JP6196163B2 - 多能性幹細胞を作製する方法 - Google Patents
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- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Description
cells)は、短期間、ナイーブ状態を維持した後、より分化したプライム段階へと進行した。
inactivated)。
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
(i)ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をNM23の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
(ii)細胞をMUC1*抗体で被覆した幹細胞増殖表面に付着させるとともに、細胞を成長させることと、
(iii)細胞を採取するとともに、工程(ii)の幹細胞で発現するマイクロRNAを同定することと、
(iv)bFGFベース培地中のヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をネズミフィーダー細胞の層上で別に培養することと、
(v)細胞を採取するとともに、工程(iv)の細胞で発現するマイクロRNAを同定することと、
(vi)工程(iii)で同定されたマイクロRNAと、工程(v)で同定されたマイクロRNAとを比較することと、
(vii)工程(iii)では存在しているか、又は発現が増大しており、工程(v)では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、ナイーブ細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
(viii)工程(v)では存在しており、工程(iii)では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、プライム細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
を含む、方法を含む。
(i)ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の第1のセット及び第2のセットを、NM23の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
(ii)細胞をMUC1*抗体で被覆した第1の幹細胞増殖表面に付着させることと、
(iii)細胞の第1のセットにおいてマイクロRNAのレベルを測定することと、
(iv)同一の細胞の第2のセットの細胞を採取するとともに、細胞の第2のセットを第2の幹細胞増殖表面上にプレーティングすることと、
(v)第2の幹細胞増殖表面上で一定期間成長させることと、
(vi)細胞の第2のセットにおいてマイクロRNAのレベルを測定することと、
(vii)細胞の第1のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の第2のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することを含む、ナイーブ幹細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
(viii)細胞の第2のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の第1のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、プライム幹細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
を含む、方法に関する。
(a)幹細胞又は前駆細胞のサンプルを得ることと、
(b)幹細胞又は前駆細胞を表面に接触させることと、
(c)幹細胞又は前駆細胞を、MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中で培養することと、
を含む、方法に関する。
(a)幹細胞又は前駆細胞を、MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中で予めインキュベートすることと、
(b)幹細胞又は前駆細胞を表面に接触させることと、
を含む、方法に関する。
(a)(i)MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中でのインキュベートの後に、幹細胞又は前駆細胞をペレット状にする工程と、
(a)(ii)第1の作用物質を含まない培地中で幹細胞又は前駆細胞を再懸濁する工程と、
(a)(iii)幹細胞又は前駆細胞を表面上にプレーティングする工程と、
(a)(iv)48時間にわたって放置する工程と、
を更に含み得る。
(i)幹細胞を、MUC1*を二量体化する作用物質を含む培地中でインキュベートする工程と、
(ii)他の細胞と付着させる前に、幹細胞に、細胞を表面に接触させる力を加える工程と、
(iii)細胞を、作用物質を含まない培地中で再懸濁する工程と、
(iv)表面上にプレーティングする工程と、
(v)48時間にわたって放置する工程と、
(vi)MUC1*を二量体化する作用物質を添加する工程と、
を更に含み得る。
(i)フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面を含む物体であって、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質と結合する、物体と、
(ii)NM23とともに最小培地を含む幹細胞成長培地と、
備えるキットに関する。
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
and a plurality of objects)。
本明細書で使用される場合、幹細胞増殖表面は、ヒト幹細胞の付着を可能にするように化学的又は生物学的に改質することができ、更に幹細胞を増殖させ、そこから幹細胞を採取することができる、任意の表面である。国際公開第2009/105570号は、得られる表面が細胞付着に良好であり、特に非接着性細胞であるヒト幹細胞の付着を可能にするような、細胞培養用のプラスチック容器のプラズマ改質を記載している。国際公開第2009/105570号に記載の表面の一つは、Vita(商標)表面(ThermoFisher, USA)として販売されている。特に、国際公開第2009/105570号における表面#4は幹細胞を成長させることから普及されてきた。残念ながら、これらの表面に結合した後にそこで成長するように、これらの細胞を準備する(「順化する」としても知られる)必要がある方法は非常に長期間にわたる複雑なものである。国際公開第2009/105570号は、別の表面から手動で切り離すとともに剥離した幹細胞はそれらの表面には結合しないことを開示している。加えて、幹細胞は、開示された表面上で結合又は成長する前に、単一細胞になるまで、数回、例えば38回及び48回、酵素により継代させる必要がある。さらにVita(商標)表面の使用説明書には、幹細胞をRhoキナーゼ阻害剤の存在下で培養させなければならないことが記載されており、そうしなければ幹細胞が表面に結合しないか、又は表面に結合した状態を保てない。国際公開第2009/105570号の更なる欠点は、開示された表面はマトリゲル及びフィーダー細胞の代用を目的とする規定の基質であるが、マウスフィーダー細胞由来の馴化培地を標準bFGF幹細胞培養培地に添加しなければ、幹細胞は表面上で成長することがないことであり、このため規定の動物質を含まない表面の用途にはそぐわない。
最近の研究論文によって、FGF及び線維芽細胞フィーダー細胞馴化培地中で培養したヒト幹細胞は真の多能性(ナイーブ状態又は基底状態)幹細胞ではなくなっていると結論づけられている。正しくは、bFGF中での成長はヒト幹細胞を「プライム状態」と呼ばれるより成熟した状態にさせる。ヒトプライム幹細胞対ヒトナイーブ幹細胞の分野における研究結果によって、プライム幹細胞が、真の多能性幹細胞のように完全に機能的な成体細胞へと分化することができないことが示唆されている。研究者らは、プライム幹細胞を「ナイーブ」と呼ばれる真の多能性状態へと一時的に戻す方法を開発している。ナイーブ幹細胞がプライム幹細胞とは異なる経路を介して成長するため、ナイーブ幹細胞は、プライム幹細胞の表面で発現されるものとは異なる細胞表面受容体を保有するか、又はプライム幹細胞の表面で発現されるものとは異なるレベルで発現される細胞表面受容体を保有することになる。そのため、プライム幹細胞とナイーブ幹細胞とは、化学的又は生化学的に規定された表面に対する親和性が異なる。
本明細書に開示される発見によって、欠損した幹細胞を用いた研究に基づく現在の「発見」の多くもまた欠損したものであることが示される。FGF経路により及び/又はマウスフィーダー細胞若しくはその馴化培地で成長させた幹細胞の研究により得られたデータは、どの所見がヒトに適用され、どの所見がヒトに適用されないのかを決定することができない関連データと関連のないデータとが混ざったものである。例えば、がんの治療に対する新たなアプローチは、分化を誘導することによってがん細胞の自己複製能を抑制することである。がん細胞のマイクロRNAを、幹細胞、特に新たに分化する幹細胞のマイクロRNAと比較して、どの調節因子ががん細胞に欠けているかを決定するという研究を行った。理論としては、欠けている分化を誘導するマイクロRNAをがん細胞に導入し、がん細胞がより健常細胞のように働くようにがん細胞を「再プログラミング」することができるというものであった。このこれまでの一連の研究の問題は、分析したマイクロRNAがFGFを用いて、マウスフィーダー細胞上で成長させた幹細胞由来のものであるということであった。数多くの証拠が、bFGFがヒト多能性幹細胞ではなく、マウス幹細胞を成長させる成長因子であることを裏付けている。現在、本発明者らは、bFGF及びマウスフィーダー細胞がともに、ヒト幹細胞をその自然のナイーブ状態から離脱させ、「プライム」状態又は「マウス−ヒトキメラ」にする因子を分泌することを認識している。プライム状態は、ナイーブ幹細胞で発現されるものとは大きく異なる遺伝子発現パターン、その結果として大きく異なるマイクロRNA発現パターンを特徴とする。したがって、分化の開始を示唆するものとして同定され、そのため潜在的ながん治療に有用であるとされてきたマイクロRNAの大部分とは言わないまでも多くが、マウス幹細胞分化の開始のみを示唆するものにすぎないか、又はヒトナイーブ幹細胞がMUC1*経路を介して伝播し、通常、ナイーブ状態からしか分化することができない自然状態とは全く関連するものではない。そのため、これまでにヒト幹細胞の多能性からの離脱を示唆するものとして同定されたマイクロRNAは、偽多能性の非自然状態からの離脱を示唆するマイクロRNAであるにすぎず、そのためヒトのがんの治療には全く役に立たない。したがって、がんを治療するのに使用することができる、分化を誘導するマイクロRNAプロファイルを正確に同定するためには、マウス幹細胞経路ではなくヒト幹細胞経路を刺激する成長因子下で培養された、ヒト幹細胞において自然な多能性状態であるナイーブ幹細胞を使用する必要がある。ヒトの幹細胞又は前駆細胞の分化を調節するマイクロRNAを正確に同定する方法は、ナイーブ状態から分化させたヒトナイーブ幹細胞に対して差分分析を行うことである。次いで、ナイーブ幹細胞が分化を開始した時点で上方調節されているマイクロRNAを同定し、それをがんの治療に使用することができる。好ましい実施形態では、ナイーブ細胞は、NM23(二量体形態)中、抗MUC1*抗体で被覆した表面上でヒト幹細胞を培養することによって得られる。より好ましい実施形態では、抗MUC1*抗体で被覆した表面はVita様表面である。他の実施形態では、ナイーブ様幹細胞を、NM23二量体中、不活性化ヒトフィーダー細胞の層上、又はヒトがん細胞の層上、又はそれらの分泌物の存在下で培養することができる。新たに分化したナイーブ幹細胞に存在するが、がん細胞では欠けているマイクロRNAを同定し、それを抗がん治療剤として使用する。
MUC1は、C末端から始まり、細胞膜を通り、細胞外ドメインへと出るという順番で列挙される、本明細書中で以下のように呼ばれる幾つかの領域を含む。MUC1受容体の基本構造は、1)細胞質尾部と、2)膜貫通部と、3)MGFRと、4)IBRと、5)特異領域と、6)反復領域と、シグナルペプチドを含むN末端領域とを含む。MUC1並びに正常細胞及び腫瘍細胞におけるその機能の詳細な説明に関しては、国際出願PCT/US2005/032821号(その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする)の細胞表面上の切断されたMUC1の機能及び活性の記載を参照されたい。
完全長MUC1受容体(ムチン1前駆体、Genbankアクセッション番号:P15941)
MTPGTQSPFF
LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL
APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS
APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS
TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR
ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHIS
NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ
FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN
YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号1)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(配列番号2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT
VVTA(配列番号3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT
VVTG(配列番号4)
G TINVHDVETQ
FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN
YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号5)
GFLGLS
NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG
IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE
KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号6)
ATTTPASKST
PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS TVPPLTSSNH
STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI
YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ
FNQYKTEAAS
RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL
VALAIVYLIA
LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP
PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号7)
GSGHASSTPG
GEKETSATQR SSVPSSTEKN AFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ
LTLAFREGTI NVHDMETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA
LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS
YTNPAVAATS ANL(配列番号8)
LDPRVRTSAP
DTRPAPGSTA PQAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA
PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP
DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA
PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP
DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA
PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP
DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA
PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DNRPALGSTA PPVHNVTSAS
GSASGSASTL VHNGTSARAT TTPASKSTPF SIPSHHSDTP TTLASHSTKT DASSTHHSSV PPLTSSNHST
SPQLSTGVSF FFLSFHISNL QFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ
LTLAFREGTI NVHDVETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA
LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS
YTNPAVAAAS ANL(配列番号9)
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号10)
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号11)
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号12)
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号13)
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS(配列番号14)
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPF(配列番号15)
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS
DVPFPFSAQSGA(配列番号16)
GFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(配列番号17)
SVVVQLTLAFREG(配列番号18)
PDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA(配列番号19)
最小培地(「MM」)500mLには以下のものが含まれる:400mlのDME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen、#10565−018)、100mlのノックアウト血清代替物(Invitrogen、#10828−028)、5mlの100×MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen、#11140−050)、0.9ml(0.1mM)のβ−メルカプトエタノール(55mMストック液、Invitrogen、#21985−023)、任意で異物混入のリスクを最小限にするために2.5mlのPSA(ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン)(MP Biochem、#1674049)を含んでいてもよい。
6成分最小培地「MN6」は、1%非必須アミノ酸と、64mg/Lアスコルビン酸(Sigma)と、14ug/Lセレン酸ナトリウム(Sigma)と、19.4mg/Lインスリン(Sigma)と、543mg/L重炭酸ナトリウム(Sigma)と、10.7mg/Lトランスフェリン(Sigma)とが添加された、DMEM/F12/GlutaMAX又は細胞培養に好適な同様の基本培地からなるものである。
ウサギポリクローナル抗体は、動物をMUC1成長因子受容体ペプチドの一次配列(PSMGFR)を用いて免疫化させることによって生成した。血清を標準方法に従って採取した後、PSMGFRペプチド又は最後の10個のC末端アミノ酸を欠いたPSMGFRペプチド「C−10ペプチド」のいずれかを結合させたアフィニティーカラム上で精製した。次いで精製した抗体(それぞれSDIX−抗FLR及びSDIX−抗C−10)をプラスチック製の細胞培養プレート(Vitaプレート、ThermoFisher、又はBD
Falcon、#353046)上に直接被覆し、該抗体が幹細胞の付着を促すことを確認した。表面を抗体で被覆するために、完全な表面被覆を可能にする一定容量のPBS中で1ug/mL〜300ug/mLの濃度の抗体を4℃で一晩、又は室温でおよそ3時間、インキュベートした。これらの抗PSMGFR表面に結合するヒト幹細胞及び付着量は表面上に被覆される抗体の濃度に対応するものであり、対照抗体では幹細胞の付着は全く起こらなかった。図24a〜図24cを参照されたい。ヒト幹細胞H9(WiCell)及びBGO1V/hOG細胞(Life Technologies)は、低ナノモル濃度の二量体形態のNM23−H1の存在下で最小幹細胞培地「MM」単独、又はヒト若しくはマウスのいずれかの線維芽細胞フィーダー細胞由来の50%馴化培地が添加されたMM+4ng/mL bFGF中で培養した場合、未分化幹細胞として付着するとともに増殖した。プレート表面に付着した二価抗PSMGFR抗体が、MUC1*受容体の二量体化を引き起こし、そのことから成長因子として作用したと結論づけた。しかしながら、細胞は培地にNM23(二量体)を添加した場合により高速で増殖した。
細胞表面からはより遠位にあるMUC1*細胞外ドメイン部分と選択的に結合するMUC1*モノクローナル抗体を同定し、これらのモノクローナル抗体が、表面へのヒトES細胞及びヒトiPS細胞の付着をより良好に促すことを確認した。マウスをPSMGFR配列で規定されるペプチドを用いて免疫化した。ハイブリドーマクローンの上清を、PSMGFRペプチドとの結合能に関してELISAによって試験するとともに、どれが生きたMUC1*陽性細胞と結合するかを決定するためにFACSによって試験した。ハイブリドーマは、10C末端アミノ酸を欠いたPSMGFRペプチドとは選択的に結合するが、該ペプチドが10N末端ペプチドを欠いていると結合しない場合に更に選択された。加えて、ハイブリドーマを、プラスチック製の細胞培養プレート等の表面への幹細胞の付着を促す能力に関してスクリーニングした。これらのクローンの中で、表面上に被覆した場合、幹細胞を捕獲するとともにその成長を促す2D6C8及び2D6C3という2つのクローンを選択した。
モノクローナル抗体2D6C8又は2D6C3を多様なプラスチック製の細胞培養プレート上に被覆し、多様な細胞源由来のヒト幹細胞を捕獲する能力に関して試験した。3ug/mL〜125ug/mLの範囲の濃度の抗体およそ1mLを多様なメーカーからの標準的なプラスチック容器又は組織培養処理プラスチック容器上に被覆した。表面への抗体及び続く幹細胞の付着に関しては、組織培養処理プレートが未処理のポリスチレンよりも僅かに優れていたことが観察された。先の実施例と同じように、最小幹細胞培地(MM)単独中での成長によって幹細胞の増殖が起こったが、低ナノモル濃度のNM23−H1(二量体)又は二価抗PSMGFR抗体が培地中に存在する場合に、この増殖が大幅に改善されたことが観察された。
非被覆の(bare)又は125ugの2D6C8モノクローナル抗MUC1*抗体若しくは2D6C3モノクローナル抗MUC1*抗体のいずれかで被覆したVitaプレート(ThermoFisher)を、幹細胞の付着、及び続く成長を促す能力に関して試験した。MEFフィーダー細胞上で成長させ、最小幹細胞培地(MM)+8nM NM23−S120G中で培養した胚性幹(ES)細胞(H9)を手動で採取し、コロニー片をVita単独又は2D6C8 mabで被覆したVita又はVita+2D6C3 mab上にプレーティングした。第2の幹細胞源を同一の表面上にプレーティングした。これらは、マトリゲル上で成長させ、4ng/ml bFGF+マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞由来の50%馴化培地中で培養したH9 ES細胞であった。未分化コロニーを手動で切り取り(dissected)、採取した後、Vita単独又はVita+抗MUC1*抗体上にプレーティングした。プレーティング後、幹細胞を培地中で培養させた。どちらの培地でも、細胞を二量体形態の8nM NM23又は4ng/mL bFGF+マウスフィーダー細胞由来の50%馴化培地中で予め成長させた。驚くべきことにbFGF−MEF−CM中で培養した幹細胞を除く、Vita単独及びVita+2D6C8の両方に付着するNM23−MM中で培養した幹細胞が付着不良を示し、付着した僅かの細胞が1〜2日後に線維芽細胞様細胞へと分化するか又は死滅した。Vita単独表面に結合したNM23−MM幹細胞は、Vita+2D6C8抗体表面上のものより迅速に分化した。細胞源の細胞がNM23中で培養され、表面が抗PSMGFR抗体(2D6C8)で被覆したVitaプレートであった場合、プレーティングの8日後まで未分化コロニーのままであった。これらのコロニーは、採取し、新たなVita+2D6C8表面上で継代したところ、更に5日間、成長速度が低減せずに未分化コロニーとして成長し続けた。実験設定及び実験結果を図1に示す。図2は、図1の実験設定において見られるような、培地を変える前である2日目のウェルの写真を示している。bFGF及び馴化培地中で培養したウェル内の細胞は付着せず、1回目の培地の交換によって失われた。NM23−MM中で培養した左側の(left-most)カラムのウェル内の細胞は両方とも未分化幹細胞コロニーを形成した(図2、図3)。しかしながら、2D6C8抗体で被覆した表面のみでコロニーが生じ、5日目まで未分化のままであったため(図4)、連続継代することができた。結論として、Vita表面単独では、2D6C8又は2D6C3等の抗PSMGFR抗体で被覆したVita表面と同様にヒト幹細胞の成長を支持することはできなかった。さらに、bFGF+フィーダー細胞馴化培地中で培養した場合、抗体被覆を行っても又は行わなくてもVita表面上でプレーティングした幹細胞は成長が促されることはなかった。図5の実験設定、並びに図6(2日目)及び図7(7日目)の画像は、細胞を抗体被覆表面上にプレーティングする際に幹細胞の体積が低減する場合、細胞付着及びコロニー形成が3倍超になることを示している。4mLではなく1mLのプレーティング細胞で、より大きな体積の3つのコロニー付着と比較して最大14個のコロニーが形成された。図6及び図7で言及されている時間は、MM単独中で細胞をプレーティングした時点と、二量体形態のNM23を添加した時点との間の時間に相当する。該時間はプレーティング後0分〜3時間で最適であると考えられる。
ヒトES細胞及びヒトiPS細胞の付着及び増殖の効率を改善する幾つかの要因を特定した:1)トリプシン処理した(又はそうでなければ単一の)幹細胞は、抗PSMGFR抗体被覆表面を使用する場合、特にベース表面がVita表面と類似の原子組成の表面である場合、コロニー片よりも良好に作用し、2)予め低ナノモル濃度の二量体NM23中、フィーダー細胞又はマトリゲル等の他の表面上で培養した細胞はbFGF中で培養した細胞よりも良好であったが、この効果はプレーティングの直前の低ナノモル濃度の二量体NM23中での30分のインキュベーションによって最小限になる場合があり、3)プレーティング後の初めの24時間のRhoキナーゼ阻害剤の使用によって、幹細胞の付着が改善されるが、幹細胞の生存には影響を与えなかった。さらに、幹細胞成長培地の容量を6ウェルプレートの1ウェル当たり4mLから2mL又は1mLへと低減させることで幹細胞の付着が増進したことに注目した。さらに、細胞成長培地を48時間ごとではなく24時間ごとに交換し、4mLではなく2mLの培地を用いることで、一部の細胞型の維持が改善した。
先の実験では、付着の不良又は塊状での細胞付着のために継代中に幹細胞が大幅に喪失した。本実験では、Vita表面+Rhoキナーゼ阻害剤(ROCi:Y−27632、Calbiochem)又はROCiを含まないVita+抗MUC1*抗体又はVita表面+抗MUC1*抗体+ROCi上でのiPS細胞及びES H9細胞の両方に関する付着、成長及び分化を比較した。細胞の塊化を最小限に抑えるために、初めに未分化幹細胞コロニー片をトリプシン処理し、単一細胞を得た(トリプシンは0.05%で使用し、0.5g/L又は21.45μMであり、50mlの1×溶液として供給されている(Mediatech, Inc.、カタログ番号:25−052)。
本実験では、前もってbFGF中、MEFフィーダー細胞上で培養した後、単一細胞として、a)Vita表面上にプレーティングし、次いで4ng/mL bFGF、50% MEF馴化培地及び10uM ROCi(Y−27632、Calbiochem)中で培養するか、又はb)12.5ug/mL D26C3抗PSMGFR抗体で被覆したVitaプレート上にプレーティングし、次いで初めの48時間のみ10uM ROCiを存在させて8nM NM23二量体−MM中で培養した、ヒト幹細胞の付着、成長、及びヒトES細胞の自然分化に対する耐性を比較した。図12eに示される比較によって、表面を抗PSMGFR抗体で被覆すること又は細胞をNM23二量体−MM中で培養することを含むものではなかった現行の技術水準を上回る改善が示される。
ROCiの有無での幹細胞付着の直接比較において、ROCiの非存在下では、幹細胞が表面に付着する前に塊化することが観察された。一部のコロニーが細胞の塊の下に形成されたが、大抵の場合、細胞の塊化は表面への幹細胞の付着過程を阻害するものであった。ROCiの存在下で幹細胞の付着で観察された改善は、細胞が表面に付着するまで、単一細胞として細胞の分離状態を維持することであると考えた。代替的に、良好な幹細胞付着が、プレーティング前に幹細胞をトリプシン処理することによって達成された。EDTAの添加(本発明者らは、0.1mM〜1.0mM EDTAを使用した)によっても、表面への幹細胞の接着が増大した。別の方法では、溶液中に幹細胞を含むプレートを遠心することで、細胞を表面に接触させ、幹細胞付着をもたらし、それによる成長は、プレーティング後、初めの24時間〜48時間、10uM ROCiが存在する事例と変わらないものであった。
実施例7.1 − 組換えNM23−wt及びNM23−S120Gのクローニング
WT NM23−H1 cDNAを、以下のプライマー:5'-atc
gat gga tcc gat ggc caa ctg
tga gcg tac
c-3'(配列番号38)及び5'-gtg gtg ctc gag ttc ata
gat cca gtt ctg agc-3'(配列番号39)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。BamHI制限酵素及びXhoI制限酵素(New England Biolabs)による消化の後、精製フラグメントを、同じ制限酵素によって消化させたpET21bベクター(Novagen)にクローニングした。次いで、以下のプライマー:5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'(配列番号40)及び5'-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'(配列番号41)を使用して、メーカーの使用説明書に従ってGeneTailor(商標)部位特異的突然変異誘発システム(Life Technologies)を用いることでNM23−H1突然変異体S120G(#120のセリンをグリシンへと突然変異させた)を生成した。配列確認の後、WT及び突然変異体NM23−H1構築物を、組換えタンパク質発現のためにBL21(DE3)細胞(Life Technologies)へと形質転換させた。
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga(配列番号42)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH(配列番号43)
LBブロス(ルリア−ベルターニブロス)を一晩培養物の1/10で植菌し、OD600がおよそ0.5に達するまで37℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、0.4mMイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトシド(IPTG, Sigma)を用いて誘導し、培養を4時間後に停止させた。細胞を遠心分離(4℃で10分間、6000rpm)によって採取した後、細胞ペレットを泳動バッファー:PBS(pH7.4)、360mM NaCl及び80mMイミダゾールで再懸濁した。次いでリゾチーム(1mg/mL、Sigma)、MgCl2(0.5mM)及びDNアーゼ(0.5ug/mL、Sigma)を添加した。細胞懸濁液を37℃で30分間、回転台(275rpm)の上でインキュベートし、5分間氷上で超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除いた。次いで、残屑を除去した(cleared)溶解物を、泳動バッファーで平衡化したNi−NTAカラム(Qiagen)に適用した。カラムを洗浄した後、420mMイミダゾールが添加された泳動バッファーによって、タンパク質をカラムから溶出させた。溶出画分を非還元SDS−PAGEで分析し、タンパク質を含む画分を組み合わせた。特に指定のない限り、構成要素は全てSigmaのものとした。
NM23 H1 S120Gを、変性バッファー:100mM Tris(pH8.0)及び8M尿素を用いて変性させた。次いで、変性タンパク質を透析によってリフォールディングに供した。タンパク質を、1)100mM Tris(pH8.0)、4M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA(Fluka)及び5%グリセロール(Acros)、2)100mM Tris(pH8.0)、2M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロール、並びに3)100mM Tris(pH8.0)、1M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して24時間連続して透析した。次いで、タンパク質を、100mM Tris(pH8.0)、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して9時間、並びに25mM Tris(pH8.0)、0.2Mイミダゾール、0.1M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して一晩透析した。最後に、タンパク質を、PBS(pH7.4)、0.2Mイミダゾール、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して4回バッファーを交換して24時間透析した。特に指定のない限り、構成要素は全てSigmaのものとした。不溶性の凝集物を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除き、二量体(およそ37KDa)を、泳動バッファーとしてPBS(pH7.4)を用いたSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ピーク画分を非還元SDS−PAGEで分析し、二量体を含む画分を組み合わせた。
NM23タンパク質のオリゴマー形成状態を、ゲル濾過標準(Bio-Rad)で較正したSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE
healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって推測した。NM23機能の重大な特徴はその多量体化状態であり、その中でもNM23の二量体形態は多能性及び細胞成長を促す活性型である。
miR−145発現の増大は、幹細胞の多能性からの離脱を示唆するものである。成長因子を幹細胞培地に与えない(これは分化を誘導する標準的な方法である)と、それに応じてmiR−145発現が急増する。RT−PCR測定結果は、NM23S120G二量体−MUC1*相互作用の遊離MUC1* ecdペプチドによる競合阻害によって、単純に成長因子NM23S120G二量体又はbFGFを与えないことで細胞を分化させることで引き起こされるものよりも早期でかつより大きなmiR−145の発現の急増がもたらされたことを示していた(図22i)。これらの結果によって、このことがNM23S120G二量体の、多能性を促進するMUC1*成長因子受容体の細胞外ドメインとの結合の特異的相互作用であることが実証される。
マトリゲル上のH9 hES細胞を、MM(最小幹細胞培地)中の8nM NM23二量体又はMM+MEF馴化培地中の4ng/mL bFGFで6継代にわたって培養した後、胚様体法によって分化させた。続く核マーカーDAPI及び3つの生殖系列のマーカーに対する抗体による染色を行った:図23aは内胚葉−αフェトプロテインを示し、図23bは外胚葉−ネスチンを示し、図23cは中胚葉−平滑筋アクチンを示す。NM23−MM中で培養した幹細胞は3つ全ての生殖系列ヘと分化し、単一クラスタ内の殆どの細胞が同じマーカーに対して陽性染色した。bFGF及びMEF馴化培地中で培養した幹細胞も3つ全ての生殖系列ヘと分化したが、多くの場合で協調分化を示さず、最近接核は試験した生殖系列マーカーに対して陰性染色した(図23d〜図23f)。
2D6C3モノクローナル抗体又は2D6C8モノクローナル抗体を、3.25ug/mL〜125ug/mLの濃度で組織培養処理プレートの表面上に被覆し、室温で3時間、又は4℃で一晩インキュベートした。ヒトES細胞及びヒトiPS細胞はこれらの抗体被覆表面上に容易に付着し、連続継代することができた。多能性マーカーでのICC染色及びRT−PCRから明らかなように、得られた幹細胞は多能性であった。
Vita表面を、MUC1*受容体を二量体化することによって、幹細胞付着方法及び成長刺激方法の両方として機能するモノクローナルMUC1* ecd抗体(D26C3)で被覆した。図24a〜図24cは、幹細胞がD26C3抗体被覆密度に応じて付着及び増殖したが、対照抗体を使用した場合には幹細胞の付着は観察されなかったことを示す。幹細胞は、任意の成長因子、すなわちNM23又はbFGFの非存在下において最小幹細胞培地単独で培養したとしても、表面に固定化した抗体からのMUC1*の二量体化によってこれらのMUC1*抗体表面上で増殖した。しかしながら、成長速度は最小培地中でのNM23の使用によって大幅に改善した。場合によっては、Rhoキナーゼ阻害剤を初めの48時間存在させ、表面への付着を増大させたが、生存には影響を及ぼさなかった。ES細胞及びiPS細胞は、NM23−MM中のこれらのMUC1*抗体表面上で、成長速度又は多能性を低減させることなく20継代を超えて連続継代した。さらに、NM23−MM中のMUC1*抗体表面上で成長する幹細胞は、連続継代ごとに成長速度が劇的に増大した。4継代までに、プレーティングした600000個のiPS細胞は4日で7.9M未分化幹細胞へと13倍に増大した。同様に、5継代までに、H9細胞は17倍に増大した(図24d〜図24f)。標準多能性マーカーによるICC染色によって、細胞が多能性であり、正常な核型を有していたことが確認された(図S24a及び図S24b)。加えて、得られるES細胞及びiPS細胞は、3つ全ての生殖系列へと分化することが可能であった(図24g〜図24l)。要約すると、NM23−MM中、D26C3抗体表面上の成長によって、手動で切り離すことなく、より少ない時間でより多くの未分化幹細胞が生じた。
実施例10.1 − ナイーブ細胞又はプライム細胞
NM23−MM中のMUC1*抗体表面上で培養した幹細胞の質を更に評価するために、「ナイーブ」状態又は基底状態にあるヒト幹細胞の指標となる遺伝子の発現レベルを測定した。ナイーブ幹細胞において通常、Klf4及びKlf2が高く、FoxA2及びXIST(X不活性化の指標)は非常に低いか又は全く発現しない。細胞がより分化した状態である「プライム」状態になると、遺伝子発現パターンの逆転が起こる。NM23−MM中、MUC1*抗体表面上で、bFGF中、MEFフィーダー細胞上で、又はmTeSR中、マトリゲル上で培養した幹細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルを比較した。NM23−MM中、MUC1*抗体表面上で培養した幹細胞は、bFGF中、MEF上で培養した細胞よりも高いレベルのナイーブマーカーと、低いレベルのプライムマーカーとを発現した。mTeSR中、マトリゲル上で培養した細胞は、bFGF中、MEF上で培養した細胞と比較してより高いレベルのFoxa2及びXIST(プライム状態の指標となる)と、より低いレベルの幾つかのナイーブマーカーとを発現した(図25a)。
様々な条件で成長させた細胞を採取した。細胞をペレット化し、分析時間まで−70℃で凍結させた。総RNAを、メーカーの使用説明書に従ってTRIzol(商標)試薬(Life
Technologies)を用いてサンプルから抽出した。RNAサンプル中のFOXa2(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00232764_m1)、KLF4(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00358836_m1)、NANOG(Applied Biosystems、アッセイID:Hs02387400_g1)、KLF2(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00360439_g1)、XIST(Applied biosystems、アッセイID:Hs01079824_m1)、OCT4(POUクラス5ホメオボックス1)(ABI、アッセイID:Hs00999634_gH)及びGAPDH(Applied Biosystems、P/N:4310884E)の定量化を、メーカーの使用説明書に従ってTaqMan(商標)ワンステップRT−PCRマスターミックス試薬(Applied Biosystems、P/N:4309169)を使用して行った。リアルタイムPCRのデータを、比較Ct法を用いて分析した。各サンプル中の各転写産物の相対量を、標的Ctと、対応するGAPDHのCtとの差(ΔCt)を計算することで求めた。2回目の正規化を、データセットでの他の全てのΔCtからMEF/FGFサンプルのΔCtを減算することによって行った(ΔΔCt)。
NM23の、完全に規定された異種成分を含まない6成分培地(MN6)中で単一成長因子としてES細胞及びiPS細胞の成長を支持する能力を試験した。結果によって、NM23−MN6が1ウェル当たり12.5ugで、MUC1*抗体表面及びビトロネクチン等の他の表面上で多能性幹細胞の連続継代を完全に支持したことが示される(図26a〜図26f)。驚くべきことに、NM23とともにMN6培地を使用することで、初めの24時間〜48時間Rhoキナーゼ阻害剤の必要性が排除されると考えられる(図26g〜図26l)。
プライム状態のH9胚性幹細胞から出発した。該幹細胞をbFGF中、マウスMEFフィーダー細胞上でおよそ30継代にわたって培養した。細胞の第1のセットをbFGF中、MEF上で培養し続けた。第2の群はヒトフィーダー細胞(HS27)上へと移したが、第1のセットと同様に4ng/mlのbFGF中で培養した。細胞の第3のセットをNM23−S120G中で培養したが、マウスMEFフィーダー細胞上に残した。細胞の第4のセットをヒトフィーダー細胞(HS27)上に移して、NM23−S120G中で培養した。全ての細胞を更に6継代にわたってこれらの条件に従って培養した。次いで細胞をナイーブ幹細胞状態のマーカーであるKlf4、及びプライム幹細胞状態のマーカーであるFoxa2の存在に関して染色した。図27〜図35は、NM23中で培養するとともに、ヒトフィーダー細胞に曝した細胞だけがナイーブ幹細胞マーカーKlf4を発現し、プライム幹細胞マーカーであるFoxa2は発現しなかったことを示している。
二量体形成を選好するNM23突然変異体がヒトがんにおいて同定されている。これらの突然変異体の幾つかが、MUC1*と結合せず、多能性を促進しない四量体及び六量体の形成を抑える。NM23−S20G等の突然変異体は、野生型(wt)タンパク質よりも二量体形成を選好するが、高濃度の六量体が分化を誘導しない溶液を得るために、S120G突然変異体を任意で変性し、リフォールディングして、二量体画分をFPLC等の方法を用いて精製する。突然変異NM23−P96Sも、二量体形成を選好し、組換えタンパク質として発現する場合にS120G突然変異体より可溶性となる。NM23は、P96S突然変異に加えて、C末端に0個、1個、2個又は6個のアミノ酸欠失を含むように標準方法によって生成された。図36は、組換えタンパク質の発現の可溶性画分のFPLCトレースのオーバーレイである。図36は、NM23−P96S+2個又は6個のC末端欠失では、MUC1*活性化に好適な二量体形態のNM23がかなりの割合を占めていたことを示している。NM23−P96S+6個のC末端欠失が好ましいが、これは可溶性タンパク質として大部分が二量体であるためである。
以下のプライマー:5'-tcggggagaccaactctgcagactccaag-3'(配列番号45)及び5'-cttggagtctgcagagttggtctccccga-3'(配列番号46)を使用して、メーカーの使用説明書に従ってQuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Agilent)を用いることでNM23−H1突然変異体P96S(#96のプロリンをセリンへと突然変異させた)を生成した。配列確認後、欠失構築物をPCRによって生成した。NM23 P96S ΔC1を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号47)及び5'-gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca-3'(配列番号48)を用いて増幅した。NM23 P96S ΔC2を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号49)及び5'-gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct-3'(配列番号50)を用いて増幅した。NM23 P96S ΔC6を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号51)及び5'-gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca-3'(配列番号52)を用いて増幅した。得られるフラグメントを精製し、消化し(NdeI、AgeI)、発現ベクターpET21bのNdeI制限部位とAgeI制限部位との間にクローニングした。pET21bは予め、XhoI制限部位をAgeIに置き換えることで修飾した。
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga(配列番号53)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH(配列番号54)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcaccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号55)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWITGHHHHHH(配列番号56)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctaccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号57)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCATGHHHHHH(配列番号58)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctataccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号65)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYTGHHHHHH(配列番号66)
LBブロス(ルリア−ベルターニブロス)を一晩培養物の1/10で植菌し、OD600がおよそ0.5に達するまで37℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、0.4mMイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトシド(IPTG, Sigma)を用いて誘導し、培養を4時間後に停止させた。細胞を遠心分離(4℃で10分間、6000rpm)によって採取した後、細胞ペレットを泳動バッファー:PBS(pH7.4)、360mM NaCl及び80mMイミダゾールで再懸濁した。次いでリゾチーム(1mg/mL、Sigma)、MgCl2(0.5mM)及びDNアーゼ(0.5ug/mL、Sigma)を添加した。細胞懸濁液を37℃で30分間、回転台(275rpm)の上でインキュベートし、5分間氷上で超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除いた。次いで、残屑を除去した溶解物を、泳動バッファーで平衡化したNi−NTAカラム(Qiagen)に適用した。カラムを洗浄した(8CV)後、420mMイミダゾールを添加した泳動バッファー(6CV)によって、タンパク質をカラムから溶出させた。タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200)によって更に精製した。
min 分
hr 時間
図7
min 分
hr 時間
UN 未分化
DIFF 分化
図9
Vita alone Vita単独
図11
Antibody 抗体
図12a
5 days post plating プレーティングの5日後
図12b
Day 5 5日目
図12d
Day 5 5日目
図19
tryp トリプトファン
2day post SC H9s SC H9の2日後
hrs 時間
図20
tryp トリプトファン
2day post SC H9s SC H9の2日後
hrs 時間
図22
hexamer 六量体
tetramer 四量体
dimer 二量体
monomer 単量体
NM23S120G-mixed NM23S120Gミックス
NM23S120G-hexamer NM23S120G六量体
NM23S120G-dimer NM23S120G二量体
Time(s) 時間(秒)
normalized 正規化
No protein タンパク質なし
Peptide ペプチド
hrs 時間
withdrawn 排除
図S22
hexamer 六量体
tetramer 四量体
dimer 二量体
monomer 単量体
NM23S120G-hexamer NM23S120G六量体
NM23S120G-mixed NM23S120Gミックス
NM23S120G-dimer NM23S120G二量体
NativePAGE Novex
4-16% Bis-Tris Gel ネイティブPAGE Novex 4%〜16% Bis−Trisゲル
h 時間
図23
Alpha Feto
Protein αフェトプロテイン
Nestin ネスチン
Smooth Muscle Actin 平滑筋アクチン
図24
Calcein カルセイン
Anti-MUC1* 抗MUC1*
Control Ab 対照抗体
# of Cell X 10^6 細胞数×106
H9 ES Cells H9 ES細胞
iPS Cells iPS細胞
Alpha Feto Protein αフェトプロテイン
Beta-Tublin β−チューブリン
Smooth Muscle Actin 平滑筋アクチン
図S24a
MERGED マージ
図S24b
MERGED マージ
図25
Fold Change Relative
to MEF/FGF CT MEF/FGF CTに対する倍数変化
matrigel マトリゲル
vitronectin ビトロネクチン
図26
MUC1* antibody surface MUC1*抗体表面
NO ROCi ROCiなし
Vitronectin Surface ビトロネクチン表面
図36
dimer 二量体
図37
PRIMED markers プライムマーカー
NAIVE markers ナイーブマーカー
matrigel マトリゲル
Claims (1)
- ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるようにFoxa2の発現が陽性であるヒトのプライム幹細胞からKlf4の発現が陽性であるヒトのナイーブ幹細胞を誘導する方法、又はKlf4の発現が陽性であるヒトのナイーブ幹細胞をKlf4の発現が陽性であるナイーブ幹細胞状態に維持する方法であって、
前記ヒトのナイーブ幹細胞の誘導に使用するヒトのプライム幹細胞又は前記ヒトのナイーブ幹細胞の維持に使用するヒトのナイーブ幹細胞を、NM23又は、NM23−S120G、NM23−P96S、及び、2個又は6個のC末端欠失を有するNM23−P96Sの群から選択されるいずれか1つの二量体を選択的に形成するNM23の変異体の存在下かつRhoキナーゼ阻害剤の非存在下で培養することを特徴とし、
配列番号10〜16から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるペプチドに結合するポリクローナル抗体若しくは配列番号10〜16から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるペプチドに結合するモノクローナル抗体で被覆された培養プレート上で、又は、
ヒトHS27包皮線維芽フィーダー細胞の存在下で培養することを含む、方法。
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