RU2778304C2 - Улучшение органов для трансплантации - Google Patents
Улучшение органов для трансплантации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778304C2 RU2778304C2 RU2018130072A RU2018130072A RU2778304C2 RU 2778304 C2 RU2778304 C2 RU 2778304C2 RU 2018130072 A RU2018130072 A RU 2018130072A RU 2018130072 A RU2018130072 A RU 2018130072A RU 2778304 C2 RU2778304 C2 RU 2778304C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- organ
- stem cells
- cell
- stem
- Prior art date
Links
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 title claims abstract description 183
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 432
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 137
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 102000004591 Telomerase Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000000381 tumorigenic Effects 0.000 claims abstract description 5
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 claims description 80
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 19
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 16
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 15
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 15
- 210000001654 Germ Layers Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 claims description 9
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004969 Inflammatory Cells Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 claims description 6
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 claims description 5
- 210000002216 Heart Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001541 Thymus Gland Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 78
- 206010061255 Ischaemia Diseases 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 12
- 230000001850 reproductive Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 37
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 33
- 230000035492 administration Effects 0.000 description 27
- 101710026246 POU5F1 Proteins 0.000 description 25
- 102100019163 POU5F1 Human genes 0.000 description 25
- 210000004271 bone marrow stromal cells Anatomy 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 description 21
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 description 20
- 101700006931 SOX2 Proteins 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 14
- 101700068938 ZFP42 Proteins 0.000 description 13
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 13
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 13
- 101700033684 rex Proteins 0.000 description 13
- 239000002609 media Substances 0.000 description 12
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 12
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 11
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 11
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 9
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 9
- 210000002459 Blastocyst Anatomy 0.000 description 8
- 210000004700 Fetal Blood Anatomy 0.000 description 8
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 8
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 230000000302 ischemic Effects 0.000 description 8
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 8
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 8
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 8
- 210000000577 Adipose Tissue Anatomy 0.000 description 7
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 7
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- -1 rox-1 Proteins 0.000 description 7
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000002826 Placenta Anatomy 0.000 description 6
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 6
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 6
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 6
- 230000002631 hypothermal Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 230000000770 pro-inflamatory Effects 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 5
- 102100008658 FN1 Human genes 0.000 description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 5
- 102100018914 GYPA Human genes 0.000 description 5
- 101710042158 GYPA Proteins 0.000 description 5
- 101710042157 GYPE Proteins 0.000 description 5
- 210000004263 Induced Pluripotent Stem Cells Anatomy 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 210000003716 Mesoderm Anatomy 0.000 description 5
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 102100005499 PTPRC Human genes 0.000 description 5
- 101700059076 PTPRC Proteins 0.000 description 5
- 210000001147 Pulmonary Artery Anatomy 0.000 description 5
- 101700079116 QSOX1 Proteins 0.000 description 5
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 230000002497 edematous Effects 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 5
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000000392 somatic Effects 0.000 description 5
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 4
- 210000001900 Endoderm Anatomy 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 206010021113 Hypothermia Diseases 0.000 description 4
- 102100015262 MYC Human genes 0.000 description 4
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 4
- 102100002980 STC1 Human genes 0.000 description 4
- 101700033054 STC1 Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 4
- 230000003394 haemopoietic Effects 0.000 description 4
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 4
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 4
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 4
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 4
- 210000000988 Bone and Bones Anatomy 0.000 description 3
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 3
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 3
- 102100010813 EGF Human genes 0.000 description 3
- 101700033006 EGF Proteins 0.000 description 3
- 210000003038 Endothelium Anatomy 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 210000003958 Hematopoietic Stem Cells Anatomy 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 3
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 3
- 101700049309 NOS2 Proteins 0.000 description 3
- 102100002496 NOS2 Human genes 0.000 description 3
- 208000005333 Pulmonary Edema Diseases 0.000 description 3
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 3
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 3
- 101710041199 TNFAIP6 Proteins 0.000 description 3
- 102100005369 TNFAIP6 Human genes 0.000 description 3
- 208000001608 Teratocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000001464 adherent Effects 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 201000009030 carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 201000001084 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 3
- 230000001973 epigenetic Effects 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000001146 hypoxic Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000023404 leukocyte cell-cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 2
- 210000001109 Blastomeres Anatomy 0.000 description 2
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 description 2
- 210000000621 Bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 102100009641 CXCL10 Human genes 0.000 description 2
- 101710032181 CXCL10 Proteins 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 210000000845 Cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000016615 EC 2.7.7.49 Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 EC 2.7.7.49 Proteins 0.000 description 2
- 210000002304 ESC Anatomy 0.000 description 2
- 210000003981 Ectoderm Anatomy 0.000 description 2
- 210000003979 Eosinophils Anatomy 0.000 description 2
- 229940116977 Epidermal Growth Factor Drugs 0.000 description 2
- 101710027196 FBXO15 Proteins 0.000 description 2
- 101700051117 FUT1 Proteins 0.000 description 2
- 101710037135 GAPC2 Proteins 0.000 description 2
- 101710037116 GAPC3 Proteins 0.000 description 2
- 101710025049 GAPDG Proteins 0.000 description 2
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 2
- 102100006425 GAPDH Human genes 0.000 description 2
- 101710010461 Gapdh1 Proteins 0.000 description 2
- 102000011294 Interleukin 1 Receptor Antagonist Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010023402 Interleukin 1 Receptor Antagonist Protein Proteins 0.000 description 2
- 101700048573 KLF4 Proteins 0.000 description 2
- 102100006525 KLF4 Human genes 0.000 description 2
- 101710025050 MK0970 Proteins 0.000 description 2
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 2
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010054107 Nodule Diseases 0.000 description 2
- 241001594857 Pao Species 0.000 description 2
- 208000002151 Pleural Effusion Diseases 0.000 description 2
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 2
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 2
- 206010039203 Road traffic accident Diseases 0.000 description 2
- 101700003526 SALL4 Proteins 0.000 description 2
- 101710019780 SLC22A3 Proteins 0.000 description 2
- 230000037165 Serum Concentration Effects 0.000 description 2
- 101700070946 TGL4 Proteins 0.000 description 2
- 101700026084 THY1 Proteins 0.000 description 2
- 210000002435 Tendons Anatomy 0.000 description 2
- 210000003437 Trachea Anatomy 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 210000003954 Umbilical Cord Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 101710025091 cbbGC Proteins 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710025070 gapdh-2 Proteins 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004255 neuroglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000001776 parthenogenetic Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920002496 poly(ether sulfone) Polymers 0.000 description 2
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 2
- 230000000754 repressing Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000003068 static Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001502 supplementation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-M thromboxane A2(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)O[C@@H]2O[C@H]1C2 DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-M 0.000 description 2
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- NKCXQMYPWXSLIZ-PSRDDEIFSA-N (2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-m Chemical compound O=C([C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NKCXQMYPWXSLIZ-PSRDDEIFSA-N 0.000 description 1
- 102100001249 ALB Human genes 0.000 description 1
- 101710027066 ALB Proteins 0.000 description 1
- 101710043860 ANGPT1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004381 Amniotic Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 1
- 229940114079 Arachidonic Acid Drugs 0.000 description 1
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N Arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 210000001367 Arteries Anatomy 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102100008428 CCL2 Human genes 0.000 description 1
- 101700006000 CCL2 Proteins 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100003729 CD40LG Human genes 0.000 description 1
- 102100006435 CSF3 Human genes 0.000 description 1
- 101700072041 CXCL1 Proteins 0.000 description 1
- 102100018698 CXCL1 Human genes 0.000 description 1
- 102100009637 CXCL11 Human genes 0.000 description 1
- 101710032182 CXCL11 Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000004720 Cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N Chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 description 1
- 108009000280 Complement Activation Proteins 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 208000008313 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 210000004087 Cornea Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108009000097 DNA Replication Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000031025 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000102 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920004934 Dacron® Polymers 0.000 description 1
- 210000004443 Dendritic Cells Anatomy 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N Dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 Dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 description 1
- 210000002242 Embryoid Bodies Anatomy 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 210000004696 Endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 102000002045 Endothelin Human genes 0.000 description 1
- 108050009340 Endothelin Proteins 0.000 description 1
- ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N Endothelin-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)=O)NC(=O)[C@@H](CO)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZUBDGKVDJUIMQQ-UBFCDGJISA-N 0.000 description 1
- KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N Epoprostenol Chemical compound O1C(=CCCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]21 KAQKFAOMNZTLHT-VVUHWYTRSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 210000004494 Erythroblasts Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 Extremities Anatomy 0.000 description 1
- 102100007406 FGF4 Human genes 0.000 description 1
- 101700036125 FGF4 Proteins 0.000 description 1
- 229950003499 FIBRIN Drugs 0.000 description 1
- 210000000887 Face Anatomy 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940012952 Fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 229940019698 Fibrinogen containing hemostatics Drugs 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 210000002683 Foot Anatomy 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010018987 Haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 210000002837 Heart Atria Anatomy 0.000 description 1
- 210000003709 Heart Valves Anatomy 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000004754 Hybrid Cells Anatomy 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N Hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100004115 ICAM1 Human genes 0.000 description 1
- 101700051176 ICAM1 Proteins 0.000 description 1
- 102100015977 IL16 Human genes 0.000 description 1
- 101700036616 IL16 Proteins 0.000 description 1
- 101710006708 ITGA3 Proteins 0.000 description 1
- 102100019335 ITGA3 Human genes 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004125 Interleukin-1alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 1
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004324 Lymphatic System Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 102100012644 MIF Human genes 0.000 description 1
- 108060004872 MIF Proteins 0.000 description 1
- DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N Meropenem Chemical compound C=1([C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)S[C@@H]1CN[C@H](C(=O)N(C)C)C1 DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000000472 Morula Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 Mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000004253 Multipotent Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 208000009025 Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000933 Neural Crest Anatomy 0.000 description 1
- 210000001178 Neural Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 206010029305 Neurological disorder Diseases 0.000 description 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 101710043203 P23p89 Proteins 0.000 description 1
- 102100010404 PLA2G4A Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic Elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic Elastase Human genes 0.000 description 1
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 210000003240 Portal Vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000004129 Prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000008425 Protein Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 210000003492 Pulmonary Veins Anatomy 0.000 description 1
- 206010037370 Pulmonary contusion Diseases 0.000 description 1
- 102100002050 ROS1 Human genes 0.000 description 1
- 101710027587 ROS1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100007015 SERPINE1 Human genes 0.000 description 1
- 210000004927 Skin cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000000278 Spinal Cord Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 210000002536 Stromal Cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010042316 Subarachnoid haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102100008471 THBD Human genes 0.000 description 1
- 102100008333 THY1 Human genes 0.000 description 1
- 210000003411 Telomere Anatomy 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010060872 Transplant failure Diseases 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 102100009661 VTN Human genes 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 210000001766 X Chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001325 Yolk Sac Anatomy 0.000 description 1
- DWGPSNYAMMWMIW-UHFFFAOYSA-K [5-(1,2-dihydroxyethyl)-2-oxido-4-oxofuran-3-yl] phosphate Chemical compound OCC(O)C1OC([O-])=C(OP([O-])([O-])=O)C1=O DWGPSNYAMMWMIW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium(0) Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceuticals Drugs 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding Effects 0.000 description 1
- 231100000319 bleeding Toxicity 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 101710014509 celF Proteins 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002083 cellular DNA Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000003690 classically activated macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010372 cloning stem cell Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture media Substances 0.000 description 1
- 230000023298 conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 1
- QGBSISYHAICWAH-UHFFFAOYSA-N cyanoguanidine Chemical compound NC(N)=NC#N QGBSISYHAICWAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000002514 epidermal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001123 epoprostenol Drugs 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000004868 gas analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric Effects 0.000 description 1
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000003897 hepatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-M leukotriene B4(1-) Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC([O-])=O VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-M 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 239000010687 lubricating oil Substances 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005399 mechanical ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229960002260 meropenem Drugs 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 210000002198 morula cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 210000003867 nerve cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective Effects 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive Effects 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 239000000082 organ preservation Substances 0.000 description 1
- 238000010373 organism cloning Methods 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- CMFNMSMUKZHDEY-UHFFFAOYSA-M peroxynitrite Chemical compound [O-]ON=O CMFNMSMUKZHDEY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutic aid Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920003208 poly(ethylene sulfide) Polymers 0.000 description 1
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 230000023123 positive regulation of leukocyte activation Effects 0.000 description 1
- 230000013188 positive regulation of leukocyte chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003303 reheating Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000008943 replicative senescence Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 101700073234 stc Proteins 0.000 description 1
- 231100000803 sterility Toxicity 0.000 description 1
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000005700 syncytium formation by plasma membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000511 telomere Polymers 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 108060008245 thrombospondin family Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 thrombospondin family Human genes 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 230000001573 trophoblastic Effects 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к способу трансплантации органа, включающему воздействие на орган экзогенных стволовых клеток, причем стволовые клетки представляют собой человеческие, происходящие из костного мозга, неэмбриональные, неполовые стволовые клетки, экспрессирующие теломеразу, имеют нормальный кариотип, не являются туморогенными, причем стволовые клетки были подвергнуты по меньшей мере 10-40 делениям клеток в культуре до их воздействия на орган и причем орган подвергают воздействию стволовых клеток до трансплантации реципиенту. Настоящее изобретение обеспечивает снижение вредных воздействий ишемии на орган, предназначенный для забора для трансплантации или забранный для трансплантации. 15 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл.
Description
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка включает список последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и включенный, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 8 апреля 2014 года, названа ATH-022234USORD_SL.txt, и ее размер составляет 7517 байтов.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Областью изобретения является трансплантация органов и разработка способов и композиций, улучшающих успех трансплантации органов. Способы и композиции направлены на подверганию желаемого органа, до или в течение трансплантации, воздействию стволовых клеток. В одном из вариантов осуществления стволовые клетки снижают вредные воздействия ишемии на орган, предназначенный для забора для трансплантации или забранный для трансплантации. В другом варианте осуществления органом является легкое. В дополнительном варианте осуществления, в котором орган, предназначенный для трансплантации, перфузируют ex vivo, способ включает снижение ишемического реперфузионного повреждения посредством перфузии органа средой, содержащей стволовые клетки.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Трансплантация органов представляет собой получение и забор органа от донора или из донорного участка (если донор и реципиент являются одним и тем же) и имплантацию, поддержание и/или использование органа в реципиенте или реципиентом донорского органа. По имеющимся оценкам, на основных рынках здравоохранения (например, США, Европа и Япония) осуществляют более 50000 трансплантаций органов в год, и более 170000 пациентов находятся в листах ожидания для трансплантации органов. Спрос на здоровые органы значительно превышает предложение.
Основной проблемой при трансплантации органов является отторжение трансплантата, которое может приводить к значительным осложнениям в функционировании органа или недостаточности трансплантата. В основном, ее решают с помощью подбора доноров и реципиентов, имеющих очень схожие серотипы, и с использованием иммуносупрессорных лекарственных средств для контроля иммунного ответа, лежащего в основе отторжения трансплантата.
Другой основной проблемой является сохранение жизнеспособности органов до процедуры имплантации и в течение нее. Удаление, хранение и трансплантация органа может значительно влиять на внутреннюю структуру и функцию органа и может существенно повлиять на степень, с которой замедляется или предотвращается возвращение нормальной функции органа после завершения трансплантации. Такое повреждение органа, главным образом, происходит в результате ишемии и гипотермии, но также может относиться к реперфузии органа ex vivo или в течение имплантации. Способы консервации органов, включая перфузию ex vivo, служат для минимизации этого повреждения для обеспечения оптимального срока жизнеспособности и функционирования трансплантата. Но, даже с использованием этих способов, во многих случаях здоровое состояние органа будет снижаться, влияя на исход трансплантации, и в некоторых случаях снижение является настолько значительным, что донорские органы забраковывают до трансплантации как нежизнеспособные.
Технология, направленная на решение этих важных проблем в трансплантации органов, должна оказывать существенное влияние на качество жизни и выживаемость пациентов и на лечение осложнений, ассоциированных с трансплантацией.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к способу, включающему трансплантацию органа, подвергнутого воздействию экзогенных стволовых клеток до, в течение и/или после трансплантации. Воздействие стволовых клеток может повышать вероятность успешной трансплантации органов. Таким образом, изобретение относится к следующим вариантам осуществления.
В одном из вариантов осуществления способ может включать толеризацию органа посредством приведения органа в контакт с экзогенными стволовыми клетками до, в течение и/или после трансплантации. С помощью толеризации органа его лучше подготавливают к приживлению реципиентом без значительного иммунологического противодействия. Толеризации можно достигать, например, посредством индукции T-регуляторных клеток в органе (см., например, Eggenhofer et al., Stem Cells Translation Medicine 2013;2:000-000).
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу снижения повреждения органа ex vivo посредством приведения органа в контакт со средой, содержащей экзогенные стволовые клетки, до, в течение и/или после трансплантации.
В одном из вариантов осуществления повреждение происходит в результате ишемического реперфузионного повреждения.
В одном из вариантов осуществления способ направлен на снижение общей деградации ткани или клетки в органе, подлежащем трансплантации. Это может являться результатом действия факторов, включающих, в качестве неограничивающих примеров, ишемию, гипотермию и реперфузию. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к снижению повреждения в результате одного или нескольких из этих явлений. Такие явления могут быть вызваны, по меньшей мере частично, одним или комбинацией следующего: (1) иммуномодуляции T-клеток TH1 в T-клетки TH2; (2) иммуномодуляции макрофагов М1 в макрофаги M2 (например, вызывающей сдвиг от провоспалительного ответа в сторону противовоспалительного ответа); (3) ингибирования инфильтрации нейтрофилами (например, посредством снижения рецепторов поверхности клеток); (4) сдвиг нейтрофилов от провоспалительных в сторону противовоспалительных; и (5) цитопротекции или антиапоптотических эффектов, вызванных экзогенными стволовыми клетками.
Явления, представленные в настоящем описании, могут приводить к воспалению, другому иммунному ответу, продукции цитокинов, апоптозу клеток и другим событиям, влияющим на жизнеспособность органа и пригодность для трансплантации. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к снижению вредных воздействий этих явлений посредством введения экзогенных стволовых клеток в орган, являющийся объектом этих явлений или в котором эти явления уже происходят.
Примеры явлений, которые могут приводить к воспалению, другому иммунному ответу, продукции цитокинов, апоптозу клеток и другим явлениям, влияющим на жизнеспособность органа и пригодность для трансплантации, могут включать, в качестве неограничивающих примеров, явления, ассоциированные с эндотелиальным ответом, активными формами кислорода, комплементом и лейкоцитами. Явления, ассоциированные с эндотелиальным ответом, могут включать, в качестве неограничивающих примеров, экспрессию конкретных провоспалительных продуктов генов (например, молекул адгезии лейкоцитов, цитокинов) и/или биоактивных средств (например, эндотелина, тромбоксана A2) и/или репрессию других "протективных" продуктов генов (например, конститутивной синтазы оксида азота, тромбомодулина) и/или биоактивных средств (например, простациклина, оксида азота). Явления, ассоциированные с активными формами кислорода (например, (O2-), (OH-), (HOCl), (H2O2) и образующимся из оксида азота пероксинитритом), могут включать, в качестве неограничивающих примеров, прямое повреждение клеточных мембран посредством перекисного окисления липидов, стимуляцию активации лейкоцитов и хемотаксис посредством активации фосфолипазы A2 цитоплазматической мембраны для образования арахидоновой кислоты (тромбоксана A2 и лейкотриена B4), и/или повышение активации лейкоцитов, хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к эндотелию после ишемической реперфузии. Явления, ассоциированные с активацией комплемента, такого как C3a, C5a, iC3b, C5b9 (C5a является наиболее активным), могут включать, в качестве неограничивающих примеров, образование нескольких провоспалительных медиаторов, изменяющих сосудистый гомеостаз, например, посредством нарушения кровотока в ишемизированном органе посредством изменения сосудистого гомеостаза и повышения адгезии лейкоцитов к эндотелию. Явления, ассоциированные с лейкоцитами, могут включать, в качестве неограничивающих примеров, активацию лейкоцитов, хемотаксис, адгезию лейкоцитов к эндотелию и трансмиграцию, которые в дальнейшем могут приводить к механической обструкции, т.к. лейкоциты высвобождают токсичные ROS, протеазы и эластазы, что приводит к проницаемости микрососудов, отеку, тромбозу и гибели паренхиматозных клеток.
В одном из вариантов осуществления орган выбран из группы, включающей, в качестве неограничивающих примеров, легкое, почку, сердце, печень, поджелудочную железу, тимус, желудочно-кишечный тракт и композитные аллотрансплантаты, такие как конечности, лица и т.п., и ткани, включая, в качестве неограничивающих примеров, роговицу, кожу, вены, артерии, кости, сухожилия и клапаны, такие как клапаны сердца и т.п.
В одном из вариантов осуществления стволовые клетки снижают воспаление в органе. Например, орган можно подвергать воздействию стволовых клеток в течение периода времени и при дозе, достаточных для снижения воспаления в органе.
В одном из вариантов осуществления стволовые клетки снижают наличие воспалительных клеток в органе. Например, орган можно подвергать воздействию стволовых клеток в течение периода времени и при дозе, достаточных для снижения наличия воспалительных клеток в органе.
В одном из вариантов осуществления стволовые клетки снижают воспалительные цитокины в органе. Например, орган можно подвергать воздействию стволовых клеток в течение периода времени и при дозе, достаточных для снижения воспалительных цитокинов в органе.
В одном из вариантов осуществления стволовые клетки снижают наличие отека легких. Например, орган можно подвергать воздействию стволовых клеток в течение периода времени и при дозе, достаточных для снижения наличия отека легких.
В одном из вариантов осуществления стволовые клетки повышают наличие экспрессии ИЛ-10 (белка и/или мРНК) в легочной ткани. Например, орган можно подвергать воздействию стволовых клеток в течение периода времени и при дозе, достаточных для повышения наличия экспрессии ИЛ-10 в легочной ткани.
В одном из вариантов осуществления повреждение является результатом гипоксии в органе.
В одном из вариантов осуществления стволовые клетки снижают эффекты гипоксии в органе.
В одном из вариантов осуществления стволовые клетки вводят в любое время между удалением органа у донора и трансплантацией реципиенту.
В одном из вариантов осуществления органа подвергают воздействию стволовых клеток в течение процедуры трансплантации.
В одном из вариантов осуществления орган можно подвергать воздействию стволовых клеток, в то время как орган все еще является интактным у донора, но до удаления органа у донора.
В одном из вариантов осуществления орган можно подвергать воздействию стволовых клеток в течение периода времени. Период времени может зависеть от конкретного органа. Например, период времени может составлять приблизительно 1-2 часа, приблизительно 2-3 часа, приблизительно 3-4 часа, приблизительно 4-5 часов, приблизительно 5-6 часов, приблизительно 7-8 часов, приблизительно 8-9 часов, приблизительно 9-10 часов или приблизительно 10 часов или более. Один из примеров подходящего периода времени описывают в Zhao et al., BMC Medicine 2012, 10:3, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в качестве руководства по способу ex vivo, включая подходящие периоды времени, для внутривенной обработки клеток ex vivo.
В одном из вариантов осуществления концентрация стволовых клеток, воздействию которых подвергают орган, может зависеть от конкретного органа. Например, концентрация клеток, воздействию которых подвергают орган, может составлять от приблизительно 0,01 до приблизительно 5×107 клеток/мл, от приблизительно 1×105 клеток/мл до приблизительно 5×107 клеток/мл, или приблизительно 10×106 клеток/мл.
В другом варианте осуществления концентрация стволовых клеток, подвергаемых воздействию органа, может составлять от приблизительно 1×105 клеток/кг органа до приблизительно 5×105 клетки/кг органа, от приблизительно 5×105 клеток/кг органа до 1×106 клеток/кг органа и до 5×106 клеток/кг органа, от приблизительно 5×106 клеток/кг органа до 1×107 клеток/кг органа, от приблизительно 1×107 клеток/кг органа до 1,5×107 клеток/кг органа или от приблизительно 1×107 клеток/кг органа до 2×108 клеток/кг органа.
В других вариантах осуществления стволовые клетки содержатся в жидкости для перфузии в органе или в носителе для внутриорганного (такого как внутрибронхиальное) введения.
В другом варианте осуществления стволовые клетки содержатся в среде, в которой орган приводят в контакт до трансплантации, такой как среда, в которую орган погружают, а не перфузируют.
Авторы настоящего изобретения предполагают использование любой желаемой стволовой клетки в способах по изобретению. Они включают, в качестве неограничивающих примеров, эмбриональные стволовые клетки, неэмбриональные мультипотентные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, нейрональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и т.п. В одном из вариантов осуществления стволовые клетки могут являться несовпадающими по HLA, аллогенными клетками.
Клетки включают, в качестве неограничивающих примеров, клетки, не являющиеся эмбриональными стволовыми клетками и половыми клетками, имеющие некоторые характеристики эмбриональных стволовых клеток, но полученные из неэмбриональной ткани и обеспечивающие эффекты, описываемые в настоящей заявке. Клетки могут от природы обеспечивать эти эффекты (т.е. являться генетически или фармацевтически немодифицированными). Однако для повышения активности природные экспрессоры можно генетически или фармацевтически модифицировать.
Клетки могут экспрессировать маркеры плюрипотентности, такие как oct4. Они также могут экспрессировать маркеры, ассоциированные с длительной репликативной способностью, такие как теломераза. Другие характеристики плюрипотентности могут включать способность дифференцироваться в типы клеток из нескольких зародышевых листков, таких как два или три из эктодермального, эндодермального и мезодермального эмбриональных зародышевых листков. Такие клетки могут являться или не являться иммортализованными или трансформированными в культуру. Клетки могут значительно размножаться без трансформации, а также поддерживать нормальный кариотип. В одном из вариантов осуществления неэмбриональные стволовые, неполовые клетки можно подвергать желаемому количеству делений клеток в культуре. Например, неэмбриональные стволовые, неполовые клетки можно подвергать по меньшей мере 10-40 делениям клеток в культуре, например, 30-35 делениям клеток, где клетки не трансформируют и они имеют нормальный кариотип. Клетки могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток из каждой из двух из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональной линий и могут включать дифференцировку во все три из них. Кроме того, клетки могут не являться туморогенными, например, не приводить к тератомам. Если клетки являются трансформированными или туморогенными, и желательно использовать их для инфузии, такие клетки можно деактивировать таким образом, что они не могут образовывать опухоли in vivo, например, посредством обработки, предотвращающей клеточную пролиферацию в опухоли. Такие обработки хорошо известны в этой области.
Клетки включают, в качестве неограничивающих примеров, следующие пронумерованные варианты осуществления:
1. Выделенные наращенные неэмбриональные стволовые, неполовые клетки, клетки, подвергнутые по меньшей мере 10-40 делениям клеток в культуре, где клетки экспрессируют oct4, не являются трансформированными и имеют нормальный кариотип.
2. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 1 выше, дополнительно экспрессирующие один или несколько из теломеразы, rex-1, rox-1 или sox-2.
3. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 1 выше, которые могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток по меньшей мере из двух из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональных линий.
4. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 3 выше, дополнительно экспрессирующие один или несколько из теломеразы, rex-1, rox-1 или sox-2.
5. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 3 выше, которые могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток из каждой из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональных линий.
6. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 5 выше, дополнительно экспрессирующие один или несколько из теломеразы, rex-1, rox-1 или sox-2.
7. Выделенные наращенные неэмбриональные стволовые, неполовые клетки, получаемые посредством культивирования неэмбриональной, незародышевой ткани, клеток, подвергнутых по меньшей мере 40 делениям клеток в культуре, где клетки не являются трансформированными и имеют нормальный кариотип.
8. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 7 выше, экспрессирующие один или несколько из oct4, теломеразы, rex-1, rox-1 или sox-2.
9. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 7 выше, которые могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток по меньшей мере из двух из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональных линий.
10. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 9 выше, экспрессирующие один или несколько из oct4, теломеразы, rex-1, rox-1 или sox-2.
11. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 9 выше, которые могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток из каждой из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональных линий.
12. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 11 выше, экспрессирующие один или несколько из oct4, теломеразы, rex-1, rox-1 или sox-2.
13. Выделенные наращенные неэмбриональные стволовые, неполовые клетки, клетки, подвергнутые по меньшей мере 10-40 делениям клеток в культуре, где клетки экспрессируют теломеразу, не являются трансформированными и имеют нормальный кариотип.
14. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 13 выше, дополнительно экспрессирующие один или несколько из oct4, rex-1, rox-1 или sox-2.
15. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 13 выше, которые могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток по меньшей мере из двух из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональных линий.
16. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 15 выше, дополнительно экспрессирующие один или несколько из oct4, rex-1, rox-1 или sox-2.
17. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 15 выше, которые могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток из каждой из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональных линий.
18. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 17 выше, дополнительно экспрессирующие один или несколько из oct4, rex-1, rox-1 или sox-2.
19. Выделенные наращенные неэмбриональные стволовые, неполовые клетки, которые могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток по меньшей мере из двух из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональных линий, подвергнутые по меньшей мере 10-40 делениям клеток в культуре.
20. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 19 выше, экспрессирующие один или несколько из oct4, теломеразы, rex-1, rox-1 или sox-2.
21. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 19 выше, которые могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток из каждой из эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной эмбриональных линий.
22. Неэмбриональные стволовые, неполовые клетки по п. 21 выше, экспрессирующие один или несколько из oct4, теломеразы, rex-1, rox-1 или sox-2.
В одном из вариантов осуществления вместо стволовых клеток используют кондиционированную среду.
В одном из вариантов осуществления орган имеет человеческое происхождение.
В силу свойства клеток обеспечивать желаемые эффекты, можно создавать банки клеток, содержащие клетки, выбранные в качестве имеющих желаемую активность (уровень способности) для обеспечения эффектов. Таким образом, настоящее изобретение относится к анализу клеток на способность. Банк может представлять собой источник для получения фармацевтической композиции для введения в орган. Можно использовать клетки непосредственно из банка или наращивать перед использованием. Особенно в случае, когда клетки подвергают дополнительному наращиванию, после наращивания желательно проверять, имеют ли клетки по-прежнему желаемую активность. Банки делают возможным использование клеток "в готовом виде", являющихся аллогенными в отношении донора и реципиента орган.
Таким образом, изобретение также относится к диагностическим способам, осуществляемым перед подверганием органа воздействию стволовых клеток. Способы включают оценку активности клеток для обеспечения эффектов, описываемых в настоящей заявке. Клетки можно получать из банка клеток и использовать напрямую или наращивать перед введением. В любом случае, клетки можно анализировать на желаемую активность. Особенно в случае, когда клетки подвергают дополнительному наращиванию, после наращивания желательно проверять, имеют ли клетки по-прежнему желаемую активность.
Хотя клетки, выбранные по эффектам, обязательно анализируют в течение селекции, для подтверждения того, что клетки по-прежнему обеспечивают эффекты на желаемом уровне, предпочтительным и целесообразным может являться повторный анализ клеток перед введением индивидууму для лечения. Это является особенно предпочтительным, если клетки сортируют в течение любого периода времени, например, в банке клеток, где клетки, скорее всего, замораживают при хранении.
Между исходным выделением клеток и введением в орган, можно осуществлять многочисленные (т.е. последовательные) анализы на эффекты. Они предназначены для подтверждения того, что клетки могут по-прежнему обеспечивать эффекты на желаемом уровне после манипуляций, осуществляемых в течение этого периода времени. Например, анализ можно осуществлять после каждого наращивания клеток. Если клетки хранят в банке клеток, их можно анализировать после прекращения хранения. Если они заморожены, их можно анализировать после размораживания. Если клетки из банка клеток наращивают, их можно анализировать после наращивания. Предпочтительно, можно анализировать часть конечного клеточного продукта (физически вводимого в орган).
Поскольку стволовые клетки могут обеспечивать эффекты, представленные в настоящем описании, с помощью секретируемых молекул, различные варианты осуществления для введения стволовых клеток, представленные в настоящем описании, можно осуществлять посредством введения одной или нескольких секретируемых молекул, таких как те, которые могут находиться в кондиционированной среде для культивирования.
Изобретение также относится к композициям, содержащим популяцию клеток, имеющих желаемую активность для обеспечения желаемых эффектов. Такие популяции можно находить в виде фармацевтических композиций, подходящих для введения в орган, и/или в банках клеток, клетки из которых можно использовать непосредственно для введения или наращивать перед введением. В одном из вариантов осуществления клетки имеют усиленную (повышенную) активность по сравнению с предыдущей (родительской) популяцией клеток. Родительские клетки определены в настоящем описании. Усиление можно осуществлять посредством селекции природных экспрессоров или с помощью внешних факторов, действующих на клетки.
Клетки можно получать с помощью условий выделения и культивирования, представленных в настоящем описании. В конкретном варианте осуществления их получают с помощью условий культивирования, представленных в настоящем описании, включающих более низкие концентрации кислорода в комбинации с более высокими концентрациями сыворотки, такой как используемая для получения клеток, обозначенная как "MultiStem®".
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1. Схема дизайна исследования.
фигура 2. Репрезентативная макроскопическая картина правой нижней доли (RLL) и левой нижней доли (LLL) легкого №2 после реперфузии. MSC-обработанная LLL выглядит нормальной, в то время как обработанная наполнителем RLL выглядит отечной и воспаленной.
Фигура 3. Полуколичественная балльная оценка демонстрирует значимое снижение общего воспаления в MSC-обработанной LLL по сравнению с обработанной наполнителем RLL в 4 из 5 легких и в совокупности. Представлено среднее ± SD для объединенных наблюдений 3 "слепых" наблюдателей.
Фигуры 4A-B. Репрезентативные микрофотографии легкого 1 демонстрируют воспаление от минимального до незначимого в MSC-обработанной LLL по сравнению с утолщением альвеолярной перегородки, отеком и периваскулярными и перибронхиальными воспалительными клеточными инфильтратами. Исходное увеличение 200X.
Фигуры 5A-C. Снижение общего количества клеток в жидкости BAL в MSC-обработанной LLL в легких №№3-5 (фиг. 5A). Общее количество клеток не анализировали в легких №1 или №2. Инстилляция MSC также приводила к значимому снижению повышенных количеств общих нейтрофилов и эозинофилов в жидкости BAL во всех 5 легких (фиг. 5B-C). Данные представляют собой среднее ± SEM для объединенных наблюдений 3 "слепых" наблюдателей.
Фигура 6. Репрезентативный анализ цитокинов в жидкости BAL из легкого №4 демонстрирует значимое повышение ИЛ-10 в MSC-обработанной LLL, но отсутствие значимого изменения iNOS, STC-1 или TSG-6. Данные представляют собой среднее + стандартное отклонение для определения в трех повторениях для каждого образца LLL или RLL.
Фигура 7. Анализ цитокинов в ткани легкого. Анализ qPCR осуществляли с использованием образцов легочной ткани, собранных из LLL и RLL легких 2-5 при t=0, 2 и/или 4 часов. Кратная экспрессия представляет собой уровни гена-мишени по сравнению со значением t=0. Все данные нормировали по гену домашнего хозяйства GAPDH. Данные представляют собой среднее + стандартное отклонение для образцов LLL и RLL из легких 2-5.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами, реагентами и т.д., представленными в настоящем описании и, таким образом, может варьироваться. Терминология, используемая в настоящем описании, предназначена исключительно для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема описываемого изобретения, определенного исключительно в формуле изобретения.
В настоящем описании заголовки разделов используют исключительно в организационных целях, и не следует рассматривать их в качестве какого-либо ограничения описываемого объекта изобретения.
Способы по настоящему изобретению, как правило, осуществляют в соответствии с обычными способами, хорошо известными в этой области и описываемыми в различных общих и более конкретных ссылках, цитируемых и обсуждаемых на всем протяжении настоящего описания, если не указано иное. См., например, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboretory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990).
Определения
В настоящем описании единственное число означает один или несколько; по меньшей мере один. Если в настоящем описании используют форму во множественном числе, она, как правило, включает форму в единственном числе.
"Банк клеток" представляет собой промышленную номенклатуру для клеток, выращиваемых и хранимых для последующего использования. Клетки можно хранить в аликвотах. Их можно использовать непосредственно из хранилища или можно выращивать после хранения. Это удобно, поэтому существуют "готовые к использованию" клетки, доступные для введения. Клетки можно хранить уже в фармацевтически приемлемом эксципиенте таким образом, что их можно вводить напрямую или их можно смешивать с соответствующим эксципиентом после прекращения хранения. Клетки можно замораживать или иным образом хранить в форме для сохранения жизнеспособности. В одном из вариантов осуществления изобретения создают банки клеток, в которых клетки выбирают по повышенной активности для достижения эффектов, описываемых в настоящей заявке. После прекращения хранения и до введения предпочтительным может являться повторный анализ клеток на активность. Его можно осуществлять с использованием любого из анализов, прямых или непрямых, описываемых в настоящей заявке или иначе известных в этой области. Затем можно вводить клетки, имеющие желаемую активность. Банки можно создавать с использованием аутологичных клеток (полученных от донора органа или реципиента). Или банки могут содержать клетки для аллогенного использования.
Термин "совместное введение" означает введение в комбинации друг с другом, совместно, скоординированно, включая одновременное или последовательное введение двух или более средств.
Термин "содержащий" означает, без других ограничений, включение объекта обязательно без какого-либо ограничения или исключения того, что еще можно включать. Например, "композиция, содержащая x и y" включает любую композицию, содержащую x и y, независимо от того, какие другие компоненты могут присутствовать в композиции. Аналогично, "способ, включающий этап x" включает любой способ, в котором осуществляют x, является ли x единственным этапом способа или лишь одним из этапов, независимо от того, сколько других этапов могут присутствовать, и независимо от того, насколько простым или сложным является x по сравнению с ними. Термин "состоящий из" и аналогичные фразы с использованием слов с корнем "содержать" в настоящем описании используют в качестве синонимов термина "содержащий", и они имеют одно и то же значение.
Термин "состоящий из" является синонимом термина "содержащий" (см. выше).
Термин "контакт" при использовании в отношении стволовой клетки и органа, подлежащего трансплантации, может означать, что после подвергания органа воздействию стволовая клетка физически соприкасается с органом. В таких случаях стволовая клетка находится в прямом контакте с органом. В других случаях стволовая клетка может косвенно контактировать с органом, если одна или несколько структур (например, другая клетка) и/или жидкостей (например, кровь) физически располагается между стволовой клеткой и органом.
"EC-клетки" обнаруживали при анализе типа злокачественного новообразования, называемого тератокарциномой. В 1964 году исследователи отметили, что одну клетку в тератокарциномах можно выделять и сохранять недифференцированной в культуре. Этот тип стволовой клетки стал известен как клетка эмбриональной карциномы (EC-клетка).
Термин "эффективное количество", как правило, означает количество, обеспечивающее желаемый местный или системный эффект, например, эффективный для улучшения нежелательных эффектов воспаления, включая достижение конкретных желаемых эффектов, описываемых в настоящей заявке. Например, эффективное количество является количеством, достаточным для достижения благоприятного или желаемого клинического результата. Эффективные количества можно вводить все сразу за одно введение или в небольших количествах, обеспечивающих эффективное количество за несколько введений. Точное определение того, что будут рассматривать как эффективное количество, может быть основано на факторах, отдельных для каждого органа, включая тип органа, заболевание или повреждение, подвергаемое лечению, способ, которым обрабатывают орган, длительность времени с момента забора и т.д. Специалист в этой области будет способен определять эффективное количество для указанного органа с учетом этих соображений, общепринятых в этой области. В рамках изобретения, термин "эффективная доза" означает то же, что и "эффективное количество."
Термин "эффективный путь", как правило, означает путь, обеспечивающий доставку средства в желаемый компартмент, систему или место. Например, эффективный путь является путем, которым можно вводить средство для обеспечения нахождения в желаемом месте действия количества средства, достаточного для осуществления благоприятного или желаемого клинического результата (в данном случае, эффективной трансплантации).
"Эмбриональные стволовые клетки (ESC)" хорошо известны в этой области, и их получают из множества различных видов млекопитающих. Эмбриональные стволовые клетки являются стволовыми клетками, полученными из внутренней клеточной массы ранней стадии развития эмбриона, известной как бластоциста. Они способны дифференцироваться во все производные трех первичных зародышевых листков: эктодермы, эндодермы и мезодермы. Они включают каждый из более 220 типов клеток взрослого организма. ES-клетки могут становиться любой тканью в организме, за исключением плаценты. Только клетки морулы являются тотипотентными, способными становиться всеми тканями и плацентой. Некоторые клетки, схожие с ESC, можно получать с помощью ядерного переноса ядра соматической клетки в энуклеированную оплодотворенную яйцеклетку.
Термин "экзогенный" при использовании в отношении стволовой клетки, как правило, относится к стволовой клетке, являющейся внешней по отношению к органу, и воздействию которой подвергают (например, приводят в контакт) орган, предназначенный для трансплантации эффективным путем. Экзогенная стволовая клетка может происходить из того же индивидуума или из другого индивидуума. В одном из вариантов осуществления экзогенные стволовые клетки могут включать стволовые клетки, собранные из индивидуума, выделенные, наращиваемые ex vivo, а затем воздействию которых подвергают орган, предназначенный для трансплантации эффективным путем.
Термин "подвергать воздействию" может включать действие по введению одной или нескольких стволовых клеток в орган, предназначенный для трансплантации. Введение в орган можно осуществлять ex vivo или in vivo (например, посредством перфузии индивидууму).
Использование термина "включает" не предназначено для ограничения.
Термин "повышать" или "повышение" означает индуцирование биологического явления полностью или повышение степени явления.
"Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (клетки IPSC или IPS)" являются соматическими клетками, перепрограммированными, например, посредством встраивания экзогенных генов, придающих соматической клетке менее дифференцированный фенотип. Затем эти клетки можно и индуцировать для дифференцировки в менее дифференцированное потомство. Клетки IPS получают с использованием модификаций подхода, исходно созданного в 2006 году (Yamanaka, S. et al., Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007)). Например, в одном случае, для получения клеток IPS исследователи начинают с клеток кожи, которые затем модифицируют стандартным лабораторным способом с использованием ретровирусов для встраивания генов в клеточную ДНК. В одном случае, встроенными генами являлись Oct4, Sox2, Lif4 и c-myc, как известно, действующие совместно в качестве природных регуляторов для сохранения клеток в состоянии, подобном эмбриональным стволовым клеткам. Эти клетки описывают в литературе. См., например, Wernig et al., PNAS, 105:5856-5861 (2008); Jaenisch et al., Cell, 132:567-582 (2008); Hanna et al., Cell, 133:250-264 (2008); и Brambrink et al, Cell Stem Cell, 2:151-159 (2008). Эти ссылки включены в качестве ссылки на руководство по IPSC и способам их получения. Также возможно, что такие клетки можно получать с помощью конкретных условий культивирования (подвергания воздействию конкретных средств).
Термин "ишемическое реперфузионное повреждение" известен в этой области и описан, например, в http://emedicine.medscape.eom/article/431140-overview#aw2aab6b3 (о консервации органа), а также de Groot, H. et al., Transplant Proc. 39(2):481-4 (Mar. 2007), включенных в настоящее описание в качестве ссылок в качестве руководства по ишемическому реперфузионному повреждению и его механистическим подробностям.
"Ишемия" происходит в две фазы. Первую фазу обозначают как фаза теплой ишемии, и она включает время от удаления донорского органа и прерывания кровотока до введения в орган гипотермического раствора для консервации. Фаза холодной ишемии происходит, когда орган поддерживают в гипотермическом состоянии перед трансплантацией и нормальной рециркуляцией у реципиента.
Термин "выделенный" относится к клетке или клеткам, не ассоциированным с одной или несколькими клетками или одним или несколькими клеточными компонентами, ассоциированными с клеткой или клетками in vivo. Термин "обогащенная популяция" означает относительное повышение количества желаемых клеток относительно одного или нескольких других типов клеток in vivo или в первичной культуре.
Однако, в рамках изобретения, термин "выделенный" не указывает на наличие только клеток по изобретению. Вернее, термин "выделенный" указывает на то, что клетки по изобретению удаляют из их природного тканевого окружения, и они присутствуют в более высокой концентрации по сравнению с нормальным тканевым окружением. Таким образом, "выделенная" популяция клеток может дополнительно включать типы клеток в дополнение к клеткам по изобретению и может включать дополнительные тканевые компоненты. Это также можно выражать в терминах делений клеток, например. Клетка можно подвергать 10, 20, 30, 40 или более делениям in vitro или ex vivo таким образом, что она становится обогащенной по сравнению с ее исходными количествами in vivo или в ее исходном тканевом окружении (например, костном мозге, периферической крови, плаценте, пуповине, пуповинной крови, жировой ткани и т.д.).
"MAPC" является аббревиатурой для "мультипотентных зрелых клеток-предшественников". Она относится к клетке, не являющейся эмбриональной стволовой клеткой или половой клеткой, но имеющей некоторые из их характеристик. MAPC можно охарактеризовать с помощью ряда альтернативных характеристик, каждая из которых придает новизну клеткам при их открытии. Таким образом, они могут отличаться одной или несколькими из этих характеристик. Во-первых, они имеют длительную репликативную способность в культуре без трансформации (туморогенные) и с нормальным кариотипом. Во-вторых, они могут давать начало потомству клеток из нескольких зародышевых листков, таких как два или все три зародышевых листка (т.е. эндодерма, мезодерма и эктодерма), после дифференцировки. В-третьих, хотя они не являются эмбриональными стволовыми клетками или половыми клетками, они могут экспрессировать маркеры этих незрелых типов клеток таким образом, что MAPC могут экспрессировать один или несколько из Oct 3/4 (т.е. Oct 3A), rex-1 и rox-1. Они также могут экспрессировать один или несколько из sox-2 и SSEA-4. В-четвертых, как и стволовая клетка, они могут самоподдерживаться, т.е. имеют длительную репликативную способность без трансформации. Это означает, что эти клетки экспрессируют теломеразу (т.е. имеют теломеразную активность). Таким образом, тип клеток, обозначаемый как "MAPC", может отличаться альтернативными основными характеристиками, описывающими клетку посредством некоторых из этих новых свойств.
Термин "зрелый" в отношении MAPC является неограничивающим. Он относится к неэмбриональной соматической клетке. MAPC являются кариотипически нормальными и не образуют тератомы in vivo. Эту аббревиатуру впервые использовали в патенте США № 7015037 для описания плюрипотентной клетки, выделенной из костного мозга. Однако впоследствии открыли клетки с плюрипотентными маркерами и/или дифференцировочным потенциалом, и в целях по настоящему изобретению они могут являться эквивалентными клетками, сначала обозначенными "MAPC". Основное описание типа клеток MAPC представлено выше в сущности изобретения.
MAPC представляют собой популяцию более незрелых клеток-предшественников, чем MSC (Verfaillie, CM., Trends Cell Biol 12:502-8 (2002), Jahagirdar, B.N., et al., Exp Hematol, 29:543-56 (2001); Reyes, M. and CM. Verfaillie, Ann N Y Acad Sci, 938:231-233 (2001); Jiang, Y. et al., Exp Hematol, 30896-904 (2002); и Jiang, Y. et al, Nature, 418:41-9. (2002))
Термин "MultiStem®" является торговым названием клеточного препарата на основе MAPC по патенту США № 7015037, т.е. неэмбриональной стволовой, неполовой клеткой, как описано выше. MultiStem® получают способами культивирования клеток, описываемыми в этой патентной заявке, в частности, с использованием более низкой концентрации кислорода и более высокой сыворотки. MultiStem® хорошо размножаются, кариотипически нормальны и не образуют тератомы in vivo. Они могут дифференцироваться в клеточные линии нескольких зародышевых листков и могут экспрессировать один или несколько из теломеразы, oct3/4, rex-1, rox-1, sox-2 и SSEA4.
Термин "орган" можно использовать в соответствии с его общепринятым и понятным значением в этой области как целый интактный орган, удаленный у донора для трансплантации или предназначенный для удаления у донора для трансплантации реципиенту. Хотя термин "орган" особенно отмечен в этой заявке, способы используют по отношению к тканям, которые могут не составлять целые органы. Т.е. к частям органов, таким, как описывают где-либо в настоящей заявке. Таким образом, при необходимости, термином "ткань" можно соответствующим образом заменять термин "орган".
"Фармацевтически приемлемый носитель" является любой фармацевтически приемлемой средой для клеток, используемых в настоящем изобретении. Такая среда может поддерживать изотоничность, метаболизм клеток, pH и т.п. Она совместима при введении в орган и, таким образом, ее можно использовать для доставки клеток и лечения.
Термин "активность" относится к способности клеток обеспечивать эффекты, описываемые в настоящей заявке. Таким образом, активность относится к эффекту на различных уровнях, включая, в качестве неограничивающих примеров, повышение вероятности успешной трансплантации, замедление разрушения органа до трансплантации, снижение воспалительной активности в органе, обеспечение иммунологической толерантности по отношению к органу, повышение продукции противовоспалительных цитокинов в органе, повышение наличия нейропротекторных T-клеток в органе, снижение наличия реактивных T-клеток в органе, снижение уровня провоспалительных цитокинов в органе, снижение эффектов гипоксии в органе, реверсирование уровня отека в органе и снижение эффектов гипотермии в органе. Повреждение, возникающее при удалении, консервации и трансплантации, происходит, в основном, в результате ишемии и гипотермии. Они могут влиять на органы различными способами. Их описывают в ссылке Medscape, процитированной выше, и в настоящей заявке приведена ссылка на нее. Согласной этой ссылке, механизмы повреждения ткани включают утрату целостности структуры клеток, нарушение ионной композиции клетки, нарушение образования АТФ, и в результате реперфузии повреждение может происходить в течение реперфузии в результате токсического накопления свободных радикалов кислорода.
Что касается целостности структуры клетки, она может нарушаться в результате утраты структурной целостности мембраны клетки. Поддержание целостности мембраны клетки зависит от контроля температуры, pH, осмоляльности. Ишемия органа и консервация нарушают все эти параметры.
"Примордиальные эмбриональные половые клетки" (PG- или EG-клетки) можно культивировать и стимулировать для получения многих менее дифференцированных типов клеток.
"Клетки-предшественники" являются клетками, образующимися при дифференцировке стволовой клетки, имеющей некоторые, но не все, характеристики их терминально-дифференцированного потомства. Определенные клетки-предшественники, такие как "сердечные клетки-предшественники", коммитированы по отношению к линии, но не к конкретному или терминально-дифференцированному типу клеток. Термин "предшественник", как используют в аббревиатуре "MAPC", не ограничивает эти клетки конкретной линией. Клетка-предшественник может образовывать клетку-потомство, более высокодифференцированную, чем клетка-предшественник.
В рамках изобретения, термин "снижает" означает предотвращение, а также снижение. В отношении лечения органа, "снижать" - это предотвращать или ослаблять отторжение органа. Это включает причины или симптомы отторжения органа. Это применяют, например, по отношению к основополагающей биологической причине отторжения, например, улучшение вредных воздействий воспаления.
"Селекция" клетки с желаемым уровнем активности может означать идентификацию (например, посредством анализа), выделение и наращивание клеток. С помощью нее можно получать популяцию, имеющую более высокую активность, чем родительская популяция клеток, из которой клетку выделяли. "Родительская" популяция клеток относится к родительским клеткам, из которых делились выбранные клетки. "Родительский" относится к точной взаимосвязи P1 → F1 (т.е. клетке-потомству). Таким образом, если клетку X выделяют из смешанной популяции клеток X и Y, в которой X является экспрессором, а Y - нет, нельзя классифицировать всего лишь изолят X как имеющий повышенную экспрессию. Но, если клетка-потомство X является более высоким экспрессором, можно классифицировать клетку-потомство как имеющую повышенную экспрессию.
Выбор клетки, обеспечивающей желаемый эффект, будет включать анализ для определения того, обеспечивают ли клетки желаемый эффект, а также будет включать получение этих клеток. Клетка может от природы обеспечивать желаемый эффект в том смысле, что эффект не обеспечивается экзогенным трансгеном/ДНК. Но эффективную клетку можно улучшать посредством инкубации или подвергания воздействию средства, повышающего эффект. Популяция клеток, из которой выбирают эффективную клетку, может быть известна в качестве имеющей активность до осуществления анализа. Клетка может не быть известна в качестве обеспечивающей желаемый эффект до осуществления анализа. Т.к. эффект может зависеть от экспрессии гена и/или секреции, также можно выбирать клетки с учетом одного или нескольких генов, вызывающих эффект.
Селекцию можно осуществлять из клеток в ткани. Например, в этом случае клетки будут выделять из желаемой ткани, наращивать в культуре, выбирать по обеспечению желаемого эффекта и дополнительно наращивать выбранные клетки.
Селекцию также можно осуществлять из клеток ex vivo, таких как клетки в культуре. В этом случае одну или несколько клеток в культуре будут анализировать на обеспечение желаемого эффекта, и можно дополнительно наращивать полученные клетки, обеспечивающие желаемый эффект.
Клетки также можно выбирать по повышенной способности обеспечивать желаемый эффект. В этом случае популяция клеток, из которой получают улучшенную клетку, уже имеет желаемый эффект. Усиленный эффект означает более высокое среднее количество на клетку, чем в родительской популяции.
Родительская популяция, из которой выбирают улучшенную клетку, может являться, по существу, гомогенной (один тип клеток). Одним из путей получения такой улучшенной клетки из этой популяции, является получение отдельных клеток или совокупностей клеток и анализ этих клеток или совокупностей клеток для получения клонов, от природы имеющих усиленный (больший) эффект (в противоположность обработке клеток модулятором, индуцирующим или повышающим эффект), а затем наращивание этих клеток, улучшенных от природы.
Однако клетки можно обрабатывать одним или несколькими средствами, которые будут индуцировать или повышать эффект. Таким образом, по существу, гомогенные популяции можно обрабатывать для усиления эффекта.
Если популяция не является, по существу, гомогенной, то предпочтительно, чтобы родительская популяция клеток, подлежащая обработке, содержала по меньшей мере 100 из желаемого типа клеток, у которых ищут усиленный эффект, более предпочтительно - по меньшей мере 1000 клеток, и еще более предпочтительно - по меньшей мере 10000 клеток. После обработки эту субпопуляцию можно выделять из гетерогенной популяции известными способами селекции клеток и, при желании, дополнительно наращивать.
Таким образом, желаемые уровни эффекта могут быть выше уровней в указанной предшествующей популяции. Например, клетки, помещаемые в первичную культуру из ткани и наращиваемые и выделяемые с помощью условий культивирования, не предназначенных специально для получения эффекта, могут представлять родительскую популяцию. Такую родительскую популяцию можно обрабатывать для усиления среднего эффекта на клетку или подвергать скринингу на клетку или клетки в популяции, демонстрирующие эффект более высокой степени без умышленной обработки. Затем такие клетки можно наращивать для получения популяции с более высокой (желаемой) экспрессией.
"Самоподдержание" стволовой клетки относится к способности образовывать реплицированные дочерние стволовые клетки, имеющие дифференцировочный потенциал, идентичный тем клеткам, из которых они образовывались. Аналогичным термином, используемым в этом контексте, является "пролиферация".
Термин "стволовая клетка" означает клетку, которая может подвергаться самоподдержанию (т.е. потомству с тем же дифференцировочным потенциалом), а также образовывать клетки-потомство, более ограниченные по дифференцировочному потенциалу. В контексте изобретения стволовая клетка также будет включать более дифференцированную клетку, подвергнутую дедифференцировке, например, в результате ядерного переноса, в результате слияния с более незрелой стволовой клеткой, в результате встраивания конкретных факторов транскрипции или в результате культивирования в конкретных условиях. См., например, Wilmut et al., Nature, 385:810-813 (1997); Ying et al, Nature, 416:545-548 (2002); Guan et al, Nature, 440: 1199-1203 (2006); Takahashi et al., Cell, 126:663-676 (2006); Okita et al., Nature, 448:313-317 (2007); и Takahashi et al, Cell, 131:861-872 (2007).
Дедифференцировку также может вызывать введение конкретных соединений или воздействие физического окружения in vitro или in vivo, которое будет вызывать дедифференцировку. Стволовые клетки также можно получать из аномальной ткани, такой как тератокарцинома, и некоторых других источников, таких как эмбриоидные тельца (хотя их можно считать эмбриональными стволовыми клетками в том смысле, что их получают из эмбриональной ткани, хотя и не напрямую из внутренней клеточной массы). Стволовые клетки также можно получать, встраивая гены, ассоциированные с функционированием стволовых клеток, в нестволовую клетку, такую как индуцированная плюрипотентная стволовая клетка.
Термин "индивидуум" означает позвоночного, такого как млекопитающее, такого как человек. Млекопитающие включают, в качестве неограничивающих примеров, людей, собак, кошек, лошадей, коров и свиней.
Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству средства, определенному как приводящее к какому-либо терапевтическому ответу у млекопитающего. Например, эффективные противовоспалительные терапевтические средства могут пролонгировать выживаемость пациента и/или ингибировать очевидные клинические симптомы. Способы лечения, являющиеся терапевтически эффективными в значении термина, в рамках изобретения, включают способы лечения, улучшающие качество жизни индивидуума, даже если они не улучшают исход заболевания сам по себе. Специалист в этой области легко определит такие терапевтически эффективные количества. Таким образом, термин "лечить" означает доставлять такое количество. Таким образом, лечение может предотвращать или улучшать любые патологические симптомы.
Термин "толеризация" или "толеризировать" относится к обработке органа перед трансплантацией (трансплантата) стволовыми клетками для снижения иммуногенности трансплантата, чтобы сделать возможной толерантность реципиента к органу или облегчить ее развитие. Термин в широком смысле относится к концепции снижения иммуногенности трансплантируемого органа, делающего возможной толерантность у реципиента или способствующего ее развитию. Таким образом, толеризация органа делает орган переносимым реципиентом. Другими словами, термин может относиться к тому, чтобы сделать иммунную систему неспособной вызывать иммунный ответ на клетку или ткань, в норме вызывающие иммунный ответ. Примером этого является секреция T-регуляторной клеткой факторов, супрессирующих активированную T-клетку таким образом, что она больше не может секретировать провоспалительные цитокины.
Это можно осуществлять с помощью обработки ex vivo перед трансплантацией или даже с помощью местного введения до забора.
Термины "лечить" или "лечение" используют в широком смысле в отношении изобретения, и каждый такой термин включает, среди прочего, профилактику, улучшение, ингибирование или излечение недостаточности, дисфункции, заболевания или другого вредного процесса, включая те, которые мешают терапии и/или являются ее результатом.
Термин "проверять" означает подтверждение. В контексте изобретения подтверждают, что клетка является экспрессором с желаемой активностью. Таким образом, затем эту клетку можно использовать (в лечении, банкировании, скрининге лекарственных средств и т.д.) с разумным ожиданием эффективности. Таким образом, проверять означает подтверждать, что клетки, которые, как исходно обнаруживали, имеют/получены в качестве имеющих желаемую активность, фактически, сохраняют активность. Таким образом, валидация является событием проверки в процессе с двумя событиями, включающем исходное определение и последующее определение. Второе событие в настоящем описании обозначают как "валидация".
Стволовые клетки
Настоящее изобретение можно осуществлять на практике, предпочтительно, с использованием стволовых клеток вида позвоночных, такого как люди, не являющиеся человеком приматы, домашние животные, сельскохозяйственные животные и другие неотносящиеся к человеку млекопитающие. Они включают, в качестве неограничивающих примеров, клетки, описываемые ниже.
Эмбриональные стволовые клетки
Наиболее хорошо изученной стволовой клеткой является эмбриональная стволовая клетка (ESC), т.к. она обладает неограниченным самоподдержанием и мультипотентным дифференцировочным потенциалом. Эти клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты, или их можно получать из примордиальных половых клеток постимплантационного эмбриона (эмбриональные половые клетки или EG-клетки). ES- и EG-клетки впервые получили из мыши, а позднее из многих других животных, а недавно также из не являющихся человеком приматов и людей. При встраивании в бластоцисты мыши или бластоцисты других животных ESC могут вносить свой вклад во все ткани животного. ES- и EG-клетки можно идентифицировать по положительному окрашиванию с использованием антител против SSEA1 (мышь) и SSEA4 (человек). См., например, патенты США №№ 5453357; 5656479; 5670372; 5843780; 5874301; 5914268; 6110739 6190910; 6200806; 6432711; 6436701, 6500668; 6703279; 6875607; 7029913; 7112437; 7145057; 7153684; и 7294508, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в качестве руководства по эмбриональным стволовым клеткам и способам их получения и наращивания. Таким образом, ESC и способы их выделения и наращивания хорошо известны в этой области.
Идентифицирован ряд факторов транскрипции и экзогенных цитокинов, влияющих на статус активности эмбриональных стволовых клеток in vivo. Первым описываемым фактором транскрипции, вносящим вклад в плюрипотентность стволовой клетки, является Oct4. Oct4 принадлежит к семейству факторов транскрипции POU (Pit-Oct-Unc) и является ДНК-связывающим белком, способным активировать транскрипцию генов, содержащим октамерную последовательность, названную "октамерный мотив" в области промотора или энхансера. Oct4 экспрессируется во время стадии расщепления оплодотворенной зиготы до образования зародышевого цилиндра. Функцией Oct3/4 является репрессия индуцирующих дифференцировку генов (т.е. FoxaD3, hCG) и активация генов, способствующих плюрипотентности (FGF4, Utfl, Rel). Sox2, член факторов транскрипции из группы белков с высокой подвижностью (HMG), взаимодействует с Oct4 для активации транскрипции генов, экспрессирующихся во внутренней клеточной массе. Важно, чтобы экспрессия Oct3/4 в эмбриональных стволовых клетках поддерживалась между конкретными уровнями. Гиперэкспрессия или негативная регуляция >50% уровня экспрессии Oct4 будет изменять направление развития эмбриональной стволовой клетки с образованием примитивной эндодермы/мезодермы или трофэктодермы, соответственно. In vivo эмбрионы с недостаточностью Oct4 развиваются до стадии бластоцисты, но клетки внутренней клеточной массы не являются плюрипотентными. Вместо этого они дифференцируются в направлении экстраэмбриональной трофобластной линии. Sall4, фактор транскрипции Spalt млекопитающих, является вышележащим регулятором Oct4 и, таким образом, важен для поддержания соответствующих уровней Oct4 в течение ранних фаз эмбрионального развития. Если уровни Sall4 опускаются ниже конкретного порога, трофэктодермальные клетки будут размножаться эктопически во внутренней клеточной массе. Другим фактором транскрипции, необходимым для плюрипотентности, является Nanog, названный в честь кельтского племени "Tir Nan Og": "земля вечно молодых". In vivo Nanog экспрессируется со стадии компактной морулы, впоследствии определяется во внутренней клеточной массе и негативно регулируется к стадии имплантации. Негативная регуляция Nanog может быть важна для избежания неконтролируемого размножения плюрипотентных клеток и чтобы сделать возможной многолинейную дифференцировку в течение гаструляции. Эмбрионы без Nanog, выделенные в день 5,5, состоят из неорганизованной бластоцисты, в основном, содержащей экстраэмбриональную эндодерму, но без различимого эпибласта.
Неэмбриональные стволовые клетки
Стволовые клетки идентифицированы в большинстве тканей. Вероятно, лучше всего охарактеризованной является гематопоэтическая стволовая клетка (HSC). HSC являются клетками, происходящими из мезодермы, их можно выделять с использованием поверхностных клеточных маркеров и функциональных характеристик. Их выделяют из костного мозга, периферической крови, пуповинной крови, зародышевой печени и желточного мешка. Они инициируют гемопоэз и образуют множество гематопоэтических линий. При трансплантации летально облученным животным они могут репопулировать эритроидный, нейтрофил-макрофагальный, мегакариоцитарный и лимфоидный пул гематопоэтических клеток. Также можно индуцировать несколько их самоподдерживающих делений клеток. См., например, патенты США №№ 5635387; 5460964; 5677136; 5750397; 5681599 и 5716827. В патенте США № 5192553 описывают способы выделения неонатальных или фетальных гематопоэтических стволовых клеток или клеток-предшественников человека. В патенте США № 5716827 описывают гематопоэтические клетки человека, являющиеся Thy-1+ предшественниками, и соответствующие среды для выращивания для регенерации их in vitro. В патенте США № 5635387 описывают способ и устройство для культивирования гематопоэтических клеток человека и их предшественников. В патенте США № 6015554 описывают способ восстановления лимфоидных и дендритных клеток человека. Таким образом, HSC и способы их выделения и наращивания хорошо известны в этой области.
Другой стволовой клеткой, хорошо известной в этой области, является нейрональная стволовая клетка (NSC). Эти клетки могут пролиферировать in vivo и непрерывно регенерировать, по меньшей мере, некоторые нервные клетки. При культивировании ex vivo нейрональные стволовые клетки можно индуцировать для пролиферации, а также дифференцировки в различные типы нейронов и глиальных клеток. При трансплантации в головной мозг нейрональные стволовые клетки могут приживаться и давать начало нейронам и глиальным клеткам. См., например, Gage F.H., Science, 287:1433-1438 (2000), Svendsen S.N. et al., Brain Pathology, 9:499-513 (1999), и Okabe S. et al, Mech Development, 59:89-102 (1996). В патенте США № 5851832 описывают мультипотентные нейрональные стволовые клетки, полученные из ткани головного мозга. В патенте США № 5766948 описывают получение нейробластов из полушарий головного мозга новорожденного. В патентах США №№ 5564183 и 5849553 описывают применение стволовых клеток нервного гребня млекопитающего. В патенте США № 6040180 описывают получение in vitro дифференцированных нейронов из культур мультипотентных стволовых клеток ЦНС млекопитающего. В WO 98/50526 и WO 99/01159 описывают получение и выделение нейроэпителиальных стволовых клеток, предшественников олигодендроцитов-астроцитов и линиеспецифичных нейрональных предшественников. В патенте США № 5968829 описывают нейрональные стволовые клетки, полученные из эмбрионального переднего мозга. Таким образом, нейрональные стволовые клетки и способы их получения и наращивания хорошо известны в этой области.
Другой стволовой клеткой, интенсивно исследуемой в этой области, является мезенхимальная стволовая клетка (MSC). MSC получают из эмбриональной мезодермы, и их можно выделять из многих источников, включая, среди прочего, костный мозг взрослого, периферическую кровь, жировую ткань, плаценту и пуповинную кровь. MSC могут дифференцироваться во многие мезодермальные ткани, включая мышцы, кости, хрящи, жировую ткань и сухожилие. Существует большое количество работ на тему этих клеток. См., например, патенты США №№ 5486389; 5827735; 5811094; 5736396; 5837539; 5837670 и 5827740. См. также Pittenger, M. et al, Science, 284:143-147 (1999).
Другим примером зрелой стволовой клетки являются стволовые клетки жировой ткани взрослых (ADSC), выделенные из жировой ткани, как правило, посредством липосакции с последующим высвобождением ADSC с использованием коллагеназы. ADSC во многом схожи с MSC, полученными из костного мозга, за исключением того, что из жировой ткани можно выделять гораздо больше клеток. Сообщают, что эти клетки дифференцируются в костную ткань, жировую ткань, мышцы, хрящи и нейроны. Способ выделения описывают в патентной публикации США № 2005/0153442 A1.
Другие стволовые клетки, известные в этой области включают желудочно-кишечные стволовые клетки, эпидермальные стволовые клетки и печеночные стволовые клетки, также обозначаемые как "овальные клетки" (Potten, C, et al., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:821-830 (1998), Watt, F., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:831 (1997); Alison et al., Hepatolog, 29:678-683 (1998).
Другие неэмбриональные клетки, которые, как сообщают, способны дифференцироваться в типы клеток нескольких эмбриональных зародышевых листков, включают, в качестве неограничивающих примеров, клетки из пуповинной крови (см. патентную публикацию США № 2002/0164794), плаценты (см. патентную публикацию США № 2003/0181269), матрикса пуповины (Mitchell, K.E. et al., Stem Cells, 21:50-60 (2003)), небольшие эмбрионально-подобные стволовые клетки (Kucia, M. et al., J Physiol Pharmacol, 57 Suppl 5:5-18 (2006)), стволовые клетки амниотической жидкости (Atala, A., J Tissue Regen Med, 1:83-96 (2007)), клетки-предшественники, полученные из кожи (Toma et al, Nat Cell Biol, 3:778-784 (2001)), костный мозг (см. патентные публикации США №№ 2003/0059414 и 2006/0147246), выделенные из костного мозга взрослые мультилинейные индуцибельные клетки (MIAMI) (см. PCT US2004/002580) и клетки эндометрия (см. патентную публикацию США № 2013/0156726), каждая из ссылок включена в настоящее описание в качестве ссылки в качестве руководства по этим клеткам.
Стратегии перепрограммирования соматических клеток
Для индуцирования преобразования дифференцированных клеток в эмбриональное состояние используют несколько различных стратегий, таких как ядерная трансплантация, слияние клеток и индуцируемое культивированием перепрограммирование. Ядерный перенос включает инъекцию соматического ядра в энуклеированный ооцит, который после переноса в суррогатную мать может давать начало клону ("репродуктивное клонирование") или после эксплантации в культуре может давать начало генетически соответствующим эмбриональным стволовым клеткам (ES) ("перенос ядра соматической клетки", SCNT). Слияние соматических клеток с ES-клетками приводит к образованию гибридов, проявляющих все черты плюрипотентных ES-клеток. При эксплантации соматических клеток в культуре осуществляют селекцию иммортализованных клеточных линий, которые могут являться плюрипотентными или мультипотентными. К настоящему моменту, сперматогониальные стволовые клетки являются единственным источником плюрипотентных клеток, которые можно получать из постнатальных животных. Посредством трансдукции соматических клеток с использованием определенных факторов можно инициировать перепрограммирование в плюрипотентное состояние. Эти экспериментальные подходы подробно рассмотрены (Hochedlinger and Jaenisch, Nature, 441: 1061-1067 (2006) и Yamanaka, S., Cell Stem Cell, 1:39-49 (2007)).
Ядерный перенос
Ядерная трансплантация (NT), также обозначаемая как перенос ядра соматической клетки (SCNT), означает встраивание ядра из донорной соматической клетки в энуклеированный ооцит для получения клонированного животного, такого как овца Dolly (Wilmut et al., Nature, 385:810-813 (1997). Получение живых животных с помощью NT показало, что эпигенетическое состояние соматических клеток, включая терминально-дифференцированные клетки, хотя и стабильно, но не является необратимо фиксированным, и его можно перепрограммировать в эмбриональное состояние, способное направлять развитие нового организма. В дополнение к обеспечению исключительного экспериментального подхода для выявления основных эпигенетических механизмов, участвующих в эмбриональном развитии и патологии, технология ядерного клонирования представляет потенциальный интерес для персонализированной трансплантационной медицины.
Слияние соматических клеток и эмбриональных стволовых клеток
Эпигенетическое перепрограммирование соматических ядер в недифференцированное состояние показано на гибридах мыши, полученных слиянием эмбриональных клеток с соматическими клетками. Гибриды между различными соматическими клетками и клетками эмбриональной карциномы (Solter, D., Nat Rev Genet, 7:319-327 (2006), эмбриональными зародышевыми (EG) или ES-клетками (Zwaka and Thomson, Development, 132:227-233 (2005)) обладают многими чертами родительских эмбриональных клеток, что свидетельствует о том, что плюрипотентный фенотип является доминантным в таких продуктах слияния. Как и у мыши (Tada et al., Curr Biol, 11:1553-1558 (2001)), ES-клетки человека обладают потенциалом для перепрограммирования соматических ядер после слияния (Cowan et al., Science, 309:1369-1373(2005)); Yu et al., Science, 318: 1917-1920 (2006)). Активация молчащих маркеров плюрипотентности, таких как Oct4, или реактивация неактивной соматической X-хромосомы представляет молекулярное доказательство перепрограммирования соматического генома в гибридных клетках. Предполагают, что репликация ДНК необходима для активации маркеров плюрипотентности, что впервые наблюдают через 2 для после слияния (Do and Scholer, Stem Cells, 22:941-949 (2004)), и что форсированная гиперэкспрессия Nanog в ES-клетках способствует плюрипотентности при слиянии с нейрональными стволовыми клетками (Silva et al., Nature, 441:997-1001 (2006)),
Индуцируемое культивированием перепрограммирование
Плюрипотентные клетки получают из эмбриональных источников, таких как бластомеры и внутренняя клеточная масса (ICM) бластоцисты (ES-клетки), эпибласт (EpiSC-клетки), примордиальные половые клетки (EG-клетки) и постнатальные сперматогониальные стволовые клетки ("maGSCsm" "ES-подобные" клетки). Плюрипотентные клетки и их донорская клетка/ткань являются следующими: партеногенетические ES-клетки получают из ооцитов мыши (Narasimha et al, Curr Biol, 7:881-884 (1997)); эмбриональные стволовые клетки получают из бластомеров (Wakayama et al., Stem Cells, 25:986-993 (2007)); клетки внутренней клеточной массы (источник недоступен) (Eggan et al., Nature, 428:44-49 (2004)); эмбриональные зародышевые клетки и клетки эмбриональной карциномы получают из примордиальных половых клеток (Matsui et al, Cell, 70:841-847 (1992)); GMCS, maSSC, и MASC получают из сперматогониальных стволовых клеток (Guan et al., Nature, 440:1199-1203 (2006); Kanatsu-Shinohara et al, Cell, 119:1001-1012 (2004); и Seandel et al, Nature, 449:346-350 (2007); EpiSC-клетки получают из эпибластов (Brons et al, Nature, 448:191-195 (2007); Tesar et al, Nature, 448:196-199(2007)); партеногенетические ES-клетки получают из ооцитов человека (Cibelli et al, Science, 295L819 (2002); Revazova et al, Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007)); ES-клетки человека получают из бластоцисты человека (Thomson et al, Science, 282:1145-1147 (1998)); MAPC получают из костного мозга (Jiang et al, Nature, 418:41-49 (2002); Phinney and Prockop, Stem Cells, 25:2896-2902 (2007)); клетки пуповинной крови (полученные из пуповинной крови) (van de Ven et al, Exp Hematol, 35:1753-1765 (2007)); клетки, полученные из нейросферы, получают из нервной клетки (Clarke et al, Science, 288:1660-1663 (2000)). Известно, что донорские клетки из линии половых клеток, такие как PGC или сперматогониальные стволовые клетки, являются унипотентными in vivo, но показано, что плюрипотентные ES-подобные клетки (Kanatsu-Shinohara et al, Cell, 119:1001-1012 (2004) или maGSC (Guan et al, Nature, 440:1199-1203 (2006) можно выделять после длительного культивирования in vitro. В то время как большинство этих плюрипотентных типов клеток были способны к дифференцировке in vitro и образованию тератом, только ES, EG, EC и maGCS, полученные из сперматогониальных стволовых клеток, или ES-подобные клетки являлись плюрипотентными по более строгим критериям, т.к. они были способны образовывать постнатальные химеры и вносить вклад в зародышевую линию. Недавно мультипотентные взрослые сперматогониальные стволовые клетки (MASC) получили из тестикулярных сперматогониальных стволовых клеток взрослых мышей, и эти клетки имели профиль экспрессии, отличающийся от такового у ES-клеток (Seandel et al, Nature, 449:346-350 (2007)), но схожий с EpiSC-клетками, которые получали из эпибласта постимплантационных эмбрионов мыши (Brons et al, Nature, 448:191-195 (2007); Tesar et al., Nature, 448: 196-199 (2007)).
Перепрограммирование с помощью определенных факторов транскрипции
Takahashi и Yamanaka описали перепрограммирование соматических клеток обратно в ES-подобное состояние (Takahashi and Yamanaka, Cell, 126:663-676 (2006)). Они успешно перепрограммировали эмбриональные фибробласты мыши (MEF) и зрелые фибробласты в плюрипотентные ES-подобные клетки после вирусно-опосредованной трансдукции четырех факторов транскрипции Oct4, Sox2, c-myc и Klf4 с последующей селекцией для активации гена-мишени Oct4 Fbx15. Клетки, имеющие активированный Fbx15, называли iPS (индуцированными плюрипотентными стволовыми) клетками, и показано, что они являются плюрипотентными, по их способности образовывать тератомы, хотя они были неспособны образовывать живые химеры. Это плюрипотентное состояние зависело от непрерывной вирусной экспрессии трансдуцированных генов Oct4 и Sox2, в то время как эндогенные гены Oct4 и Nanog не экспрессировались или экспрессировались на более низком уровне, чем в ES-клетках, и обнаруживали, что их соответствующие промоторы являлись, в значительной степени, метилированными. Это согласуется с выводом о том, что клетки Fbx15-iPS не соответствуют ES-клеткам, а могут представлять собой неполное состояние перепрограммирования. В то время как с помощью генетических экспериментов установили, что Oct4 и Sox2 важны для плюрипотентности (Chambers and Smith, Oncogene, 23:7150-7160 (2004); Ivanona et al, Nature, 442:5330538 (2006); Masui et al., Nat Cell Biol, 9:625-635 (2007)), роль двух онкогенов c-myc и Klf4 в перепрограммировании менее ясна. Некоторые из этих онкогенов, фактически, могут являться необязательными для перепрограммирования, т.к. получали iPS-клетки мыши и человека в отсутствие трансдукции c-myc, хотя и с низкой эффективностью (Nakagawa et al, Nat Biotechnol, 26: 191-106 (2008); Werning et al, Nature, 448:318-324 (2008); Yu et al, Science, 318: 1917-1920 (2007)).
MAPC
MAPC человека описывают в патенте США № 7015037. MAPC идентифицированы у других млекопитающих. Например, MAPC мыши также описывают в патенте США № 7015037. MAPC крысы также описывают в патенте США № 7838289.
Эти ссылки включены в настоящее описание в качестве ссылок для описания MAPC, впервые выделенных Catherine Verfaillie.
Выделение и выращивание MAPC
В этой области известны способы выделения MAPC. См., например, патент США № 7015037, и эти способы, вместе с определением характеристик (фенотипа) MAPC, включены в настоящее описание в качестве ссылки. MAPC можно выделять из множества источников, включая, в качестве неограничивающих примеров, костный мозг, плаценту, пуповину и пуповинную кровь, мышцы, головной мозг, печень, спинной мозг, кровь или кожу. Таким образом, можно получать аспираты костного мозга, биоптаты головного мозга или печени и других органов и выделять клетки с использованием способов положительной или отрицательной селекции, доступных специалистам в этой области, в зависимости от генов, экспрессирующихся (или не экспрессирующихся) в этих клетках (например, с помощью функциональных или морфологических анализов, таких как описываемые в процитированных выше заявках, включенных в настоящее описание в качестве ссылок).
MAPC также получают модифицированными способами, описываемыми в Breyer et al, Experimental Hematology, 34: 1596-1601 (2006) и Subramanian et al., Cellular Programming and Reprogramming: Methods and Protocols; S. Ding (ed.), Methods in Molecular biology, 636:55-78 (2010), включенных в качестве ссылок на эти способы.
MAPC из костного мозга человека, описываемые в патенте США № 7015037
MAPC не экспрессируют общий лейкоцитарный антиген CD45 или эритробласт-специфичный гликофорин-A (Gly-A). Смешанную популяцию клеток подвергали разделению в фиколл-гипаке. Затем клетки подвергали отрицательной селекции с использованием антитела против CD45 и против Gly-A, истощая популяцию CD45+ и Gly-A+ клеток, и затем выделяли оставшиеся приблизительно 0,1% мононуклеарных клеток костного мозга. Клетки также можно помещать в покрытые фибронектином лунки и культивировать, как описано ниже, в течение 2-4 недель для истощения клеток CD45+ и Gly-A+. В культурах адгезивных клеток костного мозга многие адгезивные стромальные клетки подвергаются репликативному старению около 30 деления клеток, и более гомогенная популяция клеток продолжает размножаться и сохранять длинные теломеры.
Альтернативно, можно использовать положительную селекцию для выделения клеток с помощью комбинации клеточно-специфичных маркеров. Способы положительной и отрицательной селекции доступны специалистам в этой области, и многочисленные моноклональные и поликлональные антитела, подходящие для целей отрицательной селекции, также доступны в этой области (см., например, Leukocyte Typing V, Schlossman, et al., Eds. (1995) Oxford University Press) и являются коммерчески доступными в ряде источников.
Способы разделения клеток млекопитающего из смеси популяций клеток также описывают Schwartz, et al., в патенте США № 5759793 (магнитное разделение), Basch et al., 1983 (иммуноаффинная хроматография) и Wysocki and Sato, 1978 (активируемая флуоресценцией сортировка клеток).
Клетки можно культивировать в среде для культивирования с низким содержанием сыворотки или без сыворотки. Бессывороточную среду, используемую для культивирования MAPC, описывают в патенте США № 7015037. Общепринято используемые факторы роста включают, в качестве неограничивающих примеров, фактор роста тромбоцитов и эпидермальный фактор роста. См., например, патенты США №№ 7169610; 7109032; 7037721; 6617161; 6617159; 6372210;6224860; 6037174; 5908782; 5766951; 5397706 и 4657866; все из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в качестве руководства по выращиванию клеток в бессывороточной среде.
Дополнительные способы культивирования
В дополнительных экспериментах плотность, при которой культивируют MAPC, может варьироваться от приблизительно 100 клеток/см2 или приблизительно 150 клеток/см2 до приблизительно 10000 клеток/см2, включая от приблизительно 200 клеток/см2 до приблизительно 1500 клеток/см2, до приблизительно 2000 клеток/см2. Плотность может варьироваться в зависимости от вида. Кроме того, оптимальная плотность может варьироваться в зависимости от условий культивирования и источника клеток. Специалист в этой области может определять оптимальную плотность для указанного набора условий культивирования и клеток.
Кроме того, можно использовать эффективные концентрации атмосферного кислорода менее приблизительно 10%, включая приблизительно 1-5% и, в частности, 3-5%, в любое время в течение выделения, выращивания и дифференцировки MAPC в культуре.
Клетки можно культивировать при различных концентрациях сыворотки, например, приблизительно 2-20%. Можно использовать эмбриональную телячью сыворотку. Можно использовать более высокую концентрацию сыворотки в комбинации с более низким давлением кислорода, например, приблизительно 15-20%. Клетки не нужно подвергать селекции до адгезии к чашкам для культивирования. Например, после использования градиента фиколла клетки можно высевать напрямую, например, при 250000-500000/см2. Адгезивные колонии можно выбирать, возможно, объединять, и наращивать.
В одном из вариантов осуществления, используемом в экспериментальных способах в примерах, для культивирования клеток использовали условия высокой концентрации сыворотки (приблизительно 15-20%) и низкого кислорода (приблизительно 3-5%). Конкретно, адгезивные клетки из колоний помещали и пассировали при плотностях приблизительно 1700-2300 клеток/см2 при 18% сыворотки и 3% кислорода (с PDGF и EGF).
В варианте осуществления конкретно в случае MAPC добавками являются клеточные факторы или компоненты, позволяющие MAPC сохранять способность дифференцироваться в типы клеток нескольких эмбриональных линий, таких как все три линии. Об этом может свидетельствовать экспрессия конкретных маркеров недифференцированного состояния, таких как Oct 3/4 (Oct 3A), и/или маркеров высокой способности к размножению, таких как теломераза.
Культура клеток
В случае всех компонентов, указанных ниже, см. патент США № 7015037, включенный в настоящее описание в качестве ссылки в качестве руководства по этим компонентам.
В основном, клетки, применимые для изобретения, можно поддерживать и наращивать в среде для культивирования, доступной и хорошо известной в этой области. Также рассматривают дополнение среды для культивирования клеток сыворотками млекопитающих. Также можно использовать дополнительные добавки, преимущественно, для снабжения клеток необходимыми микроэлементами для оптимального роста и размножения. Предпочтительно, в культивировании клеток также можно использовать гормоны. Для дополнения сред для культивирования клеток также можно использовать липиды и липидные носители, в зависимости от типа клетки и направления развития дифференцированной клетки. Также рассматривают использование слоев фидерных клеток.
Клетки в культуре можно поддерживать в суспензии или прикрепленными к твердой подложке, такой как компоненты внеклеточного матрикса. Для стволовых клеток часто необходимы дополнительные факторы, способствующие их прикреплению к твердой подложке, такие как коллаген типа I и типа II, хондроитинсульфат, фибронектин, "суперфибронектин" и фибронектин-подобные полимеры, желатин, поли-D- и поли-L-лизин, тромбоспондин и витронектин. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используют фибронектин. См., например, Ohashi et al., Nature Medicine, 13:880-885 (2007); Matsumoto et al, J Bioscience and Bioengineering, 105:350-354 (2008); Kirouac et al., Cell Stem Cell, 3:369-381 (2008); Chua et al., Biomateriah, 26:2537-2547 (2005); robinskaya et al, Stem Cells, 26:2245-2256 (2008); Dvir-Ginzberg et al, FASEB J, 22:1440-1449 (2008); Turner et al, J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater, 82B: 156-168 (2007); и Miyazawa et al, Journal of Gastroenterology and Hepatology, 22: 1959-1964 (2007)).
Клетки также можно выращивать в "3D" (агрегированных) культурах. См. пример в PCT US2009/31528, зарегистрированной 21 января 2009 года.
После выращивания в культуре клетки можно использовать свежими или замороженными и хранить в виде замороженных стоков с использованием, например, DMEM с 40% FCS и 10% DMSO. Другие способы получения замороженных стоков для культивированных клеток также доступны специалистам в этой области.
Фармацевтические составы
Патент США № 7015037 включен в настоящее описание в качестве ссылки в качестве руководства по фармацевтическим составам. В определенных вариантах осуществления популяции клеток находятся в композиции, адаптированной и подходящей для доставки, т.е. физиологически совместимой.
Составы будут ориентированы на степень желаемого эффекта, такого как снижение воспаления, снижение апоптоза, отека и т.д., положительная регуляция конкретных факторов и т.д.
В некоторых вариантах осуществления чистота клеток для введения в орган составляет приблизительно 100% (по существу, гомогенные). В других вариантах осуществления она составляет от 95% до 100%. В некоторых вариантах осуществления она составляет от 85% до 95%. В частности, в случае смесей с другими клетками процентная доля может составлять приблизительно 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90% или 90%-95%. Или чистоту выделения можно выражать в терминах делений клеток, где клетки подвергают, например, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 или более делениям клеток.
Выбор состава для введения клеток будет зависеть от множества факторов. Главными среди них будут вид донора/реципиента, природа органа, подвергаемого лечению, природа другой терапии и вводимых средств, оптимальный путь введения, выживаемость эффективным путем, схема дозирования и другие факторы, которые будут очевидны специалистам в этой области. Например, выбор подходящих носителей и других добавок будет зависеть от конкретного пути введения и природы конкретной лекарственной формы.
Конечные составы водной суспензии клеток/среды, как правило, будут включать коррекцию ионной силы суспензии до изотоничности (т.е. от приблизительно 0,1 до 0,2) и физиологического pH (т.е. приблизительно pH от 6,8 до 7,5). Кроме того, конечный состав, как правило, будет содержать жидкое смазочное средство.
Специалисты в этой области легко могут определять количество клеток и необязательные добавки, наполнители и/или носитель в композициях, подлежащих введению в способах по изобретению. Как правило, любые добавки (в дополнение к клеткам) присутствуют в количестве от 0,001 до 50% масс. в растворе, таком как фосфатно-солевой буфер. Активный ингредиент присутствует в порядке от микрограммов до миллиграммов, например, от приблизительно 0,0001 до приблизительно 5% масс., предпочтительно - от приблизительно 0,0001 до приблизительно 1% масс., наиболее предпочтительно - от приблизительно 0,0001 до приблизительно 0,05% масс. или от приблизительно 0,001 до приблизительно 20% масс., предпочтительно - от приблизительно 0,01 до приблизительно 10% масс., и наиболее предпочтительно - от приблизительно 0,05 до приблизительно 5% масс.
В некоторых вариантах осуществления клетки инкапсулируют для введения, в частности, когда инкапсулирование повышает эффективность или обеспечивает преимущества в отношении эксплуатации и/или срока годности. Клетки можно инкапсулировать с помощью мембран, а также капсул. Предполагают, что можно использовать любой из множества доступных способов инкапсулирования клеток.
В различных вариантах осуществления для микрокапсулирования клеток можно использовать широкий спектр материалов. Такие материалы включают, например, полимерные капсулы, альгинат-поли-L-лизин-альгинатные микрокапсулы, капсулы поли-L-лизин-альгината бария, капсулы альгината бария, полые волокна из полиакрилонитрила/поливинилхлорида (PAN/PVC) и полые волокна из полиэфирсульфона (PES).
Способы микрокапсулирования клеток, которые можно использовать для введения клеток, известны специалистам в этой области и описаны, например, в Chang, P., et al, 1999; Matthew, H.W., et al, 1991; Yanagi, K., et al, 1989; Cai Z.H., et al, 1988; Chang, T.M., 1992 и в патенте США № 5639275 (в котором, например, описывают биосовместимую капсулу для длительного поддержания клеток, стабильно экспрессирующих биологически активные молекулы). Дополнительные способы инкапсулирования приведены в европейской патентной публикации № 301777 и патентах США №№ 4353888; 4744933; 4749620; 4814274; 5084350; 5089272; 5578442; 5639275 и 5676943. Все из указанных выше источников включены в настоящее описание в качестве ссылок в частях, относящихся к инкапсулированию клеток.
В конкретных вариантах осуществления клетки включают в полимер, такой как биополимер или синтетический полимер. Примеры биополимеров включают, в качестве неограничивающих примеров, фибронектин, фибрин, фибриноген, тромбин, коллаген и протеогликаны. В полимер также можно включать другие факторы, такие как цитокины, обсуждаемые выше. В других вариантах осуществления изобретения клетки можно включать в пустоты трехмерного геля. Большой полимер или гель, как правило, будут имплантировать хирургически. Полимер или гель, который можно составлять в достаточно небольших частицах или волокнах, можно вводить другими общепринятыми, более удобными, нехирургическими путями.
Дозировка клеток будет варьироваться в широких пределах и будет соответствовать индивидуальным требованиям в каждом конкретном случае. Количество клеток будет варьироваться в зависимости от типа, массы и состояния органа, количества или частоты введений и других переменных, известных специалистам в этой области. Клетки можно вводить путем, подходящим для ткани или органа. Примеры подходящих путей доставки могут включать интратрахеальную доставку (например, в случае легкого), внутривенную доставку, внутриартериальную доставку (например, внутрикоронарную), прямую инъекцию в орган и доставку в лимфатическую систему.
Клетки можно суспендировать в подходящем эксципиенте в концентрации от приблизительно 0,01 до 1×105 клеток/мл, от приблизительно 1×105 клеток/мл до 10×106 клеток/мл или от приблизительно 10×106 клеток/мл до 5×107 клеток/мл. Подходящими эксципиентами являются те, которые биологически и физиологически совместимы с клетками и с органом реципиента, такие как забуференный физиологический раствор или другие подходящие эксципиенты. Композицию для введения можно составлять, получать и хранить стандартными способами, соблюдая надлежащую стерильность и стабильность.
Дозировка
Дозы (т.е. количество клеток) для людей или других млекопитающих специалисты в этой области могут определять без излишнего экспериментирования с помощью этого описания, документов, процитированных в настоящем описании, и познаний в этой области. Оптимальная доза, подлежащая использованию в соответствии с различными вариантами осуществления изобретения, будет зависеть от множества факторов, включая следующие: подлежащее лечению заболевание и его стадия; вид донора, состояние его здоровья, пол, возраст, массу и уровень метаболизма; иммунокомпетентность донора; другие вводимые терапевтические средства; и ожидаемые потенциальные осложнения исходя из анамнеза или генотипа донора. Параметры также могут включать: являются ли клетки сингенными, аутологичными, аллогенными или ксеногенными; их активность; участок и/или распределение, которые должны быть целью; и такие характеристики участка, как доступность для клеток. Дополнительные параметры включают совместное введение с другими факторами (такими как факторы роста и цитокины). Оптимальная доза в указанной ситуации также будет зависеть от способа составления клеток, способа их введения (например, перфузии, внутриорганного введения и т.д.) и степени, с которой клетки будут локализоваться в целевых участках после введения.
В конечном итоге, уровни доз, режим и частоту будут определять по эффективности. Ее будут измерять по состоянию здоровья и жизнеспособности органа и, возможно, по функционированию органа и клиническим показателям после трансплантации. Такие показатели будут варьироваться в зависимости от органа. В одном из вариантов осуществления они могут включать показатели функционирования органа. Можно оценивать показатели жизнеспособности органа для трансплантации с помощью клинической литературы. В другом варианте осуществления для определения эффективности можно анализировать (например, с использованием qPCR) уровни или профили конкретных маркеров (например, уровни мРНК в ткани, уровни цитокинов и количества воспалительных клеток). Например, для определения эффективности можно анализировать уровень мРНК ИЛ-10 из легочной ткани с помощью qPCR. В другом примере можно оценивать дозу в легком по воздействию на: уровни цитокинов; другие маркеры воспаления в жидкостях (например, полученных посредством бронхоальвеолярного лаважа); уровни отека; гемодинамические и дыхательные показатели; и оценку газообмена в реперфузируемых легких ex vivo.
В различных вариантах осуществления клетки/среду можно вводить в начальной дозе, а затем поддерживать посредством дополнительного введения. Клетки можно вводить исходно одним способом, а затем вводить тем же способом или одним или несколькими различными способами. Уровни можно поддерживать с помощью непрерывного введения клеток/среды. В различных вариантах осуществления клетки вводят исходно, или для поддержания их уровня у индивидуума, или для того и другого, посредством внутривенной инъекции. Во многих вариантах осуществления используют другие формы введения в зависимости от типа и состояния органа и других факторов, обсуждаемых где-либо в настоящем описании.
Клетки/среду можно вводить с различной частотой в течение широкого диапазона периодов времени. Как правило, длительность лечения будет пропорциональна длительности сбора и транспортировки, эффективности используемых способов терапии и состоянию и ответу органа, подвергаемого лечению.
В других вариантах осуществления клетки можно вводить (например, посредством внутривенной, внутриартериальной, интратрахеальной, прямой инъекции и т.д.) индивидууму-донору перед забором органа. В зависимости от пути введения, клетки можно вводить в течение подходящего периода времени (например, от минут до приблизительно 1-4 часов, приблизительно 4-8 часов, приблизительно 8-12 часов, приблизительно 12-16 часов, приблизительно 16-20 часов, приблизительно 20-24 часов). Орган можно забирать общепринятыми хирургическими способами после периода времени. После забора клетки приводят в контакт (например, незамедлительно приводят в контакт) с органом в течение периода времени, достаточного, чтобы позволить клеткам распределиться по всему органу (например, менее приблизительно 1 часа, приблизительно 1-2 часа, приблизительно 2-3 часа, приблизительно 3-4 часа). Клетки можно приводить в контакт с органом посредством инфузии и/или погружения органа в резервуар, содержащий клетки. Затем орган можно хранить на льду и/или подключать к системе реперфузии, после чего орган доставляют в место проведения трансплантации.
После прибытия в место проведения трансплантации орган можно помещать в систему реперфузии (если этого еще не было сделано), содержащую клетки. Затем можно проводить инфузию клеток в орган в течение периода времени (например, менее приблизительно часа, приблизительно 1-2 часа, приблизительно 2-3 часа, приблизительно 3-4 часа) в зависимости от органа и системы реперфузии. В течение трансплантации клетки можно приводить в контакт с органом посредством инфузии реципиенту (например, внутривенно), прямой инъекции в орган и/или прямого нанесения на поверхность органа. Инфузию можно осуществлять, например, перед закрытием приносящих и выносящих сосудов органа. При трансплантации печени, например, клетки можно подвергать инфузии в воротную вену печени перед присоединением вены к трансплантированной печени. Дополнительно или альтернативно, клетки можно доставлять в орган после трансплантации (например, после закрытия приносящих и выносящих сосудов органа) в течение подходящего периода времени (например, от минут до приблизительно 1-4 часов, приблизительно 4-8 часов, приблизительно 8-12 часов, приблизительно 12-16 часов, приблизительно 16-20 часов, приблизительно 20-24 часов) в зависимости от системы доставки и органа.
Композиции
Изобретение также относится к популяциям клеток с конкретными активностями для обеспечения любого из эффектов, представленных в настоящем описании. Как описано выше, эти популяции получают посредством селекции на предмет клеток, имеющих желаемую активность. Эти популяции используют для получения других композиций, например, банка клеток, содержащего популяции с конкретными желаемыми активностями, и фармацевтических композиций, содержащих популяцию клеток с конкретной желаемой активностью.
ПРИМЕРЫ
Способы
Забор легкого и перфузия ex vivo
После получения разрешения на исследование от местного Organ Procurement Agency, LifeGift, для настоящего исследования приобретали отбракованные донорские легкие в соответствии с установленным протоколом IRB в Houston Methodist (IRB(2)111 1-0205). Легкие от каждого из пяти пациентов приобретали стандартным образом с использованием антеградного Perfadex (Vitrolife AB, Gothenburg, Sweden) с притоком 60 мл/кг с ретроградной перфузией Perfadex через легочные вены. Затем легкие хранили в пластиковых мешках, содержащих 1 литр Perfadex, и хранили на льду в течение транспортировки. Затем, после транспортировки легких в Houston Methodist, их хранили в холодильной камере при 4°C всего в течение 8 часов холодового статического хранения для индукции холодового ишемического повреждения.
Перфузию легкого ex vivo (EVLP) осуществляли с использованием CE-маркированного Vivoline LSI (Vivoline Medical AB, Lund, Sweden) (фиг. 1) (Wierup, P. et al., Ann Thorac Surg 2006;81(2):460-6; Ingemansson, R. et al., Ann Thorac Surg 2009;87(1):255-60; и Cypel, M. et al., N Engl J Med 2011;364(15):1431-40). Систему заправляли 2,5 л раствора Steen (XVIVO Perfusion). Избегали использования отмытых эритроцитов или крови для снижения количества переменных в анализе осуществимости. В перфузат добавляли 100 мг меропенема (AstraZeneca AB, Sodertalje, Sweden) и 10000 ед. гепарина (LEO Pharmaceutical, Copenhagen, Denmark). Перед присоединением легких к модулю EVLP pH раствора доводили до 7,35-7,45 с использованием трометамола (Addex-THAM, Fresenius Kabi AB, Uppsala, Sweden). В одном случае, когда также получали сердце, с помощью Dacron Graft накладывали швы на разделенные ветви легочной артерии для восстановления целостности легочной артерии (PA) и облегчения присоединения легкого к циклу EVLP. Трахею соединяли с механическим вентилятором с помощью силиконовой трубки размера, совпадающего с диаметром трахеи. В левое предсердие помещали температурный зонд. Сначала, для удаления воздуха из цикла легкие перфузировали при скорости потока 0,5 л/мин. Шунт для удаления воздуха на входной канюле держали открытым до достижения температуры органа 32°C, а затем закрывали на оставшуюся часть процедуры. Затем поток повышали до 100% предполагаемого сердечного выброса для конкретного набора легких. Затем легкие нагревали в течение 30 минут до заданных 36°C и не позволяли разнице температур между притоком и оттоком крови в легких превышать 8°C. Затем скорость потока постепенно повышали до заданного уровня 70 мл/мин на килограмм массы донора, в течение чего непрерывно измеряли давление PA и ограничивали его 15 мм рт.ст. Повторного нагревания достигали в течение 20-30 минут. Когда температура перфузата достигала 32°C, начинали механическую вентиляцию с контролем объема при исходном дыхательном объеме 3 мл на килограмм массы донора с уровнем положительного давления конца выдоха (PEEP) 5 см H2O, частотой 7-10 вдохов/мин и FiO2 0,5. Затем дыхательный объем постепенно повышали до максимума 7 мл на килограмм массы донора. Образцы перфузата для анализов газов крови забирали через специальный порт системы.
Клетки
MAPC, полученные из костного мозга человека (Human MultiStem®, Athersys Inc., Cleveland) выделяли из одного аспирата костного мозга, полученного у здорового донора при его согласии, и обрабатывали согласно описанным ранее способам (Perm, MS et al., Circ Res 2012; 110(2):304-11; Maziarz, RT et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation 2012;18(2 Sup):S264-S265; и clinicaltrials.gov #NCT01436487, #NCT01240915 и #NCT01841632). Вкратце, MAPC культивировали в покрытых фибронектином пластиковых флаконах для тканевых культур при низком давлении кислорода во влажной атмосфере 5% CO2.
Клетки культивировали в средах для культивирования MAPC (DMEM с низким содержанием глюкозы [Life Technologies Invitrogen], дополненной FBS (Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), добавкой жидких сред ITS [Sigma], MCDB [Sigma], фактором роста тромбоцитов (R&D Systems, Minneapolis, MN), эпидермальным фактором роста (R&D Systems), дексаметазоном ([Sigma], пенициллином/стрептомицином [Life Technologies Invitrogen], 2-фосфо-L-аскорбиновой кислотой [Sigma, St. Louis, MO) и линолевой кислотой-альбуминой (Sigma). Клетки пассировали каждые 3-4 дня, собирали с использованием трипсина/ЭДТА (Life Technologies Invitrogen, Carlsbad, CA). Клетки являлись положительными по CD49c и CD90 и отрицательными по MHC класса II и CD45 (все Ab от BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Затем клетки замораживали при 30-35 удвоениях популяции в криопробирках в газообразной фазе жидкого азота в концентрации 1-10×106 в 1 мл (PiasmaLyte, 5% HSA и 10% DMSO). Непосредственно перед их использованием MAPC размораживали и напрямую использовали.
Инокуляции клеток, инкубации легких и анализы жидкости, полученной посредством бронхоальвеолярного лаважа (BAL), и ткани
Когда температура, измеряемая с помощью внутрипредсердного зонда, достигала приблизительно 32°C, размораживали пробирки MultiStem емкостью 1 мл, содержимое разводили в 19 мл стерильного физиологического раствора и вводили с помощью бронхоскопа в проксимальную часть бронха LLL. Аналогичный объем наполнителя (20 мл стерильного физиологического раствора) аналогично вводили в проксимальную часть бронха RLL. Через пять минут после доставки MultiStem легкие подсоединяли к механическому вентилятору Hamilton-C2. Через 2 или 4 часа перфузии с помощью системы Vivoline эксперименты прекращали. За пять минут до прекращения перфузии те же субсегменты RLL и LLL, которые ранее инокулировали клетками или наполнителем, подвергали лаважу 60 мл физиологического раствора. Затем полученную жидкость BAL разделяли на аликвоты неочищенной жидкости BAL для оценки общих количеств клеток и разницы количества клеток или центрифугировали (1200 g × 10 мин при 4°C) и собирали супернатант в отдельные пробирки, быстро замораживали и хранили при -70°C (Lathrop, MJ et al, Stem Cells Translational Medicine (in press); и Goodwin, M. et al, Stem Cells 2011:29(7): 1137-48). Для одного легкого также получали образцы жидкости BAL в течение фазы нагревания до начала вентиляции, непосредственно перед доставкой MSC или наполнителя.
Общие количества клеток в жидкости BAL определяли с использованием ADVIA® Hematology Analyzer (Siemens Diagnostics, Johnson City, TN). Цитоспиновые образцы получали с использованием 5×104 клеток, центрифугированных на предварительно очищенных, предварительно обработанных предметных стеклах (Corning Incorporate, Coming, NY) при 800 об./мин. в течение 8 мин, высушенных в течение ночи и окрашенных с использованием DiffQuick (Hema 3 Stain Set, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Популяции клеток определяли с помощью "слепого" ручного подсчета 200 клеток, осуществляемого тремя разными индивидуумами (Lathrop, MJ et al., Stem Cells Translational Medicine (in press); и Goodwin, M. et al., Stem Cells 2011:29(7):1137-48). Содержание белка в неразбавленной жидкости BAL анализировали с помощью метода Бредфорда (Bio-Rad, Hercules, CA). Использовали набор Human Cytokine Array Kit, панель A (R&D Systems, Minneapolis, MN) для анализа супернатантов жидкости BAL на растворимые цитокины, хемокины и другие вещества, включая C5/Ca, CD40L, CD54, CXCL1, CXCL10, Г-КСФ, Gro-1α, ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-1RA, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-16, ИЛ-23, IP-10, I-TAC, MCP-1, MIF, PAI-1, RANES, серпин E1, sICAM, sTREM-1, ФНО, и относительное количество цитокинов по сравнению с внутренними контролями, определяемыми с помощью системы UVP Bioimaging system (Upiand, CA). ELISA на другие конкретные цитокины осуществляли по инструкциям производителя, ИЛ-10 (R&D Systems, Minneapolis, MN, кат. №:D1000B) и STC1, TSG-6 и iNOS (MyBioSource, San Diego, CA, кат. №: MBS946255, MBS926793, MBS723617).
Гистологические анализы
После BAL в конце периода перфузии легкие гравитационно фиксировали 10%-ным формалином при комнатной температуре в течение 1 часа. Фиксированные легкие рассекали и области, в которые вводили клетки, хранили в 10%-ном формалине перед заливкой парафином. Затем заключенные срезы 5 мкм оценивали на гистологические признаки. Три индивидуума "слепым" образом оценивали воспаление легких на 10 дыхательных путях на животное с учетом наличия и интенсивности перибронхиальных клеточных инфильтратов по сравнению с известными положительными и отрицательными контролями с использованием общепринятой полуколичественной системы балльной оценки с использованием диапазона 0-3 и шага шкалы 0,5, как описано ранее (Lathrop, MJ et al., Stem Cells Translational Medicine (in press); и Goodwin, M. et al., Stem Cells 2011:29(7): 1137-48).
Анализы qPCR тканевых воспалительных маркеров
Биоптаты легкого из легких №№ 2-5 получали с использованием автоматического сшивающего аппарата (Covidien GIA™ DST Series™ 80 мм) с периферии LLL и RLL непосредственно перед инфузией клеток или наполнителя, через 2 и 4 часа после инфузии клеток или наполнителя и в конце эксперимента. Образцы быстро замораживали, а затем гомогенизировали и определяли уровни экспрессии мРНК воспалительных цитокинов с помощью qPCR (см. подробности ниже).
Образцы гомогенизировали в РНК-лизирующем буфере и экстрагировали РНК с использованием набора RNeasy kit (Qiagen, Gennantown, MD) по инструкциям производителя. Осуществляли дополнительную обработку ДНКазой с использованием набора, не содержащего ДНК (Life Technologies, Carlsbad, CA). Концентрацию РНК измеряли с помощью NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA) и 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Promega, Madison, WI) с последующей обработкой РНКазой с использованием RNace-it Cocktail (Agilent, Santa Clara, CA). В качестве контролей использовали образцы, отрицательные по обратной транскриптазе, и воду. 5 мкл кДНК смешивали с SYBR green (Promega) и праймерами (IDT) и анализировали с помощью системы ABI 7500 FAST system (Applied Biosystems, Foster City, CA). Образцы нормировали по GAPDH и выражали как процент Human Reference (Agilent) +/- стандартное отклонение.
Последовательности праймеров являлись следующими:
VEGFA-F1 (SEQ ID NO: 1);
VEGFA-R1 (SEQ ID NO: 2);
IGF1-F4 (SEQ ID NO: 3);
IGF1-R4 (SEQ ID NO: 4);
EGF-F1 (SEQ ID NO: 5);
EGF-R1 (SEQ ID NO: 6);
IL-10-F2 (SEQ ID NO: 7);
IL-10-R2 (SEQ ID NO: 8);
FGF2-F1 (SEQ ID NO: 9);
FGF2-R1 (SEQ ID NO: 10);
HGF-F1 (SEQ ID NO: 11);
HGF-R1 (SEQ ID NO: 12);
CCL5-F1 (SEQ ID NO: 13);
CCL5-R1 (SEQ ID NO: 14);
TGFB1-F1 (SEQ ID NO: 15);
TGFB1-R1 (SEQ ID NO: 16)
CXCL10-F1 (SEQ ID NO: 17);
CXCL10-R1 (SEQ ID NO: 18);
NOS3-F2 (SEQ ID NO: 19);
NOS3-R2 (SEQ ID NO: 20);
STC1-F1 (SEQ ID NO: 21);
STC1-R1 (SEQ ID NO: 22);
GAPDH-F1 (SEQ ID NO: 23);
GAPDH-R1 (SEQ ID NO: 24);
ANGPT1-F2 (SEQ ID NO: 25);
ANGPT1-R2 (SEQ ID NO: 26);
NOS2-F1 (SEQ ID NO: 27);
NOS2-R1 (SEQ ID NO: 28);
TNFAIP6-F1 (SEQ ID NO: 29);
TNFAIP6-R1 (SEQ ID NO: 30);
FGF7-F1 (SEQ ID N0: 31); и
FGF7-R1 (SEQ ID NO: 32).
Статистический анализ
Группы сравнивали с использованием одностороннего или двухстороннего ANOVA с апостериорным критерием Фишера или с помощью прямого анализа двух групп с использованием критерия Стьюдента, при необходимости, с использованием поправки Уэлча для неодинаковой дисперсии (Lathrop, MJ et al., Stem Cells Translational Medicine (in press); и Goodwin, M. et al., Stem Cells 2011:29(7):1137-48).
Результаты
Соответствующие клинические характеристики донорских легких приведены в таблице 1.
Таблица 1 Клинические характеристики донорских легких |
||||||
Характеристики доноров | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Среднее ± SD |
Возраст | 55 | 56 | 44 | 66 | 50 | 54,2±3,6 |
Пол | Мужской | Мужской | Мужской | Женский | Мужской | |
Причина смерти | CVA | SH | Асфиксия | IH | MVA | |
PaO2 при 100% FiO2 | 150 | 186 | 254 | 443 | 149 | 236,4±55,1 |
PEEP | 10 | 10 | 10 | 5 | 10 | 9,0±1,0 |
Рентгенологические данные | Инфильтрат-отек | Инфильтрат-отек | Инфильтрат-отек | Чистые | Отек-коллапс правой нижней доли, плевральный выпот справа | |
Внешний вид легких | отечные | отечные | отечные | Множественные поверхностные узелки | Ушибы легких, отечные |
CVA: острое нарушение мозгового кровообращения; SH: субарахноидальное кровоизлияние; IH: внутричерепное кровотечение; MVA: дорожно-транспортное происшествие.
Возраст доноров находился в диапазоне 44-66 лет и три из пяти донорских легких получали от пациентов с катастрофическими неврологическими нарушениями, одного с асфиксией и одного после дорожно-транспортного происшествия. Четыре из пяти легких не посчитали подходящими для трансплантации из-за плохого функционального статуса, включая низкие значения PaO2 со средним значением 184,75 мм рт.ст. при 100% FiO2 при + PEEP 10 мм рт.ст.. В этих легких также наблюдали рентгенографические нарушения, по-отдельности включающие ушибы, выраженную эмфизему или коллапс доли легкого, не отвечающий на маневр раскрытия альвеол, проводимый в операционной. В каждом из этих легких также наблюдали рентгенографические признаки отека легких, при этом у двух также наблюдали плевральный выпот и все из них отмечали как в разной степени отечные после хирургического удаления. В легком №5 наблюдали коллапс RLL на CXR, но оно расправлялось после удаления и бронхоскопического извлечения слизистых пробок. Одно из легких (легкое №4) являлось физиологически подходящим для донорства, с нормальным внешним видом, чистым CXR и хорошей оксигенацией при PEEP 5 мм рт.ст., но его не использовали по причине наличия небольших поверхностных узелков, которые затем признавали доброкачественными при биопсии.
Резюме протокола, используемого для каждого легкого, представлено в таблице 2, а также в схематической форме на фиг. 1.
Таблица 2 Резюме протокола эксперимента |
||||||
Донорское легкое | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Среднее ± SD |
Длительность холодового статического хранения (часы) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8,0±0 |
Время нагрева (минуты) | 22 | 25 | 28 | 26 | 24 | 25,0±1,0 |
Длительность перфузии ex vivo (часы) | 4 | 2,5 | 4 | 4 | 4 | 3,6±0,6 |
Вводимые клетки или наполнитель | 107 MSC в LLL Наполнитель в RLL |
107 MSC в LLL Наполнитель в RLL |
107 MSC в LLL Наполнитель в RLL |
106 MSC в LLL Наполнитель в RLL |
107 MSC в LLL Наполнитель в RLL |
В целом, легкие подвергали схожему времени холодового хранения (8 часов) и нагрева (25+2,2 минут), а затем схожему времени реперфузии (3,7±0,6 часов) после бронхоскопического введения клеток или наполнителя. В конце периода реперфузии наблюдали некоторую степень дополнительного отека, развивавшегося в легких, и в легком № 4 также заново развилась некоторая степень отека. Однако в целом, наблюдали меньше видимого отека и воспаления в MSC-обработанной доле (LLL) по сравнению с обработанной наполнителем доле (RLL), даже при том, что для легкого №4 использовали меньшую дозу MAPC. Типичные изображения представлены на фиг. 2.
Гистологическая оценка легких в конце периода реперфузии показала, что, хотя можно было обнаружить очаги областей воспаления в некоторых из MAPC-обработанных LLL, наблюдали значимо меньшее общее воспаление в 4 из 5 легких, а также в среднем для всех 5 легких, как определяли с помощью полуколичественной балльной оценки перибронхиального, периваскулярного отека и отека альвеолярной перегородки и по наличию воспалительных клеточных инфильтратов (фиг. 3). Типичные микрофотографии представлены на фиг. 4.
Общие количества клеток в жидкости BAL получали в двух из четырех легких (легкие 3 и 5), в которые вводили более высокие дозы клеток. В обоих случаях наблюдали значимое снижение в MSC-обработанной LLL по сравнению с обработанной наполнителем RLL (фиг. 5A). Тенденцию в сторону снижения общих количеств клеток в жидкости BAL также наблюдали в легком, в которое вводили меньшую дозу MSC (легкое 4, фиг. 5A). Разница количеств клеток, полученная на образцах жидкости BAL из всех пяти легких, демонстрирует соответствующее повышение нейтрофилов и эозинофилов в обработанной наполнителем RLL, улучшающееся в MSC-обработанной LLL (фиг. 5B). Результаты измерений общих уровней белка в жидкости BAL варьировались между легкими, но во всех 5 легких наблюдали соответствующее снижение общего уровня белка в MSC-обработанной LLL по сравнению с обработанной наполнителем RLL (фиг. 5C).
Наблюдали повышение уровней ИЛ-10 в MSC-обработанной LLL по сравнению с обработанной наполнителем RLL (фиг. 6). Однако, другие растворимые противовоспалительные медиаторы, включенные в доклинические модели действия MSC при повреждении легких и другие модели, такие как ИЛ-1RA, STC, TGS-6 и iNOS, не повышались достоверно в MSC-обработанной LLL какого-либо из 5 легких (фиг. 6). Уровни мРНК в ткани анализировали в 4 из 5 легких (легкие 2-5) с помощью анализов qPCR биоптатов, полученных перед введением клеток или наполнителя, а затем после 2 или 4 часов периода реперфузии. В целом, профили уровней мРНК в ткани являлись более схожими для 4 легких. Наблюдали сравнимое с уровнями белка ИЛ-10 в жидкости BAL 3,5-кратное повышение уровней мРНК ИЛ-10 в ткани в MSC-обработанной LLL по сравнению с лишь 1,6-кратным повышением в обработанной наполнителем RLL, оцениваемым через 2 часа (фиг. 7). Аналогичное повышение в LLL по сравнению с RLL также наблюдали через 2 часа для уровней мРНК Angpt1 и STC1. Примечательно, что и в LLL, и в RLL наблюдали значительное повышение кратной экспрессии TSG6 с 2 до 4 часов.
Обсуждение
Исследовали ряд различных способов улучшения жизнеспособности донорских легких и снижения теплового или холодового ишемического воспалительного повреждения. Они включают промывание раствором с внеклеточными параметрами, вводимым антеградным и ретроградным образом, и использование портативной системы консервации ex vivo, в настоящее время проходящей клинические исследования для применения в транспортировке донорских легких (Machuca, TN et al., Surg Clin North Am 2013;93(6): 1373-94). Различные области исследований терапевтических вмешательств имеют целью модулировать ответ, индуцируемый ишемией и реперфузией. Например, экспериментальные модели на животных демонстрируют положительное воздействие геннотерапевтической доставки ИЛ-10 (Cypel, M. et al., Sci Transl Med. 2009;l(4):4-9) и активации рецепторов аденозина (Fernandez, LG et al., J Thorac Cardiovasc Surg 2013; 145(6):1654-9; и Mulloy, DP et al, Ann Thorac Surg 2013;95(5): 1762-7). Однако, хотя экспериментальные данные являются многообещающими, маловероятно, что модуляция одного из множества воспалительных путей может регулировать явление, изменяющее несколько задействованных клеточных механизмов, таких как врожденный и адаптивный иммунитет, активация каскада комплемента, дисфункция эндотелия и запуск гибели клеток. В отличие от этого, полученные из костного мозга MSC и MAPC обладают уникальным потенциалом воздействия на множество воспалительных путей, задействованных в ишемическом/реперфузионном повреждении.
Исходно перфузию легких ex vivo (EVLP) создавали в качестве способа оценки качества легких при донорстве после остановки сердца (DCD) и других неприемлемых донорских легких (Wierup, P. et al., Ann Thorac Surg 2006;81(2):460-6; и Ingemansson, R. et al., Ann Thorac Surg 2009;87(l):255-60). В настоящее время этот способ проходит клиническое испытание для оценки и восстановления потенциальных донорских легких, не считающихся подходящими для трансплантации по существующим критериям (Cypel, M. et al., N Engl J Med 2011;364(15): 1431-40). EVLP дополнительно предоставляет возможность вводить MSC или MAPC непосредственно в донорское легкое интратрахеальным или внутрисосудистыми путями перед имплантацией. Используя этот подход, авторы настоящего изобретения выбирали исходную оценку прямого введения MAPC в дыхательные пути в одну долю с противоположным легким в качестве сравнения для непосредственной оценки эффектов в каждом отдельном легком. Хранение с холодной ишемией (8 часов общего холодового хранения) продлевали за рамки фактического времени, общепринятого для легких, для усиления какого-либо IRI, которое могло развиться, и, таким образом, для максимизации потенциального противовоспалительного действия MSC. Авторы настоящего изобретения также выбрали использование "готовых к использованию" несовпадающих по HLA MAPC в качестве доказательства осуществимости. Кроме того, авторы настоящего изобретения демонстрируют согласованный и мощный противовоспалительный эффект MAPC. Примечательно, что изменение профиля цитокинов, в частности, повышение ИЛ-10, может являться особенно благоприятным при IRI.
Из приведенного выше описания настоящего изобретения специалистам в этой области будут понятны усовершенствования, изменения и модификации. Такие усовершенствования, изменения и модификации доступны специалистам в этой области и должны охватываться прилагаемой формулой изобретения. Все патенты, патентные заявки и публикации, процитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> LAFRANCESCA, SAVERIO
TING, ANTHONY A.
DEANS, ROBERT J.
<120> УЛУЧШЕНИЕ ОРГАНОВ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ
<130> P101237EP-WO
<140> PCT/US2014/034015
<141> 2014-04-14
<150> 61/811,525
<151> 2013-04-12
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 1
tggtgtcttc agtggatgta ttt 23
<210> 2
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 2
agtctctcat ctcctcctcc tc 22
<210> 3
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 3
gaatccttcc tctccttgga ac 22
<210> 4
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 4
gccttctccc aagtgcataa 20
<210> 5
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 5
acacatgcta gtggctgaaa 20
<210> 6
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 6
gcatcctctc cctctgaaat ac 22
<210> 7
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 7
gctggaggac tttaagggtt ac 22
<210> 8
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 8
gatgtctggg tcttggttct c 21
<210> 9
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 9
gctggtgatg ggagttgtat tt 22
<210> 10
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 10
ctgccgccta aagccatatt 20
<210> 11
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 11
tgggaaccag atgcaagtaa g 21
<210> 12
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 12
aatgagtgga tttcccgtgt ag 22
<210> 13
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 13
tgcccacatc aaggagtatt t 21
<210> 14
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 14
gatgtactcc cgaacccatt t 21
<210> 15
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 15
cgtggagctg taccagaaat ac 22
<210> 16
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 16
cacaactccg gtgacatcaa 20
<210> 17
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 17
gtaataactc taccctggca ctataa 26
<210> 18
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 18
catgggaaag gtgagggaaa ta 22
<210> 19
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 19
ccggaacagc acaagagtta 20
<210> 20
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 20
gtctgtgtta ctggactcct tc 22
<210> 21
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 21
ggtcaatgtc aagagaggaa gag 23
<210> 22
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 22
ctagtgagag tcaagcacca atag 24
<210> 23
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 23
ggtgtgaacc atgagaagta tga 23
<210> 24
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 24
gagtccttcc acgataccaa ag 22
<210> 25
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 25
ccaaagaggc ctggaaggaa ta 22
<210> 26
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 26
gtactgcctc tgactggtaa tg 22
<210> 27
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 27
gtcagagtca ccatcctctt tg 22
<210> 28
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 28
gcaagctcat ctccacagta tc 22
<210> 29
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 29
caggttgctt ggctgattat g 21
<210> 30
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 30
gcaagctcat ctccacagta tc 22
<210> 31
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 31
cttgaggtca gcctacagat aac 23
<210> 32
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 32
acctcccatt ggtgaacata taa 23
<---
Claims (16)
1. Способ трансплантации органа, включающий воздействие на орган экзогенных стволовых клеток, причем стволовые клетки представляют собой человеческие, происходящие из костного мозга, неэмбриональные, неполовые стволовые клетки, экспрессирующие теломеразу, имеют нормальный кариотип, не являются туморогенными, причем стволовые клетки были подвергнуты по меньшей мере 10-40 делениям клеток в культуре до их воздействия на орган и причем орган подвергают воздействию стволовых клеток до трансплантации реципиенту.
2. Способ по п.1, где стволовые клетки могут дифференцироваться в типы клеток по меньшей мере двух из эндодермального, эктодермального и мезодермального зародышевых листков.
3. Способ по п.2, где стволовые клетки могут дифференцироваться в типы клеток эндодермального, эктодермального и мезодермального зародышевых листков.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором стволовые клетки экспрессируют oct4.
5. Способ по любому из пп.1-3, в котором орган является органом человека.
6. Способ по любому из пп.1-3, в котором стволовые клетки являются несовпадающими по HLA, аллогенными клетками.
7. Способ по любому из пп.1-3, где стволовые клетки подвергают по меньшей мере 30-35 делениям клеток.
8. Способ по любому из пп.1-3, где концентрация стволовых клеток, воздействию которых подвергают орган, составляет от 1×106 клеток/мл до 10×106 клеток/мл.
9. Способ по любому из пп.1-3, где орган подвергают воздействию стволовых клеток в течение 2-4 часов.
10. Способ по любому из пп.1-3, где стволовые клетки содержатся в жидкости для перфузии в орган или в носителе для внутриорганного введения.
11. Способ по любому из пп.1-3, где стволовые клетки содержатся в среде, в которую орган погружают до трансплантации.
12. Способ по любому из пп.1-3, где орган выбран из группы, состоящей из легкого, почки, сердца, печени, поджелудочной железы, тимуса, желудочно-кишечного тракта и композитных аллотрансплантатов.
13. Способ по любому из пп.1-3, где подвергание воздействию стволовых клеток снижает воспаление в органе.
14. Способ по любому из пп.1-3, где подвергание воздействию стволовых клеток снижает наличие воспалительных клеток в органе.
15. Способ по любому из пп.1-3, где подвергание воздействию стволовых клеток снижает воспалительные цитокины в органе.
16. Способ по любому из пп.1-3, где подвергание воздействию стволовых клеток снижает повреждение при ишемии-реперфузии.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361811525P | 2013-04-12 | 2013-04-12 | |
US61/811,525 | 2013-04-12 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015148585A Division RU2665364C2 (ru) | 2013-04-12 | 2014-04-14 | Улучшение органов для трансплантации |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022121959A Division RU2022121959A (ru) | 2013-04-12 | 2022-08-12 | Улучшение органов для трансплантации |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018130072A RU2018130072A (ru) | 2018-10-02 |
RU2018130072A3 RU2018130072A3 (ru) | 2022-01-21 |
RU2778304C2 true RU2778304C2 (ru) | 2022-08-17 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6328960B1 (en) * | 1998-03-18 | 2001-12-11 | Osiris Therapeutics, Inc. | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
EP2241617A1 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-20 | Rijksuniversiteit Groningen | Multipotent cells derived from blood and methods and uses related thereto |
EP2377542A2 (en) * | 2009-01-15 | 2011-10-19 | Corestem Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for bone-disease treatment or countering inflammation, comprising cartilage stem cells as an active principle |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6328960B1 (en) * | 1998-03-18 | 2001-12-11 | Osiris Therapeutics, Inc. | Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation |
EP2377542A2 (en) * | 2009-01-15 | 2011-10-19 | Corestem Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for bone-disease treatment or countering inflammation, comprising cartilage stem cells as an active principle |
EP2241617A1 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-20 | Rijksuniversiteit Groningen | Multipotent cells derived from blood and methods and uses related thereto |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Darwin J Prockop et al., Mesenchymal Stem/Stromal Cells (MSCs): Role as Guardians of Inflammation / Molecular Therapy, Vol. 20, No. 1, pp.14-20. Cheuk-Kwan Sun et al., Autologous Transplantation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Markedly Reduced Acute Ischemia-Reperfusion Lung Injury in a Rodent Model / Journal of Translational Medicine, Vol. 9, No. 118, pp. 1-13. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11071752B2 (en) | Organs for transplantation | |
JP2023133612A (ja) | 膵島移植のための改善された方法 | |
JP2019089846A (ja) | 血管形成の調節 | |
US20230021683A1 (en) | Preparation, expansion, and uses of adult pluripotent stem cells | |
RU2778304C2 (ru) | Улучшение органов для трансплантации | |
KR20210116469A (ko) | Hla-e를 발현하는 간 전구 세포를 포함하는 세포 조성물 | |
NZ714064B2 (en) | Improving organs for transplantation |