JPH02503867A - Ｉｌ‐２レセプター特異的キメラ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｉ　Ｌ　−２レセプタ一特異的キメラ抗体（発明の分野） 本発明は一般的には新規治療薬等を開発するｔこめの組換えＤＮＡ技術及びモノ クローナル抗体技術の組合せに関し、またより牛等定するとヒトのインターロイ キン２レセプターに１与異的なキメラ抗体の製造及びそのキメラ抗体のＴ細胞関 連病の治療への応用Ｇこ関する。

（発明の背景） 哺乳類における免疫応答は外来物質すなわち抗原と１与異的（こ相互作用する２ つのタイプの細胞によって仲介される。そのうちの１つのタイプの細胞、Ｂ細胞 は抗体の生産を担う、第２のタイプの細胞、Ｔ細胞はＢ細胞及びＴ細胞を含むそ の他の巾広し１造血細胞の生体中における機能をコントロールする広範囲な細胞 群を含んでし）る。

Ｔ細胞がこのコントロールを行う】つの方法しよ本来Ｔ細胞成長因子と命名さ、 れていたインターロイキン２　（ＩＬ−２）として知られているリンフ才力イン の生産を介するものである。ＩＬ−２の最初の機能はＴ細胞の刺激及び維持のよ うである。事実、（１くら力九の免疫学者は、ＩＬ−２が免疫応答全体の中で中 ｌ已・に（立置すると）言している（参考として引用するファジー（Ｆａｒｒａ ｒ）　、　　Ｊ、等、イムノロジカルレヴユ−（Ｉｍ＋ａｕｎｏ１．　Ｒｅｖ、 ）６３＋１２９　１．６６　　（１９８２）参照）。

この生物学的効果を示すためＩＬ−２は特異的な高親和性膜レセプターと相互作 用する（グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）　、　Ｗ、等、“ブロク゛レス・イン・ヘマ トロジ−（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｙ）　Ｘ　ＩＶ、　 Ｅ。

ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）　ｍ　、グルン・アンド・スタソトン（Ｇｒｕｎｅａｎ ｄＳｔａｔｔｏｎ）版、ニューヨーク（１９８６）、２８３　ｆｆ）、ヒトのＩ Ｌ−２レセプターはサイズ５５ｋＤの１つの鎖を有する複雑な糖タンパク質であ る（レオナード（Ｌｅｏｎａｒｄ）、　Ｗ、等、ジャーナル・オブ・バイオロジ カル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｍ、）　　２亙立。

１．８７２　　（１９８５））、このタンノくり質をコードする遺イ云子番よ単 離されており、かつ２１個のアミノ酸から成るシク゛ナルペフ″チドを含む２７ ２個のアミノ酸を含むペプチドが予想されて（する（レオナード（Ｌｅｏｎａｒ ｄ）、　Ｗ、等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　　３土上。

６２６　　（１９８４）。

ヒトＩＬ−２レセプターの構造及び機能に関する説明の多くしま特異的反応性を 有するモノクローナル抗体の開発によるものである。

特に抗Ｔａｃとして知られている１つのモノクローナＪし抗体（ウチャマ（Ｕｃ ｈｉｙａｓａ）等、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉ＋ｓｍｕｎｏ１． ）１２６．１３９３　（１９８１））は、ＩＬ−２レセブクーがＴ細胞だけでな く卓球マクロファージ群の細胞、肝臓のクツパー細胞、皮膚のランゲルノ＼ンス 細胞及びもちろん活性イヒＴ１ｉ＆胞にも検出される事を示した０重要なことは 、他のＴ細胞、Ｂ細胞又は循還マクロファージが一般にＩＬ−２レセプターを有 さなし）ことである（バーマン（Ｒｅｒｒｍａｎｎ）等、ジャーナル・オブ・エ クスベＩノメンタル・メデイシン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）　１６２．　Ｉ ＩＩＨＩ　９８５））。

また抗Ｔａｃモノクローナル抗体はＩ　Ｌ−２との相互作用を必要とするリンパ 球の機能を限定するのにも使用され、かつ培養細胞中の細胞毒性サプレッサーＴ リンパ球の生成を含む種々のＴ細胞の機能を阻害することを示した。また、抗Ｔ ａｃを用いた実験に基づき、現在では種の病気がＴｅｌ胞による不適当なＩＬ− ２レセプターの発現特に成人のＴ細胞白血病と関係づけられている。

最近、ＩＬ−２レセプターはＴ細胞関連病への新しし）治療法の理想的標的とな ることが示された。抗Ｔａｅモノクローナル抗体番よ、ＩＬ−２レセプターを有 する細胞を効果的に除去するために単独又は免疫結合体（例えばリシンＡ、アイ ソトープ等との）として使用し得る。例えば理論的にこれらのｔＪ：、薬は病気 に関するＩＬ、−２発現白血病細胞、特定のＢ細胞又は活性化Ｔ細胞を除去する が、必要とされる正常なＴ細胞免疫応答を保証する成熟正常Ｔ細胞及びぞＯ前駆 体は保持し得る。一般に他のＴ細胞特異的試薬は基本的に全ての末梢Ｔ細胞を破 壊する可能性をもち、この事が治療効果を制限している。全体的に見てＩＬ−２ レセプタ一特異的モノクローナル抗体は、自己免疫病、器官移植及び活性化Ｔ細 胞による望ましくない応答の治療への応用が期待し得る。事実、臨床的試みが始 められている（参考として引用するワルドマン（Ｗａｌｄｍａｎ）、　Ｔ、サイ エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２，７２７〜７３２　（１９８６）参照）。

残念ながら抗Ｔａｃモノクローナル抗体の使用には、特に反復治療において特定 の欠点がある。マウスのモノクローナル抗体ではヒトの補体をうまく固定せず、 一方、ヒトの抗体の場合はより効果的である。

しかし、より重要なことは、抗Ｔａｃモノクローナル抗体がヒトの患者に注入さ れたとき抗原となる実質的なマウスのアミノ酸配列を含んでいることである。多 くの研究は、注入されたマウスモノクローナル抗体の非結合部分に対して誘導さ れる患者の免疫応答が強（、基本的に最初の治療後さらにその抗体の治療への使 用を避なければならないことを示した０種々のマウスのモノクローナル抗体が多 数、種々の病気の治療用に開発されることが予想されるので、別のマウスのモノ クローナル抗体による第１及び第２の治療を行った後に、さらにそのような治療 を行うことはそれ自体危険を伴う。

従って、実質的に抗原性が低く、かつ治療用に適した方法で安価に生産される改 良型抗Ｔａｃモノクローナル抗体の必要性がある０本（本発明の概要） 本発明はＴ細胞に関連するヒトの病気の治療に有効な新しい組成物で、抗Ｔａｃ モノクローナル抗体により結合をうけるエピトープに当るヒトのＩＬ−２レセプ ターに特異的に結合し得るキメラ抗体を含む組成物を提供する。このＩＬ−２キ メラ抗体は２対の軽鎖／重鎖複合体を有し、このうち少なくとも１対はヒトの不 変部セグメントと結合したマウスの可変部を含む鎖を、天然のＪ及びＤセグメン トの有無にかかわれず存している。

本発明のキメラ抗体又はその結合フラグメントは種々の組換えＤＮＡ技術と最終 的なトランスフェクション細胞、好ましくはミエローマ又はバイプリドーマ細胞 などの不朽真核細胞中での発現により生産される。ヒトの免疫グロブリンネ変部 をコードする第１の配列及び目的とするマウスの免疫グロブリン可変又は超可皮 部をコードする第２の配列は有機合成的に、又は適当なｃＤＮＡ又はゲノムＤＮ Ａセグメントを合せることにより作り得る。

このキメラ抗体が放射性核種、リボゾーム阻害タンパク質又は細胞表面で活性を もつ細胞毒性物質と複合体を形成した時、この物質はＴ細胞関連の病気の治療に 特に有効であろう、これらの化合物は投与様式に依存した、医学的に許容しうる 投与形体で提供され得る。

（図の簡単な説明） 第１図は抗Ｔａｃ軽鎖のＶ及びＪ領域のＤＮＡコード配列及び推定されるアミノ 酸配列を示している。

第２図は抗Ｔａｃ重鎖のＶ及びＪ　９５域のＤＮＡコード配列及び推定されるア ミノ酸配列を示している。

第３図〜第１０図は本発明を説明するのに使用したプラスミドの図である。

第１１図はプラスミド中に挿入するＶ及びＪ領域の調製に適した戦略の概要を示 している。

（発明の詳細な説明） 本発明に従かいヒトＩＬ−２レセプター上のエピトープに結合し得るマウス可変 ／ヒト不変部キメラ抗体をコードするＤＮＡ配列が提供される。これを発現ベク ター、かつ適当な宿主に入れると大量のキメラ抗体が生産され得る。このキメラ 抗体は実質的にＡＴＣＣに登録され、受理番号ＣＲＬ９６８８と命名されている ミエローマ細胞系列によって生産される抗体等の抗Ｔａｃモノクローナル抗体の 結合と同様の結合形体又は結合特性（例えば交叉反応性又は阻害性）を有する。

これらのキメラ抗体は例えばヒトの患者のＴ細胞に関連する病気の治療に有用で ある。

基本的な免疫グロブリン構造単位はテトラマーから成ることが分っている。各テ トラマーは各々１つの“軽鎖（約２５ｋＤ）及び１つの“重鎖３　（約５０〜７ ０ｋＤ）を有する２対の同じポリペプチド鎖から成り立っている。重鎖のＮＨ１ 末端は主に抗原認識を担う約１００〜１１０個のアミノ酸から成る可変部で始ま っている。重鎖のＣ０ＯＨ末端は主にエフェクター機能を担う不変部を形成して いる。

軽鎖はカッパー又はラムダに分類される０重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デ ルタ又はニブシロンに分類され、各々ＩｇＧ、ＩｇＭ。

ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの免疫グロブリンアイソタイプを定義している。

軽鎖及び重鎮の中で可変部及び不変部は約１２個又はそれ以上のアミノ酸から成 る“Ｊ”領域で結合しており、また重鎮は約１２個又はそれ以上のアミノ酸から 成る“Ｄ′領領域含んでいる。（一般的には、参考としてここで引用している“ ファンダメンタル　イムノロジー（Ｆｏｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ）、ボール（Ｐａｕｌ）　、　Ｗ、編第７照）。

キメラ抗体とは、その軽鎖及び重鎮遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺 伝子から一般的には遺伝子工学により構築される抗体のことである０例えば、マ ウスのモノクローナル抗体の遺伝子の可変（Ｖ）セグメントがヒトの不変（Ｃ） セグメント、Ｔ、及びγコなどに結合される。このように好ましい治療用キメラ 抗体は、他種の哺乳類も使用し得るがマウス抗体由来の°Ｖ”又は抗原結合ドメ イン及びヒトの抗体由来の“Ｃｏ又はエフェクタードメインから成るハイブリッ ドタンパク質である。

ヒトのキメラ抗体は、ヒトの治療に用いる上でマウスの抗体に比べ少なくとも３ つの潜在的利点を有する。

ｌ）エフェクタ一部分がヒトに由来するものであるからヒトの免疫システムの他 の部分とより良く相互作用を起こす（例えば補体依存細胞毒性（ＣＤ　Ｃ）又は 抗体依存細胞性細胞毒性ＣＡ　Ｄ　ＣＣ’）により、より効率的に標的細胞を破 壊する）。

２）ヒトの免疫システムはこのキメラ抗体のＣ領域を異物として認識すべきでは ない、この点で、注入されたキメラ抗体に対する抗体応答は全てが外来のマウス 抗体よりも小さいはずである。

３）注入したマウス抗体は正規の抗体に比べその寿命が短かいと報告されている （シラ−（Ｓｈａｗ）　、　Ｄ、等、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　 Ｉｓｍｕｎｏｌ、）１３８．４５３４−４５３８　　（１９８７）　）　。

注入したキメラ抗体はヒトの抗体と同様の寿命を有する可能性があり、このこと は、投与量や投与回数の軽減を可能にする。

本発明の１つの特徴は抗Ｔａｃモノクローナル抗体の重鎮及び、又は軽鎖の可変 又は超可変領域をコードする組換えＤＮＡセグメントである。一般にこれらのセ グメントをコードするＤＮＡセグメントな不変領域をコードするＤＮＡセグメン トに結合している０発現のため抗Ｔａｃ軽及び重鎖可変領域（天然において存在 するＪｆＩ域と共に）を含むポリペプチド鎖をコードする好ましい可変領域ＤＮ Ａ配列を各々第１図及び第２図に示す、コドン縮退及び重大ではないアミノ酸置 換により、以下に述べているようにこれらの配列は容易に他の配列に置換し得る 。

さらに一般的にこれらのＤＮＡセグメントにはこのキメラ抗体コード配列と機能 的に結合した発現コントロールＤＮＡ配列が含まれる。この発現コントロール配 列は真核宿主細胞をトランスホーム又はトランスフェクトし得るベクター中の真 核性プロモーターシステムであることが望ましい、一度このベクターが適当な宿 主に組込まれれば、この宿主はそのヌクレオチド配列を高いレベルで発現するの に適する条件下に維持され、望ましい場合は軽鎖、重鎖、軽／重鎖ダイマー又は キメラ抗体自体の採取及び精製が行なわれる。

本来の“成熟”型免疫グロブリンは配列中の１個以上のアミノ酸の欠失、置換、 挿入又は付加によりその長さがいくぶん異なることがより知られている。従って 、両可変及び不変領域は、実質的に自然の変化を受けているが、“実質的には同 一゛であり、なおかつそれら各々の活性を維持し得るものである。ヒトの不変領 域ＤＮＡ配列は従来法により種々のヒト細胞、好ましくは不朽Ｂ細胞から単離し 得る。そのＤＮＡ配列源に適した細胞及び発現及び分泌に適した宿主は、アメリ カン　タイプ　カルチャー　コレクション（参考として引用する“カタログ・オ ブ・セル　ライング　アンド　ハイブリドーマ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）　　’第５ｍ。

（１９８５）ロックビル、メリーランド、Ｕ、Ｓ、Ａ）などの多くの提供源から 入手し得る。

修正を受けた重鎮及び軽鎖も容易に設計され、かつ当分野でよく知られている種 々の組換えＤＮＡ技術を用いて製造し得る。例えば、それらの鎖はいくつかのア ミノ酸置換により一次構造レベルで天然の配列から変化し得る。別に、その−次 構造の一部のみ（通常、少なくとも約６０〜８０％、一般には９０〜９５％）を 含むポリペプチドフラグメントが生成される。このフラグメントは、より低い免 疫原性を示す１つ以上の免疫グロブリン活性（例えば補体固定活性）を有してい る。特に、多くの遺伝子の様に免疫グロブリン関連遺伝子は各々１つ以上の別個 の生物学的活性を有する別々の機能領域を含むことが注目される。これらは他の 遺伝子（例えば参考としてここに引用する１９８７年１２月１５日登録のＬｌ、 Ｓ、Ｓ、Ｎ、１３２．３８７にみられる酵素など）由来の機能領域と融合され、 新しい性質を有する融合タンパク質（例えばイムノトキシン類）を生成し得る。

一般に遺伝子の修正は部位指定突然変異誘発等（参考としてここで引用するギル マン（Ｇｉ　１１ｅａｎ）及びスミス（Ｓｍｉ　ｔｈ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ） 　　８．　８１　９７　（１９７９）　　；ロバーツ（Ｒｏｋｅｒ　ｔｓ）　＋ Ｓ等、ネイチ−？　−（Ｎａｔｕｒｅ）　　３２８．７３１−７３４．　（１９ ８７）　；及び米国特許第４．７０３，００８号参照）種々の従来技法により容 易に行ない得る０本発明の可変領域をコードする好ましいＤＮＡセグメントは、 一般に第１図及び第２図の配列と実質的に相同的（すなわち低イオン強度かつ高 温条件下でその配列にハイブリダズし得る）で、最も好ましくは少なくとも約９ ０〜９５％の相同性を存する。

目的とするキメラ抗体を最終的に発現し得る本発明の核酸配列は種々の異なるポ リヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、ＲＮＡ等）及びその成分要素（例 えばＶ、Ｊ、Ｄ及びＣ領域）から、種々の技法を用いて生成し得る。適当なゲノ ム配列を結合することは現在、最も一般的な生成法であるが、ｃＤＮＡ配列も使 用されている（参考としてここで引用しているヨーロッパ特許出願番号第８５１ ０２６５５．８号、第８５３０５６０４号、第８４３０２３６８．０号及び第８ ５］、１５３１１．．４号、及びＰＣＴ出願番号第ＧＢ　８５１００３９２号及 びＵＳ　８６１０２２６９号参照）。

先に述べたように、本発明のＤＮＡ配列（一般的には第１図及び第２図中の配列 に由来する１０個のアミノ酸をコードする少なくとも約３０個の連続するヌクレ オチド）は、その配列が発現コントロール配列に機能的に結合された後（すなわ ちそのコントロール配列の機能を保証する場所に位置する）、宿主内で発現され る。一般にこれらの発現ベクターはエビソーム又はその宿主の染色体ＤＮＡの組 込み部分としてその宿主生物中で複製し、得る。一般に発現ベクターは目的とす るＤＮＡ配列でトランスホームされた細胞の検出を可能にする、例えばテトラサ イクリン又はネオマイシン等の選択マーカーを含んでいる（例えば参考としてこ こで引用する米国特許第４．７０４，３６２号参照）。

大腸菌は本発明のＤＮＡ配列をクローニングするのに特に適した原核性宿主の１ つである。使用に適する他の微生物宿主には枯草菌などのバチルス及びサルモネ ラ（Ｓａｌ＋ｎｏｎｅｌ　ｌａ）セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）及び種々のシェ ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などの他の腸内細菌が含まれる。これ らの原核性宿主の場合、−ｉ的に宿主細胞と適合する発現コントロール配列（例 えば複製オリジン）を含む発現ベクターも作り得る。さらにラクトースプロモー ターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β−ラクタマ ーゼプロモーターシステム又はラムダファージ由来のプロモーターシステム等多 くのｌコ広いプロモーターが存在する。一般にプロモーターは場合によってはオ ペＩ／−ター配列と共に発現をコンＩ・ロールし、またこのシステムにはりポゾ ーム結合部位や転写及び翻訳を開始及び完了させる配列が含まれる。

またイーストなどのその他の微生物も発現に使用される。サツカロミセス（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵 素のプロモーター等のプロモーター、及び複製オリジン、終止配列及び必要とさ れるその他の配列等の発現コントロール配列を有する適当なベクターを使用でき る好ましい宿主である。

微生物に加えて哺乳類組織培養細胞も本発明のポリペプチドの生産に使用される （参考としてここで引用するウイネイカー（ｊｌｉｎｎａｃｋｅｒ）　　’フロ ムジーンズトウークローンズ（Ｆｒｏｍ　Ｇｅｎｅｓ　ｔ。

Ｃ１ｏｎｅｓ）　’　Ｖ　ＣＨ出版、Ｎ、Ｙ、、Ｎ、Ｙ、（１９Ｂ？）参照）。

本来の免疫グロブリンを分泌しうる多（の適当な宿主細胞系列が当分野で開発さ れてきていることがら真核細胞が実際には好ましく、またこれらにはＣＨＯ細胞 系列、種々のＣＯ８細胞系列、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系列その他のもの が含まれるが、形質転換Ｂ細胞又はハイプリドーマが特に好ましい、これらの細 胞に対する発現ベクターには複製オリジン、プロモーター、エンハンサ−（参考 としてここで引用するクイーン（Ｑｕｅｅｎ）、　　Ｃ，等、イムノロジカル　 レヴユ−（Ｉｍ＋＊ｕｎｏ１．　　Ｒｅｖ）８９．　４９　６８　（１９８６） 参照）、及びリボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位 及び転写終止配列などの必須プロセシング情報部位などの発現コントロール配列 を含み得る。好ましい発現コントロール配列は免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０ 、アデノウィルス、子牛パピローマウィルス等に由来するプロモーターである。

目的とするＤＮＡセグメント（例えば重鎮及び軽鎖コード配列及び発現コントロ ール配列）を含むベクターは宿主細胞のタイプに応じた従来法により宿主細胞に 転移し得る０例えば一般に原核性細胞には塩化カルシウムトランスフェクシッン 法が使用され、一方、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理が用いられる（一 般的には参考としてここで引用するマニアチス（Ｍａｎｉａｔｔｓ）等、モレキ ュラークローニング：ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハーバ−プ レス版、（１９８２）参照）。

発現抜本発明のキメラ抗体全体、そのダイマー、又は個々の軽鎖及び重鎮を、硫 安沈殿、分画カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法等を含む、当分野にお ける標準操作に従がい精製し得る（一般にはスコープス（Ｓｃｏｐａｓ）　、　 　Ｒ，“タンパク質の精製”スブリンガーバーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ ｌａｇ）版、Ｎ、Ｙ、　　（１９８２）参照）。

部分的又は望ましい程度の均一性までの精製後そのポリペプチドは治療又は検定 操作、免疫蛍光染色法等を開発及び遂行するのに使用される（一般的には“免疫 学的方法”第１巻及び第■巻、レフコヴイッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）及びバー ニス　（Ｐａｒｎｉｓ）編、アカデミツクブレス版、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、　 　（１９７９及び１９８１．）参照）。

一般的に本発明のキメラ抗体は個々にＴ細胞関連の病気の治療に使用し得ること が分るであろう。一般にある病気に関連する細胞がＩＬ−２レセプターを保有す ると同定された場合、このキメラ抗体が適用し得る（参考としてここで引用する “ヒト悪性腫瘍の治療”と題するＵ、　　Ｓ、　　Ｓ、　Ｎ、　　７０８５７０ ７参照）。

例えばこの治療に適した典型的病気は、感染病及び心臓、肺臓、腎臓、肝臓等の 器官移植を行ったほとんどの患者が対象となる。その他の病気にはＩ型糖尿病、 多重硬化症、リューマチ関節炎、ラパス紅斑病及びミアスセニアグラビスが含ま れる。

また本発明の抗体はその病気の原因である細胞上の他のマーカーと反応する他の 抗体、特にヒトキメラ抗体又はヒトモノクローナル抗体と合せて用いられる。例 えば適当なＴ細胞マーカーには、参考としてここで引用している“第１回国際白 血球分化ワークシ町ツブ”白血球分類、パーナート（Ｂｅｒｎａｒｄ）等線、ス プリンガー・バーラグ（Ｓｐｒ＋ｎｇｅｒ−νｅｒｌａｇ）版、Ｎ、Ｙ、　　（ １９８４）で命名されたいわゆる“分化のクラスター”に分類されているものが 含まれる。

またこのキメラ抗体は化学療法薬又は免疫抑制剤と合せて与えられる個別投与組 成物として使用し得る。一般的にこの試薬にはセファロスポリン又はプリンアナ ログ（例えばメソトレキセート、６−メルカプトプリン等）が含まれるが、当分 野でよく知られている多くの付加試薬（例えばシクロホスファミド、サルファ剤 等）も使用される。

本発明の好ましい医薬組成分にはイムノトキシンにおける本キメラ抗体の使用を 含む、イムノトキシンは二つの要素から成り、また特にインビトロ又はインビボ における選択された細胞の殺生に有用である。１つの要素は付着又は吸収された とき通常細胞を殺す細胞毒性剤である。“配合ベヒクル”として知られている第 二の要素はがん腫瘍を含む細胞等の特定のクイ１の細胞へ毒性剤を配合する手段 を提供する。一般にこの２つの成分は種々の従来の化学的手法のいずれかにより 化学的に結合している０例えば細胞毒性剤がタンパク質で、かつ第２の成分がキ メラ抗体など、本来の免疫グロブリンである場合その結合は例えば５ＰＤＰ、カ ルボジイミド、グルタルアルデヒド等異種二官能性架橋剤によって行なわれる０ 種々のイムノトキシン類の生産法はこの分野ではよ（知られており、例えば参考 としてここで引用している“モノクローナル抗体−トキシン結合体：マジックビ ユレットを目脂して”ソーベ（Ｔｈｏｒｐｅ）等、臨床医学におけるモノクロー ナル抗体、アカデミツクブレス版、１６８−１９０（１９８２）に見ることがで きる。

種々の細胞毒性剤がイムノトキシンへの使用に適している。細胞毒性剤にはヨウ 素１３１、インドリウム−９０、レニウム−１８８、及ヒヒスマスー２１２等の 放射性核種、ビンデシン、メソトレキセート、アドリアマイシン及びシスプラチ ナム等の多くの化学療法薬、及びリボゾーム阻害タンパク賞、アメリカやまごぼ う抗ウイルスタンパク質、アブリン及びリシン（又はそれらのＡ鎖、ジフテリア トキシンＡ鎖、シュードモナス外毒素Ａ等）等の細胞毒性タンパク質又はホスホ リパーゼ酵素（例えばホスホリパーゼＣ）などの細胞表面で活性を示す試薬を含 み得る。（一般的には参考としてここで引用している１キメラトキシン２オルス ネス（Ｏｌｓｎｅｓ）及びフィル（Ｐｈｉｌ）　、７　アーマシューティカル　 セラピー（Ｐｈａｒ＋ｍａｃ、　Ｔｈｅｒ、）■、３５５−３８１（１，９８２ ＞及び“がん検出及び治療のためのモノクローナル抗体ゝパルドウイン（Ｂａｌ ｄｗｉｎ）及びベイヤース（Ｂｙｅｒｓ）　ｍ、１５９−１７９．２２４〜２６ ６、アカデミツクブレス版（１９８５）参照）。

イムノトキシンの配給成分には本発明のキメラ抗体が含まれる。

本来のキメラ免疫グロブリン又はＦ　ａｂ、　Ｆ　（ａｂｚ）等のそれらの結合 フラグメントを用いることが望ましい。一般的にこのイムノトキシン中のキメラ 抗体はヒトＴｇＭ又はＩｇＧアイソタイプから成るが、望ましい場合は他の哺乳 類の不変領域も使用し得る。

特に本発明のキメラ抗体及びその医薬組成物は非経口的投与すなわち皮下、筋肉 又は静脈注射による投与に有用である。一般に非経口投与用の組成物には許容し 得るキャリヤー、好ましくは水性キャリヤーに溶かした抗体、又はその混合物の 溶液を含んでいる。多くの水性キャリヤーには例えば水、緩衝液、０．４％食塩 水、０．３％グリシン等が使用し得る。これらの溶液は無菌的でかつ一般的には 粒子物質は含まれない。これらの組成物は従来の滅菌法で滅菌される。

この組成物にはｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤など適当な生理学的条件に必要 とされる医薬的に許容し得る補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム 、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸す、トリウム等が含まれる。これらの製 剤中の抗体濃度範囲は広く、すなわち約０．５％以下、通常約１％以下から多く とも１５又は２０％までの範囲にあり、選択される特定の投与様式に従かい主に 液体容積、粘度その他に基ずいて決定される。

筋肉注射用の典型的医薬組成物はＩＮｌの無菌緩衝液及び５０■の抗体から作ら れる。静脈注射用の典型的組成物は２５０ａｄの無菌リンゲル液及び１５０Ｉ１ ｇの抗体から作られる。非経口投与用組成物を調合する方法は当分野ではよく知 られており、またここで参考として引用している“レミントンズ・ファーマシュ ーテイカル　サイエンス（Ｒｅｙａ：ｎｇｔｏｎ”ｓ　Ｐｈａｒｓａｃｅｎｔｊ ｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）’第１５編、マツク出版社、イーストン、ペンシルバ ニア（１９８０）などに詳細番こ説明されている。

本発明の抗体の保存には凍結乾燥が用いられ、使用前に適当なキャリヤーで再構 成される。この技術は従来の免疫グロブリンへのを幼性が示されてきており、ま た従来の凍結乾燥及び再構成技術を使用し得る。凍結乾燥及び再構成が種々の程 度の抗体活性の損失を起こしく例えば従来の免疫グロブリンについて言えば、Ｉ ｇＭ抗体はｒｇｃ抗体よりも大きい活性の損失を伴う傾向を持つ）、よってその 使用レベルを調整して補正しなければならないことは当業者に理解されよう。

本発明のヒトキメラ抗体及びその混合物を含む組成物は予防及び、又は治療用に 投与し得る。治療用の組成物は感染及び合併症を数滴又は少なくとも部分的に抑 えるのに十分な量を患者に投与する。これを行うのに適当な量を“医学的有効投 与量”と呼ぶ、この用途に有効な量は感染程度及び患者の自己免疫システムの通 常の状態に依存するが、一般的には投与当り抗体約１■〜約２００■の範囲にあ り、また通常は患者当り５〜２５■の投与量が使用される。一般に本発明の物質 は致命的又は潜在的に致命的な重病状態に用いられることに注意しなければなら ない、このような場合、外来物質の最小化及び本発明のヒトキメラ抗体によって 起こる“異物′拒絶反応確率の低下の観点から、これらの抗体の実質的に過剰量 の投与は担当の医師によって行なわれるべきである。

予防的用途の場合、本発明の抗体又はこれらの混合物を含む組成物は、まだ病気 になっていない患者に対し、その耐性を増すために投与される。これらの量は“ 予防効果投与量”と呼ばれる。この用途の場合、詳細な量は患者の健康状態及び 免疫の通常レベルに依存するが、一般にその量は投与当り０．１〜２５■の範囲 であり、特に、患者当り０，５〜２．５■が用いられる。

本組成物の単−又は多重投与は担当医師によって選択される投与量レベル及び投 与パターンに応じて行なわれる。いずれの場合もこの医薬製剤により患者の効果 的処理に十分な量の本発明の抗体が提供される。

さらに本発明のキメラ抗体はインビトロで巾広い用途を持つ０例えばこのキメラ 抗体はＴ細胞の分類、特異的ＩＬ−２レセプター保有細胞又はこのレセプター断 片の単離、ワクチン調製等に使用し得る。

診断用のキメラ抗体はラベル化されているもの及びラベル化されていないものが 使用される。非ラベル化抗体はヒト免疫グロブリン不変領域に特異的な抗体のよ うなキメラ抗体と反応する別のラベル化抗体（第２抗体）と合せて使用し得る。

一方、このキメラ抗体は直接ラベル化し得る。ラベルには放射性核種、蛍光色素 、酵素、酵素基質、酵素共因子、酵素阻害因子、リガンド（特にハブテン）等巾 広いものが使用される。多くの免疫検定法が使用可能で、これらは当分野でよく 知られているものである。

また細胞活性に対する保護又は細胞活性の検出又は選択された抗原の検出を目的 として本抗体を使用するためのキ７）も提供し得る。

従って本発明の抗体組成物は単独又は目的とする細胞型に特異的な付加的抗体と 合せて通常容器内に凍結乾燥体として提供される。ラベル又はトキシンと結合し た抗体又は未結合の抗体は、トリス、リン酸塩、炭酸塩等のバッファ、安定側、 殺菌側、血清アルブミンのような不活性タンパク質等、及び一連の使用説明書と ともにそのキットに含められる。一般にこれらの物質は活性抗体量の約５％（重 り以下であり、かつ通常抗体濃度の少なくとも約０．００１％（重量）の総ＭＮ を存している。しばしば活性成分を希釈する不活性な希釈剤又は賦形剤を含むこ とが望ましい、その場合その賦形剤は全組成物の約１〜９９％（重量）の範囲で 存在する。キメラ抗体に結合し得る第２抗体をこの検定で使用する場合、通常は これを別のバイアルに入れる。一般にこの第２抗体はラベルと結合しており、か つ先に述べた抗体形体と類似する形体をとっている。

以下の例は説明のためのものであって、制限を意図するものではない。

実験 プラスミドの構築 １、構築は文献（ガルシア（Ｇａｒｃｉａ）、Ｊ、　Ｖ、等、ネイチャー（Ｎａ ｔｕｒｅ）　３２２．３８３−３８５　（１９８６）：第３図）に報告されてい るプラスミドｐＫｃａｔＨ＞がら始めた。このプラスミドは時計回りに次の部分 を含んでいる。

ａ、マウス免疫グロブリン重鎮エンハンサ−（第３図のＥＸ）を含む７００ｂｐ 断片。

ｂ、マウス免疫グロブリン軽鎖カンバ遺伝子ＭＯＰＣ４１とそのプロモーターを 含む１１００塩基対（ｂｐ）の断片、このプロモーターの転写開始部位から２５ ｂｐＴ流に１つのＢｇｌｌＴ部位がある。

Ｃ，バクテリアのｃＡＴ遺伝子（８００ｂｐ）　。

ｄ、動物ウィルスＳＶ４０由来のスプライシングシグナル及びポリアゾニレ−シ コンシグナル（８５０ｂｐ）　。

ｅ、ＳＶ４０の複製オリジンを含む部分（７００ｂｐ）　。

ｆ、Ａｐ−遺伝子及び複製オリジンを含むプラスミドｐＭＬ］（ラスキー（Ｌｕ ｓｋｙ）、Ｍ及びボッチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ）、Ｍ−ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒ ｅ）　　２９３．７９−８１．２３００ｂｐ）の５ｐｈｉ部位からＥｅｏＲ１部 位までを含むプラスミドｐＢＲ３２２の一部分。

２、ｐＫｃａｔＨをＢｇｌｌｌで切断し、その末端をタレノーポリメラーゼで充 填した。配列ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣを有するＸｂａＩリンカ−をその充填したＢ ｇｌｎ部位に挿入し、生成したプラスミドをｐ　Ｋｃａｔ　Ｈ−Ｘｂａと呼ぶ。

３、　　ｐ　Ｋｃａｔ　Ｈ−ＸｂａをＸｈｏｌＴで部分消化し、アガロースゲル による分離で全長の線状プラスミド（すなわちＸｈｏｌｌにより唯１ケ所で切断 したプラスミド）を単離した。このＤ　Ｎ　ＡｔｃＢａｍＨＩで切断し、アガロ ースゲルによる分離で５６００ｂｐの断片を単離した。

その大きさからこの断片はＣＡＴ遺伝子の末端のＢａ一部位からＸｈｏｎ部位に 相当する（第３図）、この断片を自分自身でライゲーションさせ、生成したプラ スミドをｐ　Ｋｃａｔ　Ｈ−Ｘｂａ　−Ｂ　Ｘと呼ぶ。これはｐＫｃａＨに似て いるがＢｇ１１１部位の代りにＸｂａ１部位を有し、かつＸｈｏｌｌ−ＢａｍＨ Ｉ　　ＳＶ４０断片を欠いている（第４図）。

４、　　ｐＫｃａｔ　Ｈ−Ｘｂａ−ＢＸをＥｃｏＲＩで部分消化し、アガロース ゲルによる分離で全長の線状プラスミドを単離した。このＤＮＡをＢａｍＨＩで 切断し、２６００ｂｐの断片を単離した。この断片はＥ、の前のＥｃｏＲ１部位 からＢａｍＨＩ部位までの範囲のものである。文献（ムリガン（Ｍｕ　］　］　 ｉｇａｎ）、Ｒ，Ｃ，及びバーブ（Ｂｅｒｇ）、Ｐ、プロシーディング・イン・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ、　　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ 、Ｓｉｃ、）ＵＳＡ、７８．２０　？　２−２９７６　　（１９８０））に報告 されているプラスミドｐｓＶｇＰｊをＥｃｏＲＩ及びＢａ蒙ＨＩで切断し、その 大きい方のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＫｃａｔ　Ｈ−Ｘｂａ−ＢＸ由来の ＥｃｏＲＩ−ＢａｓＨＩ断片とライゲージロンした。生成したプラスミドをｐＳ Ｖ２ｇｐ　ｔ−Ｅ、−にと呼ぶ（第５図）。

５、　プラスミドＩ）ＳＶ２ｎｅｏ　　（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　、Ｐ、 　　Ｊ−及びバーブ（Ｂｅｒｇ）　、Ｐジャーナル・オブ・モレキュラーアンド アプライドジェネティクス（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　＞　　 １．３２７−３４１　（１９８２））をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、そ の大きい方のＥｃｏＲＩ　−ＢａＩＩＨＩ断片を（４）で用いたｐＫｃａｔ）（ −Ｘ　ｂａ　−Ｂ　Ｘ由来の同様のＥｃｏＲＩ　−Ｂａ＊ＨＩ断片にライゲーシ ョンした。生成したプラスミドをｐ　ＳＶ　２ｎａｏ　−ＥＨ−にと呼ぶ。

これはｐ　ＳＶ　２ｇｐｔ　−ＥＨ−にと似ているがＧｐｔ遺伝子の代りにＮｅ ｏ遺伝子を含んでいる。

６、　　ｐＳＶ２ｇｐｔ　−Ｅｗ−ＫをＸｂａｌ及びＢａａ＋ＨＩで切断し、そ の末端をクレノーポリメラーゼで充填した。クローン化したヒトに不変セグメン ト遺伝子の断片（ヒーター（Ｈｉｅｔｅｒ）　、　　Ｐ、　Ａ、等、セル（Ｃｅ ｌｌ）　、２２．１９７−２０７　（１９８０））はコード領域の３３６ｂ９上 流のＨｉｎｄＩ［１部位からコード領域の下流的８００ｂｐのところにあるＸｂ ａ１部位までに相当し、これを単離精製後、その末端を充填した。これら２つの 断片をライゲーションし、ついで第２の断片のＨｉｎｄ１１１部位がＸｂａ１部 位に結合し、かつ第２の断片のＸｂａ１部位がＢａｍ８１部位に結合したプラス ミドを選択した。これらの制限部位の配列からこの生成物にはＸｂａ１部位及び Ｂａｍ１−（１部位が再生される。この新しいプラスミドをｐＶｔ　１と呼ぶ（ 第６図）。

７、　クローン化した抗Ｔａｃ軽鎖遺伝子のＶＪ領領域含むＸｂａｌ断片をイン ビトロ突然変異誘発により調製した（以下参照）。ｐＶに１をＸｂａＩで切断し 、ホスホアターゼで処理後、先のＸｂａ■断片をとライゲーションした。ＶＪ領 領域下流のＣ領域と同じ向きで含むプラスミドを選択し、これをｐＬＴＡＣ２と 呼んだ（第７図）。

８、　　ｐｓＶ２ｎｅｏ　−Ｅｓ−ＫをＸｂａｌ及びＢａ、ｍＨＩで切断し、そ の末端をタレノーポリメラーゼで充填した。ヒトのＣγ１遺伝子を含む２８００ ｂｐの断片をファージＨＧ３Ａ（！シコン（Ｅｌｌｉｓｏｎ）、この断片はＣＨ Ｉエクソンから２１０ｂｐ上流のＰ　ｖｕ　Ｈ８位からＣＨ３エクソンの約１１ （１０ｂｐ下流のｐｖｕｒ１部位に相当し、その末端を充填した。これら２つの 断片をライゲーションし、第２断片のＨｉｎｄＩ１１部位がＸｂａＩ部位に結合 し、かつ第２断片のｐｖｕ■部位が１３ａｍＨ１部位に結合しているプラスミド を選択した。これら制限部位の配列からこの生成物にはＸｂａ１部位及びＢａｍ Ｈ１部位が再生される。この新しいプラスミドをｐＶ７１ｎｅｏと呼ぶ（第８図 ）。

９、　　ｐＳＶ２ｎｅｏ　−Ｅｗ−ＫをＸｂａｌ及びＢａｍＨＩで切断し、その 末端をタレノーポリメラーゼで充填した。ＣＨＩエクソンから２１０ｂＰ上流の ＨｉｎｄＩＩ［部位からＣＨ３エクソンから約１１００ｂｐ上下流Ｐｖｕｌｌま でに相当し、その末端を充填したヒトｃγ３遺伝子を含む３６００ｂｐの断片（ タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｂｉ）、Ｎ９等、セル（Ｃｅ１１）　　２９，６７１ −６７９　（１９８２））を精製した。

２つの断片をライゲーションし、ついで第２断片のＨ３ｎｄＩ［１部位がＸｂａ Ｔ部位に結合し、かつ、第２断片のＰｖｕ１１部位がＢａｍＨＩに結合したプラ スミドを選択した。これらの制限部位の配列からこの生成物はＸｂａＴ部位及び ＢａｍＨＩ部位を再生する。この新しいプラスミドをｐＶｒ３ｎｅｏと呼ぶ、こ のプラスミドはＣ１０の代りにＣ１０を有すること以外は１）Ｖｒｌｎｅｏと同 じである。

１０、クローン化した抗Ｔａｃ重鎖遺伝子のＶＪ領領域含むＸｂａｌ断片をイン ビトロの突然変異誘発で調製した（以下参照）。

ｐＶｒ１　ｎｅｏをＸｂａｒで切＃７ｉ後、ホスファターゼで処理してがら先の Ｘｂａｌ断片をライゲージタンした。そのＶ　Ｊ　ＳＮ域が下流のＣ領域と同じ 配向のプラスミドを選択し、これをｐＨＴＡＣと呼ぶ。

１１、別に３個のプラスミドを各々ｐＶｙ　Ｉｎｅｏ　、　ｐＶｒ　３ｎｅｏ及 びｐＨＴＡＣから調製し、これらを各々ｐＶｒ　１、ｐＶｒ３及びｐＧＴＡＣｌ と呼んだ、各々の場合、元のプラスミドを旧ｎｄ　ｍ及びＢａｍＨｌで切断し、 その大きい方の旧ｎｄｍ−ＢａｍＨＩ断片を精製した。Ｈｙｇ遺伝子を含むプラ スミドｐＸＢｏｈｐｈ（ＤＸＨｌｅｍａｎｎ）　、Ｈ，モレキュラー・アンド・ セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）土、２９２９ −２９３１（１，９８４））を旧ｎｄ　１！及びＢａ５ＨＩで切断し、Ｔ（ｙｇ を含む１．６００ｂｐ断片を精製した０元のプラスミドに由来する断片を各々ｐ 　Ｘ　ｂｏｈｐｈ断片にライゲーションした。ｐＶｒ１を第９図に、そしてｐ　 ＧＴＡ　Ｃ１を第１０図に示した。

１．２．ｐＨＴＡＣをＸｂａｌで切断し、重鎖Ｖ　、Ｊ領域を含む小さい方のＸ ｂａｌ断片を精製した。ｐＶｒ３をＸｂａｌで切断し、ホスファターゼで処理後 、先の小さい方のＸｂａｌ断片とライゲーションした。

ＶＪ領領域以下のＣ領域と同じ配向のプラスミドを選択し・ｐＧＴＡ、Ｃ３と呼 んだ、これはｐＧＴＡｃｌと同様であるがＣ１０の代りにＣ１０を含んでいる。

（軽鎖及び重鎖ｃＤＮＡのクローニング）ｍＲＮＡをグアニジンイソチオシアネ ート法とつづくハイボンド−ｍＡＰベーパー（アマ−ジャム）によるポリＡ選択 により、抗Ｔａｃハイブリドーマのおよそ１０−８腹水細胞から抽出した。

ｃＤＮ’Ａをガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）及びホフマン＜Ｈｏｆｆｍａｎ）　　（ ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ＞　、　Ｕ、及びホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ＞　、　Ｂ 、　　Ｊ、ジーン（Ｇｅｎｅ）ユ、２６３−２６９　　（１，９８３）　）の方 法により調製し、ＥｃｏＲ■メチラーゼで処理後、ＥｃｏＲＩリンカ−とライゲ ージ５ンし、λｇｔｌｏアーム（プロメガバイオチク製）にクローン化してから バフキングして（ストラテジーンバンキングエキストラクト）　Ｃ６００Ｈｆｌ 細胞に対してブレーティングした。マウスＣに及びＣγ１セグメントの５′末端 にハイブリダイズする各々４３及び３７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを 合成した（アプライドバイオシステムズ、モデル３８０Ｂ　　ＤＮＡ合成機）、 オリゴヌクレオチドを５′末端ラベルし、プラークのスクリーニングに使用した （参考として引用するマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、モ１ノキュラークロ ーニング、ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハーバ−プレス版（１ ９８２））。

そのオリゴヌクレオチドプローブで約１０，０００個のプラークをスクリーニン グした。Ｔプローブについては約１００個のプラークが陽性を示し、またγブロ ー・ブについては４０個のプラークが陽性を示した。ダイデオキシ法（サンガー （Ｓａｎｇｅｒ）、　　Ｆ、等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｐ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ　、１互、５４６３−５４６７ 　（１９７７））による部分的配列決定によりに単離物のうちの２つは同じ配列 を有していたが、他の２つは別の配列を有していることを示した。１つのベアー の場合、ｋＶ遺伝子セグメントを、そのリーディングフレーム中のＪＫ２セグメ ントと結合させた。さらに、このＶセグメントは２３番目の保存的Ｃｙｓを欠い ていた。おそらくこれらのクローンはバイプリドーマ形成後体細胞突然変異を起 こしつづけた１つのにアリール中の異常な合併事象の結果であるにクローンの別 のペアーのＶＪ上セグメント完全に配列決定されかつ同一のものであった（第１ 図）、この軽鎖はＪＫ５セグメントを使用しており、マウスに軽鎖中に保存され ている全アミノ酸残基を含んでいる（参考としてここで引用するカバット（Ｋａ ｂａｔ）、　Ｅ、Ａ。

等、“免疫学的に重要なタンパク質の配列”特に４５頁参照）。

４個の１２ａクローンの部分的配列決定はこれらが同じ遺伝子に由来することを 示した。２つのうちのＶＪ上セグメント完全に配列決定され、これらは同じもの であった。この重鎮（第２図）はＪＨ２セグメントを使用しており、サブグルー プ■に属するものである（カバント（Ｋａｂａｔ）、　Ｅ、　Ａ、等、上述、１ ２１−１２７参照）。

それはＤセグメントが検出されないこと及び１０個のＧを含むＮ　８Ｘ域を有す ることからいくぶん変っている。に軽鎖の両方の了り−ルが調べられ、わずか１ 個の重鎮配列が検出されたことから我々はとりあえずこれらの配列を抗Ｔａｃ抗 体遺伝子に割振った。

（キメラ遺伝子の調製） 先に述べた軽鎖重鎖キメラ遺伝子の構築及び発現のためのプラスミドベクターを 調製した。プラスミドｐＶに１　（第６図）は先行するイントロン及びポリＡシ グナルの３３６ｂｐを含むヒトにゲノムＣセグメントを含んでいる。またこれは ＭＯＰＣ４１に遺伝子由来の強力なプロモーター配列及び重鎮エンハンサ−配列 を含んでいる。

このプロモーターとＣイントロンの間には唯一のＸｂａＩ部位がある。

またこのプラスミドは選択用のｇｐｔ遺伝子を含んでいる。非常に似ている別の ２個のプラスミドをＫＣＯＮ域の代りにヒトｒｌ及びγ３Ｃ領域を用いて調製し た。各々の場合、Ｘｂａ１部位及びＢａｍＨ１部位の間に挿入された領域はＣＨ Ｉエクソンの５′側約２１．ＯｂｐからＣＨ３エクソンの３′側約１１００ｂｐ に及ぶ領域である。さらにｇｐｔ遺伝子はｈｙｇ遺伝子とＷ換してヒグロマイシ ン耐性を与えられている。

我々の戦略はｐＶに１のＸｂａ１部位にスプライスドナーシグナルを伴う抗Ｔａ ｅにｃＤＮＡ由来のＶ　Ｊ　５７域を挿入するものである。この操作はマウスＶ Ｊセグメント及びヒトｃにセグメント間に合成イントロンを持つキメラに遺伝子 を作り出す、この目的のため我々はある種のブライマー指定突然変異誘発を考案 したく第１１図）。

ｒＥｅｏＲＩ　　ｃＤＮＡクローンをＭ１３ｍｐＨ変異体の１つに移した。その ポリリンカー中のＸｂａｌ及びＥｃｏＲ１部位は隣接している。

最初の２２個の残基がＪＫ５セグメントの最後の２２ｂｐにハイブリダイズする オリゴヌクレオチドを合成した６次の１６個のヌクレオチド配列はマウスゲノム ＤＮＡのＪＫ５と同じものであり、従ってスプライスドナーシグナルを含んでい る。オリゴマーの最後のヌクレオチドは短かい非関連配列を伴うＸｂａＩ部位か ら成っている。

このオリゴヌクレオチドをにＤＮＡを含むファージＭ１３ＤＮＡにハイブリダイ ズし、タレノーポリメラーゼで伸長したく第３図）。

このＤＮＡを変性し、ＣＤＮＡ挿入物の５′側のＭ１３ＤＮＡを示す“リバース ブライマー”にハイブリダイズした。このリバースブライマーを伸長し、そのＤ ＮＡをＸｂａＩで切断した。伸長したｃＤＮＡのＶＪ上セグメント含むＸｂａｌ フラグメントを精製し、ｐＶに１のＸｂａ１部位に正しい配向でクローン化して プラスミドｐＬＴＡＣ２を作成した（第７図）、結果的にこのキメラに遺伝子は ・最初のｚｂｐ及び最後の２０９ｂρが各々マウス及びヒトのゲノムＤＮＡと同 じＶＪ−Ｃイントロンを有している。このことはこの構築物の配列決定により確 認された。この遺伝子は重鎮エンハンザ−により活性化されるにプロモーターか ら転写される。イントロンの欠失によって得られた結果に基づいて我々はイント ロンが転写ＤＮＡから正しくスプライシングされていると予想した。

同様にして、スプライスドナーシグナルを伴う抗Ｔａｃγ２ａ重鎖ｅＤＮＡ由来 のＶ、、ＢＩ域をｐＶｒｌｒ＋ｅｏのＸｂａ１部位に挿入した。

生成したプラスミドｐＨＴＡＣはマウスＶＪ及びヒトＣｙｌセグメントの間に合 成イントロンを有するキメラ重鎖遺伝子を含んでいる。

Ｈｙｇ遺伝子及びヒ）・のＣｒ１、Ｃｒ３の不変領域を各々有しているキメラ重 鎮遺伝子を含んでいる別のプラスミドｐＧＴＡｃ１及びｐ　ＧＴＡ　Ｃ３を上述 のように構築した（第１０図）。

（プラスミドへのＶＪｃＤＮＡＳＪＩ域の挿入の詳細な説明）ファージＭ１３＋ ｐＨのＲＦ　　ＤＮＡをＢｃｏＲｌ及びＸｂａｌで切断し、その末端を充填した 後そのＤＮＡをライゲーションしてＪＭ１ｏ１細胞にトランスホームした。１つ のプラークを選び出し、そのＤＮＡの配列決定してそのＤＮＡの末端が正しく結 合し、かつその介在ＤＮＡセグメントを欠失しっつＥｃｏＲＩ及びＸｂａ１部位 が再生していることをｆｉｌした。このファージをＭ１３ｍｐＨＤと命名した。

抗Ｔａｃｌｌ鎖及び重鎖ｃＤＮＡを含むＢｃｏＲＩ断片を別々にＭｌ、３ｍｐＨ のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、その結果それらの５′末端はＸｂａ１部位と 隣接することになる。生成したファージは各々Ｍ１３ｍｐＨＬ及びＭ１３ｍｐＨ Ｈと命名した。

以下に示す４８ヌクレオチド長のブライマーを合成し、ゲルにより精製した。

ＣＣＡＧＡ　Ａ　ＴＴＣＴＡＧＡ　ＡＡ　Ａ　ＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＧ　ＴＴＴ ＣＡ　ＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧ　ＴＣＣＣその３′末端からブライマーの最初 の２２ヌクレオチドはＪＫ５セグメントの最後の２２ｂｐ（非コード鎖）と同じ である０次の１６ヌクレオチドはマウスのゲノムＤＮＡのＪＫ５に続く、それゆ えスプライスドナーシグナルを含む配列（第１１図中ＳＤで略記されている）と 同じである。そのオリゴマーの最後のヌクレオチドには短かい非関連配列を伴う Ｘｂａ１部位が含まれる。およそ１ｕｇの一本鎖Ｍｌ　３ｍｐＨＩ　Ｌ　　ＤＮ Ａを３５ｐｌの１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，４）、６０　ｍＭ　Ｎａ１ｌ　、　１ ０　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ中５０ｎｇのブライマーと混合し５０℃で１５分間インキ ュベージコン後２３℃で１５分間インキュベーションした。各々２００μＭのｄ ＮＴＰを含む４μｉの溶液を５ｕのタレノーポリメラーゼと共に加えた。この溶 液を３７℃で３０分間インキュベーションした。Ｘｂａ１部位の上流の新しく合 成された鎖にハイブリダイズし得る（第１１図）５０ｎｇの°リバースブライマ ー’ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ　にューイングランドバイオラボ）を添 加した。この溶液を９５℃で３分間インキュベーションし、ついで氷水中で冷却 した。新たに各々２００μＭのｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ溶液４μｌ及び５υのクレノーポ リメラーゼを加え、この溶液を３７℃で３０分間インキュベーションした。この 溶液をフェノール−クロロホルムで抽出後エタノール沈殿し、再溶解してから２ ０ｕのＸｂａｌで消化した。この消化ＤＮＡを４％ポリアクリルアミドゲルで分 画し、エチジウムブロマイドで染色した。高分子量ＤＮＡに加えて、′テール” を有する軽鎖ｃＤＮＡＯＶＪｉｉＪ域に対応する約４ｏｏｂｐの断片が確認され た（第１１図）。この断片をｐＶに１のＸｂａｌに直接正しい向きにクローン化 した。

以下に示す５０ヌクレオチド長のブライマーを合成し、ゲルを用いて精製した： ＣＣＡＧＡ　ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡ　Ｇ ＧＡＧ　ＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧ３′端からそのブライマーの最初の２１残 基はＪＨ２セグメント（非コード鎖）の最後の２１ｂｐと同じ配列を有している ０次の１９ヌクレオチドはマウスのゲノムＤＮＡ中のＪＨ２に続（、それゆえス プライスドナーシグナルを含む配列と同じ配列を有している。このオリゴマーの 最後のヌクレオチドは短かい非関連配列を伴うＸｂａ１部位を含んでいる。この ブライマーを上述の操作と同様にＭ１３ｓ＋ｐ１１ＨＤＮＡにハイブリダイズし て重鎮ｃＤＮＡＯｖ　Ｊ　ＳＥＡ域を含む断片を合成した。この断片をｐＶγ１ 　ｎｅｏのＸｂａ１部位に直接正しい向きにクローン化した。

（キメラ抗体の特異性） ＣＲ２−２及び０２Ｍ細胞は各々ＴＬ−２レセプター（ＩＬ２Ｒ）の表面におけ る発現がポジティブ及びネガティブであるヒトのＴ細胞系列である。ＣＲ２−２ 細胞はＥＬＩＳＡ検定におけるキメラ抗体の結合特異性を示すのに使用し、一方 ＯＥＭ細胞はネガティブコントロールとして用いた。

テストした抗体はいくつかの方法で調製した。Ｔ、ワルドマン０１ａｌｄｍａｎ ｎ）により提供された抗Ｔａｃモノクローナル抗体はＤＥＡＥ−デキストランカ ラムを用いてマウス腹水から精製した。

５Ｐ２１０細胞を軽鎖／ガンマ１重鎮キメラプラスミドｐ　ＬＴＡＣ２及びｐＧ ＴＡＣＩ（上述）でトランスフェクトして生成した細胞系列Ｌ４０Ｈ４をマウス に注射し、腹水化した。腹水３ｄからベーカーＡｂｘカラム及びサイズ排除カラ ムを用い６５０μｇのキメラガンマ１抗体を精製した。また組織培養物中の抗体 生産を検出するため、Ｌ４０Ｈ４及び細胞系列５１．３及びＬ４０Ｈ２（先に述 べた５Ｐ２１０のｐＬＴＡＣ２及びガンマ３重鎮プラスミドｐＧＴＡＣ３による トランスフェクションにより生成したもの）及び非生産系列５ｐ２１０の各々１ ０６個の細胞を各々１−のＤＭＥ培地と混合した。２４時間後、分泌されたキメ ラ抗体を含む培地上清を収穫し、直接検定に用いた。

各タイプの培養細胞をＦＡＣＳバッファ（ダルベツコリン酸緩衝液中０．１％Ｂ ＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）で洗浄した。

２Ｘ１０’個の細胞を２０μ］ＦＡＣＳバンフア中の精製抗体又はトランスフェ クトした細胞系列由来の２０μｌ培地上清と混合し、氷水中で２時間インキュベ ーションした。この細胞を１μ１ＦＡＣＳバフフアで３回洗浄した（各洗浄後低 速遠心で収集する）。

抗Ｔａｅ抗体（又はコントロールとして抗体なし）とインキュベーシヨンした細 胞を２０μＩＦＡＣＳバッファ中０．５μ！のパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウ ス抗体（Ｆａｂ）　、　’断片（タボ　イムノロジカルズ（Ｔａｇｏ　Ｉｍｍｕ ｎｏｌｏｇｔｃａｌｓ）　、バーリンガム、カリフォルニア）と混合し、一方、 キメラ抗体とインキュベーシヨンした細胞を２０μ１ＦＡＣＳバンファ中０．５ μｌのパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトガンマ鎖（Ｆ　ａｂ）２重断片（タボ（ Ｔａｇｏ））と混合した。これらの細胞を水中で３０分間インキュベーションし た後ＦＡＣＳバッファで３回洗浄した。その後これらの細胞を１００μｌのパー オキシダーゼ発色液と混合し室温で５分間インキュベーションした。細胞を遠心 後その上清を９６穴プレートに移しそのＯＤ値をＥＬ　Ｉ　ＳＡ測定機で測定し た。各抗体で処理した細胞の４１４ｎｍにおけるＯＤ（直を第１表に示す。

予想どおり抗Ｔａｃ抗体自体はＩ　Ｌ２Ｒ＋ＣＲ２−２細胞には結合したがＩＬ ２Ｒ−０２Ｍ細胞には結合しなかった。抗Ｔａｃと等量の精製ガンマｌキメラ抗 体はＣＲ２−２細胞に対して等しい結合壁を与え、またＣＥＭ細胞への結合も起 こさなかった。双方のキメラ抗体生産細胞由来の全ての上溝はＣＲ２−２細胞に 結合した。別のネガティブコントロールと同様に、５１．３上清はＣＥＭ細胞に は結合せず、一方親株の５Ｐ２１０細胞由来の上清はＣＲ２−２細胞と結合しな かった。

抗Ｔａｃハイブリドーマからの軽鎖及び重鎮遺伝子の誘導と合せて、これらの結 果は、これらのキメラ抗体がヒトのＩＬ２Ｒに対する特異性を保持していること を示している。

第１表 キメラ抗体の細胞ＥＬＩＳＡ検定法 ＣＲ２−２細胞　　ＣＥＭ細胞 （ＩＬ２Ｒ＋）　　　（ＩＮ−２Ｒ−）マウスガンマ２ａ な　　し　　　　　　　　　　　　　　　　０．０３７　　　　　　　　　　− 抗Ｔａｃ　（１００ｎｇ）　　　　　０．６７９　　　　０．０２４ヒトガンマ 　１ な　　し　　　　　　　　　　　　　　　　０．０　８４　　　　　　　　　　 −精製腹水（１００ｎｇ）　　　　０．６４　ｉ　　　　　　０．０４４Ｌ４０ Ｈ４（２０μβ上清）　　　　０．４８１　　　　　　−ヒトガンマ　３ ５１．３　（２０μβ上清）　　　　０．３８１　　　　　０．０３８Ｌ４０Ｈ ２（２０μβ上清）　　　　　０．９３２キメラ抗体の分泌速度を定量するため 標準法を用いたＥＬＪＳＡ検定を行った。この結果を第２表に示す。キメラガン マＩを分泌する細胞系列Ｌ　４０　ＨＯ及びキメラガンマ３を分泌する細胞系列 ５１．３各々の約１０６個の細胞を５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１−で培 養し、２４時間後にその上清を収集した。９６穴プレートはヤギ抗ヒト抗体（タ ボ　イムノロジカルズ（Ｔａｇｏ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ−ｃａｌｓ）　）でコ ーティングした。各ウェルを種々の既知量のガンマ１キメラ抗体（腹水から精製 したもの）及び１μｌのキメラ抗体上清とともにインキュベートした。簡単に言 うと、このプレートを洗浄し、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトガンマ鎖抗体と インキュベーションした。再度洗浄してからパーオキシダーゼ発色液とインキュ ベーションし、ＥＬ　ｒ　ＳＡ測定機を用いて４１４ｎｍにおけるＯＤ値を測定 した。精製抗体を用いて得た標準曲線と比較によるとその培養上清はμｌ当当り 各々約８及び７０ｇの抗体を含んでいた。すなわち細胞は２４時間で１０ｒ′個 細胞当り各々８及び７Ｂの抗体を分泌した。

第２表 キメラ抗体分泌速度 Ｄ４１４ 精製ガンマ１キメラ ３　ｎ　ｇ　　　　　　　　　　　　　０．４２６４　ｎ　ｇ　　　　　　　　 　　　　　Ｏ，５３５Ｌ４０）（４（１μβ上清）　　　　　　　１．（１１４ ５１，３（１μｌ上清）　　　　　　０．８４５混合リンパ球反応は移植拒否反 応のモデルであり、キメラ抗Ｔａｃ抗体の有効性を検定するのに使用した。以下 の第３表に示した実験は標準法で行った（例えばストロング（Ｓｔｒｏｎｇ）　 、　　Ｄ、　Ｍ、等、マイクロカルチャーシステム及び多重自動サンプル収穫機 を用いたマウス牌細胞のインビトロ活性化、ジャーナル・オブ・イムノロジカル ・メソッド（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　）　２．２７９　（１９７ ３）、簡単に言うと、２人の無関係の提供者由来のヒト末梢血液リンパ球を精製 した。２人の提供者のリンパ球を９６穴プレート中、別々に、−緒に混ぜて、又 は毎日添加する指定抗体とともに一緒に混ぜてインキュベートした。−緒に混ぜ たとき、Ｔ細胞は器官移植物を異物として！！！ｍすることから、それらのＴ細 胞は互いに異物と認識する。

それゆえそれらは３日後の３Ｈラベル化チミジンの取り込みで測定されるように 増殖する０本来の抗Ｔａｃ抗体又はキメラ抗体の添加はＩＬ２Ｒへの結合により その細胞の増殖を強く阻害する（阻害率をカッコ内に示す）、これはＴ細胞増殖 に必要なＩＬ２ＲへのＩＬ２の結合を阻害する。これらの実験はこのキメラ抗体 が異細胞へのＴ細胞の応答を減少させるのに使用でき、それゆえ移植拒絶痘を防 ぐ上での医学的用途を有することを示している。

第　　　３　　　表 混合リンパ球反応における抗ＩＬ２Ｒ抗体の阻害実験１　　実験２ 提供者Ａ３１０±２９２　　　　　１５１±　５提供者Ｂ９０１　±　３８　　 　　　７１２±　２９Ａ　＋　Ｂ　　　　　１１７４０±１５９３　　１９８０ ６±２０３４Ａ＋Ｂ十抗Ｔ　ａｃ　　　　　　４２６２　±３４６（７３χ）７ ３１１±４６１　（６６χ）Ａ、　＋　Ｂ＋ヒトガンマ１　４１２６±３７０　 （７４χ）　　　６７２１±９８１　（６９χ）Ａ十Ｂ＋ヒトガンマ３　　　　 　　　　　　　　６４２３±４２３（７］χ）先に述べた事から本発明のキメラ 抗体が他のヒ）ＩＬ−２レセプタ一特異的抗体の多くの利点を提供することは高 く評価されよう。

抗Ｔａｃマウスモノクローナル抗体と比較して、本ヒトキメラ抗体はより経済的 に生産され、かつそれに含まれる外来アミノ酸配列は実質的により少ない。ヒト 患者への注射後の抗原性の減少は有意な治療改善性を示している。

本発明は明瞭性及び理解を目的として説明及び例により詳細に記述されているが 、請求の範囲内で変化及び修正を行ない得ることは明白であろう。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、Ｊ。

Ｖ４０ εＨ ＦＩＧ　　５゜ ＦＩＧ、Ｊ。

Ｈ ｃｐ會 ＦＩＧ、　７゜ ＦＩＧ、Ｊ。

ＥＨ ＦＩＧ、Ｊ。

Ｘｂａ　Ｉ　　　　　　　Ｖ　　　　　　　　　　　Ｊ　　　　　　　Ｃ平成　 　年　　月　　　日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殺 １、事件の表示　　ＰＣＴ／ＵＳ　８９／　Ｏｉ　５７８２、発明の名称　　Ｉ Ｌ−２してブター特異的キメラ抗体３、補正をする者 事件との関係　　出願人 ５、補正命令の日付　　　自　　発 国際調査報告

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト患者に関するＴ細胞関連病の治療法で該患者にヒトＴ細胞上のＩＬ− ２レセプターと特異的に反応する治療効果投与量のヒトＴ細胞上のＩＬ−２レセ プターと特異的に反応するマウス可変領域／ヒト不変領域キメラ抗体組成物を投 与することを含む方法。
2. （２）マウス可変領域がＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ９６８８号と命名される細胞 系列により生産されるような抗Ｔａｃモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖由来の 全可変領域を含む請求項（１）記載の方法。
3. （３）マウス可変領域の少なくとも１つが天然のマウスＪセグメントと結合して いる請求項（１）記載の方法。
4. （４）ヒト軽鎖不変領域がｋ鎖不変領域を含んでいる請求項（１）記載の方法。
5. （５）ヒト軽鎖不変領域が７１又は７３鎖不変領域を含む請求項（１）記載の方 法。
6. （６）組成物が細胞毒性薬剤と複合体を形成しているキメラ抗体を含んでいる請 求項（１）記載の方法。
7. （７）細胞毒性薬剤がリボゾーム阻害タンパク質、放射性核種又は細胞表面で活 性を示す細胞毒性薬剤である請求項（１）記載の方法。
8. （８）ヒトＩＬ−２レセプターエピトープに結合し得るキメラ抗体で２対の軽鎖 ／重鎖複合体を有し、その少なくとも１対のものがマウス可変領域及びヒト不変 領域セグメントを含む鎖を有する抗体。
9. （９）マウス可変領域が天然のＪセグメントに隣接している請求項（８）記載の キメラ抗体。
10. （１０）ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ９６８８号と命名される細胞系列により分泌 されるモノクローナル抗体の結合を阻害する請求項（８）記載のキメラ抗体。
11. （１１）少なくとも１つの可変領域が折Ｔａｃモノクローナル抗体の可変領域の アミノ酸配列を含む請求項（１０）記載のキメラ抗体。
12. （１２）エミローマ又はハイプリドーマ細胞中で生産される請求項（８）記載の キメラ抗体。
13. （１３）ヒトのゲノムＤＮＡセグメントに結合したマウスｃＤＮＡセグメントを 含むＤＮＡをトランスフェクトしたミエローマ細胞中で発現される請求項（８） 記載のキメラ抗体。
14. （１４）細胞毒性薬剤又はシグナル試薬と複合体を形成する請求項（８）記載の キメラ抗体。
15. （１５）ヒトの重鎖不変領域及びＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ９６８８号と命名さ れた細胞系列により分泌されるモノクローナル抗体重鎖可変領域と実質的に同一 の可変領域を含む免疫グロブリン重鎖。
16. （１６）可変領域及び不変領域がマウスＪセグメントを介して結合している免疫 グロブリン重鎖。
17. （１７）ヒトの軽鎖不変領域及びＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ９６８８号と命名さ れた細胞系列により分泌されるモノクローナル抗体軽鎖可変領域と実質的に同一 の可変領域を含む免疫グロブリン軽鎖。
18. （１８）ヒトの免疫グロブリン不変領域をコードする第１の配列及びマウス免疫 グロブリン可変領域をコードし、実質的に第１図又は第２図のアミノ酸配列の１ つをコードする第２の配列を含むポリヌクレオチド分子。
19. （１９）請求項（１８）のポリヌクレオチドでトランスフェクトした細胞系列。
20. （２０）ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ９６８８号と命名された細胞系列。
21. （２１）免疫グロブリン軽鎖の一部をコードするＤＮＡセグメントで第１図の配 列由来の少なくとも約３０個の連続するヌクレオチドを合むセグメント。
22. （２２）前記セグメントが実質的に第１図の配列に相同的な全長の軽鎖可変領域 をコードする請求項（２１）記載のＤＮＡセグメント。
23. （２３）免疫グロブリン重鎖の一部をコードするＤＮＡセグメントで第２図の配 列由来の少なくとも約３０個の連続するヌクレオチドを含むセグメント。
24. （２４）前記セグメントが実質的に第２図中の配列に相同的な全長の重鎖可変領 域をコードする請求項（２３）記載のＤＮＡセグメント。
25. （２５）請求項（２１）又は（２３）記載のＤＮＡセグメントに機能的に結合す る異種プロモーターを含む発現ベクター。
26. （２６）請求項（２５）記載の発現ベクターでトランスホームした不朽化細胞系 列。
27. （２７）異種ポリペプチドに融合した第１図又は第２図のタンパク質配列由来の 少なくとも約１０個の連続するアミノ酸を含むタンパク質組成物。
28. （２８）異種ポリペプチドが免疫グロブリン不変領域である請求項（２７）記載 のタンパク質組成物。
29. （２９）前記タンパク質がグリコシル化されている請求項（２７）記載のタンパ ク質組成物。
30. （３０）ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ９６８８号と命名された細胞系列により分泌 される免疫グロブリンと実質的に同じ抗原結合特性を示す組換え的に生産された 抗体。