TWI433684B - 抗-延長性第i型醣原神經脂質抗體、它的衍生物以及用途 - Google Patents
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Description
本發明是有關於抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體(anti-extended Type I glycosphingolipid antibodies)以及它們於哺乳動物(包括人類)中在由延長性第I型醣原神經脂質的不適當的活性或代謝所導致的;或它們的存在導致、引起或有關聯的疾病(diseases)或病症(disorders)之改善、治療或預防上的用途,例如,在一癌症[諸如大腸直腸癌(colorectal cancer)],或其他病理學(pathology)上的用途。一感興趣的抗體可以被應用於治療目的或診斷目的。因此,本發明亦揭示包含有感興趣的抗體以及它們的衍生物之預防的(prophylactic)、免疫治療的(immunotherapeutic)以及診斷的(diagnostic)組成物,以及它們在供用於在哺乳動物(包括人類)中預防或治療,或者診斷由延長性第I型醣原神經脂質在細胞[諸如某些惡性細胞(malignant cells)]之中以及之上的不適當代謝和/或表現所引起的疾病之方法上的用途。
延長性第I型醣原神經脂質(extended Type I glycosphingolipid)是一種可能與,例如,某些惡性狀態有關聯的細胞表面分子。
異常糖基化(aberrant glycosylation)已經被觀察到是許多癌症類型的一種共同特徵,Hakomori,PNAS 99:10231-10233,2002。某些碳水化合物抗原(carbohydrate antigens)被用來診斷帶有聚乳糖胺結構(polylactosamine structures)的人類癌症。聚乳糖胺通常根據單元結構(unit structure)而被分類為2個種類。一種具有Galβ1→3GlcNAc結構的聚乳糖胺被稱為一第I型鏈,而那些具有Galβ1→4GlcNAc結構者被稱為一第II型鏈。在某些人類癌症中所發現的最常見的腫瘤-關聯性抗原(tumor-associated antigenes)具有通常被唾液酸化(sialylated)和/或被岩藻糖基化(fucosylated)的乳糖系列第II型鏈結構(lacto series Type II chain structure)。第I型鏈抗原在正常細胞以及組織中是豐富的,並且偶爾是與癌症有關聯的,Stroud et al.,JBC 266:8439-8446,1991。例如,2→3經唾液酸化的Lea
抗原(2→3 sialylated Lea
antigen)(藉由N19-9抗體所定義出的CA 19-9抗原)是一種癌症-關聯性第I型鏈抗原。然而,以偵測那些第I型抗原為基礎的癌症診斷方法已經因為高度偽陽性和/或高度偽陰性的發生率(high false positive and/or high false negative incidences)而受到限制,參見,例如美國專利第6,083,929以及6,294,523號。
2種小鼠單株抗體(NCC-ST421以及IMH2)是針對延長性第I型鏈抗原而被提升。NCC-ST421對於Lea
-Lea
具有專一性。NCC-ST421抗體強烈地誘發使用人類末梢血液白血球作為效應子(effectors)來對抗各種不同的人類腫瘤細胞的抗體依賴性細胞毒性(antibody dependant cell cytotoxicity,ADCC),以及誘發利用一人類補體來源的補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity,CDC),Watanabe et al.,Cancer Res. 51:2199-2204,1991。Lea
-Lea
抗原被發現在人類結腸癌細胞株(human colon carcinoma cell line)(Colo205)中會被高度地表現。
IMH2亦針對延長性第I型鏈而被建立。根據1
H-NMR、FAB-MS以及酵素降解研究(enzymatic degradation studies),IMH2結合至Leb
-Lea
、Ley
-Lex
、Leb
以及Ley
,Stroud et al.,Eur. J. Biochem. 203:577-586,1992。IMH2顯示出在活體外強烈的淋巴細胞-活化的(lymphocyte-activated)以及補體-依賴的(complement-dependent)Colo205細胞殺滅,以及在活體內抑制Colo205生長。
IMH2與衍生自結腸(colon)、胰臟(pancreas)、肝臟(liver)以及子宮內膜(endometrium)的癌組織(carcinoma tissues)反應。然而,正常結腸對於IMH2顯示出不反應性(no reactivity)。正常肝臟以及胰臟在正常肝細胞(hepatocytes)以及蘭氏小島細胞(islets of Langerhans cells)中顯示出弱的或被高度地限制的反應性。免疫化學染色強度(immunochemical staining intensity)在子宮內膜癌中要比在正常子宮內膜中更為強烈,Ito et al.,Cancer Res. 52:3739-3745,1992。
NCC-ST421以及IMH2這兩者在接種會表現延長性第I型鏈抗原的人類腫瘤細胞之後的裸鼠(nude mice)體內展現出腫瘤生長的抑制,但是在不會表現延長性第I型鏈抗原的腫瘤細胞中沒有生長抑制發生。
因為在正常細胞上有大量的第I型結構,使用第I型抗體供作為診斷和/或治療目的至今是不可能的。
傳統癌症治療[諸如化學治療(chemotherapy)以及放射治療(radiotherapy)]在各種不同的癌症病患中已經顯示出某些優點。儘管在傳統治療中的抗腫瘤活性(antitumor activity)的優勢,然而,在癌症病患體內對於正常組織的治療-誘發的毒性(treatment-induced toxicity)會實質地降低生活的品質。為達到較佳的抗腫瘤活性的劑量增強(dose intensification)亦被限制。單株抗體能夠保證集中於腫瘤組織而非為正常組織之被標靶的細胞毒性(targeted cytotoxicity)。
單株抗體(mAbs)可以被發展成為對於被表現在腫瘤細胞上的抗原具有高度的專一性(specificity)並且可以促發所欲的抗腫瘤活性。mAbs的保證是藉由發展出會產生完全人類mAbs(fully human mAbs)的小鼠而被促進。一種諸如此類的工具是KM小鼠,美國專利第7,041,870號以及Tomizuka et al.,Nat. Genet. 16:133-143,1997。在該KM小鼠中,編碼免疫球蛋白(immunoglobulins)的小鼠基因被去活化(inactivated)並且被置換以人類抗體基因。因此,該KM小鼠會表現完全人類抗體。
數種完全人類抗體已經使用該KM小鼠而被成功地發展出來。
例如,Motoki等人發展出一種會指引TRAIL-R2的抗體依賴性寡聚合(antibody dependent oligomerization)並且起始有效的細胞凋亡信號以及不受宿主效應子功能支配的腫瘤退化(tumor regression)的人類IgG(KMTR2)(Clin. Cancer Res. 11(8):3126-3135,2005;以及參見美國專利第7,115,717號與Imakire et al.,Int. J. Cancer 108:564-570,2004)。HD8[一種對於人類白血球抗原DR(HLA-DR)具有專一性的完全人類單株抗體]在活體外發揮抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體-依賴性細胞毒性(CDC),並且延長被接種以非-何杰金淋巴瘤細胞株(non-Hodgkin lymphoma cell lines)的經免疫妥協的小鼠(immunocompromised mice)的生命期限(life span),Tawara et al.,Cancer Sci. 98(6)921-928,2007。
此外,在KM小鼠中被提升並且針對碳水化合物抗原的2種人類IgM被報導。HMMC-1專一性地辨識一新穎的O-聚醣結構(O-glycan structure)、與密拉氏管-相關的癌症(Mullerian duct-related carcinomas)陽性地反應,以及對一人類子宮內膜癌細胞株(human uterine endometrial cancer cell line)(SNG-S)展現出補體依賴性細胞毒性,Nozawa et al.,Clin Cancer Res. 10:7071-7078,2004。另一種會辨識一位於細胞膜上的糖蛋白(glycoprotein)的人類單株IgM(HMOCC-1)與卵巢癌(ovarian cancer)反應(Suzuki et al.,Gynecol. Oncol. 95:290-298,2004)。由於那2種抗體是IgMs,那些抗體在癌症治療上的應用應該藉由分子大小(molecular size)以及在生產上的限制而受到限制。
本發明提供會專一性地結合至延長性第I型醣原神經脂質(extended Type I glycosphingolipid)的新穎的人類抗體,以及它們的片段與衍生物。
本發明包括該等抗體的變異性重與輕鏈的胺基酸序列以及它們對應的核酸序列。
本發明的另一個具體例包括感興趣的抗體的互補決定區域(complementarity determining regions,CDR)序列,俾以獲得包含有一或多個CDR區域或者CDR-衍生的區域(CDR-derived regions)的結合分子[它保有親代分子(CDR’s從中被獲得)的延長性第I型醣原神經脂質-結合能力]。
本發明的另一個具體例包括包含有本發明的抗體序列的細胞株(cell lines)以及載體(vectors)。
本發明的另一個具體例是有關於該等抗體用於製備一用來治療與延長性第I型醣原神經脂質功能、代謝與表現有關聯的疾病以及病症的醫藥品或組成物的用途。
本發明的另一個具體例是有關於該等抗體在診斷與非典型的或不正常的延長性第I型醣原神經脂質生物學以及表現有關聯的障礙上的用途。
在針對延長性第I型鏈碳水化合物抗原的人類單株抗體的發展上,這些以及其他目標是被滿足的。例如,mAb GNX-8是一種衍生自一KM小鼠的人類IgG1。GNX-8對於數種人類結腸直腸癌細胞株(human colorectal cancer cell lines)展現出CDC以及ADCC活性並且在活體內抑制Colo205以及DLD-1腫瘤生長。GNX-8與原發性(primary)以及轉移性(metastatic)的結腸直腸癌、乳癌、胰臟癌以及肺癌反應,但是不與正常人類組織以及血液細胞反應。
額外的特徵以及優點在此處被描述,並且在參照下面的詳細說明後,將變得明顯。
本發明不限於被描述於本文中的特定方法學、操作程序、多肽(polypeptides)、聚核苷酸(polynucleotides)、細胞株、載體或試劑,因為在無背離本發明的精神以及範疇下變化可以發生或可以被使用。再者,本文中所使用的術語僅供例示特定的具體例並且不意欲限制本發明的範疇。除非另外有所定義,本文中所使用的所有技術性與科學術語以及任一縮寫字具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。那些被描述於本文中者相似或等效的任一方法和材料可以被用於實施本發明,並且本文中所描述的僅是示範性的方法、裝置以及材料。
為了描述以及揭示被報導於本文中的可以被用於本發明的蛋白質、酵素、載體、宿主細胞以及方法學的目的,本文中所提及的全部專利案以及公開案藉此以其整體被併入本案以作為參考資料。然而,在此不應被解釋為本發明不被給予先於該等因為先前發明的揭露內容的權利的許可。
一“延長性第I型醣原神經脂質疾病(extended Type I glycosphingolipid disease)”是一種特徵在於與延長性第I型醣原神經脂質,例如,在細胞表面上的不正常代謝、過量表現或被增加的位準有關聯或引起的病(malady)、病症(disorder)、疾病(disease)、病理學(pathology)、病況(condition)、異常(abnormality)等等。
片語“實質上相同的(substantially identical)”是有關於一抗體多肽序列可以被解釋為一相對於一參考多肽序列展現出至少70%、80%、90%、95%或更多的序列相同性(sequence identity)的抗體鏈。該術語是有關於一核酸序列可以被解釋為一相對於一參考核酸序列展現出至少大約85%、90%、95%、97%或更多序列相同性的核苷酸序列。
術語,“相同性(identity)”或“同源性(homology)”可以意指在排列序列以及導入間隔(introducing gaps)之後,在候選序列(與一相對於被比較的候選物的對應序列的殘基是相同的)中的核苷酸鹼基或胺基酸殘基的百分比,若有必要,要達至整體序列的最大百分比相同性(maximum percent identity),並且不考慮任何有如部分的序列相同性的守恆性取代(conservative substitutions)。N-端或C-端的延長(extensions)或插入(insertions)都不應被解釋為降低相同性或同源性。用來排列序列的方法以及電腦程式是可獲得的並且是在此技藝中所熟知的。序列相同性可以使用序列分析軟體而被測量。
片語以及術語,一抗體、核酸或抗原的“功能性片段(functional fragment)、變異體(variant)、衍生物(derivative)或類似物(analog)”與類似之物,以及它們的形成是一具有與一感興趣的全長抗體或抗原相同的定性生物活性(qualitative biological activity)化合物或分子。例如,一抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體的一功能性片段或類似物是一可以結合至一延長性第I型醣原神經脂質分子之一者,或是一可以結合至延長性第I型醣原神經脂質的一促效性(agonistic)或拮抗性(antagonistic)的抗體。一個實例是一scFv分子。關於延長性第I型醣原神經脂質,一個它的變異體或衍生物是一種與天然存在的延長性第I型醣原神經脂質不同的分子並且仍然可以被用於本發明的一個目的,諸如,雖然與一野生型延長性第I型醣原神經脂質不相同還是可以被使用,例如,作為一免疫原(immunogen)來建立會選擇性地結合至野生型延長性第I型醣原神經脂質的抗體。
“取代性(substitutional)”變異體是那些在一天然序列中至少一胺基酸殘基已經被移除並且在相同位置被置換以一不同的被適當插入的胺基酸者。取代可以是單一的,其中僅一個在分子中的胺基酸被取代,或者可以是多重的,其中在相同的分子中二或多個胺基酸被取代。複數的取代可以是在相鄰位址。此外,一個胺基酸可以被置換以複數個殘基,在此情況下該一變異體包含有一個取代以及一個插入這兩者。
“插入性(insertional)”變異體是那些具有一或多個胺基酸是直接地鄰接於一個在一天然序列中的一特定位置的胺基酸而被插入者。直接地鄰接於一個胺基酸意指被連接至該胺基酸的α-羧基或α-胺基官能基基團。
“刪除性(deletional)”變異體是那些具有在一天然胺基酸序列中的一或多個胺基酸被移除者。通常,在一分子的特定區域中刪除性變異體將有一或二個胺基酸被刪除。
術語,取代、插入以及刪除變異體亦可類似地應用於核酸。
適應性免疫反應(adaptive immune response)具有2種主要的部分:T淋巴細胞的細胞性免疫反應(cellular immune response)以及抗體分泌B淋巴細胞(antibody secreting B lymphocytes)的體液性免疫反應(humoral immune response)。B細胞抗原決定位(B cell epitopes)可以是線性、連續的胺基酸,或可以是構形的(Protein Science(2005)14,246)。相對地,T細胞抗原決定位是切斷來自存在於主要組織相容性複合體(MHC)蛋白質[major histocompatibility complex(MHC)proteins]{或者,在人類的例子中,人類白血球抗原(HLA)第I型或第II型分子[human leukocyte antigen(HLA)class I or class II molecules]}的情況下的抗原性蛋白質(antigenic proteins)的短的線性胜肽(short linear peptides)。抗原決定位表達(Epitope presentation)端視MHC-胜肽結合與T細胞受體(TCR)交互作用[T cell receptor(TCR)interactions]這兩者而定。MHC蛋白質是高度地多型性的(polymorphic)並且各自結合至一組限定的胜肽。因此,在一感染的期間,存在於一宿主的特定的MHC對偶基因(MHC alleles)的組合限制所辨識的潛在抗原決定位的範圍。
2種基本類型的T細胞是藉由CD8以及CD4蛋白質(它們支配一T細胞將分別辨識不論是以第I型或第II型分子而表達的抗原決定位)的表現而被區分。在藉由抗原表達細胞(antigen presenting cells)以膜結合囊(membrane bound vesicles)的方式的囊封(encapsulation)之後,CD4+
T抗原決定位被加工,其中抗原是藉由蛋白酶(proteases)而被降解為會結合至MHC第II型蛋白質的胜肽片段。相對地,CD8+
T細胞通常辨識由一細胞內所表現的病毒或自身的抗原、藉由免疫蛋白酶體(immunoproteasome)而在細胞質中被切斷為短胜肽的蛋白質。在切割之後,胜肽是藉由與抗原加工處理(antigen processing,TAP)有關聯的輸送體(transporter)而被移位至內質網(endoplasmic reticulum)中供裝載至HLA I抗原上。CD4+
T[輔助(helper)]細胞抗原決定位在針對一蛋白質抗原驅動T-細胞依賴的免疫反應上是緊要的。
在最廣義下,術語“抗體”被使用,並且包括單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體(polyclonal antibodies)、多重專一性抗體(multispecific antibodies)[例如,雙專一性抗體(bispecific antibodies)]、抗體片段或帶有一或多個的的CDR或CDR-衍生的序列的合成多肽(只要該多肽展現出所欲的生物活性)。抗體(Abs)以及免疫球蛋白(Igs)是具有相同結構特徵的糖蛋白。一般而言,抗體被認為是具有一被定義的或被辨識的專一性的Igs。因此,雖然抗體針對一專一性標的展現出結合專一性,免疫球蛋白包括抗體以及其他缺乏標的專一性的似-抗體分子這兩者。
本發明的抗體可以是任何型式(class)(例如,IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等等)或亞型(subclass)(例如,IgG1
、IgG2
、IgG2a
、IgG3
、IgG4
、IgA1
、IgA2
等等)之一者[“型式(type)”與“型式(class)”,以及“亞型(subtype)”與“亞型(subclass)”在此可以被交換地使用]。天然的或野生型(亦即,從一族群的一非-經人工地操作的成員中而被獲得的)抗體以及免疫球蛋白,以及聚合抗體(polymeric antibodies)的單體(monomers)(諸如IgA以及IgM)通常是大約150,000道耳頓(daltons)的異四聚體糖蛋白(heterotetrameric glycoproteins),其包含有2個相同的輕(L)鏈以及2個相同的重(H)鏈。各個重鏈在一端具有一變異領域(variable domain,VH
),繼而是若干恆定領域(constant domains)。各個輕鏈在一端具有一變異領域(VL
)以及在另一端具有一恆定領域。
就“非-經人工地操作的(non-artificially manipulated)”而言是意指不是藉由天然方式[諸如免疫作用(immunization)或轉形(transformation)]來控制或來表現一外來抗原結合分子。與藉由一種操作的形式[諸如突變發生(mutagenesis)、使用重組方法(recombinant methods)等等]來改變該抗原-結合分子的一胺基酸而被獲得的相比較,野生型可意指為在一族群中最普遍的對偶基因或物種或從一非-經人工地操作的動物體內所獲得的抗體,以及天然存在的對偶基因或天然地建立並且在一族群中可以被持續的多型性,或者一經由天然方式建立的變異體或衍生物[諸如一惡性組織(malignancy)]。術語的使用是藉由熟習此技藝者於該術語在句子、段落、概念、思想、構想等等中被發現、被使用的情況下而被容易地推知以及瞭解。
如此處所用的,“抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體”意指一會專一性地結合至人類延長性第I型醣原神經脂質的抗體或衍生性多肽。
在抗體的一變異領域的情況下,術語“可變異的(variable)”意指一在抗體之間以及之中的序列上廣泛地不同,並且在專一性辨識以及結合一特定抗體至一特定標的上可以是必需的相關分子的某些部分。然而,變異性(variability)不是被平均地分布遍及抗體的變異領域。
在輕鏈以及重鏈變異領域這兩者中,變異性可以被集中在3個被稱為互補決定區域(CDRs;亦即,CDR1、CDR2以及CDR3)[亦被知曉為高變異區域(hypervariable regions)]的節段。變異領域的更高度守恆的部分被稱為框架(framework,FR)區域或序列。天然的重與輕鏈的變異領域各自包含有4個大量地採用一β板構形(β sheet configuration)、藉由3個形成環連接並且在某些例子中形成部分的β板結構的CDRs而被連接的FR區域。在各個鏈中的CDRs可以藉由FR區域而與來自其它鏈的CDRs而被維持在一起(通常在鄰近處),有助於抗體的標的[抗原決定位(epitope)或決定位(determinant)]結合位址的形成(參見Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institute of Health,Bethesda,MD(1987))。重鏈的一個CDR(諸如,CDR3)可以單獨地帶有會專一性地結合至同源抗原決定位的能力。
如此處所用的,免疫球蛋白胺基酸殘基的計數,除非另有指明,是依據Kabat等人的免疫球蛋白胺基酸殘基計數系統而被完成。
術語“抗體片段”意指一抗體的一完整的或一全長的鏈的一部分,通常是標的結合或變異區域。抗體片段的實例包括,但不限於:Fab
、Fab'
、F(ab')2
以及Fv
片段。一“功能性片段”或“抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體的類似物”是一可以結合一同源抗原者。如此處所用的,功能性片段通常與“抗體片段”是同義的,並且有關於抗體可以意指可以結合一同源抗原的片段(諸如Fv
、Fab
、F(ab')2
等等)。
一“Fv
”片段由一呈一非-共價結合(non-covalent association)的一重與一輕鏈變異領域的二聚物(dimer)(VH
-VL
二聚物)所構成。那各個變異領域的3個CDR’s的構形交互作用以定義出一有如在一完整抗體的VH
-VL
二聚物的標的結合位址。共同地,該等6種CDRs授與針對完整抗體的標的結合專一性(target binding specificity)。然而,甚至一單變異領域(或一包含有僅3種對一標的具有專一性的CDRs的Fv
的一半)可以具有辨識以及結合標的的能力。
“單-鏈Fv
”、“scFv
”或“scAb”抗體片段包含有一抗體的VH
以及VL
領域,其中該等領域存在於一單多肽鏈中。一般而言,該Fv
多肽進一步包含有一在VH
以及VL
領域之間能夠讓scFv來形成所欲的結構供標的結合的多肽連接子(polypeptide linker)(通常是一可撓性分子,諸如,一寡肽),該多肽連接子可以被獲得自一天然存在的分子、衍生自一天然存在的分子、是一人工序列[諸如聚甘胺酸(polyglycine)]等等。某些分子可以包括一或多個恆定領域或它們的一部分。
術語“雙鏈抗體(diabodies)”意指具有2個抗原結合位址的抗體片段建構物,其片段可以包含有一以相同的多肽鏈而被連接至一輕鏈變異領域(VL
)的重鏈變異領域(VH
)。藉由使用一太短而致使在相同鏈中的2個變異領域之間無法容許配對的連接子,該雙鏈抗體領域被迫使要與另一鏈的結合領域配對以產生一抗原結合位址。
Fab
片段含有輕鏈的變異與恆定領域以及重鏈的變異與第一恆定(CH1
)領域。Fab'
片段藉由在該CH1
領域的羧基端添加有一些殘基以達到包括一或多個來自抗體樞鈕區域(hinge region)的半胱胺酸(cysteines)而不同於Fab
片段。Fab'
片段可以藉由在F(ab')2
胃蛋白酶分解產物的樞鈕半胱胺酸上的二硫鍵(disulfide bond)的切割而被產生。額外的抗體的酵素以及化學的處理可以產生其他感興趣的功能性片段。
如此處所用的,術語“單株抗體”(mAb或MAb)意指一種得自於一實質上同質性抗體之族群中的抗體,亦即,除了可能天然發生的突變(可能呈較少的數量而存在)之外,構成該族群的個別抗體是相同的。
特別地,單株抗體在此包括“嵌合(chimeric)”抗體,其中重和/或輕鏈的一部分與在衍生自一特定物種或屬於一特定抗體型式(class)或亞型(subclass)[型式(type)或亞型(subtype)]的抗體中的對應序列是相同或同源的(homologous),而該鏈(等)的其餘部分與在衍生自其他物種或屬於另一抗體型式或亞型的抗體以及該等抗體的片段中的對應序列是相同或同源的,只要嵌合抗體展現出所欲的結合至延長性第I型醣原神經脂質或者影響延長性第I型醣原神經脂質活性或代謝的生物活性(美國專利第4,816,567號;以及Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci USA 81:6851(1984))。因此,來自一型式的抗體的CDR’s可以被移植至一不同型式或亞型的抗體的FR之中。
直接針對一單一標的位址、抗原決定位(epitope)或決定位(determinant)的單株抗體是專一性的。此外,相對於傳統的(多株)抗體製備物[它們典型地包括被導向接針對一抗原的不同的決定位(抗原決定位)的不同抗體],各個單株抗體被導向針對一在標的上的單一決定位。除了它們的專一性之外,單株抗體有益的是在於:藉由一宿主細胞而被合成、藉由其他免疫球蛋白而不受污染,以及提供用來選殖編碼它們的抗體鏈的相關基因與mRNA。修飾語“單株”表示抗體的特徵有如是得自於一實質上同質性的抗體群組,以及不被解釋為需要藉由任何特定方法生產抗體。例如,供用於本發明的單株抗體可以使用熟知的技術而從噬菌體抗體存庫中被分離出來或者可以從一多株抗體製備物中被純化出來。依據本發明而被使用的親代單株抗體可以藉由Kohler et al.,Nature 256:495(1975)所描述的融合瘤方法而被製造,或者可以藉由在此技藝中所熟知的重組方法而被製造。
非-人類[例如,鼠(murine)]抗體[當相較於一人類抗體時,它們含有衍生自非-人類免疫球蛋白的序列]的“人類化(humanized)”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或它們的片段(諸如Fv
、Fab
、Fab’
、F(ab’)2
或其他的抗體的標的-結合次序列)。一般而言,人類化抗體實質上將包含有1個(以及典型地2個)變異領域的全部,其中全部或實質上全部的CDR區域對應於那些一非-人類免疫球蛋白所具者以及全部或實質上全部的FR區域是那些一人類免疫球蛋白模版序列所具者。
人類化抗體亦可以包含有至少一免疫球蛋白恆定區域(Fc
)的一部分,典型地那些被選定的人類免疫球蛋白模版所具者。一般而言,目的是要具有一在一人類體內是最小免疫原性(immunogenic)的特定專一性的抗體。因此,在一或多個CDR’s中的一或多個胺基酸亦可以被改變為針對一人類宿主是較小免疫原性之一者,而實質上沒有將一或多個針對延長性第I型醣原神經脂質的CDR’s的專一性結合功能減到最小。
另擇地,FR可以是非-人類的,但那些最大免疫原性的胺基酸被置換以較小免疫原性者。然而,如上面所討論的,CDR移植不是獲得一人類化抗體的僅有方式。例如,當就框架殘基而言具有一在決定CDR環的全部三-維結構以及抗體針對配位子(ligand)的全部親和力(affinity)上的角色不是罕見的時,僅修飾CDR區域可能不足以最佳化一抗體。
因此,任一方法可以被實行俾以降低抗體免疫原性(antibody immunogenicity),藉此非-人類親代抗體分子被修飾為一對於一人類是較小免疫原性者,與一人類抗體的總體序列相同性未必是一必要。因此,人類化(humanization)亦可以,例如,藉由僅一些殘基(特別地是那些被曝露在抗體分子表面以及不被包埋在該分子中者)的純粹的取代,並且因此,不會容易地受到宿主免疫系統的影響。在此所教示的該一方法是有關於取代(例如,在抗體分子上的帶電的或某些其他殘基),目的是要降低或減少所形成的分子的免疫原性,而不會妥協抗體對於同源抗體決定位或決定位具有的專一性。參見,例如,Studnicka et al.,Prot Eng 7(6)805-814,1994;Mol Imm 44:1986-1988,2007;Sims et al.,J Immunol 151:2296(1993);Chothia et al.,J Mol Biol 196:901(1987);Carter et al.,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285(1992);Presta et al.,J Immunol 151:2623(1993);WO 2006/042333以及美國專利第5,869,619號。
關於重新表面化抗體(resurfacing antibodies)的策略以及方法,以及在一不同的宿主體內降低抗體的免疫原性的方法被揭示在,例如,美國專利第5,639,641號中。簡言之,在一較佳的方法中,(1)一庫的抗體重與輕鏈變異區域的位置排列被產生俾以產生重與輕鏈變異區域框架表面被曝露的位置,其中關於全部的變異區域的排列位置是至少大約98%相同的;(2)一組的重與輕鏈變異區域框架表面被曝露的胺基酸殘基被定義為一非-人類的,諸如,一齧齒動物抗體(rodent antibody)(或它的片段);(3)一組與齧齒動物表面被曝露的胺基酸殘基的組最接近地相同的重與輕鏈變異區域表面被曝露的胺基酸殘基被鑑定出;以及(4)除了那些落在,例如,齧齒動物抗體的一CDR的任一殘基的任一原子的大約5之內者,該在步驟(2)中所定義的重與輕鏈變異區域框架表面被曝露的胺基酸殘基的組被取代以該在步驟(3)中所鑑定出的重與輕鏈變異區域框架表面被曝露的胺基酸殘基的組,俾以產生一人類化的,諸如,一保有結合專一性的齧齒動物抗體。
抗體可以藉由各種不同的其他技術而被人類化,包括:CDR移植(EPO 0 239 400;WO 91/09967;以及美國專利第5,530,101號與第5,585,089號)、鑲飾(veneering)或重新表面化(resurfacing)(EPO 0 592 106;EPO 0 519 596;Padlan,1991,Molec Imm 28(4/5):489-498;Studnicka et al.,1994,Prot Eng 7(6):805-814;以及Roguska et al.,1994,PNAS 91:969-973)以及鏈洗牌(chain shuffling)(美國專利第5,565,332號)。人類抗體可以藉由在此技藝中已知的各種不同的方法而被製造,包括,但不限於:噬菌體呈現方法(phage display methods)(參見美國專利第4,444,887號、第4,716,111號、第5,545,806號與第5,814,318號;以及WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735與WO 91/10741)、使用基因轉殖動物[諸如齧齒動物(Amgen、Kirin與Merdarex小鼠)]、使用嵌合細胞等等。
“抗體同源物(antibody homolog)”或“同源物”意指任一會專一性地結合如在此所教示的延長性第I型醣原神經脂質的分子。因此,一抗體同源物包括天然或重組的抗體(無論是否經修飾)、保有感興趣的生物性質(biological properties)(諸如結合延長性第I型醣原神經脂質)的抗體的部分(諸如一Fab
或Fv
分子)、一單鏈抗體、一攜帶一或多個CDR區域的多肽等等。同源物的胺基酸序列不需要與天然存在的抗體所具者相同而可以被改變或被修飾以攜帶被取代的胺基酸、被插入的胺基酸、被刪除的胺基酸、除了20個通常在蛋白質中所發現者以外的胺基酸等等,俾以獲得一具有被增進的或其他的有益性質的多肽。
具有同源性序列(homologous sequences)的抗體是那些具有與本發明的一延長性第I型醣原神經脂質抗體的胺基酸序列具有序列同源性(sequence homology)的胺基酸序列的抗體。較佳地,同源性是就本發明的一抗體的變異區域的胺基酸序列而言。在此作為被適用於一胺基酸序列的“序列同源性”當藉由,例如,依據Pearson&Lipman,Proc Natl Acad Sci USA 85,2444-2448(1988)的FASTA搜尋方法而被決定時被定義為一相對於另一胺基酸序列具有至少大約90%、91%、92%、93%、94%或更多序列同源性,以及更佳地至少大約95%、96%、97%、98%或99%序列同源性的序列。
如以上所教示的,一嵌合抗體是一具有一衍生自不同來源(諸如不同抗體、不同型的抗體、不同動物物種)的抗體的不同部分者,例如,一具有一衍生自一被與一人類免疫球蛋白恆定區域配對的鼠單株抗體的變異區域的抗體等等。因此,一人類化抗體是一種嵌合蛋白的物種。用於生產嵌合抗體的方法在此技藝中是已知的,參見,例如,Morrison,1985,Science 229:1202;Oi et al.,1986,BioTechniques 4:214;Gillies et al.,1989,J Immunol Methods 125:191-202;以及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號與第4,816,397號。
人工抗體(artificial antibodies)包括:scFv
片段、嵌合抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體(triabodies)、四鏈抗體(tetrabodies)以及mru(參見Winter & Milstein,1991,Nature 349:293-299;以及Hudson,1999,Curr Opin Imm 11:548-557的回顧),各自具有抗原-結合或抗原決定位-結合的能力。在單鏈Fv
片段(scFv
)中,一抗體的VH
以及VL
領域是藉由一可撓性胜肽而被連接。典型地,連接子是一為大約15個胺基酸的胜肽。若連接子是極為較小的(例如,5個胺基酸),雙鏈抗體被形成,該等雙鏈抗體是二價scFv
二聚體。若
亦被包括在本發明的範圍之內的是一感興趣的抗體的功能性等效物(functional equivalents)。術語“功能性等效物”包括具有同源性序列的抗體、抗體同源物、嵌合抗體、抗體變異體、抗體衍生物、人工抗體以及經修飾的抗體,例如,其中各個功能性等效物是藉由結合至延長性第I型醣原神經脂質的能力而被定義。熟習此技藝者將瞭解:在被稱為“抗體片段”的分子的群組以及被稱為“功能性等效物”的群組中有一重疊。生產保有延長性第I型醣原神經脂質結合能力的功能性等效物的方法對於熟習此技藝者是已知並且被揭示在,例如,WO 93/21319、EPO第239,400號、WO 89/09622、EPO第338,745號以及EPO第332,424號。
本申請案的功能性等效物亦包括經修飾的抗體,例如,藉由任一形式的分子共價接附至抗體而被修飾的抗體。例如,經修飾的抗體包括藉由,例如,糖基化(glycosylation)、乙醯基化(acetylation)、聚乙二醇化(pegylation)、去醯胺化(deamidation)、磷酸化(phosphorylation)、醯胺化(amidation)、藉由已知的保護/阻斷的基團的衍生化(derivatization)、蛋白質水解切割(proteolytic cleavage)、針對一細胞配位子的連結(linkage)、針對一毒素(toxin)或細胞毒性部分(cytotoxic moiety)或其他蛋白質的連結等等而被修飾的抗體。共價接附(covalent attachment)不會產生一對於產生一抗-遺傳性型反應(anti-idiotypic response)有免疫力的抗體。修飾可以藉由已知的技術而被達成,包括,但不限於:專一性化學切割、乙醯基化、甲醯基化(formylation)、代謝合成(metabolic synthesis)、化學綴合(chemical conjugation)等等。此外,經修飾的抗體可以含有一或多個非-典型的胺基酸。
對於具有本技藝中的通常技術者而言許多技術是可獲得的,該等技術容許結合親和力的最佳化。典型地,該等技術涉及在感興趣的位址上的各種不同的胺基酸殘基的取代,繼而一針對同源抗原或抗原決定位的突變多肽的結合親和力的篩選分析。
一旦抗體被鑑定出以及被分離出,常常對於產生一變異體抗體或突變體(mutant),或者突變形成的蛋白質(mutein),其中,例如,在抗體的一或多個高變異區域(hypervariable regions)中的一或多個胺基酸殘基被改變。另擇地,或此外,框架殘基的一或多個改變(例如,取代)可以被導入至抗體中,其中這些導致一在針對延長性第I型醣原神經脂質的抗體突變體的結合親和力上的改善。
可以被修飾的框架區域的實例包括:那些直接非-共價地結合抗原者(Amit et al.,Science 233:747-753(1986));交互作用/影響一CDR的構形(Chothia et al.,J. Mol. Biol. 196:901-917(1987));和/或加入VL
-VH
界面(interface)(EP 239 400)。在某些具體例中,一或多個該等框架區域殘基的修飾導致一針對同源抗原的抗體的結合親和力的增進(enhancement)。例如,在本發明的特定具體例中,從大約1至大約5個框架殘基可以被改變。有時,可能足以產生一適合供用於臨床前試驗(preclinical trials)的抗體突變體,甚至其中沒有高變異區域殘基已經被改變。通常,然而,該抗體突變體可以包含有一或多個高變異區域改變(等)。恆定區域亦可以被改變俾以獲得所欲的或更為所欲的效應子性質。
經改變的高變異區域殘基可以被隨機地改變,特別地其中親代抗體的起始結合親和力是使得被隨機地產生的抗體突變體可以一在此所教示的分析而針對經改變的結合被容易地篩選。
一個關於獲得抗體突變體(諸如,CDR突變體)的方法是“丙胺酸掃描突變發生(alanine scanning mutagenesis)”(Cunningham & Wells,Science 244:1081-1085(1989);以及Cunningham & Wells,Proc Nat. Acad Sci USA 84:6434-6437(1991))。一或多個高變異區域殘基(等)被置換以丙胺酸或聚丙胺酸殘基(等)。那些對於取代顯示出功能性靈敏度的高變異區域殘基(等)接而藉由在或針對取代的位址進一步導入或其他突變而被精進。因此,雖然用來導入一胺基酸序列變異的位址被預先決定,突變本身的本質不需要被預先決定。類似的取代可以其他胺基酸而被嘗試,端視所欲的被掃描的殘基的性質而定。
一用於鑑定出要修飾的胺基酸殘基的更為系統性的方法包含有鑑定出涉及於結合延長性第I型醣原神經脂質的高變異區域殘基以及那些具有少或沒有涉及於延長性第I型醣原神經脂質結合的高變異區域殘基。就各個被測試用來增進對於延長性第I型醣原神經脂質的結合的ala突變體而言,一非-結合性高變異區域殘基的丙胺酸掃描被執行。在另一個具體例中,那些明顯地涉及於結合延長性第I型醣原神經脂質的殘基(等)被選擇出來被修飾。修飾可以涉及刪除一殘基或鄰接於一感興趣的殘基而插入一或多個殘基。然而,通常修飾涉及以另一個胺基酸取代殘基。一守恆性取代(conservative substitution)可以是一第一取代。若該一取代導致一在生物活性上的改變(例如,結合親和力),接著另一個守恆性取代可以被製造以決定是否更多實質上的改變被獲得。
甚至更多實質上在一抗體範圍以及生物性質的表達上的修飾可以藉由選擇一在性質上更實質地不同於那通常位於一位址上者的胺基酸而被獲得。因此,該一取代可以被製造,當維持:(a)在取代的區域中的多肽主鏈的結構,例如,有如一板或螺旋的構形;(b)在標的位址的分子的電荷(charge)或疏水性(hydrophobicity);或(c)側鏈的體積(bulk)。
例如,天然存在的胺基酸可以根據共同的側鏈性質而被區分為群組:
(1)疏水性:甲硫胺酸(methionine)(M或met)、丙胺酸(alanine)(A或ala)、纈胺酸(valine)(V或val)、白胺酸(leucine)(L或leu)以及異白胺酸(isoleucine)(I或ile);
(2)中性、親水性:半胱胺酸(cysteine)(C或cys)、絲胺酸(serine)(S或ser)、蘇胺酸(threonine)(T或thr)、天冬醯胺酸(asparagines)(N或asn)以及麩醯胺酸(glutamine)(Q或gln);
(3)酸性:天冬胺酸(aspartic acid)(D或asp)以及麩胺酸(glutamic acid)(E或glu);
(4)鹼性:組胺酸(histidine)(H或his)、離胺酸(lysine)(K或lys)以及精胺酸(arginine)(R或arg);
(5)會影響鏈配向(chain orientation)的殘基:甘胺酸(glycine)(G或gly)以及脯胺酸(praline)(P或pro);以及
(6)芳族:色胺酸(tryptophan)(W或trp)、酪胺酸(tyrosine)(Y或tyr)以及苯丙胺酸(phenylalanine)(F或phe)。
非-守恆性取代可以限定為以一來自另一群組的胺基酸交換一胺基酸。守恆性取代可以限定為以在一群組中的另一個胺基酸置換一胺基酸。
較佳的胺基酸取代可以包括那些,例如:(1)降低對於蛋白質水解的易感性(susceptibility);(2)降低對於氧化的易感性;(3)改變結合親合力;以及(4)授與或修飾其他物理-化學的或功能性的性質的該等類似物。
類似物可以包括一除了天然存在的胜肽序列之外的各種不同的突變形成的蛋白質的序列。例如,單一或多重胺基酸取代(較佳地守恆性胺基酸取代)可以在天然-存在的序列[較佳地在形成分子內接觸的領域(等)以外的多肽的部分]中被作出。一守恆性胺基酸取代實質上不會改變親代序列的結構特徵[例如,一置換胺基酸不應該傾向於破壞一存在於親代序列中的螺旋,或瓦解其他形式的以親代序列為特徵的二級結構],除非一在R基團或側鏈的體積或構形上的改變,Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,ed.,W. H. Freeman and Company,New York (1984));Introduction to Protein Structure(Branden & Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N. Y.(1991));以及Thornton et al. Nature 354:105(1991)。
通常,具有經改善的生物性質的抗體突變體將具有一與親代抗-人類延長性第I型醣原神經脂質抗體具有至少75%的胺基酸序列相同性或相似性(similarity)、至少80%、至少85%、至少90%以及常常至少95%相同性的胺基酸序列。有關於親代抗體序列的相同性或相似性在此被定義為在是與親代抗體殘基相同(亦即,相同的殘基)或相似(亦即,來自根據共同側-鏈性質的相同群組的胺基酸殘基,如上述)的候選序列中的胺基酸殘基的百分比,在排列序列以及導入間隔之後,若有必要,要達至最大百分比序列相同性。
另擇地,抗體突變體可以藉由系統性突變抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體的重與輕鏈的FR以及CDR區域,或Fc
區域而被產生。
另一個用於產生抗體突變體的操作程序涉及使用噬菌體呈現法(phage display)的親和力成熟(affinity maturation)(Hawkins et al.,J Mol Biol 254:889-896(1992)以及Lowman et al.,Biochemistry 30(45):10832-10838(1991))。噬菌體外殼-蛋白質融合(bacteriophage coat-protein fusions)(Smith,Science 228:1315(1985);Scott & Smith,Science 249:386(1990);Cwirla et al.,Proc Natl Acad Sci USA 8:309(1990);Devlin et al. Science 249:404(1990);Wells & Lowman,Curr Opin Struct Biol 2:597(1992);以及美國專利第5,223,409號)被知曉為對於將被呈現的蛋白質或胜肽的表現型連接至編碼它們的噬菌體顆粒的基因型是有用的。抗體的Fab
領域亦可以藉由噬菌體而被呈現(McCafferty et al.,Nature 348:552(1990);Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7978(1991);以及Garrard et al.Biotechnol 9:1373(1991))。
單價噬菌體呈現法由當融合一在噬菌體顆粒上的噬菌體外殼蛋白質時呈現一組的蛋白質變異體所構成(Bass et al.,Proteins 8:309(1990))。親和力成熟(affinity maturation),或各種不同的蛋白質的平衡結合親和力的改善,先前已經由連續施用突變發生、單價噬菌體呈現法與功能性分析(Lowman & Wells,J Mol Biol 234:564 578(1993);以及美國專利第5,534,617號),以及使用那關於抗體的Fab
領域的方法(Barbas et al.,Proc Natl Acad Sci USA 91:3809(1994);以及Yang et al.,J Mol Biol 254:392(1995))而被達到。
許多(例如,106
或更多)蛋白質變異體(在序列中的被定義的位置上的不同)的存庫可以藉由噬菌體顆粒而被建構,該等蛋白質變異體的每一者含有編碼特定蛋白質變異體的DNA。因此,數個高變異區域位址(例如,6至7個位址)被突變以在各個位址上產生全部可能的胺基酸取代。在循環的親和力純化之後,使用一被固定的抗原,個別的噬菌體選殖株被分離出,以及被呈現的蛋白質的胺基酸序列是由DNA被推論出。
在生產抗體突變體之後,那分子相對於親代抗體的生物活性有如在此所教示的可以被決定。如上面所注意到的,那可能涉及決定抗體的結合親和力和/或其他生物活性或物理性質。在本發明的一個較佳具體例中,一組的抗體突變體被製備並且針對對於抗原的結合親和力而被篩選。一或多個被選自於篩選的抗體突變體被選擇性地進行一或多個進一步的生物活性分析以確認該抗體突變體(等)具有新的或被改善的性質。在較佳的具體例中,該抗體突變體保有會結合延長性第I型醣原神經脂質的能力而具有一類似於或較佳/較高於親代抗體所具者的結合親和力。
另擇地,多價噬菌體(McCafferty et al.(1990)Nature 348:552-554;以及Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628)亦可以被用來表現隨機點突變(random point mutations)[例如,藉由使用一易出錯DNA聚合酶(error-prone DNA polymerase)]以產生一噬菌體抗體片段的存庫,該存庫接而可以針對對於延長性第I型醣原神經脂質的親和力而被篩選,Hawkins et al.,(1992)J Mol Biol 254:889-896。
較佳地,在親和力成熟過程的期間,可複製的表現載體(the replicable expression vector)是在一轉錄調節性要素(transcription regulatory element)的嚴密控制下,以及培養條件被調整,因此呈現超過1個複本(copy)的融合蛋白質的顆粒的數量或數目是少於大約1%。亦較佳地,呈現超過1個複本的融合蛋白質的顆粒的數量是少於呈現一單一複本的融合蛋白質的顆粒的數量的大約10%。較佳地該數量是少於大約20%。
在此所使用的另一個等義片語是一抗原結合部分(antigen binding portion),該抗原結合部分是有關於一感興趣的抗體會結合一第I型醣原神經脂質抗原決定位的的部分。在此所使用的全部的要描述各種不同的可以針對一原始抗體而被製造的改變的片語以及術語被認為落在片語“抗原結合部分”的範疇之內。因此,例如,一抗體片段(諸如,一Fab
分子、一Fv
、一scAb、一mru、任一該功能性片段)、一抗體變異體(諸如一對偶基因或一含有一在它的一級胺基酸序列上的改變的分子)、一衍生物(諸如一嵌合的或人類化的抗體)、一類似物[如在此所描述的,包括功能性等效物(其包括一感興趣的抗體的被遺傳地修飾的形式)、一抗體同源物等等]等等被包括在片語抗原結合部分之內。
因此被選擇的抗體突變體(等)可以被進行進一步的修飾,常常視抗體之所意欲的用途而定。該等修飾可能涉及進一步改變胺基酸序列、融合異源性多肽和/或共價修飾。例如,一不涉及維持抗體突變體的適當構形的半胱胺酸殘基通常可以被取代以絲胺酸來改善分子的氧化安定性(oxidative stability)以及來預防異常交聯(aberrant cross-linking)。相對地,一半胱胺酸可以被加至抗體中以改善安定性(特別地當抗體是一抗體片段,諸如一Fv
片段)。
另一形式的抗體突變體具有一被改變的糖基化態樣。該經改變的糖基化態樣可以藉由添加或刪除一或多個在抗體中所發現的碳水化合物部分和/或藉由添加或刪除一或多個不存在於抗體中的糖基化位址而被達到。抗體的糖基化典型地被N-連接至Asn或者被O-連接至Ser或 Thr。三肽序列(天冬醯胺酸-X-絲胺酸以及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸,其中X是除了脯胺酸以外的任一胺基酸)對於一碳水化合物部分酵素性地接附天冬醯胺酸側鏈而言是共同的辨識序列。例如,N-乙醯基半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)、半乳糖(galactose)、岩藻糖(fucose)或木糖(xylose)被結合至一羥基胺基酸(hydroxyamino acid),最常是絲胺酸或蘇胺酸,雖然5-羥基脯胺酸(5-hydroxyproline)或5-羥基離胺酸(5-hydroxylysine)亦可以被使用。對原始抗體的序列添加或取代一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基可以增進O-連接的糖基化的可能性。
有關於效應子功能,修飾本發明的抗體可以是所欲的,俾以增進抗體的效能(effectiveness)。例如,半胱胺酸殘基(等)可以被導入至Fc
區域,藉此容許在那區域的鏈間二硫鍵(interchain disulfide bond)形成。因此所產生的同二聚體抗體(homodimeric antibody)可以具有被改善的內在化能力(internalization capability)和/或被增加的藉由補體以及抗體-依賴性細胞細胞毒性(ADCC)而被調節的細胞殺滅(cell killing),參見Caron et al.,J Exp Med 176:1191-1195(1992)以及Shopes,Immunol 148:2918-2922(1993)。該一抗體衍生物或類似物在活體內亦可以對於降解更有抵抗力。
另擇地,一具有雙重Fc
區域的抗體可以被建造並且可以藉此具有被增進的補體溶解(complement lysis)以及ADCC能力,參見Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design 3:219230(1989)。
抗體的共價修飾被包括在本發明的範疇之內。若適用,該等共價修飾可以藉由化學合成或藉由抗體的酵素性或化學性切割而被製造。其他形式的抗體的共價修飾可以被導入至藉由將抗體的被標靶的胺基酸殘基與一能夠與被選擇的側鏈或者與N-端或C-端殘基反應的有機衍生性試劑(organic derivating agent)反應的分子。
半胱胺醯基殘基(cysteinyl residues)可以被反應以α-鹵乙酸鹽(α-haloacetates)(以及對應的胺)[諸如氯乙酸(chloroacetic acid)或氯乙醯胺(chloroacetamide)],俾以產生羧基甲基或羧基胺基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱胺醯基殘基亦可以藉由反應以,例如,溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸[α-bromo-β-(5-imidazoyl)propionic acid]、氯乙醯磷酸(chloroacetyl phosphate)、N-烷基馬來亞醯胺(N-alkylmaleimides)、3-硝基-2-吡啶基二硫化物(3-nitro-2-pyridyl disulfide)、甲基2-吡啶基二硫化物(methyl 2-pyridyl disulfide)、p-氯汞基苯甲酸鹽(p-chloromercuribenzoate)、2-氯汞基-4-硝基酚(2-chloromercuri-4-nitrophenol)或氯-7-硝基苯-2--1,3-二唑(chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole)而被衍生出。
組胺醯基殘基(histidyl residues)可以藉由在pH5.5至7.0下反應以二乙基焦碳酸鹽(diethylpyrocarbonate)而被衍生出。p-溴苯甲醯甲基溴(p-bromophenacyl bromide)亦可以被使用,該反應較佳地是在pH6.0下於0.1M二甲胂酸鈉(sodium cacodylate)中被執行。
離胺醯基(lysinyl)以及α端殘基可以被反應以琥珀酸或其他羧酸厈(succinic or other carboxylic acid anhydrides)來逆轉(reverse)殘基的改變。其他適合的用來衍生含有α-胺基的殘基(α-amino-containing residues)的試劑包括酰亚胺酯(imidoesters)[諸如,甲基甲吡足亞胺酸(methyl picolinimidate)]、吡哆醛磷酸(pyridoxal phosphate)、吡哆醛(pyridoxal)、氯氫硼化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid)、O-甲基異脲(O-methylisourea)以及2,4-戊二酮(2,4-pentanedione),並且胺基酸可以被轉胺酶-催化(transaminase-catalyzed)為乙醛酸(glyoxylate)。
精胺醯基殘基(arginyl residues)可以藉由反應以一或數個傳統的試劑[諸如,苯基乙二醛(phenylglyoxal)、2,3-丁二銅(2,3-butanedione)、l,2-環己二酮(l,2-cyclohexanedione)以及茚三酮(ninhydrin)]而被修飾。精胺酸殘基的衍生化(derivatization)常常需要鹼性反應條件(alkaline reaction conditions)。此外,該等試劑可以反應以離胺酸以及精胺酸ε-胺基基團。
酪胺醯基殘基(tyrosyl residues)的專一性修飾可以芳族重氮化合物(aromatic diazonium compounds)或四硝基甲烷(tetranitromethane)而被製造。例如,N-乙醯基咪唑(N-acetylimidazole)以及四硝基甲烷分別被用來形成O-乙醯基酪胺醯基物種(O-acetyl tyrosyl species)以及3-硝基衍生物。酪胺醯基殘基可以使用125
I或131
I而被碘化(iodinated)以製備供用於一放射免疫分析法(radioimmunoassay)的被標識的蛋白質。
羧基側基團[天冬胺醯基(aspartyl)或麩胺醯基(glutamyl)]可以藉由反應以碳二亞胺(carbodiimides)(R-N=C=C-R’)(其中R以及R’可以是不同的烷基基團,)而被修飾。
在中性或鹼性的條件,麩醯胺醯基glutaminyl)以及天冬醯胺醯基殘基(asparaginyl residues)經常分別被去醯胺基(deamidated)為對應的麩胺醯基以及天冬胺醯基殘基。那些殘基的被去醯胺基的形式落在本發明的範疇之內。
其他修飾包括:脯胺酸以及離胺酸的羥化作用(hydroxylation)、絲胺醯基(serinyl)或蘇胺醯基殘基(threonyl residues)的羥基基團的磷酸化、離胺酸、精胺酸以及組胺酸側鏈的α-胺基基團的甲基化(Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H. Freeman & Co.,San Francisco,pp. 79-86(1983))、N端胺(N-terminal amine)的乙醯基化以及任一C端羧基基團的醯胺化(amidation)。
另一種形式的共價修飾涉及化學地或酵素地偶合碳水化合物以及糖苷(glycosides)至抗體。那些操作程序不需要在一具有針對N-連接的或O-連接的糖基化的糖基化能力的宿主細胞中生產抗體。端視所使用的偶合模式而定,糖(等)可以被接附至:(a)精胺酸以及組胺酸;(b)自由羧基基團;(c)自由巰基基團(free sulfhydryl groups)(諸如那些半胱胺酸所具者);(d)自由羥基基團(諸如那些絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸所具者);(e)芳族殘基(諸如那些苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸所具者);或者(f)麩醯胺酸的醯胺基團(amide group)。該等方法被描述於WO 87/05330以及Aplin & Wriston,CRC Crit Rev Biochem,pp. 259-306(1981)中。
存在於抗體的任一碳水化合物部分的移除可以被化學地或酵素地達成。化學性去糖基化,例如,需要將抗體曝露於化合物[三氟甲磺酸(trifluoromethanesulfonic acid)],或一等效化合物,導致切割除了連接糖(linking sugar)[N-乙醯基葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)或N-乙醯基半乳糖胺(N-acetylgalactosamine)]之外的大多數或全部的糖,而留下完整的抗體。化學性去糖基化被描述於,例如,Hakimuddin et al.,Arch Biochem Biophys 259:52(1987)以及Edge et al.,Anal Biochem 118:131(1981)中。有如在,例如,Thotakura et al.,Meth Enzymol 138:350(1987)中所描述的,在抗體上的碳水化合物部分的酵素性切割可以藉由各種不同的內切糖苷酶(endoglycosidases)以及外切糖苷酶(exoglycosidases)的任一者而被達到。
另一種形式的抗體的共價修飾包含有以在美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第4,301,144號、第4,670,417號、第4,791,192號或第4,179,337號中所陳述的方式將抗體連接至各種不同的非蛋白質性的聚合物(nonproteinaceous polymers)[例如,聚乙烯乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙烯乙二醇(polypropylene glycol)或聚氧基烷撐(polyoxyalkylenes)]之一者。
功能性等效物可以藉由交換不同的在一框架或一由複數個抗體所衍生出的複合物FR(composite FR)之中的不同的抗體鏈的CDR’s而被製備。因此,例如,不同型的抗體對於一對於一組既定的CDRs而言藉由取代不同重鏈(例如,IgG1-4
、IgM、IgA1-2
或IgD)以產生不同的延長性第I型醣原神經脂質抗體型以及同型(isotypes)是可能的。類似地,落在本發明的範疇之內的人工抗體可以藉由將一組既定的CDR’s包埋在一完整合成框架之中而被生產。
本發明的抗體片段以及功能性等效物涵括那些具有一專一性結合至延長性第I型醣原神經脂質的可偵測的程度的分子。一結合的可偵測的程度包括落在至少10至100%的範圍之內的全部數值,較佳地至少50%、60%或70%,更佳地至少75%、80%、85%、90%、95%或99%的一感興趣的抗體的結合能力。亦被包括的是具有一大於那些一感興趣的抗體所具者的100%的親和力的等效物。
一般而言,CDR’s對於抗原決定位辨識以及抗體結合而言是重要的。然而,對於包含有不會干擾抗體辨識以及結合同源抗體決定位的能力的CDR’s的殘基的改變可以被製造。例如,不會影響抗原決定位辨識,更增加針對抗原決定位的抗體的結合親和力的改變被製造。根據知識,數個研究已經調查在一抗體的序列中的各種不同的位置上導入一或多個胺基酸改變的效用。
因此,一感興趣的抗體的等效物可以藉由使用諸如,例如,寡核苷酸-調節的位址-指引的突變發生(oligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis)、匣式突變發生(cassette mutagenesis)、易出錯PCR(error-prone PCR)、DNA洗牌(DNA shuffling)、胺基酸修飾或大腸桿菌(E. coli)的增變基因株(mutator-strains)(Vaughan et a1.,1998,Nat Biotech 16:535-539;以及Adey et al.,1996,Chap. 16,pp. 277-291,in Phage Display of Peptides and Proteins,eds. Kay et al.,Academic Press)的方法改變重與輕鏈基因上的CDR1、CDR2和/或CDR3的序列而被產生。改變初級抗體的核酸序列的方法可以導致抗體具有被改善的親和力(Gram et al.,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580;Boder et al.,2000,Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705;Davies & Riechmann,1996,Immunotech 2:169-179;Thompson et al.,1996,J Mol Biol 256:77-88;Short et al.,2002,J Biol Chem 277:16365-16370;以及Furukawa et al.,2001,J Biol Chem 276:27622-27628)。
重複循環的“多肽選擇”可以為了較高的親和力結合藉由,例如,多重胺基酸改變的選擇(它是藉由多重選擇的循環而被選擇)而被用來選擇。在第一輪的選擇(涉及在配位子或抗體多肽中的一第一區域的胺基酸的選擇)之後,在配位子的胺基酸的其他區域中的額外輪的選擇被進行。選擇的循環被重複直到所欲的親和力性質被達到。
被改善的抗體亦可包括那些藉由動物免疫作用(immunization)、融合瘤形成(hybridoma formation)以及針對具有專一性特徵的抗體的選擇而被製備的具有被改善的特徵的抗體。
“拮抗劑(antagonist)”意指一能夠抑制一或多個與延長性第I型醣原神經脂質有關聯的生物活性的分子。拮抗劑可以干擾一消耗一第I型醣原神經脂質的細胞的維持以及生長。一拮抗劑的干預的全部要點被認為相等於本發明的目的。因此,拮抗劑(例如,會結合至延長性第I型醣原神經脂質的中和性抗體)是被包括在本發明的範疇之內。
“促效劑(agonist)”意指一抗體、一抗體片段、一綴合物(conjugate)等等,它活化延長性第I型醣原神經脂質的一或多種生物活性或一表現延長性第I型醣原神經脂質的細胞。促效劑可以作為一表現一第I型醣原神經脂質的細胞的有絲分裂促進劑(mitogen)。一促效劑的干預的全部要點應該被認為相等於本發明的目的。因此,會結合至延長性第I型醣原神經脂質以及增進一活性(諸如,例如,分化)的抗體被包括在本發明的範疇之內。
術語“細胞”、“細胞株”以及“細胞培養物”包括它們的後代。亦被瞭解的是:全部的後代在,諸如,DNA含量上因為故意的或無意的突變而可以不準確地相同。有如針對在原始細胞中所篩選的,具有相同的感興趣的功能或生物性質的變異體後代被包括在本發明的範疇之內。在本發明中所使用的“宿主細胞”通常是原核或真核的宿主,依據一設計選擇而被選擇。
一細胞生物體、細胞或細胞株使用一核酸的“轉形(transformation)”意指將一核酸導入至標的細胞中,而使得該核酸是可複製的[有如一染色體外要素(extrachromosomal element)或藉由染色體整合(chromosomal integration)],以及選擇性地被表現。一具有一核酸的細胞或生物的“轉染作用(transfection)”意指藉由細胞或生物體獲取核酸(例如,一表現載體),不論任一編碼序列事實上是否被表現。術語“被轉染的宿主細胞”以及“被轉形的”意指一種被導入一核酸的細胞。典型的原核宿主細胞包括各種不同的大腸桿菌品系(E. coli strains)。典型的真核宿主細胞是動物細胞,諸如中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary),或人類來源的細胞。被導入的核酸序列可以是來自有如宿主細胞的相同物種或一與宿主細胞不同的物種之中,或者可以是一雜合核酸序列,含有某些外來以及某些同源的核酸。轉形亦可以藉由病毒-衍生的要素或載體(carrier)的轉導作用(transduction)或感染(infection)而發生。
術語“載體(vector)”意指一核酸建構物、一載體(carrier),含有一核酸、轉殖基因、外來基因或感興趣的基因,該載體可以被可操作地連接至適合的控制序列供在一適合的宿主中表現轉殖基因。該等控制序列包括,例如,一會影響轉錄(transcription)的啟動子(promoter)、一會控制該轉錄的選擇性操縱子(operator)序列、一編碼適合的mRNA核糖體結合位址(ribosome binding site)的序列以及控制與終止轉錄與轉譯(translation)的序列。該載體可以是一質體(plasmid)、一噬菌體顆粒或僅一可能的基因組插入。一旦被轉形至一適合的宿主中,該載體可以被複製並且獨立於宿主基因組作用,或在一些例子中,可以整合至一宿主細胞基因組或其他核酸。在本說明書中,“質體”以及“載體”可以被互換地使用,有如一質體是一載體的通常被使用的形式。然而,本發明被意欲要包括該等其他形式的載體(作為等效載體)作用有如並且在此技藝中是或為已知的,諸如,病毒、噬菌粒(phagemids)、轉位子(transposons)、攜帶核酸的合成分子、脂質體(liposomes)以及類似之物。
用於治療目的的“哺乳動物(mammal)”意指任一被分類為一哺乳動物的動物,包括人類、家庭的與農場的動物(domestic and farm animals)、非人類的靈長類動物(primates),以及動物園、運動或玩賞的動物(諸如狗、馬、貓、牛)等等。
感興趣的抗體可以被篩選出或可以被用於一有如在此所描述的或有如在此技藝中已知的分析。該等分析常常需要一是可偵測的試劑,亦即,例如,被標識的。文字“標識(label)”當在此被使用時意指一可以被直接地或間接地綴合至一分子或蛋白質(例如,一抗體)的可偵測的化合物或組成物。標識本身可以是可偵測的(例如,放射同位素標識、粒子或螢光標識),或可以是一獲得一可偵測的信號(諸如,在一酵素性標識的例子中,可子催化一受質化合物或組成物的化學改變,該受質化合物或組成物接而是可偵測的)的儀器。
如此處所用的,“固相(solid phase)”意指一種一實體(entity)或分子(諸如,本發明的抗體)可以黏附或結合的基質(matrix)。固相的實例在此涵括包括那些部分或完整的玻璃[例如,可控孔徑玻璃(controlled pore glass)]、多醣(polysaccharides)[例如,瓊脂糖(agarose)]、塑膠、聚丙烯(polypropylenes)、聚丙烯醯胺(polyacrylamides)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)以及矽酮(silicones)。在某些具體例中,端視情況而定,固相可以包含有一分析培養盤(assay plate)的井;在其他具體例中可以被用於一純化管柱(例如,一親和性層析管柱)。因此,固相可以是一紙、一珠粒、一塑膠、一晶片等等,可以由各種不同的材料[諸如硝基纖維素(nitrocellulose)、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、矽(silicon)等等]所製造,並且可以呈各種不同的構形。
表現延長性第I型醣神經脂質的細胞或它們的聚醣(glycans)(諸如細胞膜製備物),以及經純化的延長性第I型醣原神經脂質可以被用作為免疫原供產生感興趣的抗體。免疫原可以從天然來源中被獲得或被分離出或者可以被酵素性地或化學性地合成而被製造。全細胞(諸如延長性第I型醣原神經脂質表現細胞)、由一天然來源或由癌症(諸如癌細胞株)所衍生出的細胞可以被使用。過度表現延長性第I型醣原神經脂質的細胞可以被用作為免疫原供生產感興趣的抗體。此外,如在此技藝中已知的,攜帶延長性第I型醣原神經脂質的膜製備物可以被使用。該等細胞以及它們的部分在一診斷分析中可以被用作為抗原來源。
編碼胺基酸序列突變體的核酸分子可以藉由在此技藝中已知的各種不同的方法而被製備。該等方法包括,但不限於:感興趣的分子的一較早被製備的突變體或一非-突變體版本的寡核苷酸-調節的(或位址-指引的)突變發生、PCR突變發生以及匣式突變發生(參見,例如,Kunkel,Proc Natl Acad Sci USA 82:488(1985))。
重組表現本發明的一抗體或它的片段、衍生物或類似物(例如,本發明的一抗體的一重或輕鏈、本發明的一單鏈抗體或者本發明的一抗體突變形成的蛋白質)包括建構一含有一編碼有如在此所描述的抗體或抗體的一片段的聚核苷酸的表現載體。一旦一編碼一抗體分子的聚核苷酸已經被獲得,用於生產抗體的載體可以藉由如在此技藝中已知的重組DNA技術而被生產。一表現載體被建構含有抗體編碼序列以及適當轉錄與轉譯控制信號。該等方法包括,例如,在活體外重組DNA技術、合成技術以及在活體內基因重組。
表現載體是藉由傳統技術而被轉移至一宿主細胞內,並且被轉染的細胞接而藉由傳統技術而被培養以生產本發明的一抗體或片段。在本發明的一個方面,如在此所詳述的,編碼重與輕鏈這兩者的載體可以被共-表現於宿主細胞中供表現完整的免疫球蛋白分子。
各種不同的宿主/表現載體系統可以被利用來表現本發明的抗體分子。該等表現系統代表感興趣的編碼序列的載劑(vehicles)可以被生產並且隨後被純化,亦還代表當被轉形或被轉染以適當的核苷酸編碼序列時,細胞可以在原位表現本發明的一抗體分子。細菌細胞[諸如大腸桿菌(E. coli)]以及真核細胞通常被用來表現一重組抗體分子,特別地用來表現全重組抗體分子。例如,哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)連同一載體[諸如一攜帶來自人類細胞巨大病毒(cytomegalovirus)的主要中間早期基因啟動子要素者]對於抗體而言是一有效的表現系統(Foecking et al.,Gene 45:101(1986);以及Cockett et al.,Bio/Technology 8:2(1990))。如在此技藝中已知的,植物以及植物細胞培養、昆蟲細胞等等亦可被用來製造感興趣的蛋白質。
此外,一宿主細胞被選擇來調節被插入的序列的表現,或以所欲的特定模式修飾以及加工基因產物。該等蛋白質產物的修飾(例如,糖基化)以及加工(例如,切割)對於蛋白質的功能而言是重要的。就所欲的蛋白質以及基因產物的轉錄後加工以及修飾而言,不同的宿主細胞可以具有特定特徵以及特定機制。適當的細胞株或宿主系統可以被選擇來確保所表現的感興趣的抗體的正確修飾以及加工。因此,具有用來適當加工初級轉錄本(primary transcript)、基因產物的糖基化以及磷酸化的細胞機器(cellular machinery)的真核宿主細胞可以被使用。該等哺乳動物宿主細胞包括,但不限於:CHO、COS、293、3T3或骨髓瘤細胞(myeloma cells)。
就重組蛋白質的長期、高產率生產而言,安定表現是較佳的。例如,安定地表現抗體分子的細胞株可以被建造。與其使用含有病毒來源的複製的表現載體,宿主細胞可以被轉形以藉由適當的表現控制要素[例如,啟動子、增強子序列(enhancer sequences)、轉錄終止子(transcription terminators)、聚腺苷酸化位址(polyadenylation sites)等等]所控制的DNA以及一可選擇的標記(selectable marker)。在外來DNA的導入之後,被建造的細胞可以被容許在一被增富的培養基(enriched media)中生長歷時1至2天,並且接著被移至一選擇性培養基(selective medium)。在重組質體中的可選擇的標記授與針對選擇的抗性,以及容許細胞將質體安定地整合至一染色體並且被擴及至一細胞株。另擇地,一染色體外要素在選擇下可以被維持在細胞中。該等被建造的細胞株不僅對於抗體生產是有用的,還有在篩選以及評估與抗體分子直接地或間接地交互作用的化合物上是有用的。
一數目的選擇系統可以被使用,包括,但不限於:分別使用在tk、hgprt、gs或aprt細胞中的疱疹單純型病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus thymidine kinase)(Wigler et al.,Cell 11:223(1977))、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase)(Szybalska et al.,Proc Natl Acad Sci USA 48:202(1992))、麩胺酸合成酶(glutamate synthase)[在甲硫胺酸磺酸鹽(methionine sulfoximine)的存在下](Adv Drug Del Rev 58,671,2006以及參見Lonza Group Ltd.的網站或文獻)以及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(adenine phosphoribosyltransferase)(Lowy et al.,Cell 22:817(1980))基因。此外,抗代謝物抗性(antimetabolite resistance)可以被用作為關於下列基因的選擇的基礎:授與針對胺甲碟呤(methotrexate)的抗性的dhfr(Wigler et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77:357(1980);O’Hare et al.,Proc Natl Acad Sci USA 78:1527(1981));授與針對黴酚酸(mycophenolic acid)的抗性的gpt(Mulligan et al.,Proc Natl Acad Sci USA 78:2072(1981));授與針對胺基糖苷(aminoglycoside)、G-418的抗性的neo(Wu et al.,Biotherapy 3:87(1991));以及授與針對潮黴素(hygromycin)的抗性的hygro(Santerre et a1.,Gene30:147(1984))。在此技藝中已知的重組DNA技術的方法可以被例行性地施用以選擇所欲的重組選殖株,並且該等方法被描述在,例如,Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1993);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manua1,Stockton Press(1990);Dracopoli et al.,eds.,Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons(1994);以及Colberre-Garapin et al.,JMol Biol 150:1(1981)。
一抗體分子的表現位準可以藉由載體擴增而被增加(例如,參見Bebbington et al.,in DNA C1oning,Vo1.3.Academic Press(1987))。當一在表現抗體的載體系統中的標記是可擴增的時,一在存在於培養物中的抑制劑的位準上的增加將增加標記基因的複本的數目。因為被擴增的區域是與抗體基因有關聯,抗體的生產亦將增加(Crouse et al.,Mol Cell Bio1 3:257(1983))。
宿主細胞可以被共-轉染以2或多個本發明的表現載體,例如,編碼一重鏈-衍生的多肽的第一載體以及編碼一輕鏈-衍生的多肽的第二載體。該等2個載體可以含有相同的可選擇的標記,該等可選擇的標記能夠同樣地表現重與輕鏈多肽。另擇地,一編碼重與輕鏈多肽這兩者的單一載體可以被使用,並且能夠表現重與輕鏈多肽這兩者。在該等狀況下,輕鏈可以被設置於重鏈之前以避免一過量的毒性自由重鏈(Proudfoot,Nature 322:52(1986);以及Kohler,Proc Natl Acad Sci USA 77:2197(1980))。關於重與輕鏈的編碼序列可以包含有cDNA或基因組DNA。
一旦本發明的一抗體分子已經藉由一動物而被生產、被化學性地合成或被重組地表現,它可以藉由任一種在關於純化一免疫球蛋白分子的技藝中已知的方法而被純化,例如,藉由層析法{例如,離子交換、親和性(affinity)[特別地在蛋白質A以及尺寸-排除層析法(size-exclusion chromatography)之後藉由針對延長性第I型醣原神經脂質的親和性]等等}、離心、不同的溶解度(solubility)或藉由任一其他關於純化蛋白質的標準技術。此外,本發明的抗體或它們的片段可以被融合至在此所描述的多肽序列或其他在此技藝中已知的,俾以促進純化。
本發明的抗體可以藉由任一種在此技藝中已知的適合的方法而被產生。因此,一經純化的延長性第I型結構可以被用作為抗原,選擇性地,具有一佐劑(adjuvant)[諸如,完全或不完全的弗倫氏佐劑(Freund’s adjuvant)]。本發明的抗體可以包含有多株抗體,雖然因為抗體的修飾會最佳化在人類中的使用,以及會最佳化抗體本身的使用,單株抗體是較佳的因為易於生產以及操作特定蛋白質。製備多株抗體的方法是熟習此技藝者已知的(Harlow et al.,Antibodies:a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988))。
例如,有如在此所例示的,一免疫原可以被投藥至各種不同的宿主動物,包括,但不限於:兔、小鼠、駱駝、大鼠等等,俾以誘發生產含有對於延長性第I型醣原神經脂質具有專一性的多株抗體的血清。免疫原的投藥需要一或多次注射一免疫試劑以及若為所欲的一佐劑。各種不同的佐劑可以被用來增加免疫學反應(immunological response),端視宿主細胞而定,並且包括,但不限於:弗倫氏(完全以及不完全)、礦物油、凝膠、明礬(alum)[氫氧化鋁(aluminum hydroxide)]、界面活性物質[諸如溶血卵磷酯(lysolecithin)、普朗尼克多元醇(pluronic polyols)、多價陰離子(polyanions)]、胜肽、油乳化液(oil emulsions)、鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanins,KLH)、二硝基酚(dinitrophenol)以及具有潛在性用途的人類佐劑{諸如BCG[卡介苗(bacille Calmette-Guerin)]以及短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)}。可以被採用的佐劑的額外的實例包括MPL-TDM佐劑[單磷醯脂質A(monophosphoryl lipid A)、合成的海藻糖二霉菌酸脂(synthetic trehalose dicorynomycolate)]。免疫作用操作程序在此技藝中是熟知的並且可以藉由任一種在被選擇的動物宿主體內會促發一免疫反應(immune respone)的方法而被執行。因此,有如一設計選擇,各種不同的投藥途徑可以被使用超過各種不同的時間期間。
典型地,免疫原(具有或沒有佐劑)是藉由多重皮下的(subcutaneous)或腹膜內的(intraperitoneal)注射,或者肌肉內地(intramuscularly)或靜脈內地(intravenously)被注射至哺乳動物體內。在某些情況下,表現延長性第I型醣原神經脂質的全細胞可以被使用。端視免疫原的本質(nature)[亦即,百分比疏水性(percent hydrophobicity)、百分比親水性(percent hydrophilicity)、安定性(stability)、淨電荷(net charge)、等電點(isoelectric point)等等]而定,延長性第I型醣原神經脂質或它的部分在被免疫的動物(諸如一哺乳動物)體內可以被修飾或被綴合為是免疫原性的或更免疫原性的。例如,延長性第I型醣原神經脂質或它的一部分可以被綴合至一載體。綴合(conjugation)包括:藉由在要被綴合的免疫原或免疫原性蛋白質之一者或這兩者上衍生出活性化學官能基(functional groups)藉此一共價鍵被形成的化學性綴合,或者對於熟習此技藝者是已知的其他方法。該等載體或免疫原性蛋白質的實例包括,但不限於,KLH、卵白蛋白(ovalbumin)、血清白蛋白(serum albumin)、牛甲狀腺球蛋白(bovine thyroglobulin)、大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor)以及雜亂T輔助胜肽(promiscuous Thelper peptides)。各種不同的佐劑可以被用來增加有如上面所描述的免疫學反應。
一旦一適合的製備物被獲得,藉由已知的分離技術(separation techniques)[諸如親和性層析法、淘選(panning)、吸附(absorption)等等]從複數個抗體中分離出特定抗體是可能的。以前述方式,一個別的抗體物種可以被獲得供進一步研究,例如,定序以獲得一或多個CDRs的胺基酸序列。
本發明的抗體較佳地包含有單株抗體。單株抗體可以使用融合瘤技術(諸如由Kohler et al.,Nature 256:495(1975);美國專利第4,376,110號;Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988);以及Hammerling et al.,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevier(1981))、重組DNA方法[例如,製造以及使用轉染瘤(transfectomas)],或對於熟習此技藝者是已知的其他方法而被製備。可以被採用來生產單株抗體的其他實例包括,但不限於:人類B-細胞融合瘤技術(Kosbor et al.,Immunology Today 4:72(1983);以及Cole et al.,Proc Natl Acad Sci USA 80:2026(1983)),以及EBV-融合瘤技術(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,pp. 77-96,Alan R. Liss(1985))。該等抗體可以是免疫球蛋白型之任一者,包括IgG、IgM、IgE、IgA與IgD,以及它們的任一亞型。生產本發明的mAb的融合瘤可以在活體外或在活體內被培養。
在融合瘤模型中,一宿主(諸如一小鼠、一人類化小鼠、一具有人類免疫系統基因的基因轉殖小鼠、馬、羊、倉鼠、兔、大鼠、駱駝或任一其他適當的宿主動物)被免疫,俾以促發會生產或能夠生產會專一性地結合至延長性第I型醣原神經脂質的抗體的淋巴細胞。
另擇地,淋巴細胞可以在活體外被免疫。淋巴細胞接而是使用一適合的融合試劑[諸如聚乙烯乙二醇(polyethylene glycol)]被融合以骨髓瘤細胞,俾以形成一融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,pp. 59-103(1986))。
一般而言,在製造生產抗體的融合瘤(antibody-producing hybridomas)上,若人類來源的細胞是所欲的,末梢血液淋巴細胞(peripheral blood lymphocytes,“PBLs”)被使用,或者若非-人類哺乳動物來源是所欲的,脾臟細胞(spleen cells)或淋巴節細胞(lymph node cells)被使用。永生不死的細胞株(immortalized cell lines)通常是被轉形的哺乳動物細胞,特別地是齧齒動物、牛或人類來源的骨髓瘤細胞。典型地,一大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株被採用。融合瘤細胞可以被培養在一適合的培養基(其較佳地含有一或多種會抑制未被融合的、永生不死的細胞的生長或生存的物質)中。例如,若親代細胞缺乏酵素[次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)],用於融合瘤的培養基典型地將包括:次黃嘌呤、胺基蝶呤(aminopterin)以及胸苷(thymidine)(“HAT”培養基),會預防HGPRT-缺乏的細胞的生長的物質。
較佳的永生不死的細胞株是那些有效地融合者,藉由被選擇的生產抗體的細胞(antibody-producing cells)支持抗體的安定高位準生產,並且對於一培養基(諸如HAT培養基)是敏感的。在骨髓瘤細胞株之中是鼠骨髓瘤細胞株,諸如那些衍生自MOPC-21與MPC-11小鼠腫瘤[可獲得自沙克研究所細胞配送中心(Salk Institute Cell Distribution Center),San Diego,Calif.]以及SP2/0,FO或X63-Ag8-653細胞[可獲得自美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection),Manassas,VA]者。小鼠骨髓瘤細胞株NSO亦可以被使用[歐洲細胞培養物收集中心(European Collection of Cell Cultures),Salisbury,Wilshire,UK]。
就人類單株抗體的生產而言,人類骨髓瘤以及小鼠-人類異骨髓瘤(mouse-human heteromyeloma)細胞株亦已經被描述(Kozbor,J Immunol 133:3001(1984);以及Brodeur et a1.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc,pp. 51-63(1987))。
另一個另擇方式是要使用電融合(electrical fusion)而不是化學融合(chemical fusion)來形成融合瘤。取代化學融合,一B細胞可以使用,例如,愛潑斯坦巴爾二氏病毒(Epstein Barr Virus)或另一個轉形基因(transforming gene)而被永生不死(immortalized),參見,例如,Zurawaki et al.,in Monoclonal Antibodies,ed.,Kennett et al.,Plenum Press,pp. 19-33.(1980)。表現免疫球蛋白的基因轉殖小鼠以及被移植以人類B淋巴細胞的嚴重合併免疫缺乏(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠。
就直接針對延長性第I型醣原神經脂質的單株抗體的生產而言,融合瘤被生長在其中的培養基被分析。藉由融合瘤細胞而被生產的單株抗體的結合專一性可以藉由免疫沉澱法(immunoprecipitation)或藉由一活體內結合分析[諸如放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)、流動式細胞測量分析(fluorocytometric analysis,FACS)或酵素-結合免疫吸附分析法(enzyme-inked immunosorbent assay,ELISA)]而被決定。該等技術在此技藝中是已知的並且是落在熟習此技藝者的技藝中。此外,如在此技藝中已知的,Biacore系統可以被使用。針對延長性第I型醣原神經脂質的單株抗體的結合親和力可以藉由,例如,一斯卡查德分析(Scatchard analysis)而被決定(Munson et al.,Anal Biochem 107:220(1980))。
在會生產所欲的專一性、親和力和/或活性的抗體的融合瘤細胞被鑑定出之後,選殖株可以藉由極限稀釋操作程序(limiting dilution procedures)而被次選殖(subcloned)並且藉由標準方法而被生長(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,pp. 59-103(1986))。適合的培養基包括,例如,杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,D-MEM)或RPMI-1640。此外,有如在一動物體內的腹水性腫瘤(ascites tumors),融合瘤細胞可以在活體內被生長。
藉由次選殖而被篩選的單株抗體是藉由傳統的免疫球蛋白純化操作程序[諸如,例如,蛋白質ASepharose 、蛋白質G Sepharose、氫氧磷灰石層析法(hydroxylapatite chromatography)、凝膠排除層析法(gelexclusion chromatography)、凝膠電泳(gel electrophoresis)、透析(dialysis)或親和性層析法(affinity chromatography)]而從培養基、腹水液(ascites fluid)或血清中適當地被分開(separated)或被分離(isolated)。
各種不同的方法存在於關於生產單株抗體的技藝中並且因此,本發明不限制它們僅有在融合瘤中生產。例如,單株抗體可以藉由重組DNA方法(諸如那些被描述在美國專利第4,816,567號中的)而被製造。另擇地,如上面所討論的,人類抗體可以被獲得自基因轉殖動物,諸如KM小鼠。在那情況中,術語“單株抗體”意指一衍生自一單一真核的(eukaryotic)、病毒性(viral)或原核的(prokaryotic)選殖株。
因此,如在此技藝中已知的,使用已知要表現一延長性第I型鏈結構的人類癌細胞(諸如Colo205細胞),或一含有延長性第I型鏈的化合物[諸如醣原神經脂質(諸如Leb
/Lea
)]作為抗原,近親的(inbred)或基因轉殖的小鼠被免疫並且被追加免疫(boosted)。脾臟被獲得,細胞被融合至骨髓瘤細胞以及融合瘤被製造並且被培養。細胞上清液(supernatants)是使用,例如,Leb
/Lea
作為捕獲試劑(capture reagent)藉由ELISA而被篩選。陽性選殖株(positive clones)被擴增。IMH2是一會專一地結合至一延長性第I型鏈結構的小鼠Ig
G3
單株抗體的一個實例。
使用一基因轉殖小鼠模型,人類抗體可以藉由將基因轉殖小鼠免疫以一延長性第I型鏈免疫原而被生產。在一費用基礎上,該等抗體可以藉由,例如,Medarex,NJ and Amgen,CA而被產生。使用KM小鼠,GNX-8(IgG1
)單株抗體被選擇供進一步特徵鑑定(characterization)以及使用。
GNX-8是一細胞毒性抗體(cytotoxic antibody)。在使用Colo205結腸癌細胞作為標的的分析中,GNX-8溶解癌細胞株細胞,並且至少於50μg/ml下,該抗體溶解在培養物中的全部細胞。GNX-8不會結合至RBCs。該抗體結合至結腸直腸癌細胞(colorectal cancer cells)、乳癌細胞(breast cancer cells)以及肺癌細胞(lung cancer cells)。不同於IMH2,GNX-8不會結合至Ley
-Lex
或Ley
。
編碼本發明的單株抗體的DNA是使用傳統操作程序(例如,藉由使用能夠專一性地結合至編碼鼠抗體的重與輕鏈,或者該等來自人類、人類化的或其他來源的鏈的基因的寡核苷酸探針)而容易地被分離出並且被定序(Innis et al. in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications,Academic(1990)以及Sanger et al.,Proc Natl Acad Sci 74:5463(1977))。融合瘤細胞可以當作該DNA的來源。
一旦被分離出,DNA可以被設置於表現載體中,該等表現載體接而被轉染至宿主細胞[諸如不會另外生產免疫球蛋白蛋白質的大腸桿菌(E. coli)細胞、NSO細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞]中,俾以在重組宿主細胞中獲得合成的單株抗體。DNA亦可必被修飾,例如,藉由人類重與輕鏈恆定領域的編碼序列取代而代替同源性鼠序列(美國專利第4,816,567號;以及Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci USA 81:6851(1984))或藉由共價地接合至免疫球蛋白編碼序列、一非-免疫球蛋白多肽的全部或部分的編碼序列。該一非-免疫球蛋白多肽可以被用以取代本發明的一抗體的恆定領域,或可以被用以取代本發明的一抗體的一延長性第I型醣原神經脂質-合併位址的變異領域,俾以產生一嵌合二價抗體。
抗體可以是單價抗體。用於製備單價抗體的方法在此技藝中是熟知的。例如,一個涉及重組表現免疫球蛋白輕鏈以及經修飾的重鏈的方法。重鏈通常在Fc
區域中的任一點被截短(truncated),俾以預防重鏈交聯(cross-linking)。另擇地,相關的半胱胺酸殘基被取代以另一個胺基酸殘機或被刪除,俾以預防交聯。
辨識專一性抗原決定位的抗體片段可以藉由已知的技術而被產生。傳統地,那些片段經由完整抗體的蛋白質水解分解(proteolytic digestion)而被衍生出(參見,例如,Morimoto et al.,J Biochem Biophys Methods 24:107(1992);以及Brennan et al.,Science 229:81(1985))。例如,本發明的Fab
以及F(ab’)2
片段可以使用酵素[諸如,木瓜蛋白酶(papain)(以生產Fab
片段)或胃蛋白酶(pepsin)(以生產F(ab’)2
片段)]藉由免疫球蛋白分子的蛋白質水解切割(proteolytic cleavage)而被生產。F(ab’)2
片段含有變異區域、輕鏈恆定區域以及重鏈的CH1
領域。然而,那些片段可以藉由重組宿主細胞而被直接地生產。例如,抗體片段可以從一抗體噬菌體存庫中被分離出。另擇地,F(ab’)2
-SH片段可以從大腸桿菌(E.coli)中被直接地回收並且被化學性地偶合以形成F(ab’)2
片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163(1992)。依據另一個方法,F(ab’)2
片段可以從重組宿主細胞培養物中被直接地分離出。關於生產抗體片段的其他技術對於熟習此技藝者而言將是明顯的。在其他具體例中,抗體的選擇是一單鏈Fv
片段(Fv
),參見,例如,WO 93/16185。
就某些用途(包括抗體在人類體內的活體內的用途以及活體外偵測分析)而言,使用嵌合的、人類化的或人類抗體可以是較佳的。用於生產嵌合抗體的方法在此技藝中是已知的,參見,例如,Morrison,Science 229:1202(1985);Oi et al.,BioTechniques 4:214(1986);Gillies et al.,J Immunol Methods 125:191(1989);以及美國專利第5,807,715號、第4,816,567號與第4,816397號。
人類化抗體是衍生自在一非-人類物種所產生的抗體分子,該等抗體分子結合延長性第I型醣原神經脂質,其中一或多個由此的CDR’s被插入至來自一人類免疫球蛋白分子的FR區域內。抗體可使用此技藝中已知的各種不同的技術而被人類化,這些技術包括,例如CDR移植(CDR grafting)(EPO 239,400;WO 91/09967;以及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號與第5,585,089號)、鑲飾(veneering)或重新表面化(resurfacing)(EPO 592,106;EPO 519,596;Padlan,Molecular Immunology 28:489(1991);Studnicka et al.,Protein Engineering 7:805(1994);以及Roguska et al.,Proc Natl Acad Sci USA 91:969(1994)),以及鏈洗牌(chain shuffling)(美國專利第5,565,332號)。
一人類化抗體具有一或多個來自一非-人類來源的胺基酸殘基。該等非-人類的胺基酸殘基常常被意指為典型地取自一“重要(import)”變異領域的“重要”殘基。人類化(humanization)基本上可跟隨Winter等人的方法(Jones et al.,Nature 321:522(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323(1988);以及Verhoeyen et al.,Science 239:1534(1988)),藉由以非-人類的CDR’s或部分的CDR序列來取代一人類抗體的相對應的序列而被執行。因此,該等“人類化”抗體是嵌合抗體(chimeric antibodies)(美國專利第4,816,567號),其中實質上少於一完整的人類變異領域已藉由來自一非-人類物種的相對應的序列而被取代。實際上,人類化抗體典型地是人類抗體,其中一些CDR殘基以及可能的一些FR殘基從在齧齒動物抗體的類似位址而被取代。重鏈恆定區域(heavy chain constant region)以及樞鈕區域(hinge region)可以來自任何型(class)或亞型(subclass)俾以獲得一所欲的效果[諸如一特定的效應子(effector)功能]。
在人類框架區域(framework regions)的框架殘基(framework residues)常常可被取代以來自CDR供體抗體(CDR donor antibody)的相對應的殘基俾以改變,以及可能地改善抗原結合。框架取代可藉由此技藝中已知的方法而被鑑定出,例如:藉由模仿CDR與框架殘基的交互作用以鑑定框架殘基對於抗原結合的重要性,以及序列比對以鑑定在特定位置的獨特框架殘基,參見,例如,美國專利第5,585,089號;以及Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)。
進一步較佳的是人類化抗體對於延長性第I型醣原神經脂質保有高親和力(affinity),並且保有或獲得其他有利的生物性質。因此,人類化抗體可藉由一種經由使用親代的(parental)與人類化序列的三維模型(three-dimensional models)來分析親代的序列與各種不同的概念性人類化抗體衍生物的方法而被製備。該等假設的三-維免疫球蛋白模型通常是可獲得的並且是那些熟習此技藝者熟悉的。電腦程式是可獲得的,其例示說明以及展示被選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三-維構型結構。展示的檢查容許分析某些殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能角色(亦即,分析影響候選免疫球蛋白結合延長性第I型醣原神經脂質的能力之殘基)。以前述方式,FR殘基可被選擇出並且被結合自接受者(recipient)以及重要序列,藉此所欲的抗體特徵(antibody characteristic)(諸如對於標的抗原有被增加的親和力)被最大化,雖然它是直接地以及最實質上影響延長性第I型醣原神經脂質結合的CDR殘基。CDR區域亦可被修飾以含有一或多個偏離從CDR被獲得的親代抗體所獲得者之胺基酸,俾以提供被增強的或不同的感興趣的性質[諸如,例如,較大的親合力或較大的結合性(avidity)]。
抗體的恆定區域的某些部分可被操作以及改變俾以提供具有不同於或比在親代抗體(parent antibody)被觀察到者更好的性質之抗體同源物(homologs)、衍生物(derivatives)、片段(fragments)以及類似之物。因此,例如,許多IgG4抗體在靠近樞紐區域處形成鏈內(intrachain)二硫鍵。鏈內鍵(intrachain bond)可使親代二價分子(bivalent molecule)去穩定(destabilize)而形成包含有一重鏈與關聯性輕鏈的單價分子(monovalent molecules)。該等分子可以再連結(reassociate),但是是在一隨機的基礎上。
另一組的適合用於修飾的胺基酸包括在影響抗體功能[諸如,結合一含有一重鏈的分子與結合至Fc
受體,以及被結合的抗體的內化作用(internalization)]的樞紐區域之胺基酸。該等胺基酸包括:在IgG1分子,自大約233至大約237(Glu-Leu-Leu-Gly-Gly,序列辨識編號:1)、自大約252至大約256(Met-Ile-Ser-Arg-Thr,序列辨識編號:2)以及自大約318(Glu)至大約331(Pro)(包括,例如,Lys320
、Lys322
以及Pro329
)的殘基。
完全地人類抗體對於人類病患的治療性治療是特別地所欲的。人類抗體可藉由此技藝中已知的各種不同的方法而被製造,這些方法包括上面所描述的使用衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體存庫(antibody libraries)的噬菌體呈現法(phage display methods)(參見:美國專利第4,444,887號與第4,716,111號;以及WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735與WO 91/10741)。Cole等人以及Boerder等人的技術亦可用於人類單株抗體的製備(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss(1985);以及Boerner et al.,J Immunol 147:86(1991))。
人類抗體亦可使用不能表現功能性的內生性免疫球蛋白但又表現某些人類免疫球蛋白基因的基因轉殖小鼠(transgenic mice)而被生產。例如,人類重與輕鏈免疫球蛋白基因複合體(human heavy and light chain immunoglobulin gene complexes)可隨機地或藉由同源重組(homologous recombination)而被導入至小鼠胚胎幹細胞(mouse embryonic stem cells)內。另擇地,除了人類重與輕鏈免疫球蛋白基因以外,人類變異區域(variable region)、恆定區域以及多變區域(diversity region)可被導入至小鼠胚胎幹細胞內。小鼠重與輕鏈免疫球蛋白基因可被處理,藉此與藉由同源重組導入的人類免疫球蛋白基因座是個別地或同時地無-功能的。特別地,JH區域的同型合子刪除(homozygous deletion)預防內生性抗體(endogenous antibody)產生。經修飾的胚胎幹細胞被擴張以及微注射至胚胞(blastocysts)內俾以產生嵌合小鼠(chimeric mice)。該等嵌合小鼠接而被育種俾以產生表現人類抗體的同型合子的後代,參見,例如:Jakobovitis et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90:2551(1993);Jakobovitis et al.,Nature 362:255(1993);Bruggermann et al.,Year in Immunol 7:33(1993);以及Duchosal et al.,Nature 355:258(1992)。
基因轉殖小鼠以正常的方式使用一延長性第I型醣原神經脂質(例如,所有或一部份的延長性第I型醣原神經脂質)或一含有相同的膜製備物而被免疫化。針對對抗延長性第I型醣原神經脂質的單株抗體可使用傳統的融合瘤(hybridoma)技術而從經免疫的基因轉殖小鼠中被獲得。由基因轉殖小鼠所隱藏的人類免疫球蛋白轉殖基因在B細胞分化的期間重排(rearrange),並且隨後經歷類型轉換(class switching)以及體細胞突變(somatic mutation)。因此,使用該一技術,可能會產生治療上有用的IgG、IgA、IgM以及IgE抗體。關於一概論,參見Lonberg et al.,Int Rev Immunol 13:65-93(1995)。關於一種生產人類抗體以及人類單株抗體的討論以及用以生產該等抗體的方法,參見,例如,WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096與WO 96/33735;EPO第0598877號;以及美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號、第5,885,793號、第5,916,771與第5,939,598號。此外,公司[諸如Amgen(Fremont,CA)、Genpharm(San Jose,CA)以及Medarex,Inc.(Princeton,NJ)]可被雇用而使用類似於上面所描述的技術來提供針對對抗延長性第I型醣原神經脂質的人類抗體。
此外,人類mAbs可藉由免疫被移植以人類末稍血液白血球(human peripheral blood leukocytes)、脾細胞(splenocytes)或骨髓(bone marrow)的小鼠而被製造[例如,XTL Biopharmaceuticals(Israel)的trioma技術]。
辨識一被選擇的抗原決定位的完全地人類抗體可使用一被意指為“定向選擇(guided selection)”的技術而被產生。在那個方法中,一被選擇的非-人類單株抗體(例如,一小鼠抗體)被使用來定向選擇一辨識相同抗原決定位的完全地人類抗體(Jespers et al.,Bio/Technology 12:899(1988))。
當使用重組技術,抗體變異體(antibody variant)可在近膜間隙(periplasmic space)被細胞內地生產,或直接地被分泌至培養基內。若抗體變異體被細胞內地生產作為第一步驟,特定的殘渣(debris)(宿主細胞或被溶解的片段)可藉由,例如,離心或超過濾(ultrafiltration)而被移除。Carter et al.,Bio/Technology 10:163(1992)描述一種用以分離被分泌至大腸桿菌(E.coli)的近膜間隙之抗體的操作程序。簡言之,細胞糊(cell paste)被暴露至醋酸鈉(pH3.5)以及EDTA中。細胞殘渣(cell debris)可藉由離心而被移除。當抗體變異體被分泌至培養基內,來自該等表現系統的上清液(supernatant)通常使用一商業上可獲得的蛋白質濃縮濾膜[例如,一Amicon或Millipore Pellicon超過濾單元(ultrafiltration unit)]而被最早濃縮。一蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)(諸如PMSF)可被包括以抑制蛋白質水解(proteolysis),以及抗生素(antibiotics)可被包括以預防外來污染物的生長。
從細胞所製備出的抗體組成物可使用,例如,氫氧磷灰石層析法(hydroxylapatite chromatography)、凝膠電泳(gel electrophoresis)、透析(dialysis)以及親和性層析法(affinity chromatography)而被純化。蛋白質A或蛋白質G作為一親和配位子(affinity ligand)的適合性視一存在於抗體變異體的免疫球蛋白Fc
領域的物種以及同型物(isotype)而定。蛋白質A可被用來純化以人類IgG1、IgG2或IgG4重鏈為基礎的抗體(Lindmark et al.,J Immunol Meth 62:1(1983))。蛋白質G可被用於小鼠同型物以及人類IgG3(Guss et al.,EMBO J 5:1567(1986))。親和配位子所接附的基質(matrix)最常是瓊脂糖(agarose),但是其他的基質是可用的。機械地安定的基質{諸如可控孔徑玻璃(controlled pore glass)或聚(苯乙烯二乙烯基)苯[poly(styrenedivinyl)benzene]}容許要比使用瓊脂糖所達到者更快的流速以及更短的加工時間。當抗體變異體包含有一CH3
領域,Bakerbond ABXTM樹脂(JT Baker;Phillipsburg,NJ)可用於純化。其他用於蛋白質純化的技術{諸如,在一離子交換管柱(ion-exchange column)上的分級分離處理(fractionation)、乙醇沉澱法、逆相HPLC(reverse phase HPLC)、在矽石(silica)上的層析法、在肝素(heparin)瓊脂糖上的層析法、在一陰離子或陽離子交換樹脂[諸如一聚天冬胺酸管柱(polyaspartic acid column)]上的層析法、層析聚焦法(chromatofocusing)、SDS-PAGE以及硫酸銨沉澱法(ammonium sulfate precipitation)}亦是可獲得的,端視要被回收的抗體或變異體而定。
在任何初步純化步驟(等)之後,包含有感興趣的抗體或變異體的混合物以及污染物可使用一種呈一pH值介於大約2.5至4.5之間的洗提緩衝液[較佳地在低鹽濃度(例如,自大約0至0.25M鹽類)下被執行]而被進行低pH值的疏水性交互作用層析法(hydrophobic interaction chromatography)。
再者,本發明的抗體可使用那些熟習此技藝者所熟知的技術而被輪流利用以產生“模仿的”延長性第I型醣原神經脂質的抗-個體基因型抗體(anti-idiotype antibodies)(參見,例如,Greenspan et al.,FASEB J 7:437(1989);以及Nissinoff,J Immunol 147:2429(1991))。例如,結合至以及競爭地抑制多元聚合(multimerization)和/或結合一配位子至延長性第I型醣原神經脂質的抗體可被使用以產生“模仿的”延長性第I型醣原神經脂質的抗-個體基因型。該等中和的抗-個體基因型或該等抗-個體基因型的Fab
片段可被使用在治療性或診斷性攝生法(diagnostic regimens)。
本發明的抗體可以是雙專一性抗體(bispecific antibodies)。雙專一性抗體可以是對於至少兩種不同的抗原具有結合專一性(binding specificities)的單株的(較佳地人類或人類化的)抗體。在本發明中,結合專一性之一者是針對延長性第I型醣原神經脂質,而另一專一性可以是針對任何其他抗原,諸如一細胞-表面蛋白質、受體、受體次單元(receptor subunit)、配位子、組織-專一性抗原、病毒蛋白質、病毒地編碼的外套蛋白質(virally-encoded envelope protein)、藥理學上的活性劑(pharmacologically active agent)(諸如一藥物)、細菌地-衍生的蛋白質(bacterially-derived protein)、細菌表面蛋白質等等。
用以製造雙專一性抗體的方法是被熟知的。傳統上,雙專一性抗體的重組生產是根據兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共-表現,其中該等兩個重鏈具有不同的專一性(Milstein et al.,Nature 305:537(1983))。因為免疫球蛋白重與輕鏈的隨機組合(random assortment),融合瘤[四源雜交瘤(quadromas)]生產一具有大約10種不同的抗體分子的可能混合物,其中僅大約1種可能具有正確的雙專一性結構。該正確的分子的純化通常藉由親和性層析法步驟而被完成。類似的操作程序被揭示在WO 93/08829以及在Traunecker et al.,EMBO J 10:3655(1991)。其他用以製造雙專一性抗體的方法被提供在,例如,Kufer et al.,Trends Biotech 22:238-244,2004。
具有所欲的結合專一性的抗體變異領域可被融合至免疫球蛋白恆定領域序列。融合較佳地是與一包含有至少部分的樞紐、CH2
以及CH3
區域之免疫球蛋白重鏈恆定領域。它可具有含有存在於至少一融合物中的輕鏈結合所需的位址之第一重鏈恆定區域(CH1
)。DNA編碼免疫球蛋白重鏈融合物,並且若所欲的,免疫球蛋白輕鏈被插入至個別的表現載體內,並且被共-轉形至一適合的宿主生物內。關於產生雙專一性抗體的進一步細節,參見,例如Suresh et al.,Meth Enzym 121:210(1986)。
異綴合的抗體(heteroconjugate antibodies)亦被本發明所預期。異綴合的抗體是由兩個被共價地連結的抗體所組成。該等抗體已經,例如,被計劃標靶免疫系統細胞至有害的細胞(美國專利第4,676,980號)。被預期的是:抗體可使用在合成的蛋白質化學上已知的方法[包括那些涉及交聯劑(cross-linking agents)者]而在活體外被製備。例如,免疫毒素(immunotoxins)可使用一種二硫化物交換反應或藉由形成一硫酯鍵(thioester bond)而被建構。用於那個目的的適合的試劑之實例包括亞胺基硫醇鹽(iminothiolate)與甲基-4-巰基丁基亞胺酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate),以及那些被揭示在,例如,美國專利第4,676,980號者。
此外,吾人可產生針對延長性第I型醣原神經脂質的單一領域抗體。那個技術的實例已被描述在WO9425591[關於衍生自駱駝科(camelidae)的重鏈Ig的抗體],以及在US 20030130496(描述從噬菌體存庫分離出單一領域全人類抗體)。
另擇地,被描述用以生產單鏈抗體的技術(美國專利第4,946,778號;Bird,Science 242:423(1988);Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85:5879(1988);以及Ward et al.,Nature 334:544(1989))可被實施。單鏈抗體是藉著經由一胺基酸鍵(amino acid bridge)來連結Fv
區域的重與輕鏈片段而被形成,導致一單鏈多肽。用以在大腸桿菌(E. coli)中組合功能性Fv
片段的技術亦可被使用(Skerra et al.,Science 242:1038(1988))。單鏈抗體(“scFv
”)以及一種它們的建構之方法被描述在,例如,美國專利第4,946,778號。另擇地,Fab
可藉由類似的方法而被建構以及表現。所有的完全地或部分地人類抗體可以是比完全地鼠mAbs有較少的免疫原性(immunogenic),並且片段以及單鏈抗體亦可以是有較少的免疫原性。
本發明涵括重組地融合或化學地綴合(包括共價地以及非-共價地綴合這兩者)至一多肽的抗體。本發明之經融合或綴合的抗體可被用於簡單純化,參見,例如,WO 93/21232;EP 439,095;Naramura et al.,Immunol Lett 39:91(1994);美國專利第5,474,981號;Gillies et al.,Proc Natl Acad Sci USA 89:1428(1992);以及Fell et al.,J Immunol 146:2446(1991)。
純化可藉由使用一辨識標記(recognition marker)或標籤(tag)而被促進。例如,該標記可以是一胺基酸序列,諸如,一個六-組胺酸多肽(hexa-histidine peptide)[諸如被提供在一pQE載體(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)中的標籤],尤其它們許多是商業上可獲得的(Gentz et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86:821(1989))。其他用於純化的胜肽標籤包括,但不限於:對應於一衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白質(influenza hemagglutinin protein)的抗原決定位(epitope)(Wilson et al.,Cell 37:767(1984))的“HA”標籤以及“旗標(flag)”標籤。
抗體或抗體片段可使用在McCafferty et al.,Nature 348:552(1990)中所描述的技術而從抗體噬菌體存庫被分離出。Clarkson et al.,Nature 352:624(1991)以及Marks et al.,J Mol Biol 222:581(1991)分別描述使用噬菌體存庫的鼠以及人類抗體的分離。隨後的刊物描述藉由鏈洗牌(chain shuffling)的高親和力(nM範圍)人類抗體的生產(Marks et al.,Bio/Technology 10:779(1992)),以及組合感染(combinatorial infection)與活體內重組作為一用以建構非常大的噬菌體存庫的策略(Waterhouse et al.,Nucl Acids Res 21:2265(1993))。因此,該等技術對於用以分離單株抗體的傳統的單株抗體融合瘤技術是可實行的選擇。
候選抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體可藉由酵素結合免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、FACS、西方免疫墨點法(Western immunoblotting)或其他如此技藝中已知的免疫化學技術而被測試。因此,B細胞或表現延長性第I型醣原神經脂質的細胞可使用一已知的技術而被用以偵測結合至其中的抗體,或者含有延長性第I型醣原神經脂質或它的部分、或經純化或分離的延長性第I型鏈結構之適合的膜製備物(membrane preparations)可被黏附至一固相(solid phase),並且在一被配置作為一設計選擇的分析中被使用作為一捕獲元件(capture element)。
為了決定一特定的抗體同源物(antibody homolog)是否結合至人類延長性第I型醣原神經脂質,任何傳統的結合分析法可被使用。有用的延長性第I型醣原神經脂質結合分析法包括FACS分析法、ELISA分析法、放射免疫分析法(radioimmunoassay)以及類似的方法,它們偵測對於人類延長性第I型醣原神經脂質的抗體的結合以及由此導致的作用。在此所教示的全長(full-length)以及可溶性形式的人類延長性第I型醣原神經脂質在該等分析法中是有用的。一抗體或同源物結合至延長性第I型醣原神經脂質或它的可溶性片段可經由使用一對於抗體或同源物被衍生的物種的免疫球蛋白具有專一性的二級抗體(secondary antibody)而被便利地偵測。該二級抗體可攜帶一可偵測的標識(label)或被構形以被偵測。
一抗體或同源物結合至人類延長性第I型醣原神經脂質的能力可藉由測試它結合至人類延長性第I型醣原神經脂質+
細胞的能力而被評估。供使用在決定一特定抗體或同源物是否結合至人類延長性第I型醣原神經脂質的適合的延長性第I型醣原神經脂質+
細胞是在,諸如,細胞表面上表現延長性第I型醣原神經脂質的可獲得的哺乳動物組織培養細胞。
抗體或同源物結合至延長性第I型醣原神經脂質+
細胞可藉由使用,例如,一對於相同物種的免疫球蛋白有專一性的經螢光地-標識的二級抗體將細胞染色而被偵測,其中被測試的抗體同源物是被衍生的。一螢光活化的細胞選別機(fluorescence activated cell sorter,“FACS”)可被用以偵測以及定量任何結合,一般參見,Shapiro,Practical Flow Cytometry,Alan R. Liss,Inc.,New York,N.Y.(1985)。
為了決定一特定的抗體或同源物在活體內是否在循環的延長性第I型醣原神經脂質+
細胞的數目上引起無顯著的降低,在投藥該抗體或同源物給一具有正常的免疫功能的哺乳動物之後的24小時內,被分離自該哺乳動物的循環的延長性第I型醣原神經脂質+
細胞的數目被定量,並且與投藥前的數目或在一對照的哺乳動物中的數目相比較,其中一具有不相關的專一性之同型物-相配的抗體或同源物代替本發明的一抗體或同源物已被投藥給該對照的哺乳動物。在被給藥以一抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體或它的功能性部分或衍生物的動物中的延長性第I型醣原神經脂質+
細胞的定量可藉由,例如,使用結合抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體的經螢光地標識的抗體以及對於T細胞與B細胞具有專一性的經標識的抗體將所獲得的細胞染色,繼而FACS分析而被完成。
本發明的抗體可根據抗體辨識或專一性地結合的延長性第I型醣原神經脂質的抗原決定位(等)或部分(等)而被描述或載明。抗原決定位(等)可如在此所描述的{例如,藉由物理方法[諸如質譜法(mass spectrometry)]、醣類的組成分析(compositional analysis)、糖結合的分子、構形的抗原決定位(conformational epitopes)等等}而被載明。
本發明的抗體亦可根據交叉-反應度(cross-reactivity)而被描述或載明。結合延長性第I型醣原神經脂質之抗體[與延長性第I型醣原神經脂質具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%以及至少50%相同性(如使用此技藝已知的以及在此所描述的方法而被計算出)]亦被包括在本發明。
本發明的抗體亦可根據對於一感興趣的延長性第I型醣原神經脂質的結合親和力而被描述或載明。抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體可結合以一少於大約10-7
M、少於大約10-6
M,或少於大約10-5
M的KD
。在一感興趣的抗體中較高的結合親和力可以是有利的,諸如那些具有一自大約10-8
至大約10-15
M或更多、自大約10-8
至大約10-12
M、自大約10-9
至大約10-11
M,或者自大約10-3
至大約10-10
M的平衡解離常數(equilibrium dissociation constant)或RD
者。本發明亦提供如藉由此技藝已知的用以決定競爭結合的任何方法(例如,在此所描述的免疫分析法)所決定的競爭地抑制一抗體結合至本發明的一抗原決定位之抗體。在較佳的具體例中,抗體競爭地抑制結合至抗原決定位達至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%,或至少50%。
本發明亦包括包含有一感興趣的抗體的綴合物。該等綴合物包含有2個主要的組份:一感興趣的抗體以及一第二組份,該第二組份可以是一細胞-結合劑、一細胞毒性劑(cytotoxic agent)、一藥理學上的活性劑(pharmacologically active agent)、一藥物等等。
如此處所用的,術語“細胞-結合劑”意指一種專一性地辨識以及結合至一在細胞表面上的分子的試劑。因此,細胞-結合劑可以是一種結合一CD抗原、一病原體抗原(pathogen antigen)(諸如一病毒抗原)、一分化抗體(differentiation antigen)、一癌症抗原、一細胞-專一性抗原(cell-specific antigen)、一組織-專一性抗原、一Ig或Ig-類似的分子等等的細胞-結合劑。
細胞-結合劑可以是如目前已知的或成為已知的任何形式,並且包括胜肽、非-胜肽、醣類、核酸、配位子、受體等等,或它們的組合。細胞-結合劑可以是以一專一性或非專一性的方式結合一細胞的任何化合物。一般而言,該試劑可以是一抗體(特別地單株抗體)、淋巴激素(lymphokines)、激素(hormones)、生長因子、維生素、營養-輸送分子(nutrient-transport molecules)[諸如運鐵蛋白(transferrin)],或任何其他細胞-結合的分子或物質。
可被使用的細胞-結合劑的其他實例包括:多株抗體(polyclonal antibodies);單株抗體;以及抗體的片段(諸如Fab
、Fab
,、F(ab
,)2
以及Fv
片段)(Parham,J. Immunol. 131:2895-2902(1983);Spring etal.,J. Immunol. 113:470-478(1974);以及Nisonoff et al.,Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244(1960))。
第二組份亦可以是一細胞毒性劑(cytotoxic agent)。如此處所用的術語“細胞毒性劑”意指一降低或阻斷細胞的功能或生長和/或引起細胞的破壞之物質。因此,該細胞毒性劑可以是一紫杉醇(taxol)、一美登醇(maytansinoid)(諸如DM1或DM4、CC-1065或一CC-1065類似物)、一蓖麻毒蛋白(ricin)、一藥物、絲裂黴素C(mitomycin C)等等。在一些具體例中,該細胞毒性劑如與本發明的一綴合物的任何結合劑是直接地或經由一可切割的或不可切割的連接子而被共價地接附至一感興趣的抗體。
適合的美登醇的實例包括美登素醇(maytansinol)以及美登素醇類似物。美登醇抑制微管(microtubule)形成並且對於哺乳動物細胞有高度毒性的。
適合的美登素醇類似物的實例包括那些具有一經修飾的芳族環(aromatic ring)者以及那些具有在其他位置的修飾者。該等適合的美登醇被揭示在美國專利第4,424,219號、第4,256,746號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,362,663號、第4,364,866號、第4,450,254號、第4,322,348號、第4,371,533號、第6,333,410號、第5,475,092號、第5,585,499號以及第5,846,545號。
具有一經修飾的芳族環之適合的美登素醇的類似物的實例包括:(1)C-19-去氯(C-19-dechloro)(美國專利第4,256,746號)[例如,藉由安絲菌素P2(ansamitocin P2)的LAH還原而被製備];(2)C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4,361,650號以及第4,307,016號)[例如,藉由使用鏈絲菌屬(Streptomyces)或放線菌屬(Actinom ces)的去甲基作用(demethylation)或使用鋁氫化鋰(1ithium aluminum hydride,LAH)的去氯作用(dechlorination)而被製備];以及(3)C-20-去甲氧基(C-20-demethoxy),
具有其他位置的修飾之適合的美登素醇的類似物的實例包括:(1)C-9-SH(美國專利第4,424,219號)(藉由美登素醇與H2S或P2S5的反應而被製備);(2)C-14-烷氧基甲基(C-14-alkoxymethyl)(去甲氧基/CH2
OR)(美國專利第4,331,598號);(3)C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(acyloxymethyl)(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4,450,254號)[從土壤絲菌屬(Nocardia)而被製備];(4)C-15-羥基/醯氧基(acyloxy)(美國專利第4,364,866號)[藉由由鏈絲菌屬轉化(conversion)美登素醇而被製備];(5)C-15-甲氧基(美國專利第4,313,946號以及第4,315,929號)[被分離自滑桃樹(Trewia nudiflora)];(6)C-18-N-去甲基(美國專利第4,362,663號以及第4,322,348號)[藉由由鏈絲菌屬的美登素醇的去甲基作用而被製備];以及(7)4,5-去氧(4,5-deoxy)(美國專利第4,371,533號)[藉由美登素醇的三氯化鈦(titanium trichloride)/LAH還原而被製備]。
細胞毒性綴合物可藉由活體外的方法而被製備。為了連接一細胞毒性劑、藥物或前驅藥至抗體,通常地,一連接基團(linking group)被使用。適合的連接基團是此技藝已知的,並且包括二硫化物(disulfide)基團、硫醚(thioether)基團、不耐酸的基團(acid labile groups)、光不穩定性(photolabite)基團、不耐肽酶的基團(peptidase labile groups)以及不耐酯酶的基團(esterase labile groups)。例如,綴合物可使用一種二硫化物交換反應(disulfide exchange reaction)或藉由在感興趣的抗體與藥物或前驅藥之間形成一硫醚鍵而被建構。
被綴合至一感興趣的抗體的分子可以是一種具有一藥理學的活性的分子,諸如一藥物、諸如一小分子或一生物劑(biologic)。因此,該生物劑可以是,例如,一細胞激素(cytokine)。該分子可以是一前驅藥,諸如一藥物酯(drug ester)。該分子可以是一放射核種(radionuclide)。
如上面所討論的,本發明提供編碼如在此所揭示的一抗體或它的功能性變異體之經分離的核酸序列、包含有一編碼本發明的延長性第I型醣原神經脂質-結合多肽的核苷酸序列之載體建構物、包含有該一載體的宿主細胞以及用以生產結合延長性第I型醣原神經脂質的多肽的重組技術。
載體正常地含有此技藝已知的組份,並且通常包括,但不限於下面的一或多個:一單一序列、一複製的源點(origin of replication)、一啟動子、一聚A(polyA)序列、一或多個標記或選擇基因(selection genes)、促進和/或增強轉譯(translation)的序列、一增強子(enhancer)要素等等。因此,表現載體包括一被可操作地連結至該等適合的轉錄或轉譯的調節性核苷酸序列(諸如那些衍生自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲的基因者)。額外的調節性序列的實例包括:操縱子(operators)、mRNA核糖體結合位址(ribosomal binding sites)和/或控制轉錄與轉譯(諸如它們的起始以及終止)的其他適當的序列。當調節性序列與適當的多肽的核苷酸序列功能性地相關,核苷酸序列“被可操作地連結”。因此,若一啟動子核苷酸序列控制那個核苷酸序列的轉錄,該啟動子核苷酸序列是被可操作地連結至,例如,抗體重鏈序列。
此外,編碼沒有與抗體重和/或輕鏈序列自然地相關聯的適當的單一胜肽之序列可被併入至表現載體內。例如,一種關於一單一胜肽[分泌引導者(secretory leader)]的核苷酸序列可在架構中(in-frame)被融合至多肽序列,藉此抗體被分泌至近膜間隙(periplasmic space)或至培養基內。一在被意欲的宿主細胞中有功能的單一胜肽增強適當的抗體或它的部分的細胞外分泌(extracellular secretion)。涉及從細胞中分泌抗體的單一胜肽可從多肽中被切割。該等分泌信號的實例是熟知的並且包括,例如,那些被描述在美國專利第5,698,435號;第5,698,417號;以及第6,204,023號者。
載體可以是一質體、一單股或雙股的病毒載體、一單股或雙股的RNA或DNA噬菌體載體、一噬菌體質體(phagemid)、一黏接質體(cosmid)或一感興趣的轉殖基因的任何其他的載體。該等載體可藉由用以將DNA以及RNA導入至細胞內的熟知技術而被導入至細胞內作為聚核苷酸。載體(如果是噬菌體以及病毒的載體)亦可藉由用以感染(infection)以及轉導(transduction)的熟知技術而被導入至細胞內作為套裝的(packaged)或囊封的病毒(encapsulated virus)或一病毒-類似的顆粒。病毒的載體可以是複製完全的(replication competent)或複製不完全的(replication defective)。在後者的案例中,病毒的繁殖(propagation)通常將僅發生在補充宿主細胞並且使用複數個攜帶生產一顆粒所需的各種不同的病毒組份之載體。沒有細胞的轉譯系統(cell-free translation systems)亦可使用衍生自感興趣的現今DNA建構物的RNAs而被採用以生產蛋白質(參見,例如,WO 86/05807與WO 89/01036;以及美國專利第5,122,464號)。
本發明的抗體可從任何適合的宿主細胞中被表現。可用於本發明的宿主細胞的實例包括原核生物的(prokaryotic)、酵母菌或真核生物的細胞(eukaryotic cells),並且包括但不限於:微生物,諸如被轉形以含有感興趣的抗體編碼序列的重組的噬菌體(bacteriophage)DNA、質體DNA或黏接質體DNA表現載體之細菌[例如,大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(B. subtilis)、腸內桿菌屬(Enterobacter)、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、克留氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙氏桿菌屬(Salmonella)、鋸桿菌屬(Serratia)與志賀桿菌屬(Shigella),以及桿菌(Bacilli)、假單孢菌屬(Pseudomonas)與鏈絲菌屬(Streptomyces)];被轉形以含有抗體編碼序列的重組的酵母菌表現載體之酵母菌[例如,酵母菌屬(Saccharomyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、放線菌(Actinomycetes)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、念珠菌屬(Candida)、木黴屬(Trichoderma)、紅黴屬(Neurospora)以及絲狀真菌(filamentous fungi)[諸如紅黴屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)以及麴菌屬(Aspergillus)];被感染以含有抗體編碼序列的重組的病毒表現載體[例如桿狀病毒(Baculovirus)]之昆蟲細胞系統;被感染以重組的病毒表現載體[例如,花椰菜鑲嵌病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV);或菸草鑲嵌病毒(tobacco mosaic virus,TMV)]或被轉染以含有抗體編碼序列的重組的質體表現載體(例如,Ti質體)之植物細胞系統;或者隱藏含有衍生自哺乳動物細胞的基因組的啟動子[例如金屬硫蛋白質(metallothionein)啟動子]或自哺乳動物病毒的啟動子[例如,腺病毒晚期啟動子(Adenovirus late promoter);或痘瘡病毒(vaccinia virus)7.5K啟動子]的重組的表現建構物之哺乳動物細胞系統(例如,COS、CHO、BHK、293或3T3細胞)
供用於原核生物的宿主細胞中的表現載體通常包含有一或多個表現型可選擇的標記基因(phenotypic selectabie marker genes)。一表現型可選擇的標記基因是,例如,一種編碼一給予抗生素抗性(antibiotic resistance)或供應一自營性需求(autotrophic requirement)的蛋白質之基因。對於原核生物的宿主細胞有用的表現載體的實例包括那些衍生自商業上可獲得的載體者,諸如:pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden)、pGE Ml(Promega Biotec,Madison,WI)、pET(Novagen,Madison,WI)以及pRSET(Invitrogen,Carlsbad,CA)、一系列的載體(Studier,J Mol Biol 219:37(1991);以及Schoepfer,Gene 124:83(1993))。通常被用於重組的原核生物的宿主細胞表現載體的啟動子序列包括T7(Rosenberg et al.,Gene 56:125(1987))、β-內醯胺酶(β-lactamase)[青黴素酶(penicillinase)]、乳糖啟動子(Chang et al.,Nature 275:615(1978);以及Goeddel et al.,Nature 281:544(1979))、色胺酸(tryptophan,trp)啟動子系統(Goeddel et al.,Nucl Acids Res 8:4057(1980)),以及tac啟動子(Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(1990))。
酵母菌載體通常含有一複製的源點序列(origin of replication sequence),諸如,自一2μ酵母菌質體:一自動地複製的序列(autonomously replicating sequence,ARS)、一啟動子區域、關於聚腺苷酸化(polyadenylation)的序列、關於轉錄終止的序列以及一可選擇的標記基因。用於酵母菌載體的適合的啟動子序列包括,尤其,用於金屬硫蛋白質(metallothionein)、3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase)(Hitzeman et al.,J Biol Chem 255:2073(1980))或其他的醣解酵素(glycolytic enzymes)[諸如烯醇化酶(enolase)、甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)、己醣激酶(hexokinase)、丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase)、葡萄糖-6-異構酶(glucose-6-phosphate isomerase)、3-磷酸甘油酸變位酶(3-phosphoglycerate mutase)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、丙醣磷酸異構酶(triosephosphate isomerase)、磷酸葡萄糖異構酶(phosphoglucose isomerase)以及葡萄糖激酶(glucokinase)](Holland et al.,Biochem 17:4900(1978))的啟動子。供使用在酵母菌表現的其他適合的載體以及啟動子進一步被描述在Fleer et al.,Gene 107:285(1991)。用於酵母菌以及酵母菌轉形操作程序的其他適合的啟動子以及載體是此技藝所熟知的。酵母菌轉形操作程序是熟知的。一該操作程序是藉由Hinnen et al.,Proc Natl Acad Sci 75:1929(1978)[在一選擇性培養基中選擇Trp+
轉形體(transformants)]而被描述。
任何真核生物的細胞培養物[不管來自脊椎動物(vertebrate)或無脊椎動物(invertebrate)培養物]是可使用的。實例包括植物以及昆蟲細胞(Luckow et al.,Bio/Technology 6:47(1988);Miller et al.,Genetic Engineering,Setlow et al.,eds.,vol. 8,pp. 277-9,Plenum Publishing(1986);以及Maeda et al.,Nature 315:592(1985))。例如,桿狀病毒系統(baculovirus systems)可被用以生產異源蛋白質(heterologous proteins)。在一昆蟲系統,苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)可被使用作為一載體以表現外來基因。病毒生長在秋行軍蟲細胞(Spodoptera frugiperda cells)。抗體編碼序列可在一AcNPV啟動子[例如,多角體蛋白(polyhedrin)啟動子]的控制下而被選殖。其他已被鑑定的宿主包括斑蚊屬(Aedes)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)以及中國種家蠶(Bombyx mori)。各種不同的用以轉染的病毒株是公眾可獲得的,例如,AcNPV的L-1變異體以及中國種家蠶NPV的Bm-5菌株。再者,如此技藝已知的,棉(cotton)、玉米(corn)、馬鈴薯(potato)、大豆(soybean)、矮牽牛屬(petunia)、蕃茄(tomato)、藻類(algae)、浮萍(duckweed)以及菸草(tobacco)的植物細胞培養物亦可被利用作為宿主。
脊椎動物細胞以及脊椎動物細胞的繁殖(propagation)在培養(組織培養)上可以是一例行的操作程序,雖然苛求性細胞株(fastidious cell lines)會存在需要,例如,一具有獨特因子、餵養細胞(feeder cells)等等的特殊化培養基(specialized medium),參見Tissue Culture,Kruse et al.,eds.,Academic Press(1973)。有用的哺乳動物宿主細胞株的實例是猴腎臟(monkey kidney)、人類胎腎(human embryonic kidney)、幼倉鼠腎臟(baby hamster kidney)、中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO,Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77:4216(1980))、小鼠塞特利氏細胞(mouse Sertoli cell)、人類子宮頸癌(human cervical carcinoma)(例如,HeLa)、犬腎臟(canine kidney)、人類肺臟、人類肝臟、小鼠乳房腫瘤(mouse mammary tumor),以及NSO細胞。
宿主細胞被轉形以用於抗體生產的載體,並且被培育在含有生長因子、維生素、礦物質等等,以及適合於該等被使用的細胞與載體的誘導物(inducer)之傳統的營養培養基中。通常被使用的啟動子序列以及增強子序列是衍生自,例如,多瘤病毒(polyoma virus)、腺病毒2(Adenovirus 2)、猴病毒40(Simian virus 40,SV40)以及人類細胞巨大病毒(human cytomegalovirus,CMV)。衍生自SV40病毒的基因體的DNA序列可被使用以提供用以在一哺乳動物宿主細胞中表現一結構基因(structural gene)序列的其他基因要素(genetic elements),例如:SV40源點、早期以及晚期啟動子、增強子、剪接(splice)以及聚腺苷酸化(polyadenylation)位址。病毒的早期以及晚期啟動子是特別地有用的,因為這兩者容易從一病毒的基因體被獲得而作為一亦可含有一病毒的複製源點的片段。供用於哺乳動物宿主細胞的示範性表現載體是商業上可獲得的。
商業上可獲得的培養基[諸如Ham’s F10、最低基本培養基(Minimal Essential Medium,MEM)、RPMI-1640以及杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium,DMEM)]適合用於培養宿主細胞。此外,在Ham et al.,Meth Enzymol 58:44(1979)與Barnes et al.,Anal Biochem 102:255(1980),以及在美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,560,655號、第5,122,469號、第5,712,163號或第6,048,728中所描述的任何培養基可被使用作為一用於宿主細胞的培養基。那些培養基的任一者當需要時可被補充以激素和/或其他生長因子[諸如胰島素(insulin)、運鐵蛋白(transferrin)或表皮生長因子(epidermal growth factor)]、鹽類[諸如氯化物(chlorides)(諸如氯化鈉、氯化鈣或氯化鎂);以及磷酸鹽(phosphates)]、緩衝液(buffers)(諸如HEPES)、核苷酸[諸如腺苷(adenosine)以及胸腺嘧啶(thymidine)]、抗生素、微量元素(trace elements)(其可被定義為通常存在於微莫耳的(micromolar)範圍的最終濃度之無機化合物)以及葡萄糖或一等效的能量來源。任何其他必需的輔助物(supplements)可呈一適當的濃度而被包括作為一設計選擇。培養條件(諸如溫度、pH值以及類似之條件)是如此技藝已知適合用於細胞的並且能夠所欲的表現轉殖基因(transgene)。
感興趣的聚核苷酸可以被獲得,並且該等聚核苷酸的核苷酸序列藉由此技藝已知的任何方法而被決定。例如,若抗體的核苷酸序列是已知的,一編碼該抗體的聚核苷酸可從化學地合成的寡核苷酸(oligonucleotides)而被組合(例如,如被描述於Kutmeier et al.,Bio/Techniques 17:242(1994)),並且接而藉由,例如,PCR而擴增該等被接合的寡核苷酸。
另擇地,一編碼一抗體的聚核苷酸可從一表現相同的細胞的核酸而被產生。若一含有一編碼一特定抗體的核酸之選殖株(clone)不是可獲得的,但是該抗體分子的序列是已知的,則一編碼免疫球蛋白的核酸可從一適合的來源[諸如一存庫,它可以是一對於抗體-生產細胞(諸如被選擇以表現本發明的一抗體的融合瘤細胞)有專一性者]而被獲得。適合的引子可被構形用以PCR擴增。由PCR所產生的經擴增的核酸可接而使用此技藝已知的任何方法而被選殖至可複製的選殖載體內。
一旦抗體的核苷酸序列以及相對應的胺基酸序列被決定,抗體的核苷酸序列可使用此技藝已知用以操作核苷酸序列的方法[例如:重組DNA技術、定點突變(site directed mutagenesis)、PCR等等](參見,例如,Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(1990);以及Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998))而被操作俾以獲得在此所描述的感興趣的等效物以產生具有一不同的胺基酸序列[例如,產生胺基酸取代(substitutions)、刪除(deletions)和/或插入(insertions)]的抗體。
重和/輕鏈變異領域的胺基酸序列可藉由熟知的方法[例如,藉由比較其他重和輕鏈變異區域的已知胺基酸序列以決定序列高變異性(hypervariability)的區域]而被檢查以鑑定CDR’s的序列。一或多個的CDR’s可使用例行的重組DNA技術而被插入在框架區域內(例如,至人類框架區域內)以人類化一如在上所描述的非-人類抗體。藉由框架區域與一或多個CDR’s的組合所產生的感興趣的聚核苷酸編碼一專一性地結合延長性第I型醣原神經脂質或至少由此被辨識的碳水化合物抗原決定位(carbohydrate epitopes)以及結構的分子。例如,該等方法可被使用以製造一或多個參與一鏈內(intrachain)二硫鍵的半胱胺酸殘基(cysteine residues)的胺基酸取代或刪除,俾以產生缺少一或多個鏈內二硫鍵的抗體分子。
本發明的抗體或抗體片段可被使用以在活體外或活體內偵測在一生物樣品中的延長性第I型醣原神經脂質,以及因此表現延長性第I型醣原神經脂質的細胞。在一個具體例中,本發明的抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體被使用以決定在一組織或在衍生自該組織的細胞中的延長性第I型醣原神經脂質的存在以及位準。在組織或生物檢體(biopsy)中的延長性第I型醣原神經脂質的位準可,例如,在一使用本發明的抗體或抗體片段的免疫分析法中被決定。組織或它的生物檢體可被冷凍或固定。相同或其他的方法可被使用以決定延長性第I型醣原神經脂質的其他性質[諸如它的位準、細胞定位(cellular localization)等等]。
上面所述的方法可被使用,例如,以診斷在一已知具有或被預期具有一癌症的個體中的一癌症,其中在該病患中被測得的延長性第I型醣原神經脂質的位準被與一正常的參考個體或標準物(standard)所具者相比較。
本發明進一步提供被進一步標識供使用在研究或診斷的應用之單株抗體、人類化抗體以及它們的抗原決定位-結合片段。在一些具體例中,標識是,例如,一放射性標識(radiolabel)、一螢光團(fluorophore)、一發色團(chromophore)、一顯影劑(imaging agent)或一金屬離子。
一種用以診斷的方法亦被提供,其中該等被標識的抗體或它們的抗原決定位-結合片段被投藥給一被懷疑具有一癌症、關節炎(arthritis)、自體免疫疾病(autoimmune diseases)或者與延長性第I型醣原神經脂質表現和/或功能相關、所引起或有關聯的其他疾病之個體,並且在該個體的身體內之標記的分布被測量以及監測。
本發明的抗體或它的片段可被使用作為親和純化劑(affinity purification agents)。在那個方法中,抗體使用此技藝已知的方法而被固定在一固相(solid phase)[諸如一聚葡萄糖(dextran)或瓊脂糖、樹脂(resin)或濾紙(filter paper)]上。該被固定的抗體是與一含有的樣品接觸。
關於診斷應用,感興趣的抗體典型地被標識以一可偵測的部分(moiety)或標記(marker)。許多的標識(label)是可獲得的,它通常可被分群成下列種類:(a)放射性同位素(radioisotopes)(諸如36
S、14
C、125
I、3
H以及131
I)[抗體可使用一被描述在,例如,Current Protocols in Immunology,vol. 12,Coligen et al.,ed.,Wiley-Interscience,New York(1991)的技術而被標識以放射性同位素,並且放射性(radioactivity)可使用閃爍計數(scintillation counting)而被測量];(b)螢光標識(fluorescent labels){諸如稀土螯合物(rare earth chelates)[銪螯合物(europium chelates)]、螢光素(fluorescein)與它的衍生物、玫瑰紅(rhodamine)與它的衍生物、丹磺醯(dansyl)、麗絲胺(lissamine)、藻紅素(phycoerythrin)以及德州紅(Texas Red)},該等螢光標識可使用一被揭示在,例如,Current Protocols in Immunology(如上述)的技術而被綴合至抗體,其中螢光可使用一螢光計(fluorimeter)而被定量;以及(c)各種不同的酵素基質標識(enzyme substrate labels)是可獲得的(美國專利第4,275,149號提供一個回顧),該酵素通常催化一顯色基質(chromogenic substrate)的一化學改變,該改變可使用各種不同的技術而被測量,例如,該酵素可催化在一基質中的一顏色變化,該變化可被分光光度計地測量,或者酵素可改變該基質的螢光或化學發光(chemiluminescence)。用以定量一在螢光的變化的技術是已知的,例如,使用一亮度計(luminometer),或標識供給能量給一螢光受體(fluorescent acceptor)。酵素性標識的實例包括螢光素酶(luciferases)[例如,螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)以及細菌螢光素酶;美國專利第4,737,456號]、蟲螢光素(luciferin)、2,3-二氫呔二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)、蘋果酸去氫酶(malate dehydrogenase)、尿素酶(urease)、過氧化酶(peroxidase)[諸如:辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRPO)]、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)、溶菌酶(lysozyme)、醣氧化酶(saccharide oxidases)[例如,葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)、半乳糖氧化酶(galactose oxidase)以及葡萄糖-6-磷酸去氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)]、雜環氧化酶(heterocyclic oxidases)[諸如尿酸酶(uricase)以及黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)]、乳過氧化酶(lactoperoxidase)、微過氧化酶(microperoxidase)以及類似之物。用以綴合酵素至抗體的技術被描述在O’Sullivan et al.,Meth Enz,ed. Langone & Van Vunakis,Academic Press,New York,73(1981)。
當該等標識被使用,適合的基質是可獲得的,諸如:(i)對於辣根過氧化酶,以過氧化氫酶(hydrogen peroxidase)作為一基質,其中過氧化氫酶氧化一染料前驅物(dye precursor)[例如,正-酚基二胺(orthophenylene diamine,OPD)或3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽(3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine hydrochloride,TMB)];(ii)對於鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP),以p-硝基苯基磷酸(p-nitrophenyl phosphate)作為顯色基質;以及(iii)具有一顯色基質的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)[例如,p-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶(p-nitrophenyl-β-D-galactosidase)]或具有一螢光基質(fluorogenic substrate)的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)[諸如,4-甲基繖形基-β-D-半乳糖苷酶(4-methylumbelliferyl-β-D-galactosidase)]。
其他的酵素-基質組合是那些具有本技藝之技術者可獲得的。關於一個一般性回顧,參見美國專利第4,275,149號以及第4,318,980號。
有時候,標識被間接地綴合以抗體。例如,抗體可被綴合以生物素(biotin),並且在上面所提到的任何報導子(reporters)可被綴合以抗生物素蛋白(avidin)或反之亦然。生物素選擇性地結合至抗生物素蛋白並且因此,標識可以間接的方式而被綴合以抗體。各種不同的抗生物素蛋白是此技藝已知的。另擇地,為了達到標識的間接綴合,抗體可被綴合以一小的半抗原(hapten)[例如,地谷新(digoxin)],並且上面所提到的不同類型的標識或報導子之一者被綴合以一抗-地谷新抗體。因此,標識與抗體或突變形成的蛋白質(mutein)的間接綴合可使用一第二抗體而被達到。
在本發明的另一個具體例中,抗體不需要被標識,並且它的存在可使用一結合至該抗體的經標識的抗體(一二級抗體的另一種形式)而被偵測。
本發明的抗體可被採用在任何已知的分析方法,諸如競爭結合分析法(competitive binding assays)、直接與間接的夾心式分析法(sandwich assays),以及免疫組織化學法(immunohistochemistry)。Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques(CRC Press,Inc. 1987)。
競爭結合分析法依賴一經標識的標準品與測試樣品競爭對於與一限制數量的抗體結合的能力。抗原在測試樣品中的數量與適合被結合至抗體的標準品的數量是相反地成比例的。為了促進決定變成被結合的標準品的數量,抗體通常在競爭之前或之後被不溶解。因此,結合至抗體的標準品以及測試樣品可從保持未被結合的標準品以及測試樣品中被便利地分離。
夾心式分析法涉及兩種抗體的使用,各個抗體能夠結合至要被偵測的標的(target)的一不同的免疫原性部分(immunogenic portion)、決定位(determinant)或抗原決定位。在一夾心式分析法中,要被分析的測試樣品是藉由一被直接地或間接地固定在一固體支撐物(solid support)上的一級抗體而被結合,並且其後一直接地或間接地被標識的二級抗體結合至被結合的測試樣品,因此形成一不可溶的三-部分複合體(three-part complex),參見,例如,美國專利第4,376,110號。二級抗體可以自己被標識以一可偵測的部分(直接的夾心式分析法)或可以使用一抗-免疫球蛋白抗體或被標識以一可偵測的部分的結合對(binding pair)(例如,抗體/抗原、受體/配位子、酵素/基質)的其他適合的成員(間接的夾心式分析法)。例如,一種夾心式分析法的類型是一ELISA分析,在該案例中,可偵測的部分是一酵素。
關於免疫組織化學法(immunohistochemistry),細胞或組織樣品可以是新鮮的或冷凍的,或者可以被包埋在石蠟(paraffin)中並且以一防腐劑(preservative)[例如,諸如福馬林(formalin)]予以固定。
抗體亦可被用於活體內診斷分析。一般而言,抗體或它的變異體被標識以一放射性核苷酸(radionucleotide)(諸如111
In、99
Tc、14
C、131
I、3
H、32
P或35
S),藉此表現延長性第I型醣原神經脂質的位址可使用,例如,免疫閃爍攝影術(immunoscintigraphy)以及一γ照相機(gamma camera)而被定位。
本發明亦包括套組(kits),例如,包含有一抗體、它的片段、同源物、它的衍生物等等(諸如一被標識的或細胞毒性的綴合物)以及針對該抗體、供殺死或標識特定的細胞類型的綴合物等等的使用的指引(instructions)。該等指引可包括用以在活體外(in vitro)、活體內(in vivo)或活體外(ex vivo)使用該抗體、綴合物等等的指導。該抗體可以是呈液體形式或如一固體(通常被凍乾的)。套組可含有適合的其他試劑,諸如一緩衝液、一重組溶液(reconstituting solution)以及對於意欲的使用必需的其他成分。呈預定數量的試劑與針對它的使用指引(諸如,一種用以執行一診斷分析的治療性使用)的一經包裝的組合被預期。當抗體被標識以,諸如,一酵素,套組可含有該酵素所需的基質以及輔因子(cofactors)[例如,一提供可偵測的發色團(chromophore)或螢光團(f1uorophore)的基質前驅物]。此外,其他添加物(additives)可被包括,諸如安定劑(stabilizers)、緩衝液[例如,一阻斷緩衝液(block buffer)或溶解緩衝液(lysis buffer)]以及類似之物。各種不同的試劑的相關數量可被改變以提供一試劑的一溶液的濃縮物(concentrates),這提供使用者彈性(flexibility)、節省空間、節省試劑等等。試劑可有如乾燥粉末(通常被凍乾的)[包括賦形劑(excipients),它在溶解上提供一試劑溶液具有適當的濃度]而被提供。
本發明的抗體可被使用以治療一哺乳動物。在一個具體例中,例如,為了獲得臨床前數據,感興趣的抗體或等效物被投藥給一非人類哺乳動物。要被治療的示範性非人類哺乳動物(其中臨床前研究被執行)包括非人靈長類(nonhuman primates)、狗、貓、齧齒動物(rodents)以及其他哺乳動物。該等哺乳動物可被建立用於要被治療以抗體的一疾病的動物模型(animal models)或可被使用以研究感興趣的抗體的毒性。在各個的那些具體例中,劑量累增研究(dose escalation studies)可在哺乳動物中被執行。感興趣的產物也可在那些動物中具有治療用途。
一具有或不具有一第二組份(諸如一被綴合至抗體的治療部分)的抗體單獨或組合以一毒性因子(等)可被使用作為一治療劑(therapeutic)。本發明是針對用以治療一延長性第I型醣原神經脂質-調節或關聯性疾病、病症或病況的以抗體為基礎的治療,該治療涉及投藥本發明的抗體給一動物、一哺乳動物或一人類。該動物或個體可以是一需要一特定治療的哺乳動物,諸如一已被診斷具有一特定疾病(例如,一與延長性第I型醣原神經脂質相關或與不正常的延長性第I型鏈結構表現以及功能有關聯的疾病)的哺乳動物。針對對抗延長性第I型醣原神經脂質的抗體是有用的,例如,用於例如癌症以及自體免疫病症(autoimmune disorders)的預防(prophylaxis)或治療。例如,藉由投藥一治療上可接受的劑量的本發明的一抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體、或多數的本發明的抗體或它們的等效物(equivalents)的一雞尾酒法(cocktail)、或組合以不同來源的其他抗體;或組合以一非-抗體藥物{諸如,一抗-發炎藥物、一細胞毒性劑、一抗生素等等[諸如一鉑藥物(platinum drug)、胺甲碟呤(methotrexate)]},疾病症狀在被治療的哺乳動物(特別地人類)中可被改善或預防。
本發明的治療性化合物包括,但不限於:本發明的抗體(包括如在此所描述的它們的片段、類似物、等效物以及衍生物)以及編碼如在此所描述的本發明的抗體(包括它們的片段、類似物以及衍生物)的核酸以及如在此所描述的抗-抗-遺傳性型抗體(anti-idiotypic antibodies)。本發明的抗體可被使用以治療、抑制或預防與延長性第I型醣原神經脂質的不正常表現和/或活性有關聯的疾病(diseases)、病症(disorders)或病況(包括,但不限於任何一或多個在此所描述的疾病、病症或病況)。與延長性第I型醣原神經脂質的不正常表現和/或活性有關聯的疾病、病症或病況的治療和/或預防包括,但不限於:減輕至少一種與那些疾病、病症或病況有關聯的症狀。本發明的抗體可被提供在此技藝已知的或如在此所描述的藥學上可接受的組成物(pharmaceutically acceptable compositions)。術語“生理學上可接受的(physiologically acceptable)”、“藥理學上可接受的(pharmacologically acceptable)”、“藥學上可接受的”等等意指由聯邦或一州政府的一管理機構(regulatory agency)所核准或者被列示在美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他公認的藥典供使用在動物以及更特別地在人類。
抗-延長性第I型醣原神經脂質抗體可以任何可接受的方式而被投藥給一哺乳動物。導入的方法包括,但不限於:非經腸道的(parenteral)、皮下的(subcutaneous)、腹膜內的(intraperitoneal)、肺內的(intrapulmonary)、鼻內的(intranasal)、硬膜外的(epidural)、吸入(inhalation)以及口服的(oral)途徑,並且若欲用於免疫抑制性治療(immunosuppressive treatment),病灶內的投藥(intralesional administration)。非經腸道的滴注(parenteral infusions)包括肌肉內的(intramuscular)、皮內的(intradermal)、靜脈內的(intravenous)、動脈內的(intraarterial)或腹膜內的投藥。抗體或組成物可藉由任何便利的途徑[例如,藉由滴注或巨量注射(bolus injection)、藉由經由上皮的(epithelial)或黏膜與皮膚的內襯(mucocutaneous linings)的吸收]而被投藥,並且可與其他生物活性劑(biologically active agents)一起被投藥。投藥可以是全身的(systemic)或局部的(local)。此外,所欲的是藉由任何適合的途徑將本發明的治療性抗體或組成物導入至中樞神經系統(central nervous system)內,這些途徑包括腦室內的(intraventricular)以及椎管內的注射(intrathecal injection);腦室內的注射可藉由一例如被附接至一儲庫(reservoir)[諸如一歐麥雅儲庫(Ommaya reservoir)]的腦室內的導管(intraventricular catheter)而被促進。此外,抗體可藉由脈衝滴注(pulse infusion)(特別地以抗體的遞減劑量)而被適當地投藥。較佳地給藥是藉由注射(較佳地靜脈內的或皮下的注射)而被提供,一部分視投藥是否是短暫的或慢性的而定。
各種不同的其他輸送系統(delivery systems)是已知的並且可被使用以投藥本發明的抗體,包括,例如:囊封(encapsulation)在脂質體(liposomes)、微顆粒(microparticles)、微膠囊(microcapsules)等等(參見Langer,Science 249:1527(1990));在一脂質體、顆粒、膠囊等等上表現感興趣的一抗體、它的突變形成的蛋白質(mutein)或它的抗原-結合部分以產生一標靶載劑(targeting vehicle)(Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer;Lopez-Berestein et al.,eds.,p.353-365(1989);以及Lopez-Berestein,ibid.,p.317-327);能夠表現化合物的重組型細胞(參見,例如,Wu et al.,J Biol Chem 262:4429(1987));建構一核酸作為一反轉錄病毒的(retroviral)或其他載體的部分;等等。
活性成分亦可,例如,藉由凝聚技術(coascervation techniques)或藉由界面聚合(interfacial polymerization)而被捕獲在一被製備的微膠囊(例如,分別為羥基甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)或明膠-微膠囊(gelatin-microcapsule)以及聚-甲基丙烯酸甲酯微膠囊[poly-(methylmethacylate)microcapsule]}、在膠體藥物輸送系統(colloidal drug delivery systems)[例如,脂質體、白蛋白微球體(albumin microspheres)、微乳化液(microemulsions)、奈米顆粒(nanoparticles)以及奈米膠囊(nanocapsules)]或在微乳化液。該等技術被揭示在Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,A. Osal,Ed.(1980)。當脂質體或顆粒表現一感興趣的抗體,任何各種不同的化合物(諸如:一無抗體藥物、小分子藥物等等)可被攜帶在脂質體。本發明的抗體因此可作為一標靶功能。
肺的投藥亦可被採用,例如,藉由使用一吸入劑(inhaler)或噴霧器(nebulizer),以及具有一氣溶膠化試劑(aerosolizing agent)的配方。抗體亦可呈一乾粉組成物的形式而被投藥至一病患的肺內,參見,例如,美國專利第6,514,496號。
在一個特殊的具體例中,所欲的是局部地投藥本發明的治療性抗體或組成物至需要治療的區域;那可藉由下列而被達成,例如,且不作為限制:局部滴注、局部應用、藉由注射、藉由一導管(catheter)、藉由一栓劑(suppository)或藉由一植入物(implant),該植入物是一多孔的、無孔的或凝膠狀的材料(gelatinous material),包括膜(membranes)[諸如矽膠膜或纖維(silastic membranes or fibers)]。較佳地,當投藥本發明的一抗體,小心使用蛋白質不吸收或吸收的材料。
在又另一具體例中,抗體可在一經控制的釋放系統(controlled release system)中被輸送。在一個具體例中,一泵(pump)可被使用(參見Langer,Science 249:1527(1990);Sefton,CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201(1987);Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980);以及Saudek et al.,N Engl J Med 321:574(1989))。在另一具體例中,聚合的材料可被使用(參見Medical Applications of Controlled Release,Langer et al.,eds.,CRC Press(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen et al.,eds.,Wiley(1984);Ranger et al.,J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61(1983);亦參見Levy et al.,Science 228:190(1985);During et al.,Ann Neurol 25:351(1989);以及Howard et al.,J Neurosurg 71:105(1989))。在又另一具體例中,一經控制的釋放系統可被放置接近治療的標的。
持續-釋放的製備物(Sustained-release preparations)可被製備。持續-釋放的製備物的適合的實例包括:含有抗體的固體疏水性聚合物的半滲透基質(semi-permeable matrices),其中基質是呈被成型的物品(shaped articles)的形式,例如,薄膜(films)或基質。持續-釋放的基質(sustained-release matrices)的實例包括聚酯(polyesters)、水凝膠(hydrogels){例如,聚(2-羥基甲基丙烯酸乙酯)[poly(2-hydroxyethylmethacrylate)]、聚(乙烯醇)[poly(vinylalcohol)]}、聚乳酸交酯(polylactides)(美國專利第3,773,919號)、L-聚麩胺酸(L-glutamic acid)與乙基-L-麩胺酸(ethyl-L-glutamate)的共聚物(copolymers)、非-可降解的乙烯-醋酸乙烯(ethylene-vinyl acetate)、可降解的乳酸-羥乙酸共聚物(lactic acid-glycolic acid copolymers)(諸如,由乳酸-羥乙酸共聚物所組成的可注射的微球體)以及聚-D-(-)-3-羥基丁酸[poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid]。雖然聚合物(諸如乙烯-醋酸乙烯以及乳酸-羥乙酸)能夠釋放分子歷時超過100天,某些水凝膠釋放蛋白質歷時較短的時間週期。合理的策略可視涉及的機制而被想出用於安定作用(stabilization)。例如,若聚集機制(aggregation mechanism)被發現是經由硫-二硫化物交換(thio-disulfide interchange)的分子間的S-S鍵形成,安定作用可藉由修飾巰基(sulfhydryl)殘基、從酸性溶液凍乾、控制水分含量(moisture content)、使用適當的添加劑、胺基酸取代(amino acid substitution),以及發展特殊的聚合物基質組成物而被達成。
多肽或抗體的治療性配方可藉由混合具有所欲的純度程度的多肽與在此技藝中典型地被採用的選擇性的“藥學上可接受的”載體(carriers)、稀釋劑(diluents)、賦形劑(excipients)或安定劑(stabilizers)[亦即,緩衝劑(buffering agents)、安定劑(stabilizing agents)、防腐劑(preservatives)、等張化劑(isotonifiers)、非-離子性清潔劑(non-ionic detergents)、抗氧化劑(antioxidants)以及其他混雜的添加物(miscellaneous additives)]而被製備用以儲存作為凍乾配方或水性溶液,參見Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th ed.,Osol,ed. (1980)。該等添加物在被採用的劑量以及濃度上通常對於接受者(recipients)是無毒的,因此,賦形劑、稀釋劑、載體等等示藥學上可接受的。
一“經分離的”或“經純化的”抗體是實質上沒有來自蛋白質衍生的細胞或組織來源或培養基的細胞物質(cellular material)或其他污染的蛋白質(contaminating proteins),或者當被化學地合成時,實質上沒有化學前驅物或其他化學品。術語“實質上沒有細胞物質”包括一抗體的製備物(preparations),其中多肽/蛋白質從抗體被分離或重組地生產的細胞的細胞組份中被分離出。因此,一實質上沒有細胞物質的抗體包括具有少於大約30%、20%、10%、5%、2.5%或1%(以乾重計)的污染的蛋白質或者細胞的或次細胞的物質(subcellular material)的抗體的製備物。當抗體被重組地生產,亦較佳地是實質上沒有培養基(culture medium)(亦即培養基表現少於大約20%、10%、5%、2.5%或1%的蛋白質製備物的體積)。當抗體藉由化學合成而被生產,較佳地是實質上沒有化學前驅物或其他化學品以及試劑(亦即,感興趣的抗體從涉及蛋白質的合成的化學前驅物或其他化學品中被分離出)。因此,該等抗體的製備物具有少於大約30%、20%、10%、5%或1%(以乾重計)的除了感興趣的抗體的化學前驅物或化合物。在本發明的一個較佳具體例中,抗體被分離或純化。
如此處所用的,片語“低至無法偵測的聚集(aggregation)的位準”意指當藉由,例如,高效能尺寸排除層析法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)來測量時,樣品含有不超過5%、不超過4%、不超過3%、不超過2%、不超過1%以及通常不超過0.5%(以重量計的蛋白質)的抗體或它的變異體的聚集[此即,二或多個抗體分子或它們的變異體接合(joined)或結合(coalesced)在一起]。
如此處所用的,術語“低至無法偵測的片段化(fragmentation)的位準”意指樣品含有相當於或超過80%、85%、90%、95%、98%或99%的完整抗體分子或它的變異體[例如,當藉由HPSEC來測定時在一單一波峰中,或者藉由,例如,經還原的毛細管凝膠電泳(reduced capillary gel electrophoresis,rCGE)時在二個(2)波峰(重鏈以及輕鏈)中的總蛋白質]並且不含有其他各個具有超過5%、超過4%、超過3%、超過2%、超過1%或超過0.5%的總蛋白質的單一波峰。如此處所用的,rCGE意指在足以還原在一抗體或抗體-類型或衍生的分子中的二硫鍵的還原條件下的毛細管凝膠電泳。
本發明提供用以製備抗體或它的延長性第I型醣原神經脂質-結合片段的液體配方之方法,該方法包含有使用,例如,一具有適當的分子量(mw)截斷(cutoff)(例如,30kD截斷針對它的F(ab’)2
片段;以及10kD截斷針對它的Fab
片段)的半透膜(semi-permeable membrane)來濃縮經純化的抗體的一分離部分(fraction)至一大約15mg/ml、大約20mg/ml、大約30mg/ml、大約40mg/ml、大約50mg/ml、大約60mg/ml、大約70mg/ml、大約80mg/ml、大約90mg/ml、大約100mg/ml、大約200mg/ml、大約250mg/ml、大約300mg/ml或更多的最終濃度,以及選擇性地使用相同的膜來滲濾(diafiltering)該經濃縮的抗體分離部分至該配方緩衝液內。
此外,本發明亦包含在活體內可具有被改善的半衰期的感興趣的產物之安定的液體配方。因此,感興趣的抗體在一個體(較佳地一人類)中具有一大於3天、大於7天、大於10天、大於15天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月、大於5個月或更多的半衰期。
如此處所用的,術語“安定性”以及“安定的”在一種含有一延長性第I型醣原神經脂質抗體或它的結合片段之液體配方的背景中意指在既定的製造、製備、輸送以及儲存條件下,在配方中的抗體或它的抗體-結合片段對於熱的(thermal)以及化學的不摺疊(unfolding)、聚集、降解或片段化的抗性(resistance)。本發明的“安定的”配方在既定的製造、製備、輸送以及儲存條件下,保有相同於或超過80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%的生物活性。該抗體製備物的安定性可在被選擇的儲存條件(有如設計選擇)下相較於一參考物(reference)歷時一預設的時間期間,藉由對於那些熟習此技藝者而言係為已知的方法[包括,但不限於,rCGE、十二烷基硫酸鈉凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)以及HPSEC],依據聚集、降解或片段化的程度而被評估。
本發明包含在一於醫師或實驗室的辦公室所發現的商業冰箱或冷凍庫中被發現的溫度(諸如自大約-20℃至大約5℃)上具有安定性的液體配方,該安定性為了儲存目的(諸如,歷時大約60天、歷時大約120天、歷時大約180天、歷時大約1年、歷時大約2年或更多)藉由,例如,高效能尺寸排除層析法(HPSEC)而被評估。本發明的液體配方在使用前在室溫下歷時至少一些小時(諸如大約1小時、大約2小時或大約3小時)如藉由,例如,HSPEC而被評估亦展現安定性。
術語“載體”意指一稀釋劑(diluent)、佐劑(adjuvant)、賦形劑或載劑(vehicle),其與治療劑(therapeutic)被投藥。該等生理學的載體可以是無菌液體,諸如水以及油[包括那些石油、動物、蔬菜或合成來源的油,諸如花生油(peanut oil)、大豆油(soybean oil)、礦物油(mineral oil)、芝麻油(sesame oil)以及類似之物]。當藥學組成物被靜脈內投藥時,水是一適合的載體(carrier)。鹽水溶液與水性右旋糖(dextrose)以及甘油(glycerol)溶液可被採用作為液體載體(特別地用於可注射的溶液)。適合的藥學賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、明膠、麥芽(malt)、米、麵粉(flour)、白堊(chalk)、矽膠(silica gel)、硬脂酸鈉(sodium stearate)、單硬酯酸甘油酯(glycerol monostearate)、滑石(talc)、氯化鈉、經乾燥的脫脂乳(dried skim milk)、甘油、丙二醇(propylene glycol)、水、乙醇以及類似之物。組成物(若所欲的)亦可含有較小數量的濕潤(wetting)或乳化劑(emulsifying agents),或pH緩衝劑。該組成物可採溶液、懸浮液(suspensions)、乳化液(emulsions)、錠劑(tablets)、丸劑(pills)、膠囊(capsules)、粉末(powders)、持續釋放的配方(sustained-release formulations)、儲存處(depots)以及類似之物的形式。組成物可與傳統的結合劑(binders)以及載體[諸如三酸甘油酯(triglycerides)]而被配方作為一栓劑。口服的配方可包括標準的載體[諸如藥學等級(pharmaceutical grades)的甘露糖醇(mannitol)、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂(magnesium stearate)、糖精鈉(sodium saccharine)、纖維素、碳酸鎂(magnesium carbonate)等]、調味劑(flavorants)、著色劑(colorants)、氣味劑(odorants)等等。適合的載體的實例被描述在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Martin。該等組成物將含有一有效數量的抗體(較佳地呈純化的形式)以及一適合數量的載體,藉此提供用以適當的投藥給病患的形式。如此技藝已知的,配方將被建構以適合投藥的模式。
緩衝劑(buffering agents)幫助維持pH值在一接近生理條件或有助於抗體安定性的條件的範圍內。緩衝液較佳地存在於一自大約2mM至大約50mM的範圍內的濃度。供使用在本發明的適合的緩衝劑包括有機的以及無機的酸這兩者以及它們的鹽類,諸如,例如,檸檬酸鹽緩衝液(citrate buffers)[例如,檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物(monosodium citrate-disodium citrate mixture)、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物(citric acid-trisodium citrate mixture)、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等]、琥珀酸鹽緩衝液(succinate buffers)[例如,琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等]、酒石酸鹽緩衝液(tartrate buffers)(例如,酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、延胡索酸鹽緩衝液(fumarate buffers)(例如,延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸一鈉-延胡索酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩衝液(gluconate buffers)(例如,葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝液(oxalate buffers)(例如,草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝液(lactate buffers)(例如,乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)以及醋酸鹽緩衝液(acetate buffers)(例如,醋酸-醋酸鈉混合物、醋酸-氫氧化鈉混合物等)。磷酸鹽緩衝液(phosphate buffers)、碳酸鹽緩衝液(carbonate buffers)、組胺酸緩衝液(histidine buffers)、三甲基胺鹽類(trimethylamine salts)(諸如Tris)、HEPES以及其他該等已知的緩衝液可被使用。
防腐劑可被添加以阻礙微生物的生長,並且可在自大約0.2%至大約1%(w/v)的範圍內的數量而被添加。供使用於本發明的適合的防腐劑包括酚(phenol)、苯甲醇(benzyl alcohol)、m-甲酚(m-cresol)、對羥苯甲酸甲酯(methyl paraben)、對羥苯甲酸丙酯(propyl paraben)、十八基二甲基苄基銨氯化物(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、苯二甲烴銨鹵化物(benzylkonium halides)[例如,氯化物、溴化物(bromide)以及碘化物(iodide)]、六羥季銨氯化物(hexamethonium chloride)、對羥苯甲酸烷酯(alkyl parabens),諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚(catechol)、苯二酚(resorcinol)、環己醇(cyclohexanol)以及3-戊醇(3-pentanol)。
等張化劑(isotonicifiers)是存在以確保本發明的液體組成物的生理等張性(physiological isotonicity),並且包括多元糖醇(polhydric sugar alcohols),諸如,三元的(trihydric)或高級的糖醇(higher sugar alcohols)[諸如甘油(glycerin)、赤藻糖醇(erythritol)、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇(xylitol)、山梨糖醇(sorbitol)以及甘露糖醇(mannitol)]。考量其他成份的相關數量,多元醇(polyhydric alcohols)可存在在一介於大約0.1%至大約25%(以重量計)、較佳地大約1%至大約5%之間的數量。
安定劑意指一廣大種類的賦形劑,它在功能上可自一增容劑(bulking agents)至一溶解治療的試劑或幫助預防變性(denaturation)或附著至容器壁的添加劑的範圍內。典型的安定劑可以是多元糖醇;胺基酸,諸如精胺酸(arginine)、離胺酸(lysine)、甘胺酸(glycine)、麩醯胺酸(glutamine)、天冬醯胺酸(asparagine)、組胺酸(histidine)、丙胺酸(alanine)、鳥胺酸(ornithine)、L-白胺酸(L-leucine)、2-苯丙胺酸(2-phenylalanine)、麩胺酸(glutamic acid)、蘇胺酸(threonine)等;有機糖(organic sugars)或糖醇(sugar alcohols),諸如乳糖、海藻糖(trehalose)、水蘇糖(stachyose)、阿拉伯糖醇、赤藻糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇(ribitol)、肌醇(myoinositol)、半乳糖醇(galactitol)、甘油以及類似之物[包括環多元醇(cyclitols),諸如肌醇(inositol)];聚乙二醇(polyethylene glycol);胺基酸聚合物;含硫的還原劑(sulfur containing reducing agents),諸如尿素(urea)、麩胱甘肽(glutathione)、硫辛酸(thioctic acid)、巰乙酸鈉(sodium thioglycolate)、硫甘油(thioglycerol)、α-單硫甘油(α-monothioglycerol)以及硫代硫酸鈉(sodium thiosulfate);低分子量的多肽(亦即,<10個殘基);蛋白質,諸如人類血清白蛋白(human serum albumin)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin)、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物(hydrophilic polymers),諸如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone);醣類(saccharides),單醣(monosaccharides),諸如木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、果糖(fructose)、葡萄糖;雙醣(disaccharides),諸如乳糖、麥芽糖以及蔗糖;三醣(trisaccharides), 諸如棉子糖(raffinose);多醣(polysaccharides),諸如聚葡萄糖,等等。安定劑可存在於每部分的活性蛋白質自大約0.1至大約10,000w/w的範圍內。
額外的混雜的賦形劑可包括增容劑(bulking agents)(例如,瓊脂、明膠、澱粉等等)、螯合劑(chelating agents)(例如,EDTA)、抗氧化劑[例如,抗壞血酸(ascorbic acid)、甲硫胺酸(methionine)或維生素E]以及共溶劑(cosolvents)。
如此處所用的,術語“介面活性劑(surfactant)”意指具有兩親媒性結構(amphipathic structures)的有機物質,換句話說,是由相對的溶解度趨勢(solubility tendencies)的基團[典型地一油可溶的烴鏈(hydrocarbon chain)以及一水可溶的離子基團]所組成。介面活性劑可視表面活性部分的電荷(charge)而被分類成陰離子的(anionic)、陽離子的(cationic)以及非離子性(nonionic)介面活性劑。介面活性劑常常被使用作為用於如在此所討論的那些各種不同的藥學組成物以及生物材料的製備物之濕潤(wetting)、乳化(emulsifying)、溶解(solubilizing)以及分散劑(dispersing agents)。
非離子性介面活性劑或清潔劑(detergents)[亦已知為“濕潤劑(wetting agents)”]可被添加俾以幫助溶解治療的試劑(therapeutic agent),以及保護治療性蛋白質對抗攪拌誘發的聚集(agitation-induced aggregation),其亦容許配方被暴露至剪力表面應力(shear surface stresses)而沒有引起蛋白質的變性(denaturation)。適合的非離子性介面活性劑包括聚山梨醇酯(polysorbates)(20、80等)、polyoxamers(184、188等)、多元醇(polyols)以及聚氧乙烯去水山梨醇單醚(polyoxyethylene sorbitan monoethers)(,等)。非離子性介面活性劑可存在於一大約0.05mg/ml至大約1.0mg/ml,較佳地大約0.07mg/ml至大約0.2mg/ml的範圍內。
如此處所用的,術語“無機鹽類”意指任何起因於藉由一金屬或一作用像一金屬的基團替代部分或所有的酸性氫(acid hydrogen)或一酸之不含有碳的化合物,並且在藥學組成物以及生物材料的製備物中常常被使用作為一滲透度調整化合物(tonicity adjusting compound)。最常見的無機鹽類是NaCl、KCl、NaH2
PO4
等。
本發明提供一具有一pH值在自大約5.0至大約7.0、或大約5.5至6.5、或大約5.8至大約6.2,或大約6.0的範圍內的抗-延長性第I型醣原神經脂質-結合化合物或它的片段的液體配方。
此處的配方亦可含有超過一種對於要被治療的特定指示(indication)必需的活性化合物,較佳地那些具有不會不利地互相影響的互補活性者。例如,所欲的是進一步提供一免疫抑制劑(immunosuppressive agent)。該等分子適當地組合存在在對於意欲的目的有效的數量。該配方亦可含有其他的藥物或一小分子、一藥理試劑(pharmacologic agent),諸如一抗-腫瘤藥物(anti-neoplastic drug)[諸如,順鉑(cisplatin)]。
術語“小分子”以及類似的術語包括,但不限於:胜肽、胜肽模擬物(peptidomimetics)、胺基酸、胺基酸類似物、有機化合物、藥理學上的活性劑(pharmacologically active agents)(諸如藥物)、聚核苷酸、聚核苷酸類似物、核苷酸、核苷酸類似物、具有一分子量少於大約每莫耳10,000克的有機或無機的化合物[亦即,包括異有機的(heterorganic)和/或有機金屬化合物(organometallic compounds)]、具有一分子量少於大約每莫耳5,000克的有機或無機的化合物、具有一分子量少於大約每莫耳1,000克的有機或無機的化合物、具有一分子量少於大約每莫耳500克的有機或無機的化合物,與鹽類、酯以及該等化合物的其他藥學上可接受的形式。
因此,在癌症的案例中,本發明的抗體可被單獨或組合以其他類型的癌症治療(cancer treatments)而被投藥,這些癌症治療包括傳統的化學治療劑(chemotherapeutic agents)[太平洋紫杉醇(paclitaxel)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)以及多索如必辛(doxorubicin)]、抗-EGFR劑[吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)以及西妥昔單抗(cetuximab)]、抗-血管生成劑(anti-angiogenesis agents)[貝伐珠單抗(bevacizumab)以及舒尼替尼(sunitinib)],以及免疫調節劑(immunomodulating agents)[諸如干擾素-α(interferon-α)以及沙利竇邁(thalidomide)]。
如此處所用的,術語“治療的試劑(therapeutic agent)”以及“治療的試劑(therapeutic agents)”意指可被使用在治療、處理或改善一與異常的延長性第I型醣原神經脂質表現和一般代謝以及活性有關聯的疾病(disease)、病症(disorder)、病(malady)以及類似之疾病的任何試劑(等)。亦被包括的是在治療一與異常的延長性第I型醣原神經脂質表現、代謝以及活性有關聯的病症等等上具有一藥理效用(pharmacologic effect)的已知的化合物。
抗體或變異體選擇性地被配方以一或多個現在被使用以預防或治療有問題的病症之試劑。該等其他的試劑的有效數量視存在於配方中的抗體的數量、病症的類型或治療以及上面所討論的其他因素而定。這些通常被使用在相同的劑量,並且具有如在上面所使用的投藥途徑或大約自1至99%的迄今所採用的劑量。
要被使用在活體內投藥的配方必須是無菌的。那可以藉由,例如,經由無菌的濾膜(filtration membranes)過濾而被完成。例如,本發明的液體配方可藉由使用一為0.2μm或一為0.22μm的濾膜過濾而被滅菌。
此外,本發明的抗體可被綴合至各種不同的效應子分子(effector molecules),諸如異種多肽(heterologous polypeptides)、藥物、放射性核苷酸(radionucleotides)或毒素(參見,例如,WO 92/08495;WO 91/14438;WO 89/12624;美國專利第5,314,995號;以及EPO 396,387)。一抗體或它的片段可被綴合至一治療的部分,諸如一細胞毒素(cytotoxin)[例如,一細胞生長抑制的(cytostatic)或殺細胞的試劑(cytocidal agent)]、一治療的試劑或一放射性金屬離子[例如,α射極(α emitters)(諸如,例如,213
Bi)]。一細胞毒素或細胞毒性劑(cytotoxic agent)包括對細胞有害的任何試劑。實例包括紫杉醇(paclitaxol)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙啶(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、多索如必辛(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基蒽二酮(dihydroxy anthracenedione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮(l-dehydrotestosterone)、糖皮質素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普潘諾爾(propranolol)與嘌呤黴素(puromycin)以及它們的類似物或同源物。治療的試劑包括,但不限於:抗代謝物(antimetabolites)[例如,胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)以及氮烯咪胺(decarbazine)]、烷基化試劑(alkylating agents){例如,氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯丙胺酸氮芥(melphalan)、卡莫司汀(carmustine,BSNU)與洛莫司汀(lomustine,CCNU)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、硫酸布他卡因(busulfan)、二溴甘露糖醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)以及順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑[cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)cisplatin]}、蒽環黴素(anthracyclines)[例如,柔紅黴素(daunorubicin)、道諾黴素(daunomycin)以及多索如必辛(doxorubicin)]、抗生素[例如,更生黴素(dactinomycin)、放線菌素(actinomycin)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)以及安曲黴素(anthramycin,AMC)],以及抗-有絲分裂劑(anti-mitotic agents)[例如,長春新鹼(vincristine)以及長春鹼(vinblastine)]。
為了延長一抗體在活體內的血清循環(serum circulation),各種不同的技術可被使用。例如,惰性聚合物分子(inert polymer molecules)[諸如高分子量的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)]可使用或不使用一多功能的連接子經由位址-專一性綴合PEG至抗體的的N-端或C-端或者經由存在於離胺酸殘基上的ε-胺基基團(ε-amino groups)而被接附至一抗體。導致生物活性的最小損失之線性或分支的聚合物衍生化(polymer derivatization)可被使用。綴合的程度可藉由SDS-PAGE以及質譜法(mass spectrometry)而被緊密地監控以確保適當的綴合PEG分子至該等抗體。未被反應的PEG可藉由尺寸排除(size-exclusion)或藉由離子交換層析法(ion exchange chromatography)而從抗體-PEG綴合物中被分離出。PEG-衍生的抗體可使用那些具有本技藝之技術者所熟知的方法(例如,藉由在此所描述的免疫分析法)而被測試結合活性以及活體內效力(in vivo efficacy)。
一種在活體內具有一被增加的半衰期的抗體亦可藉由導入一或多個胺基酸修飾(亦即,取代、插入或刪除)至一IgG恆定領域或它的Fc
R結合片段[諸如Fe
或樞鈕Fe
領域片段(hinge Fe
domain fragment)]內而被產生,參見,例如,WO 98/23289;WO 97/34631;以及美國專利第6,277,375號。
再者,一抗體可被綴合至白蛋白俾以使一抗體在活體內更安定或在活體內具有一更長的半衰期。該等技術是此技藝已知的,參見,例如,WO 93/15199、WO 93/15200與WO 01/77137;以及EPO 413622。抗體亦可藉由,例如,經由已知的保護/阻斷基團、蛋白質水解的切斷(proteolytic cleavage)、連結至一細胞的配位子或其他蛋白質等等的糖基化(glycosylation)、乙醯基化(acetylation)、磷酸化(phosphorylation)、醯胺化(amidation)、衍生化(derivatization)而被修飾。
用以綴合該一治療的部分至抗體的技術是熟知的,參見,例如,Arnon et al.,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeld et al. (eds.),Alan R. Liss(1985);Hellstrom et al.,in Controlled Drug Delivery,2nd ed.,Robinson et al.,eds.,Marcel Dekker(1987);Thorpe,in Monoclonal Antibodies ’84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.,eds. (1985);Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy,Baldwin et al.,eds.,Academic Press(1985);以及Thorpe et al.,Immunol Rev 62:119(1982)。另擇地,一抗體可被綴合至一二級抗體以形成一抗體異綴合物(antibody heteroconjugate),諸如一雙功能性抗體,參見,例如,美國專利第4,676,980號。
本發明的綴合物可被用以修飾一既定的生物回應,治療的試劑或藥物部分不是要被建構作為限制傳統的化學治療試劑。例如,藥物部分可以是一具有一所欲的生物活性的蛋白質或多肽。該等蛋白質可以包括,例如,一毒素,諸如相思子素(abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(Diphtheria toxin);一蛋白質,諸如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子(nerve growth factor)、血小板-衍生的生長因子(platelet derived growth factor)、組織胞漿素原活化物(tissue plasminogen activator);一細胞凋亡劑(apoptotic agent),例如,TNF-α、TNF-β、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配位子(Takahashi et a1.,Int Immunol,6:1567(1994))、VEGF(WO 99/23105);一血栓劑(thrombotic agent);一抗-血管生成劑(anti-angiogenic agent),例如,血管他丁(angiostatin)或內皮他丁(endostatin);或生物回應修飾劑(biological response modifiers),諸如,例如,淋巴激素(lymphokines)、介白素-1(interleukin-1,IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-6(IL-6)、顆粒球巨噬細胞株刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,GCSF),或其他生長因子。
抗體或變異體組成物將以一種與好的醫學規範(medical practice)一致的方式而被配方、給藥以及投藥。關於此點考量的因素包括:要被治療的特定病症、要被治療的特定哺乳動物、個別病患的臨床病況、病症的起因、試劑的輸送的位址、投藥的方法、投藥的時間表,以及對於醫師(medical practitioners)已知的其他因素。要被投藥的抗體或變異體的“治療有效數量”將藉由該等考量而被支配,並且可以是對於預防、改善或治療一延長性第I型醣原神經脂質疾病、病況或病症必需的最低數量。
如此處所用的,術語“有效數量”意指一治療(therapy)[例如,一預防的(prophylactic)或治療的試劑]的數量,其足以降低一種延長性第I型醣原神經脂質相關的或關聯性疾病的嚴重性(severity)和/或持續時間(duration)、改善它的一或多個症狀、預防一種延長性第I型醣原神經脂質相關的或關聯性疾病的進展(advancement)或引起一種延長性第I型醣原神經脂質相關的或關聯性疾病的退化(regression),或者它足以導致預防一種延長性第I型醣原神經脂質相關的或關聯性疾病或者它的一或多個症狀的發展、復發(recurrence)、開始(onset)或進展(progression),或者增強或改善用於治療一延長性第I型醣原神經脂質相關的或關聯性疾病的另一種治療(例如,另一種治療的試劑)的預防和/或治療的效用(等)。例如,一感興趣的治療可降低一症狀(以基線或一正常位準為基礎)達至少大約5%、較佳地至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。在一個其他的具體例中,一有效數量的一治療劑或一預防劑(prophylactic agent)降低一種延長性第I型醣原神經脂質相關的或關聯性疾病(諸如一癌症)的一症狀達至少大約5%、較佳地至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。亦在此使用作為一同義字是術語“治療有效數量”。
在一特定的病症或病況的使用或治療上是有效的治療性多肽、抗體或它們的片段的數量將視該病症或病況的性質而定,並且可藉由標準的臨床技術而被決定。當可能的,一劑量-反應曲線(dose-response curve)以及本發明的藥學組成物可首先在活體外被衍生。若一適合的動物模型系統是可獲得的,一劑量-反應曲線可再次被獲得並且實施此技藝已知的方法而被使用以外推一適合的人類劑量。然而,根據此技藝的通常知識,一種在促進一發炎效用的一減少上有效的藥學組成物,例如,可提供一介於大約5與大約20ng/ml之間,以及較佳地介於大約10與大約20ng/ml之間的局部治療的試劑濃度。
在一個較佳具體例中,一治療性多肽、抗體或它們的片段的水性溶液可藉由皮下注射而被投藥。各個劑量可在自每公斤體重大約0.5mg至大約50mg,或更佳地,自每公斤體重大約3mg至大約30mg的範圍內。劑量可實施此技藝已知的藥學方法而被憑經驗地確定用於特定疾病、病患族群、投藥的模式等等。
關於皮下投藥的給藥時間表(dosing schedule)可改變從一週一次至每天至一天多次,視許多臨床因素[包括疾病的類型、疾病的嚴重性以及個體對於治療的試劑的敏感度(sensitivity)]而定。
在一個具體例中,組成物根據例行的操作程序而被配方作為一適合於靜脈內投藥給人類的藥學組成物。典型地,供靜脈內投藥的組成物是配於無菌等張水性緩衝液(sterile isotonic aqueous buffer)的溶液。當需要時,組成物亦可包括一安定劑以及一局部麻醉劑(local anesthetic)[諸如利多卡因或其他“卡因(caine)”麻醉劑]以減輕在注射位址的疼痛。一般而言,成分呈單位劑量形式(unit dosage form)而被個別地或混合在一起供應,例如,作為一乾的凍乾粉末或在一密封容器[諸如一示明活性劑(active agent)的份量(quantity)的安瓿(ampoule)或小藥囊(sachet)]的一濃縮物(concentrate)。當組成物要藉由滴注而被投藥,它可使用一含有無菌藥學等級的水或鹽水的滴注瓶而被配藥。當組成物藉由注射而被投藥,一安瓿的用於注射的無菌水或鹽水可被提供,例如,在一套組中,藉此成分可在投藥前被混合。
本發明亦提供:本發明的一液體配方被包裝在一示明感興趣之產品的數量的密封容器[諸如一安瓿(ampule)或小藥囊(sachet)]中。本發明的液體配方可以是在一示明該抗體或抗體片段之數量以及濃度的密封容器中。例如,本發明的液體配方可以至少大約15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml的延長性第I型醣原神經脂質抗體配於一為大約1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml或20ml的數量中而被提供於一密封容器中。
一含有可應用於治療上述疾病之物質(materials)的製造物品(article of manufacture)被提供。該製造物品包含有一容器以及一標識(label)。適當的容器包括,例如,瓶(bottles)、小瓶(vials)、注射器(syringes)以及試管(test tubes)。該等容器可以由不同種類的材料(諸如玻璃或塑膠)所形成。該容器裝有一對於診斷、預防或治療一延長性第I型醣原神經脂質病況或疾病是有效的組成物並且可具有一無菌進入孔(sterile access port)[例如,該容器可以是一種靜脈內溶液袋(intravenous solution bag)或一具有一可被一皮下注射針穿刺之擋器(stopper)的小瓶]。在該容器上或與該容器相連結的標識示明該組成物被用於治療選定的病況。該製造物品可進一步包含有一第二容器,該第二容器包含有一藥學上可接受的緩衝劑,諸如磷酸緩衝的鹽水溶液(phosphate-buffered saline)、林格氏液(Ringer’s solution)以及右旋糖溶液(dextrose solution)。該第二容器可進一步包括就一商業上與使用者的觀點而言是所欲的其他物質,包括緩衝劑、稀釋劑(diluents)、充填劑(filler)、針、注射器以及具有關於使用指示的仿單(package inserts)。
在本發明的另一個方面,包含有編碼抗體或它們的功能性衍生物之序列的核酸被投藥,俾以經由基因療法(gene therapy)來治療、抑制或預防一與延長性第I型醣原神經脂質的異常表現和/或活性有關聯的疾病(disease)或病症(disorder)。基因療法意指藉由對一個體投藥以一感興趣之被表現或可表現的核酸而被執行的療法。另擇地,被操作成攜帶感興趣之基因序列的細胞被投藥給一宿主。在本發明的一個具體例中,該等核酸在標的宿主細胞中或是由標的宿主細胞生產該編碼的蛋白質,該等標的宿主細胞會媒介一治療效用。任何對於基因療法而言是可利用的方法可以依據本發明來被使用。
有關基因療法的方法的一般性回顧,參見Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 12:488(1993);Wu et al.,Biotherapy 3:87(1991);Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 32:573(1993);Mulligan,Science 260:926(1993);Morgan et al.,Ann Rev Biochem 62:191(1993);以及May,TIBTECH 11:155(1993)。
在一個方面,該化合物包含有編碼一抗體或它的功能性結合片段的核酸序列,該核酸序列在一適當的宿主中是表現該抗體或它的片段或嵌合蛋白質(chimeric proteins)或重鏈或輕鏈的表現載體的部分。特別地,該等核酸序列具有可操作地連結至(operably linked to)該抗體或抗原-結合編碼區域的啟動子,該啟動子是可誘導的(inducible)或組成性(constitutive),並且,選擇性地,組織-專一性的(tissue-specific),以及其他調節序列(regulatory sequences)。
在另一個特定的具體例中,核酸分子被使用,其中該抗體編碼序列以及任何其他所欲的序列的兩側是在基因組中的一所欲位址處增進同源重組(homologous recombination)的區域,因而提供該抗體-編碼核酸的整合(integration)以及染色體內表現(intrachromosomal expression)(Koller et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86:8932(1989);Zijlstra et al.,Nature 342:435(1989))。在特定的具體例中,被表現的抗體分子是一單鏈抗體;另擇地,該核酸序列包括編碼該抗體的重與輕鏈這兩者,或它們的片段的序列。用於整合的替代性方法包括使用辨識特定核酸序列[鋅指(zinc finger)等]的特定轉錄因子。
將該等核酸投遞至一病患中可以是直接的(在直接的例子中病患被直接地暴露於該核酸或攜帶核酸的載體),或間接的(在間接的例子中,細胞首先在活體外被轉形以該核酸,接著被移植入該病患中)。
在一個具體例中,該等核酸序列在活體內被直接地投藥並且被表現,俾以生產所編碼的產物。那可以藉由許多在該技藝中所熟知的方法中的任一者而被達成,例如,藉由建構該等抗體編碼序列作為一適當的核酸表現載體的部分並且將其投藥,藉此該等載體成為細胞內的(intracellular),例如,藉由使用有缺陷的(defective)或減毒的(attenuated)反轉錄病毒或其他病毒載體的感染(參見美國專利第4,980,286號)、藉由直接注射裸露的DNA(naked DNA)、藉由使用微粒子撞擊法(microparticle bombardment)[例如,一基因槍(gene gun)(Biolistic,Dupont)]、使用非-病毒性載體(non-viral vectors)[諸如包含有一會結合親水性核酸並且具有與細胞融合之能力的兩親媒性(amphipathic)化合物的合成組成物,通常因而含有一疏水性部分以供與細胞膜結合、被覆以脂質或細胞-表面受體或轉染試劑(transfecting agents)、囊封在脂質體(liposomes)、微粒子(microparticles)或微膠囊(microcapsules)內]、藉由投藥與一已知會進入細胞核的胜肽鍵聯的載體、藉由投藥與一進行受體-媒介的胞吞作用(receptor-mediated endocytosis)的配位子鍵聯的載體(參見,例如,Wu et al.,J Biol Chem 262:4429(1987))(它可以被使用來標靶專一性地表現該等受體的細胞類型)等等。在另一個具體例中,核酸-配位子複合體(nucleic acid-ligand complexes)可以被形成,其中該配位子包含有一融合病毒胜肽(fusogenic viral peptide)俾以破壞吞噬小體(endosomes),容許該核酸避開溶小體降解(lysosomal degradation)。在又另一個具體例中,藉由標靶一專一性受體,該核酸可以在活體內被標靶以供細胞-專一性攝取(uptake)以及表現(參見,例如,WO 92/06180;WO 92/22635;WO 92/20316;WO 93/14188以及WO 93/20221)。
有關載體,例如,一慢病毒載體(lentivira1 vector)可以有如此技藝中所熟知的被使用。該慢病毒載體含有供用於包裝該病毒基因組並且併入至宿主細胞DNA中的組份。編碼要被使用於基因療法中的該等核酸序列被選殖至一或多個載體中,其
腺病毒(adenovirus)亦可被使用於本發明中。供用於以腺病毒為主的投遞系統之標的包括例如肝臟、中樞神經系統、內皮細胞以及肌肉。腺病毒感染非-分裂的細胞(non-dividing cells),一個勝過早期反轉錄病毒載體的優點。Kozarsky et al.,Curr Opin Gen Dev 3:499(1993)提出一個以腺病毒為基礎之基因療法的回顧。Bout et al.,Human Gene Therapy 5:3(1994)示範使用腺病毒載體將基因轉移至恆河猴(rhesus monkeys)的呼吸上皮(respiratory epithelia)。其他在基因療法中使用腺病毒的例子可以在Rosenfeld et al.,Science 252:431(1991);Rosenfeld et al.,Cell 68:143(1992);Mastrangeli et al.,J Clin Invest 91:225(1993);WO94/12649;以及Wang et al.,Gene Therapy 2:775(1995)中被找到。
腺-關聯性病毒(adeno-associated virus,AAV)亦可被使用在基因療法中(Walsh et al.,Proc Soc Exp Biol Med 204:289(1993);以及美國專利第5,436,146號;第6,632,670號;以及第6,642,051號)。
另一種基因療法的方法涉及藉由諸如電穿孔法(electroporation)、脂質體轉染(lipofection)、磷酸鈣-媒介的轉染作用(calcium phosphate-mediated transfection)或者病毒感染的方法將一基因轉移至組織培養物的細胞。通常,轉移的方法包括將一可選擇的標記(selectable marker)轉移至細胞。該等細胞繼而被處於選擇下,俾以分離出那些已攝取並且正在表現被轉移之基因的細胞。那些細胞接著被投遞給一病患。
因此,該核酸可以在所形成的重組型細胞的活體內投藥之前被引入至一細胞內。該引入可藉由此技藝中所熟知的任何方法而被執行,包括但不限於轉染作用、電穿孔法、微注射法、使用一含有該等核酸序列之病毒或噬菌體載體的感染、細胞融合(cell fusion)、染色體-媒介的基因轉移(chromosome-mediated gene transfer)、微細胞-媒介的基因轉移(microcell-mediated gene transfer)、球形質體融合(sphereoplast fusion)等。許多用於將外來基因引入細胞內的技術在此技藝中是已知的(參見,例如,Loeffler et al.,Meth Enzymol 217:599(1993);Cohen et al.,Meth Enzymol 217:618(1993);以及Cline,Pharm Ther 29:69(1985)),並且設若接受者細胞的必要發育以及生理功能不會被破壞,該等技術可以依據本發明而被使用。該技術提供將核酸穩定地轉移到細胞,藉此該核酸被該細胞表現,遺傳的並且由該細胞子代所表現。
所形成的重組型細胞可以藉由此技藝中已知的各種方法被投遞至一病患。重組型血球(recombinant blood cells)[例如,造血幹細胞或祖細胞(hematopoietic stem or progenitor cells)]較佳地被靜脈內地投遞,例如,如同在骨髓移植技藝中所熟知的。被預見供使用的細胞數量端視所欲的效用、病患狀態等而定,並且可以由一熟習此技藝者所決定。
可以被引入一核酸以供基因療法的細胞涵括任何所欲的、可取得的細胞類型,並且包括,但不限於,上皮細胞(epithelial cells)、內皮細胞(endothelial cells)、角質細胞(keratinocytes)、纖維母細胞(fibroblasts)、肌細胞(muscle cells)、肝細胞(hepatocytes)、血球(blood cells)[諸如T淋巴球(T lymphocytes)、B淋巴球(B lymphocytes)、單核球(monocytes)、巨噬細胞(macrophages)、嗜中性白血球(neutrophils)、嗜酸性球(eosinophils)、巨核細胞(megakaryocytes)以及顆粒球(granulocytes)]、各種不同的幹細胞或祖細胞[特別是造血幹細胞或祖細胞,例如,像是得自於骨髓、臍帶血(umbilical cord blood)、末稍血液(peripheral blood)、胎兒肝臟(fetal liver)等]。
在一個具體例中,用於基因療法的細胞對該病患而言是自體的(autologous)。編碼本發明之一抗體的核酸序列被引入至細胞內以使得轉殖基因(transgene)被該等細胞或它們的子代表現,並且重組型細胞接而在活體內被投藥以供治療效用。在一個特定的具體例中,幹細胞或祖細胞被使用。任何可以被分離並且在活體外被維持的幹細胞和/或祖細胞可以依據本發明之具體例而可能被使用[參見例如,WO94/08598;Stemple et al.,Cell 71:973(1992);Rheinwald Meth Cell Bio 21A:229(1980);以及Pittelkow et al.,Mayo Clinic Proc 61:771(1986)]。因為延長性第I型醣原神經脂質被表現在,例如,B細胞上,血球以及骨髓細胞是適當的宿主細胞。然而,有關使用幹細胞宿主之本發明的範圍未預期會做出與使用一轉殖基因來藉由將感興趣之轉殖基因投遞給胚胎和/或胚胎幹細胞而做出一基因轉殖生物。
因此,本發明提供藉由對一個體投藥以一有效數量之,例如,一液體配方、本發明的一抗體或它的變異體(variant)來治療、預防(prophylaxis)以及改善(amelioration)與延長性第I型醣原神經脂質有關以及有關聯的疾病或它的一或多種症狀的方法。該個體較佳地是一哺乳動物(mammal),諸如非-靈長類(non-primate)[例如,牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等]以及一靈長類[例如,猴,諸如一石蟹獼猴(cynomolgus monkey)以及一人類]。在一個較佳的具體例中,該個體是一人類。
延長性第I型醣原神經脂質亦可以被表現在某些癌細胞[諸如胰臟(pancreas)、結腸(colon)以及膀胱(bladder)]上,還有在T細胞白血病(T cell leukemias)(Qinping et al.,Oncogene 24:573-584,2005),並且延長性第I型醣原神經脂質的刺激與癌細胞的增生(proliferation of carcinoma cells)有相關性,Meijer et al.,Canc Res 66:9576-9582,2006。
因此,感興趣之抗體或它的衍生物可以被使用來控制表現延長性第I型醣原神經脂質之癌細胞的增生,其中癌症是透過此處所教示的一診斷分析藉由決定延長性第I型醣原神經脂質表現的存在而被鑑定。感興趣的抗體可以降低惡性細胞(malignant cells)的浸潤(infiltration)、降低對細胞凋亡(apoptosis)的抗性(resistance)並且將增生降至最低。該等病患接著被投藥以一癌細胞增生抑制數量(a cancer cell proliferation inhibiting amount)之如此處所提供的感興趣的一抗體或它的衍生物。如此處所教示的,一抗體或它的抗原結合部分可以若干的方式被投藥給一病患,包括投藥一多肽、一多核苷酸等。基本上任何表現一感興趣之第I型抗原決定位(epitope)的癌症可以使用一感興趣的抗體而被偵測和/或治療。例如,惡性細胞可以是一上皮細胞。該上皮細胞可以在任何器官或組織來源(諸如,結腸、直腸、食道、肺臟、前列腺、乳房、胰臟、口腔、陰道、一般胃腸道、尿道等)的任一種惡性細胞中被發現到。然而,只要是會表現一感興趣之第I型抗原決定位的惡性細胞,癌症不必然被限制於一上皮細胞。
為了裨利熟習此技藝者,本發明現在將藉由下列描述本發明可被實施之若干具體例的非限定實例而被例示說明。
Colo205細胞(ATCC)(Semple et al.,Cancer Res 38:1345-1355,1978)被生長在含有10%胎牛血清(fetal calf serum)的RPMI 1640培養基中。被收穫的細胞以PBS予以洗滌2次並且被儲存於-20℃下直到被需要。細胞沉澱物(cell pellets)使用異丙醇-己烷-水(isopropanol-hexane-water,IHW)(55:25:20)而被萃取,繼而為Folch分配分離(Folch partition)、DEAE Sephadex層析法(DEAE Sephadex chromatography)以及在一latrobead 6RS-8010管柱(latrobead 6RS-8010 column)上的HPLC。上層中性分離部分(upper-phase neutral fraction)以從55:40:5至55:25:20的IHW來執行梯度洗提(gradient elution)超過200分鐘。分離部分是依據在氯仿-甲醇-水(chloroform-methanol-water)(50:40:10)中的HPTLC移動而被收集並且合併(pooled)。延長性第I型鏈醣原神經脂質藉由在Merck HPTLC層析板(Merck HPTLC plates)(矽膠60,Merck,Darmstadt,Germany)上的製備級TLC(preparative TLC)被進一步純化,參見美國專利第6,083,929號。
一個正好移動至二聚Lea
抗原(dimeric Lea
antigen)下方的陽性蛋白質帶(藉由使用mAb IMH2的免疫染色)如同此處所教示的被純化出。
結腸直腸腺癌細胞Colo205(colorectal adenocarcinoma cells Colo 205)(ATCC CCL-222)以及DLD-1(ATCC CCL-221)被培養在補充有1mM丙酮酸鈉(Invitrogen Co.,Cat. No. 11360)的RPMI 1640培養基(Invitrogen Co.,Cat. No. 31800)中。其他的結腸直腸腺癌細胞[SW1116(ATCC CCL-233)與HT-29(ATCC HTB-38)],以及肺臟-衍生的T84細胞(ATCC,CCL-248)分別被維持在Leibovitz’s L-15培養基(Invitrogen Co., Cat. No. 41300)、McCoy’s 5a培養基(Invitrogen Co.,Cat. No. 12330)以及DMEM/F12培養基(Invitrogen Co.,Cat. No. 12400)中。 KATO III胃癌細胞(KATO III gastric carcinoma cells)(ATCC HTB-103)被培養在IMDM培養基(Invitrogen Co.,Cat. No. 12200)中。所有被使用於研究中的培養基被補充以10%胎牛血清。
KM小鼠(Kirin Brewery Co.,Ltd.)是藉由將雙重轉染色體小鼠(double transchromosomic mice)與基因轉殖小鼠(transgenic mice)雜交育種(crossbreeding)而被產生。KM小鼠具有含有整個人類免疫球蛋白重鏈基因座(human immunoglobulin heavy chain loci)以及一有關一半的人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座(human immunoglobulin kappa light chain)之YAC轉殖基因的人類染色體片段。KM小鼠被建造成不表現內生性免疫球蛋白重鏈,也不表現κ輕鏈。所有的動物是依據此技藝中所認可的原則(rules)以及規定(regulations)而被維持以及處理。
Colo205細胞每3週(5 x 106
細胞/注射)被腹膜內地(intraperitoneally)注射至KM小鼠中歷時一總計為4次的注射,繼而為每週注射被分離自Colo205細胞並且被吸附在脂多醣(lipopolysaccharide)上的延長性第I型鏈醣原神經脂質(Sigma,L-7011)(Young et al.,J. Exp. Med. 150:1008-1019,1979)歷時8次注射。經免疫的小鼠的抗-Colo205中性醣原神經脂質效價(anti-Colo205 neutral glycosphingolipid titers)是藉由使用抗-人類κ-HRP(Southern Biotechnology Associates,Cat. No. 9220-05)作為二級抗體(secondary antibody)的ELISA被監測直到效價達致1:6000。最後一次注射的3天之後,被追加免疫的小鼠(boosted mouse)的脾細胞(splenocytes)實施此技藝中所熟知的方法而被融合以P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1)小鼠骨髓瘤細胞(myeloma cells)(ATCC TIB-18)。融合瘤(hybridomas)是藉由使用被覆以Colo205中性醣脂質之96-井ELISA培養盤(96-well ELISA plates)(Corstar,Cat. No. 2592)的ELISA而被篩選。經HRP綴合的小鼠抗-人類IgG抗體被使用作為二級抗體(Southern Biotechnology Associates,Cat. No. 9040-05)以及四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidene,TMB)(Kem-Zn-Tec Diagnostics,Cat. No. 4390)被使用作為受質。與Colo205中性醣脂質顯示出高反應性(reactivity)的融合瘤上清液藉由HPTLC免疫染色以及藉由流動式細胞測量術(flow cytometry)被進一步確認。強烈地染上延長性第I型鏈醣脂質並且在Colo205細胞表面上顯示出高度結合的選殖株(clones)藉由限制稀釋法(limiting dilution)被重複地次選殖(subcloned)直到穩定的選殖株被建立。一個穩定的選殖株為GNX-8。
單株抗體是依據製造商所建議的操作程序使用蛋白質A Sepharose(GE Healthcare 17-129-79-02)以pH值梯度洗提而從培養物上清液中被純化。各個分離部分被收集並且抗體的存在是藉由ELISA被檢驗。具有Colo205中性醣脂質結合活性的分離部分被合併並且對PBS(pH 7.4)透析。經純化的抗體被等分(aliquot)並且儲存於-20℃下。
單株抗體的濃度是依據製造商所建議的操作程序以使用IgG作為標準品的Bio-Rad蛋白質分析套組(Bio-Rad Protein Assay kit)(Bio-Rad,Cat. No. 500-0006)而被決定。
GNX-8的同型(isotype)是使用一ELISA而被決定。GNX-8是一種人類IgG1並且輕鏈是κ。
經純化的GNX-8在加上β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)(還原狀態)或未加上β-巰基乙醇(非-還原狀態)的2X SDS凝膠-裝載緩衝液中被沸騰之後,經純化的GNX-8被施用至10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上。電泳是依據製造商的建議使用Minutesi-PROTEAN3電泳系統(Minutesi-PROTEAN3 Electrophoresis System)(BIO-RAD)而被執行。
在還原的SDS-PAGE凝膠上所分離出的GNX-8被轉移到硝基纖維素(nitrocellulose,NC)膜(Amersham)上並且以配於PBS中的3%脫脂乳(skim milk)予以阻斷。該膜在室溫下被培育以二級抗體歷時1小時。呈1:5000的稀釋度(dilution)之經HRP標識的山羊抗-人類IgG(γ)抗體(Zymed,62-8420)以及呈1:2000稀釋度之經HRP標識的兔子抗-人類κ鏈IgG抗體(DAKO,P0129)分別被用來偵測GNX-8的重鏈以及輕鏈。Western LightningTM
Chemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Sciences,Cat. No. NEL105)被用來顯影在BioMax Light Film(KODAK,Cat. No. 1788207)上的訊號。
在還原狀態下,GNX-8輕鏈以及重鏈的分子量是如同針對一IgG所預期的。GXN-8是一種藉由個別使用山羊抗-人類IgG(γ)-HRP以及兔子抗-人類κ鏈-HRP作為二級抗體的人類單株抗體。GNX-8是一種藉由ELISA-抗體分類(isotyping)的人類抗體。
GNX-8的pI分析是藉由PhastSystem(Pharmacia)被決定。簡言之,一抗體樣品以及pI標準品是依據製造商的操作程序使用一PhastGel注樣器8/1齒狀鑄槽器(PhastGel Sample applicator 8/1 comb)而被施用至一IEF PhastGel 3-9上並且被分開。該凝膠隨後依據製造商的操作程序而在PhastSystem Development Unit(Pharmacia)中被銀染色(silver stained)。
pI值分析(pI analysis)揭示多個範圍從pH 8.15至8.65的染色帶(bands)表示該抗體的轉譯後修飾(post-translational modifications)的可能性。高pI值表示GNX-8在生理pH值下將是可溶性的。
有關偵測細胞結合活性,2 x 105
細胞以PBS予以洗滌並且在室溫下被培育以不同濃度的抗體歷時30分鐘。在一PBS洗滌之後,經FITC-標識的山羊抗-人類IgG(Fc)抗體(ICN,Cat no. 55198)以1:3000的稀釋度在室溫下被添加至各細胞樣品歷時一額外的30分鐘。有關CDC研究,細胞在抗體處理之後以PBS予以洗滌3次並且被培育以1μl的碘化丙錠溶液(propidium iodide solution)(Sigma-Aldrich,P4846)歷時30分鐘。在一個最終PBS洗滌之後,細胞在流式細胞儀(BD,FACSort)上被分析。結果是以CELLQuest 3.3(BD)予以處理。
人類結腸癌細胞株,SW1116、Colo205以及DLD-1,以一為2 x 104
細胞/井的密度被加種(seeded)至48-井培養盤(Corning Costar)中。在被培養過夜之後,細胞被培育在500μl的培養基(具有呈不同抗體濃度之25%非-不活化的人類血清)中歷時2小時。在一PBS洗滌之後,剩餘的活細胞是藉由碘化丙錠(PI)溶液(Sigma-Aldrich,P4846)染色被定量並且藉由流動式細胞測量術被分析。純化自正常人類血清的正常人類IgGs被使用作為一個陰性對照。
在一個另擇的分析中,標的細胞藉由在大約37℃下使用大約100μl之51
Cr的培育歷時大約90分鐘而被標識。在洗滌(3x)並且培育(在37℃下大約1小時)之後,細胞(大約1x106
ml)被懸浮於補充有大約25mM HEPES緩衝液以及大約3%牛血清白蛋白的RPMI-1640中。大約20μ1之經標識的細胞,大約100μl的mAb以及25%熱-不活化的人類血清在微量滴定U底培養盤(microtiter U bottom plates)(Corning,N.Y.)的井中被混合。非-專一性小鼠Ig(Sigma,St. Louis,MO)可以被使用作為一陰性對照。在大約4小時培育之後,培養盤使用一被組裝在一微量離心機中的懸吊盤架(hanging plate holder assembled in a centrifuge)而被離心(500x g,2min),並且在各井中大約100μl上清液的放射性(radioactivity)是使用一伽瑪計數器(gamma counter)來被測量。各實驗組可以呈三重複來被測試。百分比專一性溶解(percent specific lysis)可以依據公式([A-B]x 100)/C被計算出,其中A=在被溶解的實驗細胞中的cpm;B=在未被溶解之標的細胞中的cpm;以及C=在總標的細胞中的cpm。自發性釋放較佳地理應不會超過最大可釋經標識之放射性(maximally releasable labeled radioactivity)的15%。
ADCC分析是藉由使用人類末稍血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)[使用Ficoll-Paque(GE,71-7167-00)而從健康的供體(donor)被製備]作為效應子細胞(effector cells)的乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放分析[Promega,非-放射性細胞毒性分析(Non-Radioactie cytotoxicity Assay)]而被執行。該分析定量地測量乳酸去氫酶(LDH),一種在細胞溶解時被釋放之穩定的細胞溶質酵素(cytosolic enzyme)。在培養物上清液中被釋放的LDH是使用一個30分鐘偶合酵素分析(coupled enzymatic assay)而被測定,其導致四唑鹽(tetrazolium salt,INT)轉換成一種紅色的甲臢(formazan)產物。所形成的顏色數量與被溶解的細胞數目是成比例的。
被使用作為標的細胞的Colo205細胞被分配至96-井U底培養盤(2 x 104
細胞/井)中並且於37℃下在具有各種不同的E/T比例之PBMC的存在下被培育以抗體歷時4小時。上清液中的LDH活性藉由非-放射性細胞毒性分析被測定。百分比專一性細胞溶解(percent specific cytolysis)可以依據下列公式被計算出:%專一性溶解(%specific lysis)=100 x (E-SE
-ST
)/(M-ST
),其中E是實驗釋放(在從被培育以抗體以及效應子細胞之標的細胞而來的上清液中的活性),SE
是在效應子細胞的存在下的自發性釋放(spontaneous releasee)(在從效應子細胞與單獨培養基而來的上清液中的活性),ST
是標的細胞的自發性釋放(在從被單獨培育以培養基之標的細胞而來的上清液中的活性)以及M是標的細胞的最大釋放(從被溶解以9% Triton X-100之標的細胞所釋放的活性)。
GNX-8的活體外抗腫瘤活性藉由CDC分析被評估。在25%人類血清的存在下使用GNX-8來治療人類結腸直腸癌細胞,SW1116、Colo205以及DLD-1會以一劑量依賴性的方式造成實質上的細胞溶解。結果表示GNX-8經由補體-依賴性細胞溶解(complement-dependent cytolysis)來殺死標的細胞。
對於SW1116以及Colo205細胞的CDC效用在某些實驗中是強過那個對於DLD-1所具者。細胞的可活性(viability)與GNX-8抗原的表現位準呈反比。GNX-8的CDC效用以及在3株結腸直腸株上的GNX-8抗原表現的位準證實:具有較高的GNX-8抗原表現的癌細胞較易感於細胞毒性而那些具有較低GNX-8抗原表現者具有較高的可活性。該等結果達成結論:GNX-8的抗腫瘤活性可能端視GNX-8抗原的表現位準而定。在腫瘤細胞上帶有高GNX-8抗原表現的病患可以被單獨治療以GNX-8,而表現較低位準之GNX-8抗原的腫瘤可能受益於一個除了GNX-8抗體之外加上一或多種其他癌症藥物(cancer drug)的組合療法。
人類末稍血液單核細胞(PBMC)的ADCC活性是在GNX-8的存在下對抗人類結腸直腸癌Colo205而被評估。使用IMH2的ADCC活性被使用作為陽性對照組而人類IgG作為陰性對照組。
GNX-8引發強烈的ADCC活性對抗Colo205細胞。細胞毒殺效用與E/T比例以及GNX-8濃度是正向相關的。100百分比的細胞溶解在大約20/1的E/T處被觀察到。一最大的ADCC效用,以及還有一被觀察到達至大約50%溶解的趨勢分別在大約5μg/ml的GNX-8以及就IMH2而言在大約50μg/ml時被觀察到。不論E/T比例或IgG濃度為何,對照組人類IgG顯示沒有細胞毒殺效用。要達到50%溶解的GNX-8的劑量是低於IMH2所需的1/10。
第I型醣原神經脂質被固定在一晶片(chip)上。接著mAb’s按照製造商的建議(GE Healthcare,Pistcataway,NJ)被暴露於晶片供用於動力學測量以及圍繞抗體-抗原結合反應的抗原決定位序列分析。
GNX-8的抗腫瘤活性在一Colo205異種移植物模型(xenograft model)中被評估。Colo205細胞以PBS予以洗滌2次並且於PBS中被復原至一為5 x 106
/100μl的細胞密度。6至8過大的雌性裸鼠在側腹(flank)區域中被皮下地(subcutaneously,s.c.)接種以100μl的Colo205細胞懸浮液。腫瘤大小是以一游標卡尺(vernier caliper)而1週被測量3次並且腫瘤重量(mg)被估算為(寬度2
x長度)/2。GNX-8或正常人類IgG依據預定的劑量以及排程被腹膜內地(intraperitoneally,i.p.)注射至攜帶有腫瘤的裸鼠中。
為了評估GNX-8的活體內抗腫瘤效力,癌細胞(5 x 106
細胞/小鼠)被注射至裸鼠中並且在腫瘤接種之後的24小時被治療以GNX-8(治療組,8隻小鼠/組)或正常人類IgG(對照組,7隻小鼠/組)。呈24-小時間隔的5個劑量(300μg/小鼠)以及隨後呈48-小時間隔的4個劑量(600μg/小鼠)被注射至這兩組中。
腫瘤生長在經GNX-8-治療的小鼠中被顯著地抑制。治療組在第11天達到一為大約23%之T/C(治療/對照)的中間腫瘤重量並且持續在近似的位準處直到研究的終點。一為的T/C測量在證實抗腫瘤活性上被認為是顯著的。
在GNX-8治療組中有一半的小鼠(4/8)達到超過50天的長期無-腫瘤存活(long term tumor-free survival)。另一方面,對照組動物的腫瘤大小在研究的期間持續地增大。
一個類似的研究在一個Colo205異體移植物裸鼠模型中被執行。GNX-8的第一個劑量在一腫瘤大小為80至100mg時被給予。GNX-8(治療組)以及正常人類IgG(對照組)每天被注射一次(300μg/小鼠)歷時5天,以及在第17與21天有兩個類似的劑量。
雖然治療在只有5個劑量之後被中斷,顯著的腫瘤抑制亦在治療組被觀察到。T/C(治療/對照)的中間腫瘤重量在第10天之後是低於42%並且到該研究的尾聲。
為了決定宿主效應子功能是否會促進GXN-8效力,帶有Colo205異體移植物的SCID小鼠每週2次地被治療以呈600μg/小鼠的GNX-8或正常人類IgG歷時3週。腫瘤大小每週2次地被測定直到腫瘤大小達到體重的10%,其被視為研究的終點(endpoint)。
存活率(survivability)在治療組中被延長。
為了研究GNX-8抗原決定位在人類結腸直腸癌上的發生率(occurrence),數個人類結腸直腸癌細胞株被分析。
例如,藉由GNX-8的DLD-1的活體內抑制是顯著的。
有關細胞醣蛋白的分析,經培養的細胞從T-75培養瓶(T-75 flasks)被刮下並且以PBS予以洗滌2次,接而為溶解緩衝液(lysis buffer)[50mM Tris-HCl pH 7.5,150mM NaCl,1% NP-40,0.5%去氧膽酸鈉(sodium deoxycholate),0.1% SDS以及1mM PMSF]。溶胞產物(lysates)被通過一個26號(gauge)注射針數次以分散任何大的聚集物(aggregates)。蛋白質濃度藉由蛋白質分析套組(Protein Assay Kit)(Bio-Rad)被決定。含有相同數量的蛋白質的溶胞產物在一凝膠上被分離並且藉由使用GNX-8作為一級抗體以及被標識以HRP的小鼠抗-人類IgG(Fc)(Southern Biotechnology Associates,#9040-05)作為二級抗體的西方墨點法而被分析。Western LightningTM
Chemiluminescence Reagent Plus(PerkinElmer Life Sciences,Cat. No. NEL105)被用來顯影在BioMax Light Film(KODAK,Cat. No. 1788207)上的訊號。
中性醣脂質(2μl/樣品)被打點在一HPTLC層析板(Merck,1.05642,矽膠60 F254
)上,並且以一個含有呈一比例為50:40:10(V:V:V)之氯仿:甲醇:水的流動相(mobile phase)予以顯影。有關醣脂質的聚醣染色(glycan staining),配於10% H2
SO4
中的0.2%苔黑酚(orcinol)(Sigma,O-1875)被塗佈在一HPTLC層析板上並且在110℃的一個烤爐中被培育歷時10分鐘。有關免疫染色,HPTLC層析板首先以配於氯仿:己烷(1:9)(V:V)中的0.5%聚(異丁基丙烯酸甲酯)[poly(isobutyl methacrylate)](Aldrich,181544)予以固定歷時45秒,繼而在3% BSA/PBS中阻斷歷時10分鐘。該等層析板繼而以PBS予以洗滌並且在室溫下被培育以一級抗體歷時1小時,繼而為經生物素化的(biotinylated)二級抗體在室溫下歷時1小時。一抗生物素蛋白-生物素複合體套組(Avidin-Biotin Complex kit)(Vector Laboratories,Burlingame,CA)被用來放大源自於二級抗體的訊號。該平板在室溫下被培育歷時30分鐘,繼而為依據製造商的操作程序使用一免疫染色HRP-1000套組(Immunostaining HRP-1000 kit)(Konica Minolta,130990)的顯色(color development)。
對於一經凍乾的樣品,20μl的48%氟化氫(hydrogen fluoride,HF)(Merck)被加入,並且混合物接而在4℃下被培育歷時48小時。在反應的尾聲,HF是使用N2
氣體而被移除。去岩藻糖基化的(defucosylated)醣脂質被用於GNX-8的專一性研究。
Colo205的中性醣脂質以HF予以處理並且藉由MALDI-TOF MS被分析,俾以移除岩藻糖(fucose)。TLC免疫染色被執行以分析在HF處理之前與之後GNX-8針對Colo205中性醣脂質的專一性。
GNX-8辨識未切割的醣脂質而非去岩藻糖基化的形式,這暗示GNX-8的抗原決定位是一個醣類部分並且岩藻糖是該結構的一個必要組份。
GNX-8的專一性進一步藉由在分離自Colo205細胞之中性以及單唾液酸醣脂質上的HPTLC免疫染色而被鑑定特徵。100克的Colo205細胞被收集,並且醣脂質分離部分被萃取。藉由TLC而被分開的Colo205醣脂質是針對醣類而以苔黑酚/H2
SO4
予以染色。Lea
、Leb
、Lea
-Lea
以及Leb
-Lea
的位置是依據Stroud等人(1992)(如上述)而被鑑定出。唾液酸Lea
(SLea
)藉由使用mAb NKH3的染色(美國專利第5,240,833號)被表示並且稍後使用MALDI-MS被鑑定。相同醣脂質分離部分的HPTLC免疫染色是使用CF4C4(美國專利第5,011,920號)(抗-Lea
)、T218(Abcam,Cambridge,MA)(抗-Leb
)、IMH2(Stroud等人,1992,如上述)(抗-Leb
-Lea
)以及GNX-8抗體而被執行。
結果指出:GNX-8與延長性第I型鏈醣脂質強烈地反應。GNX-8不會結合至Lea延長性第I型鏈。Colo205細胞的單唾液酸醣脂質無法被GNX-8所辨識。GNX-8在較高的濃度下與Leb
顯示出非常些微的交叉反應性。不像IMH2,GNX-8不會結合至Lex
或 Ley
。GNX-8結合至一含有Leb
的延長性鏈。GNX-8結合至Leb
-Lea
。
除了TLC免疫染色之外,GNX-8的抗原決定位是藉由使用合成聚醣(synthetic glycans)Leb
、Lea
-Lex
、Leb
-Lex
與Lex
-Lex
作為抑制劑,以及Leb
-Lea
/Lea
-Lea
醣脂質混合物作為陽性對照組的競爭性ELISA(competitive ELISA)而被特徵鑑定。
結果指出:GNX-8在高抑制劑濃度下與Leb
-Lex
些微地交叉反應,但是與其他被試驗的合成聚醣(包括合成的Leb
聚醣)不具有反應性(reactivity)。GNX-8對於延長性Leb
的結合活性要比那個對於單純Leb
所具者高出1000倍。
依據該等結果,GNX-8的抗原決定位可能是一個在一帶有岩藻糖基化(fucosylation)之延長性第I型鏈上的Leb
結構,但它不是一單純Leb
。
經福馬林(formalin)-固定之包埋於石蠟(paraffin)中的人類正常以及癌組織的檢體被獲得,例如,來自於US Biomax。
正常以及惡性人類組織的經福馬林-固定、經石蠟-包埋的組織陣列(tissue arrays)以配於PBS中的0.1%脫脂乳予以阻斷歷時30分鐘。在一以3% H2
O2
的額外10分鐘培育之後,該等組織陣列在樣品被培育以經0.1% BSA/經PBS-稀釋之經生物素化的GNX-8歷時1小時之前以PBS予以洗滌3次。接著組織樣品被反應以生物素-鏈黴抗生物素蛋白-過氧化酶複合體(biotin-streptavidin-peroxidase complex)(ABC kit,Vector,#PK-6100)歷時30分鐘供用於放大訊號。DAB PLUS受質套組(DAB PLUS Substrate Kit)(Zymed #00-2020)依據製造商的操作程序被用來視觀(visualize)免疫反應染色(immunoreactive staining)。對比染色(counterstaining)是使用蘇木精(hematoxylin)而被執行。結果藉由在一光學顯微鏡下的視觀被決定。
GNX-8抗原在人類癌細胞上的表現是藉由流動式細胞測量術而被評估。若干人類結腸直腸以及胃腫瘤細胞株,諸如,Colo205、HT-29、DLD-1、SW1116、T84以及KATO III藉由流動式細胞測量術分別被檢驗GNX-8抗原的表現。
流動式細胞測量分析證實:GNX-8對於所有被測試的癌細胞株展現結合活性。然而,對於SW1116、Colo205以及DLD-1的結合要比那些對於其他被測試的人類癌細胞株者還要明顯地強烈。
此外,GNX-8抗原表現在HL60[一種原骨髓細胞株(promyelocytic cell line)、MCF-7(一種乳癌細胞株)以及PANC-1(一種胰臟癌細胞株)]上,以及在一小鼠結腸癌細胞株CT26上被試驗。GNX-8不會結合至那4株細胞株。
2株結腸直腸癌細胞株,Colo205以及SW1116藉由西方墨點法被分析。該二細胞株在流動式細胞測量分析中證實與GNX-8強烈結合。
該等結果顯示:出現在Colo205以及SW1116之醣蛋白上的GNX-8抗原超過一範圍從32至>175kDa的分子量。因此,GNX-8抗原不僅是在醣脂質中,還有在醣蛋白中。
源自於各種不同器官(包括正常組織以及癌組織這兩者)之各種不同種類的檢體分別以GNX-8予以染色。在組織檢體中的染色態樣是藉由染色強度以及陽性細胞的頻率而被評估。染色是依據一為1+(10-20%)、2+(20-50%)或3+(>50%)的等級(scale)來被分級,而頻率是依據陽性細胞在各個切片中的百分比來被分類。
一個在原發性(primary)以及轉移性結腸直腸癌中於GNX-8抗原表現之間的強烈相關性被觀察到。一來自於一結腸直腸癌病患的一組組織切片的一免疫組織化學染色被執行。
GNX-8抗原不僅被表現在結腸直腸癌組織上,還有在鄰接的組織上。例如,一個在一癌症區域(cancer region)旁的息肉(polyp)被GNX-8染色。然而,在遠端正常組織上沒有染色被觀察到。因此,可以推論:GNX-8在可供辨識的細胞形態變化發生之前鑑定出經轉形的細胞或正在歷經轉形的細胞。
GNX-8抗原表現亦在各種不同程度(grade)的癌症上被研究。
GNX-8抗原在各個癌症階段(cancer stage)中被表現。
GNX-8不會結合至正常的結腸、直腸、胃、小腸、肝臟、食道、肺臟、前列腺或乳房。
58百分比(44/76)的結腸癌樣品被染色以GNX-8;47%直腸癌樣品;57%的轉移性結腸癌樣品;53%的胃癌樣品;29%的食道癌樣品;22%的肺癌樣品;4%的前列腺癌;17%的乳癌樣品;以及67%的胰臟癌樣品被染色以GNX-8。GNX-8不會結合至小腸、肝臟以及腎臟癌樣品。
生產GNX-8的融合瘤細胞按常規地被培養在含有10%低IgG胎牛血清(HyClone)的IMDM(Invitrogen)中。為了製備用於cDNA合成的RNA,1 x 106
個融合瘤細胞首先藉由低速離心(1000rpm,5min)被收穫。總RNA接著使用TRIZOL試劑(Invitrogen)依據製造商的操作程序從細胞沉澱物(cell pellet)中被分離。第一股cDNAs是使用SMART RACE cDNA擴增套組(SMART RACE cDNA Amplification Kit)(BD Biosciences-Clontech)而從經純化的RNA樣品中被合成。簡言之,1μg總RNA在70℃下被培育以1μl 5’-CDS以及1μl SMART II A寡引子歷時2分鐘。在添加2μl 5x第一股緩衝液(first-strand buffer)之後,1μl的20mM DTT、1μl的10mM dNTP以及1μl的PowerScript RT被添加至RNA/引子混合物中。樣品在42℃下被進一步培育歷時1.5小時。第一股cDNA合成反應是藉由添加100μl的三(羥甲基)甲基甘胺酸緩衝液(Tricine buffer)而被終止並且在72℃下被培育歷時7分鐘。
編碼GNX-8的重鏈片段的cDNA是藉由使用UPM(BD SMART RACE cDNA擴增套組)以及重鏈(CH1)的3’端之一引子(序列辨識編號:3)的PCR而被擴增。PCR反應是在94℃下歷時30秒,繼而為在58℃下歷時30秒,72℃歷時3分鐘而被執行,並且循環被重複26次。
在NUP(SMART RACE擴增套組)以及重鏈CH1的中段(middle)之一引子(序列辨識編號:4)的存在下,重鏈cDNA的變異區域(variable region)是從上面1μl的反應產物被再-擴增(re-amplified)。PCR反應是在94℃下歷時15秒,在68℃下歷時30秒而被執行並且循環被重複25次。經擴增的產物使用一PCR純化套組(PCR purification kit)(GeneMark)被純化並且核苷酸序列是使用重鏈CH1之5’端的一引子(序列辨識編號:5)而被決定。
根據序列資訊,全長重鏈cDNA是藉由從先前所製備的第一股cDNAs加上被新合成的引子(序列辨識編號:6),以及針對重鏈基因末端的引子(序列辨識編號:7),使用BD AdvantageTM
2 PCR酵素系統(BD AdvantageTM
2 PCR Enzyme System)(BD Biosciences)的PCR而被專一性地擴增。PCR反應被設定在94℃下歷時40秒,在60℃下歷時30秒以及在72℃下歷時100秒,並且循環被重複35次。
經擴增的全長重鏈cDNA首先以EcoRI與XbaI予以雙重分解(double digested)。在凝膠純化之後,經回收的重鏈cDNA接而在相同的位址處被接合至pCIneo載體(Promega)內,俾以獲得表現載體pCI-GNX-8.H3。被插入的cDNA序列是使用一與多重選殖位址的上游雜交的引子(序列辨識編號:8),以及一與多重選殖位址的下游雜交的引子(序列辨識編號:9)而被確認。GNX-8重鏈cDNA以及所推衍出的胺基酸序列在表3中分別被顯示為序列辨識編號:14以及15。其CDR1的胺基酸序列為序列辨識編號:18,DNA序列為序列辨識編號:19,其CDR2的胺基酸序列為序列辨識編號:20,DNA序列為序列辨識編號:21,其CDR3的胺基酸序列為序列辨識編號:22,DNA序列為序列辨識編號:23。
為了鑑定輕鏈cDNA序列,GNX-8的輕鏈胜肽被進行質譜法分析(mass spectrometry analysis)以及資料庫搜尋。依據蛋白質鑑定資訊,GNX-8的輕鏈是同源於小鼠λ鏈。一個在小鼠λ基因恆定區域的5’端側的引子(序列辨識編號:10)被合成。一個包括該輕鏈基因之變異區域以及一部分恆定區域的cDNA是藉由觸地PCR(touchdown PCR)而從前述的第一股被擴增。PCR反應首先在94℃下歷時30秒、在72℃下歷時90秒的5個循環之後,繼而為在94℃下歷時30秒、在66℃下歷時30秒、在72℃下歷時90秒的5個循環而被執行,以及接著在94℃下歷時30秒、在63℃下歷時30秒,以及在72℃下歷時90秒的循環被重複27次。經擴增的PCR片段接著被導入至yT&A載體(Yeastern Biotech)內供用於鑑定陽性選殖株。
4株帶有預期大小的選殖株被選出供用於使用引子(序列辨識編號;11)的序列決定。
結果指出:全部4株選殖株具有帶有一結構同源於已知輕鏈基因的5’端的相同cDNA。
為了重建全長輕鏈cDNA,一組新的引子(序列辨識編號:12以及序列辨識編號:13)被合成並且上述的cDNA被用來藉由PCR單獨製備輕鏈基因的變異區域。PCR反應包括在90℃下歷時30秒、在60℃下歷時30秒以及在72℃下歷時1分鐘的30個循環。
帶有被併入的EcoRI以及BsiWI限制酵素位址之經擴增的輕鏈變異區域cDNA是以分別的酵素予以分解。在瓊脂糖凝膠純化之後,經擴增的變異區域cDNA片段被接合至pCIck載體(一種在XbaI以及NotI位址處帶有一人類κ恆定區域的插入之以pCIneo為基礎的表現載體)的相同位址內,俾以給予輕鏈表現載體pCIck-GNX-8.mλ。定序確認被執行並且所推衍出之GNX-8輕鏈的核苷酸還有胺基酸序列分別被顯示為序列辨識編號16以及17。其CDR1的胺基酸序列為序列辨識編號:24,DNA序列為序列辨識編號:25,其CDR2的胺基酸序列為序列辨識編號:26,DNA序列為序列辨識編號:27,其CDR3的胺基酸序列為序列辨識編號:28,DNA序列為序列辨識編號:29。
一個表現重組型GNX-8抗體之重鏈以及輕鏈這兩者的單一載體是使用新黴素(neomycin)基因(pCIck-GNX-8 neo)或DHFR基因(pCIck-GNX-8 DHFR)作為一選擇標記而被建構。輕鏈載體pCIck-GNX-8.mλ以BglII予以線性化(linearized)接而為使用胎牛小腸磷酸酶(calf intestine phosphatase,CIP)的5’端去磷酸化。重鏈載體pCIck-GNX-8.H3是以BglII以及NgoMIV予以切割。含有CMV啟動子、全長重鏈cDNA以及SV40聚A的BglII-NgoMIV片段是藉由凝膠萃取而被回收並且藉由鈍端接合作用(blunt end ligation)而被導入至經線性化的輕鏈載體內以形成pCIck-GNX-8 neo。隨後,該pCIck-GNX-8 DHFR載體是藉由以NgoMIV/ClaI切割而從pCIck-GNX-8 neo移除新黴素基因並且置換成DHFR袖珍基因(minigene)而被生成。DHFR袖珍基因是藉由HindIII/SalI分解(digestion)而從pdhfr3.2載體(ATCC No. 37166)被切下,並且藉由凝膠萃取被分開以及回收。這兩個片段被處理以Klenow以給予鈍端,接著DHFR基因藉著鈍端接合作用被接合至經NgoMIV/ClaI-切割的pCIck-GNX-8 neo片段內。
序列辨識編號:14
長度:318
一旦輕與重鏈被定序,核酸可以被再編碼(recoded)俾以例如,在特定人類宿主細胞中將表現最佳化。
NS0細胞被生長至一為1 x 106
細胞/ml的密度。細胞被維持在指數生長期(exponential growth phase)並且培養基在轉染前一天被更換。在轉染當日,40 x 106
細胞被洗滌。接著,含有例如,10μg之輕鏈DNA以及經線性化的重鏈DNA的經線性化的核酸被添加至細胞懸浮液(總DNA體積應少於50μl)中並且培養物在冰上被培育歷時15分鐘。DNA以及細胞混合物被轉移至一經冷凍的比色管(chilled cuvette)(0.4cm)並且一電脈衝(electric pulse)(750V以及25μF)被施用。該比色管在電脈衝之後立即被置放在冰上並且被保持在冰上歷時10-15分鐘。細胞被收集並且平盤培養。細胞被培育在一個5% CO2
培養箱中歷時12-16天或直到選殖株出現。細胞選殖株的上清液或被生長在懸浮培養物中的細胞是藉由ELISA而被試驗並且陽性轉染瘤在新鮮培養基中被選殖。為了進一步篩選陽性轉染瘤,滴定ELISA(titration ELISA)或Biacore分析被執行。經增生的轉染瘤被維持在振盪培養瓶(shaker flasks)中並且抗體或它的衍生物從上清液中被收集。
大鼠被隨機分成2組(4隻大鼠/組)。動物們經由一尾部靜脈(tail vein)來接受1或10mg/kg的GNX-8有如一個單一靜脈內巨量注射(i.v. bolus injection)。血液樣品在第0、5、15與30分鐘,以及第1、2、4、6、24、30、72、144、168、216、240、312、336以及360小時被收集。血清被收穫並且被儲存於-20℃下直到GNX-8濃度分析。GNX-8濃度是藉由ELISA而被決定。
GNX-8是使用IODO-Gen法而被放射線標識以131
I。
裸鼠被用於活體內生物分布(in vivo biodistribution)以及成像研究。500萬個Colo205細胞被皮下地接種。當腫瘤達到一為0.5g的大小時,生物分布biodistribution研究被執行。有關生物分布研究,小鼠在尾部靜脈中被注射以10μCi/2.3μg經131
I-標識的GNX-8。5隻小鼠在注射之後的第6、24、48、72以及96小時被犧牲。血液樣品就在小鼠被犧牲之前被取得。腫瘤以及器官(腦、皮膚、肌肉、骨、心臟、肺臟、胰臟、眼、腎上腺、尾部、脾臟、腎臟、肝臟、膀胱、胃、小腸以及大腸)被立即地移除並且秤重。經放射線標識的抗體在腫瘤、器官以及血液中的百分比分別被在一γ計數器(γ counter)(Packard)中被計數。標準品是每次隨著組織以及腫瘤而被計數。組織放射性被表示為每公克器官被注射之劑量的百分比(%ID/g)。
成像研究是在一microSPECT單光子發射電腦斷層攝影X-SPECT動物成像系統(microSPECT single photon emission computerized tomography X-SPECT animal imaging system)(Gamma Medica Inc. USA)以及microCT X-射線電腦斷層攝影(microCT X-ray computerized tomography)上被執行。攜帶有Colo205腫瘤的裸鼠經由尾部靜脈被靜脈內注射以200mCi/5.5mg/100ml經131
I-標識的GNX-8。影像在第1、6、24、48、72以及96小時被獲得。有關GNX-8在大鼠、SCID小鼠以及裸鼠中於一個單一靜脈內投藥之後的藥物動力學研究被執行。GNX-8的血清濃度是藉由ELISA而被分析。
一個二室模型(two-compartment model)提供一個針對數據的適配值(good fit)並且產生被歸納在表4以及5中的PK參數。一個於Cmax
上的劑量-相關的增加在一為1.0以及10mg/kg GNX-8的單獨靜脈內投藥之後於大鼠中被觀察到。GNX-8分別在一為1以及10mg/kg的劑量下以一為3.81以及4.89天的最終半衰期(terminal half-life)從血清中被清除。
GNX-8在投藥至帶有或不帶有Colo205之裸鼠以及SCID小鼠中之後的藥物動力學參數在帶有腫瘤的這兩個物種中呈現一為大約1天的T1/2
。就非-帶有腫瘤的動物而言,T1/2
數值分別為在SCID小鼠中58.09小時以及在裸鼠中98.31小時。根據藥物動力學參數,T1/2
在非-帶有腫瘤的小鼠中要比在帶有腫瘤的小鼠中還要長。
生物分布研究在攜帶有Colo205異體移植物的裸鼠中被完成,俾以評估GNX-8的活體內腫瘤標靶活性(in vivo tumor targeting activity)以及專一性。
131
I-GNX-8放射性的最高位準在血漿中於所有的時間點(第6小時、24小時、48小時、72小時以及96小時)被偵測到。在第6小時,大約60%之每公克的注射劑量(%ID/g)在血漿中被偵測到。在第48、72以及96小時,有關血漿的%ID/g為大約20%。血漿位準顯著地高於在其他器官、腦、皮膚、肌肉、骨、心臟、肺臟、胰臟、眼、腎上腺、尾部、脾臟、腎臟、肝臟、膀胱、膀胱、胃、小腸以及大腸中,其中%ID/g在所有時間點於全部的器官中都不超過5%ID/g。除了腫瘤以外,在血漿中以及在其他器官中的放射性會隨著時間而降低。血漿放射性在第6以及96小時之間降低達大約70%。
腫瘤的放射性起初要比在正常器官中還要高。最高的腫瘤攝取(tumor uptake)在131
I-GNX-8注射之後的第48小時被觀察到,並且在其他器官的放射性降低的同時維持一穩定狀態(steady state)。因此,腫瘤/器官比例(tumor/organ ratios)在其他器官中增加。快速降低的放射性在血漿、心臟、肺臟、腎上腺、尾部、脾臟、腎臟以及肝臟中於第6以及24小時之間被觀察到。另一方面,腫瘤/血漿比例(tumor/plasma ratios)在注射之後從第6至96小時增加大約4倍。在腎臟中沒有131
I-GNX-8的累積被觀察到。
在攜帶Colo205腫瘤之裸鼠中的活體內腫瘤標靶活性是藉由成像分析而被研究。一個時序實驗(time course experiment)被作出以監測131
I-GNX-8的分布。結果亦指出:大部分的131
I-GNX-8是位在血液中,並且腫瘤標靶在注射之後從第24至72小時是明顯可見的。
活體內的數據指出:大部分的GNX-8於注射之後被存留在血液中。在各種不同的正常器官中沒有顯著的非-專一性結合。更甚者,GNX-8在靜脈內注射之後快速地標靶Colo205腫瘤並且維持標識在一個穩定狀態位準超過96小時。
單一劑量毒性(single dose toxicity)在8-9週齡的雄性以及雌性BALB/c AnN Crl BR小鼠中被執行。小鼠被靜脈內注射以呈一劑量為150mg/kg的GNX-8或單獨載劑(PBS)。所有小鼠的體重在犧牲以前的第1、8以及16研究日被測量。小鼠每日被觀察發病率(morbidity)或死亡率(mortality)的徵兆(signs)。
重複劑量毒性(repeat dose toxicity)在8週齡的雄性Sprague-Dawley Crl CD(SD)大鼠(6隻大鼠/組)中被執行。各組被投藥載劑(PBS)或3、15或75mg/kg/劑量的GNX-8,每週兩次,歷時4週。所有的動物每日被檢核死亡率並且任何的研究結果會被分別地記錄。大鼠在治療前以及治療期間之間每週被秤重,並且一個最後過夜禁食體重(final overnight fasting body weight)在最終犧牲(terminal sacrifice)時被獲得。血液樣品在最終犧牲時被收集並且被評估血液學(hematology)以及臨床化學參數(clinical chemistry parameters)。在體重以及所有測試參數上的差異顯著性藉由史徒登氏t試驗(student’s t test)被決定。
為了決定GNX-8在正常人類組織上的交叉反應性,一個非常高劑量(150μg/ml)的經生物素化的GNX-8被使用。一個具有72種人類組織(取自於3名正常人類個體的24種正常器官)的組織陣列(tissue array)(US Biomax FDA 801-1)被染色以GNX-8。依據來自於藥物動力學研究的Cmax
的結果,GNX-8以150μg/ml被使用以確保GNX-8在Cmax
下不會與正常人類組織具有嚴重的交叉反應性。那個濃度遠高於通常被使用在免疫組織化學研究中的。
微弱至中等程度的GNX-8染色在數種上皮來源的人類組織[包括胃腸道的黏膜上皮(mucosal epithelium of the gastrointestinal tract)、輸乳管的上皮細胞以及複層鱗狀上皮的角質化細胞]上被觀察到。依據Finstad等人的先前發現(Clin. Cancer Res.,3:1433-1442,1997),被導入至循環血液(circulating blood)內的抗體顯示出對於癌細胞(carcinoma cells)的專一性定位(specific localization)並且不會在抗原-陽性之鄰接的正常上皮細胞中累積。而且,抗體不會橫跨過基底膜(basement membrane)。因此,在正常組織的管道的上皮細胞中藉由GNX-8的染色不會被認為一個損害(detriment)。
兩個額外的研究被執行以供檢驗GNX-8在正常人類血球的交叉反應性。所有來自於4種不同血型(blood type)(ABO)供體的試驗血球顯示出與GNX-8的陰性反應。該等結果支持GNX-8不會結合至血球。因此,被投藥至循環系統(circulatory system)的GNX-8理應不會對血球造成傷害。
為了提出(address)GNX-8在活體內的安全性,兩個研究被執行,俾以決定急性以及亞急性毒性效用(acute and subacute toxicity effects)。
GNX-8的單一劑量毒性是在一為150mg/kg的劑量下於BALB/c小鼠中被試驗。小鼠每天被觀察1次並且沒有死亡在排定的犧牲(scheduled sacrifice)之前被發現到。所有的小鼠在整個研究的期間體重增加並且在GNX-8治療組以及對照組之間於平均體重增加上沒有顯著差異性。
GNX-8的重複劑量毒性在Sprague Dawley Crl CD大鼠中被執行。6隻8適大的動物被分配成數組。一組被投藥載劑,每週2次,歷時4週,第2、3以及4組分別接受呈3、15以及75mg/kg/劑量之配於PBS中的GNX-8,每週2次,歷時4週。所有的動物每日被檢驗死亡率並且所有的研究結果會被記錄。大鼠在治療前以及治療期間之間每週被秤重,並且一個最後過夜禁食體重在最終犧牲時被獲得。血液樣品在犧牲時被收集並且被評估血液學以及臨床化學參數。在體重以及所有其他測試參數上的差異顯著性藉由史徒登氏t試驗(Student’s t test)被分析。
沒有與GNX-治療相關的毒性的臨床癥兆。最後增重(final body weight gain)的分析指出在治療組以及對照組之間沒有差異性。對照組以及高劑量組的血液樣品在一過夜禁食之後的安樂死(euthanasia)前被取得,並且被分析血液學以及臨床化學參數。
就血紅素數量(hemoglobin amount)、血容比(hematocrit)、RBC數目、平均紅血球體積(mean corpuscular volume)、平均紅血球血紅素量(mean corpuscular hemoglobin)以及平均紅血球血紅素濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration)而言,在高劑量組以及對照組之間沒有統計學上的顯著差異性。結果指出:血液學毒性是由重複的高-劑量GNX-8投藥所誘發。
關於臨床化學分析,有關針對對照組以及高-劑量組的參數的平均值(mean value)被表示在表6中。一個可能因為重複注射高劑量抗體而在總蛋白質中的統計學上顯著的增加於高劑量組中被注意到。此外,一個在白蛋白上的些微增加亦被觀察到。然而,該等數值仍然落在大鼠的正常限值(normal limits)的範圍內。臨床化學數據顯示在高劑量GNX-8的重複注射之後,對於代謝以及分泌功能沒有顯著損傷。
為了獲得一個穩定的細胞株供用於大規模生產GNX-8,表現重組型GNX-8(rGNX-8)的NS0以及CHO細胞株被獲得。簡言之,編碼GNX-8的重與輕鏈這兩者的cDNAs從最初的融合瘤被選殖出。經分離的抗體基因接著在表現載體中被再組裝(reassembled)。純化自經轉染的NS0細胞所調馴(conditioned)之培養基的rGNX-8的分子量是藉由SDS-PAGE而被確認。rGNX-8以及最初的GNX-8融合瘤的專一性、結合活性與效力是藉由HPTLC、免疫染色、流動式細胞測量術以及CDC分析而被比較。
在最初的以及重組型GNX-8抗體之間沒有差異性。
rGNX-8以及GNX-8的N-糖基化圖譜(N-glycosylation profiles)接著藉由MALDI-MS被分析。
數據證明一個在兩種抗體之間的高度類似N-連結的糖形態。兩種抗體的幾乎所有N-聚醣含有核心岩藻糖基化結構,但沒有末端唾液酸(terminal sialic acids)。
二氫葉酸還原酶缺陷中國倉鼠卵巢(dihydrofolate reductase deficient Chinese hamster ovary)(CHO/dhfr)細胞(ATCC CRL-9096)被維持在含有5% FBS並且補充有100nM次黃嘌呤(hypoxanthine)與16μM胸腺嘧啶(thymidine)的IMDM中。為了製備重組型GNX-8生產細胞株,表現載體pCIck-GNX-8 DHFR藉由BamHI而被線性化並且經回收之DNA在溶液中的濃度是藉由OD260
吸光度(OD260
absorbance)而被決定。大約1.2 x 106
個CHO/dhfr-
細胞依據製造商的指示被轉染以10μg經線性化的DNA以及30μl的Fugene6轉染試劑(Roche)。在48小時之後,培養基被置換以含有5%經透析之胎牛血清的IMDM供用於轉染株選擇(transfectant selection)。該選擇被持續歷時大約2週直到穩定的選殖株被獲得。多數個選殖株被挑選並且被培養在48-井平盤中的相同選擇性培養基下。個別的CHO選殖株是藉由使用HRP-標識的抗-人類IgG(Fc)抗體作為二級抗體的抗原-專一性ELISA來篩選rGNX-8表現。
一表現高位準的抗體的CHO選殖株被選出供用於隨後使用胺甲碟呤(methotrexate,MTX)的基因擴增。在10nM的MTX中的基因擴增會造成一個超過30-倍增加的rGNX-8分泌。穩定的CHO選殖株被命名為CHO-rGNX-8.5M10。
CHO-rGNX-8.5M10細胞稍後在振盪的培養瓶(shaking flasks)中被適應無血清培養並且在隨著一個14-天培養達到一為大約120μg/ml的GNX-8的最大產率(yield)。培養物上清液被收集並且藉由蛋白質A層析法被純化。藉由蛋白質A層析法而被純化自CHO培養物上清液的rGNX-8抗體在SDS-PAGE上顯示預期的輕鏈以及重鏈胜肽帶。
那些習於此技藝者將認知到,或能夠無須過度實驗而確認針對此處所述之本發明的特定具體例的許多等效者。該等等效者被意欲要受到下列申請專利範圍所涵括。
Claims (14)
- 一種人類單株抗體或它的抗原結合部分,其會專一性地結合一包含一含有Leb 之延長性第I型鏈的抗原決定位(epitope),其中該抗原決定位被表現於一癌細胞上,其中該抗體或它的抗原結合部分不會與人類紅血球結合,並且包含有一包括位於一如SEQ ID NO:15所示的胺基酸序列上的所有CDRs的重鏈可變區以及一包括位於一如SEQ ID NO:17所示的胺基酸序列上的所有CDRs的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第1項的抗體,它不會與Lex 結合。
- 如申請專利範圍第1項的抗體,它不會與Ley 結合。
- 如申請專利範圍第1項的抗體,它不會與Ley -Lex 結合。
- 如申請專利範圍第1項之抗體,其係於E/T比例為20/1且抗體濃度為5μg/ml之ADCC分析中分解50%的Colo205細胞。
- 如申請專利範圍第1項的抗體,其中該癌細胞表現Leb -Lea 。
- 如申請專利範圍第1項的抗體,其中該癌細胞是一上皮細胞。
- 如申請專利範圍第7項的抗體,其中該上皮細胞包含有結腸、直腸、食道、肺臟、前列腺、乳房或胰臟。
- 如申請專利範圍第1項的抗體,其中該抗體的該部分是一scFv 。
- 如申請專利範圍第1項的抗體,其包含有一κ鏈。
- 如申請專利範圍第1項的抗體,其包含有一γ鏈。
- 一種組成物,其包含有如申請專利範圍第1項的抗體以及一藥理學上的活性劑。
- 一種製造物品,其包含有如申請專利範圍第1項的抗體以及一可偵測的部分。
- 一種組成物,其包含有如申請專利範圍第1項的抗體以及一藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
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