das therapeutische Mittel zum Induzieren von Immunreaktionen von MHC-restringierten T-Zellen ein Impfstoff beziehungsweise eine Vakzine, die Tumorzellen oder dendritische Zellen umfaßt.
Ein weiterer Grundgedanke ist der Einsatz der Gentherapie, durch die eine Immunreaktion von MHC-restringierten T-Zellen unter Verwendung von gentechnisch veränderten Tumorzellen induziert wird, die zusätzliche, Zytokine oder Oberflächenmoleküle kodierende Gene enthalten, die zur Verbesserung ihrer Fähigkeit zur Induktion spezifischer Immunreaktionen dienen. Derartige genetische Modifikationen können in Tumorzellen ex vivo eingeführt werden, die dann als Impfstoffe dem Patienten wieder verabreicht werden oder die Gene könne in vivo durch verschiedene Mittel in Tumore eingeführt werden.
Die vorher erwähnten therapeutischen Zusammensetzungen können bei der Behandlung von Tumoren verwendet werden, die eine niedrige, fehlende oder anormale Expression von MHC Klasse Ia oder Ib-Molekülen zeigen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform zeigen diese Tumore eine niedrige, fehlende oder anormale Expression von HLA-C und/oder HLA-E Molekülen.
Beispiele dieser Tumore sind Karzinome des Darms, der Brust, der Prostata ebenso wie Nierenzellkarzinom (renal cell carcinoma = RCC) und Melanom.
Die nicht-MHC-restringierten Zellen können entweder separat oder in Kombination mit dem adoptiven Transfer von MHC-restringierten CTL verabreicht werden oder können parallel mit der Verabreichung anderer therapeutischer Strategien verabreicht werden, die zur Induktion einer MHC-restringierten T Zell Reaktion in vivo entwickelt wurden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die beispielsweise LAK-Zellen enthalten können, die aus Gemischen von aktivierten NK- und LAK-T Zellen bestehen oder aus Kulturen, die vorherrschend LAK-T-Zellen enthalten, können zur adoptiven Therapie von Patienten verwendet werden, deren Tumoren die folgenden Charakteristika zeigen:

1. fehlende Expression irgendwelcher oder aller MHC Klasse- IA oder Klasse Ib-Moleküle.
2. geringe Expression von MHC Klasse Ia (kodiert durch HLA-A, B oder C-Genorte) oder Klasse Ib-Moleküle (kodiert vom HLA-E oder HLA-G-Genort). Dies kann Tumoren einschließen, die eine geringe Expression an jedem einzelnen Genort oder für jedes einzelne Allel dieser vier Genorte zeigen.
3. Tumore, bei denen die natürlichen Spiegel der HLA-C oder HLA-E Expression sie für NK oder LAK-T Zellen besonders empfänglich machen.

Die fehlende Expression oder niedrige Spiegel der MHC Klasse Ia oder Klasse Ib- Expression kann nur für einige Tumorzellen in der Tumorzellpopulation charakteristisch sein (entweder Primärtumore oder Metastasen) oder kann für alle Zellen in der Tumorpopulation charakteristisch sein (entweder Primärtumore oder Metastasen). Es existieren unterschiedliche Ansätze, wie die MHC Klasse I-Expression in Tumoren bestimmt werden kann:

a) durch immunhistochemische Färbung von kryokonserviertem Tumormaterial mit Kryostat-Schnitten unter Verwendung geeigneter monoklonaler Antikörper zum Nachweis der MHC-Expression (beispielsweise 21; 22).
b) durch Durchflußzytometrieanalyse von isolierten Tumorzellen unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die gegen die MHC Klasse I-Moleküle gerichtet sind, wie beispielsweise das Reagens W6/32 (American Type Tissue Culture Collection, Rockville MD, USA) oder weitere Antikörper, die Proteine nachweisen, die von spezifischen MHC Genorten oder Allelen kodiert werden (beispielsweise (23)).
c) durch eine Molekularanalyse der MHC-Allelexpression unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die das Vorhandensein oder die Abwesenheit der verschiedenen Genorte in DNA nachweisen können, die aus den Tumorzellen isoliert wurde (das heißt diese Verfahren können chromosomale Veränderungen in den MHC-Genen nachweisen) (beispielsweise (24)).
d) durch RT-PCR Verfahren zum Nachweis von fehlenden oder verminderten Spiegeln an RNA, die MHC Klasse IA oder Klasse Ib Allele kodiert (beispielsweise (25)).
e) durch biochemische Untersuchungen unter Verwendung der Verfahren der isoelektrischen Fokussierung zum Nachweis des Verlustes von Proteinbanden, die den verschiedenen MHC Klasse I Genorten oder Allelen entsprechen (beispielsweise (26)) und
f) durch funktionelle Studien unter Verwendung von gut charakterisierten NK- oder LAK-T-Zellen, die durch spezifische Klasse Ia oder Klasse Ib-Moleküle negativ reguliert sind. Das Versagen von Tumorzellen, die Zytotoxizität derartiger Effektorzellpopulationen zu hemmen zeigt, daß sie gegenüber einem Angriff durch LAK- oder LAK-T-Zellen mit ähnlichen Spezifitäten zugänglich sind.

Als Kontrollen für jedes dieser Verfahren kann man, wenn verfügbar, entsprechendes normales Gewebe verwenden. Beispielsweise kann man im Falle von Nierenzellkarzinomen normales Nierenparenchymgewebe verwenden, das zum Zeitpunkt der Tumor- Nephrektomie gewonnen wird. Alternativ kann man PBMC als Kontrolle verwenden.
Als Zusammenfassung kann die Kombination von nicht-MHC-restringierten und MHC- restringierten Zellen in den folgenden Situationen angewendet werden:

1. Wenn die Tumorzellen (entweder Primärtumore oder Metastasen) des Patienten irgendwelche der vorstehend bezüglich der MHC Klasse Ia oder Klasse Ib- Expression beschriebenen Eigenschaften zeigen.
2. Wenn die Patienten Immuntherapiebehandlungen unterzogen wurden, bei denen das therapeutische Prinzip auf der MHC-restringierten Tumorzellerkennung basiert, wobei ihre Tumore (entweder primäre oder Metastasen) nicht reagierten, nur teilweise Reaktionen zeigten oder eine Reaktion zeigten, jedoch nachfolgend ein erneutes Wachstum zeigten. Diese Situationen zeigen an, daß MHC-restringierte T Zellreaktionen allein nicht dazu in der Lage waren, alle Tumorzellen zu eliminieren.
3. Bei Patienten mit großer Tumorbelastung (entweder primäre oder metastatische Gewebsveränderungen) für Tumortypen, von denen sich früher herausgestellt hat, daß sie in einer großen Prozentzahl aller Fälle eine anormale MHC-Expression zeigen, wie beispielsweise Melanome, Kolonkarzinome, Brustkrebs und Prostatakarzinome (beispielsweise (21; 22)).
4. Bei Patienten, die Immuntherapien auf Grundlage der Induktion von MHC- restringierten T Zellen empfangen sollen, als eine Parallelbehandlung, um der Selektion von Tumorvarianten entgegenzutreten, die nicht durch MHC-restringierte Effektorzellen erkannt werden können.

Nicht-MHC-restringierte Zellen können dem Patienten im Anschluß an die Aufnahme von Immuntherapien auf Grundlage von MHC-restringierten Reaktionen, gleichzeitig mit derartigen Therapien oder vor der Verabreichung von Therapien auf Grundlage von MHC- restringierten Reaktionen verabreicht werden.
Die exakte Verabreichungsart muß mit den anderen Bestandteilen beziehungsweise Komponenten der Therapie koordiniert werden (beispielsweise die adoptive Übertragung von MHC-restringierten CTL oder die Verabreichung verschiedener Vakzine-Formen zur Induktion von MHC-restringierten Reaktionen. Dies kann gemäß veröffentlichter Studien (beispielsweise 11-15) durchgeführt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1. Zytotoxische Aktivitäten von LAK-Zellen, die von RCC-Patienten und gesunden Spendern gewonnen wurden, gegen MHC Klasse I negative und maligne Zielzellen. (A) aus PBMC zweier RCC-Patienten gewonnene LAK-Zellen, LAK-26 (schwarze Balken) und LAK-53 (gepunktete Balken), und (B) von zwei gesunden Spendern gewonnene LAK-Zellen, CP-176 (weiße Balken) und CP-41 (schraffierte Balken) wurden mit drei MHC Klasse I negativen Zielzellen, nämlich L721.221, K562 und Daudi untersucht. Die Ergebnisse stellen Durchschnittswerte ± Standardabweichungen in % bezüglich der zytotoxischen Reaktionen (%RCR) (27) dar, kalibriert auf eine 50%ige Lyse von L721.221-Zellen unter Verwendung der aus fünf bis sieben unterschiedlichen Experimenten gewonnenen Daten. Die Spiegel der prozentualen spezifischen Lyse bewegten sich von 25 bis 50%. LAK-26 und LAK-53 Zellen wurden bei einem E : T von 10 : 1 getestet; LAK-CP 176 und LAK-CP41 bei einem E : T von 20 : 1. (C) Spezifische zytotoxische Aktivität von LAK-26 Zellen gegen verschiedene RCC-Linien (RCC und SKRC) und eine Melanom-Linie (MEL-25) bei einem E : T von 20 : 1. (D) Spezifische Lyse- Muster von LAK-CP176-Zellen gegen dieselben RCC und MEL-Linien bei einem E : T von 20 : 1.
Fig. 2. Hemmung der Lyse durch endogene oder exogene IFNγ-Modulation von RCC-26 Zellen.
Eine spezifische zytotoxische Aktivität von LAK-26 T Zellen (A-C) und B.3NK-Zellen (D-F) gegen RCC-26 Zellen (p), Vektorkontrollzellen RCC-26VC (□) ohne IFNγ (offene Symbole) oder nach 96 h Stimulierung mit 1000 U/ml IFNγ (schwarze Symbole). Unmodifizierte RCC-26- und RCC-26VC-Zellen wurden direkt bezüglich ihrer Empfindlichkeit gegenüber einer Lyse durch LAK-26 (A) und B.3NK (D) verglichen. Zwei endogene IFNγ exprimierende RCC-26 Linien endoγ1 ( ≙) und endoγ2 ( ≙) wurden als Zielzellen im Vergleich zu RCC-26VC Kontrollzellen (□) für LAK-26 Zellen (B) und B.3NK Zellen (E) verwendet. Die zytotoxische Aktivität von LAK-26 (C) und B.3NK- Zellen (F) gegen endoγ1 und endoγ2-Zellen ohne (

;
) oder nach 96 h Stimulierung mit exogenen IFNγ ( ≙). Alle Effektor/Target-Kombinationen wurden gleichzeitig getestet. Die Daten sind als % spezifische Lyse für eines von vier unabhängigen Experimenten dargestellt. (G) Expression von MHC Klasse I auf RCC-26 Tumorzellen und transduzierte Varianten unter Verwendung des Pan Klasse I-spezifischen monoklonalen Antikörpers W6/32. Die Daten repräsentieren korrigierte durchschnittliche Fluoreszenz-Intensitäten (ΔMFI), evaluiert durch subtrahierendes MFI mit einem monoklonalen Isotyp- Kontrollantikörper von MFI mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper für eines von neun repräsentativen Experimenten.
Fig. 3. LAK und B.3NK-Aktivitäten sind nicht tumorspezifisch und die Hemmung kann durch Blockierung mit HLA Klasse I-monoklonalen Antikörper umgekehrt werden. (A)LAK-26 und (B) B.3NK Zellen wurden parallel gegen Tumor (RCC-26)- Zellen und normale Nierenzellen (NKC-26) in Gegenwart eines monoklonalen Kontrollantikörpers (MOPC21) ohne IFNγ (weiße Balken) oder im Anschluß an 96 h IFNγ-Stimulierung (schwarze Balken) getestet. Mit Klasse I-spezifischen monoklonalen Antikörpern (W6/32) für 30 Minuten vorinkubierte Zellen sind durch schraffierte Balken in beiden Diagrammen angezeigt. RCC-26 (C + E) und NKC-26 (D + F) wurden bezüglich einer HLA Klasse I-Oberflächenexpression unter Verwendung von W6/32 für ein allgemeines Klasse I-Anfärben (C + D) untersucht und unter Verwendung des HLA-C- spezifischen monoklonalen Antikörpers L31 (E + F). Nichtstimulierte RCC-26 oder NKC- 26-Zellen sind in fett gedruckten Diagrammen dargestellt, IFNγ-stimulierte Zellen sind als ausgefüllte Diagramme dargestellt und eine Kontrollanfärbung mit dem monoklonalen Antikörper MOPC21 ist mit dünnen Linien dargestellt.
Fig. 4. Hemmung der LAK-Zytotoxizität durch HLA Klasse Ia und Ib-Moleküle, die in Klasse I negative Zellen transfiziert wurden. (A-D) Zytotoxizität von LAK-26 Zellen wurde unter Verwendung unterschiedlicher Klasse I negativer Zielzellen im Anschluß an eine Modifikation zum Exprimieren von Klasse I-Molekülen getestet. (A) Die Klasse I negative L721.221 (ρ) Linie im Vergleich zur Klasse I-positiven HLA- hemizygoten Variante L721.112-Linie, die den HLA-A1, Cw7, B8 Haplotyp (π) exprimiert. (B) Klasse I negative Daudi-Zellen ( ≙) im Vergleich mit Klasse I positiven Daudi-β₂m Transfektanten, die potentiell A.0102, A.6601, B.5801, B.5802, Cw.0302 und Cw.0602 exprimieren ( ≙) (28). (C) Klasse I negative K562 Zellen (

) und die entsprechenden HLA-E exprimierende Transfektante (♦). (D) L721.221 Zellen verglichen mit Transfektanten, die einzelne HLA-Allele exprimieren (B.3501, Cw.0702, Cw.0602) zeigen vergleichbare Spiegel einer MHC-Expression (Daten nicht dargestellt). Die Daten repräsentieren Durchschnittswerte + Standardabweichung der prozentualen RCR von drei unabhängigen Experimenten bei einem E : T von 20 : 1. (E) LAK-CP41 und (F) LAK- CP176-Lyse von L721.221 Zellen und Transfektanten, die HLA-G, B.3501, B.2705, Cw.0702 und Cw.0602 bei einem E : T von 20 : 1 exprimieren. Die Daten für A-C repräsentieren eine prozentuale spezifische Lyse und D-F-Werte repräsentieren Mittelwerte + Standardabweichung des prozentualen RCR unter Verwendung einer 50% Lyse von L721.221 als einer Referenz aus drei oder mehr unabhängigen Experimenten (27). Die Werte der prozentualen spezifischen Lyse von L721.221 bewegten sich von 35% bis 58%.
Fig. 5. Negative Regulierung von zytotoxischen CD4⁺ LAK-T Zellen. (A) Phänotypische Analyse von angereicherten CD4⁺ LAK-26 abgeleiteten T-Zellen (links) und die gemischte LAK-26 Population (rechts). Die CD3 und CD4 Färbung ist dargestellt. Das zytotoxische Muster von angereicherten CD4⁺ LAK-26-abgeleiteten T Zellen (B) wurde mit demjenigen von gemischten LAK-26 Zellen verglichen (C). Die Daten stellen eine prozentuale RCR unter Verwendung einer 50%igen Lyse von K562 Zellen als einen Referenzwert dar. Die prozentuale spezifische Lyse für K562 durch CD4⁺T Zellen betrug 26% und 30% der gemischten Population.
Im Folgenden wird eine ausführliche Beschreibung der vorliegenden Erfindung bereit gestellt. Die der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegenden Grundprinzipien werden durch eine spezielle Art von nicht-MHC-restringierten Zellen, das heißt durch LAK-Zellen veranschaulicht. Es sei jedoch angemerkt, daß der Schutzbereich der Erfindung nicht auf LAK-Zellen und ihrer Verwendung beschränkt ist.
LAK-Zellen von RCC-Patienten und gesunden Spendern erkennen MHC Klasse I negative Zielzellen und HLA Klasse I positive Tumorzelllinien.
LAK-Zellen die aus PBMC von Patienten mit RCC und gesunden Spendern erzeugt wurden, wurden auf ihre zytotoxische Aktivität getestet, die gegen MHC Klasse I negative Zielzellen und verschiedene Tumorzelllinien gerichtet ist. Fig. 1 faßt die zusammengefaßten Ergebnisse mehrerer unabhängiger Experimente zusammen, bei denen die HLA Klasse I negativen Zielzellen L721.221, K562 und Daudi effizient durch vier unterschiedliche LAK-Populationen lysiert wurden. Keine wesentlichen Unterschiede im Spiegel der zytotoxischen Aktivität wurden zwischen LAK-26 und LAK-53 beobachtet, die von zwei RCC-Patienten (Fig. 1A) stammten und LAK-CP176 und LAK-CP41, die von zwei gesunden Kontrollspendern (Fig. 1B) stammten. Die von Patienten stammenden LAK-26 war dazu in der Lage, die autologe RCC-Linie (RCC-26) zu lysieren und zusätzlich konnte sie verschiedene allogene RCC-Linien (SKRC) ebenso wie die MEL-25 Melanomlinie unabhängig vom HLA-Hintergrund (Fig. 1 C) erkennen. Die von Kontrollspendern gewonnene LAK-CP 176 Linie lysierte diese unterschiedlichen Tumorzelllinien in einer ähnlichen Weise (Fig. 1D). Es wurde durch ihre Bindung an den Klasse I spezifischen monoklonalen Antikörper, W6/32, dargestellt, daß all diese Tumorlinien Klasse I positiv waren (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse demonstrieren, daß die LAK-Populationen dazu in der Lage waren, Zielzellen in einer nicht-MHC- restringierten Weise zu erkennen und eine Lyse war nicht für irgend eine einzelne Tumorart spezifisch.
LAK Populationen sind in erster Linie aus CD4⁺ und CD8⁺ T-Zellen zusammengesetzt.
Eine phänotypische Analyse von Lymphozyten-Untergruppen wurde aus den expandierten LAK-Kulturen hergestellt, die von den vier unterschiedlichen Spendern, die bei diesen Studien verwendet wurden, gewonnen wurden. Tabelle 1 zeigt die Verteilung von CD3^- CD56⁺NK Zellen und von CD3⁺CD56^-T-Zellen in diesen LAK-Populationen. Unterschiede zwischen LAK-Zellen, die von RCC-Patienten und gesunden Spendern gewonnen wurden, waren nicht ersichtlich: CD3⁺T-Zellen waren der Hauptzelltyp, der mehr als 95% der Zellen in allen Proben repräsentierte. Während die LAK-CP176-Kultur von CD8⁺T-Zellen dominiert wurde, enthielten die anderen LAK-Proben ungefähr gleiche Anzahlen an CD4⁺ und CD8⁺T-Zellen. Im Gegensatz hierzu waren CD3^-CD56⁺NK-Zellen in nur sehr geringen Anzahlen vorhanden, und bewegten sich von 0-6% der Gesamtzellen. Diese Ergebnisse zeigten, daß die Kultur-Bedingungen, die zur Erzeugung und Erhaltung dieser LAK-Zellen verwendet wurden, in erster Linie zur Expansion der T- Zell-Fraktion der Lymphozyten als der adhärenten Fraktion von NK-Zellen führte. Der Phenotyp dieser LAK-Zelllinien zeigte an, daß die zytolytische Haupt-Komponente den aktivierten T-Zellen zuzuschreiben war. Tatsächlich veränderte die Abreicherung der kleinen verbleibenden Fraktion an NK-Zellen aus den gemischten LAK-Populationen deren zytotoxisches Potential oder Spezifität nicht (Daten nicht dargestellt).
Eine MHC Klasse I-Zunahme ist mit einer IFNγ-vermittelten Hemmung von LAK-T Zellen und aktivierten NK-Zellen verbunden.
Es wurde bereits früher gezeigt, daß die IFNγ-Behandlung von Tumorzellen zu einer Resistenz gegenüber gereinigten NK-Zellen und LAK-Zellen (29; 30) führt. Um zu bestimmen, ob die MHC-Expression ebenfalls die Tumorzell-Empfindlichkeit gegenüber LAK-T Zellen beeinträchtigt, wurden RCC-26 Zellen nach Steigerung derer Klasse I- Expression durch exogene IFNγ-Stimulierung untersucht. Alternativ wurde die RCC-26 Linie mit menschlicher IFNγ cDNA transduziert, was zu einer endogenen Zytokin- Produktion und anschließenden Nach-oben-Regulierung der Klasse I-Expression (31) führte. Die Empfänglichkeit dieser unterschiedlichen IFNγ-modulierten RCC-26 Zellen gegenüber einer Lyse wurde unter Verwendung von autologen LAK-26 T-Zellen untersucht (Fig. 2A-C). Gereinigte B.3NK-Zellen, von denen kürzlich gezeigt wurde, daß sie ausschließlich p58.2-Rezeptoren der KIR-Familie exprimieren, die HLA-C Moleküle der Cw1, 3, 7 Subgruppe binden, wurden zu Vergleichszwecken eingeschlossen (Fig. 2D-F). Nicht modifizierte RCC-26 Zellen und die Kontrollinie, die einen leeren Vektor (RCC- 26VC) trug, wurden durch beide Effektorzelltypen lysiert, wobei die aktivierten NK-Zellen eine stärkere lytische Kapazität zeigten. Im Anschluß an die Stimulierung mit exogenen IFNγ zeigten beide Tumorlinien eine beträchtliche Resistenz gegenüber einer Lyse durch sowohl LAK-T als auch NK-Zellen (Fig. 2A, D). Ein ähnlicher Resistenzgrad wurde bei einer IFNγ-Transduktanten (endoγ1) beobachtet, wohingegen die zweite Transduktante (endoγ2) nur eine teilweise Resistenz gegenüber beiden Effektorpopulationen zeigte (Fig. 2B, E). Jedoch führte eine weitere Stimulierung mit IFNγ zu einer erhöhten Resistenz dieser Transduktante gegenüber sowohl LAK-26 T Zellen als auch B.3NK-Zellen (Fig. 2C, F). Diese Resistenz war mit derjenigen vergleichbar, die durch eine exogene IFNγ- Stimulierung von RCC-26 und RCC-26VC-Zellen induziert wurde. In Parallelstudien zeigten die LAK-53, LAK-CP41 und LAK-CP176 T-Zellen zytotoxische Muster wie diejenigen von LAK-26 T Zellen und B.3NK-Zellen, was eine allgemeine Beziehung zwischen IFNγ-induzierten Wirkungen und einer Resistenz gegenüber LAK-abgeleiteten zytotoxischen T-Zellen demonstriert (Daten nicht dargestellt).
Die Abnahme der LAK-T und Kontroll NK-Aktivität im Anschluß an eine Wechselwirkung mit den unterschiedlichen Target- beziehungsweise Zielzellen wurde beständig in allen Experimenten beobachtet, bei denen Zunahmen der Klasse I-Expression durch Durchflußzytometrie nachgewiesen wurden. Fig. 2G zeigt repräsentative Ergebnisse eines von zahlreichen Experimenten, die die Steigerung der MHC Klasse I- Expression durch IFNγ in RCC-26 Zellen untersuchten. Obwohl RCC-26 und RCC-26VC- Zellen konstitutiv beträchtliche Spiegel an Klasse I-Molekülen exprimierten, wurde die Expression im Anschluß an eine IFNγ-Stimulierung erhöht, wie es durch Anfärben mit dem Klasse I-spezifischen monoklonalen Antikörper, W6/32, nachgewiesen wurde. Während die Gesamtspiegel der MHC-Expression zwischen den unterschiedlichen Zelllinien variierten, waren diese reproduzierbar und gaben offensichtlich Variationen in der Reaktivität beziehungsweise Ansprechbarkeit der einzelnen Linien gegenüber der IFNγ-Induktion wieder. Interessanterweise zeigte die endoγ2-Linie niedrigere konstituive Spiegel an MHC-Molekülen im Vergleich zu endoγ1-Zellen. Diese Transdukante war ebenfalls gegenüber der LAK-T- und NK-vermittelten Zytotoxizität zugänglicher. Jedoch führte die Stimulierung von endoγ2-Zellen mit exogenen IFNγ zu einer erhöhten Klasse I- Expression (Daten nicht dargestellt) und zu einer erhöhten Resistenz gegenüber den beiden Effektorzelltypen (siehe Fig. 2C, F). Es wurde in zusätzlichen Experimenten dargestellt, daß andere Tumorzelllinien im Anschluß an ihre Behandlung mit IFNγ eine Resistenz gegenüber LAK-T-Zellen (Daten nicht dargestellt) erwarben.
Die Verfügbarkeit einer Zelllinie, die von normalem Nierenparenchym von Patient 26 (NKC-26) (32) gewonnen wurden, erlaubte die Bestimmung, ob die IFNγ-induzierte Hemmung von LAK-T und NK-Zytotoxizität auf Tumorzellen beschränkt war oder ob sie auch die Lyse normaler Epithelzellen beeinflußte. NKC-26 Zellen wurden durch autologe LAK-26 T Zellen lysiert (Fig. 3A) und durch allogene B.3NK Zellen (Fig. 3B) lysiert, was demonstriert, daß diese Effektorzellen nicht tumorspezifisch waren. Wie es bei RCC-26 Zellen ersichtlich war, hatte die exogene IFNγ-Stimulierung von NKC-26 Zellen eine beträchtliche Hemmung der Zytotoxizität durch sowohl LAK-T Zellen als auch aktivierte NK-Zellen zur Folge, was zeigt, das die IFNγ-induzierte Resistenz ebenfalls nicht tumorspezifisch war. In nicht dargestellten Studien wurde herausgefunden, daß allogene LAK-T Zellen die NKC-26 Linie lysieren konnten und daß die IFNγ-Stimulierung zu deren teilweiser Resistenz führte, was darauf hinweist, daß diese Wirkung nicht auf autologe LAK-T Zellen beschränkt war.
Parallelstudien, die die Klasse I-Expression im Anschluß an die IFNγ-Stimulierung untersuchten, zeigten eine erhöhte Bindung von W6/32 Antikörper durch sowohl RCC-26 (Fig. 3C) als auch NKC-26 Zellen (Fig. 3D). Desgleichen stellte sich heraus, daß die Spiegel von HLA-C Molekülen, die als die Liganden für die inhibitorischen p58.2 Rezeptoren dienen, die die Aktivität der B.3NK-Zellen regulieren, auf beiden Zelllinien unter Verwendung von monoklonalen Antikörper L31 (Fig. 3E, F) zunahmen. Das schwache Färbemuster, das bei dem monoklonalen Antikörper L31 beobachtet wurde, kann durch dessen bevorzugte Reaktivität mit β₂m-freien schweren Ketten von HLA-C Molekülen (33) erklärt werden.
Ein MHC Klasse I-spezifischer Antikörper kehrt die Hemmung der LAK-T Zell- Zytotoxizität um.
Weil IFNγ die Expression vieler unterschiedlicher Gene reguliert, wurden funktionelle Hemmungs-Studien unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers zur Blockierung der Klasse I-Liganden auf Zielzellen verwendet, um zu demonstrieren, daß diese Moleküle direkt zur nach-unten-Modulierung der LAK-T und NK-Aktivität beitragen. Eine Präinkubation von IFNγ-stimulierten RCC-26 oder NKC-26 Zellen mit dem monoklonalen Antikörper W6/32 führten zur Umkehrung der Hemmung beider Effektorpopulationen (Fig. 3A, B). Somit wurde die Resistenz normaler Epithelzellen und Tumorzellen durch Klasse I-Moleküle vermittelt und eine Antikörpermaskierung der Klasse I Oberflächenexpression konnte die Zugänglichkeit beziehungsweise Empfänglichkeit beider Zielzellen gegenüber einer Lyse wieder herstellen.
Die Klasse I-abhängige Hemmung der LAK-T-Zytotoxizität wurde durch ausgedehnte Blockierungsstudien bestätigt, die in Tabelle 2 zusammengefaßt sind. Zytotoxische Aktivitäten von LAK-T Zellen (LAK26, LAK-CP41) und B.3NK-Zellen gegen verschiedene Zielzellen wurden in Gegenwart von W6/32 oder eines monoklonalen Isotyp- Kontrollantikörpers untersucht. Eine Präinkubation nicht stimulierter RCC-26 und RCC- 26VC-Zellen mit dem monoklonalen Antikörper W6/32 führten zu einer kleinen Erhöhung der Lyse durch die unterschiedlichen Effektorzellen, im Vergleich zu den Isotyp- Kontrollen. Ein Zusatz des monoklonalen Antikörpers W6/32 führte zu einer wesentlichen Umkehr der Hemmung der Lyse, die bei den IFNγ-stimulierten RCC-26 und RCC-26VC- Zellen beobachtet wurde. Darüber hinaus wurde die Lyse beider IFNγ-exprimierenden Transduktanten in der Gegenwart des monoklonalen Antikörpers W6/32 erhöht. Die beständig verbesserte Zytotoxizität, die durch Maskierung von Klasse I-Molekülen erreicht wurde, wurde ebenfalls bei einer zweiten RCC-Linie und einer korrespondierten IFNγ Transduktante beobachtet (Daten nicht dargestellt). Die Ergebnisse demonstrieren, daß Klasse I-Moleküle direkt zur IFNγ-vermittelten Hemmung von LAK-T Zellen und aktivierten NK-Zellen beitrugen.
HLA Klasse Ia und Klasse Ib-Moleküle können die LAK-T-Zytotoxizität hemmen.
Weil LAK-T Zellen Klasse I negative Zielzellen effizient lysierten, wurde untersucht, ob die Expression von Klasse I-Molekülen in derartigen Zellen die LAK-T Aktivität direkt hemmen konnte. Die Klasse I negative Zelllinie L721.221 wurde aus einer Klasse I positiven Lymphoblastoidzelllinie (L721) durch strahlungsinduzierte Mutagenese unter Selektion für sequentielle HLA-Verlustvarianten gewonnen. Die L721.112-Linie repräsentiert eine hemizygote Zelllinie, die in dieser Reihe erzeugt wird, die noch einen der beiden Eltern-Haplotypen (HLA-A1, B8, Cw7) exprimiert. Während L721.221 Zellen gegenüber LAK-26 T zellvermittelter Lyse sehr empfindlich war, ergab die Expression von Klasse I-Molekülen durch L721.112 Zellen einen Teilschutz (Fig. 4A). Die Daudi-Zelllinie erzeugt β₂m nicht und exprimiert daher stabile Klasse I-Molküle an der Zelloberfläche nicht. Die Transfektion des β₂m-Gens in Daudi-Zellen stellte deren Expression von Klasse I Molekülen (28) wieder her, was durch Anfärben mit dem monoklonalen Antikörper W6/32 (Daten nicht dargestellt) bestätigt wurde. Die nichtmodifizierte Zelllinie wurde effizient durch LAK-26 T Zellen lysiert, wohingegen transfizierte Zellen eine beträchtliche Resistenz zeigten (Fig. 4B). Es hat sich ebenfalls herausgestellt, daß die K562 Zellen teilweise gegen eine LAK-26 T zellvermittelte Lyse im Anschluß an eine Transfektion mit dem Klasse Ib-Gen, das HLA-E-Moleküle kodiert, teilweise resistent wurden (Fig. 4C). L721.221 Zellen wurde genetisch modifiziert, so daß sie B35, HLA-Cw6 und HLA-Cw7- Moleküle exprimierten, wurden ebenfalls als Zielzellen für die LAK-26 T Zellen untersucht. Während keine reproduzierbare Hemmung durch HLA-B35 oder HLA-Cw7- Moleküle ersichtlich war, wurde eine teilweise Resistenz (25%) durch HLA-Cw6- Expression (Fig. 4D) induziert. Diese Ergebnisse bestätigten, daß Klasse I Moleküle alleine direkt die LAK-26 T Zell-Zytotoxyzität hemmen konnten.
Eine Einsicht in die feine Spezifität der MHC-Hemmung wurde ebenfalls für weitere LAK-T Zellen (LAK-CP41 und LAK-CP176) gewonnen, weil es möglich war, deren Lyse von L721.221 Zellen um mehr als 50% durch Expression von HLA-Cw6 (Fig. 4E, F) zu hemmen. Im Gegensatz hierzu induzierte die Expression von HLA-G, -B35 und -B27 und -Cw7-Molekülen in diesen Zellen die Resistenz gegenüber LAK-T Zellen nicht. Ein inhibitorischer Einfluß von HLA-E Molekülen erschien unwahrscheinlich, weil das Signalpeptid von HLA-G an HLA-E Moleküle binden kann, wodurch ihre stabile Oberflächenexpression ermöglicht wird (34). Deswegen können die L721.221-G Zellen sowohl HLA-E Moleküle simultan exprimieren. Weil diese Zellen keine Hemmung verursachten, erscheint es, daß HLA-E keine regulatorische Rolle in diesen beiden LAK-T Zellpopulationen spielte.
Von LAK stammende CD4 T-Zellen werden ebenfalls durch MHC-Moleküle negativ reguliert.
Eine Anreicherung von CD4⁺-Lymphozyten wurde durch Abreichern der CD8⁺-Zellen aus einer gemischten LAK-T Zellpopulation durchgeführt. Um direkt zu bestimmen, daß diese T-Zellen zytolytisch waren und daß ihre Aktivität durch Exposition gegenüber IFNγ- modulierten Tumorzellen nach unten reguliert werden konnte, wurden CD4-selektierte T- Zellen (Fig. 5A, links) mit der ungetrennten LAK-26 T-Zellpopulation verglichen, die sowohl CD4 als auch CD8-Zellen enthielten (Fig. 5A, rechts). Die hochgereinigten CD4⁺ T-Zellen waren dazu in der Lage RCC-26, NKC-26 und K562 Zielzellen in einer Art und Weise zu lysieren, die der nicht getrennten LAK-T Population (Fig. 5B und C) analog war. Darüber hinaus führte die IFNγ-Modulation (exogene Stimulation oder endogene Expression) von RCC-26 und NKC-26 Zellen zur Hemmung der Lyse der gereinigten CD4⁺ T-Zellen in einer der ungetrennten Population von LAK-T Zellen ähnlichen Weise.
LAK-T Zellen exprimieren keine bekannten inhibitorischen Rezeptoren.
Die Demonstration, daß die LAK-T Zellen durch Klasse I-vermittelte Hemmung reguliert wurden, legte nahe, daß sie inhibitorische Rezeptoren wie diejenigen tragen könnten, die von NK-Zellen exprimiert wurden. Deswegen wurde eine Oberflächenphänotypisierung durchgeführt, um derartige Rezeptoren zu identifizieren, und zwar unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die für mehrere bekannte inhibitorische Rezeptoren spezifisch sind, die mit HLA-B, C oder E-Molekülen interagieren. Wie in Tabelle 3 zusammengefaßt ist, lagen inhibitorische Rezeptoren, die zur KIR-Immunglobulin Superfamilie gehören (p58.1, p58.2 oder NKB1) nicht auf den T-Zellen vor. Kleine Prozentsätze sowohl von CD3⁺ als auch CD3^-Zellen (3-7%) exprimierten CD94-Moleküle. Es wurde herausgefunden, daß sich in NK-Zellen CD94 mit dem NKG2A Corezeptormolekül verbindet, um eine HLA-E-spezifischen heterodimeren inhibitorischen Rezeptor zu erzeugen. Weil K562 Zellen, die HLA-E exprimierten, die LAK-26 T Zell-vermittelte Zytotoxizität beträchtlich hemmten (siehe Fig. 4C), erwarteten wir in dieser Population T- Zellen zu finden, die derartige Rezeptoren tragen. Jedoch banden weniger als 1% der LAK-26 T Zellen den NKG2A-Antikörper (Daten nicht dargestellt). Desgleichen wurden, weil LAK-26, LAK-CP41 und LAK-CP 176 teilweise durch HLA-Cw6-Moleküle gehemmt wurden (siehe Fig. 4D-F) einige T Zellen, die p58.1-Rezeptoren exprimierten erwartet, wurden jedoch ebenfalls in diesen Populationen nicht aufgefunden. Somit wurden die bekannten inhibitorischen Rezeptoren, die die NK-Zellhemmung durch HLA-C und HLA- E Liganden regulieren, durch LAK-T Zellen in keinem nennenswerten Grad exprimiert, obwohl die spezifischen Klasse I Liganden, die für diese Rezeptoren charakteristisch sind, offensichtlich inhibitorische Signale an diese T-Zellen lieferten.

Beispiele

Die nachfolgenden Beispiele sind zu Veranschaulichungszwecken dargelegt und sollen nicht als den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränkend aufgefaßt werden.

Erzeugung von LAK-Zellen

Es wurden Blutproben gewonnen, entweder unter Verwendung von Heparin (50 U/ml) (beispielsweise: Heparin-Natrium, Braun Melsungen AG) oder durch Anwendung einer Defibrination zur Vorbeugung einer Koagulation bzw. Gerinnung. Um größere Anzahlen von PBMC zu gewinnen, wurde eine Apharese durchgeführt, um das Äquivalent von 1-4 Litern Blut zu erhalten (Verfahren zur Blutherstellung sind in (35) beschrieben).
Periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells = PBMC) wurden durch Ficoll/Hypaque (beispielsweise Biocoll Separating Solution, Biochrom AG) - Dichtegradierenden-Zentrifugation unter Verwendung von Standardverfahren (35) isoliert.
PBMC wurden 2mal in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und direkt kultiviert oder für eine zukünftige Anwendung kryokonserviert. Zur Kryokonservierung wurden PMBC in Konzentrationen von 5-20 × 10⁶ Zellen/ml in 1 ml Teilmengen in RPMI-Kulturmedium eingefroren, das 25-50% autologes Serum und 10% DMSO in RPMI 1640 Medium enthielt (beispielsweise: RMPI 1640 Medium, Fa. Invitrogen) und in der Gasphase eines Tankes mit flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Kryokonservierte PBMC wurden durch tropfenweisen Zusatz von RPMI Medium, das 50% menschliches Serum enthielt zu einer teilweise angetauten Zellprobe aufgetaut. Im Anschluß an die Übertragung in ein Plastikzentrifugen-Rohr wird das Volumen des Mediums auf 3-5 ml erhöht und die Zellen werden 2mal gewaschen (35).
Frisch isolierte PBMC oder angetaute PBMC wurden nach der zweiten Waschung in "LAK"-Medium in einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert.
LAK-Medium kann auf eine von zwei Arten hergestellt werden:

a) RPMI Kulturmedium, daß 15% menschliches Serum und 1000 E/ml rekombinantes menschliches Interleukin 2 (IL-2) enthält (beispielsweise Proleukin, Cetus, Emeryville CA, USA)
b) RPMI Kulturmedium, daß 15% menschliches Serum und 1000 E/ml IL-2 und 1% (vol/vol) Phytohämagglutinin (beispielsweise: Difco Laboratories, Detroit MI, USA) enthielt.

Die PBMC werden bei 37°C und 5% CO₂ 72-96 Stunden lang in 50 ml Kulturkolben kultiviert beziehungsweise gezüchtet (beispielsweise Falcon, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) die aufrecht standen und ein Volumen von 4-15 ml enthielten. Danach wurden die Kulturen gezählt und die Zelldichten erneut auf 1 × 10⁶ Zellen/ml unter Verwendung von LAK-Medium ohne PHA eingestellt. Wenn das Volumen einer Kultur mehr als 15 ml erreicht, wird es zwischen zwei Kolben aufgeteilt und die Kulturen unter den selben Bedingungen fortgesetzt.
Größere Anzahlen an Zellen können durch Kulturvolumina in größerem Maßstab in 250 ml Kulturkolben (Falcon, Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) (> 45-150 ml/Kolben) gewonnen werden. Wenn genug PBMC verfügbar sind (beispielsweise aus einer Apharese stammend) können mehrere 250 ml Kolben gleichzeitig bis zu hohen Zellanzahlen wie beispielsweise 109 Zellen kultiviert werden.
Am Ende der Kulturperiode können die aktivierten Zellen nach Lymphozyten- Subpopulationen phänotypisiert werden, um die Zusammensetzung von NK und LAK-T Zellen zu bestimmen. Es ist unsere Erfahrung, daß nach zwei oder drei Wochen der Kultur die Populationen in erster Linie LAK-T Zellen sind. Eine funktionelle Bestimmung ihres zytolytischen Potentials kann vorgenommen werden, indem ein Standardchrom- Freisetzungsassay unter Verwendung von Daudi und K562 Zelllinien als Zielzellen durchgeführt wird (27).
Aktivierte LAK-Zellen können für eine zukünftige Anwendung kryokonserviert werden, und zwar unter Verwendung derselben Einfriervorschrift wie oben beschrieben oder können direkt nach Abschluß der Kulturphase verwendet werden.

Erzeugung von tumorspezifischen zytotoxischen T Zellen (CTL)

Tumorspezifische CTL können durch unterschiedliche Ansätze erzeugt werden, indem entweder frisches Tumormaterial oder bekannte, rekombinante Tumorantigene verwendet werden, abhängig vom Tumortyp und der Verfügbarkeit von Gewebsmaterial.
In den seltenen Fällen, in denen eine in vitro Tumorlinie verfügbar ist, können CTL durch Stimulation von PBL gegen bestrahlte Tumorzellen erzeugt werden. Kurz, Tumorzellen wurden in 24-well(bzw. Vertiefungs)-Platten gezüchtet und im Anschluß an eine Bestrahlung der Tumorzellen wurden autologe PBL in menschliches Serum enthaltendes Medium zugesetzt, das wahlweise mit IL-2 und/oder IL-4 ergänzt war. Alle 7 bis 10 Tage wurden die T Zellen geerntet und erneut mit bestrahlten Tumorzellkulturen restimuliert. Nach mehreren Restimulierungsrunden wurde die Aktivität und Spezifität der gemischten CTL-Populationen unter Verwendung eines Standard-Chrom-Freisetzungsassays (standard chromium release assay), ELISPOT oder eines Zytokin-Sekretionsassays getestet.
Alternativ kann, wenn keine Tumorlinie verfügbar ist, ein Lysat aus Tumorgewebe verwendet werden, um in vitro dendritische Zellen (DC) zu pulsen, um die Präsentation von spezifischen Peptiden, die von Tumorantigenen abgeleitet sind, durch diese professionellen Antigen präsentierenden Zellen (APC) zu unterstützen. Bezüglich bekannter Tumorantigene werden beispielsweise im Falle des malignen Malinoms synthetische Peptide oder rekombinante Proteinfragmente verwendet, die von bekannten Melanom-Antigenen abgeleitet sind, um DC zu pulsen. Ein weiteres Prinzip der weiteren Antigenpräsentation durch DC basiert auf der Erzeugung von Tumor-abgeleiteter bzw. von Tumoren stammender RNA, die dazu verwendet werden kann, um DC durch endogene Expression der Tumor-RNA direkt zu pulsen. Die Verfahren zur Restimulation und zur Analyse einer Aktivierung und Spezifität von gemischten CTL-Populationen sind oben beschrieben, das heißt Standard-Chrom-Freisetzung ELISPOT, oder Zytokinsekretionsassays.
Unabhängig vom Verfahren zur CTL-Erzeugung haben die meisten Ansätze mit sehr ähnlichen Einschränkungen zu tun, wie beispielsweise einer sehr geringen Häufigkeit von tumorspezifischen CTL-Vorläufern im Blut, zeitaufwendiger und arbeitsintensiver Herstellung von tumorspezifischen CTL und der Verfügbarkeit von individuellem Tumormaterial oder allgemeinen Tumorantigenen.

Effektorzellen und Zielzellen

PBMC, die von RCC Patienten gewonnen wurden, die einer Tumor-Nephrektomie unterzogen wurden oder von gesunden Spendern wurden zur Erzeugung von LAK-Zellen durch Kultur in RPMI 1640 Medium verwendet, das mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Pyruvat, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (vollständiges Medium) 15% hitzeinaktiviertem, gepooltem menschlichem Serum, 1% Phytohämagglutinin (PHA, Difco-Laboratories, Detroit, MC) und 1000 U/ml rIL-2 (Proleukin, Cetus Corp. Emeryville, CA) ergänzt war. Diese Kulturen wurden über mehrere Wochen aufrecht erhalten, um expandierte Populationen aktivierter CD4⁺ und CD8⁺T Zellen zu gewinnen. Die LAK-abgeleiteten CD4⁺T Zellen wurden durch Magnetperlentrennung (Dynal, Oslo, Norwegen) durch Abreicherung von CD8⁺T und NK-Zellen gemäß der Anweisungen des Herstellers angereichert. Menschliche NK-Zellen wurden wie vorher beschrieben aktiviert und gereinigte NK-Zellen wurden durch Abreichung von T-Zellen unter Verwendung von CD4- und CD3-beschichteten immunmagnetischen Perlen (Dynal) gereinigt. Die angereicherte NK-Zelllinie, die in diesen Studien verwendet wurde, bezeichnet als B.3NK- Zellen, wurde in vollständigem Medium, das mit rIL-2 (300 U/ml) ergänzt war, aufrechterhalten.
Die Zytotoxizität dieser Effektorzellen wurde unter Verwendung von mit Epstein-Barr- Virus transformierten lymphoblastoiden Zellinien (lymphoblastoid cell line = LCL) überprüft, die von der L721 Zelllinie abstammten. Die L721.112 Zellinie repräsentiert eine hemizygote Variante von L721, das den A1, Cw7, B8 Haplotyp exprimiert (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von T. Spies, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle). Die L721.221 Zelllinie exprimiert kein MHC Klasse I-Molekül (36). Diese Linie wurde transfiziert, um die Klasse I Allele, B.3501, B.3702, Cw.0602 und Cw.0702 wie beschrieben zu exprimieren. Eine HLA-E Transfektante von K562 wurde durch Transfizieren von Hybrid-DNA, die in den pcDNA3-Vektor kloniert wurde, die Exon 1 von HLA-A2 und Exons 2-7 von HLA-E kodierte, erzeugt. Dieses Konstrukt ermöglichte die HLA-E Oberflächenexpression durch Stabilisierung der HLA-E schweren Kette mit einem HLA-A2-abgeleiteten Peptid. Mit dem beta-2-mikroglobulin (132 m) kodierenden Gen transfizierte Daudi-Zellen (28) wurden freundlicherweise von P. Parham (Stanford University, Palo Alto, CA) zur Verfügung gestellt.
Die RCC-26 Tumorlinie wurde aus einem primären Stadium I (T1, G2, N0, M0)-Tumor von Patient 26 etabliert (HLA Allele: A.0201, A.3303, B.4101, B.5101, Cw.1502, Cw. 1701) und die normale Nieren-Linie, nämlich NKC-26, wurde aus normalem Nierenparenchym etabliert, das zum Zeitpunkt der Tumor-Nephrektomie gewonnen wurde (32). Beide Zelllinien wurden in 10% FCS kultiviert, das vollständiges Medium ohne Antibiotika enthielt. Die RCC-26 Zellen wurden mit der menschlichen IFNγ cDNA transduziert unter Verwendung des oben beschriebenen retroviralen Systems (37). Zwei IFNγ cDNA exprimierende Linien (als endoγ1 und endoγ2 bezeichnet) wurden durch unabhängige retrovirale Transduktion erzeugt (31). Eine Kontrolllinie (RCC-26VC) wurde unter Verwendung desselben Vektors ohne IFNγ cDNA hergestellt (31). Eine exogene IFNγ Stimulation von Tumorzellen wurde 96 Stunden lang in einem Medium durchgeführt, das 1000 U/ml rekombinantes IFNγ enthielt (Roche, Basel, Schweiz).

Zellvermittelter Zytotoxizitäts-Assay

Die zellvermittelte Lyse wurde in einem vierstündigem Standardchrom-51 Freisetzungsassay quantifiziert (27). Eine spontane Freisetzung wurde durch Inkubieren von Zielzellen alleine, die Gesamtfreisetzung durch direkte Zählung von markierten Zellen bestimmt. Die prozentuale Zytotoxizität wurde wie folgt berechnet: % spezifische Lyse = (experimentelle cpm - spontane cpm/gesamt cpm - spontane cpm) × 100. Doppelte Messungen von drei Schritt-Titrationen von Effektorzellen wurden für alle Experimente verwendet. Um die Daten aus den unabhängigen Experimenten zu vergleichen, wurden die prozentualen relativen zytotoxischen Reaktionen (% RCR) unter Verwendung einer spezifischen Lyse von nichttransfizierten L721.221 oder K562 Zellen in jedem Experiment als Referenzwerte von 50% berechnet. Die %-Lyse anderer Zielzellen wurde bezüglich des Referenzwertes bestimmt und als % RCR ausgedrückt (27).
Um den Einfluß von MHC Klasse I-Molekülen zu evaluieren wurde der Klasse I- spezifische monoklonale Antikörper, nämlich W6/32, 30 Minuten vor Zusatz von Effektorzellen den Zielzellen zugesetzt: der monoklonale Antikörper W6/32 wurde als 1 : 100 Ascites verdünnt verwendet und UPC10 (IgG2a) (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) wurde als die Isotypkontrolle verwendet.

Immunphänotypisierung von Effektorzellen und Zielzellen

Effektorzellen wurden unter Verwendung eines Panels von lymphozytenspezifischen monoklonalen Antikörpern: FITC- oder PE-markierten monoklonalen Antikörpern, die für CD3 (UCHT1), CD4 (13B8.2), CD8 (B9.11), CD56 (NKIH-1) spezifisch waren, bezogen von Beckmann/Coulter, Westbrook, ME, charakterisiert. Die inhibitorische Rezeptor- Expression wurde mit FITC- oder PE-markierten monoklonalen Antikörpern untersucht, die für p58.1 (KIR2DL1, EB6), p58.2 (KIR2DL3, GL183), CD94 (HP-3B1) spezifisch waren, alle von Beckmann/Coulter bezogen und mit NKB1 (KIR3DL1, DX9) von Pharmingen, San Diego, Ca. Die Zellen wurden 30 Minuten auf Eis inkubiert, zweimal gewaschen, mit PBS-1% Paraformaldehyd fixiert und unter Verwendung der Durchflußzytometrie untersucht (FACS-Calibur, Becton/Dickinson, San Jose, CA).
Die Tumorzellen wurden auf ihre Oberflächenexpression von MHC-Molekülen durch Durchflußzytometrie unter Verwendung von Kulturüberständen des W6/32 Hybridoms untersucht (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Der HLA-C-spezifische monoklonale Antikörper L31 wurde freundlicherweise von P. Giacomini, Mailand, Italien, zur Verfügung gestellt (33). Der monoklonale Antikörper UPC10 und MOPC212 (Sigma) wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Zellen wurden 90 Minuten lang auf Eis mit monoklonalem Antikörper inkubiert, zweimal mit PBS gewaschen und mit PEkonjugiertem Ziegen-Antimaus-Immunglobulin für 30 Minuten inkubiert (F(ab)₂, 115-116- 146; Dianove, Hamburg, Deutschland) und unter Verwendung der Durchflußzytometrie untersucht. Literatur (1) Long EO. Regulation of immune responses through inhibitory receptors. Annu Rev Immunol 1999; 17: 875-904.
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Tabelle 3 Analyse der inhibitorischen Rezeptor-Expression auf LAK-Populationen

Claims

1. Therapeutische Zusammensetzung, die folgendes enthält:

a) nicht-MHC-restringierte T-Zellen und/oder natürliche Killer (NK)-Zellen in Kombination mit

b) MHC-restringierten T-Zellen oder

c) Therapeutischen Mitteln, die Immunreaktionen von MHC-restringierten T- Zellen induzieren.

2. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die Zellen in a) aus Lymphokin aktivierten Killer-(LAK-)Zellen bestehen.

3. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei denen die Zellen in a) aus LAK-T-Zellen bestehen.

4. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, bei der das therapeutische Mittel zum Induzieren von Reaktionen der MHC-restringierten T- Zellen eine Nukleinsäure ist.

5. Therapeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-3, bei der das therapeutische Mittel zum Induzieren von Reaktionen der MHC-restringierten T- Zellen eine Vakzine ist, die Tumorzellen oder dendritische Zellen umfaßt.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definierte Zusammensetzung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

7. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche in der Medizin.

8. Verwendung irgend einer der Zusammensetzungen von Anspruch 1-6 in der Behandlung von Tumoren, die eine niedrige, fehlende oder anormale Expression von MHC Klasse Ia- oder Ib-Molekülen zeigen.

9. Verwendung nach Anspruch 8, bei der die Tumore eine niedrige, fehlende oder anormale Expression von HLA-C und/oder HLA-E-Molekülen zeigen.

10. Verwendung einer Kombination von

a) aktivierten nicht-MHC-restringierten T-Zellen und/oder natürlichen Killerzellen und

b) MHC-restringierten T-Zellen oder

c) Therapeutischen Mitteln, die Reaktionen von MHC-restringierten T Zellen induzieren, in einem Verfahren zur Behandlung von Tumoren, die eine niedrige, fehlende oder anormale Expression von MHC Klasse Ia- oder Ib-Molekülen zeigen.

11. Verwendung nach Anspruch 10, bei der die Tumoren eine niedrige, fehlende oder anormale Expression von HLA-C- und/oder HLA-E-Molekülen zeigen.

12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, bei der das Verfahren zur Behandlung von Tumoren die Schritte umfaßt, nicht MHC-restringierte T-Zellen und/oder NK-Zellen vor der Verabreichung von MHC-restringierten T-Zellen oder therapeutischen Mitteln zum Induzieren von Reaktionen von MHC-restringierten T-Zellen zu verabreichen.

13. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, bei der das Verfahren zur Behandlung von Tumoren die Schritte umfaßt, nicht MHC-restringierte T-Zellen und/oder NK-Zellen simultan mit der Verabreichung von MHC-restringierten T-Zellen oder therapeutischen Mitteln zum Induzieren von Reaktionen von MHC-restringierten T Zellen zu verabreichen.

14. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, bei der das Verfahren zur Behandlung von Tumoren die Schritte umfaßt, nicht MHC-restringierte T-Zellen und/oder NK-Zellen im Anschluß an eine Verabreichung von MHC-restringierten T-Zellen oder therapeutischen Mitteln zum Induzieren einer MHC-restringierten T Zell-Reaktion zu verabreichen.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-14, wobei das Verfahren zur Behandlung eines Tumors weiterhin den Schritt umfaßt, zu Beginn die MHC Klasse I-Expression in dem Tumor zu bestimmen.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 10-15, wobei die nicht MHC-restringierten T-Zellen und/oder NK-Zellen aus LAK-Zellen bestehen.

17. Verwendung nach einem der Ansprüche 7-16 in einem Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers.

18. Verwendung nach Anspruch 17 in einem Verfahren zur Behandlung eines Menschen.

19. Verwendung nach einem der Ansprüche 7-18, bei der der Tumor aus Kolonkarzinom, Brustkarzinom, Prostatakarzinom, Nierenzellkarzinom (RCC) oder Melanom ausgewählt ist.