ES2385248T3 - Células progenitoras hepáticas humanas y métodos de uso de las mismas - Google Patents

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Abstract

Una población de células aisladas consistente en células derivadas de tejido hepático de un ser humano que son a. CD117+, CD34+, CD45- y Lin-; b. capaces de proliferar en un cultivo y c. capaces de diferenciarse in vivo en un hepatocito, un colangiocito y una célula sinusoidal.

Description

Celulas progenitoras hepaticas humanas y metodos de uso de las mismas
CAMPO DE LA INVENCION
La invenci6n se refiere a celulas progenitoras.
5 ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La insuficiencia hepatica aguda sigue siendo un problema importante de alta mortalidad. A pesar de la alta incidencia de enfermedades que dan como resultado disfunci6n e insuficiencia hepatica, los principales avances de las terapias medicas estan actualmente limitados a la prevenci6n y el tratamiento de ciertas formas de hepatitis virica. Las enfermedades hepaticas agudas y cr6nicas siguen tratandose con enfoques sintomaticos en lugar de
10 curativos. El transplante hepatico ortot6pico ha sido hasta ahora la unica terapia disponible para pacientes con insuficiencia hepatica terminal. Desgraciadamente, la disponibilidad de 6rganos donantes es limitada y muchos pacientes mueren cada ano esperando transplantes de higado. Recientemente, se ha usado como terapia alternativa el transplante de hepatocitos sanos a higado enfermo. Sin embargo, la escasez de donantes de 6rganos ha limitado la aplicaci6n clinica del transplante de celulas hepatociticas.
15 La terapia celular con citoblastos y su progenie es un nuevo y prometedor enfoque para la necesidad medica ampliamente insatisfecha en pacientes con enfermedades hepaticas. Una serie de estudios han examinado el potencial del transplante de citoblastos/celulas progenitoras (obtenidos de tejidos extrahepaticos e intrahepaticos) en insuficiencia hepatica aguda inducida experimentalmente. Aunque los citoblastos/celulas progenitoras de 6rganos adultos pueden generar celulas hepaticas funcionales, dichas celulas son escasas. Beneficiarian en gran medida la
20 capacidad de producir grandes cantidades de estas celulas que retuviesen sus funciones definitivas completas protocolos terapeuticos clinicos que implicaran el transplante de celulas progenitoras hepaticas para mejorar enfermedades heredadas y adquiridas.
Por tanto, existe la necesidad de una fuente de celulas progenitoras hepaticas que puedan diferenciarse en celulas hepaticas funcionales.
25 SUMARIO DE LA INVENCION
La invenci6n esta basada en el descubrimiento de una celula progenitora hepatica. La celula progenitora es multipotente. La celula progenitora es capaz de diferenciarse in vivo en un hepatocito, colangiocito o celula endotelial hepatica (concretamente, una celula sinusoidal). Por consiguiente, la invenci6n proporciona una poblaci6n celular aislada como se define en la reivindicaci6n 1. La poblaci6n es un cultivo de adhesi6n. Como alternativa, las celulas
30 de la poblaci6n estan en suspensi6n. La celula deriva de tejido hepatico, tal como tejido hepatico fetal. El tejido es de un ser humano. La celula es inmunorreactiva con CD117 y CD34 y no inmunorreactiva con Lin. Las celulas proliferan in vitro. Las celulas son capaces de duplicarse 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25 o mas veces y mantener su capacidad de diferenciarse en hepatocitos, colangiocitos o celulas endoteliales hepaticas.
Se proporcionan tambien metodos de producci6n de un hepatocito o colangiocito hepatico humano o una celula
35 sinusoidal hepatica humana mediante la diferenciaci6n de cultivos de celulas progenitoras hepaticas en un medio de cultivo que contenga uno o mas factores de diferenciaci6n como se definen en las reivindicaciones 5 y 6. Los factores de diferenciaci6n incluyen factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y factor de crecimiento epidermico (EGF).
La invenci6n expone adicionalmente el uso de una celula progenitora hepatica multipotente que es CD117+, CD34+,
40 CD45- y Lin- en la fabricaci6n de una composici6n para transplante a un hospedador, por ejemplo, un mamifero tal como un ser humano, primate, rat6n, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo. Opcionalmente, se cotransplantan al hospedador celulas estromaticas hepaticas fetales o celulas mesenquimaticas hepaticas fetales. El uso de celulas derivadas de embriones humanos no esta comprendido. Se administra al hospedador factor de crecimiento de hepatocitos antes, despues o concomitantemente con las celulas progenitoras. El hospedador padece un trastorno
45 hepatico o dano de tejido hepatico. Por ejemplo, el sujeto padece hepatitis, cirrosis, cancer hepatico, esteatosis hepatica, sindrome de Reye, enfermedad de almacenamiento de gluc6geno, quistes hepaticos o enfermedad de Wilson. El transplante confiere un beneficio clinico, por ejemplo, aliviar uno o mas sintomas del trastorno hepatico particular. Los trastornos hepaticos se diagnostican por un medico usando metodos conocidos en la materia.
Se identifican los compuestos que afectan a la proliferaci6n, diferenciaci6n o supervivencia de celulas hepaticas
50 poniendo en contacto el cultivo de celulas progenitoras hepaticas con un compuesto de ensayo y determinando si el compuesto tiene efecto sobre la proliferaci6n, diferenciaci6n o supervivencia de las celulas. De forma similar, se determina el metabolito de un compuesto de ensayo. Los metabolitos se identifican cribando el medio de cultivo despues de poner en contacto el cultivo con el compuesto de ensayo. Los metabolitos se identifican mediante metodos conocidos en la materia tales como HPLC, espectroscopia de masas o electroforesis en gel. La actividad
55 antivirica de un compuesto de ensayo se determina introduciendo un virus en un cultivo de celulas progenitoras en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo y determinando la tasa de supervivencia de las celulas. Un
aumento de la tasa de supervivencia en presencia del compuesto de ensayo en comparaci6n con en ausencia del compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo tiene actividad antivirica. La infectividad de un virus se determina poniendo en contacto un cultivo de celulas progenitoras con un virus y determinando el efecto sobre la proliferaci6n o supervivencia de las celulas. Una reducci6n de la supervivencia o proliferaci6n en comparaci6n con un cultivo celular que no se ha puesto en contacto con el virus indica que el virus puede infectar celulas hepaticas. En contraposici6n, una similitud de la supervivencia o proliferaci6n en comparaci6n con un cultivo celular que no se ha puesto en contacto con el virus indica que el virus no infecta celulas hepaticas.
Opcionalmente, el cultivo se diferencia antes de poner en contacto el cultivo con un compuesto de ensayo. La proliferaci6n o supervivencia se determinan mediante metodos conocidos en la materia tales como el ensayo de BrdU. La diferenciaci6n se determina morfol6gica o histol6gicamente determinando marcadores de superficie celular hepatica. El virus es un virus tr6fico hepatico tal como virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B o virus de la hepatitis C.
A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un especialista en la materia a la que pertenece esta invenci6n. Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la practica o ensayo de la presente invenci6n, se describen los metodos y materiales adecuados a continuaci6n. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Resultaran evidentes otros rasgos y ventajas de la invenci6n a partir de la siguiente descripci6n detallada y reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es una serie de analisis por FACS y fotografias que muestran la caracterizaci6n de celulas progenitoras hepaticas humanas: a, las celulas de HF clasificadas magneticamente inmediatamente despues del aislamiento se tenian doblemente por CD117 y CD34, pero negativamente por CD90, CD45, albumina y citoqueratina 19 (CK19); b, las celulas CD117+/CD34+/Lin-crecian en colonias al cultivarse, y el primer marcador en expresarse era el receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met), n° de aumentos: 40x; c, las celulas recien aisladas y propagadas en diversos pases daban lugar a ALB-CK19-(flecha blanca), ALB+ (verde), CK19+ (rojo), ALB+CK19-(verde, hepatocitos) y ALB-CK19+ (rojo, colangiocitos), n° de aumentos: 60x; d, las celulas adherentes CD117+/CD34+/Linclasificadas magneticamente, cuando se cultivaban en medio de cultivo que contenia factor de crecimiento endotelial vascular, se diferenciaban en celulas endoteliales Flk-1+ (-50%), colangiocitos CK19+ (-13%) y hepatocitos albumina+ (-17%). Aproximadamente un 20% de las celulas no expresaban ninguno de estos marcadores.
La Fig. 2A es un grafico de barras que muestra la proliferaci6n de progenitores hepaticos y su progenie. El uso de medio acondicionado (MA) al 20% aumentaba significativamente la proliferaci6n de celulas progenitoras hepaticas y pudieron someterse a pases varias veces en comparaci6n a sin MA (p<0,001, prueba de t de Student).
La Figura 2B es un grafico de barras que muestra los resultados de analisis citometricos de flujo que demuestran
-
que se observ6 una alta proliferaci6n (celulas BrdU+) en celulas albumina+CK19+, albumina+CK19-y albuminaCK19+, mientras que la celulas negativas dobles (albumina-CK19-) eran mas quiescentes.
La Figura 2C es una serie de fotografias que muestran celulas progenitoras hepaticas en diversos pases, tenidas con fluorescencia por albumina (verde) y CK19 (rojo) y enzimaticamente para la detecci6n de la incorporaci6n de BrdU, mostrando capacidad proliferativa en diversas subpoblaciones, n° de aumentos: 40x.
Las Figuras 3A-3N son una serie de fotografias de la localizaci6n de celulas progenitoras hepaticas humanas en el higado de rat6n. a-b, Hibridaci6n in sitt con sonda centromerica humana que muestra senales nucleares en higado humano (DAB) pero no en higado de rat6n. c-d, Usando la inmunohistoquimica, se obtuvieron resultados similares con un anticuerpo anti-nucleos humanos (DAB-Ni). e-j, Las celulas recien aisladas (e-g), del 6° y 12° pases, cuando se transplantaban a ratones tratados con D-galactosamina (GalN), mostraban diferenciaci6n en hepatocitos, colangiocitos y celulas endoteliales (flechas de DAB-Ni). k, Se observaron celulas transplantadas en los higados, 1m, pero no en los bazos ni pulmones de ratones tratados con GalN. n, Se usaron higados de ratones transplantados ficticiamente como controles, n° de aumentos: 60x.
Las Fig. 4A-J son una serie de fotografias que muestran el destino in vivo de celulas progenitoras hepaticas humanas. a-d, Las celulas progenitoras hepaticas humanas un mes despues del transplante a ratones tratados con GalN contenian glucosa-6-fosfatasa (marr6n), gluc6geno (rosa), dipeptidil peptidasa IV (rojo-marr6n) y gammaglutamil transpeptidasa (marr6n). La doble tinci6n con anticuerpo anti-nucleos humanos (DAB-Ni, flechas) visualiz6 los nucleos humanos (negro). e, Regeneraci6n de un segmento de tejido de rat6n completo por progenitoras hepaticas humanas (nucleos negros, flechas). f, No se observ6 expresi6n de citoqueratina 19 (rojo-marr6n) ni g-j, albumina humana (verde) en los ratones transplantados ficticiamente, pero se observ6 (flechas) en los higados de ratones tratados con GalN que se habian transplantado con celulas progenitoras hepaticas humanas recien aisladas y del 6° y 12° pases. a-j, (N° de aumentos: 60x). f, (N° de aumentos: 200x).
La Figura 4K es una fotografia que muestra la transcripci6n de genes especificos de higado humano en higado de rat6n. Se detectaron citoqueratina 19, a-fetoproteina y albumina humanas en los higados de ratones tratados con GalN que recibieron celulas progenitoras hepaticas humanas, pero no en los ratones transplantados ficticiamente. Sin embargo, la a1-antitripsina estaba ligeramente amplificada tambien en el control. Se us6 glucosa-6-fosfato deshidrogenasa como gen domestico.
La Figura 5 es una serie de fotografias que demuestran los efectos del cotransplante de celulas estromaticas de higado fetal y celulas progenitoras de higado fetal. A, La secci6n de higado humano normal tenida con anticuerpo anti-nucleos humanos mostraba tinci6n positiva (negro/marr6n). B, La secci6n de higado de rat6n normal no mostraba tinci6n positiva con el mismo anticuerpo, demostrando la especificidad del anticuerpo. C, Los ratones tratados con retrorsina (30 mg/kg), seguida de hepatectomia parcial e inyecci6n subcutanea del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) seguido de transplante de celulas progenitoras del higado fetal, no resultaron con un alto injerto de celulas. D, Tratar los ratones con retrorsina (30 mg/kg), seguido de hepatectomia parcial e inyecci6n de celulas estromaticas aisladas de higados fetales no daba como resultado un alto injerto de celulas. E-H, Tratar los ratones con retrorsina (30 mg/kg), seguido de hepatectomia parcial y transplante de una mezcla de celulas estromaticas y progenitoras/citoblastos de higado fetal daba como resultado un alto injerto de citoblastos. I-K, Tratar los ratones con retrorsina (30 mg/kg), seguido de hepatectomia parcial e inyecci6n subcutanea de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) seguido de transplante de celulas estromaticas y progenitoras de higado fetal daba como resultado un alto injerto de celulas.
La Figura 6 es un grafico que muestra los niveles de detecci6n del factor VIII humano en ratones negros C57 atimicos normales y ratones negros C57 tratados de diversos modos.
La Figura 7 es un grafico que muestra la expresi6n de diversos marcadores de superficie celular hematopoyeticos, hepaticos y pancreaticos en higados fetales y adultos.
La Figura 8 es una serie de fotografias que muestran marcadores hepaticos en higado fetal y adulto humano.
La Figura 9A es una serie de analisis por FACS que muestran la caracterizaci6n de celulas progenitoras hepaticas humanas.
Las Figuras 9B-F son una serie de fotografias que muestran la morfologia de celulas progenitoras hepaticas humanas sobre diferentes matrices.
La Figura 10A es una fotografia de una transferencia Northern que muestra la expresi6n genica de marcadores hepaticos en celulas progenitoras hepaticas humanas.
La Figura 10B es un grafico que demuestra la expresi6n genica de marcadores hepaticos en celulas progenitoras hepaticas humanas.
DESCRIPCION DETALLADA
La presente invenci6n esta basada en el descubrimiento inesperado de una poblaci6n definida de celulas progenitoras no hematopoyeticas en el higado fetal humano que se propagan in vitro durantes varios pases y mantienen un fenotipo progenitor. Estas celulas, cuando se transplantan a animales con lesi6n hepatica aguda, exhibian diferenciaci6n funcional en hepatocitos, colangiocitos y celulas sinusoidales.
Las enfermedades hepaticas incluyen un amplio espectro de afecciones tanto agudas como cr6nicas asociadas con una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. El transplante de hepatocitos tiene un enorme potencial terapeutico en el tratamiento de enfermedades hepaticas, pero su uso clinico esta obstaculizado por la falta de tejido donante. La generaci6n de hepatocitos in vitro a partir de progenitoras de celulas hepaticas adultas o fetales, o la identificaci6n de una poblaci6n progenitora que pueda generar in vivo celulas hepaticas maduras, resolveria este problema. Los datos descritos en la presente memoria demuestran la identificaci6n de una poblaci6n definida de celulas de higados fetales humanos que se propagan exitosamente ex vivo durante varios pases y, cuando se transplantan a animales con lesi6n hepatica aguda, exhiben diferenciaci6n funcional en hepatocitos, colangiocitos y celulas sinusoidales. La propagaci6n y diferenciaci6n in vivo exitosas de las celulas progenitoras hepaticas son utiles para el transplante de celulas hepaticas, el ensayo metab6lico y toxicol6gico de candidatos a farmacos terapeuticos y un vehiculo para la terapia genica.
La presente invenci6n proporciona metodos para inducir a celulas progenitoras hepaticas humanas multipotentes de tejido de higado fetal humano a proliferar in vitro y generar grandes cantidades de progenie de celulas progenitoras humanas multipotentes capaces de diferenciarse en hepatocitos, colangiocitos y celulas sinusoidales. Se proporcionan tambien metodos de diferenciaci6n de la progenie de celulas progenitoras hepaticas humanas.
Celulas progenitoras hepaticas humanas
La invenci6n proporciona una poblaci6n celular consistente en celulas progenitoras hepaticas humanas (designadas en la presente memoria como CPH) como se definen en la reivindicaci6n 1. Una celula CPH es una celula
indiferenciada que puede inducirse a proliferar usando los metodos de la presente invenci6n. La CPH es capaz de automantenimiento, de tal modo que con cada divisi6n celular al menos una celula hija sera tambien una celula CPH. Las CPH pueden propagarse 100, 250, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o mas veces.
El fenotipado de las CPH revela que estas celulas no expresan ningun marcador hematopoyetico asignado, sin embargo, las celulas expresan marcadores de citoblastos. Por ejemplo, una CPH es inmunorreactiva con CD117 y CD34 y no inmunorreactiva con el antigeno de superficie de linaje (Lin). La CPH es una celula progenitora multipotente. Se entiende por celula progenitora multipotente que la celula es capaz de diferenciarse en mas de un tipo celular. Por ejemplo, la celula es capaz de diferenciarse en un hepatocito, un colangiocito o una celula sinusoidal.
La CD117 es tambien conocida como c-kit, receptor de factor de Steel o receptor de factor de citoblasto. La CD117 es una glucoproteina de superficie celular de 145 kDa que pertenece a la familia de tirosina cinasas receptoras de clase III. Se expresa en la mayoria de celulas progenitoras hematopoyeticas, incluyendo citoblastos hematopoyeticos multipotentes, asi como en las celulas precursoras asignadas mieloides, eritroides y linfoides. La CD117 se expresa tambien en unas pocas celulas hematopoyeticas maduras, por ejemplo, mastocitos. La CD34 es una glucoproteina transmembrana monocatenaria de 110 kDa expresada en celulas progenitoras hematopoyeticas linfoides y mieloides humanas. El antigeno de superficie de linaje es una mezcla de de 13 a 14 diferentes proteinas de superficie celular que son marcadores de linajes de celulas sanguineas maduras.
Las CPH se obtienen a partir de tejido hepatico embrionario. El tejido hepatico puede obtenerse a partir de cualquier animal que tenga tejido hepatico tal como peces, reptiles, aves, anfibios y mamiferos, por ejemplo preferiblemente roedores, tales como ratones, y seres humanos. El tejido se obtiene a partir de un feto que es de al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas semanas de edad. Las CPH representan aproximadamente un 0,5-0,7% de todo el higado fetal.
Las CPH pueden mantenerse in vitro en cultivos a largo plazo. Las CPH pueden someterse a pases de cultivo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o mas veces.
Antes del transplante, las CPH recien aisladas (celulas CD117+/CD34+/Lin-) no expresaban albumina ni CK19. Sin embargo, despues del transplante, estas celulas se diferenciaban en hepatocitos y colangiocitos maduros, como se determina mediante la expresi6n de albumina, CK19, G-6-P, GGT, DPPIV y gluc6geno humanos, y tenian una alta capacidad proliferativa. Las celulas progenitoras hepaticas expresaban los dos marcadores hematopoyeticos asociados c-kit y CD34, pero no CD45, el marcador que distingue las celulas hematopoyeticas de las celulas no hematopoyeticas. Por tanto, las CPH con amplia capacidad proliferativa descritas en la presente memoria no son de origen hematopoyetico. Ademas, al contrario de la capacidad limitada de propagarse in vitro de los citoblastos hematopoyeticos adultos, las progenitoras hepaticas de higados fetales tienen una alta capacidad proliferativa. La observaci6n de que no todas las celulas CD117+/CD34+/lin-aisladas se adherian a la placa de cultivo y se diferenciaban en celulas hepaticas durante el cultivo in vitro indica que solo una subpoblaci6n de estas celulas son progenitoras de celulas hepaticas. Las celulas CD117+/CD34+/lin-, cuando se cultivan en medio que contienen HGF y EGF, daban lugar a cuatro tipos de celulas: hepatocitos ALB-CK19-, ALB+CK19+ y ALB+CK19-y colangiocitos ALB-CK19+. Excepto para las celulas negativas dobles, todas las demas subpoblaciones tenian una alta fracci6n de celulas proliferantes (BrdU+). El subconjunto de celulas ALB-CK19-era altamente quiescente in vitro, sin embargo, in vivo el aumento de 10 veces del numero de celulas transplantadas en el pase P0 indica que estas celulas pueden tener una alta capacidad proliferativa. A pesar de la alta capacidad proliferativa de las celulas progenitoras hepaticas, no se observaron tumores in vivo cuatro semanas despues del transplante de celulas humanas. De forma interesante, las celulas CD117+/CD34+/Lin-de higados fetales tempranos, cuando se crecian en medio que contiene VEGF, no se diferenciaban solo en hepatocitos y colangiocitos, sino tambien en celulas endoteliales sinusoidales.
Condiciones de cultivo
Las CPH se hacen proliferar usando los metodos descritos en la presente memoria. Las celulas se obtienen a partir de tejido de donante mediante la disociaci6n de celulas individuales de la matriz extracelular conectiva del tejido. Se retira el tejido de fetos usando un procedimiento esteril, y se disocian las celulas usando cualquier metodo conocido en la materia, incluyendo el tratamiento con enzimas tales como tripsina, colagenasa y similares, o usando metodos fisicos de disociaci6n tales como con un instrumento romo u homogeneizador. La disociaci6n de celulas fetales puede llevarse a cabo en medio de cultivo de tejido.
Por ejemplo, puede llevarse a cabo la disociaci6n de celulas en 0,1% de tripsina y 0,05% de ADNasa en DMEM. Las celulas disociadas se centrifugan a baja velocidad, a entre 200 y 2000 rpm, habitualmente a entre 400 y 800 rpm, y se resuspenden entonces en un medio de cultivo. Las celulas hepaticas pueden cultivarse en suspensi6n o sobre un sustrato fijo. Se siembran las suspensiones de celulas disociadas en cualquier recipiente capaz de mantener las celulas, particularmente matraces de cultivo, placas de cultivo o matraces giratorios, y mas particularmente en matraces de cultivo pequenos tales como matraces de cultivo de 25 cm2. Las celulas cultivadas en suspensi6n se resuspenden a aproximadamente 5 x 104 a 2 x 105 celulas/ml (por ejemplo, 1 x 105 celulas/ml). Se siembran las celulas sembradas sobre un sustrato fijo a aproximadamente 2-3 x 103 celulas/cm2. Opcionalmente, se recubren las placas de cultivo con una proteina de matriz tal como colageno. Las celulas hepaticas disociadas pueden disponerse en cualquier medio de cultivo conocido capaz de mantener el crecimiento celular, incluyendo HEM, DMEM, RPMI, F
12 y similares, que contenga los suplementos necesarios para el metabolismo celular tales como glutamina y otros aminoacidos, vitaminas, minerales y proteinas tales como transferrina y similares. El medio de cultivo puede contener tambien antibi6ticos para evitar la contaminaci6n con levadura, bacterias y hongos tales como penicilina, estreptomicina, gentamicina y similares. El medio de cultivo puede contener suero derivado de vacas, caballos, pollos y similares.
Las condiciones de cultivo deberian ser cercanas a las condiciones fisiol6gicas. El pH del medio de cultivo deberia ser cercano al pH fisiol6gico (por ejemplo, entre pH 6-8, entre aproximadamente pH 7-7,8 o pH 7,4). Las temperaturas fisiol6gicas estan en el intervalo entre aproximadamente 30 y 40°C. Las CPH se cultivan a temperaturas entre aproximadamente 32 y aproximadamente 38°C (por ejemplo, entre aproximadamente 35 y aproximadamente 37°C).
Opcionalmente, el medio de cultivo se suplementa con al menos un factor de crecimiento inductor de la proliferaci6n ("mitogenico"). Un "factor de crecimiento" es una proteina, peptido u otra molecula que tiene un efecto inductor del crecimiento, de la proliferaci6n, inductor de la diferenciaci6n o tr6fico sobre las CPH. Los "factores de crecimiento inductores de la proliferaci6n" son factores tr6ficos que permiten a las CPH proliferar, incluyendo cualquier molecula que se una a un receptor sobre la superficie de la celula para ejercer un efecto tr6fico o inductor del crecimiento sobre la celula. Los factores de crecimiento inductores de la proliferaci6n incluyen EGF, anfirregulina, factor de crecimiento de fibroblastos acido (aFGF o FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF o FGF-2), factor de crecimiento transformante alfa (TGFa), VEGF y combinaciones de los mismos. Los factores de crecimiento se anaden habitualmente al medio de cultivo a concentraciones en el intervalo entre aproximadamente 1 ng/ml y 1 mg/ml. Las concentraciones entre aproximadamente 1 y 100 ng/ml son habitualmente suficientes. Pueden efectuarse facilmente ensayos de valoraci6n sencillos para determinar la concentraci6n 6ptima de un factor de crecimiento particular.
Los efectos biol6gicos de los factores de crecimiento y tr6ficos estan generalmente mediados por la uni6n a receptores de superficie celular. Se han identificado los receptores de una serie de estos factores y estan disponibles anticuerpos y sondas moleculares para receptores especificos. Puede analizarse en las CPH la presencia de receptores de factor de crecimiento en todas las etapas de diferenciaci6n. En muchos casos, la identificaci6n de un receptor particular proporciona la guia para la estrategia de uso en la diferenciaci6n adicional de las celulas a lo largo de rutas de desarrollo especificas con la adici6n de factores de crecimiento o tr6ficos ex6genos.
Generalmente, despues de aproximadamente 3-10 dias in vitro, se retiran mediante aspiraci6n del medio las CPH en proliferaci6n y se anade medio reciente al matraz de cultivo. Opcionalmente, se recoge el medio aspirado, se filtra y se usa como medio acondicionado para pases posteriores de las CPH. Por ejemplo, se usa el medio acondicionado al 10%, 20%, 30%, 40% o mas.
El cultivo de celulas CPH puede someterse facilmente a pases para reiniciar la proliferaci6n. Por ejemplo, despues de 3-7 dias in vitro, se agitan bien los matraces de cultivo y se transfieren entonces las CPH a un tubo de centrifuga de 50 ml y se centrifugan a baja velocidad. Se aspira el medio y se resuspenden las CPH en una pequena cantidad de medio de cultivo. Se cuentan entonces las celulas y se resiembran a la densidad deseada para reiniciar la proliferaci6n. Este procedimiento puede repetirse semanalmente para dar como resultado un aumento logaritmico del numero de celulas viables en cada pase. Se continua el procedimiento hasta obtener el numero deseado de CPH.
Las CPH y progenie de CPH pueden crioconservarse mediante cualquier metodo conocido en la materia hasta que sean necesarias (veanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.071.741, solicitudes de patente internacional PCT WO93/14191, WO95/07611, WO96/27287, WO96/29862 y WO98/14058, Karlsson et al., 65 Biophysical J. 2524-2536 (1993)). Las CPH pueden suspenderse en una disoluci6n isot6nica, preferiblemente un medio de cultivo celular, que contenga un crioconservante particular. Dichos crioconservantes incluyen dimetilsulf6xido (DMSO), glicerol y similares. Estos crioconservantes se usan a una concentraci6n de 5-15% (por ejemplo, 8-10%). Las celulas se congelan gradualmente a una temperatura de -10 a -150°C (por ejemplo, de -20 a -100°C o de -70 a -80°C).
Diferenciaci6n de celulas progenitoras hepaticas humanas
Dependiendo de las condiciones de cultivo, las CPH pueden diferenciarse en hepatocitos, colangiocitos o celulas sinusoidales.
Las CPH pueden diferenciarse en hepatocitos o colangiocitos cultivando las CPH sobre un sustrato fijo en un medio de cultivo con HGF y EGF. Como alternativa, las CPH pueden diferenciarse en celulas sinusoidales cultivando las CPH sobre un sustrato fijo en un medio de cultivo con VEGF.
La diferenciaci6n de las CPH puede inducirse tambien mediante cualquier metodo conocido en la materia que active la cascada de eventos biol6gicos que conduce al crecimiento, lo que incluye la liberaci6n de trifosfato de inositol y Ca2+ intracelular, la liberaci6n de diacilglicerol y la activaci6n de proteina cinasa C y otras cinasas celulares y similares. El tratamiento con esteres de forbol, factores de crecimiento inductores de la diferenciaci6n y otras senales quimicas puede inducir la diferenciaci6n. En lugar de factores de crecimiento inductores de la proliferaci6n para la proliferaci6n de CPH (vease anteriormente), pueden anadirse factores de crecimiento inductores de la
diferenciaci6n al medio de cultivo para influir en la diferenciaci6n de las CPH. Otros factores de crecimiento inductores de la diferenciaci6n incluyen factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), hormona liberadora de tirotropina (TRH), factor de crecimiento transformante beta (TGF�), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-1) y similares.
Los hepatocitos, colangiocitos o celulas sinusoidales diferenciados se detectan usando tecnicas inmunocitoquimicas conocidas en la materia. La inmunocitoquimica (por ejemplo, inmunofluorescencia de doble marcador y metodos de inmunoperoxidasa) usa anticuerpos que detectan proteinas celulares para distinguir las caracteristicas celulares o propiedades fenotipicas de las celulas hepaticas. Los marcadores celulares de los hepatocitos y colangiocitos incluyen albumina y CK10, mientras que los marcadores celulares de celulas sinusoidales incluyen Flk. Otros marcadores adecuados incluyen glucosa-6-fosfatasa, gluc6geno, dipeptidil peptidasa IV y gamma-glutaril transpeptidasa.
La inmunocitoquimica puede usarse tambien para identificar celulas hepaticas, detectando la expresi6n de genes hepaticos responsables de la funci6n hepatica tales como albumina, alfa-1-antitripsina, CK-19, a-proteina fetal o factor VIII humano.
Puede efectuarse tambien una histoquimica de hibridaci6n in sitt usando sondas de ADNc o ARN especificas del ARNm de genes hepaticos. Estas tecnicas pueden combinarse con metodos inmunocitoquimicos para potenciar la identificaci6n de fenotipos especificos. Si es necesario, pueden aplicarse los anticuerpos y sondas moleculares discutidos anteriormente a procedimientos de transferencia Western y Northern respectivamente para ayudar a la identificaci6n de celulas.
Transplante de celulas progenitoras hepaticas humanas
El transplante de nuevas celulas a higado danado tiene el potencial de reparar el tejido hepatico danado, restableciendo asi la funci6n hepatica. Opcionalmente, se cotransplantan celulas estromaticas fetales y/o HGF con las CPH. Sin embargo, la ausencia de celulas adecuadas con fines de transplante ha evitado que se alcanzase el potencial completo de este procedimiento. Las celulas "adecuadas" son celulas que satisfacen los siguientes criterios: (1) pueden obtenerse en grandes cantidades; (2) pueden hacerse proliferar in vitro permitiendo la inserci6n de material genetico, si es necesario; (3) son capaces de sobrevivir indefinidamente y facilitar la reparaci6n hepatica al transplantarse al higado y (4) son no inmunogenicas, obtenidas preferiblemente a partir de tejido del propio paciente o de un donante compatible.
Las CPH obtenibles a partir de tejido hepatico fetal, que pueden dividirse durante periodos prolongados mantenidas in vitro usando las condiciones de cultivo descritas en la presente memoria, satisfacen todos los requisitos deseables de celulas adecuadas con fines de transplante hepatico y son una estirpe celular particularmente adecuada, ya que las celulas no se han inmortalizado y no son de origen tumorigenico. El uso de CPH en el tratamiento de trastornos hepaticos puede demostrarse mediante el uso de modelos animales.
Las CPH se administran a cualquier animal con sintomas hepaticos anormales o de insuficiencia hepatica. Las CPH pueden prepararse a partir de tejido donante que sea xenogenico para el hospedador. Para que los xenoinjertos sean exitosos, se emplea habitualmente algun metodo de reducci6n o eliminaci6n de la respuesta inmunitaria al tejido implantado. Por tanto, los receptores de CPH pueden inmunosuprimirse mediante el uso de farmacos inmunosupresores tales como ciclosporina o mediante estrategias de inmunosupresi6n local que emplean inmunosupresores aplicados localmente. La inmunosupresi6n local se da a conocer por Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992). La patente de Estados Unidos 5.026.365 da a conocer metodos de encapsulaci6n adecuados para inmunosupresi6n local.
Como alternativa a emplear tecnicas de inmunosupresi6n, pueden aplicarse a las CPH metodos de sustituci6n o bloqueo genico usando recombinaci6n hom6loga en citoblastos embrionarios, como ensenan Smithies et al., 317 Nature 230-234 (1985), y extenderse a la sustituci6n o bloqueo genico en estirpes celulares (Zheng et al., 88 Proc. Natl. Acad. Sci. 8067-8071 (1991)), para la anulaci6n de los genes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las CPH que carecen de expresi6n de MHC permiten el injerto de poblaciones de celulas hepaticas enriquecidas a traves de la barrera de histocompatibilidad alogenica, y quizas incluso xenogenica, sin necesidad de inmunosuprimir el receptor. Las revisiones y citas generales para el uso de metodos recombinantes para reducir la antigenicidad de celulas donantes se dan a conocer tambien por Gruber, 54 Transplantation 1-11 (1992). Se dan a conocer enfoques ejemplares para la reducci6n de la inmunogenicidad de transplantes por modificaci6n de superficie por las solicitudes de patente internacional PCT WO 92/04033 y PCT/US99/24630. Como alternativa, puede reducirse la inmunogenicidad del injerto preparando CPH a partir de un animal transgenico que tiene antigenos de MHC alterados o eliminados.
Las CPH pueden encapsularse y usarse para suministrar factores al hospedador segun tecnologias de encapsulaci6n conocidas, incluyendo microencapsulaci6n (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 4.352.883, 4.353.888 y 5.084.350) y macroencapsulaci6n (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.284.761, 5.158.881, 4.976.859 y 4.968.733 y las solicitudes de patente internacional PCT WO 92/19195 y WO 95/05452). La macroencapsulaci6n se describe en las patentes de Estados Unidos 5.284.761, 5.158.881, 4.976.859,
4.968.733, 5.800.828 y la solicitud de patente internacional PCT WO 95/05452. El numero de celulas en los dispositivos puede variar, preferiblemente cada dispositivo contiene entre 103-109 celulas (por ejemplo, de 105 a 107 celulas). Pueden implantarse multiples dispositivos de macroencapsulaci6n en el hospedador.
Se ensaya el uso de las CPH preparadas a partir de tejido alogenico del receptor mediante metodos bien conocidos de tipado de tejido, para que coincida estrechamente con el tipo de histocompatibilidad del receptor.
Las CPH pueden prepararse a veces a partir del propio higado del receptor (por ejemplo, en el caso de biopsias de eliminaci6n de tumor). En dichos casos, las CPH pueden generarse a partir de tejido disociado y hacerse proliferar in vitro usando los metodos descritos anteriormente. Tras una propagaci6n adecuada del numero de celulas, pueden recogerse las CPH, modificarse geneticamente si es necesario y disponerse para inyecci6n directa en el higado del receptor.
Las CPH que se administran a la regi6n hepatica pueden formar un injerto hepatico, de modo que las celulas formen conexiones normales con las celulas hepaticas vecinas, manteniendo el contacto con las celulas hepaticas transplantadas o existentes. Por tanto, las CPH transplantadas restablecen el tejido hepatico que se ha danado debido a enfermedad y envejecimiento.
La integraci6n funcional del injerto en el tejido hepatico del hospedador puede valorarse examinando la eficacia de los injertos sobre el restablecimiento de diversas funciones, incluyendo el analisis de sangre de alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP), albumina, proteina total y bilirrubina total y directa.
La capacidad de propagar CPH in vitro para uso en transplante es tambien util para la terapia genica ex vivo. Por tanto, las CPH proporcionan un modo adicional de recuperar y propagar celulas hepaticas para uso como vehiculos en ensayos de terapia genica ex vivo.
Modificaci6n genetica de celulas progenitoras hepaticas
Aunque las CPH son celulas primarias no transformadas, poseen rasgos de una estirpe celular continua. En el estado indiferenciado, las CPH se dividen continuamente y son por tanto dianas para la modificaci6n genetica. En algunas realizaciones, las celulas modificadas geneticamente se inducen a diferenciarse en hepatocitos, colangiocitos o celulas sinusoidales mediante cualquiera de los metodos descritos anteriormente.
El termino "modificaci6n genetica" designa la alteraci6n estable o transitoria del genotipo de una CPH mediante la introducci6n intencionada de ADN ex6geno. El ADN puede ser sintetico o con carencias naturales y puede contener genes, porciones de genes u otras secuencias de ADN utiles. El termino "modificaci6n genetica" como se usa en la presente memoria no se pretende que incluya las alteraciones de origen natural tales como las que aparecen por la actividad virica natural, recombinaci6n genetica o similar.
Cualquier modificaci6n genetica util de las celulas esta dentro del alcance de la presente invenci6n. Por ejemplo, las CPH pueden modificarse para producir o aumentar la producci6n de una sustancia biol6gicamente activa tal como un factor de crecimiento o similar. En una realizaci6n, la sustancia biol6gicamente activa es un factor de transcripci6n tal como un factor de transcripci6n que modula la diferenciaci6n genetica. En una realizaci6n alternativa, la sustancia biol6gicamente activa es un factor de proliferaci6n no mitogenico, por ejemplo, v-myc, T grande de SV-40 o telomerasa.
La modificaci6n genetica se efectua por infecci6n con vectores viricos (retrovirus, herpesvirus modificados, herpesvirus, adenovirus, virus adenoasociados y similares) o transfecci6n usando metodos conocidos en la materia (lipofecci6n, transfecci6n con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporaci6n y similares) (vease Maniatis et al., en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982)). Por ejemplo, los constructos genicos quimericos pueden contener promotores viricos, por ejemplo repeticiones terminales largas (LTR) retroviricas, de virus de simio 40 (SV40), citomegalovirus (CMV) o especificos de celulas de mamifero tales como tirosina hidroxilasa (TH, un marcador de celulas de dopamina), DBH, feniletanolamina N-metiltransferasa (PNMT), ChAT, GFAP, NSE, las proteinas NF (NE-L, NF-M, NF-H y similares) que dirigen la expresi6n de los genes estructurales que codifican la proteina deseada. Ademas, los vectores pueden incluir un marcador de selecci6n de farmaco tal como el gen de aminogluc6sido fosfotransferasa de E. coli, que cuando se coinfecta con el gen de ensayo, confiere resistencia a geneticina (G418), un inhibidor de la sintesis proteica.
Las CPH pueden modificarse geneticamente usando transfecci6n con vectores de expresi6n. En un protocolo, el ADN vectorial que contiene los genes se diluye en 0,1X TE (Tris 1 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM) a una concentraci6n de 40 Ig/ml. Se anaden 22 Il del ADN a 250 Il de 2X HBS (NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1,5 mM, dextrosa 12 mM, HEPES 50 mM) en un tubo de plastico desechable esteril de 5 ml. Se anaden lentamente 31 Il de CaCl2 2 M y se incuba la mezcla durante 30 minutos (min) a temperatura ambiente. Durante esta incubaci6n de 30 min, se centrifugan las celulas a 800 g durante 5 min a 4°C. Se resuspenden las celulas en 20 volumenes de PBS enfriado con hielo y se dividen en alicuotas de 1x107 celulas, que se centrifugan de nuevo. Se resuspende cada alicuota de celulas en 1 ml de suspensi6n de ADN-CaCl2 y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. Se diluyen
entonces las celulas en medio de crecimiento y se incuban durante 6-24 h a 37°C en 5-7% de CO2. Se centrifugan de nuevo las celulas, se lavan con PBS y se devuelven a 10 ml de medio de crecimiento durante 48 h.
Las CPH se modifican geneticamente tambien usando tecnicas de transfecci6n con fosfato de calcio. Para transfecci6n con fosfato de calcio estandar, se disocian mecanicamente las celulas en una suspensi6n de celulas individuales, se siembran sobre discos tratados de cultivo de tejido a un 50% de confluencia (50.000-75.000 celulas/cm2) y se dejan unirse durante una noche. En un protocolo, se efectua el procedimiento de transfecci6n de fosfato de calcio modificado como sigue: se anade ADN (15-25 Ig) en tamp6n TE esteril (Tris 10 mM, EDTA 0,25 mM, pH 7,5) diluido a 440 Il con TE, y 60 Il de CaCl2 2 M (pH 5,8 con tamp6n HEPES 1 M) al tamp6n de ADN/TE. Se anaden gota a gota a esta mezcla un total de 500 Il de 2x HeBS (HEPES-disoluci6n salina tamponada; NaCl 275 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1,4 mM, dextrosa 12 mM, tamp6n HEPES 40 mM en polvo, pH 6,92). Se deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 min. Se lavan brevemente las celulas con 1x HeBS, se anade 1 ml de la disoluci6n de ADN precipitado con fosfato de calcio a cada placa y se incuban las celulas a 37°C durante 20 min. Despues de esta incubaci6n, se anaden 10 ml de medio a las celulas y se disponen las placas en un incubador (37°C, 9,5% de CO2) durante 3-6 horas adicionales. Se retiran el ADN y el medio mediante aspiraci6n al final del periodo de incubaci6n, se lavan las celulas 3 veces y se devuelven entonces al incubador.
Cuando la modificaci6n genetica es para la producci6n de una sustancia biol6gicamente activa, la sustancia puede ser aquella que sea util para el tratamiento de un trastorno hepatico dado. Las CPH se modifican geneticamente para expresar un agente biol6gicamente activo, tal como factores de crecimiento y receptores de factor de crecimiento. Por ejemplo, puede desearse modificar geneticamente celulas para que secreten un factor de crecimiento inductor de la proliferaci6n o un factor de crecimiento inductor de la diferenciaci6n. Los productos de factor de crecimiento utiles en el tratamiento de trastornos hepaticos incluyen HGF, VEGF, FGF-1, FGF-2, EGF, TGFa, TGF�, PDGF, IGF y las interleucinas.
Las CPH modificadas geneticamente pueden implantarse para terapia celular o terapia genica en el SNC de un receptor necesitado de la molecula biol6gicamente activa producida por las celulas modificadas geneticamente. Las tecnicas de transplante se detallan a continuaci6n.
Como alternativa, las CPH modificadas geneticamente pueden someterse a diversos protocolos de diferenciaci6n in vitro antes del implante. Una vez se han diferenciado las celulas, se vuelve a ensayar la expresi6n de la proteina deseada. Las celulas que tienen el fenotipo deseado pueden aislarse e implantarse en receptores necesitados de la proteina o molecula biol6gicamente activa que se expresa por la celula modificada geneticamente.
Metodos para cribar los efectos de los farmacos sobre las celulas progenitoras hepaticas
Pueden usarse cultivos de CPH para cribar composiciones terapeuticas potenciales. Por ejemplo, las CPH se usan para identificar compuestos que afecten a la proliferaci6n, diferenciaci6n o supervivencia de celulas hepaticas. Ademas, las CPH se usan para identificar compuestos antiviricos, determinar la infectividad de un virus o identificar metabolitos de un compuesto de ensayo. Estas composiciones de ensayo pueden aplicarse a celulas en cultivo a diversas dosificaciones, y monitorizarse la respuesta de las celulas durante diversos periodos de tiempo. Las caracteristicas fisicas de las celulas pueden analizarse observando el crecimiento celular y la morfologia con microscopio. Puede analizarse la inducci6n de la expresi6n de niveles nuevos o aumentados de proteinas tales como enzimas, receptores y otras moleculas de superficie celular, o de neurotransmisores, aminoacidos, neuropeptidos y aminas biogenicas con cualquier tecnica conocida en la materia que pueda identificar la alteraci6n del nivel de dichas moleculas. Estas tecnicas incluyen la inmunohistoquimica, que usa anticuerpos contra dichas moleculas, o el analisis bioquimico. Dicho analisis bioquimico incluye ensayos de proteina, ensayos enzimaticos, ensayos de uni6n de receptor, ensayos de inmunosorci6n ligados a enzima (ELISA), analisis electroforeticos, analisis por cromatografia liquida de alta resoluci6n (HPLC), transferencias Western y radioinmunoensayos (RIA). Los analisis de acido nucleico tales como las transferencias Northern pueden usarse para examinar los niveles de ARNm que codifica estas moleculas o enzimas que sintetizan estas moleculas.
Las CPH pueden usarse en metodos para la determinaci6n del efecto de un agente biol6gico sobre celulas hepaticas. El termino "agente biol6gico" designa cualquier agente, tal como un virus, proteina, peptido, aminoacido, lipido, carbohidrato, acido nucleico, nucle6tido, farmaco, profarmaco u otra sustancia que pueda tener efecto sobre celulas neurales, tanto si dicho efecto es danino, beneficioso u otro. Los agentes biol6gicos que son beneficiosos para las celulas hepaticas se designan en la presente memoria como "agentes hepaticos", un termino que comprende cualquier sustancia biol6gica o farmaceuticamente activa que pueda probarse potencialmente util para la proliferaci6n, diferenciaci6n o funcionamiento de celulas hepaticas o el tratamiento de una enfermedad o trastorno hepatico.
Para determinar el efecto de un agente biol6gico potencial sobre celulas hepaticas, puede obtenerse un cultivo de CPH a partir de tejido hepatico o, como alternativa, a partir de un hospedador aquejado de una enfermedad o trastorno hepatico. La elecci6n de las condiciones de cultivo depende del agente particular que se este ensayando y de los efectos que se quieran conseguir. Una vez se obtienen las celulas a partir del tejido donante deseado, se hacen proliferar in vitro.
Es posible cribar agentes biol6gicos que aumenten la capacidad proliferativa de las CPH, lo que seria util para generar grandes cantidades de celulas con fines de transplante. Es tambien posible cribar agentes biol6gicos que inhiban la proliferaci6n de CPH. Las CPH se siembran en presencia de los factores biol6gicos de interes y se ensaya el grado de proliferaci6n que aparezca. Pueden determinarse los efectos de un agente biol6gico o combinaci6n de agentes biol6gicos sobre la diferenciaci6n y supervivencia de las CPH y su progenie.
Es posible cribar CPH que se hayan inducido ya a diferenciarse antes del cribado. Es tambien posible determinar los efectos de los agentes biol6gicos sobre el proceso de diferenciaci6n aplicandolos a las CPH antes de la diferenciaci6n. Generalmente, el agente biol6gico puede solubilizarse y anadirse al medio de cultivo a concentraciones variables para determinar el efecto del agente a cada dosis. El medio de cultivo puede recargarse con el agente biol6gico cada par de dias en cantidades que mantengan la concentraci6n del agente mas o menos constante.
Los cambios en la proliferaci6n se observan por un aumento o reducci6n del numero de celulas. Un "factor regulador" es un factor biol6gico que tiene un efecto regulador sobre la proliferaci6n de CPH. Por ejemplo, un factor biol6gico se consideraria un "factor regulador" si aumentara o redujera el numero de CPH que proliferan in vitro en respuesta a un factor de crecimiento inductor de la proliferaci6n (tal como EGF). Como alternativa, el numero de CPH que responden a factores inductores de la proliferaci6n puede permanecer constante, pero la adici6n del factor regulador afecta a la velocidad a la que proliferan las CPH. Un factor de crecimiento inductor de la proliferaci6n puede actuar como factor regulador cuando se usa en combinaci6n con otro factor de crecimiento inductor de la proliferaci6n.
Usando este metodo de cribado, un especialista en la materia puede cribar los efectos secundarios del farmaco potencial sobre celulas hepaticas ensayando los efectos de los agentes biol6gicos sobre la proliferaci6n y diferenciaci6n de celulas hepaticas o la supervivencia y funci6n de las celulas hepaticas diferenciadas. Las CPH proliferadas se siembran tipicamente a una densidad de aproximadamente 5-10 x 106 celulas/ml. Si se desea ensayar el efecto del agente biol6gico sobre un tipo celular diferenciado particular o una composici6n dada de celulas, puede manipularse la relaci6n de celulas hepatociticas y colangiociticas obtenida despues de la diferenciaci6n, separando los diferentes tipos de celulas.
Los efectos de los agentes biol6gicos se identifican basandose en las diferencias significativas en cuanto a los cultivos de control con respecto a criterios tales como las relaciones de fenotipos expresados, viabilidad celular y alteraciones de la expresi6n genica. Las caracteristicas fisicas de las celulas pueden analizarse observando la morfologia celular y el crecimiento con microscopio. La inducci6n de la expresi6n de niveles nuevos o aumentados de proteinas tales como enzimas, receptores y otras moleculas de superficie celular puede analizarse con cualquier tecnica conocida en la materia que pueda identificar la alteraci6n del nivel de dichas moleculas. Estas tecnicas incluyen inmunohistoquimica, que usa anticuerpos contra dichas moleculas, o analisis bioquimicos. Dichos analisis bioquimicos incluyen ensayos de proteina, ensayos enzimaticos, ensayos de uni6n de receptor, ensayos de inmunosorci6n ligada a enzima (ELISA), analisis electroforeticos, analisis por cromatografia liquida de alta resoluci6n (HPLC), transferencias Western y radioinmunoensayos (RIA). Los analisis de acido nucleico tales como transferencias Northern y PCR puede usarse para examinar los niveles de ARNm que codifica estas moleculas o enzimas que sintetizan estas moleculas.
Los factores implicados en la proliferaci6n de CPH y la proliferaci6n, diferenciaci6n y supervivencia de progenie de CPH, y sus respuestas ante agentes biol6gicos, pueden aislarse construyendo colecciones de ADNc a partir de CPH
o progenie de CPH en diferentes etapas de su desarrollo usando tecnicas conocidas en la materia. Las colecciones de celulas en una etapa de desarrollo se comparan con aquellas de celulas en diferentes etapas de desarrollo para determinar la secuencia de expresi6n genica durante el desarrollo y para revelar los efectos de diversos agentes biol6gicos o para revelar nuevos agentes biol6gicos que alteren la expresi6n genica en celulas hepaticas. Cuando las colecciones se preparan a partir de tejido disfuncional, pueden identificarse los factores geneticos que desempenan un papel en la causa de disfunci6n comparando las colecciones de tejido disfuncional con las de tejido normal. Esta informaci6n puede usarse en el diseno de terapias para tratar los trastornos. Adicionalmente, pueden identificarse sondas para uso en el diagn6stico de diversos trastornos geneticos o para uso en la identificaci6n de celulas hepaticas en una etapa de desarrollo particular.
La presente invenci6n se ilustra adicionalmente, pero no se limita, por los siguientes ejemplos.
EJEMPLO 1: METODOS GENERALES
Aislamiento de celtlas hepaticas fetales htmanas
Se concedi6 permiso para el presente estudio por el comite etico local del hospital de la Universidad de Huddinge. Se obtuvieron tejidos de HF humanos a partir de fetos abortados a las 6-9,5 semanas de gestaci6n segun las directrices suecas. El protocolo de estudio fue aprobado por el comite etico local. Se efectu6 un legrado uterino por aspiraci6n modificado (33). La edad gestacional se estim6 segun marcadores anat6micos especificos (34) en los fetos de <12 semanas de gestaci6n y por medidas del diametro biparietal por ultrasonidos en fetos mayores (35). La edad gestacional se da como edad menstrual. Los abortos se efectuaron en embarazos sin anormalidades
aparentes, y no se incluyeron los fetos con anomalias. Se diseccion6 el HF y se dispuso en un tubo esteril que contenia medio RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen Corp., RU). Se disgreg6 el higado en una suspensi6n de celulas individuales mediante paso a traves de una malla metalica de 70 Im. Se centrifug6 la suspensi6n de celulas individuales a 200 g durante 10 min para sedimentar las celulas. Se habian cribado serol6gicamente en todas las mujeres que donaron tejido fetal la sifilis, toxoplasmosis, rubeola, VIH-1, citomegalovirus, hepatitis B y C, parovirus y herpesvirus simples de tipos 1 y 2.
Aislamiento de celtlas mediante clasificaci6n celtlar magnetica y ctltivo in vitro
Se prepararon suspensiones de celulas individuales a partir de celulas hepaticas fetales en las semanas de gestaci6n 7-9. Se aislaron las celulas usando el kit de enriquecimiento y aislamiento de celulas progenitoras primigenias humanas (Stem cell technologies, Vancouver, Canada) seguido del sistema de perlas magneticas para la separaci6n activada magneticamente de celulas (Stem cell techologies). El metodo esta basado en una selecci6n negativa de esta poblaci6n usando un c6ctel de empobrecimiento que incluye anticuerpos de 12 antigenos de superficie celular especificos de linaje (anti-CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD36, CD38, CD45RA, CD56, CD66b, glucoforina A). Se llev6 a cabo el procedimiento como se describe por los fabricantes. En cada ocasi6n, se analizaron inmediatamente las celulas progenitoras recuperadas por citometria de flujo para asegurar que no estaban presentes celulas lin+ contaminantes y para confirmar el genotipo progenitor (CD117+/CD34+/lin-) de las celulas. Se ensay6 la viabilidad de las celulas progenitoras recuperadas al final del procedimiento, despues de lo cual se sembraron las celulas en placas Petri de plastico recubiertas con colageno de tipo I (Biocoat, Becton and Dickinson, Nueva Jersey, EE.UU.) y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO, Invitrogen, Estocolmo, Suecia) que contenia 10% de suero fetal de ternero inactivado, penicilina y estreptomicina, 5% de L-glutamina, 5% de aminoacidos esenciales minimos, HGF 50 ng/ml (R&D Systems, Abingdon, Inglaterra), EGF 20 ng/ml (R&D Systems) y factor de crecimiento de fibroblastos basico 10 ng/ml (R&D Systems). Se recogi6 el medio cada tres dias, se centrifug6, se esteriliz6 por filtraci6n y se us6 como medio acondicionado (MA). Se efectu6 todo el subcultivo posterior usando MA al 20%. En algunos experimentos, se cultivaron las celulas progenitoras en medio DMEM que contenia HGF 20 ng/ml, EGF 10 ng/ml y VEGF 50 ng/ml (R&D Systems) y se dej6 dividir en cultivo. Para la detecci6n de la proliferaci6n, se incubaron las celulas en cultivo con el analogo de timidina BrdU (30 mM) durante 30 min. Se lavaron las celulas y se tineron por albumina, citoqueratina 19 y BrdU usando un anticuerpo de cabra conjugado con FITC contra albumina humana (Natutec, Frankfurt, Alemania), un anticuerpo anticitoqueratina 19 humana no conjugado (Neomarker, EE.UU.) y un anticuerpo anti-BrdU no conjugado (Sigma, Estocolmo, Suecia). Otros anticuerpos usados para fenotipado fueron anti-CD45, CD14, CD90, CD117 y CD34 (Pharmingen, EE.UU.), anti-Flk-1 (ReliaTech, Alemania) y anticuerpos especificos de la subclase secundaria IgG1 de cabra anti-rat6n (FITC/rojo Tejas) e IgG2a de cabra anti-rat6n. Se us6 citometria de flujo e inmunocitoquimica para fenotipar las celulas progenitoras. Se llevaron a cabo los procedimientos como se ha descrito (36).
Se usaron celulas progenitoras recien aisladas (P0) y celulas propagadas in vitro en los pases 6 (P6) y 12 (P12) para lo estudios de transplante.
Ratones
El comite de cuidado y uso de animales del hospital Huddinge aprob6 los protocolos animales. Se indujo el dano hepatico en ratones C57 negros/atimicos (n= 16) mediante la administraci6n de GalN (Sigma Chemicals Co., Estocolmo, Suecia) por via intraperitoneal a 0,7 g/kg de peso corporal 24 h antes de una hepatectomia parcial. Se disolvi6 la GalN en disoluci6n salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (PBS) a 100 mg/ml. Se llev6 a cabo la hepatectomia parcial (HP) como se ha descrito anteriormente (37). Se continu6 la administraci6n de GalN durante 10 dias despues de la HP.
Se transplantaron celulas progenitoras hepaticas al bazo de estos animales. Se anestesiaron los animales con eter y se inyectaron tipicamente 1x105 celulas recien aisladas (P0) y 1x106 celulas de los pases 6 y 12 suspendidas en 200 Il de medio DMEM en el bazo durante aproximadamente 10-15 s. Se transplantaron ficticiamente 4 ratones con solo medio DMEM. Despues de asegurar la hemostasia, se cerr6 la incisi6n abdominal y se monitorizaron detalladamente los animales hasta su recuperaci6n.
Preparaci6n de higados y analisis de fltorescencia en criosecciones
Se sacrificaron los ratones 4 semanas despues del transplante y se extirparon higados, bazos y pulmones. Se congelaron rapidamente 2 o 3 biopsias de cada higado de aproximadamente 2 mm2 en nitr6geno liquido y se usaron en el aislamiento de ARN para efectuar analisis de PCR-TI. Se congel6 rapidamente el resto del tejido hepatico para analisis de fluorescencia e inmunohistoquimico. Se secaron al aire criosecciones de 5 Im, se fijaron con 30% de acetona fria en metanol durante 10 min y se analizaron adicionalmente por inmunohistoquimica.
Inmtnohistoqtimica
Se ensayaron inicialmente dos metodos para la detecci6n de celulas humanas en el parenquima de rat6n: a) una tecnica de hibridaci6n in sitt que usa una sonda de ADN humano total marcada con digoxigenina (Cytocell, Oxfordshire, RU) (38) y b) un anticuerpo monoclonal de rat6n anti-nucleos humanos (Chemicon, CA, EE.UU.), seguido de tinci6n con anticuerpo secundario de caballo anti-rat6n biotinilado. Se llev6 a cabo el procedimiento de
inmunoperoxidasa usando el kit Vectastain Elite ABC (ImmunKemi, Estocolmo, Suecia) como se describe por los fabricantes. Se us6 el kit de sustrato tetraclorhidrato de diaminobencidina (DAB)-niquel como desarrollador del color. Para las dobles tinciones, se usaron combinaciones de DAB (da una tinci6n de color marr6n) y/o DAB-Ni (negro) y/o el kit Vector NovaRed. Eran otros anticuerpos primarios usados un anticuerpo de cabra anti-albumina humana conjugado con FITC (no reactivo cruzado con rat6n) (Natutec, Frankfurt, Alemania), un anticuerpo anti-citoqueratina humana 19 no conjugado (Neomarker, EE.UU.) y un anticuerpo de rat6n anti-CD26 humana no conjugado (detecta la dipeptidil peptidasa IV) (Pharmingen, EE.UU.). Se demostraron GGT, G-6-P y gluc6geno in sitt como se ha descrito anteriormente (39, 40). Se contratineron las secciones con hematoxilina y se montaron en medios de montaje (ImmunKemi, Estocolmo, Suecia).
Analisis morfometrico
Se cribaron en 60 secciones en serie de cada higado de rat6n las celulas humanas positivas de DAB-Ni. Se determin6 el numero de celulas transplantadas en agrupamientos de tres tamanos, concretamente, celulas dispuestas individualmente o en agrupamientos de ;2-20 o > 20 celulas cada uno. Se analiz6 un minimo de 100 campos de alta resoluci6n en tejidos de todos los animales transplantados.
Reacci6n en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (PCR-TI)
Se extrajo el ARN total de cuatro tejidos de higado murido quimerico humano-rat6n y un tejido de higado de rat6n normal usando el kit de aislamiento de ARN Micro-FastTrack (Invitrogen, Groningen, Holanda). Se usaron cebadores especificos humanos para detectar la expresi6n de albumina, CK-19, a-fetoproteina y a1-antitripsina humanas en higado de rat6n. Se seleccionaron los cebadores para CK-19, a-fetopoteina, albumina, antitripsina y glucosa-6fosfato deshidrogenasa (G6PD) usando el softtare Primer Express versi6n 2.0 (Applied Biosystems). Se disen6 cada conjunto de cebadores para orientarse al ADNc diana solo, no a ADN contaminante. Se sintetizaron comercialmente los conjuntos de cebadores por CyberGene (Huddinge, Suecia).
Las secuencias cebadoras eran
"CK-19 codificante": 5'-CCTGCGGGACAAGATTCTTG-3' (SEQ ID NO: 1),
anticodificante-5'-ACGGGCGTTGTCGATCTG-3' (SEQ ID NO:2), tamano de producto esperado (pb):70
"a-fetoproteina codificante": 5'-GCAAAGCTGAAAATGCAGTTGA-3' (SEQ ID NO: 3),
anticodificante 5'-GGAAAGTTCGGGTCCCAAAA-3' (SEQ ID NO:4), tamano de producto esperado (pb):129
"albumina codificante": 5'-GCTTTGCCGAGGAGGGTAA-3' (SEQ ID NO: 5),
anticodificante 5'-GGTAGGCTGAGATGCTTTTAAATGT-3', tamano de producto esperado (pb):88
"a1-antitripsina codificante": 5'-CAGAGGAGGCACCCCTGAA-3' (SEQ ID NO: 6),
anticodificante 5'-AGTCCCTTTCTCGTCGATGGT-3'(SEQ ID NO:7), tamano de producto esperado (pb): 71
"G6PD codificante": 5'-TGC CCC CGA CCG TCT AC-3' (SEQ ID NO: 8),
anticodificante 5'-ATG CGG TTC CAG CCT ATC TG-3'(SEQ ID NO:9), tamano de producto esperado (pb):76.
Se realizaron las reacciones de PCR por duplicado en placas 6pticas de 96 pocillos en un volumen total de 25 Il. Cada reacci6n contenia 2,5 Il de ADNc, 12,5 Il de SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) y 500 nM de cada cebador. Se incluyeron controles positivos y negativos en todos los procesos. Las condiciones de ciclaci6n termica eran 2 min a 50°C inicialmente y 10 min a 95°C, como se recomienda por el fabricante. Las condiciones del ciclo eran 40 ciclos a 95°C durante 15 s y a 60°C durante 1 min. Se incluy6 el gen domestico, G6PD, como control de normalizaci6n end6gena, que se us6 para confirmar el aislamiento de ARN y transcripci6n inversa exitosos y la cantidad total de ARN en cada muestra. Para visualizar los resultados de la PCR-TI, se procesaron los productos de PCR por un sistema de electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 12,5% listo para usar y se tineron las bandas mediante tinci6n con plata automatizada (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia).
Metodos estadisticos
Los datos se presentan como media ± DE. Se analiz6 la significaci6n de las diferencias con la prueba de t de Student y el analisis de varianza (ANOVA). Un valor de p menor de 0,05 se consider6 significativo.
EJEMPLO 2. LAS CELULAS PROGENITORAS HEPATICAS CD117+/CD34+/LIN-PUEDEN DIFERENCIARSE EN HEPATOCITOS Y COLANGIOCITOS IN VITRO
Usando un kit disenado para aislar progenitoras hematopoyeticas primigenias, se obtuvo una poblaci6n de celulas a partir de higados fetales humanos (sg 6-9) que no expresaban ningun marcador hematopoyetico asignado. El fenotipado adicional de esta poblaci6n mostr6 expresi6n de los marcadores de citoblastos CD117 y CD34, pero no
expresi6n de marcadores hepaticos tales como albumina (marcador hepatocitico) y CK19 (marcador colangiocitico). Tampoco habia expresi6n de Thy-1 (CD90) ni CD45 (Fig. 1a). Esta poblaci6n representa aproximadamente un 0,5%0,7% de los higados fetales completos en las semanas de gestaci6n 6-9. No se observaron expresiones de CD45 y CD90 durante el subcultivo de las celulas. Tras el cultivo, se encontr6 que estas celulas eran una mezcla de poblaciones tanto adherentes (-85%) (Fig. 1b) como no adherentes (-15%). La poblaci6n no adherente no pudo propagarse adicionalmente en las condiciones de cultivo dadas a continuaci6n. Las celulas CD117+/CD34+/Lin- y su progenie tienden a crecer en colonias (Fig. 1b). El primer marcador que se expres6 por las celulas progenitoras adherentes despues de 2 dias en cultivo fue c-Met (receptor de factor de crecimiento de hepatocitos) (Fig. 1b). El cultivo in vitro de estas celulas durante 2 semanas en medio de cultivo que contiene factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y factor de crecimiento epidermico (EGF) mostr6 la presencia de cuatro tipos de celulas: i) -85% de celulas positivas dobles que expresan albumina y CK19, ii) -4% de celulas negativas dobles, iii) -6% de celulas positivas simples que expresan solo albumina y iv) -5% de celulas positivas simples que expresan solo CK19 (Fig. 1c). Se mantuvo este fenotipo durante varios pases durante el cultivo (Fig. 1c). Sin embargo, de P11 en adelante hubo un ligero descenso del numero de celulas positivas dobles (-60%) y negativas dobles (-3%), mientras que aumentaban las celulas positivas simples por albumina o CK19. Estos datos demuestran que las celulas progenitoras primigenias no hematopoyeticas de higados en desarrollo temprano pueden diferenciarse in vitro en hepatocitos y colangiocitos.
EJEMPLO 3: LAS CELULAS PROGENITORAS HEPATICAS CD117+/CD34+/LIN-SE DIFERENCIAN EN CELULAS ENDOTELIALES SINUSOIDALES HEPATICAS IN VITRO EN PRESENCIA DE FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR
De forma interesante, cuando se dejaron diferenciar celulas CD117+/CD34+/Lin-adherentes en medio de cultivo que contenia factor de crecimiento endotelial vascular 50 ng/ml (VEGF), se observ6 una gran proporci6n de celulas con morfologia de tipo endotelial. La caracterizaci6n adicional de esta poblaci6n celular usando marcadores de celulas hepaticas, incluyendo Flk-1, conocido por expresarse en progenitores endoteliales hepaticos fetales, revel6 cuatro poblaciones de celulas: a) celulas endoteliales que expresan el receptor Flk-1 (-50%), b) hepatocitos (-13%), c) colangiocitos (-17%) (Fig. 1d) y d) una poblaci6n celular que no expresaba ninguno de estos marcadores (-20%) (datos no mostrados). El fenotipo sinusoidal de las celulas Flk-1+ se confirm6 usando un amplio panel de anticuerpos (Tabla 1). Se usaron celulas endoteliales de vena umbilical humana para demostrar las diferencias fenotipicas entre celulas endoteliales vasculares y sinusoidales (Tabla 1). El analisis por microscopia electr6nica revel6 la presencia de orificios y la ausencia de membrana basal caracteristicos de las celulas endoteliales sinusoidales (datos no mostrados). Estos datos muestran que las celulas progenitoras primigenias no hematopoyeticas de higados en desarrollo temprano pueden diferenciarse in vitro en hepatocitos, colangiocitos y celulas endoteliales.
Tab1a 1. Rendimiento y viabi1idad ce1u1ar de ce1u1as progenitoras primigenias ais1adas magneticamente y cu1tivadas a partir de higados feta1es en e1 primer trimestre
Edad embrionaria del
N° total de celulas N° de CD117+/CD34+/Lin- Viabilidad Tiempo medio de N° subpases de N° aproximado de celulas
higado fetal
duplicaci6n celulares obtenidas
obtenidos
6 semanas
6x106 3,1x104 93% 12-15 dias 4 -5x105
6 semanas
5,6x106 2x104 95% 7-10 dias 4 -4,5x105
6,5 semanas
10x106 4,5x104 94% 4-5 dias 12* -400x106
6,5 semanas
6,8x106 2,5x104 97% 4-5 dias 14* -360x106
8 semanas
8x106 3,2x104 92% 10-12 dias 2 -7x104
8,5 semanas
15x106 6,5x104 90% 4-5 dias 12* -550x106
8 semanas
7x106 3,2x104 95% 12-14 dias 2 -8x105
8,5 semanas
18x106 6,5x104 92% 2-3 dias 10* -70x106
9,5 semanas
13x106 5,5x104 97% 8-10 dias 9* -50x106
9 semanas
11x106 7,5x104 94% 3-4 dias 12* -307x106
9 semanas
5,6x106 4,5x104 93% 8-10 dias 2 -10x104
9,5 semanas
10,5x106 7,5x104 92% 4-5 dias 12* -320x106
9,5 semanas
17,6x106 8,8x104 95% 5-7 dias 12 -360x106
9 semanas 14x106 13,3x104 96% 3-4dias 11 -272x106 9,5 semanas 15,5x106 9,5x104 97% 12-14 dias 4 -389x106 9,5 semanas 13,6x106 12x104 91% 4-5dias 11 -245x106
*Celulas aun en cultivo actualmente
EJEMPLO 4: LAS CELULAS PROGENITORAS HEPATICAS PUEDEN SOMETERSE EXTENSAMENTE A PASES
IN VITRO
La proliferaci6n de las progenitoras hepaticas dependia del uso regular de medio acondicionado (ME) al 20% durante el cultivo. Usando ME al 20%, estas celulas pueden cultivarse hasta al menos 12 pases. La retirada del ME redujo significativamente el numero de pases celulares obtenidos (p<0,001, Fig. 2a), reflejando una reducci6n en la proliferaci6n de las celulas. Se encontr6 que se observaba una alta capacidad proliferativa en las celulas positivas dobles (ALB+CK19+) y las celulas positivas simples de albumina (ALB+CK19-), como se detectaba por la incorporaci6n de BrdU (Fig. 2b y c). Las celulas pueden mantenerse durante largos periodos con un fenotipo estable. Es importante mencionar que no todos los HF generaron celulas que proliferaban rapidamente y que podian mantenerse en cultivo durante varios pases (Tabla 2). La proliferaci6n exitosa durante largos periodos dependia de la calidad del tejido de HF obtenido. Sin embargo, se encontr6 que las celulas CD117+/CD34+/Lin-aisladas a partir de todos los HF ensayados se diferenciaban en celulas hepaticas. Los datos de los estudios in vitro demostraron que las celulas CD117+/CD34+/Lin-y su progenie tienen una amplia capacidad de replicaci6n y pueden mantenerse durante largos periodos con un fenotipo estable.
Tab1a 2. Caracteristicas fenotipicas de ce1u1as F1k-1+ obtenidas a partir de progenitores hepaticos
Anticuerpos contra
HUVEC F1k-1+
CD141
+ +
*CD142
+ +
CD144
+ -
LDL aceti1ado
+ +
U1ex Europaeus
+ -
*CD106
+ +
CD62E
+ -
CD31
+ -
VWF
+ -
CD105
+ +
Fibrob1asto
- -
a-actina
- -
*Expresado so1o en ce1u1as endote1ia1es activadas. HUVEC: ce1u1as endote1ia1es de vena umbi1ica1 humana
EJEMPLO 5: LAS CELULAS PROGENITORAS FETALES HUMANAS PROPAGADAS SE INJERTAN EXITOSAMENTE Y SE DIFERENCIAN EN HEPATOCITOS, COLANGIOCITOS Y SINUSOIDES MADUROS EN LOS HiGADOS DE RATONES TRATADOS CON GALN
Para ensayar si las celulas CD117+/CD34+/Lin-aisladas recientemente (P0) y las celulas propagadas en cultivo (P6 y P12) tienen el potencial de diferenciarse y ser funcionales in vivo, se transplantaron estas celulas a ratones que se hepatectomizaron parcialmente en primer lugar y se trataron entonces con D-galactosamina (GalN) para inducir lesi6n hepatica aguda. Este protocolo induce lesi6n hepatica aguda y facilita la regeneraci6n hepatica (21). Dos ratones del grupo de control y dos del grupo de ensayo murieron al cabo de 24 h despues del tratamiento. Se presentan los resultados de los ratones supervivientes a las cuatro semanas despues del transplante celular. Despues del transplante intraesplenico, las celulas en P0 primarias, asi como las celulas sometidas a subpases P6 y P12, sobrevivieron en el higado de rat6n tratado con GalN. Los experimentos para comparar los resultados obtenidos usando una sonda centromerica humana y un anticuerpo anti-nucleos humanos para localizar las celulas transplantadas dieron resultados similares. La especificidad de especie de la sonda de ADN humana (Fig. 3a y b) y el anticuerpo anti-nucleos humanos se demuestra por el resultado positivo con higado humano (Fig. 3c) y la
inmunohistoquimica negativa con higados transplantados ficticiamente de ratones atimicos (Fig. 3d). Las celulas CD117+/CD34+/lin-recien aisladas, cuando se transplantaban, se diferenciaban en hepatocitos (Fig. 3e), celulas sinusoidales (Fig. 3f) y conductos biliares formados (Fig. 3g) a las 4 semanas despues del transplante. Las celulas progenitoras hepaticas en P6 y P12, cuando se transplantaban, se injertaban y reconstituian el higado danado agudamente (Fig. 3h-j). Se encontraron celulas transplantadas en los higados de los ratones (Fig. 3k) pero no en otros tejidos tales como bazo (Fig. 3I) y pulm6n (Fig. 3m) ni en animales transplantados ficticiamente (Fig. 3n). Las celulas transplantadas humanas expresaban marcadores hepatociticos tales como glucosa-6-fosfatasa (G-6-P) (Fig. 4a) y gluc6geno (Fig. 4b) y marcadores biliares tales como dipeptidil peptidasa IV (DPPIV) (Fig. 4c) y gammaglutamil transpeptidasa (GGT) (Fig. 4d). En tres ratones, se encontraron segmentos de tejido regenerado que estaban repoblados al 90% por celulas hepaticas humanas (Fig. 4e). Se observaron tambien zonas claras de conductos biliares completamente repobladas por progenitoras humanas. Estas celulas se tenian positivamente por CK19 y anticuerpo anti-nucleos humanos (Fig. 4f). Se us6 anticuerpo monoclonal contra albumina humana que no reacciona de forma cruzada con albumina de murido para examinar la expresi6n de albumina humana en las celulas transplantadas. La inmunohistoquimica negativa con higados transplantados ficticiamente de ratones atimicos (Fig. 4g) mostr6 la especificidad de especie del anticuerpo. Se encontraron varias estructuras positivas de albumina (Fig. 4h-j) en los 10 ratones transplantados, sin embargo no se observaron focos que expresaran albumina humana en ratones transplantados ficticiamente (n=2) usando condiciones identicas. Se detect6 albumina humana solo en los higados de los ratones, pero no en el bazo ni los pulmones. Como nota de interes, no se observaron formaciones tumorales en ninguno de los ratones analizados.
Para determinar si el injerto hepatico era comparable entre celulas progenitoras hepaticas humanas en P0, P6 y P12, se cribaron en 60 secciones en serie de cada higado de rat6n las celulas humanas positivas de DAB-Ni. Se determin6 el numero de celulas transplantadas en agrupamientos de tres tamanos, concretamente, celulas dispuestas individualmente o en agrupamientos de ;5-20 o >20 celulas. El analisis mostr6 que no habia una diferencia significativa en el numero de celulas transplantadas dispuestas individualmente o en agrupamientos de ; 2-20 celulas entre los animales que recibian celulas en P0, P6 y P12. No se observaron agrupamientos de >20 celulas en los ratones transplantados con celulas en P0, pero se observaron en ratones que recibieron celulas en P6
o P12 (Tabla 3) (p<0,001, ANOVA). En ratones transplantados con celulas en P0, se detect6 un aumento de 10 veces del numero de celulas humanas transplantadas, mientras que en ratones inyectados con celulas en P6 y P12, se detect6 un aumento de 6 veces (Tabla 3). Estos datos demuestran que las celulas CD117+/CD34+/Lin-recien aisladas proliferan exitosamente y se diferencian in vivo en hepatocitos, colangiocitos y celulas endoteliales sinusoidales maduras. Ademas, las celulas CD117+/CD34+/Lin-propagadas in vivo y su progenie proliferan in vivo y reconstituyen exitosamente el higado de rat6n danado.
Tab1a 3. Injerto de ce1u1as progenitoras hepaticas humanas en ratones tratados con D-Ga1N
Detecci6n de las celulas transplantadas 4 semanas despues del transplante
N° de pase celular
N° de celulas transplantadas Celulas humanas detectadas (0,6 cm3 de volumen hepatico total despues de hepatectomia parcial) % de celulas individuales % de agrupamientos de ;2-20 celulas % de agrupamientos de >20 celulas
P0
1x105 1,0 ± 0,2x106 58 42 0
P0
60 40 0
P6
57 41 2
P6
1x106 6,7 ± 2,3x106 50 45 5
P6
51 47 2
P6
52 45 3
P12
63 35 2
P12
1x106 6,1 ± 2,2x106 57 40 3
P12
62 33 5
P12
58 40 2
EJEMPLO 6: TRANSCRIPCION DE GENES ESPECiFICOS DE HiGADO HUMANO EN RATONES TRANSPLANTADOS CON CELULAS PROGENITORAS HEPATICAS HUMANAS
Se confirm6 el injerto de las celulas transplantadas determinando la expresi6n de genes humanos en los ratones transplantados. Se analizaron los higados de los ratones sacrificados un mes despues del transplante de celulas progenitoras hepaticas fetales humanas mediante PCR-TI usando cebadores especificos de genes especificos de higado humanos, incluyendo albumina, a1-antitripsina, CK19 y AFP. El ADN del higado de un rat6n atimico
5 transplantado ficticiamente dio como resultado la amplificaci6n de G6PD, que se us6 como control de la integridad del ARN. Los cebadores de CK19, albumina y AFP eran especificos de especie para los seres humanos, ya que no amplificaban los genes de rat6n respectivos, sin embargo, no se encontr6 que la a1-antitripsina fuese especifica de especie (Fig. 4k). Estos resultados muestran que tanto las celulas recien aisladas (P0) como en diversos pases P6 y P12 se injertan en el higado de rat6n danado.
10 EJEMPLO 7: PROTECCION DEL FACTOR VIII HUMANO EN RATONES TRANSPLANTADOS CON CELULAS PROGENITORAS HEPATICAS
Los niveles de FVIII humano son despreciables en ratones de higado danado quimicamente y hepatectomizados, asi como en ratones tratados de la misma manera y que ademas reciben el factor de crecimiento HGF y/o celulas estromaticas. Sin embargo, los ratones de higado danado quimicamente y hepatectomizados que recibian solo
15 celulas progenitoras hepaticas humanas o una combinaci6n de HGF+celulas estromaticas+progenitoras demostraron altos niveles de FVIII humano en su plasma (Figura 6).

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una poblaci6n de celulas aisladas consistente en celulas derivadas de tejido hepatico de un ser humano que son
    -
    a.
    CD117+, CD34+, CD45-y Lin;
    b.
    capaces de proliferar en un cultivo y
    c.
    capaces de diferenciarse in vivo en un hepatocito, un colangiocito y una celula sinusoidal.
  2. 2.
    La poblaci6n celular aislada de la reivindicaci6n 1, en la que la poblaci6n es capaz de duplicarse al menos 6 veces.
  3. 3.
    La poblaci6n celular aislada de la reivindicaci6n 1, en la que la poblaci6n es capaz de duplicarse al menos 12 veces.
  4. 4.
    La poblaci6n celular aislada de la reivindicaci6n 1, en la que dicha poblaci6n es un cultivo de adhesi6n.
  5. 5.
    Un metodo de producci6n de una celula sinusoidal hepatica humana in vitro que comprende
    -
    a.
    proporcionar una suspensi6n celular que comprende una celula CD117+, CD34+ y Lin;
    b.
    cultivar la suspensi6n celular y
    c.
    diferenciar la progenie celular en un medio de cultivo que contiene factor de crecimiento endotelial vascular.
  6. 6. Un metodo de producci6n de un hepatocito o colangiocito hepatico humano in vitro que comprende:
    -
    a.
    proporcionar una suspensi6n celular que comprende una celula CD117+, CD34+ y Lin;
    b.
    cultivar la suspensi6n celular y
    c.
    diferenciar la progenie celular en un medio de cultivo que contiene EGF y HGF.
  7. 7. Un metodo de producci6n de una poblaci6n de celulas progenitoras hepaticas humanas que se diferencian in vivo en hepatocitos, colangiocitos y celulas sinusoidales, que comprende seleccionar de una poblaci6n de celulas
    -
    derivadas de higado humano las celulas que son CD117+, CD34+, CD45-y Lin.
  8. 8.
    Uso de una celula progenitora hepatica multipotente que comprende proporcionar un cultivo celular in vitro que comprende celulas progenitoras hepaticas CD117+, CD34+, CD45-y Lin-humanas multipotenciales, en el que dichas celulas mantienen la capacidad multipotencial de diferenciarse en hepatocitos, colangiocitos o celulas sinusoidales, para la fabricaci6n de una composici6n para transplante a un hospedador.
  9. 9.
    El uso de la reivindicaci6n 8, en el que el transplante comprende adicionalmente el cotransplante de celulas estromaticas hepaticas fetales o celulas mesenquimaticas hepaticas fetales a dicho hospedador, excluyendo el uso de embriones humanos.
  10. 10.
    El uso de la reivindicaci6n 8, en el que el transplante comprende adicionalmente administrar a dicho hospedador factor de crecimiento de hepatocitos.
    DETECCION DE FVIII HUMANO EN RATONES DE HiGADO DA�ADO TRANSPLANTADOS CON CELULAS PROGENITORAS HEPATICAS HUMANAS
    RATONES
    N� DE RATONES DETECCION DE FVIII HUMANO ng/m1
    C57/BL AT�MICOS NORMALES
    10 19 ± 2,6
    LESI�N HEP�TICA + HEPATECTOM�A DE C�LULAS NO HUMANAS
    8 15 ± 3,9
    LESI�N HEP�TICA + HEPATECTOM�A +HGF/C�LULAS ESTROM�TICAS
    8/8 20 ± 5,1 / 35 ± 10,2
    LESI�N HEP�TICA + HEPATECTOM�A +HPC
    10 66 ± 15
    LESI�N HEP�TICA + HEPATECTOM�A + HGF + C�LULAS ESTROM�TICAS + HPC
    15 121 ± 36
    FIG. 6
    EXPRESION DE MARCADORES HEMATOPOYETICOS, HEPATICOS Y PANCREATICOS EN HiGADOS FETAL Y ADULTO
    ANTICUERPOS DE
    % DE CELULAS DE HF DE 9 SEM % DE CELULAS DE HF DE 18 SEM % DE CELULAS DE HiGADO ADULTO
    CD117
    0,9 ± 0,2 15 ± 1,5 0,003 ± 0,001
    CD90
    0,5 ± 0,3 12 ± 5,5 0,002 ± 0,001
    CD34
    2 ± 0,3 30 ± 7,5 0,04 ± 0,01
    CD123
    1 ± 0,05 12 ± 5,6 0,03 ± 0,02
    CD133
    0,3 ± 0,04 16 ± 7,0 0,002 ± 0,001
    Flk-1
    10 ± 4,0 8 ± 3,0 1 ± 0,05
    Flt-1
    2 ± 0,2 20 ± 4 0,002 ± 0,001
    Tle-2
    0,1 ± 0,02 8 ± 3 0
    ALBUMINA
    0 15 ± 2,4 60 ± 10
    AG. HEPATOC�TICO
    0 10 ± 2,2 0,004 ± 0,001*
    HEA-125
    0 10 ± 2,0 6 ± 2
    CK19
    0 5 ± 2,4 6 ± 2
    c-Met
    0,02 ± 0,01 5 ± 2,3 70 ± 6
    a-FETOPROTE�NA
    9 ± 0,4 26 ± 7,9 0,008 ± 0,004
    CD45
    4 ± 2,2 12 ± 5,3 20 ± 5
    CD14
    3 ± 2,0 5 ± 3,9 3 ± 0,7
    Gly A
    70 ± 20 50 ± 10 10 ± 5
    HLA DE CLASE I
    4 ± 2,4 6 ± 3 70 ± 5
    HLA DE CLASE II
    2 ± 1,3 2 ± 1,3 10 ± 5
    NESTINA
    4 ± 2,3 6 ± 2 2 ± 0,4
    AMILASA
    4 ± 3,5 16 ± 4 5 ± 5,6
    INSULINA
    0,5 ± 0,1 2 ± 1,5 0,002 ± 0,001
    POLIP�PTIDO PANCRE�TICO
    4 ± 3 18 ± 3 6 ± 1
    GLUCAG�N
    4 ± 2,3 15 ± 3 5 ± 3,5
    FIG. 7
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