KR20110076912A - 항-연장된 ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체, 이의 유도체 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연장된 I형 쇄 글라이코스핑고지질에 특이적으로 결합하는 인간 항체 및 이 항체의 항원-결합 부분에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항-연장된 I형 글라이코스핑고지질 항체, 및 이의 부적절한 활성 또는 물질대사로 인해 야기되거나, 이로 인해 야기되거나 생성되거나 관련되거나, 또는 이의 존재로부터 야기되는 인간을 비롯한 포유동물에서의 질병 또는 질환, 예를 들면 결장직장암 또는 다른 질환의 완화, 치료 또는 예방에서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 치료 목적 또는 진단 목적으로 이용될 수 있다. 따라서, 관심 항체 및 이의 유도체를 포함하는 예방적, 면역치료적 및 진단 조성물, 및 일부 악성종양 세포와 같은 세포에서 연장된 I형 글라이코스핑고지질의 부적절한 물질대사 및/또는 발현으로 인해 야기된 인간을 비롯한 포유동물에서의 질병을 예방하거나, 치료하거나, 진단하는 방법에서의 이들의 용도가 또한 본원에 개시되어 있다.
연장된 I형 글라이코스핑고지질은 예를 들면 일부 악성 상태와 관련될 수 있는 세포 표면 분자이다.
이상 글라이코실화(glycosylation)가 많은 암 유형의 흔한 특징으로 관찰되어 왔다([Hakomori, PNAS 99: 10231-10233, 2002]). 인간의 암을 진단하는데 사용된 탄화수소 항원의 일부는 폴리락토사민 구조를 갖고 있다. 폴리락토사민은 일반적으로 단위 구조에 따라 2가지 카테고리로 분류된다. Galβl -> 3GlcNAc 구조를 갖는 폴리락토사민은 I형 쇄라 불리고, Galβl -> 4GlcNAc 구조를 갖는 폴리락토사민은 II형 쇄라 불린다. 일부 인간 암에서 발견되는 가장 흔한 종양-관련 항원은 락토 시리즈의 II형 쇄 구조이고, 이는 일반적으로 시알화 및/또는 푸코실화되어 있다. I형 쇄 항원은 정상 세포 및 조직에 풍부하고, 종종 암과 관련되어 있다([Stroud et al., JBC 266: 8439-8446, 1991]). 예를 들면 2 -> 3 시알화된 Lea 항원(N19-9 항체에 의해 한정된 CA 19-9 항원)은 암-관련 I형 쇄 항원이다. 그러나, 이들 I형 항원의 검출에 근거한 암 진단 방법은 높은 위양성 및/또는 높은 위음성 발생에 의해 방해되었고, 예를 들면 미국 특허 제6,083,929호 및 제6,294,523호를 참고할 수 있다.
2가지의 마우스 단일클론 항체인 NCC-ST421 및 IMH2가 연장된 I형 쇄 항원에 대해 생성되었다. NCC-ST421은 Lea-Lea에 특이적이다. NCC-ST421 항체는 다양한 인간 종양 세포에 대한 작동자(effector)로서 인간 말초 혈액 백혈구를 이용하여 항체 독립적 세포 세포독성(ADCC)를 강하게 유발하였고, 인간 보체 공급원을 이용하여 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도하였다([Watanabe et al., Cancer Res. 51:2199-2204, 1991]). Lea-Lea 항원은 인간의 결장 암종 세포주인 Colo205에서 높게 발현되는 것으로 발견되었다.
IMH2 또한 연장된 I형 쇄에 대해 확립되었다. 1H-NMR, FAB-MS 및 효소 분해 연구에 근거하여 IMH2는 Leb-Lea, Ley-Lex, Leb 및 Ley에 결합된다([Stroud et al., Eur. J. Biochem. 203:577-586, 1992]). IMH2는 시험관내에서 Colo205 세포의 보체 의존적 사멸 및 강한 림프구 활성화된 세포사멸을 나타내고, 생체내에서 Colo205의 성장을 억제하였다.
IMH2는 결장, 췌장, 간 및 자궁내막에서 유래된 암종 조직과 반응하였다. 그러나, 정상적인 결장은 IMH2와의 반응성을 나타내지 않았다. 정상 간 및 췌장은 정상 간세포 및 랑게르한섬 세포에서 약하거나 매우 제한된 반응성을 나타내었다. 면역화학적 염색 강도는 정상 자궁내막에 비해 자궁내막 암종에서 훨씬 더 강하였다([Ito et al., Cancer Res. 52:3739-3745, 1992]).
NCC-ST421 및 IMH2 둘 모두 연장된 I형 쇄 항원을 발현하는 인간 종양 세포를 접종한 후 누드 마우스에서 종양 성장을 억제시켰지만, 연장된 I형 쇄 항원을 발현하지 않는 종양 세포에서는 성장 억제가 나타나지 않았다.
정상 세포에서 I형 구조가 풍부하기 때문에, 이제까지 진단 및/또는 치료 목적으로 I형 항체를 이용하는 것은 가능하지 않았다.
종래의 암 치료, 예를 들면 화학치료 및 방사선치료는 다양한 암 환자에서 일부 이점을 나타내었다. 그러나, 종래의 치료법의 항종양 활성의 이점에도 불구하고, 정상 조직에 대한 치료-유도된 독성은 암 환자의 삶의 질을 상당히 감소시킬 수 있다. 더 좋은 항종양 활성의 투여량 강화 또한 제한된다. 모노클론 항체는 정상 조직이 아니라 종양 조직에 집중된 표적화된 세포독성을 가능하게 한다.
종양 세포 상에서 발현되는 항원에 대해 높은 특이성을 갖고 바람직한 항종양 활성을 이끌어낼 수 있는 모노클론 항체(mAb)가 개발될 수 있다. 완전 인간 mAb를 생산하는 마우스의 개발에 의해 mAb의 전망이 더해졌다. 이런 수단중 하나는 KM 마우스이다(미국 특허 제7,041,870호 및 [Tomizuka et al., Nat. Genet. 16:133-143, 1997]). KM 마우스에서, 면역글로불린을 암호화하는 마우스 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 대체되었다. 따라서, KM 마우스는 완전(fully) 인간 항체를 발현한다.
KM 마우스를 이용하여 여러 완전 인간 항체가 성공적으로 개발되었다.
예를 들면 모토키(Motoki) 등은 TRAIL-R2의 항체 의존적 다량체화를 지시하고, 숙주의 작동자 작용과는 독립적인 종양 퇴화 및 효과적인 아폽토시스 신호전달을 개시하는 인간 IgG(KMTR2)를 개발하였다([Clin. Cancer Res. 11(8):3126-3135, 2005]; 및 미국 특허 제7, 115,717호 및 [Imakire et al., Int. J. Cancer 108:564-570, 2004]). 인간 백혈구 항체인 DR(HLA-DR)에 특이적인 완전 인간 모노클론 항체인 HD8은 시험관 내에서 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC) 및 또한 보체-의존적 세포독성(CDC)을 발휘하고, 비-호지킨 림프종 세포주로 접종된 면역손상된 마우스의 수명을 연장시켰다([Tawara et al., Cancer Sci. 98 (6) 921-928, 2007]).
또한, KM 마우스에서 생성되고 탄화수소 항원을 향하는 2가지의 인간 IgM가 보고되었다. HMMC-1은 신규한 O-글라이칸 구조를 특이적으로 인식하고, 뮬러관-관련 암종에 양성 반응하고, 인간 자궁내막 암세포주인 SNG-S에 보체 의존적 세포독성을 나타낸다([Nozawa et al., Clin Cancer Res. 10:7071-7078, 2004]). 세포 막 상에 위치한 당단백질을 인식하는 다른 인간 모노클론 IgM인 HMOCC-1은 난소암과 반응하였다([Suzuki et al., Gynecol. Oncol. 95:290-298, 2004]). 이들 2가지 항체가 IgM이기 때문에, 암 치료에서 이들 항체의 적용은 분자 크기 및 생산 제한에 의해 제한된다.
본 발명은 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 특이적으로 결합하는 신규한 인간 항체, 및 이의 절편 및 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 항체의 가변성 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 및 이들의 상응하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 또는 CDR이 수득되는 모 분자의 연장된 I형 글라이코스핑고지질-결합 능력이 유지된 CDR-유래된 영역을 포함하는 결합 분자를 수득하기 위한 관심 항체의 CDR 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 항체 서열을 갖고 있는 세포주 및 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 연장된 I형 글라이코스핑고지질 작용, 물질대사 및 발현과 관련된 질병 및 질환의 치료를 위한 약제 또는 조성물의 제조를 위한 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 비정형적이거나 비정상적인 연장된 I형 글라이코스핑고지질 생물학 및 발현과 관련된 질병의 진단에서의 항체의 용도에 관한 것이다.
이들 및 다른 목적은 연장된 I형 쇄 탄화수소 항체에 대한 인간 모노클론 항체의 개발에서 만족되었다. 예를 들면, mAb GNX-8은 KM-마우스에서 유래된 인간 IgG1이다. GNX-8은 여러 인간 결장직장 암 세포주에서 CDC 및 ADCC 활성을 나타내고, 생체 내에서 Colo205 및 DLD-1 종양 성장을 억제한다. GNX-8은 폐암뿐만 아니라 원발성 및 전이성 결장직장암, 유방암, 췌장암과 반응하지만, 정상적인 인간 조직 및 혈액 세포와는 반응하지 않는다.
부가적인 특징 및 이점에 본원에 개시되고, 하기의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
본 발명은 본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않고 변형되거나 사용될 수 있기 때문에 본원에 개시된 특정한 방법, 프로토콜, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 세포주, 벡터 또는 시약으로 제한되지 않는다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 예시할 목적일 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어 및 임의의 약자는 본 발명의 기술 분야에서 당 분야의 숙련자들에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질을 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있고, 단지 예시적인 방법, 장치 및 물질이 본원에 개시되어 있다.
본원에 언급된 모든 특허 및 문헌이 본 발명에서 사용될 수 있는 단백질, 효소, 벡터, 숙주 세포 및 방법을 개시할 목적으로 그 전체가 본원에 참고로 혼입되어 있다. 그러나, 본원에 개시된 것중 어떤 것도 종래 기술로서 이러한 개시내용에 의해 본 발명이 예상되는 것으로 간주되어서는 안된다.
"연장된 I형 글라이코스핑고지질 질병"은 예를 들면 세포 표면에서의 연장된 I형 글라이코스핑고지질의 비정상적인 물질대사, 과발현 또는 증가된 수준과 관련되거나 이에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 결함, 질환, 질병, 건강 이상, 상태, 비정상적 상태 등이다.
항체 폴리펩타이드 서열에 관한 문구 "실질적으로 동일한"은 항체 쇄가 기준 폴리펩타이드 서열에 대해 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 항체로서 간주됨을 의미한다. 핵산 서열에 대한 상기 용어는 기준 핵산 서열에 대해 약 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드의 서열로서 간주됨을 의미한다.
용어 "동일성" 또는 "상동성"은 전체 서열에 대해 최대%의 동일성을 달성하기 위해서 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 간극을 도입한 후 후보자가 비교되는 상응하는 서열의 잔기와 동일한 후보자 서열의 뉴클레오타이드 염기 또는 아미노산 잔기의 %를 의미할 수 있고, 임의의 보존성 치환은 서열 동일성의 일부로서 간주되지 않는다. N-말단 또는 C-말단 연장 또는 삽입은 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 간주되지 않는다. 서열을 정렬하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램이 이용가능하고, 이들은 당 분야에 잘 공지되어 있다. 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 서열 동일성이 측정될 수 있다.
항체, 핵산 또는 항원의 "작용성 절편, 변이체, 유도체 또는 유사체" 등은 전체 길이의 관심 항체 또는 항원과 공통적인 정성적인 생물학적 활성을 갖는 화합물 또는 분자이다. 예를 들면 항-연장된 I형 글라이코스핑고지질 항체의 작용성 절편 또는 유사체는 연장된 I형 글라이코스핑고지질 분자에 결합할 수 있는 것, 또는 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 결합하는 작용적 또는 길항적 항체이다. 예는 scFv 분자이다. 연장된 I형 글라이코스핑고지질의 경우, 이의 변이체 또는 유도체는 자연 발생되는 연장된 I형 글라이코스핑고지질과 동일하지는 않지만 본 발명의 목적으로 사용될 수 있는 분자이고, 예를 들면 야생형 연장된 I형 글라이코스핑고지질과 동일하지는 않지만 예를 들면 야생형 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 선택적으로 결합하는 항체를 발생시키는 면역원으로 사용될 수 있는 것들이다.
"치환성" 변이체는 천연 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되어 동일한 위치에 삽입되는 다른 아미노산으로 대체된 것들이다. 치환은 분자에서 단 하나의 아미노산이 치환되는 단일 치환일 수 있거나, 또는 두개 이상의 아미노산이 동일한 분자내에서 치환되는 다중 치환일 수도 있다. 여러개의 치환이 연속적 부위에 존재할 수 있다. 또한 하나의 아미노산이 다수의 잔기로 대체될 수 있고, 이 경우, 이런 변이체는 치환 및 삽입을 둘 모두 포함한다.
"삽입성" 변이체는 하나 이상의 아미노산이 천연 서열의 특정한 위치의 아미노산에 바로 인접하게 삽입된 것들이다. 아미노산에 바로 인접하다는 것은 아미노산의 α-카복실 작용기 또는 α-아미노 작용기중 하나에 연결됨을 의미한다.
"결실성" 변이체는 천연 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것들이다. 일반적으로, 결실성 변이체는 분자의 특정한 영역에서 결실된 하나 또는 2개의 아미노산을 가질 것이다.
용어 치환, 삽입 및 결실 변이체는 또한 핵산에도 유사하게 적용된다.
적응성 면역 반응은 다음과 같은 2가지의 주요 부문을 갖는다: T 림프구의 세포 면역 반응 및 항체를 분비하는 B 림프구의 체액성 면역 반응. B 세포 에피토프는 선형의 연속적인 아미노산일 수 있거나, 또는 배좌성일 수 있다([Protein Science (2005) 14, 246]). 이와는 대조적으로, T 세포 에피토프는 주 조직 적합성 복합체(MHC) 단백질로서 제공되는 항원 단백질로부터 분해된 짧은 선형 펩타이드이거나, 또는 인간의 경우 인간 백혈구 항원(HLA) I형 또는 II형 분자이다. 에피토프 제시는 MHC-펩타이드 결합 및 T 세포 수용체(TCR) 상호작용 둘 모두에 의존한다. MHC 단백질은 매우 다형성이고, 각각이 제한된 세트의 펩타이드에 결합한다. 따라서, 숙주에 존재하는 MHC 대립인자의 특정한 조합이 감염동안 인식되는 잠재적인 에피토프의 범위를 한정한다.
2가지의 기본적인 유형의 T세포가 CD8 및 CD4 단백질의 발현에 의해 구별되고, 이는 T 세포가 각각 I형 또는 II형 분자에 의해 제시되는 에피토프를 인식할 것임을 나타낸다. CD4+ T 에피토프는 막 결합 소낭에서 항원 제시 세포에 의해 캡슐화된 후 처리되고, 여기서 항원은 프로테아제에 의해 MHC II형 단백질에 결합하는 펩타이드 절편으로 분해된다. 이와는 대조적으로, CD8+ T 세포는 이뮤노프로테아좀(immunoproteasome)에 의해 사이토졸에서 짧은 펩타이드로서 분해되는 단백질인 일반적으로 세포 내부에서 발현되는 바이러스 또는 자체 항원을 인식한다. 분해후, HLA I형 항원 상으로 부하되기 위해 펩타이드가 항원처리와 관련된 이동자(TAP)에 의해 세포질 망상구조로 이동된다. CD4+ T(헬퍼) 세포 에피토프는 단백질 항원에 대한 T 세포-의존성 면역 반응을 유도하는데 결정적이다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 폴리펩타이드가 바람직한 생물활적 활성을 갖는 한, 모노클론 항체(전장 모노클론 항체 포함), 폴리클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들면 이중 특이적 항체), 항체 절편, 또는 하나 이상의 CDR 또는 CDR-유래 서열을 갖는 합성 펩타이드를 포함한다. 항체(Ab) 및 면역글로불린(Ig)은 동일한 구조 특징을 갖는 당단백질이다. 일반적으로, 항체는 한정되거나 인식된 특이성을 갖는 Ig로서 간주된다. 따라서, 항체가 특정 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 항체 및 표적 특이성이 없는 다른 항체-류 분자 둘 모두를 포함한다.
본 발명의 항체는 임의의 클래스(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 등) 또는 서브클래스(예를 들면, IgG1, IgG2n, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등)일 수 있다("유형", "클래스" 및 "아형" 및 "서브클래스"는 본원에서 서로 교환되어 사용될 수 있다). 천연 또는 야생형, 즉 비-인공적으로 조작된 모집단에서 수득된 항체 및 면연글로불린 및 중합체 항체, 예를 들면 IgA 및 IgM의 단량체는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종4량체 당단백질이다. 각각의 중쇄는 한 말단에서의 가변 도메인(VH)에 이은 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에서의 가변 도메인(VL) 및 다른 말단에서의 불변 도메인을 갖는다.
"비-인공적으로 조작된"은 외래 항원 결합 분자를 함유하거나 발현하도록 비-천연 수단, 예를 들면 면역접종 또는 형질변환으로 처리되지 않았음을 의미한다. 야생형은 모집단에서 발견되는 가장 주를 이루는 대립인자 또는 종을 의미하거나, 비-인공 조작된 동물에서 수득된 항체를 의미하거나, 천연 발생한 대립인자 또는 천연 발생하고 모집단에서 유지될 수 있는 다형성, 또는 악성 종양과 같은 자연 수단을 통해 발생한 변이체 또는 유도체를 의미할 수 있고, 항원-결합 분자의 아미노산을 변화시키기 위해 재조합 방법 등을 이용한 돌연변이와 같은 조작의 형태로 수득된 것과 대비된다. 이 용어의 이용은 이 용어가 발견되고, 이용되는 문장, 문단, 개념, 생각, 아이디어 등의 맥락에서 당 분야의 숙련자들에게 쉽게 추측되고 이해된다.
본원에서 이용되는 "항-연장된 I형 글라이코스핑고지질 항체"는 인간의 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 유래된 폴리펩타이드를 의미한다.
항체의 가변 도메인의 맥락에서의 용어 "가변"은 항체 사이의 서열에서 광범위하게 상이하고, 특정한 표적에 대한 특정한 항체의 특이적 인식 및 결합에 절대적으로 필요할 수 있는 관련 분자의 일부 부분을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인의 전체에 고르게 분포되어 있지 않다.
가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 또한 초가변성 영역으로 공지되어 있는 상보성 결정 영역이라 불리는 3가지 단편(즉, CDR1, CDR2 및 CDR3)에 집중되어 있다. 가변성 도메인의 보다 높게 보존된 부분은 프레임워크(FR) 영역 또는 서열이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변성 도메인은 각각 4가지의 FR 영역을 포함하고, 크게 β시트 배열을 취하며, β시트 구조를 연결하고 일부 경우 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR 영역에 의해 함께, 종종 인접하게, 유지되며, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 표적(에피토프 또는 결정) 결합 부위를 형성하는데 기여한다([Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987]). 한 CDR, 예를 들면 중쇄의 CDR3는 단독으로 동족(cognate) 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 가질 수 있다.
본원에서 이용되는 면역글로불린 아미노산 잔기의 번호는 달리 지시되지 않는 한, 카바트(Kabat) 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 번호매김에 따라 번호매겨진다.
용어 "항체 절편"은 항체의 손상되지 않거나 전장 쇄의 일부, 일반적으로는 표적 결합 또는 가변 영역을 의미한다. 항체 절편의 예는 Fab, Fab', F( ab' )2 및 Fv 절편을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. "항-연장된 I형 글라이코스핑고지질 항체의 유사체" 또는 "작용성 절편"은 동족 항원에 결합할 수 있는 것이다. 본원에서 사용되는 작용성 절편은 일반적으로 "항체 절편"과 동의어이고, 항체와 관련해서는 동족 항원에 결합할 수 있는 절편, 예를 들면 Fv, Fab, F( ab' )2 등을 의미할 수 있다.
"Fv" 절편은 비-공유결합 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다(VH-VL 이량체). 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR의 배열이 상호작용하여 손상되지 않은 항체로서 VH-VL 이량체의 표적 결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 CDR이 손상되지 않은 항체에 표적 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단 하나의 가변 도메인(또는 표적에 대해 특이적인 단 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반) 조차 표적을 인식하고 결합하는 능력을 가질 수 있다.
"단일쇄 Fv", "sFv" 또는 "scAb" 항체 절편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 구성하고, 여기서 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄로서 제시된다. 일반적으로 Fv 폴리펩타이드는 천연 발생 분자로부터 수득되거나, 천연 발생 분자로부터 유래되거나, 인공 서열인 폴리펩타이드 링커, 종종 가요성 분자, 예를 들면 올리고펩타이드, 예컨대 폴리글라이신 등을 VH와 VL 도메인 사이에 추가로 포함하고, 이로 인해 sFv가 표적 결합을 위한 바람직한 구조를 형성할 수 있게 된다. 일부 분자는 하나 이상의 불변 도메인 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
용어 "다이아바디(diabody)"는 동일한 폴리펩타이드 쇄에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함할 수 있는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 절편 구축물을 지칭한다. 동일한 쇄 상의 2개의 가변 도메인이 쌍을 이루이기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 다이아바디 도메인은 다른 쇄의 결합 도메인과 쌍을 이루어 항원 결합 부위를 생성한다.
Fab 절편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인, 및 중쇄의 가변 및 제 1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. CH1 도메인의 카복실 말단에 몇개의 잔사를 추가하여 항체 힌지 영역에서 나온 하나 이상의 시스테인을 포함함으로써, Fab' 절편은 Fab 절편과는 상이하다. Fab' 절편은 F( ab' )2 펩신 분해 생성물의 힌지 시스테인에서의 다이설파이드 결합을 분해함으로써 생성될 수 있다. 항체의 추가적인 효소 및 화학 처리는 흥미로운 다른 작용성 절편을 생성할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "모노클론 항체"(mAb 또는 MAb)는 실질적으로 균질한 항체의 모집단(즉, 모집단을 구성하는 개별적인 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다)에서 수득되는 항체를 의미한다.
본원의 모노클론 항체는, 키메릭 항체가 연장된 I형 글라이코스핑고지질의 바람직한 생물학적 활성을 나타내거나, 또는 연장된 I형 글라이코스핑고지질의 활성 또는 물질대사에 영향을 미치는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종에서 유래되거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스(유형 또는 아형)에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이지만, 쇄의 나머지가 다른 종에서 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 "키메릭" 항체, 및 또한 이런 항체의 절편을 포함한다(미국 특허 제 4,816,567호; 및 [Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)]). 따라서, 항체의 한 클래스에서 나온 CDR은 다른 클래스 또는 서브클래스의 항체의 FR에 그래프팅될 수 있다.
모노클론 항체는 단일 표적 부위, 에피토프 또는 결정자에 대해 특이적이고, 이를 향한다. 또한, 전형적으로 항원의 서로 다른 결정자(에피토프)를 향한 서로 다른 항체를 포함하는 종래의 (폴리클론) 항체 제조물과는 대조적으로, 각각의 모노클론 항체는 표적 상의 단일 결정자에 대한 것이다. 이들의 특이성에 추가하여, 모노클론 항체는 유리하게는 숙주 세포에 의해 합성되고, 다른 면역글로불린으로 오염되지 않고, 이의 항체 쇄를 암호화하는 관련 유전자 및 mRNA의 클로닝을 위해 제공된다. 수식어 "모노클론"은 실질적으로 균일한 항체 모집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들면 본 발명에서 사용하기 위한 모노클론 항체는 잘 공지된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리에서 단리될 수 있거나, 또는 폴리클론 제조물로부터 정제될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 모 모노클론 항체는 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 개시된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 당 분야에 잘 공지되어 있는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
비-인간(예를 들면 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는, 인간 항체와는 달리, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 절편(예를 들면 Fv, Fab, Fab', F( ab' )2 또는 항체의 다른 표적-결합 서열)이다. 일반적으로, 인간화된 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 주형 서열인, 1개, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다.
인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 선택된 인간의 면역글로불린 주형의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일반적으로,인간에서는 최소한으로 면역원성인, 특정 특이성을 갖는 항체 분자를 갖는 것이 목적이다. 따라서, 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 대한 하나 이상의 CDR의 특이적 결합 작용에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서, 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 아미노산을 인간 숙주에서 덜 면역원성인 것들로 교환하는 것이 가능하다.
다르게는 FR은 비-인간이지만, 가장 면역원성인 아미노산들이 덜 면역원성인 것들로 대체될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 논의된 바와 같은 CDR 그래프트가 인간화된 항체를 수득하는 유일한 방법은 아니다. 프레임워크 잔기가 CDR 루프의 전반적인 3차원 구조 및 항체의 리간드에 대한 전반적인 친화성을 결정하는 역할을 하는 것이 흔하기 때문에, 예를 들면 단지 CDR 영역을 개질시키는 것이 항체를 최적화시키는 데 충분하지 않을 수 있다.
따라서, 비-인간 모 항체 분자가 인간에 대해 덜 면역원성인 것으로 변화되도록 항체 면역원성을 감소시키는 임의의 방법을 실시할 수 있고, 인간 항체와의 전반적인 서열 동일성이 항상 필요한 것은 아니다. 따라서, 인간화는 예를 들면 단지 몇몇 잔기, 특히 항체 분자 표면에 노출되고 분자 내부로 파묻히지 않아서 숙주 면역 시스템이 쉽게 접근할 수 없는 잔기를 치환함으로써 인간화가 달성될 수 있다. 이런 방법은 예를 들면 항체 분자 상의 하전된 잔기 또는 일부 다른 잔기의 치환에 대해 본원에 개시되어 있고, 목표는 동족 에피토프 또는 결정자에 대한 항체의 특이성을 손상시키지 않으면서 생성된 분자의 면역원성을 감소시키거나 꺾는 것이다. 예를 들면 [Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994]; [Mol Imm 44:1986-1988, 2007]; [Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987)]; [Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J Immunol 151 :2623 (1993)], 제WO 2006/042333호 및 미국 특허 제5,869,619호를 참고할 수 있다.
항체를 재표면화(resurfacing)하는 전략 및 방법, 및 서로 다른 숙주에서 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 다른 방법이 예를 들면 미국 특허 제5,639,641호에 개시되어 있다. 간략하게, 바람직한 방법에서, (1) 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 풀의 위치 정렬을 생성하여 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출된 위치를 생성하며, 여기서 모든 가변 영역에 대한 정렬 위치가 약 98% 이상 동일하고; (2) 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를 비-인간, 예를 들면 설치류 항체(또는 이의 절편)에 대해 정의하고; (3) 설치류 표면 노출된 아미노산 잔기와 가장 밀접하게 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를 확인하고; (4) 예를 들면 설치류 항체의 CDR의 임의의 잔기의 임의의 원자의 약 5Å 이내인 아미노산 잔기를 제외하고, 단계 (2)에서 정의된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를 단계 (3)에서 확인된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크 표면 노출된 아미노산 세트로 대체하여 결합 특이성이 보유된 인간화된, 예를 들면 설치류 항체를 생성한다.
CDR 그래프팅(유럽 특허 제0,239,400호; 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 재표면화 (유럽 특허 제0,592,106호; 유럽 특허 제0,519,596호; [Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498]; [Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814]; 및 [Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973]) 및 쇄 셔틀링(미국 특허 제5,565,332호)를 비롯한 다양한 다른 기법에 의해 항체가 인간화될 수 있다. 인간 항체는 파지 디스플레이 방법(미국 특허 제4,444,887호, 제4,716,111호, 제5,545,806호 및 제5,814,318호; 및 제WO 98/46645호, 제WO 98/50433호, 제WO 98/24893호, 제WO 98/16654호, 제WO 96/34096호, 제WO 96/33735호 및 제WO 91/10741호 참조), 트랜스제닉 동물, 예를 들면 설치류 이용(암젠(Amgen), 키린(Kirin) 및 메다렉스(Merdarex) 마우스), 키메릭 세포 이용 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는 당분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
"항체 상동체" 또는 "상동체"란 본원에 개시된 바와 같은 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 특이적으로 결합하는 임의의 분자를 의미한다. 따라서, 항체 상동체는 예를 들면 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 대한 결합과 같은 흥미있는 생물학적 성질이 보유된 개질되거나 개질되지 않은 천연 또는 재조합 항체, 항체의 일부, 예를 들면 Fab 또는 Fv 분자, 단일 쇄 항체, 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 폴리펩타이드 등을 포함한다. 상동체의 아미노산 서열은 천연 발생 항체와 동일할 필요는 없고, 개선되거나 다른 유리한 성질을 갖는 폴리펩타이드가 수득되도록 치환된 아미노산, 삽입된 아미노산, 결실된 아미노산, 단백질에서 정상적으로 발견되는 20개 이외의 아미노산 등을 갖도록 변형되거나 개질될 수 있다.
상동성 서열을 갖는 항체는 본 발명의 연장된 I형 글라이코스핑고지질 항체의 아미노산 서열과 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직하게는 상동성은 본 발명의 항체의 가변 영역의 아미노산 서열에 대해 비교된다. 본원에서 아미노산 서열에 대해 적용되는 "서열 상동성"은 예를 들면 [Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988)]에 따른 FASTA 서치 방법에 의해 측정하였을 때 약 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열로 한정된다.
상기 개시된 키메릭 항체는 항체의 서로 다른 부분이 서로 다른 공급원, 예를 들면 서로 다른 항체, 서로 다른 클래스의 항체, 서로 다른 동물 종에서 유래된 항체이고, 예를 들면 쥐과 모노클론 항체에서 유래된 가변성 영역이 인간 면역글로불린 불변 영역과 쌍을 이룬 항체 등이다. 따라서, 인간화된 항체는 키메릭 항체의 일종이다. 키메릭 항체의 제조 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 [Morrison, 1985, Science 229:1202]; [Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214]; [Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202]; 및 미국 특허 제5,807,715호, 제4,816,567호 및 제4,816,397호를 참고할 수 있다.
인공 항체는 scFv 절편, 키메릭 항체, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디 및 mur([Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299]; 및 [Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11 :548-557] 참조)를 포함하고, 이들은 각각 항원-결합 또는 에피토프-결합 능력을 갖고 있다. 단일 쇄 Fv 절편(scFv)에서, 항체의 VH 및 VL 도메인은 가요성 펩타이드에 의해 연결되어 있다. 전형적으로 링커는 약 15개 아미노산의 펩타이드이다. 링커가 훨씬 더 작다면, 예를 들어 5개의 아미노산이라면 다이아바디가 형성되고, 이는 2가의 scFv 이량체이다.
흥미있는 항체의 작용성 등가물 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 용어 "작용성 등가물"은 상동 서열을 갖는 항체, 항체 상동체, 키메릭 항체, 항체 변이체, 항체 유도체, 인공 항체 및 개질된 항체를 포함하고, 여기서, 각각의 작용성 등가물은 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 대한 결합 능력으로 정의된다. 당 분야의 숙련자는 "항체 절편"이라 불리는 분자 군과 "작용성 등가물"이라 불리는 군이 겹친다는 것을 이해할 것이다. 연장된 I형 글라이코스핑고지질 결합 능력이 유지된 기능적 등가물의 제조 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면 제WO 93/21319호, 유럽 특허 제239,400호, 제WO 89/09622호, 유럽 특허 제338,745호 및 유럽 특허 제332,424호에 개시되어 있다.
본원의 작용성 등가물은 또한 개질된 항체, 예를 들면 임의의 유형의 분자의 항체로의 공유 결합에 의해 개질된 항체를 포함한다. 예를 들면 개질된 항체는 글라이코실화, 아세틸화, 펙화, 탈아미드화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/블록킹기에 의한 유도체화, 단백질가수분해성 분해, 세포 리간드로의 연결, 독소 또는 세포독성 잔기 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해 개질된 항체를 포함한다. 공유결합 부착이 항-이디오유형 반응을 생성하는 면역성 항체를 생성할 필요는 없다. 개질은 특이적 화학적 분해, 아세틸화, 폼일화, 물질대사 합성, 화학적 컨쥬게이션 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는 공지된 기법에 의해 달성될 수 있다. 또한, 개질된 항체는 하나 이상의 비-전형적인 아미노산을 함유할 수 있다.
결합 친화성의 최적화를 허용하는 많은 기법이 당 분야의 숙련자들에게 이용가능하다. 전형적으로, 기법은 흥미로운 부위에서의 다양한 아미노산 잔기의 차환, 및 이어서 동족 항원 또는 에피토프에 대한 돌연변이 폴리펩타이드의 결합 친화성의 스크리닝 분석을 포함한다.
일단 항체가 확인되고 단리되면, 하나 이상의 아미노산 잔기가 예를 들면 항체의 하나 이상의 초가변성 영역에서 변화되는 항체 변이체 또는 돌연변이 또는 뮤테인(mutein)을 생성하는 것이 종종 유용하다. 다르게는, 또는 추가로, 프레임워크 잔기의 하나 이상의 변형(예를 들면 치환)이 항체에 도입되어 이로 인해 연장된 I형 글라이코스핑고지질에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화성이 개선될 수 있다.
개질될 수 있는 프레임워크 영역 잔기의 예는 직접적으로 항원에 비-공유결합적으로 결합하는 것들([Amit et al., Science 233:747-753 (1986)]); CDR의 공간배열과 상호작용하거나 영향을 미치는 것들([Chothia et al., J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)]); 및/또는 VL-VH 계면에 참여하는 것들(유럽 특허 제239400호)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이런 프레임워크 영역 잔기의 하나 이상의 개질은 동족 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 개선시킨다. 본 발명의 특정 실시양태에서는 예를 들면 약 1 내지 약 5개의 프레임워크 잔기가 변형될 수 있다. 종종 초가변성 영역 잔기중 어느 것도 변화되지 않는 경우에조차, 전임상 시험에 이용하기에 적합한 항체 돌연변이를 생성하는데 충분할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 항체 돌연변이체는 하나 이상의 초가변성 영역 변형을 포함할 수 있다. 바람직하거나 보다 바람직한 작동자 성질을 수득하기 위해서 불변 영역 또한 변형될 수 있다.
특히 모 항체의 출발 결합 친화성이 무작위 생성된 항체 돌면변이체가 본원에 개시된 바와 같은 분석법에서 변화된 결합에 대해 쉽게 스크리닝될 수 있는 정도인 경우, 변화되는 초가변성 영역 잔기는 무작위로 변화될 수 있다.
항체 돌연변이체, 예를 들면 CDR 돌연변이체를 생성하기 위한 한가지 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이"([Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]; 및 [Cunningham & Wells, Proc Nat. Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991])이다. 하나 이상의 초가변성 영역 잔기를 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기로 대체한다. 그런 다음, 치환 부위에서 또는 이를 위해 다른 돌연변이를 추가로 도입함으로써 치환에 대해 작용 민감성을 나타내는 이들 초가변성 영역 잔기를 다듬는다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입할 부위가 미리 결정되지만, 돌연변이의 성질 그 자체는 미리 결정될 필요가 없다. 스캐닝된 잔기의 바람직한 성질에 따라, 다른 아미노산을 이용하여 유사한 치환을 시도할 수 있다.
개질될 아미노산 잔기를 확인하는 보다 체계적인 방법은 연장된 I형 글라이코스핑고지질의 결합에 관여하는 초가변성 영역 잔기 및 연장된 I형 글라이코스핑고지질 결합에 거의 관여하지 않거나 전혀 관여하지 않는 초가변성 영역을 확인하는 것을 포함한다. 비-결합 초가변성 영역 잔기의 알리닌 스캔을 수행하고, 여기서 각각의 ala 돌연변이체를 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 결합 개선에 대해 시험한다. 다른 실시양태에서, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 결합에 유의하게 관련되는 잔기들이 개질될 것으로 선택된다. 개질은 대상 잔기에 인접하여 하나 이상의 잔기를 삽입하거나 잔기를 결실하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 보통 개질은 잔기의 다른 아미노산으로의 치환을 포함한다. 보존성 치환이 제 1 치환일 수 있다. 이런 치환이 생물학적 활성(예를 들면 결합 친화성)을 변화시키면, 더 많은 실질적 변화를 수득할 수 있는지를 측정하기위해 다른 보존성 치환을 수행할 수 있다.
보통 그 부위를 차지하는 아미노산과는 그 성질이 보다 실질적으로 상이한 아미노산을 선택함으로써 항체 범위 및 생물학적 성질의 제시를 보다 더 실질적으로 개질시킬 수 있다. 따라서, (a) 치환 영역의 폴리펩타이드 주쇄의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 배좌, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크성을 유지하면서 이런 치환이 만들어질 수 있다.
예를 들면 천연 발생 아미노산은 공통적인 측쇄 성질에 근거하여 다음과 같은 군들로 나누어질 수 있다:
(1) 소수성: 메티오닌(M 또는 met), 알라닌(A 또는 ala), 발린(V 또는 val), 루신(L 또는 Leu) 및 아이소루신(I 또는 ile);
(2) 중성, 친수성: 시스테인(C 또는 cys), 세린(S 또는 ser), 트레오닌(T 또는 thr), 아스파라긴(N 또는 asn) 및 글루타민(Q 또는 gln);
(3) 산성: 아스파트산(D 또는 asp) 및 글루탐산(E 또는 glu);
(4) 염기성: 히스티딘(H 또는 his), 라이신(K 또는 lys) 및 아르기닌(R 또는 arg);
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: 글라이신(G 또는 gly) 및 프롤린(P 또는 pro); 및
(6) 방향족: 트립토판(W 또는 trp), 타이로신(Y 또는 tyr) 및 페닐알라닌(F 또는 phe).
비-보존성 치환은 아미노산의 다른 군의 아미노산으로의 교환을 수반할 수 있다. 보존성 치환은 아미노산의 그 군내의 다른 아미노산으로의 교환을 수반할 수 있다.
바람직한 아미노산 치환은 예를 들면 (1) 단백질가수분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 결합 친화성을 변화시키고, (4) 이런 유사체의 다른 물리-화학적 또는 작용적 성질을 부여 또는 개질시키는 것들을 포함한다.
유사체는 천연 발생 펩타이드 서열과는 다른 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들면 단일 또는 다중 아미노산 치환(바람직하게는 보존성 아미노산 치환)이 천연 발생 서열(바람직하게는 분자간 접촉부를 형성하는 도메인 외부의 폴리펩타이드의 부분)에서 만들어질 수 있다. 보존성 아미노산 치환은, R 기 또는 측쇄의 벌크성 또는 배좌 변화를 제외하고는, 모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야만 한다(예를 들면 아미노산의 대체가 모 서열에서 발생하는 나선을 끊는 경향이 있거나, 모 서열의 특징인 다른 유형의 2차 구조를 방해해서는 않된다)([Proteins, Structures and Molecular Principles, Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)]; [Introduction to Protein Structure, Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)]; 및 [Thornton et al. Nature 354:105 (1991)]).
보통, 개선된 생물학적 성질을 갖는 항체 돌연변이체는 모 항-인간 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인중 하나의 아미노산 서열과 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 및 종종 95% 이상의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 모 항체 서열에 대한 동일성 또는 유사성은, 최대 서열 동일성%가 달성되도록 서열을 정렬하고, 필요한 경우 간극을 도입한 후, 모 항체 잔기와 동일(즉, 동일한 잔기)하거나 유사한(즉, 공통 측쇄 성질에 근거하여 동일한 군에서 나온 아미노산 잔기) 후보자 서열중의 아미노산 잔기의 %로서 정의된다.
다르게는, 항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체의 중쇄 및 경쇄의 FR 및 CDR 영역, 또는 Fc 영역의 체계적인 돌연변이에 의해 항체 돌연변이체가 생성될 수 있다.
항체 돌연변이를 생성하는 다른 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화성 돌연변이를 이용하는 것을 포함한다([Hawkins et al., J MoI Biol 254:889-896 (1992)] 및 [Lowman et al., Biochemistry 30(45): 10832-10838(1991)]). 박테리오파지 코트-단백질 융합체([Smith, Science 228:1315 (1985)]; [Scott & Smith, Science 249:386 (1990)]; [Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 8:309 (1990)]; [Devlin et al. Science 249:404 (1990)]; [Wells & Lowman, Curr Opin Struct Biol 2:597 (1992)]; 및 미국 특허 제5,223,409호)는 디스플레이된 단백질 또는 펩타이드의 표현형을 이들을 암호화하는 박테리오파지 입자의 유전형과 연결시키는데 유용한 것으로 알려져 있다. 항체의 Fab 도메인 또한 파지 상에 디스플레이된다([McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990)]; [Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7978 (1991)]; 및 [Garrard et al. Biotechnol 9:1373 (1991)]).
1가 파지 디스플레이는 단백질 변이체 세트를 파지 입자 상에 박테리오파지 코트 단백질의 융합체로서 디스플레이하는 것으로 구성된다([Bass et al., Proteins 8:309 (1990)]). 다양한 단백질의 친화성 성숙, 또는 결합 친화성 평형의 개선은 항체의 Fab 도메인을 이용한 접근법([Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 91 :3809 (1994)]; 및 [Yang et al., J MoI Biol 254:392 (1995])을 이용할 뿐 아니라, 연속적인 돌연변이의 적용, 1가 파지 디스플레이 및 기능 분석([Lowman & Wells, J MoI Biol 234:564 578 (1993)]; 및 미국 특허 제5,534,617호)을 통해 이전에 달성되어왔다.
서열의 한정된 위치에서 상이한 많은(예를 들면 106 이상) 단백질 변이체의 라이브러리가 각각이 특정한 단백질 변이체를 암호화하는 DNA를 함유하는 박테리오파지 입자 상에 구축될 수 있다. 따라서, 여러 초가변성 영역 부위(예를 들면 6 내지 7개 부위)가 돌연변이되어 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 부동화된 항원을 이용한 친화성 정제 사이클 후에, 개별적인 박테리오파지 클론이 단리되고, 디스플레이된 단백질의 아미노산 서열이 DNA로부터 추론된다.
항체 돌연변이를 생산한 후, 모 항체에 대한 그 분자의 생물학적 활성을 본원에 개시된 바와 같이 측정할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 활성 또는 물리적 성질의 측정을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체 돌연변이체의 패널을 제조하고, 항원에 대한 결합 친화성에 대해 스크리닝한다. 스크리닝에서 선택된 하나 이상의 항체 돌연변이체를 선택적으로 하나 이상의 추가의 생물학적 활성에 대해 분석하여 항체 돌연변이체가 새롭거나 개선된 성질을 갖는지 확인한다. 바람직한 실시양태에서, 항체 돌연변이체는 모 항체와 유사하거나 또는 더 좋은/더 높은 결합 친화성으로 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는 능력을 보유한다.
다르게는, 또한 다가 파지([McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554]; 및 [Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628])를 이용하여 (예를 들면 실수하기 쉬운 DNA 중합효소를 이용함으로써 생성되는) 무작위 점 돌연변이를 발현시켜 파지 항체 절편의 라이브러리를 생성한 후, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 친화성에 대해 스크리닝할 수 있다([Hawkins et al., [1992] J MoI Biol 254:889-896]).
바람직하게는, 친화성 성숙 과정 동안, 복제가능한 발현 벡터는 전사 조절 요소의 엄격한 제어를 받고, 배양 조건은 융합 단백질의 하나 이상의 카피(copy)를 디스플레이하는 입자의 양 또는 수가 약 1% 미만이 되도록 조절된다. 또한 바람직하게는, 융합 단백질의 하나 이상의 카피를 디스플레이하는 입자의 양은 단일 카피의 융합 단백질을 디스플레이하는 입자의 양의 약 10% 미만이다. 바람직하게는 양은 약 20% 미만이다.
본원에서 이용되는 다른 등가적 문구는 항원 결합 부분이고, 이는 I형 글라이코스핑고지질 에피토프에 결합하는 관심 항체의 그 부분에 관한 것이다. 원래의 항체에 대해 만들어질 수 있는 다양한 개질을 설명하기 위해 본원에서 사용되는 모든 문구 및 용어는 "항원 결합 부분"이라는 문구의 범위 이내에 포함되는 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들면 항체 절편, 예를 들면 Fab 분자, Fv 및 scAb, mru, 임의의 이런 기능적 절편, 항체 변이체, 예를 들면 이의 1차 아미노산 서열에서의 변화를 함유하는 분자 또는 대립인자, 유도체, 예를 들면 키메릭 항체 또는 인간화된 항체, 유사체 (관심 항체의 유전적으로 개질된 형태를 포함하는 기능적 등가물 포함), 본원에 개시된 항체 유사체 등이 "항체 결합 부분"이라는 문구에 포함된다.
이렇게 선택된 항체 돌연변이체는 종종 항체의 의도된 용도에 따라 추가로 개질될 수 있다. 이런 개질은 추가의 아미노산 서열의 변화, 이종 폴리펩타이드로의 융합 및/또는 공유결합 개질을 포함할 수 있다. 예를 들면 항체 돌연변이체의 적절한 배좌를 유지하는데 관여하지 않는 시스테인 잔기는, 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교결합을 방지하기 위해, 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 항체에 시스테인을 추가하여 안정성을 개선시킬 수 있다(특히, 항체가 항체 절편, 예를 들면 Fv 절편인 경우).
다른 유형의 항체 돌연변이체는 변화된 글라이코실화 패턴을 갖는다. 이는 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄화수소 잔기를 부가 또는 결실하고/하거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글라이코실 부위를 부가 또는 결실함으로써 달성될 수 있다. 항체의 글라이코실화는 전형적으로 Asn에 대해 N-결합되거나, Ser 또는 Thr에 대해 O-결합된다. 트라이펩타이드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)이 아스파라긴 측쇄에 탄화수소 잔기가 효소적으로 부착되기 위한 흔한 인식 서열이다. 예를 들면 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 푸코스 또는 자일로스가 하이드록시아미노산, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌(5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신 또한 이용될 수 있다)에 결합된다. 원래의 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환하면 O-결합된 글라이코실화 가능성을 개선시킬 수 있다.
항체의 효율이 개선되도록 본 발명의 항체를 작동자 기능에 대해 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 그 영역에서 쇄간 다이설파이드 결합 형성을 허용할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 개선된 내부화 능력을 가질 수 있고/있거나 보체 및 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에 의해 매개되는 세포 사멸을 증가시킬 수 있다([Caron et al., J Exp Med 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993)]). 이런 항체 유도체 또는 유사체는 또한 생체 내에서의 분해에 대해 보다 저항성일 수 있다.
다르게는, 항체는 이중 Fc 영역을 갖도록 조작될 수 있고, 이에 의해 개선된 보체 용균 및 ADCC 능력을 가질 수 있다. [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219 230 (1989)]를 참고할 수 있다.
항체의 공유결합 개질이 본 발명의 범위에 포함된다. 이들은, 적용가능한 경우, 화학적 합성 또는 항체의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 제조될 수 있다. 항체의 표적 아미노산 잔기를 선택된 측쇄와 반응할 수 있는 유기 유도체화 시약 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응시킴으로써 항체의 다른 유형의 공유결합 개질이 분자에 도입된다.
시스테인 잔기를 α-할로아세테이트(및 상응하는 아민), 예를 들면 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응시켜 카복실메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 생성할 수 있다. 시스테인 잔기는 또한 예를 들면 브로모트라이플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 다이설파이드, 메틸 2-피리딜 다이설파이드, p-클로로머쿠리벤조에이트, 2-클로로머큐라-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸과의 반응에 의해 유도화될 수 있다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5 내지 7.0에서 다이에틸파이로카보네이트와의 반응에 의해 유도화될 수 있다. p-브로모페나실 브로마이드를 또한 이용할 수 있고, 이 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트 중에서 수행된다.
라이시닐 및 α 말단 잔기는 석신산 무수물 또는 다른 카복실산 무수물과 반응하여 잔기의 전하를 반전시킬 수 있다. α-아미노-함유 잔기를 유도화시키기 위한 다른 적합한 시약은 이미도에스터, 예를 드면 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트라이니트로벤젠설폰산, O-메틸아이소우레아 및 2,4-펜탄다이온을 포함하고, 아미노산은 글라이옥실레이트를 이용하여 트랜스아미나제-촉매될 수 있다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 여러개의 종래의 시약, 예를 들면 페닐글라이옥살, 2,3-부탄다이온, 1,2-사이클로헥산다이온 및 닌하이드린을 이용한 반응에 의해 개질될 수 있다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 종종 알칼리 반응 조건을 필요로 한다. 또한, 시약은 라이신 및 또한 아르기닌 ε-아미노기와 반응할 수 있다.
타이로실 잔기의 특이적 개질은 방향족 다이아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, N-아세틸이미디졸 및 테트라아니트로메탄을 이용하여 각각 O-아세틸 타이로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성한다. 타이로실 잔기는 125I 또는 131I를 이용하여 요드화되어 방사성면역분석법에 이용하기 위한 라벨링된 단백질을 제조한다.
카복실 측기(아스파틸 또는 글루타밀)는 카보다이이미드(R-N=C=C=R')(여기서, R 및 R'은 서로 다른 알킬 기일 수 있다)와의 반응에 의해 개질될 수 있다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 중성 또는 염기성 조건 하에서 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화된 형태는 본 발명의 범위에 포함된다.
다른 개질은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세린 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화([Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N 말단 아민의 아세틸화 및 임의의 C 말단 카복실기의 아미드화를 포함한다.
다른 유형의 공유결합 개질은 탄화수소 및 글리코사이드의 항체로의 화학적 또는 효소적 커플링을 포함한다. 이들 과정은 N-결합되거나 O-결합된 글라이코실화에 대한 글라이코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 항체의 생산을 요구하지 않는다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당이 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실 기, (c) 유리 설프하이드릴 기, 예를 들면 시스테인의 설프하이드릴 기, (d) 유리 하이드록실 기, 예를 들면 세린, 트리오닌 또는 하이드록시프롤린의 유리 하이드록실 기, (e) 방향족 잔기, 예를 들면 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 것들, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이런 방법은 제WO 87/05330호 및 [ApHn & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pp. 259-306 (1981)]에 개시되어 있다.
항체에 존재하는 임의의 탄화수소 잔기의 제거는 화학적 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 예를 들면 화학적 탈글라이코실화는 항체가 화합물, 트라이플루오로메탄설폰산 또는 등가의 화합물에 노출되어 항체는 손상되지 않은 채 남아있으면서 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당이 분해될 것을 요구할 수 있다. 화학적 탈글라이코실화는 예를 들면 [Hakimuddin et al., Arch Biochem Biophys 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal Biochem 118:131 (1981)]에 개시되어 있다. 항체 상의 탄화수소 잔기의 효소적 분해는 예를 들면 [Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350(1987)]에 개시된 임의의 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제에 의해 달성될 수 있다.
항체의 공유결합 개질의 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 개시된 방식으로 항체를 다양한 비단백질 중합체중 하나, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결하는 것을 포함한다.
프레임워크 내에서 서로 다른 항체 쇄의 서로 다른 CDR을 서로 교환함으로써 또는 다수의 항체로부터 유래된 복합 FR에 의해 기능 등가물이 생성될 수 있다. 따라서, 서로 다른 중쇄, 예를 들면 IgG1 -4, IgM, IgA1 -2 또는 IgD를 치환하여 서로 다른 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체 유형 및 아이소타입을 생성함으로써 주어진 세트의 CDR에 대해 예를 들면 서로 다른 클래스의 항체가 가능하다. 유사하게, 완전히 합성된 프레임워크 이내에 주어진 세트의 CDR을 끼워넣음으로써, 본 발명의 범위 이내의 인공 항체가 생성될 수 있다.
본 발명의 항체 절편 및 기능적 등가물은 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대해 검출가능한 정도의 특이적 결합을 갖는 분자를 포함한다. 검출가능한 정도의 결합은 관심 항체의 결합 능력의 10 내지 100% 범위의 모든 값, 바람직하게는 50% 이상, 60% 이상 또는 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상이다. 관심 항체의 100% 보다 큰 친화성을 갖는 등가물이 또한 포함된다.
CDR은 일반적으로 에피토프 인식 및 항체 결합에 중요하다. 그러나, 항체가 동족 에피토프를 인식하여 결합하는 능력을 방해하지 않고 CDR을 포함하는 잔기가 제조되도록 변화시킬 수 있다. 예를 들면 에피토프 인식에 영향을 미치지 않지만, 항체의 에피토프에 대한 결합 친화성을 증가시키는 변화를 만들 수 있다. 여러 연구가 지식에 근거하여 항체의 서열의 다양한 위치에서 하나 이상의 아미노산 변화를 도입한 효과에 대해 조사하였다.
따라서, 예를 들면 올리고뉴클레오타이드-매개된 부위 지향적 돌연변이, 카세트 돌연변이, 실수하기 쉬운(error-prone) PCR, DNA 셔플링(shuffling), 아미노산 개질 또는 이.콜라이의 돌연변이 균주와 같은 방법을 이용함으로써 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3, 또는 프레임워크 영역의 중쇄 및 경쇄 유전자의 서열을 변화시킴으로써 관심 항체의 등가물이 생성될 수 있다([Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539]; 및 [Adey et al., 1996, Chap. 16, pp. 277-291, in Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press]). 1차 항체의 핵산 서열을 변화시켜 개선된 친화성을 갖는 항체를 생성할 수 있다([Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580]; [Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705]; [Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179]; [Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88]; [Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370]; 및 [Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628]).
"폴리펩타이드 선택"의 반복된 사이클을 이용하여 예를 들면 사이클의 여러 선택에 의해 선택되는 여러 아미노산 변화의 선택에 의해 더 높은 친화성 결합에 대해 선택할 수 있다. 리간드 또는 항체 폴리펩타이드의 아미노산의 제 1 선택 영역이 관련된 제 1 라운드 선택 후에, 리간드의 다른 영역 또는 아미노산을 선택하는 추가의 라운드가 실행된다. 바람직한 친화성 성질이 달성될 때까지 선택 사이클을 반복한다.
개선된 항체는 또한 동물 면역접종, 하이드리도마 형성 및 특정한 특성을 갖는 항체에 대한 선택이라는 표준 기법에 의해 제조된 개선된 특성을 갖는 항체를 포함한다.
"길항제"란 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질과 관련된 하나 이상의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 분자를 의미한다. 길항제는 I형 글라이코스핑고지질을 소비하는 세포의 유지 및 성장을 방해할 수 있다. 길항제에 의한 모든 개입 지점은 본 발명의 목적에서 등가의 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들면 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는 항체를 중화시키는 길항제가 본 발명의 범위에 포함된다.
"작용제"란 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 또는 이를 발현하는 세포의 하나 이상의 생물학적 활성을 활성화시키는 항체, 항체 절편, 컨쥬게이트 등을 의미한다. 작용제는 I형 글라이코스핑고지질을 발현하는 세포의 미토겐(mitogen)으로 작용할 수 있다. 작용제에 의한 모든 개입 지점은 본 발명의 목적에서 등가인 것으로 간주된다. 따라서, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하고, 활성, 예를 들면 분화를 개선시키는 항체는 본 발명의 범위에 포함된다.
용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양액"은 이의 후손을 포함한다. 고의적인 또는 의도적이지 않은 돌연변이로 인해 모든 후손이 예를 들면 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 것을 또한 이해해야한다. 원래의 세포에서 스크리닝하였을 때 관심있는 생물학적 성질 또는 기능이 동일한 후손 변이체 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에서 이용되는 "숙주 세포"는 일반적으로 고안 선택으로 선택된 원핵세포 또는 진핵세포 숙주이다.
세포 유기체, 세포 또는 세포주를 핵산으로 "형질전환"시킨다는 것은 핵산을 표적 세포로 도입하여 핵산이 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합에 의해 복제될 수 있고, 선택적으로 발현됨을 의미한다. 핵산을 이용한 세포 또는 유기체의 "형질전환"은 임의의 암호화 서열이 실제로 발현되든 발현되지 않든 핵산, 예를 들면 발현 벡터가 세포 또는 유기체에 의해 받아들여짐을 의미한다. 용어 "형질전환된 숙주 세포" 및 "형질전환된"은 핵산이 도입된 세포를 의미한다. 전형적인 원핵세포 숙주 세포는 다양한 이.콜라이 균주를 포함한다. 전형적인 진핵세포 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 인간 기원의 세포이다. 도입된 핵산 서열은 숙주 세포와 동일한 종에서 나온 것이거나, 숙주 세포와 다른 종에서 나온 것일 수 있고, 일부의 외래 핵산 및 일부의 동종 핵산을 함유한 하이브리드 핵산 서열일 수 있다.
형질전환체는 또한 바이러스 유래된 요소 또는 담체를 이용한 형질도입(transduction) 또는 감염에 의해 발생할 수 있다.
용어 "벡터"는 트랜스유전자를 적합한 숙주에서 발현시키는데 적합한 제어 서열에 작용가능하게 연결될 수 있는 핵산, 트랜스유전자, 외래 유전자 또는 관심 유전자를 함유한 담체인 핵산 구축물이다. 이런 제어 서열은 예를 들면 전사를 수행하는 프로모터, 이런 전사를 제어하는 선택적 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자일 수 있거나 또는 단지 잠재적인 게놈 삽입체일 수 있다. 일단 적합한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과는 독립적으로 복제되고 기능할 수 있거나, 일부 경우에는 숙주 세포 게놈 또는 다른 핵산으로 통합될 수 있다. 플라스미드가 흔히 사용되는 벡터의 유형이므로, 본원에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 서로 교환되어 사용된다. 그러나, 본 발명은 등가의 담체 작용을 하고, 바이러스, 파지미드, 트랜스포손, 핵산을 갖는 합성 분자, 리포솜 등과 같은 당 분야에 공지되어 있거나 공지되고 있는 다른 형태의 벡터를 포함하고자 한다.
치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축, 농장 동물, 인간이 아닌 영장류, 동물원의 동물, 스포츠 동물 또는 애완 동물, 예를 들면 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯한 포유동물로 분류될 수 있는 임의의 동물을 의미한다.
관심 항체는 본원에 개시되어 있거나 당 분야에 공지되어 있는 분석법에서 이용되거나 스크리닝될 수 있다. 종종, 이런 분석법은 검출가능하게 하는, 예를 들면 라벨링되는 시약을 필요로 한다. 본원에서 이용되는 용어 "라벨"은 분자 또는 단백질, 예를 들면 항체에 직접적 또는 간접적으로 컨쥬게이트될 수 있는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 라벨은 그 자체가 검출가능할 수 있거나(예를 들면 방사성동위원소 라벨, 입자 또는 형광 라벨), 또는 검출가능한 신호를 수득하는 수단일 수 있거나, 효소적 라벨의 경우에서와 같이 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화(변화된 후, 검출가능하다)를 촉매할 수 있다.
본원에서 이용되는 "고형 상"은 본체 또는 분자, 예를 들면 본 발명의 항체가 부착되거나 결합되는 매트릭스를 의미한다. 본원에서 고형 상의 예는 유리(제어 중공 유리), 폴리사카라이드(예를 들면 아가로스), 플라스틱, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 완전히 또는 부분적으로 형성된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 내용물에 따라, 고형 상은 분석 플레이트의 벽을 구성할 수 있고; 다른 실시양태에서는 정제 컬럼(예를 들면 친화성 크로마토그래피 컬럼)에 사용될 수 있다. 따라서, 고형 상은 종이, 비드, 플라스틱, 칩 등일 수 있고, 다양한 물질, 예를 들면 니트로셀룰로스, 아가로스, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 실리콘 등으로부터 제조될 수 있고, 다양한 형태로 사용될 수 있다.
연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 또는 이의 글리칸을 발현하는 세포, 예를 들면 세포막 제조물, 및 또한 정제된 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질이 관심 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 면역원은 천연 공급원으로부터 수득되거나 단리될 수 있거나, 효소적 또는 화학적으로 합성하여 제조될 수 있다. 전체 세포, 예를 들면 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 발현 세포, 천연 공급원 또는 암으로부터 유래된 세포, 예를 들면 암 세포주를 이용할 수 있다. 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 발현하는 세포를 관심 항체를 제조하기 위한 면역원으로 이용할 수 있다. 또한 당 분야에 공지되어 있는, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 갖는 막 제조물을 이용할 수 있다. 이런 세포 및 이의 일부를 진단 분석법에서 항원 공급원으로 이용할 수 있다.
아미노산 서열 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 방법은 올리고뉴클레오타이드-매개된(또는 부위 지향적) 돌연변이, PCR 돌연변이, 및 관심 분자의 이전에 제조된 돌연변이체 또는 비-돌연변이체의 카세트 돌연변이를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다(예를 들면 [Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488 (1985)]를 참조할 수 있다).
본 발명의 항체, 또는 이의 절편, 유도체 또는 유사체(예를 들면 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄, 본 발명의 단일쇄 항체, 또는 본 발명의 항체 뮤테인)의 재조합 발현은 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 항체 절편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 포함한다. 일단 항체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 항체 생산을 위한 벡터를 당 분야에 공지된 재조합 DNA 기법에 의해 생산할 수 있다. 항체 암호화 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터가 구축된다. 방법은 예를 들면 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다.
발현 벡터는 종래의 기법에 의해 숙주 세포로 전달되고, 그런 다음, 형질감염된 세포가 본 발명의 항체 또는 이의 절편을 생산하도록 종래의 기법으로 배양된다. 본 발명의 한 양태에서, 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 암호화하는 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에서 동시 발현될 수 있다.
다양한 숙주/발현 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있다. 이런 발현 시스템은 관심 암호화 서열이 생산되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내며, 또한 적절한 뉴클레오타이드 암호화 서열로 형질전환되거나 형질감염되면 동일 반응계에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 박테리아 세포, 예를 들면 이. 콜라이, 및 진핵 세포가 재조합 항체 분자의 발현에, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현에 흔히 이용된다. 예를 들면, 벡터, 예를 들면 인간 사이토메갈로바이러스에서 나온 주 즉시 초기 유전자 프로모터 요소를 갖는 벡터와 연결된 포유동물 세포, 예를 들면 CHO 세포가 항체를 위한 효과적인 발현 시스템이다([Foecking et al., Gene 45:101 (1986); and Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)]). 식물 및 식물 세포 배양액, 곤충 세포 등이 또한 당분야에 공지된 바와 같이 관심 단백질을 제조하는데 이용될 수 있다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 바람직한 특정한 방식으로 유전자 생성물을 개질하고 처리하는 숙주 세포가 선택된다. 단백질 생성물의 이런 개질(예를 들면 글라이코실화) 및 처리(예를 들면 분해)가 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 서로 다른 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 바람직한 번역후 처리 및 개질을 위한 특정한 특징 및 특이적 기작을 가질 수 있다. 관심있는 발현된 항체의 정확한 개질 및 처리가 보증되도록 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 따라서, 1차 전사체의 적절한 처리, 유전자 생성물의 글라이코실화 및 인산화를 위한 세포 장치를 갖는 진핵세포 숙주 세포가 이용될 수 있다. 이런 포유동물 숙주 세포는 CHO, COS, 293, 3T3 또는 골수종 세포를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기간의 고수율 생산을 위해, 안정된 발현이 바람직하다. 예를 들면 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 제조될 수 있다. 바이러스의 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소(예를 들면 프로모터, 인핸서 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포가 풍부한 매질에서 하루 내지 이틀동안 성장하도록 허용한 후, 선택 배지로 이동시킬 수 있다. 재조합 플라스미드의 선택가능한 마커로 인해 선택에 대한 내성이 부여되고 세포가 플라스미드를 염색체로 안정적으로 통합하여 세포주로 확장될 수 있게 된다. 다르게는, 염색체외 요소를 선택 하에서 세포에 유지시킬 수 있다. 이런 조작된 세포주는 항체 생산에 유용할 뿐아니라 항체 분자와 직접적 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 유용하다.
tk, hgprt 또는 aprt 세포 각각에서의 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제([Wigler et al., Cell 11 :223 (1977)]), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제([Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)]), 메티오닌 설폭시미드의 존재 하에서의 글루타메이트 합성효소([Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006] 및 론자 그룹 리미티드(Lonza Group Ltd.)의 웹사이트 또는 문헌 참조), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제([Lo wy et al., Cell 22:817 (1980)]) 유전자를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다수의 선택 시스템을 사용할 수 있다. 또한, 대사길항물질 저항을 하기 유전자에 대한 선택의 근거로서 이용할 수 있다: dhfr(이는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다([Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980)]; [O'Hare et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)])); gpt(이는 마이코페놀산에 대한 내성을 부여한다([Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981)])); neo(이는 아미도글라이코사이드인 G-418에 대한 내성을 부여한다([Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991)])); 및 hygro(이는 하이그로마이신에 대한 내성을 부여한다([Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]). 재조합 DNA 기법 분야에 공지된 방법을 정규적으로 적용하여 바람직한 재조합 클론을 선택할 수 있고, 이런 방법은 예를 들면 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990)]; [Dracopoli et al., eds., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994)]; 및 [Colberre-Garapin et al., J MoI Biol 150:1 (1981)]에 개시되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(예를 들면 [Bebbington et al., DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)]를 참고할 수 있다). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능하면, 배양액에 존재하는 억제제의 수준을 증가시키면 마커 유전자의 카피의 수가 증가될 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련되어 있기 때문에, 항체의 생산 또한 증가될 것이다([Crouse et al., MoI Cell Biol 3:257 (1983)]).
숙주 세포는 본 발명의 2개 이상의 발현 벡터, 예를 들면 중쇄-유래된 폴리펩타이드를 암호화하는 제 1 벡터, 및 경쇄-유래된 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 벡터로 동시 형질감염될 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 다르게는, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 모두를 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이런 상황에서, 과도한 독성 유리 중쇄를 피하기 위해 중쇄 이전에 경쇄가 위치될 수 있다([Proudfoot, Nature 322:52 (1986)]; 및 [Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)]). 중쇄 및 경쇄에 대한 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해 생산되고, 화학적으로 합성되거나 재조합 발현되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 이후의 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 친화성에 의한 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 등), 원심분리, 용해성 차이, 또는 단백질의 정제에 대한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 절편은 본원에 개시되거나 또는 당 분야에서 달리 공지되어 있는 이종 폴리펩타이드 서열에 융합되어 정제를 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 항체는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 정제된 연장된 I형 구조는 선택적으로 아주방트, 예를 들면 완전 또는 불완전 프롱드(Freund's) 아주방트와 함께, 항원으로 이용될 수 있다. 본 발명의 항체는 폴리클론 항체를 포함할 수 있고, 인간에서의 사용을 최적화하고 항체 그 자체의 용도를 최적화하기 위한 개질화 때문에, 모노클론 항체가 특정 단백질의 생산 및 조작 용이성으로 인해 바람직하다. 폴리클론 항체의 제조 방법은 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다([Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)]).
예를 들면 본원에 예시된 바와 같은 면역원을 토끼, 마우스, 낙타, 래트 등을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 다양한 숙주 동물에 투여하여 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 특이적인 폴리클론 항체를 함유하는 혈청의 제조를 유도할 수 있다. 면역원의 투여는 면역화제, 및 필요한 경우 아주방트의 1회 이상의 주입을 수반할 수 있다. 다양한 아주방트를 이용하여 숙주 종에 따른 면역 반응을 증가시킬 수 있고, 아주방트는 프롱드(완전 및 불완전), 광유, 겔, 알룸(수산화알루미늄), 표면활성제, 예를 들면 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 유화액, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 다이니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 아주방트, 예를 들면 BCG(칼메트-게랑 간균) 및 코리네박테리움 파르붐을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 사용될 수 있는 아주방트의 추가의 예는 MPL-TDM 아주방트(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트)를 포함한다. 면역 프로토콜은 당 분야에 잘 공지되어 있고, 선택된 동물 숙주에서 면역 반응을 이끌어내는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 고안 선택으로서 다양한 기간에 걸쳐 다양한 투여 경로를 이용할 수 있다.
전형적으로 면역원(아주방트와 함께 또는 아주방트 없이)을 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해, 또는 근육내 또는 정맥내 투여에 의해 포유동물에 주사한다. 일부 상황에서, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 발현하는 전체 세포를 이용할 수 있다. 면역원의 성질(즉, 소수성%, 친수성%, 안정성, 순 전하, 등전점 등)에 따라, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 또는 이의 부분을 면역접종되는 동물, 예를 들면 포유동물에서 면역원성이 되거나 보다 면역원성이 되도록 개질하거나 컨쥬케이트시킬 수 있다. 예를 들면 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 또는 이의 일부를 담체에 컨쥬게이트시킬 수 있다. 컨쥬게이션은 컨쥬게이트되는 면역원 및 면역원 단백질중 어느 하나 또는 둘 모두 상의 활성 화학적 작용기를 유도화하여 공유 결합을 형성시키는 화학적 컨쥬게이션, 또는 당 분야에 공지된 다른 방법중 하나를 포함한다. 이런 담체 또는 면역원 단백질의 예는 KLH, 오브알부민, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린, 대두 트립신 억제제 및 불규칙적인 T-헬퍼 펩타이드를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 다양한 아주방트를 이용하여 상기 개시된 바와 같은 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
일단 적합한 제제가 수득되면, 친화성 크로마토그래피, 패닝(panning), 흡착 등과 같은 공지된 분리 기법에 의해 다수의 항체로부터 특정 항체를 분리시키는 것이 가능하다. 이런 식으로, 개별적인 항체 종을 추가의 연구, 예를 들면 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 수득하기 위한 서열 규명을 위해 수득할 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 모노클론 항체를 포함한다. 모노클론 항체는 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]; 미국 특허 제4,376,110호; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)]; 및 [Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas, Elsevier (1981)]에 개시된 바와 같은 하이브리도마 기법, 재조합 DNA 방법, 예를 들면 트랜스펙토마(transfectoma)의 제조 및 이용, 또는 당 분야의 숙련자들에게 공지된 다른 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 모노클론 항체의 생산에 이용될 수 있는 방법의 다른 예는 인간 B-세포 하이브리도마 기법([Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)]; 및 [Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)]), 및 EBV-하이브리도마 기법([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985])을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 이런 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 이의 임의의 서브클래스일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다.
하이브리도마 모델에서, 숙주, 예를 들면 마우스, 인간화된 마우스, 인간의 면역 시스템 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스, 말, 양, 햄스터, 토끼, 래트, 낙타 또는 임의의 다른 적절한 숙주 동물을 면역시켜 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다.
다르게는, 림프구는 시험관내 면역될 수 있다. 그런 다음, 적합한 융합제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성한다([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)]).
일반적으로, 항체-생산 하이브리도마의 제조에서, 인간 기원의 세포가 바람직한 경우 말초 혈액 림프구("PBS")가 이용되고, 인간이 아닌 포유동물 공급원이 바람직한 경우, 비장 세포 또는 림프절 세포가 이용된다. 무한증식 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 또는 인간 기원의 골수종 세포이다. 전형적으로 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 이용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 무한증식 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들면 모 세포에 효소, 하이포잔틴 구아닌 포스포라이보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 HGPRT-결핍 세포의 성잘을 억제하는 물질인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다("HAT 배지").
바람직한 무한증식 세포주는 효과적으로 융합되고 선택된 항체-생산 세포에 의해 항체의 안정한 고수준 생산을 지지하고, 배지, 예를 들면 HAT 배지에 민감한 것들이다. 골수종 세포주 중에는 쥐 골수종 세포주, 예를 들면 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)에서 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래된 것들, 및 버지니아주 매나사스 소재의 아메리탄 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에서 이용가능한 SP2/0, FO 또는 X63-Ag8-653 세포가 있다. 마우스 골수종 세포주 NSO 또한 이용될 수 있다(영국 윌셔 살리스버리 소재의 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(European Collection of Cell Cultures)).
인간 골수종 및 마우스-인간 이종 골수종 세포주 또한 인간 모노클론 항체의 생산을 위해 개시되었다([Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987)]).
다른 대안은 화학적 융합이 아닌 전기적 융합을 이용하여 하이브리도마를 형성하는 것이다. 화학적 융합 대신, B 세포는 예를 들면 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스 또는 다른 형질전환 유전자를 이용하여 무한증식될 수 있다. 예를 들면 [Zurawaki et al., in Monoclonal Antibodies, ed., Kennett et al., Plenum Press, pp. 19-33. (1980)]를 참조할 수 있다. 면역글로불린을 발현하는 트랜스제닉 마우스, 및 인간 B 림프구가 이식된 심한 조합된 면역결핍(SCID) 마우스 또한 이용될 수 있다.
하이브리도마 세포가 성장되는 배양 배지는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 모노클론 항체의 생산에 대해 분석된다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들면 방사성면역분석(RIA), 플루오로사이토메트릭 분석(FACS) 또는 효소-결합된 면역흡착분석(ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 이런 기법은 당 분야에 공지되어 있고, 당 분야의 기술 범위 이내이다. 또한 당 분야에 공지된 바이아코어(Biacore) 시스템을 이용할 수 있다. 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 모노클론 항체의 결합 친화성은 예를 들면 스캐차드 분석에 의해 측정될 수 있다([Munson et al., Anal Biochem 107:220 (1980)]).
바람직한 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 방법에 의해 클론을 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킨다([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)]). 적합한 배양 배지는 예를 들면 둘베코의 개질된 이클 배지(D-MEM) 또는 RPMI-1640을 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
종래의 면역글로불린 정제 방법, 예를 들면 단백질 A 세파로스, 단백질 G 세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 서브클론에 의해 분비된 모노클론 항체를 배양 배지, 복수 액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리 또는 단리한다.
모노클론 항체의 생산을 위해 다양한 방법이 당 분야에 존재하고, 따라서, 본 발명은 이들의 제조를 하이브리도마만으로 제한하지 않는다. 예를 들면 모노클론 항체는 재조합 DNA 방법, 예를 들면 미국 특허 제4,816,567호에 개시된 것들에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 인간 항체는 트랜스제닉 동물, 예를 들면 상기 논의된 KM 마우스로부터 수득될 수 있다. 본원에서, 용어 "모노클론 항체"는 단일 진핵세포, 바이러스 또는 원핵세포 클론으로부터 유래된 항체를 의미한다.
따라서, 연장된 I형 쇄 구조를 발현하는 것으로 공지된 인간 암 세포, 예를 들면 Colo205 세포를 이용하거나, 또는 연장된 I형 쇄 함유 화합물, 예를 들면 글라이코스핑고지질, 예를 들면 Leb/Lea를 항원으로서 이용하여, 동종번식의 또는 트랜스제닉 마우스를 면역시키고, 공지된 바와 같이 부스팅한다. 비장을 수득하고, 세포를 골수종에 융합시키고, 하이브리도마를 제조하고, 배양한다. 예를 들면 포획제로서 Leb/Lea를 이용한 ELISA에 의해 세포 상층액을 스크리닝하였다. 양성 클론을 증폭시켰다. IMH2는 연장된 I형 쇄 구조에 특이적으로 결합하는 마우스 IgG3 모노클론 항체의 한 예이다.
트랜스제닉 마우스 모델을 이용하여, 트랜스제닉 마우스를 연장된 I형 쇄 면역원으로 면역시킴으로써 인간 항체를 생산할 수 있다. 이런 항체는 비용 기준으로 예를 들면 뉴저지주의 메드렉스(Medarex) 및 캘리포니아주의 암젠(CA)에 의해 생산될 수 있다. KM 마우스를 이용하여, GNX-8(IgG1) 모노클론 항체를 추가의 특성화 및 이용에 대해 선택하였다.
GNX-8은 세포독성 항체이다. Colo205 결정암 세포를 표적으로 이용하는 분석법에서, GNX-8은 암 세포주 세포를 용균시켰고, 50 ㎍/ml 이상에서 항체는 배양중인 모든 세포를 용균시켰다. GNX-8은 RBC에 결합하지 않는다. 항체는 결장직장암 세포, 유방암 세포 및 폐암 세포에 결합한다. IMH2와는 달리, GNX-8은 Ley-Lex 또는 Ley에 결합하지 않는다.
본 발명의 모노클론 항체를 암호화하는 DNA는 종래의 방법을 이용하여 쉽게 단리되고 서열이 확인된다(예를 들면 쥐과 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간의 이런 쇄, 인간화된 쇄 또는 다른 공급원에서 나온 쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함)([Innis et al. in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990)] 및 [Sanger et al., Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977)]). 하이브리도마 세포는 이런 DNA의 공급원으로 작용할 수 있다.
일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 위치시킨 후, 발현 벡터를 다르게는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, NSO 세포, COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질전환시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클론 항체를 합성할 수 있다. DNA는 또한 예를 들면 동종 쥐 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나(미국 특허 제4,816,567호; 및 [Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)]), 비-면역글로불린 폴리펩타이드의 코딩 서열의 전부 또는 부분을 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합적으로 연결시킴으로써 개질될 수 있다. 이런 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 본 발명의 항체의 불변 도메인 대신 사용될 수 있거나, 본 발명의 항체의 연장된 I형 글라이코스핑고지질-조합 부위의 가변 도메인 대신 사용되어 키메릭 2가 항체를 생성할 수 있다.
항체는 모노클론 항체일 수 있다. 모노클론 항체의 제조 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들면 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 개질된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 절단되어 중쇄 가교결합을 방지한다. 다르게는, 가교결합이 방지되도록 관련된 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
특이적 에피토프를 인식하는 항체 절편은 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다. 전형적으로, 이들 절편은 손상되지 않은 항체의 단백질가수분해를 통해 유래된다(예를 들면 [Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992)]; 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]를 참조할 수 있다). 예를 들면, 본 발명의 Fab 및 F( ab' )2 절편은 효소, 예를 들면 파파인(Fab 절편 생산) 또는 펩신(F( ab' )2 절편 생산)을 이용한 면역글로불린 분자의 단백질가수분해 분해에 의해 생산될 수 있다. F( ab' )2 절편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다. 그러나, 이들 절편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들면 항체 절편은 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 다르게는 F( ab' )2-SH 절편은 이.콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F( ab' )2 절편을 형성할 수 있다([Carter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992)]). 다른 접근법에 따르면, F( ab' )2 절편은 재조합 숙주 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 절편을 생산하기 위한 다른 기법은 당 분야의 숙련자들에 자명할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 절편(Fv)이고, 예를 들면 제WO 93/16185호를 참고할 수 있다.
인간에서 항체의 생체 내 이용 및 시험관내 검출 분석법을 비롯한 일부 용도의 경우, 키메릭 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메릭 항체를 생산하는 방법은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 [Morrison, Science 229:1202 (1985)]; [Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)]; [Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989)]; 및 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호를 참고할 수 있다.
인간화된 항체는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는 비-인간 종에서 생성된 항체 분자로부터 유래되고, 여기서 이로부터의 하나 이상의 CDR이 인간 면역글로불린 분자에서 나온 FR 영역에 삽입된다. 항체는 예를 들면 CDR 그래프팅(유럽 특허 제0 239,400호; 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호), 베니어링 또는 재표면화(유럽 특허 제O 592,106호; 유럽 특허 제O 519,596호; [Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991)]; [Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994)]; 및 [Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)]), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제5,565,332호)을 비롯한 당 분야에 공지된 다양한 기법을 이용하여 인간화될 수 있다. 인간화된 항체는 인간이 아닌 공급원에서 나온 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 언급되고, 이는 전형적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 [Winter et al. (Jones et al., Nature 321:522 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)]; 및 [Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)]의 방법에 따라, 비-인간 CDR 또는 CDR 서열의 일부를 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이런 "인간화된" 항체는 손상되지 않은 인간 가변 도메인에 비해 실질적으로 더 적은 부분이 비-인간 종에서 나온 상응하는 서열에 의해 대체된 키메릭 항체(미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터 치환된 전형적인 인간 항체이다. 중쇄 불변 영역 및 힌지 영역은 바람직한 효과, 예를 들면 특정 작동자 기능을 달성하기 위한 임의의 클래스 또는 서브클래스에서 나온 것일 수 있다.
종종 인간 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 CDR 도너 항체에서 나온 상응하는 잔기로 대체되어 항원 결합을 변형, 가능하게는 개선시킬 수 있다. 프레임워크 치환은 당 분야에 공지된 방법, 예를 들면 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링, 및 특정 위치에서 이상 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인되고, 예를 들면 미국 특허 제5,585,089호; 및 [Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)]를 참고할 수 있다.
인간화된 항체가 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대해 높은 친화성을 유지하고, 다른 바람직한 생물학적 성질을 보유 또는 획득하는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 인간화된 항체는 모 서열과 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화된 항체 유도체를 분석하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 가상 3차원 면역글로불린 모델이 흔히 이용되고, 당 분야의 숙련자들에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 배좌 구조를 예시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 디스플레이를 조사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서의 일부 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는 후보자 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능해진다. 이런 식으로, 바람직한 항체 특징, 예를 들면 표적 항체에 대한 증가된 친화성이 최대화되도록 FR 잔기가 선택되고 수용체에서 나온 것 및 수입 서열과 조합되며, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 직접적이고 가장 실질적으로 영향을 미치는 것이 CDR 잔기이긴 하다. 또한 관심 성질을 개선시키거나 다른 성질을 제공하도록, 예를 들면 더 큰 친화성을 갖는 결합 또는 더 큰 결합활성을 제공하도록, CDR이 수득되는 모 항체에서 수득된 것과 상이한 하나 이상의 아미노산을 함유하도록 CDR 영역을 개질할 수 있다.
항체의 불변 영역의 일부 지역을 조작하고 변화시켜 모 항체에서 관찰된 것과 상이하거나 모 항체보다 우수한 성질을 갖는 항체 유사체, 유도체, 절편 등을 제공할 수 있다. 따라서, 예를 들면 많은 IgG4 항체가 힌지 영역 부근에서 쇄내 다이설파이드 결합을 형성한다. 쇄내 결합은 모 2가 분자가 불안정해지게 하여 연관된 경쇄를 갖는 중쇄를 포함하는 1가 분자를 형성할 수 있다. 이런 분자는 무작위로 재회합될 수 있다.
개질에 적합한 다른 세트의 아미노산은 중쇄 함유 분자의 Fc 수용체로의 결합 및 결합된 항체의 내부화와 같은 항체 기능에 영향을 미치는 힌지 영역의 아미노산을 포함한다. 이런 아미노산은 약 233 내지 약 237의 잔기(Glu-Leu-Leu-Gly-Gly, 서열 번호:1); 약 252 내지 약 256의 잔기(Met-Ile-Ser-Arg-Thr, 서열 번호:2) 및 약 318(Glu) 내지 약 331(Pro)의 잔기(예를 들면 Lys320, Lys322 및 Pro329 포함)를 IgG1 분자에 포함한다.
인간 환자의 치료에는 완전한 인간 항체가 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열에서 유래된 항체 라이브러리를 이용하여 상기 개시된 파지 디스플레이 방법을 비롯한 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 제WO 98/46645호, 제WO 98/50433호, 제WO 98/24893호, 제WO 98/16654호, 제WO 96/34096호, 제WO 96/33735호 및 제WO 91/10741호를 참고할 수 있다. [Cole et al. and Boerder et al.]의 방법이 또한 인간 모노클론 항체의 제조에 이용가능하다([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); and Boemer et al., J Immunol 147:86 (1991)]).
인간 항체는 또한 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 또한 일부 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들면 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체가 무작위 도입 또는 동종 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포로 도입될 수 있다. 다르게는, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 추가하여, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역을 마우스 배아 줄기 세포로 도입할 수 있다. 동종 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 동시에 또는 따로따로 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자가 비-기능적이 되도록 이를 처리할 수 있다. 특히, JH 영역의 동형 결실은 내인성 항체 생산을 방지한다. 개질된 배아 줄기 세포는 확장되고 배반포로 미세주입되어 키메릭 마우스를 생산한다. 그런 다음, 키메릭 마우스를 키워서 인간 항체를 발현하는 동형 자손을 생성하며, 예를 들면 [Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993)]; [Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993)]; 및 [Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)]를 참고할 수 있다.
트랜스제닉 마우스를 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질, 예를 들면 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 전부 또는 일부를 이용하거나, 또는 이를 함유하는 막 제조물을 이용하여 정상적인 방식으로 면역화하였다. 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 모노클론 항체를 종래의 하이브리도마 기법을 이용하여 면역된 트랜스제닉 마우스로부터 수득할 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 존재하는 인간 면역글로불린 트랜스유전자는 B 세포 분화동안 재배열한 후, 클래스 스위칭 및 체강 돌연변이된다. 따라서, 이런 기법을 이용하여 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 개론에 대해서는 [Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)]를 참고할 수 있다. 인간 항체 및 인간 모노클론 항체의 생산, 및 이런 항체를 생산하기 위한 프로토콜에 대한 논의는 예를 들면 제WO 98/24893호; 제WO 92/01047호; 제WO 96/34096호; 및 제WO 96/33735호; 유럽 특허 제0 598 877호; 및 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 및 제5,939,598호를 참고할 수 있다. 또한, 암젠(캘리포니아주 프레몬트), 젠팜(Genpharm)(캘리포니아주 산 호세) 및 메다렉스 인코포레이티드(Medarex, Inc.)(뉴저지주 프린스톤)와 같은 회사를 이용하여 상기 개시된 것과 유사한 기법을 이용하여 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 인간 항체를 제공할 수 있다.
또한, 인간의 말초 혈액 백혈구, 비장림프구 또는 골수(예를 들면 이스라엘 소재의 XTL 바이오파마슈티칼스(Biopharmaceuticals)의 트라이오마(trioma) 기법)를 이용하여 이식된 마우스를 면역화시킴으로써 인간 mAb를 제조할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 "안내된 선택"으로 언급되는 기법을 이용하여 생산될 수 있다. 이 접근법에서, 선택된 비-인간 모노클론 항체, 예를 들면 마우스 항체를 이용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택이 안내된다([Jespers et al., Bio/Technology 12:899 (1988)]).
재조합 기법을 이용할 경우, 항체 변이체는 세포내 또는 세포질막 주위 공간에서 생산되거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체 변이체가 세포내에서 생산되는 경우, 제 1 단계로서 숙주 세포 또는 용균된 분획인 미립자 부스러기를 예를 들면 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. [Carter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992)]는 이.콜라이의 세포막 주위 공간으로 분비되는 항체의 단리 방법을 개시하고 있다. 간략하게, 세포 페이스트를 나트륨 아세테이트(pH 3.5) 및 EDTA에 노출시킨다. 원심분리에 의해 세포 부스러기를 제거할 수 있다. 항체 변이체가 배지로 분비되는 경우, 이런 발현 시스템에서 나온 상층액은 먼저 일반적으로 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유니트를 이용하여 농축된다. 단백질가수분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들면 PMSF가 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 억제하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포에서 제조된 항체 조성물은 예를 들면 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 단백질 A 또는 단백질 G의 친화성 리간드로서의 적합성은 항체 변이체에 존재하는 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 의존한다. 단백질 A는 IgGl, IgG2 또는 IgG4 중쇄에 근거한 항체를 정제하는데 이용될 수 있다([Lindmark et al., J Immunol Meth 62: 1 (1983)]). 단백질 G는 마우스 아이소타입 및 인간 IgG3에 대해 이용될 수 있다([Guss et al., EMBO J 5: 1567 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들면 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌다이비닐)벤젠이 아가로스에 비해 더 빠른 유속 및 더 짧은 가공 시간을 가능하게 한다. 항체 변이체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABXTM 수지(뉴저지주 필립스버그 소재의 제이티 베이커(JT Baker))가 정제에 유용하다. 회수되는 항체 또는 변이체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기법, 예를 들면 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 아가로스 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피(예를 들면 폴리아스파트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전 또한 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계 후에, 관심 항체 또는 변이체를 포함하는 혼합물을, 바람직하게는 낮은 염 농도(예를 들면 약 0 내지 0.25M 염 농도)에서 수행되는, 약 2.5 내지 4.5의 pH의 용출 완충액을 이용한 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 가할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 또한 당 분야의 숙련자들에게 잘 공지된 기법을 이용하여 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 흉내내는 항-이디오타입 항체를 생성하는데 이용될 수 있다(예를 들면 [Greenspan et al., FASEB J 7:437 (1989)]; 및 [Nissinoff, J Immunol 147:2429 (1991)]를 참조할 수 있다). 예를 들면 다량체화 및/또는 리간드의 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질로의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 이용하여 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 "흉내내는" 항-이디오타입을 생성할 수 있다. 항-이디오타입 또는 이런 항-이디오타입의 Fab 절편의 중화는 치료적 또는 진단 처방 계획에 이용될 수 있다.
본 발명의 항체는 이중특이적 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 모노클론성의, 바람직하게는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본 발명에서 결합 특이성중 하나는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 것이고, 다른 특이성은 임의의 다른 항원, 예를 들면 세포-표면 단백질, 수용체, 수용체 아단위, 리간드, 조직-특이적 항원, 바이러스 단백질, 바이러스-암호화된 엔벨로프 단백질, 약학 활성 시약, 예를 들면 약물, 박테리아-유래된 단백질, 박테리아 표면 단백질 등일 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현에 근거하고, 여기서 2개의 중쇄는 서로 다른 특이성을 갖는다([Milstein et al., Nature 305:537 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 하이브리도마 콰드로마(quadroma)는 이중 단 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 가질 수 있는 약 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성한다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계를 이용하여 달성된다. 유사한 방법이 제WO93/08829호 및 [Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991)]에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 다른 방법은 예를 들면 [Kufer et al., Trends Biotech 22:238-244, 2004]에 제공되어 있다.
바람직한 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 융합된다. 이는 융합중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제 1 중쇄 불변 영역(CH1)을 가질 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합, 및 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체로 동시 형질전환시킨다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부 사항에 대해서는 예를 들면 [Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986)]를 참고할 수 있다.
본 발명에서 이종컨쥬게이트 항체가 또한 예상된다. 이종컨쥬게이트 항체는 2개의 공유결합적으로 연결된 항체로 구성된다. 이런 항체는 예를 들면 면역시스템 세포가 원하지 않는 세포를 향하도록 제안되었다(미국 특허 제4,676,980호). 가교결합제 이용을 비롯한 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용하여 항체가 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 예상된다. 예를 들면 다이설파이드 교환 반응을 이용하거나 티오에스터 결합을 형성함으로써 면역독소를 구축할 수 있다. 이 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 예를 들면 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것들을 포함한다.
또한, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 단일 도메인 항체를 생성할 수 있다. 이 기술의 예는 파지 라이브러리로부터 완전 인간 항체의 단일 도메인의 단리를 개시하고 있는 미국 특허 출원 제20030130496호 뿐만 아니라, 카멜리다에(Camelidae) 중쇄 Ig로부터 유래된 항체에 대한 제WO9425591호에 개시되어 있다.
다르게는, 단일 쇄 항체의 생산에 대해 개시된 기법(미국 특허 제4,946,778호; [Bird, Science 242:423 (1988)]; [Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988)]; 및 [Ward et al., Nature 334:544 (1989)])을 실시할 수 있다. 단일 쇄 항체는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 절편을 연결함으로써 형성되어 단일 쇄 폴리펩타이드를 생성한다. 이.콜라이의 작용성 Fv 절편의 조합에 대한 기법을 또한 이용할 수 있다([Skerra et al., Science 242: 1038 (1988)]). 단일 쇄 항체("scFv") 및 이의 구축 방법은 예를 들면 미국 특허 제4,946,778호에 개시되어 있다. 다르게는, Fab가 유사한 수단에 의해 구축되고 발현될 수 있다. 전체 및 부분적 인간 항체 모두는 전체 쥐 mAb에 비해 덜 면역원성일 수 있고, 절편 및 단일 쇄 항체 또한 덜 면역원성일 수 있다.
본 발명은 폴리펩타이드에 재조합 융합되거나 화학적으로 컨쥬게이트된(공유결합 및 비-공유결합 컨쥬게이트 둘 모두를 포함) 항체를 포함한다. 본 발명의 융합되거나 컨쥬게이트된 항체가 정제 용이성으로 인해 사용될 수 있고, 예를 들면 제WO 93/21232호; 제EP 439,095호; [Naramura et al., Immunol Lett 39:91 (1994)]; 미국 특허 제5,474,981호; [Gillies et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 1428 (1992)]; 및 [Fell et al., J Immunol 146:2446 (1991)]를 참고할 수 있다.
인식 마커 또는 택을 이용함으로써 정제를 용이하게 할 수 있다. 예를 들면 마커는 아미노산 서열, 예를 들면 헥사-히스티딘 펩타이드, 예를 들면 pQE 벡터(캘리포니아주 챠트워쓰 소재의 퀴아겐 인코포레이티드(Qiagen, Inc.)에서 제공된 택일 수 있고, 이중 많은 것들은 상업적으로 이용가능하다([Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989)]). 정제에 유용한 다른 펩타이드 택은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 택([Wilson et al., Cell 37:767 (1984)]) 및 "플랙(flag)" 택을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
[McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)]에 개시된 기법을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 또는 항체 절편을 단리할 수 있다. [Clarkson et al., Nature 352:624 (1991)] 및 [Marks et al., J MoI Biol 222:581 (1991)]는 각각 파지 라이브러리를 이용한 쥐 및 인간 항체의 단리에 대해 개시한다. 후속적인 문헌은 쇄 셔플링에 의한 고 친화성(nM 범위) 인간 항체의 생산([Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)]) 및 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체 내 재조합([Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)])에 대해 개시한다. 따라서, 이들 기법은 모노클론 항체를 단리하기 위한 종래의 모노클론 항체 하이브리도마 기법의 가능한 대안이다.
후보자 항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체를 당 분야에 공지되어 있는 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA), FACS, 웨스턴 면역블럿팅 또는 다른 면역화학 기법에 의해 시험할 수 있다. 따라서, B 세포 또는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 발현 세포를 이용하여 공지된 기법을 이용하여 이에 대한 항체 결합을 검출할 수 있거나, 또는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 또는 이의 일부를 함유하는 적합한 막 제조물 또는 정제되거나 단리된 연장된 I형 쇄 구조를 고형 상에 부착시키고 디자인 선택으로 설정된 분석법에서 포획 요소로서 이용할 수 있다.
특정한 항체 유사체가 인간 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는지를 측정하기 위해, 임의의 종래의 분석 분석법을 이용할 수 있다. 유용한 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 결합 분석법은 FACS 분석, ELISA 분석, 방사성면역분석 등을 이용할 수 있고, 이들은 항체의 인간 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질로의 결합 및 이로부터 생성되는 작용을 검출한다. 본원에 개시된 인간 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 전장 및 가용성 형태가 이런 분석에 유용하다. 항체 또는 유사체의 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 또는 이의 가용성 절편으로의 결합은 항체 또는 유사체가 유래되는 종의 면역글로불린에 특이적인 제 2 항체를 이용함으로써 편리하게 검출될 수 있다. 제 2 항체는 검출가능한 라벨을 갖거나 또는 검출될 수 있는 배열일 수 있다.
항체 또는 유사체가 인간 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는 능력은 인간 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질+ 세포에 결합하는 이의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 특정한 항체 또는 유사체가 인간 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는지를 측정하는데 이용되기에 적합한 연장된 I형 글라이코스핑고지질+ 세포는 예를 들면 세포 표면 상에서 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 발현하는 이용가능한 포유동물 조직 배양 세포이다.
항체 또는 유사체의 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질+ 세포로의 결합은 세포를 예를 들면 시험되는 항체 유사체가 유래된 종의 면역글로불린에 특이적인 형광-라벨링된 2차 항체를 이용하여 세포를 염색함으로써 검출될 수 있다. 형광 활성화된 세포 분류기("FACS")를 이용하여 임의의 결합을 검출 및 정량할 수 있다. 일반적으로 [Shapiro, Practical Flow Cytometry, Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y. (1985)]를 참고할 수 있다.
특정한 항체 또는 유사체가 생체 내에서 순환하는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질+ 세포의 수를 유의하게 감소시키지 않는지를 측정하기 위해서, 항체 또는 유사체를 정상적인 면역 기능을 갖는 포유동물에 투여한지 24시간 이내에 포유동물로부터 단리된 순환하는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질+ 세포의 수를 정량하고, 투여 전의 수, 또는 본 발명의 항체 또는 유사체 대신 무관한 특이성을 갖는 아이소타입-일치된 항체 또는 유사체가 투여된 대조군 포유동물에서의 수와 비교한다. 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체 또는 이의 기능적 일부 또는 유도체가 투여된 동물에서 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질+ 세포의 정량은, 예를 들면 수득된 세포를 항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체에 결합하는 형광-라벨링된 항체 및 또한 T 세포 및 B 세포에 특이적인 라벨링된 항체로 염색한 후, FACS 분석함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 항체는 항체가 인식하거나 특이적으로 결합하는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 에피토프 또는 일부의 측면에서 개시되고 특정될 수 있다. 에피토프는 본원에 개시된 바와 같이 예를 들면 물리적 수단, 예컨대 질량 분광, 사카라이드의 조성 분석, 당이 결합하는 분자, 배좌 에피토프 등에 의해 특정될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 가교반응성의 측면으로 개시되고 특정될 수 있다. 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 및 50% 이상 동일한(당 분야에 공지되고 본원에 개시된 방법을 이용하여 계산됨) 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는 항체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체는 또한 관심 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 결합 친화성의 측면에서 개시되거나 규정될 수 있다. 항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체는 약 10-7 M 미만, 약 10-6 M 미만 또는 약 10-5 M 미만의 KD로 결합할 수 있다. 예를 들면 약 10-8 내지 약 10-15 M 또는 그 이상, 약 10-8 내지 약 10-12 M, 약 10-9 내지 약 10-11 M, 또는 약 10-8 내지 약 10-10 M의 KD 또는 평형 해리 상수를 갖는 항체와 같은 더 높은 결합 친화성의 관심 항체가 유리할 수 있다. 본 발명은 또한 경쟁성 결합을 측정하는 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면 본원에 개시된 면역분석에 의해 측정된, 본 발명의 에피토프에 대한 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 항체는 에피토프에 대한 결합을 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상 경쟁적으로 억제한다.
본 발명은 또한 관심 항체를 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다. 컨쥬게이트는 하기와 같은 2개의 주 성분을 포함한다: 관심 항체, 및 세포-결합제, 세포독성제, 약학적 활성 시약, 약물 등일 수 있는 제 2 성분.
본원에서 사용되는 용어 "세포 결합제"는 세포 표면 상의 분자를 특이적으로 인식하여 결합하는 물질을 의미한다. 따라서, 세포 결합제는 CD 항원, 병원체 항원, 예를 들면 바이러스 항원, 분화 항원, 암 항원, 세포-특이적 항원, 조직-특이적 항원, Ig 또는 Ig-유사 분자 등에 결합하는 것일 수 있다.
세포 결합제는 공지되어 있거나 공지될 임의의 유형일 수 있고, 펩타이드, 비-펩타이드, 사카라이드, 핵산, 리간드, 수용체 등, 또는 이의 조합을 포함한다. 세포 결합제는 특이적 또는 비-특이적 방식으로 세포에 결합할 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 일반적으로 물질은 항체(특히 모노클론 항체), 림포카인, 호르몬, 성장 인자, 비타민, 영양소-이동 분자(예를 들면 트랜스페린), 또는 임의의 다른 세포 결합 분자 또는 물질일 수 있다.
사용될 수 있는 세포 결합제의 다른 예는 하기의 것들을 포함한다: 폴리클론 항체; 모노클론 항체; 및 항체의 절편, 예를 들면 Fab, Fab', F( ab' )2 및 Fv 절편([Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983)]; [Spring et al., J. Immunol. 113:470-478 (1974)]; 및 [Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (I960)]).
제 2 성분은 또한 세포독성제일 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능 또는 성장을 감소 또는 차단하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 따라서, 세포독성제는 택솔, 메이탄시노이드, 예를 들면 DM1 또는 DM4, CC-1065 또는 CC-1065 유사체, 리신, 약물, 마이토마이신 C 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 본 발명의 컨쥬게이트의 임의의 결합제와 함께, 관심 항체에 직접적으로 또는 분해가능하거나 분해가능하지 않은 연결기를 통해 공유결합적으로 부착된다.
적합한 메이탄시노이드의 예는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체를 포함한다. 메이탄시노이드는 미소관 형성을 억제하고, 포유동물 세포에 매우 유독하다.
적합한 메이탄시놀 유사체의 예는 개질된 방향족 고리를 갖는 것들 및 다른 위치에서 개질된 것들을 포함한다. 이런 적합한 메이탄시노이드는 미국 특허 제4,424,219호; 제4,256,746호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,362,663호; 제4,364,866호; 제4,450,254호; 제4,322,348호; 제4,371,533호; 제6,333,410호; 제5,475,092호; 제5,585,499호; 및 제5,846,545호에 개시되어 있다.
개질된 방향족 고리를 갖는 적합한 메이탄시놀의 예는 하기의 것들을 포함한다: (1) C-19-데클로로(미국 특허 제4,256,746호)(예를 들면 안사마이토신 P2의 LAH 환원에 의해 제조됨); (2) C-20-하이드록시 (또는 C-20-데메틸)+/-C-19-데클로로(미국 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호)(예를 들면 스트렙토마이세스 또는 악티노마이세스를 이용한 탈메틸화, 또는 리튬 알루미늄 하이드라이드(LAH)를 이용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 (3) C-20-데메톡시.
다른 위치에서의 개질을 갖는 메이탄시놀의 적합한 유사체의 예는 하기의 것들을 포함한다: C-9-SH(미국 특허 제4,424,219호)(메이탄시놀의 H2S 또는 P2S5와의 반응에 의해 제조됨); (2) C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호); (3) C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호)(노카르디아(Nocardia)에서 제조함); (4) C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); (5) C-15-메톡시(미국 특허 제4,313,946호 및 제4,315,929호)(트레위아 누디플로라(Trewia nudiflora)로부터 단리됨); (6) C-18-N-데메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 (7) 4,5-데옥시(미국 특허 제4,371,533호)(메이탄시놀의 삼염화티탄/LAH 환원에 의해 제조됨).
세포독성 컨쥬게이트는 시험관내 방법에 의해 제조될 수 있다. 세포독성제, 약물 또는 전구체를 항체에 연결하기 위해 흔히 연결기가 이용된다. 적합한 연결기는 당 분야에 공지되어 있고, 다이설파이드 기, 티오에터 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티다제 불안정 기 및 에스터라제 불안정 기를 포함한다. 예를 들면, 컨쥬게이트는 다이설파이드 교환 반응을 이용하여 구축될 수 있거나, 또는 관심 항체와 약물 또는 전구약물 사이의 티오에터 결합 형성에 의해 구축될 수 있다.
관심 항체에 컨쥬게이트된 분자는 약학 활성을 갖는 분자, 예를 들면 약물, 예를 들면 작은 분자 또는 생물제제일 수 있다. 생물제제는 예를 들면 사이토카인일 수 있다. 분자는 전구약물, 예를 들면 약물 에스터일 수 있다. 분자는 방사성 핵종일 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 항체를 암호화하는 단리된 핵산 서열 또는 이의 작용성 변이체, 본 발명의 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질-결합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 구축물, 이런 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 결합하는 폴리펩타이드를 생산하기 위한 재조합 기법을 제공한다.
벡터는 보통 당 분야에 공지된 성분을 함유하고, 일반적으로 하기의 것들중 하나 이상을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다: 신호 서열, 복제 기원, 프로모터, 폴리 A 서열, 하나 이상의 마커 또는 선택 유전자, 번역을 촉진하고/하거나 개선시키는 서열, 인핸서 요소 등. 따라서, 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자에서 유래된 것들과 같은 이런 적합한 전사 또는 번역 조절 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 조절 서열의 예는 오퍼레이터, mRNA 라이보솜 결합 부위 및/또는 전사 및 번역, 예를 들면 이의 개시 및 종말을 조절하는 다른 적절한 서열을 포함한다. 조절 서열이 적절한 폴리펩타이드에 대한 뉴클레오타이드 서열과 기능적으로 관련된 경우, 뉴클레오타이드 서열은 "작동가능하게 연결되어 있다." 따라서, 프로모터 뉴클레오타이드 서열이 그 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절하는 경우, 프로모터 뉴클레오타이드 서열은 예를 들면 항체 중쇄 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
또한, 자연적으로는 항체 중쇄 및/또는 경쇄 서열과 연관되지 않은 적절한 신호 펩타이드를 암호화하는 서열이 발현 벡터로 혼입될 수 있다. 예를 들면, 항체가 세포막 주위 공간 또는 배지로 분비되도록, 신호 펩타이드에 대한 뉴클레오타이드 서열(분비성 리더)이 폴리펩타이드 서열에 대해 인-프레임으로 융합될 수 있다. 의도된 숙주 세포에서 작용성인 신호 펩타이드는 적절한 항체 또는 이의 일부의 세포외 분비를 개선시킨다. 신호 펩타이드는 항체가 세포로부터 항체의 분비될 때 펩타이드로부터 분해될 수 있다. 이런 분비 신호의 예는 잘 공지되어 있고, 예를 들면 미국 특허 제5,698,435호; 제5,698,417호; 및 제6,204,023호에 개시된 것들을 포함한다.
벡터는 플라스미드, 단일-가닥 또는 이중-가닥 바이러스 벡터, 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA 또는 DNA 파지 벡터, 파지미드, 코즈미드 또는 관심 트랜스유전자의 임의의 다른 담체일 수 있다. 이런 벡터는 DNA 및 RNA를 세포로 도입하기 위한 잘 공지된 기법에 의해 폴리뉴클레오타이드로서 세포로 도입될 수 있다. 파지 및 바이러스 벡터의 경우, 감염 및 형질도입에 대해 잘 공지된 기법에 의해 벡터를 패키징되거나 캡슐화된 바이러스, 또는 바이러스-유사 입자로서 세포에 도입할 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 적합성(competent)이거나 복제 결함성일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 전파는 일반적으로 보완성 숙주 세포에서만 일어나고, 입자를 생산하는데 필요한 다양한 바이러스 요소를 갖는 다수의 벡터를 이용할 것이다. 본 발명의 관심 DNA 구축물로부터 유래된 RNA를 이용하여 단백질을 생산하는데 세포가 없는 번역 시스템 또한 이용될 수 있다(예를 들면 제WO 86/05807호 및 제WO 89/01036호; 및 미국 특허 제5,122,464호).
본 발명의 항체는 임의의 적합한 숙주 세포로부터 발현될 수 있다. 본 발명에서 유용한 숙주 세포의 예는 원핵세포, 효모, 또는 진핵세포를 포함하며, 관심 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코즈미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물(예를 들면 이.콜라이, 바실러스 섭틸리스(B. subtilis), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 크렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 시겔라(Shigella), 및 또한 바실리(Bacilli), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 액티노마이세테스(Actinomycetes), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 칸디다(Candida), 트라이코데마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora) 및 필라멘트성 진균, 예를 들면 뉴로스포라(Neurospora), 페니실륨(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼길루스(Aspergillus); 항체 코딩 서열을 함유하는 바이러스 발현 벡터(예를 들면 바큘로바이러스(Baculovirus))로 감염된 곤충 세포; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들면 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 또는 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 또는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들면 Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈에서 유래된 프로모터(예를 들면 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 유래된 프로모터(예를 들면 아데노바이러스 후기 프로모터, 또는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 갖는 포유동물 세포 시스템(예를 들면 COS, CHO, BHK, 293 또는 3T3 세포)를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
원핵세포 숙주 세포에서 이용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 표현형 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 표현형 선택가능한 마커 유전자는 예를 들면 항생제 내성을 부여하거나 독립영양 요구조건을 충족하는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 원핵세포 숙주 세포에 유용한 발현 벡터의 예는 상업적으로 이용가능한 플라스미드에서 유래한 것들, 예를 들면 pKK223-3(스웨덴 웁살라 소재의 파마시아 파인 케미칼스(Pharmacia Fine Chemicals)), pGEMl(위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 바이오텍(Pomega Biotec)), pET(위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐(Novagen)) 및 pRSET(캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)), 일련의 벡터([Studier, J MoI Biol 219:37 (1991)]; 및 [Schoepfer, Gene 124:83 (1993)])를 포함한다. 재조합 원핵세포 숙주 세포 발현 벡터에 흔히 이용된 프로모터 서열은 T7([Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987)]), β-락타마제 (페니실리나제), 락토스 프로모터([Chang et al., Nature 275:615 (1978)]; 및 [Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)]), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템([Goeddel et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)]), 및 tac 프로모터([Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)])를 포함한다.
효모 벡터는 종종 복제 서열 기원, 예를 들면 2μ 효모 플라스미드, 자발적 복제 서열(ARS), 프로모터 영역, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결에 대한 서열 및 선택가능한 마커 유전자를 함유할 것이다. 효모 벡터에 적합한 프로모터 서열은 다른 것들 중에서도 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제([Hitzeman et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)]) 또는 다른 해당(glycolytic) 효소([Holland et al., Biochem 17:4900 (1978)]), 예를 들면 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프락토키나제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트라이오스포스페이트 아이소머라제, 포스포글루코스 아이소머라제 및 글루코키나제를 포함한다. 효모 발현에 이용하기위한 다른 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 [Fleer et al., Gene 107: 285(1991)]에 개시되어 있다. 효모에 적합한 다른 프로모터 및 효모 형질전환 프로토콜은 당 분야에 잘 공지되어 있다. 효모 형질전환 프로토콜은 잘 공지되어 있다. 한가지 이런 프로토콜은 [Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978)]에 개시되어 있고, 이는 선택성 배지에서 Trp+ 형질전환체를 선택한다.
척추동물 배양액에서 나왔는지 또는 무척추동물 배양액에서 나왔는지와 무관하게, 임의의 진핵 세포 배양물이 작업가능하다. 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다([Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988)]; [Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., vol. 8, pp. 277-9, Plenum Publishing (1986)]; 및 [Maeda et al., Nature 315:592 (1985)]). 예를 들면, 이종 단백질의 생산에 바큘로바이러스 시스템을 이용할 수 있다. 곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV)를 외래 유전자의 발현을 위한 벡터로서 이용할 수 있다. 바이러스는 스포돕테라 푸르기페다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열을 AcNPV 프로모터(예를 들면 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에서 클로닝할 수 있다. 확인된 다른 숙주는 아에데스(Aedes), 초파리(Drosophila melanogaster) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)를 포함한다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주가 공공연하게 이용가능하고, 예를 들면 AcNPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주이다. 또한 당 분야에 공지된 바와 같이 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 조류, 개구리밥 및 담배의 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다.
배양물(조직 배양물) 중의 척추동물 세포, 및 척추동물 세포의 증식은 일상적인 과정일 수 있고, 예를 들면 독특한 인자를 갖는 특수 배지, 공급기 셀 등을 필요로 하는 배양 조건이 까다로운 세포주도 존재한다([Tissue Culture, Kruse et al., eds., Academic Press (1973)]를 참조할 수 있다). 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장; 인간 배아 신장; 새끼 햄스터 신장; 차이니즈 햄스터 난소(CHO, [Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리(Sertoli); 인간 경부 암종(예를 들면 HeLa); 개의 신장; 인간의 폐; 인간의 간; 마우스 유방 종양; 및 NSO 세포이다.
숙주 세포는 항체 생산용 벡터로 형질전환되고, 사용되는 세포 및 벡터에 적절한 인듀서(inducer) 뿐만 아니라, 성장 인자, 비타민, 무기질 등을 함유하는 종래의 영양 배지에서 배양된다. 흔히 이용되는 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 예를 들면 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40(SV 40) 및 인간 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래된다. SV 바이러스 게놈에서 유래된 DNA 서열을 이용하여 포유동물 숙주 세포의 구조 유전자 서열의 발현을 위한 다른 유전 요소, 예를 들면 SV40 오리진, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 부위 및 폴리아데닐화 부위를 제공할 수 있다. 바이러스 초기 및 후기 프로모터가 바이러스의 복제 기원을 또한 함유할 수 있는 절편으로서 바이러스 게놈으로부터 쉽게 수득되므로, 이들 둘 모두가 특히 유용하다. 포유동물 숙주 세포에서 이용하기 위한 예시적인 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다.
상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들면 햄스(Ham's) F10, 최소 필수 배지(MEM), RPMI-1640 및 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM)이 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, [Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979)] 및 [Barnes et al., Anal Biochem 102:255 (1980)] 및 미국 특허 제4,767,704호; 제 4,657,866호; 제 4,560,655호; 제 5,122,469호; 제 5,712,163호; 또는 제6,048,728호에 개시된 임의의 배지를 숙주 세포용 배양 배지로 이용할 수 있다. 이들 배지중 임의의 것을 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들면 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예를 들면 염화물, 예를 들면 염화나트륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘; 및 포스페이트), 완충액(예를 들면 HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들면 아데노신 및 티미딘), 항생제, 흔적 원소(이는 일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의될 수 있다) 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충할 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물을 디자인 선택으로서 적절한 농도로 포함시킬 수 있다. 세포에 적절하고 트랜스유전자를 바람직하게 발현시킬 수 있는 배양 조건, 예를 들면 온도, pH 등은 당 분야에 공지된 바와 같다.
당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 관심 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있고, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정할 수 있다. 예를 들면 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지되어 있으면, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드(예를 들면 [Kutmeier et al., Bio/Techniques 17:242 (1994)]에 개시됨)로부터 조합한 후 예를 들면 PCR에 의해 결찰된 올리고뉴클레오타이드를 증폭시킬 수 있다.
다르게는, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이를 발현하는 세포의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정한 항체를 암호화하는 핵산 함유 클론이 이용가능하지 않지만 항체 분자의 서열이 공지되어 있는 경우, 본 발명의 핵산을 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포와 같은 항체-생산 세포에 특이적인 것일 수 있는 적합한 공급원, 예를 들면 라이브러리로부터 면역글로불린을 암호화하는 핵산을 수득할 수 있다. PCR 증폭에 적합한 프라이머가 설정될 수 있다. 그런 다음, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 당 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다.
일단 항체의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 뉴클레오타이드 서열의 조작에 대해 당 분야에 공지된 방법, 예를 들면 재조합 DNA 기법, 부위 지향적 돌연변이, PCR(예를 들면 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)]; 및 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)] 참조) 등을 이용하여 예를 들면 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 다른 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산하도록 항체의 뉴클레오타이드 서열을 조작하여 본원에 개시된 것의 등가물을 수득할 수 있다.
당 분야에 잘 공지된 방법을 이용함으로써, 예를 들면 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열과 비교하여 서열 초가변성 영역을 결정함으로써 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 조사하여 CDR의 서열을 확인할 수 있다. 정규적인 재조합 DNA 기법을 이용하여, CDR중 하나 이상을 프레임워크 영역, 예를 들면 인간 프레임워크 영역에 삽입하여 상기 개시된 바와 같이 비-인간 항체를 인간화시킨다. 프레임워크 영역과 하나 이상의 CDR을 조합하여 생성된 관심 폴리뉴클레오타이드는 이에 의해 인식되는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질, 또는 최소한 탄화수소 에피토프 및 구조에 특이적으로 결합하는 분자를 암호화한다. 예를 들면 이런 방법을 이용하여 쇄간 다이설파이드 결합에 참여하는 하나 이상의 시스테인 잔기를 아미노산 치환 또는 결실시켜 하나 이상의 쇄간 다이설파이드 결합이 결여된 항체 분자를 생성한다.
본 발명의 항체 또는 항체 절편을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 시료중에서 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질, 및 따라서 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 발현하는 세포를 검출할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체를 이용하여 조직 또는 이 조직이 유래된 세포에서 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 존재 및 수준을 측정한다. 조직 또는 생체 검사물에서 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 수준을 예를 들면 본 발명의 항체 또는 항체 절편을 이용한 면역분석법으로 측정할 수 있다. 조직 또는 이의 생체 검사물을 동결 또는 고정시킬 수 있다. 동일한 방법 또는 다른 방법을 이용하여 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 다른 성질, 예를 들면 이의 수준, 세포에서의 위치 등을 측정할 수 있다.
상기 개시된 방법은 예를 들면 암에 걸린 것으로 알려져 있거나, 암에 걸린 것으로 의심되는 대상에서 암을 진단하는데 사용될 수 있고, 여기서 상기 환자에서 측정된 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 수준을 정상 기준 대상 또는 표준과 비교한다.
본 발명은 또한 조사 또는 진단 용도에서 사용하기위해 추가로 라벨링된 모노클론 항체, 인간화된 항체, 및 이의 에피토프-결합 절편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 라벨은 예를 들면 방사성라벨, 형광단, 발색단, 영상화제 또는 금속 이온이다.
상기 라벨링된 항체 또는 이의 에피토프-결합 절편을 암, 관절염, 자가면역질환 또는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 발현 및/또는 기능과 관련되거나 이에 의해 야기되거나, 이와 연관된 다른 질병에 걸린 것으로 의심되는 대상에게 투여하고, 대상의 신체 내부에서 라벨의 분포를 측정하거나 모니터링하는, 진단 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 항체 및 이의 절편을 친화성 정제 물질로서 이용할 수 있다. 이 방법에서, 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 항체를 고형 상, 예를 들면 덱스트란 또는 아가로스, 수지 또는 여과지에 고정시킨다. 고정된 항체를 샘플과 접촉시킨다.
진단 용도의 경우, 전형적으로 관심 항체를 검출가능한 잔기 또는 마커로 라벨링할 것이다. 다수의 라벨이 이용가능하고, 이들은 일반적으로 다음과 같은 카테고리로 분류될 수 있다: (a) 방사성동위원소, 예를 들면, 36S, 14C, 125I, 3H 및 131I(항체는 예를 들면 [Current Protocols in Immunology, vol. 12, Coligen et al., ed., Wiley-Interscience, New York (1991)]에 개시된 기법을 이용하여 방사성동위원소로 라벨링될 수 있고, 방사활성은 섬광계수를 이용하여 측정될 수 있다); (b) 형광 라벨, 예를 들면 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트), 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드(형광 라벨은 [Current Protocols in Immunology]에 개시된 기법을 이용하여 항체에 컨쥬게이트될 수 있고, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다), (c) 다양한 효소 기질 라벨(미국 특허 제4,275,149호가 개론을 제공하며, 효소는 일반적으로 다양한 기법을 이용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매하고, 예를 들면 효소는 분광적으로 측정될 수 있는 기질의 색 변화를 촉매하거나, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변화시킬 수 있다). 형광에서의 변화를 정량하는 기법은 공지되어 있고, 예를 들면 루미노미터를 이용하거나, 라벨이 형광 수용체에게 에너지를 준다. 효소 라벨의 예는 루시퍼라제(예를 들면 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시퍼린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 말레이트 데하이드로게나제, 유레아제, 퍼옥시다제, 예를 들면 고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들면 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로환 옥시다제(예를 들면 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 컨쥬게이트하는 기법은 [O'Sullivan et al., Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981)]에 개시되어 있다.
이런 라벨이 이용되는 경우, 하기와 같은 적합한 기질이 이용가능하다: (i) 서양고추냉이 퍼옥시다제의 경우 기질로서 하이드록겐 퍼옥시다제를 이용하고, 여기서 하이드로겐 퍼옥시다제가 염료 전구체(예를 들면 오르노페닐렌 다이아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB)를 산화시킨다); 알칼린 포스파타제(AP)의 경우, 발색단 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트를 이용한다); (iii) β-D-갈락토시다제(β-D-Gal)의 경우 발색단 기질(예를 들면 p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광단 기질, 예를 들면 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제를 이용한다.
당 분야의 숙련자들은 다른 효소-기질 조합을 이용할 수 있다. 일반적인 개론에 대해서는 미국 특허 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참고할 수 있다.
종종, 라벨은 항체에 간접적으로 컨쥬게이트된다. 예를 들면, 항체는 바이오틴에 컨쥬게이트될 수 있고, 상기 언급된 임의의 리포터가 아비딘과 함께 컨쥬게이트될 수 있거나, 또는 그 역이다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서, 라벨은 간접적인 방식으로 항체에 컨쥬게이트될 수 있다. 다양한 아비딘이 당 분야에 공지되어 있다. 다르게는, 라벨의 간접적 컨쥬게이트를 달성하기 위해, 항체를 작은 헵텐(예를 들면 다이곡신)에 컨쥬게이트시키고, 상기 언급된 다른 유형의 라벨 또는 리포터중 하나를 항-다이곡신 항체에 컨쥬게이트시킨다. 따라서, 라벨의 항체 또는 뮤테인과의 간접적인 컨쥬게이션은 제 2 항체를 이용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 항체는 라벨링될 필요가 없고, 이의 존재는 항체에 결합하는 라벨링된 항체인 다른 형태의 제 2 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들면 경쟁성 결합 분석, 직접적 및 간접적 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석에서 이용될 수 있다. [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc. 1987)].
경쟁성 결합 분석은 라벨링된 표준물이 제한된 양의 항체와의 결합에 대해 시험 샘플과 경쟁하는 능력에 근거한다. 시험 샘플 중의 항원의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물의 양에 반비례한다. 결합하게되는 표준물의 양의 측정이 용이해지도록, 항체는 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 불용화된다. 그 결과, 항체에 결합된 표준물 및 시험 샘플은 결합하지 않고 남아있는 표준물 및 시험 샘플로부터 편리하게 분리될 수 있다.
샌드위치 분석법은 각각이 검출될 표적의 서로 다른 면역원 부분, 결정자 또는 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 항체의 이용을 포함한다. 샌드위치 분석법에서는, 분석될 시험 샘플이 고형 지지체 상에 직접적 또는 간접적으로 고정되는 제 1 항체에 결합되고, 그런 다음 직접적 또는 간접적 라벨링된 제 2 항체가 결합된 시험 샘플에 결합하여 불용성 3-부분 복합체를 형성한다. 예를 들면 미국 특허 제4,376,110호를 참고할 수 있다. 제 2 항체는 그 자체가 검출가능한 잔기로 라벨링될 수 있거나(직접적 샌드위치 분석법), 또는 항-면역글로불린 항체 또는 검출가능한 잔기로 라벨링된 결합 쌍(예를 들면 항체/항원, 수용체/리간드, 효소/기질)의 다른 적합한 부재를 이용하여 측정될 수 있다(간접적 샌드위치 분석). 예를 들면 한가지 유형의 샌드위치 분석은 ELISA 분석이고, 여기서 검출가능한 잔기는 효소이다.
면역조직화학의 경우, 세포 또는 조직 시료는 신선하거나, 냉동 상태이거나, 또는 파라핀에 매립되어 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다.
항체는 또한 생체 내 진단 분석을 위해 이용될 수 있다. 일반적으로 항체 또는 이의 변이체를 방사성 핵종(예를 들면 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P 또는 35S)으로 라벨링하여 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 발현하는 부위를 예를 들면 면역섬광조형술 및 감마 카메라를 이용하여 국소화시킬 수 있다.
본 발명은 또한 예를 들면 항체, 이의 절편, 유사체, 이의 유도체 등, 예를 들면 라벨링된 컨쥬게이트 또는 세포독성 컨쥬게이트, 및 항체의 이용을 위한 지침, 특정 세포 유형을 죽이거나 라벨링하기 위한 컨쥬게이트 등을 포함하는 키트를 포함한다. 지침은 항체, 컨쥬게이트 등을 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 이용하기 위한 지시를 포함할 수 있다. 항체는 액체 형태이거나 고형물, 일반적으로 동결건조된 고형물일 수 있다. 키트는 적합한 다른 시약, 예를 들면 완충액, 재구성 용액 및 의도된 용도를 위한 다른 필요 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면 진단 분석 수행을 위한 치료 용도를 위한 사용 지침과 함께 소정 양의 시약의 포장된 조합이 예상된다. 항체가 예를 들면 효소로 라벨링되는 경우, 키트는 효소가 요구하는 조인자 및 기질(예를 들면 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액(예를 들면 블록킹 완충액 또는 용균 완충액) 등과 같은 다른 첨가제를 포함할 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양을 변화시켜 사용자에게 적응성, 공간 절약, 시약 절약 등을 제공하는 시약 용액의 농축물을 제공할 수 있다. 시약은, 용해되었을 때 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 무수 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명의 항체를 이용하여 포유동물을 치료할 수 있다. 한 실시양태에서는, 예를 들면 전임상 자료를 수득할 목적으로 관심 항체 또는 등가물을 인간이 아닌 포유동물에 투여한다. 치료되는 비-인간 동물의 예는 인간이 아닌 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 전임상 연구가 수행되는 다른 포유동물을 포함한다. 이런 포유동물은 항체로 치료되는 질병에 대해 확립된 동물 모델일 수 있거나, 또는 관심 항체의 독성을 연구하기 위해 이용될 수 있다. 이들 실시양태 각각에서, 투여량의 단계적 확대 연구를 포유동물에서 수행할 수 있다. 관심 생성물은 또한 이들 동물에서 치료 용도를 가질 수 있다.
세포독성 인자와 함께 또는 단독으로 투여되는, 항체에 컨쥬게이트되는 치료 잔기와 같은 제 2 성분이 있거나 없는 항체를 치료제로서 이용할 수 있다. 본 발명은 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질-매개되거나 관련된 질환, 질병 또는 상태를 치료하기 위해 동물, 포유동물 또는 인간에게 본 발명의 항체를 투여함을 포함하는 항체-계 치료법에 관한 것이다. 동물 또는 대상은 특정한 치료가 필요한 포유동물, 예를 들면 특정한 질환, 예를 들면 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질과 관련된 질환 또는 비정상적인 연장된 I형 쇄 구조 발현 및 기능과 관련된 질환으로 진단된 포유동물일 수 있다. 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질에 대한 항체가 예를 들면 암 및 자가면역 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 예를 들면 본 발명의 치료학적으로 허용가능한 투여량의 항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체, 또는 다수의 본 발명의 항체 또는 이의 등가물의 칵테일, 또는 다양한 공급원의 다른 항체와 조합되거나, 비-항체 약물, 예를 들면 항-염증성 약물, 세포독성제, 항생제 등, 예를 들면 백금 약물, 메토트렉세이트 등과 조합된 항체를 투여함으로써, 치료되는 포유동물, 특히 인간에서 질병 증상이 완화되거나 예방될 수 있다.
본 발명의 치료 화합물은 본 발명의 항체(본원에 개시된 바와 같은 이의 절편, 유사체, 등가물 포함) 및 항체를 암호화하는 핵산(이의 절편, 유사체 및 유도체 포함), 및 본원에 개시된 바와 같은 항-이디오타입 항체를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 항체는 본원에 개시된 하나 이상의 질병, 질환 또는 상태를 포함하지만 이로 한정되지는 않는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 질환 또는 상태를 치료, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병, 질환 또는 상태의 치료 및/또는 예방은 이들 질병, 질환 또는 상태와 관련된 하나 이상의 증후의 경감을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 항체는 당 분야에 공지되어 있거나 본원에 개시된 약학적으로 허용가능한 조성물로 제공될 수 있다. 용어 "생리학적으로 허용가능한", "약물학적으로 허용가능한", "약학적으로 허용가능한" 등은 동물, 보다 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나, 또는 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거되어 있음을 의미한다.
항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체는 임의의 허용가능한 방식으로 포유동물에 투여될 수 있다. 도입 방법은 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비내, 경막외, 흡입 및 경구 경로, 및 면역억제 치료가 필요한 경우 병소내 투여를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 비경구 주입은 근육내, 피내, 정맥내, 동맥내 또는 복강내 투여를 포함한다. 항체 또는 조성물은 예를 들면 주입 또는 환괴 주사, 상피 또는 점막피부 라이닝(예를 들면 경구 점막, 직장 및 내장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성 물질과 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국소성일 수 있다. 또한, 심실내 및 막내 주입을 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 본 발명의 치료 항체 또는 조성물을 중추신경계로 도입하는 것이 바람직할 수 있고; 심실내 카테너, 예를 들면 옴마야(Ommaya) 저장소와 같은 저장소에 부착된 심실내 카테너에 의해 심실내 주사가 촉진될 수 있다. 또한, 항체는 특히 항체의 투여량을 감소시키는 펄스 주입에 의해 적합하게 투여될 수 있다. 투여가 일시적인지 만성인지에 부분적으로 의존하여, 바람직하게는 주사, 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
리포솜, 미세입자, 미세캡슐 등에서의 캡슐화(예를 들면 [Langer, Science 249:1527 (1990)]); 항체, 이의 뮤테인 또는 이의 항원-결합 부분을 리포솜, 입자, 캡슐 등에서 발현시켜 표적화 비히클을 생성함([Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein et al., eds., p. 353-365 (1989)]; 및 [Lopez-Berestein, p. 317-327]); 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포(예를 들면 [Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)]); 레트로바이러스 벡터 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구축 등을 비롯한 다양한 다른 전달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 항체를 투여하는데 이용될 수 있다.
활성 성분은 또한 예를 들면 코아세르베이션 기법 또는 예를 들면 하이드록시메틸셀룰로스 계면간 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미세캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면 리포솜, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노입자 및 나노캡슐), 또는 거대유화액에 포획될 수 있다. 이런 기법은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)]에 개시되어 있다. 리포솜 또는 입자가 관심 항체를 발현하는 경우, 비-항체 약물, 소분자 약물 등과 같은 다양한 화합물 중 임의의 것이 리포솜에서 운반될 수 있다. 따라서 본 발명의 항체는 표적 작용을 수행할 수 있다.
예를 들면 흡입제 또는 네뷸라이저를 이용하거나, 분무화제와의 배합에 의한 폐 투여를 또한 이용할 수 있다. 항체는 또한 무수 분말 조성물의 형태로 환자의 폐에 투여될 수 있다. 예를 들면 미국 특허 제6,514,496호를 참고할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 치료가 필요한 영역에 본 발명의 치료 항체 또는 조성물을 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있고, 이는 예를 들면 국소 주입, 국소 도포, 주사, 카테터 이용, 좌약, 이식물 이용을 포함하지만, 이로 한정되지 않는 방법에 의해 달성될 수 있고, 상기 이식물은 예를 들면 시알라스틱(sialastic) 막 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 물질이다. 바람직하게는 본 발명의 항체를 투여할 때, 단백질이 흡수되거나 흡착되지 않는 물질을 이용하도록 주의해야한다.
또다른 실시양태에서, 항체는 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시양태에서는 펌프가 이용될 수 있다([Langer, Science 249:1527 (1990)]; [Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987)]; [Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980)]; 및 [Saudek et al., N Engl J Med 321 :574 (1989)]). 다른 실시양태에서는, 중합성 물질을 사용할 수 있다([Medical Applications of Controlled Release, Langer et al., eds., CRC Press (1974)]; [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen et al., eds., Wiley (1984)]; [Ranger et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983)]; [Levy et al., Science 228:190 (1985)]; [During et al., Ann Neurol 25:351 (1989)]; 및 [Howard et al., J Neurosurg 71:105 (1989)] 참고). 또다른 실시양태에서는, 제어 방출 시스템을 치료 표적에 인접하게 위치시킬 수 있다.
지연-방출 제제를 제조할 수 있다. 지연-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형 제품, 예를 들면 필름 또는 매트릭스의 형태이다. 지연-방출 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들면 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 공중합체(예를 들면 락트산-글리콜산 중합체로 구성된 주입가능한 미세구) 및 폴리-D-(-)-하이드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예를 들면 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산이 분자를 100일 이상동안 방출할 수 있지만, 일부 하이드로겔은 단백질을 더 짧은 기간동안 방출한다. 관련된 기작에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들면 응집 기작이 티오-다이설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합인 것으로 발견되면, 설프하이드릴 잔기를 개질시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 함습량을 제어하고, 적절한 첨가제를 이용하고, 아미노산을 치환하고, 특이적 중합체 매트릭스 조성을 개발함으로써 안정화가 달성될 수 있다.
바람직한 정도의 순도를 갖는 폴리펩타이드를 당 분야에서 전형적으로 이용되는 선택적인 "약학적으로 허용가능한" 담체, 희석제, 부형제 또는 안정화제, 즉, 완충제, 안정화제, 방부제, 등장화제, 비-이온성 세제, 산화방지제 및 다른 다양한 첨가제와 혼합함으로써 동결건조된 제형으로 또는 수용액으로서 저장하기 위한 폴리펩타이드 또는 항체의 치료 제제가 제조될 수 있고, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, ed. (19S0)]를 참고할 수 있다. 이런 첨가제들은 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 따라서, 부형제, 희석제, 담체 등은 약학적으로 허용가능하다.
"단리된" 또는 "정제된" 항체에는 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원 또는 배지에서 나온 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화합물이 실질적으로 없다. 문구 "실질적으로 세포 물질이 없는"은 폴리펩타이드/단백질이 이들이 단리되거나 재조합 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 분리되어 있는 항체 준비물을 포함한다. 따라서, 세포물질이 실질적으로 없는 항체는 약 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2.5% 미만 또는 1% 미만(무수 중량 기준)의 오염 단백질 또는 세포 또는 아세포 물질을 갖는 항체 준비물을 포함한다. 항체가 재조합 생산되는 경우, 배양 배지가 실질적으로 없는 것이 바람직하고, 즉, 배양 배지가 단백질 준비물의 약 20체적% 미만, 10체적% 미만, 5체적% 미만, 2.5체적% 미만 또는 1체적% 미만을 나타낸다. 항체가 화학적 합성에 의해 생산되는 경우, 화학적 전구체 또는 다른 화합물 및 시약이 실질적으로 없는 것이 바람직하고, 즉, 관심 항체가 단백질의 합성에 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화합물로부터 분리되어 있다. 따라서, 이런 항체의 준비물은 약 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만(무수 중량 기준)의 화학적 전구체 또는 관심 항체가 아닌 화합물을 갖는다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체는 단리되거나 정제된다.
본원에 개시된 바와 같은 문구 "낮거나 검출되지 않는 수준의 응집"은, 예를 들면 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)에 의해 측정된 단백질 중량을 기준으로 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 및 종종 0.5% 이하의 항체 또는 이의 변이체 응집(즉, 2개 이상의 항체 분자 또는 이의 변이체가 함께 연결되거나 합체됨)을 함유하는 시료를 의미한다.
본원에서 이용되는 문구 "낮거나 검출되지 않는 수준의 절편화"란 총 단백질의 80% 이하, 85% 이하, 90% 이하, 95% 이하, 98% 이하 또는 99% 이하가 HPSEC에 의해 측정하였을 때 단일 피크로 또는 환원된 모세관 겔 전기영동(rCGE)에 의해서는 2개의 피크로 나타나는 손상되지 않은 항체 분자 또는 이의 변이체이고, 총 단백질의 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 2% 이상, 1% 이상 또는 0.5% 이상을 갖는 다른 단일 피크를 나타내지 않는 샘플을 의미한다. 본원에서 이용되는 rCGE는 항체 또는 항체-유형 또는 유도된 분자에서 다이설파이드 결합을 환원시키기에 충분한 환원 조건 하의 모세관 겔 전기영동을 의미한다.
본 발명은 적절한 분자량(mw) 컷오프(예를 들면 F( ab' )2 절편의 경우 30kD 컷오프; Fab 절편의 경우 10kD 컷오프)를 갖는 반투과성 막을 이용하여 정제된 항체의 절편을 약 15 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml, 약 40 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 250 mg/ml, 약 300 mg/ml 또는 그 이상의 농도까지 농축하고, 선택적으로 농축된 항체 절편을 동일한 막을 이용하여 제제 완충액으로 투석여과함을 포함하는, 항체 또는 이의 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질-결합 절편의 액체 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 또한 생체 내에서 개선된 반감기를 가질 수 있는 관심 생성물의 안정한 액체 제형을 포함한다. 따라서 관심 항체는 대상, 바람직하게는 인간에서 3일 초과, 7일 초과, 10일 초과, 15일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2달 초과, 3달 초과, 4달 초과, 5달 초과 또는 그 이상의 반감기를 갖는다.
본원에서 이용되는 용어 "안정성" 및 "안정한"은 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 항체 또는 이의 결합 절편을 포함하는 액체 제형과 관련된 내용에서는 제형 중의 항체 또는 항원-결합 절편의 주어진 가공, 제조, 이동 및 저장 조건 하에서의 열 및 화학적 펴짐(unfolding), 응집, 분해 또는 절편화에 대한 저항성을 의미한다. 본 발명의 "안정한" 제형은 주어진 제조, 준비, 운반 및 저장 조건 하에서 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 이상의 생물학적 활성을 보유한다. 상기 항체 제조물의 안정성은 rCGE, 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 HPSEC를 포함하지만 이로 한정되지 않는 방법에 의해 기준과 비교된, 디자인 선택으로서 선택된 저장 조건하에서의 소정의 기간동안의 응집, 분해 또는 절편화 정도에 의해 평가될 수 있다.
본 발명은 의사 사무실 또는 실험실의 상업적인 냉장고 또는 냉동고에서 발견되는 온도, 예를 들면 약 -20℃ 내지 약 5℃에서 안정성을 갖는 액체 제형을 포함하며, 상기 안정성은 저장 목적의 경우 예를 들면 약 60일, 약 120일, 약 180일, 약 1년 또는 약 2년 또는 그 이상 동안 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)에 의해 평가된다. 본 발명의 액체 제형은 또한 사용하기 전에 실온에서 최소한 몇시간, 예를 들면 약 1시간, 약 2시간 또는 약 3시간동안 HSPEC에 의해 평가된 바와 같은 안정성을 나타낸다.
용어 "담체"는 이와 함께 치료제가 투여되는 희석제, 아쥬방트, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이런 생리학적 담체는 멸균 용액, 예를 들면 물 및 오일, 석유 기원, 동물 기원, 식물 기원 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 호마유 등일 수 있다. 약학 조성물이 정맥내 투여되는 경우 물이 적합한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액 또한 액체 담체로 사용될 수 있고, 특히 주사용 용액을 위해 사용될 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지 우유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 필요한 경우 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제형, 데포(depot) 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들면 트라이글리세라이드를 이용하여 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예를 들면 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등, 향료, 착색제, 취기제 등을 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예는 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," Martin]에 개시되어 있다. 이런 조성물은 효과량의 담체와 함께 바람직하게는 정제된 형태의 효과량의 화합물을 함유하여 환자에게 적절한 투여 형태를 제공할 것이다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 제형은 투여 방식에 적합하도록 구성된다.
완충제는 pH가 생리적 조건 또는 항체 안정성에 도움이 되는 조건에 가까운 범위로 유지되는 것을 돕는다. 완충액은 바람직하게는 약 2mM 내지 약 50 mM의 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제는 유기산 및 무수산, 및 이의 염, 예를 들면 시트레이트 완충제(예를 들면 모노나트륨 시트레이트-다이나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-트라이나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노나트륨 시트레이트 혼합물 등), 석시네이트 완충제(예를 들면 석신산-모노나트륨 석시네이트 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-다이나트륨 석시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제(예를 들면 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 나트타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충제(예를 들면 푸마르산-모노나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-다이나트륨 푸마레이트 혼합물, 모노나트륨 푸마레이트-다이나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제(예를 들면 글루콘산-나트륨 글라이코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제(예를 들면 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제(예를 들면 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제(예를 들면 아세트산-나트륨 아세테이트 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)을 포함한다. 포스페이트 완충제, 카보네이트 완충제, 히스티딘 완충제, 트라이메틸아민 염, 예를 들면 트리스(Tris), HEPES 및 다른 이런 공지된 완충제를 사용할 수 있다.
방부제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있고, 약 0.2% 내지 약 1% (w/v)의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명에 이용하기 적합한 방부제는 페놀, 벤질 알콜, m-크레솔, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤질코늄 할라이드(예를 들면 클로라이드, 브로마이드 및 요다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소시놀, 사이클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다.
등장화제는 본 발명의 액체 조성물의 생리학적 등장성을 보증하기 위해 존재하고, 폴리하이드릭 당 알콜, 예를 들면 트라이하이드릭 또는 더 이상의 당 알콜, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 폴리하이드릭 알콜은 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여 약 0.1중량% 내지 약 25중량%, 바람직하게는 약 1중량% 내지 약 5중량%의 양으로 존재할 수 있다.
안정화제는 부피증가제부터 치료제를 용해시키거나 변성 또는 용기 벽으로의 부착을 방지하는 것을 돕는 첨가제까지 다양하게 작용할 수 있는 넓음 범위의 부형제를 의미한다. 전형적인 안정화제는 폴리하이드릭 당 알콜; 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 라이신, 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-루신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등; 유기 당 또는 당 알콜, 예를 들면 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 아라비톨, 에리트리톨, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 라이비톨, 미오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등, 예를 들면 이노시톨과 같은 사이클리톨; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 함유 환원제, 예를 들면 우레아, 글루타티온, 티옥트산(thioctic acid), 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오설페이트; 저분자량 폴리펩티아드(즉, <10개 잔기); 단백질, 예를 들면 인간 혈청 알부민, 소의 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈, 사카라이드, 모노사카라이드, 예를 들면 자일로스, 만노스, 프락토스, 글루코스; 다이사카라이드, 예를 들면 락토스, 말토스 및 슈크로스; 트라이사카라이드, 예를 들면 라피노스; 폴리사카라이드, 예를 들면 덱스트란 등일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질의 약 0.1 내지 약 10,000 w/w의 범위로 존재할 수 있다.
추가의 잡다한 부형제는 부피증가제(예를 들면 아가, 젤라틴, 전분 등), 킬레이트화제(예를 들면 EDTA), 산화방지제(예를 들면 아스코브산, 메티오닌 또는 비타민 E) 및 조용매를 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 갖는, 즉, 반대되는 용해성 성향의 기, 전형적으로 오일 용해성 탄화수소 쇄 및 수용성 이온 기로 구성된 유기 물질을 지칭한다. 계면활성제는 표면 활성 잔기의 전하에 따라 음이온성, 양이온성 및 비이온성 계면활성제로 분류될 수 있다. 계면활성제는 종종 다양한 약학 조성물 및 본원에 논의된 바와 같은 생물학적 물질의 제조를 위해 습윤제, 유화제, 용해제 및 분산제로서 이용된다.
비-이온성 계면활성제 또는 세제(또한 "습윤제"로 공지되어 있다)는 치료제의 용해를 돕기위해 그리고 진탕-유도되는 응집으로부터 치료 단백질을 보호하기 위해 첨가될 수 있고, 이는 또한 제형이 단백질을 변성시키지 않고 전단 표면 응력에 노출되는 것을 허용한다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉(Pluronic: 등록상표) 폴리올 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에터(트윈-20(등록상표), 트윈-80(등록상표) 등)를 포함한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "무기 염"은 산 수소의 일부 또는 전부 또는 산이 금속 또는 금속처럼 적용하는 기로 대체됨으로 인해 탄소를 함유하지 않고, 종종 약학 조성물 및 생물학적 물질의 제조에서 장력 조절 화합물로서 이용되는 임의의 화합물을 의미한다. 가장 흔한 무기 염은 NaCl, KCl, NaH2PO4 등이다.
본 발명은 약 5.0 내지 약 7.0, 또는 약 5.5 내지 6.5, 또는 약 5.8 내지 약 6.2, 또는 약 6.0의 범위의 pH를 갖는 항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질-결합 화합물 또는 이의 절편의 액체 제형을 제공한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정한 증상에 대해 필요한 하나 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있고, 바람직하게는 서로 부정적인 영향을 미치지 않는 보완성 활성을 갖는 화합물들을 함유할 수 있다. 예를 들면 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다. 제형은 또한 다른 약물, 또는 작은 분자, 약학 제제, 예를 들면 항-신생물제, 예를 들면 시스플라틴을 함유할 수 있다.
용어 "소분자" 및 유사 용어는 펩타이드, 펩티도미메틱, 아미노산, 아미노산 유사체, 유기 화합물, 약학 활성 물질, 예를 들면 약물, 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 약 10,000g/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물(즉, 헤테로유기 및/또는 유기금속 화합물 포함), 약 5,000g/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 1,000g/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 500g/몰 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이런 화합물의 염, 에스터 및 다른 약학적으로 허용가능한 형태를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
따라서, 암의 경우, 본 발명의 항체는 단독으로, 또는 종래의 화학치료제(파클리탁셀, 카보플라틴, 시스플라틴 및 독소루비신), 항-EGFR 시약(게피티닙, 에를로티닙 및 세툭시맙), 항-신생혈관형성제(베바시주맙 및 수니티닙), 및 또한 면역조절제, 예를 들면 인터페론-α 및 탈리도마이드를 비롯한 다른 유형의 암 치료와 함께 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료제"는 비정상적인 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 발현, 및 일반적으로 물질대사 및 활성과 관련된 질병, 질환, 병 등의 치료, 관리 또는 완화에 사용될 수 있는 임의의 시약을 의미한다. 또한 비정상적 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 발현, 물질대사 및 활성과 관련된 질환 등의 치료에서 약리 효과를 갖는 공지된 화합물이 포함된다.
항체 또는 변이체는 선택적으로 문제의 질병을 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 시약과 함께 배합된다. 이런 다른 시약의 효과량은 본 제형에 존재하는 항체의 양, 질병 또는 치료법의 유형, 및 논의된 다른 인자에 의존할 것이다. 이들은 일반적으로 동일한 투여량으로 본원에 개시된 투여 방식으로 또는 이제까지 사용된 투여량의 1 내지 99%로 사용된다.
생체내 투여를 위해 사용되고자 하는 제형은 멸균되어야만 한다. 이는 예를 들면 멸균 여과 막을 통해 여과함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 액체 제형은 0.2 ㎛ 또는 0.22 ㎛ 필터를 이용한 여과에 의해 멸균될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 다양한 작동자 분자, 예를 들면 이종 폴리펩타이드, 약물, 방사핵종 또는 독소에 컨쥬게이트될 수 있고, 예를 들면 제WO 92/08495호; 제WO 91/14438호; 제WO 89/12624호; 미국 특허 제5,314,995호; 및 유럽 특허 제 396,387호를 참고할 수 있다. 항체 또는 이의 절편은 치료적 잔기, 예를 들면 세포 독소(예를 들면 세포증식억제제 또는 살세포제), 치료제 또는 방사활성 금속 이온(예를 들면 α-이미터, 예를 들면 213Bi)에 컨쥬게이트될 수 있다. 세포 독소 또는 세포독성제는 세포에 치명적인 임의의 시약을 포함한다. 예는 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라마이시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토폽사이드, 테노폽사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 다이하이드록시 안트라신다이온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프란올롤 및 푸로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는 대사길항물질(예를 들면 메토트렉세이트, 6-머캡토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 및 데카바진), 알킬화제(예를 들면 메클로에타민, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파마이드, 부설판, 다이브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-다이클로로다이아민 플라티늄(II) (DDP 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들면 다우노루비신, 다우노마이신 및 독솔루비신), 항체(예를 들면 닥티노마이신, 악티노마이신, 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)) 및 세포분열 저지제(예를 들면 빈크라스틴 및 빈블라스틴)을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
생체내에서 항체의 혈청 순환을 연장시키기 위해, 다양한 기법을 이용할 수 있다. 고분자량 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 항체의 N-말단 또는 C말단으로의 부위 특이적 컨쥬게이션을 통해, 또는 라이신 잔기 상에 존재하는 ε 아미노 기를 통해 다작용성 링커를 이용하거나 이용하지 않고, 불활성 중합체 분자, 예를 들면 PEG을 항체에 부착시킬 수 있다. 생물학적 활성을 최소한으로 손실시키는 선형 또는 분지된 중합체 유도화를 이용할 수 있다. 컨쥬게이션 정도는 PEG 분자의 항체로의 적절한 컨쥬게이션이 보증되도록 SDS-PAGE 및 질량 분광에 의해 밀접하게 모니터링될 수 있다. 반응하지 않은 PEG는 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 컨쥬게이트로부터 분리될 수 있다. PEG-유도된 항체는 당 분야의 숙련자들에게 공지된 방법, 예를 들면 본원에 개시된 면역분석을 이용하여 생체 내 효능 뿐 아니라 결합 활성에 대해 시험될 수 있다.
하나 이상의 아미노산 개질(즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인 또는 이의 FcR 결합 도메인(예를 들면 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 절편)에 도입함으로써 증가된 생체 내 반감기를 갖는 항체를 또한 생성할 수 있고, 예를 들면, 제WO 98/23289호; 제WO 97/34631호; 및 미국 특허 제6,277,375호를 참조할 수 있다.
또한 항체를 알부민에 컨쥬게이트시켜 항체가 생체 내에서 보다 안정하게 하거나 생체 내에서 더 긴 반감기를 갖게 할 수 있다. 이러한 기법은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 제WO 93/15199호, 제WO 93/15200호 및 제WO 01/77137호; 및 유럽 특허 제413622호를 참고할 수 있다. 항체는 또한 예를 들면 글라이코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/블록킹 기를 이용한 유도체화, 단백질분해성 분해, 세포 리간드 또는 다른 단백질로의 연결 등에 의해 개질될 수 있다.
이런 치료 잔기의 항체로의 컨쥬게이션 기법은 잘 공지되어 있고, 예를 들면 [Arnon et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), Alan R. Liss (1985)]; [Hellstrom et al., in Controlled Drug Delivery, 2nd ed., Robinson et al., eds., Marcel Dekker (1987)]; [Thorpe, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., eds. (1985)]; [Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al., eds., Academic Press (1985)]; 및 [Thorpe et al., Immunol Rev 62:119 (1982)]를 참조할 수 있다. 다르게는, 항체는 제 2 항체에 컨쥬게이트되어 항체 헤테로컨쥬게이트, 예를 들면 이작용성 항체를 형성할 수 있고, 예를 들면 미국 특허 제4,676,980호를 참조할 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 개질시키기 위해 사용될 수 있고, 치료제 또는 약물 잔기는 전통적인 화학적 치료제로 간주되지만 이로 한정되지는 않는다. 예를 들면 약물 잔기는 바람직한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이런 단백질은 예를 들면 독소, 예를 들면 아브린, 라이신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질 예를 들면 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스 시약, 예를 들면 TNF-α, TNF-β, AIM I(제WO 97/33899호), AIM II(제WO 97/34911호), Fas 리간드([Takahashi et al., Int Immunol, 6:1567 (1994)]), VEGF(제WO 99/23105호); 혈전제; 항-신생혈관형성제, 예를 들면 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 개질제, 예를 들면 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 과립구 거대세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF) 또는 다른 성장 인자를 포함한다.
항체 또는 변이체 조성물은 우수한 의학적 실시와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투여될 것이다. 이 점에서 고려할 인자는 치료되는 특정한 질병, 치료되는 특정한 포유동물, 개별적인 환자의 임상 상태, 질병의 원인, 시약의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의학 실시자에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여되는 항체 또는 변이체의 "치료 효과량"은 이런 고려사항에 의해 지배될 것이고, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 질병, 상태 또는 질환을 예방, 완화 또는 치료하는 데 필요한 최소량일 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "효과량"은 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 관련 또는 연관 질병의 심각성 및/또는 지속 기간을 감소시키거나, 이의 하나 이상의 증후를 개선시키거나, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 관련 또는 연관 질병의 진행을 방지하거나, 또는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 관련 또는 연관 질병의 퇴화를 야기하기에 충분하거나, 또는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 연관 또는 관련 질병 또는 이의 하나 이상의 증후의 진전, 재발, 개시 또는 진행을 방지하거나, 또는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 관련 또는 연관 질환의 치료에 유용한 다른 치료제(예를 들면 다른 치료제)의 예방 및/또는 치료 효과를 개선 또는 개량시키기에 충분한 치료제(예를 들면 예방적 치료제 또는 치료제)의 양을 의미한다. 예를 들면 대상 치료는 기저선 또는 정상 수준을 기준으로 증후를 약 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 이상 감소시킬 수 있다. 한가지 다른 실시양태에서, 치료제 또는 예방적 치료제의 효과량은 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 관련 또는 연관 질환, 예를 들면 암의 증후를 약 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 이상 감소시킨다. 또한 본원에서는 용어 "치료 효과량"이 등가의 의미로서 이용된다.
특정한 질병 또는 질환의 치료에 사용하기에 효과적일 치료적 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 절편의 양은 질병 또는 질환의 성질에 의존할 것이고, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 가능한 경우, 본 발명의 약학 조성물의 투여량 반응 곡선이 먼저 시험관 내에서 유래될 수 있다. 적합한 동물 모델 시스템이 이용가능하다면, 또다시 투여 반응 곡선이 수득되고 당 분야에 공지된 적합한 인간 투여 실시 방법을 외삽하는데 이용될 수 있다. 그러나, 당 분야의 공통적인 지식에 근거하여, 예를 들면 염증 효과를 감소시키는데 효과적인 약학 조성물은 약 5 내지 약 20 ng/ml, 바람직하게는 약 10 내지 약 20 ng/ml의 국소 치료제 농도로 제공될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 치료적 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 절편의 수용액을 피하 주사에 의해 투여할 수 있다. 각각의 투여량은 체중 1kg 당 약 0.5 mg 내지 약 50 mg, 보다 바람직하게는 약 3 mg 내지 약 30 mg의 범위일 수 있다. 투여량은 특정한 질병, 환자 모집단, 투여 방식 등에 대해 경험적으로 확인되고, 당 분야에 공지된 약학적 방법을 실시할 수 있다.
피하 투여를 위한 투여 스케쥴은 질병의 유형, 질병의 심각성 및 치료제에 대한 환자의 민감성을 비롯한 다수의 임상 인자에 따라 1주에 1회 내지 매일 1회 내지 여러 회로 다양할 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 인간에 대한 정맥내 투여에 적당한 약학 조성물로서 일상적인 방식으로 배합된다. 전형적으로 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위의 통증을 완화시키기 위해 국소 마취제, 예를 들면 리도카인 또는 다른 "카인" 마취제 및 가용화제를 포함할 수 있다. 일반적으로 성분은 단위 투여 형태, 예를 들면 무수 동결건조 분말로서 또는 활성 성분의 양을 나타내는 밀봉된 용기, 예를 들면 앰플 또는 샤세 중의 농축물로서 별개로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 멸균된 약학 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병을 이용하여 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 예를 들면 키트로서 제공되어 투여하기 전에 성분을 혼합할 수 있다.
본 발명은 또한 관심 제품의 양을 나타내는 앰플 또는 샤세와 같은 밀봉된 용기에 포장되어 있는 본 발명의 액체 제형을 제공한다. 본 발명의 액체 제형은 항체 또는 항체 절편의 양 및 농도를 나타내는 밀봉된 용기 중에 있을 수 있다. 본 발명의 액체 제형은 예를 들면 약 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml 또는 20 ml의 양으로 적어도 약 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml의 연장된 I형 글라이코스핑고지질 항체를 밀봉된 용기에 공급될 수 있다.
상기 개시된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조물이 제공된다. 제조물은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면 병, 바이얼, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 질환 또는 질병을 진단, 예방 또는 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균된 출입 포트(예를 들면 용기는 피하 주사 바늘이 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이얼일 수 있다)를 가질 수 있다. 용기 상의 또는 이와 연관된 라벨은 조성물이 선택 질환의 치료에 이용됨을 나타낸다. 제조품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예를 들면 포스페이트 완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 또한 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지시서가 있는 포장 삽입물을 비롯한 상업적 기준 또는 사용자 기준에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 또는 이의 작용성 유도체를 유전자 치료에 의해 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 질환을 치료, 억제 또는 방지하기 위해 투여한다. 유전자 치료란 발현된 관심 핵산 또는 발현가능한 관심 핵산을 대상에게 투여함으로서 수행되는 치료를 의미한다. 다르게는, 관심 유전자 서열을 갖도록 조작된 세포를 숙주에 투여한다. 본 발명의 실시양태에서, 핵산은 치료 효과를 매개하는 표적 숙주 세포에서 또는 이에 의해 암호화되는 단백질을 생산한다. 이용가능한 임의의 유전자 치료 방법을 본 발명에 따라 이용할 수 있다.
유전자 치료 방법의 일반적인 개론에 대해서는 [Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488 (1993)]; [Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991)]; [Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573 (1993)]; [Mulligan, Science 260:926 (1993)]; [Morgan et al., Ann Rev Biochem 62:191 (1993)]; 및 [May, TIBTECH 11:155 (1993)]를 참조할 수 있다.
한 양태에서, 화합물은 항체를 암호화하는 핵산 서열, 또는 이의 작용성 결합 절편을 포함하고, 상기 핵산 서열은 적합한 숙주에서 항체 또는 이의 절편 또는 키메릭 단백질 또는 중쇄 또는 경쇄를 발현하는 발현 벡터의 일부이다. 특히 이런 핵산 서열은 다른 조절 서열 뿐만 아니라 항체 또는 항원-결합 코딩 영역에 작용가능하게 연결된 프로모터를 갖고, 상기 프로모터는 유도성 또는 구성적이며, 선택적으로 조직-특이적이다.
다른 특정한 실시양태에서는, 항체 코딩 서열 및 임의의 다른 바람직한 서열이 게놈의 바람직한 위치에서 동종 재조합을 촉진하는 영역의 양쪽에 위치하여 항체-암호화 핵산의 통합 및 염색체내 발현을 제공하는 핵산 분자가 이용된다([Koller et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:8932 (1989)]; [Zijlstra et al., Nature 342:435 (1989)]). 특정 실시양태에서는, 발현된 항체 분자가 단쇄 항체이고; 다르게는 핵산 서열이 항체의 경쇄 및 중쇄 둘 모두 또는 이의 절편을 암호화하는 서열을 포함한다. 다르게는, 통합 방법은 특이적 핵산 서열을 인식하는 특정한 전사 인자, 아연 핑거(finger) 등의 이용을 포함한다.
핵산의 환자로의 전달은, 환자가 핵산 또는 핵산-보유 벡터에 직접 노출되는 직접적 경우, 또는 세포가 시험관 내에서 핵산으로 형질전환된 후 환자에 이식되는 간접적 경우일 수 있다.
한 실시양태에서, 핵산 서열은 생체 내에서 직접 투여되고 발현되어 암호화된 생성물을 생성한다. 이는 당 분야에 공지된 임의의 다수의 방법, 예를 들면 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 항체 암호화 서열을 구축하고, 상기 벡터가 세포 내에 있도록 예를 들면 결함이 있거나 약독화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터(미국 특허 제4,980,286호 참조)를 이용한 감염에 의해, 네이키드 DNA의 직접 주입에 의해, 미세입자 충돌(예를 들면 유전자 총; 듀퐁의 바이올리스틱(Biolistic))을 이용하여, 비-바이러스 벡터, 예를 들면 친수성 핵산에 결합하고 일반적으로 막과 조합하기 위한 소수성 부분을 함유하여 세포와 융합하는 능력을 갖는 양친매성 화합물을 포함하는 합성 조성물을 투여하거나, 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로 코팅하거나, 리포솜, 미세입자 또는 마이크로캡슐에 캡슐화하거나, 핵으로 들어가는 것으로 공지된 펩타이드에 연결된 벡터를 투여하거나, 수용체-매개되어 세포내 이입되는 리간드(예를 들면 [Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)])(이는 특이적으로 수용체를 발현하는 세포 유형을 표적으로 하도록 이용될 수 있다)에 연결된 벡터를 투여하는 등에 의해 달성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 리간드가 융해성 바이러스 펩타이드를 포함하여 엔도솜을 파괴하여 핵산이 라이소좀 분해를 피할 수 있게 하는 핵산-리간드 복합체가 형성될 수 있다. 또다른 실시양태에서는, 핵산이 특정 수용체를 표적으로 함으로써 세포-특이적 흡수 및 발현을 위해 생체 내 표적화될 수 있다(예를 들면 제WO 92/06180호; 제WO 92/22635호; 제WO92/20316호; 제WO93/14188호 및 제WO 93/20221호 참조).
벡터에 대해서는, 예를 들면 렌티바이러스 벡터가 당 분야에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 바이러스 게놈를 포장하여 숙주 세포 DNA로 통합시키는 요소를 함유하고 있다. 유전자 치료에 이용되는 항체를 암호화하는 핵산 서열은 하나 이상의 벡터에 클로닝된다.
아데노바이러스 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 아데노바이러스-계 전달 시스템의 표적은 예를 들면 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육을 포함한다. 아데노바이러스는 비-분할 세포를 감염시키고, 이는 초기 레트로바이러스 벡터에 대한 이점이다. [Kozarsky et al., Curr Opin Gen Dev 3:499 (1993)]는 아데노바이러스-계 유전자 치료의 개론을 제공한다. [Bout et al., Human Gene Therapy 5:3 (1994)]는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 레수스 원숭이의 호흡기 상피로 유전자를 전달함을 입증하였다. 유전자 치료에서 아데노바이러스의 이용에 대한 다른 예는 [Rosenfeld et al., Science 252:431 (1991)]; [Rosenfeld et al., Cell 68:143 (1992)]; [Mastrangeli et al., J Clin Invest 91 :225 (1993)]; 제WO94/12649호; 및 [Wang et al., Gene Therapy 2:775 (1995)]에서 발견할 수 있다.
아데노-연관 바이러스(AAV) 또한 유전자 치료에서 이용될 수 있다([Walsh et al., Proc Soc Exp Biol Med 204:289 (1993)]; 및 미국 특허 제5,436,146호; 제6,632,670호; 및 제6,642,051호).
유전자 치료에 대한 다른 접근법은 전기천공법, 리포펙션, 인산화칼슘-매개된 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 유전자를 조직 배양액 중의 세포로 전달함을 포함한다. 일반적으로 전달 방법은 선택가능한 마커의 세포로의 전달 단계를 포함한다. 그런 다음, 세포를 선택 하에 위치시켜 전달된 유전자를 받아들이고 발현하는 세포를 단리시킨다. 그런 다음, 이들 세포를 환자에게 전달한다.
따라서, 생성된 재조합 세포의 생체 내 투여 이전에, 핵산을 세포로 도입할 수 있다. 이런 도입은 형질감염, 전기천공, 미세주사, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터를 이용한 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 전달, 미세세포-매개된 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 포함하지만 이로 한정되지는 않는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 외래 유전자를 세포로 도입하기위한 다양한 기법이 당분야에 공지되어 있고(예를 들면 [Loeffler et al., Meth Enzymol 217:599 (1993)]; [Cohen et al., Meth Enzymol 217:618 (1993)]; 및 [Cline, Pharm Ther 29:69 (1985)] 참조), 수용 세포의 필요한 발달 및 생리적 기능이 파괴되지 않는 한, 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 기법은 핵산이 세포에 의해 발현되고, 유전가능하여 세포 자손에 의해 발현되도록 핵산을 세포로 안정하게 전달해야만 한다.
생성된 재조합 세포는 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 환자로 전달될 수 있다. 재조합 혈액 세포(예를 들면 조혈 줄기 세포 또는 선조 세포)가 예를 들면 골수 이식 분야에서 공지된 바와 같이 정맥내 투여되는 것이 바람직하다. 사용되는 것으로 예상되는 세포의 양은 바람직한 효과, 환자 상태 등에 의존하고, 당 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.
유전자 치료 목적으로 핵산이 도입되는 세포는 임의의 바람직한, 이용가능한 세포 유형을 포함하고, 상피 세포, 내피 세포, 케라티노사이트, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포, 혈액세포, 예를 들면 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식 세포, 호중구, 호산구, 거대핵세포 및 괴립구, 다양한 줄기 세포 또는 선조 세포, 특히 조혈 줄기 세포 또는 선조 세포, 예를 들면 골수, 제대혈, 말초 혈액, 태아 간 등으로부터 수득된 것들을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
한 실시양태에서, 유전자 치료에 이용되는 세포는 환자의 자가 조직이다. 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 서열은 트랜스유전자가 세포 또는 이들의 자손에 의해 발현되도록 세포로 도입되고, 그런 다음, 재조합 세포를 치료 효과를 위해 생체 내 투여한다. 특정한 실시양태에서는 줄기 세포 또는 선조 세포가 이용된다. 시험관 내에서 단리되고 유지될 수 있는 임의의 줄기 세포 및/또는 선조 세포를 본 발명의 실시양태에 따라 잠재적으로 이용할 수 있다(예를 들면 제WO 94/08598호; [Stemple et al., Cell 71 :973 (1992)]; [Rheinwald Meth Cell Bio 21A:229 (1980)]; 및 [Pittelkow et al., Mayo Clinic Proc 61:771 (1986)] 참조). 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질이 예를 들면 B 세포 상에서 발현되기 때문에 혈액 세포 및 골수 세포가 적합한 숙주 세포이다. 그러나, 줄기 세포 숙주의 이용에 대한 본 발명의 범위는 관심 트랜스유전자를 배아 및/또는 배아 줄기 세포로 투여함으로써 트랜스제닉 유기체를 제조하기 위한 트랜스유전자의 제조 및 이용을 계획하지 않는다.
따라서 본 발명은 효과량의 예를 들면 본 발명의 액체 제형, 항체 또는 이의 변이체를 대상에게 투여함으로써 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 관련 및 연관 질병 또는 이의 하나 이상의 증후를 치료, 예방 및 개선시키는 방법을 제공한다. 대상은 바람직하게는 포유동물, 예를 들면 비-영장류(예를 들면 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류(예를 들면 원숭이, 예를 들면 시아노몰거스 원숭이 및 인간)이다. 바람직한 실시양태에서, 대상은 인간이다.
연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질은 또한 일부 암 세포, 예를 들면 췌장암, 결장암 및 방광암, 및 또한 T 세포 백혈병에서 발현되고([Qinping et al., Oncogene 24:573-584, 2005]), 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질의 자극은 암종 세포의 증식과 관련되어 있다([Meijer et al., Cane Res 66:9576-9582, 2006]).
따라서, 관심 항체 또는 이의 유도체는 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 발현하는 암 세포의 증식을 제어하는데 이용될 수 있고, 상기 암은 본원에 개시된 진단 분석에 의해 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질 발현의 존재를 측정함으로써 확인된다. 관심 항체는 악성 세포의 침윤을 감소시키고, 아폽토시스에 대한 저항을 감소시키고, 증식을 최소화한다. 그런 다음, 이런 환자에게 본원에 제공된 바와 같은 암 세포 증식 억제양의 항체 또는 이의 유도체를 투여한다. 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 등의 투여를 비롯한 다수의 방법으로 환자에게 투여될 수 있다. 본질적으로 관심 I형 에피토프를 발현하는 임의의 암을 관심 항체를 이용하여 검출 및/또는 치료할 수 있다. 예를 들면 악성 세포는 상피 세포일 수 있다. 상피 세포는 결장, 직장, 식도, 폐, 전립선, 유방, 췌장 및 구강 강, 질, 일반적인 내장관, 요도 등과 같은 임의의 기관 또는 조직 기원의 임의의 악성 세포에서 발견될 수 있다. 그러나, 악성 세포가 관심있는 I형 에피토프를 발현하는 한, 암이 상피 세포로 제한될 필요는 없다.
본 발명에서는 이제 일부 실시양태를 개시하고 본 발명이 실시되는 하기의 비-한정적인 실시예에 의해 당 분야의 이점을 예시할 것이다.
실시예
실시예
1: 면역원 생성
Colo205 세포 (ATCC)([Semple et al., Cancer Res 38: 1345-1355, 1978])를10% 우태 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에서 성장시킨다. 수확된 세포를 PBS에서 2회 세척하고 필요할 때까지 -20℃에서 저장시킨다. 아이소프로판올-헥산-물(IHW)(55:25:20)을 이용하여 세포 펠렛을 추출한 후 폴치(Folch) 분배시키고, DEAE 세파덱스 크로마토그래피하고, 이아트로비드(Iatrobead) 6RS-8010 컬럼 상에서 HPLC하였다. 위쪽 상의 중성 분획의 구배 용출을 200분동안 50:40:5에서 55:25:20까지의 IHW로 수행한다. 분획을 수집하고, 클로로포름-메탄올-물(50:40:10) 중의 HPTLC 이동에 따라 모은다. 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 메르크 HPTLC 플레이트(실리카 겔 60, 독일 다름스타트 소재의 메르크) 상의 제조용 TLC에 의해 추가로 정제한다(미국 특허 제6,083,929호 참조).
이량체 Lea 항원 바로 아래로 이동된 (mAb IMH2로 면역염색된) 양성 밴드를 본원에 개시된 바와 같이 정제한다.
결장직장 아데노암종 세포인 Colo205(ATCC CCL-222) 및 DLD-1(ATCC CCL-221)을 1mM 나트륨 피루베이트(인비트로겐 캄파니(Invitrogen Co.), 카탈로그 번호 11360)으로 보충된 RPMI 1640 배지(인비트로겐 캄파니, 카탈로그 번호 31800) 중에서 배양한다. 다른 결장직장 아데노암종 세포인 SWl116(ATCC CCL-233) 및 HT-29(ATCC HTB-38), 및 폐-유래된 T84 세포(ATCC, CCL-248)를 각각 레이보비츠(Leibovitz's) L-15 배지(인비트로겐 캄파니, 카탈로그 번호 41300), 맥코이(McCoy's) 5a 배지(인비트로겐 캄파니, 카탈로그 번호 12330) 및 DMEM/F12 배지인비트로겐 캄파니, 카탈로그 번호 12400)에서 유지시킨다. KATO III 위 암종 세포(ATCC HTB-103)를 IMDM 배지(인비트로겐 캄파니, 카탈로그 번호 12200)에서 배양한다. 연구에 이용된 모든 배지는 10% 우태 혈청으로 보충되어 있다.
실시예
2: 항-연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질
MAb
의 생성
이중 트랜스크로모솜 마우스와 트랜스제닉 마우스를 교잡 육종시켜 KM 마우스(키린 브류어리 캄파니 리미티드(Kirin Brewery Co., Ltd.))를 생성한다. KM 마우스는 전체 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 함유하는 인간 염색체 절편 및 인간 면역글로불린 카파 경쇄 유전자좌의 절반에 대한 YAC 트랜스유전자를 갖고 있다. KM 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 또는 카파 경쇄중 어느 것도 발현하지 않도록 조작된다. 모든 동물을 당 분야에서 허용되는 규칙 및 규제에 따라 유지 및 취급한다.
Colo205 세포(5x106 세포/주사)를 KM 마우스에 3주마다 총 4회 주사한 후, Colo205 세포로부터 단리되고 리포폴리사카라이드(시그마, L-7011) 상에 흡착된 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 매주 8회 주사하였다([Young et al., J. Exp. Med. 150:1008-1019, 1979]). 역가가 1:6000에 이를 때까지, 면역접종된 마우스의 항-Colo205 중성 글라이코스핑고지질 역가를 2차 항체로서 항-인간 카파-HRP(써던 바이오테크놀로지 어소시에이츠(Southern Biotechnology Associates), 카탈로그 번호 9220-05)를 이용하여 ELISA로 모니터링하였다. 최종 주사한지 3일 후에, 당분야에 공지된 방법을 실시하여 부스팅된 마우스에서 나온 비장림프구를 P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1) 마우스 골수종 세포(ATCC TIB-18)와 융합시켰다. Colo205 중성 당지질로 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트(코스타(Corstar), 카탈로그 번호 2592)를 이용한 ELISA에 의해 하이브리도마를 스크리닝한다. HRP와 컨쥬게이트된 마우스 항-인간 IgG 항체를 2차 항체(써던 바이오테크놀로지 어소시에이츠, 카탈로그 번호 9040-05)로서 이용하고, 테트라메틸벤지덴(TMB)(켐-진-텍 다이아그노스틱스(Kem-Zn-Tec Diagnostics), 카탈로그 번호 4390)을 기질로서 이용한다. Colo205 중성 당지질과 높은 반응성을 나타내는 하이브리도마 상층액을 HPTLC 면역염색 및 유동 세포 측정기에 의해 추가로 확인한다. 안정한 클론이 확립될 때까지, 연장된 Ⅰ형 글라이코스핑고지질을 강하게 염색하고 Colo205 세포의 표면 상에 높은 결합을 나타내는 클론을 제한 희석에 의해 반복적으로 서브클로닝한다. 하나의 안정한 클론은 GNX-8이다.
실시예
3:
GNX
-8 항체
제조자의 제안 방법에 따라 pH 구배 용출을 이용한 단백질 A 세파로스(지이 헬쓰케어(GE Healthcare) 17-129-79-02)를 이용하여 모노클론 항체를 배양 상층액으로부터 정제한다. 각각의 분획을 수집하고, 항체의 존재를 ELISA에 의해 검사한다. Colo205 중성 당지질 결합 활성을 갖는 분획을 모으고 PBS(pH 7.4)에 대해 투석한다. 정제된 항체를 분획하고 -20℃에서 저장한다.
제조자의 추천 방법에 따라 표준물로서 IgG를 이용한 바이오-래드(Bio-Rad) 단백질 분석 키트(바이오-래드(Bio-Rad), 카탈로그 번호 200-0006)을 이용하여 모노클론 항체의 농도를 측정한다.
GNX-8의 아이소타입을 ELISA를 이용하여 측정한다. GNX-8은 인간 IgG1이고, 경쇄는 카파이다.
정제된 GNX-8을 β-머캡토에탄올의 존재(환원 조건) 또는 부재(비-환원 조건) 하의 2X SDS 겔-부하 완충액에서 끓인 후 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 적용한다. 제조자의 추천에 따라 미누테시-프로틴3(Minutesi-PROTEAN3) 전기영동 시스템(바이오-래드)을 이용하여 전기영동을 수행한다.
환원성 SDS-PAGE 겔 상에서 분리된 GNX-8을 나이트로셀룰로스(NC) 막(아머샴(Amersham))으로 이동시키고, PBS 중의 3% 탈지 우유로 블록킹시킨다. 막을 실온에서 1시간동안 2차 항체와 함께 항온처리한다. 1:5000 희석된 HRP-라벨링된 염소 항-인간 IgG(γ) 항체(지메드(Zymed), 62-8420) 및 1:2000 희석된 HRP-라벨링된 토끼 항-인간 카파 쇄 IgG 항체(DAKO, P0129)를 이용하여 GNX-8의 중쇄 및 경쇄를 검출하였다. 웨스턴 라이트닝(Western Lightening: 등록상표) 켐일루미네슨스 리에이즌트 플러스(Chemiluminescence Reagent Plus)(퍼킨엘머 라이프 사이언시즈(PerkinElmer Life Sciences), 카탈로그 번호 NEL105)를 이용하여 바이오맥스 라이트 필름(코탁(KODAK), 카탈로그 번호 1788207) 상의 신호를 전개시킨다.
환원성 조건 하에서, GNX-8 경쇄 및 중쇄의 분자량을 IgG에 대해 예상한다. GNX-8은 염소 항-인간 IgG(γ)-HRP 및 2차 항체로서 토끼 항-인간 카파 쇄-HRP를 각각 이용한 웨스턴 블롯에 의한 인간 모노클론 항체이다. GNX-8은 ELISA 아이소타이핑에 의한 인간 항체이다.
GNX-8의 pI 분석을 파스트시스템(PhastSystme)(파마시아)에 의해 측정한다. 간단하게, 파스트겔 샘플 적용기 8/1 빗을 이용하여 항체 시료 및 pI 표준을 IEF 파스트겔(PhastGel) 3-9 상에 적용하고, 제조자의 프로토콜에 따라 분리한다. 그런 다음, 제조자의 프로토콜에 따라 겔을 파스트시스템 현상 유니트(파마시아)에서 은 염색한다.
pI 분석은 pH 8.15 내지 8.65 사이의 여러 밴드를 나타내고, 이는 항체의 번역후 개질 가능성을 나타낸다. 높은 pI는 GNX-8이 생리적 pH에서 용해성일 것임을 나타낸다.
세포 결합 활성을 검출하기 위해, 2x105 개의 세포를 PBS로 세척하고, 다양한 농도의 항체와 함께 실온에서 30분동안 항온처리하였다. PBS 세척 후, 1:3000 희석된 FITC-라벨링된 염소 항-인간 IgG(Fc) 항체(ICN, 카탈로그 번호 55198)를 추가 30분동안 실온에서 각각의 세포 샘플에 첨가한다. CDC 연구의 경우, 항체 처리 후의 세포를 PBS로 3회 세척하고, 1㎕의 프로피듐 요오다이드 용액(시그마-알드리치, P4846)과 함께 30분동안 항온처리한다. 최종 PBS 세척 후, 세포를 유동 세포 분석기(BD, FACsort) 상에서 분석한다. 결과를 셀퀘스트(CELLQuest) 3.3(BD)으로 처리한다.
실시예
4: 세포독성 분석
인간 결장 암 세포주인 SW1116, Colo205 및 DLD-1을 48웰 플레이트(코닝 코스타)에 2x104 세포/웰의 밀도로 시딩한다. 하룻밤동안 배양한 후, 세포를 다양한 항체 농도에서 25% 비-불활성화된 인간 혈청과 함께 500㎕의 배지 중에서 배양한다. PBS 세척후, 남아있는 살아있는 세포를 프로피듐 요오다이드(PI) 용액(시그마-알드리치, P4846) 염색에 의해 정량하고, 유동 세포 분석기에 의해 분석한다. 정상 인간 혈청에서 정제된 정상 인간 IgG를 음성 대조군으로 이용한다.
다른 분석법에서는, 표적 세포를 약 100 ㎕의 51Cr과 함께 약 90분동안 약 37℃에서 항온처리함으로써 라벨링한다. 3회 세척하고 항온처리(37℃에서 약 1시간)한 후, 세포(약 1x106 ml)를 25mM의 HEPES 완충액 및 약 3% 소의 혈청 알부민으로 보충된 RPMI-1640에 현탁시킨다. 약 20 ㎕의 라벨링된 세포, 약 100 ㎕의 mAb 및 25%의 열 불활성화된 인간 혈청을 마이크로타이터 U 바닥 플레이트(뉴욕주 소재 코닝)의 웰에서 혼합한다. 비-특이적 마우스 Ig(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)를 음성 대조군으로 이용할 수 있다. 약 4시간의 항온처리 후, 원심분리기에 조합된 매달린 플레이트 홀더를 이용하여 플레이트를 원심분리(500 x g, 2분)하고, 각각의 웰 중의 약 100 ㎕의 상층액중의 방사 활성을 감마 카운터를 이용하여 측정한다. 각각의 실험 군을 3중으로 시험할 수 있다. 특이적 용균%는 하기 식에 따라 계산될 수 있다:
([A-B]x100)/C
상기 식에서,
A는 용균된 실험 세포의 cpm이고,
B는 용균되지 않은 표적 세포의 cpm이고,
C는 총 표적 세포의 cpm이다.
바람직하게는 자발적 방출은 최대 방출가능한 라벨링된 방사활성의 15%를 초과하지 않아야만 한다.
피콜-파크(Ficoll-Paque) (GE, 71-7167-00)를 이용하여 건강한 기증자로부터 제조된 작동자 세포로서 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 이용하여 락테이트 데하이드로게나제(LDH) 방출 분석(프로메가, 사이토톡스 96(CytoTox 96: 등록상표), 비-방사활성 세포독성 분석)에 의해 ADCC 분석을 수행한다. 분석은 세포 용균물 상에 방출된 안정한 세포질 효소인 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 정량적으로 측정한다. 배양 상층액 중에 방출된 LDH를 30분 커플링된 효소 분석을 이용하여 측정하고, 상기 분석은 테트라졸륨 염(INT)를 적색 포마잔 생성물로 전환시킨다. 형성된 색의 양은 용균된 세포의 수에 비례한다.
표적 세포로서 이용된 Colo205 세포를 96웰 U 바닥 플레이트(2x104 세포/웰)로 분배하고, 다양한 E/T 비를 갖는 PBMC의 존재 하의 항체와 함께 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 상층액중의 LDH 활성을 사이토톡스 96(등록상표) 비-방사활성 세포독성 분석을 이용하여 측정하였다. 특이적 세포용해율을 하기 식에 따라 계산한다:
특이적 용균% = 100 x (E-SE-ST)/(M-ST)
상기 식에서,
E는 실험적 방출(항체 및 작동자 세포와 함께 배양된 표적 세포에서 나온 상층액중의 활성)이고,
SE는 작동자 세포의 존재 하에서의 자발적 방출(단지 배지와 함께 배양된 작동자 세포에서 나온 상층액의 활성)이고,
ST는 표적 세포의 자발적 방출(단지 배지와 함께 배양된 표적 세포에서 나온 상층액의 활성)이고,
M은 표적 세포의 최대 방출(9% 트라이톤 X-100으로 용균된 표적 세포로부터 방출된 활성)이다.
GNX-8의 시험관내 항종양 활성을 CDC 분석에 의해 평가한다. 인간 결장직장암 세포인 SWl116, Colo205 및 DLD-1을 25% 인간 혈청의 존재 하에서 GNX-8로 처리하여 투여 의존적 방식으로 상당한 세포 용균을 야기한다. 결과는 GNX-8이 보체-의존성 세포 용해 반응을 통해 표적 세포를 죽임을 나타낸다.
일부 실험에서 SW1116 및 Colo205 세포에 대한 CDC 효과는 DLD-1 세포보다 더 강하다. 세포의 생존성은 GNX-8 항원의 발현 수준에 반비례한다. GNX-8의 CDC 효과 및 3가지 결장직장암 세포주 상에서의 GNX-8 항원 발현 수준은 더 높은 GNX-8 항원 발현을 갖는 암 세포가 세포독성에 보다 민감하고, 더 낮은 GNX-8 항원 발현을 갖는 암 세포가 더 높은 생존성을 갖는다는 것을 입증한다. 이 결과는 GNX-8의 항종양 활성이 GNX-8 항원의 발현 수준에 의존할 수 있다는 결론을 이끌어낸다. 종양 세포 상에서 높은 GNX-8 항원 발현을 갖는 환자는 GNX-8 단독으로 치료될 수 있고, 낮은 수준의 GNX-8 항원을 발현하는 종양은 GNX-8 항체에 추가하여 하나 이상의 다른 암 치료제와의 조합 치료로부터 이점을 얻을 수 있다.
인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)의 ADCC 활성을 GNX-8의 존재하에서 인간 결장직장암 Colo205에 대해 평가한다. IMH2를 이용한 ADCC 활성을 양성 대조군으로 이용하고, 인간 IgG를 음성 대조군으로 이용한다.
GNX-8은 Colo205 세포에 대해 강한 ADCC 활성을 유도한다. 세포독성 효과는 E/T 비 및 GNX-8 농도 둘 모두와 양의 관련성을 갖는다. 약 20/1의 E/T에서 100% 세포 용균이 관찰된다. 최대 ADCC 효과, 및 약 50% 용균에 대해 관찰되는 경향 또한 각각 약 5 ㎍/ml의 GNX-8 및 약 50 ㎍/ml의 IMH2에서 관찰된다. 대조군인 인간 IgG는 E/T 비 또는 IgG 농도와는 무관하게 세포독성 효과를 나타내지 않는다. 50% 용균에 도달하는 GNX-8의 투여량은 IMH2이 필요로 하는 양의 1/10 보다 적다.
실시예
5:
바이아코어
(
Biacore
) 친화성 분석
I형 글라이코스핑고지질을 칩에 부착시킨다. 그런 다음, 제조자(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬쓰케어)의 추천에 따라, 동역학 분석, 및 항체-항원 결합 반응을 둘러싼 에피토프 서열 분석을 위해 mAb를 칩에 노출시킨다.
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6: 생체 내 분석
GNX-8의 항종양 활성을 Colo205 이종이식 모델에서 평가한다. Colo205 세포를 PBS로 2회 세척하고, PBS 중에 5x106/100㎕의 세포 밀도로 재구성한다. 6 내지 8주된 암컷 누드 마우스에게 100 ㎕의 Colo205 세포 현탁액을 옆구리 부분에 피하 접종한다. 종양 크기를 버니어 캘리퍼로 주 3회 측정하고, 종양 중량(mg)을 (폭2x길이)/2로서 측정한다. 고안된 투여량 및 스케쥴에 따라 GNX-8 또는 정상 인간 IgG를 종양을 갖는 누드 마우스에 복강내 주사한다.
GNX-8의 생체 내 항종양 효능을 측정하기 위해, 암 세포(5x106 세포/마우스)를 누드 마우스에 주사하고, 종양을 접종한지 24시간 후에 GNX-8(처리군, 군당 8마리) 또는 정상 인간 IgG(대조군, 군당 7마리)중 하나를 주사한다. 양쪽 군 모두에게 24시간 간격으로 5회 투여(300 ㎍/마우스)한 후, 48시간 간격으로 4회 투여(600 ㎍/마우스)하였다.
GNX-8-처리된 마우스에서는 종양 성장이 상당히 억제된다. 처리군은 제11일에 약 23%의 T/C(처리군/대조군)의 중간값 종양 중량에 도달하였고, 연구 끝까지 그와 유사한 수준에서 유지되었다. 42% 이하의 T/C 측정치는 항종양 활성을 입증하는데 있어 유의한 것으로 간주된다.
GNX-8 처리군에서 마우스 중의 절반(4/8)이 50일동안 장기간의 종양-없는 생존을 달성한다. 한편, 대조군 동물의 종양 크기는 연구 기간동안 계속적으로 증가한다.
Colo205 이종이식 누드 마우스 모델에서 유사한 연구를 수행한다. 80 내지 100 mg의 종양 크기에 대해 GNX-8를 첫번째 투여한다. GNX-8(처리군) 및 정상 인간 IgG(대조군)을 5일동안 매일 1회(300 ㎍/마우스) 주사하고, 제17일 및 제21일에 유사하게 2회 투여한다.
처리를 단지 5회 투여 후에 중단하였지만, 처리군에서는 또한 유의한 종양 억제가 관찰된다. T/C(처리군/대조군)의 중간값 종양 중량은 10일 이후부터 연구 종료때까지 42%보다 낮다.
숙주 작동자 기능이 GNX-8 효능에 기여하지는 지를 측정하기 위해, Colo205 이종이식을 갖는 SCID 마우스를 600 ㎍/마우스의 GNX-8 또는 정상 인간 IgG로 3주동안 매주 2회 처리한다. 종양 크기가 체중의 10%에 이를 때까지 종양 크기를 매주 2회 측정하고, 이것을 연구의 종결점으로 간주한다.
처리군에서는 생존성이 연장된다.
인간 결장직장암에서 GNX-8 에피토프의 발생을 조사하기 위해, 여러 인간 결장직장암 세포주를 분석한다.
예를 들면, GNX-8에 의한 DLD-1의 생체 내 억제가 상당하다.
실시예
7:
GNX
-8 항원
세포 당단백질의 분석을 위해, 배양된 세포를 T-75 플라스크로부터 긁어내어 PBS로 2회 세척한 후, 용균 완충액(50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS 및 1 mM PMSF)로 세척한다. 용균액을 26 게이지 바늘을 통해 여러번 통과시켜 임의의 큰 응집체를 분산시킨다. 단백질 농도를 단백질 분석 키트(바이오-래드)로 측정한다. 동일한 양의 단백질을 함유하는 용균물을 겔 상에서 분리시키고, 1차 항체로 GNX-8, 및 2차 항체로서 HRP로 라벨링된 마우스 항-인간 IgG(Fc)(써던 바이오테크놀로지 어소시에이츠 #9040-05)를 이용한 웨스턴 블럿에 의해 분석한다. 웨스턴 라이트닝(상표명) 켐일루미네슨스 리에이즌트 플러스(퍼킨엘머 라이프 사이언시즈, 카탈로그 번호 NEL105)를 이용하여 바이오맥스 라이트 필름(코닥, 카탈로그 번호 1788207) 상에서 신호를 전개시킨다.
중성 당지질(2 ㎕/샘플)을 HPTLC 플레이트(메르크, 1.05642, 실리카 겔 60 F254) 상에 점적하고, 50:40:10 (V:V:V)의 비로 클로로포름:메탄올:물을 함유하는 이동상을 이용하여 전개시킨다. 당지질의 글라이칸 염색을 위해, 10% H2SO4 중의 0.2% 오르시놀(시그마, O-1875)을 HPTLC 플레이트에 분무하고, 오븐에서 110 ℃에서 10분동안 항온처리한다. 면역염색을 위해, HPTLC 플레이트를 먼저 클로로포름:헥산 1:9(V:V) 중의 0.5% 폴리(아이소부틸 메타크릴레이트)(알드리치, 181544)로 45초동안 고정시킨 후 3% BSA/PBS중에서 10분동안 블록킹한다. 그런 다음, 플레이트를 PBS로 세척하고, 실온에서 1시간동안 1차 항체로 항온처리한 후, 실온에서 1시간동안 바이오틴화된 2차 항체로 항온처리한다. 아비딘-바이오틴 복합체 키트(캘리포니아주 버링겜 소재의 벡터 래보레이토리즈(Vector Laboratories))를 이용하여 2차 항체에서 나온 신호를 증폭시킨다. 플레이트를 실온에서 30분동안 항온처리한 후, 제조자의 프로토콜에 따라 면역염색 HRP-1000 키트(코니카 미놀타(Konica Minolt), 130990)으로 색 전개시킨다.
동결건조된 샘플에, 20 ㎕의 48% 과불화수소(HF)(메르크)를 첨가한 후, 혼합물을 4℃에서 48시간동안 항온처리한다. 반응 끝에, N2 기체를 이용하여 HF를 제거한다. 탈푸코실화된 당지질을 GNX-8의 특이성 연구에 이용한다.
Colo205의 중성 당지질을 HF로 처리하고, MALDI-TOF MS에 의해 분석하여 푸코스의 제거를 확인한다. TLC 면역염색을 수행하여 HF 처리 전과 후의 Colo205 중성 당지질에 대한 GNX-8의 특이성을 분석한다.
GNX-8이 분해되지 않은 당지질은 인식하지만 데푸코실화된 형태는 인식하지 않고, 이는 GNX-8의 에피토프가 탄화수소 잔기이고, 푸코스가 구조의 필수 요소임을 제안한다.
GNX-8의 특이성은 Colo205 세포로부터 단리된 중성 및 모노시알릴 당지질에 대한 HPTLC 면역염색에 의해 추가로 특징화된다.
100g의 Colo205 세포를 수집하고, 당지질 분획을 추출한다. TLC에 의해 분리된 Colo205 당지질을 오르시날(orcinal)/H2SO4를 이용해 탄화수소에 대해 염색한다. Lea, Leb, Lea-Lea 및 Leb-Lea의 위치를 상기 문헌[Stroud et al. (1992)]에 따라 확인한다. 시알릴 Lea(SLea)는 mAb NKH3(미국 특허 제5,240,833호)을 이용한 염색에 의해 나타나고, 나중에 MALDI-MS를 이용하여 확인된다. 동일한 당지질 분획의 HPTLC 면역염색은 CF4C4(미국 특허 제5,011,920호)(항-Lea), T218(매사추세츠주 캠프릿지 소재의 앱캄(Abcam))(항-Leb), IMH2([Stroud et al., 1992])(항-Leb-Lea), 및 GNX-8 항체를 이용하여 수행된다.
결과는 GNX-8이 연장된 I형 쇄 당지질과 강하게 반응함을 나타낸다. GNX-8은 Lea 연장된 I형 쇄에 결합하지 않았다. Colo205 세포의 모노시알릴 당지질은 GNX-8에 의해 인식되지 않는다. GNX-8은 더 높은 농도(0.6 ㎍/ml)에서 Leb와 매우 약한 교차 반응성을 나타낸다. IMH2와는 달리, GNX-8은 Lex 또는 Ley에 결합하지 않았다. GNX-8은 Leb를 함유하는 연장된 쇄에 결합한다. GNX-8은 Leb-Lea에 결합한다.
TLC 면역염색에 추가하여, GNX-8의 에피토프는 억제제로서 합성 글리칸 Leb, Lea-Lex, Leb-Lex 및 Lex-Lex, 및 양성 대조군으로서 Leb-Lea/Lea-Lea 당지질 혼합물을 이용한 경쟁적 ELISA를 특징으로 한다.
결과는 GNX-8이 높은 억제제 농도에서 Leb-Lex와 약하게 교차반응하지만, 합성 Leb 글리칸을 비롯한 다른 시험된 합성 글리칸과는 반응성을 갖지 않음을 나타낸다. 연장된 Leb에 대한 GNX-8의 결합 활성은 단순한 Leb에 비해 1000배 더 높다.
이 결과에 근거하여, GNX-8의 에피토프는 아마도 푸코실화를 갖는 연장된 I형 쇄 상의 Leb 구조이고, 이는 단순한 Leb가 아니다.
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8: 세포 및 조직 분포
인간의 정상 및 암 조직의 포르말린-고정되고 파라핀-매립된 시편을 예를 들면 유에스 바이오맥스(US Biomax)로부터 수득한다.
정상 및 악성 인간 조직의 포르말린-고정되고 파라핀-매립된 조직 어레이를 PBS 중의 0.1% 탈지유로 30분동안 블록킹한다. 3% H2O2로 추가 10분동안 항온처리한 후, 조직 어레이를 PBS로 3회 세척한 후, 샘플을 0.1% BSA/PBS-희석된 바이오틴화된 GNX-8과 함께 1시간동안 항온처리한다. 그런 다음, 신호 증폭을 위해 조직 샘플을 바이오틴-스트렙트아비딘-퍼옥시다제 복합체(ABC 키트, 벡터, #PK-6100)와 함께 30분동안 반응시킨다. DAB PLUS 기질 키트(지메드(Zymed) #00-2020)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따른 면역반응성 염색을 가시화한다. 헤마톡실린을 이용하여 대비염색을 수행한다. 광 현미경 하에서 가시화시켜 결과를 측정한다.
인간 암 세포 상에서의 GNX-8의 발현을 유동 세포 분석기에 의해 평가한다. 유동 세포 분석기에 의해 GNX-8 항체의 발현에 대해 다수의 인간 결장직장 및 위 종양 세포주, 예를 들면 Colo205, HT-29, DLD-1, SWl116, T84 및 KATO III을 따로따로 조사한다.
유동 세포분석기 분석은 GNX-8이 모든 시험된 암 세포주에 대해 결합 활성을 나타냄을 입증한다. 그러나, 결합은 다른 시험된 인간 암 세포주에 비해 SWl116, Colo205 및 DLD-1에 대해 상당히 더 강하다.
또한, GNX-8 항원 발현을 HL60(전골수종 세포주), MCF-7(유방암 세포주) 및 PANC-I(췌장암 세포주), 및 또한 마우스 결장암 세포주 CT26 상에서 시험한다. GNX-8는 이들 4가지 암 세포주에 결합하지 않는다.
2가지 직장결장암 세포주인 Colo205 및 SW1116을 웨스턴 블롯에 의해 분석한다. 2가지 세포주는 유동 세포 분석기 분석에서 GNX-8과의 강한 결합을 나타내었다.
결과는 32kDa 내지 175 kDa 미만의 분자량 범위에 걸쳐 Colo205 및 SW1116 상의 GNX-8 항원의 존재를 나타낸다. 따라서, GNX-8 항원은 당지질일뿐 아니라 당단백질이다.
정상 조직 및 암 조직 둘 모두를 포함한 다양한 기관으로부터 얻은 다양한 시편을 GNX-8을 이용하여 따로따로 염색한다. 양성 세포의 염색 강도 및 빈도에 의해 조직 시편의 염색 패턴을 평가한다.
염색을 1+ (10 내지 20%), 2+ (20 내지 50%) 또는 3+ (> 50%)의 등급으로 등급매기고, 빈도는 각 절편에서 양성 세포의 %에 근거하여 분류한다.
원발성 및 전이성 결장직장 암종에서 GNX-8 항원 발현 사이에 강한 연관성이 관찰된다. 결장직장암 환자에서 나온 조직 절편의 패널을 면역조직화학적으로 염색시킨다.
GNX-8 항원은 결장직장암 조직에서뿐만 아니라 인접한 조직 상에서 수행된다. 예를 들면 암 지역에 이웃한 폴립이 GNX-8에 의해 염색된다. 그러나, 먼 정상 조직 상에서는 염색이 관찰되지 않는다. 따라서, 인식가능한 세포 형태 변화가 일어나기 전에 GNX-8이 형질전환된 세포 또는 형질전환중인 세포를 확인하는 것으로 결론지을 수 있다.
GNX-8 항원 발현 또한 다양한 등급의 암에서 연구된다.
GNX-8 항원은 각각의 암 단계에서 발현된다.
GNX-8은 정상 결장, 직장, 위, 소장, 간, 식도, 폐, 전립선 또는 유방에 결합하지 않는다.
결장암 샘플의 58%(44/76)는 GNX-8로 염색되고; 직장 암 샘플의 47%; 전이성 결장암 샘플의 57%; 위암 샘플의 53%; 식도암 샘플의 29%; 폐암 샘플의 22%; 전립선암 샘플의 4%; 유방암 샘플의 17%; 및 췌장암 샘플의 67%는 GNX-8로 염색된다. GNX-8은 소장, 간 및 신장 암 셈플에 결합하지 않는다.
실시예
9:
GNX
-8의
클로닝
및 서열규명
GNX-8 생성 하이브리도마 세포를 10% 저 IgG 우태 혈청(하이클론(HyClone))을 함유하는 IMDM(인비트로겐)에서 정규적으로 배양한다. cDNA 합성용 RNA를 제조하기 위해, 먼저 저속 원심분리(1000 rpm, 5 분)에 의해 1x106 개의 하이브리도마 세포를 수확한다. 그런 다음, 제조자의 프로토콜에 따라 TRIZOL 시약(인비트로겐)을 이용하여 세포 펠렛으로부터 총 RNA를 단리한다. SMART RACE cDNA 증폭 키트(BD 바이오사이언시즈-클론텍(BD Biosciences-Clontech))을 이용하여 정제된 RNA 시료로부터 제 1 가닥 cDNA를 합성한다. 간략하게, 1 ㎍의 총 RNA를 1 ㎕의 5'-CDS 및 1 ㎕의 SMART II A 올리고 프라이머와 함께 70℃에서 2분동안 항온처리한다. 2 ㎕의 5x 제1 가닥 완충액을 첨가한 후, 1 ㎕의 20mM DTT, 1 ㎕의 10mM dNTP 및 1 ㎕의 파워스크립트(PowerScript) RT를 RNA/프라이머 혼합물에 첨가한다. 샘플을 1.5시간동안 42℃에서 추가로 항온처리한다. 100 ㎕의 트라이신 완충액을 첨가하고, 72℃에서 7분간 항온처리함으로써 제1 가닥 cDNA 합성 반응을 종결한다.
UPM(BD SMART RACE cDNA 증폭 키트) 및 서열 번호 3의 중쇄 CH1의 3' 말단의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 GNX-8의 중쇄 절편을 암호화하는 cDNA를 증폭시킨다. 94℃에서 30초, 그런 다음, 58℃에서 30초, 72℃에서 3분, 그리고 이 사이클을 26회 반복하여 PCR 반응을 수행한다.
NUP(SMART RACE 증폭 키트) 및 서열 번호 4의 중쇄 CH1의 중간의 프라이머의 존재하에서 1 ㎕의 상기 반응 생성물로부터 중쇄 cDNA의 가변 영역을 재 증폭하였다. 94℃에서 15초, 68℃에서 30초, 그리고 이 사이클을 25회 반복함으로써 PCR 반응을 수행한다. 증폭된 생성물을 PCR 정제 키트(진마크(GeneMark))를 이용하여 정제하고, 서열 번호 5의 중쇄 CH1의 5' 말단의 프라이머를 이용하여 뉴클레오타이드 서열을 결정한다.
서열 정보에 근거하여, 새로 합성된 프라이머인 서열 번호 6, 및 중쇄 유전자의 말단을 위한 서열 번호 7, 및 BD 어드밴티지(Advantage: 상표명) 2 PCR 효소 시스템(BD 바이오사이언시즈)를 이용하여 이전에 제조된 제 1 가닥 cDNA로부터의 PCR에 의해 전장 중쇄 cDNA를 특이적으로 증폭시킨다.
PCR 반응은 94℃에서 40초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 100초로 설정되고, 이 사이클이 35회 반복된다.
증폭된 전장 중쇄 cDNA를 먼저 EcoRI 및 Xbal로 이중 분해시킨다. 젤 정제한 후, 회수된 중쇄 cDNA를 동일한 부위에서 pCIneo 벡터(프로메가)로 결찰시켜 발현 벡터인 pCI-GNX-8.H3을 수득한다. 다중 클로닝 부위의 업스트림에서 하이브리드를 형성하는 프라이머인 서열번호 8, 및 다중 클로닝 부위의 다운스트림 프라이머인 서열 번호 9를 이용하여 삽입된 cDNA 서열을 확인한다. GNX-8 중쇄 cDNA 및 추론된 아미노산 서열은 각각 서열 번호 14 및 15로서 표 3에 도시되어 있다.
경쇄 cDNA 서열을 확인하기 위해, GNX-8의 경쇄 펩타이드를 질량 분광계 분석하고 데이터베이스를 조사한다. 단백질 확인 정보에 따르면, GNX-8의 경쇄는 마우스 λ쇄와 상동성이다. 마우스 람다 유전자 불변 영역의 5' 말단의 양쪽에 있는 프라이머인 서열번호 10을 합성한다. 경쇄 유전자의 불변 영역의 일부와 가변 영역을 포함하는 cDNA를 터치다운 PCR에 의해 전술된 제 1 가닥 cDNA로부터 증폭시킨다. PCR 반응은 처음에는 94℃에서 30초, 72℃에서 90초를 5 사이클한 후, 94℃에서 30초, 66℃에서 30초, 72℃에서 90초를 5 사이클한 후, 94℃에서 30초, 63℃에서 30초 및 72℃에서 90초의 사이클을 27회 반복하여 수행된다. 그런 다음, 양성 클론 확인을 위해 증폭된 PCR 절편을 yT&A 벡터(이스턴 바이오텍(Yeastern Biotech)로 도입한다.
서열 번호 11의 프라이머를 이용한 서열 결정을 위해 예상된 크기의 4가지 클론을 선택한다.
결과는 4가지 클론이 모두 공지된 경쇄 유전자의 5' 말단과 상동성인 구조를 갖는 동일한 cDNA를 가짐을 나타낸다.
전장 cDNA를 재구성하기 위해 새로운 세트의 프라이머인 서열 번호 12와 서열번호 13을 합성하고, 상기 개시된 cDNA를 이용하여 PCR에 의해 경쇄 유전자의 가변 영역만을 제조한다. PCR 반응은 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분의 30 사이클을 포함한다.
EcoRI 및 BsiWI 제한효소 부위가 혼입되어 있는 증폭된 경쇄 가변 영역 cDNA를 각각의 효소로 분해시킨다. 아가로스 겔 정제 후, 증폭된 가변 영역 cDNA 절편을 pCIck 벡터(XbaI 및 NotI 부위에 인간 κ 불변 영역이 삽입된 pCIneo계 발현 벡터)의 동일 부위에 결찰시켜 경쇄 발현 벡터인 pCIck-GNX-8.mλ를 생성한다. 서열 확인을 수행하고, GNX-8 경쇄의 추론된 뉴클레오타이드 서열 및 또한 아미노산 서열을 각각 서열번호 16 및 서열번호 17로서 도시한다.
선택 마커로서 네오마이신 유전자(pCIck-GNX-8 neo) 또는 DHFR 유전자(pCIck-GNX-8 DHFR)중 하나를 이용하여 재조합 GNX-8 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자 둘 모두를 발현하는 단일 벡터를 구축한다. 경쇄 벡터인 pCIck-GNX-8.mλ를 BglII를 이용하여 선형화시킨 후, 소의 내장 포스파타제(CIP)를 이용하여 5' 말단 탈인산화시킨다. 중쇄 벡터인 pCI-GNX-8.H3를 BglII 및 NgoMIV로 분해한다. CMV 프로모터, 전장 중쇄 cDNA 및 SV40 폴리A를 함유하는 BglII-NgoMIV 절편을 젤 추출에 의해 회수하고, 블런트 말단 결찰에 의해 선형화된 경쇄 벡터에 도입하여 pCIck-GNX-8 neo를 형성한다. 후속적으로 pCIck-GNX-8 neo로부터 NgoMTV/ClaI 분해를 이용하여 네오마이신 유전자를 제거하고 DHFR 유전자로 대체함으로써 pCIck-GNX-8 DHFR 벡터를 생성한다. HindIII/SalI 분해에 의해 pdhfr3.2 벡터(ATCC 번호 37166)로부터 DHFR 미니유전자를 분해시키고, 분리시키고, 젤 추출에 의해 회수한다. 양 절편을 모두 Klenow로 처리하여 블런트 말단을 생성한 후, 블런트 말단 결찰에 의해 DHFR 유전자를 NgoMIV/Clal-분해된 pCIck-GNX-8 neo 절편에 결찰시킨다.
일단 경쇄 및 중쇄의 서열이 밝혀지면, 예를 들면 특정 인간 숙주 세포에서의 발현을 최적화시키기 위해 핵산의 코드를 다시 지정할 수 있다.
실시예
10:
트랜스펙토마
NS0 세포를 1x106 세포/ml의 밀도로 성장시킨다. 세포를 지수성장 상으로 유지시키고, 형질감염 전날 배지를 갈아준다. 형질감염일에 40x106 개의 세포를 세척한다. 그런 다음, 예를 들면 경쇄 DNA 및 선형화된 중쇄 DNA를 함유하는 10㎍의 선형화된 핵산을 세포 현탁액(총 DNA 체적은 50㎕ 미만이어야만 한다)에 첨가하고, 배양액을 얼음 상에서 15분간 배양한다. DNA 및 세포 혼합물을 냉각된 큐벳(0.4cm)으로 전달하고, 전기 펄스(750V 및 25 μF)를 가한다. 전기 펄스 직후에 큐벳을 얼음에 놓고, 얼음 중에서 10 내지 15분동안 유지시킨다. 세포를 수집하고 플레이팅한다. 세포를 12 내지 16일동안 또는 콜로니가 나타날 때까지 5% CO2 인큐베이터에서 배양시킨다. 세포 콜로니의 상층액 또는 현택 배양액에서 성장한 세포를 ELISA로 시험하고, 양성 트랜스펙토마를 새로운 배지에서 클로닝한다. 양성 트랜스펙토마를 추가로 스크리닝하기 위해서, 적정 ELISA 또는 바이어코어 분석을 수행한다. 확장된 트랜스펙토마를 진탕 플라스크에서 유지시키고, 항체 또는 이의 유도체를 상층액으로부터 수집한다.
실시예
11: 약동학
래트를 2가지 군(군당 4마리)으로 무작위 할당한다. 동물에게 꼬리 정맥을 통한 단일 정맥내 환괴 주사에 의해 1 또는 10 mg/kg의 GNX-8을 투여한다. 0분, 5분, 15분 및 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 24시간, 30시간, 72시간, 144시간, 168시간, 216시간, 240시간, 312시간, 336시간 및 360시간에서 혈액 시료를 수집한다. 혈청을 수확하고, GNX-8 농도 분석때까지 -20℃에서 저장한다. GNX-8 농도를 ELISA로 측정한다.
GNX-8은 IODO-Gen 방법을 이용하여 131I로 방사성라벨링된다.
생체내 생체분포 및 영상 연구를 위해 누드 마우스를 이용한다. 5백만개의 Colo205 세포를 피하 접종한다. 종양이 0.5g의 크기에 도달하면, 생체분포 연구를 수행한다. 생체분포 연구를 위해, 10 μCi/2.3 ㎍의 131I-라벨링된 GNX-8을 꼬리 정맥에 주사한다. 주사한지 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 후에 5마리의 동물을 죽인다. 마우스를 죽이기 전에 혈액 샘플을 채취한다. 종양 및 기관(뇌, 피부, 근육, 뼈, 심장, 폐, 췌장, 눈, 부신, 꼬리, 비장, 신장, 간, 방광, 위, 소장 및 대장)을 즉시 회수하여 칭량한다. 종양, 기관 및 혈액 중의 방사성라벨링된 항체의 존재를 γ 카운터(팩카드(Packard))로 각각 계수한다. 표준물을 조직 및 종양과 함께 매번 계수한다. 조직 방사활성을 기관의 g당 주입된 투여량의 %(%ID/g)로서 표현한다.
영상 연구는 마이크로스펙트(microSPECT) 단일 양자 방사 컴퓨터 단층 촬영 시스템(미국 소재의 감마 메디카 인코포레이티드(Gamma Medica Inc.)) 및 마이크로CT X-선 컴퓨터 단층 촬영기에서 수행된다. Colo205 종양을 갖는 누드 마우스에 꼬리 정맥을 통해 200 mCi/5.5mg/100ml의 131I-라벨링된 GNX-8을 정맥내 주사한다. 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 영상을 획득한다. 단일 정맥내 투여 후 래트, SCID 마우스 및 누드 마우스에서 GNX-8에 대한 약동학(PK) 연구를 수행한다. GNX-8의 혈청 농도를 ELISA로 분석한다.
2-격실 모델은 자료에 대한 우수한 부합을 제공하고, 표 4 및 5에 요약된 PK 변수를 생성한다. 래트에 1.0 및 10 mg/kg의 GNX-8을 단일 정맥내 투여한 후 Cmax에서의 투여량-연관된 증가가 관찰된다. GNX-8은 각각 1 및 10 mg/kg의 투여량에서 3.81일 및 4.98일의 말기 반감기로 혈청으로부터 제거된다.
Colo205 종양을 갖거나 갖지 않는 누드 마우스 및 SCID 마우스에서 투여된 후 GNX-8의 약동학적 변수는 종양이 있는 두가지 종 모두에서 약 1일의 T1 /2를 나타낸다. 종양이 없는 동물의 경우, T1 /2 값은 SCID 마우스에서는 58.09 시간이고, 누드 마우스에서는 98.31시간이다. 약동학 변수로부터, T1 /2가 종양을 갖고 있는 마우스에 비해 종양이 없는 마우스에서 훨씬 더 길다.
GNX-8의 생체내 종양 표적 활성 및 특이성을 평가하기 위해 Colo205 이종이식을 갖는 누드 마우스에서 생체분포 연구를 수행한다.
6시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간의 모든 시점에서 혈장 중에서 가장 높은 수준의 131I-GNX-8 방사활성이 검출된다. 6시간에서 g당 주사된 투여량의 약 60%(60 %ID/g)가 혈장에서 검출된다. 48시간, 72시간 및 96시간에서, 혈장에 대한 %ID/g은 약 20%이다. 혈장 수준은 다른 기관, 뇌, 피부, 근육, 뼈, 심장, 폐, 췌장, 눈, 부신, 꼬리, 비장, 신장, 간, 방광, 위, 소장 및 대장에 비해 상당히 더 높고, 여기서 모든 기관에서의 모든 시점에서의 %ID/g는 5%ID/g를 초과하지 않는다. 방사성활성은 혈장 및 종양을 제외한 다른 기관에서 시간이 경과함에 따라 감소된다. 혈장 방사활성은 6 내지 96시간 사이에 약 70%가 감소된다.
종양의 방사활성은 초기에는 정상 기관에 비해 더 높다. 131I-GNX-8을 주사한지 48시간 후에 가장 높은 종양 흡수가 관찰되어 정상 상태(steady state)를 유지하지만, 다른 기관의 방사 활성은 감소된다. 따라서, 종양/기관 비는 다른 기관에서는 증가된다. 6 내지 24시간 사이에 혈장, 심장, 폐, 부신, 꼬리, 비장, 신장 및 간에서 급속하게 감소되는 방사활성이 관찰된다. 한편으로, 종양/혈장 비는 주사한지 6 내지 96시간후에 약 4배로 증가된다. 신장에서는 131I-GNX-8의 축적이 관찰되지 않는다.
Colo205 종양을 갖는 누드 마우스에서의 생체 내 종양 표적 활성을 영상 분석에 의해 연구한다. 시간 경과 실험을 수행하여 131I-GNX-8의 분포를 모니터링한다. 결과는 또한 대부분의 131I-GNX-8이 혈액에 위치하고, 주사한지 24 내지 72시간 후에 종양 표적화가 명확하게 가시화된다.
생체 내 자료는 대부분의 GNX-8이 주사된 후 혈액에 남아있음을 나타낸다. 다양한 정상 기관에서는 유의한 비-특이적 결합이 없다. 또한, GNX-8은 정맥내 주사된 후 신속하게 Colo205 종양을 향하고, 라벨링을 96시간동안 정상 상태(steady state) 수준으로 유지한다.
실시예
12: 독성
8 내지 9주령된 수컷 및 암컷 BALB/c AnN CrI BR 마우스(군당 6마리)에서 단일 투여 독성 연구를 수행한다. 150 mg/kg의 투여량의 GNX-8 또는 비히클(PBS) 단독을 마우스에게 정맥 주사한다. 모든 마우스의 체중을 연구 제1일, 제8일 및 제16일, 도살 전에 측정한다. 질병 및 사망의 증후에 대해 마우스를 관찰한다.
8주령된 수컷 스프라규-도레이 Crl CD(SD) 래트(군당 6마리)에서 반복 투여 독성 연구를 수행한다. 각각의 군에 비히클(PBS) 또는 3, 15 또는 75 mg/kg의 GNX-8을 4주동안 매주 2회 투여한다. 모든 동물의 사망율에 대해 매일 확인하고, 임의의 발견을 개별적으로 기록한다. 전처리 및 치료 기간동안 매주 래트의 체중을 재고, 시험종료시 도살할 때 마지막으로 하루밤 굶은 체중을 측정하였다. 시험종료시 도살할 때 혈액 샘플을 수집하고, 혈액학 및 임상 화학 변수에 대해 평가한다. 체중과 모든 시험된 변수의 차이의 유의성을 스튜던트 t 시험에 의해 결정한다.
정상적인 인간 조직에서 GNX-8의 교차 반응성을 측정하기 위해 매우 높은 투여량(150 ㎍/ml)의 바이오틴화된 GNX-8을 이용한다. 72개의 인간 조직을 갖는 티슈 어레이(3명의 정상 인간으로부터 수득한 24가지 유형의 정상 기관)(US 바이오맥스(Biomax) FDA 801-1)를 GNX-8로 염색한다. 약동학 연구의 Cmax에서 나온 결과에 근거하여, Cmax에서 GNX-8이 정상적인 인간 조직과 심각한 교차 반응성을 갖지 않는 것을 보증하도록 150 ㎍/ml의 GNX-8을 이용한다. 이 농도는 면역조직화학적 연구에서 일반적으로 이용되는 것보다 훨씬 높다.
위장관의 점막 상피, 유선관의 상피 세포 및 층을 이룬 편평상피 세포를 비롯한 상피 기원의 여러 인간 조직에서 약하거나 중간 정도의 GNX-8 염색이 관찰된다. [Finstad et al. Clin. Cancer Res., 3:1433-1442, 1997]의 이전의 발견에 따라, 순환하는 혈액으로 도입된 항체는 암종 세포로의 특이적 국소화를 나타내고, 항원-양성인 인접한 정상 상피 세포에서는 축적되지 않았다. 또한 항체는 기부 막을 가로지르지 않는다. 따라서, 정상 조직의 관의 상피 세포의 GNX-8에 의한 염색은 손실로서 간주되지 않는다.
정상 인간 혈액 세포에서 GNX-8의 교차 반응성을 조사하기 위해 2가지의 추가 연구를 수행한다. 4가지의 다양한 혈액 유형(ABO) 기증자에서 나온 모든 시험된 혈액 세포는 GNX-8에 대해 음성 반응을 나타낸다. 이 결과는 GNX-8이 혈액 세포에 결합하지 않는다는 사실을 지지한다. 따라서, 순환계에 투여된 GNX-8은 혈액 세포에 손상을 야기하지 않아야만 한다.
생체 내에서 GNX-8의 안전성을 해결하기 위해, 급성 및 아급성 독성 효과를 측정하는 2가지 연구를 수행한다.
GNX-8의 단일 투여 독성을 150 mg/kg이 투여된 BALB/c 마우스에서 시험한다. 마우스를 매일 관찰하고, 계획된 도살 이전에는 사망이 발견되지 않았다. 연구 기간동안의 모든 마우스의 체중이 증가하고, GNX-8 처리군과 대조군 사이에는 평균 체중 증가의 측면에서 유의한 상이점이 없었다.
GNX-8의 반복 투여 독성 시험을 스프라규 도레이 Crl CD 래트에서 수행한다. 8주령된 6마리의 동물을 군에 할당한다. 한 군에는 비히클(PBS)을 4주동안 매주 2회 투여한다. 2군, 3군 및 4군에는 각각 투여당 3, 15 및 75 mg/kg의 PBS중의 GNX-8을 4주동안 매주 2회 투여한다. 모든 동물을 매일 사망에 대해 조사하고, 모든 발견을 기록한다. 전처리 및 처리 기간동안 래트를 매주 칭량하고, 시험종료시 도살할 때 마지막으로 하룻밤 굶긴 체중을 수득한다. 도살시 혈액 시료를 수집하고, 혈액 및 임상 화학 변수에 대해 평가한다. 체중과 모든 시험된 변수의 차이의 유의성은 스튜던트 t 시험에 의해 결정한다.
GNX-8 처리와 관련된 독성의 임의의 임상적 징후가 없다. 최종 체중 증가량 분석 결과, 처리군과 대조군 사이에 차이가 없음을 나타낸다. 대조군과 고 투여량 군의 혈액 샘플을 하룻밤 굶긴 후 안락사시키기 전에 채취하여, 혈액학 및 임상 화학적 프로파일에 대해 분석한다.
고 투여량 군과 대조군 사이에는 헤모글로빈 양, 적혈구 용적, RBC 수, 평균 소체 체적, 평균 소체성 헤모글로빈 및 평균 소체성 헤모글로빈 농도의 측면에서 통계적으로 유의한 차이가 없다. 결과는 고투여량의 GNX-8을 반복 투여하여도 혈액학적 독성이 유도되지 않음을 나타낸다.
임상 화학적 분석을 위해, 대조군과 고-투여량 군에 대한 변수의 평균 값을 표 6에 나타낸다. 고 투여량의 항체의 반복적인 주사로 인해 생성된 것일 수 있는 총 단백질의 통계학적으로 유의한 증가가 고 투여량 군에서 주목된다. 또한, 알부민이 약간 증가한 것으로 관찰된다. 그러나, 이 값은 여전히 래트에 대한 정상 한계 범위 이내이다. 임상 화학 자료는 고 투여량의 GNX-8이 반복 주사된 후, 물질 대사 및 분비 기능에 주목할만한 손상이 없음을 보여준다.
혈액학 및 임상 화학 분석 둘 모두 4주의 기간에 걸친 반복적인 고 투여량 GNX-8 투여의 안전성을 입증한다.
실시예
13: 규모 증가
GNX-8의 대규모 생산을 위한 안정한 세포주를 수득하기 위해, 재조합 GNX-8(rGNX-8)을 발현하는 NS0 및 CHO 세포주를 수득한다. 간략하게, GNX-8의 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 암호화하는 cDNA를 원 하이브리도마로부터 클로닝한다. 그런 다음, 단리된 항체 유전자를 발현 벡터에서 재조립한다. 형질감염된 NS0 세포에 의해 컨디셔닝된 배지로부터 정제된 rGNX-8의 분자량을 SDS-PAGE에 의해 확인한다. rGNX-8 및 원 GNX-8 하이브리도마의 특이성, 결합 활성 및 효능을 HPTLC, 면역염색, 유동 세포 측정기 및 CDC 분석에 의해 비교한다.
원 GNX-8 항체와 재조합 GNX-8 항체 사이에는 차이점이 없다.
그런 다음, rGNX-8 및 GNX-8의 N-글라이코실화 프로파일을 MALDI-MS로 분석한다.
자료는 2가지 항체 사이의 매우 유사한 N-연결된 당 패턴을 나타낸다. 2가지 항체의 거의 모든 N-글리칸은 코어 푸코실화 구조를 함유하지만, 말단 시알릴산은 함유하지 않는다.
다이하이드로폴레이트 환원효소 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO/dhfr-) 세포(ATCC CRL-9096)를 5% FBS를 함유하고, 100 nM 하이포잔틴 및 16 μM 티미딘이 보충된 IMDM에서 유지시킨다. 재조합 GNX-8 생산 세포주를 제조하기 위해, 발현 벡터인 pCIck-GNX-8 DHFR을 BamHI을 이용하여 선형화시키고, 용액중의 회수된 DNA의 농도를 OD260 흡광에 의해 측정한다. 약 1.2x106 CHO/dhfr- 개의 세포를 10 ㎍의 선형화된 DNA 및 30 ㎕의 푸진(Fugene)6 형질감염 시약(로슈)으로 제조자의 지시에 따라 형질감염시켰다. 48시간 후, 형질감염체 선택을 위해 배양 배지를 5% 투석된 우태 혈청 함유 IMDM으로 대체하였다. 안정한 콜로니가 수득될 때까지 약 2주동안 선택을 계속한다. 여러 콜로니를 따고, 48웰 플레이트의 동일한 선택 배지에서 배양한다. 2차 항체로서 HRP-라벨링된 항-인간 IgG(Fc) 항체를 이용한 항체-특이적 ELISA에 의해 개별적인 CHO 클론을 rGNX-8 발현에 대해 스크리닝한다.
높은 수준의 항체를 발현하는 CHO 클론을 메토트렉세이트(MTX)를 이용한 후속적인 유전자 증폭에 대해 선택한다. 10 nM의 MTX 중에서의 유전자 증폭 결과 rGNX-8 분비가 30배 이상 증가된다. 안정한 CHO 클론을 CHO-rGNX-8.5M10라고 이름붙였다.
CHO-rGNX-8.5M10 세포를 나중에 진탕 플라스크에서 무-혈청 배양에 적응시키고 14일 배양동안 약 120 ㎍/ml의 GNX-8의 최대 수율을 달성한다. 배양 상층액을 수집하고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제한다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 CHO 배양 상층액으로부터 정제된 rGNX-8 항체는 SDS-PAGE 상에서 예상된 경쇄 및 중쇄 펩타이드 밴드를 나타낸다.
당 분야의 숙련자들은 단지 일상적인 실험을 이용하여 본원에 개시된 본 발명의 특정한 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하고 확인할 수 있을 것이다. 이런 등가물은 하기 특허청구범위에 포함되고자 한다.
SEQUENCE LISTING
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<212> PRT
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Met Ile Ser Arg Thr
1 5
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<212> DNA
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gcatgtacta gttttgtcac aagatttggg 30
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gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg 26
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gctctagatc atttacccgg agacagg 27
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 8
actcccagtt caattacagc 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 9
tggtttgtcc aaactcatc 19
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 10
gcatgtacta gttttgtcac aagatttggg 30
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 11
gttttcccag tcacgac 17
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 12
gcgaattcac catggcctgg acttcac 27
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer
<400> 13
gccgtacgta ggacagtgac cttggttc 28
<210> 14
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 14
ggactggtga agccctcgca gaccctctca ctcacctgtg ccatctccgg ggacagtgtc 60
tctagcaaga gtgttgcttg gaactggatc aggcagtccc cattgagagg ccttgagtgg 120
ctgggaagga catactacag gtccaagtgg tataatgaat atgcagtatc tgtgaaaagt 180
cgaataacca tcaatccaga cacatccaag aaccagttct ccctgcacct gaactctgtg 240
actcccgagg acacggctgt gtattactgt gcaagaaact ttgactactg gggccaggga 300
accctggtca ccgtctcc 318
<210> 15
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 15
Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser
1 5 10 15
Gly Asp Ser Val Ser Ser Lys Ser Val Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln
20 25 30
Ser Pro Leu Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser
35 40 45
Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile
50 55 60
Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu His Leu Asn Ser Val
65 70 75 80
Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Phe Asp Tyr
85 90 95
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105
<210> 16
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 16
ctcaccacag cacctggtgg aacagtcata ctcacttgtc gctcaagtac tggggctgtt 60
acaactaata actatgccaa ctgggtccaa gaaaaaccag atcatttatt cactggtcta 120
atagatgcta ccagcaaccg agttccaggt gttcctgtca gattctccgg ctccctgatt 180
ggagacaagg ctgccctcac catcacaggg gcacagactg aggatgatgc aatgtatttc 240
tgtgctctat ggtacaacac ccattttgtt ttcggcggtg gaaccaaggt cactgtccta 300
<210> 17
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 17
Leu Thr Thr Ala Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Arg Ser Ser
1 5 10 15
Thr Gly Ala Val Thr Thr Asn Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys
20 25 30
Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Asp Ala Thr Ser Asn Arg Val
35 40 45
Pro Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala
50 55 60
Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Asp Ala Met Tyr Phe
65 70 75 80
Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Thr His Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
85 90 95
Val Thr Val Leu
100
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 18
Gly Asp Ser Val Ser Ser Lys Ser Val Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 19
ggggacagtg tctctagcaa gagtgttgct 30
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 20
Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn
1 5
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 21
acatactaca ggtccaagtg gtataat 27
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 22
Ala Arg Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 23
gcaagaaact ttgactac 18
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 24
Thr Gly Ala Val Thr Thr Asn Asn Tyr
1 5
<210> 25
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 25
actggggctg ttacaactaa taactat 27
<210> 26
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 26
Ala Thr Ser
1
<210> 27
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 27
gctaccagc 9
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 28
Ala Leu Trp Tyr Asn Thr His Phe Val
1 5
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 29
gctctatggt acaacaccca ttttgtt 27
Claims (15)
- Leb를 함유하는 연장된 I형 쇄를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하고, 인간의 적혈구에 결합하지 않으며, 상기 에피토프가 암 세포 상에서 발현되는, 인간의 모노클론 항체 또는 이의 항체 결합 부분.
- 제 1 항에 있어서,
Lex에 결합하지 않는 항체. - 제 1 항에 있어서,
Ley에 결합하지 않는 항체. - 제 1 항에 있어서,
Ley-Lex에 결합하지 않는 항체. - 제 1 항에 있어서,
약 5 ㎍/ml의 항체 농도에서 약 20/1의 E/T 비에서 수행된 ADCC 분석에서 Colo205 세포의 약 50%를 용균시키는 항체. - 제 1 항에 있어서,
암 세포가 Leb-Lea를 발현하는 항체. - 제 1 항에 있어서,
암 세포가 상피 세포인 항체. - 제 7 항에 있어서,
상피 세포가 결장, 직장, 식도, 폐, 전립선, 유방 또는 췌장을 포함하는 항체. - 제 1 항에 있어서,
상기 항체의 결합 부분이 scFv인 항체. - 제 1 항에 있어서,
κ쇄를 포함하는 항체. - 제 1 항에 있어서,
γ쇄를 포함하는 항체. - 제 1 항에 있어서,
GNX-8에서 수득된 CDR 영역을 포함하는 항체. - 제 1 항의 항체 및 약학적 활성 물질을 포함하는 조성물.
- 제 1 항의 항체 및 검출가능한 잔기를 포함하는 제조품.
- 제 1 항의 항체, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물.
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