JP6742581B2 - 標的細胞障害活性を有するiPS/ES細胞特異的抗体及びその用途 - Google Patents
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Description
このように、多能性幹細胞を用いた再生移植治療の実用化には、腫瘍化の問題を克服することが不可欠である。これまでにiPS細胞由来の発癌の抑制に対しては、癌遺伝子を含まない初期化因子の組合せの探索、非ウイルスベクターの使用、タンパク質導入によるiPS細胞の樹立といったより安全なiPS細胞樹立という観点からは様々な試みがなされてはいる。しかし、これらはiPS作製時の工夫による発癌リスクの多少の抑制という間接的なアプローチに過ぎず、完全に発癌を阻止できるレベルのものではない。
また、ES細胞にも共通する多能性幹細胞であるがゆえの未分化細胞の残存による腫瘍化(目的細胞以外の多種細胞が混在して腫瘤を形成する奇形腫)リスクに対しても、有効な解決策は提供されていない。
そこで、幹細胞研究および再生医療研究においては、EC細胞と反応せず、iPS/ES細胞とのみ反応する抗体の出現が期待されていた。最近、Chooは、ヒトES細胞を免疫原として用い、EC細胞とは反応しない抗ヒトES細胞抗体(mAb84)を報告したが(特許文献1)、この抗体がヒトiPS細胞にも反応するか否かは記載されていない(特許文献2)。
しかしながら、R-10GはヒトiPS/ES細胞に対して細胞障害活性を有していないので、当該抗体を、分化細胞集団中の残存ヒトiPS/ES細胞の除去に使用するには、フローサイトメトリーやアフィニティー担体を用いた分離操作が必要となる。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[1] iPS及びES細胞表面上の脂質性物質をエピトープとして認識し、かつEC細胞を認識しないモノクローナル抗体。
[2] iPS及びES細胞がヒト由来である、上記[1]記載の抗体。
[3] ハイブリドーマR-17F(受託番号:NITE BP-01425)により産生されるモノクローナル抗体、又は該モノクローナル抗体が認識する脂質性物質の領域と同一の領域をエピトープとして認識するモノクローナル抗体である、上記[1]又は[2]記載の抗体。
[4] 脂質性物質が糖脂質であり、前記領域が下記一般式:
Fuc-Hex−HexNAc-Hex-Hex
(式中、Fucはフコース、Hexはヘキソース、HexNAcはN-アセチルヘキソサミンを示す。)で表される糖鎖を含む、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の抗体。
[5] 少なくとも糖脂質中の下記式:
Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc
(式中、Fucはフコース、Galはガラクトース、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、Glcはグルコースを示す。)で表される糖鎖を含む領域をエピトープとして認識する、上記[4]記載の抗体。
[6] (a)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含むCDR
を含む、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の抗体。
[7] (1)配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
(2)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む上記[6]記載の抗体。
[8] 標的細胞に対して細胞障害活性を有する、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の抗体。
[9] 上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体を含有してなる、iPS又はES細胞検出用試薬。
[10] 細胞サンプルを上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体と接触させ、該抗体と結合した該サンプル中の細胞を検出することを含む、iPS又はES細胞の検出方法。
[11] 上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体を含有してなる、iPS又はES細胞除去剤。
[12] 前記抗体に対する二次抗体をさらに含有してなる、上記[11]記載の剤。
[13] 細胞集団を上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体と接触させることを含む、該細胞集団中のiPS又はES細胞の除去方法。
[14] 細胞集団を、さらに前記抗体に対する二次抗体に接触させることを含む、上記[13]記載の方法。
[15] iPS又はES細胞から分化させた細胞集団を上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体と接触させ、生存する細胞を回収することを含む、未分化細胞を含まない均一な分化細胞集団の作製方法。
[16] 前記iPS又はES細胞から分化させた細胞集団を、さらに前記抗体に対する二次抗体に接触させることを含む、上記[15]記載の方法。
[17] iPS又はES細胞から分化させた細胞集団と、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の抗体とを組み合わせてなる、細胞移植療法剤。
[18] 上記[15]又は[16]記載の方法により得られる分化細胞集団を含有してなる、細胞移植療法剤。
本発明は、iPS及びES細胞を特異的に認識し得るモノクローナル抗体(以下、「本発明の抗iPS/ES細胞抗体」、あるいは単に「本発明の抗体」という場合がある。)を提供する。本抗体は、さらに(a) EC細胞を認識しないこと、及び(b) iPS及びES細胞の表面上に存在する脂質性物質、より具体的には糖脂質を認識することを特徴とする。SSEA-3やSSEA-4等の糖脂質を認識する既知の抗iPS/ES細胞抗体は、EC細胞をも認識するので、本発明の抗iPS/ES細胞抗体は、これら既知抗体が認識する糖脂質とは異なる脂質性分子の構造を認識すると考えられた。実際、R-17F抗体及びSSEA-4抗体を用いたヒトiPS細胞の全脂質成分のFar-eastern blottingは、両抗体が異なる脂質性物質を認識した(図11B参照、SSEA-4抗体に関するデータ省略)。また、R-17F抗体のヒトiPS細胞に対する反応性は、セラミドを、ガングリオシド系列やグロボシド系列の糖脂質生合成の出発物質であるグルコシルセラミドに変換する酵素反応を阻害することにより低減することから(図11A参照)、該抗体が認識する脂質性分子はグルコシルセラミドを出発物質とする糖脂質であることが示唆された。
前記Far-eastern blotting(図11B)において、R-17F抗体と結合したTLCバンドをMALDI-TOF MS(図11C参照)及びタンデムMSで解析した結果、R-17F抗体は、Fuc-Hex-HexNAc-Hex-Hex-セラミド(Fuc: フコース、Hex: ヘキソース、HexNAc: N-アセチルヘキソサミン)を認識して結合することが示された。さらに、該構造解析結果に基づき、ラクト系及びネオラクト系糖鎖を含む合成脂質とR-17F抗体との結合活性を調べたところ、R-17F抗体はLacto-N-fucopentaose I(Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc; Fuc: フコース、Gal: ガラクトサミン、GlcNAc: N-アセチルグルコサミン、Glc: グルコース)(本明細書中「LNFP I」と略記する場合もある)を含む脂質とは結合したが、末端にフコースを含まないLacto-N-tetraoseやLacto-N-neotetraose、あるいは分岐を有するルイスaもしくはルイスb糖鎖を含む脂質には結合しなかった(図12)。
従って、好ましい実施態様において、本発明の抗体は、フコースを末端とする直鎖状のペンタオース、即ち、Fuc-Hex-HexNAc-Hex-Hexを含む糖脂質、好ましくはLNFP Iもしくはそれと対応するネオラクト系糖鎖であるFuc(α1-2)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glcを含むスフィンゴ糖脂質をエピトープとして認識することにより特徴づけられる。
抗iPS/ES細胞抗体が標的細胞に対して細胞障害活性を有するか否かは、自体公知の方法(例えば、WO 2007/102787参照)により調べることができる。当業者は、抗体の使用目的に応じて、細胞障害性抗体又は非細胞障害性抗体のいずれかを選択することができる。
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量5-7万の重鎖と2-3万の軽鎖から構成される(免疫学イラストレイテッド (I. Roitt, J. Brostoff, D. Male編))。重鎖は、通常約440個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにIgGには、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4が存在し、それぞれγ1、γ2、γ3、γ4とよばれている。軽鎖は、通常約220個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、L型とK型の2種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な2本の重鎖及び2本の軽鎖が、ジスルフィド結合(S-S結合)及び非共有結合によって結合され、分子量15-19万である。2種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖2本と同一の重鎖2本からできている。
R-17F抗体の場合、重鎖可変領域のCDRは、配列番号:8で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号26〜33(CDR1-H)、51〜60(CDR2-H)及び99〜103(CDR3-H)であり、軽鎖可変領域のCDRは、配列番号:10で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号27〜32(CDR1-L)、50〜52(CDR2-L)及び89〜97(CDR3-L)である。
(1)(a)Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Trp(配列番号:1)で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(b)Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr(配列番号:2)で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(c)Glu Gly Phe Gly Tyr(配列番号:3)で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(d)Gln Asp Val Ser Thr Ala(配列番号:4)で示されるアミノ酸配列を含むCDR、
(e)Trp Ala Ser(配列番号:5)で示されるアミノ酸配列を含むCDR、及び
(f)Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg Thr(配列番号:6)で示されるアミノ酸配列を含むCDRを含む抗体、あるいは
(2)配列番号:1〜6に示されるアミノ酸配列より選択される1以上(例、1、2、3、4、5もしくは6)のアミノ酸配列の各々において、1もしくは2個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された、上記(a)〜(f)のCDRを含む抗体であって、iPS及びES細胞を特異的に認識するが、EC細胞を認識しないものである。
(1)上記(a)〜(c)のCDRを含む軽鎖可変領域と、上記(d)〜(f)のCDRを含む重鎖可変領域とを含む抗体、又は
(2) 配列番号:1〜6に示されるアミノ酸配列より選択される1以上(例、1、2、3、4、5もしくは6)のアミノ酸配列の各々において、1もしくは2個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された、上記(1)の軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体であって、iPS及びES細胞を特異的に認識するが、EC細胞を認識しないものである。
(1)配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、又は
(2)配列番号:8及び10のいずれか一方もしくは両方において、1以上、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、いっそう好ましくは1〜数(例、1、2、3、4もしくは5)個のアミノ酸残基が置換及び/又は欠失及び/又は付加及び/又は挿入された、上記(1)の軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体であって、iPS及びES細胞を特異的に認識するが、EC細胞を認識しないものである。
本発明の抗体は、抗原決定基(エピトープ)を特異的に認識し、結合するための相補性決定領域 (CDR) を少なくとも有するものであれば、分子の形態に特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール (PEG) 等の蛋白質安定化作用を有する分子などで修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
本発明の抗体は自体公知の抗体製造法によって作製することができる。以下に、本発明の抗体作製のための免疫原(iPS/ES細胞)の調製方法、並びに該抗体の製造方法について説明する。
本発明の抗体の作製に用いられる抗原としては、iPS細胞、ES細胞又は細胞表面の脂質性物質を含有するその画分(例、膜画分)などを使用することができる。
また、iPS細胞は、様々な公的もしくは私的寄託機関から入手することもでき、また市販されている。例えば、ヒトiPS細胞株201B7及び235G1は理研バイオリソースセンターのセルバンクから入手することができ、また、Tic(JCRB1331)は独立行政法人医薬基盤研究所から入手可能である。
また、ES細胞は、様々な公的もしくは私的寄託機関から入手することもでき、また市販されている。例えば、ヒトES細胞株H1及びH9はウィスコンシン大学のWiCell研究所細胞バンクより、KhES-1、-2及び-3は京都大学再生医科学研究所あるいは理研バイオリソースセンターのセルバンクより、それぞれ入手することができる。
あるいは、本発明の抗体の作製のための免疫原として、iPS又はES細胞の細胞膜画分を用いることもできる。該細胞膜画分は、iPS又はES細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈殿させる(必要に応じて、さらに密度勾配遠心等により細胞膜画分を精製する)ことにより、調製することができる。
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
上記のようにして調製された免疫原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常1〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。温血動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、イヌ、モルモット、ヒツジ、ロバ、ニワトリ等が用いられるが、マウス、ラット及びウサギが好ましい。
上記のようにして得られたiPS又はES細胞に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、次いで2次スクリーニングに供される。2次スクリーニングでは、免疫原として使用されたiPS又はES細胞だけでなく、ES又はiPS細胞、EC細胞、EG細胞、mGS細胞等の多能性幹細胞もプローブとして使用される。2次スクリーニングの結果、iPS及びES細胞とは反応するが、ES細胞等のiPS及びES細胞以外の多能性幹細胞並びに体細胞とは反応しなかったモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、本発明の抗iPS/ES細胞抗体を産生するハイブリドーマとして選択することができる。
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法[例:塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例:DEAE、QEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など]に従って行うことができる。
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
別の実施態様において、こうして得られた抗iPS/ES細胞抗体の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAを、該抗体を産生するハイブリドーマのcDNAライブラリーから単離し、常法に従って、目的の宿主細胞で機能的な適当な発現ベクターにクローニングすることができる。次いで、こうして得られた重鎖及び軽鎖発現ベクターを宿主細胞に導入する。有用な宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、サル由来のCOS-7細胞、Vero細胞、ラット由来のGHS細胞などが挙げられる。遺伝子導入は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法又はカチオン性脂質を用いた方法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して抗体タンパク質を常法により精製することにより、本発明の抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、且つ家畜(家禽)として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量に本発明の抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やTiベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量に本発明の抗体を得ることも可能である。
本明細書において「キメラ抗体」とは、重鎖及び軽鎖の可変領域(VH及びVL)の配列が非ヒト動物種に由来し、定常領域(CH及びCL)の配列がヒトに由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス、ラット、ウサギ等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる動物種由来であることが好ましい。
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域(CDR)以外のすべての領域(即ち、定常領域及び可変領域中のフレームワーク領域(FR))の配列がヒト由来であり、CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス、ラット、ウサギ等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
本発明の抗体はiPS及びES細胞を特異的に認識することができるので、被検細胞サンプル中のiPS細胞又はES細胞の検出及び定量、特に免疫細胞化学的な検出及び定量に用いることができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2、Fab'、あるいはFab画分などいかなるフラグメントを用いてもよい。iPS/ES細胞に対する抗体を用いる測定法は特に制限されるべきものではなく、いかなる測定法を用いてもよい。
この目的のためには、例えば、本発明の抗体をアガロース、アクリルアミド、セファロース、セファデックス等の任意の適切なマトリクスを含む固相上に固定化することができる。該固相は、マイクロタイタープレート等の任意の適切な培養器であってもよい。サンプルを該固相と接触させると、サンプル中のiPS又はES細胞は該固相上に固定される。該細胞は適当な溶出バッファーを用いて固相から遊離させることができる。
また、後述の実施例に記載される抗iPS/ES細胞抗体R-17Fの場合、該抗体に対する二次抗体を微量添加することにより、標的細胞に対する細胞障害活性が顕著に増強される。従って、好ましい実施態様においては、本発明の標的細胞障害性抗iPS/ES細胞抗体及び該抗体に対する二次抗体の存在下に、細胞サンプルをインキュベートすることができる。
例えば、ヒトES細胞を放射線照射したC3H10T1/2細胞株と共培養して嚢状構造体(ES-sac)を誘導することにより造血前駆細胞に分化させることができる(Blood, 111: 5298-306, 2008)。ES細胞からの神経幹細胞・神経細胞の分化誘導法としては、胚様体形成法(Mech Div 59(1) 89-102, 1996)、レチノイン酸法(Dev Biol 168(2) 342-57, 1995)、SDIA法(Neuron 28(1) 31-40, 2000)、NSS法(Neurosci Res 46(2) 241-9, 2003)など様々な方法が知られている。ES細胞から心筋細胞への誘導方法としては、これまでにレチノイン酸、TGFβ1、FGF、dynorphin B、アスコルビン酸、一酸化窒素、FGF2とBMP2、Wnt11、PP2、Wnt3a/Wnt阻害剤などの因子を培地に添加する方法や、Nogginによる心筋分化誘導法(Nat Biotechnol 23(5) 611, 2005)などが報告されている。さらに、SDIA法およびSFEB法によるES/iPS細胞からの網膜細胞の分化誘導法(Nat Neurosci 8 288-96, 2005)なども知られているが、これらに限定されない。
反応終了後、培地を除去し、新鮮な培地もしくはPBS等の適当な緩衝液で細胞を洗浄した後、常法により生細胞を回収することにより、未分化細胞が殺傷除去された均一な分化細胞集団を得ることができる。
本発明の移植療法剤は、細胞の凍結保存に通常使用される条件で凍結保存された状態で提供され、用時融解して用いることもできる。その場合、血清もしくはその代替物、有機溶剤(例、DMSO)等をさらに含んでいてもよい。この場合、血清もしくはその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが約1〜約30% (v/v)、好ましくは約5〜約20% (v/v) であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが0〜約50% (v/v)、好ましくは約5〜約20% (v/v) であり得る。
本発明の抗体を有効成分として含有する薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化して投与することができる。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ビークル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
1) 抗体
抗ヒトTRA-1-60モノクローナル抗体 (Clone # TRA-1-60, マウスIgM)、抗ヒトTRA-1-81モノクローナル抗体 (Clone # TRA-1-81, マウスIgM) 及び抗ヒト/マウスSSEA-4モノクローナル抗体(clone# MC813, マウスIgG3) はSanta Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) から購入した。抗ヒト/マウスSSEA-1抗体 (clone#MC480, マウスIgM)、抗ヒト/マウスSSEA-3モノクローナル抗体 (clone#MC631, ラットIgM) 及び抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体 (clone# 222328, mouse IgG2A) はR & D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) から購入した。抗ヒトポドカリキシン様タンパク質I (clone mAb 84, マウスIgM) は Millipore (Billerica, Hercules, CA) から購入した。抗ヒトNanogモノクローナル抗体及び抗ヒトOct4モノクローナル抗体は、リプロセル (神奈川県) 及びAbcum (Cambridge, UK) から、それぞれ購入した。
ヒトiPS細胞株Tic (JCRB1331)およびヒトEC細胞株NCR-G3(JCRB1168)は、独立行政法人 医薬基盤研究所(大阪府)のJCRB細胞バンクから、201B2及び201B7は、京都大学iPS細胞研究所 (CiRA)から、ヒトES細胞株KhES-3は、京都大学再生医科学研究所から、H9細胞はWisconsin International Stem Cell Bank, WiCell(Madison, WI)から、それぞれ供与された。これらの細胞は、ベントキャップつき長方形型カントネック細胞培養フラスコ (25 cm2, Corning, NY) 中、マイトマイシンC処理したフィーダー細胞 (マウス胎児線維芽細胞 (MEF), 5 x l03 cells/cm2) 上で、37 ℃、5% CO2の条件下で培養した。ヒト胚性がん細胞株2102Epは、シェフィールド大学のピーター・アンドリュース教授から供与された。14週のヒト胎児(雄性)肺組織由来の線維芽細胞様細胞株MRC-5 (JCRB9008) はJCRB細胞バンクより入手した。
ヒト胎児線維芽細胞MRC-5に、4初期化遺伝子Oct3/4, Sox2, Klf4, およびc-Myc (Takahashi et al., 2007) を導入して作製したヒトiPS細胞株Tic(Toyoda et al., 2011)を、免疫原及びスクリーニング用プローブとして用いた。無血清培地であるES培地 (KNOCKOUT DMEM/F-12 (400 mL, Invitrogen-Life technologies, Carlsbad, CA), MEM非必須アミノ酸溶液 (4.0 mL, Invitrogen-Life technologies, Carlsbad, CA), 200 mM L-グルタミン (5.0 mL), KNOCKOUT Serum Replacement (100 mL, Invitrogen-Life technologies, Carlsbad, CA), 及び55 mM 2-メルカプトエタノール (0.925 mL)、10 μg/ml FGF-Basic human (Sigma)を1000倍希釈になるように加えたもの(以下 iPS培養培地))で維持したTic細胞を、hESF9培地 ((Furue et al., 2008)HEPES不含ESF基本培地 (株式会社細胞科学研究所, 仙台, Furue et al., 2005) にアスコルビン酸2-リン酸エステル、6因子 (ヒト組換えインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、2-エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、オレイン酸-脂肪酸不含ウシ血清アルブミン (FAF-BSA) コンジュゲートからなる)、ウシヘパラン硫酸ナトリウム塩及びヒト組換えFGF-2 (片山化学工業, 大阪) を添加) に、以前に記載した方法により移した (Furue et al., 2008)。37℃で4〜5日間インキュベートした後、1群のフラスコ内の細胞 (3 x 105〜1 x 106細胞/25 cm2フラスコ) を、0.1% EDTA-4Na PBS溶液 (1 mL/フラスコ) で処理して回収し、1,000 rpmで2分間遠心して細胞を集め、PBSで洗浄した後、免疫原として使用する直前まで-80℃で保存した。別の群のフラスコ内の細胞を用いて、細胞スクリーニングプレートを調製した。これらのフラスコに、解離した細胞が生存するようにROCK阻害剤 (10 μM Y27632, 和光純薬工業, 大阪) を添加した (Watanabe et al., 2007)。37℃で1時間インキュベートした後、細胞をアキュターゼ (1 mL, Millipore, Billerica, MA) を用いて回収、遠心して集め、S培地で洗浄後、hESF9培地に懸濁して、フィブロネクチンでコーティングした96-ウェルプレートに播種した (5 x 103細胞/ウェル, BD, Franklin Lakes, NJ)。細胞を1% 酢酸/エタノール (100 μL/ウェル) で15〜30分間固定した後、PBSで洗浄し、プレートを使用直前まで‐80℃にて保存した。
2つの異なるプロトコルを用いて、マウスをヒトiPS細胞で免疫した。プロトコルAでは、凍結融解したTic細胞 (0.5 mL PBS中1.5 x 107細胞) を等容のフロイント完全アジュバント (CFA, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) で乳化し、8週齢の雌性C57BL/6マウスに、0日目に腹腔内注射した (200 μL/マウス)。その後、25日目に追加免疫を行い、28日目にマウスを安楽死させた。プロトコルBでは、Tic細胞のFCAエマルジョンをマウスに皮下注射し (200 μL/マウス)、2週間後にマウスを安楽死させた。
プロトコルAで処理したマウスの脾臓から採取したリンパ球と、プロトコルBで処理したマウスから採取したリンパ節とを混合し、ポリエチレングリコールを用いてP3U1ミエローマ細胞と融合させた。融合細胞を96-ウェル組織培養プレートに播種し、ハイブリドーマ培地 (ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン (HAT) を含むS-クローンクローニング培地CM-B, 三光純薬, 東京) を添加して選択を行った。播種後7日目にTic細胞固定プレートを用いて1次スクリーニングを行った。各ハイブリドーマの培養上清を、0.1% H2O2 (Blocker Casein, Pierce-Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) を含むブロッキング液で一晩前処理したTic細胞固定プレートに添加した。該細胞プレート中でハイブリドーマ培養上清を、室温で2時間インキュベートした後、PBSでプレートを洗浄し、2000倍希釈した西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)標識した抗マウスIgG(宝バイオ, 滋賀)を各ウェルに加え、1時間インキュベートした。洗浄後、発色基質DAB (金属増感型DAB基質キット, Pierce-Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) をプレートに加え、10〜15分間発色させた後、染色したプレートを光学顕微鏡 (オリンパスIX 7, オリンパス, 東京) 下で観察した。
ヒトiPS細胞陽性抗体を産生するハイブリドーマを2次スクリーニングに供した。2次スクリーニングでは、ヒトiPS細胞(Tic)の他、ヒトEC細胞(2102Ep)、元のヒト線維芽細胞(MRC-5)及びマウス胎児線維芽細胞(MEF)をプローブとして用いた。モノクローナル抗体のアイソタイプはマウスモノクローナル抗体アイソタイピングテストキット (AbD Serotec, Kidlington, UK) を用いて解析した。
24-ウェルプレートに播種した細胞を、4% パラホルムアルデヒド(PFA)中、室温で15分間固定し、3% FBS/PBSで1時間ブロッキングした後、種々のモノクローナル抗体(R-10G, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4, SSEA-3, SSEA-1, mAb84, Nanog, Oct4及び抗PODXL抗体) とともに、4℃で一晩インキュベートした。0.1% FBS/PBSで3回(各5分間)洗浄後、二次抗体としてAlexa Fluor 647で標識したニワトリ抗マウスIgG抗体 (Invitrogen-Life technologies, Carlsbad, CA) を用い、室温で1時間インキュベートした後、Hoechst 33342 (PBSで5000倍希釈, 同仁研究所, 熊本) で染色することにより、抗体の局在性を可視化した。次いで、細胞をIN Cell Analyzer 2000 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 及びDeveloper Toolbox ver 1.8を用いて解析した。
ゼラチンでコーティングし、B6マウス由来MEFを播種したMillipore EZ スライド (Millipore, Billerica, MA) に、Tic細胞を播種した。2日間培養後、細胞を4% PFAにて、室温で10分間固定し、3% BSA/PBSで1時間ブロッキングした。次に、細胞をR-17Fモノクローナル抗体(第1の一次抗体)と4℃で一晩インキュベートした。0.1% BSA/PBSで3回洗浄後、細胞をAlexa Fluor 488で標識したヤギ抗マウスIgG1抗体(二次抗体)と、1% BSA/PBS中、室温で30〜60分間インキュベートした。
第1〜第3の一次抗体による二重(および三重)染色のために、細胞を上記と同様にして洗浄、ブロッキングした後、第1〜第3の一次抗体(R-17F, SSEA-3及びSSEA-4)と、4℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を、Alexa Fluor 488で標識したヤギ抗マウスIgG1抗体(R-17Fに対する二次抗体)、Alexa Fluor 594標識ラット抗マウスIgM抗体(SSEA-3に対する二次抗体)及びAlexa Fluor 594標識ヤギ抗マウスIgG3抗体(SSEA-4に対する二次抗体)と、上記と同様にインキュベートした。0.1% BSA/PBSで3回洗浄後、0.1% Triton X-100/4% PFAを用い、細胞を室温で10分間固定し、次いでTO-PRO3 (PBSで500倍希釈, Invitrogen-Life technologies, Carlsbad, CA) で染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡FV1000 (オリンパス, 東京) を用いてモニタリングした。
ハイブリドーマ細胞株R-17Fをプリスタン処理したSCIDマウス (CB-17/Icr-scid Jcl) に腹腔内注射した。2週間後、該マウスから腹水(2.5 mL)を採取し、プロテインA-セファロースカラム (1 x 6.0 cm)(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) に通した。R-17Fモノクローナル抗体は、1.5 M グリシン-NaOH緩衝液 (pH 8.9)/3M NaClで該カラムに吸着し、0.1 M クエン酸-リン酸緩衝液 (pH 4.0) で溶出した。R-17Fモノクローナル抗体を含む溶出液に、3 M Tris-HCl緩衝液 (pH 9.0) 加えて、直ちにpH 7〜8に中和した。
SDS-PAGE及びウェスタンブロッティングは、それぞれLaemmli (1970) 及びTowbin et al. (1992) の方法に従って実施した。簡単にいうと、サンプルを、非還元条件下、4-15%グラジエントのSDS-アクリルアミドゲル (Mini-PROTEAN TGX-gel, BioRad Laboratories, Hercules, CA) 上の電気泳動により分離した後、ウェスタンブロッティング又はタンパク質染色のいずれかを行った。ウェスタンブロッティングについては、分離したタンパク質をImmobilion Transferメンブレン (Millipore, Billerica, MA) 上に転写した後、特異的抗体を用いてイムノブロット検出を行った。可視化には、化学発光基質キット (Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL) とHRP標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン (DAKO Cytomation, Denmark A/S) を用い、LuminoImage Analyzer, Las 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) により解析した。タンパク質染色は、クーマシー・ブリリアント・ブルーG-250 (GelCode Blue, Invitrogen-Life technologies, Carlsbad, CA) を用いて行った。
細胞調製:
ヒトiPS細胞株Ticの培養フラスコより、培養液を除去し、Dispase (1 mg/mL) を1〜2 mL添加し、37℃で約2分間インキュベーターした。顕微鏡でコロニーの周りがカールすることを確認した後、Dispaseを除いた。洗浄用培地(使用期限が切れたKO-DM/F12)を添加し、セルスクリーパーで細胞を掻き取った。得られた細胞懸濁液を、20 ℃にて、300 rpmで2分間遠心し、上清を除いた。次に、PBSを10 mL添加し、再度、20 ℃にて、300 rpmで2分間遠心し、上清を除いた。沈殿に0.25% Trypsin/EDTAを500 μL添加し、37 ℃でインキュベートした。15分後、インキュベーターから取り出し、ピペティングにより単一細胞懸濁液とした。FACS緩衝液(1% BSA/Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) 溶液、4 ℃)、9.5 mLを添加した。次に、4 ℃にて、1500 rpmで3分間遠心し、上清を除去した。沈殿を指で軽くタッピングし、FACS緩衝液(0.5〜1.0 mL)に懸濁し、細胞数を計数した (トリパンブルー染色)。以後の操作は全て4 ℃又は氷中にて行った。
1サンプル当り1×105細胞を1.5 mLチューブへ移し、4 ℃にて6000 rpmで3分間遠心し、上清を除いた。沈殿にFACS緩衝液 (1% BSA、0.1% NaN3を含むPBS) 100 μLを加え、次に、一次抗体5 μL (抗体により100倍-1000倍に希釈して使用) を加えて懸濁し、氷中に30〜45分間静置した。反応後、FACS緩衝液1 mLを加えた後、4 ℃にて6000 rpmで3分間遠心し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰り返した。次に、沈殿にFACS緩衝液100 μL及び2次抗体5 μL (約100倍に希釈して使用) を加えて懸濁した。以後の操作は全て遮光で行った。氷中に30分静置し反応させた後、FACS緩衝液1 mLを加え、4 ℃にて6000 rpmで3分間遠心し、上清を除去した。同様の洗浄を2回繰り返した後、FACS緩衝液1 mLに懸濁し、セルストレイナー付きFACSチューブへ移しFACS解析した。
1サンプル当り1×105細胞を1.5 mLチューブへ移し、4 ℃にて6000 rpmで3分間遠心し、上清を除去した。沈殿にFACS緩衝液100 μLを加えた後、一次抗体5 μL (抗体により100倍-1000倍に希釈して使用) を加え、氷中にて30〜45分間反応させた。反応後、FACS緩衝液1 mLを加え、4℃にて6000 rpmで3分間遠心し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰り返した後、沈殿にFACS緩衝液100 μLを加えた。次に、7-AAD(7-amino-actinomycin D, eBioscience,Inc. San Diego, CA) 5 μL (0.25 μg) を添加し、懸濁した。以後の操作は全て遮光で行った。試料をセルストレイナー付きFACSチューブへ移し、常温にて5分間静置した後、FACSで解析した。
継代4日目のTic細胞の培地に、スフィンゴ糖脂質グルコシルセラミド(GlcCer)生合成酵素の特異的な阻害剤であるD-PDMP (D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を20 μM添加し、4日間培養した。次いで、培養液を除き、Dispase (1 mg/mL)を1〜2 mL添加し、37℃で約2分間インキュベートした。以後は上記10)フローサイトメトリーに記した方法に従い、0.25% Trypsin/EDTA処理により単一細胞懸濁液を調製し、これらの細胞をそれぞれ、SSEA-4、TRA-1-60、R-17Fと氷水中、45分間反応させた後、セルストレイナー付きFACSチューブへ移し、FACS解析した。
ヒトiPS細胞Ticをチャンバースライドグラス上に播種、2日間iPS培養培地で培養を行い、その後、hESF9培地にR-10G抗体 100 μg、R-17F抗体 100 μg、コントロールとしてPBSを加えたものそれぞれ200 μLを調製し培地交換、72時間培養した。0h、24h、48h、72h毎に位相差顕微鏡にて観察・撮影を行った。
凍結保存したTic細胞(3.0 x 107個)に3 mLのクロロホルム/メタノール (2:1, v/v)を加え、37℃で5分間、超音波処理した後、37℃で1時間抽出した。4℃にて、2500 rpmで10分間遠心し、得られた上清をガラスチューブに移した。沈殿に2 mlのクロロホルム/メタノール/水 (1:2:0.8, v/v/v) を加え、37℃で2時間抽出した。懸濁液を4 ℃、2500 rpmで10分間遠心し、得られた上清を先の上清に合わせて全脂質抽出物とした。この全脂質抽出物を250 μLのクロロホルム/メタノール/水 (65:25:4, v/v/v) に溶解してTLC分析試料とした。TLCはHPTLCシリカゲル60アルミナプレート(Merk)(10 cm x 10 cm) を使用した。Linomat 5 (CAMAG、 Muttenz, Switzerland) を用いて試料をスポットし(5〜20 μL)、クロロホルム/メタノール/水 (65:25:4, v/v/v) を溶媒として展開した。展開終了後、風乾したTLCプレートにprimulin試薬(0.001% アセトン/水 (1:10, v/v) 溶液)を噴霧し、紫外線落射撮影装置(ATTO, 東京)を用いて365 nmにて観察し、脂質成分の分離を観察した。ついで、TLCプレート上に分離した脂質成分を滝の方法 (Taki&Ishikawa, 1997) に従い、TLC熱転写装置 (ATTO, AC-5970)を用いてPVDF膜に転写した。すなわち、TLCプレートをブロッテング溶媒(イソプロパノール/0.2% CaCl2/メタノール (40:20:7、v/v/v))に15秒間浸した後、PVDF膜、テフロン(登録商標)膜、ガラスファイバーろ紙を重ね、180 ℃に加熱した熱転写装置で30秒転写した。転写されたPVDF膜を3% BSA/PBS中で4℃、一夜ブロッキングした後、R-17F抗体 (1 μg/mL) と室温で1.5時間インキュベートして反応させた。次いで、ビオチン標識抗マウスIgG(H+L)(0.1 μg/mL)(Kirke gaard & Perry Laboratories, Inc., MD, USA)) と室温で1時間、HRP-標識ストレプトアビジン(55 ng/mL)(Pierce-Thermo Scientific, Rockford, IL) と1時間反応させた後、化学発光試薬(Pierce West Pico, Pierce-Thermo Scientific) で5分間処理し、LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) で観察した。
HPTLCプレート(10 cm×10 cm) (HPTLC silica gel 60 F254 MS-grade glass plate 、 Merck)の中央部66 mm幅に、180 μLのクロロホルム/メタノール/水(65:25:4, v/v/v)で溶解したTic 総脂質 4.0×107 細胞相当分を塗布した。HPTLCプレートを乾燥後、クロロホルム/メタノール/ミリQ水(65:25:4, v/v/v)の展開槽中で6 cm展開した(展開1回目)。HPTLCプレートをドライヤーで風乾し10分間静置した。展開したHPTLCプレートを同じ混合比の展開溶媒を入れ替えた展開槽中で8.5 cm展開した(展開2 回目)。展開後、HPTLCプレートを乾燥させたのち、展開2 回目の操作を繰り返し、あわせて3度の展開を行った。展開後のHPTLCプレートの両端各2 cmをガラス切り(先端ダイヤモンド入りガラス切り2A、東新理興 TOSHIN RIKO CO., LTD.)でカットし、カットした10 cm×2 cmのHPTLCプレートの両端部分をR-17F 1 μg/mLによるTLC-Immunostainingを行いR-17F結合脂質の検出を行った。
Preparative TLC用のプレートから、TLC-Immunostainingによって検出したR-17F結合脂質の移動度に相当するバンド部位のシリカゲルを掻き取った。掻き取ったシリカゲルをネジ口ガラス試験管に移し、3 mLのクロロホルム/メタノール/ミリQ水(65:25:4, v/v/v)を加え室温湯浴中で外から3 分間超音波処理を行い、4 ℃で一晩静置させ脂質を抽出した。ガラスSPEカートリッジ (ジーエルサイエンス)にガラスSPEろ紙フィルター(ジーエルサイエンス)をセットし、シリカゲル懸濁液を加え、濾過した。ろ液(脂質抽出液)はスピッツ型ネジ口ガラス試験管(IWAKI)に集めた。ろ過後のガラスSPEカートリッジはクロロホルム/メタノール/ミリQ水(65:25:4, v/v/v)500 μLで3 度、メタノール500 μLで2度洗浄した。これらの洗浄液はろ液(脂質抽出液)とあわせ、窒素ガス気流下で乾燥させ、R-17F抗体結合脂質とした。R-17F結合脂質を150 μLのクロロホルム/メタノール/ミリQ水(65:25:4, v/v/v)で溶解し、4 ℃にて保存した。
試料溶液1〜2 μLをガラスキャピラリーを用いて吸い取りMALDIプレートにアプライした。これにマトリックス容液(DHB,2,5-dihyroxybenzoic acid、5 mg/mL)を重層して乾燥した。島津/Kratos レーダー脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型分析装置、AXIMA Resonance(島津製作所)を用い、ポジティブモードで測定した。試料について得られたマススペクトルは m/z 1000 - 2000領域にアサイン可能な一群のシグナルを示した。主要なピークについて、MS/MS,さらにはMS3の測定を行い、推定構造を提出した(本研究は島津製作所、Kyoto, Japan の奥村毅氏、中家修一氏の協力により実施された。)。
各種精製ネオグリコリピド糖鎖をNC膜(Trans-Blot Transfer Medium Pure Nitorocellulose 0.45 μm、 Bio-Rad Laboratories, Inc.)にそれぞれ2 mm幅に1 pmol, 5 mol塗布し乾燥させた後、3%BSA/PBSに浸して4 ℃で一晩ブロッキングした。ブロッキング後、NC膜を保湿箱に移し、1%BSA/PBSで希釈したR-17F 1 μg/mLを1 cm2当たり40 mLオーバーレイして、室温で2 時間反応させた。
1次抗体反応後、膜をPBSで3 分間3 度洗浄し別の保湿箱に移し、1% BSA/PBSで希釈した2 次抗体 1.3 μg/mL Rabbit polyclonal anti-mouse Ig-HRP [DAKO]を1 cm2当たり40 μLオーバーレイして、室温で1 時間反応させた。反応後、膜をPBSで3 分間3 度洗浄し、化学発光試薬SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate、Thermo Fisher Scientific, Rockford) と5分反応させ、ルミノ・イメージアナライザー(Las4000miniEPUV、GE Healthcare]のChemiluminescenceモードで検出を行った。
糖鎖の構造を以下に示す。すべてADHP誘導体化して用いた。
LNFP I : Lacto-N-fucopentaose I
Fuc(a1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc
LNnT : Lacto-N-neotetraose
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc
LNT : Lacto-N-tetraose
Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc
Lewis b : Lacto-N-difucohexose I、LNDFH I
Fuc(α1-2)Gal(β1-3)[Fuc(α1-4)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc
Lewis a : Lacto-N-fucopentaose II、LNFP II
Gal(β1-3)[Fuc(α1-4)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc
ハイブリドーマ細胞R-17Fから、MACHEREY-NAGEL NucleoSpin RNA kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Germany) を用いて、トータルRNA を精製した。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clonetech)を用いて5'RACE解析を行った。次に、トータル RNAを鋳型にマウス抗体(IgG)H鎖特異的なprimer(H-RT1)を用いてRT反応によりH鎖cDNA合成を行った。同様に、(IgG)L鎖特異的なプライマー(L-RT1) を用いてL鎖cDNAを合成した。これらcDNAを鋳型として、マウス抗体(IgG)H鎖定常域特異的なプライマー (H-PCR)を リバースプライマー、キットに含まれるUPM (Universal primer mix)をフォワードプライマーとしてRACE PCRを行った。同様に、L鎖定常域特異的なプライマー(L-PCR)をリバースプライマーとしてRACE PCRを行った。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で解析した。想定の大きさのPCR産物が得られたので、それぞれSYN4553H, SYN5531Lと命名した。ゲル抜き精製したPCR産物をクローニングプラスミド pMD20-Tにライゲーションした。常法により形質転換を行い、PCR産物由来ごとにそれぞれ48クローンを得た。これらのクローン をプラスミド領域の片側から解析した。シークエンス反応はBigDye Terminators v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI社)を使用し、ABI3730Sequencer(ABI社)により解析した。取得塩基配列の相同性をDNA Sequenceアセンブルソフトウエア、SEQUENCHERTMにより行った。
次に、本実験で用いたプライマー の塩基配列(5'→3')を示す。
RT反応
H-RT1:TCCAKAGTTCCA(配列番号:11)
L-RT1:GCTGTCCTGATC(配列番号:12)
PCR 反応(Reverse Primer)
H-PCR : GGGAARTARCCCTTGACCAGGCA(配列番号:13)
GGGAARTAGCCTTTGACAAGGCA(配列番号:14)
これら2配列を等モルずつ混合して使用
L-PCR : CACTGCCATCAATCTTCCACTTGACA(配列番号15)
1. ヒトiPS細胞に特異的なモノクローナル抗体R-17Fの作製
ヒトiPS細胞の細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体パネルを作製するために、PBS中で凍結融解したTic細胞をFCAと混合し、C57BL/6マウスを腹腔内もしくは皮下免疫した。Tic細胞固定プレートとMRC-5固定プレート(コントロール)を用いて、計960のハイブリドーマについて1次スクリーニングを行なった結果、29クローンがTic細胞上の表面抗原に反応性を有するモノクローナル抗体を産生することが分かった。これら29クローンについて2次スクリーニングを行い、2102Ep等のヒトEC細胞及びマウスフィーダー細胞(MEF)との交差反応性を調べた。免疫感作に先立ってヒトiPS細胞と共培養されたマウスフィーダー細胞に実質的な交差反応性を示す抗体はなかった。対照的に、モノクローナル抗体パネルの多くは、EC細胞株2102Epと反応性を有していた。しかし、興味深いことに、No. 10、No. 11及びNo. 17のモノクローナル抗体は、2102Epと反応性を有しないか、弱い反応性しか有しなかった。このことは、ヒトiPS細胞とヒトEC細胞との間で、表面抗原の発現に相違があることを明確に示している。
ヒトiPS細胞へのモノクローナル抗体の結合をウェスタンブロッティングにより確認した。Tic細胞溶解液をSDS-PAGEにて分離し(図1A)、ハイブリドーマ培養上清を一次抗体として試験した。いくつかの代表的なウェスタンブロッティングのプロファイルを図1Bに示す。いくつかのモノクローナル抗体は、細胞プレートアッセイにおいてヒトiPS細胞と強い結合性を示したにもかかわらず、ウェスタンブロッティングでは実質的なバンドが検出されないか、あるいはかすかなバンドしか検出されなかった(No. 11, No. 12, No. 17)。従って、これらのモノクローナル抗体は、タンパク質以外の細胞表面成分と反応すると考えられる。これらの抗体のうち、本発明者らは、IgG1サブクラスに属するクローンNo. 17の抗体(R-17Fと命名した)に焦点を当てた。
R-17F抗体のヒトiPS細胞(Tic)、ヒトES細胞(KhES-3, H9)及びヒトEC細胞(2102Ep, NCR-G3)に対する反応性を、既知のヒトiPS/ES細胞マーカーに対する抗体であるTRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-4、SSEA-3、SSEA-1、Nanog及びOct-4、ヒトES細胞株HES-3を免疫原として作製されたマウスモノクローナル抗体mAB84 (Choo et al., 2008)、並びに組換えヒトポドカリキシンに対する抗ポドカリキシン抗体aPODXLのそれらと比較した。結果を表1及び図2に示す。
また、R-17F抗体は殆どすべてのヒトiPS細胞の細胞膜全体を鮮明、均一に染色した(図2)。この染色性は従来の多能性幹細胞マーカー抗体であるSSEA-3, SSEA-4などとは明瞭に区別された(図2, 下パネル)。すなわち、SSEA-3, SSEA-4も細胞膜を染色したが、その染色には部位により不均一性が見られた。エピトープの細胞内局在性からもR-17F抗体はこれまで知られていない新規なマーカー抗体であることが示された。
R-17F抗体のヒトiPS細胞に対する細胞障害活性の有無を調べるために、Tic細胞懸濁液に種々の濃度でR-17F抗体を添加し、4 ℃で45分間反応させた後、死細胞のみを染色する7-AADを添加し、FACS解析によりTic細胞の生存率を測定した。コントロールとして、抗マンナン結合タンパク質(MBP)抗体を用いた。その結果、R-17F抗体は濃度依存的にヒトiPS細胞の対して強い細胞障害活性を示した(図3)。
次に、R-17F抗体の細胞障害活性の機序を検討すべく、細胞障害活性の温度依存性について調べた。即ち、Tic細胞とR-17F抗体とを45分間、氷水中で反応させた場合と、37 ℃で反応させた場合とで、細胞の生存率を上記と同様にして調べた。その結果、両条件下で細胞障害活性はほぼ同様に進行したことから、この細胞障害作用は補体(酵素)非依存的な反応であることが示唆された(図4)。
次に、R-17F抗体添加によるTic細胞の生存率の経時変化を15分おきに45分までモニタリングした。その結果、Tic細胞はR-17F抗体添加直後に半数近くが死滅し、その後も反応時間依存的に生存率は減少した(図5)。
次に、二次抗体の添加によりR-17F抗体のヒトiPS細胞に対する細胞障害活性が影響を受けるか否かを調べた。その結果、R-17F抗体の細胞障害活性は、ごく少量の二次抗体を加えることで著しく増強された(図6)。
最後に、他の抗iPS/ES細胞抗体のヒトiPS細胞に対する細胞障害活性をR-17F抗体のそれと比較した。ネガティブコントロールとして抗MBP抗体を用いた。その結果、本発明者らが既に報告したR-10Gや、既存の抗体(TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4)はいずれも有意な細胞障害活性を示さなかった(図7)。
以上より、R-17F抗体のヒトiPS細胞に対する細胞障害活性は、既知の他の抗iPS/ES細胞抗体には見られない特徴的な作用であることが確認された。
さらに、ヒト組織について、ヒト正常組織および胎児組織アレイ(大脳・小脳・心臓・胃・肝臓・肺・胸腺・結腸・腎臓・脾臓・胎盤・膀胱・皮膚・筋組織・舌を含む(BioChain Institution, Inc. Hayward, CA))について、蛍光標識抗体を用いて組織化学的に検討した。その結果、1-2の組織で例外的に弱い染色が見られたが、他の組織では検出限界以下であった。
ヒトiPS細胞(Tic,201B7)、ヒトES細胞(KhES-3, H9)に対するR-17F抗体の反応性をフローサイトメトリーにより定量的に解析した。R-17F抗体はTicの他,山中教授により世界で最初に作成されたiPS細胞株の1種である201B7、代表的なヒトES細胞株であるH9、KhES-3の4種の細胞株において、いずれも、高結合部位に単一の細胞ピークを示し、同一の株内での細胞間での結合不均一性が少ないことをしめしている(図9)。この結果は、図2に示した共焦点レーザー顕微鏡によるR-17F抗体染色試験において全ての細胞がR-17F抗体陽性である結果と一致しており、R-17F抗体がiPS,ES細胞一般に対して広く結合するユビキタスなマーカー抗体としての性質を持つことを強く示唆している。
ヒトiPS細胞(Tic,201B7)、ヒトES細胞(KhES-3, H9)に対するR-17F抗体の細胞障害活性を解析した。R-17F抗体を添加し、4℃で45分間反応させた後、死細胞のみを染色する7-AADを添加し、FACS解析により細胞の生存率を測定した。その結果、R-17F抗体はこれら全ての細胞株に対して抗体濃度依存的に細胞障害活性を示した(図10)。また、細胞株間でR-17Fの細胞障害活性に対する感受性に大きな相違は見られなかった。すなわち、R-17F抗体はヒトiPS/ES細胞に対しユビキタスに細胞障害活性を持つことが強く示唆された。
これまでの研究において、R-17F抗体はヒトiPS/ES細胞に対し、普遍的に細胞障害活性コロニー傷害活性を持つことが強く示唆されたが、これらの研究において、R-17F抗体の細胞障害活性は単細胞状態で懸濁培養したiPS細胞にR-17Fを加えてアッセイしている。しかし、iPS細胞は、実際には、単細胞懸濁の状態で分裂、増殖するのではなく、接着した状態でコロニーを形成して増殖する。そこで、再生医療においてR-17F抗体をヒトiPS/ES細胞の選択的除去剤としての利用の可能性を考えるならば、コロニーを形成したiPS細胞の増殖に対するR-17Fの効果を調べる必要がある。そこで、Tic 細胞のコロニー増殖に対するR-17F抗体の効果を培養72時間まで調べた。この間、Tic細胞コロニーは24時間程度のダブリングタイムで増殖しR-17F抗体を加えて培養すると、24時間後にはコロニーの増殖がごく僅かみられたが、48時間後には成長が阻止され、72時間後には元のコロニーサイズ以下への退縮が観察された。なお、ヒトiPS/ES細胞の低硫酸化ケラタン硫酸に選択的に結合するR-10G抗体を加えた場合には、コロニー増殖への影響はまったく観察されておらず、72時間後には巨大なコロニーへと増殖した。このようにR-17F抗体はTic 細胞のコロニー増殖を選択的に阻害することが示された(図8)。
上記1.のウェスタンブロッティングの結果(図1B)やTic細胞の免疫染色の結果(図2)から、本発明者らは、R-17F抗体がヒトiPS/ES細胞上の脂質性物質をエピトープとして認識しているのではないかと予測した、そこで、この仮説を検証すべく、まずTic細胞を、セラミドを、ガングリオシド系列やグロボシド系列の糖脂質生合成の出発物質であるグルコシルセラミド(GluCer)に変換する酵素反応を阻害することが知られているD-PDMPで処理し、細胞表面での糖脂質の発現を抑制させた。このD-PDMP処理したTic細胞をR-17F抗体と反応させ、蛍光標識した二次抗体を添加してFACS解析によりR-17F抗体のTic細胞に対する反応性の変化を調べた。その結果、D-PDMP処理したTic細胞では、平均蛍光強度が未処理のTic細胞に比べて48.9%にまで減少した(図11A)。また、図には示していないが、糖脂質を認識することが知られているSSEA-4もR-17F抗体と類似の挙動(28.0%まで減少)を示したが、糖タンパク質を認識するTRA-1-60では、D-PDMP処理によりTic細胞に対する反応性に変化はなかった。以上より、R-17F抗体はヒトiPS/ES細胞表面上に特異的に発現する糖脂質分子を認識している可能性が示唆された。
次に、Tic細胞の細胞膜より全脂質成分を抽出し、TLC分離した後、PVDFメンブレンに転写し、Far-eastern blottingによりR-17F抗体との反応を調べた。その結果、グロボシドの近辺にメインスポット(A)が検出された他、その少し上にマイナースポットが一つ観察された(図11B)。また、図には示していないが、これらのスポットはSSEA-4抗体をプローブとして検出されるスポットとは異なっていた。
次に、Tic細胞の脂質画分をTLCにより分画し、メインスポット(A)の精製を試みた。TLCによる分離条件を検討し、注意深く分離用TLCを行った結果メインスポット(A)を質量分析的に均一標品に精製することに成功した。すなわち、MALDI-TOF-MSにより得られたマススペクトルは m/z 1000 - 2000領域にアサイン可能なシグナルを示し、スポットAが高純度に精製された糖脂質であることを示していた(図11C)。次いでこれらのシグナルに関してMSのn乗測定を行い、その構造を確認した。これらの実験によりスポットAの構造はセラミドを含む糖脂質、Fuc-Hex-HexNAc-Hex-Hex-ceramideと同定された。また、R-17F陽性スポットを各種グリコシダーゼ処理することにより、活性に関与する糖残基を同定した。
質量分析によるエピトープの構造解析の結果に基づき、ラクト系およびネオラクト系の糖鎖をADHP(N-aminoacetyl-N-(9-antharacenyl methyl)-1,2-dihexadecyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)で蛍光標識したネオグリコリピドをニトロセルロース膜にスポットし、R-17F抗体の反応性を調べた。その結果、LNFP I: Lacto-N-fucopentaose I [Fuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc] に顕著な結合活性を示したが、LNnT: Lacto-N-neotetraose [Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc], LNT: Lacto-N-tetraose [Gal(β1-3)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc, Lewis b: Lacto-N-difucohexose I (LNDFH I) [Fuc(α1-2)Gal(β1-3)[Fuc(α1-4)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc, Lewis a: Lacto-N-fucopentaose II (LNFP II) [Gal(β1-3)[Fuc(α1-4)]GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc には全く結合活性を示さなかった(図12)。これらの結果はFuc(α1-2)Gal(β1-3)GlcNAc構造がR-17F抗体エピトープとして重要な役割りを果たしていることを示している。
ハイブリドーマR-17Fから調製したトータル RNAを用いて、5’-RACE PCRにより、重鎖、軽鎖それぞれの可変領域を含むcDNAを増幅した。増幅産物をプラスミドベクターにクローニングし、塩基配列解析を行い、得られた塩基配列結果をもとにコードされるアミノ酸配列を推定した(重鎖塩基配列: 図13-A, 軽鎖塩基配列: 図13-B)。CDRの解析はIMGT/V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/)を用いて行った。その結果、重鎖)および軽鎖のCDRは以下のように推定された。
重鎖 CDR 1 GFTFSYYW(配列番号:1)
CDR 2 IRLKSDNYAT(配列番号:2)
CDR 3 EGFGY(配列番号:3)
軽鎖 CDR 1 QDVSTA(配列番号:4)
CDR 2 WAS(配列番号:5)
CDR 3 QQHYSTPRT(配列番号:6)
WO 2007/102787に記載されるmAb84とR-17F抗体との相違を明確にすべく、ヒトiPS細胞Ticに対する両者の反応性をFACS解析により比較した。ネガティブコントロールとして抗MBP抗体を用いた。その結果、mAb84のTic細胞に対する反応性は、R-17F抗体に比べて弱いことが示された(図13A)。
次に上記3.と同様にして、mAb84のTic細胞に対する細胞障害活性を調べたところ、mAb84の添加によってTic細胞の生存率は殆ど減少しなかったことから(図13B)、mAb84にはR-17F抗体などのヒトiPS細胞に対する強い細胞障害活性がないと考えられた。なお、本件については、その後も、細胞組織染色、フローサイトメトリー分析、細胞障害作用などに関して、追加実験を行ったが結果は再現性に乏しく、場合によってはヒトiPS細胞に対してR-17F抗体と同じ程度の結合性および細胞障害活性が観察された。再現性が低い理由については現在のところ不明である。
なお、mAb84はヒトポドカリキシン様タンパク質I を認識する抗体であり、サブタイプはIgMである。R-17F抗体は糖脂質を認識する抗体であり、サブタイプはIgG1である。また、両者の重鎖、軽鎖のCDR1〜CDR3のアミノ酸配列に相同性は見られない。
1. Choo AB, Tan HL, Ang SN et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells 2008;26:1454-1463.
2. Furue M, Okamoto T, Hayashi Y et al. Leukemia inhibitory factor as an anti-apoptotic mitogen for pluripotent mouse embryonic stem cells in a serum-free medium without feeder cells. In vitro Cell Dev Biol Anim 2005;41:19-28.
3. Furue MK, Na J, Jackson JP et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:13409-13414.
4. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined fators. Cell 2007;131:861-872.
5. Toyoda M, Yamazaki IM, Itakura Y et al. Lectin microarray analysis of pluripotent and multipotent stem cells. Genes to Cells 2011;16:1-11.
6. Taki, T., Ishikawa, D., TLC blotting: application to microscale analysis of lipids and as a new approach to lipid-protein interaction, Anal Biochem 251 (1997) 135-143.
7. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2007;25:681-686.
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
Claims (9)
- iPS及びES細胞に特異的に結合し、かつ該標的細胞に対して細胞障害活性を有するモノクローナルIgG抗体であって、該抗体が、以下:
(a)配列番号:1で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
(b)配列番号:2で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
(c)配列番号:3で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
(d)配列番号:4で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
(e)配列番号:5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び
(f)配列番号:6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む、抗体。 - iPS及びES細胞がヒト由来である、請求項1記載の抗体。
- (1)配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
(2)配列番号:10に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1又は2に記載の抗体。 - ハイブリドーマR-17F(受託番号:NITE BP-01425)により産生されるモノクローナル抗体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- ハイブリドーマR-17F(受託番号:NITE BP-01425)により産生されるモノクローナル抗体以外の抗体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体を含有してなる、iPS又はES細胞除去剤。
- 細胞集団を、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体と接触させることを含む、該細胞集団中のiPS又はES細胞の除去方法。
- iPS又はES細胞から分化させた細胞集団を、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体と接触させ、生存する細胞を回収することを含む、未分化細胞を含まない均一な分化細胞集団の作製方法。
- iPS又はES細胞から分化させた細胞集団と、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体とを組み合わせてなる、細胞移植療法剤。
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