KR101302711B1 - 인간 배아줄기세포에 결합하는 단일클론항체, 이를분비하는 하이브리도마 및 이를 이용한 미분화 인간배아줄기세포의 검출 또는 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미분화된 인간 배아줄기세포의 마커 단백질인 L1CAM의 이용에 관한 것이다. 보다 자세하게는, L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체를 분비하는 하이브리도마, 및 이를 이용한 미분화된 인간 배아줄기세포의 검출, 동정 및 분리 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규한 항체 4-63을 비롯한 L1CAM 단백질에 특이적인 항체들은 미분화상태의 인간 배아줄기세포 표면에서 발현하는 L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하므로, 이들을 이용하여 미분화된 인간 배아줄기세포의 특성을 정확히 분석하고, 이들이 분리된 인간 배아줄기세포를 세포 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

인간 배아줄기세포, 미분화, L1CAM, 단일클론항체

Description

인간 배아줄기세포에 결합하는 단일클론항체, 이를 분비하는 하이브리도마 및 이를 이용한 미분화 인간 배아줄기세포의 검출 또는 분리 방법{A monoclonal antibody specific to human embryonic stem sell, a hybridoma secreting the same and a method for detecting or isolating non-differenced embryonic stem cell}

본 발명은 미분화된 인간 배아줄기세포의 세포표면에 발현하는 마커 단백질 L1CAM, 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 상기 단일클론항체의 제조방법 및 상기 단일클론항체를 이용하여 미분화된 인간배아줄기세포를 확인하고 분리하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물의 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 크게 전분화능(pluripotency)을 갖는 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 다분화능(multipotency)을 갖는 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아줄기세포는 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 장차 태아를 형성할 세포내괴(inner cell mass)로부터 형성된 줄기세포로서 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다.

배아줄기세포 배양에 대해서는, 1981년 처음으로 생쥐의 배아 줄기세포 배양법이 확립된 후(Evans et al., Nature, 292: 151-156, 1981), 1996년 영장류에서의 전분화능 배아줄기세포 배양법(Thomson et al., Biol. Reprod., 55: 254-259, 1996)이 개발되었고, 1998년 미국의 톰슨(Thomson) 등에 의해 인간 배아줄기세포 배양법이 확립되었다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998). 인간 배아줄기세포는 세포 배양시 피더(Feeder)나 피더 세포배양액이 있는 상태에서 증식하여 배양이 가능하고, 또한 전분화능을 가지고 있으므로, 배상체(embryoid body, EB)를 형성시켜 분화를 유도하였을 때 다양한 모든 조직의 세포로 분화가 일어나게 된다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff, et al., Nat. Biotech.,18:399-404; Park, et al., Biol. Reprod. 69:2007-2014, 2003). 따라서, 질병이나 사고에 의한 특정 세포나 장기의 손상 시 줄기세포를 그 특정 세포로 분화를 유도하여 사용할 수 있을 것으로 기대됨에 따라, 세포치료방법은 여러 난치성 질환의 근원적 치료방법으로 부상하고 있다.

인간 배아줄기세포의 동정을 위해서는 자가재생산 및 전분화능 유지와 관련된 Oct-4, Nanog, Sox-2를 세포내 표식인자로 사용하고 있고, 세포 표면 마커로서 TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA3, SSEA4 등에 대한 항체를 사용하고 있다. 그런데 이런 항체들에 의해서 인식되는 분자들은 대부분 탄수화물 에피토프를 가지고 있거나 그 기능이 인간 배아줄기세포의 자가재생산이나 전분화능 유지에 필수적이지 않은 것으로 보고되었다(Badcock, et al., Cancer Res. 59:4715-4719, 1999; Kannagi et al., EMBO. J. 2:2355-2361, 1983; Brimble et al., Stem Cells 25:54-62, 2007). 따라서 미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 연구하거나 분리하기 위해서는 인간 배아줄기세포에서 발현하는 세포 표면 마커들의 발굴이 필요하다.

인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 다양한 기능성 세포들을 세포 치료법에 이용 시, 중요한 것은 우선 이들을 순수 분리해내고 실제 동물이나 인체 내에서 효능과 안전성을 확립하여야 하는 일이다. 그러나 인간 배아줄기세포는 생쥐 등에서 암을 형성하는 것으로 알려져 있어(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff, et al., Nat. Biotech., 18:399-404; Park, et al., Biol. Reprod. 69:2007-2014, 2003), 세포 치료를 위해 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 기능성 세포는 반드시 인간 배아줄기세포를 제거한 후에 세포 치료에 사용되어야 한다. 따라서 인간 배아줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 보다 많이 개발하면 인간 배아줄기세포의 특성을 정확히 분석하고 세포 치료시 인간 배아줄기세포를 제거하는데 유용하게 쓰일 수 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자는 인간 배아줄기세포를 배양하여 배양된 인간 배아줄기세포가 미분화된 상태의 인간 배아줄기세포임을 확인한 후, 이를 인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체의 제조에 이용하고, 상기 제조한 단일클론항체가 인간 배아줄기세포 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 뿐만 아니라, 상기 단일클론항체가 결합하는 인간 배아줄기세포 표면 단백질이 L1CAM임을 확인하여 L1CAM이 인간 배아줄기세포 미분화 유지에 관련된 마커 단백질임을 발견하고, 본 발명의 단일클론항체를 이용하여 인간 배아줄기세포를 분리하였다.

본 발명의 목적은 미분화된 인간 배아줄기세포의 마커 단백질인 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 항체를 분비하는 하이브리도마를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 미분화된 인간 배아줄기세포의 검출 또는 분리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 L1CAM에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 미분화된 인간 배아줄기세포의 제거 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 미분화된 인간 배아줄기세포의 세포표면 단백질인 L1CAM에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 “단일클론항체”란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다.

단일클론항체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al., European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.

본 발명의 단일클론항체는 10% SDS-PAGE에서의 분자량이 약 220kDa인 미분화된 인간 배아줄기세포 단백질에 특이적으로 결합한다.

구체적으로, 본 발명의 단일클론항체는 L1 cell adhesion molecule (L1CAM)을 인식한다(도 4).

당업자라면, 본 발명에 따른 단일클론항체가 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 카이메릭 항체, 인간화항체 및 인간 단일클론항체로 전환될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 단일클론항체는 예를 들어 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역, 특히 상보성 결정 영역(complementarity determining region : CDR)이나 상보성 결정 영역 중에서도 특이성 결정 잔기(selectivity determining residue : SDR) 등을 인간 항체에 이식하는 등의 공지의 방법을 사용하여 본 발명의 단일클론항체로부터 용이하게 제조가능하며 이러한 변이체가 본 발명의 범위에 속함은 당연하다.

또한 본 발명의 단일클론항체는, 상기한 바와 같은 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 미분화된 인간 배아줄기세포의 검출, 동정 및 분리에 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자는 미분화된 인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체를 생산하기 위해, 인간 배아줄기세포를 콜라게나제 효소를 사용하여 후속배양을 쉽게 하여 대량으로 배양하고 그 특성을 분석한 후, 배양 세포가 인간 배아줄기세포임을 확인한 후 이를 생쥐에 면역주사하는데 이용하였다.

구체적으로, 인간 배아줄기세포를 배양한 후 헤마톡실린과 에오신 염색으로 인간 배아줄기세포의 형태 및 알칼라인 포스파타제 발현을 상대비 현미경으로 관찰하고, 텔로머라제 활성 및 전분화능(pluripotency) 전사 마커를 RT-PCR을 이용한 Oct4, Nanog와 Sox2 발현을 측정하여, 배양 세포가 인간 배아줄기세포임을 확인하였다(도 1C). 또한, SSEA(stage specific embryonic antigen) 염색을 통하여, 인간 배아줄기세포에 음성마커인 SSEA1에 대한 항체는 상기 세포에 결합하지 아니하고, 양성마커인 SSEA3 및 SSEA4에 대한 항체는 결합한다는 것을 면역조직화학적 방법과 유세포 분석기로 확인하였다(도 1A, B 참조). 이에 비로소, 배아줄기세포 자체를 항원으로 사용하여 미분화된 인간 배아줄기세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체의 제조가 가능하게 되었다.

이어서, 상기 배양된 인간 배아줄기세포를 불활성화시킨 후 이를 사용하여 마우스를 면역화시키고 이로부터 분리한 비장세포를 암세포와 융합하여 제조한 하이브리도마로부터 단일클론항체 4-63를 분리 및 정제하고, 상기 항체의 인간 배아줄기세포에 대한 결합능을 확인하였으며(도 2A 참조), 생쥐 배아줄기세포와 생쥐 배아섬유아세포(MEF)에는 결합하지 않음을 확인하였다(도 2B). 또한 이 항체들이 인간배아줄기세포에서 분화된 배아체 및 레티노산을 처리하여 분화시킨 세포에서 결합능이 감소한다는 것을 확인하였다(도 6A, 6B). 또한, 10% SDS-PAGE를 수행한 결과, 단일클론항체 4-63은 분자량 약 220kDa의 인간 배아줄기세포의 단백질을 인식함을 확인하였고(도 3A), 또한 그 단백질은 L1 cell adhesion molecule (도 4, 도 3B)로 확인되었다.

또한, 상기 배양된 인간배아줄기세포를 미분화 상태일 때와 분화를 유도한 배상체(Embryoid body)상태일 때 전분화능과 관련된 전사 인자(Nanog, Oct4, Sox2), 삼배엽 마커인 Pax6(ectoderm), CD34(mesoderm), AFP(endoderm) 및 L1CAM의 발현 양상을 RT-PCR을 통해 분석하였다(도 7). 그 결과 L1CAM은 Nanog, Oct4 및 Sox2와 동일하게 인간 배아줄기세포의 미분화 상태에서는 발현하지만 분화된 배상체(EB)에서는 발현이 감소 되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 L1CAM이 인간 배아줄기세포의 미분화 마커임을 증명하는 것이다.

4-63 항체가 미분화상태의 인간배아줄기세포를 분리할 수 있는지 확인하기 위하여, 배양된 인간 배아줄기 세포주에 4-63 항체를 결합시킨 후 유세포 분석기를 이용하여 항체가 결합된 세포를 분리한 다음, 기존의 미분화 마커인 SSEA3와 미분화 마커가 아닌 SSEA1에 대한 항체의 결합여부를 확인하였다. 그 결과 4-63 항체로 분리된 세포들 중 98.2%의 세포에서 SSEA3가 발현되었으나 SSEA1은 발현되지 않음을 관찰하였다(도 8). 또한 SSEA3에 대한 항체가 결합된 인간 배아줄기세포를 분리한 후 L1CAM의 발현 여부를 분석하였을 때, SSEA3가 발현하는 세포중 96.8%가 L1CAM을 발현하는 것을 확인하였다(도 8). 이 결과는 L1CAM이 인간 배아줄기세포의 미분화마커이며 L1CAM에 특이적인 4-63 항체가 미분화 인간배아줄기세포의 분리 효과가 매우 탁월하여 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.

인간 배아줄기세포를 사용하여 단일클론항체를 제조한 본 발명과는 달리, 본 발명 이전 생쥐 배아 또는 인간 배아 암세포를 사용하여 인간 배아줄기세포를 인식하는 항체가 제조된 바 있으며, 이러한 항체로는 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA1-1-81이 있다(Shevinsky, et al., Cell 30:697-705, 1982; Dodd, et al., Nature 311:469-472, 1984; Andrews, et al., Hybridoma 3:347-361, 1984). 이들 항체는 인간 배아줄기세포와 결합하지만, 이러한 항체가 결합하는 항원은 단백질이 아닌 탄수화물을 포함하는 것으로서 그 생물학적 기능이 명확하지 않다. 따라서, 인간 배아줄기세포의 세포표면의 단백질 L1CAM에 결합하는 본 발명의 단일클론항체는 상기한 바와 같은 본 발명 이전에 개발된 항체와는 이들이 결합하는 항원이 명백히 상이한 항체이다.

또한, 본 발명자는 대한민국 특허출원 제10-2004-0105717호에서 인간 배아줄기세포의 세포 표면단백질에 특이적인 단일클론항체에 대해 개시한 바 있으나, 이들 단일클론항체 3-4B는 분자량 약 26kDa 및 47-235S는 분자량 약 47kDa의 인간 배아줄기세포의 단백질을 인식하는 것으로서 본 발명의 단일클론항체가 인식하는 항원인 L1CAM은 상기 단일클론항체의 그것과는 매우 상이하다.

따라서, 인간 배아줄기세포의 세포표면 단백질 L1CAM에는 특이적으로 결합하면서도 생쥐 유래의 세포에는 결합하지 않은 본 발명의 단일클론항체의 결합 특이성은 본 발명의 단일클론항체가 본 발명 이전에는 밝혀진 바 없는 새로운 단일클론항체임을 입증하는 것이다.

상기한 단일클론항체를 사용하여 미분화된 인간 배아줄기세포와 생쥐 배아줄기세포 및 생쥐 유래의 피더(feeder)와의 차이점 분석이 가능함으로, 본 발명의 단일클론항체는 인간 배아줄기세포의 분리에 중요하게 사용될 수 있다.

상기에서 알 수 있는 바와 같이, L1CAM 단백질이 미분화된 인간 배아줄기세포 표면에 발현된다는 사실은 이제까지 알려진 바가 없으며, L1CAM에 대한 항체를 이용하면 매우 높은 순도로 미분화된 인간 배아줄기세포를 분리해낼 수 있다. 따라서 본 발명의 단일클론항체는 미분화된 인간 배아줄기세포를 검출, 동정 및 분리하는 신규한 방법을 제공할 수 있으며, 이러한 항체를 통해 미분화된 인간 배아줄기세포가 제거된 분화된 기능성 세포를 제공하여 세포치료에 유용하게 사용할 수 있게 할 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기의 인간 배아줄기세포 표면 단백질인 L1CAM에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 4-63을 생산하는 하이브리도마를 제공한다.

구체적 일 실시예에서, 본 발명의 하이브리도마는 인간 배아줄기세포에 방사선을 조사하여 세포를 불활성화시키고; 상기 불활성화된 배아줄기세포를 생쥐의 복강에 주입한 후; 상기 생쥐의 비장에서 림파구를 분리하여; 및 상기 림파구를 골수종 암세포와 융합하여 제조되었다.

이중, 단일클론항체 4-63를 분비하는 하이브리도마를 각각 하이브리도마 4-63이라 명명하고, 이를 수탁번호 KCTC 10966BP로서 2006년 7월 13일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁하였다.

단일클론항체를 분비하는 하이브리도마는 이를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.

구체적 일 실시예에서, 본 발명의 단일클론항체의 대량 생산을 위해 하이브리도마를 생쥐의 복강에 주사하여 복수액에서 배양하고. 이를 단백질 G-세파로스(sepharose) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 인간 배아줄기세포의 L1CAM 단백질에 결합하는 항체, 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편을 이용하여 미분화 인간배아줄기세포를 검출 또는 분리하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 또 다른 양태로서, 인간 배아줄기세포의 L1CAM 단백질에 결합하는 항체, 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편을 이용하여 미분화 인간 배아줄기세포를 제거하는 방법에 관한 것이다.

구체적인 일 양태에서, 본 발명에서는 L1CAM에 특이적인 항체, 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편을 이용하여 항원-항체 복합체 반응을 통해 미분화된 인간 배아줄기세포를 특이적으로 검출, 분리 또는 제거할 수 있다. 또한, L1CAM에 특이적인 항체는, L1CAM에 특이적인 단일클론항체뿐만 아니라 이의 카이메 릭, 인간화항체 및 인간 단일클론항체를 모두 포함한다. 한편, L1CAM에 특이적인 항체의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편은 상기 본 발명의 단일클론항체에서 언급한 바와 동일하다. 바람직하게는 본 발명의 미분화 인간 배아줄기세포의 검출 또는 분리 방법에서 사용되는 L1CAM에 특이적인 항체는 본 발명의 단일클론항체인 4-63이다.

항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, L1CAM 단백질은 미분화된 인간 배아줄기세포의 신규한 마커이며, 따라서, 예를 들어 본 발명의 단일클론항체와 같이 L1CAM 단백질과 결합하는 물질을 사용하는 경우, 이들은 미분화된 인간 배아줄기세포 표면의 L1CAM과 결합할 수 있으므로, 인간 배아줄기세포의 분화 여부를 판별하거나 미분화 인간 배아줄기세포를 검출, 분리 또는 제거하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 인간 배아줄기세포의 배양 및 배아줄기세포의 미분화상태 확인

<1-1> 인간 배아줄기세포의 배양

본 발명자들은 인간 배아줄기세포를 특이적으로 인식할 수 있는 새로운 단일클론항체를 제조하기 위하여, 먼저 인간 배아줄기세포 Miz-hES1(Park, et al., Biol. Reprod. 69:2007-2014, 2003), HSF6(Abeyta, et al., Human Mol. Genet 13:601-608, 2004)를 성삼의료재단 미즈메디병원, 미국 국립보건연구원(NIH)에서 H1과 H9 세포주, 서울대의과대학에서 SNU-hES3를 분양받아, DMEM(Dulbecco's modified Eagle`s medium)/F12(Gibco, Rockville, MD, USA), 20%의 넉아웃(Knockout) SR(Gibco), 0.1 mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol)(Sigma, St Luis, MO, USA), 2 mM의 글루타민(glutamine)(Gibco), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Gibco), 100 U/㎖의 페니실린(penicillin) G(Sigma), 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin) (Sigma), 4 ng/㎖의 bFGF(Gibco Invitrogen) 배지에서 인간 배아줄기세포를 배양한 후, 5-7일 간격으로 2차 배양(subculture)을 수행하였다.

구체적으로, 0.1%의 젤라틴(gelatin) 용액으로 37℃에서 10분 동안 12-웰(well)의 조직배양용 플레이트(Nunclon)를 코팅한 후, 4500 rad 감마 방사선을 조사한 MEF(mouse embryonic fibroblast, 한국생명공학연구원 실험동물실)를 웰당 6.5 × 10⁴ 세포 수로 접종하였다. 상기 방사선이 조사된 MEF는 성장하지는 않지만, 인간 배아줄기세포의 성장을 지지하는 세포이다. MEF 배양 24시간 후에 5-7일 된 인간 배아줄기세포 조직에 37℃에서 1시간 동안 1 ㎎/㎖의 콜라겐분해효소(collagenase) Ⅳ(Gibco)를 처리한 후, 상기 줄기세포를 적당한 크기로 자른 후 상기에서 준비한 MEF 조직배양용 플레이트에 옮기고, 48시간 후부터 매일 배양액을 교체하며 배양하였다.

<1-2> 배양한 인간 배아줄기세포의 미분화상태 확인

상기 실시예 <1-1>의 방법으로 배양한 6-7일 배양된 인간 배아줄기세포를 헤마토실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosine) 염색으로 관찰한 결과, MEF 세포와 뚜렷한 경계를 형성하고 모든 세포들이 밀접하게 연결되어 평평한 구형태의 한 덩어리를 형성하며 성장하였으며, 이는 인간 배아줄기세포의 특징적 형태를 나타냄을 확인하였다(도 1A-1). 상기 배양한 세포가 미분화상태를 유지하고 있는지를 확인하기 위하여, 알칼라인 포스파타제(Alkaline phosphatase, AP) 염색 키트(AP staining kit; Sigma)를 사용하여 염색한 결과 AP가 발현되고 있음을 확인하여 미분화상태를 확인하였다(도 1A-2).

또한 상기 배양세포를 SSEA(stage specific embryonic antigen) 염색한 결과, 음성대조군 마커인 SSEA1에 대하여는 음성이고, 양성대조군 마커인 SSEA3 및 SSEA4에 대하여는 양성임을 확인하여 미분화상태에 있음을 확인하였다(도 1A의 3, 4 및 5). 또한, 생쥐 배아섬유아세포에서는 발현되지 않는 Oct4 유전자가 인간 배아줄기세포에서는 발현되는 것을 확인하기 위하여, Oct4, Nanog와 Sox2 유전자에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용한 RT-PCR 및 RNA 정량을 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 β-액틴(actin) 프라이머를 이용한 RT-PCR을 수행하였다. 이들 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.

	Primer Name		Sequence
1	Nanog	Forward	TGCCTCACACGGAGACTGTC
		Reverse	TGCTATTCTTCGGCCAGTTG
2	Oct4	Forward	CGACCATCTGCCGCTTTGAG
		Reverse	CCCCCTGTCCCCCATTCCTA
3	SOX2	Forward	TACCTCTTCCTCCCACTCCA
		Reverse	ACTCTCCTCTTTTGCACCCC
4	L1CAM	Forward	ACGGGCAACAACAGCAAC
		Reverse	CGGCTTCCTGTCAATCATG
5	Pax6	Forward	AACAGACACAGCCCTCACAAACA
		Reverse	CGGGAACTTGAACTGGAACTGAC
6	CD34	Forward	TGAAGCCTAGCCTGTCACCT
		Reverse	CGCACAGCTGGAGGTCTTAT
7	AFP	Forward	CCATGTACATGAGCACTGTTG
		Reverse	CTCCAATAACTCCTGGTATCC
8	GAPDH	Forward	ACCACAGTCCATGCCATCAC
		Reverse	TCCACCACCCTGTTGCTGTA

상기 PCR을 수행한 후, 그 산물을 1.5%의 아가로스 겔에서 전기영동함으로써 Oct4, Nanog, Sox2 유전자의 발현을 확인하여 미분화상태에 있음을 확인하였다(도 1B). 상기 도 1B에서 MEF는 생쥐 배아섬유아세포이고, H9, HSF6와 SNU-hES3는 인간 배아줄기세포를 나타낸다.

상기 미분화상태의 인간배아줄기세포를 생쥐에 면역하여 하이브리도마를 제조하였다.

< 실시예 2> 생쥐 하이브리도마의 제조

상기 실시예 <1-1>의 방법으로 배양한 인간 배아줄기세포 Miz-hES1을 콜라겐분해효소 Ⅳ로 처리하여 분리하고, 약 2 × 10⁶의 세포를 100 ㎕의 PBS에 부유한 후 γ-방사선 조사하여 상기 줄기세포를 불활성화시킨 뒤, Balb/c 생쥐의 복강에 주사하였다. 3주 간격으로 3회 반복투여하고 세포융합 3일 전에 다시 주사하였다.

피더(feeder) 세포를 채취하기 위하여, 세포융합 하루 전에 건강한 생쥐의 복막에 DMEM(GIBC0) 배지를 20 ㎖을 채웠다 다시 빨아내는 방법으로 복강 내에 있는 세포를 채취한 다음 원심분리하고, 또 정상 비장을 갈아서 세포를 추출하여 이 둘을 섞은 다음 20% 우태아혈청을 넣고 웰당 10⁵개의 세포가 되도록 96웰 플레이트에 분주하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 2주 전부터 비장세포와 융합할 NS1 골수종(myeloma) 세포주(ATCC, USA)도 RPMI1640(GIBCO사)과 10%의 우태아혈청을 혼합한 배지에서 배양하였다.

인간 배아줄기세포로 면역시킨 생쥐에서 비장을 꺼내 RPMI1640(GIBCO사)으로 잘 씻고 유리봉으로 페트리 디쉬에서 잘 분쇄하고 세포 부유물을 15 ㎖ 튜브에서 방치하여 찌꺼기가 가라앉으면 상층액을 새 튜브로 옮겨두었다. NS1를 원심분리하여 수확하고 10 ㎖의 RPMI1640에 현탁하여 위의 비장세포와 함께 세포수를 계수하였다. 10⁷개의 NS1와 10⁸개의 비장세포를 50 ㎖ 튜브에 옮겨 섞은 다음 200 × g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 37℃ 물이 채워진 비이커에 2분간 두었다. 튜브를 가볍게 쳐서 세포를 부드럽게 만들고 37℃ 물에 담근 상태로 천천히 흔들면서 1 ㎖의 PEG용액(GIBCO사)을 1분 동안 첨가하였다. 100× g로 2분 동안 원심분리하고 5 ㎖의 RPMI1640 용액을 3분에 걸쳐 서서히 넣고, 다시 5 ㎖의 RPMI1640 용액을 2분에 걸쳐 서서히 넣은 다음 200 × g로 원심분리하여 세포들을 회수하고 30 ㎖의 정상 배지(RPMI1640 + 20% 우태아혈청)에 조심스럽게 현탁하였다. 37℃, CO₂ 배양기에서 30분간 방치한 후 미리 배양하여 둔 MEF 세포(피더(feeder) 세포)가 깔린 96웰 플레이트에 웰당 70 ㎕씩 10⁵개의 세포가 되도록 분주하여 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 다음 날 70 ㎕ HAT를 더하고 3일 간격으로 HAT 배지에서 2주 이상 키우면서 자라는 콜로니를 관찰하였다.

항체가 발현되는 클론을 선발하기 위하여 샌드위치(sandwich) ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체를 2 ㎍/㎖로 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양액 100 ㎕을 첨가해 37℃에서 1 시간 반응시키고, 다시 항-마우스 IgG 또는 IgM의 HRP(horseradish peroxidase, Sigma사)의 1/5,000 희석액과 1시간 더 반응시켰다. 0.05%의 트윈 20을 첨가한 인산완충액으로 플레이트를 세척하고, OPD(Sigma사)와 H₂O₂가 포함된 기질 용액을 첨가하고, 492 ㎚에서 흡광도를 측정하여 항체를 생산하는 클론을 먼저 선발하였다.

< 실시예 3> 인간 배아줄기세포에 결합하는 단일클론항체의 분리

<3-1> 인간 배아줄기세포에 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 클론의 선발

상기 실시예 2의 방법으로 제조한 클론 중에서, 비교적 안정하게 항체들을 분비하는 하이브리도마 상층액의 인간 배아줄기세포에 대한 결합능을 조사하였다. 구체적으로, 배양된 인간 배아줄기세포를 콜라젠 분해효소 Ⅳ로 분리하고 다시 세포분리 완충액(GIBCO)으로 20분 37℃에서 처리하여 단일세포로 분리한 뒤, 40 μm 스트레이너(strainer)를 통과시켜 2 × 10⁵ 세포를 플로우 사이토미트리(Flow cytometry)에 사용하였다. 먼저 단일세포화된 인간 배아줄기세포를 PBA(1%의 BSA 를 PBS에 용해)에 부유시키고 항체 상층액을 4℃에서 30분간 반응시켰다. 4℃에서 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액 100 ㎕을 제거하고 여기에 항-마우스 Ig-FITC(BD)를 200배 희석하여 4℃에서 30분 반응시킨 다음 2회 PBA로 세척하고 프로피디움 요오다이드(Propidium Iodide, PI) 음성인 세포들만 골라 FACS 칼리버(caliber)로 인간 배아줄기세포에 대한 결합능을 분석하였다.

그 결과, 인간 배아줄기세포에 결합하는 항체를 분비하는 다양한 하이브리도마들을 선발하고 계대배양을 계속하며 서브클로닝하여, 확실하게 안정성을 유지하고 인간 배아줄기세포에 대한 특이성을 유지한 항체 4-63를 분비하는 하이브리도마를 선발하였다.

상기 단일클론항체 4-63를 분비하는 하이브리도마를 하이브리도마 4-63(수탁번호: KCTC 10966BP)라 명명하고, 이를 2006년 7월 13일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 기탁하였다.

<3-2> 단일클론항체의 정제

상기 실시예 <3-1>에서 선별한 하이브리도마 4-63로부터 4-63 항체를 정제하였다.

구체적으로, 4-63 항체를 정제하기 위하여, 일주일 전에 0.5 ㎖의 프리스탄(pristane) 접종한 Balb/c 생쥐의 복강에 상기 하이브리도마 세포 1X10⁷을 0.5 ㎖의 PBS에 용해시켜 주사하고, 주사 10-14일 후 주사기로 복수를 추출하고, 상기 복수를 원심분리하여 상층액만 모았다. 상기 복수액 1 ㎖에 PBS을 첨가하여 2 ㎖로 희석시켰다. 또한, 1 nM의 EDTA와 0.02%의 NaN₃을 상기 복수액에 첨가하고, 0.22 ㎛ 여과기로 여과하였다. 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)을 사용하여 4℃에서 2시간 동안 회전하면서 항체를 결합시키고 컬럼을 똑바로 세워서 혈청 분리관을 이용하여 컬럼의 벽면을 세척액(0.5 M의 NaCl, 0.1 M의 Tris, pH 8.0)으로 세척하고, 컬럼을 페리스타틱 펌프(peristatic pump)에 연결하여 세척액으로 충분히 세척하였다. 세척 완료 후, 0.2 M의 글리신(glycin)-HCl(pH 2.7)으로 항체를 용출하였다. 이때, 미리 준비한 1 M의 Tris(pH 9.0)를 포함한 튜브에 상기 용출액을 완충시켰다. 그리고 PBS(pH 7.4)에서 4회 반복하면서 투석한 후 항체를 -20℃에 나누어서 보관하였다.

< 실시예 4> 4- 63항체의 미분화상태의 인간배아줄기세포에 대한 결합 능력

상기 실시예<3-2>에서 정제한 4-63 항체의 인간 배아줄기세포에 대한 결합능을 형광 세포염색을 통하여 상기 실시예<3-1>과 동일한 방법으로 조사하였다(도 2A). 배아줄기세포는 H9, SNU-hES3 및 HSF6 세종류를 사용하였으며, 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것이며, SSEA1는 인간 배아줄기세포에 결합하지 않는 항체(음성대조군)이고, SSEA3, SSEA4는 인간 배아줄기세포에 결합하는 항체(양성 대조군)이다. 도 2A에서 파란 실선은 단일클론항체 4-63으로 각각의 인간배아줄기세포에서 형광 세포염색을 수행한 것으로 세 가지 인간배아줄기세포에 4-63이 결합하는 것을 보여 준다.

또한, 생쥐 배아줄기세포(J1)(Li. et al., Cell, 69:906-915, 1992), 생쥐 배아섬유아세포(MEF)를 DMEM(GIBCO) 과 10%의 우태아혈청에서 배양한 후 콜라겐분해효소 Ⅳ로 분리하였다. 상기 4-63 항체를 상기와 동일한 방법으로 생쥐 배아줄기세포(J1), 생쥐 배아섬유아세포(MEF)에 대한 결합능을 확인하기 위하여, 형광 세포염색으로 플로우 사이토미트리를 수행하였으며(도 2B), 그 결과 4-63 항체가 J1, MEF에는 결합하지 않음을 확인하였다.

또한, 4-63 항체와 공지의 미분화된 인간배아줄기세포 표면 마커인 TRA-1-81에 대한 항체를 인간배아줄기세포 H9, SNUhES3 및 HSF6에 가하여 형광염색 하였을 때, 두 항체가 모두 세포 표면에서 co-localized 되는 것을 확인하였다(도 2C). 위의 도2 결과들은 4-63 항체가 미분화된 인간배아줄기세포에 결합함을 증명하는 것이다.

< 실시예 5> 4-63 항체가 결합하는 항원의 분리 및 동정

< 실시예 5-1> 면역침강법에 의한 4-63 항체가 결합하는 항원의 분리

단일클론항체 4-63가 인식하는 인간 배아줄기세포의 세포표면 마커를 분리하기 위하여 먼저 배양한 인간 배아줄기세포 SNU-hES3를 PBS로 세척하고 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Rockford, IL)로 바이오틴화(biotinylation)시키고 세포를 용해용액 (25mM Tris-HCl, pH 7.5, 250mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 2 g/ml aprotinin, 100 g/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 g/ml leupeptin)으로 4℃에서 20분 동안 용해시키고 핵은 원심분리로 제거하였다. 단백질 농도는 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 검정 키트(Pierce)를 사용하여 결정하였다. Protein G plus-Sepharose (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz)에 비특이적으로 결합하는 단백질은 세포용해액을 20 μl의 Protein G plus-sepharose와 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 상층액만 회수하여 제거하고, 회수한 상층액은 다시 약 1 mg의 항체와 4℃에서 12시간 동안 반응시키고 여기에 다시 20 μl의 Protein G plus-sepharose를 더해 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물을 세포용해액으로 10회 이상 세척하고 남아있는 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분리하였다. 이 단백질을 니트로셀룰로즈 막에서 웨스턴 블럿을 수행하였다. 니트로셀룰로즈 막을 5% 탈지유(skim milk)을 넣은 PBST(PBS + 0.1% Tween 20)에서 1시간 반응시키고 다시 PBST로 두차례 이상 세척한 후 Streptavidin-HRP(horseradish peroxidase) 결합체 (1:1,500 Amershambiosciences)로 1 시간 동안 반응시켰다. PBST로 5차례의 세척 후에 바이오친 표지된 단백질을 ECL 검출 시약(Amersham biosciences)로 발색시켰다. 그 결과, 단일클론항체 4-63이 분자량 약 220 kDa 크기의 단백질에 결합함을 확인하였다(도3A). 그리고 다시 위와같이 H9, HSF6, SNU-hES3를 바이오틴 표지없이 위의 세포용해액으로 녹인 후 위와 같은 방법으로 4-63과 5G3(상업적으로 판매되는 L1CAM 단일클론항체)으로 면역 침강을 하고 면역침강된 화합물을 10% SDS-PAGE로 전개 한 후 웨스턴 블러팅 하였다. 니트로셀룰로즈 막에 biotin 표지된 항체 4-63을 1차 항체로 하고 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)을 사용하여 4-63으로 면역침강된 단백질을 검출하였다. 다시 예상하였던 약 220 kDa 단백질이 세 종류의 인간배아줄기세포에서 검출되는 것을 확인하였다(도 3B).

< 실시예 5-2> 4-63 항체가 결합하는 항원의 분리 및 동정

면역 침강 되는 단백질을 모으기 위해 1×10⁸ SNUhES3 세포에서 얻은 세포용해액을 실시예 5와 같은 방법으로 면역 침강법을 수행하였다. 10% SDS-PAGE를 수행하고 이 젤을 Coomassie G250 (Biorad)으로 염색하였다. 4-63에 의해 면역 침강된 단백질을 포함하는 SDS 젤을 Comassie G250 (BIO-RAD)으로 공급자의 프로토콜에 따라 염색하였다. 단백질이 포함된 부분을 잘라내고 30% 메탄올로 5분 동안 세척하고 잘게 부셨다. 젤 부스러기를 30% 메탄올로 염색이 완전히 탈색될 때까지 반응시키고 난 후, 절 부스러기는 100% 아세토니트릴로 10 분 동안 수분을 제거하고 30분 동안 진공 원심분리기에서 말렸다. 젤 부스러기에 300ng의 트립신(Promega), 50mM 중탄산암모늄 용액을 넣어 16 시간 동안 37℃에서 반응시켜 단백질을 절단시켰다. 잘린 펩타이드를 3차례에 걸쳐 100 μl의 50 mM 중탄산암모늄으로 추출해내고 진공 원심분리기에서 말렸다. 펩타이드 혼합물은 Q-TOF micro (MicroMass)에서 ESI Q-TOF MS/MS (electrospray quadrupole time of flight tandem mass spectrometry)로 분석하였다(도 4). 그 결과 4-63이 인식하는 이 단백질이 L1 cell adhesion molecule isoform 2 precursor임을 확인하였다. 도4에서 밑줄 친 부분은 실제로 아미노산 서열이 Q-TOF에서 밝혀진 것을 표시한 것이다.

4-63 항체가 L1CAM에 결합하는지 확인하기 위하여, L1CAM에 대한 공지의 단일클론항체 5G3(BD)를 사용하여 SNU-HES3 세포 추출물을 면역 침강시켜 얻은 침전물들을 10% SDS-PAGE에서 전개시키고 웨스턴 블럿팅 한 후 비오틴(biotin) 표지 시킨 항체 4-63을 1차 항체로 사용하고 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)를 사용하여 면역침강된 단백질들을 ECL로 검출하였다. 그 결과 5G3이 면역침강시킨 L1CAM 단백질에 바이오틴 표지된 4-63 항체가 결합함을 확인하였다(도3B). 이 결과는 4-63의 타겟 항원이 L1CAM임을 증명한다.

< 실시예 6> 4-63 항체가 인식하는 L1CAM 의 도메인 결정

L1CAM은 6개의 면역글로불린 유사 도메인(Ig domain)들과 5개의 파이브로넥틴 타입 III (fibronectin type III) 도메인들로 구성되어 있다. 4-63 항체가 L1CAM의 어느 도메인에 결합하는지를 확인하기 위하여 L1CAM의 deletion mutant들을 제조하고 이들에 대한 4-63 항체의 결합능을 조사하였다. 공지의 항체인 UJ127및 5G3도 조사하여 4-63 항체와 비교하였다.

< 실시예 6-1> L1 면역글로불린 도메인( Ig )- Fc 와 L1 파이브로넥틴 타입 III 도메인( Fn )- Fc 융합 단백질 발현

L1 면역글로불린 도메인(Ig)-Fc를 발현시키기 위한 발현벡터를 제작하기 위해서 pJK-dhfr2-L1-monomer(출원번호 10-2006-0079969) DNA를 주형으로 L1 Ig 양 말단 프라이머 L1-Igdom-F (5'-GAG GAG GAA TTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG-3') 와 L1-Igdom-R (5'-CTC CCC CTC GAG CGG CCC AGG GCT CCC CAC CAC CAA GAG CTG-3')를 사용 하여 95℃에서 5분 동안 전처리 반응 후, 95℃, 45초/58℃, 45초/72℃, 2분 동안 30회 DNA 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 시키고, 72℃에서 10분간 후처리 조건으로 중합효소반응을 수행하여 증폭하였다. 중합효소는 염기서열의 오류를 위해 pfu polymerase(Solgent co.)를 사용하였다.

증폭된 L1 면역글로불린 도메인 DNA단편을 pJK-dhfr2-FC 발현벡터(Aprogen)에 삽입하기 위해서 벡터와 증폭된 DNA단편을 EcoRI과 XhoI 효소로 각각 절단하여 1% 아가로스젤에 전기 영동하여 해당되는 단편을 오려내어 Gel purification kit (Intron co.)를 사용하여 회수하였다. 회수된 두 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제 (Roche)를 이용하여 16℃에서 12시간 반응하여 대장균 (E. coli DH5α)에 heat shock법을 이용하여 형질 전환시켰다. 형질전환된 세포로부터 DNA를 분리하여 L1 면역글로불린 도메인 발현벡터인 pJK-dhfr2-L1Ig-Fc를 제작하였다.

L1 파이브로넥틴 타입 III 도메인(Fn)-Fc를 발현시키기 위한 발현벡터를 제작하기 위해서 pJK-dhfr2-L1-monomer(출원번호 10-2006-0079969) DNA를 주형으로 L1 시그날 펩타이드 부분 양 말단 프라이머 Fn-leader-F (5'-GA GGA GGA ATT CCG GCG CCG GGA AAG ATG GTC GTG GCG -3') 와 Fn-Leader rcm-R (5'-CAC CGG CCC AGG GCT CCC CAT CAC ATG GTG TCC TTC-3')를 사용하여 위와 같은 조건으로 PCR을 수행하한 후 얻어진 L1 시그날 서열 단편을 아가로스 젤로부터 회수하였다.

또한, 같은 pJK-dhfr2-L1-monomer DNA를 주형으로 L1 Fn 양 말단 프라이머 Fn-dom rcm-F (5'-GAA GGA CAC CAT GTG ATG GGG AGC CCT GGG CCG GTG CCA-3')와 Fn-dom-R (5'-CTC CCC CTC GAG GAG CCT CAC GCG GCC TGT GCC ATT GGT CTT-3')를 사용하여 PCR을 수행한 후 L1 Fn 단편을 회수하였다. 회수된 L1 시그날 서열 단편과 L1 Fn 단편을 동량 섞은후 Fn-leader-F와 Fn-dom-R 를 사용하여 다시 PCR을 수행 하였다. 증폭된 L1 시그날 서열-Fn DNA단편을 EcoR I과 Xho I 효소로 절단하여 JK-dhfr2-FC 발현벡터(Aprogen)의 EcoRI-XhoI 위치에 클로닝하여 pJK-dhfr2-L1Fn-Fc를 제작하였다.

L1 Ig-FC와 L1 Fn-Fc 융합 단백질을 발현시키기 위해서 pJK-dhfr2-L1 Ig-FC나 pJK-dhfr2-L1Fn-Fc DNA를 HEK293T (ATCC NO., CRL11268) - 이하 293T라 한다 - 에 각각 발현시켰다. 이를 위하여, 500㎕의 Opti-MEM 배지(Gibco BRL)에 Lipofectamine 2000(Invitrogen)과 상기 발현벡터 20㎍을 각각 섞어 넣어서 5분간 상온에서 반응시킨 후, 두 반응액을 합치고 15분간 상온에서 다시 반응시켰다. Lipofectamine 2000과 DNA를 반응시킨 용액에 Opti-MEM 배지 4㎖을 넣고 섞어준 뒤, 이를 293T 세포가 있는 배양용기에 조심스럽게 넣어주고, 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 6시간 배양 후, 5㎖의 DMEM에 10% FBS가 포함된 배지를 다시 첨가하여주고 3일 동안 배양하였다.

< 실시예 6-2> 웨스턴블럿팅

293T 세포에서 L1 Ig-FC를 발현시킨 세포 배양액과 L1 Fn-Fc를 발현시킨 세포 배양액을 각각 7.5% SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 분리하였다. 이 단백질을 니트로셀룰로즈 막으로 옮겨 웨스턴 블럿을 수행하였다. 상기 니트로셀룰로즈 막에 4-63 항체나 공지 항체인 UJ127(Chemicon)이나 5G3(Pharmingen)항체를 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 TBST(TBS + 0.05% Tween 20) 완충용액으로 세 차례 세척하였다. 항-마우스 IgG의 horseradish peroxidase (HRP) conjugate (1:5000 Sigma)를 가하고 1 시간 반응시켰다. 다시 TBST 완충용액으로 5차례의 세척 후, ECL 검출 시약(Amersham biosciences)로 발색시켰다. 그 결과, 4-63 항체와 공지의 5G3는 약 140 kDa 크기의 Ig-Fc에 결합하고, 공지의 UJ127 항체는 약 140kDa 크기의 Fn-Fc에 결합함을 확인하였다 (도 5A)

< 실시예 6-3> L1 Ig 도메인의 mutants 제작 및 4-63 항체가 결합하는 도메인 확인

6개의 L1 Ig 도메인 중 첫 번째~다섯번째(1-5), 첫 번째~네번째(1-4), 첫 번째~세번째(1-3), 첫 번째~두번째(1-2), 또는 첫 번째(1) 도메인만 발현하는 발현벡터를 각각 제작하기 위하여 상기 pJK-dhfr2-L1Ig-Fc 클론을 주형으로 프라이머 L1-Igdom-F (5'-GAG GAG GAA TTC CGG CGC CGG GAA AGA TGG TCG TGG CG-3')와 L1-Ig5dom-R (5'-CTC CCC CTC GAG TTT CTT CTC GAT TGT GCT GCG-3'), L1-Ig4dom-R (5'-CTC CCC CTC GAG GAC AAC GTA GAT GTA GGC ATT-3'), L1-Ig3dom-R (5'-CTC CCC CTC GAG CTC CAC GGT GAC ATA GTA CGC-3'), L1-Ig2dom-R (5'-CTC CCC CTC GAG CTT GAC CCG GAG GTC AAT GGG-3'), 또는 L1-Ig1dom-R (5'-CTC CCC CTC GAG CTC GGC CAT GAG CCG GAT CTC-3')를 사용하여 각각 PCR을 수행한 후 증폭된 DNA단편을 EcoR I과 Xho I 효소로 각각 절단하여 JK-dhfr2-Fc 발현벡터(Aprogen)의 EcoRI-XhoI 위치에 클로닝하여 각각pJK-dhfr2-L1Ig1-5dom-Fc, pJK-dhfr2-L1Ig1-4dom-Fc, pJK-dhfr2-L1Ig1-3dom-Fc, pJK-dhfr2-L1Ig1-2dom-Fc, pJK-dhfr2-L1Ig1dom-Fc를 제작하였다.

L1의 Ig1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1 도메인에 Fc가 융합된 단백질을 얻기 위하여 상기의 발현벡터를 각각 293T 세포에 발현시킨 후, 각 세포배양액을 4-63 항체나 5G3항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행한 결과, 4-63 항체는 L1의 첫번째 Ig 도메인을 포함한 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 도메인-Fc 융합 단백질에 모두 결합하였다(도5B). 이 결과는 4-63 항체가 L1의 첫 번째 도메인에 결합함을 말해준다. 반면, 5G3는 첫 번째 도메인을 제외한 1-5, 1-4, 1-3, 1-2에 결합하여 L1의 두 번째 도메인에 결합함을 함을 확인하였다(도 5C). 이 결과는 4-63 항체가 UJ127과 5G3와는 다른 항체임을 말해준다.

< 실시예 7> 미분화상태의 인간배아줄기세포 표면에서 L1CAM 의 발현 여부 분석

인간배아줄기세포를 상기처럼 콜라겐 분해 효소로 분리하고 분리된 인간 배아줄기세포 덩어리를 깨어지지 않게 조심하여 박테리아 플레이트(bacteria plate)에 잘 옮겨 EB 배양액(Dulbecco's modified Eagle`s medium(DMEM)/F12(Gibco), 20%의 FBS(Fetal bovine serum, hyclone), 0.1 mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol, Sigma), 2 mM의 글루타민(glutamine, Gibco), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Gibco), 100 U/㎖의 페니실린 G(Sigma), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin, Sigma)에서 EB(embryoid body)를 형성할 수 있도록 4일간 배양하였다. 이때, 매일 배양액과 플레이트를 교체하여 주었다. 이렇게 EB로 분화시킨 인간배아줄기세포를 항체 4-63을 사용하여 실시예 <3-1>처럼 FACS로 분석하였다. 그 결과, 인간 배아줄기세포의 미분화 마커인 SSEA3, 4 발현이 급격히 감소하는 것처럼 4-63에 의해 인지되는 L1CAM의 발현도 급격히 감소하였다(도6A).

인간배아줄기세포는 레티노산(Retinoic acid)을 처리하면 미분화능을 잃고 분화되는 성질이 있으므로(Henderson, et al., Stem Cells 20:329-337, 2002) 4일째 배양된 H9 배지에 10^-5 M 레티노산을 8일 동안 처리하거나 하지 않은 다음 세포를 떼서 항체로 위 실시예 <3-1>처럼 FACS 분석을 하였다(도 6B). 그 결과 분화된 세포에서는 그 결합능이 감소함을 확인할 수 있으며, 이런 결과는 항체 4-63이 인식하는 L1CAM이 미분화 인간배아줄기세포에 특이적으로 발현함을 말해준다.

이어서, 상기 배양된 인간배아줄기세포를 미분화 상태일 때와 분화를 유도한 배상체(Embryoid body)상태일 때 전분화능과 관련 전사 인자(Nanog, Oct4, Sox2), 삼배엽 마커인 Pax6(ectoderm), CD34(mesoderm), AFP(endoderm) 및 L1CAM의 발현 양상을 RT-PCR을 통해 분석하였다(도 7). RT-PCR을 수행하기 위하여 H9, HSF6 그리고 SNU-hES3 세포와 각 세포에서 유도한 배상체(EB 6일, 12일)를 TriZol reagent를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 5 μg을 Invitrogen(SuperScriptTM III first-strand systhesis system for RT-PCR)사의 RT-PCR 키트의 방법에 따라 각각의 cDNA를 합성하였고, 표 1에 나타낸 미분화 전사 마커와 분화 마커의 프라이머로 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 L1CAM은 Nanog, Oct4, Sox2와 동일하게 인간 배아줄기세포의 미분화 상태에서는 발현하지만 분화된 배상체(EB)에서는 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 L1CAM이 인간 배아줄기세포의 미분화 마커임을 증명하는 것이다.

< 실시예 8> 4-63 항체를 이용한 미분화 인간 배아줄기세포의 분리

4-63 항체가 미분화상태의 인간배아줄기세포를 분리할 수 있는지 확인하기 위하여, 배양된 인간 배아줄기세포주 H9에 4-63 항체를 결합시킨 후 유세포 분석기(BD FACSAria cell sorter)를 이용하여 항체가 결합된 세포를 분리한 다음, 기존의 미분화 마커인 SSEA3와 분화 마커인 SSEA1에 대한 항체의 결합여부를 확인하였다. 그 결과 4-63 항체로 분리된 세포들 중 98.2 %의 세포에서 SSEA3가 발현되었으나 SSEA1은 발현되지 않음을 관찰하였다(도 8). 또한 SSEA3에 대한 항체가 결합된 인간 배아줄기세포를 분리한 후 L1CAM의 발현 여부를 분석하였을 때, SSEA3가 발현하는 세포중 96.8%가 L1CAM을 발현하는 것을 확인하였다(도 8). 이 결과는 L1CAM이 인간 배아줄기세포의 미분화 마커이며 L1CAM에 특이적인 4-63 항체가 미분화 인간배아줄기세포의 동정 및 분리에 유용하게 사용할 수 있음을 증명하는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체는 미분화 인간 배아줄기세포에서 발현하는 L1CAM에 결합하므로, 미분화 인간배아줄기세포의 동정과 분리에 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 치료법에서 분화된 세포 중에서 미분화된 인간 배아줄기세포를 제거하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 배양된 인간 배아줄기세포의 미분화상태를 확인하는 것으로서, 도 1a-1은 배양된 인간 배아줄기세포를 헤마토실린과 에오신 염색으로 관찰한 결과이고, 도 1a-2는 알칼라인 포스파타제 염색 키트를 사용하여 알칼라인 포스파타제가 발현되고 있음을 확인한 사진이고, 도1a-3, 4 및 5는 상기 배양세포를 각각 SSEA1, SSEA3, SSEA4에 대한 항체로 염색한 결과이다. 도1b는 상기 배양세포에서 Oct4 유전자가 발현되는 것을 확인한 결과이다.

도 2는 본 발명의 단일클론항체 4-63이 인간배아줄기세포 표면에 결합하는 것을 나타낸 것으로서, 도 2A는 형광 세포염색을 통하여 4-63 항체가 인간 배아줄기세포인 Miz-hES1, SNUhES3 및 HSF6에 결합하는 것을 나타내는 그래프이고(이때, 실선은 4-63 항체를 사용한 결과이고 붉은 바탕은 2차 항체만 사용한 것이다), 도 2B는 생쥐 배아줄기세포 J1이나 생쥐 배아섬유아세포 MEF에는 결합하지 않은 것을 보여주는 것이다 (도 2B). anti-SSEA1는 인간 배아줄기세포에 결합하지 않는 항체(음성대조군)이고, anti-SSEA3, SSEA4는 인간 배아줄기세포에 결합하는 항체(양성대조군)이다. 도 2C는 4-63 항체와 공지의 인간 배아줄기세포 마커인 TRA-1-81에 대한 항체가 인간배아줄기세포 HSF6에 같이 결합하는 것을 나타낸 결과이다.

도 3은 항체 4-63에 결합하는 분자를 면역침강법으로 관찰한 것이다. 도 3A는 인간 배아줄기세포 Miz-hES1의 표면을 바이오틴화(biotinylation)한 후에 본 발 명의 단일클론항체 4-63으로 면역 침강시킨 후에 침강된 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분리시키고 Streptavidin-HRP을 사용한 웨스턴 블럿팅을 통하여 검출한 것이고, 도 3B는 인간배아줄기세포 Miz-hES1과 SNUhES3 세포 추출액을 항체 4-63나 공지의 UJ127로 면역침강한 후 10% SDS-PAGE에서 분리시키고 비오틴(biotin)으로 표지된 항체 4-63와 스트렙타비딘-HRP(Streptavidin-HRP)를 사용하여 웨스턴 블럿팅을 한 결과이다.

도 4는 인간배아줄기세포에서 면역침강시킨 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분리하여 트립신으로 절단한 후 얻은 펩타이드를 Q-TOF 분석을 통해 4-63이 인식하는 항원이 L1CAM (L1 Cell Adhesion Molecule)임을 확인한 그림이다.

도 5는 4-63이 인식하는 에피토프를 결정한 실험 결과로서, 도5A는 L1CAM을 면역글로불린 (Ig) 도메인이나 파이브로넥틴 타입 III(fibronectin type III, Fn) 도메인에 인간 항체의 Fc를 융합시킨 단백질에 대하여 4-63, 5G3, UJ127 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 한 결과를 나타낸 것이고, 도5B는 soluble L1CAM (SolL1), L1CAM의 Ig 도메인 중 1-6(Ig1-6), 1-5(Ig1-5), 1-4(Ig1-4), 1-3(Ig1-3), 1-2(Ig1-2), 1(Ig1) 도메인에 인간 항체의 Fc를 융합시킨 단백질에 대하여 4-63 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 한 결과를 나타낸 것이고, 도5C는 상기 L1CAM의 변형체에 대하여 5G3 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 한 결과를 나타낸 것이다.

도 6A 및 6B는 형광 세포염색을 통하여 본 발명의 단일클론항체 4-63이 인간배아줄기세포의 분화시에 결합이 감소하는 것을 보여주는 것으로서, 도 6A는 인간 배아줄기세포를 배아체로 분화시 SSEA3, SSEA4와 함께 4-63의 결합이 감소함을 보여 준 것이고, 도 6B는 인간 배아줄기세포의 분화를 유도하는 레티노산(Retinoic acid) 존재시 4-63 항체의 배아줄기세포에 대한 결합능이 감소하는 것을 보여주는 그래프이다. 이때, 양성대조군으로서 인간배아줄기세포의 마커인 SSEA3, TRA-1-60 및 TRA-1-81도 레티노산 존재시 발현이 감소 되는 것이 관찰되었다.

도 7은 인간배아줄기세포를 미분화 상태일 때와 분화를 유도한 배상체(Embryoid body)상태일 때 전분화능 관련 전사 인자(Nanog, Oct4, Sox2), 삼배엽 마커인 Pax6(ectoderm), CD34(mesoderm), AFP(endoderm) 및 L1CAM의 발현 양상을 RT-PCR을 통해 분석한 결과이다.

도 8은 4-63 항체를 이용한 FACS sorting에 의하여 미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 분리할 수 있음을 나타낸 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A monoclonal antibody specific to human embryonic stem sell, a hybridoma secreting the same and a method for detecting or isolating non-differenced embryonic stem cell <130> PA070611KR <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Oct4 <400> 1 aagaacatgt gtaagctggg gccc 24 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer for Oct4 <400> 2 ggaaaggctt ccccctcagg gaaagg 26 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer beta-actin <400> 3 cctaaggcca accgtgaaaa g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer beta-actin <400> 4 tcttcatggt gctaggagcc a 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for southern blotting <400> 5 aattaaaatt aaaattaa 18

Claims (10)

1. 인간 배아줄기세포의 L1CAM 단백질에 결합하는 항체, 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편을 이용하여 미분화 인간배아줄기세포를 검출 또는 분리하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab'), F(ab')₂ 또는 Fv인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 단일클론항체, 카이메릭항체, 인간화 항체 및 인간 단일클론항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 항체는 수탁번호 KCTC 10966BP의 하이브리도마에 의해 분비되는 단일클론항체(4-63)인 방법.
5. 인간 배아줄기세포의 L1CAM 단백질의 면역글로불린 유사 도메인(Ig domain) 1에 결합하는 단일클론항체(4-63)를 분비하는 수탁번호 KCTC 10966BP의 하이브리도마.
6. 제5항의 하이브리도마에 의해 분비되는, 인간 배아줄기세포의 L1CAM 단백질의 면역글로불린 유사 도메인(Ig domain) 1에 결합하는, 단일클론항체(4-63).
7. L1CAM에 대한 항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 항체 단편을 이용하 여 미분화 인간배아줄기세포를 제거하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 L1CAM에 대한 항체는 단일클론항체, 카이메릭항체, 인간화 항체 및 인간 단일클론항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab'), F(ab')₂ 또는 Fv인 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 항체는 수탁번호 KCTC 10966BP의 하이브리도마에 의해 분비되는 단일클론항체(4-63)인 방법.

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