KR20210116469A

KR20210116469A - Hla-e를 발현하는 간 전구 세포를 포함하는 세포 조성물

Info

Publication number: KR20210116469A
Application number: KR1020217021847A
Authority: KR
Inventors: 쟝-레온 첼린제리안; 엘리사 코리토어; 주세페 마자; 나탈리 벨몬테; 에티엔느 소칼
Original assignee: 프로메테라 테라푸틱스 에스에이
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-09-27
Also published as: BR112021011273A2; EA202191673A1; AU2019398753A1; CN113316633A; CA3122715A1; US20220049225A1; SG11202106169SA; WO2020120664A1; MX2021006773A; JP2022513475A; TW202043463A; EP3894542A1; IL283867A

Abstract

본 발명은 HLA-E 양성인 단리된 간 전구 세포, 이의 세포주, 이를 포함하는 세포 집단 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 간 전구 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

HLA-E를 발현하는 간 전구 세포를 포함하는 세포 조성물

본 발명은 기술분야로서 간 기원의 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포, 및 의약, 간학, 이식, 간부전 및 섬유-염증성 간 질환에서의 그 용도에 대한 것이다.

간은 많은 생명 기능을 수행하는 주요 장기이다. 여러가지 간 기능들 중 하나의 손상으로도 건강에 상당한 영향을 미친다. 세계 보건 기구에 따르면, 전세계인 급성 또는 만성 간 질환의 발생으로, 사망 원인의 5번째 내지 9번째를 차지하고 있다. 간 세포 이식 (LCT)은 간 회복/재생을 목표로 한 간 질환 치료에 대해 임상 평가 중인 시술이다 (Najimi et al., Stem Cells Translational Medicine, 2016). 공여자를 수용자와 가능한 면역학적으로 비슷하게 일치시키고자 하는 노력에도 불구하고, 간 세포 이식 후 면역계에 의한 거부 반응으로 인한 문제들이 세포 요법, 조직 이식 및 특히 LCT 이후의 주요 과제로 남아있다. 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 특히 사이토카인을 함유한 세포외 환경에 따라 차별적으로 거동할 수 있는 다면성 세포이다 (Spees et al., Stem Cells research and therapy, 2016). 연구들에서, MSC가 면역원성이 낮고, 면역 반응 발생을 저해할 수 있으며, 다양한 면역 세포를 전-염증성에서 항-염증성/조절성 표현형으로 만들 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Najar et al., Inflammation research, 2018). MSC는, 베이스라인 수준에서는, 최소한 면역억제성이다. 이 세포가 특정 환경 신호에 노출되면 면역억제표현형을 획득할 수 있다 (Kouroupis et al., Tissue engineering Part B, 2018). 공교롭게도, 나이브 MSC는 주입 후 개별 환자의 내부 신호에 따라 단 일부만 면역억제성이 된다. 이러한 이유로, 개선된 면역억제 특성을 가진 새로운 MSC-표현형의 개발이 요구되고 있다.

면역 기능 및 이식 거부 반응의 핵심은 일반적으로 인간에서 HLA 복합체로서 지칭되는 주 조직접합성 항원이다. 클래스 I HLA 단백질을 코딩하는 유전자들은 인간 염색체 6p21의 텔로미어 말단에 몰려있다. 이러한 것으로는 도처에서 발현되는 고전적인 클래스 Ia 단백질, HLA-A, -B 및 -C가 있으며, 상당한 다형성을 나타낸다. 반면, 비-고전적인 클래스 Ib 단백질, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G는 상대적으로 불변형이며, 선택적으로 발현된다. HLA-클래스 Ib 분자의 주 기능은 T 림프구 및 B 림프구, NK 세포 및 항원-제시 세포와 같은 여러가지 면역 작동자 세포 상에 발현되는 특정 저해 수용체와의 상호작용함으로써 면역 반응을 조절하는 것이다.

뼈, 연골 또는 지방세포 조직으로부터 유래된 MSC는 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 Ia 단백질을 낮은 수준으로 발현하는 것으로 있다. 이는 HLA-Ib 단백질, 특히 HLA-E 등의 용해성 인자의 발현을 통해 면역조절 특성을 발휘할 수 있다 (Morandi et al., Stem Cells, 2008). 생리학적 조건에서, HLA-E의 발현은 HLA-G의 발현과 밀접하게 연관되어 있다 (Morandi et al, Stem Cells, 2008; Morandi, Pistoia, Front. Immunol., 2014). HLA-E는 인간 태아 간 (Houlihan et al., J. Immunol., 1992), 성체 간세포 및 쿠퍼 세포 (Araujo et al., J. Immunol. Res., 2018)에서 발현되는 것으로 밝혀져 있다. 이러한 발현은 C형 간염 바이러스 (HCV) 간염 후 증가하므로, 간 질환에서 HLA-E의 잠재적인 면역조절 기능을 시사해준다 (Araujo et al., 2018). 인간 유도된 만능성 줄기 세포-유래 망막 색소 상피 세포는 CD94/NKG2A 수용체 복합체와 상호작용하여 NK 세포 활성화를 억제하는 HLA-E를 구성적으로 발현한다 (Sugita et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2018). HLA-E는 골수 이식 후 이식 편대 숙주 질환의 위험 감소 및 사망율 감소와 관련 있는 것으로 확인된 바 있다 (Pabon et al., Transplant Proceedings 2014). IFNγ를 이용한 지방세포 조직 MSC의 시험관내 감작시, HLA-E 및 기타 면역억제 단백질의 발현이 증가되어 T 세포 저해가 강화된다 (Wobma et al., J. Immunol. Regen. Med., 2018).

WO2008121894는 HLA-E 양성 세포, 또는 HLA-E 양성 세포, 또는 HLA-E 및 HLA-G 양성 세포로 농화된 집단을 함유한 MSC의 세포성 조성물 및 이의 퇴행성 질환의 치료 및 이식 면역조절에서의 잠재적인 용도를 개시하고 있다. WO2018081514는 시험관내 저산소성 배양 조건에서 전-염증성 사이토카인을 중간엽 기질 세포에 적용함으로써 수득되는 면역억제 중간엽 기질 세포를 기술하고 있다. US20120328578은 세포에 염증이 발생한 관절의 윤활액 또는 전-염증성 사이토카인을 처리함으로써 줄기 세포로부터 면역억제 특성을 유도하는 것을 토대로 하는 윤활 관절의 염증 치료 방법을 기술하고 있다.

ADHLSC 및 HHALPC (HALPC로도 지칭됨, 인간 동종이계 간 전구 세포)는 GMP 환경에서 구축된, 임상 실험을 위해 대량으로 제조된 것으로, 정상적인 인간 간의 콜라게나제 분해 및 실질 분획의 1차 배양으로 수득된 미분화된 전구 세포이다. HHALPC는 자가-재생 능력을 가지고 있으며, 중간엽 및 간세포 마커를 발현하고, 진행된 간원성 분화 잠재성을 나타내는 특이성을 가지고 있다. 이들 세포는, 간 섬유증, 비-알코올성 지방간염 (NASH) 및 급성-만성 간부전 (ACLF) 등의 인간 간 질환과 기타 인간 질환을 치료하는데 특히 흥미롭다.

Raicevic 등 (Cytotherapy, 2015)은 성체-유래 인간 간 중간엽 기질 세포 (ADHLSC)에 염증성 사이토카인 칵테일을 밤새 첨가하는 방법을 언급하고 있다. HLA-E 또는 HLA-G의 막 발현 및 세포내 발현은 관찰되지 않았다. 또한, Raicevic은 HLA-E를 발현하는 세포를 다량 포함하는 조성물에 대해서는 언급한 바 없다.

Mehdi Najar et al., 2018에는 염증 감작된 ADHLSC가 언급되어 있다. 이 문헌은 염증 감작된 ADHLSC에서 HLA-E의 유도나 HLA-G의 발현에 대해서는 언급되어 있지 않다. Mehdi Najar는 HLA-E를 발현하는 세포성 조성물과 관련 있을 수 있는 이점들에 대해서도 전혀 언급한 바 없다.

Hoda El-Kehdy et al., 2017에는 또한 염증 감작된 ADHLSC가 언급되어 있으며, (미)분화된 ADHLSC에서 HLA-ABC, HLA-DR 및 HLA-G가 구성적 및 감작화된 상태에서 발현되고 HLA-G 또는 HLA-DR 발현에 대한 현저하게 유도된 발현은 없는 것으로 기술되어 있다.

이들 선행 문헌들 어느 것에서도 임상에 사용하기 위해 HLA-E를 발현하는 간 줄기 또는 전구 세포 집단을 수득하여야 한다거나, 또는 충분한 HLA-E 발현이 세포용해로부터 탈출하는데 중요한 역할을 할 수 있다는 내용은 전혀 기술되어 있지 않다.

당해 기술 분야에서는, 예를 들어, 염증, 자가-면역 질환 및 이식편 거부 반응을 예방하기 위해, 특히 간 질환 관련 병태를 치료하기 위해, 면역조절뿐 아니라 보강된 면역억제 및/또는 면역회피 활성을 가진 새로운 또는 개선된 동종이계 세포 요법이 요구되고 있다.

본 발명은 청구항 1항에 따른 인간 성체 간-유래 전구 세포 또는 줄기 세포, 청구항 8항에 따른 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포, 및 청구항 21항에 따른 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HLA-E 양성 세포, 및 이러한 HLA-E 양성 세포를 적어도 60%로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포에서 관찰되는 HLA-E 발현은 대부분이 세포 표면 상에서 이루어지는 것은 아니더라도 주로 세포 표면 상에서 이루어진다. (세포 표면 상에서) HLA-E를 발현하는 세포를 증가된 양으로 포함하는 조성물은 CD8+ T 세포 매개의 세포용해를 피할 수 있어, 특히 요법에 사용하기 적합한 것으로 확인되었다.

본 발명의 세포, 세포 집단 및 세포를 포함하는 조성물에서, HLA-E 발현은 이의 면역억제 및/또는 면역회피 특성을 상당히 강화하는 것으로 밝혀졌다. 이들 세포, 세포 집단 및 조성물은 특히 원치않은 면역 반응을 수반하는 장애, 예를 들어, 비-제한적으로, 염증, 자가-면역 질환 및 이식편 거부 반응을 치료 또는 예방뿐 아니라 간 질환 치료에 사용하기 매우 적합하다.

단리된 간 전구 세포, 세포 집단 또는 이들 세포를 포함하는 조성물은 이의 증식 능력을 유지하고 있어, 자체 간 특이성과 더불어, 간 세포 이식에 대한 효능 및 안전성이 강화된다. 아울러, 이들 줄기 세포는 성체로부터 기원하므로, 배아 세포와 관련한 면역학적, 윤리적 및 발암성 문제에서 벗어난다 (Volarevic et al., International Journal of Medical sciences, 2018).

HLA-E 발현으로 인한 전구 세포의 강화된 면역억제 특징은 세포 요법 및/또는 조직 이식, 특히 동종이계 세포 이식에서 면역-반응 관련 위험을 낮추는데 기여한다. 이에, 본 발명의 HLA-E 양성의 간-유래 전구 세포는 환자에 대한 개선된 효능 및 허용성으로 인해 여러가지 간 장애들에 대한 세포 요법으로서 성공 가능성이 높다.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 간 전구 세포, 세포 집단 또는 이들 세포를 포함하는 조성물은 또한 HLA-G 양성일 수 있거나, 또는 HLA-G를 증가된 수준으로 발현할 수 있다. HLA-E와 HLA-G의 공동-작용이 각각의 간 전구 세포의 면역억제 작용을 추가로 강화함으로써, 세포 요법 방식으로 사용하기 더 적합하게 될 수 있는 것으로 생각된다 (Morandi, Pistoia, Frontiers in Immunology 2014).

본 발명의 다른 추가적인 구현예에서, 간-유래 전구 세포, 세포 집단 또는 이들 세포를 포함하는 조성물은 추가적으로 하나 이상의 중간엽 마커에 대해서도 양성이다. 그러한 중간엽 마커로는, 비-제한적으로, 비멘틴 (Vimentin), CD13, CD90, CD73, CD44, CD29, α-평활근 액틴 (ASMA) 및 CD140-b를 포함한다. 다른 추가적인 구현예에서, 본 발명의 간-유래 전구 세포는 HGF를 분비한다. 다른 추가적인 구현예에서, 본 발명의 간-유래 전구 세포는 HLA-DR에 대해 음성이다. 추가적인 구현예에서, 간-유래 전구 세포는 선택적으로 하나 이상의 간 마커에 대해 양성이거나, 및/또는 선택적으로 하나 이상의 간-특이 활성을 가진다. 간 마커로는, 비-제한적으로, 알부민 (ALB), HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A4 및 α-1 항-트립신을 포함한다. 간-특이 활성으로는, 비-제한적으로, 우레아 분비, 빌리루빈 접합, α-1-항-트립신 분비 및 CYP3A4 활성을 포함한다.

제2 측면에서, 본 발명은 청구항 30항에 따른 HLA-E 양성의 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 이 방법은 하나 이상의 사이토카인을 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 배양물의 세포 배지에 첨가하는 것을 의미하는 세포의 프리컨디셔닝화 (preconditioning) 단계를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 청구항 24항 또는 29항에 따라 사용하기 적합하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 면역억제 특성이 특히 유익한 다수의 질환들을 치료하는데 이용하도록 제공된다.

다른 측면에서, 본원은 또한 원치않은 면역 반응을 수반한 장애, 섬유성 장애 및 간 질환을 비롯하여, 본원에 개시된 세포, 세포 집단 및/또는 조성물의 면역억제 특성이 특히 유익한 장애 및 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 기술한다. 원치않는 면역 반응은, 예를 들어, 비-제한적으로 염증, 자가-면역 질환 및 이식편 거부 반응을 포함한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 본 발명의 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주, 세포 집단 및/또는 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 투여는 전형적으로 치료학적 유효량으로 이루어지며, 즉 일반적으로 원하는 국소 또는 전신 효과 및 성능을 제공하는 양으로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본원은 요법에 사용하기 위한 및/또는 원치않은 면역 반응을 수반한 장애를 치료 및/또는 예방하거나, 섬유성 장애를 치료 및/또는 예방하거나, 아울러 간 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 본 발명의 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주, 세포 집단 및/또는 조성물의 용도를 기술한다. 이러한 질환은 간 조직에 영향을 미치는 장애, 간세포 생존 및/또는 기능에 영향을 미치는 질환 및/또는 섬유-염증 반응에 의해 유발되는 만성 간부전을 포함할 수 있다. 아울러, 본 발명의 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주, 세포 집단 및/또는 조성물의 사용은, 면역조절 및 면역억제 특성으로 인해, 바람직하지 않은 면역 반응을 회피하고자 하는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 용도 및/또는 요법에서의 용도를 제공한다.

도 1, 도 2 및 도 3은 본 발명의 다양한 구현예들에 따른 간 전구 세포에서의 HLA-E 발현을 나타낸 것이다.
도 1은 여러가지 배양 조건에서, 한 공여자 (VLK019)로부터 단리된 간 전구 세포의 HLA-E 단백질 발현을 무처리 대조군 조건과 비교하여 보여주는 FACS 분석 데이터를 제시한다: IL-1β/TNFα/IFNγ 조합, IL-10 단독 및 IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10 조합 ("모두 처리"). 녹색 히스토그램 'ISO'는 이소형 대조군이다 (베이스라인, 형광 비-검출, HLA-E 발현 비-검출).
도 2는 여러가지 배양 조건에서, 3종의 공여자로부터 단리된 간 전구 세포의 HLA-E 단백질 발현을 무처리 대조군 조건과 비교하여 보여주는 FACS 분석 데이터를 제시한다: IL-1β/TNFα/IFNγ 조합, IL-10 단독, 및 IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10 조합 ("모두 처리"). 녹색 히스토그램은 이소형 대조군이다 (베이스라인, 형광 비-검출, HLA-E 발현 비-검출).
도 3은 여러가지 배양 조건에서 검출된 HLA-E 발현에 대한 평균 형광 강도 (n=3)를 무처리 대조건 조건과 비교하여 보여주는 FACS 분석 데이터를 나타낸 것이다: IL-1β/TNFα/IFNγ 조합, IL-10 단독 및 IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10 조합 ("모두 처리"). 프리컨디셔닝화된 세포에서 무처리 세포 대비 HLA-E 발현 수준 증가가 확인된다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 다양한 구현예들에 따른 HLA-E 양성의 간 전구 세포의 유전자 발현 프로파일을 보여준다.
도 4는 3가지 배양 조건에서 HLA-E 및 HLA-G 유전자 발현이 무처리 대조군 조건 (베이스라인)과 비교해 배수 증가함으로 보여주는 RT-PCR 데이터를 나타낸 것이다: IL-1β/TNFα/IFNγ 조합, IL-10 단독 및 IL-1β/ TNFα/IFNγ/IL-10 조합 ("모두 처리").
도 5는 본 발명의 구현예들에 따른 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포에서 IDO1, HGF, PTGS2, IL-6 및 IL-10의 유전자 발현이 무처리 대조군 (베이스라인)과 비교해 배수 증가함을 보여주는 RT-PCR 데이터를 나타낸 것이다. 세포를 IFNγ, TNFα, IL-1β, IL-10 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 전-염증성 사이토카인으로 사전 처리하였을 때, IDO1, PTGS2, IL-6 및/또는 IL-10에서 유전자 발현 수준의 증가가 확인되었다.
도 6은 본 발명의 구현예에 따른 HLA-E 양성의 단리된 간 전구 세포에서의 HLA-G 단백질 분비량을 나타낸 것이다.
도 6은 여러가지 배양 조건에서 회수한 상층액 내 용해성 HLA-G의 검출가능한 수준을 보여주는 분비 분석 데이터를 나타낸 것이다: 무처리 (대조군 조건), IL-1β/TNFα/IFNγ 조합, IL-10 단독 또는 IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10 조합 ("모두 처리") 처리. 인간 HLA-G 서열을 운반하는 플라스미드로 형질감염된 인간 흑색종 Bowes 세포 (HMBC)를 양성 대조군으로 사용하였다 ("형질감염된 HMBC"). 이들 데이터는, 본 발명의 구현예에 따른 HLA-E 발현에 대해 양성인 프리컨디셔닝화된 단리된 간 전구 세포에서 HLA-G 분비가 증가한다는 것을, 검증해준다.
도 7은 본 발명의 다양한 구현예들에 따른 HLA-E 양성 간 전구 세포를 포함하는 세포 집단에서의 면역조절 인자 PGE2의 분비를 나타낸 것이다.
도 7은 무처리 간 전구 세포 (대조군 조건) 및 IL-1β/TNFα/IFNγ 조합, IL-10 단독 또는 IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10 조합 ("모두 처리")으로 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포를 포함하여 여러가지 조건들에서 상층액내 PGE2의 검출가능한 수준을 보여주는 분비 분석 데이터를 나타낸 것이다. 분비 수준 증가가 무처리 조건 대비 본 발명의 구현예에 따른 프리컨디셔닝화된 세포에서 관찰되었다.
도 8은 본 발명의 다양한 구현예들에 따른 HLA-E 양성의 간 전구 세포를 포함하는 세포 집단에서의 IDO1 효소 활성 수준 증가를 나타낸 것이다.
여러가지 실험 조건들로부터 수득한 상층액내 검출가능한 IDO 활성 수준을 보여주는 효소 분석 데이터를 도 8에 제시한다. 여러가지 조건은 무처리 간 전구 세포 (대조군 조건) 및 IL-1β/TNFα/IFNγ 조합, IL-10 단독 또는 IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10 조합 ("모두 처리")으로 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포를 포함한다. 본 발명의 구현예들에 따른 프리컨디셔닝화된 세포들에서 IDO 활성 강화가 관찰되었다.
도 9A, 9B 및 9C는 컨디셔닝화 처리 전 및 처리 후 간 전구 세포 집단에서의 HLA-E 발현을 나타낸 것이다.
도 10A, 10B, 10C 및 10D는 CD8 T-세포 매개 세포용해에 대한 본 발명에 따른 세포 조성물 및 세포의 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 HLA-E 양성인 단리된 간-유래 전구 세포 또는 줄기 세포, 이러한 세포의 제조 방법, 이러한 세포를 포함하는 조성물, 및 염증, 자가-면역 질환 및 이식편 거부 반응과 같이 원치않은 면역 반응을 수반하는 장애를 치료 또는 예방하기 위한, 또한 간 질환을 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

달리 정의되지 않은 한, 기술 용어 및 과학 용어를 비롯하여 본원에서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가진다. 추가적인 지침으로서, 용어 정의들은 본 발명의 교시 내용을 더 잘 이해하기 위해 포함된다.

본원에서, 하기 용어들은 다음과 같은 의미를 가진다:

본원에서 관사 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않은 한 단수 및 복수의 언급을 의미한다. 예를 들어, "구획"은 하나 보다 많은 구획을 의미한다.

본원에서, "약"은, 매개변수, 양, 시간적 기간 등과 같이 측정가능한 값이, 본원에 내용으로 수행하기에 적절한 편차인 한, 특정 값으로부터 +/-20% 이하, 바람직하게는 +/-10% 이하, 더 바람직하게는 +/-5% 이하, 보다 더 바람직하게는 +/-1% 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 편차를 포괄하는 것을 의미한다. 그러나, 수식어 "약"이 나타내는 값 자체가 명시적으로 기술된 것으로도 이해되어야 한다.

본원에서, "포함한다", "포함하는", 및 "포함하는" 및 "로 구성된다"는 "등이 있다", "비롯하여", "포함한다" 또는 "함유한다", "함유하는", "가진다"와 동의어이며, 그 다음에 오는 것, 예를 들어 구성성분을 지정하는 포괄적인 또는 열린 의미이며, 당해 분야에 공지되어 있거나 또는 본원에 개시된 부가적인, 언급되지 않은 구성요소, 특징, 요소, 구성원, 단계의 존재를 배제하거나 또는 제외하는 것은 아니다.

양 말단을 사용해 수치 범위를 나타내는 방식은 그 범위에 속하는 모든 수치 및 분수뿐 아니라 언급된 양 말단을 모두 포함하는 것이다.

본원 및 명세서 전체에서, 표현 "중량%", "중량 퍼센트", "%wt" 또는 "wt%"는, 달리 정의되지 않은 한, 제형의 총 중량에 대한 각 성분의 상대적인 중량을 나타낸다.

본원에서, 용어 "단리된 세포"는 일반적으로 생체내에서 세포와 조합된 하나 이상의 세포 또는 하나 이상의 세포 성분이 조합되지 않은 세포를 의미한다. 예를 들어, 단리된 세포는 이의 천연 환경으로부터 취해지거나, 또는 천연 환경으로부터 취해진 세포의 증식, 예를 들어 생체외 증식을 통해 수득될 수 있다.

본원에서, 용어 "시험관내"는 동물 또는 인간 신체의 바깥쪽 또는 외부를 의미한다. 본원에서, 용어 "시험관내"는 "생체외"를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 용어 "생체외"는 전형적으로 동물 또는 인간 신체로부터 취해진 후 신체 외부, 예를 들어 배양 용기에서 유지 또는 증식시킨 조직 또는 세포를 의미한다.

용어 "간 전구 세포"는 간으로부터 단리된 세포를 배양함으로써 생성되는 비-전문화된 증식-적격 세포, 또는 상대적으로 좀더 전문화된 세포 유형 하나 이상을 생성할 수 있는 자손을 의미한다. 간 전구 세포는 하나 이상의 계통을 따라 분화하여 점점 더 전문화된 세포 (바람직하게는, 간세포 또는 간-활성 세포)를 생성할 수 있는 자손을 만들며, 이들 자손은 그 자체가 전구 세포이거나, 또는 심지어 최종 분화된 간 세포 (예, 완전 전문화된 세포, 특히 일차 인간 간 세포와 비슷한 형태적 및 기능적 특징을 보이는 세포)를 만들 수 있다. 용어 "줄기 세포"는, 줄기 세포의 자손 또는 이의 적어도 일부가 비-전문화된 또는 상대적으로 덜 전문화된 표현형, 분화 잠재력 및 모 줄기세포의 증식 기능을 실질적으로 유지하는, 자기-재생할 수 있는, 즉 분화하지 않고 증식할 수 있는, 즉 자손 또는 이의 일부의 추가적인 증식 능력이 모 세포와 비교해 실질적으로 감소되지 않는 전구 세포뿐 아니라 제한된 자기-재생성을 나타내는, 즉 자손 또는 이의 일부의 추가적인 증식 능력이 모 세포와 비교해 명백하게 감소된 줄기 세포를 포괄한다.

전구 세포 또는 줄기 세포는, 다양한 세포 유형으로의 분화 능력을 토대로, 일반적으로 전능성, 만능성, 다능성 또는 단분화성으로 언급할 수 있다. 하나의 "전능성" 세포는 완전한 유기체로 생장, 즉 발생할 수 있는 것으로 정의된다. "만능성" 세포는 완전한 유기체로 생장하진 못하지만 3가지 배엽, 즉 중배엽, 내배엽 및 외배엽 모두의 기원이 되는 세포 유형으로 생장할 수 있으며, 유기체의 모든 세포 유형으로 생장할 수 있다. "다능성" 세포는 유기체의 2종 이상의 장기 또는 조직 각각으로부터 유래되는 하나 이상의 세포 유형으로 생장할 수 있으며, 이들 세포 유형은 동일한 또는 서로 다른 배엽으로부터 기원할 수 있지만, 유기체의 모든 세포 유형으로는 생장하지 못한다. "단분화성" 세포는 오직 한가지 계열의 세포로만 분화할 수 있다.

용어 "중간엽 줄기 세포"는 기본적으로 중간엽 또는 기질 세포로부터 유래하거나 또는 이로부터 단리된 다능성 기질 세포로서 이해하여야 한다. 중간엽 줄기 세포는, 비-제한적으로, 간세포, 조골세포, 연골세포, 힘줄세포 (tenocyte) 및 지방세포 등의, 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있다.

용어 "간세포 (hepatocyte)"는, 비-제한적으로, 여러가지 크기 또는 배수성 (예, 이배체, 사배체, 팔배체)을 가진 간세포 등의, 간 상피 및 실질 세포 (parenchymal cell)를 포괄한다.

본원에서, 용어 "HLA-E 양성"은 HLA-E 단백질을 검출가능한 수준으로 발현하는 간 전구 세포 또는 줄기 세포를 의미한다. HLA-E 발현은 세포내에서 이루어지거나, 세포 표면 상에서 이루어지거나 및/또는 용해성 단백질로서 발현될 수 있다. 세포가 특정 마커에 대해 양성이라고 하는 경우, 이는, 당해 기술 분야의 당업자가 적절한 측정을 통해 수행하였을 때 적절한 대조군과 비교해 그 마커에 대해 개별 신호의 존재 또는 증거를 판단하는, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄 반응 또는 유세포 측정에 의해 가능한 항체-검출가능성 또는 검출을 판단하는 것을 의미한다. 검출 방법으로 마커에 대한 정량 평가가 가능하다면, 양성 세포는, 대조군과는 유의하게 다른, 신호, 예를 들어, 비-제한적으로, 대조군 세포에 의해 발생되는 신호보다 적어도 0.5배, 적어도 1배, 적어도 1.5배 높은, 예를 들어, 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 높거나 심지어 그 보다 더 강한 신호를 평균적으로 발생시킬 수 있다.

본원에서, 용어 "증가된"은 발현, 분비 또는 효소 활성의 증가 의미로 사용되는 경우에, 프로컨디셔닝화의 결과로서 발현, 분비 또는 효소 활성의 수준이, 예를 들어 프로컨디셔닝화와 같은 어떠한 처리가 이행되지 않은 유사 세포에서의 발현, 분비 또는 효소 활성의 기저 수준보다 높은, 예를 들어, 비-제한적으로, 대조군 세포에서 나타나는 이러한 신호에 비해 적어도 0.5배, 적어도 1배, 적어도 1.5배 높은, 예를 들어, 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 이상 또는 심지어 그 이상으로 높은 것으로 정의된다.

용어 "간"은 간 장기를 의미한다. 용어 "간의 일부"는 일반적으로 간 장기의 임의 일부로부터 유래되는 조직 샘플을 의미하며, 그 일부의 양 또는 이것이 기원하는 간 장기의 부위로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 간 장기에 존재하는 모든 세포 유형들이 간의 일부로 제공될 수 있다. 간 일부의 양은 적어도 부분적으로는 본 발명의 방법을 타당하게 수행하기에 충분하게 일차 간 세포를 수득하는데 필요한 실무적인 고려 사항에 준한다. 그래서, 간의 일부는 간 장기에 대한 %로 표현할 수 있다 (예, 적어도 1%, 10%, 20%, 50%, 70%, 90% 또는 그 이상, 전형적으로 w/w). 다른 비-제한적인 예로, 간의 일부는 중량으로 정의할 수 있다 (예, 적어도 1 g, 10 g, 100 g, 250 g, 500 g 또는 그 이상). 예를 들어, 간의 일부는 간엽, 예를 들어 우 간엽 또는 좌 간엽, 또는 간 생검 또는 간 분리 수술 중에 적출되는 다수의 세포를 포함하는 임의의 세그먼트 또는 조직 샘플일 수 있다.

용어 "성체 간"은 출생한 개체, 즉 출생 후 임의 시기, 바람직하게는 만삭 출생한 개체의 간을 의미하며, 예를 들어 생후 적어도 1일, 1주일, 1개월 또는 1개월이 지난 연령, 또는 적어도 1, 5, 10세 또는 그 이상일 수 있다. 그러므로, "성체 간" 또는 성숙 간은 다르게는 "유아", "어린이", "청소년" 또는 "성체"라는 통상적인 용어로 설명되는 인간 개체에서 발견할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 간이 여러가지 동물 종들에서 출생 후 여러 시간 간격으로 실질적으로 발달 성숙도에 도달할 수 있어, 용어 "성체 간"이 각 종에 따라 적절히 해석될 수 있음을 알 것이다.

용어 "포유류"는, 비-제한적으로, 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 반려 동물 및 실험 동물, 예를 들어 마우스, 랫, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 및 영장류, 예를 들어, 원숭이 유인원 등과 같이 분류되는 모든 동물을 포함한다.

본원에서, 용어 "해리 (disassociating)"는 일반적으로 세포의 조직 또는 장기 조직화를 부분적으로 또는 완전히 파괴, 즉, 조직 또는 장기의 세포 및 세포 성분 간의 결합을 부분적으로 또는 완전히 파괴하는 것을 의미한다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 조직 또는 장기를 해리하는 목적은 이러한 조직 또는 장기로부터 세포 현탁액 (세포 집단)을 수득하고자 하는 것이다. 현탁액은 고립 또는 단일 세포뿐만 아니라, 물리적으로 부착되어 2개 이상의 세포로 이루어진 클러스터 또는 클럼프를 형성하는 세포를 포함할 수 있다. 해리는 바람직하게는 세포 생존성을 감소시키지 않거나, 또는 감소가 가능한 최소화된다.

본원에서, 용어 "일차 세포"는 개체의 장기 또는 조직, 예를 들어 간으로부터, 조직 또는 장기 외식편에 존재하는 세포를 적절한 기법으로 해리시킴으로써, 수득되는 세포 현탁액에 존재하는 세포를 포함한다.

용어 "배양"은 당해 기술 분야에서의 통상적인 의미이며, 광의적으로는 세포 및/또는 이의 자손의 유지 및/또는 생장을 의미한다.

용어 "계대 배양 (passaging)"은 당해 기술 분야에서의 통상적인 의미이며, 배양된 세포를 배양 기판으로부터 그리고 세포 간에 서로 분리하는 것을 의미한다. 간략하게 기술하기 위해, 세포를 부착 배양 조건 하에 배양하는 1차 시기 이후에 수행되는 계대 배양은, 본원에서는 본 발명의 방법에서 "1차 계대 배양" (또는 계대 1, P1)으로 지칭된다. 세포는 1회 이상 계대 배양할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상 계대 배양할 수 있다. 1차 계대 배양 이후의 각각의 계대는 본원에서 숫자를 1씩 증가시켜, 예를 들어 계대 2, 3, 4, 5, 또는 P1, P2, P3, P4, P5 등으로 나타낸다.

본원에서, 용어 "컨플루언스"는 세포가 서로 접촉해 생장에 이용가능한 표면의 실질적인 전체를 덮는 (즉, 완전 컨플루언트), 배양 세포의 밀도를 지칭한다.

용어 "혈장"은 통상적으로 정의되며, 인간 또는 동물 신체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 지칭한다.

용어 "혈청"은 통상적으로 정의되며, 샘플에서 먼저 응고시킨 다음 혈액 샘플의 형성된 응고물과 세포 성분들을 적정한 기법, 전형적으로 원심분리를 통해 액체 성분 (혈청)으로부터 분리함으로써 전혈 샘플로부터 수득한다. 불활성 촉매, 예를 들어, 유리 비드 또는 분말이 응고를 촉진할 수 있다. 유익하게는, 혈청은 포유류에 대한 불활성 촉매가 든 혈청-분리 용기 (SST)를 이용해 수득할 수 있다.

용어 "세포 배지" 또는 "세포 배양 배지" 또는 "배지"는 세포를 유지 또는 생장시키는데 유용할 수 있는 영양물질을 포함하는 수성 액체 또는 젤라틴성 물질을 의미한다. 세포 배양 배지는 혈청을 함유하거나 또는 무-혈청성일 수 있다.

본원에서, 용어 "성장인자"는 단독으로 또는 다른 물질에 의해 조절되는 경우, 다양한 세포 유형의 증식, 생장, 분화, 생존 및/또는 이동에 영향을 미치며, 유기체에서 발생학적, 형태학적 및 기능적 변화를 초래할 수 있는, 생물학적 활성 물질을 의미한다. 성장인자는 전형적으로 리간드로서, 세포에 존재하는 수용체 (예컨대, 표면 또는 세포내 수용체)에 결합함으로써 작용할 수 있다. 본원에서 성장인자는 특히 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 단백질성 물질일 수 있다. 용어 "성장인자"는 섬유모세포 성장인자 (FGF) 패밀리, 골 형성 단백질 (BMP) 패밀리, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF) 패밀리, 형질변환 성장인자 베타 (TGF-β) 패밀리, 신경 성장인자 (NGF) 패밀리, 상피 성장인자 (EGF) 패밀리, 인슐린 관련 성장인자 (IGF) 패밀리, 간세포 성장인자 (HGF) 패밀리, 인터루킨-6 (IL-6) 패밀리 (예컨대, 온코스타틴 M), 조혈 성장인자 (HeGF), 혈소판 유래 내피 세포 성장인자 (PD-ECGF), 안지오포이에틴, 혈관 내피 성장인자 (VEGF) 패밀리 또는 글루코코르티코이드에 속하는 구성원을 망라한다. 본 방법이 인간 간 세포에 대해 사용될 경우, 이러한 방법에 사용되는 성장인자는 인간 또는 재조합 성장인자일 수 있다. 인간 및 재조합 성장인자는 세포 기능에 바람직한 효과를 발휘할 것으로 기대되는 바, 이러한 방법에서 이들 성장인자를 사용하는 것이 바람직하다.

본원에서, 용어 "프리컨디셔닝화된" 간 전구 세포 또는 줄기 세포는 시험관내에서 하나 이상의 신호전달 분자에 노출된 간 전구 세포 또는 줄기 세포로서 정의된다. 선호적으로는, 이들 분자는 세포의 세포 배지에 지정된 시간 동안 첨가된다.

본원에서, 용어 "사이토카인"은, 비-제한적으로, T 세포, B 세포, NK 세포, 대식 세포, 조혈 세포, 중간엽 줄기 세포 및 전구 세포 등의 다능성 세포 또는 기타 세포 유형 등의, 면역 시스템의 세포 또는 다능성 세포에 작용하는, 면역 또는 기타 세포에 의해 분비되는 성장, 분화 또는 주화성 인자와 같은 신호전달 분자를 의미한다. 대표적인 사이토카인으로는, 비-제한적으로, 인돌아민 2,3-다이옥시게나제 (IDO), 간세포 성장인자 (HGF), 인터루킨들로 이루어진 군, 예를 들어 비-제한적으로, 인터루킨-1 α (IL-1α), 인터루킨-1 β (IL-1β), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-10 (IL-10), 인터페론, 예를 들어 인터페론-α (IFNα) 및 인터페론-γ (IFNγ), 종양 괴사 인자-α (TNFα) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 등이 있다.

용어 "세포 집단" 및 "세포의 집단"은 일반적으로 세포 군을 의미한다. 달리 명시되지 않은 한, 이 용어는 본원에서 정의된 바와 같이 본질적으로 세포로 이루어지거나, 또는 세포를 포함하는 세포 군을 의미한다. 세포 집단은 본질적으로 공통 표현형을 가지는 세포들로 이루어질 수 있거나, 또는 공통 표현형을 가지는 일부의 세포를 적어도 포함할 수 있다. 세포는, 비-제한적으로, 시험관내 배양 (예컨대, 부착 또는 단일층 생장) 동안 형태학적 외양, 특정 세포 성분 또는 생성물 (예컨대, RNA 또는 단백질)의 발현 수준, 특정 생화학적 경로의 활성, 증식 능력 및/또는 동력학적 특성, 분화 잠재력 및/또는 분화 신호에 대한 반응 또는 거동을 비롯하여, 한가지 이상의 입증가능한 특징이 실질적으로 유사하거나 또는 동일할 경우, 공통 표현형을 가진다고 한다. 따라서, 이러한 입증가능한 특징들이 세포 집단 또는 이의 일부를 정의할 수 있다. 실질적으로 세포 대다수가 공통 표현형을 가진다면, 그 세포 집단은 "실질적으로 동종"일 수 있다. "실질적으로 동종"인 세포 집단은 공통 표현형, 예컨대, 구체적으로 명시된 표현형 (예를 들어, 본 발명의 간 전구 세포 또는 줄기 세포 또는 본 발명의 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 자손의 표현형)과 같이 공통 표현형을 가진 세포를 60% 이상, 예를 들어, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 심지어는 99% 이상으로 포함할 수 있다. 아울러, 집단에 존재하는 임의의 다른 세포가 세포 집단의 전체적인 특성을 변형시키 않거나 또는 이에 중대한 영향을 미치지 않을 경우, 그 세포 집단은 본 발명의 간 전구 세포 또는 줄기 세포 (즉, 본 발명의 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 자손)의 표현형과 같은 공통 표현형을 가진 세포로 본질적으로 이루어진 것일 수 있으며, 따라서, 이는 세포주로서 정의될 수 있다.

본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 개체에 유의한 자극을 유발하지 않으며 투여 조성물의 생물학적 활성 및 특성을 무효화하지 않는, 담체 또는 희석제를 의미한다. 담체에 대한 비-제한적인 예로는 프로필렌 글리콜, 식염수, 유제 및 유기 용매와 물의 혼합물 등이 있다.

용어 "충분량"은 요망한 측정가능한 효과를 발휘하기에 충분한 양, 예를 들어 단백질의 발현 프로파일을 변형시키기에 충분한 양을 의미한다.

용어 "치료학적 유효량"은 질환의 증상을 완화하는데 효과적인 양이다. 치료학적 유효량은 예방을 요법으로 간주할 수 있으며, "예방학적 유효량"일 수 있다.

용어 "치료"는 치료학적 치료 및 목표한 병리학적 병태 또는 장애를 예방 또는 서행 (약화)하는 것을 목표로 하는 예방학적 또는 방지적 조처 둘다를 의미한다. 치료가 필요한 개체는 이미 장애를 가지고 있는 개체뿐 아니라 장애를 앓을 경향이 있는 개체 또는 장애를 예방하여야 하는 개체를 포함한다.

본원에서, 용어 "동종이계"는 공여 물질이 수용자와는 다른 개체로부터 기원하는 것을 의미한다. 동종이계 줄기 세포 이식은 유전학적으로 유사하지만 동일한 개체는 아닌 공여자로부터 기원한 줄기 세포를 사람에게 이식하는 시술을 의미한다.

본원에서, 용어 "섬유증"은 회복 또는 반응 과정에서 장기나 조직에 과도하게 섬유성 결합 조직이 형성되는 것을 의미한다.

용어 "간 섬유증"은 급성 또는 만성 간 손상 후 간질 (interstitial) 또는 "흉터" 세포외 기질의 축적을 의미한다. 진행성 섬유증의 말기인 간경변은 중격 형성과 간세포의 결절을 둘러싼 고리 흉터가 특징적이다. 전형적으로, 섬유증은 임상적으로 명확해지기까지 수년 또는 수십년이 걸리지만, 간경변이 수개월에 걸쳐 진행되는 주목할만한 예외로는 소아 간 질환 (예, 담도 폐쇄증), 약물-유발성 간 질환, 및 간 이식 후 면역억제로 인한 바이러스성 간염 등이 있을 수 있다.

용어 "rMFI" 또는 상대적인 평균 형광 강도는 대조군 항체 (이소형 대조군)로부터 수득되는 형광 강도에 대한 특정 표적의 항체를 이용해 측정한 형광 강도의 비율이다.

용어 "유전자 공학", "유전자 변형" 또는 "유전자 조작"은 생물공학 기법을 이용해 유기체의 유전자를 직접 조작하는 것이다. 이는, 개선되거나 또는 새로운 유기체를 만들기 위해 종간 또는 종 경계를 넘어선 유전자의 전달을 비롯하여, 세포의 유전자 구성을 바꾸기 위해 사용되는 일련의 기술이다. 새로운 DNA는 재조합 DNA 방법을 이용해 대상 유전 물질을 분리 및 복제함으로써 수득하거나, 또는 DNA를 인공 합성함으로써 수득한다. 일반적으로, 구조체를 구축하고, 이를 이용해 DNA를 숙주 유기체에 삽입한다.

용어 "게놈 편집" 또는 "게놈 공학"은 살아있는 유기체의 게놈에 DNA를 삽입하거나, 결손시키거나, 변형시키거나 또는 교체하는 일종의 유전자 조작이다. 게놈 편집은, 유전 물질을 숙주 게놈에 무작위 삽입하는 초기 유전자 조작 기술과는 달리, 부위 특이적인 위치로 삽입되게 표적화한다.

제1 측면에서, 본 발명은, 적어도 60%의 전구 세포 또는 줄기 세포가 세포 표면 마커 HLA-E를 발현하는 인간 성체 간-유래 전구 세포 또는 줄기 세포, 또는 HLA-E 양성의 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 조성물을 제공한다.

단리된 간-유래 전구 세포에서 HLA-E 발현 유도는 이의 면역억제 특성을 상당히 강화하는 것으로 확인된다. 이러한 HLA-E 발현 세포는 CD8+ T 세포 매개 세포용해로부터 보호된다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, HLA-E 양성인 전구 세포의 면역억제 특성은 자연 살상 세포의 세포독성 활성을 조절하는 HLA-E 조절 능력으로 인해 생기는 것으로 생각된다. 따라서, HLA-E 양성의 전구 세포는 특히 여러가지 간 장애를 비롯하여, 원치않은 면역 반응을 수반하는 장애, 예를 들어, 비-제한적으로, 염증, 자가-면역 질환 및 이식편 거부 반응을 치료 및/또는 예방하는데 매우 적합하다.

이들 전구 세포는 자체 증식 능력을 유지할 수 있으며, 특정 배지에서 배양시 세포를 간-특이적인 세포 유형으로 특이적으로 분화시킬 수 있는 것으로, 보인다. 이들의 증식 능력과 간 특이성은 간 세포 이식시 효능 및 안전성 증가로 이어진다. 또한, 이들 줄기 세포는 성체 기원이므로, 배아 세포와 관련한 면역학적, 윤리적 및 발암성 문제로부터 벗어난다.

본 발명의 전구 세포의 강화된 면역억제 특징은 세포 요법 및/또는 조직 이식의 면역-반응 관련 위험을, 특히 동종이계 세포 이식시 특히 높은 면역-반응 관련 위험을 낮추는데 기여한다. 이에, 본 발명의 HLA-E 양성인 간-유래 전구 세포는 원치않은 면역반응을 수반하는 장애, 예를 들어, 비-제한적으로, 염증, 자가-면역 질환 및 이식편 거부 반응뿐 아니라 여러가지 간 장애에 대한 세포 요법으로서 성공 가능성이 높고, 환자에 대한 효능과 허용성이 우수하다.

특정 구현예에서, 본 발명은 HLA-E 양성인 인간 간 전구 세포, 바람직하게는 HLA-E 양성의 인간 성체 간 전구 세포를 제공한다.

본 발명의 목적에서, 용어 "HLA-E의 발현" 또는 "HLA-E 양성 세포"는, 야생형 일차 무처리 세포에서 관찰될 수 있는 HLA-E 기저 발현 수준보다 높은 수준으로 발현되는 것으로서 정의된다. 즉, 이러한 세포는 무처리된 전구 세포 또는 줄기 세포에서의 HLA-E 기저 발현 수준와 비교해 증가된 HLA-E 발현 수준을 가진다. 이에, 본 발명은 기저 수준과 비교해 HLA-E 발현 수준이 증가된 간으로부터 단리된 전구 세포 또는 줄기 세포의 조성물을 제공한다. HLA-E의 기저 발현 수준은 HLA-E 발현을 강화하는 자극의 부재시 비-발현뿐 아니라 최소한의 발현을 의미할 수 있다. 증가된 발현 수준은, 예를 들어, 비-제한적으로, 대조군 세포의 발현 측정치 대비 적어도 1.5배 높게, 예를 들어, 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 또는 심지어 그 보다 높은 발현 수준을 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명은, 적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%의 전구 세포 또는 줄기 세포가 세포 표면 마커 HLA-E를 발현하는, 인간 성체 간-유래 전구 세포 또는 줄기 세포의 조성물에 관한 것이다.

다른 추가적인 구현예에서, 본 발명은, 유세포 측정에 의한 측정시 HLA-E 발현 세포의 HLA-E 상대적인 평균 형광 강도 (rMFI)가 적어도 6.5배인, 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 조성물에 관한 것이다. rMFI는 표적의 평균 형광 강도를 대조군의 중앙 형광 강도로 나눈 비율이다. rMFI는 일반적으로 편차가 적용되지 않는 안정적인 매개변수로 간주된다. 본 발명의 맥락에서, 항-(인간) HLA-E 항체를 사용한다. 적합한 항체에 대한 일 예는 Miltenyi 사의 항-HLA-E 항체 클론 REA1031이다. 가능한 유세포 측정기는 MACSQuant® 분석기이다.

추가적인 구현예에서, HLA-E 발현 세포는 유세포 측정에 의한 측정시 HLA-E 상대적인 평균 형광 강도 (rMFI)가 적어도 7, 더 바람직하게는 적어도 8, 더 바람직하게는 적어도 9, 더 바람직하게는 적어도 10이다. 다른 구현예에서, 이러한 rMFI는 6.5 내지 15, 더 바람직하게는 6.5 내지 14, 더 바람직하게는 6.5 내지 13, 더 바람직하게는 6.5 내지 13, 더 바람직하게는 6.5 내지 12이다.

면역 허용성 유도에 참여하는 다른 단백질은 HLA-G이다. HLA-G는, HLA-E와 마찬가지로, 저해성 자연 살상 세포 수용체를 자극하여, 면역억제 기능을 발휘할 수 있다. HLA-E 및 HLA-G는 함께 작동하는 것으로 보고된 바 있다. 이에, 본 발명의 추가적인 구현예에서, 간 전구 세포는 또한 HLA-G에도 양성이다. HLA-E와 HLA-G의 공동-작동은 해당 간 전구 세포의 면역억제 작용을 추가적으로 강화하여, 세포 요법 방식으로 사용하기 더 적합해진다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 집단 또는 조성물은 HLA-E를 더 높은 수준으로 분비할 것이다.

추가적인 구현예에서, 본 발명의 세포, 이를 포함하는 세포 집단 및 조성물은 하나 이상의 중간엽 마커에 대해 양성일 수 있다. 중간엽 마커로는, 비-제한적으로, 비멘틴, CD13, CD90, CD73, CD44, CD29, α-평활근 액틴 (ASMA) 및 CD140b를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 본 발명의 세포, 이러한 세포를 포함하는 집단 및 조성물은 HGF를 분비한다. 다른 추가적인 구현예에서, 본 발명의 세포, 이들 세포를 포함하는 집단 및 조성물은 HLA-DR에 음성이다. 추가적인 구현예에서, 이러한 집단 및 조성물은 선택적으로 하나 이상의 간 마커 및/또는 하나 이상의 간-특이 활성과 연관된 마커에 대해 추가적으로 양성이다. 예를 들어, 간 마커로는, 비-제한적으로, 알부민 (ALB), HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A4 및 α-1 항-트립신을 포함한다. 간-특이 활성으로는, 비-제한적으로, 우레아 분비, 빌리루빈 접합, α-1-항-트립신 분비, CYP3A4 활성을 포함한다. 이들 마커/활성의 존재는 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 간 기원, 다능성 및 유지되는 간 기능성을 추가로 검증해준다.

일 구현예에서, 세포는 또한 하기 측면들로 특정될 수 있다:

a. α-평활근 액틴 (ASMA), CD140b, 및 선택적으로 알부민 (ALB)에 대해 양성;

b. SUSD2 (Sushi domain containing protein 2) 및 사이토케라틴-19 (CK-19)에 대해 음성

추가적인 구현예에서, 이들 세포는 CD90, CD73, 비멘틴, ASMA, CD140b 및 CD13을 발현하고, HGF를 분비하는 것으로 검증되었다.

추가적인 다른 구현예에서, 세포는 또한 하기에 대해 양성인 것으로 특정되거나 또는 측정될 수 있다:

a. HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 및 CYP3A4, 및 선택적으로 알부민으로부터 선택되는 하나 이상의 간 마커; 및/또는

b. 비멘틴, CD90, CD73, CD44 및 CD29로부터 선택되는 하나 이상의 중간엽 마커; 및/또는

c. 우레아 분비, 빌리루빈 접합, α-1-항-트립신 분비 및 CYP3A4 활성으로부터 선택되는 하나 이상의 간-특이 활성; 및/또는

d. ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46 및 CD81로부터 선택되는 하나 이상의 마커; 및/또는

e. MMP1, ITGA11, FMOD, KCND2, CCL11, ASPN, KCNK2 및 HMCN1으로부터 선택되는 하나 이상의 마커.

추가적인 구현예에서, 세포는 추가적인 검사를 통해, 마커 CD133, CD45, CK19 및/또는 CD31에 음성인 것으로 확립된다.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 간-유래 전구 세포는, 추가적으로, 무처리된 간-유래 전구 세포 또는 줄기 세포에서 검출되는 PGE2 기저 분비 수준과 비교해, 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 분비 수준이 증가된다.

본 발명의 다른 추가적인 구현예에서, 간-유래 전구 세포는, 무처리 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서 검출되는 효소 활성 기저 수준과 비교해, 인돌아민 2,3-다이옥시게나제 (IDO)의 효소 활성 수준 증가를 또한 나타낸다.

본 발명의 또 다른 추가적인 구현예에서, 간-유래 전구 세포는 IDO, 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 신타제 2 (PTGS2), 인터루킨-6 (IL-6) 및/또는 IL-10으로 이루어진 군에 속하는 하나 이상의 사이토카인 또는 면역조절 인자를, 무처리 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서 검출되는 기저 발현 수준과 비교해, 증가된 수준으로 발현한다.

PTGS2는 PGE2 생산에 참여하고, IDO, PGE2, IL-6, IL-10 및 HGF는 면역조절 특성을 가진 분비형 인자이다. 발현, 분비 및/또는 효소 활성 각각 또는 이들 조합의 수준 증가는, 본 발명의 간-유래 전구 세포의 면역억제 및 면역조절 특성에 추가적으로 기여한다. 따라서, 전술한 구현예에 따른 세포는 더 강력한 면역조절 특성을 가지며, 세포 요법, 특히 동종이계 세포 이식을 수반하는 요법에 사용하기 더 안전하다.

일 구현예에서, 이러한 조성물 또는 세포 집단은 전구 세포 또는 줄기 세포를 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상 또는 약 90% 이상으로 포함할 수 있거나, 또는 동종의 또는 실질적으로 동종의 전구 세포 또는 줄기 세포 집단이다. 본 조성물 또는 세포 집단의 면역억제 특성은 이러한 집단 내 전구 세포 또는 줄기 세포의 양적 증가에 의해 더욱 강화된다.

본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 본 발명의 세포가 생존성과 자체 면역조절 특성을 유지하도록 선택된다. 담체는, 예를 들어, 물, 식염수, 포스페이트 완충화된 염수, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적정 혼합물을 함유한 약제학적으로 허용가능한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 이에, 본 발명은 전술한 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주 또는 이를 포함하는 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물을 개시한다.

바람직하게는, 본 발명의 단리된 간 전구 세포를 포함하는 조성물은 세포를 적어도 10³, 10⁶, 10⁹ 또는 그 이상 (예를 들어, 각 용량 또는 투여에 대해 세포 5,000,000-500,000,000 또는 5,000,000-250,000,000 또는 50,000,000-500,000,000 또는 50,000,000-250,000,000 또는 100,000,000-500,000,000 또는 100,000,000-250,000,000주)으로 포함할 수 있다. 이러한 세포-기반의 조성물은 또한 추가적인 치료학적, 진단적 또는 임의의 다른 유용한 효과를 제공할 수 있는 생물학적 (예, 항체 또는 성장인자) 또는 화학적 (예, 약물, 세포 보존성 또는 표지 화합물) 기원의 기타 물질을 함유할 수도 있다. 문헌들에 추가적인 특정 완충제, 성장인자 또는 보강제를 함유할 수 있는 세포-기반의 약학적 조성물과 혼용가능한, 선택적인 첨가제, 부형제, 비히클 및/또는 담체에 대한 몇가지 예들이 제시되어 있으며, 조성물에서 각 성분의 양 (㎍/mg, 부피 또는 퍼센트로)뿐 아니라 각 전구 세포와 이를 조합하는 수단도 기재되어 있다.

추가적인 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장기 보관에 적합한 세포 (예, 냉동보존 세포) 또는 신선한 세포로서 상기한 세포를 함유한 조성물의 형태로 (인간 또는 동물 모델에) 생체내 투여하거나 또는 시험관내 적용하기 위한 치료학적 방법에 이용가능할 수 있는 약학적 조성물로서 제공할 수 있다.

다른 추가적인 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 생체 인공 간 기구 (bioartificial liver device), 천연 또는 합성 매트릭스 또는 적정 위치 (세포의 복귀 및 생착을 돕는 케모카인을 발현하는 염증 또는 조직 병변 영역을 비롯한)에서 세포의 생착과 기능을 허용하는 기타 시스템을 포함하여, 시험관내 및/또는 생체내에서 세포를 생장 및 분화시킬 수 있는 세포 현탁물, 스폰지 또는 기타 3차원 구조로서 제공될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 (정맥내 또는 동맥내 카테터 투여를 또한 망라한) 주입을 통해 또는 이식, 예를 들어 배아 또는 태아에의 국소 주입, 전신 주입, 비장내 주입, 관절내 주입, 복막내 주입, 문맥내 주입, 예를 들어 간 피막 (liver capsule) 아래 간 펄프 (liver pulp)에 주입, 비경구 투여 또는 자궁내 주입을 통해 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 세포, 조성물 및 세포 집단은 다양한 방법을 통해 수득할 수 있다.

일 구현예에서, 조성물 또는 세포 집단에 존재하는 본 발명의 줄기 세포 또는 전구 세포는 HLA-E를 코딩하는 외인성 핵산 서열을 포함한다. 인간 HLA-E 서열은 NCBI에서 Gene ID 3133 하에 등록되어 있다. 이러한 외인성 핵산의 도입은 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 유전자 조작 기법을 통해 수행할 수 있다. 이러한 외인성 핵산은, 예를 들어, 벡터, 유도성 프로모터, 대상 단백질 산물을 코딩하는 서열 등을 포함하는 핵산 구조체일 수 있다. 서열을 세포에 전달하기 위한 다양한 벡터 (예, 플라스미드, 발현 벡터, 레트로바이러스 벡터 등)들이 공지되어 있다. 일 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.

당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법들을 이용해, 표적 세포를, 예를 들어 전기천공, 칼슘 석출 DNA, 융합, 형질감염, 리포펙션 등에 의해 형질감염시킬 수 있다. DNA를 도입하는 구체적인 방식이 본 발명을 구현하는데 결정적인 것은 아니다. 레트로바이러스와 적절한 패키징 세포주의 조합을 이용할 수 있는데, 캡시드 단백질이 표적 세포 감염시 작용할 것이다. 통상적으로, 세포 및 바이러스는 배양 배지에서 적어도 약 24시간 동안 인큐베이션한다. 통상적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터는 "결함형", 즉 증식성 감염에 필요한 바이러스 단백질을 생산하지 못한다. 벡터의 복제에는 패키징 세포주에서의 증식이 필요하다.

대상 단백질 산물 역시 본원에 기술된 전구 세포 또는 줄기 세포 집단의 검출 및/또는 선별을 보조하도록 선택할 수 있다. 줄기 세포를 검출 또는 선별하기 위해, 검출 구조체를 줄기 세포인 것으로 의심되거나 또는 줄기 세포를 포함하는 세포 또는 세포 집단에 도입한다. 발현 구조체를 도입한 후, 세포는 검출가능한 마커를 발현하기에 충분한 시간 동안, 통상적으로 적어도 12시간에서 약 2주 이하의 기간 동안 유지되며, 그 기간은 약 1일 내지 약 1주일일 수 있다.

증식 후 표적 세포에서 유전자 구조체를 회수할 수 있는, 이는 일시적인 벡터 시스템을 사용하거나 또는 원하는 단백질 코딩 서열 측면에 위치되는 이종의 재조합 부위를 배치함으로써, 달성할 수 있다. 바람직하게는, 구조체의 결손 후 외인성 서열이 결핍된 세포를 쉽게 단리할 수 있도록, 검출가능한 마커, 예를 들어 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제, 항체 선별 방법에 적합한 세포 표면 단백질 등을 발현 벡터에 포함시킨다.

포유류 세포에서 일시적 또는 장기간의 발현을 제공하는 발현 벡터를 이용할 수 있다. 일반적으로, 일시적인 발현은 숙주 세포가 발현 벡터의 카피를 다수 축적하여 발현 벡터에 의해 코딩된 바람직한 폴리펩타이드를 고 수준으로 합성할 수 있도록, 숙주 세포에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용을 수반한다. 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 일시적인 발현 시스템은 편리한 단기간 세포 증폭을 허용하지만, 세포의 장기적인 유전자형에는 영향을 미치지 않는다.

일부 구현예에서, 선택 세포는 1회 이상의 계대 동안, 통상적으로 적어도 약 2회 계대 배양, 적어도 약 3회 계대 배양 또는 그 이상 내지 약 10회 계대 배양 이하, 통상적으로 약 7회 계대 배양 이하 동안 배양 상태로 유지된다. 이러한 배양 후, 세포는 전술한 검출 마커의 발현에 따라 분류된다.

일 구현예에서, 외인성 핵산은 표적화된 게놈 편집을 통해 세포에 도입된다. 표적화된 게놈 편집에 사용되는 통상적인 방법은 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, TALEN (transcription activator-like effector-based nuclease)와 같은 뉴클레아제, 및 CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 시스템을 이용하는 것이다. 바람직한 구현예에서, CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 줄기 세포 또는 전구 세포에 HLA-E를 도입한다.

본 발명은 마찬가지로 프리컨디셔닝화 또는 자극을 이용함으로써 HLA-E 양성의 간 전구 세포 또는 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 이러한 방법은 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 배양물의 세포 배지에 하나 이상의 사이토카인을 첨가하는 것을 의미하는 세포의 프리컨디셔닝화 단계를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 이러한 방법은 하기 단계들을 포함한다:

(a) 성체 간 또는 이의 일부를 해리시켜, 일차 간 세포 집단을 수득하는 단계;

(b) (a)의 일차 간 세포의 조제물을 구축하는 단계;

(c) (b)의 조제물에 포함된 세포를, 세포의 부착 및 생장과 세포 집단의 출현 (emergence)을 허용하는 지지체 상에서 배양하는 단계;

(d) (c)의 세포를 1회 이상 계대 배양하는 단계;

(e) 단계 (d) 1회 계대 배양시, 바람직하게는 단계 (d)의 마지막 계대 배양시, 세포를 하나 이상의 사이토카인으로 프리컨디셔닝화하는 단계; 및

(f) (e)의 프리컨디셔닝화 후 수득되는 세포 집단을 회수하는 단계.

추가적인 구현예에서, HLA-E의 발현은 선택적으로 단계 (f)에서 수득한 세포에서 측정하고, 필요에 따라 이들 세포에 대해 추가적인 선별을 수행한다.

HLA-E 기저 발현은 배지내 외인성 사이토카인 부재 조건에서의 비-발현뿐 아니라 최소한의 발현을 의미할 수 있다.

상기 방법의 단계 (a)에서, 해리 단계는, 완전히 분화된 간세포와 더불어, 간 전구 세포 또는 줄기 세포를 생산하기 위해 이용할 수 있는 소정량의 일차 세포를 포함하는, 간 또는 이의 일부를 수득하는 단계를 수반한다.

간 또는 이의 일부는 "개체", "공여 개체" 또는 "공여자"로부터 수득되며, 이들 용어는 상호 호환적으로 척추 동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간을 의미한다. 간의 일부는 간의 임의 부위로부터 유래되는 조직 샘플일 수 있으며, 간에 존재하는 여러가지 세포 유형들을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 바람직하게는 포유류 간 또는 간의 일부로부터 단리되며, 여기서 용어 포유류는 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 실험 동물, 스포츠 동물 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소, 마우스, 랫, 토끼 등을 비롯하여, 포유류로서 분류되는 모든 동물을 지칭한다. 더 바람직하게는, 간 전구 세포 또는 줄기 세포는 인간 간 또는 이의 일부, 바람직하게는 인간 성체 간 또는 이의 일부로부터 단리된다. 인간 성인의 간으로부터 본 발명에 따라 유래되는 간 전구 세포 또는 세포주 또는 이의 자손은, 예를 들어, 원치않은 면역 반응을 수반하는 장애, 예를 들어, 비-제한적으로, 간 질환을 비롯하여 염증, 자가-면역 질환 및 이식편 거부 반응을 앓고 있는, 환자, 특히 인간 환자에 대한 연구 및 요법에 유용하게 이용될 수 있다. 예를 들어, 종양 증식을 구축하기 쉬운 배아 줄기 세포와 같은 다른 줄기 세포 소스와는 대조적으로, 성체 간 유래 줄기 세포는 발암 변이 위험이 낮아, 세포 이식에 사용하기 더 안전하다.

본 발명의 대안적인 구현예에서, 성체 간 또는 이의 일부는 비-인간 동물 개체로부터, 바람직하게는 비-인간 포유류 개체로부터 유래할 수 있다. 비-인간 동물 또는 비-인간 포유류 개체의 간으로부터 본원에 기술된 바와 같이 유래되는 전구 세포 또는 줄기 세포 또는 세포주, 또는 이의 자손은, 예를 들어, 동일한, 동족 (related) 또는 기타 비-인간 동물 또는 비-인간 포유류 종에 속하는 구성원에 대한 간 질환 연구 및 요법에서, 또는 심지어 간 질환을 앓고 있는 인간 환자에 대한 요법 (예를 들어, 이종장기이식, 비-인간 동물 또는 비-인간 포유류 세포를 포함하는 생체-인공 간 기구)에서, 유용하게 이용할 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 특히 인간 요법에 사용하기 적합한 비-인간 포유류 세포는 돼지로부터 기원할 수 있다.

공여자는 당해 기술 분야에서 허용되는 기준, 예를 들어, (순환 및 호흡 기능의 비-가역적인 정지를 수반하는) "심장-폐" 또는 (뇌간을 비롯한, 뇌 전체의 모든 기능의 비-가역적인 정지를 포함하는) "뇌사" 기준에 따라 결정되는 바와 같이, 살아있거나 또는 죽은 상태일 수 있다. 회수는 당해 기술 분야에 공지된 절차, 예를 들어 생검, 절제 또는 절개를 포함할 수 있다.

당해 기술 분야의 당업자라면, 공여 개체로부터 간 또는 그 일부를 회수하는 적어도 일부 측면들이 대응되는 법적 및 윤리적 규범에 의거할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 비-제한적으로, 살아있는 인간 공여자로부터 간 조직을 수득하는 것은 향후 공여자의 생명을 유지시키는데 적합하여야 할 수 있다. 즉, 살아있는 인간 공여자로부터, 예를 들어 생검 또는 절제를 이용해, 공여자에서 생리학적 간 기능이 적절한 수준으로 유지되도록, 간의 일부만 취할 수 있다. 한편, 비-인간 동물로부터 간 또는 이의 일부를 회수하는 것은, 비-인간 동물의 향후 생존 유지에 적합하여야 하는 것은 아닐 수 있다. 예를 들어, 비-인간 동물은 조직 회수 후 인도적으로 안락사시킬 수 있다. 이러한 고려 사항과 유사 사항들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이며, 윤리적 및 법적 규범을 반영할 것이다.

간 또는 이의 일부는, 지속적으로 순환되는, 예를 들어 심박동 및 지속적인 호흡 기능, 예를 들어 폐 호흡 또는 인공 호흡 중인 공여자, 바람직하게는 인간 공여자로부터 수득할 수 있다. 윤리적 및 법적 규범에 따라, 공여자는 뇌사이어야 하거나 아닐 수도 있다 (예를 들어, 인간 공여자를 향후 생존시키는데 적합하지 않은 간 전체 또는 이의 일부의 회수는 뇌사자에게 허용될 수 있음). 이러한 공여자로부터 간 또는 이의 일부의 회수는, 조직이 통상적으로 허혈증 (순환 정지)으로 인한 상당한 산소결핍증 (산소 공급 부족)을 겪지 않으므로, 유용하다.

대안적으로, 간 또는 이의 일부는, 회수 시점에 조직에서 순환이 정지된, 예를 들어 심박동이 정지된 및/또는 호흡 기능이 중단된, 예를 들어 폐 호흡이 중단되고 인공 호흡하지 않는, 공여자, 바람직하게는 인간 공여자로부터 수득할 수 있다. 이러한 공여자로부터 유래되는 간 또는 이의 일부는 적어도 약간의 산소결핍증이 있을 수 있지만, 이러한 조직으로부터 살아있는 전구 세포 또는 줄기 세포를 또한 단리할 수 있다. 간 또는 이의 일부는, 공여자의 순환 (예, 심박동)이 정지된 지 약 24시간 이내, 예를 들어 약 20시간 이내, 예를 들어 약 16시간 이내, 더 바람직하게는 약 12시간 이내, 예를 들어 약 8시간 이내, 심지어 더 바람직하게는 약 6시간 이내, 예를 들어 약 5시간 이내, 예를 들어 약 4시간 이내, 예를 들어 약 3시간 이내, 더욱 바람직하게는 예를 들어 약 2시간 이내, 가장 바람직하게는 약 1시간 이내, 예를 들어 공여자의 순환 (예, 심박동)이 정지된 지 약 45분 이내, 약 30분 이내 또는 약 15분 이내에, 회수할 수 있다.

회수한 조직은 실온까지 또는 실온보다 낮은 온도에서 냉각시킬 수 있지만, 통상적으로는 특히 냉동으로 핵형성 또는 얼음 결정 성장이 발생할 경우에는, 조직 또는 이의 일부는 냉동하지 않는다. 예를 들어, 조직은 약 1℃ 내지 실온, 약2℃ 내지 실온, 약 3℃ 내지 실온 또는 약 4℃ 내지 실온의 임의 온도에서 보관할 수 있으며, 유익하게는 약 4℃에서 보관할 수 있다. 조직은 또한 당해 기술 분야에서 공지된 바와 같이 "얼음 위"에 둘 수도 있다. 조직은, 허혈성 상태인 기간, 즉 공여자에서 순환이 정지된 이후의 시간 전체 또는 그 일부의 시간 동안, 냉각될 수 있다. 즉, 조직은 온 허혈 (warm ischemia), 냉 허혈 (cold ischemia) 또는 온 허혈과 냉 허혈의 조합으로 처리될 수 있다. 회수한 조직은, 그렇게, 예를 들어 가공 처리하기 전 최대 48시간 동안, 바람직하게는 24시간 미만, 예를 들어 16시간 미만, 더 바람직하게는 12시간 미만, 예를 들어 10시간 미만, 6시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만 또는 1시간 미만 동안 유지시킬 수 있다.

회수 조직은 예를 들어, 적합한 배지에 완전히 또는 적어도 일부 침지하는 것이 유익할 수 있지만, 그렇게 보관하여야 하는 것은 아니며, 및/또는 조직을 향후 가공 처리하기 전에 조직에 적합한 배지를 관류시킬 수 있지만, 관류시켜야 하는 것은 아니다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 가공 처리하기 전까지의 기간 동안 조직의 세포 생존을 뒷받침할 수 있는 적합한 배지를 결정할 수 있다.

간 또는 이의 일부로부터 전구 세포 또는 줄기 세포의 회수는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라, 예를 들어, EP1969118, EP3039123, EP3140393 또는 WO2017149059에 기술된 바와 같이, 수행한다.

간략하게는, 먼저 간 또는 이의 일부의 해리로부터 일차 간 세포 집단을 수득하여, 이러한 간 또는 이의 일부로부터 1차 세포 집단을 구축한다. 그 후, 이 집단을 구성하는 세포를 부착 조건 하에, 바람직하게는 지지체 상에서 세포의 부착 및 생장을 허용하는 부착 조건 하에 배양한다. 다음으로, 이들 세포를 1회 이상, 바람직하게는 70% 컨플루언스로 계대 배양한다. 마지막으로, 하나 이상의 간 마커 및 하나 이상의 중간엽 마커에 대해 양성이고 하나 이상의 간-특이 활성을 가진 세포를 단리한다.

간 또는 이의 일부를 해리하여 이로부터 1차 세포 집단 (현탁물)을 수득하는 적절한 방법은, 비-제한적으로, 효소 분해, 기계적 분리, 여과, 원심분리 및 이들의 조합 등의, 당해 기술 분야에 잘 알려진 임의 방법일 수 있다.

상기 방법의 단계 (b)에서, 본원에서와 같이 정의되고 간 또는 이의 일부의 해리에 의해 수득되는 1차 세포 집단은 전형적으로 이종적일 수 있으며, 즉, 간 실질 및/또는 간 비-실질 영역에 존재하는 것일 수 있는, 전구 세포 또는 줄기 세포를 비롯한, 임의의 간을 구성하는 세포 유형에 속하는 한가지 이상의 세포 유형의 세포들을 포함할 수 있다. 간을 구성하는 세포 유형에 대한 예로는, 비-제한적으로, 간세포, 담관 세포 (cholangiocyte, bile duct cell), 쿠퍼 세포, 간 성상 세포 (Ito 세포), 난형 세포 (oval cell) 및 간 내피 세포 등이 있다. 상기한 용어들은 당해 기술 분야에서 확립된 의미를 가지며, 본원에서는 이와 같이 분류된 임의의 세포 유형들을 망라하는 것으로 광의적으로 해석된다.

1차 세포 집단은, 간 해리 방법 및/또는 임의의 적절한 기법을 적용함으로써 물리적 특성 (크기, 형태), 생존성, 세포 배양 조건 또는 세포 표면 마커를 토대로, 간세포 및/또는 기타 세포 유형의 초기 조제물을 분획화 또는 농화하는 임의 방법에 따라, 간세포를 여러가지 비율 (전체 세포의 0.1%, 1%, 10% 또는 그 이상)로 포함할 수 있다

본원에서 정의되고 간 (또는 이의 일부)의 해리에 의해 수득되는 1차 세포 집단은, 신선한 1차 간 세포로서 세포 배양물 확립에 바로 사용하거나, 또는 바람직하게는 통상적인 장기 보존 기법을 이용하여 1차 간 세포의 냉동보존 조제물로서 보관할 수 있다.

단계 (c)에서, 단계 (b)에서 수득되는 1차 간 세포 조제물은 이후 완전 합성 지지체 (예, 플라스틱 또는 임의의 폴리머 물질), 또는 유사한 1차 세포의 부착 및 증식 및 바람직한 마커를 가진 성체 간 전구 세포 집단의 출현을 허용하는 생물학적 기원의 임의의 기타 물질, 피더 세포 또는 단백질 추출물로 사전-코팅된 합성 지지체 상에서 직접 배양하며, 이러한 마커는 바람직하게는 단백질 수준에서 면역조직화학, 유세포 측정 또는 기타 항-항체를 이용한 기법을 이용함으로써 식별한다. 1차 세포는 세포의 부착 및 이종의 세포 집단의 증식 및 출현을 지지해주는 세포 배양 배지에서 배양한다. 상기에서 정의되는 1차 간 세포의 배양 단계를 통해 간 전구 세포의 출현 및 배양 증식이 이루어지며, 간 전구 세포 또는 줄기 세포가 충분히 증식될 때까지 계속될 수 있다. 예를 들어, 배양은, 세포 집단이 특정 수준의 컨플루언스 (예를 들어, 적어도 50%, 70% 또는 적어도 90% 이상의 컨플루언스)에 도달할 때까지 계속될 수 있다.

단계 (c)에서 수득되는 간 전구 세포 또는 줄기 세포는 EP3140393 또는 WO2017149059에 기술된 바와 같이, 이 단계 (즉, 단계 (d)에 언급된 바와 같이 세포의 계대 배양하기 전에)에서 이미 관련 마커를 검출할 수 있는 기법에 의해 추가적으로 특정될 수 있다. 이러한 마커를 동정하고 이에 대해 양성 또는 음성인지를 측정하기 위해 사용되는 기법들 중에서도, 특히 웨스턴 블롯, 유세포 측정, 면역조직화학 및 ELISA가 이 단계에서 이용가능한 간 전구 세포에서 심지어 소량으로도 마커를 단백질 수준에서 검출할 수 있으므로, 이러한 방법이 바람직하다.

간 전구 세포의 단리는 이후 양성 마커의 존재를 토대로 행해질 수 있으며, 간 전구 세포는 하나 이상의 중간엽 마커에 대해 양성일 수 있다. 중간엽 마커로는, 비-제한적으로, 비멘틴, CD13, CD90, CD73, CD44, CD29, α-평활근 액틴 (ASMA) 및 CD140-b 등이 있다. 또한, 간 전구 세포는 HGF를 분비할 수 있다. 또한, 간 전구 세포는 선택적으로 하나 이상의 간 마커에 양성일 수 있거나, 및/또는 하나 이상의 간-특이 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 간 마커로는, 비-제한적으로, 알부민 (ALB), HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1, CYP3A4 및 α-1 항-트립신 등이 있다. 간-특이 활성으로는, 비-제한적으로 우레아 분비, 빌리루빈 접합, α-1-항-트립신 분비 및 CYP3A4 활성 등이 있다.

본 방법의 단계 (d)에서, 1차 세포를 세포의 부착 및 동종의 세포 집단의 증식 및 출현을 지원하는 세포 배지에서 배양하며, 그래서 동종의 세포 집단이 1회 이상의 계대 배양 후 간 전구 세포 또는 줄기 세포로 점점 농화된다. 이들 간 전구 세포는, 48-72시간 이내로 달성될 수 있는 세포 배가 (cell doubling)와 바람직한 특성을 가진 간 전구 세포를 적어도 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상의 계대 배양 동안 유지하면서, (EP3140393 또는 WO2017149059에 기술된 바와 같이) 바람직한 특성을 가진 자손을 수득하기에 충분한 세포를 구축하도록 빠르게 증폭시킬 수 있다.

단리된 간 전구 세포는 세포 부착이 가능한 기판에 접종하고, 일반적으로, 혈청을 함유하거나 또는 무-혈청성일 수 있는, 추가적인 증식을 뒷받침하는 배지, 액체 배양 배지에서 배양한다. 일반적으로, 세포 부착을 허용하는 기판은 실질적으로 친수성 기판일 수 있다. 부착 세포를 배양하는 현행 표준 실무는 보바인, 인간 또는 기타 동물 혈청이 첨가된 또는 비-첨가된 정의된 화학 배지의 사용을 수반할 수 있다. 영양분 및/또는 증식 촉진제 외에도, 유기 또는 무기 화합물들의 적절한 혼합물이 첨가될 수 있는 이들 배지는, 또한 특정 세포 유형의 증식/부착 또는 제거/탈착을 촉진할 수 있다. 공급되는 영양분 및/또는 증식 촉진제 이외에 첨가되는 혈청 또한, 처리된 플라스틱 표면을 세포가 더 잘 부착할 수 있는 매트릭스 층으로 코팅함으로써 세포 부착을 촉진할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 세포는 이후 바람직한 밀도로 쉽게 접종할 수 있도록 세포 계수할 수 있다.

세포가 접종되는 환경은 적어도 단리된 간 전구 세포의 생존 및/또는 증식을 뒷받침하는, 세포 배지, 본 발명의 방법에서 전형적으로 액체 배지를 포함할 수 있다. 액체 배양 배지는, 여기에 세포를 투입하기 전, 투입과 함께, 또는 투입 후, 시스템에 첨가될 수 있다.

전형적으로, 배지는 당해 기술 분야에 공지된 기본 배지 제형을 포함할 것이다. 다수의 기본 배지 제형들을 이용해 본 발명의 1차 세포를 배양할 수 있으며, 그 예로는 비-제한적으로 이글스 최소 필수 배지 (MEM), 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM), 알파 변형된 최소 필수 배지 (alpha-MEM), 필수 기초 배지 (Basal Medium Essential: BME), 이스코브의 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM), BGJb 배지, F-12 영양 혼합물 (Ham), Liebovitz L-15, DMEM/F-12, 필수 변형된 이글스 배지 (EMEM), RPMI-1640, 배지 199, Waymouth's MB 752/1 또는 윌리엄스 배지 E, 및 이들의 변형 및/또는 조합 등이 있다. 상기한 기본 배지의 조성물은 당해 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 세포 배양에 필요한 배지 및/또는 배지 첨가제들의 농도를 수정 또는 조절하는 것은 당해 기술 분야의 당업자의 능력에 속한다. 바람직한 기본 배지 제형은, 적절한 생장, 증식, 바람직한 마커 및/또는 생물학적 활성의 유지 또는 장기 보관을 위해, 성장인자 혼합물이 첨가된, 성체 간 세포의 시험관내 배양을 뒷받침하는 것으로 보고된, Williams Medium E, IMDM 또는 DMEM 등의 상업적으로 이용가능한 것들 중 하나일 수 있다. 다른 바람직한 배지는, 예를 들어 Miltenyi 사의 StemMacs™과 같이 간 전구 세포의 생장을 뒷받침하는 상업적으로 이용가능한 무혈청성 배지이다.

상기한 기본 배지 제형들은 자체 공지된 포유류 발달에 필수적인 특정 성분들을 포함한다. 예를 들어, 비-제한적으로, 이들 성분은 무기 염 (특히, Na, K, Mg, Ca, Cl, P를 함유한 염, 가능하게는 Cu, Fe, Se 및 Zn를 함유한 염), 생리 완충제 (예를 들어, HEPES, 바이카보네이트), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및/또는 핵산 베이스, 리보스, 데옥시리보스, 아미노산, 비타민, 항산화제 (예를 들어, 글루타티온) 및 탄소원 (예, 글루코스, 피루베이트, 예를 들어, 소듐 피루베이트, 아세테이트, 예를 들어, 소듐 아세테이트) 등을 포함할 수 있다. 다수의 배지들이 소듐 피루베이트가 첨가된 또는 비-첨가된 글루코스-저 함유 제형으로서 이용가능함은 자명할 것이다.

기본 배지는, 배양에 사용하기 위해, 하나 이상의 추가적인 성분이 보충될 수 있다. 예를 들어, 부가적인 보충제를 사용해, 생장 및 증폭을 최적화하도록 필수 미량 원소 및 물질을 세포에 공급할 수 있다. 이러한 보충제로는 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄염 및 이들의 조합 등이 있다. 이들 성분은, 비-제한적으로, HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution), 이글스 염 용액과 같은, 염 용액에 함유될 수 있다. 추가적인 항산화제 보충제, 예를 들어 β-머캅토에탄올도 첨가될 수 있다. 다수의 기본 배지들이 이미 아미노산을 함유하고 있지만, 일부 아미노산, 예를 들어 용액에 존재할 경우 안정성이 낮은 것으로 알려진 L-글루타민이, 나중에 첨가될 수 있다. 배지에는, 또한, 전형적으로, 페니실린과 스트렙토마이신 혼합물과 같은 항생제 및/또는 항-진균제 화합물, 및/또는 기타 화합물, 비-제한적인 예로, 암포테리신, 암피실린, 겐타마이신, 블레오마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 날리딕산, 네오마이신, 니스타틴, 파로모마이신, 폴리믹신, 푸로마이신, 리팜피신, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 틸로신 및 제옥신이 보충될 수 있다.

또한, 유익하게는, 호르몬이 세포 배양에 이용될 수 있으며, 이러한 것으로는 비-제한적으로 D-알도스테론, 다이에틸스틸베스트롤 (DES), 덱사메타손, 에스트라디올, 하이드로코르티손, 인슐린, 프로락틴, 프로게스테론, 소마스타틴/인간 성장 호르몬 (HGH), 티로트로핀, 티록신, L-티로닌, 상피 성장인자 (EGF) 및 간세포 성장인자 (HGF)를 포함한다. 간 세포는 또한 트리요오도티로닌, α-토코페롤 아세테이트 및 글루카곤을 첨가하여 배양하는 것이 유익할 수 있다.

지질 및 지질 담체 역시 세포 배양 배지를 보충하기 위해 이용할 수 있다. 이러한 지질 및 담체로는, 비-제한적으로, 특히 사이클로덱스트린, 콜레스테롤, 알부민이 접합된 리놀레산, 알부민이 접합된 리놀레산 및 올레산, 비-접합 리놀레산, 알부민 접합된 레놀레익-올레익-아라키돈산, 알부민 비접합 올레산, 알부민 접합된 올레산을 포함할 수 있다. 알부민 역시 마찬가지로 지방산 무첨가 제형에 이용할 수 있다.

세포 배양 배지에 포유류 혈장 또는 혈장을 첨가하는 것 역시 고려된다. 혈장 또는 혈청은 종종 생존 및 증폭에 필수적인 성분 및 세포성 인자를 함유한다. 적정 혈청 대체제의 사용도 고려된다. 본원에 기술된 배지에 사용하기 적절한 혈청 또는 혈장은 인간 혈청 또는 혈장, 또는 비-인간 동물의 혈청 또는 혈장, 바람직하게는 예를 들어, 인간을 제외한 영장류 (예를 들어, 여우원숭이, 원숭이, 유인원), 태아 또는 성체 보바인, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 토끼, 마우스 또는 랫 혈청 또는 혈장 등의, 비-인간 동물의 혈청 또는 혈장을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포 배지에 상기한 혈장 및/또는 혈청들의 임의 조합이 사용될 수 있다.

본 발명의 추가적인 구현예에서, 단리된 간 전구 세포는 하나 이상의 사이토카인으로 프리컨디셔닝화된다. 바람직하게는, 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 배양물의 세포 배지에 사이토카인을 첨가한다. 사용되는 세포는 신선하거나, 냉동된 것일 수 있거나, 또는 예비 배양된 것이다.

단계 (e)에서, 프리컨디셔닝화를 위한 배지 조성물은, 간 전구 세포의 단리시 사용되는 배지의 조성물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 대안적으로, 배지는 다른 것일 수 있다.

본 발명의 구현예에 따른 단리된 간 전구 세포의 프리컨디셔닝화는 따라서 세포를 시험관내에서 하나 이상의 신호전달 분자에 노출시키는 것을 수반하며, 이 경우, 세포 배지에 해당 사이토카인의 첨가를 통해 사이토카인에 노출시키는 것을 수반한다. 프리컨디셔닝화에 사용하기 적합한 사이토카인은 전-염증성 사이토카인뿐 아니라 항-염증성 사이토카인일 수도 있으며, 이는 비-제한적으로 인터루킨-1 α (IL-1α), 인터루킨-1 β (IL-1β), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-6 (IL-6), 인터루킨-10 (IL-10), 인터페론, 예를 들어 인터페론-α (INFα) 및 인터페론-γ (IFNγ), 종양 괴사 인자-α (TNFα) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자를 포함한다.

HLA-E와 같은 특정 마커의 발현은 유세포 측정, 면역-세포화학 또는 친화성 흡착, 웨스턴 블롯 분석, ELISA 등과 같은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 면역학적 기법을 이용해, 또는 마커 mRNA의 양을 측정하는 임의의 적절한 기법, 예를 들어 노던 블롯, 반-정량적인 또는 정량적인 RT-PCR 등에 의해 검출할 수 있다.

전술한 바와 같이, 단리된 전구 세포에 사이토카인의 시험관내 처리는 HLA-E의 발현 유도로 이어진다. 이에, 본 발명의 추가적인 구현예에서, 프리컨디셔닝화된 세포는, 프리컨디셔닝화되지 않은 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서의 HLA-E 기저 발현과 비교해, HLA-E 발현 수준이 증가된다. 그래서, 본 발명은 동일하게 세포 배지에 하나 이상의 사이토카인을 첨가함으로써, HLA-E 발현 수준이 기저 수준에 비해 증가된 간으로부터 단리된 프리컨디셔닝화된 전구 세포의 제조 방법을 제공한다. HLA-E 기저 발현은 배지에 외인성 사이토카인의 부재 시 비-발현뿐 아니라 최소한의 발현을 의미할 수 있다. 발현의 증가된 수준은, 예를 들어, 비-제한적으로, 대조군에서의 발현 측정치보다 적어도 1.5배 높은, 예를 들어, 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배 높은 또는 심지어 그 이상으로 높은 발현 수준을 의미한다.

선호적으로는, HLA-E 발현을 유도하기 위해 사이토카인, 즉 IFNγ, TNFα, IL-1β 및 선택적으로, IL-10 및 이들의 조합을 이용한다. 이에, 본 발명의 추가적인 구현예에서, 성체 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 프리컨디셔닝화는 바람직하게는 IFNγ, TNFα, IL-1β, IL-10 및 이들의 임의 조합으로부터 선택되는 사이토카인을 사용해 수행된다. 이들 사이토카인은 간 전구 세포에서 HLA-E 발현을 효과적으로 유도하는 것으로 밝혀져 있다. 일 구현예에서, 상기한 사이토카인은 적어도 IFNγ 및 TNFα이다. 바람직한 구현예에서, 혼합물은 IL-1β 및/또는 IL-10을 더 포함한다. 이들 특정 사이토카인 조합은 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서 HLA-E 발현 유도를 높이는 효과를 나타낸다.

일 구현예에서, 사이토카인은 세포의 세포 배지에 최종 총 농도 5 ng/ml 내지 400 ng/ml, 바람직하게는 10 ng/ml 내지 360 ng/ml, 더 바람직하게는 20 ng/ml 내지 240 ng/ml로 첨가된다. 본 발명의 다른 또는 추가적인 구현예에서, 세포 배지에서 각 사이토카인의 농도는 5 내지 100 ng/ml, 더 바람직하게는 10 내지 80 ng/ml, 가장 바람직하게는 20 내지 60 ng/ml이다.

보다 구체적으로는, 간 전구 세포를 사이토카인을 사용해 프리컨디셔닝화하는 효과는, 세포를 1시간 내지 72시간, 바람직하게는 12시간에서 60시간, 더 바람직하게는 24시간에서 60시간, 가장 바람직하게는 24시간에서 48시간 동안 프리컨디셔닝화하는 경우에, HLA-E 발현에 가장 효과적이다.

언급된 농도 및 처리 기간 범위는 이들 세포에서 허용가능한 HLA-E 발현을 유도하기에 충분한 것으로 보인다.

상기 단계 (f)에서, 세포 집단의 선택적인 단리는, 본 발명의 추가적인 구현예에서, 프리컨디셔닝화되지 않은 간 전구 세포 또는 줄기 세포와 비교해 HLA-E 수준이 증가된 세포에 적용된다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 HLA-E에 양성인 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주 또는 이를 포함하는 세포 집단, 또는 선택적으로 유전자 변형된, 분화된 자손, 특히 간세포 또는 간세포-유사 세포 등의 이들의 자손을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은, 비-제한적으로, 하기를 비롯한 간 질환 치료에 사용하기 위한 전술한 조성물을 제공한다:

- 간 대사 장애, 간 퇴행성 질환 또는 전격성 간부전을 치료하기 위한 (동종이계) 간 세포 이식,

- 생체-인공 간 기구의 제조,

- 동물에서 본 발명에 따른 단리된 전구 세포 또는 줄기 세포 또는 이의 집단의 이식을 이용한 인간 간 질환에 대한 동물 모델의 제조,

- 시험관내 및 동물 독성, 약물학 모델 제조,

- 본 발명에 따른 단리된 전구 세포 또는 줄기 세포 또는 이의 집단에서, 인간 간염 바이러스에 대한 항-바이러스제를 비롯한 새로운 약물의 검사.

따라서, 본 발명의 세포는, 비-제한적으로, 간부전, 간염 및 선천적인 대사 장애 등의 간 관련 질환을 치료하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 이의 면역조절 특성으로 인해 염증 또는 면역 반응과 관련된 간 질환을 치료하는데 매우 적합하다. 잠재적인 면역-관련 위험을 내포한 간 세포 이식을 수반하는 치료에는, 또한 본 발명의 간 전구 세포를 포함하는 조성물의 우수한 면역조절 특성이 유용하다.

또한, 본 발명은 하기 목적으로 사용하기 위한 단리된 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 집단, 또는 이를 포함하는 조성물을 개시한다:

- 원치않은 면역 반응을 수반한 장애, 예를 들어, 비-제한적으로, 염증, 자가-면역 질환 및 이식편 거부 반응의 치료,

- 면역요법,

- 섬유증 질환, 간 섬유증 및/또는 섬유-염증성 만성 간부전 등의 만성 섬유-염증성 질환의 존재와 연관있을 수 있는, 임의의 생화학적, 혈청학적 마커 또는 임의의 기타 임상 또는 초음파 특징을 가진, 비-제한적으로, 간 섬유증 장애, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 전립선 섬유증, 유방 섬유증, 심근 섬유증 및 섬유증 특이 마커 증가를 수반한 기타 장애를 비롯한, 섬유증 장애 치료,

- 간의 선천적인 대사 장애를 치료하기 위한 간 전구 세포 또는 줄기 세포 이식:

이러한 질환에 대한 비-제한적인 예로는 페닐케톤뇨증 및 기타 아미노산병증, 혈우병 및 기타 응고 인자 결핍, 가족성 고콜레스테롤혈증 및 기타 지질 대사 장애, 우레아 사이클 장애, 글리코겐증, 갈락토스혈증, 프럭토스혈증, 티로신혈증, 단백질 및 탄수화물 대사 장애, 유기산뇨증, 미토콘드리아 질환, 과산화소체 및 리소좀 장애, 단백질 합성 이상, 간 세포 수송체 결함, 당화 결함 등을 포함한다,

- 후천적인 진행성 간 퇴행 질환의 치료,

- 전격성 간부전 및 급성 또는 만성 간부전의 치료,

- 생체-인공 간 기구 및 간 보조 기구에,

- 인간 간 질환에 대한 동물 모델

본 발명의 HLA-E 양성의 간 전구 세포 또는 이의 세포 집단 또는 이를 포함하는 조성물은 (간 또는 기타 장기 및 조직을 이식하기 전 또는 이식한 후 이에 대한 면역 반응을 조절하기 목적 등의) 간내 또는 간외 위치에서 간 세포 이식 (LCT)을 통해 세포 요법 및 조직 조작에 이용할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 단리된 인간 간 전구 세포 또는 이를 포함하는 조성물을 동물에 이식함으로써, 인간 간 질환에 대한 동물 모델을 수득할 수 있으며, 여기서 인간 간세포에 대한 화합물의 효과를 보다 효과적으로 평가할 수 있으며, 동물 모델에서의 효과들과 구분할 수 있다.

- 인간 간친화성 바이러스 감염 (HBV, HAV, HCV, HEV, HDV...)에 대한 동물 모델 제조,

- 본 발명에 따른 간 전구 세포 또는 줄기 세포 이식을 이용한 자연사, 전파, 내성, 치료 효과, 항바이러스제 사용 또는 임의의 연구 조사,

- 본 발명에 따른 간 전구 세포 또는 줄기 세포를 이용한 독성, 약학 및 약물유전학에 대한 시험관내 세포 모델 및 생체내 동물 모델의 제조,

- 본 발명에 따른 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서 신생 약물 검사,

- 이후 시험관내에서 증폭시킬 수 있는, 본 발명에 따른 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서의 바이러스 서열 삽입에 의해 유전자 요법,

- 인간 간 세포 대사를 연구하기 위한 동물 모델,

- 동종이계 세포에 대한 허용성,

- 간 또는 간 세포 동종이식 거부를 방지, 예방 또는 치료하기 위한 본 발명에 따른 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 사용.

전술한 바와 같이, 본 발명의 간 전구 세포의 면역억제 특성으로 인해, 본 발명의 조성물은 조직을 염증, 섬유증 및 후속적인 파괴로부터 보호하기 위해 대상 조직에 투여할 수 있다. 이는, 특히, 원치않은 면역 반응이 종종 유해한 결과를 유발하는 세포 대체 요법에 유용하다. 따라서, 본 발명의 조성물은 세포 대체 요법에 이용할 수 있다. 전구 세포는, 기능을 상실한 세포를 대체하거나 또는 세포에 기능성을 보충하고 섬유증 및 조직 파괴로 이어지는 염증을 회피하기 위해, 개체에서 대상 조직, 바람직하게는 간 조직에 투여할 수 있다. 이에, 전구 세포, 이의 세포주, 이의 세포 집단 및 이를 포함하는 조성물은, 섬유증 질환, 특히 간에서 섬유-염증 반응으로 만성 간부전이 발생하는 섬유-염증성 만성 간 질환의 존재와 연관있을 수 있는, 임의의 생화학적, 혈청학적 마터 또는 임의의 기타 임상적 또는 초음파 특징을 가진, 비-제한적으로, 간 섬유증 장애, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 전립선 섬유증, 유방 섬유증, 심근 섬유증 및 특이적인 섬유증 마커의 증가를 수반하는 기타 장애를 비롯하여, 섬유증 장애를 치료하는데 특히 매우 적합하다. 간-유래 전구 세포의 면역억제 특성은 간 기능의 점진적인 상실을 유발하는 진행 중인 섬유-염증 반응을 줄이거나 또는 방지하는데 기여한다. 한편, 간 세포 유형을 재생 및 분화하는 간 전구 세포의 능력이 간 재생에 기여하여, 따라서 만성 간부전을 예방하는데에도 도움이 된다.

간 무게 및/또는 기능의 감소로 이어지는 간 섬유증으로 대표되며 본 발명의 HLA-E 수준이 증가된 간 전구 세포 또는 줄기 세포가 유용할 수 있는 질환 상태 또는 결함으로는, 비-제한적으로, 알라질 증후군 (Alagille syndrome), 알코올성 간 질환 (알코올-유발성 간경변), α1-항트립신 결핍증 (모든 표현형), 고지혈증 및 기타 지질 대사 장애, 자가면역 간염, 버드-키아리 증후군, 담도 폐쇄증, I, II 및 III형 진행성 가족성 담즙정체, 간암, 캐롤리병, 크리글러-나자르 증후군, 프럭토스혈증, 갈락토스혈증, 탄수화물 결핍성 당화 결함, 기타 탄수화물 대사 장애, 레프숨병 및 기타 과산화소체 질환, 니만 피크 질환, 울만 질환 및 기타 리소좀 장애, 티로신혈증, 트리플 H, 및 기타 아미노산 대사 장애, 두빈-존슨 증후군, 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD) 및 비-알코올성 지방간염 (NASH) 등의 지방 간 질환, 만성 간부전, 급성-만성 간부전 (ACLF), 길버트 증후군, 글리코겐 축적 질환 I 및 III, 혈색소증, 간염 A-G, 포르피린증, 원발성 담즙성 간경변, 경화성 담관염, 티로신혈증, 응고 인자 결핍증, B형 혈우병, 페닐케톤뇨, 윌슨병, 전격성 간부전, 간절제술 후 간부전, 미토콘드리아 호흡 연쇄 질환 등이 있다. 또한, 세포는 바이러스 감염으로 인한 후천성 간 장애를 치료하는데에도 이용할 수 있다.

이에, 본 발명의 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주, 세포 집단 및/또는 조성물의 용도는, 간 질환을 치료하기 위한 약제를 제조하거나 및/또는 요법에 이용하기 위해 제공된다. 이러한 질환은 간 조직에 영향을 미치는 장애, 간세포 생존 및/또는 기능에 영향을 미치는 질환뿐 아니라 섬유-염증 반응으로 인한 만성 간부전을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주, 세포 집단 및/또는 조성물은, 면역조절 및 면역억제 특성으로 인해, 부적절한 면역 반응을 회피하여야 하는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 용도 및/또는 요법에서의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 세포의 투여는 개체에서 조직 재구성 또는 재생을 유발할 수 있다. 세포는, 의도한 조직 부위로 이식 또는 이동시켜 기능성 결함인 부위를 재구성 또는 재생하거나 또는 그 영역을 염증 반응으로 인해 유발될 가능성이 있는 추가적인 손상으로부터 보호하는 방식으로, 투여된다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 기술한다. 이러한 투여는 전형적으로 치료학적 유효량으로, 즉 일반적으로 원하는 국소 또는 전신 효과 및 성능을 제공하는 양으로 이루어진다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 성체 간 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주 또는 이를 포함하는 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 비-제한적으로, 본 발명의 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주 또는 이를 포함하는 세포 집단 또는 이의 자손은 유익하게는 (카테터 투여를 포함한) 주입 또는 이식을 통해, 예를 들어 국소 주입, 전신 주입, 비장내 주입 (Gupta et al., Seminars in Liver Disease 12: 321, 1992 참조), 문맥 정맥에 주입, 간 펄프, 예를 들어 간 피막 하 간 펄프에 주입, 비경구 투여 또는 배아 또는 태아로의 자궁내 주입을 통해 투여할 수 있다.

선택적으로 유전자 변형된, 본 발명의 간으로부터 기원하는 전구 세포 또는 줄기 세포, 이의 세포주 또는 이를 포함하는 세포 집단, 또는 이의 자손, 또는 이들을 포함하는 약학적 조성물은, 간 세포 이식 (LCT)을 통한 세포 요법 및 조직 공학에 추가적으로 이용할 수 있다. 간 세포 이식 및 간 줄기 세포 이식 (LSCT)은 본 발명의 세포를 포함한 성숙한 간세포 또는 간 전구 세포를, 바람직하게는 문맥 정맥을 통해, 간 접근 및 세포 생착을 달성하는 임의의 방식뿐 아니라 또한 직접 간 주입 또는 비장내 주입에 의해 주입하는 기법을 의미한다.

예를 들어, 세포는 단리 공정 후 또는 냉동보존 후 해동하여 임의의 보존 배지, 바람직하게는 인간 알부민을 함유한 배지 중의 세포 현탁물로서 제공될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 환자 자신의 조직을 이용해 본 발명의 전구 세포 또는 줄기 세포를 분리하는 것을 포함한다. 이러한 세포는 환자 자가의 것이며, 환자에게 쉽게 투여할 수 있다. 그러나, 만일 환자가 예를 들어 특정 병리학적 병태의 근원이 되는 유전자 결함을 가지고 있다면, 이러한 결함은 수득한 세포를 유전자 조작하거나 또는 동종이계 줄기 세포 이식으로서 당해 기술 분야에서 또한 공지된 환자 자신의 것이 아닌 조직으로부터 단리된 전구 세포 또는 줄기 세포를 이용함으로써 방지할 수 있다.

이러한 세포의 환자 투여를 고려할 경우, 전구 세포 또는 줄기 세포를 수득하기 위해 본 발명의 방법이 적용되는 간 조직은, 환자와 투여되는 세포 간의 조직 적합성이 적어도 달성가능한 범위내에서 최대화되도록, 선정하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 노력에도 불구하고, 투여된 세포가 환자의 면역 시스템에 의해 거부될 위험 (예, 이식 편대 숙주 거부)은 여전히 높다. 본 발명에 따른 간-유래 전구 세포를 포함하는 조성물은 동종이계 LCT 또는 LSCT의 거부 위험을 추가로 감소시키며, 따라서, 추가적인 구현예에서, 본 발명은 동종이계 이식에 사용하기 위한 조성물을 제공해준다.

본 발명의 전구 세포 또는 줄기 세포의 치료학적 용도와 관련한 문제는 최적 효과 달성을 위해 필요한 세포의 양이다. 투여 용량은 가변적일 수 있으며, 첫 투여 후 후속 투여를 포함할 수 있으며, 본 발명의 내용을 숙지한 당해 기술 분야의 당업자라면 알 수 있을 것이다. 전형적으로, 투여되는 용량 또는 용량들이 세포의 치료학적 유효량을 제공할 것이며, 즉 이는 원하는 국소 또는 전신 효과 및 성능을 달성한다. 아울러, 당해 기술 분야의 당업자라면 개체에 투여할 본 발명의 약학적 조성물 내 선택 첨가제, 비히클 및/또는 담체를 쉽게 결정할 수 있다. 전형적으로, (활성 전구 세포 또는 줄기 세포(들) 및/또는 사이토카인(들)과 더불어) 임의의 첨가제가 포스페이트 완충 식염수에 0.001 내지 50% (w/w 또는 w/v) 용액의 함량으로 존재할 수 있으며, 활성 성분은 전형적으로 수 ㎍ 내지 수 mg의 수준으로, 예를 들어 약 0.0001 내지 약 5% (w/w 또는 w/v), 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 0.05% 또는 약 0.001 내지 약 20%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10%, 가장 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5%로 존재할 수 있다.

HLA-E 양성의 간 전구 세포 또는 이의 집단을 포함하는 치료학적 조성물을 투여하는 경우, 이는 일반적으로 단위 투여량으로 제형화될 수 있다. 임의 경우에, 예를 들어, 세포를 바이오폴리머 또는 합성 폴리머와 병합함으로써, 본 발명의 세포 또는 이러한 세포의 집단의 생존을 보장하는 물질을 함유하거나 및/또는 환자에 세포를 투여하는 공지된 방법을 채택하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 바이오폴리머의 예로는, 비-제한적으로, 파이브로넥틴, 피브린. 피브리노겐, 트롬빈, 콜라겐 및 프로테오글리칸 라미닌, 부착 분자, 프로테오글리칸, 히알루로난, 글리코스아미드글리칸 쇄, 키토산, 알기네이트, 이러한 단백질로부터 유래되는 천연 또는 합성 변형된 펩타이드, 및 합성, 생분해성 및 생체적합한 폴리머 등이 있다. 이들 조성물은 사이토카인, 성장인자를 첨가 또는 비-첨가하여 준비할 수 있으며, 세포가 함침된 3차원 겔로서 또는 현탁물로서 투여할 수 있다.

본 발명을 실시하는데 이용되는 세포는 필요한 양의 적절한 용매에, 적절한 경우, 다른 성분들을 다양한 함량으로 첨가함으로써, 멸균 주사 용액으로 제조할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 멸균수, 생리 식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 같은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와의 혼합물 형태일 수 있다. 이 조성물은 습윤제, 유화제, pH 완충제, 겔화제 또는 점성 강화 첨가제, 보존제, 착향제, 착색제 등과 같은 보조 물질을, 투여 경로 및 원하는 조제물에 따라 함유할 수 있다.

본 발명은 본 발명을 추가적으로 예시하는 후술한 비-제한적인 실시예를 들어 추가적으로 설명되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지도 그렇게 해석되어서도 안된다.

실시예들

1. 프리컨디셔닝화된 HLA -E 양성 간 전구 세포 또는 줄기 세포의 제조

(a) 간 전구 세포의 제조

인간 성체 간 전구 세포는 EP 3 140 393 또는 WO 2017 149 059에 기술된 바와 같이 건강한 사체 또는 심박동 정지된 공여체의 간으로부터 분리하였다.

간략하게는, 간 세포 조제물을 10% FBS, 10 mg/ml INS, 1 mM DEX가 첨가된 윌리암의 E 배지에 재현탁하였다. Corning^® CellBIND^® 플라스크에서 1차 세포를 배양하였으며, 5% CO₂ 가습 분위기 하에 37℃에서 배양하였다. 24시간 후, 배지를 교체하여 비-부착 세포는 제거한 다음 이후 1주일에 2회로 교체하였으며, 배양물을 매일 현미경으로 검경하였다. 배양 배지는 12-16시간 후 9% FBS가 첨가된 글루코스-고 함유 DMEM 배지로 교체하였다. 중간엽-유사 형태의 세포 유형이 생겨났으며 이를 증식시켰다. 70-95% 컨플루언스에 도달하면, 세포에 재조합 트립신 및 1 mM EDTA를 첨가하여 트립신 처리한 다음 1-10 x 10³세포/cm² 밀도로 재접종하였다. 각각의 계대 배양시, 세포는 80-90% 컨플루언스에서 트립신 처리하였다.

(b) 간 전구 세포의 프리컨디셔닝화

염증 감작화는 80-90% 컨플루언스에 도달한 상태의 세포에서 P5에서 IL-1β (5-100 ng/mL, peprotech, ref: 200-1B), IFNγ (5-100 ng/mL, prospec, ref: CYT-206), TNFα (5-100 ng/mL, prospec, ref: CYT-223), IL-10 (5-100 ng/mL, peprotech, ref: 200-10-10UG) 및/또는 이들의 조합을 48시간 동안 처리함으로써 수행하였으며, "모두 처리"는 IL-1β, IFNγ, TNFα 및 IL-10 조합이 처리된 세포를 의미한다. 그 후, 상층액을 회수하고, 세포를 분석하기 위해 재조합 트립신 (trypLE; LifeTech) 및 1 mM EDTA로 트립신 처리하였다.

2. HLA -E 발현: 유세포 측정에 의한 세포 특정화

무처리 세포 및 처리 세포 상에서 HLA-E 발현을 유세포 측정에 의해 조사하였다.

세포 총 5 x 10⁵개를 PBS 완충제에서 30분간 4℃에서 또는 실온에서 15분간 항-인간 HLA-E-PE 항체와 인큐베이션하였다. 대응되는 대조군 이소형 항체를 이용해 단일클론 항체의 비-특이적인 결합을 조사하였다. 이소형으로부터 수득된 히스토그램 쉬프트에서, HLA-E 발현이 이소형과 비교해 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 무처리 조건과 비교해 프리컨디셔닝화된 세포에서 HLA-E 발현 수준이 증가한다는 것을 보여준다.

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 구현예에 따른 세포의 세포 배지에 하나 이상의 사이토카인을 첨가하여 간 전구 세포를 프리컨디셔닝한 결과, 프리컨디셔닝화 무처리 세포 (대조군 조건)에서의 HLA-E 기저 발현 수준과 비교해 세포에서 HLA-E 발현 수준이 증가하였다.

도 3에 나타낸 결과는 특이적인 mAb로 염색한 세포의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타낸 것으로, 대조군 조건 (무처리)과 비교해 MFI 증가를 보이는 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포 집단의 HLA-E 양성 특징을 검증해준다. 결과는 평균　±　SEM으로 나타내었다. 모든 데이터는 Prism 5 소프트웨어로 분석하였다.

3. 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT- PCR )에 의한 유전자 발현 검증

프리컨디셔닝화된 성체 간 전구 세포와 대조군 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비하였다.

유전자 발현을 RT-PCR에 의해 특정화하였다. 시판 키트를 제조사의 지침에 따라 사용해 cDNA를 합성하였다. 샘플은 실시간 PCR 장치에서 2세트로 수행하였다. 내인성 대조군 전사체의 신호 세기에 대해 표준화하여 유전자의 상대적인 발현을 정량하였다. 표준화 후, 데이터를 도표로 작성하여, 여러가지 사이토카인 조합들로 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포 집단들을 비교하였다.

보다 상세하게는, GenElute™ Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma - RTN070)를 사용한 총 RNA 추출을 위해 세포를 회수하였다. RNA 추출시, DNAse 처리는 On-Column DNase I Digestion Set (Sigma ref: DNASE70)를 사용해 수행하였다. 그런 후, RNA를 NanoDrop (Thermo Scientific)을 이용해 정량하였다. cDNA 합성 키트 (Roche - 04897030001)를 제조사의 지침에 따라 사용해 제1 cDNA 가닥을 합성하였다. 주형 cDNA, Taqman 마스터 믹스 완충제 (10㎕; Applied Biosystems) 및 정방향 및 역방향 프라이머를 함유한 PCR 증폭 혼합물 (최종 부피 20 ㎕)에서, PCR을 2세트로 ViiA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)에서 수행하였다. 순환 조건은 95℃에서 10분간 중합효소 활성화 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분으로 이루어진 사이클 40회로 구성하였다. 정량화는 하우스키핑 유전자 GAPDH에 대해 표준화하여 수행하였다.

본 실험에 사용된 시판 프라이머 및 프로브를 아래에 열거한다 (모두 Thermo Fisher 사 제품): GAPDH - Hs99999905_m1, HLA-G - Hs00365950_g1, HLA-E - Hs03045171_m1, IDO1 - Hs00984148_m1, HGF - Hs00300159_m1, PTGS2 - Hs00153133_m1, IL-6 - Hs00174131_m1, IL-10 - Hs00961622_m1.

도 4는 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포가 HLA-E 양성임을 보여준다. 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포는 프리컨디셔닝화 무처리 간 전구 세포에서의 HLA-E 기저 발현 수준과 비교해 HLA-E 발현 수준 증가를 나타내었다. 또한, 도 4는 프리컨디셔닝화된 HLA-E 양성 세포가 HLA-G에 대해서도 양성일 수 있다는 것을 보여준다. 이들 결과는 평균 ± SEM (n=3)으로 나타낸다. 모든 데이터는 Prism 5 소프트웨어로 분석하였다.

HLA-E 양성이거나 또는 HLA-E 발현 수준이 증가된 간 전구 세포는, 또한, 프리컨디셔닝화 무처리 간 전구 세포 또는 줄기 세포 (대조군)에서 검출된 기저 발현 수준과 비교해, 하나 이상의 사이토카인 및/또는 면역조절 특성을 가진 인자를 증가된 발현 수준으로 가질 수 있다. 도 5는, HLA-E 양성 세포를 증가된 양으로 포함하는 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포 집단에서, 인돌아민 2,3-다이옥시게나제 1 (IDO1), 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 신타제 2 (PTGS2), IL-6 및 IL-10 유전자의 발현 수준이 증가됨을 보여준다. 검사는 3종의 공여자로부터 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포를 대상으로 수행하였다 (n=3). 결과는 평균 ± SEM으로 나타낸다.

4. HLA -G 분비: HLA -E 양성의 간 전구 세포 또는 줄기 세포를 포함하는 집단에서 CLIA ( chemiluminescent sandwich principle)에 의한 용해성 HLA -G 정량

프리컨디셔닝화된 간 전구 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비하였다.

용해성 단백질의 발현은 프로컨디셔닝화된 간 전구 세포로부터 회수한 상층액에서 측정하였다. 용해성 HLA-G 단백질 정량화는 시판 효소-연계된 면역분석 (ELISA)을 이용해 하기 기술된 바와 같이 수행하였다.

용해성 HLA-G ELISA를 CLIA 키트를 사용해 수행하였다: 인간 HLA-G ELISA 키트 (CLIA) - LS-F30041. 세포 배양물 상층액 100 ㎕ 또는 표준물질을 포획 항체와 함께 37℃에서 90분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 바이오틴화된 검출 항체 100 ㎕를 각 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 두었다. 세척 단계 후, HRP-접합물 100 ㎕/w을 첨가하여 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 5회 세척 후, 플레이트를 화학발광 기질과 5분간 37℃에서 광 차단 하에 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, 플레이트를 즉시 분석하여 각 웰의 상대적인 빛 단위 (Relative Light Unit, RLU)를 마이크로플레이트 루미노미터를 사용해 측정하였다. 분석의 검출 범위는 sHLA-G 0,16-10 ng/ml이었다. 각 샘플은 2세트로 검사하였다.

도 6에 제시된 결과는 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포가 상층액에 HLA-G를 증가된 수준으로 함유하고 있음을 보여준다.

5. HLA -E 양성의 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서 면역조절 사이토카인 및/또는 면역 조절 인자의 발현

프리컨디셔닝화된 HLA-E 양성의 간 전구 세포를 실시예 1에 기술된 바와 같이 준비하였다.

용해성 단백질의 발현을 시판 효소 연계된 면역분석 (ELISA) 키트를 사용해 측정하였다. HLA-E 기저 발현 수준과 비교해 HLA-E 발현 수준이 증가된 HLA-E 양성의 간 전구 세포 또는 간 전구 세포는, 프리컨디셔닝화 무처리된 간-유래 전구 세포 또는 줄기 세포 (무처리)에서 검출되는 PGE2의 기저 수준과 비교해, 프로스타글란딘 E2 (PGE2)을 증가된 수준으로 분비하였다.

도 7은 본 발명의 구현예들에 따른 IFNγ, TNFα, IL-1β 및/또는 IL-10으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인으로 프리컨디셔닝화 후 HLA-E 수준이 증가된 간 전구 세포에서, 면역조절 인자 PGE2의 분비가 증가함을 검증해준다. 검사는 3종의 공여자로부터 분리한 간 전구 세포를 대상으로 수행하였다 (n=3). 결과는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 모든 데이터는 Prism 5 소프트웨어로 분석하였다.

6. IDO1 활성은 본 발명의 구현예에 따른 HLA -E 성체 간 전구 세포에서 강화된다

IDO1의 효소 활성을 화합물 N-포르밀키누레닌 (NFK)과 선택적으로 반응하여 고 형광성 산물 (Ex/Em = 402/488 nm)을 생성하는 형광 현상제를 사용해 측정하였다. NFK 형성은 IDO 효소 활성 정도와 직접적으로 연관되어 있다.

도 8에 나타낸 바와 같이, IDO1의 효소 활성은 프리컨디셔닝화 무처리된 간 전구 세포 (무처리)의 기저 활성과 비교해 프리컨디셔닝화된 간 전구 세포에서 강화되었다. 검사는 3종의 공여자로부터 분리한 간 전구 세포를 대상으로 수행하였다 (n=3). 결과는 평균 ± SEM으로 나타낸다. 모든 데이터는 Prism 5 소프트웨어로 분석하였다.

본 발명은 이전에 구현된 임의 형태로 제한되지 않으며, 첨부된 청구항을 재검토하지 않고도 본원에 기술된 제조예에 일부 수정이 행해질 수 있는 것으로, 간주된다.

7. 인간 간 전구 세포에서 HLA -E 발현의 정량화

세포를 해동하여, 세포 결합 표면 상에 30.000 세포/cm²로 9% FBS가 첨가된 DMEM 중에 접종하였다. 다음날, 세포를 DMEM + 9% FBS (= 비자극 조건) 또는 DMEM + 9% FBS + IFNγ 10 ng/ml, TNFα 50 ng/ml, IL-1β 20 ng/ml을 포함하는 전-염증성 칵테일 (= 자극 조건)과 함께 인큐베이션하였다. 24시간 인큐베이션한 후, 세포를 탈착시키고, 유세포 측정을 통해 HLA-E 발현을 측정하였다.

HLA-E 발현을 항-HLA-E 항체 (#130-117-401, Clone REA1031, Miltenyi 사)를 이용한 유세포 측정 (MacsQuant)에 의해 확인하였다. 상대적인 평균 형광 강도 (rMFI, MFI 항체 / MFI 이소형) 및 HLA-E를 발현하는 세포의 %를 이소형 대조군 항체를 이용해 결정하였다.

결과:

세포별 HLA-E 발현은 비자극 세포 대비 자극된 세포에서 증가하는 것으로 관찰되었다. 또한, 집단에서 HLA-E 양성 세포의 %가 현저하게 증가하였으며, 이에 요법에 사용하기 유용한 HLA-E 발현 세포를 높은 비율로 함유한 세포 집단이 수득되었다.

도 9a는 전-염증성 칵테일로 자극한 간 전구 세포에서 HLA-E 발현이 더 높음을 보여주는 대표적인 히스토그램을 보여준다. 도 b는 전-염증성 조건 적용시 또는 비-적용시 HLA-E 양성 세포의 평균 %를 보여준다. 24시간 컨디셔닝화한 후, 컨디셔닝화 처리된 집단에서는 컨디셔닝화 무처리 세포와 비교해 HLA-E 양성 세포가 증가하였다 (14.7% 대 86.4%). 자극 조건에서 HLA-E 양성 세포의 비율은 최소 69,6% 및 최대 98,2%인 반면, 비-자극 조건에서의 HLA-E 양성 세포는 4,1% 내지 22,3% 범위였다. 도 9a에 나타낸 바와 같이 이소형 대조군과 비교해 형광 강도가 더 강한 세포는 HLA-E 양성으로 간주하였다.

도 9c는 24시간 자극 후 HLA-E 발현 증가를 보여준다: 자극 세포에서의 평균 rMFI는 8,3인 반면 비자극 세포에서는 3,0이었다. 자극 조건에서는 rMFI 6,8 내지 11,8이 관찰된 반면, 비자극 세포에서는 rMFI 2,2 내지 3,8이 관찰되었다 (rMFI: 상대적인 평균 형광 강도 또는 MFI 항체 / MFI 이소형 (세포를 HLA-E 항체로 염색하였을 때의 형광 신호를 이소형 대조군으로 염색하였을 때의 세포의 형광 신호로 나눔). (n=다른 2종의 간 공여자를 포함하여 5종).

8. HLA -E 발현은 NK 또는 CD8+ 세포에 의한 간 줄기 또는 전구 세포의 사멸을 감소시킨다

간 줄기 또는 전구 세포 상에서의 HLA-E 발현의 효과를 조사하기 위해 PBMC로부터 단리한 CD8+ T 세포를 이용한 세포성 분석을 개발하였다.

인간 CD8+ T 세포의 단리 및 배양:

피콜-하이큐 밀도 구배 원심분리에 의해 정상 성인 공여자의 연층으로부터 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 단리하였다. Dynabeads^®Untouched™ Humand CD8 T 세포 키트를 제조사의 지침 (Invitrogen™)에 따라 사용해 CD8+T 세포를 단리하였다. 단리된 세포의 순도 및 생존성은 항상 유세포 측정 분석 (APC-접합된 CD8 항체 및 DAPI)으로 확인하였으며, CD8+ 세포가 >80%이었다.

간 줄기 세포의 배양 및 프리컨디셔닝화:

세포독성 분석의 개시 2일 전 (= -2일)에, 간 줄기 세포를 해동하여, 세포 결합 표면에서 9% FBS가 첨가된 DMEM 중에 상에 30.000 세포/cm²로 접종하였다. 다음날, 세포를 DMEM + 9% FBS (= 비자극 조건) 또는 DMEM + 9% FBS + IFNγ 10 ng/ml, TNFα 50 ng/ml, IL-1β 20 ng/ml을 포함하는 전-염증성 칵테일 (= 자극 조건)과 함께 인큐베이션하였다. 24시간 동안 프리컨디셔닝화한 후, 세포에 트립신을 처리하여 계수한 다음, 세포독성 분석 또는 특정화 (유세포 측정에 의한 HLA-E 발현)를 수행하였다. HLA-E 발현은 유세포 측정에 의해 확인하였다. 상대적인 평균 형광 강도 (RMFI, MFI 항체 / MFI 이소형) 및 HLA-E를 발현하는 세포의 %를 이소형 대조군 항체를 이용해 결정하였다.

CD8+ T 세포 세포독성 분석:

2번의 연속적인 공배양을 수행하였다. 1차 접촉에서 수득한 CD8+ T 세포를 다시 동일한 간 줄기 세포 배치의 배양물에 다시 넣었다. 0일차 1차 접촉은, 24웰 플레이트에서 X-VIVO 배지 중에 20 000 세포/cm²로 접종된 비자극된 또는 자극된 세포의 혈소판을 사용해, 개시하였다. 4시간 인큐베이션 (37℃, 5% CO₂ 가습 분위기)한 후, 각각의 웰에 CD8+ T 세포 2,000,000개를 X-VIVO 최종 1 ml로 첨가하였다. 대조군 조건은 CD8+ T 세포 배양물 단독 또는 인간 T-활성인자 항-CD3/CD28 Dynabeads (제조사의 프로토콜에 따라)로 구성하였다. 공배양 4일차에, IL-2 100 UI/ml을 각 웰에 첨가하였다. 7일간 공배양한 후, CD8+ T 세포를 함유한 상층액을 회수함으로써 1차 접촉을 종료하였다. 배양물 상층액은 향후 ELISA 분석을 위해 -80℃에서 보관하고, CD8+ T 세포는 IL-2가 첨가된 X-VIVO에 재현탁하여 유세포 측정으로 계수하였다 (CD8+ 세포 절대 계수). 1차 접촉과 동일한 조건의 간 줄기 세포 (자극 또는 비자극)와 2차 접촉시키기 위해, CD8+ T 세포를 배양물에 다시 투입하였다. 2차 접촉은 5일간 (=11일까지) 진행하였으며, 그 후 공배양 상층액, CD8+ T 세포 및 간 줄기 세포를 회수하였다. CD8+ T 세포 및 간 줄기 세포의 생존성 및 세포 계수를 APC 접합된 CD8 항체 및 DAPI를 이용한 유세포 측정에 의해 평가하였다.

전-염증성 프리컨디셔닝화가 CD8+ T 세포의 세포독성에 대한 내성에 미치는 효과를 광학 현미경, 공배양 종료시 생존성 및 세포 계수 측정 및 공배양 상층액내 분비된 IFNγ (CD8+ T 세포 활성화의 서로게이트) 측정을 통해 분석하였다.

결과:

도 10a는 CD8+ T 세포와의 공배양 후 (2차 접촉 5일차) 간 줄기 세포의 대표적인 사진을 보여준다. 전-염증성 사이토카인으로 자극된 간 줄기 세포는 공배양 종료시에도 여전히 관찰된 반면 대부분의 비자극 세포는 사멸하였다.

도 10b는 CD8+ T 세포와 공배양한 이후의 (2차 접촉) 간 줄기 세포를 보여준다. 세포 계수는 유세포 측정으로 결정하였다 (Miltenyi 사의 MacsQuant를 이용한 절대 계수, CD8+ 양성 세포 제외). 세포를 자극한 경우 비자극 세포에 비해 세포 계수는 더 많았으며, 평균적으로 세포수 15199 대 3581 세포이었다 (n = 2종의 간 공여자 및 2종의 PBMC를 포함하여 4).

도 10c는 간 줄기 세포와의 공배양 (2차 자극) 종료 후 CD8+ T 세포 계수를 보여준다. T 세포는 일단 활성화되면 증식하므로, 실험 종료시 CD8+ T 세포의 수를 측정하였다. 평균적으로, 비자극 세포와의 공배양 종료한 경우 자극 세포와 비교해 CD8+ T 세포의 수가 더 많았다 (세포 188369 대 87930개). CD8+ T 세포의 수는 유세포 측정으로 결정하였다 (Miltenyi 사의 MacsQuant를 이용한 절대 계수, CD8+ 양성 세포만 포함). (n = 2종의 간 공여자 및 2종의 PBMC를 포함하여 4).

도 10d는 HLA-E를 높은 수준으로 발현하는 간 전구 세포 집단/CD8+ T 세포의 공배양 (2차 접촉) 종료시 IFNγ 농도를 보여준다. 공배양물내 IFNγ 농도는, CD8+ T 세포를 비자극 간 전구 세포와 인큐베이션한 경우가 자극한 간 전구 세포와 비교해 더 높았다. T 세포에 의한 IFNγ 분비는 활성화와 연관되어 있으므로, 이는 자극된 간 줄기 세포가 CD8+ T 세포를 활성화함을 의미한다. IFNγ는 CD8+ T 세포 - 간 줄기 세포 공배양 상층액에서 ELISA에 의해 측정하였다 (n = 12, 2종의 간 줄기 세포 공여자 및 4종의 PBMC 공여자 포함)

결론:

전-염증성 칵테일로 자극한 후, HLA-E를 높은 수준으로 발현하는 간 전구 세포 집단은 CD8+ T 세포-매개 세포용해가 방지되었다. 아울러, 자극된 간 줄기 세포와 인큐베이션한 경우, 비자극 세포와 비교해, (T 세포 증식 및 IFNγ 분비 저하에 의해 확인되는 바와 같이) CD8+ T 세포의 활성화가 저하되었다. 이러한 예방은 높은 HLA-E 발현 수준과 연관되어 있다.

Claims

60% 이상의 전구 세포 또는 줄기 세포가 세포 표면 마커 HLA-E를 발현하는 것을 특징으로 하는, 인간 성체 간-유래 전구 세포 또는 줄기 세포를 포함하는 조성물.
제1항에 있어서,
적어도 65%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%의 전구 세포 또는 줄기 세포가 세포 표면 마커 HLA-E를 발현하는, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
HLA-E 발현 세포는 항-인간 HLA-E 항체를 이용한 유세포 측정에 의한 측정시 HLA-E의 상대적인 평균 형광 강도 (rMFI)가 6.5 이상인, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
HLA-E 발현 세포는 유세포 측정에 의한 측정시 HLA-E의 상대적인 평균 형광 강도 (rMFI)가 7 이상, 바람직하게는 8 이상, 더 바람직하게는 9 이상, 더 바람직하게는 10 이상인, 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 성체 간-유래 전구 세포 또는 줄기 세포가 비멘틴 (Vimentin), CD13, CD90, CD73, CD44, CD29, α-평활근 액틴 (ASMA) 및/또는 CD140b로부터 선택되는 하나 이상의 중간엽 마커에 대해 양성인, 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 분비된 HLA-G를 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
HLA-E 양성인 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제8항에 있어서,
상기 세포가 인간 간 세포이고, 바람직하게는 성인 인간 간 세포인, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제8항 또는 제9항에 있어서,
HLA-E 발현 세포는 항-인간 HLA-E 항체를 이용한 유세포 측정에 의한 측정시 HLA-E의 상대적인 평균 형광 강도 (rMFI)가 6.5 이상인, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포가 하나 이상의 사이토카인으로 프리컨디셔닝화 (preconditioning)되는 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제11항에 있어서,
상기 세포는, 프리컨디셔닝화되지 않은 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서의 HLA-E 기저 발현과 비교해, HLA-E 발현 수준이 증가된 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 사이토카인이 IFNγ, TNFα, IL-1β, IL-10 및 이들의 임의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인이 상기 세포의 세포 배지에 총 농도 5 ng/ml 내지 400 ng/ml로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 배지에서 상기 사이토카인 각각의 농도가 5 ng/ml 내지 100 ng/ml인 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인이 적어도 IFNγ와 TNFα인 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제16항에 있어서,
상기 사이토카인이 IL-1β를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포가 1시간 내지 72시간, 바람직하게는 12시간 내지 60시간 동안 프리컨디셔닝화되는 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포가 추가적으로 HLA-G에 양성인 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 추가적으로 프리컨디셔닝화되지 않은 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서의 PGE2 기저 분비 수준과 비교해 PGE2 분비 수준이 증가된 것이거나; 및/또는 프리컨디셔닝화되지 않은 간 전구 세포 또는 줄기 세포에서의 IDO 효소의 기저 활성 수준과 비교해 IDO 효소 활성 수준이 증가된 것을 특징으로 하는, 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포.
제8항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 단리된 간 전구 세포 또는 줄기 세포를 포함하는 세포 집단.
제21항에 있어서,
적어도 65%, 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%의 전구 세포 또는 줄기 세포가 세포 표면 마커 HLA-E를 발현하는, 세포 집단.
제8항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 제21항 또는 제22항에 따른 세포 집단을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
면역요법에 사용하거나 및/또는 원치않은 면역 반응을 수반한 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것인, 조성물, 단리된 간 전구 세포 또는 세포 집단.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
섬유증 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것인, 조성물, 단리된 간 전구 세포 또는 세포 집단.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것인, 조성물, 단리된 간 전구 세포 또는 세포 집단.
제26항에 있어서,
상기 간 질환이 섬유-염증성 만성 간 질환인 것을 특징으로 하는, 조성물, 단리된 간 전구 세포 또는 세포 집단.
제26항 또는 제27항에 있어서,
상기 간 질환이 알라질 증후군, 알코올성 간 질환 (알코올-유발성 간경변), α1-항트립신 결핍증 (모든 표현형), 고지혈증 및 기타 지질 대사 장애, 자가면역 간염, 버드-키아리 증후군, 담도 폐쇄증, I, II 및 III형 진행성 가족성 담즙정체, 간암, 캐롤리병, 크리글러-나자르 증후군, 프럭토스혈증, 갈락토스혈증, 탄수화물 결핍성 당화 결함, 기타 탄수화물 대사 장애, 레프숨병 및 기타 과산화소체 질환, 니만 피크 질환, 울만 질환 및 기타 리소좀 장애, 티로신혈증, 트리플 H, 및 기타 아미노산 대사 장애, 두빈-존슨 증후군, 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD) 및 비-알코올성 지방간염 (NASH)을 포함한 지방 간 질환, 만성 간부전, 급성-만성 간부전 (ACLF), 길버트 증후군, I 및 III형 글리코겐 축적 질환, 혈색소증, A-G형 간염, 포르피린증, 원발성 담즙성 간경변, 경화성 담관염, 티로신혈증, 응고 인자 결핍증, B형 혈우병, 페닐케톤뇨, 윌슨병, 전격성 간부전, 간절제술 후 간부전, 미토콘드리아 호흡 연쇄 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물, 단리된 세포 또는 세포 집단.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 이식, 바람직하게는 동종이계 이식에 사용하기 위한 것인, 조성물, 단리된 간 전구 세포 또는 세포 집단.
하나 이상의 사이토카인을 간 전구 세포 또는 줄기 세포 배양물의 세포 배지에 첨가하는 것을 포함하는, HLA-E 양성의 간 전구 세포 또는 줄기 세포를 수득하는 방법.
제30항에 있어서,
상기 사이토카인이 IFNγ, TNFα, IL-1β, IL-10 및 이들의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서,
상기 사이토카인이 총 농도 5 ng/ml 내지 400 ng/ml로 첨가되고, 사이토카인 각각의 농도가 5 내지 200　ng/ml인 것을 특징으로 하는, 방법.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인이 적어도 IFNγ와 TNFα, 및 선택적으로 IL-1β인 것을 특징으로 하는, 방법.