JP2017221204A - 多能性幹細胞を作製する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】胚、又は人工多能性状態から採取した直後にヒト幹細胞をナイーブ幹細胞として伝播させる方法及びプライム幹細胞をナイーブ状態へ戻し長期間維持する方法の提供。【解決手段】ナイーブ幹細胞状態の特性が得られる様に、Foxa2の発現が陽性であるヒトのプライム幹細胞からKlf4の発現が陽性であるヒトのナイーブ幹細胞を誘導する方法又はKlf4の発現が陽性であるヒトのナイーブ幹細胞をKlf4の発現が陽性であるナイーブ幹細胞状態に維持する方法。NM23又はNM23−S120G、NM23−P96S、及び、2個又は6個のC末端欠失を有するNM23−P96Sの群が選択される一つの二量体を選択的に形成するNM23の変異体の存在下で、Rhoキナーゼ阻外剤の非存在下で培養し、特定のアミノ酸配列のペプチドに結合するモノクロナール抗体で被覆されたプレート上で、ヒトHS27包皮線維芽フィーダ細胞の存在下で培養する方法。【選択図】なし
Description
従来、ヒト幹細胞は、線維芽細胞フィーダー細胞が幹細胞の成長を増大させるとともに幹細胞の自然分化を阻害する未知の因子を分泌することから、フィーダー細胞層上で成長させてきた。最近になって、幹細胞の成長を可能にする規定表面(defined surfaces)を開発する目的から、マトリゲルが、bFGF及び線維芽細胞フィーダー細胞由来の馴化培地(細胞分泌物)と併用した場合に幹細胞の成長を支持する表面被覆として認定されている。改善点として、本発明者はこれまでに、幹細胞成長培地が、MUC1*アクチベータ、例えば二価の抗MUC1*抗体又は二量体形態のNM23、好ましくは四量体及び六量体の特徴的な形成を抑えながら、二量体を選択的に形成するNM23−S120G等の突然変異体を含んでいれば、マトリゲル上での幹細胞の成長には、フィーダー細胞由来の馴化培地は必要ではないことを究明している。
しかしながら、マトリゲル層上での幹細胞の成長は細胞ベースの表面よりは改善されているが、マトリゲルは治療上の使用を目的とする(destined for)ヒト幹細胞の成長のための最終目標とされる規定の又は異種成分を含まない(xeno-free)表面ではない。マトリゲルは、ヒト移植を目的とする細胞には望ましくない構成要素が混合したものである。マトリゲルには、とりわけマウス肉腫細胞が含まれる。したがって当業者であれば、必要とされるものが、規定の、好ましくは異種成分を含まない(動物材料を含まない)幹細胞成長のための表面であることが理解される。
異種成分を含まない規定の表面が幾つか報告されており、市販されているものもある。Vita(商標)表面(ThermoFisher, USA)、ヒドロゲル被覆表面、及び組換えビトロネクチンは、幹細胞の付着及び成長を促すと報告されている。しかしながら、これらには依然として、フィーダー細胞馴化培地の使用が必要とされる。加えて、幹細胞の付着の程度は概して、マトリゲルが支持するものよりも低い。この分野が抱える別の問題は、幹細胞の成長培地又は表面を変える際は必ず、幹細胞を徐々に適応させなければならないことである。この適応期間は、幹細胞の培地又は成長表面を変えるのに数週間から数ヶ月かかる場合がある。
近年の研究によって、表面の機械的性質が幹細胞の多能性維持能に影響を与えることが示されている。例えば、剛体表面が分化を誘導し、より弾性の表面が自然分化を阻害することが分かっている。圧力は幹細胞の分化又は分化に対する抵抗性に影響を与える別の因子である。表面の機械的特徴に加えて、表面の化学的性質が分化に影響を与えることが分かっている。さらに、異なる分化段階の幹細胞が異なる結合選択性を有することが報告されている。すなわち、或る段階にある幹細胞は、或る特定の化学的特徴を有する表面に付着するとともに成長することができ、別の段階にある幹細胞はこの第1の表面には結合しないが、第1の表面とは異なる化学組成を有する第2の表面に付着するとともに成長する。
したがって、幹細胞の付着を可能にし、また多能性幹細胞の成長を促進するヒト幹細胞の成長及び維持のための規定表面を開発することは、既存の方法を上回る改善であると考えられる。これらの規定成長表面を、多能性を促進することが知られているリガンドと結合させれば、現行の技術水準の更なる改善となる。多能性幹細胞の成長のための完全に規定されたシステムを作製するような表面及び成長培地が開発されれば、更なる一層の改善となり、システムが動物産物を含まなければより好ましいとされる。通常4〜8週間の順化期間を経ずに成長培地又は成長表面を変えることができるように、幹細胞の適応を合理化する方法を特定することができれば、現行の技術水準の大幅な改善となる。
近年、研究者ら(非特許文献1、非特許文献2)によって、従来方法により成長させたヒト幹細胞は、真の多能性幹細胞ではなく、既に「プライム(primed)」と呼ばれるより成熟した状態へと分化していることが報告された。プライム幹細胞は、bFGF/TGF−β経路を介して成長し、内細胞塊由来の「ナイーブ(naive)」又は「基底状態」のマウス幹細胞というよりは胚盤葉上層由来のマウス幹細胞に酷似している。ヒトナイーブ幹細胞対ヒトプライム幹細胞の分野における初期研究の統一見解としては、1)ヒトナイーブ幹細胞はbFGFの存在下では安定ではなく、2)ヒトナイーブ幹細胞を成長させる成長因子又は経路が未知である。
現在、研究によって、bFGF含有培地で培養したヒト幹細胞は真の多能性ではなくなっていることが分かっている(非特許文献2)。Jaenisch他は、重大な研究論文において、ヒト胚性幹(ES)細胞は、「ナイーブ」と呼ばれる真の多能性幹細胞ではなく、「プライム」状態のものであると説明している。現在、研究によって、ナイーブ状態のヒト幹細胞は、主要成長因子がbFGFである標準的な幹細胞成長培地中では維持することができないことが分かっている。
ともに胚盤胞段階の胚由来であるヒトES細胞とマウスES細胞とを比較することによって、研究者らは、ヒトES細胞はマウス幹細胞とは形態学的にかつ分子的に異なることを発見した。研究者らは更に、これまでに単離されてきたヒトES細胞は真の多能性ではなく、より後期の発生段階である胚盤葉上層段階由来のマウス幹細胞により酷似していることを開示した。これらの所見等によって、我々がヒト多能性ES細胞と考えているものが実際は、真の多能性幹細胞よりも成熟したものであることが示される。Jaenisch他は、ナイーブ幹細胞を同定する分子マーカーと、プライム幹細胞を同定するマーカーとを発見している。
研究者らは、LIF並びにグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(ERK1/2)の経路の阻害剤と組み合わせた、Oct4因子、Klf4因子及びKlf2因子の異所性誘導によって、ヒトプライム幹細胞をナイーブ状態へと一時的に戻すことができた。誘導することができるタンパク質キナーゼA経路アゴニストであるホルスコリン、誘導することができるタンパク質キナーゼA経路アゴニストであるホルスコリン
Klf4及びKlf2の発現は、これら2つの遺伝子の異所性発現の必要性に一時的に取って替わっていた。ヒトES細胞がナイーブ状態へと戻ると、該細胞はPD/CH/LIF/FK中で培養する必要があるが、数回の継代しかナイーブ状態を維持することができず、その後プライム細胞へと成熟した。このことは、研究者らが、ヒトES細胞の多能性ナイーブ状態を促進するとともに維持する成長因子を同定することができなかった有力な証拠である。従来のヒトESCとは対照的に、これらの後成的に変換されたナイーブ幹細胞は、Oct4、Nanog、Klf4、Klf2、Tbx3、Gbx2、Lin28及びSOCS3を発現し(ナイーブマーカー)、Otx2、Sox17、Cer1、Foxa2、Zic1、Lhx2及びXISTの発現を喪失したか、又は大きく低減させていた(プライムマーカー)。加えて、ナイーブ状態へと一時的に戻ったプライム細胞は、コロニー状ではなくシート状に成長した。
しかしながら、非特許文献1によって、ナイーブマーカーがOct4、Nanog、Klf4、Klf2、Rex1及びNrOb1であり、ナイーブ細胞が、FGF5及びXIST等のX不活性化のマーカーの発現を喪失したか、又は大きく低減させていたことが報告されている。これら2つの研究チームによって作成されたナイーブマーカー及びプライムマーカーのリストが一致していないのは、分析したナイーブ幹細胞の違いによるものであると考えられる。非特許文献2では、マウスナイーブ幹細胞との類似性により、ナイーブ状態へと一時的に戻ったことが確認された、ヒトプライム幹細胞を分析していた。また、先の研究で同定された遺伝子は、非特許文献2に記載の後のより広範な研究で同定された遺伝子の活性化を引き起こし得る。両研究とも、ナイーブマーカーが少なくともOct4、Nanog、Klf4及びKlf2からなっており、プライムマーカーが少なくともFOXa2及びXISTからなっていることは一致している。
これまでの研究では、ヒト幹細胞をナイーブ幹細胞として伝播させる成長経路又は成長因子(複数の場合もある)を同定することはできなかった。さらに、遺伝子の異所性発現及び因子の集合体(concoction)下での成長を用いても、復帰ナイーブ細胞(reverted-naive cells)は、短期間、ナイーブ状態を維持した後、より分化したプライム段階へと進行した。
ナイーブ幹細胞を培養する方法を特定することができれば、顕著な改善となると考えられる。このような方法には、ナイーブ状態の成長及び維持を刺激する成長経路の特定、それらの増殖を可能にする培地の開発、又はナイーブ幹細胞の成長若しくは単離のためのナイーブ幹細胞が結合する表面の特定が含まれる。
J. Nichols and A. Smith, Cell Stem Cell 4 (6), 487 (2009).
J. Hanna, A. W. Cheng, K. Saha et al., Proc Natl Acad Sci U S A 107 (20), 9222 (2010).
したがって、胚若しくは人工多能性状態のいずれかから採取した直後にヒト幹細胞をナイーブ幹細胞として伝播させる方法、又はプライム幹細胞をナイーブ状態へと戻し、該細胞をその状態に長期間維持する方法が必要とされる。プライム幹細胞をナイーブ状態へと安定して変換させる方法が必要とされており、現行の方法では幹細胞をナイーブ状態に一時的にしか保持することができない。理想的には、ヒト幹細胞をナイーブ状態に維持する方法、又はヒト幹細胞をプライム状態からナイーブ状態へと変換させる方法は、遺伝子の異所性発現を伴わないものとする。
一態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する方法であって、細胞をMUC1*アクチベータの存在下で培養することを含む、方法に関する。細胞は、ヒト細胞、幹細胞、ヒト幹細胞、前駆細胞、胚起源とすることができるか、又はより幹様となるように誘導される。細胞は胚盤胞由来のヒト細胞とすることができる。
この方法では、MUC1*アクチベータは、二量体又は二価の分子、例えばNM23、又はNM23の突然変異体若しくは変異体、又は二価の抗体若しくは抗体変異体とすることができる。
細胞は、ヒトフィーダー細胞又はその分泌物の存在下で培養することができる。フィーダー細胞は線維芽細胞若しくはがん細胞とすることができるか、又はフィーダー細胞は成長的に不活性である(growth inactivated)。
本発明は、ナイーブ幹細胞をナイーブ幹細胞状態に維持する方法であって、細胞をMUC1*アクチベータの存在下で培養することを含む、方法にも関する。
別の態様では、本発明は、ヒト幹細胞株を樹立する方法であって、胚盤胞から細胞を採取することと、細胞をNM23又は二量体NM23の存在下で培養することとを含む、方法に関する。
更に別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する、又はナイーブ幹細胞をナイーブ幹細胞状態に維持する方法であって、誘導元の細胞又はナイーブ幹細胞状態を有する細胞を、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に付着させることを含む、方法に関する。表面では、窒素(N)が少なくとも約0.5%であり、酸素(O)及び窒素(N)の合計量が少なくとも約17.2%以上であり、接触角が少なくとも約13.9度である場合がある。表面は、1.7%〜2.1%の窒素と、26.4%〜28.7%の酸素とを含み、窒素と酸素とが合わせて28.2%〜30.7%である場合があり、表面では、接触角が14.3度〜18.8度である。表面はVita(商標)表面(ThermoFisher, USA)であり得る。
更に別の態様では、本発明は、ナイーブ細胞マーカーの発現が増大した細胞を選択する方法であって、ナイーブ細胞マーカーの発現が増大した細胞を含有すると思われる細胞の集団を、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に曝すことと、選択された細胞を表面の存在下で培養することとを含む、方法に関する。表面では、窒素(N)が少なくとも約0.5%であり、酸素(O)及び窒素(N)の合計量が少なくとも約17.2%以上であり、接触角が少なくとも約13.9度である場合がある。表面は、1.7%〜2.1%の窒素と、26.4%〜28.7%の酸素とを含み、窒素と酸素とが合わせて28.2%〜30.7%である場合があり、表面では、接触角が14.3度〜18.8度である。表面はVita(商標)表面(ThermoFisher, USA)であり得る。
上記のいずれの方法においても、表面は、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質を更に含む場合がある。細胞表面分子はMUC1又はMUC1*であり得る。細胞表面分子はPSMGFR配列であり得る。作用物質は抗体であり得る。抗体はPSMGFRに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。特に、モノクローナル抗体は以下のκ鎖可変領域CDR配列を有する場合がある:
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
上記の方法によると、作用物質はSSEA1、SSEA4、Tra 1−60、Tra 1−81又はCD34に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。記載の作用物質はNM23、又はNM23の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価であり得る。
上記のいずれの方法においても、方法をRhoキナーゼ阻害剤の非存在下で行う場合がある。方法は、表面上にプレーティングする前に、細胞をトリプシン処理して単一細胞にすることを含み得る。また、細胞を例えば規定構造1cm2当たり約1×103個の細胞〜規定構造1cm2当たり1×104個の細胞という低密度で表面上にプレーティングしてもよい。特に、細胞を規定構造1cm2当たり約5263個の細胞でプレーティングする場合がある。
別の態様では、方法は、細胞を低容量の培地、好ましくは表面を被覆するだけの容量の培地で表面上にプレーティングすることを含み得る。この培地の容量は、規定構造1cm2当たり0.1mL〜0.2mLであり得る。細胞をEDTAの存在下で表面上の細胞上にプレーティングしてもよい。さらに、方法は、プレーティングした細胞を、力を加えることで表面に密着させることを含み得る。力は遠心力であり得る。
別の態様では、本発明は、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面を含む物体であって、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質と結合する、物体に関する。
表面では、窒素(N)が少なくとも約0.5%であり、酸素(O)及び窒素(N)の合計量が少なくとも約17.2%以上であり、接触角が少なくとも約13.9度である場合がある。表面はVita表面又はVita様表面であり得る。細胞表面分子はMUC1又はMUC1*であり得る。細胞表面分子はPSMGFR配列であり得る。作用物質は抗体であり得る。抗体はPSMGFRに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。特に、モノクローナル抗体は以下のκ鎖可変領域CDR配列を有する場合がある:
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
作用物質はSSEA1、SSEA4、Tra 1−60、Tra 1−81又はCD34に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。記載の作用物質はNM23、又はNM23の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価であり得る。
別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態又はプライム幹細胞状態の特性を示すマイクロRNAシグネチャを同定する方法であって、
(i)ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をNM23の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
(ii)細胞をMUC1*抗体で被覆した幹細胞増殖表面に付着させるとともに、細胞を成長させることと、
(iii)細胞を採取するとともに、工程(ii)の幹細胞で発現するマイクロRNAを同定することと、
(iv)bFGFベース培地中のヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をネズミフィーダー細胞の層上で別に培養することと、
(v)細胞を採取するとともに、工程(iv)の細胞で発現するマイクロRNAを同定することと、
(vi)工程(iii)で同定されたマイクロRNAと、工程(v)で同定されたマイクロRNAとを比較することと、
(vii)工程(iii)では存在しているか、又は発現が増大しており、工程(v)では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、ナイーブ細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
(viii)工程(v)では存在しており、工程(iii)では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、プライム細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
を含む、方法を含む。
(i)ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をNM23の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
(ii)細胞をMUC1*抗体で被覆した幹細胞増殖表面に付着させるとともに、細胞を成長させることと、
(iii)細胞を採取するとともに、工程(ii)の幹細胞で発現するマイクロRNAを同定することと、
(iv)bFGFベース培地中のヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞をネズミフィーダー細胞の層上で別に培養することと、
(v)細胞を採取するとともに、工程(iv)の細胞で発現するマイクロRNAを同定することと、
(vi)工程(iii)で同定されたマイクロRNAと、工程(v)で同定されたマイクロRNAとを比較することと、
(vii)工程(iii)では存在しているか、又は発現が増大しており、工程(v)では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、ナイーブ細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
(viii)工程(v)では存在しており、工程(iii)では存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、プライム細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
を含む、方法を含む。
幹細胞増殖表面はVita表面又はVita様表面であり得る。
更に別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態又はプライム幹細胞状態の特性を示すマイクロRNAシグネチャを同定する方法であって、
(i)ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の第1のセット及び第2のセットを、NM23の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
(ii)細胞をMUC1*抗体で被覆した第1の幹細胞増殖表面に付着させることと、
(iii)細胞の第1のセットにおいてマイクロRNAのレベルを測定することと、
(iv)同一の細胞の第2のセットの細胞を採取するとともに、細胞の第2のセットを第2の幹細胞増殖表面上にプレーティングすることと、
(v)第2の幹細胞増殖表面上で一定期間成長させることと、
(vi)細胞の第2のセットにおいてマイクロRNAのレベルを測定することと、
(vii)細胞の第1のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の第2のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することを含む、ナイーブ幹細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
(viii)細胞の第2のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の第1のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、プライム幹細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
を含む、方法に関する。
(i)ヒトの胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞の第1のセット及び第2のセットを、NM23の二量体変異体又は二価変異体の存在下で培養することと、
(ii)細胞をMUC1*抗体で被覆した第1の幹細胞増殖表面に付着させることと、
(iii)細胞の第1のセットにおいてマイクロRNAのレベルを測定することと、
(iv)同一の細胞の第2のセットの細胞を採取するとともに、細胞の第2のセットを第2の幹細胞増殖表面上にプレーティングすることと、
(v)第2の幹細胞増殖表面上で一定期間成長させることと、
(vi)細胞の第2のセットにおいてマイクロRNAのレベルを測定することと、
(vii)細胞の第1のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の第2のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することを含む、ナイーブ幹細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
(viii)細胞の第2のセットでは存在しているか、又は発現が増大しており、細胞の第1のセットでは存在していないか、又は発現が低減しているマイクロRNAを同定することにより、プライム幹細胞状態に特有のマイクロRNAを同定することと、
を含む、方法に関する。
第1の幹細胞増殖表面はVita表面又はVita様表面であってもよく、第2の幹細胞増殖表面はビトロネクチンであってもよい。
更に別の態様では、本発明は、ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるように細胞を誘導する方法であって、ナイーブ状態の特性を示すマイクロRNAを細胞に導入することを含む、方法に関する。
更に別の態様では、本発明は、患者においてがんを治療又は予防する方法であって、患者に、細胞がナイーブ状態からより分化した状態へと移行すると上方調節されるタンパク質又は核酸を投与することを含む、方法に関する。核酸はマイクロRNAであり得る。細胞のより分化した状態はプライム状態であり得る。
更に別の態様では、本発明は、幹細胞増殖表面上で幹細胞又は前駆細胞を培養する方法であって、
(a)幹細胞又は前駆細胞のサンプルを得ることと、
(b)幹細胞又は前駆細胞を表面に接触させることと、
(c)幹細胞又は前駆細胞を、MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中で培養することと、
を含む、方法に関する。
(a)幹細胞又は前駆細胞のサンプルを得ることと、
(b)幹細胞又は前駆細胞を表面に接触させることと、
(c)幹細胞又は前駆細胞を、MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中で培養することと、
を含む、方法に関する。
更に別の態様では、本発明は、表面に結合するように幹細胞又は前駆細胞を適応させる方法であって、
(a)幹細胞又は前駆細胞を、MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中で予めインキュベートすることと、
(b)幹細胞又は前駆細胞を表面に接触させることと、
を含む、方法に関する。
(a)幹細胞又は前駆細胞を、MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中で予めインキュベートすることと、
(b)幹細胞又は前駆細胞を表面に接触させることと、
を含む、方法に関する。
表面はMUC1*を二量体化する第2の作用物質を含み得る。
上記方法は、工程(a)の後でかつ工程(b)の前に、
(a)(i)MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中でのインキュベートの後に、幹細胞又は前駆細胞をペレット状にする工程と、
(a)(ii)第1の作用物質を含まない培地中で幹細胞又は前駆細胞を再懸濁する工程と、
(a)(iii)幹細胞又は前駆細胞を表面上にプレーティングする工程と、
(a)(iv)48時間にわたって放置する工程と、
を更に含み得る。
(a)(i)MUC1*を二量体化する第1の作用物質を含む培地中でのインキュベートの後に、幹細胞又は前駆細胞をペレット状にする工程と、
(a)(ii)第1の作用物質を含まない培地中で幹細胞又は前駆細胞を再懸濁する工程と、
(a)(iii)幹細胞又は前駆細胞を表面上にプレーティングする工程と、
(a)(iv)48時間にわたって放置する工程と、
を更に含み得る。
更に別の態様では、本発明は、フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面に結合するように幹細胞を適応させる方法であって、細胞を、MUC1*を二量体化する作用物質を含む培地中で予めインキュベートした後、幹細胞を表面へと導入することを含む、方法に関する。表面では、窒素(N)が少なくとも約0.5%であり、酸素(O)及び窒素(N)の合計量が少なくとも約17.2%以上であり、接触角が少なくとも約13.9度である場合がある。
上記方法は、
(i)幹細胞を、MUC1*を二量体化する作用物質を含む培地中でインキュベートする工程と、
(ii)他の細胞と付着させる前に、幹細胞に、細胞を表面に接触させる力を加える工程と、
(iii)細胞を、作用物質を含まない培地中で再懸濁する工程と、
(iv)表面上にプレーティングする工程と、
(v)48時間にわたって放置する工程と、
(vi)MUC1*を二量体化する作用物質を添加する工程と、
を更に含み得る。
(i)幹細胞を、MUC1*を二量体化する作用物質を含む培地中でインキュベートする工程と、
(ii)他の細胞と付着させる前に、幹細胞に、細胞を表面に接触させる力を加える工程と、
(iii)細胞を、作用物質を含まない培地中で再懸濁する工程と、
(iv)表面上にプレーティングする工程と、
(v)48時間にわたって放置する工程と、
(vi)MUC1*を二量体化する作用物質を添加する工程と、
を更に含み得る。
表面はVita(商標)表面(ThermoFisher, USA)であり得る。力は遠心力、圧力、又は真空であり得る。
更に別の態様では、本発明は、
(i)フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面を含む物体であって、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質と結合する、物体と、
(ii)NM23とともに最小培地を含む幹細胞成長培地と、
備えるキットに関する。
(i)フィーダー層を欠いた幹細胞増殖表面を含む物体であって、幹細胞又は前駆細胞上に存在する細胞表面分子に結合する作用物質と結合する、物体と、
(ii)NM23とともに最小培地を含む幹細胞成長培地と、
備えるキットに関する。
表面では、窒素(N)が少なくとも約0.5%であり、酸素(O)及び窒素(N)の合計量が少なくとも約17.2%以上であり、接触角が少なくとも約13.9度である場合がある。表面はVita(商標)表面(ThermoFisher, USA)であり得る。細胞表面分子はMUC1又はMUC1*であり得る。細胞表面分子はPSMGFR配列であり得る。作用物質は抗体であり得る。抗体はPSMGFRに結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。特に、モノクローナル抗体は以下のκ鎖可変領域CDR配列を有する場合がある:
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20);CDR2:KVSNRFS(配列番号21);及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)、又は、
CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26);CDR2:LVSNLES(配列番号27);及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
上記の方法によると、作用物質はSSEA1、SSEA4、Tra 1−60、Tra 1−81又はCD34に結合するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。記載の作用物質はNM23、又はNM23の突然変異体若しくは変異体であるとともに、二量体又は二価であり得る。抗体はヒト化していてもよい。また、最小培地は異種成分を含まなくてもよい。
本発明のこれら及び他の目的は、以下の本発明の説明、本明細書に添付した参照図面及び本明細書に添付した特許請求の範囲から更に十分に理解される。
本発明は、本明細書で下記に与えられる詳細な説明、及び例示目的のみで与えられ、したがって本発明を限定するものではない添付の図面から更に十分に理解される。
本願において、数量を特定していないものは単数及び複数の対象の両方を含む("a" and "an" are used to refer to both single and a plurality of objects)。
本発明は、哺乳類細胞培養、とりわけ幹細胞等の未熟細胞の培養の分野に関するものであり、少なくとも約0.5%のNを含有し、O及びNの合計量が17.2%以上であり、接触角が約13.9度である、フィーダー層を欠いた基質への細胞付着、該基質上での培養、及び該基質からの剥離のための方法及び組成物を提供する。一実施形態では、基質には細胞表面受容体に結合する抗体も付着されている。別の実施形態では、細胞をMUC1*アクチベータを含む培地中で培養する。更に別の実施形態では、培地には、更にRhoキナーゼ又はRho阻害剤(ROCi)が含まれる。更に別の実施形態では、本発明は、Rhoキナーゼ阻害剤の必要性を排除する方法に関する。更に別の実施形態では、本発明は、ナイーブ状態の幹細胞の選択、維持又は誘導のための方法、成長因子及び表面に関する。
幹細胞増殖表面
本明細書で使用される場合、幹細胞増殖表面は、ヒト幹細胞の付着を可能にするように化学的又は生物学的に改質することができ、更に幹細胞を増殖させ、そこから幹細胞を採取することができる、任意の表面である。国際公開第2009/105570号は、得られる表面が細胞付着に良好であり、特に非接着性細胞であるヒト幹細胞の付着を可能にするような、細胞培養用のプラスチック容器のプラズマ改質を記載している。国際公開第2009/105570号に記載の表面の一つは、Vita(商標)表面(ThermoFisher, USA)として販売されている。特に、国際公開第2009/105570号における表面#4は幹細胞を成長させることから普及されてきた。残念ながら、これらの表面に結合した後にそこで成長するように、これらの細胞を準備する(「順化する」としても知られる)必要がある方法は非常に長期間にわたる複雑なものである。国際公開第2009/105570号は、別の表面から手動で切り離すとともに剥離した幹細胞はそれらの表面には結合しないことを開示している。加えて、幹細胞は、開示された表面上で結合又は成長する前に、単一細胞になるまで、数回、例えば38回及び48回、酵素により継代させる必要がある。さらにVita(商標)表面の使用説明書には、幹細胞をRhoキナーゼ阻害剤の存在下で培養させなければならないことが記載されており、そうしなければ幹細胞が表面に結合しないか、又は表面に結合した状態を保てない。国際公開第2009/105570号の更なる欠点は、開示された表面はマトリゲル及びフィーダー細胞の代用を目的とする規定の基質であるが、マウスフィーダー細胞由来の馴化培地を標準bFGF幹細胞培養培地に添加しなければ、幹細胞は表面上で成長することがないことであり、このため規定の動物質を含まない表面の用途にはそぐわない。
本明細書で使用される場合、幹細胞増殖表面は、ヒト幹細胞の付着を可能にするように化学的又は生物学的に改質することができ、更に幹細胞を増殖させ、そこから幹細胞を採取することができる、任意の表面である。国際公開第2009/105570号は、得られる表面が細胞付着に良好であり、特に非接着性細胞であるヒト幹細胞の付着を可能にするような、細胞培養用のプラスチック容器のプラズマ改質を記載している。国際公開第2009/105570号に記載の表面の一つは、Vita(商標)表面(ThermoFisher, USA)として販売されている。特に、国際公開第2009/105570号における表面#4は幹細胞を成長させることから普及されてきた。残念ながら、これらの表面に結合した後にそこで成長するように、これらの細胞を準備する(「順化する」としても知られる)必要がある方法は非常に長期間にわたる複雑なものである。国際公開第2009/105570号は、別の表面から手動で切り離すとともに剥離した幹細胞はそれらの表面には結合しないことを開示している。加えて、幹細胞は、開示された表面上で結合又は成長する前に、単一細胞になるまで、数回、例えば38回及び48回、酵素により継代させる必要がある。さらにVita(商標)表面の使用説明書には、幹細胞をRhoキナーゼ阻害剤の存在下で培養させなければならないことが記載されており、そうしなければ幹細胞が表面に結合しないか、又は表面に結合した状態を保てない。国際公開第2009/105570号の更なる欠点は、開示された表面はマトリゲル及びフィーダー細胞の代用を目的とする規定の基質であるが、マウスフィーダー細胞由来の馴化培地を標準bFGF幹細胞培養培地に添加しなければ、幹細胞は表面上で成長することがないことであり、このため規定の動物質を含まない表面の用途にはそぐわない。
本発明では、国際公開第2009/105570号に記載の表面、より具体的には1.7%〜2.1%の窒素と、26.4%〜28.7%の酸素とで構成され、窒素と酸素とが合わせて28.2%〜30.7%であり、接触角が14.3度〜18.8度である表面は、MUC1*受容体を二量体化するリガンドの存在下で成長させれば、馴化培地の非存在下で幹細胞の培養に使用することができることが示されている。MUC1*受容体を二量体化するとともに活性化するリガンドとしては、細胞表面の近位にあるMUC1受容体の初めの45アミノ酸に配列が対応している、PSMGFRペプチドに対する二価抗体が挙げられる。細胞表面に直接隣接した10アミノ酸を欠いていることを除いて、配列がPSMGFRペプチドに対応しているペプチドに対する抗体が好ましい。NM23はMUC1*のリガンドであり、より具体的には二量体NM23、又は四量体及び六量体の形成よりも二量体の形成が選好される、NM23−S120G、NM23−P96S等の突然変異体(1〜6アミノ酸のC末端欠失と組み合わされても又は組み合わされていなくてもよい)が特に好ましい。
馴化培地の必要性が排除されることに加えて、本発明は、幹細胞を、これらの及び他の規定の表面上で成長するように適応させるのに要する順化時間を最小限に抑える方法を開示する。本願の他の箇所でより完全に詳述されているように、NM23中で成長させた幹細胞には長期にわたる適応期間は必要ない。さらに、FGF及び馴化培地中で予め培養させた幹細胞は、規定の表面に導入する前に細胞をNM23含有培地中で短期間インキュベートすることによって、国際公開第2009/105570号に記載の表面に結合するように適応させることができる。国際公開第2009/105570号の内容、とりわけ幹細胞成長表面の材料及び組成の開示に関するものは、その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
別の改良形態では、本発明は、国際公開第2009/105570号に記載の表面をMUC1*受容体と結合するリガンド又は抗体で被覆することに関するものであり、これにより細胞付着の改善がもたらされ、MUC1*リガンドなしで表面を使用するよりも良好に自然分化が阻害される。図12eを参照されたい。本発明は他の幹細胞表面タンパク質へのリガンドの使用も企図している。
ナイーブ細胞
最近の研究論文によって、FGF及び線維芽細胞フィーダー細胞馴化培地中で培養したヒト幹細胞は真の多能性(ナイーブ状態又は基底状態)幹細胞ではなくなっていると結論づけられている。正しくは、bFGF中での成長はヒト幹細胞を「プライム状態」と呼ばれるより成熟した状態にさせる。ヒトプライム幹細胞対ヒトナイーブ幹細胞の分野における研究結果によって、プライム幹細胞が、真の多能性幹細胞のように完全に機能的な成体細胞へと分化することができないことが示唆されている。研究者らは、プライム幹細胞を「ナイーブ」と呼ばれる真の多能性状態へと一時的に戻す方法を開発している。ナイーブ幹細胞がプライム幹細胞とは異なる経路を介して成長するため、ナイーブ幹細胞は、プライム幹細胞の表面で発現されるものとは異なる細胞表面受容体を保有するか、又はプライム幹細胞の表面で発現されるものとは異なるレベルで発現される細胞表面受容体を保有することになる。そのため、プライム幹細胞とナイーブ幹細胞とは、化学的又は生化学的に規定された表面に対する親和性が異なる。
最近の研究論文によって、FGF及び線維芽細胞フィーダー細胞馴化培地中で培養したヒト幹細胞は真の多能性(ナイーブ状態又は基底状態)幹細胞ではなくなっていると結論づけられている。正しくは、bFGF中での成長はヒト幹細胞を「プライム状態」と呼ばれるより成熟した状態にさせる。ヒトプライム幹細胞対ヒトナイーブ幹細胞の分野における研究結果によって、プライム幹細胞が、真の多能性幹細胞のように完全に機能的な成体細胞へと分化することができないことが示唆されている。研究者らは、プライム幹細胞を「ナイーブ」と呼ばれる真の多能性状態へと一時的に戻す方法を開発している。ナイーブ幹細胞がプライム幹細胞とは異なる経路を介して成長するため、ナイーブ幹細胞は、プライム幹細胞の表面で発現されるものとは異なる細胞表面受容体を保有するか、又はプライム幹細胞の表面で発現されるものとは異なるレベルで発現される細胞表面受容体を保有することになる。そのため、プライム幹細胞とナイーブ幹細胞とは、化学的又は生化学的に規定された表面に対する親和性が異なる。
プライム幹細胞の特徴の一つは、酵素的切断を用いた連続採取では生存することができないことであり、ナイーブ幹細胞は生存することができる。国際公開第2009/105570号では、酵素的切断により連続採取された幹細胞のみを表面に結合させることが開示されているため、本発明者らは、ナイーブ幹細胞が国際公開第2009/105570号の表面、特にNunclon(商標)Vita(商標)表面(ThermoFisher, USA)として販売されている表面に結合していると結論づけている。そのため、国際公開第2009/105570号に記載の表面(本明細書ではVita表面又はVita様表面と称される)を用いて、ナイーブ幹細胞、より包括的にナイーブ状態、又は従来のbFGF培地中、フィーダー細胞表面上で培養したものよりもナイーブな状態にあるヒト幹細胞の成長及び/又は維持を選択することができる。
ナイーブ幹細胞の別の報告されている特徴は、ナイーブ幹細胞がコロニー形態のみならずシート状に成長する能力を有することである。本発明者らは、抗MUC1*抗体及びNM23を含むMUC1*アクチベータとともに培養した幹細胞は、非フィーダー細胞表面及び非マトリゲル表面上で成長させた場合にもシート状で成長することを確認している。より具体的には、抗MUC1*抗体及び二量体NM23又はNM23変異体を含む二価MUC1*アクチベータとともに培養し、抗MUC1*又はNM23二量体で被覆した表面上で成長させるヒト幹細胞は、ヒトナイーブ幹細胞の特徴であるコロニー状ではなくシート状に成長する。好ましい実施形態では、抗MUC1*抗体はVita表面又はVita様表面上に吸着され、付着したヒト幹細胞は、NM23又は二量体状態にあるNM23変異体を含む最小幹細胞培地中で培養される。実施例5の結果を示す図12eによって、ヒト幹細胞が、MUC1*アクチベータを含む培地中、任意で抗MUC1*抗体を提示するVita様表面上で培養した場合に、コロニー状ではなくシート状に成長することが実証される。特に好ましい実施形態では、MUC1*アクチベータ培地には、bFGF又はTGF−βは含まれない。図25及び実施例10の実験は、bFGF含有培地中で培養したヒト幹細胞がプライム状態にあり、MUC1*活性化リガンド、例えば二量体NM23中、任意で更にMUC1*リガンド、例えば抗MUC1*抗体を任意で提示するVita表面又はVita様表面上で培養した幹細胞がナイーブ状態又はよりナイーブの状態にあることを示している。図12では、RT−PCRを用いて、ヒトH9 ES(胚性幹)細胞におけるナイーブ遺伝子対プライム遺伝子の発現レベルを測定する。最小幹細胞培地に4ng/ml bFGFを添加する標準方法に従って培養し、マウス線維芽細胞フィーダー細胞(MEF)の表面上で成長させたこれらの細胞、「MEF/FGF CT」を「1」と規定し、他の全ての成長方法をこの値に対して正規化している。これらの図では、「NM23/MUC1*Ab」は、MUC1*抗体(C3)で被覆したVitaプレート上で培養した任意の他の成長因子の非存在下の最小幹細胞培地中で二量体形態にある8nM NM23−S120Gを指す。図12は、従来方法によって培養した幹細胞と比較して、Vitaプレート上のMUC1*抗体の表面でのNM23二量体の成長がプライムマーカーのより低い発現及びナイーブマーカーのより高い発現をもたらしたことを示している。
mTeSRは高濃度のbFGF及びTGF−βを含む市販の半規定培地である。図12bは、mTeSR中、マトリゲルの層上で培養した同じタイプの幹細胞がプライムマーカーFoxa2及びXISTのより高い発現をもたらしたが、ナイーブマーカーKlf2、Klf4及びNanogのより低い発現をもたらしたことを示している。多能性マーカーであるOct4は、平均すると対照よりも高い発現を示した。継代数(p1〜14)から分かるように、マトリゲル上でのmTeSR中の連続継代では、「不良」マーカー発現パターンは改善されなかった。
これに対して、図12cは、NM23培地中、抗MUC1*抗体表面上での幹細胞の培養によって、ナイーブ(良好)マーカーの発現が増大し、プライムマーカーの発現が低減したこと、プライムマーカーの発現に対するナイーブマーカーの発現のパターンは各連続継代数に伴い改善したことを示している。ヒトインテグリンビトロネクチンは、規定済みであり、組換えタンパク質として作製される場合、異種成分を含まないが、図12dに示される結果によって、幹細胞の表面上でのビトロネクチンと一部の抗原との相互作用が、ナイーブではない経路を示唆することが強く主張される。同じ親細胞源の幹細胞を、bFGF中、フィーダー上で成長したものから採取し、1回の継代において、bFGF+フィーダー細胞馴化培地、mTeSR又はNM23−最小培地のいずれかで培養し、全てビトロネクチンの層上で成長させた。RT−PCR測定結果によって、NM23培地が他よりもナイーブな遺伝子発現プロファイルを示したが、概してビトロネクチン上での成長がプライムマーカーの発現の増大及びナイーブマーカーの発現の低減を引き起こしたことが示される。
図37は、bFGF中、MEFフィーダー上で培養したヒト幹細胞(n=3)、mTeSR中、マトリゲル上で培養したヒト幹細胞(n=5)、又はNM23−S120G二量体の最小幹細胞培地中、12.5ug/mlのモノクローナル抗MUC1*抗体である2D6C3で被覆したVita表面上で培養したヒト幹細胞(n=6)のRT−PCR測定結果を示している。この実験では、2つの更なるプライムマーカー、OTX2及びLHX2も測定した。図37のグラフは、他の実験と一致して、NM23中、MUC1*のリガンドを提示する表面上での成長がナイーブマーカーの発現を増大させ、プライムマーカーの発現を低減させることを示している。
比較実験では、ICC染色を用いて、bFGF又はNM23(最小幹細胞培地中で二量体)中、マウスフィーダー細胞又はヒトフィーダー細胞上でのヒトES細胞の成長に応答した僅か2つのマーカー:FOXa2(プライム)及びKLF4(ナイーブ)の発現を評価した。図27〜図35によって、NM23培地中、ヒト線維芽細胞の表面上で培養したヒト幹細胞のみがナイーブマーカーKLF4を発現し、プライムマーカーFOXa2を発現しなかったことが示される。これに対して、マウス線維芽細胞の層上にプレーティングし、NM23又はbFGFを含む培地中で培養した同じ細胞源の細胞はナイーブマーカーKLF4を発現せず、プライムマーカーFOXa2を発現した。
まとめると、これらのデータによって、マウス細胞の層上又はビトロネクチンの層上でヒト幹細胞を成長させることでプライム状態が維持又は誘導され、bFGF含有培地中でヒト幹細胞を培養することでもプライム状態が維持又は誘導されることが示されている。そのため、ヒトナイーブ幹細胞は、MUC1*経路によって成長し、この経路を活性化する培地中、例えばMUC1*を二量体化する作用物質を含む培地中、及びプライム経路を活性化させず、任意で多能性経路を活性化する溶液中又は表面、例えばMUC1*を二量体化するリガンド上で維持又は誘導することができると結論づけられる。好ましい実施形態では、幹細胞は、二量体形態のNM23を含む培地中で細胞を培養することによって維持するか、又はよりナイーブな状態へと戻るように誘導され、細胞はVita様表面又は抗MUC1*抗体で被覆した表面に付着する。更により好ましい実施形態では、幹細胞は、NM23の濃度が8nM〜32nMであり、表面が3ug/mL〜125ug/mLの濃度で抗MUC1*抗体2D6C3又は2D6C8で被覆したVita表面であるNM23二量体含有培地中で培養する。加えて、任意でVita様表面上にプレーティングした、MUC1*と結合する抗体を用いて、ナイーブ幹細胞を同定及び単離することができる。
加えて、プライム幹細胞を、MUC1*経路が活性化する条件下で細胞を成長させることによって、ナイーブ状態又はよりナイーブな状態へと戻すことができる。例えば、MUC1*、又はNM23若しくはNM23変異体を含むそのリガンドの発現を引き起こす若しくは増大させる核酸、又はMUC1の切断の増大をもたらす作用物質の細胞(成体細胞、前駆細胞又はプライム幹細胞であり得る)への導入によって、細胞がよりナイーブな状態又はナイーブ状態へと戻る。
出願人によって、幹細胞は、MUC1*アクチベータ、例えば二価抗MUC1*又はNM23、とりわけ二量体NM23又は二量体化を選好する突然変異体、例えばNM23−S120G、NM23−P96S、1つ〜6つのアミノ酸欠失が起こり得るNM23のC末端欠失体、又は更にN末端に1つ〜6つのアミノ酸欠失を有する、NM23−S120G若しくはNM23−P96Sを含む最小幹細胞培地(MM又はMN6)中の表面上でより良好に成長し、C末端に6つの欠失を有するNM23−P96Sが、可溶性画分において二量体の大部分を産生することから、好ましいことが発見された。加えて、抗MUC1*抗体の薄層をプラスチック容器、組織培養処理プレート、Vita様表面又はVita(商標)表面等の表面に塗布する場合、幹細胞増殖が増進し、自然分化が阻害された。さらに、FGF及びマウス胚性線維芽細胞(MEF)馴化培地(CM)中で培養した幹細胞は、FGF−CM中でプレーティングした場合、Vita表面への付着不良を示した。対照的に、細胞をFGF−CMではなくNM23−MM培地中でプレーティングし、その後培養した場合は、細胞は付着するとともに成長した。FGF−CM(馴化培地)で成長させた細胞を採取し、その後プレーティングする前に短時間、NM23−MM中でインキュベートした場合、付着及びその後の成長が改善した。
国際公開第2009/105570号に記載されるような規定の表面、より具体的には1.7%〜2.1%の窒素と、26.4%〜28.7%の酸素とで構成され、窒素と酸素とが合わせて28.2%〜30.7%であり、接触角が14.3度〜18.8度である表面の性能は、抗MUC1*抗体及びNM23、特に二量体形成を選好する突然変異体NM23−S120Gを含む、MUC1*受容体を二量体化する作用物質の層を添加することによって大幅に改善した。本発明は、MUC1*を二量体化する作用物質を、国際公開第2009/105570号に記載の表面上に付着させることに関するものである。好ましい実施形態では、作用物質は二価抗MUC1*抗体である。モノクローナル抗体2D6C3及び2D6C8が特に好ましい。本発明は、抗体を国際公開第2009/105570号に記載の表面に接触したタンパク質又は重合体の層に被覆又は付着させることを更に含む。
本発明は、国際公開第2009/105570号に記載の平板固体基質と本質的に同じ割合(%)のN、O及びN+Oである化学組成をもたらす表面、より具体的には1.7%〜2.1%の窒素と、26.4%〜28.7%の酸素とで構成され、窒素と酸素とが合わせて28.2%〜30.7%であり、接触角が14.3度〜18.8度である表面上での重合体の生成にも関する。MUC1*を二量体化する作用物質は、任意でこれらの基質に付着させ、ヒト幹細胞の成長及びヒト幹細胞の分化の阻害を改善し、ナイーブ幹細胞の集団を単離及び増進させることができる。
本発明のキットは、表面の化学組成がおおよそ、1.7%〜2.1%の窒素と、26.4%〜28.7%の酸素とで構成され、窒素と酸素とが合わせて28.2%〜30.7%であり、接触角が14.3度〜18.8度である、細胞培養用の容器と、MUC1*を二量体化する作用物質、例えば二価抗MUC1*若しくはNM23若しくは二量体形態のNM23、NM23−S120G、NM23−P96S、又はそれらの突然変異体、及び1つ〜6つのC末端アミノ酸欠失を有するものを含む培地中で細胞を培養するための使用説明書とからなり得る。
本発明者らは、ヒトナイーブ幹細胞がMUC1*経路を介して成長し、FGF(線維芽細胞成長因子受容体)経路では成長しないことを発見した。
さらに本発明者らは、プライム幹細胞、ES細胞及びiPS(人工多能性幹)細胞を、MUC1*成長因子受容体経路を活性化することによって、ナイーブ状態へと安定して変換させることができることを発見した。
さらに本発明者らは、ヒト幹細胞は、マウス細胞、例えばマウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞由来の分泌物の存在下で培養した場合、MUC1*経路が活性化していたとしてもプライム状態へと進行するか、又はナイーブ状態へと戻すことができないことを発見した。対照的に、最小培地+NM23(任意でNM23−S120G突然変異体)中、ヒトフィーダー細胞、例えばHS27包皮線維芽細胞フィーダー細胞上で培養したヒト幹細胞は、よりナイーブな幹細胞として成長し、無期限に連続継代によってその状態に維持することができる。
MUC1*成長因子受容体を活性化することに加えて、マウス幹細胞を成長させる或る特定の経路を活性化させる必要がない。FGFはナイーブ状態でヒト幹細胞を培養するのに、培地に添加するべきではない。同様に、ヒト幹細胞は、マウスフィーダー細胞上で培養した場合、プライム状態へと進行する。
対照的に、ヒトナイーブ幹細胞は、MUC1*アクチベータ、例えばNM23−S120Gとともに培養し、ヒト(非マウス)フィーダー細胞、例えばHS27包皮線維芽細胞上で、又は異種成分を含まない表面上で成長させた場合、ナイーブ状態又は少なくともよりナイーブな状態に安定して維持するとともに伝播する。細胞に作用し、プライム状態へと成熟させる因子を分泌しない異種成分を含まない表面としては、標準的なプラスチック容器、細胞培養処理プレート、高い結合能を有する基質、例えばVita又はSynthemax(これらは全て、幹細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗MUC1*、抗Tra 1−81/1−60又は抗SSEA3/4等によって任意で誘導体化することができる)が挙げられる。
MUC1*成長因子受容体の経路は、NM23、特にNM23二量体によって活性化される。本発明者らは典型的に、最小幹細胞培地+二量体化を選好し、MUC1*受容体を活性化しない高次多量体を形成しない突然変異体であるNM23−S120G突然変異体中で細胞を培養することによって、ナイーブ幹細胞の成長を活性化した。他のMUC1*アクチベータとしては、二量体化するMUC1*部分と結合する二価抗体が挙げられる。例えば、MUC1*細胞外ドメインの45アミノ酸に対する抗体は、MUC1*成長因子受容体を二量体化するとともに活性化し、幹細胞の成長を支持する。
本明細書に開示される発見は広範囲にわたって影響を及ぼす。初めに、現行のほとんどのヒト幹細胞は、FGF中、マウスフィーダー層上で又はマトリゲル上で成長させ、FGF+マウスフィーダー細胞由来の馴化培地を与えたものである。本明細書で提示された所見によって、FGF及びマウスフィーダー細胞はともに、ヒト幹細胞を欠損させ(corrupt)、プライム状態への進行を誘導することが示される。該プライム状態は、機能的な成体細胞へと成熟することができない非生産性状態であり得る。そのため、ヒト幹細胞から機能的な成体細胞を得るために、開始細胞はナイーブ状態でなければならない。幹細胞分野での主な問題は、多くの細胞は機能的な成体細胞へと成熟させることができず、また生体細胞へと成熟させることができたとしても、それは非常に稀なことであるということである。これらの研究によって、主な問題は、現在使用されているヒト幹細胞が、ヒトではない経路に曝されることで欠損することであることが証明されている。したがって、機能的な成体細胞へと成熟することができる幹細胞を得るためには、幹細胞をMUC1*アクチベータ、例えば二量体形態のNM23中で培養させなければならず、またフィーダー細胞を使用する場合は常に、フィーダー細胞はヒト由来でなければならない。
全て「プライム」状態であったこれまでのヒト幹細胞の特性化により推測されること
本明細書に開示される発見によって、欠損した幹細胞を用いた研究に基づく現在の「発見」の多くもまた欠損したものであることが示される。FGF経路により及び/又はマウスフィーダー細胞若しくはその馴化培地で成長させた幹細胞の研究により得られたデータは、どの所見がヒトに適用され、どの所見がヒトに適用されないのかを決定することができない関連データと関連のないデータとが混ざったものである。例えば、がんの治療に対する新たなアプローチは、分化を誘導することによってがん細胞の自己複製能を抑制することである。がん細胞のマイクロRNAを、幹細胞、特に新たに分化する幹細胞のマイクロRNAと比較して、どの調節因子ががん細胞に欠けているかを決定するという研究を行った。理論としては、欠けている分化を誘導するマイクロRNAをがん細胞に導入し、がん細胞がより健常細胞のように働くようにがん細胞を「再プログラミング」することができるというものであった。このこれまでの一連の研究の問題は、分析したマイクロRNAがFGFを用いて、マウスフィーダー細胞上で成長させた幹細胞由来のものであるということであった。数多くの証拠が、bFGFがヒト多能性幹細胞ではなく、マウス幹細胞を成長させる成長因子であることを裏付けている。現在、本発明者らは、bFGF及びマウスフィーダー細胞がともに、ヒト幹細胞をその自然のナイーブ状態から離脱させ、「プライム」状態又は「マウス−ヒトキメラ」にする因子を分泌することを認識している。プライム状態は、ナイーブ幹細胞で発現されるものとは大きく異なる遺伝子発現パターン、その結果として大きく異なるマイクロRNA発現パターンを特徴とする。したがって、分化の開始を示唆するものとして同定され、そのため潜在的ながん治療に有用であるとされてきたマイクロRNAの大部分とは言わないまでも多くが、マウス幹細胞分化の開始のみを示唆するものにすぎないか、又はヒトナイーブ幹細胞がMUC1*経路を介して伝播し、通常、ナイーブ状態からしか分化することができない自然状態とは全く関連するものではない。そのため、これまでにヒト幹細胞の多能性からの離脱を示唆するものとして同定されたマイクロRNAは、偽多能性の非自然状態からの離脱を示唆するマイクロRNAであるにすぎず、そのためヒトのがんの治療には全く役に立たない。したがって、がんを治療するのに使用することができる、分化を誘導するマイクロRNAプロファイルを正確に同定するためには、マウス幹細胞経路ではなくヒト幹細胞経路を刺激する成長因子下で培養された、ヒト幹細胞において自然な多能性状態であるナイーブ幹細胞を使用する必要がある。ヒトの幹細胞又は前駆細胞の分化を調節するマイクロRNAを正確に同定する方法は、ナイーブ状態から分化させたヒトナイーブ幹細胞に対して差分分析を行うことである。次いで、ナイーブ幹細胞が分化を開始した時点で上方調節されているマイクロRNAを同定し、それをがんの治療に使用することができる。好ましい実施形態では、ナイーブ細胞は、NM23(二量体形態)中、抗MUC1*抗体で被覆した表面上でヒト幹細胞を培養することによって得られる。より好ましい実施形態では、抗MUC1*抗体で被覆した表面はVita様表面である。他の実施形態では、ナイーブ様幹細胞を、NM23二量体中、不活性化ヒトフィーダー細胞の層上、又はヒトがん細胞の層上、又はそれらの分泌物の存在下で培養することができる。新たに分化したナイーブ幹細胞に存在するが、がん細胞では欠けているマイクロRNAを同定し、それを抗がん治療剤として使用する。
本明細書に開示される発見によって、欠損した幹細胞を用いた研究に基づく現在の「発見」の多くもまた欠損したものであることが示される。FGF経路により及び/又はマウスフィーダー細胞若しくはその馴化培地で成長させた幹細胞の研究により得られたデータは、どの所見がヒトに適用され、どの所見がヒトに適用されないのかを決定することができない関連データと関連のないデータとが混ざったものである。例えば、がんの治療に対する新たなアプローチは、分化を誘導することによってがん細胞の自己複製能を抑制することである。がん細胞のマイクロRNAを、幹細胞、特に新たに分化する幹細胞のマイクロRNAと比較して、どの調節因子ががん細胞に欠けているかを決定するという研究を行った。理論としては、欠けている分化を誘導するマイクロRNAをがん細胞に導入し、がん細胞がより健常細胞のように働くようにがん細胞を「再プログラミング」することができるというものであった。このこれまでの一連の研究の問題は、分析したマイクロRNAがFGFを用いて、マウスフィーダー細胞上で成長させた幹細胞由来のものであるということであった。数多くの証拠が、bFGFがヒト多能性幹細胞ではなく、マウス幹細胞を成長させる成長因子であることを裏付けている。現在、本発明者らは、bFGF及びマウスフィーダー細胞がともに、ヒト幹細胞をその自然のナイーブ状態から離脱させ、「プライム」状態又は「マウス−ヒトキメラ」にする因子を分泌することを認識している。プライム状態は、ナイーブ幹細胞で発現されるものとは大きく異なる遺伝子発現パターン、その結果として大きく異なるマイクロRNA発現パターンを特徴とする。したがって、分化の開始を示唆するものとして同定され、そのため潜在的ながん治療に有用であるとされてきたマイクロRNAの大部分とは言わないまでも多くが、マウス幹細胞分化の開始のみを示唆するものにすぎないか、又はヒトナイーブ幹細胞がMUC1*経路を介して伝播し、通常、ナイーブ状態からしか分化することができない自然状態とは全く関連するものではない。そのため、これまでにヒト幹細胞の多能性からの離脱を示唆するものとして同定されたマイクロRNAは、偽多能性の非自然状態からの離脱を示唆するマイクロRNAであるにすぎず、そのためヒトのがんの治療には全く役に立たない。したがって、がんを治療するのに使用することができる、分化を誘導するマイクロRNAプロファイルを正確に同定するためには、マウス幹細胞経路ではなくヒト幹細胞経路を刺激する成長因子下で培養された、ヒト幹細胞において自然な多能性状態であるナイーブ幹細胞を使用する必要がある。ヒトの幹細胞又は前駆細胞の分化を調節するマイクロRNAを正確に同定する方法は、ナイーブ状態から分化させたヒトナイーブ幹細胞に対して差分分析を行うことである。次いで、ナイーブ幹細胞が分化を開始した時点で上方調節されているマイクロRNAを同定し、それをがんの治療に使用することができる。好ましい実施形態では、ナイーブ細胞は、NM23(二量体形態)中、抗MUC1*抗体で被覆した表面上でヒト幹細胞を培養することによって得られる。より好ましい実施形態では、抗MUC1*抗体で被覆した表面はVita様表面である。他の実施形態では、ナイーブ様幹細胞を、NM23二量体中、不活性化ヒトフィーダー細胞の層上、又はヒトがん細胞の層上、又はそれらの分泌物の存在下で培養することができる。新たに分化したナイーブ幹細胞に存在するが、がん細胞では欠けているマイクロRNAを同定し、それを抗がん治療剤として使用する。
過去の国際公開第2011/159960号において、本発明者らは、がん細胞が幹細胞増殖プラトーに陥った細胞であるという証拠を提示している。本発明者らは、がん細胞は種類によって、同時に培養することができるものもあれば、できないものもあることに言及している。本発明者らは、同時に培養することができるがん細胞は、同じような幹細胞増殖プラトーに陥っており、それらの成長はマイクロRNAの同じシグネチャによって調節されると述べている。同時に培養することができるがん細胞は、原発臓器とは独立して同じがん型に属する。各がん型を調節する各シグネチャにおける個々のマイクロRNAの同一性は、大規模シークエンシング及び全トランスクリプトーム分析等の技法を用いて決定することができる。様々な亜型のがんのマイクロRNAシグネチャが同定されれば、患者に影響を与えているものとは異なるがん型の1つ又は複数のマイクロRNAシグネチャを混合することによって、がんを治療又は予防することができる。代替的なアプローチでは、ヒトナイーブ幹細胞を様々な増殖プラトーに維持するマイクロRNAシグネチャを決定することができ、それからそれらの様々なマイクロRNAシグネチャを混合して、がんワクチンを作製することができる。
MUC1
MUC1は、C末端から始まり、細胞膜を通り、細胞外ドメインへと出るという順番で列挙される、本明細書中で以下のように呼ばれる幾つかの領域を含む。MUC1受容体の基本構造は、1)細胞質尾部と、2)膜貫通部と、3)MGFRと、4)IBRと、5)特異領域と、6)反復領域と、シグナルペプチドを含むN末端領域とを含む。MUC1並びに正常細胞及び腫瘍細胞におけるその機能の詳細な説明に関しては、国際出願PCT/US2005/032821号(その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする)の細胞表面上の切断されたMUC1の機能及び活性の記載を参照されたい。
MUC1は、C末端から始まり、細胞膜を通り、細胞外ドメインへと出るという順番で列挙される、本明細書中で以下のように呼ばれる幾つかの領域を含む。MUC1受容体の基本構造は、1)細胞質尾部と、2)膜貫通部と、3)MGFRと、4)IBRと、5)特異領域と、6)反復領域と、シグナルペプチドを含むN末端領域とを含む。MUC1並びに正常細胞及び腫瘍細胞におけるその機能の詳細な説明に関しては、国際出願PCT/US2005/032821号(その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする)の細胞表面上の切断されたMUC1の機能及び活性の記載を参照されたい。
「MUC1成長因子受容体」(MGFR)という用語は、成長因子等の活性化リガンド、又は切断酵素等の修飾酵素と相互作用して細胞増殖を促進する、MUC1受容体部分を意味する機能定義語である。MUC1のMGFR領域は、細胞表面に最も近く、以下で規定されるPSMGFRの大部分又は全てによって規定される細胞外部分である。MUC1の正確な切断部位は知られておらず、さらにこのタンパク質を切断する酵素は1つ又は複数の場所で切断を行うことができる。さらに、切断産物であるMUC1*成長因子受容体形態は、細胞型に基づき様々な場所で切断することができると考えられる。MGFRには、未修飾ペプチド、及び例えばリン酸化、グリコシル化等の酵素修飾を受けたペプチドの両方が包含される。本発明の結果は、細胞からのIBRの一部又は全ての放出を引き起こす腫瘍形成に関連する部位でのMUC1切断の際に、この部分をリガンドに接近可能にさせる機構と一致するものである。MGFRはMUC1*としても知られる。
本明細書で使用される場合、「抗PSMGFR」は、MGFRの領域、及び任意でPSMGFRの任意の部分を認識する任意の抗体を指す。nat−PSMGFRに対する抗体が本願で例示され、また好ましいが、この特定の配列に対する抗体に限定されることを意味するものではなく、MGFR及びPSMGFRの他のフラグメントも考慮される。
抗MUC1*抗体は、幹細胞、前駆細胞又はがん細胞に存在する、タンデムリピートドメインを欠いたMUC1タンパク質を認識する任意の抗体を指す。「MUC1成長因子受容体の一次配列」(PSMGFR)という用語は、下記で規定されるように、場合によってMGFRのほとんど又は全てを規定するペプチド配列、並びに該ペプチド配列の機能的変異体及びフラグメントを指す。PSMGFRは、下記の表1で挙げられる配列番号10、並びに最大20(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20)という任意の整数値のアミノ酸置換、及び/又はN末端及び/又はC末端に最大20という任意の整数値のアミノ酸付加若しくはアミノ酸欠失を有する全てのその機能的変異体及びフラグメントとして規定される。上記の内容において「機能的変異体又はフラグメント」は、配列番号10のペプチドと特異的に結合する又はそうでなければ特異的に相互作用するリガンドと特異的に結合する又はそうでなければ特異的に相互作用することができるような変異体又はフラグメントを指す。配列番号10のPSMGFRペプチド(「天然」であるとしてnat−PSMGFRと称される)の機能的変異体であるPSMGFRの一例は、配列番号12(var−PSMGFRと称される)であり、これは天然の−SRY−の代わりに−SPY−配列を含むという点でnat−PSMGFRとは異なるものである(配列表の太字を参照されたい)。var−PSMGFRは、天然型と比較して配座安定性が増進されており、このことは抗体産生等の或る特定の用途にとって重要であり得る。PSMGFRには、未修飾ペプチド、及び例えばリン酸化、グリコシル化等の酵素修飾を受けたペプチドの両方が包含される。
表1:ペプチド配列(N末端からC末端へと列挙される):
完全長MUC1受容体(ムチン1前駆体、Genbankアクセッション番号:P15941)
MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号1)
完全長MUC1受容体(ムチン1前駆体、Genbankアクセッション番号:P15941)
MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV LSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTS ASGSASGSAS TLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号1)
MUC1受容体及び切断型アイソフォームを細胞膜表面へと指向するN末端MUC−1シグナル伝達配列。配列番号2、配列番号3及び配列番号4の変異体によって示されるように、C末端において最大3個のアミノ酸残基が欠けていてもよい。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(配列番号2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA(配列番号3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG(配列番号4)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(配列番号2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA(配列番号3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG(配列番号4)
N末端にnat−PSMGFRを有し、完全長MUC1受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型MUC1受容体アイソフォーム(翻訳後、かつ細胞表面上での受容体の発現前に切断することができる任意のN末端シグナル配列を除いて示した「PSMGFRTC」の一例である「nat−PSMGFRTCアイソフォーム」):
G TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号5)
G TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号5)
N末端にnat−PSMGFRとPSIBRとを有し、完全長MUC1受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型MUC1受容体アイソフォーム(翻訳後、かつ細胞表面上での受容体の発現前に切断することができる任意のN末端シグナル配列を除いて示した「CMアイソフォーム」):
GFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号6)
GFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号6)
N末端にnat−PSMGFR+PSIBR+特異領域を有し、完全長MUC1受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型MUC1受容体アイソフォーム(任意のN末端シグナル配列を除いて示した「URアイソフォーム」):
ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS TVPPLTSSNH
STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI
YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS
RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA
LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号7)
ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS TVPPLTSSNH
STSPQLSTGV SFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI
YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREG TINVHDVETQ FNQYKTEAAS
RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIA
LAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA ASANL(配列番号7)
完全長MUC1受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型MUC1受容体アイソフォーム(翻訳後、かつ細胞表面上での受容体の発現前に切断することができる任意のN末端シグナル配列を除いて示した「Yアイソフォーム」):
GSGHASSTPG GEKETSATQR SSVPSSTEKN AFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ LTLAFREGTI NVHDMETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS YTNPAVAATS ANL(配列番号8)
GSGHASSTPG GEKETSATQR SSVPSSTEKN AFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ LTLAFREGTI NVHDMETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS YTNPAVAATS ANL(配列番号8)
N末端にnat−PSMGFR+PSIBR+特異領域+反復配列を有し、完全長MUC1受容体の膜貫通配列と細胞質配列とを含む切断型MUC1受容体アイソフォーム(翻訳後、かつ細胞表面上での受容体の発現前に切断することができる任意のN末端シグナル配列を除いて示した「Repアイソフォーム」):
LDPRVRTSAP DTRPAPGSTA PQAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DNRPALGSTA PPVHNVTSAS GSASGSASTL VHNGTSARAT TTPASKSTPF SIPSHHSDTP TTLASHSTKT DASSTHHSSV PPLTSSNHST SPQLSTGVSF FFLSFHISNL QFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ LTLAFREGTI NVHDVETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS YTNPAVAAAS ANL(配列番号9)
LDPRVRTSAP DTRPAPGSTA PQAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DTRPAPGSTA PPAHGVTSAP DNRPALGSTA PPVHNVTSAS GSASGSASTL VHNGTSARAT TTPASKSTPF SIPSHHSDTP TTLASHSTKT DASSTHHSSV PPLTSSNHST SPQLSTGVSF FFLSFHISNL QFNSSLEDPS TDYYQELQRD ISEMFLQIYK QGGFLGLSNI KFRPGSVVVQ LTLAFREGTI NVHDVETQFN QYKTEAASRY NLTISDVSVS DVPFPFSAQS GAGVPGWGIA LLVLVCVLVA LAIVYLIALA VCQCRRKNYG QLDIFPARDT YHPMSEYPTY HTHGRYVPPS STDRSPYEKV SAGNGGSSLS YTNPAVAAAS ANL(配列番号9)
MUC1成長因子受容体の天然一次配列(「PSMGFR」の一例であるnat−PSMGFR):
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号10)
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号10)
配列番号10のN末端に単一アミノ酸欠失を有する、MUC1成長因子受容体の天然一次配列(「PSMGFR」の一例であるnat−PSMGFR):
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号11)
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号11)
安定性が増進したMUC1成長因子受容体の天然一次配列の「SPY」機能的変異体(「PSMGFR」の一例であるvar−PSMGFR):
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号12)
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号12)
配列番号12のC末端に単一アミノ酸欠失を有する、安定性が増進したMUC1成長因子受容体の天然一次配列の「SPY」機能的変異体(「PSMGFR」の一例であるvar−PSMGFR):
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号13)
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(配列番号13)
切断型PSMGFR受容体(TR)(var−PSMGFRの「SPY」配列を有する):
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS(配列番号14)
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS(配列番号14)
MUC1成長因子受容体の拡張配列(ESMGFR)(var−PSMGFRの「SPY」配列を有する):
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPF(配列番号15)
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPF(配列番号15)
MUC1成長因子受容体の腫瘍特異的拡張配列(TSESMGFR)(var−PSMGFRの「SPY」配列を有する):
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS
DVPFPFSAQSGA(配列番号16)
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVS
DVPFPFSAQSGA(配列番号16)
鎖間結合領域の一次配列(PSIBR):
GFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(配列番号17)
GFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(配列番号17)
切断型鎖間結合領域(TPSIBR):
SVVVQLTLAFREG(配列番号18)
SVVVQLTLAFREG(配列番号18)
反復モチーフ2(RM2):
PDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA(配列番号19)
PDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA(配列番号19)
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によりその範囲を限定されるものではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の多様な変更形態が、上記の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなる。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。以下の実施例は、本発明の例示として与えられるものであり、限定するものとして与えられるものではない。
実施例1.1 − 幹細胞最小培地「MM」
最小培地(「MM」)500mLには以下のものが含まれる:400mlのDME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen、#10565−018)、100mlのノックアウト血清代替物(Invitrogen、#10828−028)、5mlの100×MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen、#11140−050)、0.9ml(0.1mM)のβ−メルカプトエタノール(55mMストック液、Invitrogen、#21985−023)、任意で異物混入のリスクを最小限にするために2.5mlのPSA(ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン)(MP Biochem、#1674049)を含んでいてもよい。
最小培地(「MM」)500mLには以下のものが含まれる:400mlのDME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen、#10565−018)、100mlのノックアウト血清代替物(Invitrogen、#10828−028)、5mlの100×MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen、#11140−050)、0.9ml(0.1mM)のβ−メルカプトエタノール(55mMストック液、Invitrogen、#21985−023)、任意で異物混入のリスクを最小限にするために2.5mlのPSA(ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン)(MP Biochem、#1674049)を含んでいてもよい。
実施例1.2 − 幹細胞規定培地−「MN6」
6成分最小培地「MN6」は、1%非必須アミノ酸と、64mg/Lアスコルビン酸(Sigma)と、14ug/Lセレン酸ナトリウム(Sigma)と、19.4mg/Lインスリン(Sigma)と、543mg/L重炭酸ナトリウム(Sigma)と、10.7mg/Lトランスフェリン(Sigma)とが添加された、DMEM/F12/GlutaMAX又は細胞培養に好適な同様の基本培地からなるものである。
6成分最小培地「MN6」は、1%非必須アミノ酸と、64mg/Lアスコルビン酸(Sigma)と、14ug/Lセレン酸ナトリウム(Sigma)と、19.4mg/Lインスリン(Sigma)と、543mg/L重炭酸ナトリウム(Sigma)と、10.7mg/Lトランスフェリン(Sigma)とが添加された、DMEM/F12/GlutaMAX又は細胞培養に好適な同様の基本培地からなるものである。
実施例1.3 − 抗体で被覆した表面への幹細胞の付着を促すポリクローナル抗MUC1*抗体
ウサギポリクローナル抗体は、動物をMUC1成長因子受容体ペプチドの一次配列(PSMGFR)を用いて免疫化させることによって生成した。血清を標準方法に従って採取した後、PSMGFRペプチド又は最後の10個のC末端アミノ酸を欠いたPSMGFRペプチド「C−10ペプチド」のいずれかを結合させたアフィニティーカラム上で精製した。次いで精製した抗体(それぞれSDIX−抗FLR及びSDIX−抗C−10)をプラスチック製の細胞培養プレート(Vitaプレート、ThermoFisher、又はBD Falcon、#353046)上に直接被覆し、該抗体が幹細胞の付着を促すことを確認した。表面を抗体で被覆するために、完全な表面被覆を可能にする一定容量のPBS中で1ug/mL〜300ug/mLの濃度の抗体を4℃で一晩、又は室温でおよそ3時間、インキュベートした。これらの抗PSMGFR表面に結合するヒト幹細胞及び付着量は表面上に被覆される抗体の濃度に対応するものであり、対照抗体では幹細胞の付着は全く起こらなかった。図24a〜図24cを参照されたい。ヒト幹細胞H9(WiCell)及びBGO1V/hOG細胞(Life Technologies)は、低ナノモル濃度の二量体形態のNM23−H1の存在下で最小幹細胞培地「MM」単独、又はヒト若しくはマウスのいずれかの線維芽細胞フィーダー細胞由来の50%馴化培地が添加されたMM+4ng/mL bFGF中で培養した場合、未分化幹細胞として付着するとともに増殖した。プレート表面に付着した二価抗PSMGFR抗体が、MUC1*受容体の二量体化を引き起こし、そのことから成長因子として作用したと結論づけた。しかしながら、細胞は培地にNM23(二量体)を添加した場合により高速で増殖した。
ウサギポリクローナル抗体は、動物をMUC1成長因子受容体ペプチドの一次配列(PSMGFR)を用いて免疫化させることによって生成した。血清を標準方法に従って採取した後、PSMGFRペプチド又は最後の10個のC末端アミノ酸を欠いたPSMGFRペプチド「C−10ペプチド」のいずれかを結合させたアフィニティーカラム上で精製した。次いで精製した抗体(それぞれSDIX−抗FLR及びSDIX−抗C−10)をプラスチック製の細胞培養プレート(Vitaプレート、ThermoFisher、又はBD Falcon、#353046)上に直接被覆し、該抗体が幹細胞の付着を促すことを確認した。表面を抗体で被覆するために、完全な表面被覆を可能にする一定容量のPBS中で1ug/mL〜300ug/mLの濃度の抗体を4℃で一晩、又は室温でおよそ3時間、インキュベートした。これらの抗PSMGFR表面に結合するヒト幹細胞及び付着量は表面上に被覆される抗体の濃度に対応するものであり、対照抗体では幹細胞の付着は全く起こらなかった。図24a〜図24cを参照されたい。ヒト幹細胞H9(WiCell)及びBGO1V/hOG細胞(Life Technologies)は、低ナノモル濃度の二量体形態のNM23−H1の存在下で最小幹細胞培地「MM」単独、又はヒト若しくはマウスのいずれかの線維芽細胞フィーダー細胞由来の50%馴化培地が添加されたMM+4ng/mL bFGF中で培養した場合、未分化幹細胞として付着するとともに増殖した。プレート表面に付着した二価抗PSMGFR抗体が、MUC1*受容体の二量体化を引き起こし、そのことから成長因子として作用したと結論づけた。しかしながら、細胞は培地にNM23(二量体)を添加した場合により高速で増殖した。
実施例2 − 表面へのヒト幹細胞の付着を促すモノクローナル抗体、2D6C8及び2D6C3(本明細書ではC3及びC8とも称される)の開発
細胞表面からはより遠位にあるMUC1*細胞外ドメイン部分と選択的に結合するMUC1*モノクローナル抗体を同定し、これらのモノクローナル抗体が、表面へのヒトES細胞及びヒトiPS細胞の付着をより良好に促すことを確認した。マウスをPSMGFR配列で規定されるペプチドを用いて免疫化した。ハイブリドーマクローンの上清を、PSMGFRペプチドとの結合能に関してELISAによって試験するとともに、どれが生きたMUC1*陽性細胞と結合するかを決定するためにFACSによって試験した。ハイブリドーマは、10C末端アミノ酸を欠いたPSMGFRペプチドとは選択的に結合するが、該ペプチドが10N末端ペプチドを欠いていると結合しない場合に更に選択された。加えて、ハイブリドーマを、プラスチック製の細胞培養プレート等の表面への幹細胞の付着を促す能力に関してスクリーニングした。これらのクローンの中で、表面上に被覆した場合、幹細胞を捕獲するとともにその成長を促す2D6C8及び2D6C3という2つのクローンを選択した。
細胞表面からはより遠位にあるMUC1*細胞外ドメイン部分と選択的に結合するMUC1*モノクローナル抗体を同定し、これらのモノクローナル抗体が、表面へのヒトES細胞及びヒトiPS細胞の付着をより良好に促すことを確認した。マウスをPSMGFR配列で規定されるペプチドを用いて免疫化した。ハイブリドーマクローンの上清を、PSMGFRペプチドとの結合能に関してELISAによって試験するとともに、どれが生きたMUC1*陽性細胞と結合するかを決定するためにFACSによって試験した。ハイブリドーマは、10C末端アミノ酸を欠いたPSMGFRペプチドとは選択的に結合するが、該ペプチドが10N末端ペプチドを欠いていると結合しない場合に更に選択された。加えて、ハイブリドーマを、プラスチック製の細胞培養プレート等の表面への幹細胞の付着を促す能力に関してスクリーニングした。これらのクローンの中で、表面上に被覆した場合、幹細胞を捕獲するとともにその成長を促す2D6C8及び2D6C3という2つのクローンを選択した。
図13は2D6C3κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR1:RSSQTIVHSNGNTYLE(配列番号20)、CDR2:KVSNRFS(配列番号21)、及びCDR3:FQGSHVPFT(配列番号22)。
図14は2D6C3重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR1:GYAMS(配列番号23)、CDR2:TISSGGTYIYYPDSVKG(配列番号24)、及びCDR3:LGGDNYYEY(配列番号25)。
図15は2D6C8κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR1:RASKSVSTSGYSYMH(配列番号26)、CDR2:LVSNLES(配列番号27)、及びCDR3:QHIRELTRSE(配列番号28)。
図16は2D6C8重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR1:GYAMS(配列番号29)、CDR2:TISSGGTYIYYPDSVKG(配列番号30)、及びCDR3:LGGDNYYEY(配列番号31)。
図17は3C2B1κ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR1:RASKSISTSDYNYIH(配列番号32)、CDR2:LASNLES(配列番号33)、及びCDR3:QHSRELPLTF(配列番号34)。
図18は3C2B1重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。CDR1:TYTMS(配列番号35)、CDR2:TISTGGDKTYYSDSVKG(配列番号36)、及びCDR3:GTTAMYYYAM(配列番号37)。
実施例2.1 プラスチック容器上に被覆したモノクローナル抗体2D6C8又は2D6C3はヒトES細胞及びヒトiPS細胞の付着を促す
モノクローナル抗体2D6C8又は2D6C3を多様なプラスチック製の細胞培養プレート上に被覆し、多様な細胞源由来のヒト幹細胞を捕獲する能力に関して試験した。3ug/mL〜125ug/mLの範囲の濃度の抗体およそ1mLを多様なメーカーからの標準的なプラスチック容器又は組織培養処理プラスチック容器上に被覆した。表面への抗体及び続く幹細胞の付着に関しては、組織培養処理プレートが未処理のポリスチレンよりも僅かに優れていたことが観察された。先の実施例と同じように、最小幹細胞培地(MM)単独中での成長によって幹細胞の増殖が起こったが、低ナノモル濃度のNM23−H1(二量体)又は二価抗PSMGFR抗体が培地中に存在する場合に、この増殖が大幅に改善されたことが観察された。
モノクローナル抗体2D6C8又は2D6C3を多様なプラスチック製の細胞培養プレート上に被覆し、多様な細胞源由来のヒト幹細胞を捕獲する能力に関して試験した。3ug/mL〜125ug/mLの範囲の濃度の抗体およそ1mLを多様なメーカーからの標準的なプラスチック容器又は組織培養処理プラスチック容器上に被覆した。表面への抗体及び続く幹細胞の付着に関しては、組織培養処理プレートが未処理のポリスチレンよりも僅かに優れていたことが観察された。先の実施例と同じように、最小幹細胞培地(MM)単独中での成長によって幹細胞の増殖が起こったが、低ナノモル濃度のNM23−H1(二量体)又は二価抗PSMGFR抗体が培地中に存在する場合に、この増殖が大幅に改善されたことが観察された。
実施例3 − 2D6C8又は2D6C3で被覆したVitaプレートがES細胞及びiPS細胞の成長の付着を促す
非被覆の(bare)又は125ugの2D6C8モノクローナル抗MUC1*抗体若しくは2D6C3モノクローナル抗MUC1*抗体のいずれかで被覆したVitaプレート(ThermoFisher)を、幹細胞の付着、及び続く成長を促す能力に関して試験した。MEFフィーダー細胞上で成長させ、最小幹細胞培地(MM)+8nM NM23−S120G中で培養した胚性幹(ES)細胞(H9)を手動で採取し、コロニー片をVita単独又は2D6C8 mabで被覆したVita又はVita+2D6C3 mab上にプレーティングした。第2の幹細胞源を同一の表面上にプレーティングした。これらは、マトリゲル上で成長させ、4ng/ml bFGF+マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞由来の50%馴化培地中で培養したH9 ES細胞であった。未分化コロニーを手動で切り取り(dissected)、採取した後、Vita単独又はVita+抗MUC1*抗体上にプレーティングした。プレーティング後、幹細胞を培地中で培養させた。どちらの培地でも、細胞を二量体形態の8nM NM23又は4ng/mL bFGF+マウスフィーダー細胞由来の50%馴化培地中で予め成長させた。驚くべきことにbFGF−MEF−CM中で培養した幹細胞を除く、Vita単独及びVita+2D6C8の両方に付着するNM23−MM中で培養した幹細胞が付着不良を示し、付着した僅かの細胞が1〜2日後に線維芽細胞様細胞へと分化するか又は死滅した。Vita単独表面に結合したNM23−MM幹細胞は、Vita+2D6C8抗体表面上のものより迅速に分化した。細胞源の細胞がNM23中で培養され、表面が抗PSMGFR抗体(2D6C8)で被覆したVitaプレートであった場合、プレーティングの8日後まで未分化コロニーのままであった。これらのコロニーは、採取し、新たなVita+2D6C8表面上で継代したところ、更に5日間、成長速度が低減せずに未分化コロニーとして成長し続けた。実験設定及び実験結果を図1に示す。図2は、図1の実験設定において見られるような、培地を変える前である2日目のウェルの写真を示している。bFGF及び馴化培地中で培養したウェル内の細胞は付着せず、1回目の培地の交換によって失われた。NM23−MM中で培養した左側の(left-most)カラムのウェル内の細胞は両方とも未分化幹細胞コロニーを形成した(図2、図3)。しかしながら、2D6C8抗体で被覆した表面のみでコロニーが生じ、5日目まで未分化のままであったため(図4)、連続継代することができた。結論として、Vita表面単独では、2D6C8又は2D6C3等の抗PSMGFR抗体で被覆したVita表面と同様にヒト幹細胞の成長を支持することはできなかった。さらに、bFGF+フィーダー細胞馴化培地中で培養した場合、抗体被覆を行っても又は行わなくてもVita表面上でプレーティングした幹細胞は成長が促されることはなかった。図5の実験設定、並びに図6(2日目)及び図7(7日目)の画像は、細胞を抗体被覆表面上にプレーティングする際に幹細胞の体積が低減する場合、細胞付着及びコロニー形成が3倍超になることを示している。4mLではなく1mLのプレーティング細胞で、より大きな体積の3つのコロニー付着と比較して最大14個のコロニーが形成された。図6及び図7で言及されている時間は、MM単独中で細胞をプレーティングした時点と、二量体形態のNM23を添加した時点との間の時間に相当する。該時間はプレーティング後0分〜3時間で最適であると考えられる。
非被覆の(bare)又は125ugの2D6C8モノクローナル抗MUC1*抗体若しくは2D6C3モノクローナル抗MUC1*抗体のいずれかで被覆したVitaプレート(ThermoFisher)を、幹細胞の付着、及び続く成長を促す能力に関して試験した。MEFフィーダー細胞上で成長させ、最小幹細胞培地(MM)+8nM NM23−S120G中で培養した胚性幹(ES)細胞(H9)を手動で採取し、コロニー片をVita単独又は2D6C8 mabで被覆したVita又はVita+2D6C3 mab上にプレーティングした。第2の幹細胞源を同一の表面上にプレーティングした。これらは、マトリゲル上で成長させ、4ng/ml bFGF+マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞由来の50%馴化培地中で培養したH9 ES細胞であった。未分化コロニーを手動で切り取り(dissected)、採取した後、Vita単独又はVita+抗MUC1*抗体上にプレーティングした。プレーティング後、幹細胞を培地中で培養させた。どちらの培地でも、細胞を二量体形態の8nM NM23又は4ng/mL bFGF+マウスフィーダー細胞由来の50%馴化培地中で予め成長させた。驚くべきことにbFGF−MEF−CM中で培養した幹細胞を除く、Vita単独及びVita+2D6C8の両方に付着するNM23−MM中で培養した幹細胞が付着不良を示し、付着した僅かの細胞が1〜2日後に線維芽細胞様細胞へと分化するか又は死滅した。Vita単独表面に結合したNM23−MM幹細胞は、Vita+2D6C8抗体表面上のものより迅速に分化した。細胞源の細胞がNM23中で培養され、表面が抗PSMGFR抗体(2D6C8)で被覆したVitaプレートであった場合、プレーティングの8日後まで未分化コロニーのままであった。これらのコロニーは、採取し、新たなVita+2D6C8表面上で継代したところ、更に5日間、成長速度が低減せずに未分化コロニーとして成長し続けた。実験設定及び実験結果を図1に示す。図2は、図1の実験設定において見られるような、培地を変える前である2日目のウェルの写真を示している。bFGF及び馴化培地中で培養したウェル内の細胞は付着せず、1回目の培地の交換によって失われた。NM23−MM中で培養した左側の(left-most)カラムのウェル内の細胞は両方とも未分化幹細胞コロニーを形成した(図2、図3)。しかしながら、2D6C8抗体で被覆した表面のみでコロニーが生じ、5日目まで未分化のままであったため(図4)、連続継代することができた。結論として、Vita表面単独では、2D6C8又は2D6C3等の抗PSMGFR抗体で被覆したVita表面と同様にヒト幹細胞の成長を支持することはできなかった。さらに、bFGF+フィーダー細胞馴化培地中で培養した場合、抗体被覆を行っても又は行わなくてもVita表面上でプレーティングした幹細胞は成長が促されることはなかった。図5の実験設定、並びに図6(2日目)及び図7(7日目)の画像は、細胞を抗体被覆表面上にプレーティングする際に幹細胞の体積が低減する場合、細胞付着及びコロニー形成が3倍超になることを示している。4mLではなく1mLのプレーティング細胞で、より大きな体積の3つのコロニー付着と比較して最大14個のコロニーが形成された。図6及び図7で言及されている時間は、MM単独中で細胞をプレーティングした時点と、二量体形態のNM23を添加した時点との間の時間に相当する。該時間はプレーティング後0分〜3時間で最適であると考えられる。
ヒト人工多能性幹細胞(iPS)細胞を図8の実験設定に従って化学分析し、結果を図9に示す。a)予め8nM NM23二量体中、マトリゲル上で培養した細胞、又はb)予め4ng/mL bFGF中、マウス線維芽細胞フィーダー細胞上で培養した細胞という2つの細胞源からのiPS細胞を試験した。幹細胞コロニー片を1mLの8nM NM23(二量体)−最小培地(MM)中でプレーティングし、3時間放置した後、体積を6ウェルプレートの1ウェル当たり4mLまで増大させた。培地は48時間ごとに交換した。細胞を、細胞が過剰成長するようになり、分化し始める7日目まで成長させ、それによってどの条件が全体的な付着、増殖及び分化の阻害に最良であったかを評価した。結論として、両MUC1*抗体によって、Vita表面がより長い期間、分化を阻害するのに良好なものとなる。Vita+抗体表面は、5日目で100%未分化なコロニーを含み、7日目まで最も多くの細胞と最も少ない分化と示した。
実施例4 − NM23(二量体)含有培地中、抗PSMGFR抗体被覆表面上での幹細胞の成長に関するプロトコルの最適化
ヒトES細胞及びヒトiPS細胞の付着及び増殖の効率を改善する幾つかの要因を特定した:1)トリプシン処理した(又はそうでなければ単一の)幹細胞は、抗PSMGFR抗体被覆表面を使用する場合、特にベース表面がVita表面と類似の原子組成の表面である場合、コロニー片よりも良好に作用し、2)予め低ナノモル濃度の二量体NM23中、フィーダー細胞又はマトリゲル等の他の表面上で培養した細胞はbFGF中で培養した細胞よりも良好であったが、この効果はプレーティングの直前の低ナノモル濃度の二量体NM23中での30分のインキュベーションによって最小限になる場合があり、3)プレーティング後の初めの24時間のRhoキナーゼ阻害剤の使用によって、幹細胞の付着が改善されるが、幹細胞の生存には影響を与えなかった。さらに、幹細胞成長培地の容量を6ウェルプレートの1ウェル当たり4mLから2mL又は1mLへと低減させることで幹細胞の付着が増進したことに注目した。さらに、細胞成長培地を48時間ごとではなく24時間ごとに交換し、4mLではなく2mLの培地を用いることで、一部の細胞型の維持が改善した。
ヒトES細胞及びヒトiPS細胞の付着及び増殖の効率を改善する幾つかの要因を特定した:1)トリプシン処理した(又はそうでなければ単一の)幹細胞は、抗PSMGFR抗体被覆表面を使用する場合、特にベース表面がVita表面と類似の原子組成の表面である場合、コロニー片よりも良好に作用し、2)予め低ナノモル濃度の二量体NM23中、フィーダー細胞又はマトリゲル等の他の表面上で培養した細胞はbFGF中で培養した細胞よりも良好であったが、この効果はプレーティングの直前の低ナノモル濃度の二量体NM23中での30分のインキュベーションによって最小限になる場合があり、3)プレーティング後の初めの24時間のRhoキナーゼ阻害剤の使用によって、幹細胞の付着が改善されるが、幹細胞の生存には影響を与えなかった。さらに、幹細胞成長培地の容量を6ウェルプレートの1ウェル当たり4mLから2mL又は1mLへと低減させることで幹細胞の付着が増進したことに注目した。さらに、細胞成長培地を48時間ごとではなく24時間ごとに交換し、4mLではなく2mLの培地を用いることで、一部の細胞型の維持が改善した。
実施例4.1 − 幹細胞培養に対するRhoキナーゼ阻害剤の効果
先の実験では、付着の不良又は塊状での細胞付着のために継代中に幹細胞が大幅に喪失した。本実験では、Vita表面+Rhoキナーゼ阻害剤(ROCi:Y−27632、Calbiochem)又はROCiを含まないVita+抗MUC1*抗体又はVita表面+抗MUC1*抗体+ROCi上でのiPS細胞及びES H9細胞の両方に関する付着、成長及び分化を比較した。細胞の塊化を最小限に抑えるために、初めに未分化幹細胞コロニー片をトリプシン処理し、単一細胞を得た(トリプシンは0.05%で使用し、0.5g/L又は21.45μMであり、50mlの1×溶液として供給されている(Mediatech, Inc.、カタログ番号:25−052)。
先の実験では、付着の不良又は塊状での細胞付着のために継代中に幹細胞が大幅に喪失した。本実験では、Vita表面+Rhoキナーゼ阻害剤(ROCi:Y−27632、Calbiochem)又はROCiを含まないVita+抗MUC1*抗体又はVita表面+抗MUC1*抗体+ROCi上でのiPS細胞及びES H9細胞の両方に関する付着、成長及び分化を比較した。細胞の塊化を最小限に抑えるために、初めに未分化幹細胞コロニー片をトリプシン処理し、単一細胞を得た(トリプシンは0.05%で使用し、0.5g/L又は21.45μMであり、50mlの1×溶液として供給されている(Mediatech, Inc.、カタログ番号:25−052)。
実験設定の第1の部分を図10に示す。初めに採取した細胞をNM23−MM中、15分間事前にインキュベートした後、洗い流して、1ウェル当たり1mLのMM中でプレーティングした。僅か15分後、8nM NM23−S120Gを添加し、最終容量を1ウェル当たり4mLとした。図11から分かるように、Rhoキナーゼ阻害剤(ROCi)は、幹細胞を表面に付着させる前に溶液中で幹細胞が塊化するのを防ぐ。実験終了時には、同等品質の同等数のコロニーが存在していたが、これらの結果は、少なくとも初めの24時間〜48時間は、NM23−MMにROCiを添加したVita+抗体表面からより多くのコロニーが生じたことを示している。実際、任意の細胞源のES細胞又はiPS細胞をトリプシン処理し、単一細胞懸濁液にして、前もってbFGF中で培養していれば少なくとも15分間、低ナノモル濃度の二量体形態のNM23中で予めインキュベートして、抗PSMGFR抗体で被覆した表面上にプレーティングした後、初めの24時間〜48時間、低ナノモル濃度のNM23二量体+ROCi中で培養した場合、未分化状態での幹細胞の付着及び増殖は少なくとも10倍〜100倍に増大した。図12aは、8nM NM23二量体−MM中、マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー上での培養物から採取し、各種濃度のD26C3抗PSMGFR抗体で被覆したVita表面上に、初めの48時間だけ10uM ROCiでプレーティングしたヒトES H9細胞のプレーティング後5日目の画像を示している。図12b〜図12dはこれらの細胞の拡大写真である。
実施例5 − Vita表面技術の改善
本実験では、前もってbFGF中、MEFフィーダー細胞上で培養した後、単一細胞として、a)Vita表面上にプレーティングし、次いで4ng/mL bFGF、50% MEF馴化培地及び10uM ROCi(Y−27632、Calbiochem)中で培養するか、又はb)12.5ug/mL D26C3抗PSMGFR抗体で被覆したVitaプレート上にプレーティングし、次いで初めの48時間のみ10uM ROCiを存在させて8nM NM23二量体−MM中で培養した、ヒト幹細胞の付着、成長、及びヒトES細胞の自然分化に対する耐性を比較した。図12eに示される比較によって、表面を抗PSMGFR抗体で被覆すること又は細胞をNM23二量体−MM中で培養することを含むものではなかった現行の技術水準を上回る改善が示される。
本実験では、前もってbFGF中、MEFフィーダー細胞上で培養した後、単一細胞として、a)Vita表面上にプレーティングし、次いで4ng/mL bFGF、50% MEF馴化培地及び10uM ROCi(Y−27632、Calbiochem)中で培養するか、又はb)12.5ug/mL D26C3抗PSMGFR抗体で被覆したVitaプレート上にプレーティングし、次いで初めの48時間のみ10uM ROCiを存在させて8nM NM23二量体−MM中で培養した、ヒト幹細胞の付着、成長、及びヒトES細胞の自然分化に対する耐性を比較した。図12eに示される比較によって、表面を抗PSMGFR抗体で被覆すること又は細胞をNM23二量体−MM中で培養することを含むものではなかった現行の技術水準を上回る改善が示される。
実施例6 − Rhoキナーゼ阻害剤の必要性は排除することができる
ROCiの有無での幹細胞付着の直接比較において、ROCiの非存在下では、幹細胞が表面に付着する前に塊化することが観察された。一部のコロニーが細胞の塊の下に形成されたが、大抵の場合、細胞の塊化は表面への幹細胞の付着過程を阻害するものであった。ROCiの存在下で幹細胞の付着で観察された改善は、細胞が表面に付着するまで、単一細胞として細胞の分離状態を維持することであると考えた。代替的に、良好な幹細胞付着が、プレーティング前に幹細胞をトリプシン処理することによって達成された。EDTAの添加(本発明者らは、0.1mM〜1.0mM EDTAを使用した)によっても、表面への幹細胞の接着が増大した。別の方法では、溶液中に幹細胞を含むプレートを遠心することで、細胞を表面に接触させ、幹細胞付着をもたらし、それによる成長は、プレーティング後、初めの24時間〜48時間、10uM ROCiが存在する事例と変わらないものであった。
ROCiの有無での幹細胞付着の直接比較において、ROCiの非存在下では、幹細胞が表面に付着する前に塊化することが観察された。一部のコロニーが細胞の塊の下に形成されたが、大抵の場合、細胞の塊化は表面への幹細胞の付着過程を阻害するものであった。ROCiの存在下で幹細胞の付着で観察された改善は、細胞が表面に付着するまで、単一細胞として細胞の分離状態を維持することであると考えた。代替的に、良好な幹細胞付着が、プレーティング前に幹細胞をトリプシン処理することによって達成された。EDTAの添加(本発明者らは、0.1mM〜1.0mM EDTAを使用した)によっても、表面への幹細胞の接着が増大した。別の方法では、溶液中に幹細胞を含むプレートを遠心することで、細胞を表面に接触させ、幹細胞付着をもたらし、それによる成長は、プレーティング後、初めの24時間〜48時間、10uM ROCiが存在する事例と変わらないものであった。
モデル実験では、ヒトES H9細胞を抗PSMGFR抗体(2D6C3)で被覆したVita表面上にプレーティングし、細胞をNM23−MM中に入れ、細胞をトリプシン処理するか(上段)、1mM EDTAの存在下でトリプシン処理するか(中段)、又は10uM ROCiの存在下でトリプシン処理した(下段)。図19から分かるように、トリプシン単独では、細胞の塊化及び表面への付着不良が残り、トリプシン+EDTAは細胞付着を改善したが、細胞はニューロン様表現型へと分化した。図20は、同じ条件下でプレートを遠心することで表面への幹細胞の付着が大きく改善したことを示している。細胞をプレーティングした後、プレートを、スイングバケット式遠心分離器を用いて1200RPMで3〜5分間遠心した。図20が示すように、細胞を表面に物理的に移動させることで、細胞の塊化が取り除かれ、Rhoキナーゼ阻害剤の必要性が排除された。同様の結果は、細胞含有培地に圧力を加えること、又は細胞が隣接細胞とではなく表面と物理的に接触する可能性を増大させる任意の(of)方法によって達成することができる。
代替方法において、Rhoキナーゼ阻害剤の使用は、細胞のプレーティング密度を単純に低減させることによっても排除することができることが見出された。NM23−MM単独(ROCiなし)中での6ウェルプレートの1ウェル当たり25000個又は50000個の細胞でプレーティングした、表面に付着させる細胞は、ROCiが存在しているかのように正常に増殖する。図21に示される実験では、BGO1V/hOG細胞をトリプシン処理し、計数して、6ウェルプレートの1ウェル当たり25000個又は50000個の細胞のいずれかでプレーティングして、NM23−MM中で7日間培養した。ROCiを使用せずとも、細胞はROCiが存在するものと区別なく付着するとともに増殖した。
更に別の方法では、rhoキナーゼ阻害剤の必要性が基本培地の組成を単純化することで排除される。低ナノモル濃度の二量体NM23を含むが、血清アルブミン又はβメルカプトエタノールを含まない培地によって、ROCiの必要性が排除された。例えば、NM23−MN6(DMEM/F12/GlutaMAX、又は1%非必須アミノ酸と、64mg/Lアスコルビン酸(Sigma)と、14ug/Lセレン酸ナトリウム(Sigma)と、19.4mg/Lインスリン(Sigma)と、543mg/L重炭酸ナトリウム(Sigma)と、10.7mg/Lトランスフェリン(Sigma)とが添加された、細胞培養に好適な類似の基本培地)中で培養したヒトH9細胞では、幹細胞の70%〜90%の付着及び最適な細胞生存にはROCiの使用は必要なかった。(図26)。
実施例7 − 異なるNM23多量体を生成させ、機能に関して化学分析する
実施例7.1 − 組換えNM23−wt及びNM23−S120Gのクローニング
WT NM23−H1 cDNAを、以下のプライマー:5'-atc gat gga tcc gat ggc caa ctg tga gcg tac c-3'(配列番号38)及び5'-gtg gtg ctc gag ttc ata gat cca gtt ctg agc-3'(配列番号39)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。BamHI制限酵素及びXhoI制限酵素(New England Biolabs)による消化の後、精製フラグメントを、同じ制限酵素によって消化させたpET21bベクター(Novagen)にクローニングした。次いで、以下のプライマー:5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'(配列番号40)及び5'-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'(配列番号41)を使用して、メーカーの使用説明書に従ってGeneTailor(商標)部位特異的突然変異誘発システム(Life Technologies)を用いることでNM23−H1突然変異体S120G(#120のセリンをグリシンへと突然変異させた)を生成した。配列確認の後、WT及び突然変異体NM23−H1構築物を、組換えタンパク質発現のためにBL21(DE3)細胞(Life Technologies)へと形質転換させた。
実施例7.1 − 組換えNM23−wt及びNM23−S120Gのクローニング
WT NM23−H1 cDNAを、以下のプライマー:5'-atc gat gga tcc gat ggc caa ctg tga gcg tac c-3'(配列番号38)及び5'-gtg gtg ctc gag ttc ata gat cca gtt ctg agc-3'(配列番号39)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。BamHI制限酵素及びXhoI制限酵素(New England Biolabs)による消化の後、精製フラグメントを、同じ制限酵素によって消化させたpET21bベクター(Novagen)にクローニングした。次いで、以下のプライマー:5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'(配列番号40)及び5'-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'(配列番号41)を使用して、メーカーの使用説明書に従ってGeneTailor(商標)部位特異的突然変異誘発システム(Life Technologies)を用いることでNM23−H1突然変異体S120G(#120のセリンをグリシンへと突然変異させた)を生成した。配列確認の後、WT及び突然変異体NM23−H1構築物を、組換えタンパク質発現のためにBL21(DE3)細胞(Life Technologies)へと形質転換させた。
NM23 S120G−DNA配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga(配列番号42)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga(配列番号42)
NM23 S120G−アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH(配列番号43)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH(配列番号43)
実施例7.2 − 組換えNM23−wt及びNM23−S120Gの発現/精製
LBブロス(ルリア−ベルターニブロス)を一晩培養物の1/10で植菌し、OD600がおよそ0.5に達するまで37℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、0.4mMイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトシド(IPTG, Sigma)を用いて誘導し、培養を4時間後に停止させた。細胞を遠心分離(4℃で10分間、6000rpm)によって採取した後、細胞ペレットを泳動バッファー:PBS(pH7.4)、360mM NaCl及び80mMイミダゾールで再懸濁した。次いでリゾチーム(1mg/mL、Sigma)、MgCl2(0.5mM)及びDNアーゼ(0.5ug/mL、Sigma)を添加した。細胞懸濁液を37℃で30分間、回転台(275rpm)の上でインキュベートし、5分間氷上で超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除いた。次いで、残屑を除去した(cleared)溶解物を、泳動バッファーで平衡化したNi−NTAカラム(Qiagen)に適用した。カラムを洗浄した後、420mMイミダゾールが添加された泳動バッファーによって、タンパク質をカラムから溶出させた。溶出画分を非還元SDS−PAGEで分析し、タンパク質を含む画分を組み合わせた。特に指定のない限り、構成要素は全てSigmaのものとした。
LBブロス(ルリア−ベルターニブロス)を一晩培養物の1/10で植菌し、OD600がおよそ0.5に達するまで37℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、0.4mMイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトシド(IPTG, Sigma)を用いて誘導し、培養を4時間後に停止させた。細胞を遠心分離(4℃で10分間、6000rpm)によって採取した後、細胞ペレットを泳動バッファー:PBS(pH7.4)、360mM NaCl及び80mMイミダゾールで再懸濁した。次いでリゾチーム(1mg/mL、Sigma)、MgCl2(0.5mM)及びDNアーゼ(0.5ug/mL、Sigma)を添加した。細胞懸濁液を37℃で30分間、回転台(275rpm)の上でインキュベートし、5分間氷上で超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除いた。次いで、残屑を除去した(cleared)溶解物を、泳動バッファーで平衡化したNi−NTAカラム(Qiagen)に適用した。カラムを洗浄した後、420mMイミダゾールが添加された泳動バッファーによって、タンパク質をカラムから溶出させた。溶出画分を非還元SDS−PAGEで分析し、タンパク質を含む画分を組み合わせた。特に指定のない限り、構成要素は全てSigmaのものとした。
実施例7.3 − タンパク質リフォールディング
NM23 H1 S120Gを、変性バッファー:100mM Tris(pH8.0)及び8M尿素を用いて変性させた。次いで、変性タンパク質を透析によってリフォールディングに供した。タンパク質を、1)100mM Tris(pH8.0)、4M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA(Fluka)及び5%グリセロール(Acros)、2)100mM Tris(pH8.0)、2M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロール、並びに3)100mM Tris(pH8.0)、1M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して24時間連続して透析した。次いで、タンパク質を、100mM Tris(pH8.0)、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して9時間、並びに25mM Tris(pH8.0)、0.2Mイミダゾール、0.1M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して一晩透析した。最後に、タンパク質を、PBS(pH7.4)、0.2Mイミダゾール、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して4回バッファーを交換して24時間透析した。特に指定のない限り、構成要素は全てSigmaのものとした。不溶性の凝集物を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除き、二量体(およそ37KDa)を、泳動バッファーとしてPBS(pH7.4)を用いたSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ピーク画分を非還元SDS−PAGEで分析し、二量体を含む画分を組み合わせた。
NM23 H1 S120Gを、変性バッファー:100mM Tris(pH8.0)及び8M尿素を用いて変性させた。次いで、変性タンパク質を透析によってリフォールディングに供した。タンパク質を、1)100mM Tris(pH8.0)、4M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA(Fluka)及び5%グリセロール(Acros)、2)100mM Tris(pH8.0)、2M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロール、並びに3)100mM Tris(pH8.0)、1M尿素、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して24時間連続して透析した。次いで、タンパク質を、100mM Tris(pH8.0)、0.2Mイミダゾール、0.4M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して9時間、並びに25mM Tris(pH8.0)、0.2Mイミダゾール、0.1M L−アルギニン、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して一晩透析した。最後に、タンパク質を、PBS(pH7.4)、0.2Mイミダゾール、1mM EDTA及び5%グリセロールに対して4回バッファーを交換して24時間透析した。特に指定のない限り、構成要素は全てSigmaのものとした。不溶性の凝集物を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除き、二量体(およそ37KDa)を、泳動バッファーとしてPBS(pH7.4)を用いたSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ピーク画分を非還元SDS−PAGEで分析し、二量体を含む画分を組み合わせた。
実施例7.4 − タンパク質のオリゴマー形成状態
NM23タンパク質のオリゴマー形成状態を、ゲル濾過標準(Bio-Rad)で較正したSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって推測した。NM23機能の重大な特徴はその多量体化状態であり、その中でもNM23の二量体形態は多能性及び細胞成長を促す活性型である。
NM23タンパク質のオリゴマー形成状態を、ゲル濾過標準(Bio-Rad)で較正したSuperdex 200 10/300 GLカラム(GE healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって推測した。NM23機能の重大な特徴はその多量体化状態であり、その中でもNM23の二量体形態は多能性及び細胞成長を促す活性型である。
NM23 H1アイソフォームを、野生型タンパク質(wt)、及び更には単一点突然変異、S120Gを有するタンパク質として発現させた。サイズ排除クロマトグラフィー(図22a)、ネイティブゲル、及びウェスタンブロット法(図S22)による分析によって、8nM〜13uMの濃度では、可溶性NM23−wt及び可溶性NM23−S120Gの大部分が六量体(NM23S120G六量体)であることが示された。しかしながら、上で挙げられたタンパク質リフォールディング法を用いると、NM23S120Gが変性してリフォールディングし、主に二量体からなる集団を生じ、それをサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製することで、本質的に全て二量体の安定した集団(NM23S120G二量体)を回収した。このようにして、どちらも六量体からなるNM23−wt及びS120G突然変異体と、本質的に全て二量体であるリフォールディングしたFPLC精製NM23S120Gとを作製した(図22a及び図S22a、図S22b)。
表面プラズモン共鳴を用いた直接結合アッセイにおいて、NM23の六量体及び二量体のMUC1* ecdペプチドとの結合能をBiacore 3000機器で試験した。合成MUC1* ecdペプチド(PSMGFR−HIS6タグ)を金チップ上に固定した。NM23−wt、NM23S120G二量体、NM23S120G六量体、又は50%のNM23S120G二量体を含むサンプルをペプチド表面に別々に流した。ペプチド表面に結合したNM23の量は、各サンプルに存在する二量体の量に対応するものであった(図22b)。NM23S120G二量体は、固定化MUC1*ペプチドとのロバストな結合を示したが、大部分が六量体であるNM23−wt及びNM23S120G六量体は最小結合を示した。SPRシグナルが、溶液−ペプチド表面の界面で結合した分子種の質量に正比例することに留意されたい。そのため、六量体形態のNM23がMUC1*ペプチド表面に結合した場合、六量体の質量が大きくなることによって、二量体の3倍のレゾナンスユニット(RU)が生じる。六量体の結合量が最小であったという事実は、NM23六量体がMUC1*受容体と結合しないという考えと一致する。
ナノ粒子アッセイを用いて、NM23二量体対六量体の結合を特性化した。MUC1* ecdペプチド(QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAHHHHHH)(配列番号44)をNTA−SAM被覆金コロイドに固定化した。NM23−wt、NM23S120G二量体及びNM23S120G六量体を発現させ、Strep−タグIIを用いて精製した(図22c)。NM23S120G二量体の添加によって、特異的な結合を示すピンク色から青色への溶液の色の変化が誘導され、その後特異的な結合が抗MUC1* Fabの添加によって阻害された。これに対して、NM23−wt又はNM23S120G六量体の添加では色の変化が誘導されず、このことは六量体がMUC1*受容体と結合しないことを示していた(図22d)。
様々なNM23多量体を、多能性幹細胞成長を維持する能力に関して試験した。ヒトH9 ES細胞を、NM23−wt、NM23S120G二量体又はNM23S120G六量体のいずれかを含む最小培地(MM)中で培養した。NM23S120G二量体では、完全に未分化の幹細胞が生じたが(図22e)、NM23S120G六量体及びNM23−wt(大部分が六量体)は急速に分化した(図22f、図22g)。このことがNM23二量体と、多能性成長を促進するMUC1*細胞外ドメインとの特異的相互作用であることを更に実証するために、合成MUC1* ecdペプチド(PSMGFR)を最小培地中のNM23二量体で成長させた幹細胞に添加して、この相互作用を競合阻害した。NM23二量体−MUC1*相互作用の破壊によって最高度の分化がもたらされた(図22h)。
実施例7.5 − NM23−MUC1*相互作用が阻害されると、miR−145が急増する
miR−145発現の増大は、幹細胞の多能性からの離脱を示唆するものである。成長因子を幹細胞培地に与えない(これは分化を誘導する標準的な方法である)と、それに応じてmiR−145発現が急増する。RT−PCR測定結果は、NM23S120G二量体−MUC1*相互作用の遊離MUC1* ecdペプチドによる競合阻害によって、単純に成長因子NM23S120G二量体又はbFGFを与えないことで細胞を分化させることで引き起こされるものよりも早期でかつより大きなmiR−145の発現の急増がもたらされたことを示していた(図22i)。これらの結果によって、このことがNM23S120G二量体の、多能性を促進するMUC1*成長因子受容体の細胞外ドメインとの結合の特異的相互作用であることが実証される。
miR−145発現の増大は、幹細胞の多能性からの離脱を示唆するものである。成長因子を幹細胞培地に与えない(これは分化を誘導する標準的な方法である)と、それに応じてmiR−145発現が急増する。RT−PCR測定結果は、NM23S120G二量体−MUC1*相互作用の遊離MUC1* ecdペプチドによる競合阻害によって、単純に成長因子NM23S120G二量体又はbFGFを与えないことで細胞を分化させることで引き起こされるものよりも早期でかつより大きなmiR−145の発現の急増がもたらされたことを示していた(図22i)。これらの結果によって、このことがNM23S120G二量体の、多能性を促進するMUC1*成長因子受容体の細胞外ドメインとの結合の特異的相互作用であることが実証される。
全RNAを、メーカーの使用説明書に従ってmirVana(商標)キット(Applied Biosystem、P/N:AM1561)を使用することでサンプルから抽出した。各全RNAサンプルに対して、2つのcDNAサンプルを、TaqMan(商標)マイクロRNA逆転写キット(Applied Biosystems、P/N:4366596)と、miR−145及び内在性コントロール(endogenous control)として働く核内低分子RNA U6B(RNU6B)に特異的な2つの異なるステム−ループプライマーとを使用して合成した。cDNAサンプルでのmiR−145及びRNU6Bの定量化を、メーカーの使用説明書に従ってTaqMan(商標)マイクロRNAアッセイ(Applied Biosystems、P/N:4427975)を使用して行った。リアルタイムPCRのデータを、比較Ct法を用いて分析した。各サンプル中のmiR−145の相対量を、miR−145 Ctと、対応するRNU6B Ctとの間の差(ΔCt)を計算することで求めた。2回目の正規化を、データセットでの他の全てのΔCtから最小ΔCtを減算することによって行った(ΔΔCt)。
図22aは、組換えNM23野生型及びNM23−S120G突然変異体を、異なる多量体化状態の形成をもたらす異なるプロトコルを用いて発現させ、特性化させた後、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した結果を示す。NM23−S120G突然変異体は、安定した二量体集団を生じるプロトコルを用いて変性及びリフォールディングした。六量体と四量体と二量体との混合物を、約50%の二量体を含むように生成した。図22bは、NM23−S120G又は野生型多量体を、表面プラズモン共鳴(SPR)によって試験し、合成MUC1*細胞外ドメイン(ecd)ペプチドとの結合能を決定した結果を示す。MUC1*ペプチドとのNM23結合量は、各サンプルに存在する二量体の濃度に対応する。図22cは、Strep−タグIIを含む、組換えNM23−wt、NM23S120G六量体及びNM23S120G二量体をサイズ排除クロマトグラフィーによって特性化した結果を示す。図22dは、MUC1* ecdペプチドを提示するナノ粒子を、Strep−タグIIを含む、NM23−wt、NM23S120G二量体又はNM23S120G六量体と混合した結果を示す。ナノ粒子のピンク色から青灰色への色の変化は結合を示す。NM23二量体は64nMでMUC1* ecdペプチドと結合し、六量体は野生型又はS120G突然変異体にかかわらず結合しない。相互作用は抗MUC1* Fabによって競合阻害され、このことは色の変化がNM23二量体とMUC1* ecdとの特異的な相互作用によるものであったことを示している。H9 hES細胞をNM23S120G二量体(図22e)、NM23S120G六量体(図22f)、野生型(図22g)又はNM23S120G二量体+合成MUC1* ecdペプチド(図22h)で培養した。NM23S120G二量体のみが多能性幹細胞の成長を支持した。六量体又はNM23S120G二量体−MUC1*相互作用の阻害によって即時分化がもたらされた。図22iは、H9 hES細胞をbFGF+馴化培地又はNM23S120G二量体のいずれかで培養した後、成長因子を与えないことで分化させた結果を示す。NM23S120G二量体で培養した一部の細胞は成長因子を受け続けたが、NM23−MUC1*相互作用を競合阻害するMUC1* ecdペプチドも与えられた。多能性からの離脱に関するマーカーであるmiR−145を、RT−PCRによって時間の関数として測定した。
図S22は、安定した二量体集団として組換えNM23を生じるために開発されたプロトコルを示す。図22aは、組換えNM23−wt、又は可溶性部分から精製し、変性した後、リフォールディングして、二量体集団又は適切な二量体と六量体との50/50ミックスをもたらす調製物を形成するS120G突然変異体を、ネイティブゲル上で分析し、どのプロトコルがどの多量体を生じたかを決定した。タンパク質は、1ウェル当たり5ug及び10ugの総タンパク質でロードした。図22bは、ウェスタンブロット法をネイティブゲル上で実施した結果を示すものであり、ここではNM23−wt又はS120G突然変異体の様々な調製物を、幹細胞培養物に使用したものと比較して非常に低い濃度(8nM、16nM及び32nM)でロードした。図22cは、培養条件下でのNM23S120G二量体の安定性を試験した結果を示す。NM23S120G二量体は、細胞培養培地に添加し、CO2インキュベータ内で48時間まで維持した後、SDS−PAGEによって分析した。NM23S120G二量体では、幹細胞培養物での使用に要求される時間枠内で変性は起こらないことが示された。
実施例8 − NM23−MM中で長期間培養したヒトES細胞は3つ全ての生殖系列へと正常に分化し、殆どの場合で協調分化を示した
マトリゲル上のH9 hES細胞を、MM(最小幹細胞培地)中の8nM NM23二量体又はMM+MEF馴化培地中の4ng/mL bFGFで6継代にわたって培養した後、胚様体法によって分化させた。続く核マーカーDAPI及び3つの生殖系列のマーカーに対する抗体による染色を行った:図23aは内胚葉−αフェトプロテインを示し、図23bは外胚葉−ネスチンを示し、図23cは中胚葉−平滑筋アクチンを示す。NM23−MM中で培養した幹細胞は3つ全ての生殖系列ヘと分化し、単一クラスタ内の殆どの細胞が同じマーカーに対して陽性染色した。bFGF及びMEF馴化培地中で培養した幹細胞も3つ全ての生殖系列ヘと分化したが、多くの場合で協調分化を示さず、最近接核は試験した生殖系列マーカーに対して陰性染色した(図23d〜図23f)。
マトリゲル上のH9 hES細胞を、MM(最小幹細胞培地)中の8nM NM23二量体又はMM+MEF馴化培地中の4ng/mL bFGFで6継代にわたって培養した後、胚様体法によって分化させた。続く核マーカーDAPI及び3つの生殖系列のマーカーに対する抗体による染色を行った:図23aは内胚葉−αフェトプロテインを示し、図23bは外胚葉−ネスチンを示し、図23cは中胚葉−平滑筋アクチンを示す。NM23−MM中で培養した幹細胞は3つ全ての生殖系列ヘと分化し、単一クラスタ内の殆どの細胞が同じマーカーに対して陽性染色した。bFGF及びMEF馴化培地中で培養した幹細胞も3つ全ての生殖系列ヘと分化したが、多くの場合で協調分化を示さず、最近接核は試験した生殖系列マーカーに対して陰性染色した(図23d〜図23f)。
実施例9 − プラスチック製細胞培養プレート上に被覆したモノクローナル抗MUC1*抗体であるMN−C3(2D6C3)は、NM23−最小培地と併せることで多能性幹細胞の成長を完全に支持する
2D6C3モノクローナル抗体又は2D6C8モノクローナル抗体を、3.25ug/mL〜125ug/mLの濃度で組織培養処理プレートの表面上に被覆し、室温で3時間、又は4℃で一晩インキュベートした。ヒトES細胞及びヒトiPS細胞はこれらの抗体被覆表面上に容易に付着し、連続継代することができた。多能性マーカーでのICC染色及びRT−PCRから明らかなように、得られた幹細胞は多能性であった。
2D6C3モノクローナル抗体又は2D6C8モノクローナル抗体を、3.25ug/mL〜125ug/mLの濃度で組織培養処理プレートの表面上に被覆し、室温で3時間、又は4℃で一晩インキュベートした。ヒトES細胞及びヒトiPS細胞はこれらの抗体被覆表面上に容易に付着し、連続継代することができた。多能性マーカーでのICC染色及びRT−PCRから明らかなように、得られた幹細胞は多能性であった。
実施例9.1 − 幹細胞成長表面
Vita表面を、MUC1*受容体を二量体化することによって、幹細胞付着方法及び成長刺激方法の両方として機能するモノクローナルMUC1* ecd抗体(D26C3)で被覆した。図24a〜図24cは、幹細胞がD26C3抗体被覆密度に応じて付着及び増殖したが、対照抗体を使用した場合には幹細胞の付着は観察されなかったことを示す。幹細胞は、任意の成長因子、すなわちNM23又はbFGFの非存在下において最小幹細胞培地単独で培養したとしても、表面に固定化した抗体からのMUC1*の二量体化によってこれらのMUC1*抗体表面上で増殖した。しかしながら、成長速度は最小培地中でのNM23の使用によって大幅に改善した。場合によっては、Rhoキナーゼ阻害剤を初めの48時間存在させ、表面への付着を増大させたが、生存には影響を及ぼさなかった。ES細胞及びiPS細胞は、NM23−MM中のこれらのMUC1*抗体表面上で、成長速度又は多能性を低減させることなく20継代を超えて連続継代した。さらに、NM23−MM中のMUC1*抗体表面上で成長する幹細胞は、連続継代ごとに成長速度が劇的に増大した。4継代までに、プレーティングした600000個のiPS細胞は4日で7.9M未分化幹細胞へと13倍に増大した。同様に、5継代までに、H9細胞は17倍に増大した(図24d〜図24f)。標準多能性マーカーによるICC染色によって、細胞が多能性であり、正常な核型を有していたことが確認された(図S24a及び図S24b)。加えて、得られるES細胞及びiPS細胞は、3つ全ての生殖系列へと分化することが可能であった(図24g〜図24l)。要約すると、NM23−MM中、D26C3抗体表面上の成長によって、手動で切り離すことなく、より少ない時間でより多くの未分化幹細胞が生じた。
Vita表面を、MUC1*受容体を二量体化することによって、幹細胞付着方法及び成長刺激方法の両方として機能するモノクローナルMUC1* ecd抗体(D26C3)で被覆した。図24a〜図24cは、幹細胞がD26C3抗体被覆密度に応じて付着及び増殖したが、対照抗体を使用した場合には幹細胞の付着は観察されなかったことを示す。幹細胞は、任意の成長因子、すなわちNM23又はbFGFの非存在下において最小幹細胞培地単独で培養したとしても、表面に固定化した抗体からのMUC1*の二量体化によってこれらのMUC1*抗体表面上で増殖した。しかしながら、成長速度は最小培地中でのNM23の使用によって大幅に改善した。場合によっては、Rhoキナーゼ阻害剤を初めの48時間存在させ、表面への付着を増大させたが、生存には影響を及ぼさなかった。ES細胞及びiPS細胞は、NM23−MM中のこれらのMUC1*抗体表面上で、成長速度又は多能性を低減させることなく20継代を超えて連続継代した。さらに、NM23−MM中のMUC1*抗体表面上で成長する幹細胞は、連続継代ごとに成長速度が劇的に増大した。4継代までに、プレーティングした600000個のiPS細胞は4日で7.9M未分化幹細胞へと13倍に増大した。同様に、5継代までに、H9細胞は17倍に増大した(図24d〜図24f)。標準多能性マーカーによるICC染色によって、細胞が多能性であり、正常な核型を有していたことが確認された(図S24a及び図S24b)。加えて、得られるES細胞及びiPS細胞は、3つ全ての生殖系列へと分化することが可能であった(図24g〜図24l)。要約すると、NM23−MM中、D26C3抗体表面上の成長によって、手動で切り離すことなく、より少ない時間でより多くの未分化幹細胞が生じた。
図24aは、抗MUC1*ウサギポリクローナル抗体又は対照IgG抗体を各種濃度で組織培養処理表面上に吸着させた結果を示す。BGO1V/hOG hES細胞を表面上にプレーティングし、96時間成長させた。細胞数は定量化するのにカルセインアッセイを実施した。BGO1V/hOG hES細胞をNM23−MM中で多能性を低減させず又は核型を変えずに20代培養された。H9 hES細胞を3.12ug(図24b)又は12.5ug(図24c)のモノクローナル抗MUC1*抗体、MN−C3で被覆したVita表面上にプレーティングした。細胞は抗体濃度に応じて付着及び増殖した。図24dは、ヒトH9 ES細胞又はヒトiPS細胞の成長速度が、抗体被覆表面上にプレーティングし、NM23−MM中で培養した後に指数関数的に増大したことを示している。ヒトES細胞及びヒトiPS細胞をMN−C3で被覆したVita(商標)プレート上で成長させ、NM23−MM中で培養した。各継代の開始時に、600000個の細胞をプレーティングし、4〜6日の成長期間後、計数した。これを5、6継代繰り返した。毎回、先の継代由来の600000個の細胞から開始した。4継代までに、プレーティングした600000個のiPS細胞は4日で7.9M未分化幹細胞へと13倍に増大した。5継代までに、H9細胞は17倍に増大した。MN−C3表面上での3継代後に、ES細胞及びiPS細胞は両方とも、本質的に分化することなく、4日目までほぼ100%のコンフルエンシーまで成長したことに注目した。4継代後にNM23−MM中のMN−C3抗体表面上で培養したiPS細胞(図24e)及びH9 ES細胞(図24f)の写真を撮影した。6継代後、得られた細胞を胚様体法によって分化させた。核マーカーDAPI、並びに内胚葉−αフェトプロテイン(図24g及び図24j)、外胚葉−β−チューブリン(図24h及び図24K)、及び中胚葉−平滑筋アクチン(図24i及び図24l)という3つの生殖系列のマーカーに対する抗体による染色によって、細胞がNM23−MM中の抗MUC1*被覆表面上での連続継代後に正常に分化することが示される。
図S24aは、少なくとも7継代にわたってNM23−MM中の新規の規定表面上で培養したhESが標準多能性マーカーを発現することを示す。モノクローナル抗MUC1*抗体(MN−C3)表面上のH9細胞を、7継代後の標準多能性マーカーの存在に関して化学分析した。細胞は標準多能性マーカーに対して陽性染色し、正常な核型を有していた。
図S24bは、少なくとも7継代にわたってNM23−MM中の新規の規定表面上で培養したiPSが標準多能性マーカーを発現することを示す。モノクローナル抗MUC1*抗体(MN−C3)表面上のiPS細胞(iPS FTD19クローン42)を、7継代後の標準多能性マーカーの存在に関して化学分析した。細胞は標準多能性マーカーに対して陽性染色し、正常な核型を有していた。
実施例10 − NM23−MM中のMUC1*抗体表面上で培養したヒト幹細胞はより高いレベルのナイーブ細胞マーカーと、より低いレベルのプライム細胞マーカーとを発現する
実施例10.1 − ナイーブ細胞又はプライム細胞
NM23−MM中のMUC1*抗体表面上で培養した幹細胞の質を更に評価するために、「ナイーブ」状態又は基底状態にあるヒト幹細胞の指標となる遺伝子の発現レベルを測定した。ナイーブ幹細胞において通常、Klf4及びKlf2が高く、FoxA2及びXIST(X不活性化の指標)は非常に低いか又は全く発現しない。細胞がより分化した状態である「プライム」状態になると、遺伝子発現パターンの逆転が起こる。NM23−MM中、MUC1*抗体表面上で、bFGF中、MEFフィーダー細胞上で、又はmTeSR中、マトリゲル上で培養した幹細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルを比較した。NM23−MM中、MUC1*抗体表面上で培養した幹細胞は、bFGF中、MEF上で培養した細胞よりも高いレベルのナイーブマーカーと、低いレベルのプライムマーカーとを発現した。mTeSR中、マトリゲル上で培養した細胞は、bFGF中、MEF上で培養した細胞と比較してより高いレベルのFoxa2及びXIST(プライム状態の指標となる)と、より低いレベルの幾つかのナイーブマーカーとを発現した(図25a)。
実施例10.1 − ナイーブ細胞又はプライム細胞
NM23−MM中のMUC1*抗体表面上で培養した幹細胞の質を更に評価するために、「ナイーブ」状態又は基底状態にあるヒト幹細胞の指標となる遺伝子の発現レベルを測定した。ナイーブ幹細胞において通常、Klf4及びKlf2が高く、FoxA2及びXIST(X不活性化の指標)は非常に低いか又は全く発現しない。細胞がより分化した状態である「プライム」状態になると、遺伝子発現パターンの逆転が起こる。NM23−MM中、MUC1*抗体表面上で、bFGF中、MEFフィーダー細胞上で、又はmTeSR中、マトリゲル上で培養した幹細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルを比較した。NM23−MM中、MUC1*抗体表面上で培養した幹細胞は、bFGF中、MEF上で培養した細胞よりも高いレベルのナイーブマーカーと、低いレベルのプライムマーカーとを発現した。mTeSR中、マトリゲル上で培養した細胞は、bFGF中、MEF上で培養した細胞と比較してより高いレベルのFoxa2及びXIST(プライム状態の指標となる)と、より低いレベルの幾つかのナイーブマーカーとを発現した(図25a)。
連続継代数に伴って、NM23−MMを使用した場合にはナイーブ状態への傾向が顕著であったが(図25c)、mTeSRを使用した場合にはその傾向は顕著なものではなかった(図25b)。図37は、bFGF中、MEFフィーダー上(n=3)、mTeSR中、マトリゲル上(n=5)又はNM23−S120G二量体−最小幹細胞培地中、12.5ug/mlモノクローナル抗MUC1*抗体2D6C3で被覆したVita表面上(n=6)で培養したヒト幹細胞のRT−PCR測定結果を示す。この実験では、更に2つのプライム細胞マーカー、OTX2及びLHX2も測定した。図37のグラフは、他の実験と一致して、NM23中、MUC1*に対するリガンドを提示する表面上での成長が、ナイーブマーカーの発現を増大するとともに、プライムマーカーの発現を低減することを示している。
表面単独の寄与を評価するために、bFGF中、MEF上で45継代成長させたES細胞を組換えビトロネクチンの層上にプレーティングした。次いで細胞をNM23−MM、bFGF+MEF馴化培地又はmTeSR中で1継代培養した後、ナイーブマーカーとプライムマーカーとのサブセットの発現に関して化学分析した。NM23−MM中で培養した細胞は、bFGF又はmTeSRよりも高いナイーブマーカーの発現と、低いプライムマーカーの発現とを示したが、ビトロネクチンでの成長は、全ての試験培地でナイーブマーカーの発現の低減と、プライムマーカーの発現の増大とをもたらした(図25d)。これらの結果は、ビトロネクチンでの成長がヒト幹細胞をプライム状態へと誘導し、幹細胞の完全性にマイナスの影響を及ぼすことを示している。
実施例10.2 − ナイーブ遺伝子又はプライム遺伝子の発現を定量化するリアルタイムPCR法
様々な条件で成長させた細胞を採取した。細胞をペレット化し、分析時間まで−70℃で凍結させた。総RNAを、メーカーの使用説明書に従ってTRIzol(商標)試薬(Life Technologies)を用いてサンプルから抽出した。RNAサンプル中のFOXa2(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00232764_m1)、KLF4(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00358836_m1)、NANOG(Applied Biosystems、アッセイID:Hs02387400_g1)、KLF2(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00360439_g1)、XIST(Applied biosystems、アッセイID:Hs01079824_m1)、OCT4(POUクラス5ホメオボックス1)(ABI、アッセイID:Hs00999634_gH)及びGAPDH(Applied Biosystems、P/N:4310884E)の定量化を、メーカーの使用説明書に従ってTaqMan(商標)ワンステップRT−PCRマスターミックス試薬(Applied Biosystems、P/N:4309169)を使用して行った。リアルタイムPCRのデータを、比較Ct法を用いて分析した。各サンプル中の各転写産物の相対量を、標的Ctと、対応するGAPDHのCtとの差(ΔCt)を計算することで求めた。2回目の正規化を、データセットでの他の全てのΔCtからMEF/FGFサンプルのΔCtを減算することによって行った(ΔΔCt)。
様々な条件で成長させた細胞を採取した。細胞をペレット化し、分析時間まで−70℃で凍結させた。総RNAを、メーカーの使用説明書に従ってTRIzol(商標)試薬(Life Technologies)を用いてサンプルから抽出した。RNAサンプル中のFOXa2(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00232764_m1)、KLF4(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00358836_m1)、NANOG(Applied Biosystems、アッセイID:Hs02387400_g1)、KLF2(Applied Biosystems、アッセイID:Hs00360439_g1)、XIST(Applied biosystems、アッセイID:Hs01079824_m1)、OCT4(POUクラス5ホメオボックス1)(ABI、アッセイID:Hs00999634_gH)及びGAPDH(Applied Biosystems、P/N:4310884E)の定量化を、メーカーの使用説明書に従ってTaqMan(商標)ワンステップRT−PCRマスターミックス試薬(Applied Biosystems、P/N:4309169)を使用して行った。リアルタイムPCRのデータを、比較Ct法を用いて分析した。各サンプル中の各転写産物の相対量を、標的Ctと、対応するGAPDHのCtとの差(ΔCt)を計算することで求めた。2回目の正規化を、データセットでの他の全てのΔCtからMEF/FGFサンプルのΔCtを減算することによって行った(ΔΔCt)。
図25は、RT−PCRを用いて、OCT4、NANOG、KLF4及びKLF2を含むナイーブマーカーのサブセットの発現(ナイーブ状態で高い)と、XIST及びFOXA2を含むプライムマーカーのサブセットの発現(プライム状態で高い)とを定量化した結果を示す。測定結果を、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して正規化し、4ng/ml bFGF中、MEF上で培養したH9 ES細胞(対照)に対する倍数変化として表した。図25aは、NM23−MM中、MUC1*抗体(MN−C3)表面上で培養したH9 ES細胞が平均して、ナイーブマーカーの発現の増大と、プライムマーカーの発現の低減とを示したことを示している(n=6)。これに対して、mTeSR中、マトリゲル上で培養したH9細胞は、ナイーブマーカーの発現の低減と、プライムマーカーの発現の増大とを示した(n=5)。ナイーブマーカー又はプライムマーカーのサブセットの個々の測定結果を、NM23−MM、抗MUC1*抗体表面上(図25b)及びmTeSR、マトリゲル上(図25c)に対して継代数の関数としてプロットした。連続継代に伴って、NM23−MMではナイーブ状態への傾向が増大したが、mTeSRではその傾向は増大しなかった。図25dは、継代数又は表面に起因する差を補正するために、bFGF中、MEF上で45継代にわたって連続継代したH9細胞を細胞源として使用した結果を示す。細胞をビトロネクチンの層上にプレーティングし、bFGF+MEF馴化培地、mTeSR、又はNM23−MM中で1継代培養した。全ての値を、4ng/ml bFGF中、MEF上で培養したH9 ES細胞の対照に対する倍数変化として表した。NM23−MM、MUC1*抗体表面上に対する値を比較のために加える。全体として、ビトロネクチン上にプレーティングした後、ナイーブマーカーの発現が低減するとともに、プライムマーカーの発現が増大した。
実施例11 − 6成分規定培地及び異種成分を含まない培地中でNM23はMUC1*抗体表面上での多能性幹細胞の成長を支持する
NM23の、完全に規定された異種成分を含まない6成分培地(MN6)中で単一成長因子としてES細胞及びiPS細胞の成長を支持する能力を試験した。結果によって、NM23−MN6が1ウェル当たり12.5ugで、MUC1*抗体表面及びビトロネクチン等の他の表面上で多能性幹細胞の連続継代を完全に支持したことが示される(図26a〜図26f)。驚くべきことに、NM23とともにMN6培地を使用することで、初めの24時間〜48時間Rhoキナーゼ阻害剤の必要性が排除されると考えられる(図26g〜図26l)。
NM23の、完全に規定された異種成分を含まない6成分培地(MN6)中で単一成長因子としてES細胞及びiPS細胞の成長を支持する能力を試験した。結果によって、NM23−MN6が1ウェル当たり12.5ugで、MUC1*抗体表面及びビトロネクチン等の他の表面上で多能性幹細胞の連続継代を完全に支持したことが示される(図26a〜図26f)。驚くべきことに、NM23とともにMN6培地を使用することで、初めの24時間〜48時間Rhoキナーゼ阻害剤の必要性が排除されると考えられる(図26g〜図26l)。
図26は、hES細胞及びhiPS細胞をNM23−完全に規定された異種成分を含まない6成分培地(MN6)中、MUC1*抗体表面又はビトロネクチンの層上で連続培養した結果を示す。図26a〜図26hは、hES H9を、初めの48時間Rhoキナーゼ阻害剤(ROCi)の存在下又は非存在下で、NM23−MN6中、Vita(商標)プレート上に被覆したMN−C3抗体表面上で培養した結果を示している。図26i〜図26lは、NM23−MN6中、Vita(商標)プレート上に被覆したMN−C3抗体表面上で培養したiPS細胞を示す。図26m〜図26tは、Rhoキナーゼ阻害剤(ROCi)の存在下又は非存在下で、NM23−MN6中、組織培養処理プレート上に被覆したビトロネクチン表面上で培養したhES H9細胞を示す。初めの48時間のRhoキナーゼ阻害剤の補助効果は、細胞をNM23−MN6中、MN−C3抗体表面上で培養した場合に最小となった。
実施例12 − NM23又はFGF中、ヒト又はマウスのフィーダー細胞上で培養したヒト幹細胞をナイーブ状態又はプライム状態のマーカーの存在に関して探索する
プライム状態のH9胚性幹細胞から出発した。該幹細胞をbFGF中、マウスMEFフィーダー細胞上でおよそ30継代にわたって培養した。細胞の第1のセットをbFGF中、MEF上で培養し続けた。第2の群はヒトフィーダー細胞(HS27)上へと移したが、第1のセットと同様に4ng/mlのbFGF中で培養した。細胞の第3のセットをNM23−S120G中で培養したが、マウスMEFフィーダー細胞上に残した。細胞の第4のセットをヒトフィーダー細胞(HS27)上に移して、NM23−S120G中で培養した。全ての細胞を更に6継代にわたってこれらの条件に従って培養した。次いで細胞をナイーブ幹細胞状態のマーカーであるKlf4、及びプライム幹細胞状態のマーカーであるFoxa2の存在に関して染色した。図27〜図35は、NM23中で培養するとともに、ヒトフィーダー細胞に曝した細胞だけがナイーブ幹細胞マーカーKlf4を発現し、プライム幹細胞マーカーであるFoxa2は発現しなかったことを示している。
プライム状態のH9胚性幹細胞から出発した。該幹細胞をbFGF中、マウスMEFフィーダー細胞上でおよそ30継代にわたって培養した。細胞の第1のセットをbFGF中、MEF上で培養し続けた。第2の群はヒトフィーダー細胞(HS27)上へと移したが、第1のセットと同様に4ng/mlのbFGF中で培養した。細胞の第3のセットをNM23−S120G中で培養したが、マウスMEFフィーダー細胞上に残した。細胞の第4のセットをヒトフィーダー細胞(HS27)上に移して、NM23−S120G中で培養した。全ての細胞を更に6継代にわたってこれらの条件に従って培養した。次いで細胞をナイーブ幹細胞状態のマーカーであるKlf4、及びプライム幹細胞状態のマーカーであるFoxa2の存在に関して染色した。図27〜図35は、NM23中で培養するとともに、ヒトフィーダー細胞に曝した細胞だけがナイーブ幹細胞マーカーKlf4を発現し、プライム幹細胞マーカーであるFoxa2は発現しなかったことを示している。
実施例13 − 二量体を選択的に形成し、不活性な四量体及び六量体の形成を抑えたNM23突然変異体
二量体形成を選好するNM23突然変異体がヒトがんにおいて同定されている。これらの突然変異体の幾つかが、MUC1*と結合せず、多能性を促進しない四量体及び六量体の形成を抑える。NM23−S20G等の突然変異体は、野生型(wt)タンパク質よりも二量体形成を選好するが、高濃度の六量体が分化を誘導しない溶液を得るために、S120G突然変異体を任意で変性し、リフォールディングして、二量体画分をFPLC等の方法を用いて精製する。突然変異NM23−P96Sも、二量体形成を選好し、組換えタンパク質として発現する場合にS120G突然変異体より可溶性となる。NM23は、P96S突然変異に加えて、C末端に0個、1個、2個又は6個のアミノ酸欠失を含むように標準方法によって生成された。図36は、組換えタンパク質の発現の可溶性画分のFPLCトレースのオーバーレイである。図36は、NM23−P96S+2個又は6個のC末端欠失では、MUC1*活性化に好適な二量体形態のNM23がかなりの割合を占めていたことを示している。NM23−P96S+6個のC末端欠失が好ましいが、これは可溶性タンパク質として大部分が二量体であるためである。
二量体形成を選好するNM23突然変異体がヒトがんにおいて同定されている。これらの突然変異体の幾つかが、MUC1*と結合せず、多能性を促進しない四量体及び六量体の形成を抑える。NM23−S20G等の突然変異体は、野生型(wt)タンパク質よりも二量体形成を選好するが、高濃度の六量体が分化を誘導しない溶液を得るために、S120G突然変異体を任意で変性し、リフォールディングして、二量体画分をFPLC等の方法を用いて精製する。突然変異NM23−P96Sも、二量体形成を選好し、組換えタンパク質として発現する場合にS120G突然変異体より可溶性となる。NM23は、P96S突然変異に加えて、C末端に0個、1個、2個又は6個のアミノ酸欠失を含むように標準方法によって生成された。図36は、組換えタンパク質の発現の可溶性画分のFPLCトレースのオーバーレイである。図36は、NM23−P96S+2個又は6個のC末端欠失では、MUC1*活性化に好適な二量体形態のNM23がかなりの割合を占めていたことを示している。NM23−P96S+6個のC末端欠失が好ましいが、これは可溶性タンパク質として大部分が二量体であるためである。
実施例14 − NM23 P96S及び欠失構築物
以下のプライマー:5'-tcggggagaccaactctgcagactccaag-3'(配列番号45)及び5'-cttggagtctgcagagttggtctccccga-3'(配列番号46)を使用して、メーカーの使用説明書に従ってQuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Agilent)を用いることでNM23−H1突然変異体P96S(#96のプロリンをセリンへと突然変異させた)を生成した。配列確認後、欠失構築物をPCRによって生成した。NM23 P96S ΔC1を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号47)及び5'-gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca-3'(配列番号48)を用いて増幅した。NM23 P96S ΔC2を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号49)及び5'-gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct-3'(配列番号50)を用いて増幅した。NM23 P96S ΔC6を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号51)及び5'-gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca-3'(配列番号52)を用いて増幅した。得られるフラグメントを精製し、消化し(NdeI、AgeI)、発現ベクターpET21bのNdeI制限部位とAgeI制限部位との間にクローニングした。pET21bは予め、XhoI制限部位をAgeIに置き換えることで修飾した。
以下のプライマー:5'-tcggggagaccaactctgcagactccaag-3'(配列番号45)及び5'-cttggagtctgcagagttggtctccccga-3'(配列番号46)を使用して、メーカーの使用説明書に従ってQuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Agilent)を用いることでNM23−H1突然変異体P96S(#96のプロリンをセリンへと突然変異させた)を生成した。配列確認後、欠失構築物をPCRによって生成した。NM23 P96S ΔC1を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号47)及び5'-gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca-3'(配列番号48)を用いて増幅した。NM23 P96S ΔC2を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号49)及び5'-gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct-3'(配列番号50)を用いて増幅した。NM23 P96S ΔC6を、以下のプライマー:5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(配列番号51)及び5'-gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca-3'(配列番号52)を用いて増幅した。得られるフラグメントを精製し、消化し(NdeI、AgeI)、発現ベクターpET21bのNdeI制限部位とAgeI制限部位との間にクローニングした。pET21bは予め、XhoI制限部位をAgeIに置き換えることで修飾した。
配列確認後、全ての構築物を組換えタンパク質発現のためにBL21(DE3)細胞(New England Biolabs)に形質転換した。
NM23 P96S − DNA配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga(配列番号53)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaactcgagcaccaccaccaccaccactga(配列番号53)
NM23 P96S − アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH(配列番号54)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYELEHHHHHH(配列番号54)
NM23 P96S ΔC2 − DNA配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcaccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号55)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatcaccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号55)
NM23 P96S ΔC2 − アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWITGHHHHHH(配列番号56)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWITGHHHHHH(配列番号56)
NM23 P96S ΔC6 − DNA配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctaccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号57)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctaccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号57)
NM23 P96S ΔC6 − アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCATGHHHHHH(配列番号58)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCATGHHHHHH(配列番号58)
NM23 P96S ΔC1 − DNA配列
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctataccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号65)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaactctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctataccggtcaccaccaccaccaccactga(配列番号65)
NM23 P96S ΔC1 − アミノ酸配列
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYTGHHHHHH(配列番号66)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNSADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYTGHHHHHH(配列番号66)
以下は、各種NM23変異体の比較アミノ酸配列である。
実施例15 − タンパク質発現/精製
LBブロス(ルリア−ベルターニブロス)を一晩培養物の1/10で植菌し、OD600がおよそ0.5に達するまで37℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、0.4mMイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトシド(IPTG, Sigma)を用いて誘導し、培養を4時間後に停止させた。細胞を遠心分離(4℃で10分間、6000rpm)によって採取した後、細胞ペレットを泳動バッファー:PBS(pH7.4)、360mM NaCl及び80mMイミダゾールで再懸濁した。次いでリゾチーム(1mg/mL、Sigma)、MgCl2(0.5mM)及びDNアーゼ(0.5ug/mL、Sigma)を添加した。細胞懸濁液を37℃で30分間、回転台(275rpm)の上でインキュベートし、5分間氷上で超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除いた。次いで、残屑を除去した溶解物を、泳動バッファーで平衡化したNi−NTAカラム(Qiagen)に適用した。カラムを洗浄した(8CV)後、420mMイミダゾールを添加した泳動バッファー(6CV)によって、タンパク質をカラムから溶出させた。タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200)によって更に精製した。
LBブロス(ルリア−ベルターニブロス)を一晩培養物の1/10で植菌し、OD600がおよそ0.5に達するまで37℃で培養した。この時点で、組換えタンパク質の発現を、0.4mMイソプロピル−β−D−チオ−ガラクトシド(IPTG, Sigma)を用いて誘導し、培養を4時間後に停止させた。細胞を遠心分離(4℃で10分間、6000rpm)によって採取した後、細胞ペレットを泳動バッファー:PBS(pH7.4)、360mM NaCl及び80mMイミダゾールで再懸濁した。次いでリゾチーム(1mg/mL、Sigma)、MgCl2(0.5mM)及びDNアーゼ(0.5ug/mL、Sigma)を添加した。細胞懸濁液を37℃で30分間、回転台(275rpm)の上でインキュベートし、5分間氷上で超音波処理した。不溶性の細胞残屑を遠心分離(4℃で30分間、20000rpm)によって取り除いた。次いで、残屑を除去した溶解物を、泳動バッファーで平衡化したNi−NTAカラム(Qiagen)に適用した。カラムを洗浄した(8CV)後、420mMイミダゾールを添加した泳動バッファー(6CV)によって、タンパク質をカラムから溶出させた。タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200)によって更に精製した。
本明細書で引用された全ての参考文献は、その全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
当業者は、単なるルーチン実験を使用して、本明細書に具体的に記載された本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識する、又は確認することができるだろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
図6
min 分
hr 時間
図7
min 分
hr 時間
UN 未分化
DIFF 分化
図9
Vita alone Vita単独
図11
Antibody 抗体
図12a
5 days post plating プレーティングの5日後
図12b
Day 5 5日目
図12d
Day 5 5日目
図19
tryp トリプトファン
2day post SC H9s SC H9の2日後
hrs 時間
図20
tryp トリプトファン
2day post SC H9s SC H9の2日後
hrs 時間
図22
hexamer 六量体
tetramer 四量体
dimer 二量体
monomer 単量体
NM23S120G-mixed NM23S120Gミックス
NM23S120G-hexamer NM23S120G六量体
NM23S120G-dimer NM23S120G二量体
Time(s) 時間(秒)
normalized 正規化
No protein タンパク質なし
Peptide ペプチド
hrs 時間
withdrawn 排除
図S22
hexamer 六量体
tetramer 四量体
dimer 二量体
monomer 単量体
NM23S120G-hexamer NM23S120G六量体
NM23S120G-mixed NM23S120Gミックス
NM23S120G-dimer NM23S120G二量体
NativePAGE Novex 4-16% Bis-Tris Gel ネイティブPAGE Novex 4%〜16% Bis−Trisゲル
h 時間
図23
Alpha Feto Protein αフェトプロテイン
Nestin ネスチン
Smooth Muscle Actin 平滑筋アクチン
図24
Calcein カルセイン
Anti-MUC1* 抗MUC1*
Control Ab 対照抗体
# of Cell X 10^6 細胞数×106
H9 ES Cells H9 ES細胞
iPS Cells iPS細胞
Alpha Feto Protein αフェトプロテイン
Beta-Tublin β−チューブリン
Smooth Muscle Actin 平滑筋アクチン
図S24a
MERGED マージ
図S24b
MERGED マージ
図25
Fold Change Relative to MEF/FGF CT MEF/FGF CTに対する倍数変化
matrigel マトリゲル
vitronectin ビトロネクチン
図26
MUC1* antibody surface MUC1*抗体表面
NO ROCi ROCiなし
Vitronectin Surface ビトロネクチン表面
図36
dimer 二量体
図37
PRIMED markers プライムマーカー
NAIVE markers ナイーブマーカー
matrigel マトリゲル
min 分
hr 時間
図7
min 分
hr 時間
UN 未分化
DIFF 分化
図9
Vita alone Vita単独
図11
Antibody 抗体
図12a
5 days post plating プレーティングの5日後
図12b
Day 5 5日目
図12d
Day 5 5日目
図19
tryp トリプトファン
2day post SC H9s SC H9の2日後
hrs 時間
図20
tryp トリプトファン
2day post SC H9s SC H9の2日後
hrs 時間
図22
hexamer 六量体
tetramer 四量体
dimer 二量体
monomer 単量体
NM23S120G-mixed NM23S120Gミックス
NM23S120G-hexamer NM23S120G六量体
NM23S120G-dimer NM23S120G二量体
Time(s) 時間(秒)
normalized 正規化
No protein タンパク質なし
Peptide ペプチド
hrs 時間
withdrawn 排除
図S22
hexamer 六量体
tetramer 四量体
dimer 二量体
monomer 単量体
NM23S120G-hexamer NM23S120G六量体
NM23S120G-mixed NM23S120Gミックス
NM23S120G-dimer NM23S120G二量体
NativePAGE Novex 4-16% Bis-Tris Gel ネイティブPAGE Novex 4%〜16% Bis−Trisゲル
h 時間
図23
Alpha Feto Protein αフェトプロテイン
Nestin ネスチン
Smooth Muscle Actin 平滑筋アクチン
図24
Calcein カルセイン
Anti-MUC1* 抗MUC1*
Control Ab 対照抗体
# of Cell X 10^6 細胞数×106
H9 ES Cells H9 ES細胞
iPS Cells iPS細胞
Alpha Feto Protein αフェトプロテイン
Beta-Tublin β−チューブリン
Smooth Muscle Actin 平滑筋アクチン
図S24a
MERGED マージ
図S24b
MERGED マージ
図25
Fold Change Relative to MEF/FGF CT MEF/FGF CTに対する倍数変化
matrigel マトリゲル
vitronectin ビトロネクチン
図26
MUC1* antibody surface MUC1*抗体表面
NO ROCi ROCiなし
Vitronectin Surface ビトロネクチン表面
図36
dimer 二量体
図37
PRIMED markers プライムマーカー
NAIVE markers ナイーブマーカー
matrigel マトリゲル
Claims (1)
- ナイーブ幹細胞状態の特性が得られるようにFoxa2の発現が陽性であるヒトのプライム幹細胞からKlf4の発現が陽性であるヒトのナイーブ幹細胞を誘導する方法、又はKlf4の発現が陽性であるヒトのナイーブ幹細胞をKlf4の発現が陽性であるナイーブ幹細胞状態に維持する方法であって、
前記ヒトのナイーブ幹細胞の誘導に使用するヒトのプライム幹細胞又は前記ヒトのナイーブ幹細胞の維持に使用するヒトのナイーブ幹細胞を、NM23又は、NM23−S120G、NM23−P96S、及び、2個又は6個のC末端欠失を有するNM23−P96Sの群から選択されるいずれか1つの二量体を選択的に形成するNM23の変異体の存在下かつRhoキナーゼ阻害剤の非存在下で培養すること、又は
配列番号10〜16から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるペプチドに結合するポリクローナル抗体若しくは配列番号10〜16から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるペプチドに結合するモノクローナル抗体で被覆された培養プレート上で培養すること、又は、
ヒトHS27包皮線維芽フィーダー細胞の存在下で培養することを含む、方法。
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