CN102282172A - 抗伸展的ⅰ型鞘糖脂抗体、其衍生物以及用途 - Google Patents

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Abstract

提供了特异性结合伸展的I型链鞘糖脂的人抗体和这些抗体的抗原结合部分。

Description

抗伸展的Ⅰ型鞘糖脂抗体、其衍生物以及用途
发明领域
本发明涉及抗伸展的I型鞘糖脂抗体(anti-extended type-Iglycosphingolipid antibody)及其在改善、治疗或预防哺乳动物包括人类中由伸展的I型鞘糖脂不适当的活性或代谢所引起的疾病或失调中的用途；在导致、引起或与所述伸展的I型鞘糖脂不适当的活性或代谢相关的疾病或失调中的用途或在改善、治疗或预防所述伸展的I型鞘糖脂不适当的活性或代谢中的用途，例如在癌症如结肠直肠癌或其它病理学中的用途。感兴趣的抗体可用于治疗目的或诊断目的。因此，还公开了包含感兴趣的所述抗体及其衍生物的预防性、免疫治疗性和诊断性组合物以及它们在预防或治疗、或诊断哺乳动物包括人的疾病的方法中的用途，所述疾病由伸展的I型鞘糖脂(type-I glycosphingolipid)在细胞中和细胞上(如某些恶性细胞)不适宜的代谢和/或表达所引起的。
发明背景
伸展的I型鞘糖脂是可能与例如某些恶性状态相关的细胞表面分子。
异常的糖基化已被注意到是许多癌症类型的共同特征，Hakomori，PNAS 99：10231-10233，2002。一些用于人类癌症的诊断的碳水化合物抗原携有多聚乳糖胺结构。多聚乳糖胺根据单元结构通常被分为两个类别。具有Galβ1→3GlcNAc结构的多聚乳糖胺被称为I型链，具有Galβ1→4GlcNAc结构的被称为II型链。在一些人类癌症中发现的最常见的肿瘤相关抗原具有乳糖系列(lacto-series)II型链结构，其通常是唾液酸化和/或岩藻糖基化的。I型链抗原在正常细胞和组织中大量存在，并偶尔与癌症相关，Stroudet al.，JBC 266：8439-8446，1991。例如，2→3唾液酸化的Lea抗原(由N 19-9抗体所定义的CA 19-9抗原)是癌症相关I型链抗原。然而，基于检测那些I型抗原的癌症诊断方法受到了高假阳性和/或高假阴性发生率的妨碍，参见例如美国专利号6,083,929和6,294,523。
针对伸展的I型链抗原产生了两种小鼠单克隆抗体，NCC-ST421和IMH2。NCC-ST421特异于Lea-Lea。所述NCC-ST421抗体使用人外周血白细胞作为效应物强烈诱导针对多种人肿瘤细胞的抗体依赖性细胞胞毒性(ADCC)以及诱导具有人补体来源的补体依赖性胞毒性(CDC)，Watanabe etal.，Cancer Res.51：2199-2204，1991。所述Lea-Lea抗原被发现在人结肠癌细胞系Colo205中高表达。
IMH2也是针对伸展的I型链而建立的。基于1H-NMR、FAB-MS和酶降解研究，IMH2结合Leb-Lea、Ley-Lex、Leb和Ley，Stroud et al.，Eur.J.Biochem.203：577-586，1992。IMH2在体外显示出强淋巴细胞激活性以及补体依赖性杀伤Colo205细胞，以及在体内抑制Colo205生长。
IMH2与源自结肠、胰腺、肝和子宫内膜的癌组织反应。然而，正常的结肠显示出与IMH2无反应性。正常的肝和胰腺在正常的肝细胞和胰岛细胞中显示出弱或高度受限的反应性。免疫化学染色强度在子宫内膜癌中要比在正常子宫内膜中强得多，Ito et al.，Cancer Res.52：3739-3745，1992。
接种表达所述伸展的I型链抗原的人肿瘤细胞后，NCC-ST421和IMH2在裸鼠中均展现出对肿瘤生长的抑制，但是在不表达伸展的I型链抗原的肿瘤细胞中未发生生长的抑制。
由于正常细胞上I型结构的高丰度，迄今为止使用I型抗体用于诊断和/或治疗目的是不可能的。
常规的癌症治疗如化疗和放疗已经在各种癌症患者中显示出一些优势。尽管常规疗法中有抗肿瘤活性的益处，然而治疗诱导的对正常组织的毒性可大大地降低癌症患者的生活质量。用于更好的抗肿瘤活性的剂量增强也受到限制。单克隆抗体使得能产生集中于肿瘤组织而非正常组织的靶向胞毒性的希望。
可开发出对肿瘤细胞上表达的抗原具有高特异性的单克隆抗体(mAb)，其可以引发期望的抗肿瘤活性。产生完全人mAb的小鼠的开发更促进了mAb的希望。一种此工具是KM小鼠，美国专利号7,041,870和Tomizuka etal.，Nat.Genet.16：133-143，1997。在KM小鼠中，编码免疫球蛋白的小鼠基因被失活并用人抗体基因置换。因此，KM小鼠表达完全人抗体。
使用KM小鼠已经成功开发了若干完全人抗体。
例如，Motoki et al.开发了人IgG(KMTR2)，其引起TRAIL-R2的抗体依赖性寡聚化并启动了有效凋亡信号传导以及不依赖于宿主效应物功能的肿瘤退化(Clin.Cancer Res.11(8)：3126-3135，2005；及见美国专利号7,115,717和Imakire et al.，Int.J.Cancer 108：564-570，2004)。特异于人白细胞抗原DR(HLA-DR)的完全人单克隆抗体HD8在体外产生抗体依赖性细胞胞毒性(ADCC)和补体依赖性胞毒性(CDC)并且延长了接种非霍奇金淋巴瘤细胞系的无免疫应答小鼠的寿命，Tawara et al.，Cancer Sci.98(6)921-928，2007。
另外，也报道了在KM小鼠中产生的针对碳水化合物抗原的两种人IgM。HMMC-I特异性识别新的O-聚糖结构，与苗勒氏管(Mullerian duct)相关癌阳性反应并对人子宫内膜癌细胞系SNG-S显示补体依赖性胞毒性，Nozawa et al.，Clin Cancer Res.10：7071-7078，2004。另一种识别位于细胞膜上糖蛋白的人单克隆IgM HMOCC-1与卵巢癌反应(Suzuki et al.，Gynecol.Oncol.95：290-298，2004)。由于那两种抗体是IgM，那些抗体在癌症治疗中的应用会受到分子大小和生产中局限的限制。
发明概述
本发明提供了特异性结合伸展的I型鞘糖脂的新型人抗体以及其片段和衍生物。
本发明包括所述抗体的可变重链和轻链的氨基酸序列以及它们相应的核酸序列。
本发明的另一个实施方案包括感兴趣抗体的互补性决定区(CDR)序列以获得结合分子，所述结合分子包含一或多个CDR区或者CDR衍生区，保留了所述CDR所得自的亲代分子(parent molecule)结合伸展的I型鞘糖脂的能力。
本发明的另一个实施方案包括载有本发明抗体序列的细胞系和载体。
本发明的另一个实施方案涉及所述抗体在制备治疗与伸展的I型鞘糖脂功能、代谢和表达相关的疾病和失调的药物或组合物中的用途。
本发明的另一个实施方案涉及所述抗体在诊断与非典型或不正常的伸展的I型鞘糖脂生物学和表达相关的失调中的用途。
在针对伸展的I型链碳水化合物抗原的人单克隆抗体的开发中满足了那些以及其它目的。例如，mAb GNX-8是源自KM小鼠的人IgG1。GNX-8对若干人结肠直肠癌细胞系显示了CDC和ADCC活性并在体内抑制Colo205和DLD-1肿瘤生长。GNX-8与原发和转移性结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌以及肺癌反应，但不与正常人组织和血细胞反应。
另外的特征和优势在本文中描述，并将通过下面的发明详述而变清楚。
发明详述
本发明不限于本文所描述的特定方法学、方案、多肽、多核苷酸、细胞系、载体或试剂，因为在不背离本发明精神和范围的情况下可发生或者使用变化。此外，本文所使用的术语仅用于对特定的技术方案进行示例的目的而并非意图限制本发明的范围。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩写词均具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。类似或等价于本文所述的那些的任何方法和材料均可用于实施本发明，而本文仅描述示例性的方法、装置和材料。
本文所提及的所有专利和出版物通过描述和揭示其中所报道的可用于本发明的蛋白、酶、载体、宿主细胞和方法学而以全文援引加入本文。然而，本文没有内容可被解释为认可前述发明的公开在本发明之前。
“伸展的I型鞘糖脂疾病”是一种病态(malady)、失调(disorder)、疾病、病理学、病症(condition)、异常(abnormality)等等，其特征在于与下述相关或由下述所引起：伸展的I型鞘糖脂例如在细胞表面的不正常代谢、过表达或增加的水平。
关于抗体多肽序列的措辞“基本上一致”可理解为抗体链与参考多肽序列展现出至少70％、80％、90％、95％或更高的序列相同性。关于核酸序列的所述术语可理解为核苷酸序列与参考核酸序列展现出至少约85％、90％、95％、97％或更高的序列相同性。
术语“相同性”或“同源性”可以是指候选序列中与其所对比的相应序列的残基相同的核苷酸碱基或氨基酸残基的百分比，如果必要，在比对序列并引入缺口(gap)后以达成整个序列最大百分比相同性，且不将任何保守取代看做序列相同性的部分。N-端或者C-端延伸或插入均不会被理解为降低相同性或同源性。用于序列比对的方法和计算机程序是可得的并且是本领域中熟知的。序列相同性可以用序列分析软件来测量。
短语和术语抗体、核酸或抗原的“功能性片段、变体、衍生物或类似物”和类似以及其形式是指与感兴趣的全长抗体或抗原具有同样性质的生物学活性的化合物或分子。例如，抗伸展的I型鞘糖脂抗体的功能性片段或类似物是能够结合伸展的I型鞘糖脂分子的一种，或者是结合伸展的I型鞘糖脂的激动性(agonistic)或拮抗性抗体。一个例子是scFv分子。对于伸展的I型鞘糖脂，其变体或衍生物是与天然产生的伸展的I型鞘糖脂不相同然而却可以用于本发明目的的分子，如虽然与野生型伸展的I型鞘糖脂不相同但却可以用作例如免疫原以产生选择性结合野生型伸展的I型鞘糖脂的抗体。
“取代”变体是在天然序列中具有至少一个氨基酸残基被移除并用插入到同样位置上的不同氨基酸置换的那些。取代可以是单一的，其中所述分子中仅有一个氨基酸被取代，或者可以是多重的，其中在同一分子中两或多个氨基酸被取代。多个取代可以在连续的位点。一个氨基酸也可以被多个残基置换，这种情况下此变体包含取代和插入。
“插入”变体是在天然序列中紧接着特定位置上的氨基酸插入一或多个氨基酸的那些。紧接着氨基酸是指连接到所述氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。
“缺失”变体是在天然氨基酸序列中有一或多个氨基酸被移除的那些。通常，缺失变体会在分子的特定区域中有一或多个氨基酸被缺失。
术语取代、插入和缺失变体也类似地用于核酸。
适应性免疫应答有两种主要的手段：T淋巴细胞的细胞免疫应答和分泌抗体的B淋巴细胞的体液免疫应答。B细胞表位可以是线性、连续的氨基酸，或者可以是构象性的(Protein Science(2005)14，246)。相反，T细胞表位是裂解自抗原蛋白的短线性肽，所述抗原蛋白出现于主要组织相容性复合物(MHC)蛋白中，或者在人的情况中在人白细胞抗原(HLA)I类或II类分子中。表位呈递依赖于MHC-肽结合以及T细胞受体(TCR)相互作用。MHC蛋白是高度多态性的，并且每个结合有限的一组肽。因此，宿主中存在的MHC等位基因的特定组合限制了感染过程中所识别的潜在表位的范围。
T细胞两种基本类型通过CD8和CD4蛋白的表达区分，其分别决定了T细胞是否识别由I类或II类分子呈递的表位。CD4+T表位在包囊后由抗原递呈细胞在膜结合囊泡(vesicle)中加工，在该处所述抗原由蛋白酶降解成肽片段，所述片段结合MHC II类蛋白。相反，CD8+T细胞一般识别从细胞内表达的病毒或自体抗原，在细胞质中由免疫蛋白酶体(immunoproteasome)裂解成短肽的蛋白。在裂解后，肽被与抗原加工关联的转运蛋白(TAP)转运到内质网内用于装载到HLA I抗原上。CD4+T(辅助性)细胞表位在推动对蛋白抗原的T细胞依赖性免疫应答中至关重要。
术语“抗体”以最宽的意义来使用，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段或者携带一或多个CDR或CDR衍生序列的合成多肽，只要所述多肽展现出所期望的生物学活性。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。一般来说，抗体被看作是具有给定的或已识别的特异性的Ig。因此，抗体展现出对特异靶的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏靶特异性的抗体样分子。
本发明的抗体可以是任何类的(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)或者亚类(例如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)(“型”和“类”和“亚型”和“亚类”在本文可互换使用)。天然或野生型(即得自群体的非人工操纵的成员)抗体和免疫球蛋白及多聚抗体的单体如IgA和IgM通常是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每个重链在一端具有可变结构域(VH)，其后为数个恒定结构域。每个轻链在一端具有可变结构域(VL)并在另一端具有恒定结构域。
“非人工操纵的”是指未经过非自然手段如免疫或转化处理以含有或表达外源抗原结合分子。野生型可以是指群体中所发现的最普遍的等位基因或物种或者是指得自非人工操纵的动物的抗体以及是指天然产生的等位基因或多态性，其天然出现且可在群体中保持，或者通过天然方式出现的变体或衍生物，如恶性肿瘤(与通过操纵形式如诱变、使用重组方法等以改变抗原结合分子的氨基酸获得的相比)。该术语的使用是技术人员在语句、段落、概念、想法、主意等(该术语可在其中找到、或使用等)的背景下容易推断及理解的。
如本文所用，“抗伸展的I型鞘糖脂抗体”意指特异性结合人伸展的I型鞘糖脂的抗体或衍生多肽。
术语“可变”在抗体可变结构域上下文中是指相关分子的某部分，其在抗体之间在序列上具有广泛差异并且在特定抗体对特定靶的特异性识别和结合中可以是完整的。然而，可变性并不均匀分布于抗体可变结构域。
所述可变性在轻链和重链可变结构域中均集中于3个称作互补性决定区(CDR；即CDR1、CDR2和CDR3)的区段，其也称作高变区。可变结构域更加高度保守的部分称作构架(FR)区或序列。天然轻链和重链的可变结构域每个均包含四个FR区，主要为β折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环连接所述β折叠结构(在一些情况下形成部分的所述β折叠结构)。每个链中的CDR保持在一起，经常很接近，通过所述FR区以及与来自其它链的CDR一起用于形成抗体的靶(表位或决定簇)结合位点(参见Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institute of Health，Bethesda，MD(1987))。一个CDR如重链的CDR3可单独携有特异性结合同族(cognate)表位的能力。
除非另外指明，本文所用的免疫球蛋白氨基酸残基的编号根据Kabat etal.的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行。
术语“抗体片段”是指抗体的完整或全长链的部分，一般是靶结合或可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab′，F(ab′)2和Fv片段。“功能性片段”或“抗伸展的I型鞘糖脂抗体的类似物”是可以结合同族抗原的一种。如本文所用，功能性片段一般与“抗体片段”同义，并且对于抗体而言，可以指能结合同族抗原的片段如Fv、Fab、F(ab′)2等。
“Fv”片段由一个重链和一个轻链可变结构域以非共价缔合的二聚体组成(VH-VL二聚体)。每个可变结构域的三个CDR的构型相互作用以限定出所述VH-VL二聚体在完整抗体中的靶结合位点。总体上，所述六个CDR赋予了完整抗体上的靶结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或者仅包含三个特异于靶的CDR的半个Fv)也可具有识别和结合靶的能力。
“单链Fv”、“sFv”或“scAb”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中所述结构域存在于单一多肽链中。一般而言，所述Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，一般为柔性分子如寡肽，其可以得自天然产生的分子、源于天然产生的分子、是人工序列如多聚甘氨酸等，其使得所述sFv能形成用于靶结合的所需结构。一些分子可包括一或多个恒定结构域或其部分。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段构建体，所述片段可包含在相同多肽链中连接轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不能允许在同一个链上的所述两个可变结构域之间配对的接头，双抗体结构域被迫与另一个链的结合结构域配对以产生抗原结合位点。
所述Fab片段含有轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变和第一个恒定结构域(CH1)。Fab′片段通过在CH1结构域的羧基端添加几个残基以包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸而与Fab片段不同。Fab′片段可通过裂解位于F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸的二硫键而产生。抗体的另外酶处理和化学处理可产生其它感兴趣的功能性片段。
如本文所用术语“单克隆抗体”(mAb或MAb)是指得自基本上同质抗体群的抗体，即所述包含单个抗体的群是相同的(除了可能少量存在的天然产生的突变)。
本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类(型或亚型)的抗体的相应序列相同或者同源，而所述链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或者同源，以及包括此种抗体的片段，只要所述嵌合抗体展现出所期望的结合伸展的I型鞘糖脂或者影响伸展的I型鞘糖脂活性或代谢的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison et al.，ProcNatl Acad Sci USA 81：6851(1984))。因此，来自一类抗体的CDR可以嫁接到不同类或亚类的抗体的FR中。
单克隆抗体是特异性的，针对单一靶位点、表位或决定簇。另外，与通常包括针对抗原不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每个单克隆抗体针对靶上单一的决定簇。除其特异性之外，单克隆抗体由宿主细胞合成、未被其它免疫球蛋白污染因而具有优势，并用于克隆编码其抗体链的相关基因和mRNA。修饰词“单克隆”表明所述抗体的特点是得自基本上同质的抗体群，而不应被理解为要求通过特定方法来生产所述抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以使用熟知技术分离自噬菌体抗体文库或者可以从多克隆制备物中纯化。依照本发明使用的亲代单克隆抗体可以通过Kohler et al.，Nature 256：495(1975)中描述的杂交瘤方法制备或者可以通过本领域熟知的重组方法制备。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或者片段(如Fv、Fab、Fab′，F(ab′)2或抗体的其它靶结合亚序列)，其与人抗体相比含有源自非人免疫球蛋白的序列。通常，人源化抗体将基本上包含全部一个、通常两个可变结构域，其中全部或者基本上全部的CDR区对应非人免疫球蛋白的那些并且全部或者基本上全部的FR区是人免疫球蛋白模板序列的那些。
所述人源化抗体还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是所选人免疫球蛋白模板的那个。一般而言，目标是得到在人中免疫原性最小化的具有某特异性的抗体分子。因此，可以将一或多个CDR中的一或多个氨基酸换成对人宿主免疫原性较低的氨基酸，而基本上不会最小化所述一或多个CDR对伸展的I型鞘糖脂的特异性结合功能。
或者，所述FR可以为非人的但是那些最具免疫原性的氨基酸被置换为较小免疫原性的那些。但是，如上所述的CDR嫁接并非获得人源化抗体的仅有方法。例如，仅修饰CDR区可能不足以优化抗体，这是由于构架残基在决定CDR环的整体三维结构以及决定抗体对配体的整体亲和性中具有作用并非是不寻常的。
因此，可施行任何方法来降低抗体免疫原性从而将非人亲代抗体分子修饰为对人有较低免疫原性，而与人抗体的整体序列相同性并不总是必须的。因此，人源化也可通过例如仅取代几个残基、特别是暴露于抗体分子表面而不是埋在分子内、从而对宿主免疫系统而言不易于接近的那些而实现。本文教导了关于取代例如抗体分子上带电的或某些其它残基的此种方法，目的是降低或阻抑所得分子的免疫原性而不损害所述抗体对同族表位或决定簇的特异性。参见例如Studnicka et al.，Prot Eng 7(6)805-814，1994；Mol Imm 44：1986-1988，2007；Sims et al.，J Immunol 151：2296(1993)；Chothia et al.，J MoI Biol 196：901(1987)；Carter et al.，Proc Natl Acad SciUSA 89：4285(1992)；Presta et al.，J Immunol 151：2623(1993)，WO2006/042333和美国专利号5,869,619。
用于对抗体表面重整(resurfacing)的策略和方法以及其它用于降低抗体在不同宿主中免疫原性的方法在例如美国专利号5,639,641中公开。简言之，在优选的方法中，(1)进行抗体重链和轻链可变区集合的位置比对以产生重链和轻链可变区构架表面暴露位置，其中对于所有可变区的比对位置至少大约98％相同；(2)对非人如啮齿类抗体(或其片段)定义出一组重链和轻链可变区构架表面暴露氨基酸残基；(3)鉴定出与该组啮齿类表面暴露氨基酸残基最紧密相同的一组重链和轻链可变区构架表面暴露氨基酸残基；以及(4)将步骤(2)中定义的那组重链和轻链可变区构架表面暴露氨基酸残基用步骤(3)中定义的那组重链和轻链可变区构架表面暴露氨基酸残基取代，除了那些在例如啮齿类抗体的CDR的任何残基的任何原子约
Figure BPA00001328432500101
之内的那些氨基酸残基之外，以产生人源化的例如保留结合特异性的啮齿类抗体。
抗体的人源化可用许多其它技术来进行，包括CDR嫁接(EPO 0 239400；WO 91/09967；和美国专利号5,530,101和5,585,089)，饰面法(veneering)或表面重整(EPO 0 592 106；EPO 0 519 596；Padlan，1991，Molec Imm28(4/5)：489-498；Studnicka et al.，1994，Prot Eng 7(6)：805-814；和Roguska etal.，1994，PNAS 91：969-973)和链改组(美国专利号5,565,332)。人抗体可通过多种本领域已知的方法制备，包括但不限于噬菌体展示方法，参见美国专利号4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及WO 91/10741，使用转基因动物如啮齿类(Amgen，Kirin和Merdarex小鼠)，使用嵌合细胞等等。
“抗体同系物”或“同系物”是指如本文教导的特异性结合伸展的I型鞘糖脂的任何分子。因此，抗体同系物包括修饰的或未经修饰的天然或重组抗体、保留感兴趣的生物学性质(如结合伸展的I型鞘糖脂)的抗体的部分如Fab或者Fv分子、单链抗体、携有一或多个CDR区的多肽等等。所述同系物的氨基酸序列不必与天然产生的抗体相同，而是可以被改变和修饰以携有取代氨基酸、插入氨基酸、缺失氨基酸、20个蛋白中常见氨基酸之外的氨基酸等等以获得具有增强的或者其它有益性质的多肽。
具有同源序列的抗体是那些具有与本发明的伸展的I型鞘糖脂抗体的氨基酸序列有序列同源性的氨基酸序列的抗体。优选地，同源性是与本发明抗体可变区的氨基酸序列。在本文用于氨基酸序列的“序列同源性”定义为与另一氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％或更多序列同源性、更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，通过例如根据Pearson & Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 85，2444-2448(1988)的FASTA搜索方法确定。
如上文所教导的嵌合抗体是一种具有源自不同来源的抗体的不同部分的抗体，如不同的抗体、不同类的抗体、不同的动物物种，例如具有源自鼠单克隆抗体可变区配有人免疫球蛋白恒定区的抗体等。因此，人源化抗体是一种嵌合抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见例如Morrison，1985，Science 229：1202；Oi et al.，1986，BioTechniques 4：214；Gillies et al.，1989，J Immunol Methods 125：191-202；和美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816,397。
人工抗体包括scFv片段、嵌合抗体、双抗体、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)和mru(参见Winter & Milstein，1991，Nature 349：293-299和Hudson，1999，Curr Opin Imm 11：548-557的综述)，每个均具有抗原结合能力或表位结合能力。在单链Fv片段(scFv)中，抗体的VH和VL结构域通过柔性肽连接。通常，接头是约15个氨基酸的肽。如果接头小得多，例如5个氨基酸，则形成双抗体，其是二价scFv二聚体。如果
感兴趣抗体的功能性等价物也包括在本发明的范围内。术语“功能性等价物”包括具有同源序列的抗体、抗体同系物、嵌合抗体、抗体变体、抗体衍生物、人工抗体和经修饰的抗体，例如其中每个功能性等价物通过结合伸展的I型鞘糖脂的能力来定义。本领域技术人员会理解称作“抗体片段”的分子的组与称作“功能性等价物”的组会有重叠。保留结合伸展的I型鞘糖脂能力的功能性等价物的生产方法是本领域技术人员已知的，并且在例如WO 93/21319、EPO No.239,400、WO 89/09622、EPO No.338,745和EPO No.332,424中公开。
本申请的功能性等价物还包括修饰的抗体，例如通过将任何类型的分子共价附着于抗体而修饰的抗体。例如，修饰的抗体包括已经例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、脱酰胺化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生化、蛋白酶解、连接细胞配体、连接毒素或胞毒性部分或其它蛋白等而修饰的抗体。所述共价附着不需产生从生成抗独特型应答免疫的抗体。修饰可由已知的技术达成，包括但不限于特异的化学裂解、乙酰化、甲酰化、代谢合成、化学缀合等。另外，所述修饰的抗体可含有一或多种非典型氨基酸。
本领域技术人员可使用很多能够将结合亲和性优化的技术。通常，所述技术涉及各种在感兴趣位点的氨基酸残基的取代，随后筛选分析突变体多肽对同族抗原或表位的结合亲和性。
一旦鉴定出并分离出抗体，生成变体抗体或突变体、或突变蛋白通常是有用的，其中改变了一或多个氨基酸残基，例如在抗体的一或多个高变区中。或者，或者另外可以在抗体中引入或多个构架残基的改变(例如取代)，其中这些导致抗体突变体对伸展的I型鞘糖脂结合亲和性的改善。
可被修饰的构架区残基的例子包括那些直接地非共价结合抗原的残基(Amit et al.，Science 233：747-753(1986))；与CDR构象相互作用或影响CDR构象的残基(Chothia et al.，J.MoI.Biol.196：901-917(1987))；和/或参与VL-VH界面的残基(EP 239 400)。在某些实施方案中，一或多个此种构架区残基的修饰导致抗体对同族抗原结合亲和性的增强。例如，在本发明特定的实施方案中可以改变约一至大约五个构架残基。有时，这可足以产生适用于临床前测试的抗体突变体，即使其中没有高变区残基被改变。然而，通常所述抗体突变体可包含一或多个高变区改变。也可改变恒定区以获得所期望的或者更期望效应物性质。
被改变的高变区残基可以随机变化，特别是当亲代抗体的起始结合亲和性使得可以轻易地在本文教导的测定法中筛选随机产生的抗体突变体的改变的结合。
获得抗体突变体如CDR突变体的一种方法是“丙氨酸分区诱变法”(Cunningham & Wells，Science 244：1081-1085(1989)；和Cunningham &Wells，Proc Nat.Acad Sci USA 84：6434-6437(1991))。一或多个高变区残基被丙氨酸或聚丙氨酸残基置换。继而通过在取代位点或者为取代位点引入进一步的或者其它突变来将那些证明了对取代的功能敏感性的高变区残基进行优化。因此，引入氨基酸序列变化的位点被预先确定，而突变本身的特性不需要被提前确定。可用其它氨基酸尝试类似的取代，这取决于被扫描的残基的所需性质。
鉴定要修饰的氨基酸残基的更系统的方法包含鉴定涉及结合伸展的I型鞘糖脂的高变区残基和那些很少或没有涉及结合伸展的I型鞘糖脂的高变区残基。进行非结合高变区残基的丙氨酸扫描，测定每个ala突变体结合伸展的I型鞘糖脂的增强。在另一个实施方案中，那些显著涉及结合伸展的I型鞘糖脂的残基被选择来进行修饰。修饰可涉及残基的缺失或者临近感兴趣残基的一或多个残基的插入。然而，通常修饰涉及残基被其它氨基酸取代。保守取代可以是第一个取代。如果此取代导致生物学活性(例如结合亲和性)的变化，那么可进行另一个保守取代以确定是否获得更实质的变化。
可通过筛选与正常位于位点上的氨基酸在性质上更实质不同的氨基酸来获得在抗体范围内和生物学性质呈递中甚至更实质的修饰。因此，可在保持如下的情况下进行此种取代：(a)多肽主链在取代区域的结构，例如作为折叠或者螺旋构象；(b)所述分子在靶位点的电荷或疏水性，或者(c)侧链的大小。
例如，可根据共同侧链性质而将天然产生的氨基酸分成组：
(1)疏水的：甲硫氨酸(M或met)，丙氨酸(A或ala)，缬氨酸(V或val)，亮氨酸(L或leu)和异亮氨酸(I或ile)；
(2)中性亲水的：半胱氨酸(C或cys)，丝氨酸(S或ser)，苏氨酸(T或thr)，天冬酰胺(N或asn)和谷氨酰胺(Q或gin)；
(3)酸性的：天冬氨酸(D或asp)和谷氨酸(E或glu)；
(4)碱性的：组氨酸(H或his)，赖氨酸(K或lys)和精氨酸(R或arg)；
(5)影响链方向的残基：甘氨酸(G或gly)和脯氨酸(P或pro)，以及
(6)芳香的：色氨酸(W或trp)，酪氨酸(Y或tyr)和苯丙氨酸(F或phe)。
非保守取代可使得将氨基酸用来自另一组的氨基酸互换。保守取代可使得将一个氨基酸用组中的另一个互换。
优选的氨基酸取代可包括例如(1)降低对蛋白水解的易感性的，(2)降低对氧化的易感性的，(3)改变结合亲和性的和(4)赋予或修饰此种类似物的其它物理化学或功能性质的那些。
类似物可包括天然产生的肽序列之外的序列的各种突变蛋白。例如，可以在天然产生的序列中(优选在所述多肽形成分子间相互作用的结构域外的部分中)进行单一或者多重氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。除了在R基团或侧链的大小和构象中的变化之外，保守取代不应实质上改变亲代序列的结构特征(例如置换氨基酸不应要破坏亲代序列中出现的螺旋或者破坏为所述亲代序列特征的其它类型的二级结构)，Proteins，Structures andMolecular Principles(Creighton，ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(Branden & Tooze，eds.，GarlandPublishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton et al.Nature 354：105(1991)。
普遍来说，具有改善的生物学性质的抗体突变体将具有这样的氨基酸序列，其与亲代抗人伸展的I型鞘糖脂抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列有至少75％氨基酸序列相同性或相似性、至少80％、至少85％、至少90％和经常至少95％相同性。与亲代抗体序列的相同性或相似性在本文中定义为候选序列中与亲代抗体残基相同(即同样的残基)或相似(即基于如前所述共同侧链性质的同组的氨基酸残基)的氨基酸残基的百分比，如果必要，在比对所述序列并引入缺口后获得最大百分比序列相同性。
或者，可通过系统突变重链和轻链的FR和CDR区、或抗伸展的I型鞘糖脂抗体的Fc区生成抗体突变体。
另一生成抗体突变体的过程涉及使用利用噬菌体展示的亲和力成熟(Hawkins et al.，J MoI Biol 254：889-896(1992)和Lowman et al.，Biochemistry30(45)：10832-10838(1991))。已知噬菌体外壳蛋白融合(Smith，Science228：1315(1985)；Scott & Smith，Science 249：386(1990)；Cwirla et al.，ProcNatl Acad Sci USA 8：309(1990)；Devlin et al.Science 249：404(1990)；Wells& Lowman，Curr Opin Struct Biol 2：597(1992)；和美国专利号5,223,409)可用于将所展示的蛋白或肽的表型与编码它们的噬菌体颗粒的基因型相联系。抗体的Fab结构域也已经在噬菌体上展示(McCafferty et al.，Nature 348：552(1990)；Barbas et al.Proc Natl Acad Sci USA 88：7978(1991)；和Garrardet al.Biotechnol 9：1373(1991))。
单价噬菌体展示由如下组成：将一组蛋白变体作为噬菌体外壳蛋白的融合物在噬菌体颗粒上展示(Bass et al.，Proteins 8：309(1990))。亲和力成熟或者各种蛋白的平衡结合亲和性先前通过顺序应用诱变、单价噬菌体展示和功能性分析实现(Lowman & Wells，J MoI Biol 234：564578(1993)；和美国专利号5,534,617)以及对抗体Fab结构域使用所述方法(Barbas et al.，ProcNatl Acad Sci USA 91：3809(1994)；和Yang et al.，J MoI Biol 254：392(1995))。
可在噬菌体颗粒上构建许多(例如106或更多)蛋白变体(在序列中给定位置不同)的文库，其每个均含有编码特定蛋白变体的DNA。因此，将若干高变区位点例如6-7个位点)突变以生成在每个位点所有可能的氨基酸取代。在亲和性层析循环后，使用固定的抗原分离各个噬菌体克隆，并从DNA推断出所展示的蛋白的氨基酸序列。
在产生抗体突变体后，所述分子相对于亲代抗体的生物学活性可以如本文所教导的那样确定。如上所述，这可以涉及确定所述抗体的结合亲和性和/或其它生物学活性或物理特性。在本发明优选的实施方案中，制备了一组抗体突变体并对筛选其对于抗原的结合亲和性。从该筛选中所选择的一或多个抗体突变体任选进行一或多个进一步的生物学活性测定以确认所述抗体突变体具有新的或者改善的性质。在优选的实施方案中，抗体突变体保留结合伸展的I型鞘糖脂的能力且其结合亲和性类似于或者优于/高于亲代抗体的。
或者，也可使用多价噬菌体(McCafferty et al.(1990)Nature 348：552-554；和Clackson et al.(1991)Nature 352：624-628)表达随机点突变(例如使用易错DNA聚合酶产生的)以生成噬菌体抗体片段文库，继而可以将筛选其对于伸展的I型鞘糖脂的亲和性，Hawkins et al.，(1992)J MoI Biol 254：889-896。
优选地，在亲和力成熟法期间，可复制的表达载体在转录调节元件的紧密控制之下，并且调整培养条件使得展示超过1个拷贝融合蛋白的颗粒的量或者数目少于约1％。还优选展示超过1个拷贝融合蛋白的颗粒量少于展示单一拷贝融合蛋白的颗粒量的约10％。优选该量为少于约20％。
本文使用的另一等价措辞是抗原结合部分，其涉及结合I型鞘糖脂表位的感兴趣抗体的部分。本文用来描述可以对原始抗体进行各种改变的所有措辞和术语均被认为落入措辞“抗原结合部分”的范围内。因此，措辞抗原结合部分包括了如本文所述的例如抗体片段如Fab分子、Fv、scAb、mru、任何此类功能性片段、抗体变体如等位基因或者在其一级氨基酸序列中含有变化的分子、衍生物如嵌合或人源化抗体、类似物等，包括功能性等价物，其包括感兴趣抗体的遗传修饰形式、抗体同系物等等。
如此选择的抗体突变体可以进行进一步修饰，常取决于所述抗体所要的用途。此种修饰可涉及氨基酸序列的进一步改变、与异源多肽的融合和/或共价修饰。例如，不涉及保持抗体突变体的适当构象的半胱氨酸残基可以被取代(通常用丝氨酸)以改善所述分子的氧化稳定性并防止异常交联。反过来，可以将半胱氨酸加入抗体中以改善稳定性(特别是当所述抗体是抗体片段如Fv片段时)。
另一类的抗体突变体具有改变的糖基化模式。这可以通过将一或多个抗体中发现的碳水化合物部分添加或缺失和/或通过添加或缺失一或多个所述抗体中未出现的糖基化位点来达成。抗体的糖基化通常经N-连接至Asn或经O-连接至Ser或Thr。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物部分通过酶附着至天冬酰胺侧链的共同识别序列。例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、岩藻糖或木糖结合至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。在原始抗体的序列中添加或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基可增强O-连接糖基化的可能性。
可以期望对于本发明抗体的效应物功能进行修饰，从而增强所述抗体的效力。例如，可将半胱氨酸残基引入到Fc区，由此使得可以在该区形成链间二硫键。因此而生成的同二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞胞毒性(ADCC)，参见Caron et al.，J Exp Med 176：1191-1195(1992)和Shopes，Immunol 148：2918-2922(1993)。此种抗体衍生物或类似物也可在体内对降解更具抗性。
或者，抗体可被工程化为具有双Fc区并可以由此而具有增强的补体裂解和ADCC能力，参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219 230(1989)。
抗体的共价修饰包括在本发明的范围内。如果可行，这可通过化学合成或通过抗体的酶或化学裂解来进行。抗体其它类型的共价修饰通过如下方式引入该分子：通过将抗体的靶氨基酸残基与有机衍生剂反应，所述衍生剂能够与选择的侧链或者N-端或C-端残基反应。
半胱氨酰基残基可与α-卤乙酸(α-haloacetate)(以及相应的胺)反应如氯乙酸或氯乙酰胺以产生羧甲基或羧氨基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰基残基也可通过与例如如下的物质反应而衍生化：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑)丙酸、氯乙酰基磷酸盐/酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对-氯汞基苯甲酸盐/酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或者氯-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑。
组氨酰基残基可通过在pH 5.5-7.0与焦碳酸二乙酯反应而衍生化。也可使用对-溴苯酰甲基溴，反应优选在pH6.0于0.1M二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰基和α末端残基可与琥珀酸或其它羧酸酐反应以反转该残基的电荷。其它用于衍生含有α-氨基的残基的适宜试剂包括亚氨酸酯(imidoester)，如甲基吡啶亚胺甲酯(methyl picolinimidate)，磷酸吡哆醛，吡哆醛，氯氢硼化物，三硝基苯磺酸，O-甲基异脲和2，4-戊二酮，所述氨基酸可以用乙醛酸进行转氨酶催化。
精氨酰基残基可通过与一或若干个常规试剂如苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，1，2-环己二酮和茚三酮反应来修饰。精氨酸残基的衍生化经常需要碱性反应条件。另外，所述试剂可以与赖氨酸以及精氨酸ε-氨基反应。
可以用芳香族重氮化合物或四硝基甲烷来对酪氨酰基残基进行特异修饰。例如，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷用于分别形成O-乙酰基酪氨酸物质和3-硝基衍生物。酪氨酰基残基可用125I或131I进行碘化以制备标记的蛋白用于放射性免疫测定。
羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)可通过与碳二亚胺(R-N＝C＝C-R′)反应而修饰，其中R和R′可以是不同的烷基基团。
谷氨酰胺酰基天冬酰胺酰基残基经常在中性或碱性条件下被分别脱酰胺化成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。那些残基的脱酰胺化形式在本发明的范围之内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化、丝氨酰基或苏氨酰基残基羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))、N端胺的乙酰化和任何C端羧基的酰胺化。
另一类型的共价修饰涉及将碳水化合物和糖苷化学偶联或酶偶联至抗体。这些过程不需要在具有用于N-连接或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主中产生抗体。取决于所使用的偶联模式，可以将糖附着至：(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，如半胱氨酸的那些；(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些；(e)芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。此种方法在WO 87/05330和ApHn & Wriston，CRC Crit Rev Biochem，pp.259-306(1981)中描述。
抗体上出现的任何碳水化合物部分的去处可经化学或酶来完成。例如化学去糖基化可要求抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等价化合物，导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或所有糖的裂解，而抗体却保持完整。化学去糖基化在例如Hakimuddin et al.，ArchBiochem Biophys 259：52(1987)和Edge et al.，Anal Biochem 118：131(1981)中描述。抗体上碳水化合物部分的酶裂解可通过多种内切糖苷酶和外切糖苷酶(例如Thotakura et al.，Meth Enzymol 138：350(1987)中描述的)中的任何酶来达成。
抗体另一种类型的共价修饰包含将抗体以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述方式连接至多种非蛋白质样聚合物的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化亚烷基(polyoxylalkylene)。
可在构架内或者源自多个抗体的组合FR内通过互换不同抗体链的不同CDR产生功能性等价物。由此，例如不同类的抗体对于给定组的CDR通过不同重链的取代(例如IgG1-4，IgM，IgA1-2或IgD)可以产生有区别的伸展的I型鞘糖脂抗体类型和同种型。类似地，本发明范围内的人工抗体可以通过在完全合成的构架内嵌入给定组的CDR来产生。
本发明的抗体片段和功能性等价物涵盖那些分子，其具有可检测程度的对伸展的I型鞘糖脂的特异结合。可检测程度的结合包括感兴趣抗体结合能力的至少10-100％范围内的所有值，优选至少50％、60％或70％，更优选至少75％、80％、85％、90％、95％或99％。具有的亲和性超过感兴趣抗体的100％的等价物也包括在内。
所述CDR通常对表位识别和抗体结合是重要的。然而，可对包含所述CDR的残基进行改变而不干扰抗体识别并结合同族抗原的能力。例如，可以进行不影响表位识别却提高抗体对表位结合亲和性的改变。基于这个认识，若干研究已经调查了在抗体序列不同位置引入一或多个氨基酸改变的作用。
由此，可通过改变CDR1、CDR2和/或CDR3中或者在构架区中的重链和轻链基因的序列来产生感兴趣抗体的等价物，所用的方法如例如寡核苷酸介导的定点诱变、盒式诱变、易错PCR、DNA改组、氨基酸修饰或大肠杆菌(E.coli)的增变株(Vaughan et al.，1998，Nat Biotech 16：535-539；和Adeyet al.，1996，Chap.16，pp.277-291，在Phage Display of Peptides and Proteins中，eds.Kay et al.，Academic Press)。改变初级抗体核酸序列的方法可导致具有改善的亲和性的抗体(Gram et al.，1992，Proc Natl Acad Sci USA89：3576-3580；Boder et al.，2000，Proc Natl Acad Sci USA 97：10701-10705；Davies & Riechmann，1996，Immunotech 2：169-179；Thompson et al.，1996，JMoI Biol 256：77-88；Short et al.，2002，J Biol Chem 277：16365-16370；和Furukawa et al.，2001，J Biol Chem 276：27622-27628)。
重复循环“多肽选择”可用于通过例如对多个氨基酸改变的选择来选择较高的亲和性结合，所述对多个氨基酸改变的选择通过多个选择循环来选择。在第一轮选择(涉及配体或抗体多肽中氨基酸的第一个选择区)后，在配体的其它区或氨基酸中进行另外轮的选择。重复选择循环直至达到所期望的亲和性特性。
改善的抗体也包括那些通过标准技术制备的具有改善的特性的抗体，所述标准技术为动物免疫、杂交瘤形成及选择具有特异特性的抗体。
“拮抗剂”是指能够抑制一或多个与伸展的I型鞘糖脂关联的生物学活性的分子。拮抗剂可以干扰消耗I型鞘糖脂的细胞的维持和生长。对于本发明的目的，拮抗剂的所有干预点均看做是等价的。由此，包括在本发明范围内的是例如中和结合伸展的I型鞘糖脂的抗体的拮抗剂。
“激动剂”是指激活伸展的I型鞘糖脂或表达其的细胞的一或多种生物学活性的抗体、抗体片段、缀合物等等。激动剂可以作为表达I型鞘糖脂的细胞的促细胞分裂剂。对于本发明的目的，激动剂的所有干预点均被看做是等价的。由此，包括在本发明范围内的是例如结合伸展的I型鞘糖脂并增强活性如分化的抗体。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”包括其后代。也应理解由于主动或非主动突变，所有的后代可能不是精确相同的，如在DNA含量方面。具有相同的感兴趣的功能或生物学性质(如在原始细胞中筛选的)的变体后代包括在本发明的范围内。本发明中使用的“宿主细胞”通常是原核或真核宿主，根据设计选择来进行选择。
用核酸“转化”细胞生物体、细胞、细胞系意指将核酸引入到靶细胞，从而所述核酸可以作为染色体外元件或者通过染色体整合而复制并任选地表达。用核酸“转染”细胞或生物体是指所述细胞或生物体对核酸例如表达载体的摄取，无论实际上是否有任何编码序列被表达。术语“转染的宿主细胞”和“转化的”是指细胞中引入了核酸。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌的各种株。典型的真核宿主细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞或人源细胞。所述引入的核酸序列可以来自与宿主细胞相同的物种或不同的物种，或者可以是含有一些外源和一些同源核酸的杂合核酸序列。转化也可以通过用病毒来源的元件或运载体(carrier)的转导或感染来进行。
术语“载体”意指含有核酸、转基因、外源基因或感兴趣基因的核酸构建体、运载体，其能够可操纵地连接至适宜的控制序列用于在适宜的宿主中表达所述转基因。此种控制序列包括例如实现转录的启动子、任选的操纵基因序列以控制所述转录、编码适宜的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒或者仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化入适宜宿主，所述载体可以独立于宿主基因组而复制和发挥功能，或者可以在某些情况中整合入宿主细胞基因组或其它核酸。在本说明书中“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的常用形式。然而，本发明要包括其它形式的载体，其发挥如本领域所知的等价的运载体功能且其是或者成为本领域所知的，如病毒、噬菌粒、转座子、携有核酸的合成分子、脂质体等。
用于治疗目的的“哺乳动物”是指任何分类为哺乳动物的动物，包括人、家养和畜牧动物、非人灵长类、以及动物园、运动或宠物动物如狗、马、猫、牛等。
感兴趣的抗体可以在如本文所述的或者如本领域已知的测定中筛选或使用。此种测定经常需要可探测的试剂，即例如标记的。当用于本文时，词语“标已”是指能够被直接或间接地缀合至分子或蛋白例如抗体的可探测化合物或组合物。所述标记可以本身是可探测的(例如放射性同位素标记、颗粒或荧光标记)或者可以是获得可探测信号的仪器，如在酶标记的情况中可以催化底物化合物或组合物的化学改变从而使其可探测。
如本文所用，“固相”是指实体或者分子如本发明的抗体可以粘附或者结合的基质。固相所涵盖的例子在本文包括部分或完全由玻璃(例如可控孔度玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、塑料、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮类形成的那些。在某些实施方案中，根据上下文，固相可以包含测定平板的孔；在其它中可以在纯化柱中使用(例如亲和层析柱)。由此，固相可以是纸、珠、塑料、芯片等等，可以由多种材料制成，如硝化纤维素、琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、硅等，并且可以是多种构型。
表达伸展的I型鞘糖脂或其聚糖的细胞如细胞膜制备物以及纯化的伸展的I型鞘糖脂可用作免疫原来产生感兴趣的抗体。所述免疫原可以得自或者分离自天然来源或者可以经酶合成或化学合成制备。可以使用整个细胞如表达伸展的I型鞘糖脂的细胞、源自天然来源或者癌症的细胞如癌细胞系。过表达伸展的I型鞘糖脂的细胞可以用作免疫原来制备感兴趣的抗体。还可以如本领域所知的那样使用携有伸展的I型鞘糖脂的膜制备物。此种细胞及其部分可在诊断测定中被用作抗原来源。
可以通过多种本领域已知的多种方法制备编码氨基酸序列突变体的核酸分子。所述方法包括但不限于先前制备的感兴趣分子的突变或非突变形式的寡核苷酸介导(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变(参见例如Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82：488(1985))。
本发明的抗体或其片段、衍生物或类似物(例如本发明抗体的重链或轻链、本发明的单链抗体或本发明的抗体突变蛋白)的重组表达包括构建表达载体，所述载体含有编码如本文所述的抗体或抗体片段的多核苷酸。一旦获得编码抗体分子的多核苷酸，可以通过如本领域所知的重组DNA技术来产生用于生产所述抗体的载体。构建了含有抗体编码序列以及适当的转录和翻译控制信号的表达载体。所述方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
通过常规技术将所述表达载体转移至宿主细胞继而将经转染的细胞通过常规技术培养以产生本发明的抗体或片段。在本发明的一方面，编码重链和轻链二者的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个免疫球蛋白分子，如本文中所详述。
可利用多种宿主/表达载体系统来表达本发明的抗体分子。此种表达系统代表运载体(vehicle)，通过其可产生并继而纯化感兴趣的编码序列，而此种表达系统也代表细胞，当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时其可以在原位表达本发明的抗体分子。细菌细胞如大肠杆菌和真核细胞一般用于表达重组抗体分子，特别是表达整个重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如CHO细胞与载体一起如携有来自人巨细胞病毒主要中间体早期基因启动子元件的载体是有效的抗体表达系统(Foecking et al.，Gene 45：101(1986)；和Cockett et al.，Bio/Technology 8：2(1990))。如本领域所知的那样，植物和植物细胞培养物、昆虫细胞等等也可用于制备感兴趣的蛋白。
此外，选择宿主细胞，其调节插入序列的表达或者以所期望的特异方式修饰和加工基因产物。蛋白产物的此种修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)可能对蛋白的功能很重要。不同的宿主细胞对所期望的蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰可具有特定的特性和特异的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保对所表达的感兴趣抗体的正确修饰和加工。因此，可以使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。此种哺乳动物细胞包括但不限于CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤细胞。
对于长期、高产量生产重组蛋白，优选稳定的表达。例如，可工程化稳定表达所述抗体分子的细胞系。与其使用含有病毒复制起点的表达载体，倒不如可以通过由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)和可选择标记控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA之后，允许经工程化的细胞在富集培养基中生长1到2天，并继而转移至选择性培养基。重组质粒中的可选择标记赋予了对选择的抗性并允许细胞稳定地将质粒整合到染色体中以及扩展至整个细胞系。或者，在选择下可将染色体外元件保留在细胞中。此种工程化的细胞系不仅用于抗体生产还用于筛选和评价直接或间接与抗体分子相互作用的化合物。
可使用数个选择系统，包括但不限于分别在tk、hgprt或aprt细胞中使用单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska et al.，Proc Natl Acad Sci USA 48：202(1992))、谷氨酸合酶(在存在甲硫氨酸硫酰亚胺的情况下)(Adv Drug Del Rev58，671，2006以及参见Lonza Group Ltd.的网页或文献)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lo wy et al.，Cell 22：817(1980))基因。而且，抗代谢物抗性可用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler et al.，Proc NatlAcad Sci USA 77：357(1980)；OHare et al.，Proc Natl Acad Sci USA 78：1527(1981))；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan et al.，Proc Natl Acad Sci USA78：2072(1981))；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu et al.，Biotherapy3：87(1991))；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre et al.，Gene30：147(1984))。本领域已知的重组DNA技术可常规地用于选择所期望的重组克隆，并且此种方法在例如Ausubel et al.，eds.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons(1993)；Kriegler，Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton Press(1990)；Dracopoli et al.，eds.，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley & Sons(1994)；和Colberre-Garapin et al.，J MoI Biol 150：1(1981)中描述。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增来提高(例如参见Bebbington etal.，在DNA Cloning中，Vol.3.Academic Press(1987))。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时候，培养物中存在的抑制剂水平的提高将提高所述标记基因的拷贝数。由于扩增区与抗体基因关联，则抗体的生产将也被提高(Crouse et al.，MoI Cell Biol 3：257(1983))。
宿主细胞可以用二或更多个本发明的表达载体共转染，例如第一个载体编码源自重链的多肽而第二个载体编码源自轻链的多肽。所述两个载体可含有相同的选择标记，其使得重链和轻链多肽可以等量表达。或者，可使用单一载体，其编码并且能够表达重链和轻链多肽二者。在此情况下，可将轻链至于重链之前以避免过量的毒性游离重链(Proudfoot，Nature322：52(1986)；和Kohler，Proc Natl Acad Sci USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体分子已由动物产生、经化学合成或经重组表达，其可以通过任何本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的方法纯化，例如通过层析(例如离子交换层析、亲和层析特别是通过对蛋白A之后的伸展的I型鞘糖脂的亲和性以及大小排阻层析等等)、离心、差别溶解法(differentialsolubility)或者通过任何其它标准纯化蛋白技术。另外，可将本发明的抗体或其片段融合至本文所述或本领域已知的异源多肽序列以辅助纯化。
本发明的抗体可通过任何本领域已知的适宜方法来产生。由此，可使用纯化的伸展的I型结构作为抗原，任选使用佐剂，完全或不完全弗氏佐剂。本发明的抗体可包含多克隆抗体，但是由于对抗体的修饰以优化在人中的使用以及优化抗体本身的使用，优选单克隆抗体，这是为了特定蛋白生产和操作的简便。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的(Harlow et al.，Antibodies：a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，2nd ed.(1988))。
例如，可将如本文所示例的免疫原施用于各种宿主动物包括但不限于兔、小鼠、骆驼科动物、大鼠等以诱导产生含有特异于伸展的I型鞘糖脂的多克隆抗体的血清。所述免疫原的施用可包括一或多次注射免疫剂以及佐剂(如果需要)。可使用各种佐剂以提高免疫学应答，取决于宿主物种，其包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物油、凝胶、铝(氢氧化铝)、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白(KLH)、二硝基苯酚和潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。可使用的佐剂的另外的例子包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A、合成海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedicorynomycolate))。免疫方案是本领域所熟知的并且可以通过任何在所选的动物宿主中引发免疫应答的方法来实行。由此，可在各种时间段内使用各种施用途径作为设计选择。
通常，通过多次皮下或腹膜内、或者肌肉内或静脉内注射来将免疫原(有或无佐剂)注射到哺乳动物内。在某些情况下，可使用表达伸展的I型鞘糖脂的整个细胞。根据免疫原的性质(即百分比疏水性、百分比亲水性、稳定性、净电荷、等电点等)可对伸展的I型鞘糖脂或其部分进行修饰或缀合以使其在经免疫的动物如哺乳动物中有免疫原性或者更具免疫原性。例如可将伸展的I型鞘糖脂或其部分缀合至运载体。所述缀合包括通过衍生化在免疫原和要被缀合的免疫原性蛋白上均存在或者存在于任何一个上的活性化学官能团的化学缀合从而形成共价键或包括其它本领域技术人员已知的方法。此种运载体或免疫原性蛋白的例子包括但不限于KLH、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂和混杂的辅助T细胞肽。可使用各种佐剂以提高上述的免疫学应答。
一旦获得适宜的制备物，可以通过已知的分离技术如亲和层析、淘选(panning)、吸收等等从多个抗体中分离特定的抗体。以此方式，可获得单个抗体用于进一步的研究例如测序以获得一或多个CDR的氨基酸序列。
本发明的抗体优选包含单克隆抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤技术制备，如Kohler et al.，Nature 256：495(1975)；U.S.Pat.No.4,376,110；Harlow etal.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)；和Hammerling et al.，Monoclonal Antibodies and T-CeIlHybridomas，Elsevier(1981)所述，重组DNA方法，例如制备和使用转染瘤，或其它本领域技术人员已知的方法。可用于生产单克隆抗体的方法的其它例子包括但不限于人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.，Immunology Today4：72(1983)；和Cole et al.，Proc Natl Acad Sci USA 80：2026(1983))以及EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，pp.77-96，Alan R.Liss(1985))。此种抗体可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD在内的任何免疫球蛋白类别及其任何亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可在体内或体外培养。
在杂交瘤模型中，对宿主如小鼠、人源化小鼠、具有人免疫系统基因的转基因小鼠、马、绵羊、仓鼠、兔、大鼠、骆驼或任何其它适宜的宿主动物进行免疫以引发产生或能够产生特异性结合伸展的I型鞘糖脂的抗体的淋巴细胞。
或者，可在体外对淋巴细胞进行免疫。继而使用适宜的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp.59-103(1986))。
通常，在制备产生抗体的杂交瘤时，如果期望人来源的细胞则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)或者如果期望非人哺乳动物来源时则使用脾细胞或淋巴结细胞。永生化的细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛或人来源的骨髓瘤细胞。通常利用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可将所述杂交瘤细胞在适宜的培养基中培养，所述培养基优选含有一或多种物质抑制未融合的永生细胞的生长或存活。例如，如果亲代细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于所述杂交瘤的培养基通常将包括阻止HGPRT-缺陷型细胞生长的物质次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)。
优选的永生化细胞系是这样的细胞系，其有效融合、通过选择的产抗体细胞来支持稳定高水平的抗体生产以及对培养基如HAT培养基敏感。在骨髓瘤细胞系例如是鼠骨髓瘤系如源自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些(可得自SaIk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif)和SP2/0，FO或X63-Ag8-653细胞(可得自American Type Culture Collection，Manassas，VA)。也可使用小鼠骨髓瘤细胞系NSO(European Collection of Cell Cultures，Salisbury，Wilshire，UK)。
人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系也被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor，J Immunol 133：3001(1984)；和Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc，pp.51-63(1987))。
另一选择是使用电融合而不是化学融合来形成杂交瘤。作为化学融合的替代，可使用例如埃巴病毒或另一转化基因来将B细胞永生化，参见例如Zurawaki et al.，在Monoclonal Antibodies中，ed.，Kennett et al.，PlenumPress，pp.19-33.(1980)。也可使用表达免疫球蛋白的转基因小鼠和移植了人B淋巴细胞的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠。
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对伸展的I型鞘糖脂的单克隆抗体的生产。杂交瘤细胞产生的单克降抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定如放射免疫测定(RIA)、荧光细胞计数分析(FACS)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。此种技术是本领域已知的且在技术人员的技能范围内。如本领域所知，还可使用Biacore系统。单克隆抗体对伸展的I型鞘糖脂的结合亲和性可例如通过Scatchard分析来确定(Munson etal.，Anal Biochem 107：220(1980))。
在鉴定出生产所期望特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释过程将所述克隆进行亚克隆并通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp.59-103(1986))。适宜的培养基包括例如Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(D-MEM)或者RPMI-1640。另外，杂交瘤细胞可作为动物中的腹水性肿瘤在体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化过程如例如蛋白A琼脂糖、蛋白G琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析来将亚克隆所分泌的单克隆抗体适当地从培养基中分开或分离。
本领域存在多种生产单克隆抗体的方法，因此本发明不限于它们仅仅在杂交瘤中的生产。例如，单克隆抗体可通过重组DNA方法来制备，如在美国专利号4,816,567中描述的。或者，人抗体可得自转基因动物，如上述的KM小鼠。在这个背景下，术语“单克隆抗体”是指源自单一的真核、病毒或原核克隆的抗体。
因此，使用已知表达伸展的I型链结构的人癌细胞如Colo205细胞、或者含伸展的I型链的化合物如鞘糖脂如Leb/Lea作为抗原如本领域已知的那样对近交或转基因小鼠进行免疫和加强。获得脾，细胞融合骨髓瘤细胞并且制成及培养杂交瘤细胞。使用例如Leb/Lea作为捕获试剂通过ELISA来筛选细胞上清。扩增阳性克隆。IMH2是特异性结合伸展的I型链结构的小鼠IgG3单克隆抗体的例子。
使用转基因小鼠模型，可通过用伸展的I型链免疫原免疫转基因小鼠来产生人抗体。此种抗体可在付费的基础上产生，例如通过Medarex，NJ和Amgen，CA。使用所述KM小鼠，选择GNX-8(IgG1)单克隆抗体用于进一步的鉴别和使用。
GNX-8是细胞毒性抗体。在使用Colo205结肠癌细胞作为靶的测定中，GNX-8裂解癌细胞系细胞并且于至少50μg/ml，抗体裂解培养物中所有的细胞。GNX-8不结合RBC。所述抗体结合结肠癌细胞、乳腺癌细胞和肺癌细胞。与IMH2不同，GNX-8不结合Ley-Lex或Ley。
使用常规过程轻易地将编码本发明单克隆抗体的DNA分离并测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链或者来自人、人源化或其它来源的这种链的基因的寡核苷酸探针)(Innis et al.在PCR Protocols.AGuide to Methods and Applications中，Academic(1990)和Sanger et al.，ProcNatl Acad Sci 74：5463(1977))。杂交瘤细胞可用作此种DNA的来源。
一旦被分离，DNA可以被置入表达载体内，其继而被转染入宿主细胞如不另外产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、NSO细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞以获得单克隆抗体在重组宿主细胞内的合成。DNA也可被修饰，例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；和Morrison et al.，Proc Natl Acad SciUSA 81：6851(1984))或者通过共价接合至免疫球蛋白编码序列，全部或部分的非免疫球蛋白多肽的编码序列。此种非免疫球蛋白多肽可被取代为本发明抗体的恒定结构域，或者可被取代为本发明抗体的一个伸展的I型鞘糖脂组合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域所熟知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达。重链一般在Fc区中任意点被截断从而阻止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基被另一种氨基酸残基取代或者被缺失从而阻止交联。
识别特定表位的抗体片段可用已知技术产生。传统上，那些片段来源于对完整抗体的蛋白酶消化(参见例如Morimoto et al.，J Biochem BiophysMethods 24：107(1992)；和Brennan et al.，Science 229：81(1985))。例如，本发明的Fab和F(ab′)2片段可以通过使用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)对免疫球蛋白分子的蛋白酶裂解而产生。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域。然而，那些片段可直接通过重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可分离自抗体噬菌体文库。或者，F(ab′)2-SH片段可直接从大肠杆菌移出并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163(1992)。根据另一方法，F(ab′)2片段可直接分离自重组宿主细胞培养物。用于产生抗体片段的其它技术对于本领域技术人员来说是明显的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(Fv)，参见例如WO 93/16185。
对于一些用途，包括在人体内使用抗体和体外检测测定中，可以优选使用嵌合、人源化或人抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的，参见例如Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies et al.，J Immunol Methods 125：191(1989)；和美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816397。
人源化抗体源自在非人物种中生成的结合伸展的I型鞘糖脂的抗体分子，其中一或多个CDR插入来自人免疫球蛋白分子的FR区中。抗体可使用多种本领域已知技术人源化，包括例如CDR嫁接(EPO 239,400；WO91/09967；和美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、饰面法或表面重整(EPO 592,106；EPO 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28：489(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering 7：805(1994)；和Roguska et al.，Proc Natl Acad Sci USA 91：969(1994))、以及链改组(美国专利号5,565,332)。
人源化抗体具有一或多个来自非人来源的氨基酸残基。非人氨基酸残基经常被称作“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本上按照Winter et al.(Jones et al.，Nature 321：522(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323(1988)；和Verhoeyen et al.，Science 239：1534(1988))等所述方法进行，非人CDR或CDR序列的部分取代为人抗体的相应序列。因此，此种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变区已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点取代的人抗体。重链恒定区和铰链区可来自任何类或亚类以获得所期望的效果，如特定的效应物功能。
人构架区中的构架残基经常可用来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变并可能改善抗原结合。构架取代通过本领域已知的方法来鉴定，例如通过对CDR和构架残基相互作用建模来鉴定对抗原结合重要的构架残基以及通过序列对比来鉴定特定位点的异常构架残基，参见例如美国专利号5,585,089；和Riechmann et al.，Nature 332：323(1988)。
进一步优选的是人源化抗体保留对伸展的I型鞘糖脂的高亲和性以及保留或者获取其它有利的生物学性质。因此，人源化抗体可通过如下方法制备，即通过用亲代序列和人源化序列的三维模型来分析亲代序列和各种概念上的人源化抗体衍生物。假定的三维免疫球蛋白模型是普遍可得的并且是本领域技术人员所熟悉的。对所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构进行说明和展示的计算机程序是可得的。对所述展示的研究使得可以对某些残基在所述候选免疫球蛋白序列的功能中所可能起到的作用进行分析，即对影响所述免疫球蛋白结合伸展的I型鞘糖脂的能力的残基进行分析。以此方式，可从受体和输入序列选择和组合FR残基从而使所期望的抗体特性如对靶抗原提高的亲和性最大化，虽然直接地和最本质地影响伸展的I型鞘糖脂结合的是CDR残基。也可将CDR区修饰为含有一或多个与从亲代抗体(从其中获得CDR)所获得的不同的氨基酸以提供增强的或不同的感兴趣特性如例如更高亲和性或更大亲和力的结合。
可对抗体恒定区的某些部分进行操纵和改变以提供具有与亲代抗体中观察到的不同或更优的特性的抗体同系物、衍生物、片段等。由此，例如许多IgG4抗体在铰链区附近形成链间二硫键。所述链间键可使亲代二价分子不稳，形成包含重链及所关联轻链的单价分子。此种分子可重新缔合，但是在随机的基础上。
另一组适宜于修饰的氨基酸包括影响抗体功能的铰链区域内的氨基酸，所述抗体功能如对含有重链(结合Fc受体)的分子的结合以及所结合抗体的内化。此种氨基酸包括在IgG1分子中从约233到约237(Glu-Leu-Leu-Gly-Gly，SEQ ID NO：1)；从约252到约256(Met-Ile-Ser-Arg-Thr，SEQ ID NO：2)和从约318(Glu)到约331(Pro)的残基，包括例如Lys320，Lys322和Pro329。
特别需要完全的人抗体以用于治疗人类患者。人抗体可通过多种本领域已知的方法制备，包括上述使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法，参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741。Cole et al.和Boerder et al.的技术也可用于人单克隆抗体的制备(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss(1985)；和Boemer et al.，J Immunol 147：86(1991))。
人抗体也可使用转基因小鼠产生，所述小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但其也表达某些人免疫球蛋白基因。例如，可将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或通过同源重组引入到小鼠胚胎干细胞中。或者，除人重链和轻链基因之外，可将人可变区、恒定区和多变区引入到小鼠胚胎干细胞中。可通过由同源重组引入人免疫球蛋白基因座而对小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因进行处理从而使其分别或同时变成非功能性的。具体来说，JH区的纯合性缺失阻止内源抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩展并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。继而培育嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代，参见例如Jakobovitis et al.，Proc Natl Acad Sci USA90：2551(1993)；Jakobovitis et al.，Nature 362：255(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immunol 7：33(1993)；和Duchosal et al.，Nature 355：258(1992))。
以正常方式用伸展的I型鞘糖脂对转基因小鼠进行免疫，例如用伸展的I型鞘糖脂的全部或部分或者用含有其的膜制备物。可使用常规杂交瘤技术从经免疫的转基因小鼠获得针对伸展的I型鞘糖脂的单克隆抗体。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排并随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用此技术可以产生治疗上有用的IgG，IgA，IgM和IgE抗体。综述参见Lonberg et al.，Int Rev Immunol 13：65-93(1995)。产生人抗体和人单克隆抗体的讨论和产生此种抗体的方案参见例如WO98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；和WO 96/33735；EPO No.0 598 877；和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，可在公司如Amgen(Fremont，CA)，Genpharm(San Jose，CA)和Medarex，Inc.(Princeton，NJ)中预定使用类似于上述技术来提供针对伸展的I型鞘糖脂的人抗体。
也可通过免疫移植了人外周血白细胞、脾细胞或骨髓的小鼠而制备人mAb(例如XTL Biopharmaceuticals，Israel的三杂交瘤(trioma)技术)。
可使用称作“导向选择(guided selection)”的技术产生识别所选表位的完全人抗体。在此方法中，使用选择的非人单.克隆抗体例如小鼠抗体来对识别相同表位的完全人抗体的选择进行导向(Jespers et al.，Bio/Technology12：899(1988))。
当使用重组技术时，抗体变体可在周质间隙中于细胞内产生或者直接分泌到培养基中。如果所述抗体变体在细胞内产生，作为第一步，可通过例如离心或超滤将颗粒性碎片(宿主细胞或裂解片段)去除。Carter et al.，Bio/Technology 10：163(1992)描述了用于分离被分泌到大肠杆菌周质间隙中的抗体的方法。简短来说，使细胞团(cell paste)暴露于醋酸钠(pH 3.5)和EDTA。可通过离心来去除细胞碎片。当抗体变体被分泌到培养基中时，通常首先使用商业可购的蛋白浓缩滤器对来自此种表达系统的上清进行浓缩，例如使用Amicon或Millipore Pellicon超滤单元。可以引入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解并且可包括抗生素以阻止偶发污染物的生长。
可使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从所述细胞中制备的抗体组合物。蛋白A或蛋白G作为亲和性配体的适宜性取决于抗体变体中存在的免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人IgG1，IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark et al.，J ImmunolMeth 62：1(1983))。蛋白G可用于小鼠同种型和人IgG3(Guss et al.，EMBOJ 5：1567(1986))。亲和性配体所附着的基质最常见的是琼脂糖，但也可使用其它基质。机械上稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许与使用琼脂糖相比较快的流速和较短的加工时间。当抗体变体含有CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(JT Baker；Phillipsburg，NJ)可用于纯化。取决于要回收的抗体或变体，也可用其它蛋白纯化技术，如在离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶上的层析、肝素琼脂糖上的层析阴离子或阳离子树脂上的层析(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以使包含感兴趣的抗体或变体以及污染物的混合物经受低pH疏水相互作用层析，其中使用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度下(例如从约0-0.25M的盐)进行。
此外，使用本领域技术人员已知的技术，本发明的抗体可依次被用于产生“模拟”伸展的I型鞘糖脂的抗独特型抗体。(参见例如Greenspan et al.，FASEB J 7：437(1989)；和Nissinoff，J Immunol 147：2429(1991))。例如，结合伸展的I型鞘糖脂并竞争性抑制配体与伸展的I型鞘糖脂的多聚化和/或结合的抗体可用于产生“模拟”伸展的I型鞘糖脂的抗独特型抗体。此种中和性抗独特型抗体或此种抗独特型抗体的Fab片段可用于治疗或诊断方案。
本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体可以是单克降抗体，优选是人抗体或人源化抗体，是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在本发明中，结合特异性之一是针对伸展的I型鞘糖脂，而另一个特异性可以是对任何其它抗原，如细胞表面蛋白、受体、受体亚基、配体、组织特异性抗原、病毒蛋白、病毒编码的包膜蛋白、药物活性剂如药物、细菌来源蛋白、细菌表面蛋白等。
制备双特异性抗体的方法是熟知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于两种免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中所述两种重链具有不同的特异性(Milstein et al.，Nature 305：537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机相配，杂交瘤(四瘤(quadromas))产生约10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有约1种可能具有正确的双特异性结构。对正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤完成。类似方法在WO 93/08829和Traunecker etal.，EMBO J 10：3655(1991)中公开。其它制备双特异性抗体的方法在例如Kufer et al.，Trends Biotech 22：238-244，2004中提供。
具有所期望结合特异性的抗体可变结构域可被融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。所述融合优选与包含至少部分铰链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域进行。其可以具有第一个重链恒定区(CH1)，其含有在融合体至少一个中存在的轻链结合必需位点。编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA被插入到独立的表达载体中并被共转化至适宜的宿主生物体内。对于生成双特异性抗体的进一步细节参见例如Suresh et al.，Meth Enzym 121：210(1986)。
本发明还虑及异源缀合(heteroconjugate)抗体。异源缀合抗体由两种共价接合的抗体组成。此种抗体已经例如被提议为使免疫系统细胞靶向于不希望的细胞(美国专利号4,676,980)。所述抗体被构想可使用合成蛋白化学中已知的方法体外制备，包括使用涉及交联剂的那些。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫酯键来构建免疫毒素。用于此目的的适宜试剂的例子包括亚氨基硫醇盐/酯(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸盐/酯以及例如在美国专利号4,676,980中公开的那些。
另外，可以生成针对伸展的I型鞘糖脂的单结构域抗体。所述技术的例子已经在WO9425591中描述用于源自骆驼科重链Ig的抗体以及在US20030130496中描述了来自噬菌体文库的单结构域完整人抗体的分离。
或者，可以进行描述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778；Bird，Science 242：423(1988)；Huston et al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879(1988)；和Ward et al.，Nature 334：544(1989))。通过将Fv区的重链和轻链片段经氨基酸桥连接来形成单链抗体，产生单链多肽。也可使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra et al.，Science 242：1038(1988))。单链抗体(″scFv″)和它们的构建方法在例如美国专利号4,946,778中描述。或者，可以用类似方法构建和表达Fab。所有完整的或部分的人抗体可以比完整的鼠mAb具有较低的免疫原性，而片段和单链抗体也可以有较低的免疫原性。
本发明涵盖了重组融合至或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至多肽的抗体。本发明的融合或缀合抗体可用于简化纯化，参见例如WO 93/21232；EP 439,095；Naramura et al.，Immunol Lett 39：91(1994)；美国专利号5,474,981；Gillies et al.，Proc Natl Acad Sci USA 89：1428(1992)；和Fell et al.，J Immunol 146：2446(1991)。
可通过使用识别标记或标签来辅助纯化。例如，所述标记可以是氨基酸序列，如六组氨酸肽，如pQE载体(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)中提供的标签，例如其很多都是商业可购的，Gentz et al.，Proc Natl Acad Sci USA86：821(1989)。其它可用于纯化的肽标签包括但不限于″HA″标签，其对应于源自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson et al.，Cell 37：767(1984))和″flag″标签。
抗体或抗体片段可分离自抗体噬菌体文库，所述文库使用McCaffertyet al.，Nature 348：552(1990)中描述的技术产生。Clarkson et al.，Nature352：624(1991)和Marks et al.，J MoI Biol 222：581(1991)分别描述了使用噬菌体文库对鼠和人抗体的分离。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和性(nM范围)人抗体(Marks et al.，Bio/Technology 10：779(1992))以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nucl Acids Res 21：2265(1993))。因此，所述技术是对用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代。
如本领域所知的那样，候选抗伸展的I型鞘糖脂抗体可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、FACS、蛋白免疫印记或其它免疫化学技术测试。因此，可使用B细胞或表达伸展的I型鞘糖脂的细胞使用已知技术检测结合其的抗体或者可将含伸展的I型鞘糖脂或其部分的适宜膜制备物、或者纯化或分离的伸展的I型链结构附着于固相并用作测定中的捕获元件，如设计选择所设置。
为确定特定抗体同系物是否结合人伸展的I型鞘糖脂，可使用任何常规的结合测定。可用的伸展的I型鞘糖脂结合测定包括FACS分析、ELISA测定、放射免疫测定等，其检测抗体对人伸展的I型鞘糖脂的结合及从其中所导致的功能。本文教导的人伸展的I型鞘糖脂的全长和可溶形式在此种测定中有用。可通过使用对抗体或其同系物所源自的物种的免疫球蛋白有特异性的第二抗体来方便地检测所述抗体或同系物对伸展的I型鞘糖脂或其可溶性片段的结合。所述第二抗体可携有可检测标记或者被设置为被检测。
可通过测试抗体或同系物结合人伸展的I型鞘糖脂+细胞的能力来对所述抗体或同系物结合人伸展的I型鞘糖脂的能力进行评估。适宜用于确定特定抗体或同系物是否结合伸展的I型鞘糖脂的伸展的I型鞘糖脂+细胞是表达伸展的I型鞘糖脂如在细胞表面表达伸展的I型鞘糖脂的可得的哺乳动物组织培养细胞。
可通过将细胞染色来检测抗体或同系物对伸展的I型鞘糖脂+细胞的结合，所述染色可使用例如荧光标记的第二抗体，所述第二抗体对测试的抗体同系物所源自的相同物种的免疫球蛋白有特异性。荧光激活细胞分选仪(″FACS″)可用于检测和定量任何结合，一般参见Shapiro，Practical FlowCytometry，Alan R.Liss，Inc.，New York，N.Y.(1985)。
为确定特定抗体或同系物是否不引起体内循环的伸展的I型鞘糖脂+细胞数目的显著降低，在将所述抗体或同系物施用于具有正常免疫功能的哺乳动物后的24小时内，对分离自所述哺乳动物的循环的伸展的I型鞘糖脂+细胞的数目进行定量并与施用前的数目进行对比或者与对照哺乳动物的数目进行对比，所述对照哺乳动物中施用了不相关特异性的同种型匹配抗体或同系物来代替本发明的抗体或同系物。在用伸展的I型鞘糖脂抗体或其功能性部分或衍生物给药的动物内对伸展I型鞘糖脂+细胞的定量可例如通过用结合抗-伸展的I型鞘糖脂抗体的荧光标记的抗体以及标记的特异于T细胞和B细胞的抗体染色所获得的细胞、随后通过FACS分析进行。
本发明的抗体可以用所述抗体识别或特异性结合的表位或伸展的I型鞘糖脂的部分描述或者详细说明。所述表位可如本文所述的那样进行详细说明，例如通过物理方式如质谱、糖类的成分分析、糖所结合的分子、构象表位等等。
本发明的抗体还可以用交叉反应性进行描述或者详细说明。与伸展的I型鞘糖脂具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％相同性(使用本领域已知和本文所述方法计算)的结合伸展的I型鞘糖脂的抗体也包括在本发明中。
本发明的抗体还可以用对感兴趣的伸展的I型鞘糖脂的结合亲和性来进行描述或者详细说明。抗-伸展的I型鞘糖脂抗体可以低于约10-7M、低于约10-6M、或低于约10-5M的KD结合。感兴趣抗体中较高的结合亲和性可以是有益的，如具有如下平衡解离常数或KD的那些：从约10-8到约10-15M或更多、从约10-8到约10-12M、从约10-9到约10-11M、或从约10-8到约10-10M。本发明也提供竞争性抑制抗体对本发明表位结合的抗体，这是通过任何本领域已知的确定竞争性结合的方法来确定的，例如本文所述的免疫测定。在优选的实施方案中，所述抗体竞争性地将对所述表位的结合抑制至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。
本发明还包括包含感兴趣抗体的缀合物。所述缀合物包含两种主要组分，感兴趣的抗体和第二种组分，其可以是细胞结合剂、细胞毒性剂、药物活性剂、药物等等。
如本文所用，术语“细胞结合剂”是指特异识别和结合细胞表面上分子的物质。由此，所述细胞结合剂可以是结合CD抗原、病原体抗原如病毒抗原、分化抗原、癌症抗原、细胞特异抗原、组织特异性抗原、Ig或类Ig分子等等的物质。
细胞结合剂可以是任何现在已知的类型、或变得已知的类型，包括肽、非肽、糖类、核酸、配体、受体等等、或者其组合。所述细胞结合剂可以是能够以特异性或非特异性方式结合细胞的任何化合物。通常，所述结合剂可以是抗体(特别是单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、营养转运分子(如转铁蛋白)、或任何其它细胞结合分子或物质。
可使用的细胞结合剂的其它例子包括：多克隆抗体；单克隆抗体；和抗体的片段如Fab、Fab′，F(ab′)2和Fv片段(Parham，J.Immunol.131：2895-2902(1983)；Spring et al.，J.Immunol.113：470-478(1974)；和Nisonoff et al.，Arch.Biochem.Biophys.89：230-244(I960))。
所述第二种组分还可以是细胞毒性剂。如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指降低或阻断细胞的功能或生长和/或引起细胞破坏的物质。由此，所述细胞毒性剂可以是紫杉醇、美登木素生物碱(maytansinoid)如DM1或DM4、CC-1065或CC-1065类似物、蓖麻毒蛋白、药物、丝裂毒素C等等。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂与本发明缀合物的任何结合剂一样直接或者经可裂解或不可裂解的接头共价附着于感兴趣的抗体。
适宜的美登木素生物碱的例子包括美登木醇和美登木醇类似物。美登木素生物碱抑制微管形成且对哺乳动物细胞具高度毒性。
适宜的美登木醇类似物的例子包括具有修饰的芳香环的那些和在其它位置有修饰的那些。这种适宜的美登木素生物碱在美国专利号4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；6,333,410；5,475,092；5,585,499；和5,846,545中描述。
具有修饰的芳香环的适宜的美登木醇类似物的例子包括：(1)C-19-脱氯(美国专利号4,256,746)(通过例如安丝菌素(ansamytocin)P2的LAH还原来制备)；(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过例如使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或者使用氢化铝锂(LAH)的脱氯作用来制备)；和(3)C-20-脱甲氧基，
具有其它位置修饰的适宜的美登木醇类似物的例子包括：(1)C-9-SH(美国专利号4,424,219)(通过美登木醇与H2S或P2S5的反应而制备)；(2)C-14-烷氧甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利号4,331,598)；(3)C-14-羟甲基或酰氧甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4,450,254)(从诺卡菌属制备)；(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4,364,866)(通过由链霉菌对美登木醇的转化而制备)；(5)C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)(分离自滑桃树(Trewia nudiflora))；(6)C-18-N-脱甲基(美国专利号4,362,663和4,322,348)(通过由链霉菌对美登木醇的脱甲基化而制备)；和(7)4，5-脱氧(美国专利号4,371,533)(通过美登木醇的三氯化钛/LAH还原而制备)。
可通过体外方法来制备胞毒性缀合物。为了将毒性剂、药物或前体药物连接至抗体，普遍使用连接基团。适宜的连接基团是本领域已知的且包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。例如可通过二硫化物交换反应或通过在感兴趣的抗体和药物或前体药物之间形成硫醚键而构建缀合物。
缀合至感兴趣抗体的分子可以是具有药理活性的分子，如药物如小分子或生物制剂。因此，所述生物制剂可以例如是细胞因子。所述分子可以是前体药物，如药物酯。所述分子可以是放射性核素。
如上所述，本发明提供编码本文公开的抗体或其功能性变体的分离的核酸序列、包含编码本发明的伸展的I型鞘糖脂结合多肽的核苷酸序列的载体构建体、包含此载体的宿主细胞以及生产结合伸展的I型鞘糖脂的多肽的重组技术。
所述载体通常含有本领域已知的组分且一般包括但不限于下列的一或多种：信号序列、复制起点、启动子、polyA序列、一或多个标记或选择基因、辅助和/或增强翻译的序列、增强子元件等等。因此，表达载体包括可操纵地连接至此种适宜的转录或翻译调节核苷酸序列(如源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的那些)的核苷酸序列。另外的调节序列的例子包括操纵基因、mRNA核糖体结合位点和/或其它控制转录和翻译(如其起始和终止)的适当序列。当调节序列功能性涉及适当多肽的核苷酸序列时，则核苷酸序列是“可操纵地连接的”。因此，如果启动子核苷酸序列控制核苷酸序列(例如抗体重链序列)的转录则所述启动子核苷酸序列是可操纵地连接于所述抗体重链序列的。
另外，可在表达载体中掺入并不与抗体重链和/或轻链序列天然关联的编码适当信号肽的序列。例如，可将信号肽(分泌前导序列)的核苷酸序列于框内融合至多肽序列从而使抗体被分泌至周质间隙或培养基中。在要使用的宿主细胞内有功能的信号肽增强了适当抗体或其部分的细胞外分泌。所述信号肽可以在抗体从细胞分泌时从所述多肽裂解。此种分泌信号的例子是本领域所熟知的，包括例如美国专利号5,698,435；5,698,417；和6,204,023中描述的那些。
所述载体可以是质粒、单链或双链病毒载体、单链或双链RNA或DNA噬菌体载体、噬菌粒、粘粒或感兴趣转基因的任何其它运载体。可以通过众所周知的将DNA和RNA引入细胞内的技术来将此种载体作为多核苷酸引入细胞内。所述载体在噬菌体和病毒载体的情况中还可以通过众所周知的感染和转导技术而作为包装的或包囊的病毒或病毒样颗粒而引入细胞内。病毒载体可以是可复制的或者是复制缺陷的。在后者的情况下，病毒增殖通常将仅在互补宿主细胞并使用携有产生颗粒所需的各种病毒组分的多个载体时发生。也可使用无细胞翻译系统使用源自现有感兴趣DNA构建体的RNA来产生蛋白(参见例如WO 86/05807和WO 89/01036；及美国专利号5,122,464)。
本发明的抗体可从任何事宜的宿主细胞中表达。可用于本发明的宿主细胞的例子包括原核、酵母或真核细胞且包括但不限于微生物如细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌属(Bacilli)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属)，其转化了含有感兴趣抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体；酵母(例如酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、放线菌(Actinomycetes)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、木霉属(Trichoderma)、链孢霉属(Neurospora)和丝状真菌如链孢霉属、青霉属(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)和曲霉菌属(Aspergillus))，其转化了含有抗体编码序列的重组酵母表达载体；感染了含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；感染了含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV或烟草花叶病毒TMV)或转化了重组质粒表达载体(例如Ti质粒)的植物细胞系统；或者携带含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子或者痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293或3T3细胞)。
用于原核宿主细胞的表达载体通常包含一或多种表型可选择标记基因。表型可选择标记基因是例如编码赋予抗生素抗性或供应自养需求的蛋白的基因。可用于原核宿主细胞的表达载体的例子包括那些源自商业可购质粒如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pGEMl(Promega Biotec，Madison，WI)、pET(Novagen，Madison，WI)和pRSET(Invitrogen，Carlsbad，CA)系列的载体(Studier，J MoI Biol 219：37(1991)；和Schoepfer，Gene 124：83(1993))的那些。普遍用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括T7(Rosenberg et al.，Gene 56：125(1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子(Chang et al.，Nature 275：615(1978)；和Goeddel etal.，Nature 281：544(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.，Nucl AcidsRes 8：4057(1980))和tac启动子(Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(1990))。
酵母载体经常会含有复制起点序列，如来自2μ酵母质粒，自主复制序列(ARS)、启动子区、用于多聚腺苷酸化的序列、用于转录终止的序列和可选择标记基因。适于酵母载体的启动子序列包括例如金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸酯激酶(Hitzeman et al.，J Biol Chem 255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Holland et al.，Biochem 17：4900(1978))如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。其它用于酵母表达的适宜载体和启动子在Fleer et al.，Gene 107：285(1991)中进一步描述。其它用于酵母和酵母转化方案的适宜启动子和载体是本领域已知的。酵母转化方案是众所周知的。Hinnen et al.，Proc Natl Acad Sci 75：1929(1978)描述了一个此种方案，其在选择性培养基中选择Trp+转化体。
任何真核细胞培养物均是可行的，无论来自脊椎动物或非脊椎动物。例子包括植物和昆虫细胞(Luckow et al.，Bio/Technology 6：47(1988)；Miller et al.，Genetic Engineering，Setlow et al.，eds.，vol.8，pp.277-9，PlenumPublishing(1986)；和Maeda et al.，Nature 315：592(1985))。例如，杆状病毒系统可用于生产异源蛋白。在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可被用作载体表达外源基因。所述病毒在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列克隆在AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。其它已被鉴定的宿主包括伊蚊、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒株是公共可得的，例如AcNPV的L-I变体和家蚕NPV的Bm-5株。此外，如本领域所知的，棉花、谷类、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄、藻类、浮萍和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
脊椎动物细胞和脊椎动物细胞的繁殖在培养物中(组织培养)可以是常规过程，虽然挑剔的细胞系需要例如具有独特因子、饲养细胞等的专门培养基，参见Tissue Culture，Kruse et al.，eds.，Academic Press(1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子有猴肾脏；人胚胎肾脏；幼仓鼠肾脏；中国仓鼠卵巢(CHO，Urlaub et al.，Proc Natl Acad Sci USA 77：4216(1980))；小鼠Sertoli；人宫颈癌(例如HeLa)；犬肾脏；人肺；人肝脏；小鼠乳腺肿瘤；和NSO细胞。
由用于抗体生产的载体转化宿主细胞并在常规营养培养基中培养，所述培养基含有生长因子、维生素、矿物质等等以及适于所使用的细胞和载体的诱导物。普遍使用的启动子序列和增强子序列源自例如多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)。源自SV40病毒基因组的DNA序列可用于为哺乳动物宿主细胞中结构基因序列的表达提供其它遗传元件，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接和多聚腺苷酸化位点。病毒早期和晚期启动子尤其有用，因为二者均易于作为片段而得自病毒基因组，其也可含有病毒复制起点。用于在哺乳动物宿主细胞中的示例性表达载体是商业可购的。
商业可购的培养基如Ham′s FlO、Minimal Essential Medium(MEM).RPMI-1640和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)适用于培养宿主细胞。另外，在Ham et al.，Meth Enzymol 58：44(1979)和Barnes et al.，AnalBiochem 102：255(1980)以及在美国专利号4,767,704；4,657,866；4,560,655；5,122,469；5,712,163；或6,048,728中描述的任何培养基均可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基均可在需要时补加激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化物如氯化钠、氯化钙、或氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺嘌呤和胸苷)、抗生素、微量元素(其可以被定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价能量来源。根据没计选择，可以适当的浓度包括任何其它必要的补充物。培养条件如温度、pH等如本领域已知的那样适宜于细胞并使得转基因能进行期望的表达。
可使用任何本领域已知的方法来获得感兴趣的多核苷酸并确定所述多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码所述抗体的多核苷酸序列可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如在Kutmeier etal.，Bio/Techniques 17：242(1994)中描述)并继而通过例如PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，编码抗体的多核苷酸可以从表达其的细胞的核酸而产生。如果没有含编码特定抗体的核酸的克降，但是抗体分子的序列已知，则编码该免疫球蛋白的核酸可得自适当来源，如文库，其可以是特异于产抗体细胞的文库，所述产抗体细胞如是被选择用来表达本发明抗体的杂交瘤细胞。可以配制适宜的引物用于PCR扩增。由PCR产生的扩增的核酸可继而用任何本领域已知的方法来克隆到可复制克隆载体中。
一旦确定了核苷酸序列以及相应的抗体氨基酸序列，则可以操纵该抗体的核苷酸序列以获得本文所述感兴趣的等价物，使用本领域已知的用于操纵核苷酸序列的方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory(1990)；和Ausubel et al.，eds.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons(1998))产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
可通过众所周知的方法来检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列，例如通过与其它重链和轻链可变区的已知氨基酸序列的对比来确定序列高变区。使用常规重组DNA技术，可将一或多个所述CDR插入构架区内，例如如前所述插入到人构架区内以人源化非人抗体。通过组合所述构架区以及一或多个CDR所产生的感兴趣多核苷酸编码特异性结合伸展的I型鞘糖脂或者至少由此识别的碳水化合物表位和结构的分子。例如，此方法可用于进行一或多个半胱氨酸残基(参与链内二硫键)的氨基酸取代或缺失以产生缺乏一或多个链内二硫键的抗体分子。
本发明的抗体或抗体片段可用于在体内或体外检测生物样品中伸展的I型鞘糖脂，及因此可检测表达伸展的I型鞘糖脂的细胞。在一个实施方案中，本发明的抗伸展的I型鞘糖脂抗体用于确定组织中或源自该组织的细胞中伸展的I型鞘糖脂的存在以及水平。该组织或活组织检查中伸展的I型鞘糖脂的水平可在例如使用本发明抗体或抗体片段的免疫测定中确定。其组织或活组织检查可以是冷冻的或固定的。同样方法或其它方法可用于确定伸展的I型鞘糖脂的其它特性，如其水平、细胞定位等等。
上述方法可用于例如在已知患有或怀疑患有癌症的对象中诊断癌症，其中在所述患者中测量的伸展的I型鞘糖脂的水平与正常参照对象或标准进行对比。
本发明还提供被进一步标记以用于研究或诊断应用的单克隆抗体、人源化抗体和其表位结合片段。在一些实施方案中，所述标记例如是放射性标记、荧光团、生色团、显像剂或金属离子。
还提供了诊断方法，其中将所述标记的抗体或其表位结合片段施用于怀疑患有癌症、关节炎、自身免疫疾病或其它涉及伸展的I型鞘糖脂表达和/或功能或者由伸展的I型鞘糖脂表达和/或功能引起或与伸展的I型鞘糖脂表达和/或功能相关的疾病的对象，并且对该标记在所述对象体内的分布进行测量和监测。
本发明的抗体及其片段可用作亲和性纯化剂。在此方法中，使用本领域已知方法将抗体固定于固相上如右旋糖酐或琼脂糖、树脂或滤纸。所述固定的抗体与含有样品接触
对于诊断应用，通常会用可检测部分或标记标记感兴趣的抗体。可用的有许多标记，其通常可分为如下类别：(a)放射性同位素，如36S，14C，1251，3H和131I(可使用例如Current Protocols in Immunology，vol.12，Coligen et al.，ed.，Wiley-Interscience，New York(1991)中所述技术来将抗体用放射性同位素标记并且可使用闪烁计数测量放射性)；(b)荧光标记，如稀土螯合物(铕螯合物)、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红，可例如使用前述Current Protocols in Immunology中公开的技术将荧光标记缀合到抗体上，其中可使用荧光计来对荧光进行定量；和(c)可使用各种酶底物标记(美国专利号4,275,149提供综述)，酶通常催化产色底物的化学改变，可使用各种技术对其进行测量，例如酶可催化底物的颜色改变，可对其进行分光光度测量，或者酶可以改变底物的荧光或者化学发光。对荧光中的变化进行定量的技术是已知的，例如使用光度计，或者所述标记供应能量给荧光受体。酶标记的例子包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利号4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶缀合至抗体的技术在O′Sullivan et al.，Meth Enz，ed.Langone & Van Vunakis，Academic Press，New York，73(1981)中描述。
当使用此种标记时，有适宜的底物，如：(i)对于辣根过氧化物酶有过氧化氢酶作为底物，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基盐酸联苯胺(TMB))；(ii)对于碱性磷酸酶(AP)有对-硝基苯磷酸作为生色底物；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)有生色底物(例如对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物如4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶。
其它酶-底物组合对于本领域技术人员来说是可得的。对于一般综述参见美国专利号4,275,149和4,318,980。
有时，所述标记间接地缀合抗体。例如，可将生物素缀合至抗体并可将任何前述的报道分子缀合至抗生物素蛋白，或反之。生物素选择性结合抗生物素蛋白，因此所述标记可以间接方式缀合抗体。各种抗生物素蛋白是本领域已知的。或者，为了实现标记的间接缀合，可将抗体与小的半抗原(例如地高辛)缀合并将上述不同类型的标记或报道分子中的一种与抗地高辛抗体缀合。因此，使用第二个抗体可实现所述标记与抗体或突变蛋白的间接缀合。
在本发明另一个实施方案中，所述抗体不需要被标记，而其存在可用结合所述抗体的标记的抗体(另一种形式的第二抗体)来检测。
本发明的抗体可用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接或间接夹心测定和免疫沉淀测定。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual ofTechniques(CRC Press，Inc.1987)。
竞争性结合测定依靠标记的标准物与测试样品竞争结合有限量抗体的能力。测试样品中的抗原量与结合抗体的标准物的量成反比。为辅助确定结合的标准物的量，通常在竞争前或竞争后使所述抗体不溶。结果，结合抗体的标准物和测试样品可以方便地与保持未结合的标准物和测试样品分开。
夹心测定涉及使用两种抗体，每种能够结合至待测靶的不同免疫原性部分、决定簇或表位。在夹心测定中，使要分析的测试样品结合直接或间接固定于固体支持物的第一抗体，之后将直接或间接标记的第二抗体结合已结合的测试样品，由此形成不溶的三部分复合物，参见例如美国专利号4,376,110。所述第二抗体本身可以用可检测部分来标记(直接夹心测定)或者可以使用标记了可检测部分的抗-免疫球蛋白抗体或其它适宜的结合对成员(例如抗体/抗原、受体/配体、酶/底物)来测量(间接夹心测定)。例如，一种类型的夹心测定是ELISA测定，在该情况中可检测部分是酶。
对于免疫组织化学，细胞或组织样品可以是新鲜的或冷冻的或者可以是包埋入石蜡并用防腐剂如例如福尔马林固定的。
抗体还可以用于体内诊断测定。通常，所述抗体或其变体用放射性核素标记(如111In，99Tc，14C，131I，3H，32P或35S)从而可以使用例如免疫闪烁成像和γ照相机来对表达伸展的I型鞘糖脂的位点定位。
本发明还包括试剂盒，例如包含抗体、其片段、同系物、其衍生物等，如标记的或细胞毒性缀合物和使用所述抗体的说明书，用于杀伤或者标记特定细胞类型的缀合物等等。所述说明书可包括对体外、体内或离体使用抗体、缀合物等的指导。抗体可以是以液体形式或作为固体，通常是冻干的。所述试剂盒可含有适宜的其它试剂，如缓冲液、重建溶液(reconstitutingsolution)和其它用于所需用途的必要成分。虑及了预定量试剂包装的组合，其中有对于其用途的说明书，如用于进行诊断测定的治疗用途。当抗体被标记时，比如使用酶，则所述试剂盒可包括所述酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。另外，可包括其它添加剂如稳定剂、缓冲液(例如阻断缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以是变化的以提供试剂溶液的浓缩物，其给用户提供了灵活性、空间经济性、试剂经济性等等。试剂可以干粉提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其溶解后提供了具有适当浓度的试剂溶液。
本发明的抗体可用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，例如将感兴趣的抗体或等价物施用于非人哺乳动物用于获得临床前数据的目的。示例性的待治疗非人哺乳动物包括非人灵长类、狗、猫、啮齿类和其它进行临床前研究的哺乳动物。此种哺乳动物可以是要用抗体治疗的疾病的已建立的动物模型或者可以用于研究感兴趣抗体的毒性。在那些实施方案中的每一个中，可以在哺乳动物中进行剂量放大研究。感兴趣的产物也可在那些动物中具有治疗用途。
有或者没有第二组分(如缀合至其的治疗性部分)的抗体被单独施用或者与细胞毒性因子组合施用可以用作治疗剂。本发明针对基于抗体的治疗，其涉及将本发明的抗体施用于动物、哺乳动物或人以治疗伸展的I型鞘糖脂-介导或相关的疾病、失调或病症。所述动物或对象可以是需要特定治疗的哺乳动物如已被诊断为具有特定失调的哺乳动物，所述失调例如涉及伸展的I型鞘糖脂或者与异常的伸展的I型链结构表达和功能相关。针对伸展的I型鞘糖脂的抗体可用于例如癌症和自身免疫失调的预防和治疗。例如，通过施用治疗可接受剂量的本发明的抗-伸展的I型鞘糖脂抗体、或者多种所述抗体或其等价物的混合物、或者与其它不同来源的抗体的组合、或者与非抗体药物如消炎药、细胞毒性剂、抗生素等如铂药物、甲氨蝶呤等的组合，经治疗的哺乳动物特别是人中的疾病症状可以被改善或预防。
本发明的治疗化合物包括但不限于本发明的抗体(包括如本文所述的其片段、类似物、等价物和衍生物)和如本文所述编码本发明抗体的核酸(包括其片段、类似物和衍生物)以及如本文所述的抗独特型抗体。本发明的抗体可用于治疗、抑制或防止与伸展的I型鞘糖脂的异常表达和/或活性相关的疾病、失调或病症，包括但不限于本文所述的任何一或多种疾病、失调或病症。对与伸展的I型鞘糖脂的异常表达和/或活性相关的疾病、失调或病症的治疗和/或预防包括但不限于减轻至少一种与那些疾病、失调或病症相关的症状。可以如本领域所知或者如本文所述那样在药物可接受的组合物中提供本发明的抗体。术语“生理可接受的”、“药学可接受的”、“药物可接受的”等等意指由联邦或州政府管理机构许可或者是在美国药典或其它普遍认可的药典中列出用于动物特别是人。
可以以任何可接受的方式将抗-伸展的I型鞘糖脂抗体施用于哺乳动物。引入的方法包括但不限于肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、硬膜外、吸入和口服途径，以及如果期望用于免疫阻抑治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、皮内、静脉内、动脉内或腹膜内施用。抗体或组合物可以通过任何方便途径施用，例如通过输注或弹丸注射(bolus injection)、通过上皮或粘膜内层吸收(例如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等)以及可以与其它生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或者局部的。另外，可以期望将本发明的治疗性抗体或组合物通过任何适宜途径引入中枢神经系统，包括室内和鞘内注射；脑室内注射可通过脑室导管辅助，例如附着至储液囊(reservoir)，如Ommaya储液囊。另外，抗体可通过脉冲输注而适宜地施用，特别是用递减剂量的抗体。优选通过注射来给予药剂，优选静脉内或皮下注射，部分取决于所述施用是简短的还是慢性的。
各种其它输送系统是已知的并且可用来施用本发明的抗体，包括例如在脂质体、微粒、微胶囊等中包囊(参见Langer，Science 249：1527(1990))；感兴趣的抗体、其突变蛋白或其抗原结合部分在脂质体、颗粒、胶囊等上的表达以产生靶向运载体，Treat et al.，在Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein et al.，eds.，p.353-365(1989)；和Lopez-Berestein，ibid.，p.317-327中；能够表达所述化合物的重组细胞，参见例如Wu et al.，J Biol Chem 262：4429(1987)；将核酸构建为逆转录病毒或其它载体的一部分等等。
也可将活性成分陷入微胶囊中，所述微胶囊的制备例如是通过凝聚(coascervation)技术或者是通过界面聚合，分别例如是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，陷入胶体药物输送系统中(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒子和纳米胶囊)或者粗乳剂中。此种技术在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，A.Osal，Ed.(1980)中公开。当脂质体或粒子表达感兴趣抗体时，在脂质体中可携有多种化合物的任一种，如非抗体约物、小分子药物等。本发明抗体因而可发挥靶向功能。
也可使用肺施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及有喷雾剂的制剂。所述抗体也可以干粉组合物的形式被施用到患者肺部，参见例如美国专利号6,514,496。
在具体的实施方案中，可能期望将本发明治疗性抗体或组合物局部施用到需要治疗的区域；这可以例如而非限制性地通过局部输注、表面应用、通过注射、通过导管、通过栓剂或者通过植入物实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，如sialastic膜或纤维。优选地，当施用本发明的抗体时，要当心对蛋白不吸收或吸收的材料的使用。
在另一个实施方案中，所述抗体可以在控制释放系统中输送。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，Science 249：1527(1990)；Sefton，CRCCrit Ref Biomed Eng 14：201(1987)；Buchwald et al.，Surgery 88：507(1980)；和Saudek et al.，N Engl J Med 321：574(1989))。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer et al.，eds.，CRC Press(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen et al.，eds.，Wiley(1984)；Ranger et al.，J Macromol SciRev Macromol Chem 23：61(1983)；也参见Levy et al.，Science 228：190(1985)；During et al.，Ann Neurol 25：351(1989)；和Howard et al.，J Neurosurg71：105(1989))。在另一个实施方案中，控制释放系统被置于治疗靶附近。
也可制备持续释放制备物。持续释放制备物的适宜例子包括含有所述抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是成形物品的形式，例如膜或基质。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基L-谷氨的共聚物、非降解性乙烯-醋酸乙烯酯、降解性乳酸-乙醇酸共聚物(如由乳酸-乙醇酸共聚物组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使得分子的释放能超过100天，而某些水凝胶在较短的时间段释放蛋白。根据所涉及的机制可以设计用于稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换而形成的分子间S-S键，可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用适当添加剂、氨基酸取代和开发特异聚合物基质组合物实现稳定化。
多肽或抗体的治疗性制剂可以制备为冻干制剂或者水溶液储存，通过将具有所期望纯度的多肽与任选的本领域常用的“药物可接受”运载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂混合，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和其它各种添加剂参见Remington′s PharmaceuticalSciences，16th ed.，Osol，ed.(19S0)。此种添加剂在所使用的剂量和浓度通常对接受者是非毒性的，因此赋形剂、稀释剂、运载体等是药物可接受的。
“分离的”或“纯化的”抗体是基本上没有来自所述蛋白所源自的细胞或组织来源或培养基的细胞材料或者其它污染蛋白，或者当经化学合成时基本上没有化学前体或其它化学品。语言“基本上没有细胞材料”包括抗体的制备物，其中所述多肽/蛋白与其所分离自或者从中重组产生的细胞的细胞组分分开。因此，基本上没有细胞材料的抗体包括所述抗体的制备物，其具有少于大约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)的污染蛋白或者细胞或亚细胞材料。当抗体是重组产生时，其还优选基本上没有培养基，即培养基占蛋白制备物的体积少于约20％、10％、5％、2.5％或1％。当抗体是通过化学合成时，其优选基本上没有化学前体或其它化学品或试剂，即感兴趣的抗体与在蛋白合成中所涉及的化学前体或其它化学品分开。因此，所述抗体的此种制备物具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(干重)的感兴趣抗体之外的化学前体或化合物。在本发明优选的实施方案中，抗体是分离的或纯化的。
如本文所用，措辞“低至不可检测水平的聚集”是指样品含有不超过5％、不超过4％、不超过3％、不超过2％、不超过1％及经常不超过0.5％的抗体或其变体的聚集，即两或更多个抗体分子或其变体连接或聚结在一起，这是通过对蛋白称重得到的，例如通过高效大小排阻层析(HPSEC)测量。
如本文所用，术语“低至不可检测水平的片段化”是指样品含有等于或多于总蛋白的80％、85％、90％、95％、98％或99％的完整抗体分子或其变体，例如在通过HPSEC确定的单一峰中或者例如在通过还原毛细管凝胶电泳(rCGE)的两个(2)峰中(重链和轻链)且不含有其它每个具有超过5％超过4％、超过3％、超过2％、超过％或超过0.5％的总蛋白的单一峰。如本文所用的rCGE是指在还原条件下的毛细管凝胶电泳，其中所述还原条件足以还原抗体或抗体类型或衍生的分子中的二硫键。
本发明提供用于制备抗体或其伸展的I型鞘糖脂结合片段的液体制剂的方法，所述方法包含将纯化的抗体的级分浓缩至终浓度为约15mg/ml、约20mg/ml、约30mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约80mg/ml、约90mg/ml、约100mg/ml、约200mg/ml、约250mg/ml、约300mg/ml或更多，其中浓缩是使用例如具有适当分子量(mw)截断值的半透膜(例如30kD截断值用于其F(ab′)2片段；以及10kD截断值用于Fab片段)以及任选地将浓缩的抗体级分用同样的膜透滤到配制缓冲液中。
另外，本发明也涵盖了可在体内具有改善的半衰期的感兴趣产物的稳定液体制剂。因此，感兴趣的抗体在对象中优选在人中具有超过3天、超过7天、超过10天、超过15天、超过25天、超过30天、超过35天、超过40天、超过45天、超过2个月、超过3个月、超过4个月、超过5个月或更长的半衰期。
如本文所用，在包含伸展的I型鞘糖脂抗体或其结合片段的液体制剂上下文中，术语“稳定性”和“稳定的”是指制剂中的抗体或其抗原结合片段在给定的制造、制备、运输和储存条件下对于热和化学解折叠、聚集、降解或片段化的抗性。本发明“稳定的”制剂在给定的制造、制备、运输和储存条件下保留了等于或多于80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.5％的生物学活性。作为设计选择，所述抗体制备物的稳定性可以在选定的储存条件下于预定时间段中通过本领域技术人员已知的方法由与参照对比的聚集、降解或片段化的程度来进行评估，所述方法包括但不限于rCGE、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPSEC。
本发明涵盖了在商业冰箱或者医师办公室中或实验室中可见的冷冻器中所能见到的温度下具有稳定性的液体制剂，例如从约-20℃到约5℃，所述稳定性例如通过高效大小排阻层析(HPSEC)评估，对于储存目的，如大约60天、约120天、约180天、约1年、约2年或更长。本发明的液体制剂也展示了在室温下至少几个小时如在使用前约1小时、约2小时或者约3小时的稳定性，通过例如HSPEC评估。
术语“运载体(carrier)”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体(vehicle)。此种生理学运载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成来源的那些，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物经静脉内施用时，水是适宜的运载体。盐溶液和水右旋糖和甘油溶液也可用作液体运载体，特别用于可注射溶液。适宜的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥脱脂奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物还可含有少量的湿润或乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物可以采取的形式有溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂、储存物(depot)等。所述组合物可用传统的粘合剂和运载体如甘油三酯来配制为栓剂。口服制剂可包括标准运载体如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等、香料、着色剂、香味剂等等。适宜运载体的例子在″Remington′sPharmaceutical Sciences，″Martin中描述。此种组合物将含有有效量地抗体，优选为纯化的形式，与适宜量地运载体一起，从而提供适当施用于患者的形式。如本领域所知，将构建所述制剂以适应施用的模式。
缓冲剂帮助将pH保持在近似生理条件或有益于抗体稳定性的条件的范围内。缓冲液优选以约2mM到约50mM的浓度范围存在。适宜用于本发明的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，如例如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、洒石酸盐缓冲液(例如洒石酸-酒石酸钠混合物、洒石酸-酒石酸钾混合物、洒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸盐缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠盐混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和醋酸盐缓冲液(例如醋酸-醋酸钠混合物、醋酸-氢氧化钠混合物等)。可使用磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、三甲胺盐如Tris、HEPES其它此种已知的缓冲液。
可添加防腐剂以延缓微生物生长，而且能以从约0.2％到约1％(w/v)范围的量来添加。适宜用于本发明的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、benzylconium卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯己双铵、烷基对羟苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
等渗剂的存在是确保本发明的液体组合物的生理学等渗性且包括多元糖醇(polhydric sugar alcohol)，如三元或更高的糖醇，如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。多元醇可以介于约重量的0.1％到约25％之间的量存在，考虑到其它成分的相对量，优选约1％到约5％。
稳定剂是指广泛类型的赋形剂，其功能的范围可以从填充剂到添加剂，其使治疗剂可溶或者帮助防止变性或附着于容器壁。典型的稳定剂可以是多元糖醇；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、阿拉伯糖醇、赤藓醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；疏水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮、糖类、单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖；多糖如右旋糖酐等等。稳定剂可以从约0.1到约10,000w/w每部分活性蛋白的范围内存在。
另外各种赋形剂可包括填充剂(例如琼脂、明胶、淀粉等等)、螯合剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸或维生素E)和共溶剂。
如本文所用，术语“表面活性剂”是指具有两亲性结构的有机物质，即由对抗可溶性倾向的基团(通常是油溶性碳氢链)和水溶性离子基团组成。根据表面活性部分的电荷，可将表面活性剂分类为阴离子、阳离子和非离子表面活性剂。表面活性剂经常作为湿润剂、乳化剂和分散剂用于本文所述生物材料的各种药物组合物和制备物。
可添加非离子表面活性剂或去污剂(也称作“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白防止震荡诱导的聚集，其还使制剂暴露于剪切表面应力(shear surface stress)而不引起蛋白变性。适宜的非离子表面活性剂包括聚山梨酯(20、80等)、polyoxamers(184、188等)、Pluronic
Figure BPA00001328432500511
多元醇和聚乙二醇脱水山梨醇单醚(TWEEN-20
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、TWEEN-80
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等)。非离子表面活性剂可以在约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围存在，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml。
如本文所用，术语“无机盐”是指任何不含碳的化合物，其是用金属或像金属一样作用的基团来置换所有或部分的酸氢或酸而得到的，并且经常在生物材料的药物组合物和制备物中被用作张度调节化合物。最常见的无机盐是NaCl、KCl、NaH2PO4等。
本发明提供抗伸展的I型鞘糖脂结合化合物或其片段的液体制剂，具有的pH范围从约5.0到约7.0、或者约5.5到6.5、或者约5.8到约6.2、或者约6.0。
若对于所治疗的特定适应症而言有必要，本文的制剂还可以含有一种以上的活性化合物，优选具有互补活性不会有害地互相影响的那些。例如，可以期望进一步提供免疫抑制剂。此种分子适宜以对于要达到的目的有效的量而组合存在。制剂还可含有另一种药物、或小分子、药物学药剂、如抗肿瘤药物如顺铂。
术语“小分子”和类似术语包括但不限于肽、假肽、氨基酸、氨基酸类似物、有机化合物、药物学活性剂如药物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、具有小于约10,000克每摩尔的分子量的有机或无机化合物(即包括杂有机(heterorganic)和/或有机金属化合物)、具有小于约5,000克每摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有小于约1,000克每摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有小于约500克每摩尔的分子量的有机或无机化合物以及此种化合物的盐、酯和其它药物可接受形式。
因此，在癌症的情况中，本发明的抗体可以单独施用或者与其它类型的癌症治疗组合施用，包括常规化疗剂(紫杉醇、卡铂、顺铂和阿霉素)、抗-EGFR剂(吉非替尼、埃罗替尼和西妥昔单抗)、抗-血管发生剂(贝伐单抗和舒尼替尼)以及免疫调节剂如干扰素-α和沙立度胺。
如本文所用，术语“治疗剂”是指任何可用于治疗、控制或改善与异常的伸展的I型鞘糖脂表达和通常与代谢以及活性有关的疾病、失调、病症等的物质。在治疗与异常的伸展的I型鞘糖脂表达、代谢以及活性有关的病症等时具有药物作用的已知化合物也包括在内。
任选将抗体或变体与当前用于预防或治疗所研究病症的一或多种物质一起配制。此种其它物质的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型以及上面讨论的其它因素。这些通常以前文所用的相同剂量和施用途径来使用或者迄今为止所用剂量的约1-99％。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可以通过例如经无菌滤膜过滤来实现。例如，本发明的液体制剂可以通过使用0.2μm或0.22μm滤器过滤进行消毒。
另外，可将本发明的抗体缀合至各种效应物分子如异源多肽、药物、放射性核素或毒素，参见例如WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；U.S.Pat.No.5,314,995；和EPO 396,387。可将抗体或其片段缀合至治疗性部分如细胞毒素(例如细胞抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子(例如α发射体，如例如213Bi)。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害的物质。例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶和氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、和顺-二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素、道诺霉素和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素、放线菌素、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))、和抗-有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
为延长抗体在体内的血清循环，可使用各种技术。例如，惰性聚合物分子如高分子量聚乙二醇(PEG)可在具有和不具有多功能性接头的情况下将PEG位点特异性地缀合至抗体的N-端或C-端或者通过赖氨酸残基中存在的ε氨基附着至抗体。可使用导致最小生物学活性损失的线性或者分支聚合物衍生化。可通过SDS-PAGE和质谱紧密监测缀合程度以确保PEG分子适当缀合抗体。可通过大小排阻或通过离子交换层析将未反应的PEG与抗体-PEG缀合物分开。可使用本领域技术人员已知的方法来测试PEG-衍生的抗体的结合活性以及体内有效性，例如通过本文所述的免疫测定进行。
也可通过将一或多个氨基酸修饰(即取代、插入或缺失)引入到IgG恒定结构域或其FcR结合片段(如Fc或铰链Fc结构域片段)中从而产生在体内具有增加的半衰期的抗体，参见例如WO 98/23289；WO 97/34631和美国专利号6,277,375。
此外，可将抗体缀合至白蛋白以使抗体在体内更稳定或者在体内具有更长的半衰期。所述技术是本领域已知的，参见例如WO 93/15199，WO93/15200和WO 01/77137；和EPO 413622。抗体也可以被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/阻断基团衍生化、蛋白酶解裂解、连接细胞配体或其它蛋白等等。
将此种治疗性部分缀合至抗体的技术是众所周知的，参见例如Arnon etal.，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，Alan R.Liss(1985)；Hellstrom et al.，in Controlled Drug Delivery，2nd ed.，Robinson etal.，eds.，Marcel Dekker(1987)；Thorpe，in Monoclonal Antibodies ′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.，eds.(1985)；MonoclonalAntibodies For Cancer Detection and Therapy，Baldwin et al.，eds.，AcademicPress(1985)；和Thorpe et al.，Immunol Rev 62：119(1982)。或者，可将抗体缀合至第二抗体以形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)，比如双功能抗体，参见例如美国专利号4,676,980。
本发明的缀合物可用于修饰给定的生物学应答，治疗剂或药物部分不应被理解为限于常见的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所期望的生物学活性的蛋白或多肽。此种蛋白可包括例如毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂例如TNF-α、TNF-β、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO97/34911)、Fas配体(Takahashi et al.，Int Immunol，6：1567(1994))、VEGF(WO99/23105)；血栓形成剂；抗血管生成剂，例如制管张素或内皮抑制素；或生物应答修饰剂，如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)或其它生长因子。
抗体或不同组合物将以遵从良好医疗实践的方式进行配制、给药和施用。在此背景下要考虑的因素包括所治疗的特定失调、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、所述失调的病因、药剂输送的位点、施用方法、施用的时间表、以及医疗从业者已知的其它因素。要施用的抗体或变体的“治疗有效量”将由这些考虑因素来控制，并且可以是预防、改善或治疗伸展的I型鞘糖脂疾病、病症或失调所需的最小量。
如本文所用，术语“有效量”是指治疗(例如预防性或治疗性物质)的量，其足以降低与伸展的I型鞘糖脂涉及或相关疾病的严重程度和/或持续时间、改善其一或多种症状、防止伸展的I型鞘糖脂涉及或相关疾病的进展或引起伸展的I型鞘糖脂涉及或相关疾病的退化或者其足以防止伸展的I型鞘糖脂涉及或相关疾病或其一或多种症状的发展、复发、发作、或进展或者增强或改善另一种用于治疗伸展的I型鞘糖脂涉及或相关疾病的治疗(例如另一种治疗剂)的预防性和/或治疗性作用。例如，基于基准或正常水平，感兴趣的治疗可使症状减轻至少约5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一个实施方案中，有效量的治疗性或预防性物质使伸展的I型鞘糖脂涉及或相关疾病如癌症的症状减轻至少约5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。也用于本文作为等价含义的术语是“治疗有效量”。
在特定失调或病症的应用或治疗中将是有效的治疗性多肽、抗体或其片段的量将取决于所述失调或病症的性质并且可以通过标准临床技术确定。在可能时，可首先在体外获得本发明的剂量应答曲线和药物组合物。如果有适宜的动物模型系统，则又可以获得剂量应答曲线并用于推断出本领域已知的适宜的人剂量实施方法。然而，基于本领域常识，有效促进炎症效应减少的药物组合物例如可以提供局部治疗剂浓度为介于约5至约20ng/ml之间，优选介于约10至约20ng/ml之间。
在优选的实施方案中，可通过皮下注射来施用治疗性多肽、抗体或其片段的水溶液。每个剂量可以在每公斤体重约0.5mg至约50mg的范围内，或者更优选在每公斤体重约3mg至约30mg。对于特定疾病、患者群、施用方式等，所述剂量可以凭经验确定，实行本领域已知的制药方法。
对于皮下施用的给药时间表可从每星期一次到每天一次到每天多次之间变化，这取决于数个临床因素，包括疾病类型、疾病严重程度以及对象对于治疗剂的敏感性。
在一个实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。在必要时，所述组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因或其它的″卡因(caine)″麻醉剂以缓解注射位点的疼痛。通常，将所述成分分开供应或者混合在一起以单位剂量形式供应，例如作为干燥的冻干粉末或者密封容器中的浓缩物如标明活性剂数量的安瓿或袋。当所述组合物通过输注来施用时，其可以用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶来分散。当通过注射施用所述组合物时，可在例如试剂盒中提供一安瓿用于注射的无菌水或者盐水，以便可以在施用前将所述成分混合。
本发明也提供了本发明的液体制剂包装在密封容器中如标明感兴趣产品的量的安瓿或袋。本发明的液体制剂可以在标明了抗体或抗体片段的量和浓度的密封容器中。例如本发明的液体制剂可以在密封容器中供应，其具有至少约15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml、或300mg/ml的伸展的I型鞘糖脂抗体，其量是约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml。
提供了含有可用于治疗上述失调的材料的制品。所述制品包含容器和标记。适宜的容器包括例如瓶、小管、注射器和试管。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳可有效用于诊断、预防或治疗伸展的I型鞘糖脂病症或疾病的组合物并可具有无菌出口(例如所述容器可以是静脉注射液袋或者具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的小管)。在所述容器上或者与其相关的标记标明所述组合物用于治疗所选的病症。所述制品可进一步包含第二个容器，其包含药物可接受的缓冲液如磷酸缓冲盐水、Ringer′s溶液和右旋糖溶液。其可进一步包括在商业和用户的立场上所期望的其它材料，包括缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器以及包装插入物及使用说明书。
在本发明的另一方面，施用包含编码抗体或其功能性衍生物的序列的核酸以通过基因治疗来治疗、抑制或预防与异常的伸展的I型鞘糖脂的表达和/或活性相关的疾病或失调。基因治疗是指通过给对象施用已表达的或可表达的感兴趣的核酸来进行的治疗。或者，将被操纵为携有感兴趣基因序列的细胞施用给宿主。在本发明的实施方案中，核酸在靶宿主细胞中或由靶宿主细胞生产所编码的介导治疗作用的蛋白。任何可用的基因治疗方法均可根据本发明来使用。
对于基因治疗方法的一般综述参见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy12：488(1993)；Wu et al.，Biotherapy 3：87(1991)；Tolstoshev，Ann RevPharmacol Toxicol 32：573(1993)；Mulligan，Science 260：926(1993)；Morganet al.，Ann Rev Biochem 62：191(1993)；和May，TIBTECH 11：155(1993)。
在一方面，所述化合物包含编码抗体、或其功能性结合片段的核酸序列，所述核酸序列是表达载体的一部分，所述表达载体在适当的宿主中表达所述抗体或片段或嵌合蛋白或重链或轻链。特别地，此种核酸序列具有可操纵地连接至抗体或抗原结合编码区的启动子，所述启动子是可诱导的或者是组成型的，且任选是组织特异性的，以及具有其它调节序列。
在另一个特定的实施方案中，使用了核酸分子，其中抗体编码序列和任何其它期望的序列两旁具有促进在基因组中期望位点的同源重组的区域，由此提供了所述抗体编码核酸的整合和染色体内表达(Koller et al.，ProcNatl Acad Sci USA 86：8932(1989)；Zijlstra et al.，Nature 342：435(1989))。在特异的实施方案中，所表达的抗体分子是单链抗体；或者，所述核酸序列包括编码所述抗体的重链和轻链二者或其片段的序列。替代的整合方法包括使用识别特异核酸序列、锌指结构等的特定转录因子。
核酸向患者的输送可以是直接的，在此情况下所述患者直接暴露于所述核酸或携有核酸的载体，或者所述输送也可以是间接的，在此情况下首先在体外用所述核酸转化细胞，继而将细胞移植入患者。
在一个实施方案中，所述核酸序列被直接在体内施用并且被表达以产生所编码的产物。这可通过任何本领域已知的任何方法完成，例如通过将所述抗体编码序列构建为适当核酸表达载体的一部分并施用其，从而所述载体变成在细胞内，例如通过使用缺陷或减毒的逆转录病毒或其它病毒载体感染(参见美国专利号4,980,286)、通过直接注射裸DNA、通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic、Dupont)、使用非病毒载体如含有两亲性化合物的合成组合物，所述两亲性化合物结合亲水核酸并具有与细胞融合的能力，因而通常含有用于与膜组合的疏水部分，用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，包囊入脂质体、微粒、或微胶囊内，通过将所述载体与已知进入细胞核的肽连接而施用，通过将所述载体与经受受体介导的胞吞作用的配体连接而施用(参见例如Wu et al.，J Biol Chem 262：4429(1987))(其可用于特异表达该受体的靶细胞类型)等等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中配体包含融合病毒肽以破坏内体，使得核酸避免被溶酶体降解。在又一个实施方案中，可通过靶向特异受体而将核酸在体内靶向于细胞特异性摄取和表达(参见例如WO 92/06180；WO 92/22635；WO92/20316；WO93/14188和WO 93/20221)。
关于载体，例如可如本领域所知的那样使用慢病毒载体。慢病毒载体含有用于包装病毒基因组并整合入宿主细胞DNA的组件。将编码用于基因治疗的抗体的核酸序列克隆到一或多个载体内，其
本发明中也可以使用腺病毒。基于腺病毒的输送系统的靶包括例如肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒感染非分裂细胞，是相对于早期逆转录病毒载体的优势。Kozarsky et al.，Curr Opin Gen Dev 3：499(1993)提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout et al.，Human Gene Therapy 5：3(1994)证明了使用腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮细胞。在基因治疗中使用腺病毒的其它例子可见于Rosenfeld et al.，Science 252：431(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68：143(1992)；Mastrangeli et al.，J Clin Invest91：225(1993)；WO94/12649；和Wang et al.，Gene Therapy 2：775(1995)。
腺伴随病毒(AAV)也可用于基因治疗(Walsh et al.，Proc Soc Exp BiolMed 204：289(1993)；和美国专利号5,436,146；6,632,670；和6,642,051)。
基因治疗的另一方法涉及将基因通过方法如电穿孔、脂染、磷酸钙介导的转染或病毒转染转移到组织培养中的细胞内。通常，转移方法包括将可选择标记转移到细胞内。继而将细胞置于选择之下以分离那些已经摄取并表达所述转移的基因的细胞。继而将那些细胞输送给患者。
因此，可将所述核酸引入到细胞内之后再将所得的重组细胞体内施用。此种引入可以通过任何本领域已知的方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等等。本领域已知许多种方法用于将外源基因引入细胞内(参见例如Loeffler et al.，Meth Enzymol 217：599(1993)；Cohen et al.，Meth Enzymol 217：618(1993)；和Cline，Pharm Ther 29：69(1985))并且其可根据本发明而使用，前提是受体细胞的必要发育和生理功能没有受到破坏。所述技术应该提供所述核酸到细胞的稳定转移，从而所述核酸被所述细胞表达，由所述细胞后代继承并表达。
可通过各种本领域已知的方法将所得的重组细胞输送给患者。重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选经静脉内施用，例如骨髓移植领域内已知的那样。设想使用的细胞的量取决于所期望的效果、患者状态等，并可由本领域技术人员确定。
可以将核酸引入其中用于基因治疗目的的细胞涵盖了任何期望的、可用的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞、血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞和粒细胞、各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等所获得。
在一个实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。将编码本发明抗体的核酸序列引入细胞内从而使转基因由所述细胞或其后代表达，继而为了治疗作用而将所述重组细胞在体内施用。在特异的实施方案中，使用干细胞或祖细胞。能够被分离且在体外维持的任何干细胞和/或祖细胞可潜在地用于本发明的实施方案(参见例如WO 94/08598；Stemple et al.，Cell71：973(1992)；Rheinwald Meth Cell Bio 21A：229(1980)；和Pittelkow et al.，Mayo Clinic Proc 61：771(1986))。因为伸展的I型鞘糖脂在例如B细胞上表达，所以血细胞和骨髓细胞是适宜的宿主细胞。然而，本发明的范围在关于干细胞宿主的使用方面并不涉及制备和使用转基因以通过将感兴趣的转基因施用于胚胎和/或胚胎干细胞以制备转基因生物体。
因此本发明提供治疗、预防和改善伸展的I型鞘糖脂涉及和相关疾病或其一或多种症状的方法，通过给对象施用有效量的例如本发明的液体制剂、抗体或其变体进行。所述对象优选是哺乳动物，如非灵长类(例如奶牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如猴如食蟹猴和人)。在优选的实施方案中，所述对象是人。
伸展的I型鞘糖脂也在某些癌症细胞如胰腺、结肠和膀胱以及在T细胞白血病上表达(Qinping et al.，Oncogene 24：573-584，2005)且伸展的I型鞘糖脂的刺激与癌细胞的增殖相关，Meijer et al.，Cane Res 66：9576-9582，2006。
因此，感兴趣的抗体或其衍生物可用于控制表达伸展的I型鞘糖脂的癌细胞的增殖，其中癌症是经本文教导的诊断测定通过确定伸展的I型鞘糖脂表达的存在而鉴定的。感兴趣的抗体可以降低恶性细胞的浸润、降低对凋亡的抗性并使增殖最小化。继而对此种患者施用了癌细胞增殖抑制量的本文提供的感兴趣的抗体或其衍生物。如本文所教导，抗体或其抗原结合部分可以多种方式施用给患者，包括施用多肽、多核苷酸等等。本质上任何表达感兴趣的I型表位的癌症均可用感兴趣的抗体检测和/或治疗。例如，恶性细胞可以是上皮细胞。上皮细胞可以在任何器官或组织来源的任何恶性细胞中发现，如结肠、直肠、食管、肺、前列腺、乳房、胰腺、口腔、阴道、一般而言的胃肠道、尿道等等。然而，只要所述恶性细胞表达感兴趣的I型表位，则所述癌症并不必限于上皮细胞。
本发明将通过下面的描述了一些实施方案并且实施了本发明的非限制性实施例来例证本发明的益处。
实施例
实施例1：免疫原的产生
Colo205细胞(ATCC)(Semple et al.，Cancer Res 38：1345-1355，1978)在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中生长。将收集的细胞用PBS洗涤两次并储存于-20℃待用。用异丙醇-正己烷-水(IHW)(55∶25∶20)来提取细胞沉淀，随后Folch分配、DEAE Sephadex层析和Iatrobead 6RS-8010柱上进行HPLC。在IHW中从55∶40∶5到55∶25∶20对上层相中性级分进行200分钟的梯度洗脱。根据HPTLC迁移在氯仿-甲醇-水中(50∶40∶10)收集和混合级分。伸展的I型链鞘糖脂通过制备TLC在Merck HPTLC平板(Silica Gel 60，Merck，Darmstadt，Germany)上进一步纯化，参见美国专利号6,083,929。
如本文教导的那样纯化迁移至紧随二聚Lea抗原下方的阳性条带(通过用mAb IMH2的免疫染色)。
将结肠直肠腺癌细胞Colo205(ATCC CCL-222)和DLD-1(ATCCCCL-221)在补加了1mM丙酮酸钠(Invitrogen Co.，Cat.No.11360)的RPMI1640培养基(Invitrogen Co.，Cat.No.31800)中培养。将其它结肠直肠腺癌细胞SW1116(ATCC CCL-233)和HT-29(ATCC HTB-38)以及肺来源的T84细胞(ATCC，CCL-248)分别维持在Leibovitz′s L-15培养基(Invitrogen Co.，Cat.No.41300)、McCoy′s 5a培养基(Invitrogen Co.，Cat.No.12330)和DMEM/F12培养基(Invitrogen Co.，Cat.No.12400)中。将KATO III胃癌细胞(ATCCHTB-103)在IMDM培养基(Invitrogen Co.，Cat.No.12200)中培养。本研究中使用的所有培养基均补加了10％胎牛血清。
实施例2：抗伸展的I型鞘糖脂mAb的产生
通过杂交育种双转染色体小鼠和转基因小鼠产生KM小鼠(KirinBrewery Co.，Ltd.)。KM小鼠具有人染色体片段，所述片段含有完整人免疫球蛋白重链基因座和一半的人免疫球蛋白κ轻链基因座的YAC转基因。KM小鼠被工程化以使其既不表达内源免疫球蛋白重链也不表达κ轻链。所有动物均根据本领域所接受的条例和规则进行维持和操作。
每3星期将Colo205细胞经腹膜内注射到KM小鼠中(5×106细胞/注射)，总共注射4次，随后每星期注射从Colo205细胞分离并吸附在脂多糖(Sigma，L-7011)上的伸展的I型链鞘糖脂(Young et al.，J.Exp.Med.150：1008-1019，1979)，共注射8次。通过ELISA用抗人κ-HRP(SouthernBiotechnology Associates，Cat.No.9220-05)作为二抗来监测免疫小鼠的抗Colo205中性鞘糖脂效价直至效价达到1∶6000。最终注射的3天后，将来自被加强小鼠的脾细胞与P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1)小鼠骨髓瘤细胞(ATCCTIB-18)融合，实施方法是本领域已知的。通过ELISA用包被了Colo205中性糖脂的96-孔ELISA平板(Corstar，Cat.No.2592)筛选杂交瘤。与HRP缀合的小鼠抗人IgG抗体用作二抗(Southern Biotechnology Associates，Cat.No.9040-05)，四甲基联苯胺(TMB)(Kem-Zn-Tec Diagnostics，Cat.No.4390)用作底物。显示与Colo205中性糖脂具高反应性的杂交瘤上清通过HPTLC免疫染色和通过流式细胞术进一步确认。对伸展的I型链糖脂强烈染色并在Colo205细胞表面显示高度结合的克隆通过有限稀释被重复亚克隆直至建立起稳定的克隆。一种稳定的克隆是GNX-8。
实施例3：GNX-8抗体
使用蛋白A Sepharose(GE Healthcare 17-129-79-02)以根据厂商建议过程用pH梯度洗脱将单克隆抗体从培养物上清中纯化。收集每一级分并用ELISA检测抗体的存在。将具有Colo205中性糖脂结合活性的级分汇集起来并针对PBS(pH 7.4)进行透析。将纯化的抗体等分并储存于-20℃。
由Bio-Rad Protein Assay试剂盒(Bio-Rad，Cat.No.500-0006)使用IgG作为标准根据厂商推荐过程来确定单克隆抗体的浓度。
用ELISA来确定GNX-8的同种型。GNX-8是人IgG1且轻链是κ。
将纯化的GNX-8在2×SDS凝胶上样缓冲液中具有(还原条件)和不具有(非还原条件)β-巯基乙醇的情况下煮沸后上样于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。使用Minutesi-PROTEAN3电泳系统(BIO-RAD)根据厂商推荐进行电泳。
将在还原性SDS-PAGE凝胶上分离的GNX-8转移至硝化纤维素(NC)膜(Amersham)并用3％PBS中的脱脂牛奶进行封闭。将膜与二抗一起在室温温育1小时。以1∶5000稀释的HRP-标记的山羊抗-人IgG(γ)抗体(Zymed，62-8420)和以1∶2000稀释的HRP-标记的兔抗-人κ链IgG抗体(DAKO，P0129)分别用于检测GNX-8的重链和轻链。使用Western LightningTMChemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Sciences，Cat.No.NEL105)在BioMax Light Film(KODAK，Cat.No.1788207)上显示信号。
在还原条件下，GNX-8轻链和重链的分子量如对IgG的预期一样。通过分别用山羊抗-人IgG(γ)-HRP和兔抗-人κ链-HRP作为二抗进行的蛋白印迹，GNX-8是人单克降抗体。通过ELISA分型GNX-8是人抗体。
GNX-8的pI分析通过PhastSystem(Pharmacia)确定。简短来说，将抗体样品和pI标准物用PhastGel点样器8/1梳(comb)上样至IEF PhastGel 3-9并根据厂商方案进行分离。随后在PhastSystem Development Unit(Pharmacia)中根据厂商方案对凝胶进行银染。
pI分析显示出从pH 8.15到8.65范围内的多个条带表明了抗体翻译后修饰的可能性。高pI表明GNX-8在生理pH将是可溶的。
为了检测细胞结合活性，用PBS洗涤2×105细胞并将其与各种浓度的抗体在室温温育30分钟。PBS洗涤后，将1∶3000稀释的FITC-标记的山羊抗-人IgG(Fc)抗体(ICN，Cat no.55198)添加至每个细胞样品，于室温另外再持续30分钟。对于CDC研究，将抗体处理后的细胞用PBS洗涤3次并与1μl的碘化丙啶溶液(Sigma-Aldrich，P4846)温育30分钟。在最终PBS洗涤后，在流式细胞仪(BD，FACSort)上分析细胞。结果用CELLQuest 3.3(BD)处理。
实施例4：细胞毒性测定
将人结肠癌细胞系SW1116、Colo205和DLD-1在48-孔平板(CorningCostar)中以2×104细胞/孔的密度接种。过夜培养后，将细胞在具有25％未失活人血清的500μl培养基中于各种抗体浓度温育2hr。在PBS洗涤后，通过碘化丙啶(PI)溶液(Sigma-Aldrich，P4846)染色定量余下的活细胞并通过流式细胞术分析。从正常人血清纯化的正常人IgG用作阴性对照。
在替代的测定中，通过与大约100μl的51Cr在约37℃温育约90min来标记靶细胞。洗涤(3x)和温育(于37℃约1hr)后，将细胞(约1×106ml)悬浮于补加了约25mM HEPES缓冲液和约3％牛血清白蛋白的RPMI-1640中。将大约20μl标记细胞、大约100μl的mAb和25％热失活的人血清在微量滴定U形底平板(Corning，N.Y.)的孔中混合。非特异性小鼠Ig(Sigma，St.Louis，MO)可用作阴性对照。大约4hr温育后，在装配有悬挂平板托架的离心机中将平板离心(500×g，2min)，每孔中约100μl上清中的放射性用γ计数器测量。每个实验组可被测试三次。百分比特异性裂解可以根据下式计算([A-B]×100)/C，其中A＝裂解的实验细胞中的cpm；B＝末裂解的靶细胞中的cpm；以及C＝总靶细胞中的cpm)。自发释放优选不应超过15％的最大可释放标记放射性。
通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定(Promega，CytoTox 96
Figure BPA00001328432500621
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)进行ADCC测定，使用从健康的供体用Ficoll-Paque(GE，71-7167-00)制备的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞。所述测定定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)，其是在细胞裂解时释放的稳定的细胞质酶。用30分钟偶联酶测定(coupled enzymatic assay)测量培养物上清中释放的LDH，所述偶联酶测定导致四唑盐(INT)转化成红色甲产物。形成的颜色的量与裂解的细胞的数目成比例。
将用作靶细胞的Colo205细胞分配至96-孔U形底平板中(2×104细胞/孔)并在各种E/T比率的PBMC的存在下用抗体在37℃温育4小时。上清中LDH活性用CytoTox 96
Figure BPA00001328432500632
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay测量。百分比特异性细胞裂解根据下式计算：％特异性裂解＝100×(E-SE-ST)/(M-ST)其中E是实验释放(来自与抗体和效应细胞温育的靶细胞的上清中的活性)，SE是在效应细胞存在下的自发释放(来自效应细胞单独与培养基的上清中的活性)，ST是靶细胞的自发释放(来自靶细胞单独与培养基温育的上清中的活性)以及M是靶细胞的最大释放(从使用9％Triton X-100裂解的靶细胞释放的活性)。
GNX-8的体外抗肿瘤活性用CDC测定评估。在25％人血清存在下用GNX-8处理人结肠直肠癌细胞SW1116、Colo205和DLD-1导致了剂量依赖方式的实质性细胞裂解。结果表明GNX-8通过补体依赖性细胞裂解杀死靶细胞。
在一些实验中SW1116和Colo205细胞上的CDC效应强于DLD-1上的。细胞的生存力与GNX-8抗原的表达水平成反比例。在所述三种结肠直肠癌细胞系上的GNX-8的CDC效应和GNX-8抗原表达水平证明具有较高GNX-8抗原表达的癌细胞对于细胞毒性更敏感，而具有较低GNX-8抗原表达的那些具有较高的存活力。结果导致了这样的结论，即GNX-8的抗肿瘤活性可依赖于GNX-8抗原的表达水平。在肿瘤细胞上具有高GNX-8抗原表达的患者可以单独用GNX-8治疗，而表达低水平GNX-8抗原的肿瘤可以受益于除了GNX-8抗体之外的一或多种其它癌症药物的组合治疗。
在GNX-8存在下针对人结肠直肠癌Colo205评估人外周血单个核细胞(PBMC)的ADCC活性。具有IMH2的ADCC活性用作阳性对照而人IgG用作阴性对照。
GNX-8针对Colo205细胞诱导强烈的ADCC活性。细胞毒性作用与E/T比率和GNX-8浓度均正相关。在约20/1的E/T观察到百分之一百的细胞裂解。在约5μg/ml的GNX-8和约50μg/ml的IMH2分别观察到最大的ADCC效应以及对于约50％的裂解所观察到的趋势。对照人IgG显示出无细胞毒性作用，无论E/T比率或IgG浓度是怎样的。达到50％裂解的GNX-8的剂量少于IMH2所需的1/10。
实施例5：BIACORE亲和性分析
将I型鞘糖脂附着至芯片。继而根据厂商推荐将mAb暴露于芯片以进行动力学测量以及围绕抗体-抗原结合反应的表位序列分析(GE Healthcare，Pistcataway，NJ)。
实施例6：体内测定
在Colo205异种移植模型中评估GNX-8的抗肿瘤活性。将Colo205细胞用PBS洗涤两次并以5×106/100μl的细胞密度在PBS中重建。将6-8周龄的雌性裸小鼠用100μl的Colo205细胞悬液在侧腹区s.c.接种。每周用游标卡尺对肿瘤大小测量三次并将肿瘤重量(mg)评估为(宽度2×长度)/2。根据设计的剂量和时间表将GNX-8或正常人IgG经i.p.注射入携有肿瘤的裸小鼠中。
为评估GNX-8的体内抗肿瘤效力，将癌细胞(5×106细胞/小鼠)注射入裸小鼠内并在肿瘤接种24小时后用GNX-8(处理组，8只小鼠/组)或正常人IgG(对照组，7只小鼠/组)处理。两组注射以24小时时间间隔的5次给药(300μg/小鼠)和随后的以48小时时间间隔的4次给药(600μg/小鼠)。
在GNX-8处理的小鼠中肿瘤生长被显著抑制。在第11天治疗组达到大约23％的中位肿瘤重量T/C(处理/对照)并在该近似水平持续至研究结束。在证明抗肿瘤活性方面＜42％的T/C测量值被认为是显著的。
GNX-8处理组中一半(4/8)的小鼠达到了超过50天的长期无肿瘤存活。另一方面，对照组动物的肿瘤大小在研究期间持续增加。
在Colo205异种移植裸小鼠模型中进行了类似研究。GNX-8的第一次给药在80至100mg的肿瘤大小下进行。GNX-8(处理组)和正常人IgG(对照组)每天注射一次(300μg/小鼠)，持续5天，并在第17和21天有两次相似给药。
在处理组中也观察到了显著的肿瘤抑制，尽管所述处理在仅仅5次给药后被中止。在第10天后中位肿瘤重量T/C(处理/对照)低于42％并持续至研究结束。
为确定宿主效应物功能是否对GNX-8效力有贡献，携有Colo205异种移植物的SCID小鼠用GNX-8或正常人IgG以600μg/小鼠每周处理两次，共三周。每周测量两次肿瘤大小直至肿瘤大小达到体重的10％，这被认为是研究的终点。
在处理组中生存性被延长。
为探索GNX-8表位在人结肠直肠癌上的出现，分析了若干人结肠直肠癌细胞系。
例如，GNX-8对DLD-1的体内抑制是显著的。
实施例7：GNX-8抗原
对于细胞糖蛋白的分析，将培养的细胞从T-75烧瓶中刮下并用PBS洗涤两次，随后用裂解缓冲液洗涤(50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS和1mM PMSF)。将裂解物通过26号针头若干次以分散任何大的聚集物。用Protein Assay试剂盒(Bio-Rad)确定蛋白浓度。将含有相同量蛋白的裂解物在凝胶上分离并用GNX-8作为一抗以及HRP标记的小鼠抗人IgG(Fc)(Southern Biotechnology Associates，#9040-05)作为二抗通过蛋白印迹分析。使用Western LightningTMChemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Sciences，Cat.No.NEL105)在BioMax Light Film(KODAK，Cat.No.1788207)上显示信号。
将中性糖脂(2μl/样品)点样至HPTLC平板上(Merck，1.05642，硅胶60F254)并用含比率为50∶40∶10(V∶V∶V)的氯仿∶甲醇∶水的移动相显色。对于糖脂的聚糖染色，将10％H2SO4中0.2％的苔黑酚(Sigma，O-1875)喷到HPTLC平板上并在烤箱内于110℃温育10分钟。对于免疫染色，首先将HPTLC平板用0.5％聚(甲基丙烯酸异丁酯)(Aldrich，181544)在氯仿∶己烷1∶9(V∶V)中固定45秒，随后在3％BSA/PBS中封闭10分钟。继而将平板用PBS洗涤并与一抗在室温温育1hr，随后与生物素化的二抗于室温1hr。使用Avidin-Biotin Complex试剂盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)扩增来自二抗的信号。将平板在室温温育30分钟，随后根据厂商方案用Immunostaining HRP-1000试剂盒(Konica Minolta，130990)进行显色。
向冻干的样品中添加20μl的48％氟化氢(HF)(Merck)，并继而将混合物在4℃温育48h。在反应结束时，用N2气去除HF。去岩藻糖基化的糖脂用于GNX-8的特异性研究。
Colo205的中性糖脂用HF处理并通过MALDI-TOF MS分析以确认岩藻糖的去除。进行TLC免疫染色以分析在HF处理前和处理后GNX-8对Colo205中性糖脂的特异性。
GNX-8识别未被裂解的糖脂而不是去岩藻糖基化的形式，表明GNX-8的表位是碳水化合物部分且岩藻糖是该结构的必要组分。
通过对分离自Colo205细胞的中性和单唾液酸糖脂的HPTLC免疫染色进一步鉴别GNX-8的特异性。收集了100克的Colo205细胞，并提取了糖脂级分。用苔黑素/H2SO4对经TLC分离的Colo205糖脂进行碳水化合物染色。根据前述的Stroud et al.(1992)鉴定出Lea，Leb，Lea-Lea和Leb-Lea的位置。唾液酸Lea(SLea)通过用mAb NKH3染色来指明(美国专利号5,240,833)，随后用MALDI-MS鉴定。用CF4C4(美国专利号5,011,920)(抗-Lea)、T218(Abeam，Cambridge，MA)(抗-Leb)、IMH2(前述Stroud et al.，1992)(抗Leb-Lea)和GNX-8抗体对相同糖脂级分进行HPTLC免疫染色。
结果表明GNX-8与伸展的I型链糖脂强烈反应。GNX-8未结合Lea伸展的I型链。Colo205细胞的单唾液酸糖脂未被GNX-8识别。GNX-8与较高浓度(0.6μg/ml)的Leb显示非常轻微的交叉反应性。不同于IMH2，GNX-8未结合Lex或Ley。GNX-8结合含有Leb的伸展链。GNX-8结合Leb-Lea。
除TLC免疫染色之外，通过使用合成聚糖Leb、Lea-Lex、Leb-Lex和Lex-Lex作为抑制剂以及Leb-Lea/Lea-Lea糖脂混合物作为阳性对照的竞争性ELISA来鉴别GNX-8的表位。
结果表明GNX-8与高抑制剂浓度的Leb-Lex轻微地交叉反应，但是与其它测试的合成聚糖包括合成Leb聚糖没有反应性。GNX-8对伸展的Leb的结合活性比对简单的Leb的高1000倍。
基于该结果，GNX-8的表位可能是在具有岩藻糖基化的伸展的I型链上的Leb结构，但却不是简单的Leb。
实施例8：细胞和组织分布
从例如US Biomax获得了福尔马林固定和石蜡包埋的人正常和癌组织标本。
将所述正常和恶性人组织福尔马林固定、石蜡包埋的组织阵列用PBS中的0.1％脱脂牛奶封闭30分钟。在另外10分钟与3％H2O2温育后，将该组织阵列用PBS洗涤三次后将样品与0.1％BSA/PBS-稀释的生物素化的GNX-8温育1小时。继而使该组织样品与生物素-链霉抗生素蛋白-过氧化物酶复合物(ABC试剂盒，Vector，#PK-6100)反应30分钟用于信号放大。使用DAB PLUS Substrate试剂盒(Zymed#00-2020)根据厂商方案使免疫反应染色显像。用苏木精进行对比染色。通过光学显微镜显像来确定结果。
通过流式细胞术评估GNX-8抗原在人癌细胞上的表达。通过流式细胞术分别检验了数个人结肠直肠和胃肿瘤细胞系如Colo205、HT-29、DLD-1、SW1116、T84和KATO III的GNX-8抗原的表达。
流式细胞术分析证明GNX-8展示了对所有测试的癌细胞系的结合活性。而对SW1116、Colo205和DLD-1细胞的结合显著强于其它测试的人癌细胞系。
另外，在HL60(早幼粒细胞细胞系)、MCF-7(乳腺癌细胞系)和PANC-1(胰腺癌细胞系)上以及在小鼠结肠癌细胞系CT26上测试了GNX-8抗原表达。GNX-8不结合这四个细胞系。
用蛋白印迹分析两种结肠直肠癌细胞系Colo205和SW1116。这两种细胞系在流式细胞术分析中证明了与GNX-8强结合。
结果显示在Colo205和SW1116的糖蛋白上存在分子量从32到＞175kDa范围的GNX-8抗原。因此，GNX-8抗原不仅在糖脂中也在糖蛋白中。
将来自各种器官包括正常组织和癌组织的多种标本分别用GNX-8染色。用染色强度和阳性细胞频率来评估组织标本中的染色模式。以1+(10-20％)、2+(20-50％)或3+(＞50％)的尺度对染色进行评级，而基于每区段中阳性细胞的百分比来对频率进行分类。
在原发和转移结肠直肠癌中观察到GNX-8抗原表达之间的强相关。对来自结肠直肠癌患者的一组组织区段进行免疫组织化学染色。
GNX-8抗原不仅在结肠直肠癌组织上表达也在相邻组织上表达。例如，临近癌症区的息肉被GNX-8染色。然而，在远端正常组织上末观察到染色。因此，可以得到结论，GNX-8在可识别的细胞形态改变发生前鉴定出转化的细胞或正在进行转化的细胞。
还在各种级别的癌症上研究了GNX-8抗原表达。
GNX-8抗原在每个癌症阶段中表达。
GNX-8不结合正常的结肠、直肠、胃、小肠、肝、食管、肺、前列腺或乳房。
百分之五十八(44/76)的结肠癌样品被GNX-8染色；47％的直肠癌样品；57％的转移结肠癌样品；53％的胃癌样品；29％的食管癌样品；22％的肺癌样品；4％的前列腺癌样品；17％的乳腺癌样品；和67％的胰腺样品被GNX-8染色。GNX-8不结合小肠、肝和肾癌样品。
表1GNX-8对人正常组织的特异性
Figure BPA00001328432500681
*在复层鳞状上皮的角质化上染色
§在管导系统/输乳管的上皮细胞上染色
#在管导系统的上皮细胞上染色
表2GNX-8对人癌组织的特异性
  人癌组织   发生率(阳性数目/测试数目)   染色强度和位置
  结肠   44/76   3+(5)、2+(12)、1+(27)
  直肠   50/107   3+(13)、2+(20)、1+(17)
  小肠   0/10
  肝   0/12
  肾   0/3
  结肠(转移)   27/47   2+(9)、1+(18)
  食管   4/14   2+(1)、1+(3)
  肺   10/45   3+(1)、2+(5)、1+(4)
  前列腺   2/45   2+(2)
  乳房   7/45   3+(1)、2+(4)、1+(2)
  胰腺   8/12   2+(3)、1+(5)
实施例9：GNX-8的克隆和测序
将产GNX-8杂交瘤细胞常规在含有10％低IgG胎牛血清(HyClone)的IMDM(Invitrogen)中培养。为制备RNA用于cDNA合成，首先通过低速离心(1000rpm，5min)收获1×106杂交瘤细胞。继而根据厂商方案用TRIZOL试剂(Invitrogen)从细胞沉淀分离总RNA。用SMART RACE cDNAAmplification试剂盒(BD Biosciences-Clontech)从纯化的RNA样品合成第一链cDNA。简短来说，将1μg总RNA与1μl 5′-CDS和1μl SMART II A寡核苷酸引物在70℃温育2分钟。加入2μl 5×第一链缓冲液后，将1μl 20mMDTT、1μl 10mM dNTP和1μl的PowerScript RT加入到RNA/引物混合物中。将样品在42℃进一步温育1.5小时。通过加入100μl Tricine缓冲液并在72℃温育7分钟终止第一链cDNA合成反应。
通过使用UPM(BD SMART RACE cDNA Amplication试剂盒)和重链CH1 3′末端的引物SEQ ID NO：3的PCR扩增编码GNX-8重链片段的cDNA。PCR反应在94℃进行30秒，随后58℃30秒、72℃3分钟，并将此循环重复26次。
在存在NUP(SMART RACE扩增试剂盒)和重链CH1中间的引物SEQID NO：4的情况下，将重链cDNA的可变区从1μl上述反应产物中再扩增。PCR反应在94℃进行15秒、68℃30秒并将此循环重复25次。使用PCR纯化试剂盒(GeneMark)来纯化扩增产物并使用重链CH1 5′末端的引物SEQID NO：5来确定核苷酸序列。
基于序列信息，使用BD AdvantageTM 2 PCR Enzyme System(BDBiosciences)用新合成的引物SEQ ID NO：6以及对于重链基因的末端SEQID NO：7通过PCR从先前制备的第一链cDNA特异性扩增全长重链cDNA。PCR反应设置为94℃40秒、60℃30秒和72℃100秒，并将该循环重复35次。
首先将扩增的全长重链cDNA用EcoRI和XbaI双消化。在凝胶纯化后，将回收的重链cDNA在相同位点连接到pCIneo载体(Promega)中以获得表达载体pCI-GNX-8.H3。用与多克隆位点的上游杂交的引物SEQ ID NO：8和多克隆位点下游的引物SEQ ID NO：9来确认插入的cDNA序列。GNX-8重链cDNA以及所推断的氨基酸序列分别示于表3的SEQ ID NO：14和15。
为鉴定轻链cDNA序列，对GNX-8的轻链肽进行质谱分析和数据库检索。根据蛋白鉴定信息，GNX-8的轻链与小鼠λ链同源。合成了在小鼠λ基因恒定区5′末端旁侧的引物SEQ ID NO：10。通过降落PCR从前述第一链cDNA扩增包括轻链基因的可变区和部分恒定区的cDNA。PCR反应首先进行5个循环的30秒94℃、90秒72℃，随后是5个循环的30秒94℃、30秒66℃、90秒72℃，以及接着重复27次30秒94℃、30秒63℃、和90秒72℃的循环。继而将扩增的PCR片段引入到yT&A载体(YeasternBiotech)中用于阳性克隆鉴定。
选出了4个具有预期大小的克隆用于经引物SEQ ID NO：11的序列确定。
结果表明所有4个克隆均具有与已知轻链基因的5′末端具有同源结构的相同cDNA。
为重建全长轻链cDNA，合成了新的引物组SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13并且上述cDNA用于通过PCR来仅制备轻链基因的可变区。PCR反应包括30个循环的94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟。
用各自的酶来消化具有掺入的EcoRI和BsiWI限制酶位点的扩增的轻链可变区cDNA。琼脂糖凝胶纯化后，将扩增的可变区cDNA片段连接到pCIck载体(基于pCIneo的表达载体，在XbaI和NotI位点具有插入的人κ恒定区)的相同位点中以得到轻链表达载体pCIck-GNX-8.mλ。进行测序确定并且GNX-8轻链的推断核苷酸以及氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：16和17。
构建表达重组GNX-8抗体的重链和轻链的单一载体，其具有新霉素基因(pCIck-GNX-8 neo)或DHFR(pCIck-GNX-8 DHFR)作为选择标记。用BglII将轻链载体pCIck-GNX-8.mλ线性化后用小牛肠磷酸酶(CIP)在5′末端去磷酸化。用BglII和NgoMIV裂解重链载体pCI-GNX-8.H3。将含有CMV启动子的BglII-NgoMIV片段、全长重链cDNA和SV40polyA通过凝胶提取回收并通过平末端连接引入到线性化的轻链载体中以形成pCIck-GNX-8neo。接着，通过用NgoMTV/ClaI裂解将新霉素基因从pCIck-GNX-8 neo上去除并用DHFR置换以产生pCIck-GNX-8 DHFR载体。通过HindIII/SalI消化将DHFR小基因从pdhfr3.2载体(ATCC No.37166)裂解并通过凝胶提取分离和回收。用Klenow处理这两个片段以产生平末端，继而通过平末端连接将DHFR基因连接到NgoMIV/ClaI-裂解的pCIck-GNX-8neo片段中。
表3引物和序列
Figure BPA00001328432500721
SEQ ID NO：14
长度：318
类型：DNA
(重链，可变区)
GGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGG
GGACAGTGTCTCTAGCAAGAGTGTTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCC
CCATTGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGT
GGTATAATGAATATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAATCC
AGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCACCTGAACTCTGTGACTCCCG
AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAACTTTGACTACTGGGGCCA
GGGAACCCTGGTCACCGTCTCC
SEQ ID NO：15
长度：106
类型：氨基酸
(重链，可变区)
GLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSKSVAWNWIRQSPLRGLEWLGRTYYRSKWY
NEYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLHLNSVTPEDTAVYYCARNFDYWGQGTL
VTVS
SEQ ID NO：16
长度：300
类型：DNA
(轻链，可变区)
CTCACCACAGCACCTGGTGGAACAGTCATACTCACTTGTCGCTCAAGTAC
TGGGGCTGTTACAACTAATAACTATGCCAACTGGGTCCAAGAAAAACCA
GATCATTTATTCACTGGTCTAATAGATGCTACCAGCAACCGAGTTCCAGG
TGTTCCTGTCAGATTCTCCGGCTCCCTGATTGGAGACAAGGCTGCCCTCA
CCATCACAGGGGCACAGACTGAGGATGATGCAATGTATTTCTGTGCTCT
ATGGTACAACACCCATTTTGTTTTCGGCGGTGGAACCAAGGTCACTGTCC
TA
SEQ ID NO：17
长度：100
类型：氨基酸
(轻链，可变区)
LTTAPGGTVILTCRSSTGAVTTNNYANWVQEKPDHLFTGLIDATSNRVPGVP
VRFSGSLIGDKAALTITGAQTEDDAMYFCALWYNTHFVFGGGTKVTVL
一旦轻链和重链被测序，则可以对核酸进行重新编码以优化在例如特异人宿主细胞中的表达。
实施例10：转染瘤
NS0细胞生长至1×106细胞/ml的密度。将该细胞维持在指数生长期并在转染前一天更换培养基。转染当天，洗涤40×106细胞。接着将10μg含有例如轻链DNA的线性化的核酸和线性化的重链DNA加入到细胞悬液中(总DNA体积应低于50μl)并将培养物在冰上温育15min。将DNA和细胞混合物转移至冷却的比色皿(0.4cm)并施以电脉冲(750V和25μF)。在电脉冲后立即将比色皿置于冰上并在冰上保留10-15min。收集细胞并钠板。将细胞在5％CO2培养箱内温育12-16天或者直到群落出现。用ELISA测试在悬液培养中生长的细胞群落或细胞的上清并在新鲜培养基中克隆阳性转染瘤。为了进一步筛选阳性转染瘤，进行滴定ELISA或者Biacore测定。将扩展的转染瘤在摇瓶中维持并从上清中收集抗体或其衍生物。
实施例11：药物代谢动力学
将大鼠随机分两组(4只大鼠/组)。动物经尾静脉接受1或10mg/kg的GNX-8单次静脉弹丸注射。在0、5、15和30分钟以及1、2、4、6、24、30、72、144、168、216、240、312、336和360小时收集血液样品。收获血清并储存于-20℃直至GNX-8浓度测定。用ELISA确定GNX-8浓度。
通过IODO-Gen方法用131I放射性标记GNX-8。
裸小鼠用于体内生物分布和成像研究。经皮下接种5百万Colo205细胞。当肿瘤达到0.5g的大小时，进行生物分布研究。对于生物分布研究，在尾静脉对小鼠注射10μCi/2.3μg131I-标记的GNX-8。注射后6、24、48、72和96小时处死5只小鼠。在即将处死小鼠前取血液样品。立即取出肿瘤和器官(脑、皮肤、肌肉、骨、心、肺、胰腺、眼、肾上腺、尾、脾、肾、肝、膀胱、胃、小肠和大肠)并称重。在γ计数器(Packard)中分别对肿瘤、器官和血液中放射性标记抗体的存在进行计数。每次与组织和肿瘤一起对标准物计数。组织放射性表示为每克器官注射剂量的百分数(％ID/g)。
在microSPECT单光子发射计算机断层扫描X-SPECT动物成像系统(Gamma Medica Inc.USA)和microCT X-射线计算机断层扫描上进行成像研究。携有Colo205肿瘤的裸小鼠经尾静脉静脉内注射200mCi/5.5mg/100ml131I-标记的GNX-8。在1、6、24、48、72和96小时获取图像。在单次静脉内施用后在大鼠、SCID小鼠和裸小鼠中进行对GNX-8进行药物代谢动力学(PK)研究。用ELISA分析GNX-8的血清浓度。
二室模型提供了对数据很好的拟合并产生了表4和5中总结的PK参数。在大鼠中单次静脉内施用1.0和10mg/kg的GNX-8后观察到Cmax剂量相关的提高。GNX-8在1和10mg/kg的剂量分别以3.81和4.98天的终末半衰期从血清中清除。
在施用于裸小鼠和SCID小鼠(有或没有携有Colo205肿瘤的小鼠)后，GNX-8的药物代谢动力学参数呈现出了在两种有肿瘤的小鼠中均为约1天的T1/2。对于非携有肿瘤的动物，T1/2值分别在SCID小鼠中是58.09hr及在裸小鼠中是98.31。从药物代谢动力学参数来说，非携有肿瘤的小鼠中的T1/2比携有肿瘤的小鼠的长得多。
表4大鼠中的药物代谢动力学参数
  参数   1mg/kg i.v.   10mg/kg i.v.
  Tmax(分钟)   5   5
  Cmax(μg/ml)   9.49   102.08
  T1/2终末(天)   3.81   4.98
表5SCID小鼠和裸小鼠(i.v.施用5mg/kg GNX-8)中药物代谢动力学参数
在携有Colo205异种移植物的裸小鼠中进行生物分布研究以评估GNX-8的体内肿瘤靶向活性和特异性。
在6h、24h、48h、72h和96h所有时间点均在血浆中检测到最高水平的131I-GNX-8放射性。在6h，在血浆中检测到约60％的每克注射剂量(％ID/g)。在48、72和96小时，血浆的％ID/g是约20％。血浆水平显著高于脑、皮肤、肌肉、骨、心、肺、胰腺、眼、肾上腺、尾、脾、肾、肝、膀胱、胃、小肠和大肠其它器官中的，其中％ID/g在所有时间点所有器官中均不超过5％ID/g。放射性在除了肿瘤之外的血浆中和在其它器官中随时间降低。血浆放射性在6小时和96小时之间降低约70％。
肿瘤的放射性初始高于正常器官中的。最高的肿瘤摄取在131I-GNX-8注射48小时后观察到，并在其它器官的放射性降低时保持稳定状态。因此，肿瘤/器官比率在其它器官中升高。在6小时和24小时之间观察到在血浆、心、肺、肾上腺、尾、脾、肾和肝中放射性快速降低。另一方面，在注射后6至96小时肿瘤/血浆比率升高约4倍。未观察到131I-GNX-8在肾中的积累。
通过成像分析研究携有Colo205肿瘤的裸小鼠中的体内肿瘤靶向活性。进行时程实验以监测131I-GNX-8的分布。结果也表明大多数的131I-GNX-8位于血液，并且在注射后从24至72小时清楚可见肿瘤靶向。
体内数据表明大部分GNX-8在注射后保留在血液中。在各种正常器官中没有显著的非特异性结合。此外，在静脉注射后GNX-8迅速靶向Colo205肿瘤并将标记保持在稳态水平超过96小时。
实施例12：毒性
在8-9周龄的雄性和雌性BALB/c AnN Crl BR小鼠(6只小鼠/组)中进行单剂量毒性。小鼠静脉内注射150mg/kg剂量的GNX-8或者仅注射运载体(vehicle)(PBS)。在处死前1、8和16天的研究中测量所有小鼠的体重。每天观测小鼠的发病迹象或死亡率。
在8周龄的雄性Sprague-Dawley Crl CD(SD)大鼠(6只大鼠/组)中进行重复剂量毒性。每组小鼠被施用运载体(PBS)或者3、15或75mg/kg/剂量的GNX-8，每周两次共4周。每天检查所有动物的死亡率并将任何发现单独记录。在处理前和处理期间每周对大鼠称重，并在临终处死时测量最终的过夜空腹体重。在临终处死时收集血液样品并评估血液和临床化学参数。体重和所有测试参数中差异的显著性通过Student’s t-检验来确定。
为确定GNX-8在正常人组织上的交叉反应性，使用非常高剂量(150μg/ml)的生物素化GNX-8。将具有72种人组织的组织阵列(24种类型的正常器官取自3个正常人个体)(US Biomax FDA 801-1)用GNX-8染色。基于药物代谢动力学研究Cmax的结果，以150μg/ml使用GNX-8以确保GNX-8在Cmax将不会与正常人组织有严重的交叉反应性。该浓度比免疫组织化学研究中常规使用的浓度要高得多。
在若干上皮来源的人组织上观察到弱至中等的GNX-8染色，包括胃肠道的粘膜上皮、输乳管的上皮细胞和复层鳞状上皮的角化细胞。根据Finstadet al.(Clin.Cancer Res.，3：1433-1442，1997)先前的发现，引入循环血液的抗体显示出对癌细胞的特异性定位且不在附近抗原阳性的正常上皮细胞中聚集。而且，抗体不穿过基底膜。因此，GNX-8在正常组织管道的上皮细胞中的染色并不被认为是有损害的。
进行了另外两个研究以检验GNX-8在正常人血细胞上的交叉反应性。所有测试的来自4种不同血型(ABO)的捐献者的血细胞显示出对GNX-8的阴性反应。结果证实GNX-8不结合血细胞。因此，施用于循环系统的GNX-8不应引起对血细胞的损害。
为解决GNX-8在体内的安全性，进行了两个研究以确定急性和亚急性毒性效应。
以150mg/kg的剂量在BALB/c小鼠中测试GNX-8的单剂量毒性。每天观察一次小鼠并且在预定的处死前未发现死亡。所有小鼠在研究期间增加了体重并且在GNX-8处理组和对照组之间体重增加的平均值没有显著差异。
在Sprague Dawley Crl CD大鼠中进行GNX-8的重复剂量毒性。8周龄的6只动物被分配到组。一组施用运载体(PBS)每周两次共4周。第2、3和4组分别接受3、15和75mg/kg/剂量的PBS中的GNX-8，每周两次共4周。每天检测所有动物的死亡率并记录所有的发现。在处理前和处理期间每周对大鼠称重并在临终处死时测量最终的过夜空腹体重。在临终处死时收集血液样品并评估血液学和临床化学参数。体重和所有其它测量的参数中差异的显著性通过Student’s t-检验来确定。
没有与GNX-8处理相关毒性的临床迹象。最终体重增加的分析表明对照组和处理组之间没有差异。在空腹过夜后的安乐死前，取得对照组和高剂量组的血液样品并分析血液学和临床化学谱。
高剂量组和对照组之间在血红蛋白量、血细胞比容、RBC数目、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白和平均红细胞血红蛋白浓度上没有统计学显著差异。结果表明重复高剂量的GNX-8施用未诱导血液学毒性。
对于临床化学分析，对照和高剂量组的参数平均值在表6中给出。在高剂量组中注意到了总蛋白在统计学上显著的增加，其可能缘于高剂量抗体的重复注射。另外，也观察到白蛋白的轻微升高。然而，该数值仍然在大鼠的正常界限范围内。临床化学数据显示在重复注射高剂量的GNX-8后对代谢和排泄功能没有显著损害。
血液学和临床化学分析均验证了在4周期间内GNX-8重复高剂量施用的安全性。
表6临床化学分析
Figure BPA00001328432500781
实施例13：规模扩大
为获得用于大规模生产GNX-8的稳定细胞系，获得了表达重组GNX-8(rGNX-8)的NS0和CHO细胞系。简短来说，从原始杂交瘤克降编码GNX-8的重链和轻链的cDNA。继而将分离的抗体基因在表达载体中重新组装。通过SDS-PAGE证实从转染的NS0细胞条件化的培养基纯化的rGNX-8的分子量。通过HPTLC、免疫染色、流式细胞术和CDC测定比较rGNX-8和原始GNX-8杂交瘤的特异性、结合活性和效力。
在原始和重组GNX-8抗体之间没有不同。
继而通过MALDI-MS分析rGNX-8和GNX-8的N-糖基化谱。
数据说明两种抗体之间高度类似的N-连接糖模式。这两种抗体的几乎所有N-聚糖都含有核心岩藻糖基化结构，但却无末端唾液酸。
将二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO/dhfr-)细胞(ATCCCRL-9096)在含有5％FBS及补加了100nM次黄嘌呤和16μM胸苷的IMDM中维持。为制备重组GNX-8生产细胞系，用BamHI线性化表达载体pCIck-GNX-8DHFR并通过OD260吸收来确定溶液中回收的DNA的浓度。用10μg线性化DNA和30μl的Fugene6转染试剂(Roche)根据厂商指示转染大约1.2×106CHO/dhfr-细胞。48小时后，用含有5％经透析的胎牛血清的IMDM替换培养基以用于转染子选择。该选择持续大约2星期直至获得稳定集落。挑取多个集落并在相同选择培养基于48-孔平板中培养。通过使用HRP-标记的抗-人IgG(Fc)抗体作为二抗的抗原特异性ELISA筛选各个CHO克隆的rGNX-8表达。
表达高水平抗体的CHO克隆被选择用于随后使用甲氨蝶呤(MTX)的基因扩增。在10nM的MTX中的基因扩增导致rGNX-8的分泌增加超过30倍。该稳定的CHO克隆被命名为CHO-rGNX-8.5M10。
之后使CHO-rGNX-8.5M10细胞在摇瓶中适应无血清培养并经过14天的培养达到大约120μg/ml GNX-8的最大产量。收集培养物上清并通过蛋白A层析纯化。通过蛋白A层析从CHO培养上清纯化的rGNX-8抗体在SDS-PAGE上显示出所预期的轻链和重链肽条带。
本领域技术人员应了解或者能够使用不超过常规实验的方法来确定许多本文所述的本发明的特定实施方案的等价方案。此种等价方案意图被附随的权利要求书涵盖。
Figure ISB00000476347900011
Figure ISB00000476347900021
Figure ISB00000476347900031
Figure ISB00000476347900041
PCT/RO/134表
Figure QPA00001328432100011
         关于微生物或其它生物材料保藏的说明
               (PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月再版)

Claims (15)

1.特异性结合包含伸展的I型链的表位的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述伸展的I型链包含Leb，其中所述表位在癌细胞上表达，其中所述抗体或其抗原结合部分不结合人红细胞。
2.权利要求1的抗体，其不结合Lex。
3.权利要求1的抗体，其不结合Ley。
4.权利要求1的抗体，其不结合Ley-Lex。
5.权利要求1的抗体，其在ADCC测定中于约20/1的E/T比率以约5μg/ml的抗体浓度裂解约50％的Colo205细胞。
6.权利要求1的抗体，其中所述癌细胞表达Leb-Lea。
7.权利要求1的抗体，其中所述癌细胞是上皮细胞。
8.权利要求7的抗体，其中所述上皮细胞包含结肠、直肠、食管、肺、前列腺、乳房或胰腺。
9.权利要求1的抗体，其中所述其部分是scFv。
10.权利要求1的抗体，其包含κ链。
11.权利要求1的抗体，其包含γ链。
12.权利要求1的抗体，其包含从GNX-8获得的CDR区。
13.包含权利要求1的抗体和药物学活性剂的组合物。
14.包含权利要求1的抗体和可检测部分的制品。
15.包含权利要求1的抗体和药物可接受的运载体、赋形剂或稀释剂的组合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8703129B2 (en) * 2008-09-07 2014-04-22 GlycoNex, Inc. Antibodies against extended type 1 chain antigens, derivatives thereof and use
UY34105A (es) 2011-06-03 2012-07-31 Lg Life Sciences Ltd Formulación líquida estable de etanercept
GB201319374D0 (en) 2013-11-01 2013-12-18 Univ Nottingham Glycans as functional cancer targets abd antibodies thereto

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996025436A1 (en) * 1995-02-14 1996-08-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Recombinant human anti-lewis b antibodies
US6083929A (en) * 1991-05-06 2000-07-04 The Biomembrane Institute Extended type 1 chain glycosphingolipids as tumor-associated antigens
US6432402B1 (en) * 1989-05-25 2002-08-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti-idiotypic antibody which induces an immune response against a glycosphingolipid and use thereof
CN1460022A (zh) * 2000-07-03 2003-12-03 生物膜研究所 作为肿瘤相关抗原的伸展1型链鞘糖脂

Family Cites Families (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5168043A (en) 1986-01-10 1992-12-01 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Blood group antigen panel
EP0232706A3 (en) * 1986-01-10 1988-11-30 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Blood group antigen panel
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5011920A (en) 1986-01-30 1991-04-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Disialofucoganglioside immunogen and fucoganglioside monosialosyl Lea II
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
AU631545B2 (en) 1988-04-15 1992-12-03 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
ATE119198T1 (de) 1988-04-16 1995-03-15 Celltech Ltd Verfahren zur herstellung von proteinen mittels rekombinanter dna.
DE68921982T4 (de) 1988-06-14 1996-04-25 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5240833A (en) 1989-01-30 1993-08-31 The Biomembrane Institute Method for the production of monoclonal antibodies directed to tumor-associated gangliosides and fucogangliosides
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
IL94611A (en) 1989-06-05 1994-12-29 Organogenesis Inc Medium for cell cultures containing insulin or growth factor similar to insulin, transferrin or iron ion, triiodothyronine or thyroxine and method of use
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991014438A1 (en) 1990-03-20 1991-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH07500961A (ja) 1990-10-01 1995-02-02 ユニバーシティ オブ コネチカット 細胞による選択的内在化を目的としたウイルス及び細胞の標的設定
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
JPH09506761A (ja) 1990-11-09 1997-07-08 ステファン ディー．ギリーズ サイトカインの免疫複合体
WO1992020316A2 (en) 1991-05-14 1992-11-26 University Of Connecticut Targeted delivery of genes encoding immunogenic proteins
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
AU2160992A (en) 1991-06-05 1993-01-12 Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan, The Targeted delivery of genes encoding secretory proteins
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
AU3434393A (en) 1992-01-17 1993-08-03 Regents Of The University Of Michigan, The Targeted virus
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
EP0563475B1 (en) 1992-03-25 2000-05-31 Immunogen Inc Cell binding agent conjugates of derivatives of CC-1065
JPH07505773A (ja) 1992-04-03 1995-06-29 ヤング　アレキサンダー　ティー 標的化されたウイルスベクターを用いた遺伝子治療
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
HU218069B (hu) 1992-06-09 2000-05-28 Hoppe Ag. Kilincses zárrendszer
JPH08501085A (ja) 1992-08-26 1996-02-06 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 抗腫瘍剤としてのサイトカインｉｐ−１０の利用
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
AU689758B2 (en) 1992-10-09 1998-04-09 Advanced Tissue Sciences, Inc. Liver reserve cells
CA2592997A1 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Pseudo-adenovirus vectors
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
US6165463A (en) 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
KR20050085971A (ko) 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU715543B2 (en) 1995-09-08 2000-02-03 Genzyme Corporation Improved AAV vectors for gene therapy
WO1997033899A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
EP0904278A4 (en) 1996-03-22 1999-09-15 Human Genome Sciences Inc MOLECULE II INDUCER OF APOPTOSIS
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US7227002B1 (en) 1997-04-14 2007-06-05 Micromet Ag Human antibodies that bind human 17-A1/EpCAM tumor antigen
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6642051B1 (en) 1997-10-21 2003-11-04 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus(AAV) packaging cassettes for the production of recombinant AAV vectors
KR20010031713A (ko) 1997-11-03 2001-04-16 벤슨 로버트 에이치. 맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장억제제
AU2001259063A1 (en) 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
CN100475848C (zh) 2001-05-18 2009-04-08 麒麟麦酒株式会社 抗trail-r抗体
US20060148009A1 (en) 2004-10-12 2006-07-06 Xencor, Inc. Prediction and assessment of immunogenicity

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6432402B1 (en) * 1989-05-25 2002-08-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti-idiotypic antibody which induces an immune response against a glycosphingolipid and use thereof
US6083929A (en) * 1991-05-06 2000-07-04 The Biomembrane Institute Extended type 1 chain glycosphingolipids as tumor-associated antigens
US6294523B1 (en) * 1991-05-06 2001-09-25 The Biomembrane Institute Extended type 1 chain glycosphingolipids as tumor-associated antigens
WO1996025436A1 (en) * 1995-02-14 1996-08-22 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Recombinant human anti-lewis b antibodies
CN1460022A (zh) * 2000-07-03 2003-12-03 生物膜研究所 作为肿瘤相关抗原的伸展1型链鞘糖脂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARK R. STROUD 等: "Extended type-1 chain glycosphingolipid antigens Isolation and characterization of trifucosyl-Leb antigen (III4V4VI2Fuc3Lc6)", 《EUR. J. BIOCHEM.》 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ591488A (en) 2012-11-30
IL211561A0 (en) 2011-05-31
CA2735433C (en) 2016-02-16
CA2735433A1 (en) 2010-03-11
MX2011002478A (es) 2011-04-05
TWI433684B (zh) 2014-04-11
HK1157363A1 (zh) 2012-06-29
KR101432474B1 (ko) 2014-08-21
AU2008361352B2 (en) 2013-05-09
BRPI0823049A2 (pt) 2015-06-16
KR20110076912A (ko) 2011-07-06
CN102282172B (zh) 2014-02-19
KR20140066785A (ko) 2014-06-02
RU2011108579A (ru) 2012-09-10
AU2008361352A1 (en) 2010-03-11
TW201010724A (en) 2010-03-16
US20110142844A1 (en) 2011-06-16
KR101442323B1 (ko) 2014-09-25
ES2549877T3 (es) 2015-11-02
EP2324060A1 (en) 2011-05-25
DK2324060T3 (en) 2015-10-26
IL211561A (en) 2016-04-21
JP2012502027A (ja) 2012-01-26
ZA201101547B (en) 2012-05-30
US8163497B2 (en) 2012-04-24
JP5611210B2 (ja) 2014-10-22
EP2324060B1 (en) 2015-07-22
EP2324060A4 (en) 2011-10-19
RU2478648C2 (ru) 2013-04-10
WO2010027364A1 (en) 2010-03-11

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