WO2007010941A1 - 抗原及びこの抗原を識別するモノクローナル抗体 - Google Patents

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WO2007010941A1
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human
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Takaaki Ohara
Tetsu Kakutani
Seishi Kyoizumi
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Kaneka Corporation
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Definitions

  • the present invention relates to a novel antigen (referred to as HSCA-1 antigen) that has been confirmed to be present in human myelocytic monocytes, acute leukemia cells, and CD34-positive hematopoietic stem cells, and a monoclonal antibody that identifies this antigen (Referred to as HSCA-1 antibody) and immunoreactive fragments thereof.
  • HSCA-1 antigen a novel antigen that has been confirmed to be present in human myelocytic monocytes, acute leukemia cells, and CD34-positive hematopoietic stem cells
  • a monoclonal antibody that identifies this antigen
  • immunoreactive fragments thereof Referred to as HSCA-1 antibody
  • CD33 molecule As a surface antigen marker specific for human myeloid cells'monocytic cells, CD33 molecule, CD13 molecule and the like are known (Non-patent Document 1).
  • the CD33 molecule is a membrane antigen specific for hematopoietic cells and is expressed on monocytes / macrophages, myeloid cells, granulocytes, histocytes, mast cells, hematopoietic progenitor cells, and myeloid white blood cells.
  • a glycoprotein with a molecular weight of 67 kDa which is thought to have a function as a sialic acid-dependent adhesion protein, but the detailed function has not been elucidated (Patent Document 1, Non-Patent Documents 2, 3, Four).
  • Non-patent Documents 2 and 3 The clinical application of antibodies against CD33 molecules is used to determine acute myeloid leukemia (AML) (Non-patent Documents 2 and 3). Humanized anti-CD33 antibodies are also used to treat acute myeloid leukemia.
  • Gemtuzumab ozogamlcln (patent document 2), a combination of antibiotics and calicheamicin, has been approved as an orphan drug in the United States for the first relapsed acute myeloid leukemia of the elderly. It is.
  • CD13 molecules are expressed on granulocytes, monocytes, myeloid progenitor cells, myeloid leukocytes, hepatic distal tubules, liver bile ducts, central nerves, and the like. It is a glycoprotein with a molecular weight of 150 kDa and has aminopeptidase activity (Non-patent Document 5). As a clinical application of antibodies against the CD13 molecule, it is used to determine acute myeloid leukemia (AML)! /, Ru (Non-patent document 6).
  • AML acute myeloid leukemia
  • Ru Non-patent document 6
  • Patent Document 1 International Patent Number WO / 9109058
  • Patent Document 2 US Patent No. US5714586
  • Patent Document 3 JP 2002-171971 A
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-371099
  • Non-Patent Document 1 Shunsuke Ueda et al., “CD Antigen Handbook”, Ishiyaku Publishing Co., Ltd., 1999, P-7
  • Non-Patent Document 2 Japan BRM Society, “CD Classification Nord Book (1995)”, Japan BRM Society, 199 6 years, p.110
  • Non-Patent Document 3 Fumiaki Takahisa et al., ⁇ Annual Review Blood 2003 ”, Chugai Medical, 2003, p. 100
  • Non-Patent Document 4 Andrew et al., "Blood” 1983, 62nd p.124
  • Non-Patent Document 5 BRM Society of Japan, CD Classification Nord Book (1995), Japan BRM Society, 199
  • Non-Patent Document 6 Shunsuke Ueda et al., "CD Antigen Handbook", Ishiyaku Publishing Co., Ltd., 1999, P.70
  • the present invention relates to a novel antigen present in a myeloid / monocytic cell, an acute myeloid leukemia cell, and a CD34 positive (CD34 +; hereinafter, the CD antigen positive description is expressed in the same manner) and a hematopoietic stem cell
  • An object is to provide a monoclonal antibody that identifies this antigen.
  • Another object of the present invention is to provide a method for measuring the antigen by immunoassay or flow cytometry using the labeled antibody.
  • the present invention uses the antibody to produce human myeloid / monocytic cells, human acute myeloid cells from human bone marrow fluid, umbilical cord blood and human blood.
  • the object is to provide a method for separating, purifying or removing leukemia cells and CD34 + hematopoietic stem cells.
  • the present invention relates to a novel HSCA-1 antigen present in human myeloid / monocytic cells, acute myeloid leukemia cells and CD34 + hematopoietic stem cells, and a monoclonal antibody (HSCA) that distinguishes this antigen. -1 antibody) or immunoreactive fragments thereof. It is also a solid support on which these monoclonal antibodies or immunoreactive fragments thereof are immobilized.
  • the present invention is also a hyperidoma that produces the HSCA-1 antibody.
  • the present invention provides a method for measuring the antigen by immunoassay or flow cytometry using the antibody or immunoreactive fragment thereof labeled with a fluorescent label, a radioisotope label or an enzyme. But there is.
  • the present invention uses the above antibody or immunoreactive fragment thereof to separate myeloid / monocytic cells, acute myeloid leukemia cells or CD34 + hematopoietic stem cells from human bone marrow fluid, umbilical cord blood and human blood. It is also a method of purification or removal.
  • a novel antigen confirmed to be present in human myeloid / monocytic cells, acute leukemia cells and CD34-positive hematopoietic stem cells, and a monoclonal antibody for identifying the antigens are provided.
  • the labeled antibody of the present invention the antigen can be easily measured by immunoassay or flow cytometry, and can be applied to diagnosis of acute leukemia. It can also be applied to the separation and purification or removal of human myelocytic monocytes, acute myeloid leukemia cells and CD34 + hematopoietic stem cells using the antibody.
  • FIG. 1 is an autoradiography diagram showing molecular weight analysis of HSCA-1 antigen by immunoprecipitation using HSCA-1 antibody.
  • FIG. 2 Flow cytometry of HSCA-1 antibody expression in human mononuclear cells compared to the expression of CD3, CD20, CD33, CD34, and CD56 antigens using HSCA-1 antibody. is there.
  • the “HSCA-1 antigen” is a novel antigen that is a protein having a molecular weight of 6 kDa, which is present in human myeloid monocytes, human acute myeloid leukemia cells and human CD3 4+ hematopoietic stem cells. More preferably, it is not present in human peripheral blood T cells, B cells, and NK cells.
  • the "HSCA-1 antibody” is a monoclonal antibody that identifies the HSCA-1 antigen.
  • the HSCA-1 antibody is preferably a monoclonal antibody produced by a hyperidoma obtained by fusing spleen cells of a mammal immunized with KG-1 cells and myeloma cells.
  • KG-1 cells are human myeloblast-like cells derived from patients with acute myeloid leukemia and can be obtained from JRBC (Japanese Collection of Research Bioresources) cell bank or the like.
  • Hematopoietic stem cells are not only cells such as erythrocytes, leukocytes, megakaryocytes, but also many cells that have the ability to separate all blood cells including the lymphatic system such as T cells and B cells. A cell that is capable of self-proliferation. Hematopoietic stem cells are characterized by being positive for CD34 antigen and negative for CD38 antigen (CD34 + CD38-; hereinafter, CD antigen positive and negative are indicated in the same manner).
  • the hybridoma that produces the monoclonal antibody of the present invention uses KG-1 cells as a sensitizing antigen, and basically immunizes the cells by applying a normal immunization method, and performs normal cell fusion. It can be produced by cell fusion by applying a legal method and cloning by applying the usual cloning method.
  • KG-1 cells as a sensitizing antigen, as an immunized mammal, the intraperitoneal cavity of a non-human mouse, rat, rabbit, guinea pig, hidge, goat, chicken, etc. Give to the skin, foot pad, etc.
  • myeloma cells that are cell fusion partners are usually derived from mice, it is particularly preferred to immunize mice. Immunization is performed by a general method such as, for example, KG-1 cells diluted to an appropriate amount and suspended in PBS (-Xphosphate-buffered saline, pH 7.2) or physiological saline. Administration weekly for 1-3 months is preferred.
  • PBS -Xphosphate-buffered saline, pH 7.2
  • Antibody-producing cells such as spleen cells, lymphocytes, and peripheral blood are collected from the immunized animal, and these are fused with myeloma cells, which are tumor cell lines, to produce a hyperidoma.
  • myeloma cells include known cell lines such as P3-NSI / l-Ag4-l cells (abbreviated NS-1 cells) (Kehler et al., Eur. J. Immunol, 6: 511 (1976)), SP2 / 0.
  • -Agl4 cells (abbreviated as SP2 cells) (Schulman et al., Nature, 276: 269 (1978)), FO cells (Desantgros et al., J. Immunol. Meth., 35: 1 (1980)), etc. are often used.
  • SP2 cells Schott al., Nature, 276: 269 (1978)
  • FO cells Desantgros et al., J. Immunol. Meth., 35: 1 (1980)
  • NS-1 cells are desirable.
  • Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is basically performed according to the usual method, for example, the method of Kohler and Milstein (Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)). Can do.
  • cell fusion promoters include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus.
  • Cell fusion is performed using a predetermined amount of antibody-producing cells and myeloma cells, for example, about 1 to 10 times the amount of antibody-producing cells relative to myeloma cells.
  • the medium for cell fusion include a medium suitable for the growth of myeloma cells, for example, RPMI 1640 medium. Both cells are mixed in such a medium, and a solution of polyethylene glycol (for example, having an average molecular weight of 1,000 to 6,000) kept at 37 ° C is added to the medium at a concentration of 30 to 60% (W / V). Initiate cell fusion by mixing.
  • the desired hyperidoma can be obtained by adding an appropriate medium and repeatedly removing the supernatant by centrifugation.
  • This hyperidoma is selected by culturing in a normal selection medium, for example, a HAT medium containing hypoxanthine (H), aminobuterin (A) and thymidine (T). In HAT culture medium, culture for several days to several weeks until cells other than the desired hyperpridoma die. Once the hybridoma colonies are confirmed, screen the antibody in the culture supernatant.
  • a normal selection medium for example, a HAT medium containing hypoxanthine (H), aminobuterin (A) and thymidine (T).
  • HAT culture medium culture for several days to several weeks until cells other than the desired hyperpridoma die. Once the hybridoma colonies are confirmed, screen the antibody in the culture supernatant.
  • Screening of antibodies in the culture supernatant can be performed, for example, by measuring the antibody activity in the culture supernatant by ELISA (fixed cells as an antigen) (Amano Ando et al., Monoclonal Antibody Experiment). Introduction to operation, Kodansha Scientific (1993) ⁇ .126).
  • ELISA fixed cells as an antigen
  • the hybridoma that produces the target antibody screened can be finally obtained as a colony consisting of a single hyperidoma clone by repeating the limiting dilution method by a conventional method.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention thus obtained can be cultured and passaged in a known medium, for example, RPMI 1640 or Dulbecco's modified medium, in the same manner as ordinary hyperidoma. It can also be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • a known medium for example, RPMI 1640 or Dulbecco's modified medium
  • the culture supernatant of the monoclonal antibody of the present invention can also be prepared by culturing the hyperpridoma of the present invention in a large amount in 15% fetal calf serum (FCS) -RPMI 1640 medium.
  • the monoclonal antibody of the present invention can also be prepared from ascites produced by injecting Hypridoma into the abdominal cavity of a mouse.
  • the monoclonal antibody thus prepared may be purified by a conventional antibody purification method.
  • Antibody purification methods include salting out with ammonium sulfate, etc., ion-exchange chromatography using jetylamino ester (DEAE) derivatives and carboxymethyl (CM) derivatives, hydroxyapatite chromatography, gel filtration chromatography, protein There are methods such as affinity chromatography using A or protein G, and these methods can be combined for purification.
  • the immunoglobulin class of the monoclonal antibody of the present invention obtained as described above is not particularly limited, but is immunoglobulin (hereinafter referred to as Ig) G1, and the light chain (L chain) is Examples are antibodies that are kappa chains.
  • the monoclonal antibody of the present invention does not degrade the antigen binding site (Fab)! ⁇ Digested with proteolytic enzymes such as papain, pepsin, etc. Even if an antibody immunoreactive fragment such as Fab, F (ab ′) 2 or the like obtained by a conventional method is used as long as it retains the same properties as the monoclonal antibody of the present invention, It can be used in the same manner as clonal antibodies.
  • Fab antigen binding site
  • fluorescent labels such as Furuo Retsuse Inn isothiocyanate Xia sulfonate (FITC), radioactive elemental like 125 1, or an alkali
  • FITC Furuo Retsuse Inn isothiocyanate Xia sulfonate
  • An antigen can be detected by reacting an immunoglobulin labeled with an enzyme such as phosphatase or peroxidase.
  • fluorescent labels such as the monoclonal antibody of the present invention itself FITC, radioactive elemental like 125 1, or alkaline phosphatase, by labeling with an enzyme such as Peruokishidaze, it is also possible to detect the antigen.
  • the monoclonal antibody or immunoreactive fragment of the present invention can be used as a solid support (for example, a resin such as Sepharose Nyagarose immobilized with Protein A or Protein G, or a cyanogen bromide active Sepharose enzyme).
  • a column for cell separation can be prepared by immobilizing it on a resin such as agarose. When human bone marrow fluid, umbilical cord blood and human blood are allowed to flow through this column, human bone marrow mononuclear cells, human acute myeloid leukemia cells or CD34 + hematopoietic stem cells can be separated and purified.
  • human bone marrow mononuclear cells, human acute myeloid leukemia cells, or CD34 + hematopoietic stem cells can be selectively removed from human bone marrow fluid, umbilical cord blood or human blood.
  • the monoclonal antibody or immunoreactive fragment of the present invention is used by binding an antibiotic, a toxin, an enzyme or a radioisotope, or antibody-dependent cytotoxic activity using the monoclonal antibody of the present invention.
  • an antibiotic a toxin, an enzyme or a radioisotope, or antibody-dependent cytotoxic activity using the monoclonal antibody of the present invention.
  • Killing human acute myeloid leukemia cells, human myeloid cells, human monocytes or human CD34 + hematopoietic stem cells from human blood using (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) You can also.
  • HSCA-1 antigen and the monoclonal antibody that distinguishes this antigen in the present invention will be described more specifically.
  • the present invention is not limited by the following examples.
  • HSCA-1 Made of high-pridoma and HSCA-1 pile: (a) KG-1 cells (JCRB cell bank) were used as sensitizing antigens. The KG-1 cells, 1.0 X 1 0 5 / ml of such a concentration, 15% fetal calf serum (FCS) - RPMI 1640 medium (Co., Ltd. Date Research raw material manufactured by the Institute of Medicine) was suspended in 15ml, Culture It was placed in a dish (made by Grainer) (diameter 10 cm) and cultured at 37 ° C in a 5% CO incubator. Cells are cultured on days 4-5
  • the mouse spleen was also removed and placed in a dish containing PBS (-), and the spleen was crushed using two frosted glass slides. It was collected. The cells were placed in a tube, centrifuged at 4 ° C and 240G for 10 minutes, and the supernatant was discarded.
  • NS-1 cells which are myeloma cells to be fused, were prepared as follows. NS-1 cells are adjusted to a concentration of 1.0 x 10 5 / ml, suspended in 15 ml of 15% fetal calf serum (FCS) -RPMI 1640 medium, placed in a culture dish (diameter 10 cm), and placed in a 5% CO incubator. Medium, 37 ° C
  • spleen cells and NS-1 cells were washed three times with 30 ml of RPMI 1640 medium, respectively, and then spleen cells (total 2.89 x 10 8 ) and NS-1 cells (total 8.07 x 10 7 ) Were mixed.
  • make 10 ml of RPMI 1640 medium put it in a glass tube, centrifuge at 4 ° C, 300 G for 10 minutes, and remove the supernatant.
  • PEG solution Polyethylene glycol 4,000 dissolved in PBS (-) to 50% (Roche Diagnostics) 1ml + dimethyl sulfoxide 0.1ml + RP MI 1640 medium 0.1ml
  • lml glass Add to tube over 1 minute, stir for 1 minute, then RP L ml of MI 1640 medium was added over 1 minute. Furthermore, 1 ml of RPMI 1640 medium was added over 1 minute, and finally 7 ml of RPMI 1640 medium was added over 3 minutes, followed by centrifugation at 150 G for 10 minutes at room temperature to completely remove the supernatant.
  • the pellet thus obtained was loosened, and an appropriate amount of 15% FCS-RPMI 1640 medium was added to adjust the cell concentration to 1 X 10 7 cells / ml.
  • the cells were spread on a 96 uel flat bottom plate (manufactured by Corning) at 100 1 / well.
  • a 50-fold concentrated hypoxanthine + aminopterin + thymidine (HAT) solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) diluted with 15% FCS-RPMI 1640 medium to 2% (HAT 2% solution)
  • 100 ⁇ 1 of the supernatant in the well was replaced with the above 2% solution 100 / ⁇ 1.
  • the supernatant 1001 in the well was replaced with the above 2% solution 1001 on the third, fifth, eighth, eleventh, and fourteenth days from the day of cell fusion.
  • the antibody activity in the culture supernatant was measured by the ELISA method described below.
  • the 96-well plate for the poly-L-lysine treatment riser shown below was prepared.
  • EIA / RIA high-binding flat-bottom plate manufactured by Coaster Co., Ltd.
  • poly-L-lysine solution 50 g / ml 50 1 was placed in each well of the plate.
  • the solution was left at room temperature for 5 to 30 minutes, and the poly-L-lysine solution was removed by suction.
  • 1001 of sterilized ultrapure water was put into each well of the plate and removed by suction. This washing operation was repeated two more times, and the plate was left to dry in a clean bench.
  • the KG-1 cells (4.8 X 10 6 cells / 96 Uwerupureto) used in the immunogen, in the Earl of buffered saline solution (EBSS) (Corporation Date Research Institute, Ltd. Institute for Biomedical Research), 3 times After washing, 50 1 was dispensed into each well of the plate at a cell concentration of IX 10 6 cells / ml with PBS ( ⁇ ). Leave at room temperature for 15 minutes, wait for cells to adhere to the bottom, and centrifuge at 90G.
  • EBSS Earl of buffered saline solution
  • goat IgG antibody (antibodies to mouse IgG, IgA, IgM; manufactured by Kappel) 1001, diluted 1,500 times, was placed in each well and allowed to react at room temperature for 1 hour or longer.
  • the wells were washed three times with a PBS ( ⁇ )-0.05% Tween20 solution 150 1 containing 0.1% gelatin.
  • Ortho-Diamine (OPD) -Hydrogen peroxide solution (0.3% OPD, 0.02% hydrogen peroxide dissolved in 0.05M citrate buffer (PH4.0)) 100 1 in each well and at room temperature 10
  • OPD Ortho-Diamine
  • PH4.0 citrate buffer
  • the mixture was allowed to stand for 1 minute, and after confirming color development, 1N sulfuric acid-2 mM azide sodium solution 100 1 was further added to the well and stirred. Finally, the absorbance at 492 nm (OD492) was read with a plate reader (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), the amount of coloring dye was measured, and the activity of the antibody was determined.
  • the monoclonal antibody HSCA-1 having KG-1 cell binding activity obtained in (d) above was subjected to single cell cloning by the limiting dilution method.
  • a clone medium (Blyclone (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to 15% FCS-RPMI 1640 medium to a concentration of 5% (w / w)) so that one hyperidoma was Z-well. 1) and dispense the suspension into a 96-well flat-bottom plate (Corning) containing thymocytes as a feeder cell at 37 ° C in the presence of 5% CO. Incubated with
  • the feeder cell was prepared as follows. The thymus was removed from the BALB / c mouse, the cells were separated by pipetting, and suspended in 15% FCS-RPMI 1640 medium containing hypoxanthine / thymidine (HT). The cell concentration was adjusted to 5 ⁇ 10 6 cells / ml and dispensed into each well. About two weeks later, 1001 of the culture supernatant on which one hyperidoma was grown per well was collected, and the presence or absence of antibody activity was examined by antibody assembly using the ELISA method described in (d) above. In this way, positive cell clones were subjected to the same single cell cloning as described above five times in total to produce HSCA-1 antibody with stable and complete antibody production. Thus, a hybridoma clone was obtained.
  • This HSCA-1 antibody-producing hybridoma is referred to as Mouse-Mouse hybridoma HSCA-1 as an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD: 305-8566, Tsukuba, Ibaraki Prefecture 1-1- 1 Deposited at Central No. 6) (Accession No. FERM BP-10621: Transferred domestic deposit on March 16, 2000 to international deposit on June 15, 2006 under the Budapest Treaty).
  • HSCA-1 antibody In order to prepare a large amount of HSCA-1 antibody, the above hyperidoma was injected into the abdominal cavity of a mouse to prepare ascites containing a large amount of HSCA-1 antibody. That is, BALB / c mice were injected intraperitoneally with 1 X 10 7 / PBS (-) lml HSCA-1 hyperpridoma, and when the mouse abdomen became enlarged and ascites reached a maximum in 1-2 weeks. In addition, 10.0 ml of ascites was collected. After adding 10.0 ml of PBS (-) to this, further SAS solution (75 g of ammonium sulfate was dissolved in 100 ml of pure water by warming to 50 ° C and left at 4 ° C for 1 liter.
  • SAS solution 75 g of ammonium sulfate was dissolved in 100 ml of pure water by warming to 50 ° C and left at 4 ° C for 1 liter.
  • the immunoglobulin class and subclass of the HSCA-1 antibody were determined by the ELISA method.
  • a mouse high-pridoma subtyping kit (Roche Diagnostics) was used. Dilute anti-mouse immunoglobulin (from Hedge) 500 times with coating buffer (50 mM sodium carbonate buffer / 0.01% sodium azide (pH 9.4-9.7)), and add 50 1 per well to a 96-well flat-bottom plate. And left at 37 ° C for 30 minutes.
  • washing solution (0.9% sodium chloride / 0.1% Tween 20) 200 1 / well, washed twice, then coating buffer (the peptide obtained by gelatin degradation with Tris-HCl buffer and sodium chloride sodium Dissolved) Put 200 1 / well, leave at 37 ° C for 15 minutes, and then wash twice with cleaning solution 200 1 / well.
  • buffer the peptide obtained by gelatin degradation with Tris-HCl buffer and sodium chloride sodium Dissolved
  • the culture supernatant of HSCA-1 antibody was applied at 50 ⁇ l / tool, allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes, and then washed twice with washing solution 200 1 / well.
  • subclass-specific anti-mouse immunoglobulin monoperoxidase (POD) conjugate anti-mouse IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, ⁇ chain and ⁇ chain
  • POD subclass-specific anti-mouse immunoglobulin monoperoxidase conjugate
  • Substrate solution [2,2'-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid: ABTS) tablet 1 tablet in 5 ml substrate buffer (perborate dissolved in citrate / sodium phosphate buffer ) was dissolved in 100) / tool and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the positive control sample anti-mouse IgGl
  • the reaction was stopped by adding 100 mM / well solution of 4 mM sodium azide solution.
  • the absorbance at 405 nm (OD405) of each well was measured with a spectrophotometer (U2000; manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • OD405 in the positive control sample is 1.409 for anti-mouse IgG, 2.340 for anti-mouse IgG1, 0.081 for anti-mouse IgG2a, 0.053 for anti-mouse IgG2b, 0.057 for anti-mouse IgG3, It was 0.058 for mouse IgM, 0.058 for anti-mouse IgA, 0.058 for anti- ⁇ chain, and 0.276 for anti- ⁇ chain.
  • OD405 in the negative control sample was 0.109 for anti-mouse IgG, 0.126 for anti-mouse IgG1, 0.093 for anti-mouse IgG2a, 0.052 for anti-mouse IgG2b, 0.060 for anti-mouse IgG3, 0.079 for anti-mouse IgM, It was 0.061 for mouse IgA, 0.058 for anti- ⁇ chain, and 0.122 for anti- ⁇ chain.
  • OD405 of this monoclonal antibody HSCA-1 is 1.409 for anti-mouse IgG, 2.340 for anti-mouse IgG1, 0.081 for anti-mouse IgG2a, 0.053 for anti-mouse IgG2b, and 0 for anti-mouse IgG3. It was 0.058 for anti-mouse IgM, 0.058 for anti-mouse IgA, 0.058 for anti- ⁇ chain, and 0.276 for anti- ⁇ chain. That is, the immunoglobulin class and subclass of HSCA-1 antibody was IgG1, and the type of light chain (L chain) was ⁇ chain.
  • lactoperoxidase manufactured by Sigma-Aldrich Japan; dissolved in PBS ( ⁇ ) to 2 mg / ml) 50 1 and 0.5 M phosphate buffer (0.5 M sodium dihydrogen phosphate solution 1.95) Add 0.5M ninatrihydrogen phosphate about 3-4ml to pH 7.0) and add sodium iodide-125 (NEN; low pH, total 2mCi) About lmCi was added, and hydrogen peroxide solution (30% hydrogen peroxide solution diluted 1,000-fold with PBS (-)) 201 was added and mixed, and incubated at 30 ° C for 4 minutes.
  • This 125 1-labeled cell centrifuge pellet was distilled into 0.5 ml Nodet P (NP) -40 buffer (NP -40 lg, Tris-HCl 0.12 g, NaCl 0.87 g, Sodium azide 0.02 g) Add 80 ml of water, adjust the pH to 7.2 with hydrochloric acid, adjust to 100 ml), and mix with a vortex mixer (stand on ice for 15 minutes). Centrifugation was performed at 10,000 G for 20 minutes, and the supernatant was collected.
  • NP Nodet P
  • NP -40 buffer NP -40 lg, Tris-HCl 0.12 g, NaCl 0.87 g, Sodium azide 0.02 g
  • Add 80 ml of water adjust the pH to 7.2 with hydrochloric acid, adjust to 100 ml), and mix with a vortex mixer (stand on ice for 15 minutes). Centrifugation was performed at 10,000 G for 20 minutes, and the supernatant was collected.
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis sample lysis buffer 150 mM Tris-hydrochloric acid (pH 6.8), 4% SDS, 14% glycerol. It was subjected to polyatrylamide gel electrophoresis.
  • SDS-polyacrylamide gel (10% polyacrylamide gel) was prepared, and the above-mentioned sample 151 was applied.
  • a negative control IgG antibody manufactured by Imnotech
  • HSCA-1 antibody was applied.
  • 51 Benchmark Prestained Protein Ladder (Gibcocopy Aruel) was applied.
  • HSCA-1 antibody 0.5 ⁇ g was added to 1 ⁇ 10 5 cell lines described above, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes.
  • FITC-labeled anti-mouse Ig antibody diluted 2,500 times with PBS (-) (containing FCS 1%, sodium azide 0.01%) and then PBS (-) (containing FCS 1%, sodium azide 0.01%) The sample was placed on ice for 30 minutes, and washed once with PBS (-) (containing 1% FCS and 0.01% sodium azide).
  • 50 1 of normal mouse serum diluted 50-fold with PBS (-) (containing FCS 1% and azizote sodium 0.01%) was added and left on ice for 15 minutes.
  • the total amount of FITC (100 g, manufactured by Sigma-Aldrich Japan) was dissolved in 0.15 ml of carbonate buffer (0.5 M sodium hydrogen carbonate and 0.5 M sodium carbonate adjusted to pH 9.5). To this, 1.37 ml (1.0 mg) of HSCA-1 antibody was added and stirring was continued for 1.5 hours at room temperature. This solution was applied to a PD10 column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) and bound to the antibody protein to remove free FITC.
  • Human peripheral blood mononuclear cells were prepared as follows. Specifically, 0.05 ml of heparin sodium injection solution (10,000 U / ml) was placed in a 15 ml polypropylene tube (Corning), and 4 ml of peripheral blood was collected. 5 ml of PBS (-) / H [PBS (-) plus 1% palin sodium injection solution (l, 000 U / ml)] was mixed and mixed well. Thereto, 3.5 ml of Lymphocyte separation medium (manufactured by Organontech-Riki) was placed at the bottom of the tube and centrifuged at 400 G for 30 minutes.
  • Lymphocyte separation medium manufactured by Organontech-Riki
  • the mononuclear cell layer was collected, and PBS (-) / HF [PBS (-) containing 1% heparin sodium injection (l, 000 U / ml) and 2.5% FCS] in 15 ml polypropylene.
  • the tube was made up to 15 ml and centrifuged at 510 G for 10 minutes.
  • PBS (-) / H for precipitation F15 ml was added for suspension, and the mixture was centrifuged at 240 G for 10 minutes. This time, the precipitate was suspended in 10% FCS / RPMI 1 640, and the number of cells was adjusted to about 1 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • About 1 ⁇ 10 5 peripheral blood mononuclear cells prepared were suspended in PBS ( ⁇ ) (containing 1% FCS and 0.01% sodium azide).
  • HSCA-1-FITC antibody was added to each 0.1 ⁇ g, and phycoerythrin (PE) -labeled monoclonal antibodies CD3-PE antibody, CD20-PE antibody, CD33-PE 0.1 ⁇ g each of the antibody, CD34 (class III) -PE antibody, CD56-PE antibody, and IgGl antibody as a control (all manufactured by Imnotech) were added and left on ice for 30 minutes.
  • PBS containing 1% FCS and 0.01% sodium azide
  • Probidium Iodide Sigma Aldritch Japan
  • F ACScan Betaton Dickinson
  • the vertical axes are CD3-PE antibody, CD20-PE antibody, CD33-PE antibody, CD34 (class III) -PE antibody, CD56-PE antibody, and control, respectively.
  • the fluorescence intensity of the IgGl antibody and the horizontal axis indicate the fluorescence intensity of the HSCA-1-FITC antibody. Dots indicate cells.
  • the crosshairs were drawn on the flow cytometry diagram obtained by treating human peripheral blood mononuclear cells with mouse immunoglobulin G1-FITC antibody and mouse immunoglobulin G1-PE antibody (manufactured by Imremtech).
  • the vertical axis and the horizontal axis show the lines that distinguish each positive and negative.
  • the HSCA-1 antibody is a CD33 antibody that is a bone marrow cell (myeloid) marker and is positive for most cells of positive human peripheral blood mononuclear cells. It can be seen that the cells are recognized. However, although HSCA-1 antibody is similar to CD33 antibody, it recognizes clearly different human peripheral blood mononuclear cells, and many of the human peripheral blood mononuclear cells recognized by HSCA-1 antibody It was also found that the cells were positive for CD34 (Class III) antibodies. Since T cells are positive for CD3 antibody, B cells are positive for CD20 antibody, and NK cells are positive for CD56 antibody, HSCA-1 antibody does not recognize human peripheral blood T cells, B cells, or NK cells. I understood that.
  • the HSCA-1 antibody is a novel monoclonal antibody that is different from the HSCA-2 antibody that recognizes conventional T cells and the like and the HSCA-3 antibody that is a CD34-like antibody! /.

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Abstract

　本発明は、ヒト骨髄球・単球細胞、急性骨髄性白血病細胞及びCD34+造血幹細胞に存在することが確認された新規な抗原（HSCA-1抗原）、及び、この抗原を認識するモノクローナル抗体に関する。 　標識された本発明の抗体を用いれば、イムノアッセイ又はフローサイトメトリーにより、上記抗原を容易に測定することができ、急性白血病の診断等に応用が可能である。また、当該抗体を利用した、ヒト骨髄球・単球細胞、急性骨髄性白血病細胞及びCD34+造血幹細胞の分離精製又は除去にも応用できる。                                                                               

Description

明 細 書
抗原及びこの抗原を識別するモノクローナル抗体
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト骨髄球'単球細胞、急性白血病細胞及び CD34陽性造血幹細胞に 存在することが確認された新規な抗原 (HSCA-1抗原と称する）、この抗原を識別する モノクローナル抗体 (HSCA-1抗体と称する）、及びその免疫反応性フラグメントに関 する。
背景技術
[0002] ヒト骨髄球'単球細胞特異的な表面抗原マーカーとして、 CD33分子、 CD13分子な どが知られている（非特許文献 1)。 CD33分子は造血細胞に特異的な膜抗原であり、 単球/マクロファージ、骨髄球、顆粒球、組織球、肥満細胞、造血前駆細胞、骨髄性 白血球細胞に発現している。分子量 67kDaの糖タンパク質で、シアル酸依存性の接 着タンパク質としての機能を有していると考えられているが、詳細な機能は解明され ていない (特許文献 1、非特許文献 2、 3、 4)。 CD33分子に対する抗体の臨床応用と しては、急性骨髄性白血病 (AML)の判定に用いられており（非特許文献 2、 3)、また 、ヒト化抗 CD33抗体は、急性骨髄性白血病の治療薬としていくつか開発され、抗生 物質カリケアマイシンとの結合体である Gemtuzumab ozogamlcln (特許文献 2)は、高 齢者の初回再発急性骨髄性白血病に対して、米国でォーファンドラッグとして認可さ れている。
[0003] CD13分子は造血細胞の顆粒球、単球、骨髄系前駆細胞、骨髄性白血球細胞、腎 臓の遠位細尿管、肝臓の細胆管、中枢神経などに発現している。分子量 150kDaの 糖タンパク質で、アミノぺプチダーゼ活性を有している（非特許文献 5)。 CD13分子に 対する抗体の臨床応用としては、急性骨髄性白血病 (AML)の判定に用いられて！/、 る (非特許文献 6)。
[0004] また、 KG-1細胞を BALB/Cマウスに免疫することにより、 CD34陽性造血幹細胞、末 梢血 T細胞および NK細胞に存在し、 B細胞、単球、顆粒球には存在しない、新規な 抗原 (HSCA-2抗原： CD43ァイソフォーム抗原)や未熟な造血幹細胞に存在する新 規な抗原 (HSCA- 3抗原）、およびそれらを識別するモノクローナル抗体 (HSCA- 2抗 体、 HSCA- 3抗体）が得られている（特許文献 3, 4)
特許文献 1：国際特許番号 WO/9109058号
特許文献 2：米国特許番号 US5714586号公報
特許文献 3：特開 2002— 171971
特許文献 4:特開 2002— 371099
非特許文献 1 :右田俊介ら編、「CD抗原ハンドブック」、医歯薬出版株式会社、 1999 年、 P-7
非特許文献 2 :日本 BRM学会編、「CD分類ノヽンドブック (1995)」、 日本 BRM学会、 199 6年、 p.110
非特許文献 3 :高久文麿ら編、 Γ Annual Review血液 2003」、中外医学社、 2003年、 p. 100
非特許文献 4:アンドリューら、「Blood」 1983年、第 62卷、 p.124
非特許文献 5 :日本 BRM学会編、「CD分類ノヽンドブック (1995)」、 日本 BRM学会、 199
6年、 p.50
非特許文献 6 :右田俊介ら編、「CD抗原ハンドブック」、医歯薬出版株式会社、 1999 年、 P.70
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 急性白血病の診断用及び治療用細胞表面抗原としては、現状知られている CD33 分子や CD13分子、上記モノクローナル抗体などだけでは不十分であり、新しい細胞 表面抗原及びその抗原を識別するモノクローナル抗体が求められて 、る。
[0006] 本発明は、骨髄球 ·単球細胞、急性骨髄性白血病細胞及び CD34陽性 (CD34+；以 下 CD抗原の陽性の記載は同様にして表記する）造血幹細胞に存在する新規な抗原 並びに、この抗原を識別するモノクローナル抗体を提供することを目的とする。また本 発明は、標識した該抗体を利用したィムノアッセィあるいはフローサイトメトリーにより 、前記抗原を測定する方法を提供することを目的とする。更に本発明は、該抗体を利 用して、ヒト骨髄液、臍帯血及びヒト血液中からヒト骨髄球 ·単球細胞、ヒト急性骨髄性 白血病細胞及び CD34+造血幹細胞を分離精製又は除去する方法を提供することを 目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、急性骨髄性白血病患者由来のヒト骨髄芽球様細胞である KG-1細 胞を BALB/Cマウスに免疫する手法を応用した結果、新たに得られたモノクローナル 抗体が、新規な HSCA-1抗原を識別することを見出し、本抗体が、上記目的を満たし 得るものであることを確認し、本発明を完成するに至った。
[0008] すなわち、本発明は、ヒト骨髄球 ·単球細胞、急性骨髄性白血病細胞及び CD34+造 血幹細胞に存在する新規な HSCA-1抗原、並びに、この抗原を識別するモノクロ一 ナル抗体 (HSCA-1抗体)又はその免疫反応性フラグメントである。また、これらモノク ローナル抗体又はその免疫反応性フラグメントが固定ィ匕された固体支持体でもある。 また、本発明は、上記 HSCA-1抗体を産生するハイプリドーマでもある。
[0009] また、本発明は、蛍光標識、放射性同位元素標識又は酵素標識された上記抗体ま たはその免疫反応性フラグメントを用いて、ィムノアッセィ又はフローサイトメトリーによ り、上記抗原を測定する方法でもある。
[0010] さらに本発明は、上記抗体又はその免疫反応性フラグメントを用いて、ヒト骨髄液、 臍帯血及びヒト血液中から骨髄球 ·単球細胞、急性骨髄性白血病細胞又は CD34+造 血幹細胞を分離精製又は除去する方法でもある。
発明の効果
[0011] 本発明によれば、ヒト骨髄球 ·単球細胞、急性白血病細胞及び CD34陽性造血幹細 胞に存在することが確認された新規な抗原、並びにこの抗原を識別するモノクローナ ル抗体が提供される。標識された本発明の抗体を用いれば、ィムノアッセィ又はフロ 一サイトメトリーにより、上記抗原を容易に測定することができ、急性白血病の診断等 に応用が可能である。また、当該抗体を利用した、ヒト骨髄球'単球細胞、急性骨髄 性白血病細胞及び CD34+造血幹細胞の分離精製又は除去にも応用できる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]HSCA- 1抗体を用いて、 HSCA-1抗原の免疫沈降法による分子量解析を示した オートラジオグラフィー図である。 [図 2]HSCA-1抗体を用いて、ヒト単核球細胞における HSCA-1抗原の発現を、 CD3 抗原、 CD20抗原、 CD33抗原、 CD34抗原、 CD56抗原の発現と比較したフローサイト メトリー図である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 以下に本発明を詳述する。
本発明においては、特に記載のない限り、当該分野で公知であるモノクローナル抗 体の作製及び分析方法が採用される。
[0014] まず、本発明を説明する上で用いられる用語を説明する。
「HSCA-1抗原」とは、ヒト骨髄球'単球細胞、ヒト急性骨髄性白血病細胞及びヒト CD3 4+造血幹細胞に存在し、分子量力 6kDaのタンパク質である新規な抗原である。さら に好ましくは、ヒト末梢血 T細胞、 B細胞、及び NK細胞に存在しないことを特徴とする
[0015] また、「HSCA-1抗体」とは、上記 HSCA-1抗原を識別するモノクローナル抗体である 。 HSCA-1抗体は、好ましくは、 KG-1細胞で免疫された哺乳動物の脾臓細胞とミエ口 一マ細胞とを融合して得られるハイプリドーマにより産生されるモノクローナル抗体で ある。ここで、 KG-1細胞とは急性骨髄性白血病患者由来のヒト骨髄芽球様細胞であ り、 JRBC (Japanese Collection of Research Bioresources)の細胞バンク等より入手す ることがでさる。
[0016] 「造血幹細胞」とは、赤血球、白血球、巨核球などの細胞のみならず、 T細胞、 B細 胞などのリンパ系を含めた全ての血液系細胞への分ィ匕能を有する多能性の細胞で あって、かつ、自己増殖可能な細胞をいう。造血幹細胞は、 CD34抗原が陽性でかつ CD38抗原が陰性である（CD34+CD38—；以下 CD抗原の陽性、陰性の記載は同様に して表記する）ことにより特徴付けられる。
[0017] 以下、さらに本発明の詳細について説明する。
本発明のモノクローナル抗体を産生するノ、イブリドーマは、 KG-1細胞を感作抗原と して使用して、基本的には、これを通常の免疫法を応用して免疫し、通常の細胞融 合法を応用して細胞融合させ、通常のクローンィ匕法を応用して、クローンィ匕すること によって作製することができる。 [0018] より具体的には、 KG-1細胞を感作抗原として使用して、被免疫哺乳動物などとして 、ヒト以外のマウス、ラット、ゥサギ、モルモット、ヒッジ、ャギ、ニヮトリなどの腹腔内、皮 下、フットパッドなどに投与する。細胞融合相手となるミエローマ細胞が、通常はマウ ス由来のものであるため、特にマウスを免疫することが好ましい。免疫は、一般的な方 法により、例えば、前記 KG- 1細胞を PBS(- Xphosphate- buffered saline, pH7.2)や生 理食塩水などで適当量に希釈、懸濁したものを、動物に毎週、 1〜3ヶ月投与すること が好ましい。
[0019] 被免疫動物から、脾臓細胞、リンパ球、末梢血などの抗体産生細胞を採取し、これ らと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイプリドーマを作製する。 抗体産生細胞としては、上記 KG-1細胞を最終投与後に摘出した脾臓細胞を使用す るのが好ましい。ミエローマ細胞としては、公知の細胞株、例えば P3-NSI/l-Ag4-l細 胞（略称 NS- 1細胞）（ケーラーら、 Eur. J. Immunol, 6:511 (1976))、 SP2/0- Agl4細胞 (略称 SP2細胞）（シュルマンら、 Nature, 276:269(1978))、 FO細胞（デサントグロスら、 J. Immunol. Meth., 35:1 (1980))などがよく用いられる。ノ、イブリドーマの培養上清か ら目的の抗体の取得を容易にするために、ミエローマ細胞としての固有の免疫グロブ リンを分泌しない株を使用することが望ましい。この点で、 NS-1細胞が望ましい。
[0020] 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には、通常の方法、例え ばケーラーとミルシュタインの方法（ケーラーら、 Nature, 256:495 (1975))に準じて行う ことができる。
[0021] より具体的には、細胞融合促進剤の存在下に、通常の栄養培地中で実施される。
細胞融合促進剤としては、ポリエチレングリコール (PEG)、センダイウィルスなどが用 いられる。細胞融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞との所定量を、例えばミエ口 一マ細胞に対して抗体産生細胞を約 1〜10倍程度用いて行われる。細胞融合時の 培地としては、ミエローマ細胞の増殖に適した培地、例えば RPMI 1640培地が例示で きる。このような培地中で両細胞を混合し、 37°Cに保ったポリエチレングリコール (例 えば、平均分子量 1,000〜6,000のもの）溶液を培地に 30〜60%(W/V)の濃度で添加し 、混合することで細胞融合を開始する。さらに、適当な培地を添加し、遠心分離によ る上清の除去を繰り返すことにより、目的とするハイプリドーマが得られる。 [0022] このハイプリドーマは、通常の選択培地、例えば、ヒポキサンチン (H)、アミノブテリ ン (A)及びチミジン (T)を含有する HAT培地で培養することにより選択される。 HAT培 地では、 目的のハイプリドーマ以外の細胞が死滅するまで数日間〜数週間培養する 。ノ、イブリドーマのコロニーが確認できるようになったら、その培養上清中の抗体をス クリーニングする。培養上清中の抗体のスクリーニングは、例えば、固定した細胞を抗 原とするェライザ (ELISA)法により培養上清中の抗体活性を測定することにより実施 できる（安東民衛ら、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィック (1993 ) ρ.126)。これによりスクリーニングした目的の抗体を産生するノ、イブリドーマは、常法 により限界希釈法を繰り返すことにより、最終的に単一のハイプリドーマクローンから なるコロニーとして得ることができる。
[0023] こうして得られる本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の ハイプリドーマと同様に、公知の培地、例えば、 RPMI 1640や、ダルベッコ改変培地 で、培養、継代できる。また、液体窒素中で長期間保存することもできる。
[0024] 本発明のハイプリドーマを大量に 15%牛胎児血清 (FCS)-RPMI 1640培地で培養す ることにより、本発明のモノクローナル抗体を培養上清力も調製することもできる。また 、マウスの腹腔にハイプリドーマを注射して生じた腹水から、本発明のモノクローナル 抗体を調製することもできる。
[0025] こうして調製したモノクローナル抗体は、通常の抗体の精製方法によって精製して もよい。抗体の精製方法としては、硫酸アンモ-ゥムなどによる塩析、ジェチルァミノ エステル (DEAE)誘導体及びカルボキシメチル（CM)誘導体などを用いたイオン交換 クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィ 一、プロテイン A又はプロテイン Gを用いたァフィ-ティークロマトグラフィーなどの方 法があり、これらの方法を組み合わせて精製することができる。
[0026] 上記のようにして得られる本発明のモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスは、 特に限定されるものではないが、免疫グロブリン (以下 Igと表記する） G1であり、軽鎖（ L鎖）が κ鎖である抗体が例示される。
[0027] また、本発明のモノクローナル抗体を、抗原結合部位 (Fab)を分解しな! ヽタンパク 質分解酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで消化し、さらに、タンパク質の単離精 製を常法により行い得られた、 Fab, F(ab')2などの、抗体の免疫反応性フラグメントで あっても、本発明のモノクローナル抗体と同様の性質を保持する限り、本発明のモノ クローナル抗体と同様に使用することができる。
[0028] 本発明のモノクローナル抗体を抗原と反応させた後、さらに 2次抗体として、フルォ レツセインイソチオシァネート (FITC)などの蛍光標識物質、 1251などの放射性同位元 素、又は、アルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼなどの酵素によって標識した 免疫グロブリンを反応させることにより、抗原を検出することができる。また、本発明の モノクローナル抗体そのものを FITCなどの蛍光標識物質、 1251などの放射性同位元 素、又は、アルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼなどの酵素によって標識する ことにより、抗原を検出することもできる。
[0029] また、本発明のモノクローナル抗体又は免疫反応性フラグメントを固体支持体 (例 えば、プロテイン A若しくはプロテイン Gを固定化したセファロースゃァガロースなどの 榭脂、又は、臭化シアン活性ィ匕セファロースゃァガロースなどの榭脂）に固定化する ことにより細胞分離用カラムを作製することができる。このカラムへ、ヒト骨髄液、臍帯 血及びヒト血液を流してやると、ヒト骨髄球'単球細胞、ヒト急性骨髄性白血病細胞又 は CD34+造血幹細胞を分離精製することができる。また、該細胞分離カラムを用いる ことにより、ヒト骨髄液、臍帯血又はヒト血液から、ヒト骨髄球'単球細胞、ヒト急性骨髄 性白血病細胞又は CD34+造血幹細胞を選択的に除去することもできる。
[0030] また、本発明のモノクローナル抗体又は免疫反応性フラグメントに、抗生物質、毒 素、酵素又は放射性同位元素を結合させて用いる、又は、本発明のモノクローナル 抗体を用いた抗体依存性細胞障害活性 (ADCC)若しくは補体依存性細胞障害活性 (CDC)を利用して、ヒト血液中から、ヒト急性骨髄性白血病細胞、ヒト骨髄球細胞、ヒ ト単球細胞又はヒト CD34+造血幹細胞を死滅させることもできる。
実施例
[0031] 以下、本発明における HSCA-1抗原及びこの抗原を識別するモノクローナル抗体 についてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるもの ではない。
[0032] 列 i) HSCA- 1 ： ハイプリドーマの 製、 び、 HSCA-1杭 ：の (a)感作抗原として、 KG-1細胞 (JCRB細胞バンク）を用いた。 KG-1細胞を、 1.0 X 1 05/mlの濃度になるように、 15%牛胎児血清 (FCS)- RPMI 1640培地 (株式会社日研生 物医学研究所製） 15mlに懸濁し、カルチャーディッシュ（グライナ一社製）（直径 10cm )に入れ、 5%COインキュベーターで、 37°Cで培養を行った。培養 4〜5日目に、細胞
2
を 4°C、 240Gで 10分間遠心分離して回収し、 PBS(-) (phosphate-buffered saline, pH7. 2；株式会社日研生物医学研究所製)で 2回洗浄後、 1.0 X 107個の細胞を 200 μ 1の ΡΒ S (-)に懸濁し、これを感作抗原として用いた。
[0033] (b)被免疫動物として、 BALB/cマウスのメス（8週齢）を用いた。上述の KG-1細胞を 感作抗原とし、マウスに皮下注射した。以後、同様の細胞（1.0 X 107個）を 7日目、 14 曰目、 21曰目、 29曰目、 54曰目、 61曰目、 68曰目、 74曰目、 85曰目、そして 92曰目に 皮下注射し、最終免疫として、 96日目に同様の細胞（1.0 X 107個）を腹腔内に注射し た。
[0034] (c)ハイブリドーマの調製
最終免疫から 4日後すなわち最初の免疫から 100日目に、マウス力も脾臓を摘出し、 PBS (-)を入れたディッシュに入れ、スライドグラス 2枚のすりガラス部分を用いて脾臓 をつぶし、脾臓細胞を回収した。細胞をチューブに入れ、 4°C、 240Gで 10分間遠心 分離し、上清を捨てた。
[0035] 融合相手のミエローマ細胞である NS-1細胞は、以下のように調製した。 NS-1細胞を 、 1.0 X 105/mlの濃度になるようにし、 15%牛胎児血清 (FCS)-RPMI 1640培地 15mlに 懸濁し、カルチャーディッシュ（直径 10cm)に入れ、 5%COインキュベータ一中、 37°C
2
で培養を行った。培養 4〜5日目に細胞を、 4°C、 240Gで 10分間遠心分離して回収し た。
[0036] 次に、脾臓細胞及び NS-1細胞を、それぞれ RPMI 1640培地 30mlで 3回洗浄した後 、脾臓細胞 (合計 2.89 X 108個）及び NS-1細胞 (合計 8.07 X 107個）を混合した。 RPMI 1640培地をカ卩ぇ 10mlにし、ガラスチューブに入れ、 4°C、 300Gで 10分間遠心分離し、 上清を除去した。 PEG溶液 [ポリエチレングリコール 4,000を PBS (-)に溶解して 50%に したもの（ロシュ'ダイァグノスティックス社製） 1ml +ジメチルスルフォキシド 0.1ml +RP MI 1640培地 0.1ml] lmlをガラスチューブに 1分間かけて加え、 1分間攪拌し、次に RP MI 1640培地 lmlを 1分間かけて加えた。さらに、 RPMI 1640培地 lmlを 1分間かけて 加え、最後に、 RPMI 1640培地 7mlを 3分間かけて加えた後、 150G、 10分間室温で遠 心分離し、上清を完全に除去した。
[0037] こうして得られたペレットをほぐして、 15%FCS-RPMI 1640培地を適量入れて、細胞 濃度を 1 X 107個/ mlに調整した。この細胞を 96ゥエル平底プレート (コ一-ング社製） に、 100 1/ゥエルまいた。その翌日に、 50倍濃縮ヒポキサンチン +アミノプテリン +チ ミジン (HAT)溶液（大日本製薬社製）を 15%FCS- RPMI 1640培地で希釈して 2%にし たもの（HAT2%溶液）を、 100 μ 1/ゥヱルカ卩ぇ、さらにその翌日、ゥエル中の上清 100 μ 1 を上記の ΗΑΤ2%溶液 100 /ζ 1に交換した。同様にして、細胞融合の日から、 3、 5、 8、 11 、 14日目にゥエル中の上清 100 1を上記の ΗΑΤ2%溶液 100 1に交換した。次に、下 記のェライザ (ELISA)法により培養上清中の抗体活性を測定した。
[0038] (d)エライザ法を用 Vヽた抗体アツセィ
以下に示すポリ- L-リジン処理工ライザ用 96ゥエルプレートを準備した。ェライザ用 9 6ゥエルプレートとして EIA/RIA高結合型平底プレート（コースター社製）を用い、ポリ- L-リジン溶液（50 g/ml) 50 1を、プレートの各ゥエルに入れた。プレートミキサーで 攪拌後、室温で 5〜30分間放置し、ポリ- L-リジン溶液を吸引除去した。さらに、洗浄 のために、滅菌超純水 100 1をプレートの各ゥエルに入れ、吸引除去した。この洗浄 操作はさらに 2回繰り返し、クリーンベンチ内にプレートを放置して乾燥させた。
[0039] 次に、免疫原に用いた KG-1細胞（4.8 X 106個 /96ゥヱルプレート）を、アールの緩衝 塩類溶液 (EBSS) (株式会社日研生物医学研究所製)で、 3回洗浄し、 PBS (-)で、 I X 106個/ mlの細胞濃度として、上記のプレートの各ゥエルに、 50 1ずつ分注した。室温 で 15分間放置して、細胞が底面に接着するのを待ち、 90Gで遠心分離した。上清を 吸引除去後、 0.05%のグルタルアルデヒド PBS (-)溶液を 50 μ 1ずつ静かに各ゥヱル に入れ、室温で 3分間放置した後、 PBS - OO /z lを各ゥエルに入れ、吸引除去した。 さらに、 PBS (-)で 3回洗浄後、ブロッキング溶液（0.2%ゼラチン、 0.1%BSA、 lOOmMグ リシン、 0.1%アジィ匕ナトリウム添加 PBS(-)) 100 1を各ゥエルに入れ、吸引除去した。 もう一度、ブロッキング溶液 100 1を各ゥエルに入れ、室温で 1時間静置した後、吸引 除去し、ノ、イブリドーマの培養上清 100 1を各ゥエルに入れ、室温で 2時間以上反応 させた。ゥエルを 0.1%ゼラチン添加 PBS(-)-0.05%Tween20溶液 150 1で、 3回洗浄し た。
[0040] 次に、 1,500倍希釈したャギ IgG抗体（マウス IgG、 IgA、 IgMに対する抗体;カッペル 社製） 100 1を各ゥエルに入れ、室温で 1時間以上反応させた。ここでゥエルを 0.1% ゼラチン添加 PBS(-)-0.05%Tween20溶液 150 1で、 3回洗浄した。オルトフエ-レンジ ァミン (OPD)-過酸化水素溶液（0.3%OPD、 0.02%過酸化水素を 0.05Mクェン酸緩衝液 (PH4.0)に溶解したもの） 100 1を各ゥエルに入れ、室温で 10分間放置し、発色を確 認後、 1N硫酸- 2mMアジィ匕ナトリウム溶液 100 1をさらにゥエルに加え、攪拌した。最 後に、 492nmの吸光度（OD492)をプレートリーダー（大日本製薬社製)で読み、発色 色素量を測定し、抗体の活性を判定した。本実験の陽性対照として、 KG-1細胞を免 疫したマウスの脾臓細胞採取前の血清を PBS (-)で 500倍希釈した溶液を用い、陰性 対照として、通常のマウスの血清を PBS (-)で 500倍希釈した溶液を用いた。 HSCA-1 抗体の培養上清の OD492は 0.091、陰性対照の OD492は 0.042、陽性対照の OD492 は 0.597であった。
[0041] (e)シングルセルクロー-ング
上記 (d)で得られた KG-1細胞結合活性を有するモノクローナル抗体 HSCA-1を、 限界希釈法によりシングルセルクローユングした。すなわち、ハイプリドーマが、 1個 Z ゥエルとなるように、クローユング培地 [15%FCS-RPMI 1640培地に 5%(w/w)の濃度に なるようにブライクローン (大日本製薬社製)を添加したもの]に懸濁し、その懸濁液を 100 1ずつ、胸腺細胞をフィーダ一細胞としてまいた 96ゥエル平底プレート（コーニン グ社製）に分注して、 37°C、 5%CO存在下で培養した。
2
[0042] フィーダ一細胞の調製は、以下のように行った。 BALB/cマウスから、胸腺を摘出し 、ピペッティングで細胞をばらばらにして、ヒポキサンチン/チミジン（HT)を含む、 15% FCS-RPMI 1640培地に懸濁した。その細胞濃度を 5 X 106個/ mlに合わせ、 100 1ず っ各ゥエルに分注した。約 2週間後に、ゥエル当たり、 1個のハイプリドーマが生育し ている培養上清を 100 1回収して、抗体活性の有無を上記 (d)に記したエライザ法 による抗体アツセィで調べた。こうして陽性クローンに対して、上記と同様のシングル セルクロー-ングを合計 5回行い、抗体産生が安定でかつ完全に HSCA-1抗体を産 生して 、るハイブリドーマクローンを得た。
[0043] この HSCA- 1抗体産生ハイブリドーマは、 Mouse- Mouse hybridoma HSCA- 1として、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (IPOD :干 305-8566 茨 城県つくば巿東 1 - 1 - 1 中央第 6)に寄託されて 、る（受託番号 FERM BP-10621： 2000年 3月 16日の国内寄託を、 2006年 6月 15日にブダペスト条約に基づく国際寄託 へ移管)。
[0044] (f) HSCA-1抗体の大量調製と精製
HSCA-1抗体を大量調製するために、上記ハイプリドーマをマウス腹腔に注射して 、 HSCA-1抗体を大量に含む腹水を調製した。すなわち、 BALB/cマウスに 1 X 107個/ PBS(- )lmlの HSCA- 1ハイプリドーマを腹腔内に注射し、 1〜2週間でマウスの腹部が 肥大し、腹水が最大に達した頃に、腹水 10.0mlを採取した。これに PBS(-)10.0mlを加 えた後、さらに SAS溶液（75gの硫酸アンモ-ゥムを 100mlの純水に 50°Cに温めて溶か し、 4°Cに 1晚放置して、過剰の硫酸アンモ-ゥムを沈殿除去して、上清を使用した) 2 0.0mlを添加、氷中で 30〜60分放置した。 8,000G、 10分間、 4°Cで遠心分離後、沈殿 に PBS(- .Omlをカ卩ぇ懸濁し、更に SAS溶液 lmlをカ卩え、氷中 30〜60分放置した。 8,00 0G、 10分間、 4°Cで遠心分離した後、上清に SAS溶液 2.55mlカ卩ぇ（33%飽和）、氷中 30 〜60分放置した。 8,000G、 10分間、 4°Cで遠心分離した後、沈殿を回収し、 PBS(-)4.0 mlに溶解した。さらに、 4°Cにて、 3Lの PBS (-)に対して透析した。
[0045] この硫安分画法で得られた粗精製抗体 46.6mg (溶液で 4ml)の中、約 10mgを使用 して、プロテイン Gセファロース（アマシャムフアルマシアバイオテク社製) 2mlで、さら に精製した。プロテイン Gセファロースカラムをバインディングバッファー（MAPSIIキット ；日本バイオラッドラボラトリーズ社製） 10mlで平衡ィ匕した後、抗体サンプルをカラムに アプライし、 30mlバインディングバッファーで洗浄した。カラムからの溶出は、 0.2Mダリ シン/ HCl(pH2.2)10mlで行った。クーマシーブリリアントブルー法のキット（日本バイオ ラッドラボラトリーズ社製)で回収した抗体溶液のタンパク質濃度を測定すると、 0.73m g/mlで、合計 5.8mgであった。
[0046] (実施例 2)杭体のサブクラスの決定
エライザ法により、 HSCA-1抗体の免疫グロブリンクラス及びサブクラスを決定した。 そのために、マウスハイプリドーマサブタイピングキット（ロシュ'ダイァグノスティックス 社製)を用いた。抗マウス免疫グロブリン (ヒッジ由来）をコーティング緩衝液 (50mM炭 酸ナトリウム緩衝液 /0.01%アジィ匕ナトリウム (pH9.4- 9.7))で 500倍に希釈し、 96穴平底 プレートにゥエル当たり 50 1を入れ、 37°Cで、 30分間放置した。洗浄溶液 (0.9%塩ィ匕 ナトリウム /0.1%ツイーン 20) 200 1/ゥエルで、 2回洗浄した後、コーティング緩衝液（ ゼラチンの分解により得られたペプチドをトリス塩酸緩衝液と塩ィ匕ナトリウムで溶解し たもの） 200 1/ゥエル入れ、 37°Cで、 15分間放置後、洗浄溶液 200 1/ゥエルで、 2回 洗浄した。
[0047] 次に、 HSCA-1抗体の培養上清を 50 μ 1/ゥヱルアプライし、 37°Cで 30分間放置後、 洗浄溶液 200 1/ゥエルで 2回洗浄した。さらに、サブクラス特異的抗マウス免疫グロ ブリン一ペルォキシダーゼ（POD)コンジュゲート（抗マウス IgG、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、 IgA、 λ鎖及び κ鎖）を 10倍希釈して、 50 μ 1/ゥエルアプライし、 37°Cで、 3 0分間放置した後、洗浄溶液 200 1/ゥエルで、 2回洗浄した。基質溶液 [2,2'-アジノ ビス（3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸： ABTS)タブレット 1個を 5mlの基質緩 衝液 (過ホウ酸塩をクェン酸/リン酸ナトリウム緩衝液に溶解）に溶解したもの]を 100 ΐ/ゥヱルアプライし、室温で、 30分間反応させた。陽性対照サンプル (抗マウス IgGl )が濃い緑色を呈したら、 4mMアジィ匕ナトリウム溶液を 100 1/ゥエルカ卩えて、反応を 停止させた。各ゥエルの 405nmの吸光度（OD405)を分光光度計 (U2000 ;日立製作 所製)で測定した。
[0048] 結果は、陽性対照サンプル（IgGl、 κ鎖）の OD405は、抗マウス IgGでは 1.409、抗 マウス IgGlでは 2.340、抗マウス IgG2aでは 0.081、抗マウス IgG2bでは 0.053、抗マウス IgG3では 0.057、抗マウス IgMでは 0.058、抗マウス IgAでは 0.058、抗 λ鎖では 0.058、 抗 κ鎖では 0.276であった。それに対して、陰性対照サンプルの OD405は、抗マウス I gGでは 0.109、抗マウス IgGlでは 0.126、抗マウス IgG2aでは 0.093、抗マウス IgG2bで は 0.052、抗マウス IgG3では 0.060、抗マウス IgMでは 0.079、抗マウス IgAでは 0.061、 抗 λ鎖では 0.058、抗 κ鎖では 0.122であった。
[0049] 本モノクローナル抗体 HSCA- 1の OD405は、抗マウス IgGでは 1.409、抗マウス IgGl では 2.340、抗マウス IgG2aでは 0.081、抗マウス IgG2bでは 0.053、抗マウス IgG3では 0. 057、抗マウス IgMでは 0.058、抗マウス IgAでは 0.058、抗 λ鎖では 0.058、抗 κ鎖では 0.276であった。すなわち、 HSCA-1抗体の免疫グロブリンクラス及びサブクラスは IgG 1であり、軽鎖（L鎖）のタイプは κ鎖であった。
[0050] (実施例 3) HSCA-1杭体反 杭原の免疫沈降による解析
15%FCS-RPMI 1640培地で培養した、対数増殖期にある KG-1細胞を 5.0 X 107個集 めて、 PBS (-)で 3回洗浄した。 15mlポリプロピレン製チューブ (ファルコン社製）に細胞 のペレツト^^め、そこに 150 1 PBS (-)を入れ、懸濁し、氷上に放置した。これは使 用前に 30°Cのインキュベーターで、 30°Cにした。これに、ラクトペルォキシダーゼ（シ グマアルドリッチジャパン社製； PBS (-)に溶解して、 2mg/mlにした） 50 1と、 0.5Mリン 酸緩衝液 (0.5Mリン酸二水素ナトリウム溶液 1.95mlに対して、 0.5Mリン酸水素ニナトリ ゥム約 3〜4mlをカ卩ぇ pH7.0にした） 10 1を入れ、さらに、ヨウ化ナトリウム- 125 (NEN社 製;低 pH、全 2mCi)約 lmCi分を入れ、速やかに、過酸化水素水（30%過酸化水素水 を PBS (-)で 1,000倍希釈した） 20 1を加え、混合し、 30°Cで、 4分間インキュベーショ ンした。そこに再度、過酸化水素水（30%過酸化水素水を PBS (-)で 1,000倍希釈した ) 20 1を加え、混合し、室温で、 10分間放置した。次に、 4°Cに冷やした洗浄緩衝液（ 0.02%アジ化ナトリウム /2mMヨウ化カリウム/ PBS(-)) 5mlをカ卩え、 300Gで、 7分間、室温 で遠心分離した。この洗浄操作を 3回繰り返した。遠心分離用のチューブに牛胎児血 清 2mlを入れて、その上に、洗浄緩衝液 lmlに懸濁した細胞懸濁液を静かに上層し、 300Gで 10分間遠心分離した。これを洗浄緩衝液で 2回洗浄した。
[0051] この1251ラベルした細胞の遠心分離ペレットに、 0.5mlノ-デット P(NP)- 40緩衝液（NP -40 lg、トリス塩酸 0.12g、食塩 0.87g、アジ化ナトリウム 0.02gに蒸留水 80mlを入れて、 塩酸で pHを 7.2に調整し、 100mlに合わせた）を入れて、ボルテックスミキサーで混合 した (氷上で 15分間放置)。 10,000Gで 20分間遠心分離し、上清を回収した。この1251 ラベルした KG- 1細胞の抽出液 500 μ 1のうち 80 μ 1を取り、 HSCA- 1抗体を 1.5 g、対 照の IgGl抗体 (ィムノテック社製)も 1.5 g用い、上記抽出液に加え、氷上で 30分間 放置した。一方、プロテイン G-セファロースを NP-40緩衝液で 3回洗浄した後、プロテ イン G-セファロース 10mlに対して、 NP- 40緩衝液 10mlをカ卩え、このうち 20 1を、上記 抗体を添カ卩した KG-1細胞の抽出液に添カ卩して、氷上で 1時間インキュベーションした 。 NP-40緩衝液 lmlをカ卩えて、 8,000Gで 3分間遠心分離して上清を除去し、さらにこれ を 4回繰り返し洗浄した。
[0052] これに SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動サンプル溶解緩衝液（150mMトリス-塩 酸 (pH6.8)、 4%SDS、 14%グリセロール） 30 μ 1を加え、このうち 15 μ 1を SDS-ポリアタリ ルアミドゲル電気泳動に供した。 SDS-ポリアクリルアミドゲル（10%ポリアクリルアミドゲ ル)を作製し、上述のサンプル 15 1をアプライした。レーン 1には、陰性対照の IgG抗 体 (ィムノテック社製)をアプライし、レーン 2には、 HSCA- 1抗体をアプライした。レー ン 3には、ベンチマークプレステインドプロテインラダー（ギブコピーアルエル社製）を 5 1アプライした。 100ボルト一定電圧下、 1時間電気泳動後、ゲルを 50%トリクロ口酢 酸で、 30分間固定後、蒸留水で 30分間ずつ、合計 3回洗浄した。スタンダードタンパ ク質の電気泳動位置を確認し、ゲルをゲル乾燥機で乾燥し、オートラジオグラフィー に供した。結果を図 1に示した。陰性対照の IgG抗体ではバンドが認められないのに 対し、 HSCA-1抗体では分子量 56kDaのタンパク質と反応して!/、た。
[0053] ( u)各糠株ィ 田胞による HSC A- 1杭原の 現
KG-1細胞及び CD34+Jurkat細胞以外の株化細胞を用いて、 HSCA-1抗体による染 色を行った。用いた細胞は、以下の通りである。
( KU812:好塩基球細胞株、 (2)KU812(CD34+)：好塩基球細胞株から CD34陽性 細胞を分離したもの、（3) HEL:赤芽球/巨核芽球性細胞株、 (4)jurkat(CD2+CD34") ： T細胞株、 (5)MOLT14: y δ T細胞株、（6)MOLT4:T細胞株、（7)RAJI:EB陽性 B 細胞株、（8)NALM6:preB細胞株、（9)DAUDI:B細胞株、（10)K562:赤白血病細胞 株、（ll)THP-l:単球性細胞株、（12)HL60:骨髄芽球性細胞株、（13)U937:単球性 細胞株、以上 (1)〜(13)はすべてヒト細胞株、（14)NS- 1:マウス骨髄腫細胞株。
[0054] 上記の株化細胞 1 X 105個に、 HSCA-1抗体を 0.5 μ g加えて氷上で 30分間放置した 。 PBS(-)(FCS1%、アジ化ナトリウム 0.01%を含む）で 2回洗浄した後、 PBS(-)(FCS1%、 アジ化ナトリウム 0.01%を含む）で 2,500倍希釈した FITC標識抗マウス Ig抗体を 50 μ 1カロ えて、氷上で 30分間放置した後、 PBS(-)(FCS1%、アジ化ナトリウム 0.01%を含む）で 1 回洗浄した。さらに PBS(-)(FCS1%、アジィ匕ナトリウム 0.01%を含む)で 50倍希釈した正 常マウス血清を 50 1加えて、氷上で 15分間放置した。 PBS(-)(FCS1%、アジィ匕ナトリウ ム 0.01%を含む)で 2回洗浄した後、ヨウ化プロビジゥムを最終濃度 10 g/mlになるよう に加えて細胞を染色した。染色された細胞をフローサイトメーター FACScan (ベタトン ディッキンソン社製）にて測定した。
[0055] 測定結果は、（l) KU812= +、 (2) KU812(CD34+)= ++, (3) HEL= ++ゝ (4)jurkat(CD 2+CD34- )= +、 (5) MOLT14=士、（6) MOLT4= +、（7) RAJI= +、（8) NALM6= +、 (9) D AUDI= +、（10) K562= ++、（ll) THP— 1= +、（12) HL60= +、（13) U937= +、 (14) NS- 1= -であった (ここで、 ++は強陽性、 +は陽性、士は弱陽性、 -は陰性を示す)。 CD34抗 体で陽性の細胞は、 HSCA-1抗体にぉ 、ても陽性であった。
[0056] (実施例 5) HSCA-1抗体の FITC標識
FITC全量（100 g、シグマアルドリッチジャパン社製）を炭酸塩緩衝液 (0.5M炭酸 水素ナトリウムに 0.5M炭酸ナトリウムをカ卩えて pH9.5にしたもの） 0.15mlに溶解した。そ れに HSCA-1抗体を 1.37ml (1.0mg)加え、室温で 1.5時間攪拌を続けた。この溶液を P D10カラム（アマシャムフアルマシアバイオテク社製）にアプライして、抗体タンパク質 に結合して 、な 、遊離 FITCを除去した。抗体- FITC画分を PBS(-)/0.02%アジィ匕ナト リウム 1Lに対して 3回透析した後、分光光度計（日立製作所製; U2000)で 280nm (OD 280=x)と 495nm (OD495=y)を測定し、抗体タンパク質濃度（P)と FITC結合量 (F)から 、 F/P比率 =2.7y/x-0.3yを算出した。測定結果は、 OD280=x=0.4052、 OD495=y=0.34 58で、 F/P比率 =3.10となった。こうして、 HSCA- 1抗体の FITC標識標品（HSCA- 1- FI TC抗体) 289 μ g/mlを得た。
[0057] (実施例 6)ヒト末梢血単核球細朐における HSCA- 1抗原の発現
ヒト末梢血単核球細胞は以下のように調製した。すなわち、 15mlポリプロピレン製チ ユーブ（コ一-ング社製）にへパリンナトリウム注射液（10,000U/ml) 0.05mlを入れ、そ こに採血したば力りの末梢血 4mlをカ卩え、さらに PBS(-)/H [PBS (-)に 1 %へパリンナトリ ゥム注射液（l,000U/ml)を加えたもの]を 5mlカロえ、よく混ぜた。そこに、リンフォサイト セパレーシヨンメディウム（オルガノンテク-力社製） 3.5mlをチューブ底に入れて、 400 Gで 30分間、遠心分離した。ここで、単核球細胞層を集め、 PBS(- )/HF[PBS (-)に 1% へパリンナトリウム注射液（l,000U/ml)及び 2.5%FCSをカ卩えたもの]を 15mlポリプロピレ ン製チューブにカ卩えて 15mlにして、 510Gで 10分間、遠心分離した。沈殿に PBS(-)/H F15mlを加えて懸濁し、 240Gで 10分間遠心分離した。今度は沈殿を 10%FCS/RPMI 1 640に懸濁し、細胞数を約 1 X 107個/ mlに調整した。調製した末梢血単核球細胞を約 1 X 105個ずつ、 PBS(-) (FCS1%、アジ化ナトリウム 0.01%を含む）に懸濁した。
[0058] これに HSCA-1-FITC抗体を 0.1 μ gずつ添カ卩し、さらに、フィコエリスリン（PE)標識し たモノクローナル抗体である、 CD3- PE抗体、 CD20- PE抗体、 CD33- PE抗体、 CD34 ( クラス III) -PE抗体、 CD56-PE抗体、及び、対照である IgGl抗体（いずれもィムノテック 社製)をそれぞれ 0.1 μ gずつ添加し、氷上で 30分間放置した。 PBS(-) (FCS1%、アジ 化ナトリウム 0.01%を含む)で 2回細胞を洗浄した後、ヨウ化プロビジゥム (シグマアル ドリツチジャパン社製)を最終濃度 10 g/mlになるようにカ卩え、フローサイトメーター（F ACScan：ベタトン ·ディッキンソン社製)で解析した。結果を図 2に示した。
[0059] 2つのフローサイトメトリー図において、縦軸はそれぞれ、 CD3- PE抗体、 CD20- PE 抗体、 CD33- PE抗体、 CD34 (クラス III) - PE抗体、 CD56- PE抗体、及び、対照である I gGl抗体の蛍光強度、横軸は HSCA-1-FITC抗体の蛍光強度を示した。ドットは細胞 を示している。十字の線は、ヒト末梢血単核球細胞をマウス免疫グロブリン G1-FITC 抗体及びマウス免疫グロブリン G1-PE抗体 ( 、ずれもィムノテック社製)で処理して得 られたフローサイトメトリー図に引いた縦軸と横軸の、それぞれの陽性陰性を区分す る線を示している。
[0060] これにより、 HSCA-1抗体は、骨髄細胞（ミエロイド）マーカーである CD33抗体で陽 性のヒト末梢血単核球細胞の大部分の細胞に陽性であることから、骨髄球'単球細 胞を認識していることがわかる。但し、 HSCA-1抗体は CD33抗体とは似てはいるもの の、明らかに異なるヒト末梢血単核球細胞を認識しており、 HSCA-1抗体が認識する ヒト末梢血単核球細胞の多くの細胞力 CD34 (クラス III)抗体陽性細胞であることもわ かった。また、 T細胞は CD3抗体陽性、 B細胞は CD20抗体陽性、そして、 NK細胞は C D56抗体陽性なので、 HSCA-1抗体はヒト末梢血 T細胞、 B細胞、及び、 NK細胞を認 識しな 、こともわかった。
[0061] 以上の結果より、 HSCA-1抗体は従来の T細胞等を認識する HSCA-2抗体や CD34 様抗体である HSCA-3抗体とも異なる、新規なモノクローナル抗体であると!/、える。

Claims

請求の範囲
[I] ヒト骨髄球 ·単球細胞、ヒト急性骨髄性白血病細胞及びヒト CD34+造血幹細胞を認識 することを特徴とするモノクローナル抗体。
[2] さら〖こ、ヒト末梢血 T細胞、 B細胞、及び NK細胞を認識しな ヽことを特徴とする請求 項 1記載のモノクローナル抗体。
[3] マウスモノクローナル抗体である請求項 1又は 2記載の抗体。
[4] 受託番号が FERM BP-10621であるハイプリドーマの産生するモノクローナル抗体の 場合と同じ抗原に結合する請求項 1〜3のいずれかに記載の抗体。
[5] 受託番号が FERM BP-10621であるハイプリドーマによって産生される請求項 1又は 2 記載のモノクローナル抗体。
[6] 蛍光標識、放射性同位元素標識、酵素標識、抗生物質標識、又は毒素標識されて
V、る請求項 1〜5の 、ずれかに記載の抗体。
[7] 請求項 1〜5のいずれかに記載の抗体が固定ィ匕された固体支持体。
[8] 請求項 1〜5のいずれかに記載の抗体の免疫反応性フラグメント。
[9] 蛍光標識、放射性同位元素標識、酵素標識、抗生物質標識、又は毒素標識されて
V、る請求項 8記載の免疫反応性フラグメント。
[10] 請求項 8記載の免疫反応性フラグメントが固定化された固体支持体。
[II] 請求項 1〜3のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハ イブリドーマ。
[12] 受託番号 FERM BP-10621であるハイプリドーマ。
[13] 急性骨髄性白血病患者由来ヒト骨髄芽球様細胞である KG-1細胞で免疫した哺乳動 物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させて得られることを特徴とする請求項
11記載のハイプリドーマ。
[14] 分子量が 56kDaのタンパク質であり、ヒト骨髄球 ·単球細胞、ヒト急性骨髄性白血病細 胞及びヒト CD34+造血幹細胞に存在することを特徴とする HSCA-1抗原。
[15] さら〖こ、ヒト末梢血 T細胞、 B細胞、及び NK細胞に存在しな ヽことを特徴とする請求 項 14記載の HSCA- 1抗原。
[16] 蛍光標識、放射性同位元素標識又は酵素標識によるィムノアッセィ又はフローサイト メトリーにお 、て、請求項 6記載の抗体又は請求項 9記載の免疫反応性フラグメントを 用いることを特徴とする、請求項 14又は 15記載の抗原を測定する方法。
[17] 請求項 1〜5のいずれかに記載の抗体又は請求項 8記載の免疫反応性フラグメント を用いることを特徴とする、ヒト骨髄液、臍帯血又はヒト血液中から、ヒト骨髄球'単球 細胞、ヒト急性骨髄性白血病細胞又はヒト CD34+造血幹細胞を分離精製する方法。
[18] 請求項 1〜5のいずれかに記載の抗体又は請求項 8記載の免疫反応性フラグメント を固体支持体に固定ィ匕することにより作製した細胞分離用カラムを用いたヒト血液中 から、ヒト急性骨髄性白血病細胞、ヒト骨髄球細胞及びヒト単球細胞又はヒト CD34+造 血幹細胞を除去させる方法。
[19] 請求項 1〜5のいずれかに記載の抗体又は請求項 8記載の免疫反応性フラグメント に、抗生物質、毒素、酵素又は放射性同位元素を結合させて用いることを特徴とす る、ヒト血液中から、ヒト急性骨髄性白血病細胞、ヒト骨髄球細胞、ヒト単球細胞又はヒ ト CD34+造血幹細胞を死滅させる方法。
[20] 請求項 1〜5の ヽずれかに記載の抗体を用い、抗体依存性細胞障害活性 (ADCC) 若しくは補体依存性細胞障害活性 (CDC)を利用することを特徴とする、ヒト血液中か ら、ヒト急性骨髄性白血病細胞、ヒト骨髄球細胞、ヒト単球細胞又はヒト CD34+造血幹 細胞を死滅させる方法。
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