CN103068971B - 重编程癌细胞 - Google Patents

Abstract

本申请描述了用诱导细胞分化的至少一种调节成分治疗患有癌症或处于发展癌症风险中的患者的方法。

Description

重编程癌细胞

相关申请的参考

本申请要求2010年6月16日提交的美国临时申请号61/355,483、2010年9月23日提交的美国临时申请号61/385,653、2010年12月30日提交的美国临时申请号61/428,360、2011年3月17日提交的美国临时申请号61/453,917、2011年4月6日提交的美国临时申请号61/472,516、2011年4月11日提交的美国临时申请号61/474,236，以及2011年5月9日提交的美国临时申请号61/484,052的优先权中的权益，其内容以参考方式完整地并入本文。

技术领域

本申请描述了用于重编程癌细胞从而治疗或预防癌症的方法。

背景技术

癌细胞与干细胞相似

MUC1是在所有成体上皮细胞中发现的跨膜蛋白。然而，其在癌细胞中的表达模式不同于其在健康细胞中的表达模式。在癌细胞中，蛋白质均匀地在整个细胞表面散布，然而在健康细胞中，其表达限制到顶缘（apical border）上。我们最近发现MUC1的跨膜剪切产物，我们将其命名为MUC1*（在一些先前的专利申请中，称为MGFR），起到在癌细胞上的Ⅰ类生长因子受体的作用¹。已经阐明了MUC1*起作用的机制；配体诱导二聚化的其截短细胞外结构域，基本上是由主要序列PSMGFR序列（GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（SEQ ID NO:l））所组成的，其激活生长和存活路径。MUC1剪切释放出细胞外结构域的大部分，以及掩盖配体结合位点的自我聚集结构域。

我们最近发现，在多能干细胞中，几乎所有的MUC1剪切为生长因子受体形式MUC1*，并且其起驱动干细胞生长的生长因子受体的作用²。在多能干细胞中，需要生长因子受体MUC1*的作用，用于其存活。在干细胞中，MUC1*的细胞外结构域二聚化的完全阻断是致死的。然而，当干细胞启动分化过程时，极大地减少了MUC1的剪切。事实上，新分化的干细胞大体上仅仅表达全长的MUC1。我们显示，蛋白质的MUC1*形式是生长因子受体，仅仅其活化作用是胚胎多能干细胞和诱导性多能干细胞生长和存活所必须和足够的。

在癌细胞中，大多数MUC1剪切为MUC1*。随着癌症阶段发展，MUC1*的比例增加直到癌细胞，像多能干细胞，排他地表现出MUC1*。肿瘤干细胞比正常的癌细胞表达出更多的MUC1*³。获得对化疗药物抗性的癌细胞，通过增加MUC1*的表达而不是MUC1-FL（全长）的表达，从而获得抗性。多能干细胞分泌MUC1*活化的NM23（MNE-7、H1或H2），其与MUC1*共同定位。分泌NM23的癌细胞以及优选地形成二聚物的突变体组成型活化MUC1*阳性细胞。仅仅MUC1*的转染是转化细胞所足够的。

成体细胞能够重编程从而回复为多能干细胞

最近证实，可以“重编程”成体细胞从而变为多能干细胞。为了区分这些细胞和来自自然发生的胚胎干细胞，这种新类型的重编程细胞叫做“诱导性多能细胞”或iPS细胞。第一个iPS细胞是通过用四（4）个基因转导细胞制成的。一个组插入基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc⁴，而另一个组插入基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28⁵。

所有这六个基因，Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28，编码转录因子，其然后调节其他基因的转录。由两个组使用的方法中共同的基因是Oct4、Sox2，并且通过外插法（extrapolation）Klf4/Nanog，因为Klf4是诱导Nanog表达的转录因子。后来的工作显示，通过插入仅仅三个基因：Oct4、Sox2以及Klf4或Nanog，可以诱导细胞从而变为多能性的。更多最近的研究已经显示，通过添加基因编码的蛋白质而不是基因自身，可以替换这些基因中的一些。在另一个研究中，发现转导基因Oct4和Sox2以及诱导Nanog表达的化学化合物可以诱导多能性⁶。

FGF引发小鼠干细胞路径，并且使人类干细胞成为始发态的（primed）而不是原始态的（多能性的）

最近的研究已经质疑根据现有技术方法培养的人类干细胞是不是真正多能的⁷。在具有转折性质的研究论文中，Jaenisch和同事描述，人类胚胎干（ES）细胞是“始发态的”而不是叫做“原始态”真正多能干细胞。通过比较人类胚胎干（ES）细胞和小鼠ES细胞，其中两个都是从胚泡阶段的胚胎中获得的，研究者发现，人类ES细胞在形态和分子上不同于小鼠干细胞。他们进一步公开，迄今分离的人类ES细胞不是真正多能性的，其更像从发育的较迟阶段的外胚层阶段获得的小鼠干细胞。这些发现激烈地争论，我们认为是人类多能ES细胞的不是真正的多能干细胞。Jaenisch和同事发现了识别原始态干细胞的分子标记和识别始发态的干细胞的分子标记。

通过异位诱导与LIF和糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的抑制因子，以及丝裂原活化蛋白激酶（MAP激酶ERK1/2）路径结合的Oct4、Klf4和Klf2因子，研究者能够暂时将人类始发态的干细胞回复为原始态状态。毛猴素（forskolin），能够诱导Klf4和Klf2表达的蛋白激酶A路径的激动剂，短暂地替换用于异位转基因表达的需要。一旦人类ES细胞回复为原始态状态，其就需要在PD/CH/LIF/FK中培养，但是在其成熟为始发态的细胞之前会只保持原始态几个世代（passage）。这是研究者不能够识别促进和维持人类ES细胞在多能原始态状态中的生长因子的重大证据。

与传统的人类ES细胞相比较，这些后生转化的原始态干细胞获得Klf4、Klf2、Tbx3、Gbx2、Lin28和SOCS3的表达，下文中称为原始态标记，并且失去Otx2、Soxl7、Cerl、Foxa2、Zicl、Lhx2和XIST的表达，其是用于更成熟的始发态的状态的标记。另外，暂时回复为原始态状态的始发态细胞以片状而不是以群落生长。然而，该先前的研究没有能够识别使人类干细胞像原始态干细胞一样增殖的生长路径或生长因子。进一步，甚至在因子的混合物中异位表达基因和生长，回复的细胞维持原始态一小段时间，然后发展为始发态的阶段。

因此，需要的是从胚胎或从诱导性多能状态收获后直接像原始态干细胞一样增殖人类干细胞的方法，或是将始发态的干细胞回复为原始态状态，然后使其在那个状态维持延长的一段时间的方法。需要的是将始发态的干细胞稳定地转化为原始态状态的方法，而现在的方法只能够暂时地使细胞保持在原始态状态。进一步，用于将始发态的干细胞转化原始态状态的该先前报道的方法不是完全的回复，因为其报道只观察到原始态标记对始发态的标记的表达增加或降低。需要的是用于将始发态的细胞转化为原始态状态的方法，其中转化是完全转化，其不表达始发态的状态的标记。由此得出结论，为了有效指导人类干细胞的分化，要求原始态干细胞的起始原料（starting stock）。

微小RNA的使用为癌症的治疗带来了广阔的前景^8,9,10。使用始发态的而不是原始态人类干细胞，已经执行了旨在识别多能干细胞、分化干细胞和癌细胞之间不同的调节成分（regulatory component）的所有先前工作，这提出了用于人类治疗基础无效的（invalid）结果。直到现在，声称识别诱导分化的微小RNA的研究者已经使用利用FGF以及小鼠饲养细胞增殖的干细胞^11,12,13，新的研究显示其将人类细胞转化为其不再是真正多能的始发态的状态。重要地，也需要的是使用原始态人类干细胞执行严格的实验，因为使用通过FGF中断（corrupt）为始发态的状态的人类干细胞和小鼠成分的这些实验，很可能产生不能应用到人类药物中的错误信息。

直到现在，根据起源的组织、癌细胞过表达的分子标记或癌细胞过表达的生长因子受体来表征癌症。然而，仍然不能充分地预测患者对给定的治疗所起的反应，另外，现在的治疗集中的太窄，在大多数情况下不能完全地治疗癌症，伴随着经常发生的最终的转移。

因此，在技术上需要，根据控制癌症生长和分化的调节成分（调节元件，regulatory element）的其独特标志（signature），开发将癌症分类的方法，这样能够开发重编程每一个癌症亚型的治疗。在技术上也需要，开发用于将癌症亚型分类的方法，其允许准确地预测患者的组，这将对具体的治疗起反应。在技术上也需要，开发用于生长和维持原始态人类干细胞的方法，这样控制人类干细胞和癌细胞生长和分化的调节标志能够准确地识别，并且利用于抗癌症治疗。

发明内容

本发明克服了上面提到的问题，并且提供了用于生长和维持原始态干细胞、根据控制癌症生长和分化的调节网络将癌症分类的方法，以及通过重编程或扰乱调节癌症生长和分化的网络，用于治疗癌症或处于发展癌症风险中的患者的方法。

在一个实施例中，通过给予患者或处于发展癌症风险中的人递送（deliver）诱导分化的调节信号的成分（element），来抑制或预防癌症。在另一个实施例中，通过给予患者或处于发展癌症风险中的人递送两个不同调节信号的两个不同成分，抑制或预防癌症，其中一个诱导多能性，另一个诱导分化。在另一个实施例中，通过给予患者或处于发展癌症风险中的人递送调节信号的至少两种成分的混合物，抑制或预防癌症，其中这些成分在不同亚型的两种癌症中占优势。又在另一个实施例中，通过给予癌症患者递送在不同亚型的癌症中占优势的调节信号的成分，抑制癌症。例如，用递送在MUC1*阴性癌症中占优势的调节信号的成分，可以治疗具有MUC1*阳性癌症的患者。另外，用递送诱导分化的调节信号的成分，可以治疗患者。

在优选的实施例中，通过给予患者MUC1*阴性癌症的微小RNA标志（signature），能够治疗或预防MUC1*阳性癌症。

在另一个优选的实施例中，通过给予患者miR-145治疗或预防乳癌和前列腺癌。在一个方面，本发明预期治疗，包括在分化中占优势的miR-145和其他微小RNA，可选地连同在MUC1*阴性癌症中占优势的微小RNA。

递送调节信号的成分是核酸、RNA、微小RNA、基因以及基因产物。递送调节信号的成分可以是微小RNA、微小RNA簇、基因或其诱导的基因产物，或设计用来使微小RNA沉默的相同组的基因沉默的互补核酸。在优选的实施例中，递送调节信号的成分是微小RNA、微小RNA簇。

在另一个实施例中，给予患者来自超过一个癌症类型的信号，用于治疗或预防癌症。

在一个方面，本发明涉及治疗患有癌症的患者的方法，包括给予患者组合物，其包括（i）至少两种调节成分，或（ii）引起至少一种癌症亚型标志（signature）所独特的至少两种调节成分表达的试剂，其中癌症亚型标志不同于折磨患者的癌症的癌症亚型标志。调节成分可以是RNA、微小RNA或蛋白质。引起至少一种癌症亚型标志所独特的至少两种调节成分表达的试剂是小分子。微小RNA可以是微小RNA-145。使患者受折磨的癌症可以是MUC1*阳性癌症，并且至少一种癌症亚型标志所独特的调节成分可以来自MUC1*阴性癌细胞。在一个方面，调节成分的癌症亚型的癌细胞可以与患者的癌细胞共培养（共培养）。

在进一步的其他方面，本发明涉及治疗患有癌症的患者的方法，包括给予患者组合物，其包括（i）至少两种调节成分，或（ii）引起至少一种干细胞亚型标志所独特的至少两种调节成分表达的试剂。干细胞亚型标志可以是新分化的人类干细胞（newlydifferentiating human stem cell）或是分化过的细胞（differentiated cell）的亚型标志。干细胞可以是原始态（naive）干细胞。使患者受折磨的癌症可以是MUC1*阳性癌症，并且至少一种干细胞亚型标志所独特的成分可以来自新分化的人类干细胞或分化过的细胞。干细胞可以是原始态干细胞。调节成分可以是RNA、微小RNA或蛋白质。微小RNA可以是微小RNA-145。引起至少一种干细胞亚型标志所独特的至少两种调节成分表达的试剂可以是小分子。

在另一个方面，本发明涉及治疗患有癌症的患者的方法，包括给予患者组合物，其包括（i）至少两种调节成分，或（ii）引起至少一种增殖平稳期（proliferation plateau）标志所独特的至少两种调节成分表达的试剂。调节成分可以是RNA、微小RNA或蛋白质。微小RNA可以是微小RNA-145。引起至少一种增殖平稳期标志所独特的至少两种调节成分表达的试剂可以是小分子。

在另一个方面，本发明涉及用于在患有癌症的个体中，识别治疗癌症有用的调节成分的方法，其包括：

（i）从人类原始态多能干细胞中获得调节成分的第一分子组合物；

（ii）从步骤（i）的原始态多能干细胞分化的细胞中，获得调节成分的第二分子组合物；

（iii）在调节成分的第一和第二分子组合物之间，比较调节成分的分子组成（molecular composition）；以及

（iv）识别在调节成分的第二分子组合物中表达显著增加的调节成分。

（v）从使患者受折磨的癌症亚型中，获得调节成分的第三分子组合物；

（vi）比较在（iv）中识别的调节成分和调节成分的第三分子组合物；

（vii）识别在患者的癌症亚型中不存在或显著减少的调节成分。

在该方法中，调节成分（regulatory element）可以是RNA、微小RNA（microRNA）或蛋白质。

在另一个方面，本发明涉及用于在患有癌症的个体中，识别治疗癌症有用的调节成分的方法，包括：

（i）从癌细胞中获得调节成分的第一分子组合物；

（ii）从人类新分化的干细胞中，获得调节成分的第二分子组合物；

（iii）在第一和第二分子组合物成分之间，比较调节成分的分子组成；以及

（iv）识别在调节成分的第二分子组合物中表达增加的调节成分。

在该方法中，第一分子组合物可以来自于患者的癌症亚型。调节成分可以是RNA、微小RNA或蛋白质。

在另一个方面，本发明涉及治疗患有癌症的患者的方法，包括给予患者诱导不同癌症亚型生长的调节成分。与癌症的不同亚型相比较，在使患者受折磨的癌症中，调节成分可以不存在或可以低水平表达。调节成分可以是微小RNA。调节成分可以是微小RNA-145。

又在另一个方面，本发明涉及用于治疗具有癌症或处于发展癌症风险中的患者的方法，包括给予患者来自于至少两种不同和有区别的（可区分的，distinct）癌症亚型标志的调节成分。调节成分可以选自微小RNA、核酸、蛋白质或模拟调节成分活性的小分子。

在另一个方面，本发明涉及治疗具有癌症或处于发展癌症风险中的患者的方法，包括给予患者至少两种分开的（separate）微小RNA，其中一个诱导分化，另一个诱导多能性。

又在另一个方面，本发明涉及治疗具有癌症或处于发展癌症风险中的患者的方法，包括给予患者至少两种不同的微小RNA或微小RNA簇，其中每一个微小RNA或微小RNA簇主要在有区别的癌症亚型中表达。有区别的癌症亚型可以是MUC1*阳性和MUC1*阴性。

在另一个方面，本发明涉及治疗具有癌症的患者的方法，包括给予患者微小RNA或微小RNA簇，其具有不同于患者的癌症亚型的癌症亚型的特性（特性，characteristics）。

仍在另一个方面，本发明涉及通过给予需要其的对象至少两种癌症亚型标志的调节成分的混合物，给个体接种疫苗以防止癌症的方法，其中每一个独特地识别癌症的不同亚型。调节成分可以是微小RNA。

在另一个方面，本发明涉及不需要Rho激酶抑制剂而增殖多能干细胞的方法，包括：用活化MUC1*生长因子受体路径的试剂培养细胞。试剂可以是NM23，并且可以主要以二聚物的形式存在。该方法可以进一步包括在人类成纤维细胞饲养层上生长多能干细胞。可选地，该方法可以进一步包括在没有小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞组分的层上生长多能干细胞。可选地，该方法可以包括在MUC1*抗体表面上培养细胞，其中可选地表面可以是Vita^TM细胞培养平板。

在另一个方面，本发明涉及用于增殖或维持原始态干细胞的方法，包括当没有小鼠饲养细胞或其提取物时，刺激MUC1*路径。可选地，该方法可以进一步包括在MUC1*抗体表面上培养细胞，其中可选地表面可以是Vita^TM细胞培养平板。

又在另一个方面，本发明涉及用于从混合的细胞群体中分离原始态干细胞的方法，包括使混合的细胞群体接触包被有MUC1*抗体的表面，其中原始态干细胞结合到MUC1*抗体表面上，其中可选地MUC1*抗体表面可以在Vita^TM平板上形成。

在另一个方面，本发明涉及将癌症的类型分类的方法，包括确定哪一个癌细胞类型能够在另一个癌细胞类型的条件培养基（conditioned media）上生长，其中在另一个癌细胞类型的条件培养基上生长的能力意味着这两种癌症属于相同的亚型。

仍在另一个方面，本发明涉及识别控制癌症亚型的生长和分化的调节成分的方法，包括：首先根据上述方法将癌症的类型分类，然后执行分子分析，包括微小RNA分析和总转录组（transcriptome）分析从而识别调节成分。

在另一个方面，本发明涉及确定特定（具体）调节成分治疗用于患者癌症亚型的适合性的方法，包括利用根据上述方法的方法，使用获得的调节成分信息，从而识别对癌症亚型有效的治疗。

从本发明下面的描述、所附的参考附图和所附的权利要求中，将会更充分地理解本发明的这些和其他目的。

附图说明

从下面给出的详细描述中，将会更加充分地理解本发明，仅以说明的方式给出的附图因此不是用于限制本发明，其中：

图1显示通过撤销（withdrawal）bFGF和条件培养基（CM）或NM23-S120G，或通过添加作为MUC1*受体的细胞外结构域的PSMGFR肽，当有意地中断MN23-MUC1*相互作用时，在细胞分化48、98或144小时后在H9人类干细胞中表达的微小RNA-145的量的图表。

图2显示FPLC痕迹（trace）的覆层（overlay），其显示NM23-WT（野生型）、NM23-S120G的两个不同批次以及变性然后再折叠的NM23-S120G的一个批次的多聚化状态，其导致80%二聚物形式。

图3A显示非变性的天然凝胶的图，其显示NM23-WT或NM23-S120G的不同批次的多聚化状态。

图3B显示非还原的凝胶的图，其显示再折叠然后凝胶纯化的NM23-S120G大体上100%是二聚物。

图4显示表面等离子体共振实验的传感图（sensogram），其中NM23-WT（A）或NM23-S120G（B）流经NTA-SAM包被的芯片，其上固定了组氨酸标记的PSMGFR肽（MUC1*细胞外结构域）从而饱和。结果显示作为六聚物存在的NM23-WT不结合MUC1*肽，但是NM23-S120G二聚物形式结合MUC1*肽。

图5显示表面等离子体共振实验的传感图，其中NM23-S120G的不同制剂流经3.8%（A）或5.7%（B）的NTA-SAM包被的芯片，其上固定了组氨酸标记的PSMGFR肽（MUC1*细胞外结构域）从而饱和。在部分C中，非还原的凝胶显示存在于每一个制剂中的二聚物的量。结果显示，结合到MUC1*肽上的量是样本中存在的二聚物的量的直接作用（函数，function）。

图6显示平板接种后第三天H9人类干细胞的10×照片，其中它们在特征为不同多聚化状态（A-C、D、F）的NM23-S120G、NM23-WT（E）的不同制剂中培养，或在NM23-S120G制剂中培养，其是100%二聚物（A），但是受到PSMGFR（MUC1*细胞外结构域）肽（B）或抗MUC1*Fab（C）的竞争性抑制。结果显示存在于NM23-WT中的NM23的六聚物形式诱导分化，并且中断NM23-MUC1*受体相互作用，可以诱导分化。

图7显示已经添加了NM23-WT或由50%二聚物组成的NM23-S120G突变体的T47D人类乳癌细胞的共聚焦显微图像。结果显示，NM23-WT的添加（顶行）没有导致与MUC1*受体共同定位的增加，没有增加转移到细胞核中。由于（recall）存在內源NM23，所以观察到剂量依赖的效应。相反地，NM23-S120G的添加（底行）与MUC1*受体共同定位，并且30分钟后转移（移位，translocate）到细胞核中，并且该效应是剂量依赖的。

图8显示已经添加了由50%二聚物组成的NM23-S120G突变体的T47D人类乳癌细胞的共聚焦显微图像。图像是引入NM-S120G60分钟后拍摄的，并且显示NM23和MUC1*受体共同定位，并且该效应是剂量依赖的。

图9显示以NM23-S120G（50%二聚物）或bFGF培养，并且在人类饲养细胞或小鼠饲养细胞上生长的人类H9胚胎干细胞，然后染色以确定原始态细胞的标记Klf4和始发态的细胞的标记FoxA2存在的共聚焦显微图像。结果显示，在人类饲养细胞（feeder）上用NM23培养的人类干细胞对于Klf4染色为阳性，对于FoxA2染色为阴性。

图10显示以NM23-S120G（50%二聚物）培养，并且在人类成纤维细胞饲养细胞（HS27）上生长的人类H9胚胎干细胞的共聚焦纤维图像。DAPI和明视野图像显示在图像视野内的几乎所有细胞对原始态标记Klf4是阳性的，对始发态的标记FoxA2是阴性的。

图11A到11I显示，已经用Rho激酶抑制剂（ROCi Y-27632）处理（底行；G、H、I）或没有用ROCi处理的人类H9干细胞的显微图像（A到E、G到I；4×，F；10×）。在左边（A、D、G）和右边（C、F、I）加上抗MUC1*抗体平板的Vita细胞培养平板经离心从而使细胞到表面上。结果显示在人类饲养细胞中用NM23培养的人类胚胎干细胞没有受益于ROCi，并且结合到平板上，然后只通过迅速地离心从而将细胞带到平板表面，与ROCi处理同等地生长。相反地，在小鼠饲养细胞中以FGF培养的胚胎干细胞没有显著地结合到平板上，或当没有ROCi时生长。

图12显示响应当存在来自于另一个癌细胞类型的条件培养基（CM）时生长的癌细胞生长的图。图显示癌细胞类型的一个指标为其是MUC1*阳性或阴性，当存在来自MUC1*阴性癌细胞的条件培养基时，MUC1*阳性癌细胞不能生长。U87，MUC1*阳性神经胶质瘤能够生长在来自MUC1*阳性乳癌细胞（T47D）的条件培养基中，但是不能生长在来自MUC1*阴性前列腺癌细胞（LnCAP）的条件培养基中。

图13显示响应当存在来自于用MUC1*受体转染的另一个癌细胞类型的条件培养基时生长的癌细胞生长的图。如果用编码MUC1*的基因（FLR）转染其，则U87，MUC1*阳性神经胶质瘤能够生长在来自MUC1*阴性结肠癌细胞HCT-116的条件培养基中；但是如果用空载体转染其，则不能生长。

图14显示当存在来自也是MUC1*阳性的其他癌细胞类型的条件培养基时，响应生长的MUC1*阳性的T47D人类乳癌细胞的图（A）。部分B显示当存在来自未分化的干细胞或新分化的干细胞时，响应生长的T47D癌细胞的生长。

图15显示图表，其显示当生长在MUC1*阳性癌细胞的条件培养基中时人类胚胎干细胞的生长，其促进生长，或生长在加上/减去用MUC1*转染的MUC1*阴性癌细胞的条件培养基中时，其都使干细胞停滞（stasis）。在来自MUC1*阳性癌细胞（T47D和HCT-MUC1*）的条件培养基中，胚胎干细胞能够增殖，但是不能在来自MUC1*阴性细胞（HCT）的条件培养基中增殖。

图16显示如在图15的表中所描述的生长的人类干细胞的图，显示在MUC1*阴性癌细胞的条件培养基中的生长，或用MUC1*转染的这些使干细胞停滞。

图17显示以NM23-S120（50%二聚物）生长并且接种在Vita平板上面的人类iPS细胞的照片，Vita平板已经包被有如实例7所描述的12.5ug/ml C3mab抗MUC1*抗体。没有添加Rho激酶抑制剂，没有离心平板从而促进细胞粘附，可是iPS细胞粘附、增殖和生长多个世代。17A显示10×放大。17B显示20×放大。

具体实施方式

在本申请中，“一种”和“一个”用来指单个和多个物体（对象）。

定义

MUC1阳性癌细胞，也称为MUC1*阳性癌细胞，是癌细胞，其特征为MUC1跨膜蛋白的异常表达，在健康状态（以及在MUC1阴性癌细胞中）MUC1跨膜蛋白只存在于上皮细胞中，在那里其表达是成簇的，并且限制在组织的顶缘。在MUC1阳性癌细胞，也称为如这里使用的MUC1*阳性癌细胞中发现的异常MUC1表达意味着，蛋白质在整个组织表面上的过量表达和均匀分布，而不是在组织的顶缘成簇的表达模式，其中蛋白质中的许多是截短的形式，其缺乏串联重复单元。

如这里所使用，“活化的”MUC1*是指配体结合到MUC1*上，导致生长的促进和/或细胞存活的增加。

如这里所使用，“条件培养基”是指细胞已经生长一段时间足以从细胞中分泌一定量的物质到培养基中的培养基。

如这里所使用，“新分化的”干细胞是指从多能性转变为更分化状态的细胞。

如这里所使用，“MUC1*”是指膜结合的MUC1剪切产物，其是在培养的癌细胞和癌组织中蛋白质的主要形式。MUC1*包括细胞质尾部和跨膜结构域以及大约45个氨基酸的细胞外结构域（ECD）。剪切的准确位点仍然是有点不确定的。

MUC1*的该细胞外结构域的主要序列可以由氨基酸序GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA（SEQ ID NO:l）（也称为PSMGFR肽）所组成，但不限制于该氨基酸序列。术语“MUC1生长因子受体的主要序列”（PSMGFR）是在一些情况下其限定大多数或全部MGFR的肽序列以及如下面所定义的肽序列的功能变体和片段。PSMGFR限定为SEQ ID NO:l，以及其功能变体和片段，其结合NM23或SEQ ID NO:l的抗体，并且可以具有整数值直到20的氨基酸替代（即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20）和/或在其N末端和/或C末端任何整数值直到20的氨基酸添加或缺失。如这里所使用，除非明确地说明，否则缩写PSMGFR不应该与氨基酸序列混淆。

如这里所使用，“MUC1阳性细胞”是指异常表达MUC1的细胞。

如这里所使用，“MUC1阴性细胞”是指不能异常表达MUC1的细胞，包括正常表达MUC1的细胞。

如这里所使用，“MUC1*细胞”或“MUC1*阳性细胞”是指表达截短形式的MUC1、MUC1*的细胞。

如这里所使用，“MUC1*阴性细胞”是指不表达MUC1*的细胞，其也包括MUC1阳性或MUC1阴性细胞，只要细胞不表达MUC1*。

在先前的专利申请中，跨膜MUC1剪切产物称为MGFR和MUC1*。MUC1*和MGFR（MUC1生长因子受体）包括MUC1细胞质结构域、跨膜结构域和大体上由PSMGFR组成的截短的细胞外结构域。2004年8月24日提交的美国申请公开号2006/0173171，描述了MUC1的活性，特别是MUC1的氨基酸序列以及其各种片段，以参考方式将其全部内容并入这里。

如这里所指的“癌症亚型”是分为组的癌症的类别，该组的特征是控制生长和分化的独特成组的调节成分。根据独特，其意味着在不同的癌症亚型之间，调节成分的表达水平具有显著的差异。独特的调节成分可以是从一个癌症亚型到另一个癌症亚型表达水平显著增加或减少的调节成分。癌症亚型所特有的独特调节成分的集合（collection）这里称为“癌症亚型标志”。

亚型标志不限制于癌细胞。通过类似的手段，可以将干细胞分为亚型。分析干细胞和祖细胞（progenitor）从而识别每一个亚型所独特的调节成分。根据独特，其意味着该成分在表达水平上存在显著差异。独特的调节成分可以是从一个干细胞亚型到另一个干细胞亚型表达水平显著增加或减少的调节成分。一个干细胞亚型所特有的独特调节成分的集合这里称为“干细胞亚型标志”。给予个体干细胞亚型标志用于治疗或预防癌症。特别优选的是干细胞亚型标志，其中其是由在要治疗或预防的癌症中下调的调节成分所组成的。

如这里所使用，干细胞“增殖平稳期（增殖平顶期、增殖平台，proliferationplateau）”是指特征为干细胞或祖细胞亚型的群体扩增的生长，其中暂时停止分化为更加成熟的状态。

如这里所使用，“增殖平稳期亚型标志”指在增殖平稳期，干细胞或祖细胞的亚型所独特的调节成分的集合。

如这里所指的“调节成分”可以是核酸、RNA、微小RNA、基因或基因产物。

如这里所使用，“小分子”指化学化合物，优选地具有小于1KDa的分子量，或优选地小于800Da等等，只要其能够用作诱导调节成分表达或模拟调节成分活性的试剂。如本申请中公开的应用的分析类型给定的知识，对于本领域内技术人员，这些化学化合物的合成是能够得到的。

如这里所用，调节成分表达的“显著增加”在本领域内是癌症重编程领域内的技术人员所已知的术语。

癌细胞和多能干细胞是类似的

两者的生长和存活都是由MUC1*生长因子受体路径所介导的¹。诱导成体细胞回复变为多能干细胞（诱导性多能干细胞：iPS细胞）的基因是调节MUC1转录的基因，其剪切酶和其活化配体NM23¹⁴。

在多能干细胞和癌细胞中，MUC1剪切为生长因子受体形式MUC1*，其中在这两种细胞内其起有效力的生长因子受体的作用。在多能干细胞中，胚胎干（ES）细胞或诱导性多能干（iPS）细胞中，大体上所有MUC1修剪为截短的生长因子受体形式MUC1*。配体诱导的MUC1*的活化是多能干细胞生长所必须和足够的（充分和必要的）。二聚物形式的NM23结合MUC1*生长因子受体的细胞外结构域并使其二聚化，其活化受体的生长和存活功能。添加以二聚物形式的那摩尔量的NM23独自完全地支持（support）人类多能干细胞生长，并且抑制分化。这是当不存在成纤维细胞饲养细胞或其提取物时，能够支持人类干细胞生长的唯一已知的单个试剂。一旦干细胞开始分化，极大地降低了MUC1剪切，如果检测到任何MUC1*则很小地降低MUC1剪切。微小RNA-145（miR-145）指示（signal）干细胞从多能性转变为更加分化的状态¹⁵。这里，我们显示MUC1*-NM23相互作用的特异抑制引起miR-145表达的极度增加以及伴随的分化起始（图1）。

类似于多能干细胞，所有实体瘤癌症中有75%表达MUC1*，并且其生长和存活是由MUC1*所介导的。支持干细胞生长的配体的添加，NM23，也能够引起癌细胞生长的更快并且增加其存活。癌细胞占据了分化的成体细胞和多能干细胞之间的间隙（空间）。癌细胞具有大程度的“干细胞干性（stem-ness）”。其具有自我复制能力，并且失去了能够将其识别为具体细胞类型的许多特征。

不像多能干细胞，除了MUC1*之外，癌细胞也能够表达全长的MUC1（MUC1-FL）。重要地，能够转移并且也称为“肿瘤干细胞”的抗药的癌细胞，比正常的癌细胞表达出更多的MUC1*。当具体的癌细胞需要抗药性时，其增加了表达的MUC1*的量5到10倍。该发现与癌细胞正在变为干细胞的想法一致，具有转移性的、高MUC1*阳性癌细胞最接近多能干细胞。

癌细胞和干细胞之间的另一个相似之处在于控制多能性的基因的同一性。已经识别能够将体细胞重编程返回为iPS细胞的多能基因，Oct4、Sox2和Klf4/Nanog，是控制其他基因表达以及其编码的蛋白质的转录因子。Young和同事¹⁶识别OCT4、SOX2和NANOG结合的启动子位点，识别从这些启动子表达的基因。换句话说，已经识别了由这些“多能基因”上调的基因。每一个转录因子调节大约十二个（dozen）基因的转录。在其之中的是发明人已经确定为MUC1相关因子的若干转录因子。OCT4和SOX2结合自身的MUC1启动子。SOX2和NANOG结合NM23（NME7）启动子。NM23-H1和H2先前已经识别为MUC1*的配体。在这些实验中使用的抗体也识别NM23/NME7。因此，NME7是MUC1*的活化配体。OCT4和SOX2都结合MMP16的启动子，这里公开的MMP16是MUC1的剪切酶。OCT4、SOX2或NANOG也结合到剪切酶MMP2、MMP9、MMP10、ADAMTSL-1、ADAM TS-4、ADAM-17（MUC1剪切酶），在MUC1剪切中也可以涉及的ADAM-TS16、ADAM-19和ADAM-28的启动子位点上。总之，诱导多能性的基因，包括MUC1的表达、其剪切酶以及其活化配体。

总之，这些发现强烈地讨论了癌细胞非常类似于干细胞，并且MUC1*阳性细胞最类似于多能干细胞。

多能干细胞具有指导其分化为成体细胞的固有程序。

当干细胞退出（exit）多能性时，其活化分化程序。虽然癌细胞和干细胞是非常类似的，但是癌细胞已变得调节失控（dysregulated），这样其不退出干细胞样（stem-like）的自我复制状态。所以一个自相矛盾之处是，干细胞活化从而退出自我复制的调节成分是什么，哪种癌细胞不能活化？通过研究干细胞如何关闭自我复制，我们能够了解如何诱导癌细胞也关闭其自我复制程序。

该最初分化程序中关键调节剂中的一个是miR-145。多能干细胞转变为第一分化状态的标志是miR-145表达的大量增加¹⁵。这里，我们显示在增殖的多能干细胞中中断NM23-MUC1*相互作用会引起miR-145表达上更早和更明显的峰值（图1），干细胞立即起始分化。不论添加的试剂是MUC1*拮抗剂或NM23拮抗剂，结果是相同的。这些结果显示，NM23和MUC1*也都是分化程序的关键调节剂。这提出了干细胞如何中断NM23-MUC1*相互作用从而起始分化的问题。我们已经发现，NM23在自我调节反馈回路中是关键参与者。NM23根据浓度，能够以单体、二聚物（活化形式）、四聚物或六聚物存在。然而，从癌症中分离的突变体，例如S120G突变体¹⁷，显示主要是以活化二聚物形式存在，并且抵抗或不能够形成更高级（higherorder）的多聚体。我们现在显示，四聚物和六聚物不能结合到MUC1*受体上。因此，当干细胞增殖时，其分泌的NM23的浓度和量增加。在增殖的干细胞周围的培养基中NM23水平快速地达到其主要以不结合MUC1*的六聚物存在的浓度。因而，NM23六聚物和四聚物模拟NM23拮抗剂的作用，导致miR-145立即的峰值，并且起始分化。通过比较，突变体像成神经细胞瘤中发现的NM23-S120G只形成二聚物，在组成上是活性的，因而使癌细胞在干细胞样的自我复制状态。类似地，在多能状态，该突变体NM23使人类干细胞增殖，并且防止其分化（下面的实例2和3；图2、3、6）。

因此，通过中断NM23-MUC1*相互作用，抑制NM23的二聚化，用野生型NM23处理，用是或优选是四聚物或六聚物形式的NM23突变体、变体或嵌合体处理，或通过添加调节因子，例如miR-145和与miR-145共表达的微小RNA簇，从而诱导分化，能够抑制癌症生长。

细胞重编程：已知细胞发育是双向的，没有损失编程成分（元件，element）。

成熟细胞能够经重编程从而及时返回和回复变为多能干细胞；干细胞能够经指导从而分化为成熟细胞。我们已经显示，癌细胞像干细胞，除了指导其分化并且终止自我复制的成分失去了调节。因此，由此得出结论，癌细胞能够经重编程从而分化为不能自我复制的成熟细胞。

因此，用诱导细胞分化的试剂处理是用于癌症的治疗或其预防。其实现是通过引入基因、基因产物、调节核酸、微小RNA或诱导分化或阻断自我更新的效应物的小分子。诱导分化，并且因此合适作为抗癌症治疗或用于癌症预防的调节成分能够通过下面确定：1）比较人类原始态多能干细胞的“干细胞亚型标志”和已经分化或新分化的干细胞（来自原始态来源）；2）识别这两者之间调节成分表达水平上的显著改变，其中在分化细胞的干细胞亚型标志中独特的调节成分是诱导分化的调节成分；3）比较来自分化细胞的干细胞亚型标志的该组独特成分和“癌症亚型标志”；以及4）识别在癌症亚型标志中丢失或以显著不同水平表达的这些成分。这些是能够诱导分化并且在癌症中改变的调节成分，因此适合给予患者用于癌症的治疗或预防。

诱导分化的调节成分，例如调节诱导分化或关闭诱导多能性的基因或基因产物的后生过程（epigenetic process）的RNA、非编码RNA和微小RNA，能够引入癌细胞/患者中，从而将其重编程为健康或更分化的状态。类似地，调节诱导分化或关闭诱导多能性的基因或基因产物的后生过程的这些调节RNA、非编码RNA和微小RNA，能够引入到宿主动物或人中，从而治疗癌症或防止癌症发生。另外，本发明预期使用模拟基因、基因产物、编码和非编码核酸或微小RNA的作用的小分子，这些基因、基因产物、编码和非编码核酸或微小RNA能够诱导分化，从而用于治疗诊断有癌症或处于发展癌症风险中的患者。

调节成分，包括诱导分化的核酸、微小RNA、基因和基因产物，能够引入癌细胞中，或患有癌症或处于发展癌症风险中的患者中，从而将癌细胞重编程回到更加分化的状态，并且抑制其自我更新的能力。

能够使用调节干细胞多能性的微小RNA从而重编程癌细胞以逆转癌症过程，并且抑制其自我更新能力。我们先前显示，在癌细胞中阻断MUC1*受体二聚化能够抑制癌细胞的生长。因为微小RNA调节大的网络，所以其比单个基因或基因产物在重编程细胞上会更有效。诱导分化的微小RNA簇在癌症的治疗或预防上也是有效的。

能够用来治疗癌症的微小RNA包括miR-145和诱导分化的其他微小（RNA）。诱导从祖细胞分化为更迟分化阶段的微小RNA是组织特异性的。在治疗应用中，组织特异性的微小RNA能够与分化的早期引发剂一起共同给药，从而治疗或预防特异细胞类型的癌症。例如，在脑组织中诱导分化的miR-128能够用来治疗脑癌。其可以单独地使用，或与其他非组织特异性分化调节剂，例如miR-145组合使用。

由MUC1剪切产物调节失控的基因或其基因产物（其编码的蛋白质）能够引入癌细胞中，从而“重编程”癌细胞返回为更分化的状态。

在一个实施例中，给予癌症患者或癌症预防性的患者，在多能干细胞和癌细胞中表达减少的蛋白质，从而使患者的细胞维持在分化状态，或“重编程”其癌细胞并且诱导其返回为更分化的状态。在另一个实施例中，给予癌症患者或癌症预防性的患者，在多能干细胞和癌细胞中表达减少的调节核酸。在优选的实施例中，核酸是微小RNA，其是全长的或成熟的（加工后存在的更短的序列）。又在另一个实施例中，给予癌症患者或癌症预防性的患者，当干细胞分化时表达增加的微小RNA。

可替换地，下调诱导多能性的基因，或抑制诱导多能性的基因产物是治疗癌症的有效方式。已经识别了诱导多能性的成组的基因或基因产物。一旦识别，诱导细胞分化的成组的基因或基因产物将能够重编程癌细胞，这样其失去了其自我复制能力。

NM23和MUC1*都能够起转录因子的作用（图7和8）。因为将NM23添加到生长的干细胞中，会使干细胞维持在多能状态，并且miR-145表达的增加指示干细胞失去多能性，所以由此得出结论，NM23和/或MUC1*抑制miR-145。对应于MUC1*细胞外结构域的序列肽（PSMGFR）结合到NM23或NM23的二聚物上，并且抑制其与MUC1*受体的相互作用，并且抑制其细胞内在化，在那里其与细胞核中其他靶标相互作用。添加PSMGFR肽到多能干细胞中会引起miR-145表达的大峰值，miR-145打开调节分化的网络。因此，给予PSMGFR肽诱导分化，因而可以治疗癌症或预防癌症。本发明预期给予天然和非天然的PSMGFR肽，给予诱导肽表达的载体或病毒，以及包括序列变异的肽，只要肽能够结合NM23。本发明也预期给予小分子或抗体（二价的、单价的或双特异的、天然的或工程设计的抗体和抗体片段），其抑制NM23和MUC1*之间的相互作用。另外，我们注意，我们已经显示NM23二聚物是活化MUC1*生长因子受体路径的形式。在高浓度的NM23形成四聚物和六聚物，我们发现其不能结合MUC1*。因此，通常我们使用突变体，例如抑制四聚物和六聚物形成的NM23-S120G，用于刺激干细胞生长。然而，形成更高级多聚物的野生型NM23起始关闭多能生长并且起始分化的反馈回路（feedback loop）。因此，本发明也预期使用野生型NM23用于治疗和预防癌症。

因此，然后重要的是能够识别诱导分化的试剂，这样其能够作为抗癌剂给予。类似地，重要的是能够识别诱导多能性的试剂，这样能够抑制其用于治疗或预防癌症。

如下能够识别组成亚型标志的调节成分。

通过本领域内技术人员所已知的各种技术，能够实现调节生长和分化的天然存在试剂的识别。例如，依靠以下事实，能够识别诱导分化的试剂，其将：a）在多能干细胞中不存在或极大地降低；b）在新分化的干细胞中存在；c）在癌细胞中不存在或极大地降低。一旦识别，通过使用小分子，用本领域内技术人员所已知的技术，能够模拟（mimick）诱导分化的天然存在试剂。用来识别诱导分化的试剂的分子类型的比较会变化。为了识别调节核酸和微小RNA，要从每组细胞（多能细胞、分化细胞或癌细胞）或其条件培养基中单独地提取出RNA，并且使用技术例如深度测序（Deep Sequencing）来进行比较。为了识别由诱导分化的试剂调节，并且已知或疑似是转录因子的基因和基因产物，要使用分析，像ChIP（染色质免疫沉淀分析）或技术，例如ChIP Seq。也能够比较每一个细胞类型分泌的蛋白质和核酸，从而识别诱导分化的分泌蛋白（见下面的实例5）。

另一方面，有意地活化促进自我复制的相互作用，这样能够识别使分化无效（override）的调节剂。可以抑制这些自我复制调节剂从而治疗癌症。可替换地，可以使用它们来促进干细胞或祖细胞在体内或体外的增殖。如在这下面将描述地，诱导自我复制的一些调节成分可以用来治疗癌症从而递送“混合的信号”。

可替换地，有意地中断诱导自我复制的相互作用，这样组成细胞的分子上的改变变得显而易见；相互作用的中断增加了抑制自我复制的调节剂的产生，因此能够用于治疗癌症或指导干细胞的分化。

在一个实施例中，例如使用增加抵抗MUC1*细胞外结构域的PSMGFR部分或具有PSMGFR序列的肽的抗体的Fab，中断了NM23和MUC1*之间的相互作用。在NM23-MUC1*相互作用中断和没有中断的细胞中，执行分子分析，包括深度测序和转录组分析。执行分子分析是为了识别当中断相互作用时上调的试剂（核酸、微小RNA或蛋白质）；上调的试剂是诱导分化的试剂。

除了在MUC1*细胞外结构域上分泌的NM23的活性，我们已经发现，结合到MUC1*细胞外结构域上的NM23转移到细胞核中，在这里其起上调诱导多能性的基因的转录因子或辅因子的作用（下面的实例4以及图7和8）。执行ChIP分析和ChIP seq（ChIP序列）分析从而识别由NM23-MUC1*诱导的多能基因或由其抑制的分化基因。当二聚物NM23添加到干细胞或癌细胞中时，其结合MUC1*的细胞外结构域，然后两者在30分钟内都转移到细胞核中。在细胞核定位期间，可以添加结合MUC1*和/或NM23的抗体，从而沉淀出其结合的蛋白质和核酸。在优选的实施例中，在分析中，例如在ChIP分析中使用指导抵抗MUC1的PSMGFR区域的抗体，从而确定MUC1*结合的核酸。可替换地，能够使用结合MUC1细胞质尾部的抗体。在识别MUC1*结合的核酸序列之后，要使用大量标准技术中的任何一个，例如RT-PCR、深度测序、转录组分析等等，从而确定MUC1*结合的核酸位点是否引起基因或基因产物的上调或下调。

已经清楚，通过二价抗体或其活化配体NM23的MUC1*的二聚化，示意着细胞维持或变为干细胞样。我们的证据是，抗MUC1*抗体或二聚物NM23驱动癌细胞和多能干细胞的生长，并且抑制干细胞的分化。也已经清楚，阻断或抑制MUC1*的表达示意着细胞失去多能性或分化。因此，为了识别诱导多能性的调节成分，要用MUC1*刺激剂刺激第一组多能干细胞，并且识别上调的微小RNA、基因或基因产物。为了突出在多能性中上调的那些，要用这些结果与第二组干细胞相比较，第二组干细胞中阻断了MUC1*信号，例如通过添加诱导分化的MUC1*细胞外结构域肽（PSMGFR）。当MUC1*活化时表达高，但是当MUC1*阻断时低量表达的RNA、微小RNA、基因或基因产物是诱导多能性的调节成分。当MUC1*活化时低量表达，但是当MUC1*阻断时高表达的RNA、微小RNA、基因或基因产物是诱导分化的调节成分，这些适合于用来治疗或预防癌症。在MUC1*阳性癌细胞中执行该过程，从而识别癌症亚型标志，也可以在多能干细胞中执行该过程从而识别干细胞亚型标志。

MUC1*表达是例示性的，并且可以用作识别基因、基因产物或微小RNA的模型，能够引入基因、基因产物或微小RNA从而重编程癌细胞，这样癌细胞变得更像分化的细胞。本发明预期用促进自我复制或分化的其他试剂执行类似的分析。

调节成分，例如微小RNA以及在癌症中下调的其靶标能够用来调整癌细胞的生长和分化状态，作为抗癌症治疗或作为预防癌症的疫苗。在多能干细胞和许多癌症中，MUC1*表达是高的。另外，在比攻击较慢（less aggressive）的癌症更加具有干细胞样的攻击或转移的癌症中，其表达甚至更高。拮抗MUC1*和其活化配体NM23之间相互作用的试剂诱导分化。这些特征使得MUC1*和调节其表达的成分成为重编程癌细胞的理想治疗靶标。

在癌症的治疗和预防中，识别应该抑制或下调的其他靶标的特征是：1）在多能干细胞和癌细胞中表达高；2）在攻击性癌症中比攻击较慢（较弱）的癌症中表达更高；3）在成熟、分化的细胞中不存在；以及4）证实抑制其表达能够诱导分化。因此，为了重编程癌细胞从而诱导更分化的状态，要引入MUC1、MUC1*、其活化配体NM23或其剪切酶表达的抑制剂，剪切酶包括MMP-14、MMP-16和也叫做ADAM-17的TACE。因为微小RNA对相关的基因和基因产物的大网络发挥控制，所以优选调节靶标例如MUC1、其剪切酶和NM23表达的微小RNA作为重编程癌症或预防其发生的治疗剂。因此，miR-145是单独使用或与其他微小（RNA）一起使用从而治疗或预防癌症的微小RNA之一。

先前尝试识别分化的微小RNA标志是有缺陷的，使其不适合于人类治疗。

使用通过活化FGF路径生长的干细胞，已经执行了为了潜在治疗癌症而尝试识别指导分化的微小RNA的所有研究，同时其中大多数使用的是小鼠成纤维细胞饲养细胞，其条件培养基或来源于小鼠癌症的基质胶（Matrigel）。最近，研究者显示，FGF路径的活化使小鼠干细胞维持在多能状态，但是引起人类干细胞进入叫做“始发态的”状态，其不再是多能的，并且不代表天然发生的人类干细胞。因此，为了准确地识别诱导人类干细胞分化从而治疗人类癌症的调节剂，必须比较真正多能（原始态）的人类干细胞和新分化的人类干细胞（其中来源是原始态的），然后与人类癌细胞比较，其中识别不存在于原始态干细胞，存在于新分化的干细胞并且不存在于人类癌症中的调节剂像微小RNA，并且将其用作治疗或预防癌症的治疗剂。

通过插入基因和各种化学试剂，研究者已经能够使人类始发态的干细胞变为真正多能的原始态状态较短的一段时间。这些暂时的原始态人类干细胞的表征显示，其以片状（sheet）而不是群落生长，并且通过没有副作用的胰蛋白酶处理可以获得其，比始发态的干细胞表达更高水平的KLF4，并且表达较低水平的FOXA2。直到现在，还不知道维持人类原始态干细胞生长的路径。这里，我们提出令人信服的证据，当不存在FGF、小鼠成纤维细胞饲养细胞、其条件培养基或基质胶时，以NM23培养并经MUC1*生长因子受体活化的人类干细胞是在原始态状态，因而是真正的多能人类干细胞。因此，仅仅通过分析根据本发明的方法获得的人类原始态干细胞，然后通过阻抑NM23允许这些细胞分化，能够做到准确识别诱导人类细胞分化的调节剂。虽然一些先前使用FGF生长或小鼠饲养层衍生的干细胞识别的调节成分，例如微小RNA可能是正确的，但是不能区别正确的这些调节成分和系统的人工制品的调节成分，其使用的不是真正的多能人类干细胞的干细胞。进一步，当使用这样的调节成分或标志的两个或更多的组合时，在癌症中改变并且诱导分化的调节成分的治疗使用将会更加有效。治疗学上的治疗包括调节成分的标志，其中一些将有正面作用，一些具有负作用和一些没有作用，不适合于人类治疗。因此，关键的是，使用真正的多能人类干细胞（原始态的），从而识别当细胞转变为更分化的状态时改变的调节成分，其中进一步与癌症亚型标志的比较揭示在癌症中消失或以不正确水平表达的这些成分的特性（身份）；在细胞中这些成分的表达水平恢复的治疗构成具有癌症的患者或用于预防癌症的有效治疗。本发明预期使用经MUC1*刺激培养的干细胞，用于这里所描述的用来治疗癌症、培养人类干细胞或指导其分化的研究中。

我们的实验显示，当我们没有bFGF或小鼠饲养细胞或基质胶，以NM23培养人类胚胎（ES）或诱导性多能干（iPS）细胞时，其回复为原始态状态（下面的实例6和7；图9、10和11）。对于原始态状态的标记，这些干细胞染色为阳性的，并且对于始发态的状态的标记，例如FoxA2，这些干细胞染色为阴性的。另外，在缺乏bFGF或小鼠饲养细胞或其条件培养基的NM23中培养的人类干细胞，接种在抗MUC1*抗体表面的表面上，以片状而不是群落生长，这是原始态干细胞的另一个特征。我们也已经显示，添加Rho激酶抑制剂或MAP激酶抑制剂促进逆转为原始态状态的过程。

因而，我们描述了用于治疗或预防癌症的途径，其中给予患者诱导细胞分化的试剂从而限制癌的自我复制生长。可替代的途径是通过给予患者作为癌症第一类型特征的至少一种成组的第一调节剂，以及作为癌症第二类型特征的至少一种成组的第二调节剂，从而治疗或预防癌症。也就是说第一癌症亚型标志和第二亚型标志。

我们发现，某些亚型的癌细胞不能共培养，并且存在其他亚型的癌症的条件培养基时不能生长。条件培养基包含分泌的因子，其能够编程细胞从而以确定方式生长。当存在其他具体类型的条件培养基时，某些类型的癌细胞不能生长的事实与细胞根据两个不同的程序增殖以及当细胞接收混合的信号时，意思是其自己的增殖程序加上另一个增殖程序，细胞停止增殖并且进入停滞的想法一致。

这么多年来，已经观察到人们不能同时感染多个癌症类型；相反一个癌症类型可以转移。这些数据与我们自己的实验和观察一起得出结论，用根本上混合的信号治疗癌症患者或处于发展癌症风险中的患者，其中信号构成不同增殖平稳期的调节标志的部分，将抑制癌细胞增殖的能力，并且会是有效的抗癌治疗。

直到现在，根据起源组织、癌细胞过表达的分子标记或癌细胞过表达的生长因子受体来表征癌症。然而，现在研究者关注各种肿瘤过表达或低表达的微小RNA。这里，第一次描述了用于表征癌症的方法，其中根据癌症能够与其他癌细胞共培养，将癌症分类。能够一起共培养或在其他癌症的条件培养基生长的癌症属于相同亚型的癌症，相反不能共培养的癌细胞属于不同的癌症亚组。应该首先以这种方式将癌症分类为亚型，然后从每一个亚型中找出代表性的癌症，然后分析其从而识别每一个亚型所独特的调节成分。根据独特，意味着在成分的表达水平上存在显著差异。独特的调节成分是从一个癌症亚型到另一个癌症亚型上表达水平显著增加或减少的调节成分。癌症亚型所特有的独特调节成分的集合在这里称为“癌症亚型标志”。通过给予患者与使患者受折磨的癌症不同的癌症的癌症亚型标志，其在这里称为“外来癌症亚型标志”，能够治疗癌症患者。本发明也预期通过给予患者超过一个外来癌症亚型标志，治疗患者。本发明进一步预期给予健康人至少两种癌症亚型标志，为了预防癌症的目的。

例如，如果一个识别一个癌症亚型的微小RNA标志，另一个识别另一个癌症亚型的微小RNA标志，其中在两个癌症亚型中很少有微小RNA存在于相当（comparable）水平，则然后可以给予癌症患者或处于发展癌症风险中的患者两个微小RNA簇，从而将导致细胞进入停滞的非增殖状态的混合信号传递到细胞中。在类似的途径中，一个可以识别至少两种不同的微小RNA标志，其诱导两个不同的细胞类型分化为不同的细胞命运，例如第一组微小RNA诱导细胞分化为神经细胞，第二组微小RNA诱导细胞变为皮肤细胞。通过递送两个调节信号，其如果递送到不成熟的分化细胞中，会引起细胞进入停滞状态从而防止突变种类的发生，一起给予患者两个不同的增殖平稳期标志从而治疗或预防癌症。在另一个途径中，递送从而治疗或预防癌症的两个冲突的调节信号是诱导多能性的第一组微小RNA和诱导分化的第二组微小RNA。其是能够用来治疗或预防癌症的两个不同干细胞亚型标志的实例。又在另一个实施例中，用组成仅仅一个干细胞亚型标志的分子治疗患者，例如成组的微小RNA，其与癌症亚型标志冲突，例如能够抑制其干细胞样增殖的患者自己癌细胞的微小RNA标志。

多能干细胞分化为祖细胞，其是最终分化为终末分化成体细胞的细胞的前体

我们先前报道，在多能干细胞中MUC1剪短为多能的生长因子受体MUC1*，但是只要干细胞开始分化其就回复为静止的全长MUC1。我们进一步发现，在一些关键祖细胞（progenitor）阶段，又恢复MUC1剪切为MUC1*，从而在进一步分化之前扩增特异的祖细胞群体。例如，在分化的开始，多能生长因子受体MUC1*的表达受到抑制，但是在造血干细胞、神经干细胞和其他的细胞，包括视网膜细胞中，其又表达，在这些细胞中需要在其进一步分化之前扩增重要的亚群体。其他更迟阶段祖细胞态的扩增是受生长因子受体而不是MUC1*的控制。

祖细胞停止分化一段有限的时间，并且在进一步分化之前扩增其亚群体。

我们把这些干细胞样扩增阶段叫做“增殖平稳期”。根据干细胞“增殖平稳期”意味着生长的特征是干细胞或祖细胞的亚型的群体的扩增，其中暂时停止分化为更成熟状态。存在扩增不同亚群体的若干个增殖平稳期，并且每一个的特征是指导自我复制程序的成组调节成分。根据“增殖平稳期亚型标志”意味着在增殖平稳期中干细胞或祖细胞所独特的调节成分的集合。MUC1*在很少较早祖细胞的生长和分化的调节中起作用，然而，其他祖细胞的特征是其自己独特的增殖平稳期亚型标志。正像多能干细胞与MUC1*阳性癌细胞的癌症亚型标志分享其干细胞亚型标志中的许多，其他癌症亚型标志将与特异的增殖平稳期亚型标志显著重叠。为了识别包括标志的调节成分，当关于其生长和分化路径知道很少时，能够使用技术例如深度测序或总转录组分析，从而产生标志。

我们的证据指出，当成熟细胞错误地变为截留在增殖平稳期时，则发生癌症。因此，通过执行癌细胞和各种祖细胞之间的分子比较，能够识别癌症亚型标志。每一个癌症亚型标志将接近干细胞亚型标志或增殖平稳期亚型标志。我们的实验显示，当存在癌细胞的另一个亚型时，一些癌细胞亚型不能增殖。癌细胞的每一个具体亚型分泌打开程序的试剂，该程序介导癌细胞截留的具体增殖平稳期的生长。当癌细胞接收打开其自己增殖平稳期、其“增殖平稳期亚型标志”或其“癌症亚型标志”加上外来增殖平稳期或外来癌症亚型标志的信号时，细胞变得混乱，并且停止增殖。这意味着通过用外来癌症亚型标志或增殖平稳期标志治疗细胞（患者），能够抑制癌症生长，外来癌症亚型标志或增殖平稳期标志可以具有或可以不具有与增殖平稳期标志和癌症亚型标志共同的成分。

MUC1*阳性癌细胞截留在使多能干细胞增殖的调节网络中。MUC1*阳性癌细胞的癌细胞亚型标志因此非常类似于多能干细胞的干细胞亚型标志。因此，MUC1*阳性癌细胞分泌诱导多能性的调节成分，然而MUC1*阴性癌细胞不能，这是因为其分泌扩增不同祖细胞群体的因子。MUC1*阴性癌细胞的癌症亚型标志非常类似于祖细胞群体中一个的干细胞亚型标志。两个癌细胞类型，像两个干细胞类型，具有自我复制的能力，但是其受到不同调节成分的控制。我们已经证实，MUC1*阳性癌细胞层或其条件培养基能够完全取代成纤维细胞饲养细胞或其条件培养基或bFGF的需要，用于多能干细胞的生长。然而，MUC1*阴性癌细胞或其条件培养基不能支持多能干细胞的生长。这意味着MUC1*阴性细胞的癌症亚型标志的混合成分干扰多能干细胞的干细胞亚型标志的成分，并且该混合信号导致干细胞停滞或死亡。因为我们已经显示，多能干细胞和MUC1*阳性癌细胞能够共培养，并且两者中任一个能够生长在其他的条件培养基上，所以推断其亚型标志非常接近。因此，正像MUC1*阴性细胞的癌症亚型标志引起多能干细胞的停滞和死亡，其将引起MUC1*阳性癌细胞的停滞和死亡。该发现支持了癌症是由截留在干细胞或祖细胞“增殖平稳期”的成熟细胞的群体引起的疾病集合，以及通过给予患者不同癌症亚型标志或不同干细胞亚型标志的调节成分，能够有效治疗癌症的推断。

在互补实验中，我们观察到当MUC1*阳性癌细胞培养在来自多能干细胞的条件培养基中时，其正常增殖，但是当培养在新分化的干细胞的条件培养基中时，其不能增殖。该发现与MUC1*阳性癌细胞不能增殖是因为分化的干细胞分泌的调节因子重编程癌细胞，所以其分化并且失去自我更新的能力的想法一致。

该发现与自然已经发展出防止突变发生的机制；接收混合信号的分化干细胞进入停滞阶段并且不再增殖的想法一致。例如，同时接收变为血细胞的信号以及指导其变为肌细胞的另一个信号的干细胞，可以触发默认程序从而防止细胞进一步分裂。因为癌细胞是失去引导其分化的程序的干细胞，所以会引起这些细胞进入停滞状态，并且通过将“混合的”增殖平稳期信号传递给细胞而终止增殖。

用于培养多能干细胞的现有技术方法是使其生长在成纤维细胞“饲养”细胞加上成纤维细胞生长因子（bFGF）的层或条件培养基中。如果癌细胞是干细胞样的，并且其生长和分化状态受到维持多能性的许多试剂的调节是正确的，则我们推论，干细胞能够生长在癌细胞的条件培养基中或癌细胞的层上面。因为MUC1*是干细胞和癌细胞生长和分化的关键调节剂，所以我们进一步预测，来自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基最适于生长和维持在多能状态的干细胞。我们的实验显示，多能干细胞在来自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基中生长良好，但是不能在来自MUC1*阴性癌细胞的条件培养基中生长。该发现证实了我们的想法，即癌症基本上是由截留在祖细胞增殖平稳期上的成熟细胞的群体引起的疾病的集合。

自然已经发展出防止突变发生的机制；接收混合信号的分化干细胞进入停滞状态并且不能增殖。例如，同时接收变为血细胞的信号以及指导其变为肌细胞的另一个信号的干细胞，可以触发默认程序从而防止细胞进一步分裂。因为癌细胞是重编程从而变得干细胞样的成熟细胞，所以会引起这些细胞进入停滞状态，并且通过将与细胞操作时的信号冲突的“混合的”信号传递给细胞而终止增殖。在该假设的支持上，研究者最近报道，用多能干细胞免疫动物可以防止其患结肠癌。这里，由多能干细胞发出的多能性信号以基本方式与部分分化的癌细胞的信号冲突。

在自然中，多能干细胞增殖，然后以其方式分化成为完全成熟的细胞，其称为终末分化细胞（terminally differentiated cell）。沿着从多能到终末分化的该路径，显示存在增殖平稳期，其中在关键祖细胞阶段需要在进入下一步分化之前扩增细胞群体。我们的假设是，癌症组成疾病的集合，其中细胞编程变得混乱，并且其截留在若干干细胞样增殖平稳期的一个中。如果该假设是真的，则通过传递同时的干细胞样增殖信号，癌细胞能够被迫使进入静止状态，然后由此得出结论，来自不同种类的癌细胞的条件培养基可以包含一些编程因子，并且共培养分化类型的癌细胞可以引起细胞接收防止增殖的混合信号。

作为该理论正确性的证据，我们发现当存在其他类型的癌细胞时，若干类型的癌细胞不能生长。我们推论，因为多能干细胞要求经MUC1*受体发送信号从而生长，MUC1*阳性癌症会构成远离沿着朝向完全干细胞样行为的路径的癌症种类，MUC1*阴性癌症是不同类别的。因此，我们在相反类型的癌细胞的条件培养基中生长MUC1*阳性癌细胞或MUC1*阴性癌细胞。图12显示，当存在来自LnCAP细胞（MUC1*阴性前列腺癌细胞）的条件培养基时，U87细胞（MUC1*阳性神经胶质瘤）不能生长。然而在MUC1*阳性乳癌细胞系T47D的条件培养基中，U87能够如其正常地生长（下面的实例8）。培养细胞192个小时（8天），在大约96个小时（4天）在生长上出现明显的差异，其正好对应于先前发表的用于示意会发生改变的微小RNA网络需要的时间的报道¹⁵。在来自MUC1*阳性癌细胞的培养基上，和来自MUC1*阴性癌细胞的条件培养基上的U87的生长存在多于10倍的差异，表明递送一种类型的癌症中的调节信号的成分，抑制了不同亚型的癌症的生长。要注意纠正不同培养基对细胞生长的任何效应，因为每一个细胞类型具有用于生长的其自身推荐的培养基，所有的细胞生长在相同的培养基上：50%培养基是推荐用于在平板上的细胞生长的培养基，其他50%是其他细胞类型生长的培养基，例如条件培养基。

通过给予细胞/患者起始分化的试剂，能够治疗癌症，其停止了自我复制过程并且停止了癌细胞生长。

图13显示，如果用MUC1*（FLR）转染HCT-116，则U87细胞（MUC1*阳性神经胶质瘤）能够生长在来自MUC1*阴性结肠癌细胞HCT-116的条件培养基上，如果用空载体转染，则不能在其上面生长。为了促进该观点，我们在MUC1*阴性癌细胞HCT-116（结肠癌系）的条件培养基中，或在已经转染编码MUC1*的基因的HCT-116细胞的条件培养基中，培养U87细胞。图13显示，MUC1*阴性结肠癌细胞系、用空载体转染的HCT-116（“HCT-载体”）的条件培养基在大约96个小时后不允许MUC1*阳性U87细胞的生长，96小时是用来活化微小RNA调节网络所需要的¹⁵。相反地，只是已经用编码MUC1*的载体（“HCT-MUC1*”）转染的来自相同细胞系HCT-116的条件培养基，能够允许U87的生长（图13）。注意所有的细胞生长在相同的培养基中，其是50/50混合的推荐用于平板上细胞的培养基和用于促成条件培养基的细胞的培养基。“对照”细胞是在50/50混合的U87培养基和基本干细胞培养基上培养的。

图14A-14B显示，T47D细胞（MUC1*阳性）在其他MUC1*阳性癌细胞的条件培养基上增殖（图14A）；在来自新分化的干细胞的条件培养基中其不能增殖（图14B）。当T47D细胞培养在来自MUC1*阳性的未分化干细胞的条件培养基中时，6天之后T47D细胞达到停滞，这暗示混合的癌症和多能信号的传递触发静止生长状态。

识别在已经成熟或正成熟的细胞中存在但是在癌细胞中损失的调节剂

为了识别支配多能性的微小RNA，可以执行标准技术例如深度测序，从而识别在多能性中上调但是在分化的细胞中下调的微小RNA。另外，其不应该在成熟细胞中上调，并且在多能干细胞中下调这些微小RNA应该会诱导分化。这些微小RNA也会存在于攻击性癌症中。为了识别支配分化的微小RNA，要类似地寻找在多能状态下不存在，但是在正分化的干细胞中高表达，或当多能性的缓和剂，例如MUC1*被拮抗时高表达的微小RNA的上调。在攻击性癌症中这些微小RNA也会下调。

为了识别能够独特地识别癌症不同亚型的微小RNA，要识别只存在于癌症亚型中、在健康的成熟细胞中不存在并且当下调时会抑制具体亚型的癌症生长的那些微小RNA。能够识别癌症亚型的微小RNA也可以存在于增殖干细胞或祖细胞中。若干技术是可以用于识别微小RNA，例如全转录组分析、深度测序、ChIP分析以及能够预测抑制靶标基因的微小RNA序列的计算机方法和程序。将癌症分类的一种方式是癌症是MUC1*阳性还是MUC1*阴性。类似地识别能够独特地识别未分化细胞、分化细胞和癌症亚型的基因和基因产物。除了微小RNA用来作为癌症的治疗或其预防，可以给予当独特的识别剂微小RNA表达时能够表达的基因或蛋白质而不是给予微小RNA。可替换地，上调靶标微小RNA、基因或基因产物的小分子可以用作治疗剂。

能够给予递送调节簇信号的成分的组合，例如在新分化的干细胞中占优势的核酸、微小RNA或蛋白质作为新类型的癌症疫苗。能够给予在不同亚型的癌症中占优势的这些成分的组合作为新类型的癌症疫苗。

也能够给予已经用MUC1*转染的MUC1阴性癌细胞作为癌症疫苗，因为其递送混合的基础信号（fundamental signal）。

本发明不限制于在这里描述的具体实施例的范围内。事实上，除了这里描述的这些实施例之外，通过上面的描述的附图，本发明的各种修改对于本领域内技术人员是显而易见的。这样的修改是在所附的权利要求保护范围之内的。通过本发明的说明的方式，而不是以限制的方式，提供下面的实例。

实例

实例1.MUC1*或NM23的抑制诱导miR-145的表达并且触发分化。

通过下面任一方法在基质胶中培养人类胚胎干细胞H9s三个世代（passage）：a）4ng/ml bFGF和50%来自小鼠成纤维细胞饲养细胞（MEF）的条件培养基的标准方法；或b）在基本干细胞培养基中8nM NM23-S120G；或c）80ng/ml兔多克隆抗MUC1*抗体（抗全PSMGFR序列）。基本干细胞培养基（“MM”）500mL配方是：400ml DME/F12/GlutaMAX I（Invitrogen#10565-018）、100ml Knockout血清替代品（Invitrogen#10828-028）、5ml100×MEM非必需氨基酸溶液（Invitrogen#11140-050）、0.9ml（0.1mM）β-巯基乙醇（55mM原液，Invitrogen#21985-023-可选）、2.5ml PSA（青霉素、链霉素、两性霉素）MP Biochem(#1674049可选）。

通过分别限制bFGF、NM23-S120G或抗mUC1*抗体，使用三种方法生长的多能干细胞然后允许分化。除了限制NM23-S120G之外，在另一个等分试样（aliquot）中，根据（b）合成的PSMGFR肽添加到生长的细胞中从而结合NM23并且防止其与MUC1*相互作用。每一个条件要培养三份，所以要在三个不同的时间点提取RNA：48、96和144小时。使细胞沉淀（成团）并且冷冻。根据生产商的用法说明，使用mirVana^TM试剂盒（Applied Biosystems，P/N：AM1526）从样本中提取出总RNA。对于每一个总RNA样本，使用

微小RNA反转录试剂盒（Applied Biosystems，P/N：4366596）和miR-145特异的两个不同的茎环引物，以及用作內源对照的小核RNA U6B（RNU6B），合成两个cDNA样本。根据生产商的用法说明，使用

微小RNA分析（Applied Biosystems，P/N：4427975）执行在cDNA样本中miR-145和RNU6B的定量。使用比较Ct方法分析实时PCR数据。通过计算miR-145Ct和相应的RNU6B Ct之间的差异（ΔCt），获得在每一个样本中miR-145的相对量。通过从在数据集中所有其他ΔCt中减去最小的ΔCt（ΔΔCt）执行第二标准化。

在图1中图示并显示了与标准相比较的在每一个时间点上miR-145表达的量。微小RNA miR-145是调节从多能性分化到分化（状态）的支配（主要）微小RNA。该图显示，添加能够结合并且阻断NM23行为的PSMGFR肽，会引起miR-145表达的峰值，其比现有技术表达的水平更高，在96小时而不是在现有技术方法通常的144小时出现峰值。该早期和提高的miR-145表达促进干细胞的分化，并且与其分化同步，这对于指导分化从而获得功能细胞群体是重要的。也应该注意，限制NM23或抗MUC1*导致miR-145表达比对照、现有技术FGF生长方法升高得更早。

实例2.NM23野生型和具有不同多聚化特性的变体的表达和表征

NM23-S120G克隆

使用下面的引物用聚合酶链式反应（PCR）扩增WT NM23-H1cDNA：5'-atc gat ggatcc gat ggc caa ctg tga gcg tac c-3'（SEQ ID NO:2）和5'-gtg gtg ctc gag ttc atagat cca gtt ctg agc-3'（SEQ ID NO:3）（Integrated DNA technologies）。用BamHI和XhoI限制酶（New England Biolabs）消化之后，将纯化的片段克隆到用相同限制酶消化的pET21b载体（Novagen）中。pET21b载体携带N-端T7-标签序列，C-端

序列以及由T7启动子驱动的克隆的靶标表达。序列确定之后，按照生产商的使用说明，使用GeneTailor^TM定点突变系统（Invitrogen）我们产生了NM23H1突变体S120G（丝氨酸#120突变为甘氨酸）。用31.25ng甲基化的DNA模板使用下面的引物执行突变反应：5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'（SEQ ID NO:4）和5'-gccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'（SEQ ID NO:5）。PCR反应由95°C的2分钟变性步骤，接着是三个步骤循环（×35）所组成：95°C变性15s，58°C退火30s以及68°C延伸10min。然后将扩增的片段克隆到DH5α^TM-T1^R细胞（Invitrogen）中，并且选择若干克隆用于质粒提取和序列分析。最后，将包含突变的阳性克隆转化到BL21（DE3）细胞（Invitrogen）中用于重组蛋白表达。

NM23-WT（野生型）克隆

使用下面的引物用聚合酶链式反应（PCR）扩增WT NM23-H1cDNA：5'-atc gat ggatcc gat ggc caa ctg tga gcg tac c-3'（SEQ ID NO:2）和5'-gtg gtg ctc gag ttc atagat cca gtt ctg agc-3'（SEQ ID NO:3）（Integrated DNA technologies）。用BamHI和XhoI限制酶（New England Biolabs）消化之后，将纯化的片段克隆到用相同限制酶消化的pET21b载体（Novagen）中。pET21b载体携带N-端T7-标签序列，C-端

序列以及由T7启动子驱动的克隆的靶标表达Ⅰ。选择若干克隆用于质粒提取和序列分析。最后，将阳性克隆转化到BL21（DE3）细胞（Invitrogen）中用于重组蛋白表达。表达野生型蛋白质并且收集分泌的蛋白质在His Gravitrap^TM1mL柱（GE healthcare）亲和纯化。

NM23-S120G和NM23-WT表达/纯化

500mL LB肉汤（Luria-Bertani肉汤）接种一个克隆，并在37°C过夜培养。第二天，1L LB接种100mL过夜培养物，并在37°C培养直到OD600达到0.5。在这个时刻，用0.4mM异丙基-β-D-硫-半乳糖苷（IPTG，Sigma）诱导重组蛋白表达，并且4h后停止培养。

纯化方案#1：收集和纯化分泌的蛋白质

通过离心（4°C6000rpm10分钟）收获细胞之后，在包含100mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和100mM苄脒的30mL BugButer^TM母液（mater mix）（Novagen）中重悬浮细胞团块（来自350mL培养物）。在旋转台（275rpm）上25°C温育细胞悬浮液10分钟，并且通过离心（4°C20000rpm30分钟）除去不溶性的细胞碎片。然后补充40mM咪唑到澄清的裂解液中，并将其上样到用下面的运行缓冲液平衡的组氨酸Gravitrap^TM1mL柱（GE healthcare）中：磷酸盐缓冲液（PBS）pH7.4、40mM咪唑和0.05%吐温20。然后用运行缓冲液洗涤柱子直到280nm处的吸收少于0.01。然后用包含500mM咪唑的PBS pH7.4从柱子中洗脱出蛋白质到2mL流分（fraction）。结合（合并）包含蛋白质的流分，在PBS pH7.4中洗提至0.1mg/mL，并且针对PBS pH7.4透析。然后分装蛋白质并且储存在-80°C。

该步骤产生易变的结果。来自每个批次的蛋白质需要通过FPLC和天然凝胶表征，从而确定发生两个典型结果中的哪一个：1）大约50%二聚物加上一些四聚物和六聚物，或2）100%六聚物。

纯化方案#2：折叠和纯化步骤产生100%二聚物NM23-S120G

通过离心（4°C6000rpm10分钟）收获细胞之后，用运行缓冲液：PBSpH7.4、360mMNaCl和80mM咪唑，重悬浮细胞团块（来自350mL培养物）。然后，添加溶菌酶（1mg/mL，Sigma）、MgCl₂（5mM）和DNAse（0.5ug/ml）。在旋转台（275rpm）上37°C温育细胞悬浮液30分钟，并且在冰上超声波降解5分钟（30%动力，打开5秒钟并且关闭10秒钟）。通过离心（4°C20000rpm30分钟）除去不溶性的细胞碎片。然后，将澄清的裂解液施加到用运行缓冲液平衡的NiNTA柱（5mL，Qiagen）上。在用补充有420mM咪唑的8CV运行缓冲液从柱子中洗脱出蛋白质之前（5mL流分），用6CV（柱子体积）的运行缓冲液洗涤柱子。在非还原的SDS-PAGE上分析洗脱流分，并且结合包含蛋白质的流分，并浓缩到7.5mL。然后添加7.5mL变性缓冲液（100mM Tris pH8.0和8M尿素）到蛋白质中，并且将所得到的流分浓缩为一半。重复其两次从而达到7M的最终尿素浓度。然后，通过透析变性的蛋白质经受再折叠。用：1）100mM TrispH8.0、4M尿素、250mM咪唑、0.4M L-精氨酸、1mM EDTA和5%甘油，2）100mM Tris pH8.0、2M尿素、100mM咪唑、0.4ML-精氨酸、1mM EDTA和5%甘油和3）100mM Tris pH8.0、1M尿素、100mM咪唑、0.4M L-精氨酸、1mM EDTA和5%甘油，连续透析蛋白质24h。然后用100mM Tris pH8.0、100mM咪唑、0.4M L-精氨酸、1mM EDTA和5%甘油透析蛋白质9h，并且用25mM Tris pH8.0、100mM咪唑、0.1M L-精氨酸、1mM EDTA和5%甘油透析蛋白质过夜。最后，用一个缓冲液改变的PBS pH7.4、100mM咪唑、1mM EDTA和5%甘油透析蛋白质24h。

在非还原的SDS-PAGE上分析再折叠的蛋白质，我们观察到二聚物（～37KDa）的存在，但是也观察到更高分子量的寡聚物的存在。在使用PBS pH7.4作为运行缓冲液的Akta纯化机10（GE healthcare）上，使用Superdex20010/300GL柱（GE healthcare）通过尺寸排阻色谱法进一步纯化二聚物。在分离再折叠的NM23-H1S120G二聚物时，这样的纯化步骤是非常有效的，可以达到纯度接近100%二聚物形式。

NM23野生型和S120G突变体的FPLC表征

测试NM23-S120G或NM23-WT若干不同制剂的等分试样（aliquot）从而确定每一个多聚化状态的比例，特别是二聚物，因为二聚物是经其细胞外结构域的二聚化活化MUC1*生长因子受体路径的形式。

500ul每一个样本上样到Superdex20010/300GL FPLC仪器中。上样的NM23-WT是0.17mg/ml，上样的NM23-S120G（六聚物批次）是0.19mg/ml，并且上样的NM23-S120G（二聚物批次）是0.15mg/ml。

图2显示FPLC痕迹（trace）的覆层。NM23-WT的主峰在95KDa，暗示其大体上由六聚物所组成；从分泌的蛋白质中收集的NM23-S120G批次其主峰也在对应于六聚物的95KDa处；NM23-S120G的另一个批次显示其是由主峰在30KDa处的约50%二聚物、在66KDa处的次峰（minor peak）（四聚物）和在95KDa处的次峰（六聚物）所组成的；并且变性和再折叠的NM23-S120G（方案#2）产生在30KDa处的主峰（二聚物）和在15KDa处的次峰（单体）。重组蛋白计算的分子量为19.1KDa，其包括亲和标签的重量。

非变性和非还原凝胶分析显示与NM23-S120G的不同制剂相比较的NM23-WT（野生型）的多聚化状态。

NM23-WT和NM23-S120G制剂（分泌的对再折叠的）的各种样本在非变性凝胶或非还原凝胶上运行从而确定再折叠方法的各种表达的多聚化状态。在非变性凝胶上，各种NM23多聚体的分子量能够直接显现。在非还原凝胶上，二聚物通过二硫结合保持完整，并且以约37KDa的表观分子量运行，然而六聚物以约200KDa的表观分子量运行（单体由于缺失二硫键）。天然凝胶显示，在图3A中示出的天然凝胶显示，NM23-WT主要是由六聚物组成的，分泌的NM23-S120G的一个批次也大体上100%是六聚物，然而不同的批次显示大约50%二聚物，并有一些四聚物和单体。变性然后再折叠的方案产生NM23-S120G，其70-80%是二聚物，并且也有一些四聚物、六聚物和单体存在。然后，通过凝胶过滤纯化导致产生大约70-80%二聚物的变性并再折叠的NM23-S120G制剂，以成为100%二聚物，见图3B。要注意，样本上样4mg/ml-0.1mg/ml的浓度比NM23存在于细胞中，在来自成纤维细胞的条件培养基中，或促进未分化的干细胞生长的物理相关浓度高出几千倍。因此，六聚物制剂和野生型制剂在较低浓度时可以平衡，这样其也包括比凝胶显示的更多二聚物。在下面的实例中描述的两个SPR实验支持该结论。

结合固定在芯片上的MUC1*细胞外结构域肽（PSMGFR）的各种NM23多聚物的表面等离子体共振（SPR）测定。

Biacore芯片剥去其表面，并且包被根据Bamdad,C方法的自我组装单层（SAM）。使用可变密度的自我组装单层从而探查靶标分子的结构。Biophys J.1998Oct;75(4):1989-96。形成NTA-Ni-三-乙二醇SAM从而呈现3.8%NAT-Ni。组氨酸标记的PSMGFR肽流经芯片表面，并且固定到饱和。接着，穿过固定的肽表面注入NM23-wt或NM23-S120G（60%二聚物）的每一个不同的制剂。NM23-WT或NM23-S120G以五个浓度流过肽表面：4、8、16、32和64nM。在图4中显示的所得到的结合曲线显示，随着NM23浓度线性增加，结合量也线性增加。然而，野生型（WT）蛋白质在最高浓度只显示150RU的结合（图4A），然而60%二聚物制剂显示接近400RU（图4B）。这些结果暗示，NM23的二聚物形式优选地结合MUC1*细胞外结构域肽。进一步的分析暗示，NM23六聚物根本不结合MUC1*肽，并且100RU的结合表示小部分的制剂是以二聚物存在。与该解释相一致地，对于来自两个不同制剂结合的种类，动力学分析显示打开（on）和关闭（off）速率非常类似。

也分析了显示不同比例二聚物存在的其他NM23-S120G制剂，用于结合包被有SAM的SPR芯片，SAM是由在固定到组氨酸标记的PSMGFR肽层上的三-乙二醇末端C11硫醇的背景上的3.8%（图5A）或5.7%（图5B）NTA组成的。图5显示，与60%二聚物（408RU）和70%二聚物（547RU）制剂相比较，产生100%六聚物的制剂结合得非常少（70RU）。这些结果进一步证实，结合到MUC1*细胞外结构域肽（PSMGFR）层的量仅仅是二聚物浓度的作用（函数，function）。插入物（插图，insert）显示非还原凝胶，其对在每一个NM23制剂中存在的二聚物的量定量（图5C）。

在对照实验中，在相同的芯片上固定不相关的肽，所得到的背景结合的最小量从显示的测量中减去。

实例3.不同NM23多聚化状态对人类胚胎干细胞分化状态的作用：二聚物促进多能生长，来自突变体NM23或野生型的六聚物诱导分化。

测试了NM23的多聚化状态对生长的多能干细胞的作用。能够表达、再折叠或纯化重组NM23-S120G从而产生群体，其是：1）100%二聚物；2）100%六聚物；或3）50%二聚物。记得直接结合数据暗示六聚物形式不结合具有MUC1*细胞外结构域的序列的合成肽（实例2）。另外，对于S120G突变体的三个制剂，制备NM23-WT（野生型）并通过FPLC和天然凝胶表征。显示NM23-WT主要是由六聚物组成的。然而，记得这些分析是在比干细胞分泌的浓度更高的浓度下做出的，因此我们预期野生型是由单体、二聚物、四聚物和六聚物所组成的，直到随着其浓度增加，群体迅速由六聚物形式所取代。

NM23的四个制剂单独地添加到干细胞基本培养基中，并且用来培养人类H9胚胎干细胞，其已经接种到包被有12.5ug抗MUC1*细胞外结构域抗体的Vita（Thermo Fisher，沃尔瑟姆，MA）细胞培养平板上。另外，具有MUC1*细胞外结构域肽（PSMGFR）序列的合成肽添加到接收NM23-S120G100%二聚物制剂的细胞中，为了通过结合NM23从而阻断NM23和MUC1*受体之间的相互作用。类似地，抗MUC1*抗体的Fab添加到在NM23-S120G100%二聚物制剂中培养的另一等分试样的细胞中，从而通过结合MUC1*受体，竞争性地抑制NM23和MUC1*之间的相互作用。

图6中显示了在第三天所拍摄的干细胞的图像。结果是，3天后NM23-S120G100%二聚物制剂引起干细胞生长得最快并且完全不分化（图6A）。当通过PSMGFR肽（图6B）或抗MUC1*Fab（图6C）中断该相互作用时，干细胞非常快速地分化；阻断NM23或阻断MUC1*细胞外结构域的作用是相等的，并且在这些批次的干细胞中没有检测到差异。几乎如同分化的是生长在NM23-S120G100%六聚物制剂的细胞（图6D），其与在NM23-WT（野生型）中生长的作用（图6E）是不能区别的。在50%二聚物的NM23-S120G制剂中培养的干细胞具有一些分化（图6F），但不是像由野生型NM23的六聚物所引起的分化那样广泛。

这些结果证实，二聚的NM23是活化MUC1*受体从而促进多能生长并且抑制分化的形式。结果进一步显示，中断该相互作用能够引发分化。甚至更进一步，结果显示，野生型NM23包括在自我调节反馈回路中，其随着NM23浓度增加，例如通过增加所有分泌该蛋白质的干细胞数目，NM23形成六聚物，其不结合MUC1*受体，这反过来触发分化。对于干细胞生长和递送多能信号，NM23蛋白质的突变体、变体、嵌合体或甚至产生稳定二聚物的再折叠方案是有价值的。可替换地，对于递送能够诱导分化的信号，NM23蛋白质的突变体、变体、嵌合体或甚至产生稳定六聚物的再折叠方案是有价值的，因而对于治疗和预防癌症是有用的。

实例4.NM23和MUC1*共同定位在细胞表面，然后转移到核中。

执行免疫荧光试验从而识别MUC1*和/或其配体NM23到核中的亚细胞转运（trafficking）和定位。从美国模式培养物集存库（ATCC）获得人类乳癌细胞T47D，MUC1*阳性细胞系，并且维持在包含10%FBS的RPMI培养基中。8孔室载玻片（Lab-Tek，#154534）预先包被1型胶原溶液（Sigma，#C8919）从而有助于细胞粘着。1.25×10⁵细胞/ml的T47D细胞涂在预先包被的Lab-Tek8孔室载玻片上，当存在包含1%FBS的RPMI时血清饥饿24-48小时。

以变化的浓度（8、16、32、64、128nM）添加NM23-S120G（50%二聚物制剂，见实例2和3）或NM23-WT（野生型）30、60和120分钟。然后，在室温下使细胞固定在4%多聚甲醛（paraformaldehyde）溶液中10分钟。固定之后，在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中以5分钟/洗涤，洗涤三次细胞。通过室温下在封闭缓冲液中温育一个小时，封闭非特异性染色和细胞透化，封闭缓冲液包含具有0.1%牛血清清蛋白（BSA）的PBS、0.05%皂角苷（saponin）和5%正常的山羊血清。当存在封闭缓冲液时，在室温下添加对于MUC1*的细胞外结构域的一抗（C3mab，Minerva生物技术公司：抗GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV（SEQ ID NO:6）和NM23（C20，Santa Cruz Antibodies，CA）一个小时。在包含1%BSA和0.05%皂角苷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，以5分钟/洗涤，洗涤三次细胞。二抗（Alexa-fluor488和Alexa-fluor555，Invitrogen）施加到封闭缓冲液中，以达到终浓度为1:100，并且在黑暗中，室温下温育一个小时。然后在PBS中以5分钟/洗涤，洗涤两次细胞，接着在水中洗涤一次细胞2分钟。然后使细胞固定到包含核染色DAPI（Invitrogen）的Prolong Gold上面，并且施加盖片（尺寸1.5）。

为了共聚焦显像，使用了Zeiss LSM510共聚焦显微镜（哈弗大学消化系统疾病共聚焦中心设备，柏斯以色列狄肯尼医学中心，波士顿，MA）。Lab-Tek8孔室载玻片放置在Zeiss LSM510共聚焦显微镜的载物台上。使用Plan Neofluar×40/1.3浸油镜头或PlanNeofluar×200/0.50镜头能够聚焦到代表性的细胞。使用25mW氩激发源的488nm激光线激发Alexa-488标记，使用1mW HeNe激光的543nm激光线激发Alexa-555标记，并且使用405nm激光线激发DAPI标记。收集八位（bit）图像，对于所有三个波长，针孔设置为1艾里单位（Airy unit）或76μm，并且以0.11μm/像素分辨率收集图像。设置增益（gain）和偏移量，从而扩增来自以8位数据范围内的255灰度值成像的细胞的信号。获取每1到2分钟Z型堆叠（Z-stacks）（从细胞底部到顶部0.5-1.0μm间隙），一共5到7分钟。

在图7中显示结果。图7（顶行）显示大多数为六聚物的NM23-WT（野生型）随着供应的NM23-WT浓度的增加，不表现出增加的与MUC1*的共同定位，或转移到核中。相反，30分钟温育阶段之后，NM23-S120G（二聚物）以浓度依赖的方式定位到核中。如白色箭头所示，8nM时核定位最多。

NM23是MUC1*的配体

NM23突变体S120G主要是以二聚物存在，并且结合到MUC1*上使受体二聚化。为了显示MUC1*NM23复合物定位到核中，我们执行了另一个实验，其是如上面所描述的实施。当存在变化浓度的S120G-NM23时，温育T47D细胞60分钟。图8显示，如黄颜色所指示的MUC1*和NM23共同定位，之前用S120G-NM23温育，具有细胞质定位，然后核定位。这些结果与MUC1*NM23受体复合物定位到核中并且调节转录的想法一致。应该注意正在测试NM23-S120G的浓度。我们观察到，对于刺激人类干细胞生长以及抑制分化，16nM NM23-S120G是理想的。我们也观察到，在64nM以及更高浓度时，抑制干细胞生长和分化进程。这些结果与MUC1*受体是通过二聚化活化的Ⅰ类生长因子受体的事实相一致。在64nM以及更高的浓度时，一个NM23二聚物结合到每一个MUC1*受体上，而不是一个NM23二聚物结合两个MUC1*受体。

因为我们知道，NM23-MUC1*的相互作用促进多能干细胞生长以及癌细胞生长，所以推断，NM23和MUC1*调节促进多能性和癌生长的因子的转录。

实例5.NM23和MUC1*转移到核中导致促进多能性的基因上调，并且导致诱导分化的基因下调。

在用NM23，特别是优选二聚化的制剂或变体刺激MUC1*之后，执行分析从而揭露响应NM23和/或MUC1*转移到核中的上调或下调的基因、基因产物、微小RNA和其他调节核酸的特性。抗NM23和抗MUC1*的细胞外结构域的抗体，例如抗PSMGFR抗体或抗MUC1*细胞质尾部的抗体添加到核制剂中，并且实施下拉（pull-down）分析，这样免疫沉淀出与MUC1*或NM23复合物相关的所有的核酸和所有的蛋白质。通过测序容易地确定了核酸的序列，并且通过本领域内技术人员已知的抗体探测、质谱、MALDI质谱等等，确定了蛋白质的特性。对于这样的分析，ChIP分析、ChIP SEQ、PCR、RT-PCR以及深度测序分析是理想的。

例如，用抗-NM23、抗-MUC1*或抗-MUC1-CT（细胞质尾部）抗体执行染色质免疫沉淀（ChIP）分析。通过扩增和标记免疫富集的DNA序列，以及与启动子阵列芯片的杂交，或使用SOLiD3分析仪直接扩增和测序，识别使用该技术分离的启动子序列。直接测序将识别由MUC1直接或间接调节的基因的启动子结合位点。为了确定由NM23和/或MUC1调节的基因是上调还是下调，SOLiD3分析仪能够结合RT-PCR使用，RT-PCR只能扩增由核MUC1*或MUC1-CT直接或间接结合从而识别的启动子位点下游的基因。总mRNA的定量和数据分析方法可以用作可替代的方法。

可替换地，用NM23刺激之后进行总转录组分析，并且与没有用NM23刺激的细胞进行的总转录组分析进行比较。

除了比较用NM23刺激的细胞和没有用NM23刺激的细胞之外，预期比较不同的细胞类型。例如，通过比较刺激和未刺激的MUC1*阳性癌细胞和MUC1*阴性癌细胞，能够识别这些基因、核酸、微小RNA和蛋白质，其行为限制到在MUC1*介导的生长中起作用。在另一个方面，刺激的细胞是多能干细胞，其然后与新分化的干细胞以及MUC1*阳性癌细胞进行比较。根据这些方法优选用来分析的优选细胞是任何MUC1*阳性细胞。

实例6.在没有FGF或小鼠饲养细胞的NM23-S120G中培养的人类干细胞对于原始态状态的标记染色为阳性，其是真正的人类多能干细胞状态。

为了证明原始态状态（真正的多能状态）或始发态的状态的标记的存在，探测（probe）在NM23-S120G（50%二聚物）或在人类或小鼠饲养细胞上的FGF培养的人类干细胞。

我们从始发态的H9胚胎干细胞开始。它们已经在bFGF和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养细胞上培养大约30个世代。第一组细胞继续在MEF上以bFGF培养。第二组转移到人类饲养细胞（HS27）中但是仍然以4ng/ml bFGF培养。第三组细胞以NM23-S120G中培养，但是维持在小鼠MEF饲养细胞上。第四组细胞转移到人类饲养细胞（HS27）中并且以NM23-S120G培养。所有的细胞根据这些条件培养附加的6个世代。为了证明原始态干细胞状态的标记Klf4和始发态的干细胞状态的标记Foxa2的存在，然后将细胞染色。图9和10显示，只有以NM23培养并且暴露在人类饲养细胞中的细胞表达原始态干细胞标记Klf4，并且不表达任何始发态的干细胞标记Foxa2。

实例7.以NM23-S120G培养并且在人类饲养细胞或MUC1*抗体表面生长的人类干细胞起原始态干细胞的作用。

Vita^TM（Thermo Fisher，沃尔瑟姆，MA）细胞培养平板用抗-MUC1*抗体（6孔平板的每一个孔12.5μg）包被，并且4摄氏度温育过夜。实验显示，以FGF培养的人类干细胞不能粘附这些表面，除非首先在NM23中预先温育，以及除非添加Rho激酶抑制剂（Y-27632）。然而，如果在人类饲养细胞或在限定的表面上，例如抗-MUC1*抗体层上以NM23培养源细胞，然后除去对Rho激酶抑制剂的需要，其能够有效地结合到Vita-抗-MUC1*抗体表面上。图11显示已经在HS27人类饲养细胞上以NM23-S120G（8nM在基本干细胞培养基中）培养（左侧两列；图11A、11B、11D、11E、11G和11H）或在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养细胞（右列；图11C、11F和11I）中培养的人类H9胚胎干细胞的图像。顶行（图11A、11B、11C）显示胰蛋白酶收获然后涂到Vita-抗-MUC1*表面上的细胞；中间行（图11D、11E、11F）显示用EDTA处理收获的细胞，并且底行（图11G、11H、11I）显示用胰蛋白酶收获但是当存在Rho激酶抑制剂（ROCi）（Y-27632）时平板接种的细胞。在左列（图11A、11D、11G）和右列（图11C、11F、11I）中描述的细胞在平板中，其在1500RPM离心5分钟从而将细胞带到表面上。在中间列（图11B、11E、11H）的细胞没有离心。图11显示，来自NM23、人类饲养源的细胞没有从Rho激酶抑制剂获益，但是来自FGF-MEF源的细胞不能产生未分化的群落，除非在平板接种之前用Rho激酶抑制剂处理，并且用NM23（S120G50-100%二聚物）预先温育30分钟。

另外，见图17，当不存在Rho激酶抑制剂时，在8nM NM23-S120G（50%二聚物配方）中培养的人类iPS细胞很好地连接到Vita-MUC1*抗体表面孔上。在Vita-抗-MUC1*表面上生长2或更多世代的ES或iPS细胞也不需要Rho激酶抑制剂。这些结果与下面相一致：1）Vita-抗-MUC1*表面优选地结合原始态干细胞；2）在人类饲养细胞或Vita-抗-MUC1*表面上NM23（二聚物）生长的干细胞回复为原始态状态；以及3）除了用NM23-S120G预先温育之外，Rho激酶抑制剂使始发态的干细胞回复为原始态状态。因而，包被有抗PSMGFR肽或肽的MUC1*抗体的表面选择性地结合人类原始态状态干细胞，并且能够用来从始发态的干细胞中分离出原始态干细胞。特别优选的是包被有抗肽GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV（SEQ ID NO:6）的单克隆抗体C3mab的Vita（Thermo Fisher）平板。

记得在实例6中，我们显示，以这种方式（在人类饲养细胞上的NM23）生长的人类干细胞产生原始态干细胞的标记。这些结果暗示，呈递抗-MUC1*抗体的表面，特别是当连接到具有与Vita平板类似的化学组成的表面时，能够选择性地结合原始态干细胞。已经报道，在MEF上以FGF培养的人类干细胞能够从用Rho激酶抑制剂的处理中受益很大：更多群落，更好地生长¹⁸。小鼠胚胎干细胞显示当存在Rho激酶抑制剂生长时没有获益，然而来自外胚层的小鼠干细胞从中获益。记得Jaenisch等人报道小鼠胚胎干细胞是难以捉摸的（elusive）人类原始态干细胞的等价物，然而从外胚层阶段获得的小鼠干细胞与人类始发态的干细胞对等。因此，这些结果，根据我们的结果暗示，通过用Rho激酶抑制剂和/或NM23处理，始发态的干细胞能够强制地变得更加原始态。见图11。

在本申请中，我们显示人类干细胞，特别是原始态干细胞优选地结合抗-MUC1*抗体包被的表面。WO2009/105570的Vita^TM表面（针对Vita^TM表面的公开，其内容以参考方式并入这里），已经使用在这些实例中的一些内，但是更一般地本发明预期包被到表面上的抗-MUC1*抗体，表面是由大约1.7-2.1%氮、26.4-28.7%氧以及28.2-30.7%组合的氮和氧所组成，其中表面具有14.3-18.8度的水接触角。

实例8.属于第一亚型的癌细胞不能生长在来自第二亚型的癌细胞的条件培养基中。

在来自MUC1*阳性癌细胞系（乳癌，T47D）或MUC1*阴性癌细胞系（前列腺癌，LnCAP）的条件培养基中培养U87细胞，其是MUC1*阳性神经胶质瘤细胞系。我们应该注意，不同的培养基是推荐用于生长不同的细胞类型的。为了确保看出的差异不是由于细胞生长在不同的培养基中，所有的细胞生长在相同的培养基中，其是推荐培养基的平均33/33/33或50/50组合。图12显示当培养在MUC1*阳性细胞的条件培养基中时，U87神经胶质瘤细胞增殖良好，但是培养在MUC1*阴性细胞的条件培养基中时，其不能增殖。这些结果显示，由第一细胞类型分泌的调节成分会干扰第二细胞类型的内部编程，其中混合的信号会触发默认机制，其使细胞进入生长停滞。

实例9.来自转染了外来蛋白的细胞的条件培养基是由抑制第二细胞类型生长的调节标志的混合物组成。

在如上面所描述实施的另一个实验中，U87细胞生长在MUC1*阴性癌细胞（HCT-116结肠癌，“载体”）或已经转染了MUC1*的相同细胞系（“FLR”）的条件培养基中。HCT-116细胞和MUC1*HCT-116转染的细胞生长在50/50混合的推荐用于U87生长的培养基和基本干细胞培养基中。图13显示，来自MUC1*阴性细胞的条件培养基不允许U87癌细胞的生长，并且虽然用MUC1*转染的这些细胞的条件培养基允许一些生长，但是与对照细胞相比较其受到抑制。该结果与MUC1*转染到MUC1阴性细胞中当与第二信号耦合时构成第一混合信号的想法相一致，其中信号意味着调节成分的标志，特别是细胞亚型的标志，其递送能够抑制癌细胞生长的第二混合信号。

实例10.来自人类干细胞的条件培养基具有重编程癌细胞从而限制其自我复制的标志。

MUC1*阳性乳癌细胞T47D生长在来自其他MUC1*阳性癌细胞的条件培养基中。其他MUC1*阳性癌细胞的条件培养基对MUC1*阳性细胞的生长没有反作用，图14A。

在类似的实验中，在来自未分化的人类ES细胞（H9）的条件培养基中或在新分化的H9的条件培养基中，培养MUC1*阳性乳癌细胞T47D。图14B显示，来自分化干细胞的条件培养基立即停止T47D的生长。来自未分化的干细胞的条件培养基起初增加生长，但是144小时之后，然后抑制其生长，推测当时干细胞保持但是癌细胞丢失的调节成分起始编程的分化。

实例11.来自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基编程人类癌细胞，这样其维持自我复制、未分化的状态；MUC1*阴性癌细胞递送给癌细胞混合的调节信号，并且使癌细胞进入停滞。

在该实验中，未分化的人类干细胞（BG01V/hOG（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA）生长在来自一组其他细胞的条件培养基中，从而证实通过递送给细胞属于两个不同生长标志的调节成分，干细胞也可以进入停滞。

在基本干细胞培养基上以8nM NM23-S120G（50%二聚物）培养如同单个细胞（更难生长）或如同成片群落（colony pieces）的未分化人类干细胞，基本干细胞培养基补充有：a）没有任何东西（对照）；b）来自MUC1*阳性T47D乳癌细胞的条件培养基（CM）；c）来自已经转染MUC1*的HCT-116细胞（MUC1*阴性）的条件培养基；或d）来自已经转染空载体的HCT-116细胞（MUC1*阴性）的条件培养基。图15中的表显示，在50/50基本培养基和来自MUC1*阳性癌细胞的条件培养基中培养的干细胞增殖良好，如同未分化的多能干细胞。要注意，如同单个细胞一样平板接种的干细胞在MUC1*癌细胞条件培养基中比单独在基本培养基中生长得更好。然而，当添加来自HCT-MUC1*转染子的条件培养基时，生长出现急剧的下降。此外，来自HCT-空载体细胞（MUC1*阴性）的条件培养基使细胞进入停滞，并且细胞不能增殖。在图16中拍摄并显示了在指示的培养基中5天后拍摄的所得到细胞的图像。

总之，当存在来自MUC1*阴性癌细胞（HCT）的条件培养基时，多能干细胞不能生长并且不能增殖，但是当存在来自MUC1*阳性细胞（T47D和HCT-MUC1*）的条件培养基时培养，多能干细胞会经受提高的增殖。这些结果与人类多能干细胞和MUC1*阳性癌细胞分享共同的由两个细胞类型分泌的因子调节的增殖程序的想法一致。用MUC1*转染的MUC1*阴性癌细胞分泌能够抑制干细胞生长的因子，争论用不同生长标志特定的调节成分的混合物处理细胞，能够防止细胞生长，并且使细胞进入停滞，接着细胞死亡，因此其能够用作抗癌症治疗。

实例12.将癌症亚型分类，这样能够阐明其生长调节成分的标志

生长调节成分的标志意味着调节具体细胞亚组（subset）增殖的核酸、微小RNA、基因或蛋白质的亚组，其中这些成分的表达水平显著不同于其在其他细胞类型中的水平。例如，对于乳癌的亚组，生长调节成分的标志是与由若干其他癌症类型组成的组相比较显著上调或下调的核酸、微小RNA、基因或蛋白质的集合。通过共培养细胞或在来自另一个类型的癌细胞的条件培养基中培养第一类型的癌细胞，能够将癌细胞分类为亚型，其增殖是由共同的调节成分控制的，例如微小RNA簇。当培养在第二类型的癌细胞的条件培养基中增殖没有受抑制或停滞的癌细胞，意味着这两个癌细胞类型是相同的类别，意思是其增殖受共同的生长调节成分的标志所控制。当第一类型的癌细胞不能在第二类型的癌细胞的条件培养基中生长时，意味着其属于不同的亚型组，并且其生长受到不同的微小RNA簇的调节。使用深度测序、RT-PCR、总转录组分析等等，能够确定控制每一个亚型生长的主导微小RNA。一个类型的主导（dominant）微小RNA或微小RNA簇能够用来治疗或预防其他类型的癌症。

这里引用的所有文献以参考方式将其全部内容并入。

本领域内技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验能够确定，许多相当于这里具体描述的本发明的具体实施例。这些对等物包括在权利要求的保护范围内。

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Claims (14)

1.组合物在制备用于治疗患有第一癌症亚型的患者的药物中的应用，所述组合物包括引起第二癌症亚型标志所独特的至少两种调节成分表达的试剂，其中所述第二癌症亚型标志不同于使所述患者受折磨的所述第一癌症亚型的癌症亚型标志，其中使所述患者受折磨的所述第一癌症亚型是MUC1*阳性癌症，并且所述第二癌症亚型标志所独特的所述调节成分来自于MUC1*阴性癌细胞，并且反之亦然，其中所述试剂是抑制NM23和MUC1*之间的相互作用的小分子。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述调节成分是RNA、微小RNA或蛋白质。

3.根据权利要求2所述的应用，其中所述微小RNA是微小RNA-145。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述调节成分的所述癌症亚型的癌细胞不能与所述患者的癌细胞共培养。

5.组合物在制备用于治疗患有癌症的患者的药物中的应用，所述组合物包括引起至少一种干细胞亚型标志所独特的至少两种调节成分表达的试剂，其中所述试剂是抑制NM23和MUC1*之间的相互作用的小分子。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述干细胞亚型标志是新分化的人类干细胞或分化过的细胞的亚型标志。

7.根据权利要求6所述的应用，其中所述干细胞是原始态干细胞。

8.根据权利要求5所述的应用，其中使所述患者受折磨的所述癌症是MUC1*阳性癌症，并且所述至少一种干细胞亚型标志所独特的成分来自于新分化的人类干细胞或分化过的细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述干细胞是原始态干细胞。

10.根据权利要求5所述的应用，其中所述调节成分是RNA、微小RNA或蛋白质。

11.根据权利要求10所述的应用，其中所述微小RNA是微小RNA-145。

12.组合物在制备用于治疗患有癌症的患者的药物中的应用，所述组合物包括引起至少一种增殖平稳期标志所独特的至少两种调节成分表达的试剂，其中所述试剂是抑制NM23和MUC1*之间的相互作用的小分子。

13.根据权利要求12所述的应用，其中所述调节成分是RNA、微小RNA或蛋白质。

14.根据权利要求13所述的应用，其中所述微小RNA是微小RNA-145。

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