MX2011002478A - Anticuerpo anti-glucoesfingolipido tipo i extendido, derivados del mismo y su uso. - Google Patents

Abstract

Se proveen anticuerpos humanos y porciones de unión a antígeno de dichos anticuerpos que se unen específicamente a glucoesfingolípidos de cadena tipo I extendida.

Description

ANTICUERPO ANTI-GLUCOESFINGOLÍPIDO TIPO I EXTENDIDO.

DERIVADOS DEL MISMO Y SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos anti-glucoesfingolípido tipo I extendido, y su uso en la mejora, el tratamiento o la prevención de enfermedades o trastornos en mamíferos, incluyendo humanos, que resultan de la actividad o el metabolismo inadecuado del mismo; que resultan, que causan o que están asociados con el mismo; o la presencia del mismo, por ejemplo, en un cáncer, tal como cáncer colorrectal u otra patología. Un anticuerpo de interés puede usarse para propósitos terapéuticos o propósitos de diagnóstico. De esta manera, se describen también composiciones , profilácticas, inmunoterapéuticas y de diagnóstico que comprenden los anticuerpos y derivados de los mismos de interés, y su uso en métodos para prevenir o tratar o diagnosticar enfermedades en mamíferos, incluyendo humanos, causadas por el metabolismo y/o la expresión inadecuados del glucoesfingolípido tipo I extendido en y sobre células, tales como ciertas células malignas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El glucoesfingolípido tipo I extendido es una molécula de la superficie de la célula que puede estar asociada con, por ejemplo, ciertos estados malignos.

Se ha observado que la glucosilación aberrante es una característica común de muchos tipos de cáncer; véase Hakomori, PNAS 99: 10231-10233, 2002. Algunos de los antígenos de carbohidrato usados para el diagnóstico de cánceres humanos poseen estructuras de polilactosamina. Las polilactosaminas se clasifican usualmente en dos categorías de acuerdo con la estructura unitaria. Una polilactosamina que tiene la estructura Galp1?3G1cNAc se denomina una cadena tipo I, y aquella que tiene la estructura Gaipi?4G1cNAc es referida como una cadena tipo II. Los antígenos más comunes asociados con tumores encontrados en algunos cánceres humanos tienen la estructura de cadena tipo II de la serie lacto, la cual es usualmente sialilada y/o fucosilada. Los antígenos de cadena tipo I son abundantes en células y tejidos normales, y ocasionalmente están asociados con cáncer; véase Stroud et al., JBC 266: 8439-8446, 1991. Por ejemplo, el antígeno Lea 2?3 sialilado (el antígeno CA 19-9 definido por el anticuerpo N 19-9) es un antígeno de cadena tipo I asociado con cáncer. Sin embargo, los métodos de diagnóstico del cáncer basados en la detección de aquellos antígenos tipo I han sido impedidos por las altas incidencias de falsos positivos y/o altas incidencias de falsos negativos; véase, por ejemplo, las patentes de E.UA Nos. 6,083,929 y 6,294,523.

Dos anticuerpos monoclonales de ratón, NCC-ST421 e IMH2, fueron producidos contra antígenos de cadena tipo I extendida. NCC-ST421 es específico de Lea-Lea. El anticuerpo NCC-ST421 indujo fuertemente citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) usando leucocitos de sangre periférica humana como efectores contra una variedad de células tumorales humanas, e indujo citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) con una fuente de complemento humana; véase Watanabe et al., Cáncer Res. 51 : 2199-2204, 1991. Se encontró que el antígeno Lea-Lea es altamente expresado en la línea de células de carcinoma de colon humano, Colo205.

IMH2 fue también establecido contra cadenas tipo I extendidas. IMH2 se unió a Leb-Lea, Ley-Lex, Leb y Ley con base en 1H-RMN, FAB-MS y estudios de degradación enzimática; véase Stroud et al., Eur. J. Biochem. 203: 577-586, 1992. IMH2 mostró fuerte destrucción activada por linfocitos, así como destrucción dependiente del complemento, de células Colo205 in vitro, e inhibió el crecimiento de Colo205 in vivo.

IMH2 reaccionó con tejidos de carcinoma derivados de colon, páncreas, hígado y endometrio. Sin embargo, el colon normal no mostró reactividad con IMH2. El hígado y el páncreas normales mostraron reactividad débil o altamente restringida en hepatocitos e islotes de células de Langerhans normales. La intensidad de la tinción inmunoquímica fue mucho más fuerte en carcinomas endometriales, que en endometrio normal; véase Ito et al., Cáncer Res. 52: 3739-3745, 1992.

NCC-ST421 e IMH2 exhiben inhibición del crecimiento tumoral en ratones desnudos después de inoculación de células tumorales humanas que expresan el antígeno de cadena tipo I extendida, pero no ocurrió inhibición del crecimiento en células tumorales que no expresaron el antígeno de cadena tipo I extendida.

Debido a la abundancia de estructuras tipo I en células normales, el uso de anticuerpos tipo I para propósitos de diagnóstico y/o terapéuticos no fue hasta ahora posible.

Los tratamientos convencionales del cáncer, tales como la quimioterapia y la radioterapia, han mostrado algunas ventajas en varios pacientes con cáncer. A pesar de los beneficios de la actividad antitumoral en las terapias convencionales, sin embargo, la toxicidad inducida por el tratamiento hacia los tejidos normales puede reducir sustancialmente la calidad de vida en los pacientes con cáncer. La intensificación de la dosis para mejor actividad antitumoral es también limitada. Los anticuerpos monoclonales permiten la promesa de citotoxicidad dirigida, enfocándose en tejidos tumorales, pero no en tejidos normales.

Pueden desarrollarse anticuerpos monoclonales (mAbs) con alta especificidad por antígenos expresados en células tumorales, y pueden inducir actividades antitumorales deseadas. La promesa de los mAbs fue favorecida por el desarrollo de ratones que producen mAbs completamente humanos. Una de dichas herramientas es el ratón KM; véase la patente de E.UA No. 7,041 ,870 y Tomizuka et al., Nat. Genet. 16: 133-143, 1997. En el ratón KM, los genes de ratón que codifican para inmunoglobulinas fueron inactivados y reemplazados con genes de anticuerpos humanos. De esta manera, el ratón KM expresa anticuerpos completamente humanos.

Varios anticuerpos completamente humanos se han desarrollado exitosamente usando el ratón KM.

Por ejemplo, Motoki et al., desarrollaron una IgG humana (KMTR2) que dirigió la oligomerización de TRAIL-R2 dependiente del anticuerpo e inició la señalización apoptótica y la regresión tumoral eficientes independientes de la función efectora del hospedero (Clin. Cáncer Res. 11 (8): 3126-3135, 2005; y véase la patente de E.U.A. No. 7,1 15,717 e Imakire et al., Int. J. Cáncer 108: 564-570, 2004). HD8, un anticuerpo monoclonal completamente humano específico del antígeno DR de leucocitos humanos (HLA-DR), ejerció citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), así como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) in vitro, y extendió la duración de vida de los ratones inmunocomprometidos inoculados con líneas de células de linfoma no de Hodgkin; véase Tawara et al., Cáncer Sci. 98 (6) 921 -928, 2007.

Además, se reportaron dos IgMs humanas producidas en ratones KM y dirigidas hacia antígenos de carbohidrato. HMMC-1 reconoce específicamente una estructura de O-glucano novedosa, reacciona positivamente con los carcinomas relacionados con los conductos mulerianos, y exhibe citotoxicidad dependiente del complemento en una línea de células de cáncer endometrial uterino humano, SNG-S; véase Nozawa et al., Clin Cáncer Res. 10: 7071-7078, 2004. Otra IgM monoclonal humana, HMOCC-1 , que reconoce una glucoproteína localizada en la membrana celular, reaccionó con el cáncer de ovario (Suzuki et al., Gynecol. Oncol. 95: 290-298, 2004). Puesto que estos dos anticuerpos son moléculas de IgM, la aplicación de esos anticuerpos en la terapia del cáncer debe ser limitada por el tamaño de la molécula y restricciones en producción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee anticuerpos humanos novedosos, y fragmentos y derivados de los mismos, que se unen específicamente al glucoesfingolípido tipo I extendido.

La invención incluye las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera variable de los anticuerpos y sus secuencias de ácido nucleico correspondientes.

Otra modalidad de la invención incluye las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos de interés, para obtener moléculas de unión que comprenden una o más regiones CDR, o regiones derivadas de CDR, que retienen la capacidad de unión al glucoesfingolípido tipo I extendido de la molécula precursora de la cual las CDRs se obtuvieron.

Otra modalidad de la presente invención incluye las líneas de células y vectores que albergan las secuencias de anticuerpos de la presente invención.

Otra modalidad de la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos en la preparación de un medicamento o composición para el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la función, el metabolismo y la expresión del glucoesfingolípido tipo I extendido.

Otra modalidad de la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos en el diagnóstico de trastornos asociados con la biología y la expresión atípica o anormal del glucoesfingolípido tipo I extendido.

Estos y otros propósitos se cubrieron en el desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos contra antígenos de carbohidrato de cadena tipo I extendida. Por ejemplo, el mAb GNX-8 es una lgG1 humana derivada de un ratón KM. GNX-8 exhibe actividad de CDC y ADCC en varias líneas de células de cáncer colorrectal humano, e inhibe el crecimiento tumoral de Colo205 y DLD-1 in vivo. GNX-8 reacciona con los cánceres colorrectales metastásico y primario, cánceres de mama, cánceres de páncreas, así como cánceres de pulmón, pero no con células sanguíneas y tejidos humanos normales.

Otras características y ventajas se describen en la presente, y serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención no se limita a la metodología, protocolos, polipéptidos, polinucleótidos, líneas de células, vectores o reactivos particulares descritos en la presente, debido a que pueden ocurrir variaciones o pueden usarse sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención. Además, la terminología usada en la presente es con el propósito de ejemplificar sólo modalidades particulares, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos y cualquier acrónimo usado en la presente, tienen los mismos significados como los entienden comúnmente los expertos en la técnica en el campo de la invención. Cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente puede usarse en la práctica de la presente invención, y sólo ejemplos de métodos, dispositivos y materiales se describen en la presente.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la presente se incorporan enteramente en la presente como referencia con el propósito de describir las proteínas, enzimas, vectores, células hospederas y metodologías reportadas en la presente que podrían usarse con y en la presente invención. Sin embargo, nada en la presente se considerará como una admisión de que la invención no está titulada para preceder a dichas descripciones en virtud de la invención previa.

Una "enfermedad por glucoesfingolípido tipo I extendido", es un mal, trastorno, enfermedad, patología, condición, anormalidad, etc., que se caracteriza por, está asociado con, o es causado por, el metabolismo anormal, la sobreexpresión o los niveles incrementados del glucoesfingolípido tipo I extendido, por ejemplo, en la superficie de la célula.

La frase "sustancialmente idéntica" con respecto a una secuencia de polipéptidos del anticuerpo, puede considerarse como una cadena de anticuerpos que exhibe por lo menos 70%, 80%, 90%, 95% o más identidad de secuencia con una secuencia de polipéptidos de referencia. El término con respecto a una secuencia de ácido nucleico puede considerarse como una secuencia de nucleótidos que exhibe por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 97% o más identidad de secuencia, con una secuencia de ácido nucleico de referencia.

Los términos "identidad" u "homología" pueden significar el porcentaje de bases de nucleótidos o residuos de aminoácido en la secuencia candidata que es idéntico con los residuos de una secuencia correspondiente con la cual la secuencia candidata se compara, después de que se alinean las secuencias y se introducen espacios intermedios, si es necesario, para lograr el máximo por ciento de identidad para la secuencia entera, y no considerando sustitución conservativa alguna como parte de la identidad de secuencia. Ni las inserciones, ni las extensiones N-terminales o C-terminales, debe considerarse que reducen la identidad u homología. Métodos y programas de cómputo para la alineación de las secuencias están disponibles y son bien conocidos en la técnica. Puede medirse la identidad de secuencia usando un software de análisis de la secuencia.

Las frases y términos "fragmento, variante, derivado o análogo funcional", y similares, así como formas de los mismos, de un anticuerpo, ácido nucleico o antígeno, corresponden a un compuesto o molécula que tiene actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo o antígeno de longitud completa de interés. Por ejemplo, un fragmento o análogo funcional de un anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido, es uno que puede unirse a una molécula de glucoesfingolípido tipo I extendido, o es un anticuerpo agonista o antagonista que se une al glucoesfingolípido tipo I extendido. Un ejemplo es una molécula de scFv. En cuanto al glucoesfingolípido tipo I extendido, una variante o derivado del mismo es una molécula que no es idéntica a un glucoesfingolípido tipo I extendido de ocurrencia natural, y sin embargo puede usarse para un propósito de la presente invención tal como mientras que no es idéntico a un glucoesfingolípido tipo I extendido de tipo silvestre puede usarse, no obstante, por ejemplo, como inmunógeno para producir anticuerpos que se unen selectivamente al glucoesfingolípido tipo I extendido de tipo silvestre.

Las variantes "sustitucionales", son aquellas que tienen por lo menos un residuo de aminoácido en una secuencia nativa removido y reemplazado con un diferente aminoácido insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser individuales, en donde sólo un aminoácido en la molécula es sustituido, o pueden ser múltiples, en donde dos o más aminoácidos son sustituidos en la misma molécula. Las sustituciones plurales pueden ser en sitios consecutivos. Asimismo, un aminoácido puede ser reemplazado con residuos plurales, en cuyo caso dicha variante comprende una sustitución y una inserción.

Las variantes "insercionales", son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a un aminoácido, significa unido al grupo funcional a-carboxilo o a-amino del aminoácido.

Las variantes "delecionales", son aquellas con uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos nativa removidos. Ordinariamente, las variantes delecionales tendrán uno o dos aminoácidos deletados en una región particular de la molécula.

Los términos variantes de sustitución, inserción y deleción se aplican también análogamente a ácidos nucleicos.

La respuesta inmune adaptativa tiene dos brazos principales: la respuesta inmune celular de linfocitos T y la respuesta inmune humoral de linfocitos B que secretan anticuerpos. Los epítopes de células B pueden ser aminoácidos contiguos lineales, o pueden ser conformacionales (véase Protein Science (2005) 14, 246). En contraste, los epítopes de células T son péptidos lineales cortos que son separados de proteínas antigénicas que se presentan en el contexto de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) o, en el caso de humanos, moléculas clase I o clase II del antígeno de leucocitos humanos (HLA). La presentación del epítope depende de las interacciones del receptor de células T (TCR) y la unión entre el MHC y el péptido. Las proteínas del MHC son altamente polimórficas, y cada una se une a una serie limitada de péptidos. De esta manera, la combinación particular de alelos del MHC presentes en un hospedero limita la gama de epítopes potenciales reconocidos durante una infección.

Dos tipos fundamentales de células T se distinguen por la expresión de proteínas CD8 y CD4, que determina si una célula T reconocerá a los epítopes presentados por las moléculas clase I o clase II, respectivamente. Los epítopes de células T positivas para CD4 son procesados después de la encapsulacíón por células que presentan antígeno en vesículas unidas a la membrana, en donde el antígeno es degradado por proteasas en fragmentos de péptidos que se unen a las proteínas clase II del MHC. En contraste, las células T positivas para CD8 reconocen generalmente antígenos virales o autoantígenos expresados desde dentro de una célula, proteínas que son separadas en péptidos cortos en el citosol por el inmunoproteasoma. Después de la separación, los péptidos son translocados por el transportador asociado con el procesamiento del antígeno (TAP) en el retículo endoplásmico para impregnación en los antígenos HLA 1. Los epítopes de células T (auxiliares) positivas para CD4, son críticos porque dirigen las respuestas inmunes dependientes de células T hacia los antígenos de proteína.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio, e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos), fragmentos de anticuerpo o polipéptidos sintéticos que poseen una o más secuencias de CDR o secuencias derivadas de CDR, en tanto los polipéptidos exhiban la actividad biológica deseada. Los anticuerpos (Abs) y las inmunoglobulinas (Igs) son glucoproteínas que tienen las mismas características estructurales. En genera!, se considera a los anticuerpos como Igs con una especificidad definida o reconocida. De esta manera, mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un objetivo específico, las inmunoglobulinas incluyen anticuerpos y otras moléculas tipo anticuerpo que carecen de especificidad por el objetivo.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, etc.) o subclase (por ejemplo, IgG-i , lgG2, lgG2a, lgG3, lgG , IgA-i , lgA2, etc.) ("tipo" y "clase" y "subtipo" y "subclase" se usan recíprocamente en la presente). Los anticuerpos nativos o de tipo silvestre, es decir, obtenidos de un miembro de una población no artificialmente manipulado, anticuerpos e inmunoglobulinas, y monómeros de anticuerpos poliméricos tales como IgA e IgM, son usualmente glucoproteínas heterotetrameras de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo.

Por el término "no artificialmente manipulado", se entiende no tratado por medios no naturales, tales como inmunización o transformación, que contiene o que expresa una molécula extraña de unión al antígeno. El tipo silvestre puede referirse al alelo o especie más frecuente encontrado en una población, o al anticuerpo obtenido de un animal no artificialmente manipulado, así como a los alelos o polimorfismos de ocurrencia natural que surgen naturalmente y pueden ser sustentados en una población, o una variante o derivado que surge a través de medios naturales, tales como una malignidad, en comparación con el obtenido por una forma de manipulación, tal como mutagénesis, el uso de métodos recombinantes, etc., para cambiar un aminoácido de la molécula de unión al antígeno. El uso del término es fácilmente inferido y entendido por el experto en la técnica en el contexto de la oración, párrafo, concepto, pensamiento, idea, etc., en el cual el término se encuentra, se usa, etc.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido", significa un anticuerpo o polipéptido derivado que se une específicamente a un glucoesfingolípido tipo I extendido humano.

El término "variable" en el contexto de un dominio variable de anticuerpos, se refiere a ciertas porciones de una molécula pertinente que difieren extensivamente en secuencia entre los anticuerpos, y puede ser integral en el reconocimiento y unión específicos de un anticuerpo particular a un objetivo particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos.

La variabilidad puede estar concentrada en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDRs; es decir, CDR1 , CDR2 y CDR3), conocidas también como regiones hipervariables, en los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las secuencias o regiones de estructura (FR). Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan principalmente una configuración de lámina ß, unidas por tres CDRs, que forman bucles que unen, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de lámina ß. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas, con frecuencia en proximidad, por las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al objetivo (epítope o determinante) de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Una CDR, tal como la CDR3 de la cadena pesada, puede poseer sólo la capacidad para unirse específicamente al epítope cognado.

Como se usa en la presente, la numeración de los residuos de aminoácido de inmunoglobulina se hizo de acuerdo con el sistema de numeración de residuos de aminoácido de inmunoglobulina de Kabat et al., a menos que se indique de otra manera.

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de una cadena de longitud completa o una cadena intacta de un anticuerpo, generalmente la región variable o de unión al objetivo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, fragmentos Fa , Fab', (ab-)2 y Fv. Un "fragmento funcional" o "análogo de un anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido", es uno que puede unirse a un antígeno cognado. Como se usa en la presente, el fragmento funcional es generalmente sinónimo de "fragmento de anticuerpo" y con respecto a anticuerpos, puede referirse a fragmentos tales como Fv, Fab, (AB )2, etc., los cuales pueden unirse a un antígeno cognado.

Un fragmento "Fv" consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en una asociación no covalente (dímero de VH-VL). Esta configuración de tres CDRs de cada dominio variable interactúa para definir un sitio de unión al objetivo del dímero de VH-VL como en un anticuerpo intacto. En conjunto, las seis CDRs confieren especificidad de unión al objetivo en el anticuerpo intacto. Sin embargo, incluso un dominio variable individual (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDRs específicas de un objetivo) puede tener la capacidad de reconocer y de unirse al objetivo.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla", "sFv" o "scAb" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde los dominios están presentes en una cadena polipeptídica individual. En general, el polipéptido de Fv comprende además un enlazador de polipéptidos, con frecuencia una molécula flexible tal como un oligopéptido, que puede obtenerse de una molécula de ocurrencia natural, puede derivarse de una molécula de ocurrencia natural, es una secuencia artificial tal como poliglicina, etc., entre los dominios VH y VU, lo cual permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al objetivo. Algunas moléculas pueden incluir uno o más dominios constantes, o una porción de los mismos.

El término "cuerpos dobles o completos", se refiere a construcciones de fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos pueden comprender un dominio variable de cadena pesada (VH) unido a un dominio variable de cadena ligera (Vi.) en la misma cadena polipeptídica. Mediante el uso de un enlazador que sea demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios variables en la misma cadena, los dominios del cuerpo doble son forzados a aparearse con los dominios de unión de otra cadena para crear un sitio de unión al antígeno.

El fragmento Fab contiene los dominios variable y constante de la cadena ligera y el dominio variable y el primer dominio constante (CHL) de la cadena pesada. Los fragmentos Fat>' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxilo del dominio CHi que incluye una o más cisternas de la región de gozne del anticuerpo. Pueden producirse fragmentos Fab- por el desdoblamiento del enlace disulfuro en las cisteínas de la región de gozne del producto de digestión F(AB')2 con pepsina. Otros tratamientos enzimáticos y químicos de los anticuerpos pueden dar otros fragmentos funcionales de interés.

El término "anticuerpo monoclonal" (mAb o MAb), como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, salvo por posibles mutaciones de ocurrencia natural que pueden estar presentes en cantidades menores.

Los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente en la presente anticuerpos "quiméricos", en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase (tipo o subtipo) de anticuerpo particular, siendo el resto de las cadenas idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto los anticuerpos quiméricos exhiban la actividad biológica deseada de unión al glucoesfingolípido tipo I extendido o fijen firmemente la actividad o el metabolismo del glucoesfingolípido tipo I extendido (véase la patente de E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc Nati Acad Sci USA 81 : 6851 (1984)). De esta manera, las CDRs de una clase de anticuerpo pueden ser injertadas en el FR de un anticuerpo de diferente clase o subclase.

Los anticuerpos monoclonales son específicos, siendo dirigidos contra un sitio objetivo, epítope o determinante individual. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) de un antígeno, cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un determinante individual en el objetivo. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos, siendo sintetizados por una célula hospedera, no contaminados por otras inmunoglobulinas, y proveen la clonación del gen relevante y el ARNm que codifica para las cadenas de anticuerpo del mismo. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se considerará que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso con la presente invención pueden aislarse de colecciones de anticuerpos de fagos usando técnicas bien conocidas, o pueden purificarse de una preparación policlonal. Los anticuerpos monoclonales precursores que se usarán de conformidad con la presente invención pueden obtenerse por el método de hibridomas descrito por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o pueden obtenerse por métodos recombinantes bien conocidos en la técnica.

Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino), son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab )2, u otras subsecuencias de unión al objetivo de los anticuerpos), que contienen secuencias derivadas de inmunoglobulina no humana, en comparación con un anticuerpo humano. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente un dominio variable, y típicamente dos dominios variables, en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia molde de inmunoglobulina humana.

El anticuerpo humanizado puede comprender también por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella del molde de inmunoglobulina humana elegido. En general, el propósito es tener una molécula de anticuerpo de cierta especificidad que sea mínimamente inmunógena en un humano. De esta manera, es posible que uno o más aminoácidos en una o más CDRs puedan ser cambiados también por uno que sea menos inmunógeno para un hospedero humano, sin que minimice sustancialmente la función de unión especifica de una o más CDRs al glucoesfingolípido tipo I extendido.

En forma alternativa, la FR puede ser no humana, pero aquellos aminoácidos más ¡nmunógenos son reemplazados con unos menos inmunógenos. Sin embargo, la realización de injertos de CDRs, como se discutió anteriormente, no es la única manera de obtener un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, la modificación de sólo las regiones CDR puede no ser suficiente para optimizar un anticuerpo, ya que no es raro que los residuos de estructura tengan una función en la determinación de la estructura tridimensional general de los bucles de CDR y la afinidad general del anticuerpo por el ligando.

Por lo tanto, cualquier medio puede ponerse en práctica para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo, de modo que la molécula de anticuerpo precursora no humana sea modificada para que sea una que sea menos inmunógena para un humano, y la identidad de secuencia global con un anticuerpo humano no es siempre una necesidad. De esta manera, la humanización puede lograrse también, por ejemplo, por la mera sustitución de sólo unos cuantos residuos, en particular aquellos que están expuestos sobre la superficie de la molécula de anticuerpo y no enterrados dentro de la molécula y, por ende, no fácilmente accesibles al sistema inmune del hospedero. Dicho método se enseña en la presente con respecto a la sustitución, por ejemplo, de residuos cargados o algunos otros residuos en la molécula de anticuerpo, siendo el propósito reducir o amortiguar la inmunogenicidad de la molécula resultante sin que se comprometa la especificidad del anticuerpo por el determinante o epítope cognado. Véase, por ejemplo, Studnicka et al., Prot Eng 7(6): 805-814, 1994; Mol Imm 44: 1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151 : 2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196: 901 (1987); Cárter et al., Proc Nati Acad Sci USA 89: 4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151 : 2623 (1993), documento WO 2006/042333 y patente de E.U.A. No. 5,869,619.

Estrategias y métodos para volver a igualar anticuerpos, y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos dentro de un hospedero diferente se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,639,641. En resumen, en un método preferido, (1) alineaciones de las posiciones de un grupo de regiones variables de cadena ligera y pesada de anticuerpo se generan para dar posiciones expuestas en la superficie de estructura de la región variable de cadena ligera y pesada, en donde las posiciones de la alineación para todas las regiones variables son por lo menos aproximadamente 98% idénticas; (2) una serie de residuos de aminoácido expuestos en la superficie de estructura de la región variable de cadena ligera y pesada se define para un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de roedor (o fragmento del mismo); (3) se identifica una serie de residuos de aminoácido expuestos en la superficie de estructura de la región variable de cadena ligera y pesada que es más estrechamente idéntica a la serie de residuos de aminoácido expuestos en la superficie de roedor; y (4) la serie de residuos de aminoácido expuestos en la superficie de estructura de la región variable de cadena ligera y pesada definida en el paso (2), es sustituida con la serie de residuos de aminoácido expuestos en la superficie de estructura de la región variable de cadena ligera y pesada identificada en el paso (3), salvo por aquellos residuos de aminoácido que están dentro de aproximadamente 5Á de cualquier átomo de cualquier residuo de una CDR, por ejemplo, del anticuerpo de roedor, para dar un anticuerpo humanizado tal como un anticuerpo de roedor que retiene la especificidad de unión.

Los anticuerpos pueden ser humanizados por una variedad de otras técnicas, que incluyen realización de injertos de CDRs (véase los documentos EPO 0 239 400; WO 91/09967; y las patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101 y 5,585,089), revestimiento o reigualación (véase los documentos EPO 0 592 106; EPO 0 519 596; Padlan, 1991 , Molec Imm 28(4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6): 805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS 91 : 969-973) y entremezclado de cadenas (véase la patente de E.U.A. No. 5,565,332). Pueden obtenerse anticuerpos humanos por una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a, métodos de exhibición de fagos; véase las patentes de E.U.A. Nos. 4,444,887, 4,716,111 , 5,545,806 y 5,814,318; y los documentos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741 , usando animales transgénicos tales como roedores (ratones Amgen, Kirin y Merdarex), usando células quiméricas, etc.

El término "homólogo de anticuerpo" u "homólogo" se refiere a cualquier molécula que se une específicamente al glucoesfingolípido tipo I extendido como se enseña en la presente. De esta manera, un homólogo de anticuerpo incluye un anticuerpo nativo o recombinante, ya sea modificado o no, porciones de anticuerpos que retienen las propiedades biológicas de interés, tales como unión al glucoesfingolípido tipo I extendido, tal como una molécula de Fab o Fv, un anticuerpo de cadena sencilla, un polipéptido que posee una o más regiones CDR, etc. La secuencia de aminoácidos del homólogo no necesita ser idéntica a la del anticuerpo de ocurrencia natural, pero puede ser alterada o modificada para llevar aminoácidos sustitutos, aminoácidos insertados, aminoácidos deletados, aminoácidos diferentes de los veinte aminoácidos encontrados normalmente en proteínas, etc., para obtener un polipéptido con propiedades mejoradas u otras propiedades benéficas.

Los anticuerpos con secuencias homologas, son aquellos anticuerpos con secuencias de aminoácidos que tienen homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de glucoesfingolípido tipo I extendido de la presente invención. De preferencia, la homología es con la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de un anticuerpo de la presente invención. El término "homología de secuencia", como se aplica a una secuencia de aminoácidos en la presente, se define como una secuencia con por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o más homología de secuencia, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología de secuencia con otra secuencia de aminoácidos, según se determina, por ejemplo, por el método de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman, Proc Nati Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988).

Un anticuerpo quimérico, como se enseñó anteriormente en la presente, es uno con diferentes porciones de un anticuerpo derivadas de diferentes fuentes, tales como diferentes anticuerpos, diferentes clases de anticuerpo, diferentes especies animales, por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de murino apareada con una región constante de inmunoglobulina humana, etc. De esta manera, un anticuerpo humanizado es una especie de anticuerpo quimérico. Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica; véase, por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125: 191-202; y las patentes de E.U.A. Nos. 5,807,715, 4,816,567 y 4,816,397.

Los anticuerpos artificiales incluyen fragmentos scFv, anticuerpos quiméricos, cuerpos dobles, cuerpos triples, cuerpos cuádruples y mru (véase las revisiones por Winter y ilstein, 1991 , Nature 349: 293-299; y Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11 : 548-557), cada uno con capacidad de unión al antígeno o de unión al epítope. En el fragmento Fv de cadena sencilla (svFv), los dominios VH y \A_ de un anticuerpo son enlazados por un péptido flexible. Típicamente, el enlazador es un péptido de aproximadamente 15 aminoácidos. Si el enlazador es mucho más pequeño, por ejemplo, 5 aminoácidos, se forman cuerpos dobles, los cuales son dímeros de scFv bivalentes. Si Incluidos también dentro del alcance de la invención, son los equivalentes funcionales de un anticuerpo de interés. El término "equivalentes funcionales" incluye anticuerpos con secuencias homologas, homólogos de anticuerpo, anticuerpos quiméricos, variantes de anticuerpo, derivados de anticuerpo, anticuerpos artificiales y anticuerpos modificados, por ejemplo, en donde cada equivalente funcional se define por la capacidad para unirse al glucoesfingolípido tipo I extendido. El experto en la técnica entenderá que existe un traslape en el grupo de moléculas denominadas "fragmentos de anticuerpo" y el grupo denominado "equivalentes funcionales". Métodos para producir equivalentes funcionales que retienen la capacidad de unión al glucoesfingolípido tipo I extendido son conocidos por el experto en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 93/21319, EPO No. 239,400, WO 89/09622, EPO No. 338,745 y EPO No. 332,424.

Los equivalentes funcionales de la presente solicitud incluyen también anticuerpos modificados, por ejemplo, anticuerpos modificados por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos modificados incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, desamidación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos bloqueadores/protectores conocidos, desdoblamiento proteolítico, enlace con un ligando celular, enlace con una toxina o porción citotoxica u otra proteína, etc. La unión covalente no necesita dar un anticuerpo que sea inmune de la generación de una respuesta anti-idiotípica. Las modificaciones pueden lograrse por técnicas conocidas que incluyen, pero no están limitadas a, desdoblamiento químico específico, acetilación, formilación, síntesis metabólica, conjugación química, etc. Además, los anticuerpos modificados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Muchas técnicas están disponibles para el experto en la técnica que permiten la optimización de la afinidad de unión. Típicamente, las técnicas implican la sustitución de varios residuos de aminoácido en el sitio de interés, seguida de un análisis de la afinidad de unión del polipéptido muíante por el antígeno o epítope cognado.

Una vez que el anticuerpo es identificado y aislado, con frecuencia es útil generar un mutante o anticuerpo variante, o muteína, en donde uno o más residuos de aminoácido son alterados, por ejemplo, en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo. En forma alternativa, o además, una o más alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de los residuos de estructura pueden ser introducidas en el anticuerpo, en donde éstas resultan en una mejora en la afinidad de unión del mutante de anticuerpo por el glucoesfingolípido tipo I extendido.

Ejemplos de residuos de la región de estructura que pueden ser modificados, incluyen aquellos que se unen no covalentemente directamente al antígeno (Amit et al., Science 233: 747-753 (1986)); interactúan con/afectan la conformación de una CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); y/o participan en la interfaz VL-VH (véase el documento EP 239 400). En ciertas modalidades, la modificación de uno o más residuos de la región de estructura resulta en una mejora de la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno cognado. Por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 residuos de estructura pueden ser alterados en la modalidad particular de la invención. A veces, esto puede ser suficiente para dar un mutante de anticuerpo adecuado para su uso en pruebas preclínicas, incluso en donde ninguno de los residuos de la región hipervariable ha sido alterado. Normalmente, sin embargo, el mutante de anticuerpo puede comprender una o más alteraciones de la región hipervariable. Las regiones constantes pueden ser alteradas también para obtener propiedades efectoras deseables o más deseables.

Los residuos de la región hipervariable que son alterados pueden ser cambiados aleatoriamente, especialmente en donde la afinidad de unión de partida del anticuerpo precursor es tal que mutantes de anticuerpo producidos aleatoriamente, pueden seleccionarse fácilmente para unión alterada en una prueba como se enseña en la presente.

Un procedimiento para obtener mutantes de anticuerpo tales como mutantes de CDR, es la "mutagénesis de exploración de alanina" (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989); y Cunningham y Wells, Proc Nat. Acad Sci USA 84: 6434-6437 (1991 )). Uno o más de los residuos de la región hipervariable son reemplazados por residuos de alanina o polialanina. Aquellos residuos de la región hipervariable que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones, son entonces refinados introduciendo más u otras mutaciones en o para los sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para la introducción de una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Sustituciones similares pueden intentarse con otros aminoácidos, dependiendo de la propiedad deseada de los residuos explorados.

Un método más sistemático para identificar residuos de aminoácido por modificar, comprende identificar los residuos de la región hipervariable implicados en la unión al glucoesfingolípido tipo I extendido, y aquellos residuos de la región hipervariable con poco o ningún envolvimiento con la unión al glucoesfingolípido tipo I extendido. Se realiza una exploración de alanina de los residuos de la región hipervariable que no se unen, con cada mutante de alanina puesto a prueba para el aumento de la unión al glucoesfingolípido tipo I extendido. En otra modalidad, aquellos residuos implicados significativamente en la unión al glucoesfingolípido tipo I extendido se seleccionan para ser modificados. La modificación puede implicar la deleción de un residuo o la inserción de uno o más residuos adyacentes a un residuo de interés. Sin embargo, normalmente la modificación implica la sustitución del residuo por otro aminoácido. Una sustitución conservativa puede ser una primera sustitución. Si dicha sustitución resulta en un cambio en actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión), entonces puede hacerse otra sustitución conservativa para determinar si se obtienen más cambios sustanciales.

Puede lograrse una modificación incluso más sustancial en una gama de anticuerpos y la presentación de propiedades biológicas seleccionando un aminoácido que difiera más sustancialmente en propiedades, de aquellas normalmente residentes en un sitio. De esta manera, dicha sustitución puede hacerse mientras se mantiene: (a) la estructura de la estructura de base del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal; (b) la carga o el carácter hidrofóbico de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral.

Por ejemplo, los aminoácidos de ocurrencia natural pueden dividirse en grupos con base en las propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrofóbicos: metionina (M o met), alanina (A o ala), valina (V o val), leucina (L o leu) e isoleucina (I o ile); (2) neutros, hidrofílicos: cisteína (C o cys), serina (S o ser), treonina (T o thr), asparagina (N o asn) y glutamina (Q o gln); (3) ácidos: ácido aspártico (D o asp) y ácido glutámico (E o glu); (4) básicos: histidina (H o his), lisina (K o lys) y arginina (R o arg); (5) residuos que influyen sobre la orientación de la cadena: glicina (G o gly) y prolina (P o pro), y (6) aromáticos: triptófano (W o trp), tirosina (Y o tyr) y fenilalanina (F o phe).

Las sustituciones no conservativas pueden causar el intercambio de un aminoácido con un aminoácido de otro grupo. Las sustituciones conservativas pueden causar el intercambio de un aminoácido por otro dentro de un grupo.

Las sustituciones de aminoácido preferidas pueden incluir aquellas que, por ejemplo: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos.

Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente de la secuencia peptídica de ocurrencia natural. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (de preferencia sustituciones conservativas de aminoácido) en la secuencia de ocurrencia natural (de preferencia en la porción del polipéptido fuera del dominio que forma contactos intermoleculares). Una sustitución conservativa de aminoácido no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia precursora, o romper otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia precursora), a menos que sea un cambio en el volumen o la conformación del grupo R o la cadena lateral; véase Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (Branden y Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991 ).

Ordinariamente, el muíante de anticuerpo con propiedades biológicas mejoradas tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 75% de identidad o similitud de la secuencia de aminoácidos, con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera o pesada del anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido humano precursor, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% y con frecuencia por lo menos 95% de identidad. La identidad o similitud con respecto a la secuencia del anticuerpo precursor, se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos (es decir, mismo residuo) o similares (es decir, residuo de aminoácido del mismo grupo con base en las propiedades comunes de la cadena lateral, como se mencionó anteriormente) con los residuos del anticuerpo precursor, después de la alineación de las secuencias y la introducción de espacios intermedios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia.

En forma alternativa, pueden generarse mutantes de anticuerpo por mutación sistemática de las regiones FR y CDR de las cadenas ligera y pesada, o la región Fc del anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido.

Otro procedimiento para generar mutantes de anticuerpo, implica el uso de maduración por afinidad usando la exhibición de fagos (Hawkins et ai, J Mol Biol 254: 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30(45). 10832-10838 (1991)). Se sabe que las fusiones de proteína-cubierta del bacteriófago (Smith, Science 228: 1315 (1985); Scott y Smith, Science 249: 386 (1990); Cwirla et al., Proc Nati Acad Sci USA 8: 309 (1990); Devlin et al. Science 249: 404 (1990); Wells y Lowman, Curr Opin Struct Biol 2: 597 (1992); y patente de E.U.A. No. 5,223,409) son útiles para el enlace del fenotipo de proteínas o péptidos exhibidos, con el genotipo de las partículas de bacteriófago que los codifican. Los dominios Fab de los anticuerpos han sido exhibidos también en fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990); Barbas et al. Proc Nati Acad Sci USA 88: 7978 (1991); y Garrard et al. Biotechnol 9: 1373 (1991)).

La exhibición de fagos monovalentes consiste en exhibir una serie de variantes de proteína como fusiones de una proteína de la cubierta del bacteriófago en partículas de fagos (Bass et al., Proteins 8: 309 (1990)). La maduración por afinidad, o mejora de las afinidades de unión en equilibrio de varias proteínas, se ha logrado previamente a través de la aplicación sucesiva de mutagénesis, exhibición de fagos monovalentes y análisis funcional (Lowman y Wells, J Mol Biol 234: 564 578 (1993); y patente de E.U.A. No. 5,534,617), así como usando ese procedimiento con los dominios de Fa de los anticuerpos (Barbas et al., Proc Nati Acad Sci USA 91 : 3809 (1994); y Yang et al., J Mol Biol 254: 392 (1995)).

Pueden construirse colecciones de muchas variantes de proteína (por ejemplo, 106 o más) que difieran en posiciones definidas en la secuencia, en partículas de bacteriófagos, cada uno de los cuales contiene ADN que codifica para la variante de proteína particular. De esta manera, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6 a 7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones de aminoácido posibles en cada sitio. Después de ciclos de purificación por afinidad, usando un antígeno inmovilizado, se aislan clones de bacteriófago individuales, y la secuencia de aminoácidos de la proteína exhibida se deduce a partir del ADN.

Después de la producción del mutante de anticuerpo, la actividad biológica de esa molécula respecto al anticuerpo precursor puede determinarse como se enseña en la presente. Como se indicó anteriormente, esto puede implicar determinar la afinidad de unión y/u otras actividades biológicas o propiedades físicas del anticuerpo. En una modalidad preferida de la invención, un panel de mutantes de anticuerpo se prepara y se selecciona para la afinidad de unión por el antígeno. Uno o más de los mutantes de anticuerpo seleccionados de la selección se someten opcionalmente a una o más de otras pruebas de actividad biológica para confirmar que los mutantes de anticuerpo tienen propiedades nuevas o mejoradas. En modalidades preferidas, el mutante de anticuerpo retiene la capacidad para unirse al glucoesfingolípido tipo I extendido con una afinidad de unión similar a o mejor/mayor, que la del anticuerpo precursor.

En forma alternativa, pueden usarse también fagos multivalentes (McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552-554; y Clackson et al. (1991 ) Nature 352: 624-628) para expresar mutaciones de punto aleatorias (por ejemplo, generadas por el uso de una ADN polimerasa propensa a error), para generar una colección de fragmentos de anticuerpo del fago que entonces podrían ser seleccionados para afinidad con el glucoesfingolípido tipo I extendido; véase Hawkins et al. (1992), J Mol Biol 254: 889-896.

De preferencia, durante el procedimiento de maduración por afinidad, el vector de expresión replicable está bajo el control estrecho de un elemento regulador de la transcripción, y las condiciones de cultivo se ajustan de modo que la cantidad o el número de partículas que exhiben más de una copia de la proteína de fusión, sean menores de aproximadamente 1 %. También de preferencia, la cantidad de partículas que exhiben más de una copia de la proteína de fusión es menor de aproximadamente 10% de la cantidad de partículas que exhiben una copia individual de la proteína de fusión. De preferencia, la cantidad es menor de aproximadamente 20%.

Otra frase equivalente usada en la presente es una porción de unión al antígeno, que se refiere a la porción de un anticuerpo de interés que se une a un epítope del glucoesfingolípido tipo I. Se considera que todas las frases y términos usados en la presente para describir varios cambios que pueden hacerse a un anticuerpo original, están dentro del alcance de la frase "porción de unión al antígeno". Por lo tanto, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo tal como una molécula de Fab, un Fv, un scAb, un mru, cualquiera de dichos fragmentos funcionales, una variante de anticuerpo tal como un alelo o una molécula que contiene un cambio en la secuencia de aminoácidos primaria de la misma, un derivado tal como un anticuerpo quimérico o humanizado, un análogo, etc., incluyendo equivalentes funcionales que incluyen formas genéticamente modificadas de un anticuerpo de interés, homólogos de anticuerpo como se describen en la presente, etc., se incluyen en la frase porción de unión al antígeno.

Los mutantes de anticuerpo seleccionados de esta manera pueden ser sometidos a más modificaciones, con frecuencia dependiendo del uso deseado del anticuerpo. Dichas modificaciones pueden implicar más alteración de la secuencia de aminoácidos, fusión con polipéptidos heterólogos y/o modificaciones covalentes. Por ejemplo, un residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del muíante de anticuerpo puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir el entrelazamiento aberrante. A la inversa, puede añadirse una cisteína al anticuerpo para mejorar la estabilidad (en particular en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Otro tipo de muíante de anticuerpo tiene un patrón de glucosilación alterado. Esto puede lograrse añadiendo o deletando una o más de las porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o añadiendo o deletando uno o más de los sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de los anticuerpos es típicamente N-enlazada a Asn, u O-enlazada a Ser o Thr. Las secuencias de tripéptidos, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido salvo prolina, son secuencias de reconocimiento comunes para la unión enzimática de una porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. N-acetilgalactosamina, galactosa, fucosa o xilosa, por ejemplo, son unidas a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque pueden usarse también 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original, puede aumentar la probabilidad de la glucosilación O-enlazada.

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar la efectividad del anticuerpo. Por ejemplo, pueden introducirse residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces disulfuro intercadena en esa región.

El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener capacidad de incorporación mejorada y/o destrucción de células incrementada mediada por el complemento, y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC); véase Carón et al., J Exp Med 176: 1191-1 195 (1992) y Shopes, Immunol 148: 2918-2922 (1993). Dicho derivado de anticuerpo o análogo del mismo puede ser también más resistente a la degradación ¡n vivo.

En forma alternativa, puede diseñarse un anticuerpo que tenga regiones Fc dobles, y puede tener de esta manera lisis del complemento y capacidades de ADCC mejoradas; véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219 230 (1989).

Modificaciones covalentes del anticuerpo se incluyen dentro del alcance de la invención. Dichas modificaciones pueden hacerse por síntesis química o por desdoblamiento enzimático o químico del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula, haciendo reaccionar residuos de aminoácido del anticuerpo elegidos como objetivo con un agente de derivatización orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con el residuo N-terminal o C-terminal.

Pueden hacerse reaccionar residuos de cisteinilo con a-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboxilmetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo pueden ser derivatizados también por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo- -(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridil disulfuro de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercura-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1 ,3-diazol, por ejemplo.

Los residuos de histidilo pueden ser derivatizados por reacción con pirocarbonato de dietilo a pH 5.5 a 7.0. Puede usarse también bromuro de p-bromofenacilo, y la reacción se lleva a cabo de preferencia en cacodilato de sodio 0.1 M a pH 6.0.

Pueden hacerse reaccionar residuos a-terminales y de lisinilo con anhídridos de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico, para invertir la carga de los residuos. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen a-amino, incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, borohidruro de cloro, ácido trinitrobencensulfónico, O-metilisourea y 2,4-pentanodiona, y el aminoácido puede ser catalizado por transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginilo pueden ser modificados por reacción con uno o varios reactivos convencionales, tales como fenilglioxal, 2,3-butanodiona, ,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginina requiere con frecuencia condiciones de reacción alcalinas. Además, los reactivos pueden reaccionar con la lisina, así como el grupo e-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos de tirosilo puede hacerse con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Por ejemplo, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo pueden ser yodados usando 125l o 131l para preparar proteínas marcadas para su uso en un radioinmunoensayo.

Grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden ser modificados por reacción con carbodümidas (R-N=C=C-R'), en donde R y R' pueden ser grupos alquilo diferentes, Los residuos de glutaminilo y asparaginilo son desamidados con frecuencia hasta los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, bajo condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de esos residuos está dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos de serinilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de la lisina, arginina e histidina (Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente implica acoplar químicamente o enzimáticamente carbohidratos y glucósidos al anticuerpo. Dichos procedimientos no requieren la producción del anticuerpo en una célula hospedera que tenga capacidades de glucosilación para la glucosilación N-enlazada u O-enlazada. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, los azúcares pueden ser unidos a: (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como aquellos de la cisteína; (d) grupos hidroxilo libres, tales como aquellos de la serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como aquellos de la fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de la glutamina. Dichos métodos se describen en el documento WO 87/05330 y en Aplin y Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pp. 259-306 (1981).

La remoción de cualquier porción de carbohidrato presente en el anticuerpo puede lograrse químicamente o enzimáticamente. La desglucosilación química, por ejemplo, puede requerir la exposición del anticuerpo al compuesto, ácido trifluorometansulfónico, o un compuesto equivalente, resultando en el desdoblamiento de la mayor parte o todos los azúcares salvo el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que queda el anticuerpo intacto. La desglucosilación química se describe, por ejemplo, en Hakimuddin et al. , Arch Biochem Biophys 259: 52 (1987) y en Edge et al., Anal Biochem 1 18: 131 (1981). El desdoblamiento enzimático de las porciones de carbohidrato en los anticuerpos puede lograrse por cualquiera de una variedad de endoglucosidasas y exoglucosidasas como se describe, por ejemplo, en Thotakura et al., Meth Enzymol 138: 350(1987).

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende el enlace del anticuerpo a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxilalquilenos, en la manera expuesta en las patentes de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301 ,144; 4,670,417; 4,791 ,192 o 4,179,337.

Pueden producirse equivalentes funcionales intercambiando diferentes CDRs de diferentes cadenas de anticuerpo dentro de una estructura o un FR mixto derivado de anticuerpos plurales. De esta manera, por ejemplo, diferentes clases de anticuerpo son posibles para una serie dada de CDRs por sustitución de diferentes cadenas pesadas, por ejemplo, lgG -4, IgM, lgAi-2 o IgD, para dar diferentes tipos e isotipos de anticuerpo de glucoesfingolípido tipo I extendido. Asimismo, pueden producirse anticuerpos artificiales dentro del alcance de la invención, incluyendo una serie dada de CDRs dentro de una estructura enteramente sintética.

Los fragmentos de anticuerpo y equivalentes funcionales de la presente invención abarcan aquellas moléculas con un grado detectable de unión específica al glucoesfingolípido tipo I extendido. Un grado detectable de unión incluye todos los valores en la escala de por lo menos 10 a 100%, de preferencia por lo menos 50%, 60% o 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de la capacidad de unión de un anticuerpo de interés. Incluidos también son los equivalentes con una afinidad mayor de 100%, que la del anticuerpo de interés.

Las CDRs son generalmente de importancia para el reconocimiento del epítope y la unión al anticuerpo. Sin embargo, pueden hacerse cambios a los residuos que comprenden las CDRs sin que interfieran con la capacidad del anticuerpo para reconocer y unirse a! epítope cognado. Por ejemplo, pueden hacerse cambios que no fijen firmemente el reconocimiento del epítope, y sin embargo incrementen la afinidad de unión del anticuerpo por el epítope. Varios estudios han examinado los efectos de introducir uno o más cambios de aminoácido en varias posiciones en la secuencia de un anticuerpo, con base en el conocimiento De esta manera, pueden generarse equivalentes de un anticuerpo de interés cambiando las secuencias de los genes de la cadena ligera y pesada en las regiones CDR1 , CDR2 y/o CDR3, o en las regiones de estructura usando métodos tales como mutagénesis dirigida a sitio mediada por oligonucleótidos, mutagénesis de cassette, PCR propensa a error, entremezclado de ADN, modificación de aminoácidos, o mutador de cepas de E. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16: 535-539; y Adey et al., 1996, capítulo 16, pp. 277-291 , en Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press), por ejemplo. Los métodos del cambio de la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo primario pueden resultar en anticuerpos con afinidad mejorada (Gram et al., 1992, Proc Nati Acad Sci USA 89: 3576-3580; Boder er al., 2000, Proc Nati Acad Sci USA 97: 10701-10705; Davies y Riechmann, 1996, Immunotech 2: 169-179; Thompson er a/., 1996, J Mol Biol 256: 77-88; Short er al., 2002, J Biol Chem 277: 16365-16370; y Furukawa et al., 2001 , J Biol Chem 276: 27622-27628).

Pueden usarse ciclos repetidos de "selección de polipéptidos" para seleccionar para mayor afinidad de unión, por ejemplo, por la selección de cambios de aminoácido múltiples que se seleccionan por ciclos de selección múltiples. Después de una primera ronda de selección, que implica una primera región de selección de aminoácidos en el ligando o polipéptido del anticuerpo, se llevan a cabo rondas adicionales de selección en otras regiones o aminoácidos del ligando. Los ciclos de selección se repiten hasta que se logren las propiedades de afinidad deseadas.

Los anticuerpos mejorados incluyen también aquellos anticuerpos que tienen características mejoradas que se preparan por las técnicas estándar de inmunización de animales, formación de hibridomas y selección de anticuerpos con características específicas.

El término "antagonista" se refiere a una molécula capaz de inhibir una o más actividades biológicas asociadas con el glucoesfingolípido tipo I extendido. Los antagonistas pueden interferir con el mantenimiento y el crecimiento de una célula que expresa un glucoesfingolípido tipo I. Todos los puntos de intervención por un antagonista se consideran como equivalentes para los propósitos de la presente invención. De esta manera, incluidos dentro del alcance de la invención son los antagonistas, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes que se unen al glucoesfingolípido tipo I extendido.

El término "agonista" se refiere a un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un conjugado, etc., que activa una o más actividades biológicas del glucoesfingolípido tipo I extendido, o una célula que expresa el mismo. Los agonistas pueden actuar como un mitógeno de células que expresan un glucoesfingolípido tipo I. Todos los puntos de intervención por un agonista deben considerarse como equivalentes para los propósitos de la presente invención. De esta manera, incluidos dentro del alcance de la invención, son los anticuerpos que se unen al glucoesfingolípido tipo I extendido y mejoran una actividad tal como diferenciación, por ejemplo.

Los términos "célula", "líneas de células" y "cultivo de células" incluyen la progenie de los mismos. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica, tal como en el contenido de ADN, debido a mutación deliberada o inadvertida. La progenie variante que tiene la misma función o propiedad biológica de interés, como se examina en la célula original, se incluye en el alcance de la invención. Las "células hospederas" usadas en la presente invención son generalmente hospederos procarióticos o eucarióticos, seleccionados como una elección de diseño.

La "transformación" de un organismo celular, célula o línea de células con un ácido nucleico, significa introducir un ácido nucleico en la célula objetivo, de modo que el ácido nucleico sea replicable, ya sea como un elemento extracromosómico o por integración cromosómíca y, opcionalmente, expresado. La "transfeccion" de una célula u organismo con un ácido nucleico se refiere a la absorción del ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, por la célula u organismo, ya sea o no que alguna secuencia codificante sea de hecho, expresada. Los términos "célula hospedera transfectada" y "transformada" se refieren a una célula en la cual un ácido nucleico fue introducido. Células hospederas procariótícas típicas incluyen varias cepas de E. coli. Células hospederas eucarióticas típicas son células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino o células de origen humano. La secuencia de ácido nucleico introducida puede ser de la misma especie que la célula hospedera, o de una especie diferente de la célula hospedera, o puede ser una secuencia de ácido nucleico híbrida, conteniendo algunos ácidos nucleicos extraños y algunos ácidos nucleicos homólogos. La transformación puede ocurrir también por transducción o infección con elementos o vehículos derivados de virus.

El término "vector" significa una construcción de ácido nucleico, un vehículo que contiene un ácido nucleico, el transgen, el gen extraño o el gen de interés, el cual puede ser enlazado operablemente a secuencias de control adecuadas para la expresión del transgen en un hospedero adecuado. Dichas secuencias de control incluyen, por ejemplo, un promotor que efectúa la transcripción, una secuencia de operador opcional que controla dicha transcripción, una secuencia que codifica para sitios de unión del ribosoma de ARN adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o sólo una inserción genómica potencial. Una vez transformado en un hospedero adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del hospedero, o puede en algunos casos integrarse en el genoma de una célula hospedera u otro ácido nucleico. En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" se usan recíprocamente, ya que un plásmido es una forma de vector comúnmente usada. Sin embargo, se pretende que la invención incluya dichas otras formas de vectores que cumplen una función equivalente como vehículo y las cuales se conocen o serán conocidas en la técnica, tales como virus, fagémidos, transposones, moléculas sintéticas que poseen ácidos nucleicos, liposomas, y similares.

El término "mamífero" para propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humano, animales domésticos y de granja, primates no humanos y animales de zoológico, de entretenimiento o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc.

Los anticuerpos de interés pueden seleccionarse o pueden usarse en una prueba como se describe en la presente o como es sabido en la técnica. Con frecuencia, dichas pruebas requieren que un reactivo sea detectable, es decir, por ejemplo, marcado. El término "marca", cuando se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición detectable que puede ser conjugado directamente o indirectamente con una molécula o proteína, por ejemplo, un anticuerpo. La marca puede ser por sí misma detectable (por ejemplo, marcas de radioisótopo, partículas o marcas fluorescentes), o puede ser un instrumento para obtener una señal detectable, tal como en el caso de una marca enzimática, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición de substrato que es entonces detectable.

Como se usa en la presente, el término "fase sólida" significa una matriz a la cual una entidad o molécula tal como el anticuerpo de la presente invención, puede adherirse o unirse. Ejemplos de fases sólidas abarcadas en la presente, incluyen aquellas formadas parcialmente o enteramente de vidrio (por ejemplo, vidrio poroso controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), plásticos, polipropilenos, poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y silicones. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender la cavidad de una placa de prueba; en otras modalidades, puede usarse en una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). De esta manera, la fase sólida puede ser un papel, una perla, un plástico, un chip, etc., puede hacerse de una variedad de materiales tales como nitrocelulosa, agarosa, poliestireno, polipropileno, silicio, etc., y puede estar en una variedad de configuraciones.

Células que expresan el glucoesfingolipido tipo I extendido o glucanos del mismo, tales como preparaciones de membrana celular, así como el glucoesfingolipido tipo I extendido purificado, pueden usarse como inmunógenos para generar anticuerpos de interés. El inmunógeno puede obtenerse o puede aislarse de fuentes naturales, o puede sintetizarse enzimáticamente o químicamente. Pueden usarse células enteras, tales como células que expresen el glucoesfingolipido tipo I extendido, o células derivadas de una fuente natural o de cánceres, tales como líneas de células cancerosas. Células que sobreexpresen el glucoesfingolipido tipo I extendido pueden usarse como el inmunógeno para obtener los anticuerpos de interés. Asimismo, pueden usarse preparaciones de membrana que posean el glucoesfingolipido tipo I extendido como es sabido en la técnica. Dichas células y porciones de las mismas pueden usarse como la fuente de antígenos en una prueba de diagnóstico.

Moléculas de ácido nucleico que codifican para mutantes de la secuencia de aminoácidos, pueden prepararse por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Los métodos incluyen, pero no están limitados a, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis de cassette de un mutante preparado en un principio o una versión no mutante de la molécula de interés (véase, por ejemplo, Kunkel, Proc Nati Acad Sci USA 82: 488 (1985)).

La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o fragmento, derivado o análogo del mismo (por ejemplo, una cadena ligera o pesada de un anticuerpo de la invención, un anticuerpo de cadena sencilla de la invención, o una muteína de anticuerpo de la invención), incluye la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para el anticuerpo o un fragmento del anticuerpo, como se describe en la presente. Una vez que un polinucleótido que codifica para una molécula de anticuerpo se ha obtenido, el vector para la producción del anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante, como es sabido en la técnica. Se construye un vector de expresión que contiene secuencias codificantes del anticuerpo y señales de control de la transcripción y traducción adecuadas. Los métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo.

El vector de expresión es transferido a una célula hospedera por técnicas convencionales, y las células transfectadas se cultivan entonces por técnicas convencionales para producir un anticuerpo, o fragmento, de la invención. En un aspecto de la invención, los vectores que codifican para las cadenas ligera y pesada pueden ser co-expresados en la célula hospedera por expresión de la molécula de inmunoglobulina entera, como se detalla en la presente.

Una variedad de sistemas de vector de expresión/hospedero puede usarse para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención. Dichos sistemas de expresión representan vehículos por los cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y pueden purificarse subsiguientemente, pero representan también células las cuales pueden expresar, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias codificantes de nucleótidos adecuadas, una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Células bacterianas tales como E. coli y células eucarióticas se usan comúnmente para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante entera. Por ejemplo, células de mamífero tales como células CHO, en conjunto con un vector tal como uno que posea el elemento de promotor de genes temprano intermedio mayor del citomegalovirus humano, son un sistema de expresión efectivo para anticuerpos (Foecking et al., Gene 45: 101 (1986); y Cockett er a/., Bio/Technology 8: 2 (1990)). Plantas y cultivos de células vegetales, células de insecto, etc., pueden usarse para obtener las proteínas de interés, como es sabido en la técnica.

Además, se elige una célula hospedera que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto del gen en la manera específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y el procesamiento (por ejemplo, desdoblamiento) de los productos de proteína, pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospederas pueden tener los mecanismos característicos y específicos particulares para la modificación y el procesamiento posttraducción deseados de las proteínas y los productos de genes. Pueden seleccionarse sistemas de hospederos o líneas de células adecuados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo expresado de interés. Por lo tanto, pueden usarse células hospederas eucarióticas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, así como la glucosilación y fosforilación del producto del gen. Dichas células hospederas de mamífero incluyen, pero no están limitadas a, células CHO, COS, 293, 3T3 o de mieloma.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden diseñarse líneas de células que expresen establemente la molécula de anticuerpo. Más que el uso de vectores de expresión que contengan orígenes de replicación virales, puede realizarse la transformación de células hospederas con ADN controlado por elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotor, secuencias de intensificador, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN extraño, puede permitirse que las células diseñadas crezcan por uno a dos días en un medio enriquecido, y entonces son movidas a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección, y permite que las células integren establemente el plásmido en un cromosoma y sea expandido en una línea de células. En forma alternativa, puede mantenerse un elemento extracromosómico en las células bajo selección. Dichas líneas de células diseñadas no sólo son útiles para la producción de anticuerpos, sino son útiles para seleccionar y evaluar compuestos que interactúan directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Pueden usarse muchos sistemas de selección que incluyen, pero no están limitados a, el uso de genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11 : 223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al., Proc Nati Acad Sci USA 48: 202 (1992)), glutamato sintasa, en presencia de metionina sulfoximida (Adv Drug Del Rev 58, 671 , 2006, y véase el sitio web o la literatura de Lonza Group Ltd.) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22: 817 (1980)) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Asimismo, puede usarse la resistencia antimetabolitos como la base de la selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc Nati Acad Sci USA 77: 357 (1980); OHare et al., Proc Nati Acad Sci USA 78: 1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc Nati Acad Sci USA 78: 2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Wu et al., Biotherapy 3: 87 (1991)); e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147 (1984)). Métodos conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante pueden aplicarse habitualmente para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. , eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990); Dracopoli et al., eds., Current Protocols ¡n Human Genetics, John Wiley & Sons (1994); y Colberre-Garapin er a/., J Mol Biol 150: 1 (1981).

Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden incrementarse por la amplificación del vector (véase, por ejemplo, Bebbington et al., en DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es amplificable, un incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo incrementará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo se incrementará también (Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257 (1983)).

La célula hospedera puede ser co-transfectada con dos o más vectores de expresión de la invención, por ejemplo, el primer vector codificando para un polipéptido derivado de la cadena pesada, y el segundo vector codificando para un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la igual expresión de los polipéptidos de cadena ligera y pesada. En forma alternativa, puede usarse un vector individual que codifique y sea capaz de expresar polipéptidos de cadena ligera y pesada. En dichas situaciones, la cadena ligera puede ser puesta antes de la cadena pesada para evitar un exceso de la cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322: 52 (1986); y Kohler, Proc Nati Acad Sc¡ USA 77: 2197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas ligera y pesada pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención ha sido producida por un animal, sintetizada químicamente o expresada en forma recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, en particular por cromatografía de afinidad por el glucoesfingolípido tipo I extendido después de cromatografía de exclusión por tamaño y de proteína A, etc.), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden ser fusionados con secuencias de polipéptidos heterólogas descritas en la presente o conocidas de otra manera en la técnica, para facilitar la purificación.

Los anticuerpos de la presente invención pueden generarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. De esta manera, una estructura tipo I extendida purificada puede usarse como antígeno, opcionalmente, con un adyuvante tal como adyuvante completo o incompleto de Freund. Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos policlonales, aunque debido a la modificación de los anticuerpos para optimizar su uso en humanos, así como para optimizar el uso del anticuerpo per se, se prefieren los anticuerpos monoclonales debido a la facilidad de producción y manipulación de proteínas particulares. Métodos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica (véase Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a. ed. (1988)).

Por ejemplo, un inmunógeno, como se ejemplifica en la presente, puede administrarse a varios animales hospederos que incluyen, pero no están limitados a, conejos, ratones, camélidos, ratas, etc., para inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales específicos para el glucoesfingolípido tipo I extendido. La administración del inmunógeno puede acarrear una o más inyecciones de un agente de inmunización y, si se desea, un adyuvante. Varios adyuvantes pueden usarse para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie de hospedero e incluyen, pero no están limitados a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), aceite mineral, geles, alumbre (hidróxido de aluminio), sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de la lapa Fissurella (KLH), dinitrofenol y adyuvantes de humano potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guehn) y Corynebacterium parvum. Ejemplos adicionales de adyuvantes que pueden usarse incluyen el adyuvante de MPL-TDM monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). Los protocolos de inmunización son bien conocidos en la técnica, y pueden realizarse por cualquier método que induzca una respuesta inmune en el animal hospedero elegido. De esta manera, pueden usarse varias vías de administración durante varios períodos como una elección de diseño.

Típicamente, el ¡nmunógeno (con o sin adyuvante) es inyectado en el mamífero por inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples, o intramuscularmente o intravenosamente. En ciertas circunstancias, pueden usarse células enteras que expresen el glucoesfingolípído tipo I extendido. Dependiendo de la naturaleza del inmunógeno (es decir, por ciento de carácter hidrofóbico, por ciento de carácter hidrofílico, estabilidad, carga neta, punto isoeléctrico, etc.), el glucoesfingolípído tipo I extendido o porción del mismo puede ser modificado o conjugado para que sea inmunógeno o más inmunógeno en el animal, tal como un mamífero, que está siendo inmunizado. Por ejemplo, el glucoesfingolípído tipo I extendido o una porción del mismo puede ser conjugado con un vehículo. La conjugación incluye conjugación química derivatizando grupos químicos funcionales activos en cualquiera del inmunógeno y la proteína inmunógena, o ambos, que serán conjugados, de modo que se forme un enlace covalente, u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. Ejemplos de dichos vehículos o proteínas inmunógenas incluyen, pero no están limitados a, KLH, ovoalbúmina, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, inhibidor de tripsina de soya y péptidos auxiliares T promiscuos. Varios adyuvantes pueden usarse para incrementar la respuesta inmunológíca, como se describió anteriormente.

Una vez que se obtiene una preparación adecuada, es posible aislar los anticuerpos particulares de los anticuerpos plurales por técnicas de separación conocidas, tales como cromatografía de afinidad, toma panorámica, absorción, etc. De esa manera, puede obtenerse una especie de anticuerpo individual para más estudio, por ejemplo, por secuenciación, para obtener las secuencias de aminoácidos de una o más CDRs.

Los anticuerpos de la presente invención comprenden de preferencia anticuerpos monoclonales. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando la tecnología de hibridomas, tal como es descrita por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); patente de E.U.A. No. 4,376,1 10; Harlow er a/., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a. ed. (1988); y Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981), métodos de ADN recombinante, por ejemplo, preparando y usando transfectomas, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Otros ejemplos de métodos que pueden usarse para producir anticuerpos monoclonales incluyen, pero no están limitados a, la técnica de hibridomas de células B humanas (Kosbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); y Colé et al., Proc Nati Acad Sci USA 80: 2026 (1983)), y la técnica de hibridomas-EBV (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985)). Dicrjos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina que incluye IgG, IgM, IgE, IgA e IgD, y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAb de la invención puede cultivarse in vitro o in vivo.

En el modelo de hibridomas, un hospedero tal como un ratón, un ratón humanizado, un ratón transgénico con genes del sistema inmune humano, un caballo, oveja, hámster, conejo, rata, camello o cualquier otro animal hospedero adecuado, es inmunizado para inducir a los linfocitos para que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al glucoesfingolípido tipo I extendido.

En forma alternativa, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Los linfocitos son entonces fusionados con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)).

En general, en la producción de hibridomas que producen anticuerpos, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de los nodulos linfáticos si se desean fuentes de mamífero no humano. Las líneas de células inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas, en particular células de mieloma originadas de roedor, bovino o humano.

Típicamente, se usa una línea de células de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contenga de preferencia una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas de células inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, sustentan la producción- estable de alto nivel de anticuerpos por las células seleccionadas que producen anticuerpos, y son sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Entre las líneas de células de mieloma, están las líneas de células de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de los tumores de ratón OPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. , y las células SP2/0, FO o X63-Ag8-653, disponibles de la American Type Culture Collection, Manassas, VA. Puede usarse también la línea de células de mieloma de ratón NSO (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, Reino Unido).

Líneas de células de heteromieloma de humano-ratón y de mieloma humano, se han descrito también para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J Immunol 133: 3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987)).

Otra alternativa es usar la fusión eléctrica más que la fusión química para formar hibridomas. En lugar de la fusión química, una célula B puede ser inmortalizada usando, por ejemplo, el virus de Epstein-Barr u otro gen transformante; véase, por ejemplo, Zurawaki et al., en Monoclonal Antibodies, ed., Kennett et al., Plenum Press, pp. 19-33 (1980). Pueden usarse también ratones transgénicos que expresen inmunoglobulinas y ratones inmunodeficientes combinados severos (SCID) trasplantados con linfocitos B humanos.

El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma se cultivan, se pone a prueba para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el glucoesfingolípido tipo I extendido. La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse por inmunoprecipitación o por una prueba de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA), análisis fluorocitométrico (FACS) o prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Dichas técnicas se conocen en la materia y están dentro de la aptitud del experto en la técnica. Asimismo, puede usarse el sistema Biacore, como es sabido en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal al glucoesfingolípido tipo I extendido puede determinarse, por ejemplo, por un análisis Scatchard (Munson et al., Anal Biochem 107: 220 (1980)).

Después de que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitativa, y cultivados por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)). Medios de cultivo adecuados incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco (D-MEM) o RPMI-1640. Además, pueden cultivarse células de hibridoma in vivo como tumores de ascitis en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son adecuadamente separados o aislados del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero, por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A Sepharose, proteína G Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de exclusión en gel, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Una variedad de métodos existe en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales y, de esta manera, la invención no se limita a su sola producción en hibridomas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse por métodos de ADN recombinante, tales como aquellos descritos en la patente de E.U.A. No. 4,816,567. En forma alternativa, pueden obtenerse anticuerpos humanos de animales transgénicos, tales como el ratón KM discutido anteriormente. En este contexto, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo derivado de un clon eucariótico, viral o procariótico individual.

De esta manera, mediante el uso de células cancerosas humanas que se sabe expresan una estructura de cadena tipo I extendida, como es el caso de las células Colo205, o un compuesto que contiene la cadena tipo I extendida, tal como el glucoesfingolípido tal como Le /Lea como antígeno, ratones endógamos o transgénicos son inmunizados y promovidos como es sabido en la técnica. Se obtienen bazos, las células son fusionadas con células de mieloma, y se obtienen y se cultivan los hibridomas. Los sobrenadantes de células se seleccionan por ELISA usando, por ejemplo, Leb/Lea como el reactivo de captura. Se amplifican los clones positivos. IMH2 es un ejemplo de un anticuerpo monoclonal de lgG3 de ratón que se une específicamente a una estructura de cadena tipo I extendida.

Mediante el uso de un modelo de ratón transgénico, pueden producirse anticuerpos humanos inmunizando a los ratones transgénicos con un inmunógeno de cadena tipo I extendida. Dichos anticuerpos pueden ser generados sobre una base libre, por ejemplo, por Medarex, NJ y Amgen, CA. Mediante el uso del ratón KM, el anticuerpo monoclonal GNX-8 (IgG se seleccionó para más caracterización y uso.

GNX-8 es un anticuerpo citotóxico. En pruebas que usan células de cáncer de colon Colo205 como objetivos, GNX-8 liso las células de la línea de células cancerosas, y por lo menos a 50 pg/ml, el anticuerpo lisó todas las células en el cultivo. GNX-8 no se une a los RBCs. El anticuerpo se une a las células de cáncer colorrectal, células de cáncer de mama y células de cáncer de pulmón. A diferencia de IMH2, GNX-8 no se une a Ley-Lex o Ley.

El ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención es fácilmente aislado y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de murino, o dichas cadenas de fuentes humanas, humanizadas u otras fuentes) (Innis et al. en PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990), y Sanger et al., Proc Nati Acad Sci USA 74: 5463 (1977)). Las células de hibridoma pueden servir como la fuente de dicho ADN.

Una vez aislado, el ADN puede ser puesto en vectores de expresión, los cuales son entonces transfectados en células hospederas tales como células de E. coli, células NSO, células COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen la proteína inmunoglobulina, para lograr la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombínantes. El ADN puede ser modificado también, por ejemplo, sustituyendo con la secuencia codificante los dominios constantes de cadena ligera y pesada humanas en lugar de las secuencias de murino homologas (patente de E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc Nati Acad Sci USA 81 : 6851 (1984)), o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina, la totalidad o parte de la secuencia codificante de un polipéptido no de inmunoglobulina. Dicho polipéptido no de inmunoglobulina puede sustituir a los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituir a los dominios variables de un sitio de combinación del glucoesfingolípido tipo I extendido de un anticuerpo de la invención, para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Métodos para preparar anticuerpos monovalentes, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de la cadena pesada modificada y la cadena ligera de inmunoglobulina. La cadena pesada es truncada generalmente en cualquier punto en la región Fc para prevenir el entrelazamiento de la cadena pesada. En forma alternativa, los residuos de cisteína relevantes son sustituidos con otro residuo de aminoácido, o son deletados para prevenir el entrelazamiento.

Fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos, pueden generarse mediante técnicas conocidas. Tradicionalmente, dichos fragmentos se derivan por medio del desdoblamiento proteolítico de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24: 107 (1992); y Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). Por ejemplo, pueden producirse fragmentos Fab y F(ab )2 de la invención por desdoblamiento proteolítico de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (que produce fragmentos Fab) o pepsina (que produce fragmentos F(ab')2)- Los fragmentos F(ab )2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio Cm de la cadena pesada. Sin embargo, dichos fragmentos pueden ser producidos directamente por células hospederas recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de una colección de fagos de anticuerpos. En forma alternativa, pueden recuperarse directamente fragmentos F(ab )2-SH de E. coli, y pueden ser acoplados químicamente para formar fragmentos F(ab )2 (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992). De acuerdo con otro procedimiento, pueden aislarse fragmentos F(ab')2 directamente del cultivo de células hospederas recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para los expertos en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, el documento WO 93/16185.

Para algunos usos, incluyendo el uso ¡n vivo de anticuerpos en humanos y pruebas de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica; véase por ejemplo, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125: 191 (1989); y las patentes de E.U.A. Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 4,816397.

Se derivan anticuerpos humanizados de moléculas de anticuerpo generadas en una especie no humana que se unen al glucoesfingolípido tipo I extendido, en donde una o más CDRs de las mismas son insertadas en las regiones FR de una molécula de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden ser humanizados usando una variedad de técnicas conocidas en la materia que incluyen, por ejemplo, realización de injertos de CDRs (véase los documentos EPO 239,400; y WO 91/09967; y las patentes de E.U.A. Nos. 5,225,539; 5,530,101 ; y 5,585,089), revestimiento o reigualación (véase los documentos EPO 592,106; y EPO 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28: 489 (1991 ); Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805 (1994); y Roguska et al., Proc Nati Acad Sci USA 91 : 969 (1994)) y entremezclado de cadenas (véase la patente de E.U.A. No. 5,565,332).

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido de una fuente que es no humana. Los residuos de aminoácido no humanos son referidos con frecuencia como residuos "introducidos", los cuales se toman típicamente de un dominio variable "introducido". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo los métodos de Winter et al. (Jones et al., Nature 321 : 522 (1986); Riechmann ef al., Nature 332: 323 (1988); y Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)), sustituyendo con CDRs no humanas o porciones de secuencias de CDR, las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (véase la patente de E.U.A. No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable intacto de humano ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y algunos residuos de FR posibles son sustituidos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La región de gozne y la región constante de cadena pesada pueden ser de cualquier clase o subclase para obtener un efecto deseado, tal como una función efectora particular.

Con frecuencia, los residuos de estructura en las regiones de estructura humanas pueden ser sustituidos con el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, y posiblemente para mejorar, la unión al antígeno. Las sustituciones de estructura se identifican mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, elaborando modelos de las interacciones de la CDR y los residuos de estructura para identificar residuos de estructura importantes para la unión al antígeno, y comparación de la secuencia para identificar residuos de estructura inusuales en posiciones particulares; véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,585,089; y Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988).

Se prefiere además que los anticuerpos humanizados retengan alta afinidad por el glucoesfingolípido tipo I extendido, y retengan o adquieran otras propiedades biológicas favorables. De esta manera, pueden prepararse anticuerpos humanizados por un procedimiento analizando las secuencias precursoras y varios derivados de anticuerpo humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas y precursoras. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales hipotéticos están disponibles comúnmente, y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas de cómputo que ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de las exhibiciones permite el análisis de la función probable de ciertos residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse al glucoesfingolípido tipo I extendido. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos de FR del receptor y secuencias introducidas, de modo que la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada por el antígeno objetivo, sea aumentada al máximo, aunque son los residuos de CDR que directamente y más sustancialmente influyen sobre la unión al glucoesfingolípido tipo I extendido. Las regiones CDR pueden ser modificadas también para que contengan uno o más aminoácidos que varían de aquellos obtenidos del anticuerpo precursor del cual la CDR se obtuvo, para proveer propiedades de interés mejoradas o diferentes, tales como unión de mayor afinidad o mayor avidez, por ejemplo.

Ciertas porciones de las regiones constantes del anticuerpo pueden ser manipuladas y cambiadas para proveer homólogos, derivados, fragmentos y similares del anticuerpo con propiedades diferentes de o mejores que las observadas en el anticuerpo precursor. De esta manera, por ejemplo, muchos anticuerpos de lgG4 forman enlaces disulfuro intracadena cerca de la región de gozne. El enlace intracadena puede desestabilizar la molécula bivalente precursora, formando moléculas monovalentes que comprenden una cadena pesada con la cadena ligera asociada. Dichas moléculas pueden volver a asociarse, pero sobre una base aleatoria.

Otra serie de aminoácidos adecuados para modificación incluyen aminoácidos en el área del gozne que fijan firmemente funciones del anticuerpo tales como la unión de una molécula que contiene una cadena pesada con unión al receptor Fc e incorporación del anticuerpo unido. Dichos aminoácidos incluyen, en las moléculas de lgG1 , los residuos de aproximadamente 233 a aproximadamente 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly, SEQ ID NO: 1); de aproximadamente 252 a aproximadamente 256 (Met-lle-Ser-Arg-Thr, SEQ ID NO: 2) y de aproximadamente 318 (Glu) a aproximadamente 331 (Pro) incluyendo, por ejemplo, Lys32o, Lys 322 y Pro329.

Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Pueden obtenerse anticuerpos humanos por una variedad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen los métodos de exhibición de fagos descritos anteriormente usando colecciones de anticuerpos derivadas de secuencias de ¡nmunoglobulina humana; véase las patentes de E.U.A. Nos. 4,444,887 y 4,716,11 1 ; y los documentos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Las técnicas de Colé et al. y Boerder et al., están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss (1985); y Boerner et al., J Immunol 147: 86 (1991)).

Pueden producirse también anticuerpos humanos usando ratones transgénicos que sean incapaces de expresar ¡nmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que expresen también ciertos genes de ¡nmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de ¡nmunoglobulina de cadena ligera y pesada humana pueden ser introducidos aleatoriamente o por recombinación homologa, en células madre embrionarias de ratón. En forma alternativa, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad, pueden ser introducidas en las células madre embrionarias de ratón, además de los genes de la cadena ligera y pesada humanas. Los genes de ¡nmunoglobulina de cadena ligera y pesada de ratón pueden tratarse de modo que sean no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de los loci de ¡nmunoglobulina humana por recombinación homologa. En particular, la deleción homocigótica de la región JH previene la producción endógena de anticuerpos. Las células madre embrionarias modificadas son expandidas y microinyectadas en blastocistos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos son entonces procreados para producir progenie homocigótica que exprese anticuerpos humanos; véase, por ejemplo, Jakobovitis et al., Proc Nati Acad Sci USA 90: 2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7: 33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355: 258 (1992)).

Los ratones transgénicos son inmunizados en la forma normal con un glucoesfingolípido tipo I extendido, por ejemplo, la totalidad o una porción del glucoesfingolípido tipo I extendido, o una preparación de membrana que contenga al mismo. Anticuerpos monoclonales dirigidos contra el glucoesfingolípido tipo I extendido pueden obtenerse de los ratones transgénicos inmunizados usando la tecnología de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de la células B, y subsiguientemente sufren conmutación de clase y mutación somática. De esta manera, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión, véase Lonberg et al., Int Rev Immunol 13: 65-93 (1995). Para una discusión de la producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos véase, por ejemplo, los documentos WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; y EPO No. 0 598 877; y las patentes de E.U.A. Nos. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661 ,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771 ; y 5,939,598. Además, compañías tales como Amgen (Fremont, CA), Genpharm (San José, CA) y Medarex, Inc. (Princeton, NJ) pueden ser contratadas para proveer anticuerpos humanos dirigidos contra el glucoesfingolípido tipo I extendido usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.

Asimismo, pueden obtenerse mAbs humanos inmunizando a ratones trasplantados con leucocitos de sangre periférica, esplenocitos o médula ósea humanos (usando, por ejemplo, la técnica de triomas de XTL Biopharmaceuticals, Israel).

Anticuerpos completamente humanos que reconocen a un epítope seleccionado, pueden generarse usando una técnica referida como "selección guiada". En dicho procedimiento, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce al mismo epítope (véase Jespers er a/., Bio/Technology 12: 899 (1988)).

Cuando se usan técnicas recombinantes, la vanante de anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o puede ser secretado directamente en el medio. Si la variante de anticuerpo se produce intracelularmente, como un primer paso, los restos de materia en partículas, ya sea células hospederas o fragmentos lisados, pueden ser removidos, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10: 163 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados hacia el espacio periplásmico de E. coli. En resumen, la pasta de células es expuesta a acetato de sodio (pH 3.5) y EDTA. Los restos de células pueden ser removidos por centrifugación. En donde la variante de anticuerpo es secretada en el medio, el sobrenadante de dichos sistemas de expresión es generalmente concentrado primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF, puede incluirse para inhibir la proteólisis, y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpos preparada de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. La conveniencia de la proteína A o la proteína G como un ligando de afinidad, depende de la especie y el isotipo de un dominio Fc de inmunoglobulina que está presente en la variante de anticuerpo. Puede usarse proteína A para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas de lgG1 , lgG2 o lgG4 humanas (Lindmark et al., J Immunol Meth 62: 1 (1983)). Puede usarse proteína G para isotipos de ratón y para lgG3 humana (Guss et al., E BO J 5: 1567 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad es unido, es con más frecuencia agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio poroso controlado o poli(estirendivinil)benceno, permiten magnitudes de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden lograrse con la agarosa. En donde la variante de anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXTM (JT Baker; Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, como por ejemplo, fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, CLAR de fase invertida, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía de agarosa sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio están también disponibles, dependiendo del anticuerpo o la variante que se va a recuperar.

Después de cualquier paso de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo o la variante de interés y contaminantes, puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH usando un regulador de pH de elución a un pH entre aproximadamente 2.5 y 4.5, de preferencia realizada a bajas concentraciones de sales (por ejemplo, sal de aproximadamente 0 a 0.25 M).

Además, los anticuerpos de la invención pueden usarse a su vez para generar anticuerpos anti-idiotípicos que "imiten" al glucoesfingolípido tipo I extendido usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Greenspan et al., FASEB J 7: 437 (1989); y Nissinoff, J Immunol 147: 2429 (1991)). Por ejemplo, anticuerpos que se unen a e inhiben competitivamente la multimerización y/o la unión de un ligando al glucoesfingolípido tipo I extendido, pueden usarse para generar anti-idiotipos que "imitan" al glucoesfingolípido tipo I extendido. Dichos anti-idiotipos neutralizantes o fragmentos Fab de dichos anti-idiotipos pueden usarse en regímenes terapéuticos o de diagnóstico.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser anticuerpos monoclonales, de preferencia humanos o humanizados, que tengan especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En la presente invención, una de las especificidades de unión está dirigida hacia el glucoesfingolípido tipo I extendido, mientras que la otra especificidad puede ser para cualquier otro antígeno, tal como una proteína de la superficie de la célula, receptor, subunidad de receptor, ligando, antígeno específico de tejidos, proteína viral, proteína de cubierta viralmente codificada, agente farmacológicamente activo tal como un fármaco, proteína derivada de bacterias, proteína de la superficie bacteriana, etc.

Los métodos para obtener anticuerpos biespecíficos son bien conocidos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena ligera/cadena pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., Nature 305: 537 (1983)). Debido al surtido aleatorio de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, los hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de aproximadamente diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo aproximadamente una podría tener la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se logra usualmente por pasos de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J 10: 3655 (1991).

Otros métodos para obtener anticuerpos biespecíficos se proveen, por ejemplo, en Kufer er a/., Trends Biotech 22: 238-244, 2004.

Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas pueden ser fusionados con las secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es de preferencia con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprenda por lo menos parte de las regiones CH2 y CH3 del gozne. Puede tener la primera región constante de cadena pesada (Cm) conteniendo el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Moléculas de ADN que codifiquen para las fusiones de la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertadas en vectores de expresión separados, y son co-transformadas en un organismo hospedero adecuado. Para más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Meth Enzym 121 : 210 (1986).

Los anticuerpos heteroconjugados son también contemplados por la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune hacia células no deseadas (véase la patente de E.U.A. No. 4,676,980). Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro usando métodos conocidos en la química de síntesis de proteínas que incluyen aquellos que implican agentes de entrelazamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmuno-toxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro, o formando un enlace de tioéster. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato, y aquellos descritos, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 4,676,980.

Además, pueden generarse anticuerpos de dominio individual para el glucoesfingolípido tipo I extendido. Ejemplos de dicha tecnología se han descrito en el documento W09425591 para anticuerpos derivados de la cadena pesada de ¡nmunoglobulina de camélidos, así como en el documento US20030130496, que describe el aislamiento de anticuerpos completamente humanos de dominio individual de colecciones de fagos.

En forma alternativa, pueden ponerse en práctica técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase la patente de E.U.A. No. 4,946,778; y Bird, Science 242: 423 (1988); Huston et al., Proc Nati Acad Sci USA 85: 5879 (1988); y Ward et al., Nature 334: 544 (1989)). Se forman anticuerpos de cadena sencilla, enlazando los fragmentos de la cadena ligera y pesada de la región de Fv por medio de un puente de aminoácidos, que resulta en un polipéptido de cadena sencilla. Pueden usarse también técnicas para el ensamble de fragmentos- Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., Science 242: 1038 (1988)). Anticuerpos de cadena sencilla ("scFv") y un método para su construcción se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 4,946,778. En forma alternativa, pueden construirse fragmentos Fat>, y pueden ser expresados por medios similares. Todos los anticuerpos totalmente o parcialmente humanos pueden ser menos inmunógenos que los mAbs totalmente de murino, y los fragmentos y anticuerpos de cadena sencilla pueden ser también menos inmunógenos.

La presente invención abarca anticuerpos fusionados en forma recombinante o químicamente conjugados (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con un polipéptido. Anticuerpos fusionados o conjugados de la presente invención pueden usarse para facilitar la purificación; véase, por ejemplo, los documentos WO 93/21232; EP 439,095; Naramura er a/., Immunol Lett 39: 91 (1994); patente de E.U.A. No. 5,474,981 ; Gillies et al., Proc Nati Acad Sci USA 89: 1428 (1992); y Fell et al., J Immunol 146: 2446 (1991).

La purificación puede facilitarse usando un marcador o trazador de reconocimiento. Por ejemplo, el marcador puede ser una secuencia de aminoácidos, tal como un péptido de hexa-histidina, tal como el trazador provisto en un vector pQE (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente; véase Gentz et al., Proc Nati Acad Sci USA 86: 821 (1989). Otros trazadores de péptidos útiles para purificación incluyen, pero no están limitados a, el trazador "HA", que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)), y el trazador "flag".

Anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las colecciones de fagos de anticuerpos generados, usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990). Clarkson et al., Nature 352: 624 (1991) y Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991), describen el aislamiento de anticuerpos de murino y humano, respectivamente, usando colecciones de fagos. Publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (escala en nM) por entremezclado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology 10: 779 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para construir colecciones de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nucí Acids Res 21: 2265 (1993)). De esta manera, las técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

Anticuerpos anti-glucoesfingolípido tipo I extendido candidatos, pueden ponerse a prueba por medio de la prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), FACS, Western immunoblotting u otras técnicas inmunoquímicas, como es sabido en la técnica. De esta manera, células B o células que expresen el glucoesfingolípido tipo I extendido pueden usarse para detectar la unión del anticuerpo a los mismos usando una técnica conocida, o preparaciones de membrana adecuadas que contengan al glucoesfingolípido tipo I extendido o porción del mismo, o estructuras de cadena tipo I extendidas purificadas o aisladas pueden ser adheridas a una fase sólida y usadas como un elemento de captura en una prueba, configuradas como una elección de diseño.

Para determinar si un homólogo de anticuerpo particular se une al glucoesfingolípido tipo I extendido humano, puede usarse cualquier prueba de unión convencional. Pruebas de unión al glucoesfingolípido tipo I extendido útiles, incluyen análisis por FACS, pruebas de ELISA, radioinmunoensayos, y similares, que detectan la unión del anticuerpo, y funciones que resultan de los mismos, al glucoesfingolípido tipo I extendido humano. Las formas soluble y de longitud completa del glucoesfingolípido tipo I extendido humano enseñadas en la presente, son útiles en dichas pruebas. La unión de un anticuerpo u homólogo al glucoesfingolípido tipo I extendido, o a fragmentos solubles del mismo, puede detectarse convenientemente a través del uso de un segundo anticuerpo específico para las inmunoglobulinas de la especie de la cual el anticuerpo u homólogo se deriva. El segundo anticuerpo puede llevar una marca detectable o puede estar configurado para ser detectado.

La capacidad de un anticuerpo u homólogo para unirse al glucoesfingolípido tipo I extendido humano, puede evaluarse poniendo a prueba la capacidad del mismo para unirse a células positivas para el glucoesfingolípido tipo I extendido humano. Células positivas para el glucoesfingolípido tipo I extendido adecuadas para su uso para determinar si un anticuerpo u homólogo particular se une al glucoesfingolípido tipo I extendido humano, son las células de cultivo de tejidos de mamífero disponibles que expresan el glucoesfingolípido tipo I extendido, tal como sobre la superficie de la célula.

La unión del anticuerpo u homólogo a la célula positiva para el glucoesfingolípido tipo I extendido, puede detectarse tiñendo las células con, por ejemplo, un segundo anticuerpo marcado con fluorescencia específico para inmunoglobulinas de la misma especie de la cual el homólogo del anticuerpo que está siendo puesto a prueba se deriva. Un distribuidor de células activadas por fluorescencia ("FACS") puede usarse para detectar y cuantificar cualquier unión; véase, en general, Shapiro, Practical Flow Cytometry, Alan R. Liss, Inc., New York, N.Y. (1985).

Para determinar si un anticuerpo u homólogo particular no causa una disminución significativa en el número de células positivas para el glucoesfingolípido tipo I extendido circulantes in vivo, se cuantifica el número de células positivas para el glucoesfingolípido tipo I extendido circulantes aisladas de un mamífero dentro de 24 horas después la administración del anticuerpo u homólogo a un mamífero que tenga una función inmune normal, y se compara con el número pre-administración o el número en un mamífero control a quien un anticuerpo u homólogo de isotipo comparado de especificidad irrelevante, se le ha administrado en lugar de un anticuerpo u homólogo de la presente invención. La cuantificación de células positivas para el glucoesfingolípido tipo I extendido en animales dosificados con un anticuerpo de glucoesfingolípido tipo I extendido o porción o derivado funcional del mismo puede lograrse, por ejemplo, tiñendo las células obtenidas con anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen a anticuerpos anti-glucoesfingolípido tipo I extendido, así como anticuerpos marcados específicos para células T y células B, seguido de análisis por FACS.

Los anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse en términos de los epítopes o porciones del glucoesfingolípido tipo I extendido a los cuales el anticuerpo reconoce o se une específicamente. Los epítopes pueden especificarse como se describe en la presente, por ejemplo, por medios físicos, tales como espectrometría de masa, análisis de la composición de los sacáridos, las moléculas a las cuales los azúcares se unen, epítopes conformacionales, etc.

Los anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse también en términos de reactividad cruzada. Anticuerpos que se unen a glucoesfingolípidos tipo I extendidos que tienen por lo menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 65%, por lo menos 60%, por lo menos 55% y por lo menos 50% de identidad (según se calcula usando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente), se incluyen también en la presente invención.

Los anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse también en términos de la afinidad de unión a un glucoesfingolípido tipo I extendido de interés. Los anticuerpos anti-glucoesfingolípido tipo I extendido pueden unirse con una KD de menos de aproximadamente 10*7 M, menos de aproximadamente 10"6 M o menos de aproximadamente 10'5 M. Afinidades de unión mayores en un anticuerpo de interés pueden ser benéficas, tales como aquellas con una constante de disociación en equilibrio o KD de aproximadamente 10"8 a aproximadamente 10~15 M o más, de aproximadamente 10"8 a aproximadamente 10"12 M, de aproximadamente 10"9 a aproximadamente 0"11 M, o de aproximadamente 10"8 a aproximadamente 10"10 M. La invención provee también anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo a un epítope de la invención, según se determina por cualquier método conocido en la técnica para determinar la unión competitiva, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en la presente. En modalidades preferidas, el anticuerpo inhibe competitivamente la unión al epítope por cuando menos 95%, por lo menos 90%, por lo menos 85%, por lo menos 80%, por lo menos 75%, por lo menos 70%, por lo menos 60% o por lo menos 50%.

La presente invención incluyen también conjugados que comprenden un anticuerpo de interés. Los conjugados comprenden dos componentes primarios, un anticuerpo de interés y un segundo componente, el cual puede ser un agente de unión a células, un agente citotóxico, un agente farmacológicamente activo, un fármaco, etc.

Como se usa en la presente, el término "agente de unión a células" se refiere a un agente que reconoce y se une específicamente a una molécula sobre la superficie de la célula. De esta manera, el agente de unión a células puede ser uno que se une a un antígeno de CD, un antígeno de patógeno tal como un antígeno de virus, un antígeno de diferenciación, un antígeno de cáncer, un antígeno específico de células, un antígeno específico de tejidos, una Ig o molécula tipo Ig, etc.

Los agentes de unión a células pueden ser de cualquier tipo como se conocen actualmente, o que serán conocidos, e incluyen péptídos, no péptidos, sacáridos, ácidos nucleicos, ligandos, receptores, y similares, o combinaciones de los mismos. El agente de unión a células puede ser cualquier compuesto que pueda unirse a una célula, ya sea en una manera específica o no específica. En general, el agente puede ser un anticuerpo (especialmente anticuerpos monoclonales), linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moléculas para el transporte de nutrientes (como es el caso de la transferrina), o cualquier otra sustancia o molécula de unión a células.

Otros ejemplos de agentes de unión a células que pueden usarse incluyen: anticuerpos policlonales; anticuerpos monoclonales; y fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fa , Fat , F(ab )2 y Fv (Parham, J. Immunol. 131 : 2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol. 1 13: 470-478 (1974); y Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960)).

El segundo componente puede ser también un agente citotóxico. El término "agente citotóxico", como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que reduce o bloquea la función o el crecimiento de las células, y/o que causa la destrucción de las células. De esta manera, el agente citotóxico puede ser un taxol, un maytansinoide tal como DM1 o DM4, CC-1065 o un análogo de CC-1065, una ricina, un fármaco, mitomicina C, etc. En algunas modalidades, el agente citotóxico, como con cualquier agente de unión de un conjugado de la presente invención, es unido covalentemente, directamente o por medio de un enlazador hendible o no hendible, a un anticuerpo de interés.

Ejemplos de maytansinoides adecuados incluyen maytansinol y análogos de maytansinol. Los maytansinoides inhiben la formación de los microtúbulos y son altamente tóxicos para las células de mamífero.

Ejemplos de análogos de maytansinol adecuados incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Dichos maytansinoides adecuados se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331 ,598; 4,361 ,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371 ,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; y 5,846,545.

Ejemplos de análogos de maytansinol adecuados que tienen un anillo aromático modificado, incluyen: (1) C-19-decloro (patente de E.U.A. No. 4,256,746) (preparado, por ejemplo, por reducción con LAH de ansamitocina P2); (2) C-20-hidroxi (o C-20-demetilo)+/-C-19-decloro (patentes de E.U.A. Nos. 4,361 ,650 y 4,307,016) (preparado, por ejemplo, por desmetilación usando decloración por Streptomyces o Actinomyces usando hidruro de litio-aluminio (LAH)); y (3) C-20-demetoxi, Ejemplos de análogos de maytansinol adecuados que tienen modificaciones de otras posiciones, incluyen: (1) C-9-SH (patente de E.U.A. No. 4,424,219) (preparado por la reacción de maytansinol con H2S o P2S5); (2) C-14-alcoximetilo (demetoxi/CH2OR) (patente de E.U.A. No. 4,331 ,598); (3) C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente de E.U.A. No. 4,450,254) (preparado de Nocardia); (4) C-15-hidroxi/aciloxi (patente de E.U.A. No. 4,364,866) (preparado por la conversión de maytansinol por Streptomyces); (5) C-15-metoxi (patentes de E.U.A. Nos. 4,313,946 y 4,315,929) (aislado de Trewia nudiflora); (6) C-18-N-demetilo (patentes de E.U.A. Nos. 4,362,663 y 4,322,348) (preparado por la desmetilación de maytansinol por Streptomyces); y (7) 4,5-desoxi (patente de E.U.A. No 4,371 ,533) (preparado por la reducción de maytansinol con LAH/tricloruro de titanio).

Los conjugados citotóxicos pueden prepararse por métodos in vitro. Para enlazar un agente citotóxico, fármaco o profármaco al anticuerpo, se usa comúnmente un grupo de enlace. Grupos de enlace adecuados se conocen en la técnica e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasas y grupos lábiles a esterasas. Por ejemplo, pueden construirse conjugados usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace de tioéter entre un anticuerpo de interés y el fármaco o profármaco.

La molécula conjugada con un anticuerpo de interés puede ser una molécula con una actividad farmacológica, tal como un fármaco, tal como una pequeña molécula o una biomolécula. De esta manera, la biomolécula puede ser una citocina, por ejemplo. La molécula puede ser un profármaco, tal como un éster de fármaco. La molécula puede ser un radionúclido.

Como se discutió anteriormente, la presente invención provee secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican para un anticuerpo o variante funcional del mismo como se describe en la presente, construcciones de vector que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos de unión al glucoesfingolípido tipo I extendido de la presente invención, células hospederas que comprenden dicho vector, y técnicas recombinantes para la producción del polipéptido que se une a glucoesfingolípidos tipo I extendidos.

El vector contiene normalmente componentes conocidos en la técnica que incluyen generalmente, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, un promotor, una secuencia de poliA, uno o más genes marcadores o de selección, secuencias que facilitan y/o aumentan la producción, un elemento intensificador, etc. De esta manera, los vectores de expresión incluyen una secuencia de nucleótidos enlazada operablemente a dichas secuencias de nucleótidos reguladoras de la traducción o transcripción adecuadas, tales como aquellas derivadas de genes de mamífero, microbios, virus o insectos. Ejemplos de secuencias reguladoras adicionales incluyen operadores, sitios de unión ribosomales del ARNm, y/u otras secuencias adecuadas que controlen la transcripción y traducción, tales como el inicio y la terminación de las mismas. Las secuencias de nucleótidos están "enlazadas operablemente", cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de nucleótidos para el polipéptido adecuado. De esta manera, una secuencia de nucleótidos del promotor está enlazada operablemente a, por ejemplo, la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo, si la secuencia de nucleótidos de promotor controla la transcripción de esa secuencia de nucleótidos.

Además, secuencias que codifican para péptidos de señal adecuados, que no están asociadas naturalmente con las secuencias de la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo, pueden ser incorporadas en los vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos para un péptido de señal (secuencia guía secretoria) puede ser fusionada en el marco de lectura con la secuencia de polipéptidos, de modo que el anticuerpo sea secretado hacia el espacio periplásmico o en el medio. Un péptido de señal que sea funcional en las células hospederas deseadas, aumenta la secreción extracelular del anticuerpo adecuado o porción del mismo. El péptido de señal puede ser separado del polipéptido durante la secreción del anticuerpo de la célula Ejemplos de dichas señales secretorias son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, los descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,698,435; 5,698,417; y 6,204,023.

El vector puede ser un plásmido, un vector viral de cadena sencilla o de doble cadena, un vector de fago de ADN o ARN de cadena sencilla o de doble cadena, un fagémido, un cósmido, o cualquier otro vehículo de un transgen de interés. Dichos vectores pueden ser introducidos en las células como polinucleótidos por técnicas bien conocidas para la introducción de ADN y ARN en las células. Los vectores, en el caso de vectores virales y de fagos, pueden ser introducidos también en las células como virus empacado o encapsulado, o una partícula tipo virus, por técnicas bien conocidas para los procedimientos de infección y transducción. Los vectores virales pueden ser de replicación competente o de replicación defectuosa. En el último caso, la propagación viral ocurrirá generalmente sólo en células hospederas complementarias, y usando vectores plurales que posean los varios componentes del virus necesarios para producir una partícula. Sistemas de traducción libres de células pueden usarse también para producir la proteína usando moléculas de ARN derivadas de las presentes construcciones de ADN de interés (véase, por ejemplo, los documentos WO 86/05807 y WO 89/01036; y la patente de E.U.A. No. 5,122,464).

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser expresados de cualquier célula hospedera adecuada. Ejemplos de células hospederas útiles en la presente invención, incluyen células procarióticas, de levadura o eucarióticas e incluyen, pero no están limitadas a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia y Shigella, así como bacilos, Pseudomonas y Streptomyces) transformadas con ADN recombinante de bacteriófagos, ADN de plásmidos o vectores de expresión de ADN de cósmidos que contengan las secuencias codificantes del anticuerpo de interés; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia, Actinomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida, Tríchoderma, Neurospora, y hongos filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contengan secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, Baculovirus) que contengan secuencias codificantes de anticuerpos; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; o virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contenga secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293 o 3T3) que alberguen construcciones de expresión recombinantes que contengan promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; o el promotor 7.5 K del virus de la vaccinia).

Los vectores de expresión para su uso en células hospederas procarióticas comprenden generalmente uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicos. Un gen marcador seleccionable fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica para una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que suministra un requerimiento autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión útiles para células hospederas procarióticas, incluyen aquellos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl), pET (Novagen, Madison, Wl) y la serie de vectores pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA) (Studier, J Mol Biol 219: 37 (1991); y Schoepfer, Gene 124: 83 (1993)). Secuencias de promotor usadas comúnmente para vectores de expresión de células hospederas procarióticas recombinantes incluyen 17 (Rosenberg et al., Gene 56: 125 (1987)), ß-lactamasa (penicilinasa), el promotor de lactosa (Chang er a/., Nature 275: 615 (1978); y Goeddel et al., Nature 281: 544 (1979)), el sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucí Acids Res 8: 4057 (1980)), y el promotor tac (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)).

Los vectores de levadura contendrán con frecuencia un origen de la secuencia de replicación, tal como de un plásmido de levadura de 2 µ, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región de promotor, secuencias para poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionare. Secuencias de promotor adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotioneína, 3-fosfogl ice rato cinasa (Hitzeman et al., J Biol Chem 255: 2073 (1980)) u otras enzimas glucolíticas (Holland et al., Biochem 17: 4900 (1978)) tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato ¡somerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosa fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras, se describen además en Fleer et al., Gene 107: 285 (1991 ). Otros promotores y vectores adecuados para levaduras y protocolos de transformación de levaduras, son bien conocidos en la técnica. Los protocolos de transformación de levaduras son bien conocidos. Uno de dichos protocolos es descrito por Hinnen er al., Proc Nati Acad Sci USA 75: 1929 (1978), que selecciona para transformantes positivos para Trp en un medio selectivo.

Cualquier cultivo de células eucarióticas es viable, ya sea de cultivo de vertebrados o invertebrados. Ejemplos incluyen células de plantas e insectos (Luckow et al., Bio/Technology 6: 47 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., vol. 8, pp. 277-9, Plenum Publishing (1986); y Maeda et al., Nature 315: 592 (1985)). Por ejemplo, pueden usarse sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas. En un sistema de insectos, puede usarse el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica para el anticuerpo puede ser clonada bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina). Otros hospederos que se han identificado incluyen Aedes, Drosophila melanogaster y Bombyx morí. Una variedad de cepas virales para transfección está disponible públicamente, por ejemplo, la variante L-1 del AcNPV y la cepa Bm-5 del NPV de Bombyx morí. Además, cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate, algas, lenteja de agua y tabaco pueden usarse también como hospederos, como es sabido en la técnica.

Células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos), pueden ser un procedimiento de rutina, aunque existen líneas de células fastidiosas que requieren, por ejemplo, un medio especializado con factores únicos, células nutricias, etc.; véase Tissue Culture, Kruse et al., eds., Academic Press (1973). Ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero útiles, son células de riñon de mono; células de riñon embrionario de humano; células de riñon de cría de hámster; células de ovario de hámster chino (CHO, Urlaub et al., Proc Nati Acad Sci USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón; células de carcinoma cervical humano (por ejemplo, HeLa); células de riñon de canino; células de pulmón humano; células de hígado humano; células de tumor mamario de ratón; y células NSO.

Las células hospederas son transformadas con vectores para la producción de anticuerpos, y cultivadas en un medio nutritivo convencional que contenga factores de crecimiento, vitaminas, minerales, etc., así como inductores adecuados para las células y vectores usados. Secuencias de promotor y secuencias de intensificador usadas comúnmente se derivan, por ejemplo, del virus del polioma, adenovirus 2, virus simiano 40 (SV40) y citomegalovirus humano (CMV). Secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40 pueden usarse para proveer otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula hospedera de mamífero, por ejemplo, origen de SV40, promotor temprano y tardío, intensificador y sitios de empalme y de poliadenilación. Los promotores temprano y tardío virales son particularmente útiles debido a que se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento que puede contener también un origen de replicación viral. Ejemplos de vectores de expresión para su uso en células hospederas de mamífero, están disponibles comercialmente.

Medios disponibles comercialmente, tales como F10 de Ham, medio esencial mínimo (MEM), RPMI-1640 y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), son adecuados para el cultivo de células hospederas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et ai, Meth Enzymol 58: 44 (1979) y Barnes et al., Anal Biochem 102: 255 (1980), y en las patentes de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163; o 6,048,728, puede usarse como un medio de cultivo para las células hospederas. Cualquiera de dichos medios puede ser complementado, según sea necesario, con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruros tales como cloruro de sodio, calcio o magnesio; y fosfatos), reguladores de pH (tal como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos, elementos traza (que pueden definirse como compuestos inorgánicos presentes usualmente a concentraciones finales en la escala micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario puede incluirse a concentraciones adecuadas, como una elección de diseño. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son como se conocen en la técnica adecuada para la célula, y permiten la expresión deseada del transgen.

Los polinucleótidos de interés pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos puede determinarse, por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, puede ensamblarse un polinucleótido que codifique para el anticuerpo a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., Bio/Techniques 17: 242 (1994)), y amplificando entonces los oligonucleótidos ligados, por ejemplo, por PCR.

En forma alternativa, un polinucleótido que codifique para un anticuerpo puede generarse a partir del ácido nucleico de una célula que exprese el mismo. Si un clon que contiene un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo particular no está disponible, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, un ácido nucleico que codifique para la inmunoglobulina puede obtenerse de una fuente adecuada, tal como una colección, la cual puede ser específica para células que producen anticuerpos, tales como células de hibridoma seleccionadas para que expresen un anticuerpo de la invención. Los iniciadores adecuados pueden ser configurados por amplificación por PCR. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden ser entonces clonados en vectores de clonación replicables usando cualquier método conocido en la técnica.

Una vez que se determinan la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondientes del anticuerpo, la secuencia de nucleótidos del anticuerpo puede manipularse para obtener los equivalentes de interés descritos en la presente, usando métodos conocidos en la técnica para manipular secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida a sitio, PCR etc. (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990); y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)), para generar anticuerpos que tengan una diferente secuencia de aminoácidos, por ejemplo, para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera y/o pesada puede inspeccionarse para identificar las secuencias de las CDRs por métodos bien conocidos, por ejemplo, por comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de la cadena ligera y pesada, para determinar las regiones de hipervariabilidad de la secuencia. Mediante el uso de técnicas de ADN recombinante de rutina, una o más de las CDRs pueden ser insertadas dentro de las regiones de estructura, por ejemplo, en las regiones de estructura de humano para humanizar un anticuerpo no humano, como se describió anteriormente. El polinucleótido de interés generado por la combinación de las regiones de estructura y una o más CDRs, codifica para una molécula que se une específicamente al glucoesfingolípido tipo I extendido, o por lo menos los epítopes de carbohidrato y la estructura reconocida por el mismo. Por ejemplo, dichos métodos pueden usarse para hacer sustituciones o deleciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína que participan en un enlace disulfuro intracadena, para generar moléculas de anticuerpo que carecen de uno o más enlaces disulfuro intracadena.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden usarse para detectar el glucoesfingolípido tipo I extendido, y por lo tanto células que expresan el glucoesfingolípido tipo I extendido, en una muestra biológica in vitro o in vivo. En una modalidad, el anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido de la invención se usa para determinar la presencia y el nivel del glucoesfingolípido tipo I extendido, en un tejido o en células derivadas del tejido. Los niveles del glucoesfingolípido tipo I extendido en el tejido o biopsia pueden determinarse, por ejemplo, en un inmunoensayo con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención. El tejido o la biopsia del mismo, puede ser congelado o fijado. Puede usarse el mismo método u otros métodos para determinar otras propiedades del glucoesfingolípido tipo I extendido, tales como el nivel del mismo, su localización celular, etc.

El método descrito anteriormente puede usarse, por ejemplo, para diagnosticar un cáncer en un sujeto que se sabe tiene o que se sospecha tiene un cáncer, en donde el nivel del glucoesfingolípido tipo I extendido medido en dicho paciente se compara con el de un estándar o sujeto de referencia normal.

La presente invención provee además anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a epítope de los mismos, que son además marcados para su uso en aplicaciones de investigación o de diagnóstico. En algunas modalidades, la marca es una marca radiactiva, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de formación de imágenes o un ion de metal, por ejemplo.

Se provee también un método de diagnóstico en el cual dichos anticuerpos marcados o fragmentos de unión a epítope de los mismos se administran a un sujeto que se sospecha tiene un cáncer, artritis, enfermedades autoinmunes u otras enfermedades relacionadas con, causadas por, o asociadas con, la expresión y/o función del glucoesfingollpido tipo I extendido, y se mide o se monitorea la distribución de la marca dentro del cuerpo del sujeto.

El anticuerpo y fragmentos del mismo de la presente invención pueden usarse como agentes de purificación por afinidad. En dicho procedimiento, los anticuerpos son inmovilizados sobre una fase sólida, tal como un dextrán o agarosa, resina o papel filtro, usando métodos conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado es puesto en contacto con una muestra que contiene Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo de interés será marcado típicamente con un marcador o porción detectable. Numerosas marcas están disponibles, las cuales pueden agruparse generalmente en las siguientes categorías: (a) radioisótopos, tales como 36S, 1 C, 125l, 3H y 31l (el anticuerpo puede ser marcado con el radioisótopo usando una técnica descrita, por ejemplo, en Current Protocois ¡n Immunology, vol. 12, Coligen et al., ed., Wiley-lnterscience, New York (1991), y puede medirse la radiactividad usando conteo de escintilación); (b) marcas fluorescentes, tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio), fluoresceína y derivados de la misma, rodamina y derivados de la misma, dansilo, lisamina, ficoeritrina y rojo Texas, en donde las marcas fluorescentes pueden ser conjugadas con el anticuerpo usando una técnica descrita en Current Protocols in Immunology, citado anteriormente, por ejemplo, en donde la fluorescencia puede cuantificarse usando un fluorímetro; y (c) varias marcas de substrato de enzimas, que están disponibles (la patente de E.U.A. No. 4,275, 149 provee una revisión), en cuyo caso la enzima cataliza generalmente una alteración química de un substrato cromógeno, la cual puede medirse usando varias técnicas, por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un substrato, el cual puede medirse espectrofotométricamente, o la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del substrato. Se conocen técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia, por ejemplo, usando un luminómetro, o la marca dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente de E.U.A. No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa, tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Meth Enz, ed. Langone y Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981 ).

Cuando se usan dichas marcas, están disponibles substratos adecuados tales como: (i) para peroxidasa de rábano picante con peroxidasa de hidrógeno como un substrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenileno diamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametil bencidina (TMB)); (ii) para fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de p-nitrofenilo como el substrato cromógeno; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un substrato cromógeno (por ejemplo, p-nitrofenil-ß-D-galactosidasa) o un substrato fluorógeno tal como 4-metilumbeliferil^-D-galactosidasa.

Otras combinaciones de enzima-substrato están disponibles para los expertos en la técnica. Para una revisión general, véase las patentes de E.U.A. Nos. 4,275,149 y 4,318,980.

A veces, la marca es conjugada indirectamente con el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado con biotina, y cualquiera de los reporteros mencionados anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y, de esta manera, la marca puede ser conjugada con el anticuerpo en esa manera indirecta. Varias avidinas se conocen en la técnica. En forma alternativa, para lograr la conjugación indirecta de la marca, el anticuerpo puede ser conjugado con un pequeño hapteno (por ejemplo, digoxina), y uno de los diferentes tipos de marcas o reporteros mencionados anteriormente es conjugado con un anticuerpo anti-digoxina. De esta manera, la conjugación indirecta de la marca con el anticuerpo o muteína, puede lograrse usando un segundo anticuerpo.

En otra modalidad de la invención, el anticuerpo no necesita ser marcado, y la presencia del mismo puede detectarse usando un anticuerpo marcado que se una al anticuerpo, otra forma de un segundo anticuerpo.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en cualquier método de prueba conocido, tales como pruebas de unión competitiva, pruebas en sandwich directas e indirectas, y pruebas de inmunoprecipitación. Véase Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc. 1987).

Las pruebas de unión competitiva dependen de la capacidad de un estándar marcado para competir con la muestra de prueba para unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de antígeno en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que llega a ser unido a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que llega a ser unido, los anticuerpos son generalmente insolubilizados antes o después de la competencia. Como resultado, el estándar y la muestra de prueba que son unidos a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del estándar y la muestra de prueba que permanecen no unidos.

Las pruebas en sandwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una diferente porción inmunógena, determinante o epítope, del objetivo que va a ser detectado. En la prueba en sandwich, la muestra de prueba que va a ser analizada es unida por un primer anticuerpo que es inmovilizado directamente o indirectamente sobre un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo directamente o indirectamente marcado se une a la muestra de prueba unida, formando de esta manera un complejo de tres partes insoluble; véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,376,110. El segundo anticuerpo puede ser marcado por sí mismo con una porción detectable (prueba en sandwich directa), o puede medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina u otro miembro adecuado del par de unión (anticuerpo/antígeno, receptor/ligando, enzima/substrato, por ejemplo) que es marcado con una porción detectable (prueba en sandwich indirecta). Por ejemplo, un tipo de prueba en sandwich es una prueba de ELISA, en cuyo caso la porción detectable es una enzima.

Para inmunohistoquímica, la célula o muestra de tejido puede ser fresca o congelada, o puede ser incluida en parafina y fijada con un conservador tal como formalina, por ejemplo.

Los anticuerpos pueden usarse también para pruebas de diagnóstico in vivo. En general, el anticuerpo o variante del mismo es marcado con un radionúclido (tal como 1 1ln, "Te, 1 C, 13 , 3H, 32P o 35S), de modo que los sitios que expresan el glucoesfingolípido tipo I extendido pueden localizarse usando, por ejemplo, inmunoescintigrafía y una cámara gamma.

La presente invención incluye también kits, por ejemplo, que comprenden un anticuerpo, fragmento del mismo, homólogo, derivado del mismo, etc., tal como un conjugado citotóxico o marcado, e instrucciones para el uso del anticuerpo, conjugado para la destrucción o marcación de tipos de células particulares, etc. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para el uso del anticuerpo, conjugado, etc., ¡n vitro, in vivo o ex vivo. El anticuerpo puede estar en forma líquida o como un sólido, generalmente liofilizado. El kit puede contener otros reactivos adecuados, tales como un regulador de pH, una solución reconstituible y otros ingredientes necesarios para el uso deseado. Se contempla una combinación de reactivos empacados en cantidades predeterminadas con instrucciones para el uso de los mismos, tal como para un uso terapéutico para realizar una prueba de diagnóstico. En donde el anticuerpo sea marcado, tal como con una enzima, el kit puede incluir substratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de substrato que provee el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos, tales como estabilizadores, reguladores de pH (por ejemplo, un regulador de pH de bloqueo o regulador de pH de lisis), y similares. Las cantidades relativas de los varios reactivos pueden hacerse variar para proveer concentrados de una solución de un reactivo, lo cual le provee al usuario flexibilidad, economía de espacio, economía de reactivos, etc. Los reactivos pueden proveerse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes, que tras la disolución proveen una solución de reactivo que tiene la concentración adecuada.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar a un mamífero. En una modalidad, el anticuerpo o equivalente de interés se administra a un mamífero no humano para los propósitos de obtener datos preclínicos, por ejemplo. Ejemplos de mamíferos no humanos que serán tratados incluyen primates no humanos, perros, gatos, roedores y otros mamíferos en los cuales se realicen estudios preclinicos. Dichos mamíferos pueden ser modelos animales establecidos para una enfermedad que será tratada con el anticuerpo, o pueden usarse para estudiar la toxicidad del anticuerpo de interés. En cada una de estas modalidades, pueden realizarse estudios de intensificación de la dosis en el mamífero. El producto de interés puede tener también uso terapéutico en dichos animales.

Un anticuerpo, con o sin un segundo componente, tal como una porción terapéutica conjugada con el mismo, administrado solo o en combinación con factores citotóxicos, puede usarse como un agente terapéutico. La presente invención está dirigida a terapias basadas en anticuerpos que implican administrar los anticuerpos de la invención a un animal, un mamífero o un humano, para tratar una enfermedad, trastorno o condición asociado con o mediado por el glucoesfingollpido tipo I extendido. El animal o sujeto puede ser un mamífero que necesita de un tratamiento particular, tal como un mamífero que ha sido diagnosticado con un trastorno particular, por ejemplo, uno que se relaciona con el glucoesfingollpido tipo I extendido, o asociado con la expresión y función de la estructura de cadena tipo I extendida anormal. Los anticuerpos dirigidos contra el glucoesfingollpido tipo I extendido son útiles, por ejemplo, para la profilaxis o el tratamiento de cáncer y trastornos autoinmunes, por ejemplo. Por ejemplo, mediante la administración de una dosis terapéuticamente aceptable de un anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido de la presente invención, o un coctel de una pluralidad de los presentes anticuerpos o equivalentes de los mismos, o en combinación con otros anticuerpos de fuentes variables, o en combinación con un fármaco no de anticuerpo tal como un fármaco anti-inflamatorio, un agente citotóxico, un antibiótico, etc., tal como un fármaco de platino, metotrexato, etc., pueden mejorarse o prevenirse los síntomas de enfermedad en el mamífero tratado, en particular humanos.

Los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos de la invención (incluyendo fragmentos, análogos, equivalentes y derivados de los mismos, como se describe en la presente) y ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos de la invención como se describe en la presente (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos) y anticuerpos anti-idiotípicos como se describe en la presente. Los anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar, inhibir o prevenir enfermedades, trastornos o condiciones asociados con la expresión y/o actividad aberrantes del glucoesfingolípído tipo I extendido que incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de uno o más de los trastornos, enfermedades o condiciones descritos en la presente. El tratamiento y/o la prevención de los trastornos, enfermedades o condiciones asociados con la expresión y/o actividad aberrantes del glucoesfingolípído tipo I extendido incluyen, pero no están limitados a, el alivio de por lo menos un síntoma asociado con dichos trastornos, enfermedades o condiciones. Los anticuerpos de la invención pueden proveerse en composiciones farmacéuticamente aceptables como es sabido en la técnica o como se describe en la presente. El término "fisiológicamente aceptable", "farmacológicamente aceptable", "farmacéuticamente aceptable", etc., significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal, o enlistado en la farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en humanos.

El anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido puede administrarse a un mamífero en cualquier manera aceptable. Métodos para la introducción incluyen, pero no están limitados a, las vías parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal, epidural, por inhalación y oral y, si se desea, para el tratamiento inmunosupresor, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraarterial o intraperitoneal. Los anticuerpos o las composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.), y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir los anticuerpos terapéuticos o composiciones de la invención en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, que incluye inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito de Ommaya. Además, el anticuerpo puede administrarse convenientemente por infusión pulsátil, en particular con dosis decrecientes del anticuerpo. De preferencia, la dosificación se da por inyección, de preferencia inyecciones intravenosas o subcutáneas que dependen, en parte, de si la administración es breve o crónica.

Varios otros sistemas de suministro se conocen y pueden usarse para administrar un anticuerpo de la presente invención e incluyen, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, etc. (véase Langer, Science 249: 1527 (1990)); expresión de un anticuerpo, muteína del mismo o porción de unión a antígeno del mismo, de interés en un liposoma, partícula, cápsula, etc., para dar un vehículo de determinación del blanco; véase Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, López-Berestein et al., eds., p. 353-365 (1989); y López-Berestein, ibid., p. 317-327; células recombinantes capaces de expresar el compuesto; véase, por ejemplo, Wu et al., J Biol Chem 262: 4429 (1987); construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector; etc.

Los ingredientes activos pueden ser atrapados también en una microcápsula preparada, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial usando, por ejemplo, una microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y una microcápsula de metacrilato de polimetilo, respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimosexta edición, A. Osa!, ed. (1980). Cuando el liposoma o partícula expresa un anticuerpo de interés, cualquiera de una variedad de compuestos puede ser llevado en el liposoma, tal como un fármaco no de anticuerpo, fármaco de pequeña molécula, etc. El presente anticuerpo puede cumplir de esta manera una función de determinación del blanco.

Puede usarse también la administración pulmonar, por ejemplo, por el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de dispersión en un gas. El anticuerpo puede administrarse también en los pulmones de un paciente en la forma de una composición de polvo seco; véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 6,514,496.

En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los anticuerpos o composiciones terapéuticos de la invención localmente hacia el área que necesita de tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a manera de limitación, por infusión local, aplicación tópica, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante, dicho implante siendo de un material poroso, no poroso o gelatinoso, que incluye membranas, tales como fibras o membranas sialásticas. De preferencia, cuando se administra un anticuerpo de la invención, se tiene cuidado en usar materiales a los cuales la proteína no es absorbida o adsorbida.

En otra modalidad, el anticuerpo puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, puede usarse una bomba (véase Langer, Science 249: 1527 (1990); Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14: 201 (1987); Buchwald ef al. , Surgery 88: 507 (1980); y Saudek et al. , N Engl J Med 321 : 574 (1989)). En otra modalidad, pueden usarse materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Reléase, Langer et al., eds., CRC Press (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen et al., eds., Wiley (1984); y Ranger et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23: 61 (1983); véase también Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann Neurol 25: 351 (1989); y Howard ef al., J Neurosurg 71 : 105 (1989)). En otra modalidad, puede ponerse un sistema de liberación controlada en proximidad del objetivo terapéutico.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen al anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos configurados, por ejemplo, películas o matrices. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, metacrilato de poli(2-hidroxietilo), alcohol poli(vinílico), polilactidas (patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolimeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, acetato de vinilo-etileno no degradable, copolimeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables (tales como microesferas inyectables compuestas de copolimeros de ácido glicólico-ácido láctico) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tales como acetato de vinilo-etileno y ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de las moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos más cortos. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización, dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S ¡ntermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, puede lograrse la estabilización modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados, sustituyendo aminoácidos, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

Formulaciones terapéuticas del polipéptido o anticuerpo pueden prepararse para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas, mezclando el polipéptido que tenga el grado deseado de pureza con vehículos, diluyentes, excipientes o estabilizadores "farmacéuticamente aceptables" opcionales usados típicamente en la técnica, es decir, agentes reguladores de pH, agentes estabilizadores, conservadores, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos; véase Remington's Pharmaceutical Sciences, decimosexta ed., Osol, ed. (1980). Dichos aditivos son generalmente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones usadas; por lo tanto, los excipientes, diluyentes, vehículos, etc., son farmacéuticamente aceptables.

Un anticuerpo "aislado" o "purificado" está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o fuente de tejido o medio del cual la proteína se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. El término "sustancialmente libre de material celular", incluye preparaciones de un anticuerpo en las cuales el polipéptido/proteína se separa de los componentes celulares de las células de las cuales los mismos se aislan o se producen en forma recombinante. De esta manera, un anticuerpo que está sustancialmente libre de material celular, incluye preparaciones del anticuerpo que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% o 1 % (en peso seco) de proteína contaminante o material celular o subcelular. Cuando el anticuerpo se produce en forma recombinante, está también de preferencia sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10%, 5%, 2.5% o 1 % del volumen de la preparación de proteína. Cuando el anticuerpo se produce por síntesis química, está de preferencia sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos y reactivos, es decir, el anticuerpo de interés está separado de precursores químicos u otros compuestos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, dichas preparaciones del anticuerpo tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos diferentes del anticuerpo de interés. En una modalidad preferida de la presente invención, los anticuerpos son aislados o purificados.

Como se usa en la presente, la frase "niveles de agregación de bajos a indetectables", se refiere a muestras que contienen no más de 5%, no más de 4%, no más de 3%, no más de 2%, no más de 1 % y con frecuencia no más de 0.5% de agregación del anticuerpo o variante del mismo, es decir, dos o más moléculas de anticuerpo o variantes del mismo unidas o unidas juntas, en peso de proteína según se mide, por ejemplo, por cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HPSEC).

Como se usa en la presente, el término "niveles de fragmentación de bajos a indetectables", se refiere a muestras que contienen igual a o más que 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de moléculas de anticuerpo intactas o variantes de las mismas, de la proteína total, por ejemplo, en un pico individual, según se determina por HPSEC, o en dos (2) picos (cadena pesada y cadena ligera), por ejemplo, por electroforesis en gel capilar reducida (rCGE), y no conteniendo otros picos individuales que tengan más de 5%, más de 4%, más de 3%, más de 2%, más de 1 % o más de 0.5% de la proteína total, cada uno. La rCGE, como se usa en la presente, se refiere a la electroforesis en gel capilar bajo condiciones reductoras suficientes para reducir los enlaces disulfuro en un anticuerpo o molécula tipo anticuerpo o derivada de anticuerpo.

La presente invención provee métodos para preparar formulaciones líquidas del anticuerpo o fragmento de unión al glucoesfingolípido tipo I extendido del mismo, dichos métodos comprendiendo concentrar una fracción de anticuerpo purificado a una concentración final de aproximadamente 15 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 40 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 60 mg/ml, aproximadamente 70 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 90 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 300 mg/ml o más usando, por ejemplo, una membrana semipermeable con un límite de peso molecular adecuado (por ejemplo, un límite de 30 kD para fragmentos F(ab )2 del mismo; y un límite de 10 kD para fragmentos Fab) y, opcionalmente, diafiltrando la fracción de anticuerpo concentrada en el regulador de pH de la formulación usando la misma membrana.

Además, la presente invención abarca también formulaciones líquidas estables de los productos de interés que pueden tener una vida media mejorada in vivo. De esta manera, el anticuerpo de interés tiene una vida media en un sujeto, de preferencia un humano, de más de 3 días, más de 7 días, más de 10 días, más de 15 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 2 meses, más de 3 meses, más de 4 meses, más de 5 meses, o más.

Como se usa en la presente, los términos "estabilidad" y "estable" en el contexto de una formulación líquida que comprende un anticuerpo anti-glucoesfingolípido tipo I extendido o fragmento de unión del mismo, se refieren a la resistencia del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en la formulación al despliegue térmico y químico, agregación, degradación o fragmentación bajo condiciones dadas de fabricación, preparación, transportación y almacenamiento. Las formulaciones "estables" de la invención retienen una actividad biológica igual o mayor que 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99.5% bajo condiciones dadas de fabricación, preparación, transportación y almacenamiento. La estabilidad de dicha preparación de anticuerpos puede evaluarse por los grados de agregación, degradación o fragmentación, por métodos conocidos por los expertos en la técnica que incluyen, pero no están limitados a, rCGE, electroforesis en gel de dodeciisulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) y HPSEC, en comparación con una referencia, por un período predeterminado bajo condiciones de almacenamiento seleccionadas, como una elección de diseño.

La presente invención abarca formulaciones líquidas que tienen estabilidad a las temperaturas encontradas en un refrigerador o congelador comercial encontrado en el consultorio de un médico o en un laboratorio, tales como de aproximadamente -20° C a aproximadamente 5o C, dicha estabilidad evaluada, por ejemplo, por cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (HPSEC), para propósitos de almacenamiento tales como por aproximadamente 60 días, por aproximadamente 120 días, por aproximadamente 180 días, por aproximadamente un año, por aproximadamente 2 años, o más. Las formulaciones líquidas de la presente invención exhiben también estabilidad según se evalúa, por ejemplo, por HSPEC, a temperatura ambiente, por cuando menos unas cuantas horas, tal como aproximadamente una hora, aproximadamente dos horas o aproximadamente tres horas, antes de su uso.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual la formulación terapéutica se administra. Dichos vehículos fisiológicos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de petróleo, aceite de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí, y similares. El agua es un vehículo adecuado cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol pueden usarse también como vehículos líquidos, en particular para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, y similares. Si se desea, la composición puede contener también cantidades menores de agentes mojantes o emulsificantes, o agentes reguladores de pH. Las composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, depósitos, y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir vehículos estándar tales como grados farmacéuticos de manítol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc., saborizantes, colorantes, odorantes, etc. Ejemplos de vehículos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences," Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad efectiva del anticuerpo, de preferencia en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo, para proveer la forma para administración adecuada al paciente. Como es sabido en la técnica, la formulación se preparará para favorecer el modo de administración.

Agentes reguladores de pH ayudan a mantener el pH en una escala que se aproxima a las condiciones fisiológicas o condiciones que llevan a la estabilidad del anticuerpo. Los reguladores de pH están presentes de preferencia a una concentración que varía de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Agentes reguladores de pH adecuados para su uso con la presente invención, incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos, y sales de los mismos tales como, por ejemplo, reguladores de pH de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), reguladores de pH de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), reguladores de pH de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), reguladores de pH de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.), reguladores de pH de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), reguladores de pH de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), reguladores de pH de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y reguladores de pH de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.). Pueden usarse reguladores de pH de fosfato, reguladores de pH de carbonato, reguladores de pH de histidina, sales de trimetilamina tales como Tris, HEPES y otros de dichos reguladores de pH conocidos.

Pueden añadirse conservadores para retardar el crecimiento microbiano, y pueden añadirse en cantidades que varían de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 1% (en p/v). Conservadores adecuados para su uso con la presente invención, incluyen fenol, alcohol bencílico, m-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, halogenuros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio, alquilparabenos tales como metilparabeno o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.

Están presentes isotonificadores para garantizar la isotonicidad fisiológica de las composiciones líquidas de la presente invención, e incluyen alcoholes de azúcar polihídricos tales como alcoholes de azúcar trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Pueden estar presentes alcoholes polihídricos en una cantidad de entre aproximadamente 0.1% a aproximadamente 25%, en peso, de preferencia aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, tomando en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes.

Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función desde un agente de abultamiento hasta un aditivo que solubiliza al agente terapéutico, o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del contenedor. Estabilizadores típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihidricos; aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina etc.; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, arabitol, eritritol, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol, y similares, incluyendo ciclitoles tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutation, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero de bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona, sacáridos, monosacáridos tales como xilosa, mañosa, fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa; polisacáridos tales como dextrán, etc. Los estabilizadores pueden estar presentes en la escala de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10,000 en p/p por parte de proteína activa.

Excipientes diversos adicionales pueden incluir agentes de abultamiento (por ejemplo, agar, gelatina, almidón, etc.), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina o vitamina E) y co-solventes.

Como se usa en la presente, el término "agente tensoactivo" se refiere a sustancias orgánicas que tienen estructuras antipáticas, a saber, están compuestos de grupos de tendencias de solubilidad opuestas, típicamente una cadena de hidrocarburo soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los agentes tensoactivos pueden clasificarse, dependiendo de la carga de la porción tensoactiva, en agentes tensoactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos. Los agentes tensoactivos se usan con frecuencia como agentes mojantes, emulsificantes, solubilizadores y dispersantes para varias composiciones farmacéuticas y preparaciones de materiales biológicos tales como aquellas discutidas en la presente.

Agentes tensoactivos no iónicos o detergentes (conocidos también como "agentes mojantes"), pueden añadirse para ayudar a solubilizar al agente terapéutico, así como para proteger a la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, lo cual permite también que la formulación sea expuesta a tensiones de superficie de esfuerzo cortante, sin que cause desnaturalización de la proteína. Agentes tensoactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80 etc.), poloxámeros (184, 188 etc.), polioles Pluronic® y monoéteres de polioxietileno sorbitán (TWEEN-20®, TWEEN-80® etc.). Agentes tensoactivos no iónicos pueden estar presentes en una escala de aproximadamente 0.05 mg/ml a aproximadamente 1.0 rng/ml, de preferencia aproximadamente 0.07 mg/ml a aproximadamente 0.2 mg/ml.

Como se usa en la presente, el término "sal inorgánica" se refiere a cualquier compuesto, que no contiene carbono, que resulta del reemplazo de parte o la totalidad del hidrógeno ácido o un ácido por un metal o un grupo que actúa como un metal, y se usa con frecuencia como un compuesto para el ajuste de tonicidad en composiciones farmacéuticas y preparaciones de materiales biológicos. Las sales inorgánicas más comunes son NaCI, KCI, NaH2P04, etc.

La presente invención provee formulaciones líquidas de un compuesto de unión al glucoesfingolípido tipo I extendido o fragmento del mismo, con un pH que varía de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, o aproximadamente 5.5 a 6.5, o aproximadamente 5.8 a aproximadamente 6.2, o aproximadamente 6.0.

La formulación en la presente puede contener también más que un compuesto activo, según sea necesario, para la indicación particular que está siendo tratada, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no se fijan firmemente adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proveer además un agente inmunosupresor. Dichas moléculas están presentes convenientemente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito deseado. La formulación puede contener también otro fármaco, o una pequeña molécula, o un agente farmacológico tal como un fármaco antineoplásico tal como cisplatino.

El término "pequeña molécula" y términos análogos incluyen, pero no están limitados a, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácido, compuestos orgánicos, agentes farmacológicamente activos tales como fármacos, polinucleótidos, análogos de polinucleótido, nucleótidos, análogos de nucleótido, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorgánicos y/u organometálicos) que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 10,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 5,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 1 ,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor de aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos.

De esta manera, en el caso de cáncer, los anticuerpos de la invención pueden administrarse solos o en combinación con otros tipos de tratamientos del cáncer, incluyendo agentes quimioterapéuticos convencionales (paclitaxel, carboplatino, cisplatino y doxorrubicina), agentes anti-EGFR (gefitinib, erlotinib y cetuximab), agentes antiangiogénesis (bevacizumab y sunitinib), así como agentes inmunomoduladores tales como interferón-a y talidomida.

Como se usa en la presente, los términos "agente terapéutico" y "agentes terapéuticos" se refieren a cualquier agente que puede usarse en el tratamiento, manejo o mejora de una enfermedad, trastorno, malestar y similares, asociados con la expresión, el metabolismo en general y la actividad aberrantes del glucoesfingolípido tipo I extendido. Incluidos también son compuestos conocidos con un efecto farmacológico en el tratamiento de un trastorno, etc., que está asociado con la expresión, el metabolismo o la actividad aberrantes del glucoesfingolípido tipo I extendido.

El anticuerpo o variante, opcionalmente, se formula con uno o más agentes usados comúnmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Éstos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con las vías de administración que se usaron anteriormente, o de aproximadamente 1 a 99% de las dosificaciones usadas anteriormente.

Las formulaciones que se usarán para administración in vivo deben ser estériles. Esto puede lograrse, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Por ejemplo, las formulaciones líquidas de la presente invención pueden esterilizarse por filtración usando un filtro de 0.2 pm o un filtro de 0.22 µp? Además, los anticuerpos de la presente invención pueden ser conjugados con varias moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionúclidos o toxinas; véase, por ejemplo, los documentos WO 92/08495; WO 91/14438; y WO 89/12624; la patente de E.U.A. No. 5,314,995; y el documento EPO 396,387. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede ser conjugado con una porción terapéutica tal como una citotoxina (por ejemplo, un agente citostático o citocida), un agente terapéutico o un ión de metal radiactivo (por ejemplo, emisores alfa tales como, por ejemplo, 213Bi). Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Ejemplos incluyen paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitados a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo y dacarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisplatino (cis-diclorodiamino platino (II) (DDP)), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina, daunomicina y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina, actinomicina, bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Para prolongar la circulación de un anticuerpo in vivo en suero, pueden usarse varias técnicas. Por ejemplo, moléculas de polímero inertes, tales como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular, pueden ser unidas a un anticuerpo con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de conjugación específica de sitio del PEG al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del anticuerpo, o por medio de grupos e amino presentes en los residuos de lisina. Puede usarse derivatización de polímeros lineales o ramificados que resulte en pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación puede monitorearse estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masa, para garantizar la conjugación adecuada de las moléculas de PEG a los anticuerpos. El PEG sin reaccionar puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG por cromatografía de exclusión por tamaño o por cromatografía de intercambio iónico. Pueden ponerse a prueba anticuerpos derivatizados con PEG para actividad de unión, así como para eficacia in vivo, usando métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, por los inmunoensayos descritos en la presente.

Un anticuerpo que tenga una vida media incrementada in vivo puede generarse también introduciendo una o más modificaciones de aminoácido (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante de IgG, o fragmento de unión a FCR del mismo (tal como un fragmento de dominio de Fc o fragmento de dominio de Fc del gozne); véase, por ejemplo, los documentos WO 98/23289; y WO 97/34631 ; y la patente de E.U.A. No. 6,277,375.

Además, un anticuerpo puede ser conjugado con albúmina para obtener un anticuerpo más estable in vivo, o para que tenga una vida media in vivo más larga. Las técnicas se conocen en la materia; véase, por ejemplo, los documentos WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y EPO 413622. El anticuerpo puede ser modificado también, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos bloqueadores/protectores conocidos, desdoblamiento proteolítico, enlace con un ligando celular u otra proteína, etc.

Las técnicas para conjugar dicha porción terapéutica con anticuerpos son bien conocidas; véase, por ejemplo, Arnon et al., en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), Alan R. Liss (1985); Hellstrom et al., en Controlled Drug Delivery, 2a. ed., Robinson et al., eds., Marcel Dekker (1987); Thorpe, en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., eds. (1985); Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection and Therapy, Baldwin et al., eds., Academic Press (1985); y Thorpe et al., Immunol Rev 62: 1 19 (1982). En forma alternativa, un anticuerpo puede ser conjugado con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo, tal como un anticuerpo bifuncional; véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,676,980.

Los conjugados de la invención pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada, y no se considerará que el agente terapéutico o porción de fármaco se limita a los agentes quimioterapéuticos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón-a, interferón-ß, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, por ejemplo, FNT-a, FNT-ß, AIM I (véase el documento WO 97/33899), AIM II (véase el documento WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et ai, Int Immunol, 6: 1567 (1994)), VEGF (véase el documento WO 99/23105); un agente trombótico; un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor éstimulador de colonias de macrófagos-granulocitos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF) u otros factores decrecimiento.

El anticuerpo o composición variante se formulará, dosificará y administrará en una manera consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que está siendo tratado, el mamífero particular que está siendo tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el plan de administración y otros factores conocidos por los especialistas médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo o variante que se va a administrar será determinada por dichas consideraciones, y puede ser la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad, condición o trastorno relacionado con el glucoesfingolípido tipo I extendido.

Como se usa en la presente, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico), la cual es suficiente para: reducir la severidad y/o duración de una enfermedad asociada o relacionada con el glucoesfingolípido tipo I extendido; mejorar uno o más síntomas de la misma; prevenir el avance de una enfermedad asociada o relacionada con el glucoesfingolípido tipo I extendido; causar la regresión de una enfermedad asociada o relacionada con el glucoesfingolípido tipo I extendido, o la cual sea suficiente para resultar en la prevención del desarrollo, recidiva, inicio o progresión de una enfermedad asociada o relacionada con el glucoesfingolípido tipo I extendido o uno o más síntomas de la misma; o aumentar o mejorar los efectos profilácticos y/o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, otro agente terapéutico) útil para tratar una enfermedad relacionada o asociada con el glucoesfingolípido tipo I extendido. Por ejemplo, un tratamiento de interés puede reducir un síntoma, con base en el punto de partida o un nivel normal, por cuando menos aproximadamente 5%, de preferencia por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 100%. En otra modalidad, una cantidad efectiva de un agente terapéutico o profiláctico reduce un síntoma de una enfermedad asociada o relacionada con el glucoesfingolípido tipo I extendido, tal como cáncer, por cuando menos aproximadamente 5%, de preferencia por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 25%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 100%. Usado también en la presente como un equivalente, es el término "cantidad terapéuticamente efectiva".

La cantidad de polipéptido terapéutico, anticuerpo o fragmento del mismo que será efectiva en el uso o tratamiento de un trastorno o condición particular, dependerá de la naturaleza del trastorno o condición, y puede determinarse por técnicas clínicas estándar. En donde sea posible, una curva de respuesta a la dosis y las composiciones farmacéuticas de la invención pueden derivarse primero in vitro. Si está disponible un sistema de modelo animal adecuado, de nuevo una curva de respuesta a la dosis puede obtenerse y usarse para extrapolar una dosis adecuada en humanos, poniendo en práctica métodos conocidos en la técnica. Sin embargo, con base en el conocimiento común de la técnica, una composición farmacéutica efectiva para promover una disminución de un efecto inflamatorio, por ejemplo, puede proveer una concentración de agente terapéutico local de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 ng/ml y, de preferencia, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 ng/ml.

En una modalidad preferida, una solución acuosa de polipéptido terapéutico, anticuerpo o fragmento del mismo puede administrarse por inyección subcutánea. Cada dosis puede variar de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg por kilogramo de peso corporal. La dosificación puede indagarse empíricamente para la enfermedad particular, población de pacientes, modo de administración, etc., poniendo en práctica métodos farmacéuticos conocidos en la técnica.

El plan de dosificación para la administración subcutánea puede variar de una vez por semana a diariamente a veces múltiples al día, dependiendo de muchos factores clínicos, que incluyen el tipo de enfermedad, la severidad de la enfermedad y la sensibilidad del sujeto al agente terapéutico.

En una modalidad, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en regulador de pH acuoso isotónico estéril. En donde sea necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizador y un anestésico local tal como lidocaína u otro anestésico con la terminación "caína" que alivie el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan juntos en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado en un contenedor sellado, tal como una ampolleta o sachet que indique la cantidad de agente activo. En donde la composición se administre por infusión, puede dispensarse con un matraz de infusión que contenga agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. En donde la composición se administre por inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina puede proveerse, por ejemplo, en un kit, de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

La invención provee también que una formulación liquida de la presente invención sea empacada en un contenedor sellado tal como una ampolleta o sachet que indique la cantidad del producto interés. Las formulaciones líquidas de la presente invención pueden estar en un contenedor sellado que indique la cantidad y concentración del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La formulación líquida de la presente invención puede suministrarse en un contenedor sellado con por lo menos aproximadamente 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml o 300 mg/ml de anticuerpo de glucoesfingolípído tipo I extendido, en una cantidad de aproximadamente 1 mi, 2 mi, 3 mi, 4 mi, 5 mi, 6 mi, 7 mi, 8 mi, 9 mi, 10 mi, 15 mi o 20 mi, por ejemplo.

Se provee un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un contenedor y una etiqueta. Contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, matraces, viales, jeringas y tubos de prueba. Los contenedores pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva para diagnosticar, prevenir o tratar una condición o enfermedad relacionada con el glucoesfingolípido tipo I extendido, y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón horadable por una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta sobre o asociada con el contenedor, indica que la composición se usa para el tratamiento de la condición de elección. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo contenedor que comprenda un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina regulada en su pH con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen reguladores de pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e inserciones del empaque con instrucciones para su uso.

En otro aspecto de la invención, ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican para anticuerpos o derivados funcionales de los mismos, se administran para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrantes del glucoesfingolípido tipo I extendido, por medio de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada por la administración, a un sujeto, de un ácido nucleico de interés expresado o expresable. En forma alternativa, células manipuladas para llevar secuencias de genes de interés, se administran a un hospedero. En una modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen la proteína codificada en y por células hospederas objetivo que median un efecto terapéutico. Cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles, puede usarse de conformidad con la presente invención.

Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véase Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488 (1993); Wu et al., Biotherapy 3: 87 (1991); Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573 (1993); Mulligan, Science 260: 926 (1993); Morgan et al., Ann Rev Biochem 62: 191 (1993); y May, TIBTECH 1 1 : 155 (1993).

En un aspecto, el compuesto comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para un anticuerpo, o fragmentos de unión funcionales del mismo, dichas secuencias de ácido nucleico siendo parte de vectores de expresión que expresan el anticuerpo o fragmentos o proteínas quiméricas o cadenas ligeras o pesadas del mismo, en un hospedero adecuado. En particular, dichas secuencias de ácido nucleico tienen promotores enlazados operablemente al anticuerpo o región codificante de unión al antígeno, dicho promotor siendo inducible o constitutivo y, opcionalmente, específico de tejidos, así como otras secuencias reguladoras.

En otra modalidad particular, se usan moléculas de ácido nucleico en las cuales las secuencias que codifican para el anticuerpo y cualquier otra secuencia deseada, son flanqueadas por regiones que promueven la recombínación homologa en un sitio deseado en el genoma, proveyendo de esta manera la integración y la expresión intracromosómica de los ácidos nucleicos que codifican para el anticuerpo (Koller et al., Proc Nati Acad Sci USA 86: 8932 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435 (1989)). En modalidades específicas, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo de cadena sencilla; en forma alternativa, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican para las cadenas pesada y ligera, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo. Métodos alternativos para la integración incluyen el uso de factores de transcripción particulares que reconocen secuencias de ácido nucleico específicas, dedos de zinc, etc.

El suministro de los ácidos nucleicos en un paciente puede ser directo, en cuyo caso el paciente es expuesto directamente al ácido nucleico o vectores que poseen al ácido nucleico, o indirecto, en cuyo caso las células son transformadas primero con los ácidos nucleicos in vitro, y trasplantadas entonces en el paciente.

En una modalidad, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo y son expresadas para obtener el producto codificado. Esto puede lograrse por cualquiera de numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyendo las secuencias codificantes del anticuerpo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y administrando el mismo, de modo que los vectores lleguen a ser intracelulares, por ejemplo, por infección usando vectores retrovirales defectuosos o atenuados u otros vectores virales (véase la patente de E.U.A. No. 4,980,286), por inyección directa de ADN desnudo, por el uso de bombardeo de micropartículas (usando, por ejemplo, un cañón de genes; Biolistic, Dupont), usando vectores no virales, tales como composiciones sintéticas que comprendan un compuesto antipático que se una al ácido nucleico hidrofílico y tenga la capacidad de fusionarse con células, generalmente conteniendo de esta manera una porción hidrofóbica para combinación con membranas, recubrimiento con lípidos o receptores de superficie de la célula o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, administrando el vector en enlace con un péptido que se sabe entra al núcleo, administrando el vector en enlace con un ligando sujeto a endocitosis mediada por el receptor (véase, por ejemplo, Wu ef ai, J Biol Chem 262: 4429 (1987)) (que puede usarse para dirigir tipos de células que expresan específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, pueden formarse complejos de ácido nucleico-ligando en los cuales el ligando comprende un péptido viral fusogénico que rompe los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En otra modalidad, el ácido nucleico puede ser dirigido in vivo para captación y expresión específica de células, determinando como blanco un receptor específico (véase, por ejemplo, los documentos WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/203 6; WO93/14 88; y WO 93/20221).

Respecto a los vectores, por ejemplo, puede usarse un vector lentiviral como es sabido en la técnica. Los vectores lentivirales contienen componentes para el empacado del genoma viral e integración en el ADN de la célula hospedera. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para el anticuerpo que se usará en terapia génica son clonadas en uno o más vectores, los cuales Pueden usarse también adenovirus en la presente invención. Objetivos para sistemas de suministro basados en adenovirus, incluyen hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculo, por ejemplo. Los adenovirus infectan a células que no están en división, una ventaja sobre los vectores retrovirales tempranos. Kozarsky et al., Curr Opin Gen Dev 3: 499 (1993) presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Otros casos del uso de adenovirus en terapia génica pueden encontrarse en Rosenfeld et al., Science 252: 431 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143 (1992); Mastrangeli et al., J Clin Invest 91 : 225 (1993); documento W094/12649; y Wang et al., Gene Therapy 2: 775 (1995).

Pueden usarse también virus adenoasociados (AAV) en terapia génica (véase Walsh et al., Proc Soc Exp Biol Med 204: 289 (1993); y las patentes de E.U.A. Nos. 5,436,146; 6,632,670; y 6,642,051).

Otro procedimiento para terapia génica, implica transferir un gen a células en cultivo de tejidos por métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Usualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células se ponen entonces bajo selección para aislar aquellas células que han absorbido y están expresando el gen transferido. Dichas células se suministran entonces a un paciente.

De esta manera, el ácido nucleico puede introducirse en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Dicha introducción puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica que incluye, pero no está limitado a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico, fusión de células, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. Numerosas técnicas se conocen en la materia para la introducción de genes extraños en células (véase, por ejemplo, Loeffler et al., Meth Enzymol 217: 599 (1993); Cohén et al., Meth Enzymol 217: 618 (1993); y Cline, Pharm Ther 29: 69 (1985)), y pueden usarse de conformidad con la presente invención, siempre que las funciones fisiológicas y del desarrollo necesarias de las células receptoras, no sean interrumpidas. La técnica debe proveer la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico sea expresado por la célula, sea heredable y sea expresado por la progenie de la célula.

Las células recombinantes resultantes pueden suministrarse a un paciente por varios métodos conocidos en la técnica. Células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre hematopoyéticas o células progenitoras) se administran de preferencia intravenosamente, por ejemplo, como es sabido en la técnica del trasplante de médula ósea. La cantidad de células prevista para su uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y puede ser determinada por los expertos en la técnica.

Células en las cuales un ácido nucleico puede ser introducido para propósitos de terapia génica, abarcan cualquier tipo de célula disponible deseado e incluyen, pero no están limitadas a, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos, células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos y granulocitos, varias células madre o progenitoras, en particular células progenitoras o células madre hematopoyéticas, por ejemplo, como se obtienen de médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.

En una modalidad, la célula usada para terapia génica es autóloga al paciente. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para un anticuerpo de la presente invención son introducidas en las células, de modo que el transgen sea expresado por las células o su progenie, y las células recombinantes se administran entonces in vivo para efecto terapéutico. En una modalidad específica, se usan células madre o progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que pueda aislarse y mantenerse in vitro, puede usarse potencialmente de conformidad con la modalidad de la presente invención (véase por ejemplo, el documento WO 94/08598; y Stemple et al., Cell 71 : 973 (1992); Rheinwald Meth Cell Bio 21 A: 229 (1980); y Pittelkow eí al., Mayo Clinic Proc 61 : 771 (1986)). Debido a que el glucoesfingolípido tipo I extendido es expresado, por ejemplo, en células B, células sanguíneas y células de la médula ósea son células hospederas adecuadas. Sin embargo, el alcance de la presente invención respecto al uso de células madre hospederas no contempla la obtención y el uso de un transgen para obtener un organismo transgénico administrando el transgen de interés a embriones y/o células madre embrionarias.

La invención provee de esta manera métodos de tratamiento, profilaxis y mejora de enfermedades asociadas y relacionadas con el glucoesfingolípido tipo I extendido, o uno o más síntomas de las mismas, administrando a un sujeto una cantidad efectiva, por ejemplo, de una formulación líquida, un anticuerpo o variante del mismo de la invención. El sujeto es de preferencia un mamífero tal como un no primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y un primate (por ejemplo, mono tal como un mono cynomolgus, y un humano). En una modalidad preferida, el sujeto es un humano.

El glucoesfingolípido tipo I extendido es expresado también en ciertas células cancerosas, tales como del páncreas, colon y vejiga, así como en leucemias de células T (Qinping ef al., Oncogene 24: 573-584, 2005), y la estimulación del glucoesfingolípido tipo I extendido se correlaciona con la proliferación de células de carcinoma; Meijer et al., Canc Res 66: 9576-9582, 2006.

De esta manera, el anticuerpo o derivado del mismo de interés puede usarse para controlar la proliferación de células cancerosas que expresan el glucoesfingolípido tipo I extendido, cuyos cánceres se identifican determinando la presencia de la expresión del glucoesfingolípido tipo I extendido por una prueba de diagnóstico enseñada en la presente. El anticuerpo de interés puede reducir la infiltración de células malignas, así como reducir la resistencia a la apoptosis y reducir al mínimo la proliferación. A dichos pacientes se les administra entonces una cantidad inhibidora de la proliferación de células cancerosas de un anticuerpo, o derivado del mismo de interés, como se provee en la presente. Como se enseña en la presente, un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo puede administrarse a un paciente de muchas maneras, que incluyen administrar un polipéptido, un polinucleótido, etc. Esencialmente cualquier cáncer que exprese un epítope de tipo I de interés, puede detectarse y/o tratarse con un anticuerpo de interés. Por ejemplo, la célula maligna puede ser una célula epitelial. La célula epitelial puede encontrarse en cualquier célula maligna originada de cualquier órgano o tejido, tal como colon, recto, esófago, pulmón, próstata, mama, páncreas, la cavidad oral, vagina, el tracto gastrointestinal en general, el tracto urinario, etc. Sin embargo, no es necesario limitar el cáncer a una célula epitelial, en tanto la célula maligna exprese un epítope de tipo I de interés.

La invención se ejemplificará ahora para el beneficio del experto en la técnica mediante los siguientes ejemplos no limitativos, que describen algunas de las modalidades por y en las cuales la presente invención puede ponerse en práctica.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación del inmunógeno Se cultivan células Colo205 (ATCC) (Semple et al., Cáncer Res 38: 1345-1355, 1978) en medio del RPMI 1640 conteniendo suero de ternera fetal a 10%. Las células cosechadas se lavan dos veces con PBS, y se almacenan a -20°C hasta que sean necesarias. Las pellas de células se extraen con isopropanol-hexano-agua (IHW) (55:25:20) seguidos de repartición de Folch, cromatografía de DEAE Sephadex y CLAR sobre una columna 6RS-8010 latrobead. La elución por gradiente de la fracción neutra de la fase superior se realiza en IHW de 55:40:5 a 55:25:20 durante 200 minutos. Las fracciones se colectan y se reúnen de acuerdo con la migración en HPTLC en cloroformo-metanol-agua (50:40:10). Los glucoesfingolípidos de cadena tipo I extendida se purifican adicionalmente por TLC preparativa sobre placas para HPTLC de Merck (gel de sílice 60, Merck, Darmstadt, Alemania); véase la patente de E.U.A. No. 6,083,929.

Una banda positiva (por inmunotinción con el mAb IMH2) que migró justo abajo del antígeno Lea dimérico, se purifica como se enseña en la presente.

Las células de adenocarcinoma colorrectal Colo205 (ATCC, CCL-222) y DLD-1 (ATCC, CCL-221 ) se cultivan en medio del RPMI 1640 (Invitrogen Co., No. de catálogo 31800) complementado con piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen Co., No. de catálogo 11360). Otras células de adenocarcinoma colorrectal, SW1116 (ATCC, CCL-233) y HT-29 (ATCC, HTB-38) y células T84 derivadas de pulmón (ATCC, CCL-248) se mantienen por separado en medio L-15 de Leibovitz (Invitrogen Co., No. de catálogo 41300), medio 5a de McCoy (Invitrogen Co., No. de catálogo 12330) y medio DMEM/F12 (Invitrogen Co., No. de catálogo 12400). Las células de carcinoma gástrico KATO III (ATCC, HTB-103) se cultivan en medio IMDM (Invitrogen Co., No. de catálogo 12200). Todos los medios usados en los estudios se complementan con suero de ternera fetal a 10%.

EJEMPLO 2 Generación de mAbs anti-qlucoesfingolípido tipo I extendido Se generan ratones KM (Kirin Brewery Co., Ltd.) por cruzamiento de razas de ratones transcromosómicos dobles y ratones transgénicos. Los ratones KM poseen fragmentos de cromosomas humanos que contienen a los loci enteros de la cadena pesada de inmunoglobulina humana y un transgen de YAC para la mitad de los loci de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. Los ratones KM son diseñados para que no expresen ni la cadena pesada de inmunoglobulina endógena ni la cadena ligera kappa. Todos los animales se mantienen y se manipulan de acuerdo con las reglas y regulaciones aceptadas en la técnica.

Se inyectan intraperitonealmente células Colo205 en los ratones KM cada 3 semanas (5 x 106 células/inyección) para un total de 4 inyecciones, seguidas de inyección de glucoesfingolípidos de cadena tipo I extendida que se aislan de células Colo205 y adsorbidas sobre lipopolisacárido (Sigma, L-7011) (Young ef a/., J. Exp. Med. 150: 1008-1019), cada semana para 8 inyecciones. Los títulos del anti-glucoesfingolípido neutro Colo205 de los ratones inmunizados se monitorean por ELISA usando kappa-HRP antihumano (Southern Biotechnology Associates, No. de catálogo 9220-05) como el anticuerpo secundario, hasta que el título alcance 1 :6000. Tres días después de la inyección final, los esplenocitos del ratón fomentado son fusionados con células de mieloma de ratón P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1) (ATCC, TIB-18), poniendo en práctica métodos conocidos en la técnica. Los hibridomas se seleccionan por ELISA usando placas de ELISA de 96 cavidades (Costar, No. de catálogo 2592) recubiertas con glucolípido neutro de Colo205. Anticuerpos de IgG anti-humano de ratón conjugados con HRP se usan como el anticuerpo secundario (Southern Biotechnology Associates, No. de catálogo 9040-05) y se usa tetrametilbencideno (TMB) (Kem-Zn-Tec Diagnostícs, No. de catálogo 4390) como el substrato. Los sobrenadantes del hibridoma que muestran alta reactividad con los glucolípidos neutros de Colo205, se confirman adicionalmente por inmunotinción en HPTLC y por citometría de flujo. Los clones que tiñen fuertemente los glucolípidos de cadena tipo I extendida y que muestran alta unión sobre la superficie de las células Colo205, son subclonados repetidamente por dilución limitativa hasta que se establezcan clones estables. Un clon estable es GNX-8.

EJEMPLO 3 Anticuerpo GNX-8 Se purifica el anticuerpo monoclonal de los sobrenadantes de cultivo usando proteína A Sepharose (GE Healthcare, 17-129-79-02) con elución por gradiente de pH, de acuerdo con los procedimientos sugeridos por el fabricante. Cada fracción se colecta y se examina la presencia del anticuerpo por ELISA. Las fracciones con actividad de unión al glucolipido neutro de Colo205 se reúnen y se dializan contra PBS (pH 7.4). Los anticuerpos purificados se distribuyen en alícuotas y se almacenan a -20°C.

La concentración de anticuerpo monoclonal se determina con el kit de prueba de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad, No. de catálogo 500-0006) usando IgG como el estándar, de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante.

El isotipo de GNX-8 se determina usando una ELISA. GNX-8 es una lgG1 humana, y la cadena ligera es kappa.

Se aplica GNX-8 purificado a geles de SDS-poliacrílamida a 10% después de que son hervidos en 2X regulador de pH de carga de gel de SDS con (condición reductora) o sin ß-mercaptoetanol (condición no reductora). Se lleva a cabo electroforesis usando el sistema de electroforesis Minutesi-PROTEAN3 (BIO-RAD), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

El GNX-8 separado sobre geles de SDS-PAGE reductores es transferido sobre membranas de nitrocelulosa (NC) (Amersham) y bloqueado con leche descremada a 3% en PBS. La membrana se incuba con el anticuerpo secundario por 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo de IgG(y) anti-humano de cabra marcado con HRP (Zymed, 62-8420) a dilución 1 :5000 y el anticuerpo de IgG de cadena kappa anti-humano de conejo marcado con HRP (DAKO, P0129) a dilución 1 :2000, se usan por separado para detectar la cadena pesada y la cadena ligera de GNX-8. Se usa el reactivo de quimioluminiscencia plus Western Lightning™ (PerkinElmer Life Sciences, No. de catálogo NEL105), para desarrollar la señal sobre película óptica BioMax (KODAK, No. de catálogo 1788207).

Bajo condiciones reductoras, el peso molecular de la cadena ligera y la cadena pesada de GNX-8, es como se espera para una IgG. GNX-8 es un anticuerpo monoclonal humano por Western blot con lgG(y)-HRP anti-humano de cabra y HRP de cadena kappa anti-humano de conejo como anticuerpos secundarios, por separado. GNX-8 es un anticuerpo humano por isotipificación con ELISA.

El análisis del pl de GNX-8, se determina por el PhastSystem (Pharmacia). En resumen, una muestra del anticuerpo y estándar de pl se aplican sobre un IEF PhastGel 3-9 usando un aplicador de muestras PhastGel 8/1 comb, y se separan de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después, el gel se tiñe con plata en la unidad de desarrollo PhastSystem (Pharmacia), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

El análisis del pl revela bandas múltiples que varían de pH 8.15 a 8.65, indicando la posibilidad de modificaciones post-traducción del anticuerpo. El alto pl indica que GNX-8 será soluble a pH fisiológico.

Para detectar la actividad de unión a células, 2 x 105 células se lavan con PBS y se incuban con varias concentraciones de anticuerpo por 30 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado con PBS, anticuerpos de IgG (Fe) anti-humano de cabra marcados con FITC a dilución 1:3000 (ICN, No. de catálogo 55198) se añaden a cada muestra de células por otros 30 minutos a temperatura ambiente. Para estudios de CDC, las células después del tratamiento con el anticuerpo se lavan tres veces con PBS y se incuban con 1 µ? de solución de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich, P4846) por 30 minutos. Después de un lavado final con PBS, las células se analizan en un citómetro de flujo (BD, FACSort). Los resultados se procesan con CELLQuest 3.3 (BD).

EJEMPLO 4 Prueba de citotoxicidad Las líneas de células de cáncer de colon humano SW1116, Colo205 y DLD-1 , se siembran en placas de 48 cavidades (Corning Costar) a una densidad de 2 x 104 células/cavidad. Después de que se cultivan durante la noche, las células se incuban en 500 pl de medio con suero humano no inactivado a 25% a varias concentraciones de anticuerpo por 2 horas.

Después de un lavado con PBS, las células vivas restantes se cuantifican por tinción con solución de yoduro de propidio (Pl) (Sigma-Aldrich, P4846) y se analizan por citometría de flujo. Moléculas de IgG humana normal purificadas de suero humano normal, se usan como un control negativo.

En una prueba alternativa, se marcan células objetivo por incubación con aproximadamente 100 µ? de 51Cr por aproximadamente 90 minutos a aproximadamente 37°C. Después de lavado (3x) e incubación (aproximadamente 1 hora a 37°C), se suspenden las células (aproximadamente 1 x 106 mi) en medio del RPMI-1640 complementado con regulador de pH de HEPES aproximadamente 25 mM y albúmina de suero de bovino a aproximadamente 3%. Aproximadamente 20 µ? de células marcadas, aproximadamente 100 µ? de mAb y suero humano inactivado con calor a 25%, se mezclan en las cavidades de placas de microtítulo de fondo en U (Corning, N.Y.). Inmunoglobulina de ratón no específica (Sigma, St. Louis, MO) puede usarse como un control negativo. Después de aproximadamente 4 horas de incubación, las placas se centrifugan (500 x g, 2 minutos) con un soporte de placa colgante ensamblado en una centrífuga, y se mide la radiactividad en aproximadamente 100 µ? de sobrenadante en cada cavidad con un contador gamma. Cada grupo experimental puede ponerse a prueba por triplicado. El por ciento de lisis específica puede calcularse de acuerdo con la fórmula ([A-B] x 100)/C, en donde A=cpm en células experimentales lisadas; B=cpm en células objetivo no lisadas; y C=cpm en células objetivo totales. De preferencia, la liberación espontánea no debe exceder 15% de la radiactividad marcada liberable al máximo.

Se realizan pruebas de ADCC por la prueba de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (Promega, prueba de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96®), usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas como células efectoras preparadas de donadores sanos usando Ficoll-Paque (GE, 71-7167-00). La prueba mide cuantitativamente la lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima citosólica estable que es liberada en la lisis de células. La LDH liberada en los sobrenadantes de cultivo se mide con una prueba enzimática acoplada por 30 minutos, que resulta en la conversión de una sal de tetrazolio (INT) en un producto de formazán rojo. La cantidad de color formado es proporcional al número de células lisadas.

Las células Colo205 usadas como células objetivo se distribuyen en placas de 96 cavidades de fondo en U (2 x 104 células/cavidad), y se incuban con anticuerpos en presencia de las PBMC con varias relaciones de E/T por 4 horas a 37°C. La actividad de LDH en el sobrenadante se midió por la prueba de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96®. El por ciento de citólisis específica se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: % de lisis específica = 100 x (E-SE-ST)/(M-St), en donde E es la liberación experimental (actividad en el sobrenadante de células objetivo incubadas con anticuerpo y células efectoras), SE es la liberación espontánea en presencia de células efectoras (actividad en el sobrenadante de células efectoras con medio solo), ST es la liberación espontánea de células objetivo (actividad en el sobrenadante de células objetivo incubadas con medios solo), y M es la liberación máxima de células objetivo (actividad liberada de células objetivo lisadas con Tritón X-100 a 9%).

La actividad antitumoral ¡n vitro de GNX-8 se evalúa por prueba de CDC. El tratamiento de las células de cáncer colorrectal humano, SW1 1 16, Colo205 y DLD-1 , con GNX-8 en presencia de suero humano a 25%, resulta en lisis de células sustancial en una manera dependiente de la dosis. Los resultados indican que GNX-8 destruye a las células objetivo a través de citólisis dependiente del complemento.

El efecto de CDC sobre células SW1116 y Colo205 en algunos experimentos, es más fuerte que aquel sobre células DLD-1. La viabilidad de las células es inversamente proporcional al nivel de expresión del antígeno de GNX-8. El efecto de CDC que exhibe GNX-8 y los niveles de expresión del antígeno de GNX-8 sobre las tres líneas de células de cáncer colorrectal, demuestran que las células cancerosas con mayor expresión del antígeno de GNX-8 son más susceptibles a la citotoxicidad, mientras que aquellas con menor expresión del antígeno de GNX-8 tienen mayor viabilidad. Los resultados llevan a la conclusión de que la actividad antitumoral de GNX-8 puede depender del nivel de expresión del antígeno de GNX-8. Los pacientes con alta expresión del antígeno de GNX-8 sobre las células tumorales podrían tratarse con GNX-8 solo, mientras que los tumores que expresan menores niveles del antígeno de GNX-8 pueden beneficiarse de una terapia de combinación con uno o más de otros fármacos para el cáncer además del anticuerpo GNX-8.

Se evalúa la actividad de ADCC de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas, contra el cáncer colorrectal humano Colo205 en presencia de GNX-8. La actividad de ADCC con IMH2 se usa como el control positivo, y la IgG humana como el control negativo.

GNX-8 induce fuerte actividad de ADCC contra las células Colo205. El efecto citotóxico se correlaciona positivamente con la relación E/T y la concentración de GNX-8. Cien por ciento de lisis de células se observa a una relación E/T de aproximadamente 20/1. Un efecto de ADCC máximo, y una tendencia observada también para aproximadamente 50% de lisis, se observa a aproximadamente 5 pg/ml de GNX-8 y a aproximadamente 50 pg/ml para IMH2, respectivamente. La IgG humana control no muestra efecto citotóxico, a pesar de la relación E/T o la concentración de IgG. La dosis de GNX-8 que alcanza 50% de lisis, es menor que un décimo de la necesaria para IMH2.

EJEMPLO 5 Análisis de la afinidad por Biacore Los glucoesfingolípidos tipo I son adheridos a un chip. Entonces, los mAbs son expuestos al chip para mediciones de cinética y el análisis de la secuencia de los epítopes en torno a la reacción de unión entre el anticuerpo y el antígeno, siguiendo las recomendaciones del fabricante (GE Healthcare, Pistcataway, NJ).

EJEMPLO 6 Prueba in vivo La actividad anti-tumoral de GNX-8 se evalúa en un modelo de xenoinjerto Colo205. Células Colo205 se lavan dos veces con PBS y se reconstituyen a una densidad de células de 5 x 106/100 µ? en PBS. Ratones desnudos hembras de 6 a 8 semanas son inoculados s.c. con 100 µ? de la suspensión de células Colo205 en la región del flanco. El tamaño de los tumores se mide tres veces por semana con un vernier, y se estima el peso de los tumores (mg) como ancho2 x longitud)/2. GNX-8 o IgG humana normal es inyectado i.p. en ratones desnudos que poseen tumores, de acuerdo con las dosis y los planes designados.

Para evaluar la eficacia anti-tumoral in vivo de GNX-8, se inyectan células cancerosas (5 x 106 células/ratón) en ratones desnudos, y se tratan con GNX-8 (grupo de tratamiento, 8 ratones/grupo) o IgG humana normal (grupo control, 7 ratones/grupo) 24 horas después de la inoculación del tumor. Cinco dosis (300 pg/ratón) a intervalos de 24 horas y después cuatro dosis (600 pg/ratón) a intervalos de 48 horas, se inyectan en ambos grupos.

El crecimiento tumoral es inhibido significativamente en los ratones tratados con GNX-8. El grupo de tratamiento alcanza un peso mediano de tumores de T/C (tratamiento/control) de aproximadamente 23% en el día 11 , y continúa a ese nivel aproximado hasta el final del estudio. Una medida de T/C <42% se considera como significativa en la demostración de la actividad antitumoral. La mitad (4/8) de los ratones en el grupo de tratamiento con GNX-8 logra una supervivencia libre de tumores a largo plazo durante 50 días. Por otra parte, el tamaño del tumor de los animales del grupo control se incrementa continuamente durante el estudio.

Un estudio similar se lleva a cabo en un modelo de ratones desnudos con xenoinjerto Colo205. La primera dosis de GNX-8 se da a un tamaño del tumor de 80 a 100 mg. GNX-8 (grupo de tratamiento) e IgG humana normal (grupo control) se inyectan una vez (300 pg/ratón) diariamente por cinco días, y con dos dosis similares en los días 17 y 21.

Una inhibición significativa del tumor se observa también en el grupo de tratamiento, aunque los tratamientos se descontinúan después de sólo 5 dosis. El peso mediano del tumor de T/C (tratamiento/control) es menor de 42% después del día 10 y hasta el final del estudio.

Para determinar si la función efectora del hospedero contribuyó a la eficacia de GNX-8, ratones SCID que poseen xenoinjertos Colo205 se tratan con GNX-8 o IgG humana normal a 600 pg/ratón dos veces por semana por tres semanas. El tamaño del tumor se mide dos veces cada semana hasta que el tamaño del tumor alcanza 10% del peso corporal, el cual se considera el punto final del estudio.

Se prolonga la supervivencia en el grupo de tratamiento.

Para explorar la ocurrencia del epítope de GNX-8 en cánceres colorrectales humanos, se analizan varias líneas de células de cáncer colorrectal humano.

Por ejemplo, la inhibición in vivo de DLD-1 por GNX-8, es significativa.

EJEMPLO 7 Antíqeno de GNX-8 Para el análisis de la glucoproteína de las células, se raspan células cultivadas de los matraces T-75, y se lavan dos veces con PBS, seguido de regulador de pH de lisis (Tris-HCI 50 m , pH 7.5, NaCI 150 mM, NP-40 a 1%, desoxicolato de sodio a 0.5%, SDS a 0.1 % y PMSF 1 mM). Los lisados se hacen pasar varias veces a través de una aguja de calibre 26 para dispersar cualquier gran agregado. La concentración de proteína se determina por el kit de prueba de proteínas (Bio-Rad). Los lisados que contienen la misma cantidad de proteína se separan sobre un gel y se analizan por Western blot con GNX-8 como el anticuerpo primario e IgG anti-hümano de ratón (Fe) marcada con HRP (Southern Biotechnology Associates, #9040-05) como el anticuerpo secundario. Se usa el reactivo de quimioluminiscencia plus Western Lightning™ (PerkinElmer Life Sciences, No. de catálogo NEL105), para desarrollar la señal sobre película óptica BioMax (KODAK, No. de catálogo 1788207).

Glucolípidos neutros (2 µ?/muestra) se aplican sobre una placa para HPTLC (Merck, 1.05642, gel de sílice 60 F254), y se desarrollan con una fase móvil que contiene cloroformo:metanol:agua a una relación de 50:40:10 (V:V:V). Para la tinción de los glucolípidos con glucano, orcinol a 0.2% (Sigma, 0-1875) en H2SO4 a 10% se rocía sobre una placa para HPTLC, y se incuba por 10 minutos en un horno a 110°C. Para inmunotinción, la placa para HPTLC es fijada primero con metacrilato de poliisobutilo a 0.5% (Aldrich, 181544) en cloroformo:hexano, 1 :9 (V:V) por 45 segundos, seguido de bloqueo por 10 minutos en PBS/BSA a 3%. Las placas se lavan entonces con PBS y se incuban con el anticuerpo primario a temperatura ambiente por 1 hora, seguido del anticuerpo secundario biotinilado a temperatura ambiente por 1 hora. Un kit de complejo de avidina-biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) se usa para amplificar las señales del anticuerpo secundario. La placa se incuba a temperatura ambiente por 30 minutos, seguida de desarrollo de color con un kit de HPR-1000 para inmunotinción (Konica Minolta, 130990), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

A una muestra liofilizada se añaden 20 µ? de fluoruro de hidrógeno (HF) (Merck) a 48%, y entonces la mezcla se incuba a 4°C por 48 horas. Al final de la reacción, el HF es removido con N2 gaseoso. Los glucolípidos desfucosilados se usan para el estudio de especificidad de GNX-8.

Los glucolípidos neutros de Colo205 se tratan con HF y se analizan por MS MALDI-TOF para confirmar la remoción de la fucosa. Se realiza inmunotinción en TLC para analizar la especificidad de GNX-8 dirigido hacia los glucolípidos neutros Colo205, antes y después del tratamiento con HF.

GNX-8 reconoce a los glucolípidos no desdoblados, pero no a las formas desfucosiladas, sugiriendo que el epítope de GNX-8 es una porción de carbohidrato y la fucosa es un componente esencial de la estructura.

La especificidad de GNX-8 se caracteriza además por inmunotinción en HPTLC sobre glucolípidos neutros y de monosialilo aislados de células Colo205. Se colectan 100 g de células Colo205, y se extraen las fracciones de glucolípido. Los glucolípidos de Colo205 separados por TLC se tiñen para carbohidrato con orcinal/H2SO4. Las posiciones de Lea, Leb, Lea-Lea y Leb-Lea se identifican de acuerdo con Stroud et al. (1992), citado anteriormente. Sialil Lea (SLea) es indicado por la tinción con el mAb NKH3 (véase la patente de E.U.A. No. 5,240,833), y se identificó después con S MALDI. La inmunotinción en HPTLC de las mismas fracciones de glucolípido, se lleva a cabo con anticuerpos CF4C4 (patente de E.U.A. No. 5,011 ,920) (anti-Lea), T218 (Abeam, Cambridge, MA) (anti-Leb), IMH2 (Stroud et al., 1992, citado anteriormente) (anti-Leb-Lea) y GNX-8.

Los resultados indican que GNX-8 reacciona fuertemente con los glucolípidos de cadena tipo I extendida. GNX-8 no se unió a las cadenas tipo I extendidas de Lea. Los glucolípidos de monosialilo de las células Colo205 no son reconocidos por GNX-8. GNX-8 muestra reactividad cruzada muy ligera con Le a mayor concentración (0.6 pg/ml). A diferencia de IMH2, GNX-8 no se unió a Lex o a Ley. GNX-8 se une a una cadena extendida que contiene a Leb. GNX-8 se une a Leb-Lea.

Además de la inmunotinción en TLC, el epítope de GNX-8 se caracteriza por ELISA competitiva usando los glucanos sintéticos Leb, Lea-Lex, Le -Lex y Le -Le como inhibidores, y la mezcla de glucolípidos Leb-Lea-Lea-Lea como un control positivo.

Los resultados indican que GNX-8 reacciona en forma cruzada ligeramente con Leb-Lex a alta concentración de inhibidor, pero no tiene reactividad con otros glucanos sintéticos puestos a prueba, incluyendo los glucanos Leb sintéticos. La actividad de unión de GNX-8 hacia Leb extendido es 1000 veces mayor que la de Leb simple.

Con base en los resultados, el epítope de GNX-8 es asimismo una estructura de Leb en una cadena tipo I extendida con fucosilación, pero no es un Leb simple.

EJEMPLO 8 Distribución en células y tejidos Se obtienen especímenes de tejidos cancerosos y normales humanos incluidos en parafina y fijados con formalina, por ejemplo, de US Biomax.

Las disposiciones de tejidos incluidos en parafina y fijados con formalina, de tejidos humanos malignos y normales, son bloqueadas con leche descremada a 0.1 % en PBS por 30 minutos. Después de otros 10 minutos de incubación con H202 a 3%, las disposiciones de tejidos se lavan tres veces con PBS antes de que las muestras se incuben con GNX-8 biotinilado diluido con PBS/BSA a 0.1 % por 1 hora. Entonces, las muestras de tejido se hacen reaccionar con complejo de biotina-estreptavidina-peroxidasa (kit de ABC, Vector, #PK-6100) por 30 minutos, para la amplificación de la señal. El kit del substrato DAB PLUS (Zymed, #00-2020) se usa para visualizar la tinción inmunorreactiva de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realiza contratinción usando hematoxilina. Los resultados se determinan por visualización bajo un microscopio óptico.

La expresión del antígeno de GNX-8 en células cancerosas humanas, se evalúa por citometría de flujo. Muchas líneas de células de tumor gástrico y colorrectal humanos, tales como Colo205, HT-29, DLD-1, SW1116, T84 y KATO III, se examinan por separado para la expresión del antígeno de GNX-8 por citometría de flujo.

Los análisis de citometría de flujo demuestran que GNX-8 exhibe actividad de unión a todas las líneas de células cancerosas puestas a prueba. Sin embargo, la unión es significativamente más fuerte a células SW1116, Colo205 y DLD-1 que a las otras líneas de células cancerosas humanas puestas a prueba.

Además, la expresión del antígeno de GNX-8 se pone a prueba en HL60 (una línea de células promielocíticas), MCF-7 (una línea de células de cáncer de mama) y PANC-1 (una línea de células de cáncer de páncreas), así como en una línea de células de cáncer de colon de ratón, CT26. GNX-8 no se une a estas cuatro líneas de células.

Dos líneas de células de cáncer colorrectal, Colo205 y SW1116, se analizan por Western blot. Las dos líneas de células demostraron fuerte unión con GNX-8 en los análisis de citometría de flujo.

Los resultados muestran la presencia del antígeno de GNX-8 en la glucoproteína de Colo205 y SW 116 sobre una escala de peso molecular de 32 a > 175 kDa. Por consiguiente, los antígenos de GNX-8 no están sólo en los glucolípidos, sino también en las glucoproteínas.

Una variedad de especímenes de varios órganos, que incluyen tejidos cancerosos y tejidos normales, se tiñen por separado con GNX-8. Los patrones de tinción en los especímenes de tejido se evalúan por intensidad de tinción y frecuencia de células positivas. La tinción se clasifica sobre una escala de 1+ (10-20%), 2+ (20-50%) o 3+ (> 50%), mientras que la frecuencia se clasifica con base en el porcentaje de células positivas en cada sección.

Se observa una fuerte correlación entre la expresión del antígeno de GNX-8 en los carcinomas colorrectales primario y metastásico. Se lleva a cabo una tinción inmunohistoquímica de un panel de secciones de tejido de un paciente con cáncer colorrectal.

El antígeno de GNX-8 es expresado no sólo en los tejidos de cáncer colorrectal, sino también en tejidos adyacentes. Por ejemplo, un pólipo próximo a una región de cáncer es teñido por GNX-8. Sin embargo, ninguna tinción se observa en los tejidos normales distales. Por lo tanto, puede concluirse que GNX-8 identifica a las células transformadas o las células que sufren transformación, antes de que ocurran cambios reconocibles en la morfología de las células.

La expresión del antígeno de GNX-8 se estudia también en varios grados de cáncer.

El antígeno de GNX-8 es expresado en cada etapa de cáncer. GNX-8 no se une a colon, recto, estómago, intestino delgado, hígado, esófago, pulmón, próstata o mama normales. 58% (44/76) de las muestras de cáncer de colon son teñidas con GNX-8; 47% de las muestras de cáncer de recto; 57% de las muestras de cáncer de colon metastásico; 52% de las muestras de cáncer de estómago; 29% de las muestras de cáncer de esófago; 22% de las muestras de cáncer de pulmón; 4% de las muestras de cáncer de próstata; 17% de las muestras de cáncer de mama; y 67% de las muestras de cáncer pancreático, son teñidas con GNX-8. GNX-8 no se une a las muestras de cáncer de intestino delgado, hígado y riñon.

CUADRO 1 Especificidad de GNX-8 en tejidos normales humanos * teñido en la queratinización de epitelio escamoso estratificado § teñido en células epiteliales de conductos lactíferos/sistema de conductos # teñido en células epiteliales del sistema de conductos.

CUADRO 2 Especificidad de GNX-8 en tejidos cancerosos humanos EJEMPLO 9 Clonación y secuenciación de GNX-8 Células de hibridoma que producen GNX-8 se cultivan habitualmente en IMDM (Invitrogen) conteniendo suero de bovino fetal a 10% de bajo contenido de IgG (HyClone). Para preparar ARN para la síntesis de ADNc, 1 x 106 de células de hibridoma se cosechan primero por centrifugación a baja velocidad (1000 rpm, 5 minutos). Se aisla entonces el ARN total de la pella de células usando reactivo TRIZOL (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Moléculas de ADNc de la primera cadena se sintetizan a partir de la muestra de ARN purificada usando el kit de amplificación de ADN SMART RACE (BD Biosciences-Clontech). En resumen, 1 pg de ARN total se incuba con 1 pl de 5'-CDS y 1 pl de oligonucleótidos iniciadores SMART II A a 70°C por 2 minutos. Después de la adición de 2 µ? de 5x regulador de pH de la primera cadena, 1 µ? de DTT 20 mM, 1 µ? de dNTP 10 mM y 1 µ? de transcriptasa inversa PowerScript, se añaden a la mezcla de ARN/iniciador. La muestra se incuba adicionalmente a 42°C por 1.5 horas. La reacción de síntesis de ADNc de la primera cadena concluye añadiendo 100 µ? de regulador de pH Tricine e incubando a 72°C por 7 minutos.

El ADNc que codifica para el fragmento de la cadena pesada de GNX-8 se amplifica por PCR usando UPM (kit de amplificación de ADNc SMART RACE de BD), y un iniciador del extremo 3' de la cadena pesada, CH1, SEQ ID NO: 3. La reacción de PCR se lleva a cabo a 94°C por 30 segundos, seguido de 58°C por 30 segundos, 72°C por 3 minutos, y este ciclo se repite 26 veces.

La región variable del ADNc de la cadena pesada se vuelve a amplificar a partir de 1 µ? del producto de la reacción anterior en presencia de NUP (kit de amplificación SMART RACE) y un iniciador de la parte media de la cadena pesada CH1 , SEQ ID NO: 4. La reacción de PCR se lleva a cabo a 94°C por 15 segundos, 68°C por 30 segundos, y este ciclo se repite 25 veces. El producto amplificado se purifica usando un kit de purificación de PCR (GeneMark), y la secuencia de nucleótidos se determina usando un iniciador del extremo 5' de la cadena pesada CH1, SEQ ID NO: 5.

Con base en la información de la secuencia, el ADNc de la cadena pesada de longitud completa se amplifica específicamente por PCR a partir de las moléculas de ADNc de la primera cadena previamente preparadas con los iniciadores recién sintetizados, SEQ ID NO: 6, y para el extremo del gen de la cadena pesada, SEQ ID NO: 7, con el sistema de enzimas de PCR Advantage™ 2 (BD Biosciences). La reacción de PCR se ajusta a 94°C por 40 segundos, 60°C por 30 segundos y 72°C por 100 segundos, y este ciclo se repite 35 veces.

El ADNc de la cadena pesada de longitud completa amplificado es primero doblemente digerido con EcoRI y Xbal. Después de purificación en gel, el ADNc de la cadena pesada recuperado es entonces ligado en el vector pCIneo (Promega) en los mismos sitios, para obtener el vector de expresión pCI-GNX-8.H3. La secuencia de ADNc insertada se confirma usando un iniciador que híbrida hacia el extremo 5' del sitio de clonación múltiple, SEQ ID NO: 8, y un iniciador hacia el extremo 3' del sitio de clonación múltiple, SEQ ID NO: 9. El ADNc de la cadena pesada de GNX-8 y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en el cuadro 3 como SEQ ID NOS: 14 y 5, respectivamente.

Para identificar las secuencias de ADNc de la cadena ligera, el péptido de la cadena ligera de GNX-8 se somete a análisis de espectrometría de masa y búsqueda de base de datos. De acuerdo con la información de la identificación de la proteína, la cadena ligera de GNX-8 es homologa a la cadena ? de ratón. Se sintetiza un iniciador que flanquea el extremo 5' de la región constante del gen lambda de ratón, SEQ ID NO: 10. Un ADNc que incluye la región variable y una parte de la región constante del gen de la cadena ligera, se amplifica a partir de moléculas de ADNc de la primera cadena descritas anteriormente por PCR touchdown. La reacción de PCR se lleva a cabo primero por 5 ciclos de 30 segundos a 94°C, 90 segundos a 72°C, seguido de 5 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 66°C, 90 segundos a 72°C, y entonces el ciclo de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 63°C y 90 segundos a 72°C, se repite 27 veces. Los fragmentos de PCR amplificados se introducen entonces en el vector yT&A (Yeastern Biotech) para la identificación del clon positivo.

Cuatro clones con el tamaño esperado se seleccionan para la determinación de la secuencia con el iniciador, SEQ ID NO: 11.

Los resultados indican que los cuatro clones tienen ADNc idéntico, con una estructura homologa al extremo 5' de genes de la cadena ligera conocidos.

Para reconstituir el ADNc de la cadena ligera de longitud completa, una nueva serie de iniciadores, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13 se sintetiza, y el ADNc descrito anteriormente se usa para preparar sólo la región variable del gen de la cadena ligera por PCR. La reacción de PCR incluye 30 ciclos a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto.

El ADNc de la región variable de la cadena ligera amplificado con los sitios de las enzimas de restricción EcoRI y BsiWI incorporados, es digerido con las enzimas respectivas. Después de purificación en gel de agarosa, el fragmento de ADNc de la región variable amplificado es ligado en los mismos sitios del vector pCIck (un vector de expresión basado en pCIneo con la inserción de una región constante ? humana en los sitios Xbal y Notl), para dar el vector de expresión de la cadena ligera pClck-GNX-8.rr . Se realiza la confirmación de la secuenciación y el nucleótido deducido, así como las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de GNX-8, se muestran como SEQ ID NOS: 16 y 17, respectivamente.

Un vector individual que expresa los genes de la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo GNX-8 recombinante, se construye con el gen de neomicina (pClck-GNX-8 neo) o el gen de DHFR (pClck-GNX-8 DHFR) como un marcador de selección. El vector de la cadena ligera pCIck-GNX-8.m es linealizado con Bglll, seguido de desfosforilación del extremo 5' con fosfatasa de intestino de ternera (CIP). El vector de la cadena pesada pCI-GNX-8.H3 es digerido con Bglll y NgoMIV. El fragmento BglIl-NgoMIV que contiene al promotor del CMV, ADNc de la cadena pesada de longitud completa y poliA del SV40, se recupera por extracción en gel y se introduce en el vector de la cadena ligera linealizado por ligación de los extremos rasurados, para formar pClck-GNX-8 neo. Después, el vector pClck-GNX-8 DHFR se genera removiendo el gen de neomicina con digestión con NgoMIV/Clal a partir de pClck-GNX-8 neo y reemplazo con el gen de DHFR. El minigen de DHFR es digerido del vector pdhfr3.2 (ATCC, No. 37166) por digestión con Hindlll/Sall, y se separa y recupera por extracción en gel. Ambos fragmentos se tratan con Klenow para dar extremos rasurados, y entonces el gen de DHFR es ligado en el fragmento pClck-GNX-8 neo digerido con NgoMIV/Clal por ligación de los extremos rasurados.

CUADRO 3 Iniciadores y secuencias Secuencia (5' a 3') SEQ ID NO: ELLGC I _ lJSRT ' "~~ " ¿.

GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG GTG CAG GCC GC GGT CAG GGC 4 GCC TG GGT GCC AGG GGC, AAG ACC 5 GAT GG COA ATT CAC CAT GGC TGT CTC C1T CC C GCT CTA GAT CAT TTA CCC GGA 7 VJ WJV " ACT CCC. AG : TC'A ATT ACA GC TGG TTT GTC CAA ACT CAT C 9 GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA 10 AGA TTT GGG GTT TTC (XA GTC A X) AC 1 1 GCG ??? TCA CCA TGG CCV GGA 12 CTT CAC GCC GTA CCT AGG ACA GTG ACC 1 TTG GTT C GDSVSSKSVA 1S GGGGAC A GTGTCTCT A G(. ? ? 19 GAGTGTTGCT TYYRS YN 20 ACA'TACTACAGGTCCAA ('.»'!' 21 GGTATAAT AR.NFDY ¦?? GCA AGAAACTTTGA.CTAC _ 23 "TGAVTT NY 24 ACTGGGGCTGTTACAACT 5 ATAAC AT ATS 26 GCTACCAGC 27 ALWY THFV 2S GCICrATGGTACAACACCC 29 ?????? SEQ ID NO: 14 Longitud: 318 Tipo: ADN (cadena pesada, región variable) GGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCT'CTCACTCACCTGTGC'CATCTCCGG GGACAGTG rCI'C I AGC;A G AGI G FI G JTÜG ACTGGAirAGGC:AG I CC CCATTGAGAGGCCTrGA(ÍT(KCTCrG(íAAGGA€A1 (:TACAGGTCCAACiT GGTATAATGAATATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAATCC AGACACATCC AAGA ACCAGTTC TCCCTGCACC TGA ACTC1 GTG AC CCCG A(:i A(:A{:: ;;Tcri rrATT \(i i if:AA(í AACTTTGA :TA iT(K r ('A GGGAACCCTGGTCACCGTCTCC SEQ ID NO: 15 Longitud: 106 Tipo: aminoácido (cadena pesada, región variable) GLV PSQTLSLTCA1SGDSVSSKSVAW W1R0SPLRGLE\VLG TYY.RS VVY NEYAVSVKSKlTfKPDrSKNQFSLIJLNSVTPEDTAVYYCAI NFDYWGOGrL VIAS SEQ ID NO: 16 Longitud: 300 Tipo: ADN (cadena ligera, región variable) CTCAC ACAGCACCTGC.TGGAAC:AGTCATA TCACTTGTCGCTCAAGrAC TGGGGCTGTTACAACTAATAACTATGCCAACTGGG'TCCAAGAAAAACCA GATCATrCAiTC ACTGGTCTAA TAGATGCT ACC AGCAACCGAGTTCCAGG ixrrT(:cT(ircAC5ATiX (:x: G('i :(:cí :¡A'rTGGA ÍAt,A GG :!r(: : :r A CCA 'CACAGGGGC'ACAGACTGAGGA'. GATGC.'AA' GTA rrCTGTGCrcr AlOGTACAACACCCA11TTG1rn*CGG(GGTGGAACCAAGGTCACT(jTC'C TA SEQ ID NO: 17 Longitud: 100 Tipo: aminoácido (cadena ligera, región variable) LTTA-PGG VILTCRSSTGAVTTNNYANA^VQEKPDH'tJFTGLIDATSNRV'PGVP V R FSGSLI G A ALT1TG AQTED O A M Y FCAL W Y HF VFGGGT V TV L Un vez que las cadenas ligera y pesada son secuenciadas, los ácidos nucleicos pueden ser recodificados para optimizar la expresión, por ejemplo, en células hospederas humanas específicas.

EJEMPLO 10 Transfectomas Células NSO se cultivan a una densidad de 1 x 106 células/ml. Las células se mantienen en fase de crecimiento exponencial, y se cambia el medio el día antes de la transfección. El día de la transfección, se lavan 40 x 106 células. Entonces, 10 g de ácido nucleico linealizado que contiene, por ejemplo, ADNc de la cadena ligera y ADNc de la cadena pesada linealizado, se añaden a la suspensión de células (el volumen de ADN total debe ser menor de 50 pl), y el cultivo se incuba en hielo por 15 minutos. La mezcla de ADN y células se transfiere a una probeta enfriada (0.4 cm), y se aplica un pulso eléctrico (750 V y 25 pF). La probeta se pone en hielo inmediatamente después del pulso eléctrico, y se mantiene en hielo por 10 a 15 minutos. Las células se colectan y se siembran. Las células se incuban en una incubadora de CO2 a 5% por 12 a 16 días o hasta que aparezcan las colonias. El sobrenadante de las colonias de células o células mantenidas en cultivo en suspensión, se ponen a prueba por ELISA y los transfectomas positivos son clonados en medio fresco. Para seleccionar adicionalmente los transfectomas positivos, se lleva a cabo ELISA de titulación o la prueba Biacore. Los transfectomas expandidos se mantienen en matraces de agitación, y el anticuerpo o derivado del mismo se colecta del sobrenadante.

EJEMPLO 11 Farmacocinética Se distribuye al azar a ratas en dos grupos (cuatro ratas/grupo). Los animales reciben 1 ó 10 mg/kg de GNX-8 como una inyección de bolo i.v. individual por medio de una vena de la cola. Se colectan muestras de sangre a O, 5, 15 y 30 minutos, y 1, 2, 4, 6, 24, 30, 72, 144, 168, 216, 240, 312, 336 y 360 horas. Se cosecha el suero y se almacena -20°C, hasta la prueba de concentración de GNX-8. La concentración de GNX-8 se determina por ELISA.

GNX-8 es marcado radiactivamente con 1311 usando el método IODO-Gen.

Se usan ratones desnudos para estudios de formación de imágenes y de biodistribución in vivo. Se inoculan subcutáneamente cinco millones de células Colo205. Cuando el tumor alcanza un tamaño de 0.5 g, se realiza el estudio de biodistribución. Para el estudio de biodistribución, se inyecta a los ratones en la vena de la cola con 10 pC¡/2.3 pg de GNX-8 marcado con 1311. Se sacrifica a cinco ratones a 6, 24, 48, 72 y 96 horas después de la inyección. Se toman muestras de sangre poco antes de que se sacrifique a los ratones. Tumores y órganos (cerebro, piel, músculo, hueso, corazón, pulmón, páncreas, ojo, glándula suprarrenal, cola, bazo, riñon, hígado, vejiga, estómago, intestino delgado e intestino grueso) se remueven de inmediato y se pesan. Se hace el conteo por separado de la presencia del anticuerpo marcado radiactivamente en el tumor, órgano y sangre, en un contador gamma (Packard). Se hace el conteo de los estándares cada vez con los tejidos y tumores. La radiactividad de los tejidos se expresa como el porcentaje de dosis inyectada por gramo de órgano (% de Dl/g).

Se realizan estudios de formación de imágenes en un sistema de formación de imágenes para animales X-SPECT con tomografía computada de emisión de fotones individuales microSPECT (Gamma Medica Inc. USA) y tomografía computada de rayos X microCT. Se inyecta i.v. a ratones desnudos que poseen tumores Colo205 con 200 mCi/5.5 mg/100 mi de GNX-8 marcado con 1311 por medio de la vena de la cola. Se adquieren imágenes a 1 , 6, 24, 48, 72 y 96 horas. Se realizan estudios de farmacocinética (PK) para GNX-8 en ratas, ratones SCID y ratones desnudos, después de una administración i.v. individual. La concentración de GNX-8 en el suero se analiza por ELISA.

Un modelo de dos compartimientos provee un buen ajuste a los datos, y genera los parámetros de PK resumidos en los cuadros 4 y 5. Se observa un incremento en Cmáx relacionado con la dosis, después de una administración i.v. individual de 1.0 y 10 mg/kg de GNX-8 en las ratas. GNX-8 es depurado del suero en una vida media terminal de 3.81 y 4.98 días a una dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente.

Los parámetros farmacocinéticos de GNX-8 después de la administración en ratones desnudos y ratones SCID con o sin ratones que poseen tumores Colo205, presentaron un T /2 que es casi de un día en ambas especies con tumores. Para los animales que no poseen tumores, los valores de T1 2 son de 58.09 horas en los ratones SCID, y de 98.31 horas en los ratones desnudos, respectivamente. A partir de los parámetros farmacocinéticos, el T1/2 es mucho más largo en los ratones que no poseen tumores, que en los ratones que poseen tumores.

CUADRO 4 Parámetros farmacocinéticos en ratas CUADRO 5 Parámetros farmacocinéticos en ratones SCID y ratones desnudos (administración i.v. de 5 mg/kg de GNX-8) Se realizan estudios de biodistribución, en ratones desnudos que poseen xenoinjertos Colo205 para evaluar la actividad de determinación del blanco de tumores ¡n vivo y la especificidad de GNX-8.

El nivel más alto de radiactividad de GNX-8 marcado con 1311 se detecta en el plasma en todos los puntos de tiempo, a saber, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. A 6 h, aproximadamente 60% de las dosis inyectadas por gramo (% de Dl/g) se detecta en el plasma. A 48, 72 y 96 horas, el % de Dl/g para el plasma fue de aproximadamente 20%. El nivel en plasma es significativamente mayor que en otros órganos, cerebro, piel, músculo, hueso, corazón, pulmón, páncreas, ojo, glándula suprarrenal, cola, bazo, riñon, hígado, vejiga, estómago, intestino delgado e intestino grueso, en donde el % de Dl/g en todos los puntos de tiempo en todos los órganos no excede 5% de Dl/g. La radiactividad disminuye con el tiempo en el plasma y en los otros órganos, salvo el tumor. La radiactividad en el plasma disminuye en aproximadamente 70% entre 6 y 96 horas.

La radiactividad del tumor es inicialmente mayor que en los órganos normales. La captación más alta del tumor se observa 48 horas después de la inyección de GNX-8 marcado con 13 1, y mantiene un estado estable mientras la radiactividad de los otros órganos disminuye. Por lo tanto, las relaciones tumor/órgano se incrementan en otros órganos. Se observa radiactividad rápidamente decreciente en plasma, corazón, pulmón, glándula suprarrenal, cola, bazo, riñon e hígado entre 6 y 24 horas. Por otra parte, las relaciones tumor/plasma se incrementan aproximadamente 4 veces de 6 a 96 horas después de la inyección. No se observa acumulación de GNX-8 marcado con 311 en el riñon.

La actividad de determinación del blanco de tumores in vivo en ratones desnudos que poseen tumores Colo205, se estudia en el análisis de formación de imágenes. Se realiza un experimento de curso cronológico para monitorear la distribución de GNX-8 marcado con 1311. El resultado indica también que la mayor parte del GNX-8 marcado con 1311 se localiza en la sangre, y la determinación del blanco de tumores es claramente visible de 24 a 72 horas después de la inyección.

Los datos in vivo indican que la mayor parte de GNX-8 es retenido en la sangre después de la inyección. No existe unión no específica significativa en varios órganos normales. Además, GNX-8 elige como objetivo al tumor Colo205 rápidamente después de la inyección i.v., y mantiene la marcación a un nivel de estado estable durante 96 horas.

EJEMPLO 12 Toxicidad Se realiza un estudio de toxicidad de dosis individual en ratones machos y hembras BALB/c AnN Crl BR (6 ratones/grupo) de 8 a 9 semanas. Se inyecta i.v. a los ratones con GNX-8 a una dosis de 150 mg/kg o con vehículo solo (PBS). El peso corporal para todos los ratones se mide en los días de estudio 1 , 8 y 16 antes del sacrificio. Se observa diariamente a los ratones para signos de morbilidad o mortalidad.

Se lleva a cabo un estudio de toxicidad de dosis repetida en ratas Sprague-Dawley Crl CD (SD) machos (6 ratas/grupo) de 8 semanas. A cada grupo se le administra vehículo (PBS) o 3, 15 ó 75 mg/kg/dosis de GNX-8 dos veces por semana por 4 semanas. Se inspecciona diariamente a todos los animales para mortalidad, y se registra individualmente cualquier hallazgo. Se pesa semanalmente a las ratas durante los períodos de pre-tratamiento y tratamiento, y se obtiene un peso corporal final en ayuno durante la noche al sacrificio terminal. Se colectan muestras de sangre en el sacrificio terminal, y se evalúan para hematología y parámetros de química clínica. La significancia de las diferencias en peso corporal y todos los parámetros puestos a prueba, se determina por prueba t de Student.

Para determinar la reactividad cruzada de GNX-8 sobre tejidos humanos normales, se usa una dosis muy alta (150 pg/ml) de GNX-8 biotinilado. Una disposición de tejidos con 72 tejidos humanos (24 tipos de órganos normales tomados de 3 individuos humanos normales) (US Biomax, FDA 801-1), se tiñe con GNX-8. Con base en los resultados de la Cmáx del estudio de farmacocinética, se usa GNX-8 a 150 pg/ml para garantizar que GNX-8 a la Cmá> no tenga reactividad cruzada seria con los tejidos humanos normales. Dicha concentración es mucho mayor que la que se usa regularmente en estudios inmunohistoquímicos.

Se observa tinción de débil a moderada de GNX-8 en varios tejidos humanos de origen epitelial, incluyendo el epitelio de la mucosa del tracto gastrointestinal, células del epitelio de los conductos lactíferos y células queratinizadas del epitelio escamoso estratificado. De acuerdo con los hallazgos previos de Finstad et al. (Clin. Cáncer Res., 3: 1433-1442, 1997), los anticuerpos introducidos en la sangre circulante muestran localización específica hacia la célula de carcinoma, y no se acumularon en las células epiteliales normales adyacentes positivas para el antígeno. Asimismo, los anticuerpos no atraviesan la membrana basal. Por lo tanto, no se considera un detrimento la tinción en las células epiteliales de los conductos en el tejido normal por GNX-8.

Se llevan a cabo otros dos estudios para examinar la reactividad cruzada de GNX-8 sobre células sanguíneas humanas normales. Todas las células sanguíneas puestas a prueba de los cuatro donadores del tipo sanguíneo (ABO), muestran respuesta negativa con GNX-8. Los resultados apoyan la observación de que GNX-8 no se une a las células sanguíneas. Por lo tanto, el GNX-8 administrado al sistema circulatorio no debe causar daño a las células sanguíneas.

Para consignar la seguridad de GNX-8 in vivo, se llevan a cabo dos estudios para determinar los efectos de toxicidad agudos y subagudos.

La toxicidad de la dosis individual de GNX-8 se pone a prueba en ratones BALB/c a una dosis de 150 mg/kg. Se observa a los ratones una vez al día, y no se encuentran muertes antes del sacrificio planeado. Todos los ratones aumentan de peso durante la duración del estudio, y no existen diferencias significativas en el aumento de peso corporal medio entre el grupo de tratamiento con GNX-8 y el grupo control.

La toxicidad de la dosis repetida de GNX-8 se realiza en ratas Sprague Dawley Crl CD. Se distribuyen 6 animales de 8 semanas en los grupos. A un grupo se le administra vehículo (PBS) dos veces por semana por cuatro semanas. Los grupos 2, 3 y 4 reciben GNX-8 en PBS a 3, 15 y 75 mg/kg/dosis, respectivamente, dos veces por semana por cuatro semanas. Se examina a todos los animales diariamente para mortalidad, y se registran todos los hallazgos. Se pesa semanalmente a las ratas durante los períodos de pre-tratamiento y tratamiento, y se obtiene un peso corporal final en ayuno durante la noche al sacrificio terminal. Se colectan muestras de sangre en el sacrificio, y se evalúan para hematología y parámetros de química clínica. La significancia de las diferencias en peso corporal y todos los demás parámetros medidos, se determinan por prueba t de Student.

No existen signos clínicos de toxicidad relacionados con el tratamiento con GNX-8. El análisis del aumento de peso corporal final no indica diferencia alguna entre los grupos de tratamiento y control. Muestras de sangre del grupo control y el grupo de alta dosis se toman antes de la eutanasia después de un período de ayuno, y se analizan para perfiles de química clínica y hematología.

No existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de alta dosis y los grupos control para cantidad de hemoglobina, hematócrito, número de RBC, volumen corpuscular medio, hemoglobina corpuscular media y concentración de hemoglobina corpuscular media. Los resultados no indican que se induce toxicidad hematológica por la administración repetida de GNX-8 a alta dosis.

Para análisis de química clínica, los valores medios para los parámetros para los grupos control y de alta dosis, se indican en el cuadro 6. Un incremento estadísticamente significativo en proteínas totales se observa en el grupo de alta dosis que podría resultar de las inyecciones repetidas de anticuerpo a alta dosis. Además, se observa también un ligero incremento en albúmina. Sin embargo, el valor está aún dentro de la escala de límites normales para las ratas. Los datos de química clínica no muestran daño notable a la función de excreción y el metabolismo después de la inyección repetida de GNX-8 a alta dosis.

Los análisis de química clínica y de hematología verifican la seguridad de la administración repetida de GNX-8 a alta dosis durante una duración de cuatro semanas.

CUADRO 6 Análisis de química clínica EJEMPLO 13 Para obtener una línea de células estable para la producción de GNX-8 a gran escala, se obtienen lineas de células NSO y CHO que expresan GNX-8 recombinante (rGNX-8). En resumen, moléculas de ADNc que codifican para las cadenas ligera y pesada de GNX-8, son clonadas a partir del hibridoma original. Los genes del anticuerpo aislados son reensamblados entonces en vectores de expresión. El peso molecular de rGNX-8 purificado de los medios acondicionados por células NSO transfectadas, se confirma por SDS-PAGE. La especificidad, actividad de unión y eficacia de rGNX-8 y el hibridoma de GNX-8 original, se comparan por HPTLC, inmunotinción, citometría de flujo y prueba de CDC.

No existen diferencias entre los anticuerpos GNX-8 recombinante y original.

Los perfiles de N-glucosilación de rGNX-8 y GNX-8 se analizan entonces por MS MALDI.

Los datos ilustran un patrón de azúcar N-enlazado altamente similar entre los dos anticuerpos. Casi todos los N-glucanos de los dos anticuerpos contienen la estructura de fucosilación central, pero no ácidos siálicos terminales.

Células de ovario de hámster chino deficientes en dihidrofolato reductasa (CHO/dhfr") (ATCC, CRL-9096) se mantienen en IMDM conteniendo FBS a 5% y complementado con hipoxantina 100 nM y timidina 16 µ?. Para preparar líneas de células para la producción de GNX-8 recombinante, el vector de expresión pClck-GNX-8 DHFR es linealizado por BamHI, y la concentración del ADN recuperado en solución se determina por absorbancia a D026o- Aproximadamente 1.2 x 106 células CHO/dhfr- son transfectadas con 10 pg de ADN linealizado y 30 µ? de reactivo de transfección Fugene6 (Roche), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, el medio de cultivo se reemplaza con suero de bovino fetal dializado a 5% conteniendo IMDM para la selección de los transfectantes. La selección se continúa por aproximadamente dos semanas, hasta que se obtengan colonias estables. Las colonias múltiples se colectan y se cultivan bajo el mismo medio selectivo en placas de 48 cavidades. Los clones de CHO individuales se seleccionan para la expresión de rGNX-8 por ELISA específica de antígenos, usando anticuerpos IgG(Fc) anti-humano marcados con HRP como el segundo anticuerpo.

Un clon de CHO que expresó altos niveles de anticuerpo, se selecciona para la amplificación subsiguiente de genes con metotrexato (MTX). La amplificación de genes en 10 n de MTX resulta en más de un incremento de 30 veces la secreción de rGNX-8. El clon CHO estable es nombrado como CHO-rGNX-8.5M10.

Las células CHO-rGNX-8.5M10 son adaptadas después a cultivo libre de suero en matraces de agitación, y alcanzan un rendimiento máximo de aproximadamente 120 pg/ml de GNX-8 durante un cultivo de 14 días. El sobrenadante de cultivo se colecta y se purifica por cromatografía de proteína A. El anticuerpo rGNX-8 purificado del sobrenadante de cultivo de CHO por cromatografía de proteína A, revela las bandas de péptidos de la cadena pesada y la cadena ligera esperadas sobre SDS-PAGE.

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de indagar, usando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención que se describen en la presente. Se pretende que dichos equivalentes sean abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. - Un anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítope que comprende una cadena tipo 1 extendida que comprende Leb, en donde dicho epítope es expresado en una célula cancerosa, en donde dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo no se une a Ley.

2. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque no se une a Lex.

3. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque no se une a Ley-Lex.

4. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque lisa aproximadamente 50% de células Colo205 en una prueba de ADCC a una relación E/T de aproximadamente 20/1 a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 5 g/ml.

5. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha célula cancerosa expresa Leb-Lea.

6. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha célula cancerosa es una célula epitelial.

7. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha célula epitelial comprende colon, recto, esófago, pulmón, próstata, mama o páncreas.

8. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es un scFv.

9. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una cadena ?.

10. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una cadena ?.

11. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende las regiones CDR obtenidas de GNX-8.

12. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

13. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la región variable de cadena pesada se codifica por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:14.

14. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende adicionalmente una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

15.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la región variable de cadena ligera se codifica por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:16.

16.- Una composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un agente farmacológicamente activo.

17. - Un articulo de fabricación que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y una porción detectable.

18. - Una composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.