EA026990B1 - Антитела, связывающиеся с человеческой клеткой dec-205 - Google Patents

Антитела, связывающиеся с человеческой клеткой dec-205 Download PDF

Info

Publication number
EA026990B1
EA026990B1 EA201000770A EA201000770A EA026990B1 EA 026990 B1 EA026990 B1 EA 026990B1 EA 201000770 A EA201000770 A EA 201000770A EA 201000770 A EA201000770 A EA 201000770A EA 026990 B1 EA026990 B1 EA 026990B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
variable region
chain containing
antigen
heavy chain
Prior art date
Application number
EA201000770A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201000770A1 (ru
Inventor
Тибор Келер
Личжэнь Хе
Венки Рамакришна
Лаура А. Витейл
Original Assignee
Селлдекс Терапьютикс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40257038&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA026990(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Селлдекс Терапьютикс Инк. filed Critical Селлдекс Терапьютикс Инк.
Publication of EA201000770A1 publication Critical patent/EA201000770A1/ru
Publication of EA026990B1 publication Critical patent/EA026990B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к изолированному моноклональному антителу, которое связывается с DEC-205 человека, к фармацевтической композиции, предусматривающей использование указанных антител для индукции или усиления иммунного ответа, к молекулярному конъюгату, содержащему антитело по изобретению, связанное с антигеном, выбранным из группы, состоящей из компонентов патогенного микроорганизма, опухолевого антигена, аллергена и аутоантигена, а также к вектору экспрессии, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по изобретению, и трансформированной указанным вектором клетке.

Description

Настоящее изобретение имеет отношение к изолированным антителам, например человеческим антителам, которые связываются с человеческим ЭЕС-205 и проявляют определенные свойства. Также настоящее изобретение относится к конъюгированным вакцинам, биспецифическим молекулам и терапевтическим композициям, содержащим такие антитела. Соответственно, антитела и композиции настоящего изобретения можно применять в широком диапазоне терапевтических методик, нацеленных на дендритные клетки, например, для усиления представления антигена и (или) индукции Т-клеточного ответа, такого как цитотоксические ответы Т-лимфоцитов, на различные клеточные мишени или мишенивозбудители, или для лечения различной патологии, опосредованной антигенпредставляющими клетками (АПК).
В одном из вариантов осуществления антитела настоящего изобретения проявляют одно или несколько следующих свойств: 1) связывание с человеческим ОЕС-205 с константой аффинности как минимум 108 М-1, согласно измерению с помощью поверхностного плазмонного резонанса; 2) интернализация после связывания с человеческими дендритными клетками, экспрессирующими ОЕС-205; 3) индукция или усиление ответов человеческих Т-лимфоцитов, например, цитотоксических ответов Тлимфоцитов СЭ4 и СЭ8 на антиген (который может быть связан с антителом), соответственно опосредованных механизмом с участием молекул класса I ГКГС и (или) молекул класса II ГКГС; и 4) индукция толерантности периферических Т-лимфоцитов СЭ8. Кроме того, эти антитела могут перекрестно реагировать с ОЕС-205 на дендритных клетках приматов, не относящихся к человекообразным, или таких же клетках других биологических видов. Более того, эти антитела могут соответственно проявлять одно или несколько дополнительных свойств, включая, например: 1) избирательное связывание с эпитопом, расположенном во внеклеточном домене человеческого ЭЕС-205, например, в одном или нескольких доменах, богатых цистеином, домене РпЛ, или одном или нескольких из десяти лектиноподобных доменов Стипа; и 2) локализацию в антигенпредставляющих частях клетки.
Конкретные примеры антител настоящего изобретения включают вариабельные участки тяжелых и легких цепей, где используются конкретные человеческие стволовые клетки, а именно, они кодируются генами стволовых клеток, но включают генетические перестройки и мутации, например, соматические мутации, которые возникают в ходе созревания антитела. В одном из вариантов в вариабельном участке тяжелых цепей антител настоящего изобретения используется ген Ун 3-33 человеческих стволовых клеток, и этот участок включает как минимум одну из аминокислотных замен в какой-либо одной из последовательностей № 4, 16, 28, 40, 52 и 76 по сравнению с последовательностью № 95. Иначе, в вариабельном участке тяжелой цепи используется ген ОтрЬ-С16 стволовых клеток человека, и этот участок включает как минимум одну из аминокислотных замен первой или второй из последовательностей № 64 и 70
- 1 026990 по сравнению с последовательностью № 96.
В другом варианте осуществления вариабельный участок легкой цепи антитела выбирают из группы, состоящей из участка, где а) используется ген УК1-Ь15 человеческих стволовых клеток, и этот участок включает как минимум одну из аминокислотных замен в последовательности № 10 по сравнению с последовательностью № 94; б) используется ген УК1-Ь4 человеческих стволовых клеток, и этот участок включает как минимум одну из аминокислотных замен в любой одной из последовательностей № 22 или 82 по сравнению с последовательностью № 93; или в) используется ген УК3-Ь6 человеческих стволовых клеток, и этот участок включает как минимум одну из аминокислотных замен в любой одной из последовательностей № 34, 46, 58 по сравнению с последовательностью № 92.
В другом варианте осуществления СОКЗ-последовательность вариабельного участка тяжелой цепи выбирают из группы, состоящей из последовательностей № 7, 19, 31, 43, 55 и 79 (например, консервативных аминокислотных замен). Эти антитела могут дополнительно включают С.НК3последовательность вариабельного участка легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из последовательностей № 13, 25, 37, 49, 61, 85, и консервативных модификаций их последовательностей. В другом варианте СЭК2- и СОК1-последовательности тяжелой цепи выбирают из последовательностей № 6, 18, 30, 42, 54 и 78 и последовательностей № 5, 17, 29, 41, 53 и 77 соответственно. В другом варианте С.НК2и СОК1-последовательности легкой цепи выбирают из последовательностей № 12, 24, 36, 48, 60, 84 и последовательностей № 11, 23, 35, 47, 59, 83 соответственно.
Еще в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к изолированному антителу, которое связывается с ОЕС-205 и включает СЭК1-. СЭК2- и СОК3-последовательности вариабельного участка тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, содержащей:
ί) вариабельный участок тяжелой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 5; вариабельный участок тяжелой цепи СОК2, включающий последовательность № 6; вариабельный участок тяжелой цепи СОК3, включающий последовательность № 7; вариабельный участок легкой цепи СЭКЕ включающий последовательность №11; вариабельный участок легкой цепи СОК2, включающий последовательность № 12; вариабельный участок легкой цепи СЭК3, включающий последовательность № 13; ϊϊ) вариабельный участок тяжелой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 17; вариабельный участок тяжелой цепи СОК2, включающий последовательность № 18; вариабельный участок тяжелой цепи СОК3, включающий последовательность № 19; вариабельный участок легкой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 23; вариабельный участок легкой цепи СЭК2, включающий последовательность № 24; вариабельный участок легкой цепи СЭК3, включающий последовательность № 25; ίίί) вариабельный участок тяжелой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 29; вариабельный участок тяжелой цепи СЭК2, включающий последовательность № 30; вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, включающий последовательность № 31; вариабельный участок легкой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 35; вариабельный участок легкой цепи СЭК2, включающий последовательность № 36; вариабельный участок легкой цепи СЭК3, включающий последовательность № 37; ίν) вариабельный участок тяжелой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 41; вариабельный участок тяжелой цепи СЭК2, включающий последовательность № 42; вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, включающий последовательность № 43; вариабельный участок легкой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 47; вариабельный участок легкой цепи СЭК2, включающий последовательность № 48; вариабельный участок легкой цепи СЭК3, включающий последовательность № 49; ν) вариабельный участок тяжелой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 53; вариабельный участок тяжелой цепи СЭК2, включающий последовательность № 54; вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, включающий последовательность № 55; вариабельный участок легкой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 59; вариабельный участок легкой цепи СЭК2, включающий последовательность № 60; вариабельный участок легкой цепи СЭК3, включающий последовательность № 61; νί) вариабельный участок тяжелой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 77; вариабельный участок тяжелой цепи СЭК2, включающий последовательность № 78; вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, включающий последовательность № 79; вариабельный участок легкой цепи СЭКЕ включающий последовательность № 83; вариабельный участок легкой цепи СЭК2, включающий последовательность № 84; вариабельный участок легкой цепи СЭК3, включающий последовательность № 85;
Например, изолированное антитело связывается с человеческим НЕС-205 и содержит вариабельный участок тяжелой цепи СНК1, включающий последовательность № 29; вариабельный участок тяжелой цепи СНК2, включающий последовательность № 30; вариабельный участок тяжелой цепи СНК3, включающий последовательность № 31; вариабельный участок легкой цепи СНК1, включающий последовательность № 35;
- 2 026990 вариабельный участок легкой цепи СЭР2. включающий последовательность № 36; вариабельный участок легкой цепи СЭЮ. включающий последовательность № 37.
В другом варианте изолированные антитела настоящего изобретения связываются с человеческим
ПЕС-205 и содержат вариабельный участок тяжелой цепи, характеризующийся аминокислотной последовательностью, которую выбирают из группы, состоящей из последовательностей № 4, 16, 28, 40, 52 и 76. Это антитело дополнительно включает вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из последовательностей № 10, 22, 34, 46, 58, 82.
В другом варианте осуществления изолированные антитела настоящего изобретения связываются с человеческим ПЕС-205 и содержат вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотные последовательности, которые выбирают из группы, состоящей из:
а) последовательностей № 4 и 10 соответственно и консервативных модификаций их последовательностей;
б) последовательностей № 16 и 22 соответственно и консервативных модификаций их последовательностей;
в) последовательностей № 28 и 34 соответственно и консервативных модификаций их последовательностей;
г) последовательностей № 40 и 46 соответственно и консервативных модификаций их последовательностей;
д) последовательностей № 52 и 58 соответственно и консервативных модификаций их последовательностей;
е) последовательностей № 76 и 82 соответственно и консервативных модификаций их последовательностей.
В другом аспекте изобретения изолированное моноклональное антитело, связывающееся с ПЕС-205 человека, содержит вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями, которые выбирают из группы, состоящей из:
а) последовательностей № 26 и 32 соответственно;
б) последовательностей № 14 и 20 соответственно;
в) последовательностей № 2 и 8 соответственно;
г) последовательностей № 38 и 44 соответственно;
д) последовательностей № 50 и 56 соответственно;
е) последовательностей № 74 и 80 соответственно.
Антитела настоящего изобретения могут быть либо полноразмерными, например, любого из следующих изотипов: Ι§Ο1, Ι§Ο2, Ι§Ο3, Ι§Ο4, 1дМ, 1§А1, 1§А2, 1§А8ес, ΙβΟ и 1дЕ, либо эти антитела могут быть фрагментами, такими как антигенсвязывающий участок или одноцепочечное антитело (например, РаЬ, Р(аЬ')2, Ρν, одноцепочечный фрагмент Ρν, изолированный участок, определяющий комплементарность (СПК), или комбинация двух или более изолированных СЛК).
Настоящее изобретение также имеет отношение к молекулярному конъюгату, содержащему антитело настоящего изобретения, связанное с антигеном (включая фрагменты, эпитопы и антигенные детерминанты), таким как компонент возбудителя, опухолевый антиген или аутоантиген. Например, этот антиген может включать опухолевый антиген, такой как ЗЬСО, др100 или Рте117, СЕА, др100, ТКР-2, ΝΥВК-1, ΝΥΌΟ-58, ΜΝ (др250), идиотип, тирозиназу, теломеразу, 88X2, МИС-1, МАОЕ-А3 и высокомолекулярный меланома-ассоциированный антиген (НМА-МАА) МАРТЕ те1ап-А, ΝΥΌδΟ-Ε МАОЕ-1, МАОЕ-3, АТ1, Нег2, мезотелин или высокомолекулярный меланома-ассоциированный антиген (НМАМАА).
Термин опухолевый антиген согласно употреблению в данном документе предпочтительно означает любой антиген или антигенную детерминанту, присутствующую на (или ассоциированную с) опухолевой клетке и не типичную для нормальных клеток, или антиген или антигенную детерминанту, присутствующую на (или ассоциированную с) опухолевых клетках в больших количествах, чем на нормальных (неопухолевых) клетках, или антиген или антигенную детерминанту, присутствующую на опухолевых клетках в форме, отличной от той, что обнаруживается на нормальных (неопухолевых) клетках. Таким образом, этот термин включает опухолеспецифические антигены, включая опухолеспецифические мембранные антигены, опухолеассоциированные антигены, включая опухолеассоциированные мембранные антигены, эмбриональные антигены на опухолях, рецепторы факторов роста, лиганды факторов роста и любой другой тип антигена, ассоциированный со злокачественными опухолями. Опухолевый антиген может быть, например, антигеном рака (например, молочной железы, желудочно-кишечного тракта, легкого), простатическим специфическим антигеном (ПСА) или простатическим специфическим мембранным антигеном (ПСМА), антигеном рака мочевого пузыря, антигеном рака легкого (например, мелкоклеточного рака легкого), антигеном рака толстой кишки, антигеном рака яичников, антигеном рака головного мозга, антигеном рака желудка, антигеном рака почки, антигеном рака поджелудочной железы, антигеном рака печени, антигеном рака пищевода, антигеном рака головы и шеи или антигеном колоректального рака.
- 3 026990
Термин фрагмент означает аминокислотную последовательность, являющуюся частью полноразмерного белка или полипептида, например, длиной от примерно 8 до примерно 1500 аминокислот, соответственно длиной от примерно 8 до примерно 745 аминокислот, соответственно длиной от примерно 8 до примерно 300 аминокислот, например от примерно 8 до примерно 200 аминокислот, или примерно длиной от 10 до примерно 50 или 100 аминокислот.
В другом варианте осуществления этот молекулярный комплекс дополнительно включает терапевтический агент, такой как цитотоксический агент, агент-иммунодепрессант или химиотерапевтический агент.
Указанный конъюгат по настоящему изобретению может быть использован, например, для получения лекарственного средства для нацеливания антигена на В-лимфоцит, экспрессирующий человеческий ОЕС-205. у субъекта; для получения лекарственного средства, запускающего или усиливающего иммунный ответ на этот антиген у субъекта, причем антиген выбран из группы, состоящей из компонентов патогенного микроорганизма, опухолевого антигена, аллергена и аутоантигена; для получения лекарственного средства, предназначенного для иммунизации субъекта против этого антигена, причем антиген выбран из группы, состоящей из компонентов патогенного микроорганизма, опухолевого антигена, аллергена и аутоантигена.
Также настоящее изобретение имеет отношение к фармацевтической композиции для индукции или усиления иммунного ответа, опосредованного Т-лимфоцитами, на антиген у субъекта, содержащей эффективное количество антитела по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, причем антиген выбран из группы, состоящей из компонентов патогенного микроорганизма, опухолевого антигена, аллергена и аутоантигена. Такая композиция дополнительно может содержать терапевтический агент, выбранный из адъюванта или иммуностимулирующего агента.
Настоящее изобретение также относится к применению композиции, содержащей антитело по изобретению для получения лекарственного средства для нацеливания антигена на клетки, экспрессирующие человеческий НЕС-205 у субъекта; для получения лекарственного средства для запуска или усиления иммунного ответа на антиген, который может быть опосредован Т-лимфоцитами, у субъекта; для получения лекарственного средства, предназначенного для иммунизации субъекта против заболеваний и состояний и для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у субъекта, где заболевание выбирается из группы, включающей злокачественные опухоли, инфекционные заболевания, и аутоиммунные заболевания.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела настоящего изобретения, также входят в объем настоящего изобретения, как и векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и трансформированные клетки-хозяева, содержащие такие векторы экспрессии.
Настоящее изобретение может быть использовано в способах нацеливания антигена на клетку, например клетку, способную к представлению антигена, такую как мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), моноциты (такие как ТНР-1), В-лимфобластоидные клетки (такие как С1Р.Л2, 1518 В-ЬСЬ) и ДК-производные моноцитов, у субъекта путем введения молекулы, которая связывается с рецептором на этой клетке (например, вышеописанных антител к ИЕС-205), связанным с антигеном. В одном из вариантов осуществления нацеленная клетка (которая может быть В-лимфоцитом) стимулирует Т-лимфоциты с ограничением по классу I ГКГС.
Антитела и другие композиции настоящего изобретения также можно использовать для индукции или усиления иммунного ответа (например, иммунного ответа, опосредованного Т-лимфоцитами) на антиген у субъекта. Соответственно в одном варианте настоящее изобретение относится к способу индукции или усиления цитотоксического ответа на антиген путем образования конъюгата этого антигена и антитела, которое связывается с рецептором на антигенпредставляющей клетке, например, с человеческим ИЕС-205. Этот конъюгат затем вступает в контакт, либо ίη νίνο либо ех νίνο, с клетками, экспрессирующими человеческий ИЕС-205 так, что этот антиген интернализуется, подвергается обработке и представляется Т-лимфоцитам путем, который индуцирует или усиливает цитотоксический ответ (например, ответ, опосредованный цитотоксическими Т-лимфоцитами СИ8) на этот антиген. В другом варианте осуществления это также служит для индукции ответа Т-хелперов (например, ответа, опосредованного Т-хелперами СИ4) на этот антиген. Итак, иммунный ответ может быть индуцирован с участием молекул класса I ГКГС и класса II ГКГС. На клетки, экспрессирующие ИЕС-205, также можно воздействовать адъювантом, цитокином, который стимулирует пролиферацию дендритных клеток, и (или) агентом-иммуностимулятором для дополнительного усиления иммунного ответа.
В другом варианте осуществления в объем настоящего изобретения входит способ выявления присутствия ИЕС-205 в биологическом образце, включающий:
а) обработку биологического образца антителом по любому из пп.1-8, где антитело помечено детектируемым соединением;
б) детектирование связывания антитела с ИЕС-205 для выявления комплекса антитело-ИЕС-205, свидетельствующего о наличии в этом биологическом образце ИЕС-205.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут понятны из нижеследующего подробного описания и формулы изобретения.
- 4 026990
Краткое описание чертежей
На фиг. 1Α-1Ι представлены кривые, отображающие связывание человеческих антител к ПЕС-205 (3Л6-2Р4, 3Л6-4С8, 309-2Л2, 5Α8-1Ρ1, 2Ό3-1Ρ5-2Α9, 3С7-3А3, 5Л12-501, 106-106 и 3А4-1С10) с клетками СНО-δ, экспрессирующими человеческий ПЕС-205 при флуоресцентном анализе с использованием аппарата Ь8К (ВЛ Вю5сзспсс5. штат Нью-Джерси, США).
На фиг. 2Α-2Ι представлены кривые, отображающие связывание человеческих антител к ПЕС-205 (3Л6-2Р4, 3Л6-4С8, 309-2Ό2, 5Α8-1Ρ1, 2Ό3-1Ρ5-2Α9, 3С7-3А3, 5Л12-501, 106-106 и 3А4-1С10) с ЛЕС205 на человеческих дендритных клетках при флоуцитометрии.
На фиг. 3 представлена кривая, отображающая связывание человеческих антител к ПЕС-205 (3Л62Р4, 3Л6-4С8, 309-2Л2, 5Α8-1Ρ1, 2Ό3-1Ρ5-2Α9, 3С7-3А3, 5Л12-501, 106-106 и 3А4-1С10) с ПЕС-205 при твердофазном иммуноферментном анализе.
На фиг. 4А-4С представлена интернализация в дендритных клетках меченного флуоресцецина изотиоцианатом человеческого антитела (Р1ТС-309-2П2) по сравнению с контролем (меченый флуоресцецина изотиоцианатом человеческий Ι§01) при конфокальной микроскопии.
На фиг. 5 представлено выравнивание последовательностей νΗ и νκ человеческих стволовых клеток и последовательностей νκ антител к ПЕС-205 (3Ό6-2Ρ4, 3П6-4С8, 309-2Ό2, 5Α8-1Ρ1, 2Ό3-1Ρ5-2Α9, 3С7-3А3, 5С3-2-3Р6, 1Е6-3П10). На фигуре изображены последовательности № 92, 34, 46, 58, 93, 82, 22, 94, 10, 95, 4, 16, 103-105, 76, 88, 96, 106 и 70 соответственно в порядке появления.
На фиг. 6 представлено выравнивание последовательностей СЛК1, СЛК2 и СЛК3 νΗ человеческих антител к ПЕС-205 (3Ό6-2Ρ4, 3П6-4С8, 309-2Ό2, 5Α8-1Ρ1, 3С7-3А3, 2Ό3-1Ρ5-2Α9, 5С3-2-3Р6, 5Л12501).
На фиг. 7 представлено выравнивание последовательностей СЛК.1, СПК2 и СПК3 νκ человеческих антител к ЛЕС-205 (3Л6-2Р4, 3Л6-4С8, 309-2Л2, 5Α8-1Ρ1, 3С7-3А3, 5С3-2-3Р6).
На фиг. 8 представлено схематическое изображение примера конструкта вакцины против АПК со слиянием антитела к ПЕС-205 и антигена.
На фиг. 9А и 9В отображены кривые, демонстрирующие антиген-специфическую активность, с использованием конъюгата вакцины, нацеленной на АПК 309-β1ιί'.Ό в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), моноцитах (ТНР-1), В-лимфобластоидных клетках (ΟΚ.Α2, 1518 Β-ЬСЬ) и ДКпроизводных моноцитов.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение имеет отношение к антителам (например, человеческим антителам), которые связываются с человеческим ПЕС-205. В некоторых вариантах осуществления эти антитела проявляют ряд функциональных свойств, например, связывание с человеческим ПЕС-205 с константой аффинности как минимум 108 М-1, согласно измерению с помощью поверхностного плазмонного резонанса, интернализацию после связывания с человеческими дендритными клетками, экспрессирующими ПЕС205; индукцию или усиление ответов человеческих Т-лимфоцитов, например, цитотоксических ответов Т-лимфоцитов СЛ4 и СЛ8 или ΝΚ-лимфоцитов на антиген, который может быть связан с антителом, например, цитотоксических ответов Т-лимфоцитов, опосредованных механизмами с участием молекул класса I и класса II ГКГС; локализацию в отделах дендритных клеток, где происходит обработка антигена; индукцию толерантности периферических Т-лимфоцитов СЛ8; или перекрестное реагирование с ПЕС-205 на дендритных клетках приматов, не являющихся человекообразными, или других биологических видов. В других вариантах антитела содержат вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, где используются гены человеческих стволовых клеток, и включают определенные структурные характеристики, такие как определенные СЛК-последовательности. Настоящее изобретение также относится к способам получения таких антител, молекулярных конъюгатов и биспецифических молекул, включая антитела, а также композиций, содержащих антитела. Настоящее изобретение также относится к способам нацеливания антигенпредставляющих клеток на антигены (например, мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), моноцитов (таких как ТНР-1), В-лимфобластоидных клеток (таких как ΡΊΚΑΣ, 1518 Β-ЕСЬ) и ДК-производных моноцитов ίη νίΐτο или ίη νίνο, например, путем использования антител к ПЕС-205 настоящего изобретения. Способы настоящего изобретения также включают способы индукции и усиления иммунного ответа (например, иммунного ответа, опосредованного Тлимфоцитами) на какой-либо антиген у субъекта. Такие способы включают представление антигена с участием рецептора на антигенпредставляющей клетке (например, ПЕС-205) в качестве компонента конъюгат ГКГС-Ι и (или) ГКГС-ΙΙ (например, ответ Т-лимфоцитов опосредован Т-лимфоцитами СЛ4 и СЛ8 или цитотоксическими Т-лимфоцитами или Т-хелперами). В одном варианте нацеленная клетка (которая может быть В-лимфоцитом) стимулирует Т-лимфоциты с ограничением по классу Ι ГКГС.
Чтобы облегчить понимание сути настоящего изобретения, сначала приводятся определения некоторых терминов. Дополнительные определения приведены в подробном описании.
Термин рецептор человеческих дендритных и эпителиальных клеток 205 (ПЕС-205) включает любые варианты или изоформы ПЕС-205, которые экспрессируются клетками в естественных условиях (например, человеческий ЛЕС-205, хранящийся в Банке генов под входящим номером ААС17636, и мышиный ПЕС-205, хранящийся в Банке генов под входящим номером ΑΑΣ81722). Соответственно чело- 5 026990 веческие антитела настоящего изобретения могут перекрестно реагировать с ИЕС-205 биологических видов, не являющихся человеком. Или эти антитела могут быть специфичными для человеческого ИЕС205 и могут не проявлять перекрестной реактивности с другими биологическими видами. ИЕС-205 или его любые варианты или изоформы могут быть выделены из клеток или тканей, которые экспрессируют его в естественных условиях (например, человека, мыши, обезьян циномолгус), или получены с помощью рекомбинантных методик, хорошо известных в данной области техники и (или) описанных в данном документе.
В Банке генов (входящий номер ААС17636А) приведена следующая аминокислотная последовательность ИЕС-205 человека (последовательность № 1):
тг1§\\а1ргг ра§11т11£\у ££сИаерз§г аапбрйпк »п1§кс1кр\ \т>\\ и ас10сс1 61 е1ейк1уукууу зсфЛГЫЬз цксЩбйк зупектГзс с1ззат1\\\\кс еИЫууааг 121 уг1а1кб§Ь§ {дзпазсЬлу кк££зеез1с άςρνΗβίνΐΓ 4§пзу§грсе £рШб§1мй
181 Ис1сл1с1ес1Нз §руусак1пу еусккуущс! крепл>сес1п\у екпец£§зсу сфШсраки 241 кеауузсцпс] «асШзтза ае11у1кеке щаклГ\\л§1 пц1узаг§ууе \\зс11|кр1пП 301 гпуфэскрзар ꧧззсагт ЛаезуфудзГ зсеас^руус гкр1пп!\ е11с1\\\1у5с11г 361 сба§\у1рпп§ £су1кпезп з\ус1каНакск акззсШзШ ΒΗάνβνννΐ кШпесИкее 421 ν\νϊ§11αιΐηΐ ρΐΐΓμνδάβΙ е\1ку\\ 4еп ерпурупк1р псузу1§е1§ срукуцзсеек 481 1куускгк«е к1пбазз4кт срр4е§уукгЬ §е!сук1уес1 еур£§1псп1 Шзгкецеу 5411пШткку4к зкку£уй§1 г4убзс§еуп ууа!у§§ггга \1£зп\\п£1е разр^слат 601 з!§кзу§кууе ук4сгз£ка1 з1скктз§р1 §рееазркрб <4рсрен,\\ С1зГ раз1зсук\Т 661 Иаепугкгп \\ееаегГс<|а 1§ак1зз£з11 усккеЛНГ 1ΐάς£3§ς1ι\ν 1м4§1пкгзр 721 с11с|^5\\ ср\ 8с1 ПрузЩтр пеГдрсЬ скг с1саа\ к\ ГНг руугпууНГус! ЛгеЛукрГ 781 ассШемус срркщ1рк1 рсйуупрскал; ίΗβρρΙϋββ зеу \\Т\ас11Ь 1пуееау1ус 841 азпИзПай 1з£у§1ка1к пк1ашз£(1§ ркхулутзеху ρϊόόΗΓίνзг уρχνΗτΓρνίΓ 901 §еес1утзак ΙννΠάΙίφρΐ 4сз1к1рйс екупузз1ек узрскаакуд 036ςλνίρ£ςη 961 ксйЫкруз ккздазскс йзу§§11рзу ГсредскЦ з11р4теа!1 \ущк\\1ауе 1021 кткхукпге 1±узпЛлрП уз§г1преп ГГееезгуНс аШгйцкзр й§1уупйзс 1081 зегШузкц кузеукзгср к]пазе1уку 1пп1укирк ИйуЬзакге скзптркз 1141 Ис1рус|С1аЛ зудаПНпзз 1\ущ1 Гздск! екйуузскф ЛНГзпхае! η^ςίβάοννΐ 1201 спскррушс ууз£пе1еке \ кр\с1з\ кср 3ρν1ηίρ\νΐρ Гс|пссупГп
1261 1кпгИтаИс) <4е\1т1ксс]к1 пркзЬПзк с!екеппй1е сфуГпутаз \уут1«Нугп 1321 пз1т\\ГПк1р 1зу1Ь\уга§г рккпекйа βΙδίάβΓχΠί срГкулееау уйщЬзПас 1381 Иетусккее ΗηίΠρςΓιτιρ у еИ^лу з\лс| кк\1\\уеа1п тсзрз^рЫа 3\Ηηςηβς1Γ 1441 1е<Ь\кгс1уГ р1ууу§1ззЬП ^зеззкехузП узксЬэрхук §ςί5ρ§ηον1 1Прк«1\укЬе 1501 кспзукск’Ш сукр!кзкк1 згЬуззгср аакеп§зпу1 рук«ЬсукзП цаШзкзеак 1561 ккзкЬПЬза куз1кПеПе пкГузЛтге пппПтгуху! §1здЬзу(к[5 хузуу1П§зеу1 1621 £\ к\уепкзкз £У£гсзтНа зпебуккуес еЬ^йдууск ур1§рПу1а1 апуаПзП
1681 уЬтщДпуЛ £цгЬг1Ыа§ Гззугуас|лд пеПекп1рз£Ьс1
Главные домены ИЕС-205 человека можно представить следующим образом:
\-СР-Г\П-СГК1)1-СГК1)2-СГК1)3-СГК1)4-СГК1)5-СГК1)б-СГи)7-СГи)8-СГи)9сткто-тмс где N - это Ν-конец; СК - это Суз Ккк (богатый цистеином) домен; ΓΝΙΙ - это домен фибронектинового типа II; СТГВ1-СТГВ10 - это десять лектиноподобных доменов С-типа; ТМС - это трансмембранный и цитоплазматический домены.
Термин дендритная клетка, согласно употреблению в данном документе, включает незрелые и
- 6 026990 зрелые дендритные клетки и родственные предшественники миелоидных клеток, способные дифференцироваться в дендритные клетки, или родственные антигенпредставляющие клетки (например, моноциты и макрофаги), которые характеризуются тем, что экспрессируют антигены, общие с дендритными клетками. Согласно употреблению в данном документе, термин родственный включает клетку, являющуюся производным общей клетки-предшественника или общей клеточной линии. В одном варианте антитело настоящего изобретения связывается с дендритными клетками и влияет на рост и (или) функцию дендритных клеток за счет нацеливания молекул или клеток с определенными функциями (например, опухолевых клеток, эффекторных клеток, микроорганизмов-возбудителей) на дендритные клетки. В дополнительном варианте связывание антитела настоящего изобретения с дендритной клеткой приводит к интернализации антитела дендритной клеткой.
Молекулы ГКГС включают два типа молекул, класс I ГКГС и класс II ГКГС. Молекулы класса I ГКГС представляют антиген специфичным Т-лимфоцитам СЭ8, молекулы класса II ГКГС представляют антиген специфичным Т-лимфоцитам СЭ4. Антигены, поступившие к АПК извне, подвергаются обработке преимущественно в ассоциации с классом II ГКГС. Антигены, поступившие к АПК изнутри, наоборот, подвергаются обработке преимущественно в ассоциации с классом I ГКГС. Однако при определенных условиях ДК обладают уникальной способностью пропускать экзогенные антигены во внутренние отделы для связывания с молекулами класса I ГКГС, вдобавок к молекулам класса II ГКГС. Этот процесс называется примированием перекрёстнореагирующим антигеном или перекрестным представлением.
Согласно употреблению в данном документе, термин агент-иммуностимулятор означает соединения, способные стимулировать АПК, такие как ДК и макрофаги. Например, соответствующие агентыиммуностимуляторы, пригодные для осуществления настоящего изобретения, способны стимулировать АПК так, что ускоряются процесс созревания АПК, пролиферация АПК и (или) привлечение или высвобождение молекулы-костимуляторов (например, СЭ80. СЭ86, ГСАМ-1, молекул ГКГС и ССК7) и провоспалительных цитокинов (например, ИЛ-Ιβ, ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-15 и ИФН-γ). Соответствующие агентыиммуностимуляторы также способны ускорять пролиферацию Т-лимфоцитов. Такие агентыиммуностимуляторы включают, но не ограничиваются перечисленным, лиганды СЭ40; цитокины такие как ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ и ИЛ-2; колониестимулирующие факторы, такие как Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) и ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор); антитело к СТЬА-4; ЛПС (эндотоксин); δδΡΗΚ; άδΡΗΚ; бациллу Кальметта-Герена (БЦЖ); левамизола гидрохлорид; и иммуноглобулины для внутривенного введения. В одном варианте агент-иммуностимулятор может быть агонистом То11-подобного рецептора (ТИК). Например, агентиммуностимулятор может быть агонистом ТТК3, таким как двухцепочечный полинуклеотид инозин:цитозин (поли-И:Ц, например, имеющийся в продаже под названием АшрБдеи™ производства компании Неш18ркегх Шркагша, штат Пенсильвания, США) или поли-А:У; агонист ТЬК4, такой как монофосфориллипид А (МФЛ) или КС-529 (например, имеющийся в продаже от компании ГСК, Великобритания); агонист ТТК5, такой как флагеллин; агонист ТТК7 или ТЬК8, такой как имидазохинолин; агонист ТТК7 или ТЬК 8, например, имиквимод (например, А1йага™) или резиквимод и родственные имидазохинолоновые агенты (например, имеющиеся в продаже от корпорации 3М); или агонист ТЬК 9, такой как дезоксинуклеотид с неметилированными СрО-мотивами (так называемые ΟρΟδ, например, как те, что производит компания Со1еу РЬагшасеийсаГ'). Такие агенты-иммуностимуляторы можно вводить одновременно, по отдельности или последовательно с антителами и конструктами настоящего изобретения, и они могут быть физически связаны с этими антителами и конструктами.
Согласно употреблению в данном документе, термин связанный означает ассоциацию двух или больше молекул. Эта связь может быть ковалентной или нековалентной. Эта связь также может быть генетической (т.е. при рекомбинантном слиянии). Такие связи можно создать с помощью разнообразных методик, известных в данной области техники, таких как конъюгация и получение рекомбинантных белков.
Согласно употреблению в данном документе, термин перекрестное представление антигена означает представление антигенов экзогенных белков Т-лимфоцитам с участием молекул класса I и класса II ГКГС на АПК.
Согласно употреблению в данном документе, термин ответ, опосредованный Т-лимфоцитами означает любой ответ, опосредованный Т-лимфоцитами, включая Т-лимфоциты-эффекторы (например, клетки СЭ8) и Т-лимфоциты-хелперы (например, клетки СЭ4). Ответы, опосредованные Тлимфоцитами, включают, например, цитотоксичность и пролиферацию Т-лимфоцитов.
Согласно употреблению в данном документе, термин цитотоксический ответ Т-лимфоцитов означает иммунный ответ, индуцированный цитотоксическими Т-лимфоцитами. Цитотоксические ответы Т-лимфоцитов опосредованы в основном Т-лимфоцитами СЭ8.
Термин антитело согласно употреблению в данном документе включает цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (например, антигенсвязывающий участок) или одну цепь антител или фрагментов. Антитело означает в одном предпочтительном варианте гликопротеин, содержащий
- 7 026990 как минимум две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные дисульфидными мостиками, или их антигенсвязывающий участок. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (обозначенного в данном документе сокращенно как νΗ) и постоянного участка тяжелой цепи. Постоянный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов - СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (обозначенного в данном документе сокращенно как Уь) и постоянного участка легкой цепи. Постоянный участок легкой цепи состоит из одного домена, СЬ. Участки νΗ и V можно подразделить дополнительно на участки гипервариабельности, называемыми участками, определяющими комплементарность (СОК), которые переплетаются с более консервативными участками, называемыми каркасными областями (РК). Каждый νΗ и Ун состоит из трех СОК и четырех РК, расположенных от Ν-конца до С-конца в следующем порядке: РК1, СЭК1. РК2, СЭК2. РК3, СЭК3 и РК4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Постоянные участки этих антител могут участвовать в связывании иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, клеткиэффекторы) и первым компонентом (С.'1с|) классической системы комплемента.
Термин антигенсвязывающий участок антитела (или просто участок антитела), согласно употреблению в данном документе, означает один или несколько фрагментов антитела, которые обладают способностью специфически связываться с антигеном (например, человеческим ПЕС-205). Продемонстрировано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающихся фрагментов, обозначенных термином антигенсвязывающий участок антитела, включают: ί) РаЬ-фрагмент - моновалентный фрагмент, состоящий из доменов Уь, νΗ, СЬ и СН1; тт) Р(аЬ')2-фрагмент - бивалентный фрагмент, содержащий два РаЬ-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; ттт) Рб-фрагмент, состоящего из доменов νΗ и СЛ1; ίν) Ρν-фрагмент, состоящий из доменов у!, и νΗ одного плеча антитела, ν) бАЬ-фрагмент (^агб с1 а1. (1989), №-11игс 341:544-546), который состоит из домена νΗ; и νί) отдельный участок, определяющий комплементарность (СПК), или νίί) комбинацию двух или более отдельных СПК, который могут как вариант быть связанными синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена Ρν-фрагмента, У[, и νΗ кодируются разными генами, их можно соединить с помощью рекомбинантных методик синтетическим линкером, который позволяет получить их в виде единого белка, где участки Уъ и νΗ спариваются с образованием моновалентной молекулы (известной как одноцепочечный Ρν (зсРу); см., например, Вйб с1 а1. (1988), §с1еисе 242:423-426; и Ηυδΐοη е! а1. (1988), Ргос. №И. Асаб. δα. υδΑ 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также обозначаются термином антигенсвязывающий участок антитела. Такие фрагменты антитела получают с помощью стандартных методик, известных специалистам в данной области техники, и эти фрагменты подвергают скринингу в отношении их полезности так же, как и целые антитела. Антигенсвязывающие участки можно получить с помощью методик рекомбинации ДНК или путем ферментативного или химического расщепления целых иммуноглобулинов.
Биспецифическое или бифункциональное антитело - это искусственное гибридное антитело, содержащее две различные пары тяжелых и (или) легких цепей и два различных связывающих сайта. Биспецифические антитела можно получить разными путями, включая слияние гибридом или связывание РаЬ'-фрагментов. См., например, δοΓίβδίνίΡιί & ЬасЬтапп, С1ш. Ехр. 1ттипо1. 79:315-321 (1990); Коз1е1пу е1 а1., Т 1ттипо1. 148, 1547-1553 (1992).
Термин моноклональное антитело, согласно употреблению в данном документе, означает антитело, которое проявляет только одну специфичность связывания и аффинность к определенному эпитопу. Соответственно, термин человеческое моноклональное антитело означает антитело, которое проявляет только одну специфичность связывания и которое содержит вариабельные и как вариант постоянные участки - производные последовательности иммуноглобулинов человеческих стволовых клеток. В одном из вариантов осуществления человеческие моноклональные антитела получают из гибридомы, которая включает В-лимфоцит, полученный из трансгенного животного, не являющегося человеком, например, трансгенной мыши, которая имеет геном, содержащий трансген тяжелой человеческой цепи и трансген легкой человеческой цепи, слитые с иммортализованной клеткой.
Термин рекомбинантное человеческое антитело, согласно употреблению в данном документе, включает все человеческие антитела, которые получают, вырабатывают, создают или выделяют с помощью рекомбинантных методик, например: а) антитела, выделенные у животного (к примеру, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным по генам человеческого иммуноглобулина, или из полученного из него гибридомы; б) антитела, выделенные из клетки хозяина, трансформированной для выработки антител, например, из трансфектомы; в) антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных человеческих антител; и г) антитела, полученные, выработанные, созданные или выделенные любым другим путем, который включает присоединение последовательности гена человеческого иммуноглобулина к другой ДНК-последовательности. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат различные вариабельные и постоянные участки, в которых использованы определенные последовательности иммуноглобулинов человеческих стволовых клеток, кодируемые генами стволовых клеток, но включают последующие перестройки и мутации, которые происходят, например, в процессе созревания антител. Как известно в данной области техники (см., например, ЬопЬегд (2005), №Циге Βίο- 8 026990
1ссН. 23(9): 1117-1125), вариабельный участок содержит антигенсвязывающий домен, который кодируется различными генами, которые перестраиваются для образования антитела, специфичного к какомулибо чужеродному антигену. Кроме перестройки вариабельный участок может быть дополнительно модифицирован путем множественных замен одиночных аминокислот (именуемых соматическими мутациями или гипермутациями) для увеличения аффинности антитела к чужеродному антигену. Постоянный участок будет меняться при ответе на антиген (т.е. переключение изотипов). Таким образом, перестроенные и соматически мутировавшие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют полипептиды легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, при ответе на антиген могут не иметь абсолютного сходства последовательности с исходными молекулами нуклеиновых кислот, но быть схожими или подобными в большой степени (т.е. иметь как минимум 80% сходство).
Термин человеческое антитело включает антитела, содержащие вариабельные и постоянные участки (если таковые присутствуют) последовательностей иммуноглобулинов человеческих стволовых клеток. Человеческие антитела настоящего изобретения могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов человеческих стволовых клеток (например, мутации, созданные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза ίη νίίτο или соматической мутации ίη νίνο) (см. ЬопЬетд, N. βί а1. (1994), №Шге 368(6474): 856-859); ЬопЬетд, N. (1994), НапйЬоок οί Е.хрептеп1а1 РЬатшасо1о§у 113:49-101; ЬопЬетд, N. и Низ/аг Ό. (1995), 1п1егп. Реу. 1шшипо1. Уо1. 13: 6593, и Натйшд, Р., ЬопЬетд, N. (1995), Апп. Ν.Υ. Асай. 8с1 764:536-546). Однако термин человеческое антитело не включает антитела, в которых СЭР-последовательности. являющиеся производными стволовых клеток других видов млекопитающих, таких как мышь, встроены в человеческие каркасные последовательности (т.е. человеческие антитела).
Согласно употреблению в данном документе, гетерологичное антитело определяется в соотношении к трансгенному организму, не являющимся человеком и вырабатывающим такое антитело. Этот термин означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность или кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую той, которая обнаруживается у организма, не являющегося трансгенным животным, которое не является человеком, и обычно получающимся от трансгенного животного, не являющего человеком.
Термин изолированное антитело, согласно употреблению в данном документе, означает антитело, которое в основном не содержит другие антитела, обладающие иной антигенной специфичностью (например, изолированное антитело, которое специфически связывается с человеческий ЭЕС-205, в основном не содержит антитела, специфически связывающие антигены, не являющиеся человеческим ЭЕС205). Однако изолированное антитело, которое специфически связывается с каким-либо эпитопом, может обладать перекрестной реактивностью с другими белками ЭЕС-205 других биологических видов. Однако это антитело предпочтительно всегда связывается с человеческим ЭЕС-205. Кроме того, изолированное антитело, как правило, в основном не содержит другой клеточный материал и (или) химические соединения. В одном варианте настоящего изобретения комбинация изолированных антител, обладающих различной специфичностью к ЭЕС-205, объединена в виде четко определенной композиции.
Термин эпитоп или антигенная детерминанта означает сайт на антигене, с которым специфически связываются какой-либо иммуноглобулин или антитело. Эпитопы могут быть образованы соседними аминокислотами или отстоящими друг от друга аминокислотами, сближенными при третичной укладке белка. Эпитопы, образованные соседними аминокислотами, как правило, сохраняются при воздействии на них денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные при третичной укладке, как правило, разрушаются после обработки денатурирующими растворителями. Как правило, эпитоп содержит как минимум 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Методики определения пространственной конформации эпитопов включают способы, известные в данной области техники, и те, что описаны в данном документе, например, рентгеновскую кристаллографию и двумерный ядерно-магнитный резонанс (см., например, Ерйоре Марршд РгоЮсо1з ίη МеОюйз ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 66, О. Е. Мотз, Ей. (1996)). В данном случае эпитоп предпочтительно располагается во внеклеточном домене человеческого ЭЕС-205, например, в одном или нескольких доменах, богатых цистеином, домене ΡηΙΙ или одном или нескольких из десяти лектиноподобных доменов С-типа человеческого ЭЕС-205.
Согласно употреблению в данном документе, термины специфическое связывание избирательное связывание, избирательно связывает и специфически связывает означают связывание антитела с эпитопом заданного антигена. Как правило, антитело связывается с константой диссоциации (Кс) примерно меньше 10-7 М, к примеру, примерно меньше 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже меньшей, когда ее определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса в аппарате В1ЛСОРЕ 2000 с использованием рекомбинантного человеческого ЭЕС-205 в качестве вещества, определяемого при анализе, и антитела в качестве лиганда, и связывается с заданным антигеном с аффинностью, которая как минимум двукратно превышает аффинность связывания неспецифического антигена (например, бычьего сывороточного альбумина, казеина), не являющегося заданным антигеном или схожим с этим антигеном. Фразы антигенраспознающее антитело и антитело, специфичное к антигену в данном документе используются взаимозаменяемо с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном.
- 9 026990
Также в объем данного изобретения входят антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом, и (или) антитела, которые конкурируют за связывание с человеческим ИЕС-205 с антителами, описанными в данном документе. Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп или конкурируют за связывание, можно идентифицировать с помощью стандартных методик. Такие методики включают, например, иммунологический анализ, где используется способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, т.е. анализ конкурентного связывания. Конкурентное связывание определяют в анализе, в котором исследуемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном, таким как ИЕС-205. Известно множество типов анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (РИА), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА), сэндвич-анализ конкурентного связывания (см. 5>1аНП е! а1., МеШобк ίη Еп/уто1оду 9:242 (1983)); твердофазный прямой ИФА с биотином-авидином (см. Кттк1апб е! а1., 1. 1ттипо1. 137:3614 (1986)); твердофазный прямой иммунофлуоресцентный анализ, твердофазный прямой иммунофлуоресцентный сэндвич-анализ (см. Наг1о\у и Ьапе, ЛпПЬоФсх: А ЬаЪогаФту Мапиа1, Со1б δρτίη^ НатЬот Рте55 (1988)); твердофазный прямой РИА с использованием Ι-125-метки (су/ Моге1 е! а1., Мо1. 1ттипо1. 25(1):7 (1988)); твердофазный прямой ИФА с биогтином-авидином (Сйеипд е! а1., Уио1оду 176:546 (1990)); и прямой РИА (Мо1бепЬаиег е! а1., 8сапб. 1. 1ттипо1. 32:77 (1990)). Как правило, такой анализ включает использование очищенного антигена, фиксированного на твердой поверхности или клетках, несущих либо немеченый исследуемый иммуноглобулин, либо меченый контрольный иммуноглобулин. Конкурентное торможение оценивают количественно, определяя количество метки, связанное с твердой поверхностью или клетками в присутствии исследуемого иммуноглобулина. Обычно исследуемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Как правило, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет тормозить специфическое связывание контрольного антитела с общим антигеном как минимум на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 7075% или более.
Другие методики включают, например, методики картирования эпитопа, такие как рентгеноструктурная кристаллография комплексов антиген-антитело, который позволяет изучить строение эпитопа с разрешением на уровне размера атома. Дополнительные методики включают мониторинг связывания антител с фрагментами антигена или мутировавшими формами этого антигена, где потеря связывания из-за изменений аминокислотных остатков в последовательности этого антигена часто считается условием для компонента эпитопа. Кроме того, для картирования эпитопа можно использовать компьютерные комбинаторные методики. В этих методиках используется способность исследуемого антитела выделять специфические короткие пептиды с определенной аффинностью из библиотеки пептидов фагового отображения. Эти пептиды часто рассматриваются как ориентиры при определении эпитопа, соответствующего антителу, которое используются для скрининга библиотеки пептидов. Для картирования эпитопа также разработаны компьютерные алгоритмы, которые, как показано, картируют конформационно прерывистые эпитопы.
Термин Кс, согласно употреблению в данном документе, означает константу равновесия диссоциации при взаимодействии определенного антитела с антигеном. Как правило, человеческие антитела настоящего изобретения связываются с ИЕС-205 с константой равновесия диссоциации (Кс) примерно 10-8 М или менее, к примеру, менее 10-9 М или 10-10 М или даже менее, когда ее измеряют с помощью поверхностного плазмонного резонанса в аппарате В1АСОРЕ 2000 с использованием рекомбинантного человеческого ИЕС-205 в качестве исследуемого вещества и антитела в качестве лиганда.
Термин кб, согласно употреблению в данном документе, означает скорость диссоциации антитела из комплекса антитело-антиген
Термин ка, согласно употреблению в данном документе, означает скорость ассоциации антитела с данным антигеном.
Термин ЕС50, согласно употреблению в данном документе, означает концентрацию антитела или его антигенсвязывающего участка, вызывающую ответ в анализах ш уйго или ап ш утуо, которая составляет 50% от максимального ответа, т.е. промежуточное значение между максимальным ответом и нулевым уровнем.
Согласно употреблению в данном документе, изотип означает класс антител (например, 1дМ или 1дО1), который кодируется генами постоянного участка тяжелой цепи. В одном варианте человеческое моноклональное антитело настоящего изобретения представляет собой изотип Ι§Ο1. В другом варианте человеческое моноклональное антитело настоящего изобретения представляет собой изотип Ι§Ο2.
Термин связывается с иммобилизованным ИЕС-205 означает способность человеческого антитела настоящего изобретения связываться с ИЕС-205, например, который экспрессируется на клеточной поверхности или фиксирован на твердой подложке.
Термин перекрестно реагирует, согласно употреблению в данном документе, означает способность антитела настоящего изобретения связываться с ИЕС-205 различных биологических видов. Например, антитело настоящего изобретения, которое связывает человеческий ИЕС-205, также, возможно, связывает ИЕС-205 макак-крабоедов. Согласно употреблению в данном документе, перекрестная реактивность измеряется по выявлению специфической реактивности на очищенный антиген в анализах свя- 10 026990 зывания (например, поверхностном плазмонном резонансе, твердофазном иммуноферментном анализе) или по связыванию с, или другому функциональному взаимодействию с, клетками, физиологически экспрессирующими ΌΕΟ-205. Методики определения перекрестной реактивности включают стандартные анализы связывания, такие как описанные в данном документе, например, поверхностный плазмонный резонанс с использованием аппарата Ыасоге 2000 (Ыасоге АВ, Упсала, Швеция), или связывание с ΌΕΟ205-экспрессирующими клетками соответствующих видов (например, дендритными клетками) с помощью, например, флоуцитометрии.
Согласно употреблению в данном документе, переключение изотипов означает явление, при котором класс, или изотип, антител меняется с одного класса иммуноглобулинов на другой класс иммуноглобулинов.
Согласно употреблению в данном документе термин не переключенный изотип означает класс изотипов тяжелой цепи, который вырабатывается в отсутствие переключения изотипов; ген СН, кодирующий не переключенный изотип, как правило, является первым геном СН, расположенным непосредственно вблизи от функционально перестроенного гена УЭ1 в 5' - 3' направлении. Переключение изотипов классифицируют как классическое или неклассическое переключение изотипов. Классическое переключение изотипов происходит с участием рекомбинантных событий, включающих как минимум один участок переключения в последовательности трансгена. Неклассическое переключение изотипов может происходить, например, путем гомологичной рекомбинации между человеческим σμ и человеческим Σμ (δ-ассоциированная делеция). Среди прочих могут участвовать другие механизмы неклассического переключения, такие как межтрансгенная и (или) межхромосомная рекомбинация, и приводить к переключению изотипов.
Согласно употреблению в данном документе, термин последовательность переключения означает последовательности ДНК, отвечающие за переключение рекомбинации. Последовательность донора переключения, как правило, область переключения μ, будет представлять собой 5'-конец (т.е. в 3'-5' направлении) участка конструкта, предназначенного для делеции во время рекомбинации на этапе переключения. Область акцептора переключения будет располагаться между участком конструкта, предназначенного для делеции, и постоянным участком, предназначенным для замены (например, γ, ε и т.д.). Поскольку не существует специфического сайта, где всегда происходит рекомбинация, окончательную последовательность гена, как правило, невозможно предсказать, исходя из конструкта.
Согласно употреблению в данном документе, структура гликозилирования определяется как распределение углеводных единиц, ковалентно связанных с белком, а именно с белком иммуноглобулина. Структуру гликозилирования гетерологичного антитела можно охарактеризовать как в основном схожую со структурами гликозилирования, которые возникают естественным путем на антителах, вырабатывающихся видами трансгенных животных, не являющихся человеком, где специалист в данной области техники распознает структуру гликозилирования гетерологичного антитела как более схожую с указанной структурой гликозилирования у видов трансгенных животных, не являющихся человеком, чем у видов, от которых получены трансгены генов СН.
Термин естественного происхождения, согласно употреблению в данном документе, применительно к объекту означает тот факт, что данный объект может быть обнаружен в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в каком-либо организме (включая вирусы) и которую можно выделить из источника в природе и которая не была умышленно изменена человеком в лаборатории, является последовательностью естественного происхождения.
Термин реорганизованный, согласно употреблению в данном документе, означает конфигурацию локуса тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, где У-участко расположен тотчас вблизи Ό-1- или 1участка, кодирующего в основном полные домены Ун или Уъ соответственно. Реорганизованный локус гена иммуноглобулина можно обнаружить путем сравнения ДНК стволовых клеток, при этом реорганизованный локус будет иметь как минимум один гомологичный гептамерный/нонамерный элемент.
Термин не реорганизованный или конфигурация стволовых клеток, согласно употреблению в данном документе в отношении У-участка, означает конфигурацию, где У-участок не рекомбинирован так, что он прилежит тотчас к Ό- или 1-участку.
Термин молекула нуклеиновой кислоты, согласно употреблению в данном документе, означает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно двухцепочечной ДНК.
Термин изолированная молекула нуклеиновой кислоты, согласно употреблению в данном документе, в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или части антитела (например, Ун, Уь, ΟΌΚ3), которые связываются с ΌΕΟ-205, означаете молекулу нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, не содержат другие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или части антител, которые связывают антигены, не являющиеся ΌΕΟ-205; указанные другие последовательности могут естественным образом фланкировать нуклеиновую кислоту в человеческой геномной ДНК. Например, последовательности № 2, 3 (с сигнальным пептидом)/4 (без сигнального пептида) и последовательности № 8, 9 (с сигнальным пептидом)/10
- 11 026990 (без сигнального пептида) представляют собой соответственно нуклеотидную и аминокислотную последовательности, содержащие вариабельные участки тяжелой (Ун) и легкой цепи (Уь) человеческого антитела к ЭЕС-205 3Ό6-2Ρ4 настоящего изобретения. В частности, последовательности № 2 и 3/4 соответствуют нуклеотидной и аминокислотной последовательности, соответственно, Ун антитела 3Ό6-2Ρ4, последовательности № 8 и 9/10 соответствуют нуклеотидной и аминокислотной последовательности соответственно У[, антитела 3Ό6-2Ρ4.
В объем настоящего изобретения также входят консервативные модификации последовательностей в последовательностях, приведенных в последовательности № 2-91, т.е. модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, которые не нарушают связывание антитела, кодируемого этой нуклеотидной последовательностью или содержащего эту аминокислотную последовательность, с данным антигеном. Такие консервативные модификации последовательности включают консервативные замены нуклеотидов и аминокислот, а также инсерции и делеции нуклеотидов и аминокислот. Например, модификации можно внести в последовательности № 2-91 с помощью стандартных методик, известных в данной области техники, таких как сайт-специфический мутагенез или ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают те, при которых аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, определены в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный остаток аминокислоты, не относящейся к незаменимым, в человеческом антителе к ЭЕС205 предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Методики идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, не устраняющих связывание антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Вгитте11 е! а1., ВюсНст. 32:1180-1187 (1993); КоЪауакЫ е! а1. Рго!еш Епд. 12(10):879-884 (1999); и Вигк8 е! а1. Ргос. №й1. Лсай. 8ск И8А 94:412-417 (1997))
Или, в другом варианте осуществления, мутации могут быть внесены случайно во всю или часть последовательности, кодирующей антитело ЭЕС-205. например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные модифицированные антитела к ЭЕС-205 можно подвергнуть скринингу на связывающую активность.
В отношении нуклеиновых кислот термин существенная гомология означает, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении схожи по соответствующим инсерциям или делециям нуклеотидов как минимум примерно в 80% нуклеотидов, как правило, как минимум в 90-95% и более предпочтительно как минимум в 98-99,5% нуклеотидов. Кроме того, существенная гомология имеется тогда, когда при селективных условиях гибридизации участки гибридизуются с комплементарными участками цепочки.
Процентное сходство двух последовательностей является функцией числа одинаковых позиций, общих для последовательностей (например,% гомологии=число одинаковых позиций/общее число позицийх100), с учетом числа гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процентного сходства двух последовательностей можно выполнить с помощью математического алгоритма, как описано в примерах ниже, не ограничивающихся перечисленным.
Процентное сходство двух последовательностей можно определить с помощью программы САР программного пакета ССС (имеется по адресу Ьйр://№№№.дсд.сот), используя матрицу ИУ8дарйпа.СМР и штраф за открытие гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и штраф за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процентную идентичность двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей также можно определить с помощью алгоритма Э. Мейерса и В. Миллера (САВ1О8, 4:11-17 (1989)), который встроен в программу АЫСИ (версия 2.0), используя таблицу РАМ120, штраф за открытие гэпа, составляющий 12, и штраф за продолжение гэпа, составляющий 4. Кроме того, процентное сходство двух аминокислотных последовательностей можно определить с помощью алгоритма Нидлмэна и Вунха (I. Мо1. Вю1. (48):444453 (1970)), который встроен в программу САР программного пакета ССС (имеется по адресу ййр://'№'№'№.дсд.сот), используя матрицу В1о88ит 62 или матрицу РАМ250, а также штраф за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штраф за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Последовательности нуклеиновых кислот и белков настоящего изобретения можно также использовать в качестве последовательности запроса, чтобы выполнить поиск в открытых базах данных, например, найти схожие последовательности. Такой поиск можно выполнить с помощью программ ИВЬА8Т и ХВЬА8Т (версия 2.0) А1!8сйи1, е! а1. (1990), 1. Мо1. Вю1. 215:403-10. Поиск нуклеотидов ВЬА8Т можно провести с использованием программы ИВЬА8Т, показатель = 100, длина слова =12, для поиска нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот настоящего изобретения.
- 12 026990
Поиск белков ВЬА§Т можно провести с помощью программы ХВЬА§Т, показатель = 50, длина слова = 3, для поиска аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белков настоящего изобретения. Для выравнивания гэпов в целях сравнения можно использовать Саррей ВЬЛ§Т, как описано Л115с1ш1 е! а1. (1997), Ыис1е1с Ас1Й8 Ке8. 25(17):3389-3402. При использовании программ ВЬЛ§Т и Саррей ВЬЛ§Т можно использовать заданные по умолчанию параметры соответствующих программ (например, ХВЬЛ§Т и ПВЬЛ§Т). См. 1и1р://\у\у\у.псЬгп1т.1ц1гдоу.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или частично или преимущественно очищенной форме. Нуклеиновая кислота изолирована или получена в преимущественно чистой форме, когда она очищена от других клеточных компонентов или других загрязняющих веществ, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методик, включая обработку щелочью и (или) додецилсульфатом натрия, С§С1-бэндинг, колоночную хроматографию, гель-электрофорез в агарозе и другие известные в данной области техники. См. Р. Ли8иЬе1, е! а1., ей. Сштеи! Рго1осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬНкЫпд апй \УПеу 1п1ег8с1епсе, №\у Уогк (1987).
Композиции нуклеиновых кислот часто в исходной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и схожих с ними), либо из кДНК, геномной или их смесей могут быть изменены в соответствии со стандартными методиками для создания последовательности гена. В отношении кодирующих последовательностей эти мутации могут влиять на аминокислотную последовательность согласно поставленным целям. В частности, предвидятся последовательности ДНК, существенно гомологичные или являющиеся производными естественной V, Ό, 1, постоянной последовательности и последовательности переключения и других таких последовательностей, описанных в данном документе (где термин производные указывает, что последовательность является схожей или модифицированной из другой последовательности).
Нуклеиновая кислота функционально связана, когда она находится в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, промотер или энхансер является функционально связанным с кодирующими последовательностями, если это влияет на транскрипцию данной последовательности. В отношении транскрипции регуляторных последовательностей функционально связанные означают, что связанные последовательности ДНК являются смежными, и, при необходимости объединения двух областей, кодирующих белки, смежными и в рамке считывания. В отношении последовательности переключения функционально связанные означают, что эти последовательности способны осуществлять переключение рекомбинации.
Термин вектор, согласно употреблению в данном документе, означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним типом вектора является плазмида, что означает петлю кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую можно встроить дополнительные участки ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные участки ДНК могут быть встроены в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке хозяина, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие репликацию бактериального происхождения, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки хозяина при введении в клетку хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геномом хозяина.
Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в данном документе рекомбинантными векторами экспрессии (или просто векторами экспрессии). Как правило, векторы экспрессии, использующиеся в методиках рекомбинации ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида является наиболее часто использующейся формой вектора. Однако настоящее изобретение включает и другие формы векторов экспрессии, такие, как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектом репликация, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют аналогичные функции.
Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин), согласно употреблению в данном документе, означает клетку, в которую введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует иметь в виду, что такие термины означают не только клетки конкретного субъекта, но и потомство таких клеток. Поскольку некоторые модификации могут иметь место в последующих поколениях в результате либо мутации, либо воздействия внешних факторов, такое потомство может по существу не быть идентичным родительской клетке, но они все же включены в рамки термина клетка-хозяин, согласно употреблению в данном документе.
Термин антигенпредставляющая клетка или АПК - это клетка, которая представляет собой чужеродный антиген, связанный с ГКГС, на своей поверхности. Т-лимфоциты распознают этот комплекс с помощью Т-клеточных рецепторов (ТКР). Примеры АПК включают, но не ограничиваются этим, дендритные клетки (ДК), мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), моноциты (такие как ТНР1), В-лимфобластоидные клетки (такие как С1К.А2, 1518 В-ЬСЬ) и дендритные клетки (ДК) - производные моноцитов. Некоторые АПК интернализуют антигены либо путем фагоцитоза, либо путем эндоцитоза, опосредованного рецептором. Примеры рецепторов АПК включают, но не ограничиваются этим, лектины С-типа, такие как рецептор человеческих дендритных и эпителиальных клеток 205 (ПЕС-205), и
- 13 026990 рецептор маннозы человеческого макрофага.
Термин представление антигена означает процесс, с участием которого АПК захватывают антигены и обеспечивают их распознавание Т-лимфоцитами, например, как компонента конъюгата ГКГС-1 и (или) ГКГС-П.
Термины индукция иммунного ответа и усиление иммунного ответа употребляются взаимозаменяемо и означают стимуляцию иммунного ответа (например, пассивного или адаптивного) на определенный антиген.
Термины лечить и лечение, согласно употреблению в данном документе, означают терапевтические или профилактические меры, описанные в данном документе. К способам лечения относится введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, человеческого антитела настоящего изобретения, например, субъекту, нуждающемуся в усилении иммунного ответа на определенный антиген, или субъекту, у которого может возникнуть такое заболевание, в целью предупреждения, излечения, отсрочки, уменьшения тяжести, или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания или рецидива заболевания или для продления жизни субъекта дольше срока, ожидаемого в отсутствие такого лечения.
Термин эффективная доза или эффективная дозировка означает количество, достаточное для достижения полного или, как минимум, частичного желаемого эффекта. Термин терапевтически эффективная доза означает количество, достаточное для излечения или, как минимум, частичного замедления заболевания и его осложнений у пациента, уже страдающего этим заболеванием. Количества, достаточные для этих целей, зависят от тяжести заболевания, по поводу которого проводится лечения, и общего состояния иммунной системы пациента.
Термин пациент означает человека и субъекты других видов млекопитающих, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение.
Согласно употреблению в данном документе, термин субъект включает человека или любое животное, не относящееся к человеку. Например, способы и композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения у субъекта иммунологическое заболевания. Термин животное, не относящееся к человеку включает всех позвоночных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как, приматы, не относящиеся к человекообразным, баран, собака, корова, курица, амфибии, рептилии и т.д.
Различные аспекты настоящего изобретения описаны подробно в следующих подразделах.
I. Получение антител к БЕС-205
В объем настоящего изобретения входят антитела, например, полностью человеческие антитела, которые связываются с ПЕС-205, например, ПЕС-205 человека.
Примеры моноклональных антител, которые связываются с ПЕС-205, включают 3П6-2Р4, 3П6-4С8, 3Ο9-2Ώ2, 5А8-1Р1, 2П3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Б12-5С1, 106-106, 5С3-2-3Р6, 1Ε6-3Ώ10 и 3А4-1С10. Моноклональные антитела настоящего изобретения можно получить с помощью различных методик, таких как стандартная гибридизация соматических клеток, описанная КоЫет и Μίΐδΐβίη, ИаШте 256: 495 (1975). Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе можно использовать и другие методики получения моноклональных антител, например, вирусная или онкогенная трансформация В-лимфоцитов, методик фагового отображения с использованием библиотек генов человеческих антител.
Соответственно, в одном из вариантов осуществления для получения антитела, которое связывается с человеческим ПЕС-205, используется методика гибридомы. Согласно этой методике мышь или другое соответствующее животное-хозяин можно иммунизировать соответствующим антигеном для стимуляции лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, специфически связывающиеся с антигеном, использующимся для иммунизации. Или же лимфоциты можно иммунизировать ίη νίίτο. Затем лимфоциты можно слить с клетками миеломы с помощью соответствующего фактора, вызывающего слияние клеток, например, полиэтиленгликоля, для получения клетки гибридомы (Ообшд, Мопос1опа1 ЛпОЬоШех: Ртшс1р1е8 апб РгаеПее. рр.59-103 (Лсабеппс Рге88, 1986)). Питательную среду, на которой культивируют клетки гибридомы, анализируют на выработку моноклональных антител, направленных против антигена. После того, как идентифицированы клетки гибридомы, вырабатывающие антитела с нужной специфичностью, аффинностью и (или) активностью, клоны можно субклонировать с подошью процедур с ограниченным разведением и культивировать по стандартным методикам ((Ообшд, Мопос1опа1 ЛпОЬоб1е8 Ргшс1р1е8 апб Ртасйсе, р. 59-103 (Лсабеппс Рге88, 1986)). Пригодные для такой цели питательные среды включают, например, среду Ώ-МЕМ или КРМ1-1640. Кроме того, клетки гибридомы можно культивировать ш νί\Ό в асцитных опухолях у какого-либо животного. Моноклональные антитела, вырабатываемые субклонами, можно отделить от питательной среды, асицитической жидкости или сыворотки с помощью стандартных методик очистки иммуноглобулинов, таких как, например, использованием протеин-А-сефарозы, хроматография с гидроксиапатитом, гель-электрофорез, диализ или афинная хроматография.
В другом варианте осуществления антитела и части антител, которые связывают ПЕС-205 человека, можно выделить из фаговых библиотек антител, созданных с помощью методик, описанных, например, МсСайейу е1 а1., ИаШте, 348:552-554 (1990). С1аск8оп е1 а1., ИаШте, 352:624-628 (1991), Магк8 е1 а1., I. Мо1. Бю1, 222:581-597 (1991), и Ное! е1 а1 (2005), ИаШте Бю1есЪпо1о§у 23, 344-348; патенты США № 5223409;
- 14 026990
5403484; и 5571698 Ьабпег е! а1.; патенты США № 5427908; 5580717; и 5571698 Иотег е! а1.; патенты США № 5969108 и 6172197 МсСайеЬу е! а1.; и патенты США № 5885793; 6521404; 6544731); 6555313: 65829156 и 6593081 СгШЙЬз е! а1. Кроме того, можно использовать получение высокоаффинных человеческих антител (в наномолярном диапазоне) с помощью перестановки цепи (Магкз е! а1., Вю/ТесЬпо1оду, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и рекомбинации ίη νίνο как стратегии для получения очень больших фаговых библиотек (^а!егЬоизе е! а1., Ыис. АсШз. Рез., 21:2265-2266 (1993)).
В одном конкретном варианте осуществления антитело, которое связывает ИЕС2-5 человека, получают с помощью методики фагового отображения, как описано Ное! е! а1., см. выше. Эта методика включает создание библиотеки человеческого РаЬ, имеющую уникальную комбинацию последовательностей иммуноглобулинов, выделенных у людей-доноров и имеющих синтетическое разнообразие в СИР тяжелых цепей. Затем проводят скрининг этой библиотеки на РаЬ, которые связываются с ИЕС-205 человека.
Предпочтительной животной системой для получения гибридом, которые вырабатывают антитела настоящего изобретения, является мышиная система. Получение гибридом у мыши хорошо известно в данной области техники, включая протоколы иммунизации и методики выделения и слияния иммунизированных спленоцитов.
В одном из вариантов осуществления антитела к ИЕС-205 получают с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека, а не системы мыши. В одном варианте настоящего изобретения используются трансгенные мыши, обозначенные в данном документе как мыши НиМАЬ, которые содержат минилокусы генов человеческих иммуноглобулинов, кодирующие нереорганизованные человеческие последовательности тяжелых (μ и γ) и легких (к) цепей вместе с целенаправленными мутациями, которые активирует эндогенные локусы цепей μ и к (ЬопЬегд, N. е! а1. (1994), №1иге 368 (6474): 856-859). Соответственно, у мышей проявляется сниженная экспрессия мышиных ЦМ или к в ответ на иммунизацию, при этом трансгены встроенных человеческих тяжелых и легких цепей подвергаются переключению классов и соматическим мутациями с получением высокоаффинных моноклональных человеческих антител ЦСк (ЬопЬегд, N. е! а1. (1994), см. выше; в обзоре ЬопЬегд, N. (1994), НапбЬоок о£ Ехрептейа1 РЬагтасо1оду 113:49-101; ЬопЬегд, Ν., Низ/аг И. (1995), Ьлегп. Реν. Iттиηο1. Уо1. 13: 65-93, и НагФпд, Р., ЬопЬегд, N. (1995), Апп. Ν.Υ. Асаб. δα 764:536-546). Получение мышей НуМАЬ описано подробно ниже в разделе II и у Тау1ог, Ь. е! а1. (1992), ШсШс АсШз РезеагсЬ 20:6287-6295; СЬеп, 1. е! а1. (1993), ЬИегпаЬопй Iттиηο1οду 5: 647-656; ТиаШоп е! а1. (1993), Ргос. №Ш. Асаб. 8ά И8А 90:3720-3724; СЬо1 е! а1. (1993), \а1иге СепеПсз 4:117-123; СЬеп, 1. е! а1. (1993), ЕМВО 1. 12: 821-830; ТиаШоп е! а1. (1994), 1. ]ттипо1. 152:2912-2920; ЬопЬегд е! а1. (1994), ХаПае 368(6474): 856859; ЬопЬегд, N. (1994), НапбЬоок о£ Ехрептеп1а1 РЬагтасо1оду 113:49-101; Тау1ог, Ь. е! а1. (1994), Шегпа!юпа1 Iттиηο1οду 6: 579-591; ЬопЬегд, КЦиз/аг, И. (1995), Ьиегп. Реν. Iттиηο1. Уо1. 13: 65-93; Нагбшд, Р., ЬопЬегд, N. (1995), Апп. ΝΥ. Асаб. δα 764:536-546; ЫзШмПН, И. е! а1. (1996), №!иге Вю!есЬпо1оду 14: 845-851. См. дополнительно патенты США № 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5877397, 5661016, 5814318, 5874299 и 5770429, все ЬопЬегд и Кау и компания СепРЬагт Плегпа!юпа1; патенты США № 5545807 διιπιπί е! а1.; Международных публикациях \УО 98/24884, опубликованной 11 июня 1998 г.; \УО 94/25585, опубликованной 10 ноября 1994 г.; \УО 93/1227, опубликованной 24 июня 1993 г.; \УО 92/22645, опубликованной 23 декабря 1992 г.; \УО 92/03918, опубликованной 19 мая 1992 г.
Иммунизация
Для получения полностью человеческих антител против ИЕС-205 трансгенных или трансхромосомных мышей, содержащих гены человеческих иммуноглобулинов (например, мышей НСо12, НСо7 или КМ), можно иммунизировать очищенным или обогащенным составом, содержащим антиген ИЕС205, и (или) клетки, экспрессирующие ИЕС-205, как описано, например, ЬопЬегд е! а1. (1994), №!υΐ€ 368(6474): 856-859; Εί8ΐι\νί16 е! а1. (1996), ^Шге Вю!есЬпо1оду 14: 845-851 и \УО 98/24884. Как описано в данном документе, мышей НиМАЬ иммунизируют либо рекомбинантными белками ИЕС-205, либо клеточными линиями, вырабатывающими ИЕС-205 в качестве иммуногенов. Или же мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей ИЕС-205 человека. Предпочтительно мыши должны быть возрастом 6-16 недель на момент первого введения. Например, для интраперитонеальной иммунизации мышей НиМАЬ можно использовать очищенный или обогащенный состав (5-50 мкг) рекомбинантного антигена ИЕС205. В случае, когда иммунизация очищенным или обогащенным составом, содержащим антиген ИЕС205, не приводит к выработке антител, мышей также можно иммунизировать клетками, вырабатывающими ИЕС-205, например, какой-либо клеточной линией, для индукции иммунных ответов. Примеры клеточных линий включают стабильные клеточные линии СНО и Ра_р, суперэкспрессирующие ИЕС-205.
Обобщенный опыт по различным антигенам продемонстрировал, что трансгенные мыши НиМАЬ лучше всего реагируют, когда первоначально проводится интраперитонеальная (ИП) или внутрикожная (ВК) иммунизация антигеном в полном адъюванте Фрейнда, за которой один раз в 2 недели следует иммунизация (всего до 10 раз) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Иммунный ответ можно наблюдать в процессе протокола иммунизации по анализу образцов плазмы, взятых при кровотечении в ретроорбитальной области. Плазму можно исследовать с помощью твердофазного иммуноферментного анали- 15 026990 за (как описано ниже), и мышей с достаточными титрами человеческим иммуноглобулинов против ОЕС205 можно использовать для слияний. Мышам можно вводить бустеры антигеном за 3 суток до забития и извлечения селезенки.
Получение гибридом, вырабатывающих моноклональные антитела к БЕС-205
Для получения гибридом, вырабатывающих моноклональные антитела к ОЕС-205, спленоциты и клетки лимфоузлов иммунизированных мышей можно выделить и слить с соответствующей линией иммортализованных клеток, таких как клеточная линия мышиной миеломы. Затем среди полученных гибридом можно выполнить скрининг на выработку антигенспецифических антител. Например, взвеси одного типа клеток из лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей можно слить с клетками мышиной миеломы 8Р2/0-А§8.653, не вырабатывающими антитела (АТСС, СКЬ 1580) с использованием 50% полиэтиленгликоля (χν/ν). Клетки можно сеять в концентрации примерно 1х105 на плоскодонные микроплашки с последующей 2-недельной инкубацией в селективной питательной среде, содержащей помимо обычных реагентов 10% сыворотку плода для клонирования, 5-10% фактор клонирования гибридом ОКIСЕN (ЮЕЦ) и 1Х НАТ (§1§та). Примерно через две недели клетки можно культивировать в среде, где НАТ заменен на НТ. Затем отдельные клетки можно исследовать с помощью твердофазного иммуноферментного анализа на моноклональные антитела 1дМ и 1§О к ЭЕС-205 или на связывание с поверхностью клеток, экспрессирующих ОЕС-205, например, клеточной линии СНО, экспрессирующей ОЕС-205, с помощью флуоресцентного иммуносорбентого анализа. Как только начнется рост гибридом, обычно среду можно осмотреть через 10-14 суток. Гибридомы, вырабатывающие антитела, можно снова посеять на плашку, вновь подвергнуть скринингу, и если 1§О продолжает вырабатываться, можно провести субклонирование моноклональных антител к ОЕС-205 как минимум дважды путем ограниченного разведения. Стабильные субклоны затем можно культивировать ίη νίίτο для получения антител в среде для культивирования тканей для изучения характеристик.
Получение трансфектом, вырабатывающих моноклональные антитела к БЕС-205
Антитела настоящего изобретения также можно получать в трансфектоме клеток хозяина с использованием, например, комбинации методик рекомбинации ДНК и трансфекции генов, как это известно в данной области техники (Моткоп, δ. (1985), 8с1епсе 229:1202).
В качестве примера в одном варианте нужные один или несколько генов, например, гены человеческих антител, можно встроить в вектор экспрессии, такой как плазмида экспрессии эукаритов, как та, что используется в системе экспрессии гена С8, описанной в АО 87/04462, АО 89/01036 и ЕР 338841, или другие системы, известные в данной области техники. Очищенные плазмиды с клонированными генами антител можно ввести клетки хозяина эукариотов, такие как клетки СНО или клетки Ν8Ο или другие клетки эукариотов, как клетки растений, грибов или дрожжей. Методика, используемая для введения этих генов, может быть методиками, описаны в данной области техники, такими как электропорация, липофектин, липофектамин или другие. После введения этих генов антител в клетки хозяина можно идентифицировать и отобрать клетки, вырабатывающие антитело. Эти клетки представляют собой трансфектомы, которые можно амплифицировать по уровню экспрессии и использовать в широких масштабах для выработки антител. Рекомбинантные антитела можно выделить и очистить из надосадочной жидкости культур и (или) клеток.
Или эти клонированные гены антител можно экспрессировать в других системах экспрессии, таких как Е.соН, или в целых организмах или экспрессировать их синтетическим путем.
Использование частичных последовательностей антител для выработки целых антител
Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно с участием аминокислотных остатков, располагающихся в шести участках тяжелых и легких цепей, определяющих комплементарность (СОК). По этой причине аминокислотные последовательности в пределах СОК у отдельных антител отличаются больше, чем последовательности вне СОК. Поскольку СОК-последовательности отвечают за большинство процессов взаимодействия антитело-антиген, можно получать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства определенных антител естественного происхождения за счет конструирования векторов экспрессии, которые включают СВК-последовательности определенных антител естественного происхождения, встроенные в каркасные области другого антитела с другими свойствами (см., например, ЮесНтапп, Ь. е! а1., 1998, №Лиге 332:323-327; 1опе8, Р. е! а1., 1986, №Циге 321:522-525; и Спеет С. е! а1., 1989, Ргос. №И. Асаб. 8ее. И.8.А. 86:10029-10033). Такие каркасные последовательности можно получить из открытых баз данных по ДНК, которые содержат последовательности генов антител стволовых клеток. Такие последовательности стволовых клеток будут отличаться от последовательностей антител естественного происхождения, так как они не буду включать полностью собранные вариабельные гены, которые образуются соединением У(О)1 при созревании В-лимфоцитов. Последовательности генов стволовых клеток будут также отличаться от последовательностей высокоаффинных антител вторичного репертуара у одной и той же особи в вариабельном участке. Например, соматические мутации относительно редки на Ν-конце каркасной области. Например, соматические мутации относительно редки на Ν-конце каркасной области участка 1 и на С-конце каркасной области участка 4. Кроме того, многие соматические мутации существенно не влияют на связывающие свойства антитела. По этой причине нет необходимости получать всю последовательность ДНК определенного антитела для того, чтобы
- 16 026990 создать целое рекомбинантное антитело, обладающее связывающими свойствами, схожими со свойствами исходного антитела (см. РСТ/и§99/05535, зарегистрированную 12 марта 1999 г.). Частичные последовательности тяжелых и легких цепей, содержащие СЭВ-участки, обычно достаточны для этих целей. Частичную последовательность используют для того, чтобы определить вариабельные и соединительные сегменты генов стволовых клеток, составляющие часть вариабельных генов рекомбинантного антитела. Затем последовательности стволовых клеток используют для заполнения отсутствующих частей вариабельных участков. Лидерные последовательности тяжелых и легких цепей отщепляются в процессе созревания белка и не влияют на свойства конечного антитела. Для компенсации отсутствующих последовательностей клонированные последовательности кДНК можно объединить с синтетическими олигонуклеотидами с помощью связывания или ПЦР-амплификации. Или же весь вариабельный участок можно синтезировать в виде коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и объединить путем ПЦРамплификации для создания клона полностью синтетического вариабельного участка. Этот процесс имеет определенные преимущества, такие как исключение или включение определенных сайтов рестрикции или оптимизация определенных кодонов.
Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелых и легких цепей из гибридомы используются для создания перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов для создания синтетических У-последовательностей с одинаковой способностью к кодированию аминокислот, как у естественных последовательностей. Синтетические последовательности тяжелых и каппа-цепей могут отличаться от естественных последовательностей тремя путями: цепочки повторяющихся нуклеотидных оснований прерываются для облегчения синтеза олигонуклеотидов и ПЦР-амплификации; оптимальные сайты инициации трансляции включают по правилам Кοζак (Кοζак, 1991, ί. Βίο1. СЬет. 266:19867-19870); и в 3'-5' направлении от сайтов инициации трансляции создаются сайты НшйШ.
В отношении вариабельных участков тяжелых и легких цепей оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие последовательности расщепляют на фрагменты из 30-50 нуклеотидов примерно в середине соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи олигонуклеотиды можно объединить в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, содержащие по 150-400 нуклеотидов. Эти пулы затем используются как матрицы для получения продуктов ПЦРамплификации из 150-400 нуклеотидов. Обычно олигонуклеотидным набор одного вариабельного участка расщепляют на два пула, которые амплифицируют по отдельности с получением двух перекрывающихся продуктов ПЦР. Эти перекрывающиеся продукты затем объединяют путем ПЦР-амплификации с образованием полного вариабельного участка. Также может потребоваться включить перекрывающийся фрагмент постоянного участка тяжелой или легкой цепи (включая сайт ΒЪδI легкой цепи каппа или сайт Аде! тяжелой цепи гамма) в ПЦР-амплификацию для получения фрагментов, которые можно легко клонировать в конструкт вектора экспрессии.
Затем реконструированные вариабельные участка тяжелой и легкой цепи объединяют с клонированной лидерной последовательностью промотора лидерной последовательностью инициации трансляции, последовательностями постоянного участка, 3'-нетранслированных, полиаденилирования и терминации транскрипции с образованием конструкта вектора экспрессии. Конструкты экспрессии тяжелой и легкой цепи можно объединить в одном векторе, котрансфицировать, серийно трансфицировать или отдельно трансфицировать клетки хозяина, которые затем сливают с образованием клетки хозяина, вырабатывающей обе цепи.
Плазмиды для использования в создании векторов экспрессии сконструированы так, что ПЦРамплифицированные последовательности У-тяжелой цепи и У-легкой цепи каппа можно использовать для создания мини-генов полных тяжелых и легких цепей. Эти плазмиды можно использовать для выработки полностью человеческих антител ^Οικ или ^Оук Полностью человеческие и химерные антитела настоящего изобретения также включают антитела ^02, ^03, I§Е, ^А, I§М и ^Э. Аналогичные плазмиды можно сконструировать для экспрессии других изотипов тяжелых цепей или для экспрессии антител, содержащих легкие цепи лямбда.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения структурные особенности антител к ЭЕС-205 используются для создания схожих антител, которые сохраняют как минимум одно функциональное свойство антител настоящего изобретения, такое как, например, связывание с человеческим ЭЕС-205 с константой аффинности как минимум 10 М-1 согласно измерению с помощью поверхностного плазмонного резонанса; интернализация после связывания с человеческими дендритными клетками, экспрессирующими ЭЕС-205; локализация в отделах обработки антигена в человеческих дендритных клетках; активация человеческих дендритных клеток, экспрессирующих ЭЕС-205; перекрестная реактивность с ЭЕС-205 на дендритных клетках приматов, не являющихся человекообразными; и индукция или усиление ответов человеческих Т-лимфоцитов, таких как цитотоксический ответ, на антиген, предпочтительно цитотоксических ответов, опосредованных механизмами с участием классов I и II ГКГС.
В одном из вариантов осуществления один или несколько участков СЭВ антител настоящего изобретения можно комбинировать рекомбинантно с известными каркасными областями и СЭВ для создания дополнительных, созданных с помощью рекомбинантных методик антител к ЭЕС-205 настоящего изобретения. Вариабельные каркасные области тяжелых и легких цепей можно получить из тех же самых
- 17 026990 или других последовательностей антител. Последовательности антител могут быть последовательностями антител естественного происхождения или могут быть консенсусными последовательностями нескольких антител. См. КеШеЪогоидк е1 а1., Рго!еш Ридшеегшд 4:773 (1991); Ко1Ъшдег е1 а1., Рго!еш Εη§ίиеегшд 6:971 (1993) и Сайег е1 а1., АО 92/22653.
Соответственно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения антител к ΟΕί''-205. включая получение антитела, включающего 1) каркасные области тяжелой цепи и СОК тяжелой цепи, где как минимум один СОК тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СОК, показанных в последовательностях № 5, 6, 7, 17, 18, 19, 29, 30, 31, 41, 42, 43, 53, 54, 55, 65, 66, 67, 71, 72, 73, 77, 78, 79, 89, 90 или 91; и 2) каркасные области легкой цепи и СОК легкой цепи, где как минимум один СОК легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СОК, показанных в последовательностях № 11, 12, 13, 23, 24, 25, 35, 36, 37, 47, 48, 49, 59, 60, 61, 83, 84 или 85, при этом антител сохраняет способность к связыванию ΟΕί''-205. Способность антитела к связыванию ΟΕί''-205 можно определить с помощью стандартных анализов связывания, таких как те, что приведены в примерах (например, твердофазный иммуноферментный анализ или флуоресцентный иммуносорбентный анализ).
В данной области техники известно, что домены СОК тяжелой и легкой цепи играют особо важную роль в специфичности и (или) аффинности связывания антитела с антигеном (см. На11 е1 а1., 1. 1тиио1, 149:1605-1612 (1992); РоЕтешк е1 а1., 1. 1ттиио1, 152:5318-5329 (1994); ОПп е1 а1., 1ттииоЪю1, 193:400419 (1995); КНтка е1 а1., Вгй. 1. Саисег, 83:252-260 (2000); Вейюег е1 а1., 1. Мо1 Вю1, 296:833-849 (2000); Кайег е1 а1., Ргос. Ыак. Асай. 8οΐ. И8А, 95:8910-8915 (1998); ВагЬак е1 а1., 1. Ат. Скет. 8ос, 116:2161-2162 (1994); ОПхе1 е1 а1., 1. 1ттиио1, 157:739-749 (1996)). Соответственно рекомбинантные антитела настоящего изобретения, полученные как описано выше, предпочтительно содержат СОК тяжелых и легких цепей антител 3Ό6-2Ρ4, 3О6-4С8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10. Антитела дополнительно могут содержать СЭК2 антител 3Ό6-2Ρ4, 3Э6-4С8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2Ό31Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10. Антитела дополнительно могут содержать С’0К1 антител 3Ό6-2Ρ4, 3О6-4С8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10. Антитела могут дополнительно содержать любые комбинации этих СОК.
Соответственно, в другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу получения антител к ^ΕС-205. содержащих: 1) каркасные области тяжелой цепи, участок СЭК1 тяжелой цепи, участок СЭК2 тяжелой цепи и участок СЭК3 тяжелой цепи, при этом участок СЭК3 тяжелой цепи выбирают из СОК3 3Ό6-2Ρ4, 3Ό6-4Ο8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10, например, участок С0К3 тяжелой цепи 3Ό6-2Ρ4, как показано в последовательности № 7; и 2) каркасные области легкой цепи, участок СЭР1 легкой цепи, участок СЭР2 легкой цепи и участок ί'ΌΡ3 легкой цепи, при этом участок СЭК3 легкой цепи выбирают из СЭР3 3Ό6-2Ρ4, 3Э6-4С8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10, например, участок СОК3 легкой цепи 3Ό6-2Ρ4, как показано в последовательности № 13, при этом антитела связывается с ΩΕΕ205. Антитело может дополнительно включать СЭК2 тяжелой цепи и (или) СЭК2 легкой цепи антител 3Ό6-2Ρ4, 3О6-4С8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10. Антитело может дополнительно включать СЭК1 тяжелой цепи и (или) СЭК1 легкой цепи антител 3Ό6-2Ρ4, 3О6-4С8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10.
Получение антител, имеющих модифицированные последовательности
В другом варианте осуществления последовательности вариабельных участков, или их частей антител к ΌΕΟ-205 настоящего изобретения модифицируют для создания структурно схожих антител к ΌΕΟ205, которые сохраняют связывание (т.е. к тому же самому эпитопу, как немодифицированной антитело) и, таким образом, являются функционально эквивалентными. Методики идентификации остатков, которые можно модифицировать без нарушения связывания антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Магкк е1 а1. (Вю1есЬио1оду (1992), 10(7):779-83 (диверсификация антител путем перестановки вариабельных участков легкой цепи, затем вариабельных участков тяжелой цепи с фиксированных изменениями последовательности СОК3), 1екрегк е1 а1. (1994), Вю1есЬио1оду 12(9):899-903 (отбор человеческих антител из репертуара фагового отображения к одному эпитопу антигена), Зкагои е1 а1. (1986), ΡΝΛ8 И8А 83(8):2628-31 (сайт-специфический мутагенез неизменяемого аминокислотного остатка в области стыка сегментов антитела, определяющих разнообразие вариабельности); Саккои е1 а1. (1995), 1. 1ттиио1. 155(12):5647-54 (эволюция утраты и изменений специфичности, возникающих в результате случайного мутагенеза вариабельного участка тяжелой цепи антитела).
Соответственно, в одном из аспектов настоящего изобретения участки СЭРЕ 2 и (или) 3 антител, созданных генно-инженерным путем, описанным выше, могут содержать одну или несколько аминокислотных последовательностей, как последовательности антител 3Ό6-2Ρ4, 3О6-4С8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10, описанных в данном документе. Однако в других аспектах настоящего изобретения антитела содержат производные точных последовательностей СОК 3Ό6-2Ρ4, 3О6-4С8, 309-2Ό2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ό12-501, 106-106 и 3А4-1С10, сохраняя способность к эффективному связыванию ΟΕΕ'^ΙΟ. Такие модификации последовательностей могут
- 18 026990 включать инсерции, делеции или замены одной или нескольких аминокислот, например, консервативные модификации последовательностей, как описано выше. Модификации последовательностей могут также базироваться на консенсусных последовательностях, описанных выше, определенных последовательностей СОК1, СОК2 и СОК3 антител 3Ό6-2Ρ4, 3О6-4С8, 309-202, 5Л8-1Р1, 2Ό3-1Ρ5-2Ά9, 3С7-3А3, 5012501, 106-106 и 3А4-1С10.
Соответственно, в одном из вариантов осуществления антитело, созданное генно-инженерным путем, может содержать один или несколько СОК, которые, например, на 90%, 95%, 98% или 99,5% схожи с одним или несколькими СОК антител 3Ώ6-2Ρ4, 3О6-4С8, 309-202, 5А8-1Р1, 2Ώ3-1Ρ5-2Α9, 3С7-3А3, 5012-501, 106-106 и 3А4-1С10. Диапазоны, промежуточные между вышеуказанными, например, СОК, имеющие сходство на 90-95%, 95-98% или 98-100% с одной или несколькими из вышеуказанных последовательностей, также включены в объем настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления один или несколько остатков СОК могут быть изменены для модификации связывания с целью достижения более желательной скорости ассоциации, более желательной скорости диссоциации или обеих так, чтобы добиться идеальной константы связывания. С помощью этой стратегии можно создать антитело, обладающее сверхвысокой аффинностью связывания, например, 1010 М-1 или больше. Методики созревания аффинности, известные в данной области техники и те, что описаны в данном документе, можно использовать для модификации одного или нескольких участков СОК с последующим скринингом полученных связывающих молекул на желательные изменения связывания. Соответственно, после изменений одного или нескольких СОК изменения аффинности связывания вместе с иммуногенностью можно наблюдать и оценивать количественно так, чтобы получить антитело, оптимизированное в отношении наилучшего сочетания связывания и низкой иммуногенности.
В дополнение к модификациям в СОК или вместо них модификации можно также вносить в одну или несколько каркасных областей, РК1, РК2, РК3 или РК4 вариабельных участков тяжелых и (или) легких цепей антитела постольку, поскольку эти модификации не устраняют аффинность связывания этого антитела. Например, один или несколько аминокислотных остатков клеточной линии, не являющейся стволовой, в каркасных областях вариабельного участка тяжелых и (или) легких цепей антитела настоящего изобретения заменяют на аминокислотный остаток стволовых клеток, т.е. соответствующий аминокислотный остаток в последовательности вариабельного участка тяжелой или легкой цепи человеческих стволовых клеток, с которой очень схожа последовательность этого антитела. Например, цепь антитела можно выровнять с цепью антитела стволовых клеток, с которой она имеет существенное сходство, и аминокислотный остаток, который не совпадает в последовательности каркасной области антитела и цепи каркасной области стволовых клеток можно заменить на соответствующий остаток из последовательности стволовых клеток. Когда аминокислота в вариабельной каркасной области антитела отличается от аналогичной вариабельной каркасной области эквивалентной последовательности человеческих стволовых клеток, аминокислоту каркасной области антитела обычно заменяют аминокислотой эквивалентной последовательности человеческих стволовых клеток, если есть основания ожидать, что эта аминокислоты попадает в одну из следующих категорий:
(1) аминокислотный остаток, который прямо связывается с антигеном с помощью нековалентной связи;
(2) аминокислотный остаток, который прилежит к участку СОК;
(3) аминокислотный остаток, который как-либо взаимодействует с участком СОК (например, находится в пределах примерно 3-6 А от участка СОК, что определено компьютерным моделированием), или (4) аминокислотный остаток, который участвует в сопряжении Уъ-Ун.
Остатки, которые напрямую связываются с антигеном с помощью нековалентной связи, включают аминокислоты в положениях в каркасных областях, которые с большой вероятностью будут прямо взаимодействовать с аминокислотами на антигене согласно установившимся химическим связям, например, с помощью водородных связей, сил Ван-дер-Ваальса, гидрофобных связей и им подобных. Соответственно, в одном из вариантов осуществления аминокислотный остаток в каркасной области антитела настоящего изобретения заменяют на соответствующий аминокислотный остаток стволовых клеток, который прямо связывается с антигеном с помощью нековалентной связи.
Остатки, которые прилежат к участку СОК, включают аминокислотные остатки в положениях, расположенных в непосредственной близи от одного или нескольких СОК в первичной последовательности антитела, например, в положениях, находящихся в непосредственной близи от СОК, как определено КаЬа1, или а СОК, как определено Ско11йа (см., например, СкоПиа, Ьекк ί. Μοί. ΒίοΙ. 196:901 (1987)). Соответственно, в одном из вариантов осуществления аминокислотный остаток в каркасной области антитела по настоящему изобретению заменяют на соответствующий аминокислотный остаток стволовых клеток, который прилежит к участку СОК.
Остатки, которые как-либо взаимодействуют с участком СОК, включают те остатки, которые согласно анализу вторичной структуры находится в пространственной ориентации, достаточной для того, чтобы влиять на участок СОК. Такие аминокислоты обычно содержат в боковой цепи атом в пределах 3 ангстрем (А) от некоторого атома СОК и должны содержать атом, который может взаимодействовать с атомами СОК согласно установившимся химическим связям, таким как перечисленные выше. Соответ- 19 026990 ственно, в одном из вариантов осуществления аминокислотный остаток в каркасной области антитела по настоящему изобретению заменяют на соответствующий аминокислотный остаток стволовых клеток, который как-либо взаимодействуют с участком СИК.
Как известно, аминокислоты в нескольких положениях в каркасной области играют важную роль в определении конформации СИК (например, способны взаимодействовать с СИК) у многих антител (Сйобйба, Ьекк, см. выше, СНобйа еб а1., см. выше, и Тташоибаио еб а1., б. Мо1. ΒίοΙ. 215:175 (1990), все они включены в данный документ путем ссылки. Эти авторы идентифицировали консервативные остатки каркасных областей, важный для конформации СИК, проанализировав структуру нескольких известных антител. Эти изученные антитела относятся к узкому ряду структурных или канонических классов, определенных по конформации СИК. Консервативные остатки каркасных областей в пределах членов канонического класса именуются в данном документе каноническими остатками. Канонические остатки включают остатки 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 и 95 легкой цепи и остатки 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 и 94 тяжелой цепи. Дополнительные остатки (например, остатки, определяющие структуру СИК) можно идентифицировать по методике Майи и ТНотбои (1996), б. Мо1. Вю1. 263:800. А именно, известно, что аминокислотные остатки в положениях 2, 48, 64 и 71 легкой цепи и 26-30, 71 и 94 тяжелой цепи (нумерация по КаЬаб) способны взаимодействовать с СОК во многих антителах. Аминокислоты в положениях 35 легкой цепи и 93 и 103 тяжелой цепи также с большой вероятностью взаимодействуют с СОК. Дополнительные остатки, которые могут влиять на конформацию СОК, можно идентифицировать по методике Рообе и \Уш1ег (1992), б. Мо1. Вю1. 224:487. Такие остатки называются верньерными остатками, и они представляют собой те остатки в каркасной области, которые располагаются под (т.е. образуют платформу под) СОК.
Остатки, которые участвуют в сопряжении Уь-Ун, или остатки упаковки включают остатки на границе между Уъ и Ун согласно определению, например, Ыоуобиу и НаЬег, Ргос. N311. Асаб. δοί. И8А, 82:4592-66 (1985), или СНобНба еб а1., см. выше.
Иногда трудно четко определить, попадает ли определенная аминокислота в одну или несколько вышеуказанных категорий. В таких случаях получают альтернативные варианты антител, в одном из которых определенная замена существуют, а в другом нет. Альтернативные варианты антител, полученные таким путем, можно исследовать с помощью какого-либо анализа, описанного в данном документе, на желательную активность, и выбрать предпочтительное антитело.
Дополнительные кандидаты на замену в пределах каркасной области - это аминокислоты, которые являются необычными или редкими для антитела в данном положении. Эти аминокислоты можно заменить аминокислотами из эквивалентного положения в последовательности человеческих стволовых клеток или эквивалентного положения более типичных антител. Например, замена может быть желательной, когда аминокислота в каркасной области антитела является редкой для данного положения, а соответствующая аминокислота в последовательности стволовых клеток является частой для данного положения в последовательностях иммуноглобулинов; или когда аминокислота в антителе является редкой для данного положения, а соответствующая аминокислота в последовательности стволовых клеток тоже является редкой по сравнению с другими последовательностями. Ожидается, что после замены необычной аминокислоты аминокислотой из последовательности стволовых клеток, являющейся типичной для антител, антитело будет менее иммуногенным.
Термин редкая, согласно употреблению в данном документе, означает аминокислоту, которая встречается в данном положении меньше чем примерно в 20%, предпочтительно меньше чем примерно в 10%, более предпочтительно меньше чем примерно в 5% и даже более предпочтительно меньше чем примерно в 1% последовательностей в репрезентативных образцах последовательностей; а термин частая, согласно употреблению в данном документе, означает, что аминокислота встречается больше чем примерно в 25%, но обычно больше чем примерно в 50% последовательностей в репрезентативном образце последовательностей. Например, все последовательности вариабельных участков легкой и тяжелой цепи соответственно сгруппированы в подгруппы последовательностей, который особенно гомологичны друг другу и содержат одинаковые аминокислоты в определенных критических положениях (КаЬаб еб а1., см. выше). При принятии решения о том, является ли какая-либо аминокислота в последовательности антитела редкой или частой в последовательностях, часто предпочтительно рассматривать только те последовательности в той же самой подгруппе, что и последовательность антитела.
Как правило, каркасные области антител обычно существенно схожи и еще чаще схожи в каркасных областях последовательностей человеческих стволовых клеток, производными которых они являются. Разумеется, многие аминокислоты в каркасной области мало или вообще не влияют на специфичность или аффинность антитела. Таким образом, многие консервативные замены остатков каркасной области можно осуществить без значимого изменения специфичности или аффинности полученного иммуноглобулина. Так, в одном из вариантов осуществления вариабельная каркасная область антитела как минимум на 85% схожа по последовательности с последовательностью вариабельной каркасной областью человеческих стволовых клеток или консенсусом таких последовательностей. В другом варианте осуществления вариабельная каркасная область антитела как минимум на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% схожа по последовательности с последовательностью вариабельной каркасной областью человеческих ство- 20 026990 ловых клеток или консенсусом таких последовательностей.
Вдобавок к простому связыванию ЛЕС-205 антитело можно выбрать по сохранению других функциональных свойства антитела настоящего изобретения, таких как, например:
а) связывание с человеческим ЛЕС-205 с константой аффинности, равной как минимум 108 М-1, согласно измерению с помощью поверхностного плазмонного резонанса;
б) интернализация после связывания с человеческими дендритными клетками, экспрессирующими ЛЕС-205;
в) локализация в отделах обработки антигена в дендритных клетках;
г) активация человеческих дендритных клеток, экспрессирующих ЛЕС-205;
д) перекрестная реактивность с ЛЕС-205 на дендритных клетках приматов, не относящихся к человекообразным, или таких же клетках других биологических видов;
е) индукция или усиление ответов человеческих Т-лимфоцитов, предпочтительно ответов Тлимфоцитов, опосредованных механизмами с участием класса Ι и ΙΙ ГКГС;
ж) индукция или усиление ответов человеческих Т-лимфоцитов СЛ4, СЛ8 и ΝΚ-клеток;
з) индукция периферической толерантности Т-лимфоцитов СЛ8.
Определение характеристик моноклональных антител к БЕС-25
Моноклональные антитела по настоящему изобретению можно охарактеризовать по связыванию с ЛЕС-205 с помощью различных известных методик. Как правило, антитела сначала исследуют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Вкратце, на плашки для микротитрования наносят очищенный ЛЕС-205 в фосфатном солевом буфере, а затем блокируют незначимыми белками, такими как бычий сывороточный альбумин, разведенный фосфатным солевым буфером. Разведения плазмы мышей, иммунизированных ЛЕС-205, добавляют в каждую лунку или инкубируют в течение 1-2 ч при 37°С. Плашки промывают смесью фосфатного солевого буфера и Т\\ееп 20 и затем инкубируют с реагентом с поликлональными козьими антителами, специфичными к человеческому Рс Ι§0, конъюгированными с щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37°С. После промывания плашки обрабатывают субстратом ΑΒΤ8 и анализируют при оптической плотности 405. Предпочтительно для слияния использовать мышей, у которых выявлены самые высокие титры.
Для скрининга антител и гибридом, которые вырабатывают антитела, демонстрирующие положительную реакцию на иммуноген ЛЕС-205, можно использовать твердофазный иммуноферментный анализ, как описано выше. Гибридомы, которые связываются, предпочтительно с высокой аффинностью, с ЛЕС-205, затем можно подвергнуть субклонированию и исследовать дополнительно. Один клон из каждой гибридомы, который сохраняет реактивность родительских клеток (с помощью твердофазного иммуноферментного анализа), можно выбрать для создания банка клеток и для очистки антител.
Для очистки антител к ЛЕС-205 выбранные гибридомы можно культивировать в роллерных флаконах, двухлитровых роллерных колбах или других системах для культивирования. Надосадочные жидкости можно профильтровать и концентрировать до аффинной хроматографии с протеин-А-сефарозой (РЬагташа; Пискатавей, штат Нью-Джерси) для очистки белка. После замены буфера на фосфатный солевой буфер концентрацию можно измерить по ОЛ280 с коэффициентом экстинкции 1,43 или предпочтительно с помощью нефелометрии. Ι§0 можно исследовать с помощью гель-электрофореза или по специфичности к антигену.
Чтобы определить, связываются ли выбранные моноклональные антитела к ЛЕС-205 с уникальными эпитопами, каждое антитело можно биотинилировать, используя имеющиеся в продаже реагенты (Р1егсе; Рокфорд, штат Иллинойс). Связывание биотинилированных моноклональных антител можно выявить с помощью меченого стрептавидинового зонда. Чтобы определить изотип очищенных антител, можно провести твердофазный иммуноферментный анализ на изотип с помощью методик, принятых в данной области техники. Например, на лунки на плашке для микротитрования можно нанести антитело к Ι§0 в концентрации 10 мкг/мл на ночь при 4°С. После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином на плашках проводят реакцию с моноклональными антителами или контрольными очищенными изотипами в концентрации 10 мкг/мл при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем в лунках можно провести реакцию с конъюгированным зондом, специфичным либо к Ιβ01, либо другому изотипу. Ждут завершения реакции на плашках и анализируют их, как описано выше.
Для исследования связывания моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими ЛЕС-205, можно использовать флоуцитометрию. Вкратце, клеточные линии и (или) человеческие МКПК, экспрессирующие мембраносвязанный ЛЕС-205 (выращенные при стандартных условиях культивирования), смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в фосфатном солевом буфере, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% ΝαΝ3, при 4°С в течение 1 ч. После промывания проводят реакцию между клетками и меченым флуоресцином антителом к Ι§0 при тех же условиях, что и первичная окраска антител. Образцы можно анализировать с помощью инструмента РΑСδсаη с использованием свойств светового и углового рассеяния для детекции одиночных клеток и определить связывание меченых антител. Или же можно использовать флуоресцентную микроскопию (вдобавок или вместо) флоуцитометрии. Клетки можно окрасить точно так же, как описано выше, и исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии. Такая методика позволяет визуализировать от- 21 026990 дельные клетки, но может иметь сниженную чувствительность в зависимости от плотности антигена.
ЦО к ПЕС-205 можно дополнительно исследовать на реактивность с антигеном ПЕС-205 с помощью вестерн-блоттинга. Вкратце, можно приготовить клеточные экстракты из клеток, экспрессирующих ПЕС-205, и провести с ними электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза отделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 20% мышиной сывороткой и исследуют с помощью зондов на исследуемые моноклональные антитела. Связывание ЦО можно выявить с помощью щелочной фосфатазы против ЦО и обработать таблетками с субстратом ВОР/ИВТ (81дша Скеш. Со., Сент-Луис, штат Миссури).
Методы анализа аффинности связывания, перекрестной реактивности и кинетики связывания различных антител к ПЕС-205 включают стандартные анализы, известные в данной области техники, например, поверхностный плазмонный резонанс (ППР) В1асоге с использованием аппарата В1асоге 2000 8РК (В1асоге АВ, Упсала, Швеция), как описано в примере 2 данного документа.
II. Молекулярные конъюгаты и (или) иммунотоксины
Настоящее изобретение относится к различных терапевтическим молекулярным конъюгатам (например, конъюгированным вакцинам), которые включают антиген, такой как опухолевый или вирусный антиген, связанный с антителом, которое связывается с рецептором на АПК, например, антителом, которое связывается с ПЕС-205. Таким образом обеспечивается нацеливание на антиген АПК, таких как клетки, экспрессирующие ПЕС-205 (например, дендритных клеток и В-лимфоцитов), для усиления обработки, представления и, в итоге, иммунного ответа на антиген(ы), например, цитотоксического ответа Тлимфоцитов. Схематически такой конъюгат изображен на фиг. 8. В приведенном примере антиген генетически связан с доменом СН3 каждой тяжелой цепи почти полного антитела к ПЕС-205. Однако будет понятно, что антиген может быть связан с другими частями такого антитела или его фрагмента, и что другие формы конъюгации, такие как химическая конъюгация, тоже могут быть использованы, как обсуждается ниже.
Антигены, пригодные для применения в настоящем изобретении, включают, например, антигены инфекционных заболеваний и опухолевые антигены, против которых желательны защитные или терапевтические иммунные ответы, например, антигены, экспрессирующиеся опухолевой клеткой или патогенным микроорганизмом или антигены инфекционных заболеваний. Например, пригодные антигены включают опухолеассоциированные антигены для профилактики или лечения злокачественных опухолей. Примеры опухолеассоциированных антигенов включают, но не ограничиваются перечисленным, последовательности, содержащие все или части последовательностей (ЖСО, др100 или Рше117, НЕК2/пеи, АТ1, мезотелина, СЕА, др100, МАКИ, ТКР-2, мелана-А, ЦУ-Е8О-1, ИУ-ВК-1, ИУ-СО-58, ΜΝ (др250), идиотипа, МАОЕ-1, МАОЕ-3, МАОЕ-А3, тирозиназы, теломеразы, антигенов 88X2 и МИС1 и опухолевых антигенов - производных стволовых клеток. Опухолеассоциированные антигены также включают антигены групп крови, например, антигены Ьеа, Ьеь, ЬеХ, ЬеУ, Н-2, В-1, В-2. Или же в конструкты антиген-антитело настоящего изобретения могут быть включены несколько антигенов. Например, антиген МАОЕ можно объединить с другими антигенами, такими как меланин А, тирозиназа и др100 вместе с адъювантами, такими как ГМ-КСФ или ИЛ-12, и связать с антителом к АПК.
Другие пригодные антигены включают вирусные антигены для профилактики или лечения вирусных заболеваний. Примеры вирусных антигенов включают, но не ограничиваются перечисленным, дад ВИЧ-1, епу ВИЧ-1, пеГ ВИЧ-1 (поверхностные или антигены оболочки), антигены вирусы папилломы человека (ВПЧ), РА8, вирусы простого герпеса 1, вирусы простого герпеса 2, р17, ОКР2 и ОКР3. Примеры бактериальных антигенов включают, но не ограничиваются перечисленным, Тохор^ша допйи или Тгеропета раШйит. Конъюгаты антитело-бактериальный антиген настоящего изобретения могут применять для лечения или предупреждения различных бактериальных инфекций, таких как сибирская язва, ботулизм, столбняк, хламидиоз, холера, дифтерия, лаймская болезнь, сифилис и туберкулез.
Последовательности вышеупомянутых антигенов хорошо известны в данной области техники. Например, пример последовательности кДНК МАОЕ-3 приведен в патенте США 6235525 (Институт Людвига исследования рака); примеры последовательностей нуклеиновой кислоты и белка ИУ-Е8О-1 приведены в патенте США 5804381 и патенте США 6069233 (Институт Людвига исследования рака); примеры последовательностей нуклеиновой кислоты и белка мелан-А приведены в патенте США 5620886 и патенте США 5854203 (Институт Людвига исследования рака); примеры последовательностей нуклеиновой кислоты и белка ΝΝΥ-ΕΚ-1 приведены в патенте США 6774226 и патенте США 6911529 (Институт Людвига исследования рака); и примеры последовательностей нуклеиновой кислоты и белка ΝΥ-СО^ приведены в патенте АО 02090986 (Институт Людвига исследования рака); пример аминокислотной последовательности белка НЕК-2/пеи имеется в Банке генов ОЕИВАИК под входящим номером ААА58637; и нуклеотидная последовательность (мРНК) человеческого антигена 1, подобного карциноэмбриональному, (СЕА-1) имеется в Банке генов ОЕИВАИК под входящим номером ИМ 020219.
Антиген вируса папилломы человека, который может быть использован в фармацевтических композициях и способах настоящего изобретения, может включать, например, антиген ВПЧ-16, антиген ВПЧ-18, антиген ВПЧ-31, антиген ВПЧ-33 и (или) антиген ВПЧ-35; и соответственно пригоден антиген ВПЧ-16 и (или) антиген ВПЧ-18. Геном ВПЧ-16 описано в У1го1оду, 145:181-185 (1985); последователь- 22 026990 ности ДНК, кодирующие ВПЧ-18, описаны в патенте США 5840306, описание которого включено в данный документ во всей полноте путем ссылки. Антигены ВПЧ-16 (например, серореактивные участки белков Е1 и (или) Е2 белков ВПЧ-16) описаны в патенте США 6531127; антигены ВПЧ-18 (например, серореактивные участки белков Ь1 и (или) Ь2 ВПЧ-18) описаны в патенте США 5840306, описание которого включено в данный документ во всей полноте путем ссылки. Аналогично полный геном ВПЧ имеется в Банке генов ΟΕΝΒΑΝΚ под входящим номером ΝΟ_θθ3977, описание которого включено в данный документ путем ссылки Г еном вируса гепатита С описано в заявке на Европейский патент под номером 318216, описание которой включено в данный документ путем ссылки. В Ρ0Τ/υδ90/01348, включенном в данный документ путем ссылки, описаны сведения о последовательности клонов генома вируса гепатита С, аминокислотных последовательностей вирусных белков вируса гепатита С и способы получения и применения таких композиций для вакцин против вируса гепатита С, содержащей белки вируса гепатита С и их производные - пептиды.
Антигенные пептиды белков (т.е. содержащие Т-клеточные эпитопы) можно идентифицировать с помощью ряда методик, известных в данной области техники. Например, Т-клеточные эпитопы можно предсказать, анализируя последовательность белка с помощью работающих на базе \УеЬ предсказывающих алгоритмов (ΒΙΜΑδ и δΥΡΡΕΙΤΗΙ), для предсказания пептидов, потенциально связывающих класс I и II, которые совпадают с внутренней базой данных 10000 подробно охарактеризованных пептидов, связывающих ГКГС, определенных ранее с помощью цитотоксического ответа Т-лимфоцитов. Пептиды с высокими показателями можно классифицировать и выбрать как интересные по высокой аффинности к данной молекуле ГКГС.
Другая методика идентификации эпитопов Т-лимфоцитов, содержащих антигенные пептиды, состоит в разделении белка на неперекрывающиеся пептиды нужной длины или перекрывающиеся пептиды нужной длины, которые можно получить рекомбинантным или путем синтетическим или, в ряде немногочисленных случаев, путем химическим расщепления белка и исследовать на иммуногенные свойства, например, вызывая ответ Т-лимфоцитов (т.е. пролиферацию или секрецию лимфокинов).
Чтобы точно определить Т-клеточные эпитопы в белке путем, например, точного картирования, пептид, обладающий способностью стимулировать активность Т-лимфоцитов и таким образом содержащий как минимум один эпитоп Т-лимфоцитов, можно модифицировать за счет инсерции или делеции аминокислотных остатков на Ν- или на С-конце пептида и исследовать, чтобы определить изменение Тклеточной реактивности на модифицированный пептид. Если выяснится, что два или несколько пептидов, которые имеют общую перекрывающуюся область в последовательности исходного белка, обладают способностью стимулировать человеческие Т-лимфоциты согласно методикам исследования биологии Тлимфоцитов, можно получить дополнительные пептиды, содержащие целые или часть таких пептидов, и эти дополнительные пептиды можно исследовать с помощью аналогичной процедуры. После этой процедуры пептиды выбирают и получают рекомбинантным или синтетическим путем. Пептиды выбирают на основе различных факторов, включая выраженность Т-клеточного ответа на пептид (например, коэффициент стимуляции). Физические и химические свойства выбранных пептидов (например, растворимость, стабильность) затем можно исследовать, чтобы определить, пригодны ли эти пептиды для использования в терапевтических композициях или пептидам требуется модификация.
Кроме того, конъюгированная вакцина может включать один или несколько агентовиммуностимуляторов, которые также усиливают иммунный ответ на антиген. Конъюгированная вакцина антитело-антиген настоящего изобретения может быть создана генетически или химически. В обоих случаях часть конъюгата, приходящаяся на антитело, может состоять из целого антитела или части антитела, такой как РаЬ-фрагмент или одноцепочечный Ρν. Кроме того, в конъюгат могут быть включены один или несколько антигенов и (или) агентов-иммуностимуляторов.
Химически сконструированные конъюгаты антитело-антиген могут быть получены с помощью ряда известных и доступных реагентов для создания перекрестных связей. Эти реагенты для создания перекрестных связей могут быть гомофункциональными или гетерофункциональными соединениями, такими как сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (СПДП), ^сукцинимидил^-ацетил-тиоацетат (САТА), сульфосукцинимидил-4-Щ-малеинмидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-СМЦК), 5,5'дитиобис(2-нитробензойная кислота) (ДТНБ), которые образуют ковалентные связи в различными реактивными аминокислотными или углеводными цепями на антителе к дендритным клеткам и выбранном антигене. Другие связующие агенты и агенты, образующие перекрестные связи, также можно использовать для создания ковалентных связей, такие как белок А, карбодиимид и о-фенилендималеинмид (оФДМ); (см., например, Кацюузку е! а1. (1984), ί. Ехр. Меб. 160:1686; Ьш, МА е! а1. (1985), Ргос. Νη11. Асаб. δα. ГОА 82:8648). Другие методики включают описанные Раи1из (ВеЬтшд 1пз. Μι!!. (1985), Νο. 78, 118-132); Вгеппап е! а1. фаепсе (1985), 229:81-83), и О1епше е! а1. (ί. 1ттипо1. (1987), 139: 2367-2375). Предпочтительными конъюгирующими агентами являются САТА и сульфо-СМЦК, оба из которых имеются в продаже производства компании Р1етсе СНет1са1 Со. (Рокфорд, штат Иллинойс). Агентыиммуностимуляторы тоже можно химически соединить с молекулярными конъюгатами настоящего изобретения, используя те же методики создания связей, как описанные выше.
В другом варианте осуществления антитела настоящего изобретения связывают с терапевтическим
- 23 026990 компонентом, таким как цитотоксин, лекарственное средство или изотоп. В случаях конъюгирования с цитотоксином конъюгаты антител называются иммунотоксинами. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который губителен (например, уничтожает) для клеток.
Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты включают, но не ограничиваются перечисленным, антиметаболиты (например, метотрексат, 6меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацила декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В§Nυ) и ломустин (ССNυ), циклофсофамид, бусульфан, дибромоманнитол, стрептозоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платины (II) (ΌΌΡ) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (бывший дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактимицин (бывший актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМЦ)), и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Антитело настоящего изобретения можно конъюгировать с изотопом, например, радиоактивным йодом, для создания цитотоксического радиопрепарата для лечения заболевания, связанного с дендритными клетками, такого как аутоиммунное или воспалительное заболевание, или реакция трансплантат против хозяина.
Конъюгаты антител настоящего изобретения можно использовать для модификации определенного биологического ответа, и лекарственный компонент не должен толковаться как ограниченный классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственный компонент может быть белком или полипептидом, обладающим желательной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин, или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, эндотоксин Рзеийотопаз или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухолей или интерферон у; или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерлейкин-6 (ИЛ-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) или другие факторы роста.
Методики конъюгирования такого терапевтического компонента с антителами хорошо известны, см., например, Агпоп еί а1., Мопос1опа1 АпйЬоФез Рог 1ттипо1агдейп§ ОГ Игидз Ιη Сапсег ТЬегару, ίη Мопос1опа1 АпйЬоФез Апй Сапсег ТЬегару, Ке1зГеШ еί а1. (ейз.), р. 243-56 (А1ап Р. Пзз, 1пс. 1985); Не11зйот еί а1., АпйЬоФез Рог Эгид ИеЛуегу, ίη Соп1го11ей Эгид Ие1туету (2пй Ей.), РоЬтзоп еί а1. (ейз.), р. 623-53 (Магсе1 Иеккег, 1пс. 1987); ТЬогре, АпйЬойу Сатегз ОГ СуЮГО.хю Адейз Ιη Сапсег ТЬегару: А Реνί^, ίη Мопос1опа1 АпйЬоФез '84: Вю1одюа1 Апй СНтса1 АррНсайопз, РшсЬега еί а1. (ейз.), р. 475-506 (1985); Апа1уз1з, Резийз, Апй Рйите Ртозрейше ОГ ТЬе ТЬегареийс Изе ОГ Райю1аЬе1ей АпйЬойу Ιη Сапсег ТЬегару, ίη Мопос1опа1 АпйЬоФез Рог Сапсег ЭеЮсРоп Апй ТЬегару, Ва1й\уш еί а1. (ейз.), р. 303-16 (Асайетю Ргезз 1985), и ТЬогре еί а1., ТЬе Ргерагайоп Апй СуЮГО.хю РгореШез ОГ АпйЬойу-Тохш Сопщдаίез, Iттиηο1. Реν., 62:119-58 (1982).
В другом варианте антитела настоящего изобретения можно использовать для прямого нацеливания на целые клетки, например, опухолевые клетки, клетки-эффекторы или патогенные микроорганизмы, на дендритные клетки. Например, антитела к ИЕС-205 можно прямо экспрессировать на поверхности клетки, например, путем трансфекции или трансдукции клетки вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело настоящего изобретения. Это можно осуществить, например, путем трансфицирования клетки-мишени нуклеиновой кислотой, кодирующей гибридный белок, содержащий трансмембранный домен, и антитело к дендритным клеткам, или его антигенсвязывающий фрагмент. Методики получения таких нуклеиновых кислот, гибридных белков и клеток, экспрессирующих такие гибридные белки, описаны, например, в заявке на патент США номер 09/203958, включенной в данный документ в полном объеме путем ссылки. Или же антитела к дендритным клеткам, или их антигенсвязывающий фрагмент, можно связать с клеткой или патогенным микроорганизмом с помощью химического линкера, липидных меток или другими аналогичными путями (йеКгшГ, ί. еί а1. (2000), №й Мей. 6:223-227; №/агй, Р. еί а1. (1998), РЕВ§ Ьей. 433:83-88). Клетки с присоединенными к их поверхности антителами к ИЕС-205 можно использовать для индукции специфического иммунного ответа против клетки, например, опухолевой клетки или патогенного микроорганизма.
III. Фармацевтические композиции
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, например, фармацевтической композиции, содержащей одно или комбинацию моноклональных антител настоящего изобретения, смешанных с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции, содержащие биспецифические молекулы или молекулярные конъюгаты, которые включают антитело настоящего изобретения, также входят в объем настоящего изобретения. В одном варианте композиции включают композицию нескольких (например, двух или больше) изолированных антител настоящего изобретения. Предпочтительно каждое из антител композиции связывается с отдельным заранее заданным эпитопом ИЕС205.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения также можно вводить в комбинированной
- 24 026990 терапии, т.е. в комбинации с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию настоящего изобретения с как минимум одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, такими как противовоспалительные агенты, агентами, замедляющими прогрессирование ревматоидного артрита, иммунодепрессанты и химиопрепараты. Фармацевтические композиции настоящего изобретения также можно вводить в комбинации с лучевой терапией. Одновременное введение с другими антителами, такими как антитела, специфичные к СИ4 или специфичные к ИЛ-2, также входят в объем настоящего изобретения. Такие комбинации с СИ4-специфичными антителами или ИЛ-2-специфичными антителами считаются особенно полезными при лечении аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата. Комбинации с антителами к СТБА4, СИ40 и т.д. особенно полезны при лечении злокачественных опухолей и инфекционных заболеваний.
В другом варианте конъюгированную вакцину, которая быстро интернализуется АПК, можно комбинировать с моноклональными антителами, которые усиливают антигенпредставляющую активность дендритных клеток, например, выброс иммуностимулирующих цитокинов.
Согласно употреблению в данном документе, фармацевтически приемлемый носитель включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и им подобные, которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель должен быть пригодным для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, интраспинального или внутрикожного введения (например, путем инъекции или капельного введения). В зависимости от пути введения активное соединение, т.е. антитело, биспецифическая и мультиспецифическая молекула, могут быть покрыты материалом для защиты соединения от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать это соединение.
Примеры адъювантов, которые можно использовать с антителами и конструктами настоящего изобретения, включают неполный и полный адъювант Фрейнда (Ибео БаЬогаЮпек, Детройт, штат Мичиган.); адъювант Мегск 65 (Мегск апб Сотрапу, 1пс., Равей, штат Нью-Джерси); А§-2 (§тННК1ше ВеесНат, Филадельфия, штат, Пенсильвания); алюминиевые соли, такие как гель гидроксида алюминия ((а1ит) или фосфата алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая взвесь ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионные или анионные производные полисахаридов; полифосфазены; рассасывающиеся микросферы; цитокины, такие как ГМ-КСФ, интерлейкины-2 -7, -12, и подобные факторы; 3И-МРЬ; СрО-олигонуклеотид; и монофосфорил-липид А, например, 3-де-О-ацилированный монофосфорил-липид А.
Адъюванты МРЬ производятся компанией Сопха СотротаНоп (Сиэтл, штат Вашингтон; см., например, патенты США 4436727; 4877611; 4866034 и 4912094). СрО-содержащие олигонуклеотиды (в которых СрО-динуклеотид находится в неметилированной форме) хорошо известны и описаны, например, в \УО 96/02555, \АО 99/33488 и патентах США 6008200 и 5856462. Также описаны иммуностимулирующие последовательности ДНК, например, §а!о е! а1., §аепсе 273:352, 1996.
Другие альтернативные адъюванты включают, например, сапонины, такие как Οιιί1 А, или их производные, включая §21 и О§7 (Адш1а ВюрНагтасеиНса1к 1пс., Фремингэм, штат Массачусетс); эсцин; дигитонин; или сапонины ОуркорННа или СНепоробшт сцйпоа; монтанид 1§А 720 (§еррю, Франция); §АР (СЫтоп, Калифорния, США); 1§СОМ§ (С§Ь), МР-59 (СЫтоп); серию адъювантов §ВА§ (например, §ВА§-2 или §ВА§-4, производимые компанией §тйНК1ше ВеесНат, Риксенсарт, Бельгия); детокс (Энханзин) (Соп.ха, Гамильтон, штат Монтана); РС-529 (Соп.ха, Гамильтон, штат Монтана) и другие аминоалкил-глюкозаминид-4-фосфаты (АКФ); адъюванты на основе полиоксиэтиленового эфира, такие как описанные в \АО 99/52549А1; синтетические имидазохинолины, такие как имиквимод [§-26308, Р-837], (Наткоп, е! а1., Уассте 19 1820-1826, 2001; и резиквимод [§-28463, Р-848] (Уакйакок, е! а1., Се11и1аг 1ттипо1оду 204: 64-74, 2000; основания Шиффа из карбонилов и аминов, которые конститутивно экспрессируются на поверхности антигенпредставляющих клеток и Т-лимфоцитов, такие как тукарезол (РНобек, 1. е! а1., ИаШте 377: 71-75, 1995); молекулы цитокинов, хемокинов или костимуляторов в форме белка или пептида, включая, например, провоспалительные цитокины, такие как интерферон, ГМ-КСФ, ИЛ-1 альфа, ИЛ-1 бета, ФРТ альфа и ФРТ бета, индукторы ТН1, такие как интерферон гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18 и ИЛ-21, индукторы ТН2, такие как ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИД-13 и гены других хемокинов и костимуляторов, таких как МСР-1, М1Р-1 альфа, М1Р-1 бета, РАИТЕ§, ТСА-3, СИ80, СИ86 и СИ40Б; нацеливающие лиганды агентов-иммуностимуляторов, такие как СТЬА-4 и Ь-селектин, белки и пептиды, стимулирующие апоптоз, такие как Рак; адъюванты на основе синтетических липидов, таких как ваксфектин (Реуек е! а1., Уассте 19: 3778-3786, 2001), квален, альфа-токоферол, полисорбат 80, диолеилфосфатидилхолин и холестерин; эндотоксин, [ЬР§], (ВеиЙет, В., Сиггеп! Оршюп ш МюгоЪю1оду 3: 23-30, 2000); лиганды, которые стимулируют То11-рецепторы к выработке ТН1-индуцирующих цитокинов, такие как липопротеины микобактерий, белок р19 микобактерий, пептидогликан, тейхоевая кислота и липид А; и СТ (холерный токсин, субъединицы А и В) и ЬТ (термолабильный энтеротоксин Е.соН, субъединицы А и В), семейство белков теплового шока (Н§Рк), и ЬЬО (листериолизин О; \АО 01/72329). Эти и различные дополнительные агонисты То11-подобных рецепторов (ТЬР) описаны для примера Кап/1ег е! а1., Иа!иге Мебюше, Мау 2007, Уо1. 13, Ио 5.
- 25 026990
Фармацевтически приемлемая соль означает соль, которая сохраняет желательную биологическую активность исходного соединения и не дает какие-либо нежелательные токсические эффекты (см., например, Вегде, 8.М., е! а1. (1977), I. РЬагт. 8сь 66:1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислоты и соли присоединения основания. Соли присоединения кислоты включают производные нетоксичных неорганических кислот, таких как соляная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодисто-водородная, фосфористая и им подобных, а также нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и им подобные. Соли присоединения основания включают производные щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и им подобные, а также нетоксичных органических аминов, таких как Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин, Ν-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин им подобные.
Композицию настоящего изобретения можно вводить с помощью различных методик, известных в данной области техники. Как будет понятно специалисту в данной области техники, путь и (или) методика введения будет зависеть от желательных результатов. Активные соединения можно приготовить вместе с носителями, которые защитят соединение от быстрого высвобождения, такие как лекарственные формы с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, накожные пластыри и микроинкапсулированные доставочные системы. Можно использовать рассасывающиеся биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы изготовления таких лекарственных форм запатентованы или, как правило, известны специалисту в данной области техники, См., например, 8и81ашей апй Соп1го11ей Ке1еа8е Эгид ОеПуегу 8у8!ет8, Ж КоЪт8оп, ей., Магсе1 Эеккег, 1пс., №ν Уогк, 1978.
При введении соединения настоящего изобретения определенными путями можно оказаться необходимым покрытие соединения, или одновременное введение соединения с, материалом, предупреждающим его инактивацию. Например, соединение можно вводить субъекту на соответствующем носителе, например, на липосомах или растворителе. Фармацевтически приемлемые растворители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают водно-жировые-водные эмульсии ССР, а также традиционные липосомы (81ге_|ап е! а1. (1984), 1. №игоиптипо1. 7:27).
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций для немедленного применения. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных соединений известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какая-либо традиционная среда или агент несовместимы в активным соединением, предусмотрено их использование в фармацевтических композициях настоящего изобретения. Также в композиции можно включить дополнительные активные соединения.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно составлять в форме раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этиловый спирт, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и им подобные) и их соответствующие смеси. Необходимо поддерживать соответствующую текучесть, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания нужного размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительным использование в композиции изотонических агентов, например, сахаров, полиспиртов, таких как маннитол, сорбитол или хлорид натрия. Пролонгированное всасывание композиций для инъекций можно обеспечить за счет включения в композицию агента, который замедляет всасывание, например, солей моностеарата и желатина.
Стерильные растворы для инъекций можно изготавливать путем включения активного соединения в требуемое количество в соответствующем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, как это требуется, с последующей стерилизацией микрофильтрацией. Как правило, дисперсии изготавливают путем включения активного соединения в стерильный наполнитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для изготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными методиками изготовления являются вакуумная сушка и замораживание-высушивание (лиофилизация), которые дают на выходе порошок активного ингредиента вместе с каким-либо нужным дополнительным ингредиентом из его раствора, ранее простерилизованного фильтрацией.
Схемы применения подбирают так, чтобы обеспечить оптимальный нужный эффект (например, терапевтический эффект). Например, возможно однократное внутривенное введение, несколько приемов в течение времени или дозу можно соответственно снизить или повысить в зависимости от потребностей в данной терапевтической ситуации. Например, антитела настоящего изобретения можно вводить один раз или два раза в неделю путем подкожного введения или один раз или два раза в месяц путем подкожного введения.
- 26 026990
Особые преимущества имеет составление композиций для парентерального введения в дозированной лекарственной форме для облегчения введения и однородности доз. Дозированная лекарственная форма, согласно употреблению в данном документе, означает физически отдельные единицы, используемые как разовые дозы у субъектов, нуждающихся в лечении, при этом каждая единица содержит определенное количество активного соединения, рассчитанного на желательный терапевтический эффект, вместе с требуемым фармацевтическим носителем. Технические характеристики дозированной лекарственной формы настоящего изобретения диктуются и напрямую зависят от а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, которого нужно достичь, и б) недостатков, присущих принятых в данной области техники методик составления, таких как активное соединение для лечения повышенной чувствительности у отдельных особей.
Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: 1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и им подобные; 2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (БГА), бутилированный гидрокситолуол (БГТ), лецитин, пропиллат, альфа-токоферол и им подобные; и 3) комплексообразующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУ), сорбитол, виннокаменная кислота, фосфорная кислота и им подобные.
В отношении терапевтических композиций лекарственные формы настоящего изобретения включают те, которые подходят для приема внутрь, интраназального, местного (включая трансбуккальный и сублингвальный), ректального, интравагинального и (или) парентерального введения. Лекарственные формы могут находиться в удобной дозированной лекарственной форме и могут быть изготовлены с помощью какой-либо методики, известной в области фармацевтики. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для изготовления дозированной лекарственной формы, будет зависеть от субъекта, нуждающегося в лечении, и конкретного пути введения. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с материалом носителя для изготовления разовой дозы, будет зависеть от количества композиции, которая вызывает терапевтический эффект. Как правило, из ста процентов это количество будет колебаться от примерно 0,001 процента до примерно девяноста процентов активного ингредиента, предпочтительно от примерно 0,005 процента до примерно 70 процентов, более предпочтительно от примерно 0,01 процента до примерно 30 процентов.
Лекарственные формы настоящего изобретения, пригодные для интравагинального введения, также включают маточные кольца, тампоны, кремы, гели, пасты, пенки или аэрозоли, содержащие такие носители, как те, что считаются пригодными в данной области техники. Формы выпуска для местного или накожного применения композиций настоящего изобретения включают порошки, аэрозоли, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и лекарственные формы для ингаляции. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем, и с каким-либо консервантом, буфером или пропеллентом, которые могут потребоваться.
Фразы парентеральное введение и для парентерального введения, согласно употреблению в данном документе, означают пути введения, не относящиеся к энтеральному и местному введению, как правило, с помощью инъекции, и включают, но не ограничиваются перечисленным, внутривенное, внутримышечное, интраартериальное, интратекальное, интракапсулярное, интрааорбитальное, внутрисердечное, внутрикожное, интраперитонеальное, транстрахеальное, подкожное, субкутикулярное, внутрисуставное, подкапсульное, субарахноидальное, интраспинальное, эпидурально и интрастернальное введение и капельное введение.
Примеры соответствующих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях настоящего изобретения, включают воду, этиловый спирт, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и им подобные), и их соответствующие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические эфиры, такие как этилолеат. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например за счет использования материалов для покрытий, таких как лецитин, путем поддержания нужного размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ.
Композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, увлажняющие средства, эмульсификаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение присутствия микроорганизмов можно обеспечить с помощью процедур стерилизации, см. выше, и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и им подобных. Также может оказаться желательным включение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и им подобных. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы можно обеспечить за счет включения агентов, замедляющих всасывание, таких моностеарат алюминия и желатин.
Когда соединения настоящего изобретения вводят в качестве лекарственных средств человеку и животным, их можно применять по отдельности или в форме фармацевтической композиции, содержащей, например, от 0,001 до 90% (более предпочтительно от 0,005 до 70%, например от 0,01 до 30%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
- 27 026990
Вне зависимости от выбранного пути введения соединения настоящего изобретения, которые можно использовать в соответствующей гидратированной форме, и (или) фармацевтические композиции настоящего изобретения, выпускают в приемлемых дозированных формах с помощью традиционных методик, известных специалисту в данной области техники.
Уровни фактических доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут колебаться так, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно в достижении желательного терапевтического эффекта у конкретного пациента, в композиции и пути введения без токсического действия на пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, включая активность определенных композиций настоящего изобретения, или их эфиров, солей и амидов, пути введения, время введения, скорость выведения определенного используемого соединения, длительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и (или) материалы, использующиеся в комбинации с определенными использующимися композициями, возраст, пол, вес, заболевание, общее состояние и анамнез пациента, нуждающегося в лечении, и аналогичных факторов, известных в области медицины. Врач или ветеринар, будучи специалистом в данной области техники, можно без труда определить и назначить эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с доз соединений настоящего изобретения, использующихся в фармацевтической композиции, на уровнях ниже тех, которые требуются для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу, пока не наступит желательный эффект. Как правило, соотвествующая суточная доза композиции настоящего изобретения будет составлять количество соединения, которое эффективно в самой низкой дозе для наступления терапевтического эффекта. Такая эффективная доза, как правило, будет зависеть от факторов, перечисленных выше. Предпочтительно, чтобы путь введения был внутривенным, внутримышечным, интраперитонеальным или подкожным, предпочтительно, чтобы место введения располагалось проксимально от мишени. При необходимости эффективную суточную дозу терапевтической композиции можно вводить в два, три, четыре, пять, шесть или больше приемов по отдельности через соответствующие интервалы на протяжении суток, как вариант, в дозированной лекарственной форме. В то время, как соединение настоящего изобретения можно вводить отдельно, предпочтительно вводить это соединение в виде фармацевтического состава (композиции).
Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области техники. Например, в предпочтительном варианте терапевтическую композицию настоящего изобретения можно вводить с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций, такого как устройства, описанные в патентах США № 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры известных имплантатов и модулей, полезных в осуществлении настоящего изобретения, включают: патент США 4487603, где описан имплантируемый микроинфузионный насос для введения лекарственного средства с контролируемой скоростью; патент США 4486194, где описано терапевтическое устройство для введения лекарственных средств через кожу; патент США 4447233, где описан инфузионный насос для введения лекарственных средств с точной скоростью введения; патент США 4447224, где описано имплантируемое инфузионное устройство с переменной скоростью введения для непрерывного введения лекарственных средств; патент США 4439196, где описана осмотическая система введения лекарственных средств с многокамерными отделениями; и патент США 4475196, где описана осмотическая система введения лекарственных средств. Многие другие такие имплантаты, доставочные системы и модули известны специалисту в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления антитела настоящего изобретения могут выпускаться в лекарственной форме, обеспечивающей соответствующее распределение ш νί\Ό. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) исключает многие высокогидрофильные соединения. Чтобы обеспечить пересечение ГЭБ (если это требуется) терапевтическими соединениями настоящего изобретения, их можно выпускать, например, в форме липосом. В отношении методик производства липосом см., например, патенты США 4552811, 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать один или несколько компонентов, которые избирательно переносятся в специфические клетки или органы, таким образом способствуя таргетной доставке лекарственного средства (см., например, У.У. Капабе (1989), ί. СПп. Рйагтасо1. 29:685). Примеры нацеливающих компонентов включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016 Бои е! а1.); маннозиды (Бте/аиа е! а1. (1988), Вюсйет. Вюрйу8. Ке8. Соттип. 153:1038); антитела (Р.О. В1оетап е! а1. (1995), РЕВ8 Ьей. 357:140; М. Оиа18 е! а1. (1995), АпйтюгоЪ. Адепй СйетоШег. 39:180); рецептор белка сурфактанта А (Вг18сое е1 а1. (1995), Ат. ί. РЬу8ю1. 1233:134), различные виды которого могут включать лекарственные формы настоящего изобретения, а также компоненты молекул настоящего изобретения; р120 (8сЬге1ег е! а1. (1994), 1. Вю1. СБет. 269:9090); см. также К. Кешапеп; М.Ь. Ьаиккапеп (1994), РЕВ8 Ьей. 346:123; 1.1. КЛПоп; 1.1. Иб1ег (1994), 1ттипоте1йоб8 4:273. В одном варианте настоящего изобретения терапевтические соединения настоящего изобретения изготавливают в форме липосом; в более предпочтительном варианте липосомы включают нацеливающий компонент. В наиболее предпочтительном варианте терапевтические соединения липосом вводят путем однократной инъекции в место, расположенной проксимально от опухоли или очага инфекции. Композиция должна быть жидкой до степени, которая обеспечивает ее введение шприцем. Она должна быть стабильной в условиях
- 28 026990 производства и хранения и должна быть защищенной от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.
Способность соединения тормозить рост злокачественных опухолей можно оценить на животной модели, прогностической в отношении эффективности при опухолях у человека. Или же это свойство композиции можно оценить, исследуя способность соединения к ингибированию, при этом такое ингибирование исследуют ш νίΙΐΌ с помощью анализов, известных опытному специалисту. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшить размер опухоли или как-либо иначе облегчить симптомы у субъекта. Специалист в данной области техники сможет определить такие количества с учетом таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и особенности конкретной выбранной композиции или пути введения.
Способность антител усиливать представление антигена или индуцировать цитотоксический ответ Т-лимфоцитов против различных клеток или возбудителей-мишеней также можно оценить с помощью методик, известных в данной области техники.
Композиция должна быть стерильной и жидкой до степени, которая обеспечивает ее введение шприцем. Кроме воды, носитель может быть изотоническим забуференным раствором, этиловым спиртом, полиолом (например, глицерином, пропиленгликолем и жидким полиэтиленгликолем и им подобным) и их соответствующими смесями. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования материалов для покрытий, таких как лецитин, путем поддержания нужного размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннитол или сорбитол, или хлорид натрия. Пролонгированное всасывание композиций для инъекций можно обеспечить за счет включения в композицию агента, который замедляет всасывание, например, солей моностеарата алюминия и желатина.
Когда активное соединение соответствующим образом защищено, как описано выше, это соединение можно принимать внутрь, например, с инертным растворителем или усвояемым съедобным носителем.
IV. Области применения и способы настоящего изобретения
В одном из вариантов антитела, биспецифические молекулы и молекулярные конъюгаты настоящего изобретения можно использовать для лечения и (или) предупреждения (например, иммунизации против) различных заболеваний и состояний.
Одним из первичных показаний заболеваний, которые можно лечить с помощью антител, является злокачественная опухоль. К ней относятся, но не ограничиваются этим, рак толстой кишки, меланома, лимфома, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, фибросаркома, рабдогмиосаркома, мастоцитома, рак молочной железы, лейкоз, или ревматоидная фибробластома. Другим первичным показанием заболевания является инфекционное заболевание, включая, но не ограничиваясь этим, ВИЧ-инфекцию, гепатит (например. А, В и С), грипп, герпес, лямблиоз, малярия, лейщманиоз, инфекция, вызванная 8!арНу1ососси8 аигеик, инфекция, вызванная Ркеиботопак аегидшока. Другим первичным показанием заболевания является аутоиммунное заболевание.
Для использовании в терапии конъюгированные вакцины настоящего изобретения можно вводить субъекту прямо (т.е. ш νί\Ό) либо по отдельности, либо вместе с агентом-иммуностимулятором. В одном аспекте агент-иммуностимулятор связан с конъюгатом. Или же конъюгаты можно вводить субъекту непрямым путем, сначала обеспечив контакт конъюгатов (например, путем культивирования или инкубирования) с АПК, такими как дендритные клетки, а затем уже вводить эти клетки субъекту (т.е. ех νί\Ό). Обеспечение контакта и доставки конъюгатов к АПК, так, чтобы они подверглись обработке и быть представлены АПК до введения, также называется антигенной или клеточной нагрузкой. Методики антигенной нагрузки АПК известны в данной области техники и включают, например, Сип/ег ОгаЬЬе, Сгй Кем 1ттипо1 21 (1-3): 133-45 (2001), и 8!еттап, Ехр Нета!о1 24(8): 859-62 (1996).
Во всех случаях конъюгированные вакцины и агенты-иммуностимуляторы вводят в эффективном количестве для наступления желательного терапевтического эффекта. Термин эффективное количество означает количество, необходимое или достаточное для реализации желательного биологического эффекта. Например, эффективное количество может быть количеством, необходимым для устранения опухоли, злокачественной опухоли, или бактериальной, вирусной или грибковой инфекции. Эффективное количество для какой-либо конкретной цели может меняться в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, по поводу которого проводится лечение, конкретный конъюгат, который вводят в процессе лечения, размер субъекта, или тяжесть заболевания или состояния. Специалист в данной области техники может эмпирическим путем определить эффективное количество конкретной специфической молекулы без необходимости в ненужных экспериментах.
Предпочтительные пути введения конъюгированных вакцин включают, например, инъекцию (например, подкожную инъекцию, внутривенную инъекцию, парентеральное введение, интраперитонеальное введение, интратекальное введение). Инъекция может представлять собой однократное введение или непрерывное капельное введение. Другие пути введения включают прием внутрь.
Конъюгированные вакцины настоящего изобретения также можно вводить одновременно с адъю- 29 026990 вантами и другими терапевтическими агентами. Как понятно из контекста, термин вводить одновременно, согласно употреблению в данном документе, включает любые или все одновременные, отдельные или последовательные введения антител и конъюгатов настоящего изобретения с адъювантами и другими агентами, включая введение как часть схемы применения. Конъюгаты, как правило, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем отдельно или в комбинации с такими агентами. Примеры таких носителей включают растворы, растворители, дисперсионные среды, агенты, пролонгирующие действие, эмульсии и им подобные. Применение таких сред для фармацевтически активных соединений известно в данной области техники. Любой другой традиционный носитель, пригодный для использования с этими молекулами, входит в объем настоящего изобретения.
Агенты, пригодные для одновременного введения с конъюгированными вакцинами, включают другие антитела, цитотоксины и (или) лекарственные средства. В одном варианте агент представляет собой антитело к СТЬА-4, которое известно как антитело, способствующее иммунным ответам или вызывающее иммунные ответы. В другом варианте агент представляет собой химиотерапевтический агент. Конъюгированные вакцины также можно вводить в комбинации с лучевой терапией.
Химиотерапевтические агенты, пригодные для одновременного введения с антителами и конъюгатами настоящего изобретения при лечении опухолей включают, например, таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Дополнительные агенты включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацила декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ΒδΝυ) и ломустин (ССХи), циклофсофамид, бусульфан, дибромоманнитол, стрептозоцин, митомицин С и цисдихлордиамин платины (II) (ΌΌΡ) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (бывший дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактимицин (бывший актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМЦ)), и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).
Агенты, которые устраняют или тормозят иммунодепрессивное действие, например, со стороны иммунокомпетентных клеток (например, регуляторных Т-лимфоцитов, ΝΚ-лимфоцитов, макрофагов, миелоидных клеток-супрессоров, незрелых дендритных клеток или дендритных клеток-супрессоров) или факторов-супрессоров, вырабатывающихся опухолью или клетками хозяина в местном микроокружении опухоли (например, ФРТ бета, индоламин, 2-3-диоксигеназа - ИДО), также можно вводить с антителами и конъюгатами настоящего изобретения. Такие агенты включают антитела и лекарственные средства, представляющие собой небольшие молекулы, такие как ингибиторы ИДО, такие как 1-метилтриптофан или его производные.
В другом варианте антитела настоящего изобретения можно использовать для лечения субъекта с аутоиммунным, иммунологическим или воспалительным заболеванием, например, заболеванием, характеризующимся аномальной или нежелательной иммунологической активностью, обусловленной иммуномодуляцией с участием дендритных клеток. Аутоиммунные, иммунологические и воспалительные заболевания, при которых могут оказаться полезными антитела к дендритным клеткам настоящего изобретения, включают ревматоидный артрит, рассеянный склероз, сахарный диабет 1-го типа или опосредованный иммунными механизмами, тяжелая миастения, злокачественная анемия, болезнь Аддисона, синдром Шегрена, псориаз, системная красная волчанка, воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит, склеродермия и (или) синдром Рейно, синдром Рейтера и аутоиммунные заболевания щитовидной железы, такие как тиреоидит Хасимото и гипертиреоз. Например, у субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием, может оказаться благоприятным торможение представления аутоантигенов дендритными клетками.
Антитела настоящего изобретения также можно использовать для предупреждения и лечения всех форм аллергии и аллергических заболеваний, включая, но не ограничиваясь перечисленным: аллергические болезни глаз, включая аллергический конъюнктивит, весенний кератоконъюнктивит и гигантоклеточный конъюнктивит; аллергические болезни носа, включая аллергический ринит и синусит; аллергические болезни уха, включая зуд евстахиевой трубы; аллергические болезни верхних и нижних дыхательных путей, включая эндогенную и экзогенную бронхиальную астму; аллергические болезни кожи, включая дерматит, экзему и крапивницу; и аллергические болезни желудочно-кишечного тракта.
Пригодные для одновременного введения с антителами настоящего изобретения для лечения таких иммунологических заболеваний включают, например, агенты-иммунодепрессанты, такие как рапамицин, циклоспорин и РК506; агенты-антагонисты ФРТа, такие как этанерцепт, адалимумаб и инфликсимаб; и стероиды. Примеры специфических естественных и синтетических стероидов включают, например, Альдостерон, беклометазон, бетаметазон, будезонид, клопреднол, кортизон, кортивазол, дезоксикортон, дезонид, дезоксиметазон, дексаметазон, дифторкортолон, флуклополон, флуметазон, флунизолид, флуоцинолон, флуоцинонид, флуокортинбутил, фторкортизон, фторкортолон, фторметолон, флурандренолон, флутиказон, хацинонид, гидрокортизон, икометазон, мепреднизон, метилпреднизолон, параметазон, преднизолон, преднизон, тиксокортол и триамцинолон.
- 30 026990
Другие примеры заболеваний, которые можно лечить с использованием антител к ЛЕС-205 в соответствии с настоящим изобретением включают отторжение трансплантата и реакцию трансплантат против хозяина.
Отторжение трансплантата
За последние годы достигнуто значительное увеличение эффективности хирургической техники при трансплантации тканей и органов, таких как кожа, почка, печень, сердце, легкое, поджелудочная железа и костный мозг. Возможно, главной остающейся неразрешённой проблемой является отсутствие удовлетворительных агентов для индукции иммунологической толерантности у реципиента к пересаженному аллотрансплантату или органу. Когда аллогенные клетки или органы пересаживают хозяину (т.е. когда донор и реципиент являются разными особями одного и того же биологического вида), иммунная система хозяина с большой вероятностью реагирует на чужеродные антигены в трансплантате (реакция трансплантат против хозяина), что ведет к разрушению пересаженной ткани. В отторжении трансплантата участвуют клетки СЛ8, клетки СЛ4 и моноциты. Антитела настоящего изобретения полезны для торможения ответов, вызванных аллоантигеном и опосредованных дендритными клетками у реципиента, за счет блокирования участия таких клеток в разрушении пересаженной ткани или органа.
Реакция трансплантат против хозяина
Соответствующее применение антител в вариантах осуществления настоящего изобретения заключается в модулирование иммунного ответа, участвующего в реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). РТПХ является потенциально опасным для жизни заболеванием, которое возникает, когда аллогенному реципиенту пересаживают иммунокомпетентные клетки. В такой ситуации иммунокомпетентные клетки донора могут атаковать ткани реципиента. Ткани кожи, эпителий кишечника и печень - частые мишени, и они могут разрушаться во время РТПХ. Заболевание представляет собой особо трудную проблему, когда пересаживают ткани, обладающие иммунологическими функциями, такие как костный мозг; но в других случаях, включая трансплантацию сердца и печени, тоже наблюдается менее тяжелая РТПХ. Терапевтические агенты настоящего изобретения используются для торможения активности антигенпредставляющих клеток хозяина, например, дендритных клеток.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать как налагающими какие-либо ограничения. Содержание списка последовательностей, фигур и всех ссылок, патентов и опубликованных заявок на получение патента, цитирующихся в этом описании, включены в него путем ссылки.
Примеры
Пример 1.
Получение моноклональных антител человека (НиМаЪ), специфичных к ЛЕС-205.
Анти-ЛЕС-205 моноклональные антитела человека получены путем иммунизации линии НС2/КСо7 трансгенных мышей ΗиΜΑЪ® (НиМаЪ - товарный знак компании Мейагех, Шс., Принстон, штат НьюДжерси) растворимым человеческим антигеном ЛЕС-205. Мыши НС2/КСо7 ΗиМΑЪ выведены, в соответствии с описаниями в патентах США 5770429 и 554580, которые в полном объеме включены в данный документ путем ссылки.
Антиген и иммунизация: Антиген представлял собой растворимый гибридный белок, содержащий внеклеточный домен ЛЕС-205 (включающий все десять доменов, связывающих лектин), слитый с доменом Рс антител. Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислот человеческого ЛЕС-205 имеется в публикации патента РСТ под номером \УО 96023882 (δΚίηιηηη). Для первой иммунизации антиген смешивали с полным адъювантом Фрейнда (81дша). Затем антиген смешивали с неполным адъювантом Фрейнда (δίβΐηη). Дополнительных мышей иммунизировали растворимым белком ЛЕС-205 в адъювантной системе ΚΙΒΙ МРЬ плюс ТЛМ >1дта). 5-25 микрограммов растворимого рекомбинантного антигена ЛЕС-205 в солевом фосфатном буфере или 5х106 клеток СНО, трансфицированных для экспрессии человеческого ЛРЕС-205 на поверхности, в солевом фосфатном буфере смешивают в соотношении 1:1 с адъювантом. Мышам вводили 100 мкл приготовленного антигена в полость брюшины каждые 14 суток. Животным, у которых выявили титры антител к ЛЕС-205, внутривенно вводили 10 мкг растворимого рекомбинантного антигена ЛЕС-205 за трое-пять суток до слияния. Селезенку мышей извлекали и использовали изолированные спленоциты для получения гибридом.
Получение гибридомы: Для слияния использована клеточная линия мышиной миеломы Ρ3χ63Α§8.653 йпе (АТСС СКЕ 1580). Для культивирования клеток миеломы использован КРМI 1640 (Ιηνίΐτο^η), содержащий 10% сыворотки плода коровы. В среду для роста гибридомы добавляли дополнительные питательные компоненты, которые включали: 3% фактор клонирования гибридом Олден Оден), 10% сыворотку плода коровы >1дта), Ь-глутамин (0Фсо) 0,1% гентамицин (0Фсо), 2меркаптоэтанол (0Фсо), ΗΑΤ >1дта; 1,0х104 моль гипоксантина, 4,0х10-7 моль аминоптерина, 1,6х10-5 моль тимидина), или НТ >1дта; 1,0х 10-4 моль гипоксантина, 1,6х 10-5 моль тимидина).
Клетки селезенки смешивали с клетками миеломы 653 в соотношении 6:1 и выделяли в форме гранул путем центрифугирования. По каплям добавляли полиэтиленгликоль, тщательно перемешивая, чтобы способствовать образованию гибридомы. Гибридомы культивировали в течение от одной до двух
- 31 026990 недель до появления видимых колоний. Надосадочную жидкость отделяли и использовали для начального скрининга на человеческий 1д0 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, используя захват, специфичный для человеческой цепи каппа, и детекцию человеческого Ре. Затем надосадочные жидкости, положительные на 1д0, анализировали на специфичность к ЭЕС-205 с помощью флоуцитометрии или твердофазного иммуноферментного анализа на ЭЕС-205.
Г ибридомы, вырабатывающие специфические НиМаЬ 1д0, подвергали субклонированию и размножению. Затем полученные НиМаЬ очищали с помощью колоночной хроматографии с белком А согласно стандартным условиям, что приводило к выделению ряда антител, представляющих особый интерес.
Пример 2.
Определение аффинности и констант скорости НиМаЬ с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ПНР).
Аффинность связывания и кинетику связывания различных анти-ОЕС-205 антител человека из примера 1 исследовали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ПНР) В1аеоге с использованием аппарата В1аеоге 2000 ЗРК (В1аеоге АВ, Упсала, Швеция) согласно инструкции производителя.
Очищенный рекомбинантный гибридный (или контрольный) белок человеческого ЭЕС-205 ковалентно связывали с сенсорным чипом В1аеоге СМ5 (карбоксиметилированный декстран, ковалентно связанный с золотой поверхностью; продукт компании В1аеоге № ВК-1000-14), используя стандартную реакцию сочетания аминов с помощью набора для сочетания аминов компании В1аеоге согласно инструкции производителя (; продукт компании В1аеоге № ВК-1000-50, содержащий связующие реагенты Ν-гидроксисукцинимид (Ν-ГС) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (ЭДК). Низкие уровни лигандов иммобилизовали, чтобы ограничить какое-либо влияние массового транспорта вещества, определяемого при анализе, на параметры кинетики так, что наблюдающаяся КМАХ составляли порядка 200 КП.
Связывание измеряли по потоку антител над сенсорным чипом в буфере НВЗ-ΝΡ (буфер НВЗ-Ν, продукт компании В1аеоге № ВК-1003-69: 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (НЕРЕЗ) 0,24%, хлорид натрия 0,88%, воды до объема, профильтрованные и дегазированные и уравновешенные при комнатной температуре с сурфактантом Р20 в разведении 1:2000) в концентрациях в диапазоне от 1,25 до 200 нмоль и при скорости потока 30 мкл/мин. Кинетику ассоциации и диссоциации антиген-антитело определяли примерно через 300-600 с в каждом случае.
В каждом случае проводили контрольное измерение, используя неродственный белок для вычитания фонового сигнала. В ходе всего исследования в качестве условий регенерации использовали однократное введение 18 ммоль №ОН в течение 17 с со скоростью 35 мкл/мин.
В каждом случае использовали мастер определения кинетики В1аеоге для определения параметров кинетики по серии концентраций вещества, определяемого при анализе, разведенного в буфере НВЗ-ΝΡ. Кривые ассоциации и диссоциации встраивали в модель связывания Лангмюра 1:1 с помощью программы-мастера определения кинетики В1аеоге (В1аеоге АВ) согласно инструкции производителя. Определенные аффинность и параметры кинетики (с вычитанием фонового сигнала) представлены ниже в таблице. Для каждого антитела представленные цифры означают среднее значение по двум сериям экспериментов с использованием отдельно подготовленного сенсорного чипа в каждом случае (где ка = константа скорости ассоциации, Ы = константа скорости диссоциации, Ко = константа равновесия диссоциации (мера аффинности), КА = константа равновесия ассоциации, Ктах = максимальный выходной сигнал НИР).
мАт мАт ИН ка (1/мс) ка (1/с) КА (1/М) Кв (М) КМах (ки)
№1 ЗА4-1С10 1,5 х 106 9,6 х 10 5 1,6 х Ю10 6,6 х 10 п 278
- 32 026990
№2 5А8-1Р1 3,6 х 105 2,0 х ΙΟ'4 2,1 χ ΙΟ9 1,5 χ 10 9 172
№3 ЗС7-ЗАЗ 1,7 х 105 7,6 χ ΙΟ'4 5,2 χ ΙΟ8 5,6 χ 10 9 133
№4 2ОЗ-1Р5 3,3 х 105 2,2 χ 10 5 1,5 χ 101ϋ 6,8 χ 10'11 275
№5 3ϋ6-2Ρ4 1,8 х 106 1,2 χ 10 4 1,5 χ ΙΟ10 8,0 χ 10'11 294
№6 5Ш2-5С1 5,4 х 105 3,2 χ ΙΟ'4 2,0 χ ΙΟ9 7,0 χ ΙΟ'10 272
№7 1С6-1С6 1,4 х 106 3,0 χ ΙΟ'4 4,7 χ ΙΟ9 2,3 χ 10'1ϋ 249
№8 3Ο9-2ϋ2 9,0 х 105 1,9 χ 10 4 4,7 χ ΙΟ9 2,4 χ 10'1ϋ 268
Пример 3.
Связывание НиМаЬ с клетками, экспрессирующими ПЕС-205.
Способность анти-ПЕС-205 антител НиМаЬ связываться с ПЕС-205 на клетках СНО-8, экспрессирующих на своей поверхности ПЕС-205 человека, исследовано с помощью флоуцитометрии следующим образом.
Антитела исследованы на связывание с клетками СНО-8, экспрессирующими ПЕС-205 человека на своей поверхности. Антитела НиМаЬ, очищенные с использованием протеина А (3П6-2Р4, 3П6-4С8, 309202, 5А8-1Р1, 2И3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ш2-5С1, 106-106 и 3А4-1С10), инкубировали с клетками СНО8, экспрессирующими человеческий ПЕС-205, а также с контрольными клетками СНО-8 при температуре 4°С. Все антитела использовали в концентрациях насыщения. Через 1 ч клетки промывали фосфатным солевым буфером, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% №Ν3 (РВА), и выявляли связанные антитела путем инкубации клеток с зондом, представляющим собой козье антитело, специфичное к Рс человеческого 1дС, при 4°С. Избыток зонда отмывали от клеток раствором РВА и с помощью инструмента Ь8К (ВЦ ВюзОеисез, штат Нью-Джерси, США) определяли флуоресценцию, связанную с клетками, согласно инструкции производителя. Результаты представлены на фиг. 1.
Как показано на фиг. 1, антитела НиМаЬ демонстрировали высокий уровень связывания с клетками СНО-8, экспрессирующими человеческий ПЕС-205. Эти данные демонстрируют, что эти антитела эффективно и специфически связываются с человеческим ПЕС-205, который экспрессируется на живых клетках СНО-8, при сравнении с контрольными клетками.
Пример 4.
Связывание НиМаЬ с дендритными клетками человека.
Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) были получены путем центрифугирования в градиенте плотности из лейкоцитарной массы (Ьеикорак), полученной путем афереза тромбоцитов. Моноциты выделяли по адгезии к колбам с тканевыми культурами в течение 2 ч, а затем дифференцировали в дендритные клетки путем инкубации с 2 нг/мл ГМ-КСФ и 10 нг/мл ИЛ-4 в сывороточной среде, не содержащей макрофаги (С1Ьсо), в течение 5-7 суток.
Способность анти-ЛЕС-205 антител НиМаЬ связываться с ПЕС-205 на дендритных клетках, полученных вышеописанным путем, исследовали с помощью флоуцитометрии следующим образом.
Антитела НиМаЬ, очищенные с использованием протеина А, 3Ώ6-2Ρ2, 3П6-4С8, 3С9-2П2, 5А8-1Р1, 2П3-1Р5-2А9, 3С7-3А3, 5Ώ12-5Ο1, 106-106 и 3А4-1С10, и контрольный изотип (человеческий 1дС) инкубировали с человеческими дендритным клетками при 4°С. Все антитела использовали в концентрациях насыщения. Через 1 ч клетки промывали фосфатным солевым буфером, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% №Ν3 (РВА), и выявляли связанные антитела путем инкубации клеток с зондом, представляющим собой козье антитело, специфичное к Рс человеческого 1д0, при 4°С. Избыток зонда отмывали от клеток раствором РВА и с помощью инструмента Ь8К (ВЦ Вюзыеисез, штат НьюДжерси, США) определяли флуоресценцию, связанную с клетками, согласно инструкции производителя. Результаты показаны на фиг. 2, где видно, что антитела НиМаЬ проявляли высокий уровень связывания с человеческими дендритными клетками по сравнению с контрольным изотипом.
Пример 5.
Твердофазный иммуноферментный анализ для определения характеристик связывания НиМаЬ с ПЕС-205.
Плашки для микротитрования покрывали растворимым гибридным белком ПЕС-205/Рс в фосфат- 33 026990 ном солевом буфере, а затем блокировали 5-% бычьим сывороточным альбумином в фосфатном солевом буфере. Добавляли НиМаЬ, очищенные с использованием протеина А, и контрольный изотип в концентрациях насыщения и инкубировали при 37°С. Плашки промывали смесью фосфатного солевого буфера и Т\уееп 20 и затем инкубировали с реагентом с поликлональными козьими антителами, специфичными к человеческому Рс 1д0, конъюгированными со щелочной фосфатазой, при 37°С. После промывания плашки обрабатывали субстратом ρΝΡΡ (1 мг/мл) и анализировали при оптической плотности 405-650 с помощью считывающего устройства для плашки для микротитрования. Результаты показаны на фиг. 3, где видно, что антитела НиМаЬ проявляли высокий уровень связывания по сравнению с контрольным изотипом.
Пример 6.
Анализ интернализации антител.
Человеческие дендритные клетки - производные моноцитов - в количестве 5х105 на порцию инкубировали с человеческим 1дО (1 мг/мл) для блокирования неспецифического связывания. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин на льду с 100 мкг/мл анти-ОЕС-205 антитела НиМаЬ 309-202, конъюгированного с ФИТЦ, в блокирующем буфере для связывания, а затем переносили в среду с температурой 37°С на 0, 10, 30, 60 и 120 мин для интернализации. В качестве контроля в той же концентрации использовали человеческий 1дО1, конъюгированный с ФИТЦ. Затем клетки промывали и фиксировали 1-% параформальдегидом. Фиксированные клетки промывали, вновь взвешивали в воде и путем цитоцентрифугирования наносили на предметные стекла. Изображения получали с помощью конфокального микроскопа /счзз ЬЗМ 510 Ме!а. Результаты показаны на фиг. 4, где видно, что антитела НиМаЬ, меченые ФИТЦ, проявляли эффективную интернализацию в дендритных клетках по сравнению с контролем.
Пример 7.
Секвенирование антител.
Как описано выше в примере 1, антитела НиМаЬ из гибридом, вырабатывающих специфический НиМаЬ 1д0, очищали с помощью колоночной хроматографии с протеином А, что вело к изоляции восьми антител (НиМаЬ), представляющих особый интерес. Кодирующие УН и УЕ участки НиМаЬ 3О6-2Р4, 3О6-4С8, 3Ο9-2Ώ2, 5А8-1Р1, 2О3-1Р5-2А9 (участок УН), 3С7-3А3, 1Ε6-3Ώ10 (участок УН) и 5С3-2-3Р6 идентифицировали, используя РНК соответствующих гибридом. Из РНК путем обратной транскрипции получали кДНК, участки, кодирующие У, амплифицировали с помощью ПЦР и сиквенировали продукт ПЦР. Ниже приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности участков УН апб УЕ НиМаЬ (в случае аминокислотных последовательностей подчеркнуты участки, определяющие комплементарность (СЭК)).
Нуклеотидная последовательность УН 3О6-2Р4 (УН3, локус 3-33; 1Н4) (последовательность № 2): а1§иа§Ш§§§с1§а§с1§§§Ш1сс1с§й§с1сШ1аа§а§§1§1сса§1§1с১1§са§с1§§1§§а§1с1觧§§аи§с§1§ §1сса§сс1§§§а§§1;ссс1§а§ас1:с1;сс1§1§са§с§1с1:§§аЕса1сЕса§1:а1с1а1§§са1:§сас1§§§1сс§сс১с1:сса §§са১§§с1§§а§1§§§1§§са§11а1а1§§1а1§а1§§аа§1аа1ааа1:ас1:а1ёса§ас1;ссё1§аа§ё§сс§аЦсасса1;с1;с саб>а§асааиссааб’аасасу,с1б’1а1с1б>сааа1б>аасаб’сс1б>а§аб>ссч’аб>б>асасу,б>с1§1б’1аЦас1б>1усч>аб>а§с1сс1 сасШ§ас!ас1§§§§сс১§аассс1§§1сасс§1с1;сс1са§с1аёс
Аминокислотная последовательность УН 3О6-2Р4 (последовательность № 3), включая сигнальный пептид:
МЕРОЕ8\УУРЕУАЕЕКОУ9СрУ0ЕУЕ8ОООУУрРОК8ЕКЕ8САА8ОР1Р8ГУОМН\УУ
ΚΟΑΡΟΚθΕΕ\ννΑνΐλνΥΡθ8ΝΚΥΥΑΡ8νΚΟΚΡΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΤΑ
УУУСАЕАРНРРУХУООСЛЪУТУЗБ
Зрелая аминокислотная последовательность УН 3О6-2Р4 (последовательность № 4), исключая сигнальный пептид:
0У0ЕУЕ8ОООУУ0РОК8ЕКЕ8САА8ОР1Р81УОМН\УУКРАРОКОЕЕ\УУАУ1\УУРО8 ΝΚΥΥΑΡ8νΚΟΚΡΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΤΑνΥΥΕΑΚΑΡΗΡΡΥ\νθΟθΤΕν ТУ 8 8
СРК1 Ун ЗР6-2Р4 (последовательность № 5): ΙΥΟΜΗ
СРК2 Ун ЗР6-2Р4 (последовательность № 6): ν[\¥ΥΡ08ΝΚΥΥΑΡ8νΐ<0
СРЕЗ Ун ЗР6-2Р4 (последовательность № 7): ΑΡΗΡΡΥ
Нуклеотидная последовательность УЕ 3Ώ6-2Ρ4 (УК1, локус Ь15; РК2) (последовательность № 8):
- 34 026990 а1дд2а1§е,адс1§1а1са1сс1д11сс1сд1§,2ссасадсаасс221д1ссас1ссдаса1сса§а12асссад1с1сса1сс1сас12
1с1§са1с1д11££а£аса£а£1сасса1сас11£1с§££с§а§1садд§1а11а£садс1££11а£’сс1£’£’1а1са£’садааасса£>а §ааа£сссс1аа£1ссс1£а1с1а1§с1§са1сса§Ш£сааа§1§£§§1ссса1са১11са£с§£са£1££а1с1£££аса§аШ сас1с1сасса1са§са§сс1§са§сс1§аа§аШ1§саасЕаЕас1§ссааса§1а1аа1а§11ассс§1асасЕЕ§§сс১§§ ассаа§с1§§а§а1сааас§1ас£
Аминокислотная последовательность V; 3Ό6-2Ρ4 (последовательность № 9), включая сигнальный пептид:
МРМКУЕА0ЬЕОЕЬЕЬСГРОАКСРЮМТ08Р88Е8А5УОРКУТ1ТСКА80О188ШЬАШ
У00КРЕКАРК8Е1УАА88Е08ОУР8КР8О8О8СТРРТЕТ188Е0РЕРГАТУУС00УУ8У
ΡΥΤΡΟΟΟΤΚΕΕΙΚ
Зрелая аминокислотная последовательность V; 3Ό6-2Ρ4 (последовательность № 10), исключая сигнальный пептид:
РЮМТ08Р88Е8А8УОРЕУТ1ТСЕА80О188ШЕАШУ00КРЕКАРК8ЫУАА88Е08ОУ
Ρ8ΕΓ808080ΤΡΓΤΕΤΙ88ΕΟΡΕΡΓΑΤΥΥΟΟΟΥΝ8ΥΡΥΤΓΟΟΟΤΚΕΕΙΚ
СРЕ1 Уь ЗР6-2Р4 (последовательность № 11): КА8ОС188АЕА
СРЕ2 Уь ЗР6-2Р4 (последовательность № 12): АА88ЬО8
СРЕЗ Уь ЗР6-2Р4 (последовательность № 13): ΟΟΥΝ8ΥΡΥΤ
Нуклеотидная последовательность Ун 3Б6-4С8 (УН3, локус 3-33; Ш4) (последовательность № 14): а1§§аёП1ёё§с1§а§с1ё§§1тсс1сё11§с1сШ1аа§а§§1ё1сса§1§1с১1ёса§с1§§1ёёа§1с1ё§§§§а§§сё1§ ^сса§сс1£§§а§£1ссс1§а§ас1с1сс1£1§са§с§1с1§§айса1с11са§1а1с1а1§§са1§сас1§§§1сс§сс১с1сса §§са১§§с1§§а§1ёё§1§§са§Еа1а1§§1а1§а1§§аа§1аа1ааа1ас1а1§са§ас1сс§1§а১§сс§а11сасса1с1с са§а£асааИссаа§аасас§с1§1а1с1£сааа1§ааса§сс1£а§а§сс§а§§асас§§с1§1§1а11ас1§1£с§а§а£с1сс1 сасШ§ас1ас1£8§§сс১§аассс1£§1сасс§1с1сс1са§сс1ссассаа§8£ссса1с§81с11ссссс1§8сас
Аминокислотная последовательность Ун 3О6-4С8 (последовательность № 15), включая сигнальный пептид:
МЕРОР8\¥УРРУАРРЕОУ0С0У0РУЕЗОООУУрРОЕ8РЕРЗСАА8ОР1Р81УОМН\¥У
ΕΟΑΡΟΚΟΡΕ\¥νΑνΐ\¥ΥΡθ8ΝΚΥΥΑΡ8νΚΟΕΡΤΙ8ΕΡΝ8ΚΝΤΡΥΡΟΜΝ8ΡΕΑΕΡΤΑ
УУУСАРАРНГРУ\¥СЮСПЪУТУ88
Зрелая аминокислотная последовательность Ун 3Б6-4С8 (последовательность № 16), исключая сигнальный пептид:
0У0РУЕ8ОООУУ0РОЕ8РЕР8САА8ОР1Р81УОМН\УУЕ0АРОКОРЕ\УУАУ1\УУРО8 ΝΚΥΥΑΡ8νΚΟΚΡΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΡΥΡΟΜΝ8ΡΚΑΡΡΤΑνΥΥΕΑΚΑΡΗΡΡΥ\νθΟθΤΡν ТУ8 8
СРЕ1 Ун ЗР6-4С8 (последовательность № 17): ΙΥΟΜΗ
СРЕ2 Ун ЗР6-4С8 (последовательность № 18): νΐλ¥ΥΡΟ8ΝΚΥΥΑΡ8νΚΟ
СРЕЗ Ун ЗР6-4С8 (последовательность № 19): ΑΡΗΡΡΥ
Нуклеотидная последовательность V; 3Б6-4С8 (УК1, локус Ь4; ΊΚ4) (последовательность № 20): а1§§аса1§а§§§1сссс§с1са§с1сс1§§§§с11с1§с1§с1с1§§с1ссс১1§сса§а1§1§сса!сса§Е§ассса§1с1сс а1сс1ссс1§1с1§са1с1§1১а§аса§а§1сасса1сасЦ§сс§§§саа§1с১§са11а§са§1§сШа§сс1§§1а1са§са £ааасса£ё§ааа§с1сс1аа£с1сс1§а1с1а1£а1£сс1сса£д1188ааа£1§§£§1ссса1саа§£11са§с£8са§1;££а1с1§ £§аса§аШсас1с1сасса1са§са§сс1§са§сс1£аа£а1т§саас11а11ас1§1сааса£Шаа1а§11ассс1с1сасШс§§ с££а§§£ассаа££1§£а§а1сааа
Аминокислотная последовательность V; 3Б6-4С8 (последовательность № 21), включая сигнальный пептид:
МРМЕУРА0РРОРРРР\¥РРОАЕСАЮРТ08Р88Ь8А8УОРЕУТ1ТСЕА80О188АРАУ¥
У00КРОКАРКШУРА88РЕ8ОУР8ЕР8О8О8ОТРРТРТ188Р0РЕРРАТУУС00РК8У
РЕГРОООТКУЕ1К
Зрелая аминокислотная последовательность V; 3О6-4С8 (последовательность № 22), исключая
- 35 026990 сигнальный пептид:
А10ЕТ08Р88Ь8А8УОРКУТ1ТСКА80О188АЬА\У¥00КРОКАРКЬЫ¥РА88ЬЕ8ОУР
8ΚΓ808Θ80ΤΡΡΤΕΤΙ88ΕΟΡΕΡΡΑΊΎΥΟΟΟΓΝ8ΥΡΕΤΡΟΟΟΤΚνΕΙΚ
СРК1 Уь ЗР6-4С8 (последовательность № 23): ΚΑ80ΟΙ88ΑΕΑ
СРК2 Уь ЗР6-4С8 (последовательность № 24): РА88ЕЕ8
СРКЗ Уь ЗР6-4С8 (последовательность № 25): ΟΟΡΝ8ΥΡΕΤ Нуклеотидная последовательность УН 3О9-2Р2(УН3, локус 3-33; Ό не определено; ΊΗ4) (последовательность № 26):
а1§§а§Ш§§§с1§а§с1§§§ККсс1с§К§с1с1Шаа§а§§1§1сса§1§1с১1§са§с1§§1§§а§1с1§§§§§а§§с§1§ ^сса£сс1££§а§ё1ссс1£а§ас1с1сс1^£са£с^с1££аисассиса^ааиа1££са^ас1§££1:сс£сса£§с1:сса §§са১§§с1§§а§1§§§1§§са§Ка1а1§§1а1§а1§§аа§1аа!ааа1ас1а1§са§ас1сс§1§а১§сс§аКсасса1с1с са§а§асааКссаа§аасас§с1§1а1:с1;§сааа1§ааса§сс1:§а§а§сс§а§§асас§§с1;§1§1:аКас1§1:§с§а§а§а1:с1с
1££§§а1££1асш£ас1а11££§£сса§££аассс1£§1;сасс£1с1сс1;са£с1а£с
Аминокислотная последовательность УН 3Θ9-2Ό2 (последовательность № 27), включая сигнальный пептид:
МЕРОРЗ\¥УРРУАРРКОУ0С0У0РУЕЗОООУУ0РОКЗРРЕЗСАА8ОРТРЗ]ЧУ£}МУ\У νΚΟΑΡΟΚΘΕΕ\ννΑνΐ\νΥΡθ8ΝΚΥΥΑΡ8νΚθΚΡΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΤ
АУУУСАКРЕ\УС\УУРРУ\УООСТЕУТУЗЗАЗТКСР8УРРЕА
Зрелая аминокислотная последовательность УН 3Θ9-2Ό2 (последовательность № 28), исключая сигнальный пептид:
0У0ЕУЕ8ОООУУ0РОК8ЕКЕ8САА8ОРТР8НУОМУ\УУК0АРОКОЕЕ\УУАУ1\УУРО
8ΝΚΥΥΑΡ8νΚΟΚΓΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΤΑνΥΥΟΑΚΡΕλνθλνΥΓΡΥλνθ
РСТЕУТУ88А8ТКСР8УРРЬА
СРК1 Ун ЗО9-2Р2 (последовательность № 29): ΝΥΟΜΥ
СРК2 Ун ЗО9-2Р2 (последовательность № 30): У1\УУРО8ЯКУУАР8УКО
СРКЗ Ун ЗО9-2Р2 (последовательность № 31): РЬ\УО\УУРРУ
Нуклеотидная последовательность У| 3Θ9-2Ό2 (УК3, локус Ьб; Ж4) (последовательность № 32): а1§§§а1§§а§с1§1а1са1сс1:§Ксс1с§1;§§ссаса§саасс§§1§1ссас1ссёаааК§1:§К§асаса§1;с1сса§ссассс1;§ 1ст§1с1сса§ё§ёааа§а§ссассс1:с1сс1ёсаё§§ссаё1са§аё1ёйа§са§с1;асКаёсс1;§§1;ассааса§ааасс1§§ сса§ёс1ссс১с1сс1са1с1а1§а1§са1ссаас১§ссас1ёёса1ссса§сс১Кса§1§§са§1ёёё1с1ё§§аса§а сКсас1с1сасса1са§са§сс1:а§а§сс1§аа§аШ1§са§ШаКас1:§1:са§са§с§1:с§саас1:§§сс§с1сасШс§§с§§а §§§асса১1§§а§а!сааас§1ас§
Аминокислотная последовательность Уь 3Θ9-2Ό2 (последовательность № 33), включая сигнальный пептид:
МЕАРА0ЕЕРЕЕЕЕ\УЕРРТТСЕ1УЕТ08РАТЕ8Е8РОЕКАТЕ8СКА808У88УЕА\УУ00
КРО0АРКЕЕ1УРА8Т4КАТС1РАКГ8О8О8ОТРГТЕТ188ЕЕРЕРГАУУУС00ККРАУРЕТ
РОООТКУЕ1К
Зрелая аминокислотная последовательность Уь 3Θ9-2Ό2 (последовательность № 34), исключая сигнальный пептид:
Е1УЕТ08РАТЕ8Е8РОЕКАТЕ8СКА808У88УЕА\УУ00КРО0АРКЕЕ1УРА8Т4КАТО1Р
АКГ8О8О8СТРГТЕТ188ЕЕРЕРГАУУУС00ККРАУРЕТГО<}СТКУЕ1К
СРК1 Уь ЗО9-2Р2 (последовательность № 35): КА808V88ΥΕА
СРК2 Уь ЗО9-2Р2 (последовательность № 36): ΡΑ8ΝΚΑΤ
СРКЗ Уь ЗО9-2Р2 (последовательность № 37): ΟΟΚΚΝλΥΡΕΤ
Нуклеотидная последовательность УН 5А8-1Р1 (УН3, локус 3-33; Ш2) (последовательность № 38):
- 36 026990 а1ддадШдддс1дасс1ддд1тсс1сдйдс1с1таададд1д1ссад1д1садд1дсадс1дд1ддад1с1дддддаддсд1д §1ссадсс1дд§адд1ссс1дадас1с1сс1д1§садсд1с1ддай;сассйса§1асс1а1§дса1дсас1дд§1ссдссад§с1сс аддсаад§ддс1§§ад1§§д1ддсаайа1а1д§1а1да1§дадд1аа1ааа1ас1а1дса§ас1сс§1даадд§ссдай;сасса1с1 ссададасааиссаадаасасдс1д1а1с1дсааа1даасадсс1дададссдаддасасддс1д1д1аиас1д1дсдададаси с1ас1дд1асйсда1с1с1ддддссд1ддсассс1дд1сас1д1с1сс1садсс1ссассаадддссса1;сдд1сй;ссссс1:ддсаад §
Аминокислотная последовательность νΗ 5А8-1Р1 (последовательность № 39), включая сигнальный пептид:
МЕРОРТ\УУРРУАРРКСУрСрУрРУЕ8ОСОУУрРОК8РКР8САА8ОРТР8ТТСМН\У ΥΚΟΑΡΟΚΟΡΕλννΑΠλνΥΡΟΟΝΚΥΥΑΡ8νΚΟΚΓΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΡΥΡΟΜΝ8ΡΚΑΕΡΤΑ УУУСАКРГУХУУГРРХУ (ЭКСТР ντνδδΑδΤΚΟΡδνΡΡΡΑ
Зрелая аминокислотная последовательность νΗ 5А8-1Р1 (последовательность № 40), исключая сигнальный пептид:
ОУОРУЕ8СООУУОРСК8РКР8САА80ГТГ8ТУСМН\УУКОАРСКСРЕ\УУАЩУУРО θΝΚΥΥΑΡδνΚΟΚΓΊΊδΚΡΝ8ΚΝΤΡΥΡΟΜΝδΡΚΑΕΡΤΑνΥΥ(3ΑΚΡΓΥλνΥΓΡΡ\ν<}Κθ
ΤΡντνδδΑδΤΚΟΡδνΡΡΡΑ
СРК1 Ун 5А8-1Р1 (последовательность № 41): ΊΎΟΜΗ
СРК2 Ун 5А8-1Р1 (последовательность № 42): 11 \У ΥΡΟΟΝ К Υ Υ А Р 8 V КС
СРКЗ Ун 5А8-1Р1 (последовательность № 43): ΡΡΥλΥΥΡΡΡ Нуклеотидная последовательность Уг 5А8-1Р1 (νΚ3, локус Ь6; .ΙΚ1) (последовательность № 44):
а1ддаадссссадс1садсйс1сйсс1сс1дс1ас1с1ддс1сссада1ассассддадааайд1дйдасасад1с1ссадссасс с1д1сШд1с1ссаддддааададссассс1с1сс1дсадддссад1садад1дйадсадс1асйадсс1дд1ассаасадааасс
1ддссаддс1сссаддс1сс1са1с1а1да1дса1ссаасадддссас1ддса1сссадссаддйсад1ддсад1ддд1с1дддаса дасйсас1с1сасса1садсадсс1ададсс1даадат1дсад1йайас1д1садсадсд1аддасдйсддссаадддассаад д!ддааа!сааасда
Аминокислотная последовательность Уь 5А8-1Р1 (последовательность № 45), включая сигнальный пептид:
МЕАРАОРРГРРРР\УРРРТТСЕ1УРТО8РАТР8Р8РСЕКАТР8СКА8О8У88УРА\УУОО
КРО0АРКРР1УРА8ЯКАТО1РАКР8О8О8ОТРРТРТ188РЕРЕРРАУУУС00ККТРО0О
ΤΚΥΕΙΚ
Зрелая аминокислотная последовательность Уь 5А8-1Р1 (последовательность № 46), исключая сигнальный пептид:
ΕΐνΡΤΟδΡΑΤΡ8Ρ8ΡΟΕΚΑΤΡ8(3ΚΑ808ν88ΥΡΑλνΥΟΟΚΡΟΟΑΡΚΡΡΙΥΡΑ8ΝΚΑΤΟΙΡ
ΑΚΡδΟδΟδΟΤΡΡΤΡΤΙδδΡΕΡΕΡΡΑνΥΥΡΟΟΚΚΤΡΟρΟΤΚνΕΙΚ
СРК1 Уь 5А8-1Р1 (последовательность № 47): ΚΑ8Ο8Υ88ΥΡΑ
СРК2 Уь 5А8-1Р1 (последовательность № 48): ΡΑ8ΝΚΑΤ
СРКЗ Уь 5А8-1Р1 (последовательность № 49): ООККТ Нуклеотидная последовательность νΗ 3С7-3А3 (νΗ3, локус 3-33; ΡΗ2) (последовательность № 50):
а1ддад1йдддс1дадс1ддд1Шсс1сдйдс1сШ1аададд1д1ссад1д1садд1дсадс1дд1ддад1с1дддддаддсд1д д1ссадсс1дддадд1ссс1дадас1с1сс1д1дсадсд1с1ддаИсассисад1адс1а1ааса1дсас1ддд1ссдссаддс1сс аддсааддддс1ддад1ддд1ддсаШа1а1дд1а1да1ддаад1аа1ааа1ас1а1ддадас1ссд1даадддссдаисасса1с1 ссададасааиссааааасасдс1д1а1с1дсааа1даасадсс1дададссдаддасасддс1д1д1аиас1д1дсдададаад адс1дддда1сддд1дд1асйсда1с1с1ддддссд1ддсассс1дд1сас1д1с1сс1садсс1ссассаадддссса1сдд1сйс сссс!ддсас
Аминокислотная последовательность νΗ 3С7-3А3 (последовательность № 51), включая сигнальный
- 37 026990 пептид:
МЕРСЕЗХУУРРУАРЕКСУрССУСРУЕЗСССУУрРСЕЗЕКЕЗСААЗСРТРЗЗУНМНХУ νΕΟΑΡθΚθΕΕλΥνΑΕΙ\νΥΡθ8ΝΚΥΥΟΡ8νΚΟΕΡΤΙ8ΕΡΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΕΑΕΡΤΑ УУУС АЕЕЕЕОЮ\УУРРЕ\УОЕСТЕУТУ8 8 А8ТКОР 8 УРРБ А
Зрелая аминокислотная последовательность УН 3С7-3А3 (последовательность № 52), исключая сигнальный пептид:
0ν0ΕνΕ8θθθνν0ΡθΚ8ΕΚΕ8ΕΑΑ8θΡΤΡ88ΥΝΜΗ\ννΚ0ΑΡθΚθΕΕ\ννΑΡΙ\νΥΡθ
8ΝΚΥΥΟΡ8νΚθΚΡΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΤΑνΥΥΕΑΚΕΕΕθΙθ\νΥΡΡΕ\νθ
ЕОТЕУТУЗЗАЗТКОРЗУРРЕА
СРЕ1 Ун ЗС7-ЗАЗ (последовательность № 53): 8ΥΝΜΗ
СРЕ2 Ун ЗС7-ЗАЗ (последовательность № 54): Π\¥ΥΡΟ3ΝΚΥΥΟΡ3νΚΟ
СРЕЗ Ун ЗС7-ЗАЗ (последовательность № 55): ЕЕИЗКАУУГРЕ Нуклеотидная последовательность УЕ 3С7-3А3 (УК3, локус Ьб; РК1) (последовательность № 56):
а1§§аа£сссса£с1са£сЦс1сЕсс1сс1£с1ас1с1§£с1ссса£а1ассасс££а£аааЦ£1£Ц£асаса£1с1;сса£ссасс с1§1сШ§1с1сс১§§ааа§аёссассс1с1сс1§с১§ссаё1са§а§1§11а§са§с1ас11а§сс1§§1ассааса§ааасс
1§§сс১с1ссс১с1сс1са1с1а1§а1§са1ссаас১§ссас1§§са1ссса§сс১Еса§1§§са§1§§§1с1§§§аса £асЦсас1с1сасса1са§са£сс1а£а£сс1£аа§ат1£са£ШаЦас1£1са£са£С£1а££ас§Цс§£ссаа£££ассаа£ ^§§ааа1сааас£аас1^£§с1§сасса1с1^сЕса1сЕссс§сса1с1§а1§а§са[Щ§ааа1с1§§аас1§сс1с1£Ц£1§1;£ сс!§с
Аминокислотная последовательность Уь 3С7-3А3 (последовательность № 57), включая сигнальный пептид:
МЕАРА0ЕЕГЕЕЕЕ\УЕРРТТСЕ1УЕТ08РАТЕ8Е8РОЕЕАТЕ8СЕА808У88УЕА\УУ00
КРООАРЕЕЫУРА8КЕАТ01РАЕР80808СТРРТЕТ188ЕЕРЕРРАУУУСООЕЕТЕООО
ТКУЕ1К
Зрелая аминокислотная последовательность У\ 3С7-3А3 (последовательность № 58), исключая сигнальный пептид:
ΕΐνΕΤΟ8ΡΑΤΕ8Ε8Ρ(3ΕΕΑΤΕ8ΕΕΑ8Ο8ν88ΥΕΑ\νΥΟΟΚΡθΟΑΡΚΕΕΙΥΡΑ8ΝΕΑΤθΙΡ
АЕР8О8О8ОТРЕТЕТ188ЕЕРЕРЕАУУУС00ЕЕТР(30ОТКУЕ1К
СРЕ1 Уь ЗС7-ЗАЗ (последовательность № 59): ΕΑ8Ο8Υ88ΥΕΑ
СРЕ2 Уь ЗС7-ЗАЗ (последовательность № 60): ΡΑ8ΝΚΑΤ
СРЕЗ Уь ЗС7-ЗАЗ (последовательность № 61): ООЕЕТ
Нуклеотидная последовательность УН 2О3-1Р5-2А9 (УН3, локус ОгрЬ-С16; Ш3) (последовательность № 62):
а1££а£т^8с1£а£с1£££Ес1сси§Е£с1а1аЕаааа§£1£1сса£Ша££11са£с18§1§са§1с1£££8£а£8сЕ§£1 аса1сс1ё§§§ёё1ссс1§а§ас1с1сс1ё1§с১с1с1§ёаЕсассЕса§1аас1а1§с1а1§сас1ёёё11с§сс১с1ссаё§ ааа১1с1§§а§1§§§1а1саас1аЕ§§1ас1§§1§§1§§сасассс1а1§са§ас1сс§1§а১§сс§сЕсасса1с1сса§а§ асаа1§ссаа§аас1сс11§1а1сЕсааа1§ааса§сс1§а§а§сс§а§§аса1§§с1§1§1аЕас1§1§сайаа§1§с1Ш§а1§1с
1§§§§сса১§асаа1§ё1сасс§1с1сЕса§сс1ссасса১§ссса1с§§1сЕссссс1§§сас Аминокислотная последовательность УН 2О3-1Р5-2А9 (последовательность № 63), включая сигнальный пептид:
МЕРУЕЗ\УУЕЕУА1Е1<ОУССЕУСЕУСЗСССЕУНРСОЗЕЕЕЗСАОЗОТТРЗКТАМН\УУ
ΕΟΑΡΟΚΟΕΕ\νν8ΤΙθΤΟθθΤΡΥΑΡ8νΚΟΕΓΤΙ8ΕΡΝΑΚΝ8ΕΥΕΟΜΝ8ΕΕΑΕΡΜΑνΥ
УСАЬ8АГРУ\У(ЗОСгТМУТУ88А8ТКСгР8УЕРЕА
Зрелая аминокислотная последовательность УН 2О3-1Р5-2А9 (последовательность № 64), исключая сигнальный пептид:
- 38 026990
ЕУ0ЕУ08ОООЕУНРОС8ЕЕЕ8САО8ОГТР8РСРАМН\УУЕ0АРОКОЕЕ\УУ8ТЮТСОО
ΤΡΥΑΡ8νΚΟΚΡΤΙ8ΚΡΝΑΚΝ8ΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΜΑνΥΥΕΑΕ8ΑΡΡν\νθΟθΤΜντν
ЗЗАЗТКОРЗУРРЬА
СРЕ1 Ун 2РЗ-1Р5-2А9 (последовательность № 65): ΝΥΑΜΗ
СРЕ2 Ун 2РЗ-1Р5-2А9 (последовательность № 66): ТЮТОСОТРУАР8 УКО
СРЕЗ Ун 2РЗ-1Р5-2А9 (последовательность № 67): 8АРРУ Нуклеотидная последовательность УН 1Е6-3Р10 (УН3, локус 3-33; ГН4) (последовательность № 68):
А(§§аёШдРдс(ёа§с(§§§т(ссй§й§с(а(аиааааёё(ё(сса§(§(§адёЕса§с(§§(§са§(с(§§§§§а§§сЕддР аса(ссР§§§§§§(ссс(§а§ас(с(сс(§(§с১с(с(§§айсассйса§(а§с(а(§с1а(§сас(§§§йс§сс১с(сс১ ааа১(с(§§а§(§§§1а(са§с(аП§§(ас(§§(§§йасаса(ас(а1§1а§ас(сс§(§а১§сс§аПсасса(с(сса§а§а саа(§ссаа§аа§(ссЕ§1а(сйсааа(§ааса§сс(§а§а§сс§а§§аса1§§с(§(§(айас(§Р§саа§а§а§сс§РШ:ас§а (аШР§ас(д§ЕаЕсссса(асШ§ас(ас(§§§§сс১§аассс(§Цсасс§(с(сс(са§сс(ссасса১ёссса(с§Цс
Ессссс(§§сас
Аминокислотная последовательность УН 1Е6-3Р10 (последовательность № 69), включая сигнальный пептид:
МЕРУР8\¥УРРУА1РКОУрСЕУрРУр8ОООРУНРОО8РКР8САО8ОРТР88уАМНА'У
ΚΟΑΡΟΚΟΕΕλνν8ΑΙθΤΟΟΥΊΎΥνΡ8νΚθΚΓΤΙ8ΚΡΝΑΚΚ8ΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΜΑν
УУСАЕЕРРУР1ЕТОУ8РУРРУ\УОООТЕУТУ88
Зрелая аминокислотная последовательность УН 1Е6-3Р10 (последовательность № 70), исключая сигнальный пептид:
ЕУ0ЕУ08ОООЕУНРОО8ЕЕЕ8САО8ОРТР88УАМНАУУЕ0АРОКОЕЕ\УУ8АЮТООУ
ΊΎΥνΡ8νΚΟΕΡΤΙ8ΕΡΝΑΚΚ8ΕΥΕΟΜΝ8ΕΕΑΕΡΜΑνΥΥΟΑΕΕΡΡΥΡΙΕΤΟΥ8ΡΥΡΡΥ
ХУОрОТЬУТУЗЗ
СРЕ1 Ун1Е6-ЗР10: (последовательность № 71Ρ8ΥΑΜΗ
СРЕ2 Ун 1Е6-ЗР10 (последовательность № 72): АЮТООУТУУУРЗУКО
74):
СРЕЗ Ун 1Е6-ЗР10 (последовательность № 73): ΕΡΓΥΡΙΕΤΟΥ8ΡΥΡΡΥ Нуклеотидная последовательность УН 5С3-2-3Р6 (УН3, локус 3-33; Ш2) (последовательность №
А(§даиШдддс(§а§с(§ии(Шсс(с§йяс(сШ(ааиаяи(я(ссаи(и(с১(§саис(дя(ддаи(с(иёё§§аддс§(и §1сса§сс(§§§а§§(ссс1:§а§ас(сРсс(§(§са§с§(с(§§ай:сассПса§Ра§с(а(ааса(§сас(§§§(сс§сс১с(сс ১са১§§с(§§а§(§§§(§§са§йа(а1§§1а1§а(§§аа§(аа(ааа1асРа(§§а§асРсс§1§а১§сс§айсассаРс( сса§а§асаайссаа§аасас§с(§(а(с(§саааЦааса§сс(§а§а§сс§а§§асас§дс(Цд(айас(Ц§с§а§а§аад а§с(§§§§а(с§§§(§§(асПс§а(с(с1:§§§§сс§(§§сассс1:§§1:сас(§(с(сс(са§сс(ссасса১§ссса1:с§§(сЕс сссс(££сас
Аминокислотная последовательность УН 5С3-2-3Р6 (последовательность № 75), включая сигнальный пептид:
МЕРОРЗ\УУРРУАРРЕОУ9СрУ(ЩУЕЗОООУУ9РОЕЗРЕРЗСАА8ОРТРЗЗУЫМН\У νΚ0ΑΡΟΚΟΕΕ\ννΑνΐλνΥΡΟ8ΝΚΥΥΟΡ8νΚθΚΓΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΕΥΕ0ΜΝ8ΕΚΑΕΡΤ А V У УС А Е ΕΕίΟΙΟΑΥ Е Ρ ίΑ С ЕСТБ УТ У8 8
Зрелая аминокислотная последовательность УН 5С3-2-3Р6 (последовательность № 76), исключая сигнальный пептид:
- 39 026990
0У0РУЕ8ОООУУ0РОЕ8РЕР8САА8ОГТГ88У^ЩУУЕ0АРОКОРЕ\УУАУ1\УУРО
8ΝΚΥΥθΡ8νΚθΚΡΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΤΑνΥΥΕΑΚΕΕΕΟΙθ\νΥΡΡΕ\νθ
ЕОТРУТУ88
СРЕ1 Ун 5СЗ-2-ЗР6 (последовательность № 77): 8ΥΝΜΗ
СРЕ2 Ун 5СЗ-2-ЗР6 (последовательность № 78): νΐλ¥ΥΡΟ8ΝΚΥΥΟΡ8νΚθ
СРЕЗ Ун 5СЗ-2-ЗР6 (последовательность № 79): ЕЕБСЛСРААТРБ Нуклеотидная последовательность УК УЕ 5С3-2-3Р6 (УК1, локус Ь18; Ж5) (последовательность №
80):
А1ддаса1даддд1ссссдс1садс1сс1ддддсйс1дс1дс1с1ддс1сссадд1дссада1д1дсса1ссадйдасссад1с1сс а1сс1ссс1д1с1дса1с1д1:аддадасадад1:сасса1:сасйдссдддсаад1садддсаЕадсад1дсШадсс1дд1а1садса дааассадддааадс1сс1аадс1сс1да1с1а1да1дсс1ссадШддааад1дддд1ссса1сааддисадсддсад1дда1с1д ддасадаШсас1с1сасса1садсадсс1дсадсс1даада1Шдсаасиаиас1д1саасадШаа1адиассс1сасисддсс аадддасасдас1ддадаиааасдаас1д1ддс1дсасса1с1д1сиса1сисссдсса1с1да1дадсадидааа1с1ддаас1д сс!с1дйд1д1дсс1дсаадддс
Аминокислотная последовательность УЕ УК 5С3-2-3Р6 (последовательность № 81), включая сигнальный пептид:
МРМЕУРА0РРОРРРР\¥РРОАЕСАЮРТ08Р88Р8А8УОРЕУТ1ТСЕА80О188АРА\¥
ΥΟΟΚΡΟΚΑΡΚΡΡΙΥΡΑ88ΡΕ8θνΡ8ΕΡ8θ8θ8θΤΡΡΤΡΤΙ88ΡΟΡΕΡΡΑΊΎΥ€ΟΟΡΝ8Υ
РНРО()ОТКРЕ1К
Зрелая аминокислотная последовательность УЕ УК 5С3-2-3Р6 (последовательность № 82), исключая сигнальный пептид:
АЮРТ08Р88Р8А8УОРЕУТ1ТСЕА80О188АРА\УУ00КРОКАРКРР1УРА88РЕ8ОУР 8 ЕР 8О8О8ОТРРТЬТ18 δΡΟΡΕΡΡΑΊΎΥΟΟΟΡΝδΥΡΗΡΟΟΟΤΕΡΕΙΚ
СРЕ1 Уь 5СЗ-2-ЗР6 (последовательность № 83): ΕΑ80ΟΙ88ΑΡΑ
СРЕ2 Уь 5СЗ-2-ЗР6 (последовательность № 84): РА88РЕ8
СРЕЗ Уь 5СЗ-2-ЗР6 (последовательность № 85): ΟΟΓΝ8ΥΡΗ Нуклеотидная последовательность УН 5Ώ12-5Ο1 (УН3, локус 3-33; Ш2) (последовательность № 86):
А1ддадШдддс1дадс1дддШ1сс1сдйдс1сШ1аададд1д1ссад!д1садд1дсадс1дд1ддад1с1дддддаддсд1д д1ссадсс1дддадд1ссс1дадас1с1сс1д1дсадсд1с1ддайсассйсад1адс1а!ддса1дсас1ддд1ссдссаддс1сс аддсааддддс1ддад1ддд1ддсадйа1а1дд1а1да!ддаад1аа1ааа1ас1а1дсадас1ссд1даадддссдайсасса1с1 ссададасаайссаадаасасдс1д1а1с1дсааа1даасадсс1дададссдаддасасддс1д1д1айас1д1дсдададдсс сссс1сдд1асйсда1с1с1ддддссд!ддсассс1дд1сас1д1с1сс1садсс1ссассаадддссса1сдд1сйссссс1ддса с
Аминокислотная последовательность УН 5Ώ12-5Ο1 (последовательность № 87), включая сигнальный пептид:
МЕРОР8\УУРРУАРРЕОУрСрУрРУЕ8ОООУУрРОЕ8РЕР8САА8ОРТР88ХОМН\У νΕΟΑΡΟΚΟΡΕ\ννΑνΐ\νΥΡθ8ΝΚΥΥΑΡ8νΚθΕΡΤΙ8ΕΡΝ8ΚΝΤΡΥΡΟΜΝ8ΡΕΑΕΡΤ
ΑνΥΥϋΑΕΟΡΡΕΥΡΡΡλνΟΕΟΤΡντνδδ
Зрелая аминокислотная последовательность УН 5Ώ12-5Ο1 (последовательность № 88), исключая сигнальный пептид:
- 40 026990
0У0ЕУЕ8ОООУУ0РОК8ЕКЕ8САА8ОРТР88УОМН\¥УК0АРОКОЕЕ\¥УАУ1\¥УРО
8ΝΚΥΥΑΡ8νΚθΚΡΤΙ8ΚΡΝ8ΚΝΤΕΥΕΟΜΝ8ΕΚΑΕΡΤΑνΥΥ€ΑΚθΡΡΚΥΡΡΕ\νθΚΟΤ
ЕУТУЗЗ
СРК1 Ун 5Р12-5О1 (последовательность № 89): 8ΥΟΜΗ
СРК2 Ун 5Р12-5О1 (последовательность № 90): νΐλ¥ΥΡΟ8ΝΚΥΥΑΡ8νΚΟ
СРЕЗ Ун 5Р12-5О1 (последовательность № 91): ΟΡΡΚΥΡΡΕ
Для справки аминокислотные последовательности предложенных соответствующих последовательностей стволовых клеток (определенные без ущерба для чьих-либо прав) следующие.
Линия стволовых клеток Ь6 (последовательность № 92):
ΕΐνΕΤρδΡΑΤΕ3Ε3ΡΟΕΚΑ.ΤΕ3€ΚΑ3ρ3ν8δΥΕΑ\νΥ<3ΡΚΡθρΑΡΚΕΕΙΥΡΑ3ΝΚΑΤΟΙΡ
ΑΚΡ3Ο3Ο3ΟΤΡΡΤΕΤΙ33ΕΕΡΕΡΡΑνΥΥες)ρΚ.3Ν\νΡ
Линия стволовых клеток Ь4 (последовательность № 93):
ΑΙΟΙΥΙ'Ο8Ρ88Ι.8Α8ν(ιΡ)ΡνΊ'Π'('ΡΑ8Ο(Π88ΑΙ.Α\'νΥΟΟΚΡ(ιΚΑΡΚΙ.Ι.ΙΥΡ)Α88Ι.Ρ8(ινΡ8Ρί'8(ι
8С8СТРРТЪ !/88/. ΟΡΡΙΡΛ /ΎΥΡΟΟΡΝ8ΥΡ
Линия стволовых клеток Ь15 (последовательность № 94):
Р^МТд8Р88Ь8А8ГСВКУТ1ТСКА^С188тЛ№ддКРЕКАРК8ГЖАА88Ьд8СУР8КР8 (Α8(ι8(ιΤΓ)ΡΤΙ.Τ/88/.ΟΡΕΡ)ΡΑΤΥΥ(ΑΟΟΥΝ8ΥΡ
Линия стволовых клеток УН 3-33 (последовательность № 95):
О Е(9/. νΐ·:8(ΚΡΑΑΥΡΡ(ίΡ8Ι.ΡΙ.8('ΑΑ8(ΡΊΊ·38Υ(',Ρ1Η\ννΡΟΑΡ(ίΚ(Η.ΙΑννΑ νΐΨΥϋΟ8ΝΚΥ ΥΑΙ)8νΚΡΡ1Α18ΡΙ)Ρ8ΚΝΊΊ.ΥΙΌΡΙΝ8Ι.ΡΑΕΙ)ΊΑνΥΥ(ΑΡ
Линия стволовых клеток ОгрЬ-С16 (последовательность № 96):
ЕУрЕУ93еООЕУНРООЗЕКЕЗСА<ЗЗОРТР88УАМН\УУК.9АРОКОЕЕ\УУ
3ΑΙΟΤΟΟΟΊΎΥΑΡδνΚΟΚΡΤΙ3ΚΡΝΑΚΝ8ΡΥΕ(2ΜΝ3ΡΚΑΕΡΜΑνΥΥΟΑΚ
Выравнивание последовательностей Ун и УН против предложенных соответствующих последовательностей стволовых клеток показано на фиг. 5 только в иллюстративных целях.
Пример 8.
АПК-нацеленный вакцинный конъюгат 3О9-ЗНСО.
Вакцинный конъюгат против РЕС-205 получен связыванием антигена ЗЬСО с НиМаЬ 3Ο9-2Ό2 (которое, согласно определению, перекрестно реагирует с РЕС-205 макак-крабоедов) из приведенного выше примера 7. Связь создана путем ковалентного присоединения антигена к тяжелой цепи антитела генетическим слиянием.
Создана плазмида, содержащая гены редуктазы неомицина и дигидрофолата, а также последовательность, кодирующую ЗЬСО, слитую с тяжелой цепью домена СН3 антитела 3Ο9-2Ό2 и легкой цепью 3Ο9-2Ό2. Полученный плазмидный конструкт трансфицирован в клетки СНО с использованием стандартного протокола (Р1адеп Ιηο·, Валенсия, штат Калифорния). Трансфицированные клетки отобраны в среде, содержащей антибиотик О418. После отбора клетки клонированы путем серийных разведений, и стабильные клональные линии использованы для создания банка клеток для дальнейших исследований. Для подтверждения экспрессии конструктов 3О9-ЗНСО проведен анализ белков путем вестерн-блоттинга с использованием электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Установлено, что гибридный белок имеет ожидаемую молекулярную массу и соответствующую сборку (т.е. содержит тяжелую гибридную цепь и легкую цепь). А именно, вакцинный конъюгат и антитело анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и выявляли с помощью вестерн-блоттинга. Затем блот анализировали с помощью зондов отдельно с использованием козьих антител к человеческому !дО и моноклональным антителом (ϋδ Вю1одша1з), специфичным к С-концевому пептиду ЗЬСО. Результаты подтверждали, что трансформированные клетки СНО специфически экспрессируют вакцинный конъюгат 3О9-ЗНСО, что доказывали соответствующий размер и гибридный продукт.
Пример 9.
Антигенспецифическая активность с использованием АПК-нацеленного вакцинного конъюгата 3О9-ЗНСО.
Клетки, способные представлять антиген, имели человеческое происхождение и отличались от мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), моноцитов (ТНР-1), В-лимфобластоидных клеток (С1Р.А2, 1518 В-ЕСЕ) и ДК-производных моноцитов. Все клетки были положительны на экспрессию
- 41 026990
ЭЕС-205 на поверхности, что подтверждено с помощью флоуцитометрии.
Вектор рк: 3Ο9-1ιί'.Όβ трансфицировали в клетки СНО. Стабильные клоны отбирали с использованием 0418 и затем субклонировали. Гибридный белок, вырабатывающийся клетками (вакцинный конъюгат 309-НС0; пример 8), собирали в надосадочной жидкости и очищали в колонке с протеином А.
Т-лимфоциты получали из лейкоцитарной массы здоровых доноров. Антигенспецифические Тлимфоциты получали ίη νίΐΓο после 2-3-недельной стимуляции аутологичными ДК, нацеливание на которые осуществлялось с помощью 3Ο9-1ιί'.Όβ, и обогащенными Т-лимфоцитами СЭ8 и СЭ4, до исследования на специфичность к антигену с использованием ряда АПК (как описано выше) с помощью иммуноферментного спот-анализа с 0γΒ или ИФН γ (МаЬТесЬ). Для поддержания деления эффекторов и активности каждые 3-4 суток добавляли ИЛ-7 и ИЛ-2. Антигенспецифические Т-лимфоциты культивировали на наборе для культивирования Т-лимфоцитов МП!епу1-МАС8 в течение 10-12 суток в присутствии малых доз ИЛ-2. Для стимуляции созревания ДК использовали СЭ40Ь (А1ех18 БюсЬепнсаЛ). Как показано на фиг. 9А, ответы Т-лимфоцитов СЭ8 получены в ДК и моноцитах (ТНР-1), а также Влимфобластоидных клетках (фиг. 9В). Соответственно нацеливание антигена с участием рецептора ЭЕС205 на В-лимфоцитах приводило к стимуляции Т-лимфоцитов, рестриктированных по классу I ГКГС.
Эквиваленты
Специалисты в данной области узнают или смогут установить, используя исключительно стандартные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов настоящего изобретения, рассмотренных в настоящем документе. Такие эквиваленты предназначены для включения в объем следующих пунктов формулы изобретения.
- 42 026990
Перечень последовательностей <110> СЕЛЛДЕКС ТЕРАПЬЮТИКС ИНК.
<120> АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ КЛЕТКОЙ ОЕС-205 <130> СОЗ-346РС <140> РСТ/1152008/082745 <141> 2008-11-07 <150> 61/002,253 <151> 2007-11-07 <150> 61/191,551 <151> 2008-09-10 <160> 106 <170> Ра!еп!1п уегзтоп 3.5 <210> 1 <211> 1722 <212> БЕЛОК
<213> Ното зартепз
<400> 1
Ме! Агд тНг С1у тгр А1а ТНг Рго Агд Агд РГО А1а с1у 1_еи ьеи Ме!
1 5 10 15
Ьеи Беи РНе тгр РНе РНе Азр Ьеи А1а С1и РГО Бег с1у Агд А1а А1а
20 25 30
АЗП Азр Рго РНе ТНг Пе Уа1 нт 5 С1у Азп ТНг С1у ьуз Суз Пе 1-У5
35 40 45
РГО \/а1 Туг С1у тгр Не Уа1 А1а Азр Азр Суз Азр С1и тНг С1и Азр
50 55 60
Ьуз ьеи Т гр ьуз Тгр Уа1 Бег С1 η НТ 5 Агд 1.еи РНе НТ 5 1.еи нт 5 Бег
65 70 75 80
С1п ьуз Суз ьеи С1у ьеи Азр 11е тНг ьуз Бег Уа1 Азп с1и 1_еи Агд
85 90 95
Ме! РНе Бег Суз Азр Бег Бег А1а ме! |_еи Тгр тгр ьуз Суз С1и Нт 5
100 105 110
НТ 5 Бег Ьеи Туг С1у А1а Αΐ а Агд Туг Агд ьеи А1а Ьеи ЬУ5 Азр С1у
115 120 125
Нт 5 С1у ТНг А1а Пе Бег А5П А1а Бег Азр Уа1 Тгр ьуз ЬУЗ С1у С1у
130 135 140
Бег С1и С1и Бег Ьеи СУ5 Азр С1 η РГО Туг НТ 5 С1и 11 е Туг тНг Агд
145 150 155 160
А5р С1у Азп Бег Туг С1у Агд Рго Суз С1и РНе Рго РНе 1_еи Пе Азр
165 170 175
С1у тНг Тгр НТ 5 НТ 5 Азр СУ5 Пе Ьеи Азр с!и Азр Нт 5 Бег С1у Рго
180 185 190
Тгр Суз А1а ТНг ТНг Ьеи АЗП туг С1и туг Азр Агд Ьуз Тгр О1у Пе
195 200 205
СУ5 Ьеи ьуз Рго С1и АЗП С1у Суз С1и Азр АЗП Т гр 01 и ьуз Азп 01 и
210 215 220
Οίη РЬе С1у зег Суз Туг С1п РЬе Азп ТЬг О1п ТЬг А1а Ьеи Зег тгр
225 230 235 240
ЬУ5 С1и А1а Туг Уа1 зег Суз С1п А5П О1п С1у А1а Азр Ьеи ьеи Зег
245 250 255
Пе АЗП Зег А1а д!а 01 и ьеи ТНг Туг Ьеи Ьуз О1и ьуз С1и С1у Пе
260 265 270
А1а 1_уз 11е РЬе Тгр Пе С1у Ьеи АЗП О1п ьеи Туг Зег А1а Агд С1у
275 280 285
Тгр 01 и Тгр Зег Азр НТ 5 ьуз РГО Ьеи Азп РЬе Ьеи АЗП тгр Азр РГО
290 295 300
Αδρ Агд РГО зег А1а рго ТНг Пе С1у 01 у Зег Зег суз А1а Агд мег
305 310 315 320
Азр а! а с!и 5ег О1у Ьеи Тгр 01п зег Рпе Зег Суз 01 и а! а 01 п Ьеи
325 330 335
РГО туг Уа1 Суз Агд ьуз РГО ьеи А5П АЗП тЬг Уа! С1и Ьеи тКг Азр
340 345 350
Уа1 тгр ТНг Туг 5ег Азр ТНг Агд Суз АЗР А1а 01 у тгр ьеи Рго АЗП
355 360 365
Азп 01 у РЬе СУ5 туг Ьеи ьеи Уа1 АЗП 01 и Зег Азп Зег Тгр Азр ьуз
370 375 380
А1а Нт 5 А1а ьуз Суз ьуз Αΐ а Рпе Зег Зег Азр Ьеи 11 е 5ег Пе НТ 5
385 390 395 400
Зег Ьеи А1а Азр уа! С1и Уа! Уа1 Уа1 тпг ьуз Ьеи НТ 5 АЗП 01 и АЗр
405 410 415
Пе Ьуз С1и о!и Уа1 Тгр Пе 01 у Ьеи Ьуз АЗП Пе Азп Пе Рго тЬг
420 425 430
Беи Р(те С1п Тгр 5ег Азр С1у тЬг С1и Уа! ТНг ьеи тпг Туг Тгр Азр
435 440 445
01 и Азп 01 и Рго А5П Уа1 Рго Туг АЗП ьуз ТНг РГО А5П Суз Уа1 Зег
450 455 460
Туг Ьеи 01 у с! и Ьеи С1у 01 п тгр ьуз Уа! С1п Зег суз 01и с!и ьуз
- 44 026990
465 470 475 480
Ьеи ьуз туг 7а1 Суз ьуз Агд ьуз С1у с1и Ьуз ьеи Азп Азр А1а 5ег
485 490 495
5ег Азр ьуз Мет Суз Рго РГО АЗр С1 и С1у Т гр ьуз Агд НТ 5 С1у С1и
500 505 510
тНг СУ5 туг ЬУ5 11е Туг С1 и АЗр С1и Уа1 РГО рНе С1у ТНг АЗП Суз
515 520 525
АЗП ьеи тНг 11 е тНг 5ег Агд РНе С1и С1п С1и туг ьеи Азп Азр Ьеи
530 535 540
мег ьуз ьуз туг Азр ьуз 5ег ьеи Агд ьуз Туг рНе тгр ТНг С1у Ьеи
545 550 555 560
Агд Азр уа! Азр 5ег Суз С1у с1и туг АЗП Тгр А1а тНг Уа1 С1у С1у
565 570 575
Агд Агд Агд а! а Уа1 ТНг РНе 5ег АЗП Тгр АЗП рНе ьеи С1и Рго а! а
580 585 590
5ег РГО С1у с! у Суз ν3ΐ а! а мет 5ег тНг С1у ьуз 5ег Уа1 С1у ьуз
595 600 605
тгр С1и Уа1 ьуз Азр суз Агд 5ег РНе ьуз А1а ьеи 5ег 11е Суз ьуз
610 615 620
Ьуз Мет 5ег С1у РГО ьеи С1у Рго С1и С1 и А1а 5ег Рго Ьуз Рго Азр
625 630 635 640
Азр Рго Суз Рго С1и С1у Тгр С1п 5ег РНе РГО А1а 5ег ьеи 5ег Суз
645 650 655
туг ьуз Уа1 РНе НТ 5 А1а С1и Агд 11 е Уа1 Агд ьуз Агд АЗП Тгр С1и
660 665 670
С1и а! а С1и Агд РНе Суз С1п А1а ьеи С1у А1а НТ 5 Ьеи 5ег 5ег РНе
675 680 685
5ег НТ 5 Уа1 Азр С1и Не Ьуз С1и рНе ьеи НТ 5 РНе ьеи тНг А5Р С1п
690 695 700
рНе 5ег С1у с!п НТ 5 Тгр Ьеи Тгр 11е С1у Ьеи АЗП Ьуз Агд 5ег Рго
705 710 715 720
А5Р ьеи С1 η С1у 5ег Тгр С1п Тгр 5ег Азр Агд тНг рго Уа1 5ег ТНг
725 730 735
11е Не мет Рго АЗП С1 и рНе С1п С1п Азр Туг Азр 11 е Агд Α5Ρ Суз
740 745 750
а! а а! а Уа1 Ьуз Уа1 РНе НТ 5 Агд Рго Тгр Агд Агд с1у Тгр НТ 5 РНе
- 45 026990
755 760 765
Туг Азр Азр Агд С1и РЬе Не Туг ьеи Агд Рго РЬе А1а суз Азр тЬг
770 775 780
ьуз ьеи б! и тгр Уа1 су 5 С1 η 11е Рго ьуз С1у Агд тЬг РГО ьуз тЬг
785 790 795 800
РГО Азр Тгр туг Азп Рго Азр Агд А1а С1у Пе НТ 5 С1у РГО Рго Ьеи
805 810 815
Пе Пе С1и С1у Зег е!и Туг Тгр РЬе Уа1 А1а Азр Ьеи Нт 5 ьеи А5П
820 825 830
туг С1и С1 и а1 а Уа1 ьеи Туг Суз А1а зег АЗП Нт 5 Зег РЬе ьеи А1а
835 840 845
тЬг Пе ТЬг Зег РЬе Уа1 С1у Ьеи ьуз А1а Пе ьуз АЗП ьуз ίί е А1а
850 855 860
Азп Пе Зег С1у А5р С1у С1 η ьуз Тгр тгр Пе Агд Не Зег С1 и тгр
865 870 875 880
Рго Пе Азр Азр НТ5 РЬе тЬг Туг Зег Агд туг РГО тгр НТ 5 Агд РЬе
885 890 895
Рго Уа1 ТЬг РЬе С1у С1и С1 и суз ьеи Туг мет Зег А1а ьуз ТЬг тгр
900 905 910
ьеи 11 е Азр ьеи С1у ьуз Рго ТЬг Азр Суз зег тЬг Ьуз ьеи Рго РЬе
915 920 925
11е суз С1 и ьуз Туг АЗП Уа1 Зег зег ьеи С1и ьуз Туг Зег РГО Азр
930 935 940
Зег А1а Αΐ а ЬУ5 Уа1 С1п суз зег С1и с1п тгр 11 е РГО РЬе с1п Азп
945 950 955 960
ьуз суз РЬе Ьеи ьуз 11е ьуз РГО Уа1 Зег ьеи ТЬг РЬе Зег С1п А1а
965 970 975
Зег Азр тЬг Суз Нтз Зег туг С1у С1у ТЬг ьеи рго Зег Уа1 ьеи Зег
980 985 990
С1п Пе с!и с!п Азр РЬе 11е тЬг зег ьеи Ьеи Рго А5р меб С1и А1а 995 1000 1005
тЬг ьеи 1010 тгр Пе с1у Ьеи Агд 1015 тгр тЬг А1а туг С1и 1020 ьуз Пе Азп
ьуз тгр тЬг А5р АЗП Агд С1и ьеи тЬг Туг Зег АЗП РЬе нт 5 Рго
1025 1030 1035
Ьеи ьеи Уа1 Зег С1у Агд Ьеи Агд Пе РГО С1и АЗП РЬе РЬе С1и
1040 1045 1050
С1и б!и Бег Агд туг нт 5 Суз 1060 А1а Ьеи Пе ьеи АЗП 1065 ьеи б!п ьуз
1055
Бег РГО РКе тКг б1у тКг Тгр АЗП РКе тКг Бег Су5 Бег б1и Агд
1070 1075 1080
НТ 5 РКе Уа1 Бег Ьеи суз 61 п ьуз туг Бег б!и Уа1 ьуз Бег Агд
1085 1090 1095
6ΐη ТКг ьеи б!п Азп а! а Бег б!и тКг Уа1 ьуз туг Ьеи АЗП Азп
1100 1105 1110
ьеи Туг ьуз 11 е Пе Рго Ьуз тКг Ьеи тКг тгр НТ 5 Бег а! а Ьуз
1115 1120 1125
Агд б1и Суз ьеи Ьуз Бег АЗП мет б!п ьеи Уа1 Бег Пе ТКг Азр
ИЗО 1135 1140
РГО Туг 6ΐη б1п А1а р|те Ьеи Бег Уа1 б1п а! а Ьеи Ьеи Нт 5 АЗП
1145 1150 1155
Бег Бег Ьеи Тгр Пе С1у ьеи РКе Бег б!п Азр Азр 61 и Ьеи АЗП
1160 1165 1170
РКе б!у Тгр Бег Азр С1у Ьуз Агд Ьеи НТ 5 РКе Бег Агд Тгр а! а
1175 1180 1185
б!и ТКг АЗП б!у б!п ьеи б1и Азр Суз Уа1 Уа1 ьеи Азр ТКг Азр
1190 1195 1200
б1у РКе т гр ьуз тКг Уа1 Азр Суз АЗП Азр Азп б1п Рго 61 у А1а
1205 1210 1215
Пе Суз туг туг Бег б!у АЗП б!и тКг б1и 61 и Уа1 Ьуз Рго
1220 1225 1230
Уа1 Азр Бег Уа1 ьуз Суз Рго Бег Рго Уа1 ьеи АЗП тКг РГО тгр
1235 1240 1245
Пе Рго РКе б1п АЗП Суз Суз туг Азп РКе Пе Пе тКг ьуз Азп
1250 1255 1260
Агд НТ 5 мет А1а тКг тКг 61 η Азр 61 и Уа1 НТЗ ТКг 1-У5 суз 61 п
1265 1270 1275
1_У5 ьеи Азп Рго ьуз Бег НТ 5 Пе Ьеи Бег Пе Агд АЗр б!и ьуз
1280 1285 1290
б1и АЗП АЗП РКе Уа1 Ьеи 61 и 61 п ьеи ьеи туг РКе АЗП туг мет
1295 1300 1305
А1а 5ег Тгр Уа1 мет Ьеи б!у Пе тКг туг Агд АЗП АЗП Бег ьеи
- 47 026990
1310 1315 1320
ме! тгр 1325 РНе Αδρ ьуз тНг рго 1330 ьеи Бег туг ТНг НТ δ 1335 Тгр Агд А1а
с!у Агд 1340 РГО ТНг 11е ьуз Αδη 1345 С1и ьуз рНе ьеи А1а 1350 с1у Ьеи Бег
τΗ г Αδρ 1355 с1у РНе тгр Αδρ Не 1360 С1п ТНг РНе ьуз Уа1 1365 11е С1и С1и
А1а Уа1 1370 туг РНе НТ δ С1п Нт δ 1375 Бег Не ьеи А1а суз 1380 Ьуб Не С1и
ме! Уа1 1385 Αδρ Туг ьуз С1и С1и 1390 Нт δ ΑδΠ тНг тНг Ьеи 1395 Рго С1η РНе
мег РГО 1400 Туг С1и Αδρ С1у Не 1405 Туг Бег \/а1 Не С1п 1410 ίνδ ίνδ Уа1
тНг Тгр 1415 туг С1и Αΐ а Ьеи ΑδΠ 1420 мет СУ5 Бег С1п Бег 1425 С1у С1у нт δ
Ьеи А1а 1430 Бег Уа1 ΗΤδ Αδη С1п 1435 Αδη с1у С1п Ьеи РНе 1440 Ьеи С1и Αδρ
Не Уа1 1445 ьуз Агд Αδρ С1у РНе 1450 Рго Ьеи тгр Уа1 С1у 1455 ьеи Бег Бег
НТ 5 Αδρ 1460 С1у Бег С1и Бег Бег 1465 РНе С1и Тгр Бег Αδρ 1470 с1у Бег тНг
РНе Αδρ 1475 туг Не РГО тгр Ьуз 1480 с!у с!п ТНг Бег рго 1485 с!у ΑδΠ Суз
Уа1 Ьеи 1490 Ьеи Αδρ Рго ЬУЗ С1у 1495 тНг тгр ЬУЗ нт δ С1и 1500 ίνδ σνδ Αδη
Бег Уа1 1505 1-У5 Αδρ С1у А1а Не 1510 суз туг ьуб Рго ТНг 1515 ^уδ Бег ьуз
ьуз Ьеи 1520 Бег Агд Ьеи тНг Туг 1525 Бег Бег Агд Суз РГО 1530 А1а А1а ьуз
с1и А5П 1535 С1у Бег Агд Тгр Не 1540 С1п туг ЬУЗ С1у Нт δ 1545 Суδ Туг ьуз
Бег Αδρ 1550 С1п А1а ьеи Ητδ Бег 1555 РНе Бег С1и А1а ЬУЗ 1560 ίνδ Ьеи Суз
Бег ЬУ5 1565 НТ δ Αδρ НТ δ Бег А1а 1570 тНг 11 е Уа1 Бег Не 1575 ίνδ Αδρ С1и
Αδρ С1и Αδη ЬУЗ РНе Уа1 Бег Агд ьеи мег Агд С1и ΑδΠ Αδη Αδη
- 48 026990
1580 1585 1590
11 е ТНг ме! Агд Уа1 тгр Ьеи С1у ьеи Бег с1п НТ 5 Бег Уа1 Азр
1595 1600 1605
С1п Бег т гр Бег Тгр ьеи Азр С1у Бег С1и Уа1 тНг РНе Уа1 ьуз
1610 1615 1620
Т гр С1 и Азп ьуз Бег ьуз Бег С1у Уа1 С1у Агд Суг Бег ме! кеи
1625 1630 1635
11е Αΐ а Бег АЗП С1и тНг Тгр ЬУЗ Ьуз Уа1 С1и Суз С1и нт 5 С1у
1640 1645 1650
РНе С1у Агд Уа1 Уа1 Суз ьуз Уа1 РГО |_еи С1у РГО Азр туг тНг
1655 1660 1665
А1а 11е Αΐ а 11е 11е Уа1 А1а ТНг 1_еи Бег Пе ьеи \/а1 ьеи ме!
1670 1675 1680
С1у С1у 1_еи 11е тгр РНе Ьеи РНе С1п Агд НТ 5 Агд |_еи НТ 5 Ьеи
1685 1690 1695
а! а С1у РНе Бег Бег \/а1 Агд туг А1а С1п с!у Уа1 Азп с1и Азр
1700 1705 1710
С1и 11е ме! Ьеи РГО Бег РНе НТ 5 Азр
1715 1720 <210> 2 <211> 408 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 2 а!ддад!!!д ддс!дадс!д дд!!!!сс!с д!!дс!с!!! !аададд!д! ссад!д!сад 60 д!дсадс!дд !ддад!с!дд дддаддсд!д д!ссадсс!д ддадд!ссс! дадас!с!сс 120 !д!дсадсд! с!дда!!са! с!!сад!а!с !а!ддса!дс ас!ддд!ссд ссаддсгсса 180 ддсааддддс !ддад!ддд! ддсад!!а!а !дд!а!да!д даад!аа!аа а!ас!а!дса 240 дас!ссд!да адддссда!! сасса!с!сс ададасаа!! ссаадаасас дс!д!а!с!д 300 сааа!дааса дсс!дададс сдаддасасд дс!д!д!а!! ас!д!дсдад адс!сс!сас 360 !!!дас!ас! ддддссаддд аассс!дд!с ассд!с!сс! садс!адс 408 <210> 3 <211> 134 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 3 ме! с!и РНе с1у ьеи Бег тгр Уа1 РНе ьеи Уа1 А1а 1_еи 1_еи Агд С1у 15 10 15
Уа1 С1п Суз С1п Уа1 С1п 1_еи Уа1 С1и Бег С1у б!у С1у Х/а1 Уа1 С1п 20 25 30
- 49 026990
Рго С1у Агд 35 Бег Ьеи Агд Ьеи Бег суз 40 а! а а! а Бег С1у 45 РКе 11 е РКе
Бег Пе Туг С1у мет Нт 5 тгр Уа! Агд С1п А! а Рго С1у ьуз с1у Ьеи
50 55 60
с! и Тгр Уа1 а! а Уа! Пе Тгр туг Азр С! у Бег АЗП Ьуз Туг туг А1а
65 70 75 80
Азр Бег Уа1 ьуз с1у Агд РКе ТКг Пе Бег Агд АЗр АЗП Бег ьуз АЗП
85 90 95
ТКг ьеи Туг Ьеи С1п мет Азп Бег Ьеи Агд а! а С1и Азр тКг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Агд а! а рго Нт 5 РКе Азр туг Тгр С1у С1п С1у тКг
115 120 125
Ьеи Уа! ТКг Уа! Бег Бег
130 <210> 4 <211> 115 <212> БЕЛОК <213> нолю зартепз <400> 4
С1п Уа1 1 С1п ьеи Уа! 5 с!и Бег с!у С1у с!у Уа1 10 Уа! С1п РГО С1у 15 Агд
Бег ьеи Агд ьеи Бег суз Αΐ а а1 а Бег С1у РКе Пе РКе Бег Пе туг
20 25 30
С1у мет нтз тгр Уа! Агд С1п А1а Рго С1у ьуз С1у Ьеи С1и тгр Уа!
35 40 45
а! а Уа! 11е тгр Туг Азр С1у Бег АЗП ьуз туг туг А1а Азр Бег Уа1
50 55 60
ьуз С1у Агд РКе тКг Пе Бег Агд Азр А5П Бег ЬУ5 А5П ТКг ьеи туг
65 70 75 80
ьеи С1п мет АЗП Бег Ьеи Агд А1а С1и Азр тКг Αΐ а Уа1 Туг туг суз
85 90 95
а! а Агд а! а РГО НТ 5 РКе Азр туг тгр С1у Οίη С1у ТКг ьеи уа! тКг
100 105 110
Уа! Бег Бег
115
<210> 5
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Ногтю
- 50 026990 <400> 5
11е Туг с1у Мег Нт 5 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 6
Уа1 IIе Тгр Туг Азр с1у Зег Азп Ьуз туг туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15
С1у <210> 7 <211> б <212> БЕЛОК <213> Ното зартеп5 <400> 7
А1а Рго нтз РЬе Азр туг 1 5 <210> 8 <211> 384 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 8
а!ддда!дда дс!д!а!са! ссьд«ссьс дгддссасад саассддгд! ссасгссдас 60
абссадабда сссадбсбсс а!сс!сас!д ссгдсагсгд ггддадасад адтсассатс 120
аспдгсддд сдадгсаддд гападсадс гддпадссг ддбатсадса дааассадад 180
ааадссссга ад!ссс!да! сбагдсгдса !ссад!!!дс ааадтддддг сссатсаадд 240
Исадсддса дгддагстдд дасадатс астсгсасса гсадсадссг дсадссгдаа 300
датгдсаа спапасгд ссаасадгаг аахадггасс сдьасас!!! гддссадддд 360
ассаадсТдд адагсааасд !асд 384
<210> 9 <211> 129 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 9
ме! Азр мег Агд Уа1 Ьеи А1а С1п ьеи ьеи с1у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи суз
1 5 10 15
рНе Рго С1у а1 а Агд суз Азр 11 е С1п мег тЬг С1п 5ег Рго 5ег зег
20 25 30
ьеи Зег А1а Зег Уа1 с!у Азр Агд Уа1 тЬг 11е ТКг суз Агд Αΐ а 5ег
35 40 45
С1п О1у 11 е 5ег Зег тгр ьеи А1а тгр Туг С1п С1п ьуз Рго С1и ьуз
50 55 60
а! а 65 рго ьуз Бег ьеи Пе Туг А1а 70 А1а Бег Бег ьеи С1п Бег б!у Уа1
75 80
Рго Бег Агд РКе Бег С1у Бег С1у Бег С1у тКг Азр РКе ТКг ьеи тКг
85 90 95
Пе Бег Бег Ьеи С1п Рго С1и Азр РКе А1а тКг Туг Туг Су 5 С1п С1п
100 105 110
туг Азп Бег Туг РГО Туг тКг РКе С1у С1п е1у тКг ьуг Ьеи О1и 11 е
115 120 125
ьуз
<210> 10 <211> 107 <212> БЕЛОК
<213> Ното : 5арт епз
<400> 10
Азр 11 е С1п мет тКг С1п Бег РГО Бег Бег ьеи Бег А1а Бег Уа1 с1у
1 5 10 15
АЗР Агд Уа1 ТКг 11 е тпг Суз Агд Αΐ а Бег С1п С1у Пе Бег Бег тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и ьуз Αΐ а РГО ьуз Бег ьеи Пе
35 40 45
Туг А1а А1а Бег Бег Ьеи С1 п Бег С1у Уа1 Рго Бег Агд РКе Бег С1у
50 55 60
Бег С1у Бег С1у ТКг Азр РКе тКг Ьеи тКг Пе Бег Бег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и А5Р РКе А1а ТКг Туг Туг суз С1п С1п Туг АЗП Бег Туг РГО туг
90 95 тКг РКе с!у 6ΐη с1у тКг ьуг Ьеи с1и 11е Ьуз 100 105 <210> И <211> И <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> И
Агд А1а Бег с1п с1у 11е Бег Бег тгр ьеи А1а 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепБ <400> 12
А1а А1а Бег Бег ьеи с!п Бег
- 52 026990 <210> 13 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 13
С1п С1п Туг Азп Бег Туг рго Туг ТНг 1 5 <210> 14 <211> 439 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 14
аьддадьььд ддсгдадсгд ддтьссьс дЬЕдсссЫТ ьаададдьдь ссадкдгсад 60
дгдсадсгдд ьддадьсьдд дддаддсдгд дхссадссгд ддаддгссс! дадасгсгсс 120
гдгдсадсдг сгддаггса! сььсадьаьс 1а1ддса1дс асьдддгссд ссаддсгсса 180
ддсааддддс 1ддадгдддг ддсадпага хддгагдагд даад!аахаа акасьагдса 240
дасгссдгда адддссдаьг сасса1с1сс ададасаан ссаадаасас дс1д1а1с1д 300
сааагдааса дссгдададс сдаддасасд дс!д!дгагг асгдкдсдад адсьсс1сас 360
тдасгасг ддддссаддд аасссгддгс ассдхсгссг садссгссас саадддссса 420
ьсддисггсс ссскддсас 439
<210> 15 <211> 134 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 15
ме! 1 С1и РНе с!у ьеи Бег тгр 5 Уа1 РНе Ьеи Уа1 10 А1а ьеи Ьеи Агд 15 С1у
Уа1 с1п СУ5 С1п Уа1 с1п Ьеи Уа1 С1и Бег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 С1п
20 25 30
РГО С1у Агд Бег Ьеи Агд Ьеи Бег суз А1а А1а Бег С1у РНе 11е РНе
35 40 45
Бег 11е туг С1у мег Нт 5 тгр Уа1 Агд С1п А1а РГО С1у ьуз С1у Ьеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 А1а Уа1 11е тгр Туг А5р С1у Бег АЗП ьуз туг туг А1а
65 70 75 80
Αδρ Бег Уа1 ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Бег Агд Азр АЗП Бег ьуз АЗП
85 90 95
ТНг ьеи туг Ьеи с1п Меь АЗП Бег ьеи Агд А1а с!и Αδρ тНг А1а Уа1
100 105 110
Туг туг Суз А1а Агд А1а РГО НТ 5 РНе Азр туг тгр С1у С1п С1у тНг
115 120 125
- 53 026990
Ьеи νβΐ тНг \/а1 Бег Бег 130 <210> 16 <211> 115 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепг
<400> 16 Уа1 5 С1и Бег с!у С1у С1у Уа1 10 \/а1 С1п Рго С1у 15 Агд
С1п 1 Уа1 С1п Ьеи
Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1 а А1а Бег с!у РНе Не РНе Бег Не Туг
20 25 30
С1у мет Нт з Тгр Уа1 Агд с1п А1а Рго С1у ьуз С1у ьеи С1и тгр Уа1
35 40 45
А1 а Уа1 Не тгр Туг Азр с!у Бег АЗП ьуз Туг Туг А1а Азр Бег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд рНе ТНг Не Бег Агд Азр АЗП Бег ьуз Азп ТНг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п мет АЗП Бег ьеи Агд А1а с1и А5р тНг Αΐ а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
а! а Агд А! а Рго НТ 5 рНе Азр туг тгр С1у С1п с!у тНг Ьеи Уа1 ТНг
100 105 110
Уа! Бег Бег 115 <210> 17 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепБ <400> 17
11е Туг с1у мет нтз 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 18
Уа1 11е Тгр Туг Азр С1у Бег Азп ьуз Туг Туг А1а А5р Бег Уа1 Ьуз 15 10 15
С1у <210> 19 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз
- 54 026990 <400> 19
А1а Рго Нт 5 РНе Азр туг 1 5 <210> 20 <211> 387 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> 20
атддасатда дддрссссдс тсадсгссгд дддсЕГсТдс 1дс1с1ддс1 сссаддгдсс 60
адагдрдсса гссадпдас ссадгсТсса 1сс1сссгдт срдсагстдг аддадасада 120
дисассатса стгдссдддс аадгсадддс ападсадгд сгиадссгд дгатсадсад 180
ааассаддда аадсгсстаа дсгсстдагс Ратдагдссг ссадтдда аадтддддтс 240
ссагсаадди гсадсддсад 1дда1с1ддд асадатса стсрсасса! садсадсстд 300
садсстдаад аттшдсаас гтаггасгдг саасадТИа атадпассс гстсасигс 360
ддсддаддда ссааддидда дарсааа 387
<210> 21 <211> 129 <212> БЕЛОК
<213> Ното : 5арт епз
<400> 21
мет Азр мет Агд Уа1 Рго а! а οίη ьеи ьеи С1у Ьеи ьеи |_еи Ьеи Тгр
1 5 10 15
ьеи Рго с1у а1 а Агд Суз Αΐ а 11е С1п |_еи тКг С1п Бег Рго Бег Бег
20 25 30
ьеи Бег А1а Бег \/а1 С1у Азр Агд Уа1 тНг 11 е тКг Суз Агд Αΐ а Бег
35 40 45
οίη С1у 11 е Бег Бег А1а Ьеи а1 а Тгр туг С1п С1п ьуз Рго С1у ЬУ5
50 55 60
А1а Рго ьуз Ьеи ьеи 11 е Туг Азр А1а Бег Бег Ьеи С1и Бег С1у Уа1
65 70 75 80
Рго Бег Агд РКе Бег С1у Бег с1у Бег С1у тКг Азр рКе тНг Ьеи ТЬг
85 90 95
Не Бег Бег Ьеи С1п Рго с!и Азр РКе а! а тНг туг туг Суз С1п С1п
100 105 110
рКе Азп Бег Туг Рго Ьеи тКг РКе С1у С1у С1у тНг ьуз Уа1 С1и 11е
115 120 125
Ьуз <210> 22 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз
<400> 22 Бег Бег ьеи Бег А1а Бег Уа1 С1у
А1а 1 Пе С1п Ьеи ТЬг 5 с!п Бег РГО
10 15
Азр Агд Уа1 тКг Пе тЬг Суз Агд а1 а Бег С1п С1у Пе Бег Бег А1а
20 25 30
ьеи А1а Т гр Туг С1п Οίη ьуз РГО С1 у ьуз А1а РГО ьуз Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
Туг Азр А1а Бег Бег Ьеи С1и Бег С1 у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Бег С1у
50 55 60
Бег С1у Бег С1у тЬг Азр Рпе тЬг Ьеи тЬг 11 е Бег Бег ьеи С1п РГО
65 70 75 80
С1и АЗр р|те А1 а тЬг Туг туг Суз С1п с1п Рпе АЗП Бег туг Рго Ьеи
85 90 95
ТЬг РЬе С1у 01у 01у ТЬг ьуз Уа1 с!и Пе ьуз
100 105 <210> 23 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 23
Агд д!а Бег с1п С1у 11е Бег Бег А1а ьеи А1а 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 24
Азр А1а Бег Бег ьеи с1и Бег 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 25
С1п с1п РКе Азп Бег туг Рго ьеи тЬг 1 5 <210> 26 <211> 417 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 26 атддадтттд ддстдадстд ддттттсстс дттдстсттт таададдтдт ссадтдтсад 60 дтдсадстдд тддадтстдд дддаддсдтд дтссадсстд ддаддтссст дадастстсс 120 тдтдсадсдт стддаттсас сттсадтаат татддсатдт астдддтссд ссаддсьсса 180
- 56 026990 ддсааддддс тддадтдддт ддсадттата тддтатдатд даадтаатаа атастатдса 240 дастссдтда адддссдатт сассатстсс ададасаатт ссаадаасас дстдтатстд 300 сааатдааса дсстдададс сдаддасасд дстдтдтатт астдтдсдад адатстстдд 360 ддатддтаст ттдастаттд дддссаддда ассстддтса ссдтстсстс адсТадс 417 <210> 27 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 27
мет 1 С1и РКе С1 у Ьеи 5 Бег тгр Уа1 РКе ьеи Уа1 10 А1а Ьеи Ьеи Агд 15 С1у
Уа1 с! η Суз С1п УаТ с1п Ьеи УаТ С1 и Бег с1у с!у сТу Уа1 Уа1 с!п
20 25 30
РГО с!у Агд Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а Αΐ а Бег С1у РКе тКг РКе
35 40 45
Бег АЗП Туг С1у мет туг тгр Уа1 Агд С1п а! а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи
50 55 60
С1и Т гр \/а1 а! а Уа1 Пе Тгр Туг Агр С1у Бег АЗП Ьуз Туг Туг А1а
65 70 75 80
Азр Бег Уа1 ьуз С1у Агд РКе ТКг Пе Бег Агд Азр АЗП Бег ьуз А5П
85 90 95
тКг ьеи туг ьеи С1п мет АЗП Бег Ьеи Агд А1а С1и Азр тКг А1а Уа1
100 105 110
туг туг суз А1а Агд Азр Ьеи Тгр С1у тгр Туг РКе Азр туг тгр С1у
115 120 125
С1п С1у тКг ьеи Уа1 тКг Уа1 Бег Бег а! а Бег тКг ьуз С1у Рго Бег
130 135 140
Уа1 РКе Рго ьеи а! а
145 <210> 28 <211> 130 <212> БЕЛОК
<213> Ното зартепз
<400> 28
с!п Уа1 с1п ьеи Уа1 с!и Бег С1у СТ у С1у Уа1 Уа1 С1п рго С1у Агд
1 5 10 15
Бег ьеи Агд ьеи Бег Суз А1а А1а Бег С1у РКе тКг РКе Бег АЗП Туг
20 25 30
С1у мет туг тгр УаТ Агд с1п А1а рго С1у ьуз С1у ьеи С1и Тгр УаТ
35 40 45
А1а Уа1 11е тгр Туг Азр С1у 55 Бег Азп Ьуз туг туг 60 А1а Азр Бег Уа1
50
ьуз С1у Агд РНе тНг 11е Бег Агд Азр АЗП Бег ЬУЗ АЗП ТНг ьеи туг
65 70 75 80
кеи С1п ме! АЗП Бег Ьеи Агд А1а е!и Азр ТНг А1а Уа1 Туг туг Суз
90 95
а1 а Агд Азр 1_еи тгр С1у тгр Туг РНе Азр Туг тгр С1у С1п с!у ТНг
100 105 110
ьеи Уа1 тНг Уа1 Бег Бег а! а Бег ТНг ьуз С1у Рго Бег Уа1 РНе РГО
115 120 125
Ьеи А1а 130 <210> 29 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> ното зартепг <400> 29 азп туг с1у ме! туг 1 5 <210> 30 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 30 \/а1 11е Тгр туг Азр С1у Бег Азп Ьуз Туг Туг А1а Азр Бег Уа1 1_уз 15 10 15
С1у <210> 31 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 31
Азр Ьеи Тгр С1у тгр Туг РНе Азр туг 1 5 <210> 32 <211> 384 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> 32 а!ддда!дда дс!д!а!са! сс!д!!сс!с д!ддссасад саассддтд! ссас!ссдаа 60 а!!д!д!!да сасад!с!сс адссассс!д !с!!!д!с!с саддддааад адссассстс 120 !сс!дсаддд ссад!садад !д!!адсадс !ас!!адсс! дд!ассааса дааасс!ддс 180
- 58 026990
ддстсстсат сТаТдаТдса тссаасаддд ссастддсат сссадссадд 240
дтдддтстдд дасадасттс астстсасса тсадсадсст ададсстдаа 300
тттаттастд тсадсадсдт сдсаастддс сдстсасттт сддсддаддд 360
адатсааасд Тасд 384
<210> 33 <211> 127 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 33 мет с!и А1а Рго А1а С1п ьеи Ьеи РНе ьеи Ьеи Ьеи 1_еи Тгр Ьеи Рго 15 10 15
А5Р тНг тНг С1у С1и 11е Уа1 ьеи тНг с!п Бег Рго А1а тНг Ьеи Бег
20 25 30
ьеи Бег Рго С1у б!и Агд а! а тНг Ьеи Бег Суз Агд А1а Бег С1п Бег
Уа1 Бег Бег Туг Ьеи Αΐ а тгр Туг с1п с1п ьуз Рго С1у С1п А1а Рго
50 55 60
Агд Ьеи Ьеи Не туг Азр А1а Бег АЗП Агд А1а ТНг с!у 11е РГО А1а
Агд РНе Бег С1у Бег с!у Бег с1у тНг Азр РНе тНг ьеи ТНг 11е Бег
85 90 95
Бег Ьеи С1и Рго С1и Азр РНе А1а Уа1 Туг туг суз С1п С1п Агд Агд
100
105
110
Азп Тгр Рго Ьеи тНг РНе С1у с1у с1у тНг 1_уз \/а1 С1и 11е 1_уз 115 120 125 <210> 34 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 34
С1и 11е Уа1 1_еи тНг с!п Бег Рго А1а тНг ьеи Бег ьеи Бег Рго С1у 15 10 15
с1и Агд А1а тНг ьеи Бег Суз Агд А1а Бег С1п Бег Уа1 Бег Бег Туг
20 25 30
Ьеи а1 а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1 у С1п А1а РГО Агд ьеи ьеи Пе
35 40 45
Туг Азр А1а Бег АЗП Агд А1а ТНг с!у 11 е РГО А1а Агд рНе Бег С1 у
50 55 60
Бег С1у Бег с!у тНг Азр РНе ТНг ьеи тНг 11е Бег Бег Ьеи С1и Рго
65 70 75 80
- 59 026990
С1и Азр РНе д!а Уа1 туг туг суз С1п С1п Агд Агд азп тгр рго ьеи 85 90 95 тНг РНе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 с!и 11е Ьуз 100 105 <210> 35 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 35
Агд А1а Бег с1п Бег Уа1 Бег Бег Туг ьеи А1а 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 36
Азр А1а Бег Азп Агд А1а тНг 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 37 с!п С1п Агд Агд Азп Тгр Рго Ьеи тНг 1 5 <210> 38 <211> 447 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 38
а!ддад!!!д ддс!дасс!д дд!!!!сс!с д!!дс!с!!! !аададд!д! ссад!д!сад 60
д!дсадс!дд !ддад!с!дд дддаддсд!д д!ссадсс!д ддадд!ссс! дадас!с!сс 120
!д!дсадсд! с!дда!!сас с!!сад!асс !а!ддса!дс ас!ддд!ссд ссаддстсса 180
ддсааддддс !ддад!ддд! ддсаа!!а!а !дд!а!да!д дадд!аа!аа а!ас!а!дса 240
дас!ссд!да адддссда!! сасса!с!сс ададасаа!! ссаадаасас дс!д!а!с!д 300
сааатдааса дсс!дададс сдаддасасд дс!д!д!а!! ас!д!дсдад адас!!с!ас 360
!дд!ас!!сд а!с!с!дддд ссд!ддсасс с!дд!сас!д !с!сс!садс с!ссассаад 420
ддссса!сдд !с!!ссссс! ддсаадд 447
<210> 39 <211> 148 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 39
Ме! С1и РНе с1у ьеи ТНг тгр Уа1 РНе ьеи Уа1 А1а Ьеи Ьеи Агд с1у 15 10 15
- 60 026990
Уа1 С1п Суз С1п 20 Уа1 С1 η Ьеи Уа1 С1и Бег С1у с!у с!у Уа1 Уа1 С1п
25 30
РГО С1у Агд Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а А1а Бег с1у РНе тНг РНе
35 40 45
Бег ТНг туг с1у ме! нт 5 тгр Уа1 Агд С1п Αΐ а Рго С1у ьуз с1у ьеи
50 55 60
с!и Тгр х/а! а1 а Не Не тгр туг Αδρ С1у С1у ΑδΠ ьуз Туг туг А1а
65 70 75 80
Азр Бег Уа1 ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Бег Агд Αδρ АЗП Бег ьуз АЗП
85 90 95
ТНг Ьеи туг ьеи С1п Ме! Азп Бег ьеи Агд Αΐ а с1и Αδρ ТНг А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг суз а1 а Агд Азр РНе Туг т гр Туг РНе Азр Ьеи Тгр С1у Агд
115 120 125
С1у тНг ьеи \/а1 тНг Уа1 Бег Бег а! а Бег тНг ьуз С1у Рго Бег Уа1
130 135 140
РНе Рго Ьеи а! а
145 <210> 40 <211> 129 <212> БЕЛОК
<213> Ното зартепз <400> 40 С1и суз Бег с1у с1у С1у Уа1 10 Уа1 тНг С1п РНе Рго с!у Агд 15
С1п 1 Бег Уа1 ьеи С1п Агд ьеи Уа1 5
ьеи 20 Бег а! а А1а Бег 25 С1у РНе Бег 30 ТНг туг
с1у ме! НТ δ Тгр Уа1 Агд С1 п А1а Рго С1у ьуз С1у ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Не 11 е Тгр Туг Азр С1 у с1 у АЗП Ьуз туг туг А1а Азр Бег Уа1
50 55 60
ьуз С1у Агд РНе тНг Не Бег Агд Αδρ АЗП Бег ьуз АЗП ТНг ьеи туг
65 70 75 80
ьеи С1п Ме! Азп Бег Ьеи Агд А1а С1и Αδρ ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд А$р РНе Туг Тгр туг РНе Азр Ьеи Тгр С1у Агд С1у ТНг Ьеи
100 105 110
Уа1 ТНг Уа1 Бег Бег а! а Бег тНг Ьуз С1у Рго Бег Уа1 РНе Рго ьеи
115 120 125
- 61 026990 д!а <210> 41 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 41
ТНг Туг с!у Ме! Нт5 1 5 <210> 42 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> ното гартепз <400> 42
IIе IIе тгр туг Азр С1у с!у Азп ьуз Туг туг А1а Азр Бег Уа1 ьуз 1 5 10 15
С1у <210> 43 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 43
Азр РНе туг Тгр туг рНе Азр ьеи 1 5 <210> 44 <211> 372 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 44
а!ддаадссс садс!садс! !С!С!!СС!С с!дс!ас!с! ддс!сссада !ассассдда 60
дааа!!д!д! !дасасад!с !ссадссасс С!д!С!!!д! с!ссадддда аададссасс 120
с!с!сс!дса дддссад!са дад!д!!адс адс!ас!!ад сс!дд!асса асадааасс! 180
ддссаддстс ссаддс!сс! са!с!а!да! дса!ссааса дддссас!дд са!сссадсс 240
адд!!сад!д дсад!ддд!с !дддасадас !!сас!с!са ссатсадсад сс!ададсс! 300
даада!!!!д сад!!!а!!а с!д!садсад сдтаддасд! !сддссаадд дассаадд!д 360
дааа!сааас да 372
<210> 45 <211> 123 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 45 ме! С1и А1а рго А1а с!п ьеи ьеи РНе ьеи ьеи ьеи ьеи тгр Ьеи Рго 15 10 15
Азр ТНг тНг с!у С1и 11е Уа1 Ьеи ТНг с!п Бег Рго А1а ТНг Ьеи Бег
- 62 026990
25 30
Беи Бег РГО 35 б!у б!и Агд А1а тНг Беи Бег Су5 Агд А1а Бег б!п Бег
40 45
Уа1 Бег Бег Туг Беи а! а Тгр Туг С1п С1п Буз РГО с!у С1п А1а Рго
50 55 60
Агд Беи Беи 11е Туг Азр А1а Бег Азп Агд А1а ТНг б1у Не Рго А1а
65 70 75 80
Агд РНе Бег С1у Бег б!у Бег С1 у ТНг Азр РНе тНг Беи ТНг 11е Бег
85 90 95
Бег Беи С1и РГО С1и Азр РНе А1а Уа1 Туг туг Суз б!п С1п Агд Агд
100 105 110
ТНг РНе С1у С1п С1у тНг Буз Уа1 С1и 11е Буз
115 120 <210> 46 <211> 103 <212> БЕЛОК
<213> Ното : эарт епз
<400> 46
б1и 11 е νа^ Беи тНг б!п Бег РГО А1а тНг Беи Бег Беи Бег Рго б1у
1 5 10 15
б1и Агд А1а тНг Беи Бег Суз Агд А1а Бег С1п Бег Уа1 Бег Бег Туг
20 25 30
Беи А1а тгр Туг 6ΐη С1п Буз Рго С1у с1п А1а РГО Агд Беи Беи 11е
35 40 45
Туг Азр а! а Бег Азп Агд А1а ТНг б!у 11е РГО а! а Агд РНе Бег С1у
50 55 60
Бег С1у Бег С1у тНг Азр РНе тНг Беи тНг 11е Бег Бег Беи б!и РГО
65 70 75 80
б!и Азр РНе А1а Уа1 Туг туг суз б!п С1п Агд Агд тНг РНе 61 у С1п
90 95
с!у тНг Буз Уа1 б!и 11е Буз
100
<210> 47 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 47 Агд а!а Бег С1п Бег Уа1 Бег Бег туг Беи А1а
1 5 10
<210> 48 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 48
Азр А1а Бег Азп Агд А1а тКг 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 49
С1п с!п Агд Агд тКг 1 5 <210> 50 <211> 454 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 50
агддадтггд ддсгдадсрд дд!!!!сс!с дпдссст раададдгдг ссадгдгсад 60
дгдсадстдд !ддад!с!дд дддаддсдгд д!ссадсс!д ддаддгссс! дадастстсс 120
рдрдсадсд! с!дда!!сас сИсадтадс !а!ааса!дс ас!ддд!ссд ссаддсгсса 180
ддсааддддс рддадгддд! ддса!Па!а рддгагдагд даад!аа!аа атасгагдда 240
дастссдгда адддссда!! сассагстсс ададасаап ссааааасас дсТдТагсГд 300
саааРдааса дссРдададс сдаддасасд дс!дтд!а« ас!д!дсдад адаададстд 360
дддагсддд! ддгасисда гсгсгддддс сдгддсассс !ддтсас!д! сЕссРсадсс 420
гссассаадд дсссагсддг с!!ссссс!д дсас 454
<210> 51 <211> 151 <212> БЕЛОК
<213> Ното : зарт епз
<400> 51
Ме! С1и РКе с1у Ьеи Бег Тгр Уа1 рКе ьеи Уа1 а! а Ьеи Ьеи Агд С1у
1 5 10 15
Уа1 С1п Суз с1п Уа1 С1п ьеи Уа1 С1и Бег С1у с1у С1у УаТ Уа1 С1п
20 25 30
Рго С1у Агд Бег ьеи Агд 1_еи Бег суз А1а А1 а Бег с1у РКе тКг РКе
35 40 45
Бег Бег Туг Азп Ме! Нт 5 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у 1еи
50 55 60
С1и тгр Уа1 А1а РКе 11е тгр Туг Азр С1у Бег АЗП Ьуз Туг туг С1 у
65 70 75 80
Азр Бег Уа1 ьуз С1у Агд РКе тКг Не Бег Агд Азр А5П Бег ьуз АЗП
90 95
ТНг Ьеи туг ьеи С1п ме! АЗП Бег Ьеи Агд а! а с1и Азр тНг А1а Уа1
100 105 110
туг Туг Суз Αΐ а Агд С1и С1и ьеи С1у Пе с!у т гр туг РНе Азр ьеи
115 120 125
Тгр С1у Агд с!у тНг ьеи Уа1 тНг УаТ Бег Бег а! а Бег ТНг ьуз С1у
130 135 140
РГО Бег Уа1 РНе Рго Ьеи а! а
145 150 <210> 52 <211> 132 <212> БЕЛОК
<213> ното зартепз С1у Агд 15
<400> 52 кеи Уа1 5 С1и Бег С1у С1у С1у Уа1 10 Уа1 С1п РГО
С1п 1 УаТ С1п
Бег 1_еи Агд ьеи Бег Суз Αΐ а а1 а Бег С1у РНе ТНг РНе Бег Бег туг
20 25 30
АЗП ме! НТ 5 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у ьуз С1у кеи С1и тгр Уа1
35 40 45
а! а РНе Пе Тгр Туг Азр С1у Бег АЗП ЬУЗ Туг туг С1у Азр Бег Уа1
50 55 60
ьуз С1у Агд РНе тНг Пе Бег Агд АЗР АЗП Бег ьуз АЗП тНг кеи туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Ме! АЗП Бег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг Αΐ а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и с1и Ьеи С1у Пе С1у Тгр Туг РНе А5р кеи Тгр С1у Агд
100 105 110
С1у ТНг ьеи Уа1 тНг Уа1 Бег Бег А1а Бег тНг ьуз с1у РГО Бег Уа1
115 120 125
РНе Рго Ьеи А1а 130 <210> 53 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепг <400> 53
Бег Туг Азп ме! нтз 1 5 <210> 54 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз
- 65 026990 <400> 54
РЬе 11е тгр туг Азр С1у Бег Азп ьуз туг туг с!у Азр Бег \/а1 Буз 15 10 15
С1у <210> 55 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 55
С1и С1и ьеи С1у 11е О1у тгр Туг РЬе Азр Беи 1 5 10 <210> 56 <211> 454 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> 56 атддаадссс садсгсадсБ гстсгтссгс сгдсгасгсг ддстсссада Бассассдда 60 дааагтдгдг гдасасадгс гссадссасс сгдтсгпдг стссадддда аададссасс 120 систсстдса дддссадгса дадБдГБадс адстасТБад ссБддБасса асадааассБ 180 ддссаддсБс ссаддсгссБ сатстатдат дсатссааса дддссастдд сатсссадсс 240 аддгтсадтд дсадБдддБс гдддасадас ттсасгсБса ссагсадсад ссБададсст 300 даадатгттд садттгатга стдтсадсад сдтаддасдг тсддссаадд дассааддтд 360 дааатсааас даастдгддс БдсассаТсБ дБсТБсатсг тсссдссаБс БдаБдадсад 420
ББдаааБстд даастдсстс гдттдтдтдс сБдс 454 <210> 57 <211> 123 <212> БЕЛОК
<213> ното : 5арт епз
<400> 57
Мет С1и А1а Рго А1а С1п Беи Беи РЬе Беи Беи Беи Беи Тгр Беи Рго
1 5 10 15
АЗр ТЬг тЬг С1у С1и Пе Уа1 Беи тЬг с!п Бег Рго А1а тЬг Беи Бег
20 25 30
Беи Бег РГО С1у С1и Агд А1а тЬг Беи Бег суз Агд А1а Бег С1п Бег
35 40 45
\/аТ Бег Бег Туг Беи а1 а тгр Туг С1п Οίη Буз Рго С1у С1п А1а РГО
50 55 60
Агд Беи Беи Пе Туг Азр А1а Бег А5П Агд А1а тЬг С1у 11е Рго А1а
65 70 75 80
Агд РЬе Бег С1у Бег С1у Бег С1у тЬг Азр РЬе ТЬг Беи тЬг Пе Бег
90 95
- 66 026990
Бег ьеи С1и Рго с!и Азр РНе А1а Уа1 Туг туг суз с!п С1п Агд 110 Агд
100 105
ТНг РНе С1у С1п с!у 115 <210> 58 <211> 103 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 58 тНг ьуз 7а1 с!и 120 11 е ьуз
С1и 1 11е Уа1 ьеи тНг 5 С1п Бег Рго А1а тНг 10 ьеи Бег ьеи Бег рго 15 с!у
С1и Агд А1а тНг Ьеи 20 Бег Суз Агд А1а 25 Бег с!п Бег Уа1 Бег Бег 30 туг
Ьеи а1 а тгр 35 Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у 40 С1п а! а Рго Агд 45 ьеи ьеи 11е
Туг Азр 50 А1а Бег Азп Агд А1а тНг с1у 55 11е РГО А1а Агд 60 РНе Бег с!у
Бег 65 С1у Бег С1у ТНг А5р РНе тНг ьеи 70 тНг 11е 75 Бег Бег ьеи с1и Рго 80
С1и Азр РНе А1а Уа1 85 Туг Туг Суз С1п С1п 90 Агд Агд ТНг РНе С1у 95 С1п
С1у тНг Ьуз Уа1 с!и II е ьуз 100 <210> 59 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> нолю зартепз <400> 59
Агд А1а Бег 6ΐη Бег Уа1 Бег Бег туг ьеи А1а 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 60
Азр А1а Бег Азп Агд А1а тНг 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 61
Οίη С1п Агд Агд тНг 1 5
- 67 026990 <210> 62 <211> 433 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> 62
атддадтттд тдстдадстд ддттстсстт дттдстатат тааааддтдт ссадтдтдад 60
дттсадстдд тдсадтстдд дддаддсттд дтасатсстд дддддтссст дадастстсс 120
тдтдсаддст стддаттсас сттсадтаас татдстатдс астдддттсд ссаддстсса 180
ддааааддтс тддадТдддТ атсаастатт ддтастддтд дтддсасасс статдсадас 240
тссдтдаадд дссдсттсас сатстссада дасааТдсса адаастсстт дтатсттсаа 300
атдаасадсс тдададссда ддасатддст дтдтаттаст дтдсаттаад тдсттттдат 360
дтстддддсс аадддасаат ддтсассдтс тсттсадсст ссассааддд сссатсддтс 420
ттссссстдд сас 433
<210> 63 <211> 144 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз
<400> 63 Ьуз 15 С1у
мет 1 С1и РКе Уа1 ьеи Бег 5 тгр Уа! ьеи Ьеи 10 Уа! а! а 11 е ьеи
Уа1 с1п суз С1и Уа! С1п ьеи Уа! С1п Бег с1у С1у С1у ьеи Уа1 нтз
20 25 30
РГО С1у с1у Бег Ьеи Агд ьеи Бег Су5 а! а с!у Бег С1у РКе тКг РКе
35 40 45
Бег Азп Туг Αΐ а мет НТ 5 тгр Уа! Агд С1п а! а РГО С1у Ьуз С1у Ьеи
50 55 60
С1и тгр Уа1 Бег тКг 11е С1у тКг С1у С1у с! у тКг Рго Туг А1а Азр
65 70 75 80
Бег Уа1 ьуз С1у Агд РКе тКг 11е Бег Агд Азр Азп Αΐ а ьуз АЗП Бег
85 90 95
Ьеи туг Ьеи С1п мет Азп Бег ьеи Агд А1а с1 и Азр Мет А1а Уа1 туг
100 105 110
туг Суз а! а ьеи Бег а! а РКе Азр Уа! Тгр С1у С1п С1у ТКг мет Уа!
115 120 125
ТЬг Уа1 Бег Бег а! а Бег ТКг Ьуз С! у Рго Бег Уа! РКе Рго Ьеи А1а
130 135 140
<210> 64 <211> 125 <212> БЕЛОК <213> ното гартепз <400> 64
- 68 026990
б!и Уа1 1 б!п Ьеи Уа1 5 С1п Бег с!у С1у б!у Ьеи Уа1 10 Нт 5 Рго б!у 15 б1у
Бег ьеи Агд Ьеи Бег суз а! а С1у Бег С1у рНе ТНг рНе Бег АЗП туг
20 25 30
л!а мет Нт 5 Тгр Уа1 Агд с! п А1а РГО С1у ьуз С1у ьеи С1и Т гр Уа1
35 40 45
Бег тНг Пе С1у тНг С1у С1у С1у тНг РГО туг Αΐ а Азр Бег Уа1 ьуз
50 55 60
б1у Агд РНе ТНг 11 е Бег Агд Азр Азп а! а ьуз А5П Бег ьеи Туг ьеи
65 70 75 80
С1п МеТ Азп Бег ьеи Агд А1а 61 и Азр мет. А1а Уа1 туг туг Суз А1а
85 90 95
Ьеи Бег А1а РНе Азр Уа1 Тгр С1у б1п 61 у ТНг мет Уа1 ТНг Уа1 Бег
100 105 110
Бег А1а Бег ТНг ьуз с1у РГО Бег Уа1 РНе Рго ьеи А1а
115 120 125
<210> 65
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Ното : гарт епз
<400> 65
АЗП Туг А1 а мет НТ 5
1 5
<210> 66 <211> 16 <212> БЕЛОК
<213> Ното : зарт епз
<400> 66 ТНг Пе С1у тНг С1у С1у С1у ТНг Рго Туг А1а Азр Бег Уа1 ьуз б!у
1 5 10 15
<210> 67 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 67
Бег А1а РНе Азр Уа1 1 5 <210> 68 <211> 466 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 68 атддадтттд тдстдадстд ддттттсстт дттдстатат тааааддтдт ссадтдтдад 60 дттсадстдд тдсадтстдд дддаддсттд дтасатсстд дддддтссст дадастстсс 120
- 69 026990 тдтдсаддст стддаттсас сттсадтадс татдстатдс астдддттсд ссаддстсса 180 ддааааддТс тддадтдддт атсадстатт ддтастддтд дттасасата статдтадас 240 тссдтдаадд дссдаттсас сатстссада дасаатдсса адаадтсстт дтатсттсаа 300 атдаасадсс тдададссда ддасатддст дтдтаттаст дтдсаадада дссдттттас 360 дататтттда стддттаттс сссатасттт дастастддд дссадддаас сстддтсасс 420 дтстсстсад сстссассаа дддсссатсд дтсттссссс тддсас 466 <210> 69 <211> 143 <212> БЕЛОК <213> Нолю зартепз <400> 69
мет 1 С1и РНе Уа1 ьеи 5 Бег Тгр Уа1 РНе ьеи Уа1 10 А1а Пе ьеи ьуз 15 С1у
Уа1 С! η суз С1и Уа1 с!п ьеи Уа1 с1п Бег с1у С1у С1у ьеи Уа1 НТ 5
20 25 30
Рго С1у с!у Бег Ьеи Агд ьеи Бег Суз Αΐ а с!у Бег с!у РНе тНг РНе
35 40 45
Бег Бег Туг А1а мет нт 5 тгр Уа1 Агд с1п А1а РГО С1у ьуз с1у ьеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 Бег А1а Пе С1у тНг С1у С1у туг тНг Туг туг Уа1 Азр
65 70 75 80
Бег Уа1 Ьуз С1 у Агд РНе тНг Пе Бег Агд Азр Азп А1а ьуз Ьуз Бег
85 90 95
Ьеи туг ьеи С1п мет АЗП Бег Ьеи Агд А1а С1и Азр мет А1а Уа1 туг
100 105 110
Туг Су 5 Αΐ а Агд с1и Рго РНе туг Азр 11 е Ьеи тНг С1у туг Бег Рго
115 120 125
Туг РНе Азр Туг тгр с!у с! η С1у тНг ьеи Уа1 тНг Уа1 Бег Бег
130 135 140 <210> 70 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> ното зартепз
<400> 70 С1у С1у с!у 10 ьеи Уа1 НТ 5 РГО С1у 15 С1у
С1и Уа1 1 С1п ьеи Уа1 5 С1п Бег
Бег ьеи Агд Ьеи Бег 20 Суз А1а С1у Бег 25 с1у РНе тНг РНе Бег 30 Бег Туг
А1а МеТ НТ 5 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у ьуз С1у Ьеи С1и 45 Тгр Уа1
- 70 026990
Бег Αΐ а 50 11е С1у тпг С1у С1у Туг 55 тКг Туг Туг Уа1 60 Азр Бег Уа1 ьуз
с1у Агд РКе ТКг 11е Бег Агд Азр Азп Αΐ а ьуз ьуз Бег 1_еи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1п мет АЗП Бег ьеи Агд а! а с1и Азр мет а! а Уа1 Туг туг Суз А1а
85 90 95
Агд С1 и Рго РКе Туг Азр 11е Ьеи тКг С1у Туг Бег Рго туг РКе Азр
100 105 110
Туг Тгр с!у С1п С1у тКг ьеи Уа1 ТКг Уа1 Бег Бег
115 120 <210> 71 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното зарп'епз <400> 71
Бег туг А1а мет нтз 1 5 <210> 72 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 72
А1а 11е С1у тКг С1у О1у Туг ТКг Туг Туг УаТ Азр Бег Уа1 Ьуз С1у 15 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 73
С1и Рго РКе туг Азр 11е Ьеи тКг с!у Туг Бег Рго Туг РКе Азр Туг
1 5 10 15
<210> 74 <211> 454 <212> ДНК <213> Ното гарт епз
<400> 74 атддадтттд ддсТдадсТд ддттттсстс дттдстсттт таададдтдт ссадтдтсад 60
дтдсадстдд ТддадТсТдд дддаддсдтд дТссадссТд ддаддтссст дадастстсс 120
тдтдсадсдт стддаттсас сттсадтадс татаасатдс астдддтссд ссаддстсса 180
ддсааддддс тддадтдддт ддсадттата тддтатдатд даадтаатаа атастатдда 240
дастссдтда адддссдатт сассатстсс ададасааТТ ссаадаасас дстдтатстд 300
сааатдааса дсстдададс сдаддасасд дстдтдтатт астдтдсдад адаададстд 360
дддаТсдддТ ддтасттсда ТсТсТддддс сдтддсассс ТддТсасТдТ стсстсадсс 420
Тссассаадд дсссаТсддТ сттссссстд дсас 454
- 71 026990 <210> 75 <211> 139 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 75
мет 1 С1и РНе О1у Ьеи Бег 5 тгр Уа1 РНе ьеи Уа1 10 А1а Ьеи Ьеи Агд 15 С1у
Уа1 с1п СУ5 Οίη Уа1 Οίη ьеи Уа1 С1и Бег с1у с1у С1у Уа1 Уа1 Οίη
20 25 30
РГО 01 у Агд Бег ьеи Агд Ьеи Бег СУ5 А1а А1а Бег 01 у РНе тНг РНе
35 40 45
Бег Бег Туг АЗП Мет НТ 5 Тгр Уа1 Агд Οίη А1а Рго 01 у ьуз С1у Ьеи
50 55 60
С1и Тгр Уа1 А1а Уа1 11е тгр туг Азр с1у Бег АЗП туг туг С1у
65 70 75 80
Азр Бег Уа! ЬУ5 с1у Агд РНе тНг 11е Бег Агд Азр АЗП Бег ЬУ5 АЗП
85 90 95
ТНг ьеи Туг ьеи 01 η мет АЗП Бег ьеи Агд А1а С1и Азр тНг А1а Уа1
100 105 110
Туг туг сув А1а Агд С1и 01 и Ьеи С1у 11е 01 у Тгр Туг РНе Азр Ьеи
115 120 125
Тгр С1у Агд С1у ТНг 1_еи Уа1 тНг Уа1 Бег Бег
130 135 <210> 76 <211> 120 <212> БЕЛОК
<213> Ното : зарт епз
<400> 76
Οίη Уа1 οίη Ьеи Уа1 С1и Бег С1у С1у с!у Уа1 Уа1 01 п Рго С1у Агд
1 5 10 15
Бег ьеи Агд Ьеи Бег Суз Αΐ а А1а Бег С1у РНе ТНг РНе Бег Бег Туг
20 25 30
Азп мет НТ 5 Тгр Уа1 Агд 01 п А1а Рго с1у ьуз 01 у ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
А1а Уа1 11е тгр туг Азр С1у Бег Азп ьуз туг Туг С1у Азр Бег Уа1
50 55 60
1_уз С1у Агд РНе тНг 11е Бег Агд Азр АЗП Бег ьуз АЗП ТНг Теи Туг
65 70 75 80
ьеи Οίη мет АЗП Бег ьеи Агд а! а о!и Азр тНг а! а Уа1 Туг туг суз
90 95
- 72 026990
А1а Агд с!и с1и ьеи сТу 11е с!у тгр Туг РЬе Азр Ьеи Тгр С1у Агд 100 105 110
С1у ТЬг ьеи Уа1 тНг Уа1 Бег Бег 115 120 <210> 77 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 77
Бег туг А5п ме! нп'з 1 5 <210> 78 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 78
Уа1 11е Тгр Туг Азр с!у Бег Азп Ьу5 Туг Туг С1у Азр Бег Уа1 Ьуз 1 5 10 15
С1у <210> 79 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 79
С1и С1и Ьеи с1у 11е С1у Тгр туг РКе Азр Ьеи 1 5 10 <210> 80 <211> 475 <212> ДНК <213> Ното зартепз <400> 80 агддасагда дддтссссдс !садс!сс!д дддс!!с!дс !дс!с!ддс! сссаддгдсс 60 ада!дгдсса !ссад!!дас ссадгсХсса гсс!ссс!д! сгдса!с!д! аддадасада 120 дтсассатса с!!дссдддс аад!садддс а!!адсад!д сьпадсстд дгатсадсад 180 ааассаддда аадс!сс!аа дс!сс!да!с !а!да!дссг ссад!!!дда аадтддддгс 240 сса!саадд! гсадсддсад гдда!с!ддд асадасыса с!с!сасса! садсадссгд 300 садсстдаад а!!!!дсаас !!а!!ас!д! саасад!!!а а!ад!!ассс !сас!!сддс 360 саадддасас дасгддада! гааасдаас! д!ддс!дсас са!сгд!с« сагсисссд 420 ссагс!да!д адсад!!даа агсгддаас! дсс!с!д!!д !дгдсс!дса адддс 475 <210> 81 <211> 128 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз
- 73 026990
<400> 81 ме! Азр ме! Агд 1 Уа1 5 рго А1а с1п ьеи ьеи 10 с1у ьеи ьеи ьеи ьеи 15 тгр
ьеи Рго с!у А1а Агд суз А1а ίίе с1п Ьеи тНг С1п Бег РГО Бег Бег
20 25 30
Ьеи Бег А1а Бег Уа1 с!у Азр Агд Уа1 ТНг Пе тНг суз Агд А1а Бег
35 40 45
с!п С1у Пе Бег Бег А1а Ьеи А1а Тгр туг С1п С1п ьуз РГО С1 у ьуз
50 55 60
А1а Рго Ьуз ьеи ьеи 11е туг А5р а1 а Бег Бег ьеи С1и Бег С1у Уа1
65 70 75 80
Рго Бег Агд РНе Бег с!у Бег с1у Бег С1у тНг Азр РНе тНг Ьеи тНг
85 90 95
Пе Бег Бег ьеи С1п рго с!и Азр РНе А1а тНг туг Туг Суз С1п С1п
100 105 110
РНе Азп Бег туг Рго нтз РНе С1у С1п С1.у тНг Агд ьеи С1и Пе ьуз
115 120 125
<210> 82
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Ното зартепз
<400> 82
А1а 11е С1п Ьеи тНг С1п Бег Рго Бег Бег ьеи Бег Αΐ а Бег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 тНг Пе тНг суз Агд А1а Бег С1п с1у 11 е Бег Бег А1а
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у ьуз А1а Рго ьуз Ьеи ьеи Пе
35 40 45
туг Азр А1а Бег Бег Ьеи с1и Бег С1у Уа1 Рго Бег Агд рНе Бег с!у
50 55 60
Бег с1у Бег с!у тНг Азр РНе ТНг ьеи ТНг Пе Бег Бег ьеи б1п РГО
65 70 75 80
С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг суз С1п С1п РНе азп Бег туг Рго нтз
85 90 95
РНе О1у С1п С1у тНг Агд Ьеи С1и Не Ьуз
100 105
<210> 83 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> ното 5артепз <400> 83
Агд А1а Бег с1п с!у 11е Бег Бег д1а ьеи А1а 1 5 10 <210> 84 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 84
Азр А1а Бег Бег ьеи с!и Бег 1 5 <210> 85 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Ното зартеп5 <400> 85
С1п С1п РНе Азп Бег Туг Рго ΗΊ5 1 5 <210> 86 <211> 445 <212> ДНК <213> ното зартепз <400> 86
а!ддад!!!д ддс!дадс!д дд!!!!сс!с д!!дс!с!!! !аададд!д! ссад!д!сад 60
д!дсадс!дд !ддад!с!дд дддаддсд!д д!ссадсс!д ддадд!ссс! дадас!с!сс 120
!д!дсадсд! с!дда!!сас с!!сад!адс !а!ддса!дс ас!ддд!ссд ссаддсИсса 180
ддсааддддс !ддад!ддд! ддсад!!а!а !дд!а!да!д даадтаагаа а!ас!а!дса 240
дас!ссд!да адддссда!! сасса!с!сс ададасаа!! ссаадаасас дс!д!а!с!д 300
саааьдааса дсстдададс сдаддасасд дс!д!д!а!! ас!д!дсдад аддсссссс! 360
сдд!ас!!сд а!с!с!дддд ссдгддсасс с!дд!сас!д !с!сс!садс с!ссассаад 420
ддсссатсдд !с!!ссссс! ддсас 445
<210> 87 <211> 136 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 87 ме! О1и РНе с!у ьеи Бег Тгр Уа1 РНе ьеи Уа1 А1а ьеи ьеи Агд С1у 15 10 15
Уа1 С1п Суз С1п УаТ С1п Ьеи Уа1 с1и Бег с!у С1у С1у Уа1 Уа1 с1п 20 25 30
Рго С1у Агд Бег ьеи Агд ьеи Бег Суз А1а А1а Бег с!у РНе ТНг РНе 35 40 45
Бег Бег туг С1у ме! нтз Тгр Уа1 Агд с!п А1а Рго С1у ьуз с1у ьеи 50 55 60
С1и Тгр Уа1 А1а Уа1 11е Тгр туг А5р С1у Бег азп ьуз туг туг А1а 65 70 75 80
- 75 026990
Азр Бег Уа! ьуз С1у Агд РНе тНг 11е Бег Агд Азр Азп Бег ьуз АЗП
85 90 95
тНг ьеи Туг Ьеи С1п ме! АЗП Бег ьеи Агд а! а с1и Азр тНг А1а Уа1
100 105 110
Туг туг Суз А1а Агд С1 у РГО РГО Агд туг РНе А5Р ьеи Тгр с!у Агд
115 120 125
С1у тНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Бег Бег
130 135 <210> 88 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 88
с!п Уа! 1 С1п ьеи Уа1 5 С1и Бег С1у С1у С1у 10 Уа! Уа1 с1п Рго с!у 15 Агд
Бег ьеи Агд ьеи Бег Суз а1 а А1а Бег С1у РНе тНг РНе Бег Бег туг
20 25 30
С1у ме! НТ 5 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у ьуз С1у ьеи С1и Т гр Уа!
35 40 45
Αΐ а уа! 11е Тгр туг Азр С1у Бег АЗП ьуз туг туг А1а Азр Бег Уа!
50 55 60
ьуз С1у Агд РЬе тНг 11 е Бег Агд Азр АЗП Бег ЬУ5 Азп ТНг Ьеи туг
65 70 75 80
ьеи С1п Ме! АЗП Бег ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа! Туг Туг суз
85 90 95
αΊ а Агд С1у Рго Рго Агд туг РНе Азр Ьеи тгр С1 у Агд С1у тНг ьеи
100 105 110
\/а! ТНг Уа! Бег Бег 115 <210> 89 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 89
Бег туг с1у ме! нтз 1 5 <210> 90 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 90
- 76 026990
\/а1 11е Тгр Туг Азр б!у Бег Азп ЬУ5 туг Туг а! а Азр Бег Уа1 Буз
1 5 10 15
б1у
<210> 91
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Ното : Бартепз
<400> 91
б1у Рго Рго Агд Туг РНе Азр Беи
1 5
<210> 92
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Ното : 5арт епз
<400> 92
б!и 11е УаТ Беи ТНг б1п Бег РГО Αΐ а ТНг Беи Бег Беи Бег Рго с!у
1 5 10 15
С1и Агд А1а тНг Беи Бег Суз Агд а! а Бег С1п Бег Уа1 Бег Бег туг
20 25 30
Беи А1а Тгр туг б!п б!п Буз Рго б1у С1п а1 а РГО Агд Беи Беи Пе
35 40 45
Туг А5Р А1а Бег азп Агд а1 а тНг б1у Пе РГО а1 а Агд РНе Бег б1у
50 55 60
Бег б!у Бег с!у тНг Азр РНе тНг Беи ТНг 11 е Бег Бег Беи б!и Рго
65 70 75 80
б!и Азр РНе А1а Уа1 туг туг Суз б!п С1п Агд Бег АЗП тгр Рго
85 90 95
<210> 93
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Ното 5арт епз
<400> 93
А1а Пе 6ΐη Беи тНг б1п Бег Рго Бег Бег Беи Бег А1а Бег Уа1 61 у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1 а Бег С1п б1у Пе Бег Бег А1а
20 25 30
Беи А1а Тгр туг б1п б!п Буз Рго б!у Буз А1а РГО Буз Беи Беи Пе
35 40 45
Туг Агр А1а Бег Бег Беи б!и Бег б1у Уа1 РГО Бег Агд РНе Бег б1у
50 55 60
Бег б!у Бег С1у тНг Азр РНе тНг Беи тНг Пе Бег Бег Беи б!п РГО
65 70 75 80
- 77 026990
61 и Азр РНе А1а тНг туг 85 Туг суз б!п 6ΐη РНе Азп Бег туг Рго
90 95
<210> 94 <211> 95 <212> БЕЛОК
<213> Ното : зарт епз
<400> 94
Азр 11 е б1п Ме! тНг 61 η Бег Рго Бег Бег кеи Бег а1 а Бег Уа1 61 у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 тНг П е тНг суз Агд А1а Агд С1п 61 у 11 е Бег Бег Тгр
20 25 30
Ьеи Αΐ а тгр Туг 61 η 6ΐη ьуз Рго 61 и ЬУЗ А1а Рго ьуз Бег кеи 11е
35 40 45
туг а1 а А1а Бег Бег ьеи 6ΐη Бег 61 у \/а1 РГО Бег Агд РНе Бег С1у
50 55 60
Бег с1у Бег С1у ТНг АЗр РНе тНг кеи тНг Не Бег Бег кеи 61 п Рго
65 70 75 80
б!и АЗр РНе а! а ТНг Туг туг Суз 61 η б!п туг Азп Бег Туг Рго
90 95 <210> 95 <211> 98 <212> БЕЛОК
<213> Ното : зарт епз
<400> 95
с! п \/а 1 61 п 1 кеи Уа1 5 с1и Бег С1у С1у б1у 10 Уа1 \/а1 61 п Рго с1у 15 Агд
Бег кеи Агд кеи 20 Бег суз а1 а А1а Бег 25 б1у РНе ТНг РНе Бег 30 Бег Туг
б!у ме! Н15 35 Тгр Уа1 Агд 6ΐη А1а 40 Рго С1у Ьуз 61 у кеи 45 б1и тгр Уа1
А1а Уа1 11е 50 Тгр Туг А5Р б1у 55 Бег АЗП ЬУЗ туг Туг 60 А1а Азр Бег Уа1
куз б1у Агд 65 РНе тНг 11е 70 Бег Агд АЗр АЗП Бег 75 ЬУЗ Азп тНг кеи Туг 80
кеи 61п Ме! А1а Агд <210> 96 <211> 97 АЗП Бег 85 кеи Агд А1а с!и Азр 90 тНг А1а Уа1 туг туг 95 Суз
- 78 026990 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 96
С1и 1 Уа1 с!п Ьеи Уа1 5 с1п Бег С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 нт 5 Рго С1у 15 С1у
Бег ьеи Агд Ьеи Бег Суз Αΐ а С1у Бег с!у РНе тНг рНе Бег Бег туг
20 25 30
А1а мег НТ 5 Тгр Уа1 Агд С1п А)а Рго С)у ьуз С1у ьеи С1и тгр Уа1
35 40 45
Бег а! а 11е С1у тНг С1у С1у С1у тНг туг Туг А) а Азр Бег Уа1 Ьуз
50 55 60
С1у Агд РНе тНг 11е Бег Агд А5р АЗП а1 а ьуз А5П Бег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1п мег АЗП Бег ьеи Агд а! а С1и Αδρ мег А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а
85 90 95
Агд <210> 97 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> /заменить=А5п или тНг или Бег <220>
<221> смеш_признак <222> (1)..(1) <223> /примечание^' Остаток, указанный в последовательности, не имеет предпочтения по отношению к остатку в примечании для указанной позиции <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (3)..(3) <223> /заменить=А5п или д1а <22О>
<221> смеш_признак <222> (3)..(3) <223> /примечание= Остаток, указанный в последовательности, не имеет предпочтения по отношению к остатку в примечании для указанной позиции <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(5) <223> /заменить=Туг <22О>
<221> смеш_признак
- 79 026990 <222> (5)..(5) <223> /примечание=остаток, указанный в последовательности, не имеет предпочтения по отношению к остатку в примечании для указанной позиции <400> 97
II е туг с!у мег т'з
5 <210> 98 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <22О>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> /заменить=11е или РЬе или тНг или А1а <220>
<221> смеш_признак <222> (1)..(1) <223> /примечание= Остаток, указанный в последовательности, не имеет предпочтения по отношению к остатку в примечании для указанной позиции <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3)..(3) <223> /заменить=с1у <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (4) ..(4) <223> /заменить=тНг <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(5) <223> /заменить=с!у <220>
<221> смеш_признак <222> (3)..(5) <223> /примечание=остатки, указанные в последовательности, не имеют предпочтения по отношению к остаткам в примечаниях для указанных позиций <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (7)..(7) <223> /заменить=с1у или туг <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (8)..(8) <223> /заменить=тКг <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (9)..(9) <223> /заменить=Рго <220>
<221> смеш_признак <222> (7)..(9) <223> /примечание=Остатки, указанные в последовательности, не имеют предпочтения по отношению к остаткам в примечаниях для указанных позиций
- 80 026990 <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (11)..(11) <223> /заменить=А1а или Уа1 <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (12)..(12) <223> /заменить=с1у или <220>
<221> смеш_признак <222> (11)..(12) <223> /примечание=остатки, указанные в последовательности, не имеют предпочтения по отношению к остаткам в примечаниях для указанных позиций <400> 98
Уа1 Пе тгр туг Азр С1у Бег Азп ьуз Туг туг А1а Азр Бег Уа1 Ьуз
10 15
С1у <210> 99 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> /заменить=с!у или Туг или Бег или Рго или <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(2) <223> /заменить=тгр или Бег или Агд <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (3)..(3) <223> /заменить=А1а или нтз <22О>
<221> смеш_признак <222> (1)..(3) <223> /примечание=Остатки, указанные в последовательности, не имеют предпочтения по отношению к остаткам в примечаниях для указанных позиций <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (6)..(6) <223> /заменить=ьеи или Уа1 <220>
<221> смеш_признак <222> (6)..(6) <223> /примечание^' Остаток, указанный в последовательности, не имеет предпочтения по отношению к остатку в примечании для указанной позиции <400> 99
А1а Рго Туг РЬе Агр туг
5
- 81 026990 <210> 100 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> ВАРИАНТ <222> ¢5)..(5) <223> /заменить=с!у <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (6)..(6) <223> /заменить=Уа!
<220>
<221> смеш_признак <222> (5)..(6) <223> /примечание=Остатки, указанные в последовательности, не имеют предпочтения по отношению к остаткам в примечаниях для указанных позиций <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (9)..(9) <223> /заменить=тгр или А1а <22О>
<221> смеш_признак <222> (9)..(9) <223> /примечание=” Остаток, указанный в последовательности, не имеет предпочтения по отношению к остатку в примечании для указанной позиции <400> 100
Агд А1а Бег с!п Бег Пе Бег Бег туг Ьеи А1а
5 10 <210> 101 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (1)..(1) <223> /заменить=А1а <22О>
<221> смеш_признак <222> (1)..(1) <223> /примечание= Остаток, указанный в последовательности, не имеет предпочтения по отношению к остатку в примечании для указанной позиции <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (4)..(4) <223> /заменить=5ег
- 82 026990 <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> ¢5)..(5) <223> /заменить=ьеи <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (6)..(6) <223> /заменить=с!п или С1и <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (7)..(7) <223> /заменить=5ег <22О>
<221> смеш_признак <222> (4)..(7) <223> /примечание=Остатки, указанные в последовательности, не имеют предпочтения по отношению к остаткам в примечаниях для указанных позиций <400> 101
А5р А1а Бег азп Агд А1а тКг
5 <210> 102 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=описание искусственной последовательности: синтетическая консенсусная последовательность <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3)..(3) <223> /заменить=Туг или РКе <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (4)..(4) <223> /заменить=А5п <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(5) <223> /заменить=5ег или Αδη <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (6)..(6) <223> /заменить=тгр или <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (7)..(7) <223> /заменить= <22О>
<221> ВАРИАНТ <222> (8)..(8) <223> /заменить=ьеи или Нтз или <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (9)..(9) <223> /заменить=
- 83 026990 <220>
<221> смеш_признак <222> (3)..(9) <223> /примечание=Остатки, указанные в последовательности, не имеют предпочтения по отношению к остаткам в примечаниях для указанных позиций <400> 102
С1п С1п Агд Агд ТКг Туг Рго Туг ТКг
5 <210> 103 <211> 118 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 103
С1п 1 Уа1 С1п ьеи Уа1 5 с1и Бег С1у С1у С1у 10 Уа! Уа1 С1п Рго С1у 15 Агд
Бег Ьеи Агд ьеи Бег Суз А1а А1а Бег С1у РКе ТКг РКе Бег АЗП Туг
20 25 30
с1у мет Туг тгр Уа! Агд е1п А1а Рго С1у ьуз с!у ьеи С1и тгр Уа1
35 40 45
а1 а Уа! 11е Тгр Туг Азр С1у Бег Азп ьуз Туг туг А1а Азр Бег Уа1
50 55 60
ьуз с1у Агд РКе ТКг Не Бег Агд Азр АЗП Бег ьуз Азп тКг ьеи Туг
65 70 75 80
ьеи С1п мет АЗП Бег Ьеи Агд А1а С1и АЗР ТКг а! а Уа! Туг Туг суз
85 90 95
Αΐ а Агд Азр Ьеи Тгр С1у Тгр туг РКе Азр Туг тгр С1у с!п с!у ТКг
100 105 110
ьеи Уа1 тКг Уа1 Бег Бег
115 <210> 104 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> ното зартепз <400> 104
с!п Уа1 1 С1п ьеи Уа! 5 с!и Бег С1у С1у С1у 10 Уа! Уа! С1п Рго С1у 15 Агд
Бег ьеи Агд ьеи Бег Суз а1 а А1а Бег С1у РКе тКг РКе Бег ТКг Туг
20 25 30
С1у мет Нт 5 Тгр уа! Агд С1п А1а Рго с! у ьуз с!у ьеи С! и Тгр Уа!
35 40 45
А1а Не Не Тгр туг Азр С1у С1у Азп ьуз Туг туг а! а Азр Бег Уа!
50 55 60
Ьу5 С1 у Агд РКе ТКг П е Бег Агд А5р АЗП Бег ьуз АЗП ТКг Ьеи Туг
- 84 026990
65 70 75 80
Ьеи Οίη Ме! АЗП Бег ьеи Агд А1а с1и А5Р ТКг а! а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр РКе Туг тгр Туг РКе Азр Ьеи Тгр с1у Агд С1у ТКг Ьеи
100 105 110
Уа1 тКг Уа1 Бег Бег
115
<210> 105 <211> 120 <212> БЕЛОК
<213> Ното : 5арт епз
<400> 105 С1п Уа1 Οίη Ьеи Уа1 С1и Бег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 С1п Рго е1у Агд
1 5 10 15
Бег ьеи Агд Ьеи Бег Суз Αΐ а А1а Бег О1у РКе тКг РКе Бег Бег Туг
20 25 30
Азп ме! Нт 5 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго О1у ьуз с!у ьеи С1и тгр Уа1
35 40 45
А1а РКе 11е тгр Туг Азр с1у Бег Азп ьуз Туг Туг С1у Азр Бег Уа1
50 55 60
Ьу5 О1у Агд РКе тКг 11е Бег Агд АЗр АЗП Бег ьуз АЗП тКг ьеи туг
65 70 75 80
ьеи Οίη ме! АЗП Бег ьеи Агд А1а О1и Азр ТКг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и С1и Ьеи О1у 11 е С1у Тгр Туг РКе Азр ьеи Тгр О1у Агд
100 105 110
01 у тКг ьеи Уа1 ТКг Уа1 Бег Бег
115 120
<210> 106 <211> 113 <212> БЕЛОК
<213> Ното : зарт епз
<400> 106 01и Уа1 Οίη ьеи Уа1 Οίη Бег С1у с! у С1у Ьеи Уа1 НТ 5 рго с! у 01 у
1 5 10 15
Бег ьеи Агд Ьеи Бег Суз а! а С1у Бег о1у РКе ТКг рКе Бег АЗП туг
20 25 30
А1а ме! нтз Тгр Уа1 Агд С1п А1а РГО с1у ьуз С1у ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Бег тКг 11е О1у тКг С1у С1у С1у тКг РГО туг А1а Азр Бег Уа1 ьуз
55 60
С1у Агд РЬе ТНг Не Бег Агд АЗр Азп А1а Ьуз Азп Бег Ьеи Туг Ьеи
65 70 75 80
С1 η мет АЗП Бег Ьеи Агд Αΐ а с1и Азр мет ΑΊ а Уа1 туг Туг суз А1а
85 90 95
Ьеи Бег д!а РНе Азр Уа1 тгр С1у с1п С1у ТКг мет Уа1 тНг Уа1 Бег
100 105 110
Бег

Claims (31)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированное моноклональное антитело, связывающееся с ОЕС-205 человека, содержащее вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:
    а) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 28, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 34;
    б) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 4, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 10;
    в) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 16, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 22;
    г) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 40, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 46;
    д) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 52, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 58;
    е) вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 76, и вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 82.
  2. 2. Изолированное моноклональное антитело, связывающееся с ОЕС-205 человека, содержащее аминокислотные последовательности СОК1, СОК2 и СОК3 вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из:
    ί) СОК1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 29;
    СОК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 30;
    СОК3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 31;
    СОК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 35;
    СОК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 36;
    СОК3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 37; ίί) СОК1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 17;
    СОК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 18;
    СОК3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 19;
    СОК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 23;
    СОК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 24;
    СОК3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 25; ίίί) СОК1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 5;
    СОК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 6;
    СОК3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 7;
    СОК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 11;
    СОК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 12;
    СОК3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 13; ίν) СОК1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 41;
    СОК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 42;
    СОК3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 43;
    СОК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 47;
    СОК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 48;
    СОК3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 49; ν) СОК1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 53;
    СОК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 54;
    СОК3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 55;
    СОК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 59;
    СОК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 60;
    СОК3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 61;
    - 86 026990 νί) СЭК1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 77;
    СЭК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 78;
    СЭК3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 79;
    СЭК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 83;
    СЭК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 84;
    СЭК3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 85.
  3. 3. Изолированное моноклональное антитело, связывающееся с ОЕС-205 человека, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями, которые выбирают из группы, состоящей из:
    а) последовательностей № 26 и 32 соответственно;
    б) последовательностей № 14 и 20 соответственно;
    в) последовательностей № 2 и 8 соответственно;
    г) последовательностей № 38 и 44 соответственно;
    д) последовательностей № 50 и 56 соответственно;
    е) последовательностей № 74 и 80 соответственно.
  4. 4. Изолированное моноклональное антитело по п.3, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность № 28, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность № 34.
  5. 5. Изолированное моноклональное антитело по п.3, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность № 4, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность № 10.
  6. 6. Изолированное моноклональное антитело по п.3, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность № 52, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность № 58.
  7. 7. Изолированное моноклональное антитело по п.4, содержащее:
    а) СЭЕ1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 29;
    б) СЭК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 30;
    в) СЭЕ3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 31;
    г) СЭК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 35;
    д) СЭК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 36;
    е) СЭЕ3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 37.
  8. 8. Изолированное моноклональное антитело по п.4, содержащее:
    а) СЭЕ1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 5;
    б) СЭК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 6;
    в) СЭЕ3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 7;
    г) СЭК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 11;
    д) СЭК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 12;
    е) СЭЕ3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 13.
  9. 9. Изолированное моноклональное антитело по п.4, содержащее:
    а) СЭЕ1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 53;
    б) СЭК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 54;
    в) СЭЕ3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность № 55;
    г) СЭК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 59;
    д) СЭК2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 60;
    е) СЭЕ3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность № 61.
  10. 10. Изолированное моноклональное антитело по п.5, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью № 26, и вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью № 32.
  11. 11. Изолированное моноклональное антитело по п.5, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью № 2, и вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью № 8.
  12. 12. Изолированное моноклональное антитело по п.5, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью № 50, и вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью № 56.
  13. 13. Изолированное антитело по любому из пп.1-8, представляющее собой человеческое антитело или химерное антитело.
  14. 14. Антитело по любому из пп.1-8, выбранное из группы, состоящей из антител 1д01, 1д02, 1д03, 1д04, 1дМ, 1дА1, 1дА2, 1дА§ес, 1дЭ и 1дЕ.
  15. 15. Вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по любому из пп.1-7.
  16. 16. Клетка, трансформированная вектором экспрессии по п.15.
  17. 17. Молекулярный конъюгат для индукции или усиления иммунного ответа, опосредованного Т- 87 026990 лимфоцитами, на антиген у субъекта, содержащий антитело по любому из пп.1-8, связанное с антигеном, выбранным из группы, состоящей из компонентов патогенного микроорганизма, опухолевого антигена, аллергена и аутоантигена.
  18. 18. Молекулярный конъюгат по п.17, в котором опухолевый антиген выбирают из группы, состоящей из β1ιί.Ό, др100 или Рте117, ^Т1, мезотелина, СЕА, др100, МΆКΤI, ТКР-2, ΝΥ-ΒΚ-1,
    ΝΥ-ί.Ό-58, МЫ (др250), идиотипа, тирозиназы, теломеразы, δδΧ2, МИС-1, МΆКΤI, мелана Α, NΥ-ЕδО1, МΑ0Е-1, МΑ0Е-3, МΑ0Е-Α3 и высокомолекулярного меланома-ассоциированного антигена (НМ^МАА).
  19. 19. Молекулярный конъюгат по п.17, в котором антиген представляет собой компонент ВИЧ, ВПЧ, вируса гепатита В или вируса гепатита С.
  20. 20. Молекулярный конъюгат по п.17, дополнительно содержащий терапевтический агент, выбранный из группы, состоящей из цитотоксического агента, агента-иммунодепрессанта и химиотерапевтического агента.
  21. 21. Фармацевтическая композиция для индукции или усиления иммунного ответа, опосредованного Т-лимфоцитами, на антиген у субъекта, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп.1-8 и фармацевтически эффективный носитель, причем антиген выбран из группы, состоящей из компонентов патогенного микроорганизма, опухолевого антигена, аллергена и аутоантигена.
  22. 22. Композиция по п.21, дополнительно содержащая терапевтический агент, выбранный из адъюванта или иммуностимулирующего агента.
  23. 23. Применение композиции по п.21 для получения лекарственного средства для нацеливания антигена на клетки, экспрессирующие человеческий ЛЕС-205 у субъекта.
  24. 24. Применение композиции по п.21 для получения лекарственного средства для индукции или усиления иммунного ответа на антиген у субъекта.
  25. 25. Применение композиции по п.21 для получения лекарственного средства для индукции или усиления иммунного ответа на антиген, опосредованного Т-лимфоцитами, у субъекта.
  26. 26. Применение композиции по п.21 для получения лекарственного средства, предназначенного для иммунизации субъекта против злокачественных опухолей, инфекционных заболеваний и аутоиммунных заболеваний.
  27. 27. Применение композиции по п.21 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у субъекта, где заболевание выбирается из группы, состоящей из злокачественных опухолей, инфекционных заболеваний и аутоиммунных заболеваний.
  28. 28. Способ выявления присутствия ЛЕС-205 в биологическом образце, включающий:
    а) обработку биологического образца антителом по любому из пп.1-8, где антитело помечено детектируемым соединением;
    б) выявление антитела, связанного с ЛЕС-205, для выявления комплекса антитело-ЛЕС-205, свидетельствующего о наличии в этом биологическом образце ЛЕС-205.
  29. 29. Применение молекулярного конъюгата, содержащего антитело по любому из пп.1-8, связанного с антигеном, для получения лекарственного средства для нацеливания антигена на В-лимфоцит, экспрессирующий человеческий ЛЕС-205, у субъекта.
  30. 30. Применение молекулярного конъюгата, содержащего антитело по любому из пп.1-8, связанного с антигеном, для получения лекарственного средства, индуцирующего или усиливающего иммунный ответ на этот антиген у субъекта, причем антиген выбран из группы, состоящей из компонентов патогенного микроорганизма, опухолевого антигена, аллергена и аутоантигена.
  31. 31. Применение молекулярного конъюгата, содержащего антитело по любому из пп.1-8, связанного с антигеном, для получения лекарственного средства, предназначенного для иммунизации субъекта против этого антигена, причем антиген выбран из группы, состоящей из компонентов патогенного микроорганизма, опухолевого антигена, аллергена и аутоантигена.
EA201000770A 2007-11-07 2008-11-07 Антитела, связывающиеся с человеческой клеткой dec-205 EA026990B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US225307P 2007-11-07 2007-11-07
US19155108P 2008-09-10 2008-09-10
PCT/US2008/082745 WO2009061996A2 (en) 2007-11-07 2008-11-07 Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (dec-205)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201000770A1 EA201000770A1 (ru) 2010-12-30
EA026990B1 true EA026990B1 (ru) 2017-06-30

Family

ID=40257038

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201000770A EA026990B1 (ru) 2007-11-07 2008-11-07 Антитела, связывающиеся с человеческой клеткой dec-205
EA201692127A EA201692127A1 (ru) 2007-11-07 2008-11-07 Антитела, связывающиеся с человеческим dec-205

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201692127A EA201692127A1 (ru) 2007-11-07 2008-11-07 Антитела, связывающиеся с человеческим dec-205

Country Status (18)

Country Link
US (4) US8236318B2 (ru)
EP (2) EP2570137A3 (ru)
JP (3) JP5701606B2 (ru)
KR (2) KR101811965B1 (ru)
CN (1) CN101888856B (ru)
AU (1) AU2008323848B2 (ru)
BR (1) BRPI0820270A2 (ru)
CA (1) CA2704583A1 (ru)
DK (1) DK2224954T3 (ru)
EA (2) EA026990B1 (ru)
ES (1) ES2445755T3 (ru)
HK (1) HK1146898A1 (ru)
IL (1) IL205393A (ru)
MX (1) MX2010005022A (ru)
NZ (2) NZ599777A (ru)
SG (2) SG187482A1 (ru)
WO (1) WO2009061996A2 (ru)
ZA (1) ZA201003101B (ru)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7404950B2 (en) * 2003-02-18 2008-07-29 Baylor College Of Medicine Induced activation in dendritic cell
JP5285278B2 (ja) 2004-12-22 2013-09-11 クリーブランド クリニック ファウンデイション フラゲリン関連ポリペプチドおよびその使用
US8691210B2 (en) * 2006-10-19 2014-04-08 David M Spencer Methods and compositions for generating an immune response by inducing CD40 and pattern recognition receptors and adaptors thereof
EP2115002B1 (en) * 2007-02-02 2014-08-20 Baylor Research Institute Vaccines based on targeting antigen to dcir expressed an antigen-presenting cells
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
ES2445755T3 (es) 2007-11-07 2014-03-05 Celldex Therapeutics, Inc. Anticuerpos que se unen a células dendríticas y epiteliales humanas 205 (DEC-205)
AU2009276357B2 (en) 2008-08-01 2014-09-11 Cleveland Biolabs, Inc. Methods for treating reperfusion injuries
JP6133538B2 (ja) 2008-09-22 2017-05-24 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｄ４０およびパターン認識受容体アダプターを誘発することによる免疫応答を生成するための方法および組成物
EP3029070A1 (en) 2009-08-29 2016-06-08 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
IN2012DN02368A (ru) * 2009-09-14 2015-08-21 Baylor Res Insitute
AU2010303304A1 (en) * 2009-10-08 2012-05-17 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for amelioration of autoimmune disease using fusion proteins of anti-dendritic cell receptor antibody to peptide sequences
US8846872B2 (en) 2009-11-18 2014-09-30 Mannkind Corporation Monoclonal antibodies and diagnostic uses thereof
EP3680253A3 (en) * 2010-03-02 2020-09-30 AbbVie Inc. Therapeutic dll4 binding proteins
WO2011130434A2 (en) 2010-04-13 2011-10-20 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
JP5975983B2 (ja) * 2010-04-16 2016-08-23 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 固形腫瘍を処置するための方法
WO2011146862A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing selective apoptosis
DE102010039019B4 (de) 2010-08-06 2014-08-07 Technische Universität Dresden Antikörper gegen 6-sulfo LacNAc positive humane dendritische Zellen und deren Verwendung
AR082686A1 (es) * 2010-08-13 2012-12-26 Baylor Res Inst Adyuvantes de vacuna que direccionan a los adyuvantes de anticuerpos directamente hacia las celulas presentadoras de antigenos
US11207109B2 (en) 2010-10-20 2021-12-28 206 Ortho, Inc. Method and apparatus for treating bone fractures, and/or for fortifying and/or augmenting bone, including the provision and use of composite implants, and novel composite structures which may be used for medical and non-medical applications
US11291483B2 (en) 2010-10-20 2022-04-05 206 Ortho, Inc. Method and apparatus for treating bone fractures, and/or for fortifying and/or augmenting bone, including the provision and use of composite implants
WO2015095745A1 (en) 2010-10-20 2015-06-25 206 Ortho, Inc. Method and apparatus for treating bone fractures, and/or for fortifying and/or augmenting bone, including the provision and use of composite implants, and novel composite structures which may be used for medical and non-medical applications
US11484627B2 (en) 2010-10-20 2022-11-01 206 Ortho, Inc. Method and apparatus for treating bone fractures, and/or for fortifying and/or augmenting bone, including the provision and use of composite implants, and novel composite structures which may be used for medical and non-medical applications
KR101614997B1 (ko) * 2011-01-10 2016-04-22 씨티 아틀란틱 엘티디. 종양 관련 항원 결합 항체를 포함하는 조합 요법
MX361355B (es) 2011-01-10 2018-12-04 Cleveland Biolabs Inc Uso del agonista del receptor tipo toll para el tratamiento del cáncer.
US20130017151A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Baylor Research Institute SUBSETS OF ANTIGEN-PRESENTING CELLS (APCs) IN THE HUMAN VAGINA AND THEIR DISTINCT FUNCTIONS
CA2843200A1 (en) * 2011-07-27 2013-01-31 Baylor Research Institute Dendritic cell (dc)-vaccine therapy for pancreatic cancer
SG10201702396QA (en) * 2012-03-28 2017-04-27 Sanofi Sa Antibodies to bradykinin b1 receptor ligands
GB201220010D0 (en) * 2012-11-07 2012-12-19 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic amd diagnostic target
CN103044552B (zh) * 2012-12-11 2019-01-29 中国医学科学院病原生物学研究所 人源化的抗树突状细胞表面dec-205分子的单克隆抗体
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
EP2968502B1 (en) 2013-03-14 2020-08-26 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlling t cell proliferation
US20140302037A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
WO2014197638A2 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing partial apoptosis using caspase polypeptides
MX346878B (es) 2013-06-26 2017-03-28 Univ Nac Autónoma De México Nuevos anticuerpos monoclonales contra el receptor dec-205 de celulas dendriticas de pollo.
CN103409451A (zh) * 2013-06-28 2013-11-27 扬州维克斯生物科技有限公司 一种向树突状细胞dc靶向加载肿瘤抗原肽的方法
PT3055331T (pt) 2013-10-11 2021-04-05 Oxford Bio Therapeutics Ltd Anticorpos conjugados contra ly75 para o tratamento de cancro
CN106132423B (zh) 2014-02-14 2020-07-31 贝里坤制药股份有限公司 用诱导型嵌合多肽活化t细胞的方法
MX2017001279A (es) 2014-07-30 2017-08-07 Cleveland Biolabs Inc Usos y composiciones de la flagelina.
AU2015312117A1 (en) 2014-09-02 2017-03-02 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Costimulation of chimeric antigen receptors by Myd88 and CD40 polypeptides
US10183056B2 (en) 2014-10-16 2019-01-22 Cleveland Biolabs, Inc. Methods and compositions for the treatment of radiation-related disorders
AU2015341481C1 (en) 2014-11-03 2021-09-16 ACADEMISCH ZIEKENHUIS LEIDEN (h.o.d.n. LUMC) T cell receptors directed against Bob1 and uses thereof
EP3268037B1 (en) 2015-03-09 2022-08-31 Celldex Therapeutics, Inc. Cd27 agonists
CN107056932B (zh) * 2016-12-24 2021-04-09 深圳大学 一种氨基酸序列、含ova表位的融合蛋白及其制备方法和应用
GB201703876D0 (en) 2017-03-10 2017-04-26 Berlin-Chemie Ag Pharmaceutical combinations
BR112019021520A2 (pt) 2017-04-14 2020-08-04 Tollnine, Inc. oligonucleotídeo, composto, polinucleotídeo imunomodulador, composição, conjugado, método para modular um receptor, método de tratamento de um tumor, método de tratamento de câncer, método para tratar um tumor, método de prevenção de câncer, método para induzir uma resposta imune
LT3691692T (lt) * 2017-10-14 2021-05-10 Abbvie Inc. Aktyvuojami anti-cd71 antikūno-vaisto konjugatai ir jų panaudojimo būdai
EP3700557A4 (en) * 2017-10-27 2021-07-28 Indian Institute of Science DENDRITIC CELL VACCINE
BR112020021271A2 (pt) 2018-04-17 2021-01-26 Celldex Therapeutics, Inc. construtos bispecíficos e anticorpos anti- cd27 e anti-pd-l1
GB201809746D0 (en) 2018-06-14 2018-08-01 Berlin Chemie Ag Pharmaceutical combinations
WO2019244973A1 (ja) * 2018-06-20 2019-12-26 中外製薬株式会社 標的細胞に対する免疫反応を活性化する方法およびその組成物
JP7396275B2 (ja) 2018-06-29 2023-12-12 日本ゼオン株式会社 識別媒体、真正性判定方法、及び物品
WO2020123444A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Celldex Therapeutics, Inc. Methods of using cd27 antibodies as conditioning treatment for adoptive cell therapy
CN111303284A (zh) * 2018-12-12 2020-06-19 尚华科创投资管理（江苏）有限公司 抗人白细胞介素5(il-5)单克隆抗体及其应用
WO2021108637A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treating diseases and conditions by depletion of mitochondrial or genomic dna from circulation
EP4106819A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Silverback Therapeutics, Inc. Nectin-4 antibody conjugates and uses thereof
US11920136B2 (en) 2020-02-28 2024-03-05 Tallac Therapeutics, Inc. Transglutaminase-mediated conjugation
KR20230047361A (ko) 2020-07-01 2023-04-07 아르스 파마슈티컬스 인크. 항-asgr1 항체 접합체 및 이의 용도
AU2022253269A1 (en) 2021-04-09 2023-11-23 Celldex Therapeutics, Inc. Antibodies against ilt4, bispecific anti-ilt4/pd-l1 antibody and uses thereof
EP4346882A1 (en) 2021-05-26 2024-04-10 Oxford BioTherapeutics Ltd Pharmaceutical combination comprising an anti-cd205 antibody and an immune checkpoint inhibitor
WO2023077521A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Celldex Therapeutics, Inc Anti-ilt4 and anti-pd-1 bispecific constructs
EP4433170A1 (en) 2021-11-18 2024-09-25 Oxford BioTherapeutics Ltd Pharmaceutical combinations
CN115028741A (zh) * 2022-06-21 2022-09-09 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 一种肿瘤抗原抗体复合物及制备方法和应用
CN114989311A (zh) * 2022-06-21 2022-09-02 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 3g9-lnm抗体偶联蛋白及其制备方法和应用
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035619A1 (en) * 2002-10-18 2004-04-29 Centenary Institute Cancer Medicine & Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
WO2004074432A2 (en) * 2003-01-31 2004-09-02 Celldex Therapeutics, Inc. Antibody vaccine conjugates and uses therefor
US20040258688A1 (en) * 1995-01-31 2004-12-23 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
WO2005018610A1 (en) * 2003-08-21 2005-03-03 Lipotek Pty Ltd In vivo targeting of dendritic cells
US20050186612A1 (en) * 1996-05-29 2005-08-25 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Dendritic cell receptor

Family Cites Families (119)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2857090A (en) * 1955-06-02 1958-10-21 Crown Zellerbach Corp Container for heavy articles
US2887389A (en) * 1955-06-03 1959-05-19 Creath Q Linville Cartons
US3164316A (en) * 1962-05-21 1965-01-05 Weyerhaeuser Co Carton
US3353740A (en) * 1965-12-28 1967-11-21 Int Paper Co Reclosable carton
US3447735A (en) * 1967-07-03 1969-06-03 Western Kraft Corp Easy-opening container
US3552633A (en) * 1969-10-27 1971-01-05 Inland Container Corp Pallet case
US3698548A (en) * 1970-06-15 1972-10-17 Robert N Stenzel Box for dispensing flexible sheet material
US3883067A (en) * 1972-12-15 1975-05-13 Continental Can Co Carton corner construction
US4267959A (en) * 1979-10-22 1981-05-19 Westvaco Corporation Hinged paperboard container
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) * 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US4954617A (en) * 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
DE3856559T2 (de) * 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
HU216017B (hu) 1987-11-18 1999-04-28 Chiron Corp. Eljárás HCV-1 polipeptidek, HCV-1 polinukleotidok, rekombináns vektorok és gazdasejtek, valamint immunesszé kit, hepatitis C vírusfertőzés elleni vakcinák, a fertőzés kimutatására szolgáló diagnosztikumok előállítására, és immunvizsgálati és vírustenyészt
US5804381A (en) 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
EP0438803B1 (en) * 1990-01-26 1997-03-12 Immunomedics, Inc. Vaccines against cancer and infectious diseases
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
JPH06501620A (ja) 1990-11-06 1994-02-24 ザ・チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレイション 可溶性マンノース受容体ペプチド
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1993001227A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
DE4123760C2 (de) 1991-07-18 2000-01-20 Dade Behring Marburg Gmbh Seroreaktive Bereiche auf den HPV 16 Proteinen E1 und E2
GB9117522D0 (en) 1991-08-14 1991-10-02 Medical Res Council Ligands for dendritic cells, their uses and production
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5620886A (en) 1993-03-18 1997-04-15 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
WO1995012409A1 (en) * 1993-11-04 1995-05-11 Canterbury Health Limited Dendritic cell-specific antibodies and methods for their preparation
WO1995015340A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Monoclonal antibodies to antigens expressed by human dendritic cells
US5541110A (en) * 1994-05-17 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Cloning and expression of a gene encoding bryodin 1 from Bryonia dioica
EP1167377B2 (en) 1994-07-15 2012-08-08 University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5698679A (en) * 1994-09-19 1997-12-16 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for targeting an immune response
US7635479B2 (en) 2000-03-29 2009-12-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composition and methods for enhancing immunogenecity of antigens
WO1996023882A1 (en) 1995-01-31 1996-08-08 The Rockefeller University IDENTIFICATION OF DEC, (DENTRITIC AND EPITHELIAL CELLS, 205 kDa), A RECEPTOR WITH C-TYPE LECTIN DOMAINS, NUCLEIC ACIDS ENCODING DEC, AND USES THEREOF
US20020187131A1 (en) * 1995-01-31 2002-12-12 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
US5840306A (en) 1995-03-22 1998-11-24 Merck & Co., Inc. DNA encoding human papillomavirus type 18
US5869057A (en) * 1995-06-07 1999-02-09 Rock; Edwin P. Recombinant vaccines to break self-tolerance
US6440418B1 (en) * 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
US6080409A (en) * 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US6117977A (en) * 1996-04-24 2000-09-12 Genentech, Inc. Type C lectins
US5922845A (en) * 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
US6069233A (en) 1996-10-03 2000-05-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
EP0956304B1 (en) * 1996-10-09 2004-12-15 Canterbury Health Limited Dendritic cell-specific antibodies
CA2295308C (en) * 1997-07-09 2010-12-14 Schering Corporation Isolated dendritic cell membrane protein genes
EP1027063B1 (en) 1997-09-29 2009-02-18 The Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd Mannose receptor bearing cell line and antigen composition
US6340569B1 (en) * 1997-11-12 2002-01-22 University Of Pittsburgh Monoclonal antibody and antigens specific therefor and methods of using same
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2323083A1 (en) 1998-03-17 1999-09-23 Schering Corporation Isolated mammalian membrane protein genes and related reagents
JP2002511423A (ja) 1998-04-09 2002-04-16 スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
EP1073464B1 (en) 1998-04-28 2004-10-06 Smithkline Beecham Corporation Monoclonal antibodies with reduced immunogenicity
WO1999058678A2 (en) 1998-05-11 1999-11-18 Micromet Gmbh Antibodies to dendritic cells and human dendritic cell populations and uses thereof
AU4954899A (en) 1998-06-26 2000-01-17 Trustees Of Dartmouth College Methods and compositions for modulating antigen-specific immunological (humoral)responses by targeting such antigen to apcs in conjunction with anti-cd40 ligan d administration
KR100295558B1 (ko) 1998-06-27 2001-07-12 김기태 1차면역세포들중덴드리틱세포(dendriticcell)표면에특이하게작용하는단클론항체3-6-a
EP0997476A3 (en) 1998-09-25 2000-07-19 Schering-Plough Antibodies to a mammalian Langerhans cell antigen and their uses
HUP0200155A3 (en) * 1999-02-18 2005-04-28 Hoffmann La Roche Thioamide derivatives, pharmaceutical compositions containing them and their use
EP1046651A1 (en) 1999-04-19 2000-10-25 Koninklijke Universiteit Nijmegen Composition and method for modulating dendritic cell-T interaction
US6794132B2 (en) 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
US6774226B1 (en) 1999-11-30 2004-08-10 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof
JP2003530836A (ja) * 2000-04-12 2003-10-21 ユニバーシティー オブ ロチェスター 標的化ワクチン送達システム
US7201714B2 (en) * 2000-04-27 2007-04-10 Graphic Packaging International, Inc. Paperboard cartons with laminated reinforcing ribbons and method of printing same
US7560534B2 (en) 2000-05-08 2009-07-14 Celldex Research Corporation Molecular conjugates comprising human monoclonal antibodies to dendritic cells
KR100643818B1 (ko) 2000-05-08 2006-11-10 셀덱스 쎄라퓨틱스, 인크. 수상세포에 대한 인간 모노클로날 항체
GB0105360D0 (en) * 2001-03-03 2001-04-18 Glaxo Group Ltd Chimaeric immunogens
US6794501B2 (en) 2001-05-04 2004-09-21 Ludwig Institute For Cancer Research Colon cancer antigen panel
AU2002363861A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-10 Crucell Holland B.V. Antigen presenting cell targeting conjugate, an intigen presenting cell contacted with such conjugate, their use for vaccination or as medicament, and methods for their production or generation
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
WO2004026326A2 (en) 2002-09-20 2004-04-01 Stichting Katholieke Universiteit Antigen uptake receptor for candida albicans on dendritic cells
CN1756564A (zh) 2003-03-04 2006-04-05 亚历森制药有限公司 通过耐受诱导抗原递呈细胞诱导抗原呈递治疗自身免疫性疾病的方法
US6834793B2 (en) * 2003-05-31 2004-12-28 Graphic Packaging International, Inc. Enclosed container carton convertible into a tray
KR100918746B1 (ko) * 2004-09-06 2009-09-24 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항 ａ３３ 항체
EP1926665B1 (en) * 2005-09-21 2015-11-11 Graphic Packaging International, Inc. Carton and method of forming a carton
KR101373464B1 (ko) * 2005-12-08 2014-03-14 메다렉스, 엘.엘.시. 단백질 티로신 키나제 7(ｐｔｋ7)에 대한 인간 단일클론항체 및 그의 용도
NZ568015A (en) * 2005-12-08 2012-03-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to O8E
ES2445755T3 (es) 2007-11-07 2014-03-05 Celldex Therapeutics, Inc. Anticuerpos que se unen a células dendríticas y epiteliales humanas 205 (DEC-205)
JP6136343B2 (ja) 2012-06-12 2017-05-31 株式会社リコー 情報処理システム、情報処理方法、プログラム、及び記録媒体
KR102264548B1 (ko) 2014-11-21 2021-06-16 삼성전자주식회사 반도체 패키지 및 그 제조 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040258688A1 (en) * 1995-01-31 2004-12-23 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
US20050186612A1 (en) * 1996-05-29 2005-08-25 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Dendritic cell receptor
WO2004035619A1 (en) * 2002-10-18 2004-04-29 Centenary Institute Cancer Medicine & Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
WO2004074432A2 (en) * 2003-01-31 2004-09-02 Celldex Therapeutics, Inc. Antibody vaccine conjugates and uses therefor
WO2005018610A1 (en) * 2003-08-21 2005-03-03 Lipotek Pty Ltd In vivo targeting of dendritic cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BADIEE, A. DAVIES, N. MCDONALD, K. RADFORD, K. MICHIUE, H. HART, D. KATO, M.: "Enhanced delivery of immunoliposomes to human dendritic cells by targeting the multilectin receptor DEC-205", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 25, no. 25, 30 May 2007 (2007-05-30), AMSTERDAM, NL, pages 4757 - 4766, XP022098619, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/j.vaccine.2007.04.029 *
GUO M , ET AL: "A monoclonal antibody to the DEC-205 endocytosis receptor on human dendritic cells.", HUMAN IMMUNOLOGY, NEW YORK, NY, US, vol. 61, no. 8, 1 August 2000 (2000-08-01), US, pages 729 - 738, XP002319045, ISSN: 0198-8859, DOI: 10.1016/S0198-8859(00)00144-0 *

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201003101B (en) 2014-10-29
JP2017014218A (ja) 2017-01-19
SG187482A1 (en) 2013-02-28
IL205393A0 (en) 2010-12-30
EP2570137A2 (en) 2013-03-20
HK1146898A1 (en) 2011-07-22
WO2009061996A3 (en) 2009-09-03
US8586720B2 (en) 2013-11-19
WO2009061996A2 (en) 2009-05-14
KR101624751B1 (ko) 2016-05-27
MX2010005022A (es) 2010-06-02
US20120309031A1 (en) 2012-12-06
EP2570137A3 (en) 2013-08-21
JP2015083010A (ja) 2015-04-30
KR101811965B1 (ko) 2017-12-22
EP2224954B1 (en) 2014-01-08
EP2224954A2 (en) 2010-09-08
NZ585556A (en) 2012-07-27
CA2704583A1 (en) 2009-05-14
ES2445755T3 (es) 2014-03-05
AU2008323848A1 (en) 2009-05-14
US20100098704A1 (en) 2010-04-22
CN101888856B (zh) 2014-08-27
EA201692127A1 (ru) 2017-08-31
SG10201605208QA (en) 2016-08-30
BRPI0820270A2 (pt) 2015-06-16
NZ599777A (en) 2013-09-27
US8236318B2 (en) 2012-08-07
US20130101593A1 (en) 2013-04-25
IL205393A (en) 2015-04-30
US20090175880A1 (en) 2009-07-09
DK2224954T3 (en) 2014-03-03
US8362214B2 (en) 2013-01-29
JP6067667B2 (ja) 2017-01-25
CN101888856A (zh) 2010-11-17
KR20160017128A (ko) 2016-02-15
US9624300B2 (en) 2017-04-18
JP2011503014A (ja) 2011-01-27
AU2008323848B2 (en) 2014-09-25
EA201000770A1 (ru) 2010-12-30
JP5701606B2 (ja) 2015-04-15
KR20100100857A (ko) 2010-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA026990B1 (ru) Антитела, связывающиеся с человеческой клеткой dec-205
AU2017203511B2 (en) T cell receptor-like antibodies specific for a WT1 peptide presented by HLA-A2
JP6917902B2 (ja) Ｃｔｌａ４に結合する抗体医薬
CN109963591B (zh) B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途
JP6433470B2 (ja) 樹状細胞マーカーおよびその使用法
RU2376315C2 (ru) Композиция и способ регулирования активности естественных клеток-киллеров
JP2021054858A (ja) Ｃｄ４７に結合する抗体医薬
CN106432493B (zh) 抗-cd40抗体及其用途
JP2021118699A (ja) グリカン相互作用化合物及び使用方法
EA024701B1 (ru) Антитела, связывающие cd27 человека, и их применение
US20220119529A1 (en) An anti-b7-h3 antibody
CN107849132A (zh) 人源化的和亲和力成熟的针对FcRH5的抗体和使用方法
JP2017500028A (ja) 新規の抗ｄｐｅｐ３抗体および使用方法
CN105837691A (zh) 靶向抗原呈递细胞的癌症疫苗
JP2001521520A (ja) 抗α▲下ｖ▼β▲下３▼インテグリン抗体アンタゴニスト
JP2022523200A (ja) 活性化可能な免疫チェックポイント阻害剤とコンジュゲートされた活性化可能な抗体の組み合わせ療法
CN112566937A (zh) 对cd3特异性的抗体及其用途
WO2023001303A1 (zh) 药物组合物及用途
MXPA06009759A (es) Codocito para trastornos por linfocitos b.
TW201800106A (zh) 新穎之抗ｕｐｋ１ｂ抗體及使用方法
Wang et al. Antigen targeting to dendritic cells with bispecific antibodies
CN102282172A (zh) 抗伸展的ⅰ型鞘糖脂抗体、其衍生物以及用途
WO2019192432A1 (zh) 结合淋巴细胞活化基因-3(lag-3)的抗体及其用途
WO2024035341A1 (en) Cd30 antigen-binding molecules
JP2022516408A (ja) 単離されたＭＨＣ由来ヒトペプチドおよびＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの抑制機能を刺激し、かつ活性化するためのその使用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU