PT671923E - Celulas de reserva do figado - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO ‘‘Células de reserva do fígado” 1. Introdução O presente invento refere-se a células de reserva do fígado que têm um diâmetro >30 um e que retêm o componente acídico de uma combinação de corantes ácidos e básicos. Em particular, refere-se ao isolamento, caracterização, cultura e utilizações das citadas células de reserva do fígado. As células de reserva do fígado isoladas por centrifugação por gradiente de densidade podem distinguir-se de outras células do parènquima do fígado pela sua morfologia, características de coloração, alta actividade proliferativa e capacidade de diferenciação in vitro. Nas culturas a longo prazo aqui descritas, estas células expandem-se em quantidade e diferenciam-se em células do parènquima do fígado morfologicamente maduras, capazes de mediar as funções específicas do fígado. Portanto, as células de reserva isoladas do fígado podem ter uma larga gama de aplicações, incluindo, mas sem limitação, o seu uso como veículos de genes exógenos em terapia de genes e/ou para substituir e reconstituir um fígado de mamífero destruído, infectado ou geneticamente deficiente, por transplantação. 2. Antecedentes do invento O fígado é um órgão dinâmico que representa um papel importante em vários processos fisiológicos. As funções complexas do fígado incluem metabolismo, reserva, excreção, secreção de proteínas plasmáticas, como a albumina, e desintoxicação de substâncias prejudiciais através dos enzimas do sistema citocromo P-450. Além disso, o fígado, geralmente quiescente, também é capaz de actividades mitóticas notáveis em certas circunstâncias. 2.1. Células do fígado A maior população de células de fígado é a de células parenquimatosas (CP) também conhecidas por hepatócitos. O fígado também contém vários outros tipos de células como as células endoteliais, adipocitos, células fíbroblásticas e células de Kupffer, colectivamente referidas como células do estroma (litoral). A capacidade das células do fígado para passarem por uma rápida regeneração quando o fígado é danificado ou parcialmente removido, tem conduzido a especulações sobre a existência de uma população de hemocitoblastos ou células de reserva, capazes de auto-renovação e diferenciação. Contudo, 2 86 657 ΕΡ Ο 671 923/ΡΤ antes do presente invento, estas células de reserva do fígado nunca tinham sido identificadas nem as suas características descritas. Têm sido descritas células ‘‘ovais” no fígado dos mamíferos adultos. Estas células têm uma elevada relação entre os tamanhos do núcleo e do citoplasma, têm aproximadamente 40% do diâmetro das CP recentemente isoladas, expressam actividades enzimáticas consistentes com as dos hepatócitos fetais e têm uma velocidade de proliferação relativamente elevada (Tsao et al, 1984, Exp. Cell Res., 154:38-52; Farber et al, 1956, Câncer Res., 16:142-149). Contudo, os animais devem geralmente ser tratados in vivo com etionina, 2-acetilaminofluoreno ou outros carcinogéneos para produzirem estas células. Alguns investigadores têm levantado a hipótese de as células ovais poderem ser uma manifestação da retrodiferenciaçào das CP (Grisham, 1980, Ann. N. Y. Acad. Sei., 349:128:137; Firminger, 1955, J. Nat. Câncer Instit., 15:1427-1441) mas podem melhor lembrar células endoteliais (Fausto et al., 1987, in “Cell Separation: Methods and selected applications”, Vol. 4, T.G. Pretlow II e T.P. Pretlow, editores, Academic Press, Londres, pp. 45-78). O papel das células ovais como hemocitoblastos putativos ou células de reserva nunca foi estabelecido e tem sido objecto de várias investigações (Fausto et al., 1987, in “Cell Separation: Methods and selected applications”, Vol. 4, T.G. Pretlow II e T.P. Pretlow, editores, Academic Press, Londres, pp 45-78).

Além disto, referem-se a seguir os antecedentes da arte:

American Journal of Physiology>, vol. 263, n°2, p. G139-G148, Agosto, 1992” refere-se ao fígado como sendo um sistema de hemocitoblastos e descendentes, compreendendo três compartimentos: um compartimento de hemocitoblastos de ciclizaçâo lenta, um compartimento de amplificação com células de fenotipo intermédio proliferando rapidamente em resposta a estímulos regenerativos e um compartimento de diferenciação terminal onde as células perdem a sua capacidade de se dividirem. “WO-A-94 02601” refere-se a um método de correcção da função defeituosa do fígado num animal hospedeiro por implantação de células não nativas particulares, recrutadas i.a. em hemocitoblastos não hematopoiéticas do fígado, na região do fígado. “Hepatology, vol. 6, n°5. p. 932-944, 1986” refere-se a um estudo onde hepatócitos do rato foram isolados e separados por meio de centrifugação por gradiente de densidades Percoll, resultando a recolha de subtipos de hepatócitos diferentes, derivados da metade próxima (zonas 1 e 2) ou da metade distai (zonas 2 e 3) do ácino hepático.

“Câncer Research, vol. 45, p. 5762-5768, 1985” identificou “células ovais” como sendo uma população de células heterogéneas com diversas características e diverso potencial biológico. Afirma-se que estes tipos de células incluem provavelmente i.a. tipos de hemocitoblastos facultativos e células de transição com características de tipo hepatócito, capazes de sintetizar albuminas. “Science, vol. 254, p. 1802-1805, December 1991” e “Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 87, p. 8437-8441, 1990” referem-se a um modelo animal para a hiper-colesterolemia de família, como o coelho Watanabe Heritable Hyperlipidemic que foi usado para uma terapia de genes dirigida ao fígado, baseada no transplante de hepatócitos autólogos geneticamente corrigidos ex vivo com retrovírus recombinante. “Science, vol.233, p. 1190-1192, 1986” refere-se à função de hepatócitos transplantados em ratos mutantes com falta de i.a. albumina plásmica.

Contudo, nenhuma destas referências apresenta células de reserva do fígado particulares isoladas e composições correspondentes como é o caso do presente requerimento. 2.2 Culturas de fígado

Numa tentativa de estudar as diversas funções do fígado e dos tipos de células por elas responsáveis, prepararam-se culturas in vitro de células do fígado do homem bem como de animais experimentais. Usaram-se muito culturas primárias de hepatócitos de rato para estudar os efeitos de potenciais toxinas sobre perda de enzimas, metabolismo e membranas celulares (Grisham, 1979, Int. Rev. Exp. Pathol., 20:123-210; Acosta e Mitchell, 1981, Biochem. Pharmacol., 30:3225-3230). Contudo, estes sistemas de cultura apresentam vários inconvenientes e nenhum elucidou quanto à proliferação das CP do fígado ou à identificação das células de reserva do fígado.

In vitro, os hepatócitos adultos proliferam por apenas curtos períodos de tempo, ainda que a sua capacidade de produzir albumina e de apresentar actividade do enzima do citocromo P-450, possa ser prolongada se forem co-cultivados com outras substâncias de matriz extra-celular derivadas do fígado ou com certas combinações suas. Em cultura líquida, a viabilidade dos hepatócitos e a capacidade destas células manifestarem actividade indutora do enzima do citocromo P-450, baixam em função do tempo (Sirica e Pitot, 1980, Pharmacol. Rev. 31:205-228). Além disso, a divisão celular está usualmente limitada às primeiras 24-48 horas de cultura (Clayton e Damell, 1983, Mol. Cell Biol., 3:1552-1561; 86 657 ΕΡ Ο 671 923 /ΡΤ 4

Chapman et al., 1973, J. Cell Biol., 59:735-747). A viabilidade de hepatócitos aderentes em culturas monocamada persiste por períodos algo mais longos mas a actividade especializada é também rapidamente perdida (Deschenes et ai, 1980, In Vitro 16:722-730).

Com o objectivo de melhorar o crescimento do hepatócito e de prolongar funções específicas do fígado in vitro, têm sido cultivadas células hepáticas sobre várias matrizes incluindo placas de colagénio tipo I e membranas (Michalopoulos e Pitot, 1975, Exp. Cell Res., 94:70-78), na biomatriz de fígado homogeneizado (Reid et al., 1980, Ann. N. Y. Acad. Sei., 349:70-76), em colagénio tipo IV ou em geles ricos em laminina (Bissel et ai, 1987, J. Clin. Invest. 79:801-812), ensanduichada entre duas camadas de colagénio tipo I (Dunn et al., 1989, FASEB J., 3:174-177), e sobre placas revestidas com fíbronectina ou outras proteínas de matriz extracelular (Deschenes et al., 1980, In Vitro 16:722-730). Todos estes métodos têm sido citados como aumentando de algum modo a vida funcional dos hepatócitos in vitro. A este respeito, produziram-se melhoramentos substanciais cultivando CP com vários tipos de células estromais não parenquimatosas ou hepáticas litorais ou estromais não hepáticas. Tanto os hepatócitos do homem como os do rato, que foram co-cultivados com células endoteliais do fígado da mesma espécie, mantiveram as funções específicas durante semanas em cultura, ainda que não tivessem sofrido uma expansão significativa em número (Guguen-Guilluozo et ai, 1983. Exp. Cell Res., 143:47-54; Begue et al., 1983, Biochem. Pharmacol., 32:1643-1646). Os hepatócitos de rato que foram co-cultivados com fíbroblastos humanos (Kun-Harcuch e Mendoza-Figueroa, 1989, Differentiation 41:148-157) e com células endoteliais (Begue et al., 1983, Biochem. Pharmacol., 32:1643-1646) foram citados como mantendo a actividade do citocromo P-450 por mais de 10 dias. Assim estes sistemas mistos de co-cultura de hepatócitos podem fornecer micro-ambientes semelhantes aos in vivo por optimização das interaeções célula-célula. Além disso, várias funções das CP podem ser reguladas e/ou optimizadas por outras células hepáticas. Cita-se, por exemplo, que os produtos secretores das células Kupffer modulam a actividade enzimática do citocromo P-450 das CP (Peterson e Renton, 1984, J. Pharmacol. Exp. Tlter., 229:299-304). A fixação das CP aos fíbroblastos é evidentemente dependente da secreção de substâncias de matrizes extracelulares especializadas pelas células Kupffer (Michalopoulos et al., 1979, In Vitro, 15:769-806). As células endoteliais hepáticas podem também produzir componentes importantes da matriz extracelular (Guguen-Guilluozo et al., 1983, Exp. Cell Res., 143:47-54) e os adipócitos podem fornecer as matérias-primas necessárias para a renovação das membranas das células nos hepatócitos metabolicamente activos.

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Ainda que a viabilidade e as actividades funcionais das CP hepáticas cultivadas possam ser prolongadas in vitro se as células forem co-cultivadas com células estromais não parenquimatosas do fígado, com células de suporte de outros tecidos ou com os seus produtos de secreção, a proliferação das CP é limitada ou ausente nestes sistemas. Mitoses em co-culturas de células hepáticas têm sido atribuídas principalmente a elementos não parenquimatosos (Guguen-Guilluozo et al., 1983, Exp. Cell Res., 143:47-54). Diversos relatórios indicam que as células não parenquimatosas do fígado podem expressar funções semelhantes às dos hepatócitos (Grisham, 1980, Ann. N.Y. Acacl. Sei. 349:128-137) ainda que a natureza destas não CP não tenha sido inequivocamente estabelecida. O crescimento de hepatócitos de rato tem sido particularmente melhorado quando cultivados sobre um padrão tridimensional que consiste em células estromais hepatico-derivadas ligadas a um painel de filtração em “nylon” (Naughton e Naughton, 1991, patente U.S. N° 5,032,508). O compartimento estromal contém todas as células aderentes encontradas em tecidos de fígado incluindo células de Kupffer, células endoteliais vasculares e do dueto da bílis, fibroblastos e algumas células tipo adipócito. Estas células elaboram uma matriz semelhante em alguns aspectos à observada no fígado in vivo e apoiam o crescimento a longo prazo das CP e as funções específicas do fígado in vitro. Contudo, antes do presente invento, a existência das células de reserva do fígado nestas culturas nunca tinha sido estabelecida. 3. Sumário do invento O presente invento refere-se a células de reserva do fígado, ao método de isolamento e cultivo de células de reserva do fígado e ao método de uso das células de reserva do fígado, com ou sem substâncias genéticas exógenas, na transplantação ou implantação num indivíduo com um distúrbio específico no fígado. O invento baseia-se em parte na descoberta dos Requerentes que as CP do fígado do rato podem ser desenvolvidas num sistema de cultura para manter as funções específicas do fígado por mais de 60 dias, onde a cultura contém todos os tipos de células encontradas no fígado in vivo. As co-culturas compostas de CP do fígado desenvolvidas sobre células estromais do fígado que foram ligadas a um painel de “nylon”, quando colocadas em meio líquido, ficam suspensas entre o fundo do balão e a superfície do meio, favorecendo um efeito de crescimento tridimensional. A síntese de ADN hepatocelular, que persiste durante mais de 7 semanas in vitro, é melhorada suplementando o meio com transferrina saturada e/ou condicionando o meio com soros derivados das veias hepáticas de ratos parcialmente hepatectomizados. As funções específicas do fígado tais como a síntese de albumina e a

86 657 ΕΡ Ο 671 923/ΡΤ 6 actividade do enzima do citocromo P-450 são evidentes ao longo de 60 dias em cultura. Além disso, a expressão de ambos os antigénios da classe I MHC sobre o parênquima hepático cultivado e antigénios da classe II MHC sobre células Kupffer, baixou em função do tempo in vitro. Secções através de peletizados de células da zona aderente revelaram uma arquitectura normal das células parenquimatosas.

No decurso do isolamento e cultivo das CP do fígado, foi isolada, por centrifugação por gradiente de densidade, uma população de grandes células hepáticas acidofílicas, anteriormente desconhecidas, que apresentam uma taxa de proliferação mais elevada do que as outras células hepáticas. Estes hepatócitos acidofílicos cultivados sofrem divisão celular no sistema de cultura acima descrito e a análise do ciclo das células sugere que sejam CP, mais do que células estromais, devido ao seu teor total de ADN. Um meio contendo transferrina saturada com ferro férrico e suplementado com sulfato ferroso/citrato férrico e/ou condicionado com soros de ratos hepatectomizados. melhora os índices mitóticos dos inóculos quer de células acidofílicas sozinhas quer de acidofílicas misturadas e de CP maduras sobre culturas suspensas de um painel de '‘nylon”. O que é mais importante, estas células acidofílicas são capazes de evoluir em hepatócitos em cultura e executar funções específicas do fígado e por isso se crê serem células de reserva do fígado. O invento é descrito por meio de exemplos em que células de reserva do fígado de ratos são isoladas e as suas propriedades citológicas e biológicas caracterizadas. Uma população relativamente homogénea (>90%) de células de reserva de fígado pode ser mantida em culturas onde mostra reter capacidades proliferativas e diferenciativas. Encontra-se abrangida pelo invento uma grande variedade de usos das células de reserva do fígado aqui descritas. Em particular, a elevada taxa proliferativa destas células permite-lhes serem recipientes ideais para a inserção estável de genes exógenos na terapia de genes em vários distúrbios do fígado. 4. Breve descricão dos desenhos

Figura 1. Fotomicrografia de um esffegaço citológico de um peletizado por centrifugação de densidades Percoll a 70%. As células parenquimatosas maduras coram em escuro; o corante tem de ser aplicado durante mais tempo a fim de visualizar as maiores células acidofílicas de coloração leve.

Figura 2. Fotomicrografia de um esffegaço citológico de células acidofílicas provenientes do procedimento descontínuo “Percoll puro”. Corante Diff-Quik. Ampliação do original = lOOOx. Estas células são 25-30% maiores do que as outras células da 7 86 657 ΕΡ Ο 671 923 / ΡΤ

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 6.

Figura 7.

Figura 8.

Figura 9. preparação, são vacuoladas e de fraca coloração, têm numerosos e grandes nucléolos e apresentam uma proporção de tamanhos nuclear: citoplásmico mais baixa do que outras células hepáticas do isolado. Esffegaço citológico de células parenquimatosas morfologicamente maduras na zona não aderente de culturas em monocamada iniciadas com células acidofílicas (10 dias de cultura). Células parenquimatosas maduras que aderem e possivelmente emanam de uma zona aderente de células acidofílicas em cultura em monocamada. A. Micrografia de fase inversa de uma co-cultura do fígado estabelecida por inoculação de células provenientes de um gradiente de densidades 70% Percoll sobre uma camada sub-confluente de células estromais do fígado num painel de “nylon”. B. Micrografia de fase inversa de uma co-cultura do fígado estabelecida por inoculação de células acidofílicas de reserva do fígado, isoladas usando um procedimento descontínuo de gradiente de densidades de Percoll. Análise do ciclo de células de co-culturas de fígado sob diferentes condições, conforme avaliadas em núcleos isolados corados com iodeto de propídio por citometria de fluxo. Incorporação de timidina tritiada em células hepáticas sob diversas condições de cultura. Micrografia de transmissão de electrão de uma secção através de um peletizado de células da zona aderente dissociada por enzima de uma cultura de células hepáticas de um painel de “nylon”, 85 dias após inoculação. Apresentam-se a ultra-estrutura mitocondrial patente e as membranas metabolicamente activas do retículo endoplásmico rugoso. Ampliação do original = 2800x. A. Secreção média de albumina (±1 erro padrão da média) no meio pelas células das zonas aderentes das culturas hepáticas de várias idades suspensas num painel de “nylon”. 8 86 657 ΕΡ Ο 671 923/ΡΤ Β. Coloração de imunoperoxidase para albumina numa co-cultura hepática de 40 dias.

Figura 10. Diagrama da conversão metabólica do éster etílico de etoxifluoresceína (EFEE) em fluoresceína (F) pelas células com actividade enzimática citocromo P-450. Actividade enzimática do citocromo P-450 em culturas hepáticas de várias idades, determinada pela conversão de EFEE em F conforme medida por citometria de fluxo.

Figura 11. A. Gráfico de áreas mostrando as percentagens relativas das várias células hepáticas nas zonas aderentes das culturas suspensas em painéis de “nylon”. B. Esffegaço citológico da zona aderente de uma co-cultura hepática com 40 dias mostrando a persistência das células acidofílicas como uma entidade na cultura associada a células estromais.

Figura 12. Secção através de uma co-cultura em painel de “nylon”, corada pela eosina e hematoxilina.

Figura 13. Culturas para avaliação da toxicidade: A. Doseamento de viabilidade neutral, mostrando a viabilidade enfraquecida de hepatócitos co-cultivados com concentrações crescentes de álcool. B. Incorporação de timidina tritiada enfraquecida no ADN de células hepáticas cultivadas, em relação a uma dose de 5-fluorouracilo. C. Activação da ciclofosfamida e do benzeno pelas células hepáticas co-cultivadas com células de medula óssea. Nestas condições, a viabilidade da medula óssea (doseamento MTT) diminui com o aumento das doses da ciclofosfamida e do benzeno. 5. Descrição detalhada do invento O presente invento refere-se às células hepáticas de reserva, aos métodos de isolamento e cultura destas células e aos métodos de utilização das mesmas.

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Separam-se as células de reserva hepáticas das outras CP de fígado de rato por centrifugação por gradiente diferencial; elas exibem características fenotípicas únicas como segue. As células de reserva são maiores do que todas as CP normais, com uma baixa proporção de tamanhos nuclear : citoplásmico, e têm dois ou três nucléolos proeminentes por núcleo. Estas células fixam primeiramente o componente ácido de uma combinação de corante ácido/básico, enquanto que as outras CP são fortemente basofílicas. As células de reserva hepáticas têm uma taxa alta de proliferação (um tempo de duplicação de 24-48 horas) numa cultura em monocamada e persistem por períodos ainda mais longos em co-culturas em painel de “nylon” com células estromais. Em cultura, aderem rápida e firmemente ao plástico, tal como as outras CP “maduras”. Além disso, são capazes de se diferenciarem em células com função e morfologia tipicamente CP. Após um período de crescimento rápido em culturas em monocamada, as células derivam aparentemente da cultura de células de reserva acidofilicas aderentes e destacam-se das outras células; estas têm uma mais elevada proporção de tamanhos nuclear: citoplásmico e acumulam o componente básico do corante. As actividades funcionais específicas do fígado desta células incluem a secreção de albumina e a expressão de enzimas de citocromo P-450 indutíveis. O invento é discutido em maior detalhe nas subsecções a seguir, apenas para fins de descrição e não a título de limitação. Para maior clareza da discussão, os procedimentos específicos e os métodos aqui descritos são exemplificados usando preparações de fígado de rato, mas são meramente ilustrativas da prática do invento. Os procedimentos e as técnicas análogos são igualmente aplicáveis a todas as espécies de mamíferos, incluindo o homem. De facto, as células de reserva do fígado humano foram isoladas de preparações de fígado humano seguindo procedimentos semelhantes e apresentaram um fenotipo consistente com as células de reserva do fígado acidofilicas aqui ilustradas. 5.1. Isolamento das células de reserva do fígado O presente invento refere-se às células de reserva do fígado que estão presentes em pequeno número num fígado normal, ocupando 2-5% da população total das CP do fígado. O maior tamanho destas células constitui uma base conveniente para a sua separação de outras células do fígado. Assim, estas células podem ser isoladas de um fígado por centrifugação diferencial por gradiente de densidades conforme descrito na Secção 6.1.1, infra. As células grandes obtidas na porção superior da zona de interface a seguir à centrifugação descontínua de gradiente de Percoll consistem em mais do que 90% de células grandes acidofilicas de reserva do fígado. Este nível de enriquecimento é geralmente aceitável para as várias utilizações destas células descritas na Secção 5.4., infra. 10 86 657 ΕΡ Ο 671 923/ΡΤ

Em alternativa, as células de reserva do figado podem ser isoladas submetendo preparações de células hepáticas a cromatografía de lectina, cromatografia de afinidade envolvendo selecção positiva e negativa, centrifugação repetitiva de gradiente de densidades ou a uma sua combinação. Por exemplo, as células de reserva hepáticas obtidas na Secção 6.1.1., infra, podem ser negativamente escolhidas por prospecção usando anticorpos para remover fibroblastos, células endoteliais, células de K.upffer e adipócitos. São exemplos destes anticorpos os antigénios da classe II anti-MHC e o factor VIII anti-vW específico para células Kupffer e células endoteliais, respectivamente. Estes anticorpos podem ser aplicados, em qualquer combinação, quer repetidamente quer de modo sequencial. Ao ligarem-se aos anticorpos, as células podem ser removidas por adsorção a uma superfície ou coluna sólida revestida com um segundo tipo de anticorpos; i.e. um anticorpo anti-ratinho se o anticorpo primário for originário de ratinho ou se os anticorpos estiverem conjugados com biotina, as células ligadas a anticorpos podem ser removidas por uma coluna revestida de avidina; ou se os anticorpos estiverem conjugados com contas magnéticas, as células que expressam antigénios reconhecidos pelos anticorpos podem ser removidas num campo magnético. Pode ser seguido um processo semelhante para a selecção positiva, excepto que os anticorpos dirigidos aos marcadores de superfície específicos das células de reserva do fígado são utilizados para escolher a população de células desejada. 5.2 Cultura a longo prazo de células de reserva do fígado e de outras células narenauimatosas

O fígado, ainda que seja um órgão mitoticamente quiescente, tem o potencial de regenerar após total hepatectomia ou destruição química parcial (Bucher, 1963, Int. Rev. Cytol., 15:245-300; Naughton et al., 1977, Science 196; 301-302). É importante que este fenómeno possa estar relacionado com as células de reserva do fígado para a compreensão da indução tanto da regeneração hepática como da hematocarcinogénese. Numa concretização específica do invento, exemplificada pelo Exemplo 6, infra, as células CP do fígado ou as acidofílicas de reserva do fígado mostram crescer em painel de “nylon” semeado com células estromais e persistem durante longos períodos de tempo em cultura. Além disso, a presença de células estromais ou de proteínas de matriz segregadas por estes elementos é necessária para o prolongamento da função do enzima hepatócito citocromo P-450 (Deschenes et al., 1980, In Vitro, 16:722-730; Michalopoulos e Pitot, 1975, Ex. Cell Res., 94:70-78; Reid et al., 1980, Ann. N. Y. Acacl. Sei., 349:70-76; Bissell et al., 1987, J. Clin. Invest., 79:801-812; Dunn et al., 1989, FASEB J. 3:174-177; Guguen-Guilluozo et al., 1983, Exp. Cell Res., 143:47-54; Begue et ai, 1983, Biochem. Pharmacol.. 32:1643-1646; Kuri-Harcuch e Mendoza-Figueroa, 1989, Differentiation, 41:148-157). A fibronectina, laminina e colagénio são produzidos pelas células estromais hepáticas sobre as quais as CP

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II ou as células de reserva do fígado podem ser semeadas. Os níveis destas substâncias avaliados por intensidade de fluorescência após marcação com anticorpos primários e anticorpos secundários fluoro-cromo-conjugados são mais elevados do que os observados nos cortes do órgão fígado. As sínteses aumentadas destas proteínas de matriz extracelular imitam o seu esquema de expressão em tecidos fetais.

As substâncias de matriz extracelular produzidas pelas células estremais em co-culturas do fígado podem influenciar a divisão das células e a expressão genética das CP e das células de reserva do fígado (Tonomura et al., 1987, J. Cell Phvsiol., 130:221-227; Sudhakaran et al., 1986, Exp. Cell Res., 167:505-516). A este respeito, a rapidez de síntese de ADN dos hepatócitos in vitro é mais elevada na fibronectina vs. substratos ricos em laminina (Tonomura et al., 1987, J. Cell Phvsiol., 130:221-227) e a síntese da a-fetoproteína e albumina pelas células de cultura do fígado é máxima em associação com o colagénio do tipo IV (Sudhakaran et al., 1986. Exp. Cell Res., 167:505-516). Tal como o fígado in vivo, a matriz extracelular das co-culturas de hepatócitos do presente invento contém fibronectina, laminina e colagénio IV. Observa-se também a produção de TGFp, fíbrinogénio e outras proteínas específicas do fígado pelos hepatócitos cultivados.

Quando as células grandes acidofílicas de reserva do fígado são colocadas numa co-cultura a longo prazo com células estremais, emergem três populações de células no decurso da cultura. A maior parte das células cultivadas apresenta uma morfologia tipicamente CP. Enquanto que um número substancial das restantes células é de células do estrema, uma pequena, ainda que detectável. população de células acidofílicas de reserva do fígado está invariavelmente presente ao longo de várias semanas. A capacidade de manter estas células hepáticas por muito tempo, ainda que em estado quiescente, é importante para avaliar os efeitos de vários tóxicos nestas células (Michalopoulos e Pitot, 1975, Exp. Cell Res., 94:70-78; Bissell et al., 1987, J. Clin. Invest., 79:801-812; Guguen-Guilluozo et al., 1983, Exp. Cell Res., 143:47-54). No sistema de co-cultura, é evidente a actividade do enzima do citocromo P-450 nos hepatócitos do rato durante mais do que 60 dias de cultura. Esta actividade observa-se em todas as populações distintas de células com base nas características FLS vs. SS. As células mais pequenas nestas culturas mistas que apresentam granulometria baixa a moderada parecem ser células endoteliais e de Kupffer. Tanto as células endoteliais como as de Kupffer têm sido referidas como modulando a actividade do citocromo P-450 das CP in vivo e in vitro (Begue et al., 1983, Biochem. Pharmacol., 32:1643-1646; Ratanasavahn et al., 1988, Xenobiotica. 18:765). Também tem sido referido que os macrófagos exibem as suas próprias actividades desintoxicantes (Wichramasinghe, 1987, Clin. Lab. Hematol., 9:271-280). A este respeito, foi recentemente referido que o componente macrófago do estrema da medula óssea é capaz de metabolizar EFEE em 12 86 657 ΕΡ Ο 671 923 / ΡΤ fluoresceína (Naughton et al., 1992, Proc. Soc. Exp. Biol. Meei, 201:481-490). Contudo, as células de Kupffer no sistema de co-cultura são de tamanho consideravelmente mais pequeno do que a maior parte das CP e são principalmente as células maiores que apresentam a maior actividade do citocromo P-450 como foi manifestado pela sua capacidade de metabolizar a fluoresceína em EFEE. O crescimento de células de reserva do fígado ou das PC do fígado, cultivadas a longo prazo, pode ser melhorado pela adição de vários suplementos ao meio de cultura. Os tecidos que contêm normalmente baixos níveis de ferro apresentam respostas tóxicas a níveis mais altos de ferro mas os hepatócitos normalmente subsistem num meio rico em ferro e os seus conteúdos de ferro intracelular diminuem rapidamente in vitro. Assim, a perda de capacidade das células hepáticas de proliferarem na maior parte das culturas pode ser atribuída em parte à falta de ferro. Suplementar o meio de cultura com sais de ferro e transferrina saturada inibe a produção de albumina mas melhora a incorporação de radiotimidina nos hepatócitos. A armazenagem de ferro nos mamíferos ocorre principalmente no fígado e baço. Este mineral é necessário para o crescimento das células, em parte pelo seu papel como co-factor na activaçào da ribonucleotido-redutase que é necessária para a síntese do ADN (Reichard e Ehrenbergen, 1983, Science 221:514-519). Além disso, o número de receptores de transferrina tem sido relacionado com a actividade proliferativa (Sutherland et ai, 1981, Proc. Nat. Acaci Sei. USA. 78:4515-4519); isto varia durante o ciclo da célula ocorrendo a expressão mais alta na fase S (Yeh et ai, 1982, Exp. Cell Res., 138:429-434). O anticorpo monoclonal 42/6, que reconhece o receptor da transferrina, bloqueia a ligação da transferrina e inibe o crescimento de várias linhas de células in vitro (Trowbridge et ai, 1984, Biochem. Phannacol., 33:925-932; Mendelsohn et ai, 1983, Blood, 62:821-826). O factor eritropoiético hepático (HEF), um factor encontrado nos soros de animais com fígados que regeneram após hepatectomia parcial (Naughton et ai, 1980, Amer. J. Physiol., 238.Έ245-Ε252) também melhora a síntese do ADN dos hepatócitos no sistema de cultura aqui descrito. Foram referidos nos efeitos tróficos do soro dos animais hepatectomizados no fígado e de outros tecidos de animais normais assim como em células hepáticas cultivadas (Bucher, 1963, Int. Rev. Cytoi, 15:245-300). Ainda que os mecanismos precisos que controlam a regeneração hepática não tenham sido completamente esclarecidos, encontrou-se actividade hepatotrópica no efluente do fígado em regeneração que foi perfusado ex situ (Domfest et ai, 1981, Ann. Clin. Lab. Sei., 11:27-46), sugerindo que o fígado pode contribuir para a sua própria regulação. Até agora estes factores não foram completamente caracterizados mas todos podem ser úteis no apoio ao crescimento a longo prazo das células de reserva do fígado e das CP. 13 86 657 ΕΡ Ο 671 923/ΡΤ 5.3. Caracterização das células de reserva do fígado

Como se mostra no Exemplo 6 infra, as células de reserva do fígado podem ser isoladas e enriquecidas por vários procedimentos. As células de reserva do fígado têm características físicas próprias que as distinguem das células ovais ou de quaisquer outros hepatócitos descritos até agora. São por exemplo maiores (>30 iim de diâmetro) do que as CP hepáticas normais que estão geralmente na zona dos 22-26 pm de diâmetro, apresentam uma baixa proporção nuclear : citoplásmica e têm 1 ou 2 núcleos, cada um dos quais tem 2-3 nucléolos proeminentes. Quando corados com uma combinação de corantes ácidos e básicos, tais como Diff-Quick, retêm principalmente o componente ácido do corante. De facto, uma vez que todas as CP do fígado são altamente basofílicas, as células de reserva do fígado são tão levemente coradas que originalmente se pensou serem “células fantasmas ou células mortas”. Com o fim de visualizar estas células mais nitidamente, usualmente o esfregaço citológico é corado durante mais tempo para melhorar a fixação do corante. Assim, o termo “acidofílico” usa-se por oposição a outras populações de células de fígado que são altamente basofílicas. Além disso, ao contrário das células ovais, elas estão presentes no fígado normal, não exigem indução antecipada com carcinogéneos químicos, e tanto expressam como se desenvolvem em células que apresentam funções associadas às CP de secreção de albumina e de actividade do enzima citocromo P-450. Em cultura estão fortemente aderentes ao plástico e podem também aderir a outra CP hepática. Têm um índice mitótico relativamente elevado, são capazes de se dividirem em cada 24 a 28 horas regularmente durante 10 dias a 2 semanas em cultura de monocamada e, após este período, tomam-se não aderentes. Neste fase, as células destacadas não se distinguem morfologicamente das CP hepáticas normais.

As células de reserva do fígado podem ainda ser caracterizadas pela sua reactividade com diversos anticorpos monoclonais marcadores específicos da superfície de células conhecidas. Por exemplo, expressam baixos níveis de antigénio MHC Classe I, mas não expressam antigénio detectável MHC Classe II. Além disso, as células de reserva do fígado podem expressar outros marcadores que não foram ainda identificados. Portanto, ainda com o fim de caracterizar estas células, elas podem ser usadas para criar anticorpos contra as suas moléculas da superfície das células.

Também está dentro do âmbito do invento a produção de anticorpos monoclonais e policlonais que reconhecem novos marcadores de antigénio expressos pelas células de reserva do fígado. Tais anticorpos podem ter vários usos como o isolamento de células de reserva do fígado por cromatografia de afinidade. Podem ser usados vários procedimentos conhecidos na arte para a produção de anticorpos dirigidos às células de reserva do fígado. 14 86 657 ΕΡ Ο 671 923 /ΡΤ

Podem ser imunizados vários animais hospedeiros por injecção com células viáveis de reserva do fígado, células fixadas ou preparações de membranas, incluindo, mas não limitados, a coelhos, “hamsters”, ratinhos, ratos, etc. Podem ser utilizados vários adjuvantes para ampliar a resposta imunológica, dependendo das espécies de hospedeiros, incluindo, mas não limitados a Freund (completo ou incompleto), geles minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensioactivas tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, peótidos, emulsões oleosas, hemocianina da lapa “Fissurella”, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Podem ser preparados anticorpos monoclonais para novos antigénios nas células de reserva do fígado, usando qualquer técnica que providencie a produção de moléculas de anticorpo por linhas contínuas de células em cultura. Isto inclui, mas sem limitação, a técnica de hibridoma originariamente descrita por Kohler e Milstein (1975, Nature, 256, 495-497) e a mais recente técnica de hibridoma da célula B humana (Kosbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72; Cote et al., 1983, Prox. Natl. Acad. Sei., 80:2026-2030) e a técnica de hibridoma-EBV (Cole et al., 1985, “Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy”, Alan R. Liss, Inc. pp 77-96). Podem ser usadas as técnicas desenvolvidas para a produção de “anticorpos quiméricos”, unindo os genes de uma molécula de anticorpo de ratinho de especificidade de antigénio apropriada com os genes de uma molécula de anticorpo humano (e.g. Morrison et al., 1984, Prox. Natl. Acad. Sei.. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et ai, 1985, Nature, 314:452-454). Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos em cadeia única (patente US 4,946,778) podem ser adaptadas para produção de anticorpos em cadeia única.

Podem ser usados hospedeiros singénicos, alogénicos e xenogénicos para injecção de células de reserva do fígado, preparadas na forma viável, na forma fixa ou como preparações das suas membranas extraídas. Os anticorpos monoclonais podem ser diferencialmente separados por ligação selectiva às células de reserva do fígado mas não a outras células do estroma e CP do fígado.

Os fragmentos de anticorpos que contenham locais de ligação da molécula podem ser produzidos por técnicas conhecidas. Por exemplo, esses fragmentos incluem, mas sem limitação, os fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos por digestão pela pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser produzidos por redução das pontes de bissulfureto dos fragmentos F(ab')?.

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ΕΡ0 671 923/PT 15 5.4. Usos das células de reserva do fígado A capacidade das grandes células acidofílicas proliferarem e se diferenciarem em hepatócitos activos biologicamente maduros em cultura indica que se trata de células de reserva do fígado. Como tal são particularmente úteis em terapia de transplantação para substituir ou reconstituir um fígado que esteja geneticamente deficiente, infectado por um agente infeccioso e/ou parcialmente destruído.

Um dos maiores impedimentos nas actuais tentativas de obter uma integração estável de genes estranhos em células hospedeiras eucarióticas de diferentes órgãos é a incapacidade da maior parte destas células proliferarem in vitro. Isto é particularmente problemático nas tentativas de inserir genes exógenos nas células do fígado pois que os hepatócitos normalmente não sofrem divisão celular in vitro. Recentemente realizaram-se estudos de transferência de genes usando hepatócitos isolados de coelhos Watanabe hiperlipidémicos por herança que são largamente usados como modelo animal para a hipercolesterolemia familiar no homem. Como nos seus parceiros humanos, as células do coelho Watanabe contêm uma deficiência genética no receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL), conduzindo a elevados níveis de colesterol na circulação e uma incidência aumentada de doença prematura da artéria coronária (Wilson et ciL, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:8437). Hepatócitos de coelho foram infectados com vírus recombinantes portadores de um gene receptor de LDL funcional e mostraram provocar uma melhoria temporária da hiperlipidémia em coelhos geneticamente deficientes após transplantação. Crê-se que a taxa de sucesso desta forma de terapia possa ser ainda aumentada se o gene em causa puder alcançar uma integração mais estável numa população de células recipientes que seja capaz de uma divisão celular substancial. Como as células de reserva do fígado proliferam in vitro, especialmente por períodos mais longos no sistema de co-cultura aqui descrito, estas células podem constituir candidatos ideais como recipientes para a introdução de genes exógenos em cultura.

Diversos erros inatos do metabolismo são provocados por deficiência genética hereditária nas células do fígado. Estas doenças podem ser tratadas por transplantação de células de reserva do fígado portadoras de cópias funcionais dos genes correctos. Resumidamente, este procedimento envolve o isolamento de células de reserva do fígado de pacientes afectados por uma certa deficiência, a transferência de genes funcionais para estas células para corrigir o defeito genético por tecnologias convencionais de transferência de genes, a confirmação da integração e expressão estáveis dos produtos de genes pretendidos, e a transplantação das células para os próprios fígados dos pacientes para reconstituição. Esta abordagem é particularmente aplicável em situações em que um único defeito de genes seja

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EP 0 671 923/PT 16 responsável pela doença e em que o gene defeituoso tenha sido identificado e molecularmente clonado; contudo isto não se limita e estes estados. Além da terapia de genes num contexto autólogo, as células de reserva do fígado portadoras de genes funcionais podem também ser transplantadas para indivíduos de HLA concordante alogénicos. Exemplos de genes-alvo e de doenças de fígado com eles relacionadas que sejam convenientes para esta forma de terapia, incluem, mas sem limitação, o gene receptor de LDL na hipercolesterolémia familiar, os genes do factor de coagulação para os factores VIII e IX na hemo filia, o gene alfa 1 -antitripsina no enfisema, o gene da fenilalanina hidroxilase na fenilcetonúria, o gene da omitina transcarbamilase na hiperamoniemia e genes de proteínas complementares nas várias formas de deficiências de complementos. O fígado é um centro de produção de muitas proteínas secretoras. Está anatomicamente ligado ao sistema circulatório de modo tal que permite uma eficiente libertação das várias proteínas para a corrente sanguínea. Os genes que codificam as proteínas que apresentam efeitos sistémicos podem portanto ser inseridos nas células de reserva do fígado em oposição aos tipos de células específicas que normalmente as produzem, especialmente se for difícil integrar genes nestas células. Por exemplo, diversos genes de hormonas ou genes de anticorpos específicos podem ser inseridos nas células de reserva do fígado para a secreção dos seus produtos de genes na circulação.

Na prática do invento, as células de reserva do fígado isoladas pelos procedimentos descritos no Exemplo 6, infra, são usadas como recipientes nas experiências de transferência de genes. As células podem crescer optimamente num sistema de co-cultura com células estromais antes, durante ou depois da introdução de um gene exógeno. A actividade proliferativa destas células pode ser melhorada por vários suplementos de ferro descritos na Secção 5.2., supra, e a diferenciação in vitro destas células pode ser minimizada pela adição de citocinas de modo semelhante ao do uso do factor inibidor da leucemia em culturas de hemocitoblastos hematopoiéticos.

Para introduzir genes exógenos nas células de reserva cultivadas, qualquer gene clonado pode ser transferido usando as técnicas convencionais, incluindo, mas sem limitação, a microinjecção, transfecção e transdução. Além disso, se as células de reserva do fígado expressarem receptores para a asialoglicoproteína, os plasmídeos contendo os genes em causa podem ser conjugados à asialoglicoproteína e adicionados às células para induzirem a captação e a expressão (Wu et al., 1991, J. Biol. Chem., 266:14338). Este procedimento é mais suave sobre as células recipientes.

86 657 ΕΡ Ο 671 923/ΡΤ Ο método preferido de transferência de genes utiliza vírus recombinantes, como os retrovírus e os adenovírus. Por exemplo, quando se usam vectores de expressão de adenovírus, pode-se ligar uma sequência de codificação a um complexo de controlo de transcrição/translacçào de adenovírus, e.g., a sequência de comando tripartido e do promotor tardio. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (e.g., região EI ou E3) resultará num vírus recombinante que é viável e capaz de expressar o produto de gene em células infectadas de reserva do fígado (e.g., ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3655-3659). Em alternativa, pode ser usado o promotor do vírus da vacina 7,5K (e.g., ver Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79:4927-4931). São de particular interesse os vectores baseados no vírus papiloma bovino que têm a capacidade de replicar como elementos extra-cromossomais (Sarver et al., 1981, Mol. Cell. Biol, 1:486). Logo após a entrada deste ADN nas células, o plasmídeo replica até cerca de 100-200 cópias por célula. A transcrição do ADNc inserido não requer integração do plasmídeo no cromossoma do hospedeiro, produzindo portanto um elevado nível de expressão. Estes vectores podem ser usados para uma expressão estável, por inclusão de um marcador selectivo no plasmídeo, como por exemplo o gene neo. Em alternativa, o genoma retroviral pode ser modificado para ser usado como um vector capaz de introduzir e dirigir a expressão de qualquer gene de interesse nas células de reserva do fígado (Cone & Mulligan, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6349-6353). Pode também obter-se um elevado nível de expressão usando promotores indutíveis incluindo, mas sem limitação, o promotor da metalotionina IIA e promotores de choque térmico.

Para a produção de elevado rendimento, a longo prazo, de proteínas recombinantes, prefere-se uma expressão estável. Mais do que usar vectores de expressão que contenham origens virais de replicação, podem as células de reserva do fígado ser transformadas com um ADNc controlado por elementos de controlo de expressão apropriados (e.g., promotor, melhorador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e por um marcador seleccionável. O marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à escolha e permite às células integrarem estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomas e desenvolverem-se para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas de células. Por exemplo, após a introdução de ADN estranho, pode-se deixar que as células de fígado trabalhadas cresçam durante l -2 dias num meio enriquecido e sejam depois mudadas para um meio selectivo. Podem ser usados diversos sistemas de selecção incluindo, mas sem limitação, genes da cinase da timidina do vírus de herpes simplex (Wigler et ai, 1977, Cell, 11:223), da hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 48:2026), da adenina-

86 657 ΕΡ Ο 671 923 / ΡΤ 18 fosforribosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell, 22:817). Também pode ser usada a resistência antimetabolito como base de selecção para dhfr que confere resistência aos genes de metotrexato (Wigler etal., 1980, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 77:3567; 0'Hare et ai, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78:1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mullingan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072; neo, que confere resistência ao aminoglicosido G-418 (Colberre-Garapin et ai, 1981. J. Mol. Biol., 150:1); e higro que confere resistência à higromicina (Santerre et al., 1984. Gene, 30:147). Recentemente têm sido descritos outros genes seleccionáveis, designadamente trpB que levam as células a utilizarem indol em vez de triptofano; hisD que levam as células a utilizarem histinol em lugar de histidina (Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:8047) e ODC (omitina-descarboxilase) que conferem resistência ao inibidor da omitina-descarboxilase, 2-(difluorometilo)-DL-omitina, DFMO (MacConlogue L., 1987, in “Current Communications in Molecular Biology”, Cold Spring Harbour Laboratory ed.).

As células de reserva do fígado que têm integrado um gene particular medido pela expressão do seu produto de gene por técnicas como a transferência de Northern e ELISA, podem ser transplantadas para os pacientes de quem as células derivam originalmente ou para um indivíduo de HLA concordante. Para transplantação alogénica de HLA concordante, as células de reserva do fígado podem não exigir necessariamente transferência de genes antes da transplantação. Por exemplo, as células de reserva do fígado obtidas a partir de um dador que possua um gene funcional que codifique o factor VIII de coagulação, podem ser directamente usadas por transplantação para um paciente hemofílico de HLA concordante. As células transplantadas presumivelmente multiplicar-se-ão e darão origem a CP maduras que executam as funções normais do fígado, incluindo a produção do factor VIII de coagulação.

As células de reserva do fígado além de servirem para corrigir defeitos dos genes do fígado, podem ser usadas para restabelecer o parênquima do fígado no caso da cirrose hepática ou podem ser adaptadas contra doenças infecciosas específicas do fígado. Por exemplo, células de reserva do fígado não infectadas podem ser obtidas de um paciente com hepatite na fase primária e usadas como recipientes para genes que codifiquem ARN anti-sentido que seja complementar dos elementos genéticos relacionados com a réplica crítica de um vírus da hepatite. As células podem então ser transplantadas para pacientes com o fim de controlar a propagação do vírus e restaurar a função normal do fígado.

86 657 ΕΡ Ο 671 923 / ΡΤ 19 6. Exemplo; Identificação, isolamento e caracterização de células de reserva do fígado em culturas de fígado a longo prazo 6.1. Materiais e métodos 6.1.1. Isolamento de células

Foram produzidas células de ratos machos Long-Evans com 6-9 semanas de idade após anestesia pelo pentobarbital de sódio. Inseriu-se na veia porta hepática um angiocateter de calibre 20 (Terumo Corp., Japão) e protegido por duas ligaduras 4-0. O fígado foi perfusado com 500 ml de tampão isento de CaT+ (Pertoft e Snedsrod, 1987, in “Cell Separation: Methods and Selected Applications”, vol. 4, T.G. Pretlow II e T.P. Pretlow, editores, Academic Press, New York, pp 1-24) que foi debitado a 50 ml/min por uma bomba peristáltica Harvard Instruments (MA), e massajado suavemente até descoloração uniforme. O fígado foi colocado num funil de Buchner modificado e perfusado com um tampão contendo Ca”*" e 0,05 g/dl de colagenase tipo IV (Sigma Chemical Co., MO) num sistema de recirculação durante 15 a 20 minutos. O fígado foi então transferido para uma placa de Petri contendo tampão de colagenase suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 1,5% e os hepatócitos foram postos em suspensão após a perfuração da cápsula de Glisson, filtrados através de um crivo de “nylon” de 185 pm, peletizados por centrifugação e ressuspensos num meio completo, DMEM condicionado com FBS a 6% e soro equino a 10% e suplementado com 35 μΐ de glucagon (Sigma #G9261), 10 pg de insulina (Sigma #14011), 0,25 g de glucose e 250 pl de hemissuccinato de hidrocortisona por 500 ml de meio.

As células hepáticas foram separadas nas seguintes sub-populações, usando a centrifugação de gradiente de Percoll: Células parenquimatosas. Suspensões de células foram acamadas no topo de uma solução de Percoll a 25% (Pharmacia Inc., NJ) em lOx soro salino tamponado de fosfato (PBS) de Dulbecco e centrifugadas a 800 x g (10°C) durante 10 min, para remover restos sub-celulares. As células foram lavadas, ressuspensas no meio e centrifugadas contra um gradiente de Percoll a 70%. O peletizado desta preparação contém uma população relativamente pura (>90%) de CP hepáticas. A osmolaridade desta suspensão foi calculada em 290 mOs usando o método de Timonen e Saksela (Timonen e Saksela, 1980, J. Immunol. Methods, 36:285). Células de reserva do fígado. Uma população de células acidofílicas grandes (>30pm em diâmetro), que proliferam e se diferenciam em cultura em células parecidas com

86 657 ΕΡ Ο 671 923/ΡΤ 20 hepatócitos maduros, foi separada como segue: suspensões de células de fígado recém-isoladas foram centrifugadas (500 x g/5 min) e o peletizado foi ressuspenso no meio. A suspensão de células foi acamada sobre 25 ml de uma solução a 70% v/v de Percoll “puro”/ lx PBS (Sigma Chemical Co.. MO) e centrifugada a 800 x g durante 10 min. As duas zonas (de 4) inferiores foram misturadas, lavadas e centrifugadas contra 25%/50% (v/v, Percoll “puro”/Ix PBS) de gradiente descontínuo, produzindo uma zona de interface distinta e um peletizado. A interface (peso específico = 1,0381 g/ml) consiste em cerca de 90% de grandes células, ligeiramente acidofílicas, mono-ou binucleares, com nucléolos múltiplos, proeminentes. Células estromais. Concentraram-se fibroblastos hepáticos, endotélios e células Kupffer, do seguinte modo: células de fígado recentemente isoladas foram centrifugadas contra um gradiente Percoll a 70% (Pharmacia) lOx PBS (peso específico = 1,09 g/ml) durante 10 min, formando-se um peletizado e uma zona central. Células da zona central foram lavadas e centrifugadas numa coluna de Percoll 25%/50%. A zona de interface (peso específico = 1,03625 g/ml) continha células fibroblásticas, macrófagos, células endoteliais e ocasionais leucócitos de sangue periférico. 6.1.2. Cultura em painel de “nylon”

Painéis de filtração de “nylon” de 15 mm x 60 mm (Tetko, NY) com espaços de 210 pm foram tratados com ácido acético 1,0M, lavados em água destilada e mergulhados em soro fetal bovino (FBS) para melhorar a fixação celular. Foram colocados em câmaras de lâminas Tissue Tek (Nunc. Inc., IL) e inoculados com 10' células estromais que foram recolhidas enzimaticamente de uma cultura em monocamada. Os painéis foram transferidos para balões de 25 cm2 , 18-24 h mais tarde. Dentro de duas semanas as projecções das células estromais em desenvolvimento estenderam-se através de 3 a 4, de cada 5 aberturas da rede. As culturas dos painéis foram colocadas em câmaras de lâminas, inoculadas com 2-5x106 de CP hepáticas ou de células de reserva do fígado acidofílicas e transferidas para balões de 25 cm2 após 18-24 h. As células foram cultivadas (5% CO2/35-37°C/>90% de humidade) no meio completo. A substituição do meio completo foi efectuada 6 vezes por semana. Os suplementos experimentais ao meio incluíram transferrina saturada, sulfato ferroso, citrato férrico e soro de ratos com fígados em regeneração. Verificou-se que o último continha um factor(es) que induz(em) a proliferação de hepatócitos (Bucher, 1963, Int. Rev. Cytol., 15:245-300; Naughton et al., 1980, Amer. J. Physiol., 238:E245-E252).

86 657 ΕΡ Ο 671 923 /ΡΤ 21 6.1.3. Avaliação da albumina Ο meio foi recolhido durante cada alimentação e testado quanto à presença de albumina de rato, usando o ensaio imunossorvente de enzima ligado (ELISA) (Bissell et al., 1987, J. Clin. Invest., 79:801-812). A albumina cromatograficamente pura de rato e o anticorpo de albumina de ovelha anti-rato, peroxidase-conjugada, foram adquiridas em Cappel Inc. (PA) e a absorvância a 490 nm foi determinada usando um leitor cinético de microplaca (Molecular Devices Inc. CA). Juntaram-se 100 μΐ de meio para esgotar, a placas de 96 poços e guardaram-se a 0°C durante 12-14 h. Os poços foram lavados com Tween-20 a 0,5% em PBS e os locais de ligação não específica foram bloqueados com 5,0% BSA em PBS. Depois de lavar com 0,5% Tween-20, juntaram-se 100 μΐ de conjugado de albumina-peroxidase de ovelha anti-rato a cada poço e incubaram-se durante lh a 22°C. Os poços foram lavados com 0,5% Tween-20 e incubados durante 15 min com substracto de o-fenilenodiamina (Cappel Inc., PA). A reacção foi parada e a absorvância medida num leitor EIA. Os resultados foram obtidos a partir de uma curva padrão. 6.1.4. Contagens de células

Determinaram-se contagens de células totais das zonas não aderente e aderente, usando um contador de células pelo princípio da impedância (Counter Electronics, FL). As contagens diferenciais de células foram estritamente baseadas na morfologia das células coradas usando Diff-Quick (Baxter S.P., IL). As células foram avaliadas como parenquimatosas versas estromais. Usou-se a fagocitose do carbono coloidal e a reacção com anticorpos conjugados com FITC em relação ao segmento VIII do factor vW para identificar as células de Kupffer e as células endoteliais, respectivamente. 6.1.5. Citometria de fluxo

Análise Fenotipica. As células derivadas das culturas do fígado reagiram em gelo com 100 μΐ de anticorpos polimórficos IgG| monoclonais de ratinho para antigénios de rato MHC I ou MHC II, que foram conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Serotec Inc. UK). As células de controlo foram tratadas apenas com IgGi-FITC de ratinho. As amostras foram analisadas usando um citómetro de fluxo EPICS C (Coulter Electronics. Hialeah, FL) sintonizado num comprimento de onda de 488 nm com o ganho de fluorescência ajustado para excluir >98% das células de controlo. Estabeleceram-se janelas à volta das várias populações de células usando o histograma de dois parâmetros, dispersador de luz dianteira (FLS) vs. dispersador lateral (SS), e determinou-se a percentagem de casos positivamente fluorescentes.

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Avaliação do citocromo P-450. Hepatócitos recém-isolados, hepatócitos 24 h depois do isolamento e hepatócitos derivados de culturas suspensas em painel de “nylon” de várias durações, foram avaliados quanto à actividade da citocromo P-450 monooxigenase por citometria. Juntou-se 1 mM de uma solução de base 1 μΜ de 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) (Chemical Carcinogen Repository, National Câncer Institute, Kansas City, MO) em dimetilsulfóxido (DMSO) (sigma Chem. Co.), a culturas de células durante 18 h para induzir a actividade enzimática (Miller, 1983, Anal. Chem. 133:46-57). Este composto não fluorescente foi considerado um indutor ideal para este ensaio. As células em culturas suspensas em painel de “nylon” foram levantadas usando uma mistura de tripsina-colagenase (Naughton e Naughton, 1989, Atm. N.Y. Acad. Sei., 554:125-140), peletizadas e ressuspensas em tampão salino de fosfato (PBS) a uma densidade de 5x10" células/ml, guardadas em gelo durante lhe aquecidas gradualmente até 37°C. As células foram analisadas quanto à evidência da actividade do enzima do citocromo P-450, quantificando o incremento da fluorescência da fluoresceína em células que acumulam éster etílico da etoxifluoresceína (EFEE) (Miller, 1983, Anal. Chem., 133:46-57; White et al., 1987, Biochem. J., 247:23-28). As células foram incubadas com 50 nM de EFEE (Molecular Proves, Eugene, OR) em PBS durante 5 min a 37°C e examinadas quanto à fluorescência verde num citómetro de fluxo com um filtro de passagem longa de 515 nm e sintonizado na banda dos 488 nm. A fluorescência foi circunscrita a várias populações de células com base nas diferenças das características FLS vs. SS e foi medida uma vez por minuto até 15 min em amostras mantidas a 37°C. A acumulação da fluoresceína nas células ao longo do tempo indicou a actividade do citocromo P-450 (Miller, 1983, Anal. Chem., 13:46-57; White et al., 1987, Biochem. J., 247:23-28).

Análise do ciclo das células. As células dissociadas das zonas aderentes das culturas de células de fígado suspensas em painel de “nylon” foram submetidas a análise morfométrica para averiguar as percentagens relativas de células em diferentes estágios do ciclo da célula. As células foram coradas para a determinação do conteúdo em ADN, usando uma modificação do método de Fried et al., (Fried et al., 1978, J. Histochem. Cytochem., 26:921-933) e Taylor (Taylor, 1980, J. Histochem. Cytochem., 28:1021-1024). Juntou-se uma solução de corante, constituída por 0,05 mg/ml de iodeto de propídio (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) em água destilada com 1,5% de Triton-X-100 na proporção de 1:5 (v/v), ao meio completo, e os tubos foram agitados suavemente, usando um agitador orbital durante 2-3 min. Juntou-se ARNase (1 mg/ml, 50-75 unidades Kunitz/ml) (Sigma Chem. Co.) a cada tubo durante 3 min. Filtraram-se as suspensões por um peneiro de “nylon” de 50 pm. Após circunscrição num dispersador de luz frontal para eliminar “resíduos” do histograma, mediu-se a fluorescência vermelha numa escala log usando um citofluorógrafo.

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Os histogramas foram gravados em List Mode e analisados usando o programa PARA 1 (Coulter Electronics, Hialeah, FL). O coeficiente de variação (CV) do pico G|/Go de todas as amostras foi <3,0.

Análise Estatística. As medições de citometria de fluxo foram executadas em triplicado sobre tamanhos de amostras de 5000 (análise fenotípica) até 10000 (análise do ciclo das células) casos. A conversão de EFEE em fluoresceína foi medida em função do tempo, sendo amostrados 3000 a 5000 casos por minuto. Todos os resultados foram expressos como média ±1 erro padrão da média (sem). Os níveis de significância (P) foram determinados usando o ensaio t de Student. Os valores foram considerados significativos ao nível de 5%. 6.1.6. Imunofluorescência

Fixaram-se os especímenes em etanol a 95% (24 h/4°C), desidrataram-se em álcool absoluto nas mesmas condições e clarificaram-se em xileno (8 h/4°C) antes de os embeber em parafina a 56°C. Foram clarificadas secções de 7 um em xileno, desidratadas em séries de vários graus de etanol e pré-digeridas com uma solução de hialuronidase testicular bovina (Sigma Chem. Co., MO) a 0,5 mg/ml num tampão 0,1 N de acetato de sódio/ácido acético a pH = 6,0 durante 5 min. As lâminas foram bloqueadas antes da adição de anti-soros primários com uma solução contendo 4% de soro de cabra, 0,1% de BSA e 0.1% de Tween-20 em NaCl 0,1M. Foram diluídos anticorpos primários policlonais de coelho para fibronectina ou laminina (Telios Pharmaceuticals, CA) a 1:100 em Tris-cloro 0,01M a pH = 7,6 contendo 1,0% de soro de cabra e reagiram com as secções durante 1-3 h a 22°C. Lavaram-se as lâminas 5x com solução 0,1% de Tween-20 em NaCl 0,1M e colocaram-se em tampão Tris durante 10 min antes de as marcar com IgG de cabra anti-coelho conjugado com R-ficoeritrina (Sigma Chem. Co., MO). As secções foram contra-coradas com iodeto de propídio durante 30 min, montadas com Gelmount e estudadas num microscópio de epi fluorescência Nikon. 6.1.7. Microscopia electrónica

As células da zona aderente foram dissociadas com colagenase, lavadas e colocadas em meio completo durante 4-6 h. As células foram depois peletizadas por centrifugação, fixadas durante 1 h em glutaraldeído a 2,5% em tampão de fosfato 0,1M (pH 7,3), lavadas com tampão, pós-fixadas com tetróxido de ósmio, desidratadas em concentrações crescentes de etanol e óxido de propileno e embebidas em Epon 812. As secções foram cortadas num Ultramicrotome LKB (LKB Instruments, MD), coradas com acetato de uranilo a 5% e pós-

coradas com citrato de chumbo a 0,4%. As secções foram examinadas com microscópio electrónico de transmissão JOEL 100C. 6.2. Resultados

Os resultados descritos nesta Secção são valores obtidos em experiências que utilizam os procedimentos e técnicas descritos na Secção 6.1., supra, que se referem ao isolamento, caracterização, cultura e função das células de reserva do fígado. Quando as células hepáticas foram isoladas seguindo a perfusão e separação por gradiente de densidades Percoll, observaram-se quatro categorias de células morfologicamente diferentes: 1. Células médias-grandes que apresentam pelo menos dois núcleos, nucléolos proeminentes e ocasionais “vesículas” membranosas. Estas células aderiram às placas de plástico tão bem como as células estromais do fígado e foram localizadas no peletizado Percoll a 70% (FIG. 1); 2. Células pequenas-médias que não aderiram ao plástico mas que apresentaram alguma capacidade para se fixarem às células estromais. As células deste grupo que não se fixaram, morreram e sofreram autólise dentro de 2-3 dias de cultura. Estas células encontraram-se em todas as zonas de separação mas foram mais proeminentes no meio à superfície, de gradiente 25%/50%; 3. As células mortas de vários tamanhos que foram concentradas no sobrenadante de rotação Percoll de 70%, e 4. As células grandes (>30 pm) acidofílicas levemente coradas com 1-2 núcleos e nucléolos proeminentes múltiplos (FIG. 2). Estas aparecem na interface da centrifugação a 25%/50% (Percoll puro/lx PBS) e fixam-se nas placas de plástico, painéis de “nylon”, ou às células estromais. Além disso, outras CP fixam-se a estas células uma vez que elas estejam ancoradas. Estas células grandes, acidofílicas, proliferam até duas semanas em cultura de monocamada, destacam-se e ficam suspensas na zona não aderente onde são morfologicamente indistintas dos hepatócitos recém-peletizados (FIG. 3). Estas grandes células acidofílicas são consideradas como células de reserva do fígado. Estas células persistiram durante todo o período experimental quando co-cultivadas com estroma. A associação entre as CP isoladas no peletizado Percoll a 70% e as células do estroma hepático está indicada na FIG. 4.

As células do estroma hepático foram localizadas na banda inferior da interface do gradiente Percoll descontínuo a 25%/50%. Foram incluídas nesta população as células de Kupffer (identificadas pela sua capacidade para a fagocitose do carvão coloidal e expressam antigénios MHC II), as células endoteliais (que ligam anticorpos ao factor vW VI-II), as células fíbroblásticas e as células do tipo adipócito. Estas células estromais formam uma matriz no painei de “nylon” que foi, em alguns aspectos, semelhante à que se observou com os cortes do órgão fígado. A deposição da fíbronectina e da laminina foi identificada por imunofluorescência indirecta. A intensidade da fluorescência da matriz da cultura marcada

86 657 ΕΡ Ο 671 923 / ΡΤ 25 com anticorpo anti-fíbronectina aparenta ser maior do que a observada com cortes do órgão fígado empregando uma síntese melhorada desta substância de matriz extra-celular.

As CP inoculadas no crescimento semi-confluente das células do estroma nos painéis de “nylon” proliferaram durante 2-3 dias em cultura e formaram colónias de 6-20 células em áreas que anteriormente continham apenas uma ou duas células (FIG. 5A). A proliferação parece cessar nesta altura, embora as células permaneçam viáveis. As células hepáticas acidofílicas cultivadas nos painéis de “nylon” suspensos/moldes estromais apresentaram padrões de crescimento inicial semelhantes (FIG. 5B) mas este processo parece continuar até que uma densa zona de colónias de células parenquimatosas firmemente fixadas se evidenciou.

Certos suplementos do meio tiveram actividade sobre as células do fígado em cultura. A este respeito, os suplementos com ferro aumentaram a percentagem de hepatócitos na fase S conforme foi evidenciado pela análise citofluorográfica de iodeto de propídeo (FIG. 6). O(s) factor(es) encontrado(s) no soro venoso hepático de ratos com fígados em regeneração após hepatectomia sub-total também melhoraram a síntese do ADN dos hepatócitos neste sistema de cultura misto (FIG. 7).

As células acidofílicas também se fixaram ao estroma do fígado mas passaram por uma maior velocidade de formação de colónias do que as outras CP. A incorporação de 3H-timidina por estas células foi significativamente maior do que noutras populações de hepatócitos em cultura e as células em co-culturas em painéis de “nylon” suspensos continuaram a incorporar este rádio-nuclídeo durante >2 meses. As contagens diferenciais das células da zona aderente removidas enzimaticamente indicaram um aumento no número de células do tipo parenquimatoso com evidência para os valores mitóticos. Os estudos pelo microscópio electrónico de transmissão revelaram que as células da zona aderente peletizada apresentaram características ultra-estruturais semelhantes às das células de fígado recentemente preparadas (FIG. 8). As CP que foram cultivadas em painel de “nylon” suspenso/moldes de estroma permaneceram viáveis e sintetizaram quantidades significativamente maiores de albumina do que as CP que foram usadas para iniciar as culturas (FIG. 9). Células de co-culturas em painel de “nylon” suspenso mantiveram actividade do enzima do citocromo P-450 indutível até 60 dias, conforme indicada pela sua capacidade de transformar EFEE em fluoresceína (FIG. 10). Esta conversão era intracelular pois que as medições de fluorescência foram circunscritas sobre populações discretas de células identificadas pelas suas características FLS vs. SS. Ainda que as três maiores populações de 26 86 657 ΕΡ Ο 671 923 / ΡΤ células de fígado apresentassem esta actividade, a fluorescência mais elevada foi a observada nas CP maiores. Calcularam-se unidades de conversão arbitrárias como o produto da percentagem positiva de fluorescência e do número do canal do pico, conforme descrito por Miller et al., (Miller, 1983, Anal. Chem., 133:46-57). A conversão do pico EFEE em fluoresceína foi mais elevada nas várias co-culturas do que nas células de fígado recentemente isoladas ou do que nas culturas líquidas com um dia de idade de hepatócitos isolados. Ainda que este parâmetro não pareça depender da idade da co-cultura, observaram-se diferentes velocidades e duração da conversão da EFEE em culturas de diferentes idades. As CP cultivadas manifestaram uma expressão reduzida (2.6%) da classe I de antigénios MHC quando comparada com a das CP hepáticas recentemente isoladas (4,9%). Em contraste, não foi detectável nenhuma expressão de antigénios NHC de classe I em células estremais e os epítopos MHC da classe II nos macrófagos foram substancialmente menos do que nas células não cultivadas (3,5% vs. 9,6%, respectivamente). As FIGS. 11 e 12 demonstram a percentagem relativa dos três tipos de células hepáticas maiores nas zonas aderentes de co-culturas a longo prazo iniciadas com grandes células de reserva do fígado, acidofílicas, altamente enriquecidas, desenvolvidas sobre painéis de “nylon” revestidos com células estremais.

Na FIG. 13 indicam-se exemplos do uso in vitro de culturas de células do fígado acima descritas. Os efeitos tóxicos dos diferentes agentes estão medidos nos hepatócitos co-cultivados.

Lisboa, 11. JUL 2001

Por ADVANCED TISSUE SCIENCES, INC.

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims (14)

1. 86 657 ΕΡ0 671 923/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Células de reserva do fígado, isoladas, com um tamanho de célula >30 μπι de diâmetro e que retêm o componente acídico de uma combinação de corantes acídicos e básicos.
2. 2. Células de reserva do fígado de acordo com a reivindicação 1, que aderem fortemente ao plástico numa cultura em monocamada.
3. 3. Células de reserva do fígado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que aderem a outras células parenquimatosas mais pequenas do fígado.
4. 4. Células de reserva do fígado de acordo com qualquer das reivindicações precedentes que têm 1 ou 2 núcleos, cada um dos quais contendo 2 ou 3 nucléolos proeminentes.
5. 5. Células de reserva do fígado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes que têm índices mitóticos substancialmente mais elevados do que os de outras células do fígado no início da cultura in vitro, conforme determinados por toma de timidina tritiada.
6. 6. Células de reserva do fígado de qualquer uma das reivindicações precedentes que se diferenciam para originar células capazes de produzirem albumina e actividade do enzima do citocromo P-450.
7. 7. Composição celular compreendendo uma população substancialmente homogénea de células de reserva do fígado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.
8. 8. Composição celular de acordo com a reivindicação 7, onde cerca de 90% ou mais das células são células de reserva do fígado que retêm o componente acídico de uma combinação de corantes acídicos e básicos.
9. 9. Método de isolamento de células de reserva do fígado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, compreendendo submeter uma população mista de células do fígado a centrifugação por gradiente de densidade Percoll a 70%, para daí obter quatro zonas, das quais as duas inferiores contêm as células de reserva do fígado; e misturar e centrifugar as células das duas zonas inferiores contra um gradiente descontínuo de Percoll a 86 657 ΕΡ Ο 671 923/ΡΤ 2/2 25%/50% para assim obter uma zona de interface contendo as células que têm um peso específico, por flutuação, de 1,0381 g/ml.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, compreendendo ainda a colheita de células da porção superior da zona de interface para obter uma população de pelo menos 80% de células de reserva do fígado.
11. 11. Utilização das células de reserva do fígado, isoladas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 na preparação de uma composição para reconstituir um fígado de mamífero.
12. 12. Utilização das células de reserva do fígado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 na preparação de uma composição para corrigir uma deficiência genética num mamífero, contendo as células de reserva do fígado um gene exógeno.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o gene codifica uma proteína da superfície da célula.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 12. em que o gene codifica uma proteína segregada. Lisboa, \i jul 2001 Por ADVANCED TISSUE SCIENCES, INC. - O AGENTE OFICIAL - Eng." ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA