【発明の詳細な説明】
ヒトのエリスロイド前駆細胞集団
本発明の技術分野
本発明は、ヒト血球を、特に、エリスロイド（erythroid）系列の血球、取り
分けエリスロイド系列の前駆細胞を単離する方法に関する。本発明はまた、本発
明の方法に従って産生されるエリスロイド前駆細胞よりなる組成物にも関する。
本発明の背景
赤血球（それは循環系を通って循環する）及びそれらの前駆細胞は、一つの機
能的ユニットであると考えることができる。この機能的ユニットは、「赤血球組
織系」と名付けられている。赤血球組織系は、骨髄中の前正赤芽球から血液中に
循環する脱核した赤血球までの、限定された一群の細胞要素によって構成される
。赤血球（それはその色をヘモグロビンの存在に負っている）は、ヘモグロビン
のヘム基中に配置された鉄原子と酸素との間で形成される錯体によって、身体中
に酸素を運搬する。
ヒトが、正常より実質的に低い数の循環赤血球を有している場合には、その患
者は、貧血であるか又は選択的な赤血球癆に罹っていると考えられる。選択的な
赤血球癆は、骨髄のエリスロイドコンパートメントの選択的枯渇によって特徴付
けられる骨髄癆の一群である。加えて、エリスロイド前駆細胞、すなわちバース
ト形成ユニット・エリスロイド（ＢＦＵ−Ｅ）及びコロニー形成ユニット・エリ
スロイド（ＣＦＵ−Ｅ）が、他の血球系列の増殖及び分化が正常に
続いているのに、枯渇する。
成人の赤血球癆（ＰＲＣＡ）は、自己免疫性骨髄癆の第１のヒトモデルとして
役立った。稀な疾患ではあるが、ＰＲＣＡは、広範な種々の薬物、感染及び溶血
性貧血該に続発し得、これらの場合、疾患は一般に急性である。慢性ＰＲＣＡは
、胸腺腫及び／又は他の慢性病患と関連し得る。ＰＲＣＡには、全てのタイプが
関与し得る。例えば、液性免疫は、赤芽球コンパートメント及びＢＦＵ−Ｅと、
及び稀なケースではエリスロポエチンと反応するＩｇＧ抗体に例示される。他の
場合においては、エリスロイド抑制は、ＣＤ８＋抗原を有する大顆粒リンパ球に
媒介される。
乳児の先天性形成不良性貧血は、別にダイアモンド・ブラックファン貧血とし
て知られているが、エリスロイド前駆細胞がエリスロポエチンに非感受性である
ことの結果であると信じられている。乳児の一過性の赤芽球減少症（ＴＥＣ）は
、それが胎児の赤血球造血を欠きそして一過性であることにおいて、ダイアモン
ド・ブラックファン貧血と異なっている。
全赤芽球癆は、供血者と受血者との間の主要なＡＢＯ不適合より生じうる。
赤血球造血は、赤血球の増殖及び分化をいう。出生前の発達の間に、赤血球造
血は、卵黄嚢、肝臓及び骨髄において順次行なわれる。最初に、これらの部位は
、卵黄嚢から移動してくる原始的な細胞をまかれる。中胚葉相（赤血球造血が卵
黄嚢中において起こっているときである）は、卵黄嚢の壁中における、血液島と
呼ばれる塊の形に集まった、間葉要素の分化によって特徴付けられる。原始的な
血液細胞は、これらの島の中心にあり、原始的な赤芽球へと分化す
る。肝臓相（赤血球造血が肝臓において起こっているときである）は、赤芽球の
巨赤芽球及び次いで、成人赤血球より僅かに大きい脱核細胞を含む正赤芽球への
分化によって特徴づけられる。骨髄相は、赤血球造血が骨髄で起こっている期間
に対応する。該分化した細胞は主として正赤芽球である。
出生後、前正赤芽球が、骨髄中に認識し得る最初のエリスロイド細胞である。
多能性幹細胞は、他に分化できない前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）へ、そしてＢＦＵ−
Ｅコロニー（ＣＦＵ−Ｅ）へと分化し、それが今度は、赤芽球へと分化する。Ｂ
ＦＵ−Ｅは、通常個数は少ないが、大きな増殖能力を有している。ＣＦＵ−Ｅは
、他方、より分化しており、従って、限られた増殖能力しか有しない。ここに、
術語「エリスロイド前駆細胞」は、ＢＦＵ−Ｅをいう。
エリスロイドの分化は、主としてエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の作用によって
刺激される。Ｅｐｏは、約40,000ダルトンの分子量を有する糖タンパク質である
。少量のＥｐｏは肝臓によって及びマクロファージによって産生されるが、Ｅｐ
ｏの主たる源は、腎臓である。Ｅｐｏは、主としてＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅに
対して作用する。エリスロイド前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）はまた、ＩＬ−３及びＧ
Ｍ−ＣＳＦにも応答する。加えて、これらの細胞は、アクセサリー細胞の間接的
な作用を介して又は他の必須の増殖因子との共力作用を介して、ＩＬ−４、Ｇ−
ＣＳＦ、及びＩＬ−１に応答し得る。正常骨髄吸引物又は血液中の％ＢＦＵ−Ｅ
についての文献の報告は、コロニー形成細胞集団の13.6％乃至55.4％にわたって
おり、後者は、血液又は骨髄の白血球画分の0.01〜0.1％未満を構成する。（Pie
relli，L.，et al.，1991 Bone Marrow Transplantation 7:33
5-361；Ciavarella，E．1991 Biotechnology of Blood（Goldstein，J．ed），B
oston:Butterworth-Heinemann，317-349；Arno1d，R．et al.，1986 Exp Hemato l
14:271-277；Sieff，C.，et al.，1982 Blood 60:703；Naughton，B.A.，et a
l.，1991 J Biomech Engineer-ing 113:171-177；Hows，J.M.，et al.，1992 La ncet
340:73-76；Ash，R.C.，et al.，1981 58:309-316；Leary，A.G.，et al.
，1992 PNAS 89:4013-40017）．
前赤芽球は骨髄細胞の0.2〜1.4％、平均0.6％を構成し、対して好塩基性赤芽
球は0.7〜3.7％、平均2.0％を構成すると一般に信じられている。12.2〜24.2％
の範囲、平均12.4％が、多染性赤芽球を特徴づける。正染性赤芽球は、2.0〜22.
7％の範囲にわたり、平均6.5％を有する。（B1ood：Textbook of Hematology，J
ames H．Jandl，ed．Little Brown and Co.，Boston，1987の27頁の表１−１を
参照）
形態学的には、エリスロイド系列のうち最初に認めうる細胞は、前正赤芽球で
ある。これら前正赤芽球は、２世代で好塩基性正赤芽球を、第３の世代で初期多
染性正赤芽球を、そして第４の世代で後期多染性正赤芽球を生み出す。前正赤芽
球と初期多染性正赤芽球との間の細胞は、増殖性であるが、これに対し、後期多
染性正赤芽球はそうではない。後期多染性正赤芽球は、核の押出しと骨髄のシヌ
ソイドバリアを横切った後、網赤血球へと分化する。前正赤芽球、正赤芽球、及
び網赤血球は、「前駆細胞」と呼ばれよう。網赤血球は更に、成熟赤血球へと分
化する。この成熟は、トランスフェリン受容体と網状質の喪失を伴う。加えて、
芽球から成熟赤血球へのこの漸進的分化には、細胞サイズの漸進的減少が伴って
いる。
エリスロイド細胞の分化及び成熟のこれらのステップはまた、核及び細胞質双
方の成分の生化学的変化を反映している。エリスロイドの発達の発達順序は、漸
進的な染色質濃縮、核小体数の減少、リボソーム及びミトコンドリア数の減少、
細胞質の電子密度の漸進的増大（これはヘモグロビンの蓄積に対応する）、及び
細胞質中における、細胞質膜結合粒子の凝集体としてのフェリチンの増加によっ
て特徴づけることができる。（例えば、Loken et al.，Blood 69（1）:255-263
（Jan．1987））の図８を参照）
この漸進的な形態学的分化の間に、これらの細胞の表面抗原の変化、すなわち
、タンパク質、糖タンパク質、糖脂質、及びリポタンパク質の変化が観察できる
。これらの表面抗原の有無が、これらの細胞を他の細胞から識別するために使用
できる。例えば、多能性幹細胞及び初期造血前駆細胞は、両方ともＣＤ34抗原を
発現する。「ＣＤ34」（または「クラスター命名−34」）の命名は、国際ワーク
ショップにおいて行なわれたこの糖タンパク質に対する抗体の分析によって規定
される特定の細胞表面糖タンパク質34を有する細胞を識別するために使用される
。ＢＦＵ−Ｅは、ＣＤ34＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、トランスフェリン受容体＋、及び
ＣＤ38＋である。ＣＦＵ−Ｅはトランスフェリン受容体及びＣＤ38について陽性
のままであるが、ＣＦＵ−Ｅは、ＨＬＡ−ＤＲについては陰性である。ＣＦＵ−
Ｅを超えて分化が進行するにつれて、トランスフェリン受容体及びＣＤ38の発現
と同様、ＨＬＡ−ＡＢＣの細胞表面発現が減少する。しかしながら、芽球から赤
芽球へ、好塩基性正赤芽球へ、多染性正赤芽球へ、正染性正赤芽球へ、網赤血球
へと前駆細胞が漸進的に分化するにつれて、前駆細胞は、徐々にトランスフェリ
ン受容体の発
現を減らす。
グリコフォリン（glycophorin）の発現は、芽球から赤芽球への移行のあたり
に始まり、赤血球の成熟まで続く。Band３細胞表面抗原の漸進的発現は、グリコ
フォリンのそれと類似している。（例えば、Sieff et al.，Blood 60(3)：703-7
13（Sept．1982）の図２を参照）類似の変化は、細胞表面炭水化物残基について
も観察される。
細胞表面抗原におけるこれらの変化は、異なった発達段階にある細胞を分離す
るために利用することができる。例えは、細胞表面抗原に対して、細胞表面炭水
化物部分に対してさえも（炭水化物は抗体を産生させるのに用いるのが一層困難
ではあるが）抗体を産生できる。細胞表面成分を認識する抗体は、免疫原として
膜又はその精製した成分を用いる慣用の技法によって調製できる。抗体は、ポリ
クローナルでもモノクローナルでもよい。無傷の抗体でもその特異的結合フラグ
メントでも、多価（二価のような）でも一価でも、使用できる。抗体又はそのフ
ラグメントは、例えば免疫蛍光法におけるプローブとして使用できる。抗体は、
蛍光色素で標識されて細胞懸濁液に適用される。もしも細胞懸濁液が複数の細胞
タイプ集団の混合物よりなるならば２つの細胞表面抗原を同時に検出するために
、蛍光色素標識された抗体を組み合わせて使用してもよい。例えば、１つの細胞
表面抗原に対して特異的な１つの抗体を蛍光色素であるフルオレッセインで標識
する一方、他の細胞表面抗原に対して特異的である他の抗体を、ローダミン又は
フィコエリスリンのような別個のスペクトル特性を有する蛍光色素で標識するこ
とができよう。
２つ又はより多くの蛍光色素で標識した抗体で標識したそのような細胞懸濁液
は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって複数の細胞タイプ集団へと仕
分けすることができる。ＦＡＣＳは、細胞を分離又は仕分けするために、一層洗
練された検出レベルの間に、複数の光散乱検出チャンネル及びインピーダンスチ
ャンネルを採用している。
代わりとして、抗体をビオチンと接合させることができ、次いで、支持体に結
合させたアビジン又はストレプトアビジンによってこれを分離することができる
。
植物レクチン及びアグルチニンの利用も行なわれてきた。植物レクチンは、細
胞表面の炭水化物部分を認識して結合するが、その結合した残基に対して如何な
る酵素作用も行なわない。レクチン標識した細胞を仕分けするためにＦＡＣＳを
用いて、正常のＧＭ−ＣＦＵが、成体及び胎仔マウスから濃厚化されている（Ni
cola et al.，Journal of Celluar Physiology，103:217-237（1980））。細胞
の選択的膠着によるか又はＦＩＴＣ誘導体の結合後の細胞仕分けによるレクチン
に調査において、レクチンであるアメリカやまごぼうマイトジェン、大豆アグル
チニン、Helix pomatiaアグルチニン、及び落花生アグルチニンが、ミエロイド
ＣＦＵと優先的に反応したと判定された。
一連のフルオレッセイン接合レクチンもまた、ヒト末梢血球に対する結合につ
いて、蛍光活性化セルソーターを用いて分析された（Nicola et al.，Blood Cel
ls 6：563-579（1980）））。調査した殆どのレクチンは、赤血球、リンパ球、
単球及び次いで好中球の順に、細胞結合の増大を示した。Lotus tetragonolobus
レクチンは、末梢
血中の好中球にのみ結合するように見えた。ヒト骨髄細胞に対するこの特定のレ
クチンの結合の分析は、結合度合が、顆粒球系列内の漸進的分化と共に増大する
ということを示した。末梢血中の単球及び無核の赤血球とは対照的に、髄内の単
球及び有核エリスロイド細胞はこのレクチンに結合した。
ヒト末梢血の別の研究において、Lotus tetragonolobusレクチンは、顆粒球に
結合したがリンパ球、赤血球及び単球には結合しなかった。この結合は糖である
α−Ｌ−フコースによって競合的に阻害された。（Morstyn et al.，Blood 56(5
)：798-805（1980））。骨髄細胞は、リンパ球、芽球、前骨髄球及び骨髄球、単
球及び多形核球の順にレクチンへの結合が増大した。
集団中のエリスロイド前駆細胞の数を、モノクローナル抗体による成熟造血細
胞の枯渇及びトランスフェリン受容体を識別するネズミのモノクローナル抗体に
よるＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅの正の選択をすることによって、増加させた（He
rrmann et al.，Blut 56：179-183）（1988））。
異なったアプローチを用いて、密度遠心、ヒツジ赤血球ロゼット、表面イムノ
グロブリン陽性細胞枯渇、プラスチックへの接着、及びモノクローナル抗体によ
る負の選別によって、集団中のＢＦＵ−Ｅの数を増加させた。ＢＦＵ−Ｅを培養
してin vitroでＣＦＵ−Ｅを生み出させた（Sawada et al.，The Journal of Cl
inical Investigation 80：357-366 1987；Sawada et al.，Journal of Celluar
Physiology 142：219-230 1990）。
LansdorpとDragowskaは、ＣＤ34＋ＣＤ45ＲＡ10ＣＤ71＋フェノタイブを有す
る細胞を精製し、培養14日後におけるトランスフェリ
ンの発現を報告しており、これは、このフェノタイプがエリスロイド前駆細胞に
典型的であるということを示唆している（Lansdorp，P.M.，et al 1992 J．Exp Med
175:1501-1509）。
代わりとして、膜の脂質二重層に対する親和性を有する分子を使用した。その
ような分子としては、メリチン及びプロタミンの膜結合部分が含まれる。
脂質二重層中のリン酸に結合する能力のある他の非常に基本的なペプチドも、
有効であろう。分解を防止するために変性されたマラリアペプチドのようなペプ
チド及び赤血球膜に対して親和性を有することの知られているタンパク質もまた
使用できる。
エリスロイド前駆細胞の濃厚化させた集団を高度に純粋な状態で単離する単純
化された方法に対する需要が依然としてある。エリスロイド前駆細胞は、該細胞
の臨床適用における利用性を制限することになる毒素その他の汚染物を含まない
ものでなければならない。
図面の簡単な記述
図１は、ヒトエリスロイド前駆細胞を濃厚化させた細胞集団を調製するための
本発明の方法の概念的描写である。
図２は、選択された細胞のメチルセルロース培養中の14日後において形成され
た造血コロニーを採点するための形態学的基準を示す。
図３は、ＣＤ13及びＣＤ71による標識と比較して、ＣＤ34及びＵｌｅｘで標識
した細胞のＦＡＣＳ仕分けの散乱プロット結果を示す。
図４は、メチルセルロース培養中の14日後におけるＣＤ34＋ＵＬ
ＥＸ＋細胞から形成されたコロニーの数を描く。
本発明の要約
本発明は、造血細胞からエリスロイド前駆細胞について濃厚化された細胞集団
を調製する方法を提供する。該方法は、ＣＤ34のような特異的な細胞表面抗原に
対する結合に基づいて造血前駆細胞を分離することと、次いでUlex europaeusア
グルチニンのようなレクチンに対する結合に基づいてエリスロイド前駆細胞を分
離することを伴う。コロニー形成ユニットのうちの少なくとも約60％、より好ま
しくは80〜100％がＢＦＵ−Ｅである、エリスロイド前駆細胞について濃厚化し
た細胞集団もまた提供される。
本発明はまた、エリスロイド障害を有するヒト患者のための、ヒトのエリスロ
イド前駆細胞について濃厚化した集団の投与による治療方法をも提供する。該濃
厚化した細胞集団に基づく診断方法もまた提供される。
好ましい具体例の詳細な記述
本発明は、ヒトのエリスロイド前駆細胞の濃厚化された集団及びこれを得るた
めの方法を提供する。臍帯血、卵黄嚢、及び肝臓を用いることもできるが、好ま
しくは、ヒトのエリスロイド前駆細胞の該濃厚化された集団のための元々の源は
、骨髄又は末梢血液である。
ヒトのエリスロイド前駆細胞の如何なる源も研究適用において使用できるが、
骨髄、特に、異系同種骨髄に対するものとしての自家骨髄、及び末梢血球が、エ
リスロイド系列を害する疾患に罹っているヒト患者の治療のためのヒトのエリス
ロイド前駆細胞の好ましい源である。そのような疾患は、疾患、薬物、毒素又は
放射線によっ
て誘発されたものであり得、又は遺伝的な貧血又は赤血球癆によるものであり得
る。
骨髄細胞は、腸骨稜、脛骨、大腿骨、胸骨、又は他の骨の空洞のような骨髄の
源から得ることができる。骨髄は、骨から吸引され、当業者に周知の技術に従っ
て処理される。髄は、異系同種移植の場合には提供者から、また自家移植の場合
には患者本人から、収穫することができる。骨髄の吸引物は、ヘモグロビン含有
赤血球を区別して捨てるために処理され、白血球の出発集団を残す。ここに、「
白血球」とは、ヘモグロビンを含まない造血細胞の如何なるものをもいう。
代わりとして、末梢血を、造血細胞の元々の源として役立たせることができる
。本発明の方法を開始する前に白血球画分（白血球）からヘモグロビン含有赤血
球画分（赤血球）を分離することは、絶対に必要という訳ではない。ここに、術
語「造血細胞の集団」とは、幹細胞及び前駆細胞を含む血液形成系列の細胞の如
何なる集団をもいい、それはあらゆる種類の成熟血球を含んでよい。無核細胞の
排除は必要ではないが、造血細胞の出発集団が有核細胞を含むことが必須である
。ここに、術語「有核細胞」とは、成熟赤血球（これは無核である）を除く全て
の造血細胞をいう。
「アフェレーシス」として知られた処理において、白血球は遠心分画によって
患者の血液から分離される。代わりとして、患者の血液は、固相に連結させた、
望みの細胞タイプに結合するリガンドを含んだ装置内に通されてよい。このよう
な方法の利点は、それらが、極度に稀な末梢血幹細胞及び前駆細胞が大量の血液
から分離されることを許容し、骨髄を収穫する提供者の出費及び苦痛及び関連し
た麻酔、鎮痛、輸血、及び感染の危険を免れされることである。末梢血中に存在
する幹細胞の数は、骨髄から幹細胞を血液へと「動員する」サイトカインによる
患者の前処置によって増加させることができ、こうして望みの幹細胞の収量を大
きく増加させることができる。
本発明の一般的原理は、造血細胞の如何なる源にも当てはまる。造血前駆細胞
は、それらがＣＤ34、ＣＤ71、ＣＤ45ＲＯ又はｃ−ｋｉｔ受容体のような特異的
な細胞表面抗原を有することに基づいて一般的造血集団から分離される。これら
の抗原は、Ｂ−リンパ球の前駆細胞及びミエロイド系列上、並びにＢＦＵ−Ｅ上
にも存在するが成熟血球上には存在しないと信じられている。従って、術語「造
血前駆細胞」とは、全ての造血系列の前駆細胞を含むが本質的に成熟血球を含ま
ない細胞集団をいう。
造血前駆細胞を選択するためには、好ましくは、ＣＤ34に対するモノクローナ
ル抗体が用いられる。望むならば、ミエロイド及びリンパ系列に沿った分化しか
しない細胞を、それらがそれらの系列に特異的な表面マーカーを有することに基
づいて除去してよい。しかしながら、系列の特定化された何れかの又はあらゆる
望ましくないクラスの細胞をエリスロイド前駆細胞について濃厚化した最終的集
団から除去する事は必要ではないということを、当業者は認識するであろう。
自然の血球から造血前駆細胞を分離するための種々の技術を用いることができ
る。比較的粗い分離、すなわち存在する全細胞の20％まで、通常５％以下、一般
に１％以下が正の選択マーカー例えばＣＤ34を有する分離のためには、効果を異
にする種々の技術を採用す
ることができる。用いる該分離技術は、収集すべき細胞の該画分の生存性を最大
限に維持する必要がある。採用される具体的技術は、勿論、分離の効率、方法の
毒性、分離の容易さと迅速性、及びどの装置及び／又は技術的熟練が必要か、に
依存するであろう。
分離技術は、抗体被覆磁性ビーズを用いた磁性分離、アフィニティークロマト
グラフィー、モノクローナル抗体に結合させた又は補体と接合させて用いる細胞
毒剤、及び固体マトリックスに取り付けたモノクローナル抗体を用いる「選別」
、又はその他の簡便な技術を含む。磁性ビーズその他の、アガロースビーズ又は
アクリルアミドビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜又はプラスチックのペ
トリ皿のようなマトリックスに取り付けた抗体が、直接の分離を許容する。抗体
に結合された細胞は、該固体支持体を細胞懸濁液から簡単に物理的に分離するこ
とによって、細胞懸濁液から除去することができる。細胞を、固相に連結させた
抗体とインキュベートする正確な条件及び長さは、採用した系に特異的な数種の
要因に依存するであろう。適切な条件の選択は、しかし、当該分野の熟練の範囲
内である。
次いで、ＣＤ34＋細胞が固相に結合した抗体に結合するのを許容するに十分の
時間をおいた後、未結合の細胞を生理学的緩衝液で溶出又は洗浄除去することが
できる。結合した細胞は、次いで、該固相及び用いた抗体の性質に主に依存する
如何なる適当な方法によっても該固相から分離される。
細胞分離を可能にするには、抗体をビオチンと接合させてもよく（それを次い
で支持体に結合させたアビジン又はストレプトアビジンで除去することができる
）、又は蛍光色素と接合させてもよい（
それを蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）と共に用いることができる）。望み
の細胞の生存性に有害でない限り、如何なる技術を用いてもよい。
前駆細胞は、ＣＤ34の細胞表面発現によって他の細胞から最初に分離できる。
例えば、ＣＤ34＋細胞は、磁性ビーズ分離によって正の選択を受けるが、ここに
磁性ビーズは、ＣＤ34反応性モノクローナル抗体で被覆されている。ＣＤ34＋細
胞は、次いで、磁性ビーズから除去することができる。ＣＤ34＋細胞の遊離は、
望むならば例
Jose，カリフォルニア州）によってチェックできる。ＣＤ34＋細胞の選択は、続
くレクチン選択のための出発液量を最小にするために、及び生きている又は死ん
だ若しくは死につつある欲しないアクセサリー細胞（それらは、続く選択細胞の
培養中における増殖及び分化に影響する因子を産生し得る）を除去しつつ前駆細
胞集団を濃厚化させるために、望ましい。しかしながら、濃厚化させた細胞のＣ
Ｄ34＋集団は、必ずしも純粋である必要はない。
得られた濃厚化させたＣＤ34＋細胞の集団を、次いで、ＣＤ34選択のために、
本質的に上に記述したようにしてレクチンと接触させる。Debray，等は、12種の
レクチンの赤血球膠着性を記述した（Lebray，V.，et al.，1981 Eur J Biochem
117:41-55）。その後、Craig等が、造血細胞に対する種々のレクチンの結合を
報告した（Craig，W.H.，1992 J Hematother 1:55-64）。Craig等（上記）の第5
7頁の表２は、種々のレクチンがリンパ球、単球、及び／又は顆粒球に、弱い又
は強い親和性を以て結合すると予期される、ということを示している。予想外に
も、レクチンに対する結合がエリスロイ
ド前駆細胞を選択することができる、ということが見出された（本出願の図４及
び表１を参照）。
選ばれるレクチンは、無毒であるか又は最終細胞集団から完全に除去できるも
のでなければならない。本発明の実施に際して、植物U1ex europaeusに由来する
フコース結合レクチンであるUlex europaeusアグルチニンを用いるのが好ましい
（Debray，et al.，上記）。Ｕｌｅｘによって認識される特別の炭水化物残基で
ある過剰のフコースの添加によって、細胞をこのレクチンから拮抗的に遊離させ
ることができる。
本発明の代わりの一具体例においては、ＣＤ34及びＵlｅｘを標識してよく、
そしてエリスロイド前駆細胞の単離を以下の実施例２に記述したようにフローサ
イトメトリーによって実施してよい。磁性ビーズのような固体支持体とフローサ
イトメトリーとの組み合わせも、何れの順序においても、用いてよい。
最初にレクチンに結合する細胞を分離し、続いてＣＤ34＋選択を行なうことに
より、選択の順序を逆にすることも可能である。
これら抗体及びレクチンリガンドは、治療的使用の前に除去される。本発明は
、これまでの方法に対して多くの利点を提供する。これまでのアプローチは、細
胞表面上の主としてタンパク質抗原を同定するためにモノクローナル抗体を用い
ていた。細胞表面上の炭水化物構造は、弱い抗原性があるに過ぎず、そのため炭
水化物抗原に対して高度に特異的なモノクローナル抗体、特に高親和性のＩｇＧ
抗体を作ることは困難である。植物レクチンの使用は、細胞表面上の特異的な炭
水化物構造が、効率的に且つ当該前駆細胞に対する毒性なしに、高親和性をもっ
て同定されることを許容する。幾つかの
アプローチは、エリスロイド前駆細胞を濃厚化するのに負の選択又は非特異的方
法を用いてきた。しかしながら、これらの方法は、非効率的且つ潜在的に有毒で
ある。更には、植物レクチンは、検出を許容し又は固体表面に架橋させることの
できる蛍光性分子その他のプローブで容易に標識できる。植物レクチンによって
選択された細胞は、今度は、該レクチンから精製することができる。レクチンに
よって認識される特定の糖が、レクチンから該結合細胞を遊離させるのに用いる
ことができるためである。本発明の好ましい一具体例においては、レクチンはUl
ex europaeusアグルチニンであり、それは細胞表面糖タンパク質上のフコース部
分に結合する。このレクチンヘ結合させることによって一旦エリスロイド前駆細
胞が選択されれば、該レクチンをフコースの過剰を用いて細胞を競合的に切り離
すことができる。
代わりとして、フコースに対する結合を求めて直接レクチンと競合する他の物
質を、溶出剤として用いてもよい。そのような物質としては、レクチン上のフコ
ース結合部位への結合を求めて成功裏に競合することを許容する配向のフコース
部分を有する、オリゴ糖類及び糖タンパク質が含まれる。そのような競合するオ
リゴ糖類の例はは、糖ペプチドIII、糖ペプチドＩ、及びフコシド１（Debray，e
t al 1981 Eur J Biochem 117：41-55,図６及び表６を参照）である。代わりと
して、精製された又は組換えにより合成された血液グループ抗原Ｏ（Ｈ）を、Ul
exレクチンと競合させてエリスロイド前駆細胞上のフコース結合部位から切り離
すために用いることができる（Sharon，et al.，1991 Cytometry 12:545-549）
。
我々は今や、本発明の方法の成功の評価を始める。治療及び診断
において使用するためには、上記に従って単離された集団中におけるエリスロイ
ド前駆細胞についての濃厚化の程度を確認することが望ましい。また、患者のエ
リスロイド前駆細胞が正常か又は異常かを確認すること及び患者組織内における
それらのパーセントを推定することも望ましい。濃厚化させた集団中のＢＦＵ−
Ｅの数及び質を評価するためには、ＢＦＵ−Ｅが増殖して認識可能なコロニーを
形成するための時間を許容するために、単離された細胞集団を数日間培養するこ
とが必要である。
好ましくは、エリスロイド前駆細胞について濃厚化させた単離された細胞集団
の部分量を、メチルセルロース中で培養し、in vitroにて14日間、細胞が増殖及
び分化することを許容する。メチルセルロース培養における14日後、顕微鏡検査
を用いてコロニーを数え採点する（図３を参照）。このアッセイを実施するにお
いて、元々単離された集団中に存在したコロニー形成細胞の総数が、14日間のメ
チルセルロース培養中に存在する全てのタイプのコロニーの数に従って評価され
る。ここに、「コロニー」は、物理的に接近していること及び形態学的関係のた
めに共通の一個の親細胞を有すると仮定される50個の細胞より大きいクラスター
と定義される。各コロニーは、ミエロイド（ＣＦＵ−ＧＭコロニー）、エリスロ
イド（ＢＦＵ−Ｅコロニー、ＣＦＵ−Ｅとしても当該分野において知られている
）、又は混合（ＣＦＵ−ｍｉｘコロニー）として形態学的に同定される（図２）
。ここに、術語「ＢＦＵ−Ｅコロニー」とは、図２に描かれているような、ヘモ
グロビンを含むに至ったエリスロイド細胞の多中心のバーストをいう。ここに、
「ＢＦＵ−Ｅコロニーのパーセント」は、全てのタイプの総コロニー数で除した
ＢＦＵ−Ｅコ
ロニー数として計算される。ＢＦＵ−Ｅコロニーのパーセントは、次いで、本発
明の方法によって得られた濃厚化させた集団中に14日前に存在した親ＢＦＵ−Ｅ
のパーセントを推定するために使用される。
本発明の方法は、コロニー形成細胞のうち好ましくは60％を超える、より好ま
しくは80％を超える、最も好ましくは本質的に全てがＢＦＵ−Ｅである濃厚化さ
せた細胞集団を生み出す。当業者には、コロニー無形成細胞の存在は、本発明に
とっては重要でないことが理解されよう。
得られた濃厚化させたエリスロイド前駆細胞集団は、治療及び／又は診断目的
に直ちに使用できる。代わりとして、これらの細胞を、液体培地中で培養して増
殖及び一層分化したエリスロイド前駆細胞又は成熟赤血球へと分化させてもよい
。好ましくは、培養プレートにおいて使用される培地は、十分定義された栄養補
強されたものである。適した培地の一例は、McCoyの５Ａ培養培地（Sigma，St．
Louis，ミズリー州）であり、これは胎仔牛血清（Hyclonek，Logan,ユタ州）、
ウマ血清（Hyclone）、ヒドロコルチゾン（Sigma）、α−チオグリセロール、及
びゲンタマイシン（Gibco）を追加的に含む。代わりとして、培地は、血清不含
でもよい。培養培地は、エリスロポエチン、ＩＬ３、及び幹細胞因子のような造
血増殖因子を更に含んでよい。当業者は、種々の組み合わせにおける他の適切な
造血増殖因子並びに他の適切な培養培地を用いてもよいことを認識するであろう
。
培養物に１週間隔で補給する必要があるが、培養期間中は培養培地を取り替え
ないことか好ましい。場合によっては、培養培地を時
々、少なくとも週１乃至２回交換することが望ましいかも知れない。代わりとし
て、培地及び増殖因子の連続注入を用いることもできよう （Koller，M.R.，19
93 Bio/Technology 11:358-363）。
培養期間中の選ばれた日に、細胞表面抗原の発現に基づくフローサイトメータ
ー中における仕分けのために、細胞の部分量を除去して蛍光接合モノクローナル
抗体で標識することができる。細胞表面抗原に従って仕分けされた細胞は、形態
学及びコロニー形成ユニットのための能力に従って、更に特徴づけられる。細胞
は、形態学により、前正赤芽球、正赤芽球、網赤血球、及び赤血球として特徴づ
けることができる。コロニーアッセイは、ＢＦＵ−Ｅ及びＢＦＵ−Ｅコロニーの
存在を判定するために、他の培地成分及び増殖因子を含有するメチルセルロース
中において行なうことができる。
エリスロイド前駆細胞は、単独で又は幹細胞その他の、米国特許第4,965,204
号、5,035,994号、5,130,144号の方法に従って調製される系列の特定化していな
い細胞のような他の細胞タイプと組み合わせて患者に投与することができる。エ
リスロイド前駆細胞は、一層分化したエリスロイド前駆細胞又は成熟赤血球と共
に投与してもよい。一層分化したエリスロイド前駆細胞射及び成熟赤血球は、骨
髄、臍帯血、又は末梢血より単離でき、エリスロイド前駆細胞からin vitroで誘
導できる。精密な、効果的な量は、当業者によって容易に決定でき、そして勿論
、用いられる特定の療法によって治療されつつある正にその状態に依存するであ
ろう。
エリスロイド前駆細胞は、エリスロイド前駆細胞及び／又は成熟赤血球のレベ
ルの低下しているヒト患者を治療するのに使用することができる。そのような細
胞集団は、正常な健康範囲内に細胞集団
数を持ってくるために、患者において存在している低下したエリスロイド細胞集
団を補強するために使用できよう。発表されている報告についての調査が、平均
70ｋｇの成人についての毎日の循環赤血球要求が２×1011個の赤血球であること
を示している（Ers1ev，A.J．1990 Hematology，ed：Williams，W.J．McGraw-Hi
ll，New York，p．389）。典型的なＢＦＵ−Ｅがin vivoにおいて10回分裂する
と仮定すると、一個のＢＦＵ−Ｅは、103個の成熟赤血球を生み出すであろう。
従って、２×108個のＢＦＵ−Ｅが、赤血球の１日供給量のために必要であろう
。本発明の実施に当たって、107個を超えるＢＦＵ−Ｅを単一の患者の白血球ア
フェレーシス製品から得ることが可能である。ＢＦＵ−Ｅのin vitro二倍化時間
は、18〜24時間であると推定される。ＢＦＵ−Ｅのin vitro展開を許容すること
によって、従って、数日の赤血球供給量の要求に見合うことのできる細胞調製物
を得ることが可能である。
エリスロイド前駆細胞は、培養において増殖且つ分化する能力を共に有し、そ
して長期間生存力を維持することができる。従って、エリスロイド前駆細胞のin
vitro培養から最初の量の細胞を単離すること及びその細胞量を患者へ投与する
ことが可能であろう。一定期間の後、該培養物から生存力のあるエリスロイド前
駆細胞及び／又は成熟赤血球の１つ又はより多くの追加の部分量を単離して同じ
患者へ投与することができる。
疾患、薬物、毒素又は放射線の何れによって誘導されたものであれ遺伝的若し
くは先天的欠損によるものであれ、赤血球癆又は貧血の治療にもエリスロイド前
駆細胞は用途を見出すであろう。異系同種療法が、再生不良性貧血のような疾患
において有用であり、精製
されたエリスロイド前駆細胞集団は、移植片体宿主反応による疾患（ＧＶＨＤ）
に関連する問題を除去することができる。
エリスロイド前駆細胞は、病理学的状態の貧血又は多血症におけるエリスロイ
ド前駆細胞の診断評価において、又は移植のための幹細胞収穫の評価のために、
有用性を有すると期待される。該方法はまた、in vitro培養目的のために、エリ
スロイド前駆細胞又は悪性赤血球前駆細胞のうちＣＤ34＋細胞を枯渇させるため
にも使用でき、それは多血症のような疾患の治療において有用であろう。
本発明はまた、増殖及び分化に関してのような、エリスロイド系列の細胞の研
究においても利用性を有すると期待される。例えば、造血増殖因子、のような増
殖及び分化に関連した因子を評価できる。加えて、サイトカインの組み合わせ及
び細胞外条件を評価できる。同様に、細胞自身を、細胞増殖及び／又は分化活性
その他について特定の培地及び液体を評価するために使用できる。
エリスロイド前駆細胞は、液体窒素中に長期間の貯蔵のため凍結できよう。細
胞を、次いで必要なときに解凍して使用できる。冷凍保護剤及び最適な冷却速度
が、細胞の損傷を防護することができる。溶質の添加による冷凍は、細胞内へ浸
透し、それによって、細胞質膜を損傷し且つ細胞内における浸透圧的な脱水をも
たらす氷形成の量を減らすことによるか、又は外部の氷の蒸気圧の低下に応答し
た細胞からの水の流出の速度を遅らせることによって起こる、と信じられている
。
使用できる冷凍保護剤としては、ＤＭＳＯ、メタスターチ（metastarch）、グ
リセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デ
キストラン、ショ糖、エチレングリコー
ル、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトー
ル、ｉ−イノシトール、Ｄ−乳糖、塩酸コリン、アミノ酸、メタノール、アセタ
ミド、モノ酢酸グリセロール、及び無機塩が含まれるかそれらに限定はされない
。
典型的には、細胞は10％ＤＭＳＯ、50％ＦＢＳ、及び40％ＲＰＭＩ 16140培地
中に貯蔵してよい。一旦解凍すると、細胞は、適当な造血増殖因子の導入によっ
て、増殖及び更に分化するよう誘導される。
代わりとして、エリスロイド前駆細胞は、適当な増殖因子の提供によって、直
接に増殖しそして成熟赤血球へと分化することが許容される。
以下の実施例は、本発明を更に説明する働きをするが、本発明の範囲を限定す
ることを意図したものではない。
実施例１
この実施例は、白血球の増殖を記述する。
サイトカインによる前処置によってＣＤ34＋を動員させた患者からヒト末梢血
を得た。正常成人ボランティアから骨髄を得た。細胞懸濁液をHistopaque 1O77
（Sigma，St．Louis、ミズリー州）上へ層状に加え、300×ｇで20分間遠心した
。境界面を除去し、0.1％のアジ化ナトリウム及び0.5％の牛血清アルブミンを含
有するリン酸緩衝食塩溶液（ＰＡＢ）で洗浄た。全ての手順を、融解しつつある
氷上にて０℃にて行なった。
実施例２
この実施例は、標識したＣＤ34抗体及びUlex europaeusＩレクチンを用いた、
エリスロイド前駆細胞の単離を記述する。
ビオチン化し且つＦＩＴＣ接合させた抗ＣＤ34抗体〔８Ｇ12（Baxter Interna
tional Div.，Irvine,カリフォルニア州）又はＱＢＥＮＤ10（Quantum Biosyste
ms，イングランド）〕を、フローサイメトリーによってＣＤ34＋細胞を単離する
ために使用した。ＣＤ34＋細胞を次いで、エリスロイド前駆細胞の集団を同定す
るために、フィコエリスリン接合させたUlex europaeusＩレクチンによって染色
した。いくつかの細胞調製物はまた、ビオチン−ＱＢＥＮＤ10及びフィコエリス
リン−ＵＬＥＸの組合わせにおいて、ＦＩＴＣ接合させたＣＤ13抗体（ＭＹ７）
又はＣＤ71抗体（ＨＴＲ）で染色した。ビオチンＱＢＥＮ10は、アロフィコサイ
アニン−アビジンで逆染色した。
使用したフローサイトメーターは、Becton Dickinson２レーザーFACStar Plus
及びFACScanを含んだ。フローサイトメトリーは、本質的に、Bender等（B1ood 7
7:2591-2596，1991）によって記述されたようにして行なった。要するに、FITC
及びフィコエリスリンに帰すことのできる蛍光を、488ｎｍで作動する0.3Ｗに調
節したアルゴンレーザーによる励起を用いて測定した。530±15nｍ及び575±15
ｎｍという短い帯域フィルターをそれぞれ用いて、フルオレッセイン及びフィコ
エリスリンからの放射を測定した。補償レベルは、前方対側方散乱によって同定
される該リンパ球集団に対してゲーティング（gating）しそして各々の色につい
て単染色の陽性集団の中間チャンネルを対応する無染色対照と整列させることに
よって設定した。補償レベルは、典型的には、ＦＩＴＣから１％フィコエリスリ
ン減算位置に、及びフィコエリスリンから16％ＦＩＴＣ減算位置に設定した。Ｐ
ＭＴ電圧は、典型的には、ＦＩＴＣについては58
0Ｖに、そしてフィコエリスリンについては610Ｖに設定された。最低30,000の事
象が各サンプルについて分析された。
エリスロイド前駆細胞としての細胞の同定は、下の実施例３に記述された方法
に従って、コロニー形成細胞の分布の解析によって確認した。コロニーは、図２
に示されているように、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｍｉｘ、又はＢＦＵ−Ｅとして
採点した。ＢＦＵ−Ｅコロニーはまた、ヘモグロビンの形成によるそれらの赤色
によっても同定された。Ｕlｅｘで染色するＣＤ34＋細胞はまた、ＣＤ13−及び
ＣＤ71＋（図３）であり、そのことは該細胞が顆粒球／マクロファージ系列のも
のではなく、寧ろ、エリスロイド前駆細胞の特徴である高レベルのトランスフェ
リン受容体を発現していることを示している。ＣＤ34＋Ｕｌｅｘ＋ＣＤ13−細胞
は、エリスロイド前駆細胞のみを含んでいた。結果を下の表１に示す。
実施例３
この実施例は、表現型に従った細胞のコロニーアッセイへの仕分けを記述して
いる。
FACStar PlusによりAutomatic Cell Deposition Unit（ＡＣＤＵ）を用いて細
胞を仕分けした。各仕分けの前に、単一蛍光ビーズを96ウェルのプレートへと仕
分けしそしてウェルを蛍光顕微鏡で検査することによって、ＡＣＤＵを検証した
。与えられた表現型の単一種の細胞を200μｌのコロニーアッセイ培地〔これは
、IscovesのＩＭＤＭ（Sigma）、30％ＦＢＳ（Sigma）、ＢＳＡ、及び所望濃度
のｒＩＬ−３（150Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ−ＣＳＦ（200Ｕ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（15
0Ｕ／ｍｌ）、ｒＩＬ−６（160Ｕ／ｍｌ）、及びエリスロポエチン（10Ｕ／ｍｌ
；Amgen）を含んだメチルセルロースよりなり、96ウェルのマイクロタイタープ
レートの60個の中央ウェルの各々に入れられている〕へ入れた。96ウェルプレー
トの外側のウェルには、湿度を維持するために滅菌水を充填した。代わりとして
、多数の細胞を、６ウェルプレートの１ｍｌのコロニーアッセイ培地内に配置し
た。プレートを次いで37℃にてインキュベートし、「本発明の詳細な記述」に記
述されているようにして、図２に示した形態学的基準に従って14日後に採点した
。
実施例４
この実施例は、正の濃厚化によってＤ34＋細胞集団を濃厚化する代わりの方法
を記述している。
単核球が、骨髄から1.077ｇ／ｄｌのHistopaque（Sigma）上に単離された。細
胞をカルシウム／マグネシウム不含リン酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ、Gibco
，Grand Islandニューヨーク州）で洗浄
し、２％の胎仔牛血清（Hyclone，Logan、ユタ州）を含んだIscoves改良Dulbecc
o培地（ＩＭＤＭ，Sigma）中に、細胞１×107個／ｍｌの濃度に再懸濁させ、次
いで、マウスモノクローナル抗ＣＤ34抗体（Quantumt Biosysemsからの抗ＣＤ34
モノクローナル抗体ＱＢＥＮＤ10の１μｇ／106個）で標識した。次いで細胞を
、ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Dynal，Oslo,ノルウェー）で被覆された磁性ビー
ズに接触させ、細胞懸濁液からＣＤ34＋細胞を捕獲するのに用いたい。本質的に
、ＣＤ34＋細胞を、Strauss et al.，Am．J．Ped．Hematol．Oncol．13：217（1
991）に記述されているようにして、僅かな改良を施して、正の選択に付した。
磁性ビーズ及びを、ビーズ：細胞比１：１又は５：１で、４℃にて2.5ｒｐｍで3
0分間回転させた。
ＣＤ34選択に続いて、ビーズ−細胞複合体を、マグネティックチューブホルダ
ー（Fenwal Div.，Irvine,カリフォルニアナ州）を用いて単離した。ＣＭＦ−Ｐ
ＢＳ中における一連の洗浄の後、ＲＰＭＩ
Lincolnshire、イリノイ州）を加えて37℃の水浴中において15分間インキュベー
トすることによってＣＤ34＋細胞をビーズから遊離させた。
ビーズから遊離された細胞を、ＣＤ34に対するモノクローナル抗体、すなわち
ＦＩＴＣ−８Ｇ12（Fenwal）で氷上15分間染色して、
nson）で、側方散乱対蛍光発現を用いて定量することによって、ＣＤ34純度につ
いて評価した。ＣＤ34＋細胞集団は、ＦＩＴＣ蛍光及び低い側方散乱を有する集
団として分析された。
この手順に従って得られたＣＤ34＋細胞の純度のレベルは、平均66±16％（平
均±１標準偏差、ｎ＝７）であり、約40％乃至約93％のＣＤ34＋の範囲を有した
。
実施例５
この実施例は、ＣＤ34＋細胞から正の選択によってＵｌｅｘ＋細胞集団を濃厚
化する代わりの方法を記述している。
ＣＤ34＋細胞は、Ulex europaeusＩレクチンで被覆された磁性ビーズと接触で
きよう。Ulexレクチンは、細胞懸濁液から細胞表面上にフコース残基を発現して
いるＣＤ34＋細胞を捕獲するものと期待される。磁性ビーズ及び細胞を次いで４
℃にて2.5ｒｐｍで、ビーズ：細胞比１：１又は５：１で、30分間回転できよう
。
Ｕｌｅｘ選択に続いて、ビーズ−細胞複合体を、マグネティックチューブホル
ダー（Fenwal）を用いて単離できよう。ＣＭＦ−ＰＢＳ中における一連の洗浄の
後、過剰のフコースを添加することによってビーズからＣＤ34＋細胞を遊離させ
ることができよう。得られるＣＤ34＋Ｕｌｅｘ＋細胞集団は、エリスロイド前駆
細胞について濃厚化された集団を含むと期待される。
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フロントページの続き
(72)発明者 ウンヴェルザクト，クリステン，エル
アメリカ合衆国60067イリノイ、パラタイ
ン、ノースプラムグローブ 243