KR20100039204A

KR20100039204A - 인간배아줄기세포, 유방암, 및 대장암세포에 결합하는 단일클론항체 2-ｅ2

Info

Publication number: KR20100039204A
Application number: KR1020090045271A
Authority: KR
Inventors: 류춘제; 김하나; 최홍서; 김점지; 최모란
Original assignee: 세종대학교산학협력단
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2009-05-25
Publication date: 2010-04-15

Abstract

본 발명은 인간 배아줄기세포 및 암세포주에 결합하는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마에 관한 것으로서, 구체적으로는 미분화 인간 배아줄기세포에 특이적 결합능을 보여주며, 유방암과 대장암세포에 결합하여 그 성장을 억제하는 능력을 가진 단일클론항체 2-E2와 이 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마2-E2, 상기 단일클론항체 2-E2를 포함하는 검정키트, 인간 배아줄기세포 제거용, 유방암 및 대장암 치료용 조성물에 관한 것이다.

인간 배아줄기세포, 단일클론항체, 하이브리도마, TLS, 유방암 세포, 대장암 세포, 암세포 성장 억제

Description

인간배아줄기세포, 유방암, 및 대장암세포에 결합하는 단일클론항체 2-Ｅ2 {Monoclonal antibody 2-E2 specific to human embryonic stem cell, breast, and colon carcinoma cell lines}

본 발명은 인간 배아줄기세포, 유방암, 및 대장암 세포에 결합하는 단일클론항체 2-E2 및 이를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.

배아줄기세포(embryonic stem cell)는 생물을 구성하는 다양한 기능을 가진 모든 세포들로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포로서 생쥐, 원숭이, 사람 초기 배아의 배반포(blastocyst)나 상배엽(epiblast)에 미분화상태로 존재 한다 (Evans et al., Nature, 292: 151-156, 1981; Thomson et al., PNAS 92:7844-7848, 1995; Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Brons, et al., Nature, 448: 191-196, 2007; Tesar, et al., Nature, 448:196-202, 2007). 이 세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 재생(self renewal)이라는 세포 분열에 의해 자신과 동일한 세포를 무한히 생산할 수 있으며, 다양한 환경 또는 분화 자극에 의해 우리 몸의 모든 기능성 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency)의 특징을 나타낸다. 배아줄기세포 연구의 역사적 배경을 보면 1981년 처음으로 생쥐 배아줄 기세포 (mESC, mouse embryonic stem cell) 배양법이 확립된 후(Evans et al., Nature, 292: 151-156, 1981), 1996년 영장류에서 전분화능 배아줄기세포 배양법(Thomson et al., Biol. Reprod., 55: 254-259, 1996)이 개발되었고, 1998년 미국의 톰슨(Thomson) 등에 의해 인간 배아줄기세포 (hESC, human embryonic stem cell) 배양법이 확립되었다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998). 배아줄기세포는 모든 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 갖고 있으므로, 질병이나 사고에 의한 특정 세포나 장기 손상시 줄기세포를 그 특정 세포로 분화를 유도하여 사용할 수 있을 것으로 기대됨에 따라, 여러 난치성 질환의 근원적 치료방법으로 부상하고 있다.

모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가진 배아줄기세포의 운명은 내부와 외부 신호의 조합에 의해 조절된다. 전사인자인 Oct4, Nanog, Sox2는 재생이나 전분화능을 유지하기 위한 필수적인 내부 조절인자로 알려졌다 (Boyer et al., Current Opinion in Genetics and Development 16:455-462, 2006; Boiani et al., Nat. Rev. Mol.Cell.Biol. 6:872-884, 2005). 그러나 전분화능 및 미분화 상태를 조절하는 배아줄기세포는 반드시 외부환경에서 오는 신호를 상대해야하는데, 그 이유는 생체 내(in vivo)에서 발생 동안 배아줄기세포는 실제로 수많은 다른 세포들에 둘러싸여 있기 때문이다. 발생을 유도하는 유전자 발현에서의 변화는 외부의 환경에서 오는 신호에 대한 반응에서 시작된다고 볼 수 있는데, 외부 환경의 변화에 관한 신호가 세포막이나 세포부착 분자들을 통해 내부로 전달되고, 이 신호의 궁극적인 타겟은 내부 인자인 Oct4, Nanog, Sox2로서 이들이 생체 내(in vivo) 와 시험관 내(in vitro)에서 배아줄기세포의 재생과 전분화능을 조절하는 것이라고 볼 수 있다(Boiani et al., Nat. Rev. Mol.Cell.Biol. 6:872-884, 2005). 그러므로 어떤 특이적인 외부 분자가 존재하여 배아줄기세포 표면에 존재하고 이 분자를 통한 배아줄기세포 특이적인 외부 신호가 존재하는지 연구하는 것은 배아줄기세포의 효율적인 배양을 유도하는 배지 개발, 배아줄기세포 특이적인 마커 발굴, 세포 치료제에 오염되어 암을 유발하는 미분화 배아줄기세포를 인식하여 제거하는 것 등에 응용될 수 있다.

배아줄기세포의 특징인 재생과 전분화능 특징은 종간에 잘 유지되어 왔을 것으로 추정되며, 실제로 예상대로 핵심적인 세포 내부 전사인자인 Oct4, Nanog, Sox2는 생쥐와 인간에서 종간에도 잘 유지되어 있다 (Boyer et al., Current Opinion in Genetics and Development 16:455-462, 2006; Boiani et al., Nat. Rev. Mol.Cell.Biol. 6:872-884, 2005). 또 인간 배아줄기세포 (hESC, human embryonic stem cell)도 생쥐 것처럼 전분화능을 가지고 있는 세포이므로, 시험관 내(in vitro) 조건에서 배아체(EB,embryoid body)를 형성시켜 분화를 유도하였을 때 다양한 모든 조직의 세포로 분화가 가능하다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff, et al., Nat. Biotech., 18:399-404, 2000). 또 세포 배양시는 두 세포 모두 피더(Feeder)나 피더세포 배양액이 있는 상태에서 배양이 가능하다는 유사점이 있고, 자가 증식이 가능한 세포에서 발현되고 있는 텔로머라제(telomerase)가 둘 다에서 발현하고, 생쥐 배아줄기세포에서 발현하는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)는 인간 배아줄기세포에서도 발현되고 있다. 그 러나 이런 유사점과 달리 인간과 생쥐 배아줄기세포를 배양할 때 많은 차이점도 존재한다. 두 세포는 형태학적으로 다르고, 배양시 자가 재생산이나 전분화능을 유지하기 위한 사이토카인 요구성도 다르다. 예를 들면, 생쥐 배아줄기세포는 재생을 위해 LIF (leukemia inhibitory factor)와 STAT3를 요구하나 사람은 이들이 필요하지 않다 (Smith et al., Nature 336:688-690, 1988; Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Daheron etal., Stem cells 22:770-778, 2004). 또 생쥐는 BMP (Bone morphogenic protein)가 재생에 필수적이나 인간에서는 BMP가 오히려 분화를 촉진하는데 사용된다 (Ying et al., Cell 115:281-292, 2003; Xu et al., Nat. Biotech. 20:1261-1264, 2002).인간 배아줄기세포의 재생을 촉진하는 데 사용되는 성장인자는 bFGF (basic fibroblast growth factor)로서, 실제로 피더 없이도 마트리젤(MaTrigel)(BD Biosciences, Seoul, Korea)과 bFGF 포함 배지만으로 인간 배아줄기세포를 시험관 내에서 배양할 수 있다 (Amit et al., Dev. Biol. 227:271-278, 2000; Xu et al., Nat. Biotech. 19:971-974, 2001). DNA 마이크로어레이(microarray)를 통한 전체 유전자 발현 분석결과에서도 인간의 배아줄기세포의 줄기성(Stemness)을 유지하기 위한 유전자 풀(pool)이 생쥐의 그것과 차이가 있다는 것을 알 수 있다 (Bhattacharya, et al., Blood, 103:2956-2964, 2004).

배아줄기세포의 종간의 이와 같은 차이점에도 불구하고 현재 배양중인 미분화 상태의 인간 배아줄기세포의 재생 및 전분화능을 동정하고 정의하기 위하여, 인간 배아줄기세포가 아닌 생쥐 배아(embryo)나 사람 배아암세포(embryonal carcinoma)를 생쥐에 주사하여 만든 단일클론항체, 예를 들어 SSEA1, SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81등에 대한 항체들을 사용하고 있다. 그리고 이들 항원 중 인간에서는 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81가 모두 발현하고 SSEA1은 발현하지 않으나, 생쥐에서는 반대로 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81가 모두 발현하지 않고 SSEA1만 발현하는 현저한 차이가 있다 (Boiani et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6:872-884, 2005). 그리고 이런 항체들에 의해서 정의되는 분자들은 대부분 탄수화물 항원성 부위(epitope)를 가지고 있어 그 기능이 여전히 알려지고 있지 않다 (Badcock, et al., Cancer Res. 59:4715-4719, 1999; Kannagi et al., EMBO. J. 2:2355-2361, 1983). 그리고, 최근 결과에 따르면 오랫동안 전분화능의 주요 마커로 사용되어온 SSEA3, SSEA4가 실제로 전분화능과 무관한 단순 외부항원이라는 연구 결과가 나오기도 하여 여전히 논란 중이다 (Brimble et al., Stem Cells, 25: 54-62, 2007). 단백질 마커로는 CD9, E-카데린(cadherin), 그리고 PODXL같은 분자들이 산발적인 연구를 통해 미분화 인간 배아줄기세포 표면 단백질로 알려지고 있으나 그들의 재생과 전분화능에서의 역할에 대해서는 전혀 알려지지 않았다 (Cai et al., BMC Dev Biol, 5:26-33, 2005; Carpenter et al., Dev Dyn, 229:243-258, 2004, Choo, et al., Stem Cells. 26:1454-1463, 2008). 최근에는 IGF1R과 ERBB2가 미분화 인간 배아줄기세포의 생존과 재생에 중요한 새로운 후보 분자로 새롭게 보고되었지만 (Bendall et al., Nature, 448:1015-1021, 2007; Wang et al., Blood, 110:4111-4119, 2007), 현재 여전히 미분화 배아줄기세포를 효율적으로 정의하고 동정하기 위한 단백질 표면 분자들에 대한 정보가 현저하게 부족하다.

한편, 배발생 과정과 암발생 과정은 여러 가지로 유사한 점이 많아서 두 과 정에 많은 동일한 분자가 관여하는 것으로 추정된다, 19세기 중반에 병리학자들은 암 조직을 현미경으로 관찰하면서 배아성 조직과 암조직 사이의 유사성을 발견하였다. 그 후 비어드(Beard)등은 암이란 성인 조직에 남아있는 일부 배아성 세포나 활성화된 생식세포(geminal cell)로부터 발생한다는 "배아성 잔존물 가설 (embryonal rest hypothesis)"를 내놓았다 (Beard J, Lancet, I: 1758, 1902; Sell, S, Crit. Rev. Oncol. Hematol 51: 1-28, 2004). 이 개념에 따르면 모든 암이란 성인조직의 잘못된 자리에 미량 존재하는 배아 유사성 전구체 세포(embryonal-like progenitor) 나 생식세포 (germinal cell)에서 유래한다는 것이다. 각 조직의 줄기세포는 배아성 잔존물과 동일하고 대부분의 암은 조직에 남아있는 배아성 줄기세포에서 유래한 세포의 성숙 정지(maturation arrest)상태라는 주장이다 (Sell, S, Crit. Rev. Oncol. Hematol 51: 1-28, 2004; Sell, S & Pierce, Lab. Invest 70: 6-22, 1994). 실제로 암세포는 배아성 세포와 형태학적으로 닮았을 뿐만 아니라, 운동성, 감소된 접촉 방해 (contact inhibition), 침입성(invasiveness), 빠른 증식 속도, 혐기성 대사, 분화 부족, 혈관유도 물질 분비, 배아성 단백질의 생산 등 많은 점이 유사하다 (Cortes-Funes et al., Natural history of cancer and history of oncology, 2-16, 1993). 특히 생화학, 면역학, 분자생물학등의 발달로 배아발생동안에 발현하는 많은 분자들이 성인조직에는 최소로 존재하다 다양한 암에서 다시 활발히 발현 되는데, 이런 단백질을 온코피탈 단백질(oncofetal protein)이라고 한다. 배 발생 동안과 암 발생 동안에 동시에 발현하는 온코피탈 단백질들은 실제로 암의 진단이나 치료에 쓰이는 주요한 타겟으로 CA-125 (mucin, 난소암), CEA family (carcinoembryonic antigen 대장암, 직장암), AFP(a-fetoprotein, 간암), POA (pancreatic oncofetal antigen, 췌장암, 위암) 등 실제 임상에서 진단 마커로 응용되고 있으며, 또 이들을 타겟으로 한 치료용 항체는 임상 실험 단계에 있다 (Carter et al., Endocrine-Related Cancer 11: 659-687, 2004). 그 외에도 Cripto-1 (Bianco et al., Curr Top Dev Biol. 67: 85-133, 2005), Glypican-3 (Bianco et al., Curr Top Dev Biol. 67: 85-133, 2005), 5T4 (Myers, et al., J Biol Chem. 269: 9319-9324, 1994), M2A(Bailey et al., Proc Natl Acad Sci 83: 5291-5195, 1986; Marks, et al., Br J Cancer. 80: 569-578, 1999)등이 최근 배 발생 동안과 암 발생동안에 동시에 발현되는 온코피탈 단백질로 알려졌다. 이들은 주로 세포표면 단백질로로 암세포를 직접 면역 주사하여 만든 단일클론항체나 마이크로어레이(microarray)에 의해 처음 밝혀지고 클로닝 되었으며 이들을 도입한 세포 주는 세포 이동성(cell motility)가 증가하고 세포-세포 접촉이 감소하는 등 암세포 성향을 보이고 있다. Louisville 대학의 John Eaton 교수팀은 2006년 11월 EORTC-NCI-AACR 심포지움에서 배아줄기세포를 면역 주사한 쥐의 60-90%는 폐암세포를 주사하거나 발암물질로 폐암을 유도해도 폐암에 걸리지 않음을 보고하여 배아줄기세포의 표면분자가 실제로 암 발생에 중요한 분자로 작용함을 제안하였다 (Nature News November, 2006). 이것은 인간배아줄기세포 표면마커들이 암발생 억제에 응용 될 수 있음을 보여주는 최초의 실험적 결과이다. 따라서 미분화 배아줄기세포에 특이적으로 결합하는 다양한 단일클론항체군을 만들고 이들을 이용하면 이들 항체군은 암세포 성장 전이등에 중요한 암세포 특이적인 온코피탈 단백질을 인식할 확률이 높다고 할 수 있다. 본 발명에서는 미분화 배아줄기세포에 특이적인 항체 2-E2을 만들고 이 항체가 다양한 암세포주에 결합하고 그 중 유방암 및 대장암 세포의 성장을 억제하는 특성을 보여줌으로 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 배아줄기세포에는 결합하여, 표면의 TLS (Translocated-in-Liposarcoma) 단백질을 인식하는 단일클론항체 2-E2을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유방암 세포주 및 대장암 세포주에 결합하여 이세포의 성장을 억제하는 상기한 단일클론항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 배아줄기세포 검정 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 인간 배아줄기세포를 제거하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 사용하여 미분화된 인간 배아줄기세포를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 포함하는 유방암세포 및 대장암세포의 성장을 억제하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 단일클론항체를 사용하여 유방암세포 및 대장암세포를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

지금까지의 인간배아줄기세포를 인식 분석하기위해 사용하고 있는 항체들은 생쥐 배아세포들을 면역원으로 사용하여 제조한 항체들을 응용한 것들인데 실제 배양된 인간 배아줄기세포를 직접 주사하여 그 미분화상태의 표면분자들에 대한 단일클론항체를 제조하면 좀 더 많은 다양한 인간 배아줄기세포에 특이적인 세포 표면 분자들을 발굴할 수 있을 것으로 기대된다. 이렇게 만들어진 단일클론항체는 인간 배아줄기세포의 특성을 정확히 분석하고 세포 치료시 인간 배아줄기세포를 제거하는데 유용하게 쓰일 수 있다. 그리고 이 항체를 이용하여 특이적 배아줄기세포 표면 항원을 발굴하고 이들의 재생, 전분화능에서의 역할을 규명하면 배아줄기세포 효율적인 배양을 위한 새로운 배지 개발에도 응용할 수 있다. 또 이렇게 만들어진 항체들 중 다양한 암세포들에 결합하는 항체는 암 발생에 중요한 분자들일 가능성이 있고 이런 항체가 암 세포 성장 억제능력을 보이면 이 항체를 이용한 암 치료제 개발에 응용될 수 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체 군을 제조하기 위해 혈액줄기세포의 표면항원 CD133을 발굴하는데 사용된 미 끼면역주사방법을 응용하였다 (Yin et al., Blood, 90: 5002-5012, 1997). 먼저 배양된 인간 배아줄기세포가 미분화된 상태의 인간 배아줄기세포임을 확인한 후, 이 배아줄기세포를 레티노산 (retinoic acid, RA)을 이용하여 분화를 유도하였다. 레티노산으로 분화 유도한 후 완전히 분화가 유도된 것을 확인한 다음 이 분화 유도된 세포를 생쥐의 오른쪽 뒷발에 미리 찌르고 3일 후에 왼쪽 뒷발에 미분화 인간 배아줄기세포를 주사하여 그 후 3일 간격으로 총 7회 더 면역주사한 후 왼쪽 뒷발의 오금 림프절을 분리하여 단일클론항체 제조에 사용하였다. 이들 인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체군은 미분화된 인간 배아줄기세포에는 결합하고, 레티노산으로 분화된 인간 배아줄기세포에는 붙지 않거나 약하게 결합하였다 (Choi et al., Cell and Tissue Research 333:197-206, 2008). 우리는 이들 항체군중 2-E2항체가 인간배아줄기세포 표면의 TLS를 인식하고 기존 알려진 항체와 다른 특성을 보이는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

하나의 양태로서, 본 발명은 미분화 인간 배아줄기세포의 표면에 존재하는 TLS (Translocated-in-Liposarcoma)를 인식하는 단일클론항체 2-E2에 관한 것이다.

하나의 구체적 양태에서, 본 발명의 단일클론항체 2-E2는 인간 배아줄기세포에는 결합하고 배아체 (Embryoid body)로 분화를 시작하는 인간 배아줄기세포에는 결합정도가 급격히 감소하는 단일클론항체이다.

또 다른 하나의 구체적 양태에서, 본 발명의 단일클론항체 2-E2는 유방암 세포주와 대장암 세포주에 결합하고 그 성장을 억제하는 단일클론항체이다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 단일클론항체 2-E2는 도 14,15에 보이는 염기 서열과 아미노산 서열을 가지는 단일클론항체이다.

본 발명에서 용어 “단일클론항체”란 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일클론항체는 인간 배아줄기세포 및 다양한 암세포의 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하므로, 인간 배아줄기세포 및 다양한 암세포의 세포표면 분자를 인식하는 단백질 분자이다.

항원의 특정 에피토프를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, 특히 CDR(complementarity determining region)이 이러한 복합체 형성에 기여하므로, 본 발명은 상기한 본 발명의 단일클론항체의 가변 영역, 특히 CDR을 포함하는 이의 키메릭 항체, 인간화 항체 등을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은, 상기한 바와 같은 결합 특성을 갖는 한, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편들을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명자는 인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체를 생산하기 위해 미끼면역주사방법을 사용하였다. 구체적으로 인간 배아줄기세포를 (도 1A) 레티노산으로 분화 유도한 후 완전분화가 유도된 것을 확인하고 (도 1B), 이 분화된 인간 배아줄기세포를 미끼면역원으로 생쥐 뒷발 오른쪽에 먼저 주사하고 나중에 미분화 인간 배아줄기세포를 왼쪽에 주사하여 두 세포에 공통으로 존재하는 표면 항원들에 대한 항체들은 왼쪽 뒷발 림프절에서 제거되게끔 한 후 이 왼쪽 림프절의 림파구를 분리하여 단일클론항체군을 제조하고 그중 2-E2항체를 이용하여 항원을 분석하였다.

구체적으로, 인간 배아줄기세포를 배양한 후 플로우 사이토미트리(Flow Cytometry)를 통한 SSEA1, SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 분자들의 발현분석을 통하여, 인간 배아줄기세포에 음성마커인 SSEA1에 대한 항체는 상기 세포에 결합하지 아니하고, 양성마커인 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81에 대한 항체는 결합한다는 것을 확인하였다(도 1A). 이 세포에 레티노산을 처리하면 이들 양성 마커들이 전부 음성으로 변하고 상대적으로 SSEA1은 발현이 증가함으로써 이 세포의 분화가 완전히 진행되었다는 것을 확인할 수 있었다(도 1B). 이렇게 준비한 미끼면역원과 진짜면역원을 미분화 배아줄기세포에 특이적으로 결합하는 단일클론항체군의 제조에 이용하였다.

이어서, 상기 배양된 인간 배아줄기세포를 콜라게나제로 떼어낸 후 이를 마우스의 뒷다리 발바닥을 통해 면역주사하고 이 왼쪽 다리의 오금 림프절을 분리하여 림파구을 얻어 암세포와 융합하여 제조한 하이브리도마로부터 본 발명의 구체적 양태인 단일클론항체군 480개를 분리하고, 그 중에서 33종이 인간 배아줄기세포 H9과 또 다른 인간 배아줄기세포 H1에 대한 결합하는 것을 확인하였으며, 이들이 생쥐 배아줄기세포, 생쥐 배아섬유아세포(MEF, mouse embryonic fibroblast) 등에는 결합하지 않는 것도 확인하였다. 이들 항체 중에서 항체 2-E2는 IgG1과 카파사슬을 가진 단일클론항체로 이 항체의 정제는 이를 생산하는 하이브리도마를 생쥐 복수에 주사하여 복수액에서 정제하여 분석에 사용하였다 (도 2). 이 항체는 미분화 배아줄기세포에 결합하고, 분화된 배아체세포에 약하게 결합하고, 레티노산 처리된 배아줄기세포, 생쥐배아줄기세포, 생쥐배아섬유아세포에 결합하지 않고, 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에는 약하게 결합하고 말초혈액림파구(peripheral blood lymphocyte, PBL)에는 결합하지 않는 것을 플로우 사이토미트리로 확인하고 (도 3), 여러 암세포에 결합하는 것을 확인하였다(도 4, 표1). 공지의 인간배아줄기세포 세포표면마커들과 유세포 분석기를 이용한 이중 염색을 통해서 2-E2항체가 양성인 세포 대부분이 인간배아줄기세포마커들도 양성이라는 것을 관찰하였으며 (도 5), 이 2-E2항원은 분화 유도된 배아체 발생 초기에 그 발현이 표면에서 급격히 감소하는 것을 확인하였다(도 6). 또 이 항체가 인식하는 항원을 검출하는 실험에서 인간 배아줄기세포 추출액에서 약 68와 27 kDa 단백질을 면역 침강시키는 것으로 확인하였다(도 7). 본 발명의 단일클론항체가 인식하는 인간 배아줄기세포의 단백질의 분자량은 10% SDS-PAGE를 이용하여 측정한 것으로서, 분자량의 측정 조건에 따라 일정 범위 내에서 약간의 오차가 있을 수 있다. 따라서, 단백질의 분자량을 제시함에 있어 용어 “약”의 사용을 피할 수 없으며, 일반적으로 ± 2 kDa, 바람직하게는 ± 1 kDa의 범위를 가질 수 있다. 단일클론항체 2-E2가 인식하는 단백질을 면역침강 후 SDS-PAGE에서 분리한 후 트립신으로 절단하여 PMF분석으로 그 단백질이 TLS 라는 것을 확인하였다(도 8). 이 항원이 정말 TLS인지를 공지의 생쥐 단일클론항체인 항-TLS를 이용하여 웨스턴 블라팅을 통해 다시 확인하였으며(도 9B), 이 항원이 기존 항체들과 달리 미분화 인간 배아줄기세포의 표면에서 TLS를 특이적으로 인식함을 관찰하였으며 (도 9A), 면역세포화학적 실험에서 2-E2는 세포 표면 뿐만 아니라 핵 내 TLS 도 인식한다는 것을 관찰하였다 (도 10, 11). 그리고 2-E2 항체는 또 암세포 성장억제 실험에서 결합하는 암세포 중에서 유방암세포 MDA-MB435, 대장암세포 Colo-205의 성장을 억제하는 것이 관찰되었다 (도 12). 이 항체는 인간배아줄기세포 분리 분석 및 유방암 대장암 성장억제에 응용할 수 있음 으로 이 항체를 암호하는 유전자로부터 고유 아미노산 서열을 결정하기위해 이 항체의 유전자를 중합효소연쇄반응방법으로 클로닝하였으며 (도 13) 그 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 염기서열 및 아미노산 서열을 확인하였다 (도 14, 15).

2-E2항체가 인식하는 TLS는 원래 사람 점액성 리포사코마(myxoid liposarcoma)에서 전사인자 CHOP에 전좌되어 융합된 형태로 발견된 유전자로 핵내 RNA 결합 단백질로 알려졌다 (Crozat, et al., Nature 363:640-644, 1993). 또 다른 연구그룹에서는 전좌된 염색체 t(12:16)에서 CHOP와 융합된 유전자라해서 FUS라 명명하였다 (Rabbitts, et al., Nature Genetics 4: 175-180, 1993). 전체 길이는 526 아미노산이며 웨스턴블라팅에서는 68 kDa에 검출된다. TLS의 N 말단은 글루타민(Gln), 세린(Ser), 티로신(Tyr) 이 풍부한 전사활성 도메인을 포함하며 C 말단은 RNA에 결합하는 RGG(Arg-Gly -Gly) 도메인을 가지고 있다. TLS/CHOP 융합 유전자에서는 TLS의 RNA 결합 부분이 CHOP의 루신 지퍼(Leucine zipper) DNA 결합 부분으로 치환된다. TLS는 또 BCL/ABL에 의한 백혈병 발생과정에서 발현이 유도되며 백혈병세포의 성장인자 비의존성(independence)을 유도하고 Granulocyte-colony stimulating factor receptor(GCSFR)를 억제하여 GCSF으로 유도되는 백혈병 세포의 분화를 억제 한다 (Perrotti et al., EMBO J. 17:4442-4455, 1998). 최근에는 TLS는 DNA 손상 신호시 억제되는 사이클린 D1(Cyclin D1)의 5‘ 조절지역에 소집되는 비암호화 RNA 전사체(Non-coding RNA transcript)에 결합하여 CBP와 p300의 히스톤 아세틸전이효소(histone acetyltransferase)의 활성을 억제하는 것으로 알려졌다 (Wang, et al., Nature 454: 126-130, 2008). 또 다른 최근 연구에서는 이 단백질이 분화된 인간배아줄기세포에서 발현이 감소된다는 것이 알려져 분화와 관련되어있을 것으로 추측된다 (Andersson, et al., BMC Cell Biology 9: 1-17, 2008). 아주 최근에는 이 유전자의 돌연변이에 의한 신경세포내 축적이 루게릭병 (Amyotrophic lateral sclerosis)의 원인이라는 보고가 있었다 (Vance et al., Science 323:1208-1211, 2009; Kwiatkowski et al., Science 323:1205-1208). 본 발명에서는 TLS 단백질이 미분화 인간 배아줄기세포의 표면에 발현한다는 것을 처음으로 밝히고 표면에 발현되는 TLS를 특이적으로 인식할 수 있는 새로운 항체인 2-E2를 제조하였다. 또한, 이 단백질의 발현이 미분화 인간 배아줄기세포가 분화할 때 감소한다는 것도 밝히고 다른 미분화 마커들과 동시에 발현함을 보여줌으로 (도 5,6), 미분화 상태의 인간 배아줄기세포를 정의해 주는 중요한 세포표면 마커로 작용할 수 있으며, 이를 이용하여 순수 미분화 인간 배아줄기세포를 분리하는데 사용할 수 있음을 입증하였다. 그리고 유방암 및 대장암 세포의 성장을 억제 할 수 있 음으로 (도 12), 이들 암 치료용 항체로도 개발 될 수 있다는 것을 보여준다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 바와 같은 본 발명의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.

하나의 구체적 양태에서, 본 발명은 단일클론항체 2-E2를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.

구체적 실시에서, 본 발명의 하이브리도마는 미분화 인간 배아줄기세포와 분화 배아줄기세포를 생쥐의 뒷 왼쪽 오른쪽 발바닥에 각각 주입한 후 상기 생쥐의 왼쪽 오금에서 림파구를 분리하여 골수종 암세포와 융합하여 제조하였다.

단일클론항체를 분비하는 하이브리도마는 이를 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 구체적 실시에서는 본 발명의 단일클론항체의 대량 생산을 위해 하이브리도마를 생쥐의 복강에 주사하여 복수액에서 배양하고 단백질 G-세파로스(sepharose) 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체 2-E2를 포함하는 미분화 된 인간 배아줄기세포 제거용 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체 2-E2를 사용하여 미분화된 인간 배아줄기세포를 제거하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체 2-E2를 포함하는 유방암 세포와 대장암 세포 억제를 통한 이들 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체 2-E2를 포함하는 유방암 과 대장암 치료 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 단일클론항체 2-E2는 도 14,15에 보이는 염기서열과 아미노산 서열을 가지는 단일클론항체이다

본 발명의 단일클론항체 2-E2는 세포치료를 위해 이식될 세포 중에 존재하는 배아줄기세포를 제거하거나, 이식된 세포 중에 존재하는 배아줄기세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다.

또 본 발명의 단일클론항체 2-E2의 CDR을 사용하여 유방암이나 대장암 치료에 사용되는 암 치료용 재조합 항체 개발에 사용 할 수 있다

배아줄기세포, 유방암, 대장암을 선택적으로 제거하기 위해, 본 발명의 단일클론항체를 공지의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종(radionuclide), 약제, 림포카인, 독소, 이형가능성 항체 등이 있으나 이로 제한되지는 않는다.

이식된 세포 중에 존재하는 배아줄기세포를 제거하기 위해, 또는 유방암 대 장암 세포 성장을 억제하기 위해, 항체는 그 자체 또는 항체의 CDR을 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 조성물의 경우 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 당 분야에 공지되어 있다. 이들 제제는 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내 및 국부적 면역억제치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 배아줄기세포를 제거하기에 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 단일클론항체를 포함하는 미분화된 인간 배아줄기세포의 검정 키트에 관한 것이다.

본 발명의 단일클론항체는 항원-항체 복합체 반응을 통해 이식될 또는 이식된 세포 중의 배아줄기세포를 제거하는데 사용될 뿐만 아니라 미분화된 인간 배아줄기세포를 특이적으로 검출하기 위해서도 사용될 수 있다.

이러한 검정 키트에는 본 발명의 단일클론항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정 지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블랏팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린 에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코 시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy)₃]²⁺ , [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 단일클론항체 2-E2는 인간 배아줄기세포의 세포표면 단백질을 특이적으로 인식하므로, 생쥐와 고등동물인 인간의 초기 배 발달의 차이를 연구할 수 있는 도구를 제공하여 인간 배아줄기세포의 분석 연구에 이용할 수 있으며, 세포 치료시 미분화된 인간 배아줄기세포를 제거하는데 유용하게 이용될 수 있으며, 또 인간 배아줄기세포의 무혈청 배지 개발에 대한 정보를 제공해줄 수 있다. 또 유방암 세포 및 대장암세포에 결합하여 성장을 억제함으로 이 항체의 CDR을 이용한 암 치료용 재조합 항체 개발에 이용 할 수 있다.

이하 실시 예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<실시예 1> 인간 배아줄기세포의 배양 및 분화유도

<1-1> 배아줄기세포의 배양 및 레티노산 처리에 의해 분화된 배아줄기세포와 배아체 세포의 유도

인간 배아줄기세포 H1과 H9은 위스콘신대학 연구소(Wicell Research institute)에서 구입하여 제시한 프로토콜에 따라 배양하였다. 먼저 0.1%의 젤라틴(gelatin) 용액으로 37℃에서 10분 동안 12-웰(well)의 조직배양용 플레이트(Nunclon)를 코팅한 후, 3000 rad 감마 방사선을 조사한 MEF(CF1 mouse embryonic fibroblast, 세종대학교 실험동물실)를 웰당 6.5 × 10⁴세포수로 접종하였다. 상기 방사선이 조사된 MEF는 성장하지는 않지만, 인간 배아줄기세포의 성장을 지지하는 세포이다. MEF 배양 24시간 후에 미국에서 구입한 인간 배아줄기세포 H1과 H9을, 제공한 프로토콜대로 37℃ 물중탕에서 서서히 녹인 다음 아래처럼 준비한 인간 배아줄기세포 배지 5㎖에 부유시키고 원심 분리하여 상층액을 제거하고 새 배지에서 다시 부유시킨 다음 준비한 MEF에 접종하였다. 2차 배양을 위해서는 5일된 인간 배아줄기세포 배양 플레이트에 37℃에서 10분 동안 1㎎/㎖의 콜라겐 분해 효소(collagenase) Ⅳ(Invitrogen, Seoul, Korea)를 처리한 후, 상기 줄기세포를 적당한 크기로 자른 후 다시 상기처럼 준비한 MEF 조직배양용 플레이트에 옮기고, 48시간 후부터 매일 배양액을 교체하며 배양하였다. 미분화된 인간 배아줄기세포의 콜로니 바깥쪽이 명확히 생쥐 배아 섬유아세포와 구별되는 것을 관찰할 수 있다(도 1A). 인간 배아줄기세포 배양에 사용된 배지는 DMEM/F12(Invitrogen, Seoul, Korea), 20%의 넉아웃SR(Knockout SR)(Invitrogen), 0.1mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol)(Sigma-Aldrich, St. Luis, MO), 2mM의 글루타민(Glutamine)(Invitrogen), 0.1mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 100U/㎖의 페니실린(penicillin) G(Sigma-Aldrich), 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin) (Sigma-Aldrich), 4ng/㎖의 bFGF(PeproTech, Rocky Hill, NJ)을 섞어 만든 배지를 사용하였다.

분화된 H9 세포를 유도하기 위해서 레티노산(RA)(all-trans-retinoic acid, Sigma-Aldrich)를 10^-5M로 적어도 20일 이상 상기 배지에 넣고 배양하였다. 배양 2일째부터 배아줄기세포는 분화를 시작하여 6일째 경계선이 뚜렷하던 모습이 사라지고 세포가 전체적으로 넓게 퍼지는 것을 관찰할 수 있다. H9 세포로부터 인간 EB(embryoid body)를 유도하는 과정은 분리된 인간 배아줄기세포 덩어리를 깨어지지 않게 조심하여 박테리아 플레이트(bacteria plate)에 잘 옮겨 EB 배양액DMEM/F12, 20%의 FBS(Fetal bovine serum, Hyclone), 0.1mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 2mM의 글루타민(Glutamine), 0.1mM의 비필수 아미노산, 100U/㎖의 페니실린 G, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)에서 EB (embroid body)를 형성할 수 있도록 4일간 배양하였다. 이때, 매일 배양액과 플레이트를 교체하여 주었다 (Chadwick et al., Blood 102, 906-915, 2003). 마우스 배아줄기세포 J1은 방사선 처리된 마우스 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblast)인 CF1 세포상에서 15%의 FBS, 0.1mM의 β-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 1mM의 글루타민(Glutamine), 0.1mM의 비필수 아미노산, 100U/㎖의 페니실린 G, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin), 그리고 500units/㎖ LIF(leukemia inhibitory factor, PeproTech)로 구성된 DMEM 배지(Invitrogen)를 이용하여 배양하였다. 인간 말초혈액 단핵구 세포 (human peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 Ficoll-Paque Plus method (GE Healthcare, Seoul, Korea)에서 제시한 방법을 이용하여 분리하였다.

<1-2> 플로우 사이트미트리에 의한 세포표면 항원염색

항체들의 각종세포에 대한 결합 정도를 관찰하기 위해 플로우 사이토미트리(Flow Cytometry)를 수행하였다. 구체적으로, 미분화된 인간 배아줄기세포, 레티노산으로 처리된 인간 배아줄기세포를 콜라겐분해효소 Ⅳ(1㎍/㎖)를 이용하여 15-20분 동안 처리해서 세포를 떼어냈다. PBS (pH 7.4)로 2번 세척한 후, 세포분리버퍼(cell dissociation buffer,Invtrogen) 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 단일세포로 분리하기 위해 40㎛ 스트레이너(strainer, BD Biosciences, Seoul, Korea)를 이용하여 필터하였다. 단일세포를 ㎖당 약 2 x 10⁵cell을 PBA(1% bovine serum albumin, 0.02% NaN₃ in PBS)에 섞은 후, 항-SSEA1, 항-SSEA3, 항-SSEA4, 항-TRA-1-60, 항- TRA-1-81 (Millipore, Billerica, MA) 항체를 4℃에서 30분간 반응시켰다. 0.1% PBST(Phosphate buffered saline Tween 20)로 2번 세척한 후, 1차 항체와 상응하는 항-래트 IgM-FITC, 항-마우스 IgM-FITC와 항-마우스 IgG-FITC (BD Biosciences)를 4℃에서 30분간 더 반응시켰다. 0.1% PBST로 2번 세척한 후, FACSCalibur와 Cell Quest software(BD sciences)를 이용하여 PI(propidium iodide)-음성 세포에 대해서 항체 반응 여부를 분석하였다. 미분화 인간 배아줄기세포 H9 세포가 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81에서 양성이고 SSEA1에서는 음성임을 보여주고 있고(도 1A), 레티노산(RA)으로 분화를 유도한 H9 세포는 반대로 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81에서 음성이고 SSEA1에서는 약하게 양성임을 보여주고 있다(도 1B).

<실시예 2> 하이브리도마 제조

<2-1> 인간 배아줄기세포의 면역주사

인간 배아줄기세포 H9 세포를 20일 동안 레티노산(RA)처리하여 분화된 H9 세포를 준비하였다. 미분화 H9 세포와 분화된 H9 세포에 1㎎/㎖ 콜라겐 분해효소 Ⅳ(collagenase Ⅳ)를 처리하여 세포를 떼어낸 후 파스퇴르 피펫으로 작은 크기로 잘게 부순 후 50㎕ PBS(pH 7.4)에 약 2 x 10⁶세포를 각각 섞은 후 12마리의 6주 령 암컷 Balb/c 마우스의 오른쪽 뒷발에는 -3, 0, 3, 6, 13,17일마다 분화된 H9 세포를, 왼쪽 뒷발에는 0,3,6,13,17일마다 미분화된 H9 세포를 찔러 넣었다. 21일째에 면역주사(immunization)된 마우스를 경추 탈골하여 클린벤치로 옮긴 후 멸균된 가위와 핀셋을 이용하여 왼쪽 뒷발로 부터 지방과 근육조직을 제거한 오금 림프절(popliteal lymph node)을 적출한 후 표면이 울퉁불퉁한 비광택 슬라이드 글라스(frosted slide glass)를 이용하여 오금 림프절을 갈아서 단일세포화해서 준비하였다. 미엘로마 (myeloma)세포인 FO 세포(ATCC, Manassas, VA)를 혈청 비첨가 배지로(serum-free media) 세척한 후, 오금 림프절 세포와 FO 세포를 40㎛ 세포 스트레이너를 이용하여 세포 잔해물을 제거하였다. 미분화 H9 세포를 찌른 왼쪽 림프절 세포(1.53 x 10⁸)와 FO 세포(3.06 x 10⁷)를 1:5의 비율로 섞은 후, 혈청 없는 배지인 DMEM(Invitrogen)로 2번 세척한 후 1㎖ 50% PEG1500 (polyethylene glycol, BMS, seoul, Korea)를 1분당 25방울이 섞이도록 넣어주었다. 1분 후 DMEM 배지를 1분간 3㎖, 1분간 17㎖, 1분간 20㎖을 연속적으로 넣고, 5분간 정치한 후 원심분리하여 세포를 모았다. 20% FBS 포함된 DMEM과 HAT 구성요소(Sigma-Aldrich)와 50㎖ 하이브리도마 클로닝 인자(hybridoma cloning factor, Bioveris, Gaithersburg, MD)에 융합된 세포를 96 웰 플레이트의 웰당 2 x 10⁵세포 수 만큼 깔고, 5% CO₂, 37℃세포 배양기에서 배양하였고, 3일 간격으로 200㎕의 20% FBS와 HAT 구성요소를 포함한 DMEM으로 갈아 주었다.

<2-2> 하이브리도마의 클로닝

하이브리도마 상층액에서 먼저 항체가 발현되는 클론을 선발하기 위하여 샌드위치(sandwich) ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 방법을 사용하였다. 항-마우스 IgG 또는 IgM 항체를 2 ㎍/㎖로 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양액 100㎕을 첨가해 37℃에서 1 시간 반응시키고, 다시 항-마우스 IgG 또는 IgM의 HRP(horseradish peroxidase, Sigma-Aldrich)의 1/5,000 희석액과 1시간 더 반응시켰다. 0.05%의 트윈 20을 첨가한 인산완충액으로 플레이트를 세척하고, OPD(o-phenylenediamine, Sigma-Aldrich)와 H₂O₂가 포함된 기질 용액을 첨가하고, 492㎚에서 흡광도를 측정하여 항체를 생산하는 클론을 먼저 선발하였다. 다음으로 각 클론의 배양 상층액을 상기 실시예 <1-2>에 기술한 플로우 사이토미트리 분석을 통해 미분화 H9 세포에 결합하는 다양한 하이브리도마들을 선발하고 계대배양을 계속하며 서브클로닝하여, 확실하게 안정성을 유지하고 인간 배아줄기세포에 대한 결합력을 유지한 단일클론항체군를 분비하는 37종의 하이브리도마군을 선발하였다. 이중 네 개의 항체는 다음의 다른 인간 배아줄기세포인 H1에 대한 결합력 실험에서 결합하지 않았다. 둘 다 결합하는 항체 33종의 아이소타입은 마우스 이뮤노글로불린 아이소타이핑 키트(Mouse Immunoglobulin Isotyping Kit, BD Biosciences)에서 제시한 방법을 이용하여 수행하여 결정하였다. 29개 항체는 IgG 형태이고 나머지 4개는 IgM 형태였다. 이중 항체 2E-2은 IgG1과 κ사슬를 가진 항체로 이 특허에서 인식 항원과 특성을 분석하였다.

<2-3> 단일클론항체 2-E2의 정제

쥐의 복부에 2-E2항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 찔러 넣기 일주일 전에 프리스테인(Pristane, SIGMA-Aldrich, Seoul, Korea)을 쥐 체중의 1/10 중량만큼 취해 복강에 주사하였다. 일주일 뒤 항체를 생성하는 2-E2 하이브리도마 1~5 X10⁶을 0.5㎖의 PBS에 부유시키고 쥐의 복부에 찔러 넣고 1~2주 동안 쥐의 복부가 불러오는 것을 확인하고 복수(Ascites fluids)를 채취하였고, 채취한 복수를 사용하여 항체를 정제하였다. 추출한 복수액은 37℃에서 30분 반응시킨 다음 2,500rpm, 4℃에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취했다. 상기 복수액 1㎖에 PBS을 첨가하여 2㎖로 희석시켰다. 또한, 1nM의 EDTA와 0.02%의 NaN₃를 상기 복수액에 첨가하고, 0.22㎛ 여과기로 여과하였다. 이 항체의 순수 분리를 위해서 단백질 G-세파로스 컬럼 크로마토그래피 방법으로 분리하였다. PBS로 미리 평형화시킨 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)에 항체 용액을 천천히 통과시키고 컬럼을 페리스타틱 펌프(peristatic pump)에 연결하여 PBS로 충분히 세척하였다. 세척 완료 후, 0.2M의 글리신(Glycin)-HCl(pH 2.7)으로 항체를 용출하였다. 이때 미리 준비한 1M의 Tris (pH 9.0)를 포함한 튜브에 상기 용출액을 완충시켰다. 이 항체를 PBS에 투석한 후 사용하였다. BCA 단백질 분석 키트(BCA^TM Protein Assay Kit, Pierce)를 이용하여 정제된 항체 양을 측정하고, SDS-PAGE를 이용하여 항체2-E2의 정제양상을 확인하였으며 순수하게 분리되었음을 알 수 있었다 (도 2). 복수 1㎖당 약 1~2㎎/㎖ 농도의 정제된 항체를 얻을 수 있었다.

<실시예 3> 단일클론항체 2-E2의 결합 특이성 분석

<3-1> 인간 및 생쥐 배아줄기세포와 각종 세포에 대한 결합 특이성

단일클론 항체 2-E2의 각종세포에 대한 결합정도를 관찰하기 위해 플로우 사이토미트리(Flow Cytometry)를 수행하였다. 구체적으로, 미분화된 인간배아줄기세포, 레티노산으로 처리된 인간배아줄기세포를 콜라겐분해효소 Ⅳ(1㎍/㎖)를 이용하여 15-20분 동안 처리해서 세포를 떼어냈다. PBS (pH 7.4)로 2번 세척한 후, 세포분리버퍼(cell dissociation buffer, Invtrogen)를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 단일세포로 분리하기 위해 40㎛ 스트레인너(strainer, BD Biosciences, Seoul, Korea)를 이용하여 여과하여 잘 분리된 단일세포만 사용하였다. 또한 인간 배아체 세포 및 여러 가지 암세포도 세포분리버퍼를 이용하여 세포를 떼어냈고, PBS (pH 7.4)로 2번 세척한 후, 40㎛ 스트레인너(strainer, BD Biosciences, Seoul, Korea)를 이용하여 여과한 후 사용하였다. 각 단일세포를 ㎖당 약 2 x 10⁵ cell을 PBA(1% bovine serum albumin, 0.02% NaN₃ in PBS)에 섞은 후, 항-SSEA1, 항-SSEA3, 항-SSEA4, 항-TRA-1-60, 항-TRA-1-81 (Millipore, Billerica, MA)와 단일클론 항체 2-E2를 4℃에서 30분간 반응시켰다. 0.1% PBST로 2번 세척한 후, 1차 항체와 상응하는 항-래트 IgM-FITC, 항-마우스 IgM-FITC와 항-마우스 IgG-FITC (BD Biosciences)를 4℃에서 30분간 더 반응시켰다. 0.1% PBST로 2번 세척한 후, FACSCalibur와 Cell Quest software(BD sciences)를 이용하여 프로피디움 아이오다이드 (propidium iodide, PI)-음성 세포에 대해서 항체 반응 여부를 분석하였다. 도 3 에서 실선은 단일클론항체이고 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다. 단일클론항체 2-E2가 인식하는 표면항원은 미분화 상태의 인간배아줄기세포인 H1, H9에서는 강하게 발현되었지만 분화된 EB, RA세포에서는 발현이 감소하거나 거의 결합하지 않는 것을 볼 수 있었다. 또한 인간배아줄기세포와 유사한 외부 표면항원을 가진 인간 배아암세포인 NT-2/D1과 다른 암세포 (U-87MG, SH-SY5Y, A375, MDA-MB435, MCF-7, Colo205, NCI-H69, NCI-H522, A549, AGS, SK-HEP-1, Huh7)에서도 발현되었지만, 생쥐배아줄기세포(mESC J1), 생쥐배아섬유아세포(MEF)에는 결합하지않았다. 그리고 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에는 일부에 결합하지만, 인간 말초혈액 림파구(PBL)에는 결합하지않았다. 그리고 조사된 암세포중 일부 (A172, ACHN)에는 결합하지 않음을 볼 수 있었다(도 4, 표1).

<3-2> 2-E2 항원과 공지의 인간 배아줄기세포 표면마커의 공동 발현분석

단일클론항체 2-E2와 기존에 알려진 미분화 인간배아줄기세포 표면 마커들과의 관계를 조사하기 위하여 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)을 가지고 제공한 방법대로 단일클론항체 2-E2의 바이오틴 표지화를 수행하였다. 구체적으로 1.63㎎의 NHS-LC-바이오틴을 1㎖ PBS (pH 8.0)에 녹이고, 50㎖(l46.4nmol)의 이 용액을 1㎎의 정제된 항체의 바이오틴 표지에 사용하였다. 실온에서 1시간 반응시키 고 나서 그 반응물은 4℃에서 투석액(0.1M NaHC0₃, pH 8.0)에 48시간 동안 투석되었다. 이렇게 준비한 바이오틴 표지 항체를 다음의 플로우 사이토미트리에 사용하였다. 세포를 먼저 상기 실시예 <1-2>와 같이 준비한 후 항-SSEA3, 항-SSEA4, 항-TRA-1-60, 항-TRA-1-81 (Chemicon, Temecula, CA) 항체로 각각 4℃에서 30분 반응시킨 후 FITC-결합 항-래트 IgM, 항-마우스 IgG 또는 항-마우스 IgM (BD Biosciences) 항체로 1차 항체에 맞게 30분 더 반응시켰다. PBA로 세척한 후에 세포는 바이오틴 표지된 57-C11로 30분 더 반응시킨 후 스트렙타비딘-PE(phycoerythrin)로 30분 더 반응시켰다. 세척 후에 PI-음성 세포만을 FACSCalibur (BD Biosciences)와 Cell Quest 소프트웨어(BD Biosciences)로 분석하였다. SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, 그리고 TRA-1-81 마커 각각과 2-E2 항체가 둘다 양성인 세포는 100%, 93%, 96%, 그리고 95%였다 (도 5). 이런 결과는 기존의 미분화 인간배아줄기세포의 표면 마커 양성인 대부분의 세포들이 2-E2 항원을 발현한다는 것으로 이 항원이 새로운 미분화 인간배아줄기세포 표면마커로 사용될 수 있다는 것을 말해준다.

<3-3> 2-E2 항체의 인간배아줄기세포 및 분화 유도된 배아체에 대한 결합 비교

본 발명의 2-E2항체의 미분화 인간 배아줄기세포와 분화유도된 배아체에 대한 상대적인 결합능을 비교하기 위해서, 미분화 인간배아줄기세포 및 배아체를 4, 7, 10, 14일까지 배양하고 각각의 세포들에 대한 항체의 결합 정도를 실시예 <1-2>처럼 플로우 사이토미트리로 측정하고 2차 항체로만 처리한 세포에 대해 상대적인 평균 형광값을 백분율로 나타내서 그래프로 그려보았다. 그 결과 단일클론항체 2-E2는 인간배아줄기세포 배양 7일 이후부터 자연분화 때문에 서서히 결합이 감소하는 것이 보인다. 하지만 배아체로 분화를 유도하면 분화 4일만에 2-E2 결합이 급격히 감소하는 것을 볼 수 있다. 유도된 배아체세포의 표면에서 10일 이후부터 다시 발현이 회복되지만 분화 유도 초기에는 급격히 발현 감소는 2-E2항원이 초기 분화에 특별히 민감하게 그 발현이 감소하는 특징을 가진다는 것을 말해준다(도 6).

<실시예 4> 단일클론항체 2-E2가 인식하는 항원 동정

<4-1> 단일클론항체 2-E2가 인식하는 세포표면 단백질 분자의 확인

인간 배아줄기세포 H9 세포 표면의 바이오틴레이블링(biotinylation)은 EZ-Link Sulfo-NHS- LC-Biotin (Pierce)에서 제시한 프로토콜을 약간 수정하여 수행하였다. 100 밀리미터 세포배양 플레이트에 배양한 인간 배아줄기 세포 H9을 37℃에서 미리 데워둔 PBS(pH 7.4)로 2회 세척한 후 Biotin(1mg/ml)이 녹아있는 cold PBS(pH 8.0)를 넣고, 실온에서 30분간 반응시킨다. cold PBS(pH 8.0)로 3회 세척 한 후 Biotin 라벨링된 세포는 용해 완충액(25mM Tris-HCl, pH 7.5, 250mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 2㎍/ml aprotinin, 100㎍/ml PMSF, and 5㎍/ml leupeptin, 1mM NaF, 1mM Na₃VO₄)를 이용하여 4℃에서 20분간 반응시킨 후, 12,000rpm 속도로 40분간 원심분리해서 핵을 제거한 후 사용하기 전까지 -70℃에서 보관하였다. 단백질-G-플러스 아가로스(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 비특이적으로 결합하는 단백질을 제거하기 위해서, 약 1 x 10⁷ 세포의 세포 용해물에 20㎕ 단백질-G-플러스 아가로스를 넣고 4℃에서 2시간동안 반응시킨 후 원심분리를 통해 그 단백질-G-플러스 아가로스를 회수하여 용해 완충액을 이용해 10회 세척한 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다. 단일클론항체 57-C11에 의해 인식되는 항원을 면역침강하기 위해서 단백질-G-플러스 아가로스에 비특이적으로 결합하는 단백질을 제거한 세포 용해물에 각 항체 2 μg을 넣고 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 20㎕ 단백질-G-플러스 아가로스를 넣고 4℃에서 2시간 동안 더 반응시켰다. 면역침강된 면역 혼합체를 용해 용액를 이용해서 10회 세척하고, 각 항체에 결합된 항원을 용출(elution)하기 위해 5x 샘플 완충액를 넣고, 100℃에서 5분간 끓였다. 음성 대조군 protein과 용출된 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 이용하여 분리한 후 나이트로 셀룰로오스 막으로 웨스턴 블라팅을 하였다. 이 막을 5% 탈지분유를 이용하여 실온에서 2시간동안 블로킹을 하였다. 0.1% PBST로 3번 세척 한 후, streptavidin-HRP(1:4,000; GE healthcare)를 실온에서 1시간 더 반응시켰다. 0.1% PBST로 3번 세척하고, 바이오틴이 라벨링된 단백질을 ECL 검출 키트(GE healthcare)로 확인하였다. 그 결과 단일클론 항체 2-2E는 약 68kDa 단백질과 27kDa 단백질을 미분화 인간배아줄기세포 추출액에서 면역 침강시키는 것을 확인하였다 (도 7A).

<4-2> 단일클론항체 2-E2에 의해 면역 침강된 항원의 동정

단일클론항체 2-E2에 의해 면역침강된 단백질을 포함하는 SDS 젤을 Commassie G250 (BIO-RAD)으로 공급자의 프로토콜에 따라 염색하였다 (도 7B). 면역침강된 68kDa 단백질을 절단해내고 Shevchenko(Shevchenko, et al., Anal. Chem. 68:850-858, 1996)등의 방법에 따라 변형된 돼지 트립신(modified porcine trypsin)을 이용하여 작은 단편으로 효소적으로 분해하였다. 젤 조각으로부터 SDS, 유기용매, 염색시약 등의 불순물을 제거하기 위하여 50% 아세토니트릴(acetonitrile)로 세척하였다. 그 다음, 트립신(8-10 ng/㎕)으로 8-10 시간동안 37℃에서 반응시켰다. 단백질 분해반응은 5㎕ 의 0.5% 트리플르로아세틱산(trifluoroacetic acid)의 첨가에 의해 종결하였다. 트립신에 의해 잘려진 단백질 단편들은 수용액 상태로 회수되었고, C18ZipTips(Millipore)을 이용하여 1-5㎕ 부피로 탈염 및 농축하였다. 이 농축액은 동량의 50% 수용성 아세토니트릴(aqueous acetonitrile)에 포화된 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid와 혼합되었고, 질량분석을 위하여 타겟 플레이트 위에 적하하였다. 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF(Amersham Biosciences)를 사용하였다. 타겟 플레이트 상에 적하되어 있는 단백질 단편들은 337nm의 N2 레이저 조사에 의해 기화된 다음, 20Kv 주입펄스(injection pulse)에 의해 가속하였다. 300 레이저샷(laser shots)의 누적 피크에 의해 각각의 단백질 스팟(spot)에 대한 매스스펙트럼(mass spectrum)을 구하였다. 매스 스펙트럼의 분석을 위해서 트립신의 자가분해에 의해 생성된 펩타이드의 이온 피크(ion peak) m/z(842.510, 2211.1046)를 표준 피크로 이용하였다. 분석이 완료된 매스 스펙트럼으로부터 단백질 동정을 위하여 록펠러(Rockefeller) 대학에서 개발한 ProFound 검색 엔진(http://129.85.19.192/profound_bin/ WebProFound.exe)을 이용하였다. 그 결과 이 단백질이 TLS(Translocated-in-Liposarcoma)임을 확인하였다 (도8). 도 8의 밑줄 친 아미노산은 실제로 질량분석기를 통해 확인한 펩티드를 표시한 것으로 TLS와 80개의 아미노산이 일치하는 것을 알 수 있다. 이 결과는 2-E2가 TLS 단백질을 인식하여 면역침강 할 수 있다는 것을 말해준다.

<실시예 5> 단일클론항체 2-E2의 특성분석

<5-1> 웨스턴 블라팅에 의한 2-E2 항원과 공지 TLS의 비교분석

TLS는 그 동안 핵 내의 RNA 결합 단백질로 알려져 왔음으로 이 발명을 통해 제조된 2-E2 항체는 세포 표면에 발현하는 TLS를 인식 할 수 있음으로 (도 3, 7), 이를 재확인하기위해 공지의 TLS에 대한 항체를 구입하였다. 공지의 TLS 항체인 항-TLS (BD Biosciences, 미국)를 이용하여 2-E2 항체가 면역침강시킨 TLS를 인식하는지 확인하기 위해 결합하는 인간 배아줄기세포인 H9 세포 용해추출액을 사용하여 면역침강과 웨스턴 블럿을 수행하였다. 단일클론항체 2-E2가 면역 침강시키는 항원의 웨스턴 블라팅을 수행하기 위해서, 상기 실시 예 <4-1>에서 서술한 용해 방법으로 바이오틴-레이블링된 세포 추출액을 준비하였다. 이 세포 추출액을 상기 서술한 바와 동일하게 단일클론항체 2-E2와 항-TLS 항체로 면역침강 후 준비한 면역 침강물과 항체를 넣지 않은 음성 대조군 단백질 (No Ab)과 항체만의 샘플 (Ab only)을 10% SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후 PVDF 막으로 옮겼다. 이 막은 5% 탈지분유를 이용하여 실온에서 2시간동안 블로킹을 하였다. 0.1% PBST로 3번 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP(1:4,000, GE healthcare, 미국)를 실온에서 1시간 더 반응시켰다. 0.1% PBST로 3번 세척하고, 바이오틴이 라벨링된 단백질을 ECL 검출키트(GE healthcare)로 확인하였다. 그 결과 단일클론항체 2-E2은 세포표면의 TLS를 면역 침강시켜서 검출되었지만 항-TLS 항체로는 면역 침강되어 검출되는 단백질이 없었다(도 9A). 68 kDa 단백질과 동시에 면역침강되는 27kDa 단백질은 TLS가 68 kDa 외에도 27 kDa으로도 쉽게 절단됨으로 TLS의 절단된 형태로 여겨진다. 이 PVDF 막을 제거완충용액(62.5mM Tris-HCl(pH6.8), 2% SDS, 100mM β-mercaptoethanol)에 넣고, 50℃에서 45분간 반응시킨 후, 5% 탈지분유를 이용하여 실온에서 2시간동안 블로킹을 하였다. 0.1% PBST로 3번 세척한 후, 항-TLS 항체를 4℃에서 12시간 반응시켰다. 0.1% PBST로 3번 세척 한 후, anti-mouse IgG-HRP(1:3,000; Santa Cruz)를 실온에서 1시간 동안 더 반응시켰다. 0.1% PBST로 3번 세척한 후, ECL 검출키트(GE healthcare)로 확인하였다. 그 결과 사용된 항체의 중쇄(Heavy chain, 도 9B)가 웨스턴 블라팅에서 관찰 되는 가운데, 단일클론항체 2-E2로 면역 침강시킨 TLS 단백질과 항-TLS 항체에 의해 면역침강된 TLS 둘 다 항-TLS 항체에 의해 인식됨을 관찰할 수 있었다 (도 9B). 이 결과는 세포표면을 바오틴화 한 후 면역침강하여 스트렙타비딘으로 분석한 결과와 비교할 때 (도 9A), 단일클론항체 2-E2는 세포표면 TLS를 인식하지만 항-TLS 항체는 세포표면의 TLS를 인식하지 못한다는 것을 말해준다 (도 9A, 9B). 따라서 단일클론항체 2-E2는 미분화 인간배아줄기세포의 표면에 존재하는 TLS나 최소한 이와 유사한 단백질을 인식하는 새로운 항체임을 알 수 있다. 이런 결과는 TLS가 세포 표면과 세포 내부 두 곳에 존재하며 2-E2항체는 공지의 항체와 달리 세포 표면 TLS를 인식할 수 있다는 것을 말해준다.

<5-2> 면역세포화학적 방법에 의한 2-E2항원과 TLS의 비교 분석

2-E2 항체의 인간 배아줄기세포 표면 TLS에 대한 결합력을 또 다른 방법인 면역세포화학적 방법(Immunocytochemistry)으로 조사하기 위하여 인간 배아줄기세포 H9 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅한 커버슬립에서 4일간 배양하였다. Ca²⁺과 Mg²⁺ 성분이 들어있는 PBS로 2회 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 4℃에서 15분간 처리하여 세포를 고정시켰다. Ca²⁺ 과 Mg²⁺ 성분이 들어있는 PBS로 5회 세척한 후, 세포 내부를 염색하기 위해서는 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS로 10분 처리하였다. 세포표면 염색을 위해서는 트리톤 X-100 처리 없이 바로 블로킹 용액(10% 말 혈청, 0.1% BSA, Ca²⁺ Mg²⁺-PBS)으로 1시간 세포를 블로킹하였다. 적당히 희석시킨 바이오틴화된 2-E2 항체(1:100)와 항-TLS항체(1:50)를 4℃에서 12시간 동안 각각 반응시켰다. Ca²⁺ 과 Mg²⁺ 성분이 들어있는 PBS로 3회 세척한 후, 스트렙타비딘-Cy3(Invitrogen), 항-마우스 IgG-FITC (Vector Laboratories)로 각각 실온에 서 빛을 차단한 채로 1시간 더 반응시켰다. Ca²⁺ 과 Mg²⁺ 성분이 들어있는 PBS로 3회 세척한 후, DAPI(4,6-diamidino- 2-phenylindole)를 이용하여 핵을 염색하였다. 그 결과, 항-TLS 항체는 세포표면에 결합하지 않았지만, 2-E2항체는 붉은색으로 잘 결합하는 것을 관찰하였다 (도 10). 세포막을 뚫어서 준비한 세포내부 염색시에는 트리톤 X-100처리한 세포에 TLS항체를 상기처럼 반응시키고 항-마우스 IgG-FITC로 반응시킨 다음, 바이오틴화한 2-E2항체를 결합시키고 다시 스트렙타비딘-Cy3로 반응시켰다. 그 결과 녹색으로 보이는 것처럼 항-TLS항체가 핵 내에 TLS에 잘 결합하고 또 2-E2항체도 붉은색으로 잘 결합하는 것을 관찰 할 수 있었다(도 11). 2-E2항체와 TLS항체를 융합시켜보면 노라색으로 보이는 것처럼 두 항체가 핵내 TLS를 동시에 결합하는 것을 관찰 할 수 있었다 (도 11). 이런 결과를 요약해보면 2-E2항체는 공지의 TLS 항체처럼 핵 내의 TLS항원을 인식 할 수 있으며, 또 공지의 TLS항체와는 다르게 세포표면의 TLS단백질을 인식할 수 있다는 것을 알 수 있으며 이것은 2-E2항체가 공지의 TLS항체와 다른 새로운 항체라는 것을 말해준다.

<5-3> 2-E2항체의 암세포 성장억제 실험

2-E2항체는 배아줄기세포외에 다양한 암세포에 결합하였다 (도 3). 따라서 기존 알려진 것과 다르게 TLS가 다양한 암세포 표면에서 발현한다는 것을 알 수 있고 TLS는 미분화성 암세포 성장에 그 기능이 알려져 있음으로 표면의 TLS를 인식하여 억제하는 것이 실제로 암세포 성장억제에 역할을 하는지 2-E2항체로 실 험해 보았다. 80% 정도로 건강하게 자란 암세포 주 A549, MDA-MB435, Colo-205, Choi-CK세포를 트립신으로 처리하여 떼어주고, 세포수를 헤모사이토미터(Hemocytometer)를 이용하여 측정하였다. 세포수를 0.3~ 1×10⁴개/웰로 희석하여 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 뒤 5% CO₂, 95% air가 공급되는 CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 그 후 2-E2항체 6 μg을 배양 배지 100 ㎕에 넣어 섞어주고, 세포가 자라고 있는 웰의 배지를 제거한 후에 넣어주었다. 그리고 대조군 또한 배지를 제거한 후 항체 없이 새로운 배양배지 100 ㎕ 넣은 뒤, 48 시간 더 배양하고 WST-8 solution [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium salt]을 10 ㎕/웰 씩 첨가하여 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 용해된 포마잔(formazan) 산물의 흡광도는 ELISA 판독기를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 결과는 대조군의 살아있는 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 비율로 나타내었다. 실험은 3회 이상 측정하였으며 항체 2-E2는 폐암세포(A549)나 담도암세포 (Choi-CK)에는 성장억제기능이 관찰되지 않았으나 유방암 세포주 MDA-MB-435의 성장을 약 20% 억제하고 Colo-205 성장을 약 25% 정도 억제하였다 (도 12).

<실시예 6> 단일클론항체 2-E2 항체유전자 및 아미노산 분석

<6-1> 단일클론항체 2-E2 유전자 클로닝

본 발명을 통해 미분화 배아줄기세포의 표면의 TLS를 인식하며 유방암 세포와 대장암세포 성장을 억제 할 수 있는 새로운 항체 2-E2를 제조하였다. 이 항체가 기존의 항체와 다른 새로운 항체인지 살펴보기 위해 2-E2 항체 유전자를 클로닝하여 아미노산 서열을 결정하고 기존 항체 서열과 비교 분석하였다. 먼저 RNA를 추출하여 cDNA유전자를 클로닝하기위해 왕성하게 자라는 하이브리도마 2-E2 세포 5X10⁶ 개를 원심 분리하여 수확한 후 찬 PBS로 세척 하고 1ml의 RNA-Bee (TEL-TEST사, 미국)를 넣고 격렬히 흔들어서 섞었다. 실온에서 5분 반응시키고 200 ㎕ 클로로포름를 넣고 다시 세차게 흔든 후 얼음에서 5분 보관하고 4℃ 12,000 x g, 15분 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 양과 동량의 페놀/클로로포름을 넣고 격렬히 섞은 후 원심분리하고 상층액을 다시 회수한 후 1회 더 페놀/클로로포름 추출을 반복하고 상층액을 회수한 후 클로로포름만 넣어서 최종 추출한 후 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 동량의 이소프로판을 넣은 후 실온에서 10분 방치 후 실온에서 12,000 xg, 5분 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 75% 에탄올로 RNA를 세척 한 후 물기를 완전히 없앤 후 공기 중에서 RNA침전물을 말렸다. 디에틸피로카보네이트(Diethyl Pyrocarbonate, Sigma사, 미국)처리된 증류수 50 ㎕에 녹인 다음 A260을 측정하여 RNA양을 정량하였다. 항체 유전자를 클로닝하기 위해서는 알려진 중합효소연쇄반응 프라이머를 변형한 후 사용하였다 (Wang, et al J. Immunol. Methods 233, 167-177, 2000).

4μg의 전체 RNA를 70℃ 10분간 변성 시키고 이 RNA에 중쇄 클로닝을 위해서는 IgG1 불변영역에 해당하는 중합효소연쇄반응 프라이머인 염기서열 5'-GGA GTC GAC ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC-3'인 올리고뉴클레오타이드 25 pmole과

중쇄항체 가변영역 N말단에 해당하는 프라이머인 염기서열 5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC-3' 와 5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3' 인 올리고뉴클레오타이드를 각각 25 pmole을 섞어 전체 12 ㎕로 맞추고 8 ㎕ ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron사, 한국)를 넣어 역전사중합효소 연쇄반응혼합액을 만들었다. 경쇄클로닝을 위해서는 카파사슬 불변영역에 해당하는 프라이머인 5'-GGT GTC GAC GGA TAC TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3' 올리고뉴클레오타이드 25 pmole과 카파사슬 가변영역 N 말단에 해당하는 프라이머인 5'-CGG AAG CTT GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3' 올리고뉴클레오타이드 25 pmole을 사용하였다. 중합효소연쇄반응 생산물의 효율적인 클로닝을 위하여 경쇄의 경우는 3'-프라이머 말단에 SalI 제한효소 자리를 부여하였고, 5’-프라이머 경우 HindIII 제한효소자리를 부여하였다. 중쇄경우에는 5’-프라이머에는 EcoRI, 3' 프라이머에는 SalI 제한효소 자리를 부여하였다. 중쇄 및 경쇄반응액을 각각 섞은 후 먼저 45℃에서 30분 간 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성한 후 94℃에서 1분, 45℃에서 1분, 72℃에서 2분으로 30회 반응시켰다. 그 결과 중쇄 불변영역에 해당하는 DNA절편으로 추정되는 길이인 약 400bp,경쇄 불변영역 해당되는 DNA절편으로 추정되는 길이인 약 390bp에 해당되는 위치에서 증폭된 DNA를 얻을 수 있었다 (도 13).

<6-2> 단일클론항체 2-E2 유전자의 클로닝 및 염기서열의 분석

상기 실시예 에서 증폭해낸 2-E2 항체 유전자를 클로닝하기위하여 먼저 중합효소연쇄반응 산물을 중쇄는 EcoRI과 SalI으로 처리하고 경쇄는 HindIII와 SalI으로 처리한 후 1.4 % 아가로스 젤에 전개시켜서 GeneClean II (Bio101사, 미국)로 약 400과 390bp에 해당하는 DNA를 분리하였다. 중쇄유전자를 클로닝할 벡터로 사용할 pBluescript KS+를 EcoRI과 SalI으로 처리하고 경쇄유전자 클로닝벡터로는 pBluescript SK+를 HindIII와 SalI으로 처리한 다음 GeneCleanII (Bio101사, 미국)로 분리하였다. 이 두 DNA를 T4 DNA ligase (New England Biolab사, 미국)를 사용하여 연결하고 대장균 DH5α에 CaCl₂방법으로형질 전환한 다음, 중쇄 경우 약 400bp 크기의 DNA삽입물을 가진 클론, 경쇄 경우 약 390bp 크기를 가진 대장균 클론들을 선발하였다.

항체 유전자들의 DNA 염기서열분석을 위하여 상기의 여러 클론들을 50 μg/ml의 ampicillin이 함유된 3 ml의 LB 배지에서 밤새 배양한 후 DNA miniprep kit (Intron사 한국)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하고 각각의 DNA 삽입물의 염기서열을 결정하였다. 중쇄 및 경쇄 cDNA의 염기서열을 분석한 결과 이 면역유전자들은 항체구조에 특징적인 잔기와 배열을 완벽하게 갖추고 있으며 (도 14), 구체적으로 보면 면역글로뷸린 여러 그룹 가운데서 중쇄는 생쥐 서브 그룹 Ⅱ(A)에 속한다. 항원을 인식하는 CDR 잔기로는 중쇄의 경우 순서대로 서열번호를 붙일 때, CDR1은 26-35, CDR2는 50-66, CDR3는 99-113에 해당하였다(도 14). 구조상 필수적인 디설피드 결합은 중쇄의 경우 Kabat 숫자의 22번과 96번 시스테인이 관여하였 다. 이 유전자의 분석 결과로부터 중쇄 유전자는 기능적임을 확인할 수 있었으며 유전자은행의 공지 항체 서열과 비교분석으로 새로운 항체 중쇄임을 확인할 수 있었다. 경쇄는 생쥐 서브 그룹 Ⅱ에 속한다. 항원을 인식하는 CDR 잔기로는 순서대로 서열번호를 붙일 때, CDR1은 25-41, CDR2는 56-62, CDR3는 95-102에 해당하였다 (도 15). 구조상 필수적인 디설피드 결합은 Kabat 숫자의 24번과 88번 시스테인이 관여하였다. 이 유전자의 분석 결과로부터 경쇄 유전자는 기능적임을 확인할 수 있었으며 유전자은행의 공지 항체 서열과 비교분석으로 새로운 항체 경쇄임을 확인할 수 있었다. 이런 결과는 2-E2항체가 새로운 아미노산 서열을 가진 항체라는 것을 말해준다.

도 1A는 플로우 사이토미트리(Flow cytometry) 분석을 통하여 미분화 인간 배아줄기세포의 미분화 마커인 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81은 양성이고 분화마커인 SSEA1은 음성인 것을 보여준 그림이고,

도 1B는 플로우 사이토미트리 분석을 통하여 20일 이상 레티노산으로 분화시킨 인간 배아줄기세포에서 미분화 마커인 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81은 음성이고 분화 마커인 SSEA1은 약하게 양성인 것을 보여준 그림이다 (실선은 각 단일클론항체이고, 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 것이다).

도 2는 항체 2-E2를 생쥐 복수액에서 프로테인G 세퍼로스 칼럼 크로마토그래피(Protein G sepharose column chromatography)로 정제하여 10% SDS-PAGE로 분석한 그림으로 HC는 중쇄, LC는 경쇄를 나타낸 것이다.

도 3은 플로우 사이토미트리 분석을 통해서 본 발명의 단일클론항체 2-E2가 레티노산 분화 H9 세포 (RA), 10일째의 배아체(EB), 생쥐배아섬유아세포(MEF), 생쥐배아줄기세포(mESC), 배아 암세포(NT-2/D1), 인간 말초혈액단핵구(PBMC), 인간 말초혈액 림파구(PBL)에 결합하는 정도를 보여주는 그림으로 배아체(EB)에 대한 일부 항체의 약간의 결합 능이 남아있는 것 외에는 모두 결합하지 않는 것을 보여준다 (실선은 단일클론항체 2-E 2이고, 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 음성 대조군 자료이다).

도 4는 플로어 분석을 통해서 본 발명의 단일클론항체 2-E 2가 다양한 암세포에 결합하는 정도를 보여주는 그림이다 (실선은 단일클론항체 2-E 2이고, 붉은 바탕은 2차 항체만 포함한 음성 대조군 자료이다).

표 1은 항체 2-E 2가 다양한 세포에 대한 결합 정도를 보여주는 것이다.

도 5는 이중 형광 플로어 통해 본 발명의 단일클론항체 2-E 2 항체와 인간 배아줄기세포 미분화 마크로 알려진 3, 4, -1-60, -1-81 항체가 거의 비슷한 비유로 동시에 미분화 인간 배아줄기세포에 결합하고 있음을 보여주는 그림이다. 사각형 내의 숫자는 2-E 2와 각각의 미분화 마크들이 동시에 염색되는 배아줄기세포위 백분율이다.

도 6은 4, 7, 10, 14일 날짜별로 배양한 인간배아줄기세포()와 배아체세포(EB)에 대한 플로우 사이토미트리 분석에서 2차 항체만의 결합정도를 0 퍼센트로해서 단일클론항체 2-E2의 상대적 결합력을 백분율로 보여준 것이다. 배아체에서 날짜가 경과할 때 2-E2항체의 결합력이 급격히 감소하는 것을 보여주고 있다.

도 7는 미분화 인간 배아줄기세포 표면을 바이오틴화(biotinylation)한 후에 단일클론항체 2-E2를 사용하여 면역 침강시킨 후에 침강된 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분석하여 (오른쪽) 다시 웨스턴 블라팅으로 PVDF 막으로 옮기고 거기서 스트렙타비딘-HRP (SA-HRP)로 분석한 그림이다 (왼쪽). (항체를 빼고 똑같은 실험을 한 것을 음성 대조군 (No Ab)으로 하였다). 70 kDa 아래에 침강된 단백질이 보인다.

도 8은 인간 배아줄기세포에서 2-E2항체로 면역 침강시킨 단백질을 SDS-PAGE에서 분리하여 트립신으로 절단한 후 얻은 펩타이드를 MALDI-TOF분석을 통해 본 발명의 단일클론항체 2-E2가 인식하는 항원을 매스 스펙트럼에서 확인하였을 때의 펩타이드 매스 핑거프린팅(peptide mass fingerprinting; PMF) 리스트로서 각 펩타이 드가 실제 TLS 단백질 아미노산 서열의 어디에 해당되는지 밑줄로 표시한 그림이다.

도 9는 본 발명의 단일클론항체 2-E2가 TLS 단백질을 인식하여 면역침강시키는 지 재확인하기 위해 TLS를 인식하는 생쥐 단클론항체(α-TLS, BD)를 사용하여 미분화 인간 배아줄기세포에서 2-E2와 TLS으로 면역침강시킨 단백질을 스트렙타비딘-HRP(A)와 α-TLS로 웨스턴 블랏(B)하여 확인한 그림이다. 표면단백질은 2-E2에의해 면역침강되고 그 침강된 단백질은 α-TLS에의해 인식되는것이 보이지만 α-TLS는 표면의 TLS를 면역침강시키지 못하는 것을 볼 수 있다.

도 10은 면역세포화학염색을 통하여 2-E2항체와 공지의 TLS항체가 미분화 인간 배아줄기세포 표면에 결합하는지를 보여주는 그림으로써 2-E2항체는 바이오틴을 붙여서 사용하였으며, 형광이 연결된 2차 항체로 스트렙타비딘-Cy3를 사용하였으며 공지의 TLS 항체는 항-생쥐 IgG-FITC를 사용하였으며, 2-E2만 염색되는 것을 보여준다. 핵은 DAPI로 염색하여 푸른색으로 보인다. 크기막대(scale bar)는 250 μm이다.

도 11. 면역세포화학염색을 통하여 2-E2항체와 공지의 TLS항체가 미분화 인간 배아줄기세포 내부에 결합하는지를 보여주기 위해서는 세포를 고정한 후 0.1% 트리톤 X-100으로 처리하고 염색하였다. 공지의 TLS 항체와 항-생쥐 IgG-FITC를 먼저 결합시키고(녹색) 바이오틴 2-E2 항체와 스트렙타비딘-Cy3(붉은색)를 나중에 결합하였다. 핵내 동시에 염색된 것은 노란색으로 바뀐 것을 볼 수 있다.핵은 DAPI로 염색하여 푸른색으로 보인다. 크기막대(scale bar)는 250 μm이다.

도 12는 2-E2항체에 의하여 폐암세포 A549, 유방암세포 MDA-MB435, 대장암세포 Colo-205, 담도암세포 Choi-CK의 성장이 억제되는 효과를 나타낸 것으로서, 항체의 음성대조군으로서는 항체를 넣지 않거나 (control), 배양 중인 각각의 세포에 항체 0.06μg/μl를 넣고 48 시간 배양한 후, 세포의 성장정도를 항체를 넣지 않은 control에 비해 백분율로 표현한 것이다.

도 13은 항체 2-E2 유전자를 클로닝하기위해 하이브리도마 2-E2에서 전체 RNA를 추출한 후를 역전사 효소-중합효소연쇄반응을 이용하여 중쇄유전자 (HC)와 경쇄유전자(LC)의 가변영역을 증폭한 그림이다.

도 14은 2-E2 항체 중쇄 유전자 가변영역의 염기서열과 아미노산 서열을 표시한 것으로 항원과 결합하는 CDR(Complementarity Determining Region)과 중요 아미노산의 잔기 위치를 표시한 그림이다. 염기서열위의 숫자는 Kabat numbering에 다른 숫자이다.

도 15은 2-E2 항체 경쇄 유전자 가변영역의 염기서열과 아미노산 서열을 표시한 것으로 항원과 결합하는 CDR(Complementarity Determining Region)과 중요 아미노산의 잔기 위치를 표시한 그림이다. 염기서열위의 숫자는 Kabat numbering에 다른 숫자이다

[표1]

서열목록제출서에 첨부하여 제출

Claims

서열목록 6의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열목록 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 인간 배아줄기세포 특이적인 단일클론항체 2-E2.
청구항 1에 있어서,

상기 단일클론항체는 인간 배아줄기세포에는 결합하고 배아체로 분화시 결합능력이 현저히 감소하며, 생쥐 배아줄기세포나 생쥐배아섬유아세포에는 결합하지 않는 특징을 나타내는 단일클론항체 2-E2.
청구항 1에 있어서,

상기 단일클론항체는 인간 배아줄기세포 표면에서 약 68kDa 단백질을 인식하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 2-E2.
청구항 1에 있어서,

상기 단일클론항체는 IgG1.κ 아이소타입이며, 인간 배아줄기세포 표면의 TLS 단백질을 인식하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 2-E2.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체 2-E2을 포함하는 것을 특징으로 하는 미분화 인간 배아줄기세포의 검정 키트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체 2-E2을 가하여 미분화 인간 배아줄기세포를 분리하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체 2-E2을 포함하는 것을 특징으로 하는 미분화 인간 배아줄기세포 제거용 조성물.
중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물로부터 얻은, 불멸화된 세포에 융합된 B세포를 포함하며, 청구항 1의 단일클론항체 2-E2 또는 그의 항원 결합 부위를 생산하는 하이브리도마.
유방암 및 대장암 세포에서 TLS의 활성이나 발현을 억제하여 유방암과 대장암의 성장을 억제하는 약제학적 조성물
제9항에 있어서, TLS의 세포막 결합 형태나 세포막에서 유리된 형태를 인식하는 단일클론항체 혹은 그것의 조각이나 변형 유도체
제9항에 있어서, 유방암이나 대장암 세포의 TLS의 발현을 감소시키거나 억제하는 antisense oligoneucleotide, SiRNA, 그리고 ShRNA.
제9, 10항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 6 과 7을 특징으로 하는 단일클론항체 2-E2 및 이 단일클론항체를 이용한 변형 유도체로, 이들 항체나 항체 단편에 방사성 동위원소를 붙이거나 생물학적 또는 화학적 발광화합물을 붙이거나 특정 효소나 metal chelate를 붙이는 방법을 포함함 .