KR20120013351A - 면역장애 치료 방법 - Google Patents

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KR20120013351A
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앤드류 태즈먼 허친슨
다렌 로스 존스
로버트 린지 레종
프레이저 아즈바디
로잔나 던
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이뮨 시스템 세러퓨틱스 리미티드
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Abstract

본 발명은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 당뇨병, 및 다발성 경화증과 같은 B 세포 매개 면역 장애의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 형질 세포 전구체의 표면에서 발현되는 막 결합 자유 경쇄와 결합하는 항체를 이용한 B 세포 매개 면역 장애의 치료에 관한 것이다.

Description

면역장애 치료 방법{METHOD FOR TREATING IMMUNE DISORDERS}
본 발명은 자가면역 질환, 염증성 장애 및 패혈증과 같은 B 세포 매개 면역 장애의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 막 결합 자유 경쇄와 결합하는 항체를 사용한 B 세포 매개 면역 장애의 치료에 관한 것이다.
'비자기' 성분(non-self component)으로부터 '자기' 성분(self component)을 구별하는 면역 시스템의 능력은 중요한데, 이는 자기 성분이 비정상적으로 인식되면 조직이 손상되고, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 쇼그렌 증후군 및 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환이 발생하기 때문이다(Browning, 2006).
수 십년 동안 T 세포가 자가면역 질환에 있어서 중심이 되어 왔지만, 림프종 치료제로서 B 세포 고갈 항체인 리툭시맙(rituximab)의 개발은 면역 장애에서 B 세포의 역할을 조사할 수 있는 도구를 제공하였다(Browning, 2006). 리툭시맙은 강력한 B 세포-세포용해성 키메라 IgG1 CD20 특이적 단클론 항체로서, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)에 의해서 주로 B 세포를 사멸시킨다. 리툭시맙의 표적은 CD20인데, 이것은 프레 B 세포(pre-B-cell) 단계에서 프레 형질 세포(pre-plasma cell) 단계까지 발현된다(Edwards and Cambridge, 2006). 항CD20 항체의 주사 후, 말초 부분에 존재하는 항체로 코팅된 B 세포는 매우 낮은 수준까지 빠르게 고갈되고, 약 6~12개월 동안 낮은 수준으로 유지된다(Browning, 2006).
리툭시맙에 의한 B 세포 고갈 사이클의 반복은 총 면역글로불린의 감소와 관련될 수 있는데, IgG의 경우 3.5 G L-1까지, IgM의 경우 검출 불가능한 수준까지 감소되므로, 수행될 수 있는 B 세포 고갈 회수가 제한될 수 있다(Edwards and Cambridge, 2006).
B 세포 매개 면역 장애를 치료하기 위한 새로운 방법에 대한 필요성이 남아있다.
본 발명자는 막 결합 자유 경쇄(mFLC)가 형질 세포 전구체에서 발현된다는 것을 확인했다. 형질 세포 전구체 상의 mFLC는 B 세포 매개 면역 장애의 치료 또는 예방을 위한 표적을 제공한다.
본 발명자에 의해 제안된 치료법은 B 세포 매개 면역 장애를 가진 피험자에서 mFLC와 특이적으로 결합하여 형질 세포 전구체를 고갈시키는 항체의 투여에 기초한다. 이 치료 표적의 한 가지 이점은 그것이 정상 B 세포에는 존재하지 않는다는 점이다.
따라서, 본 발명은 피험자에서 B 세포 매개 면역 장애의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 막 결합 자유 경쇄(mFLC)와 결합하는 항체의 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 항체는 형질 세포 전구체, 예를 들어 형질모세포 상의 mFLC와 결합한다.
한 구체예에서, 형질모세포는 마커 CD27, CD38 및 CD45에 대해 양성이다. 한 특정 구체예에서, 형질모세포는 마커 IgD에 대해 음성이다.
다른 바람직한 구체예에서, 항체는 mFLC와 특이적으로 결합한다.
한 구체예에서, 피험자에게 투여되는 항체는 세포독성 부분 또는 생물학적 반응 변형제와 콘쥬게이션된다. 비제한적 예로서, 세포독성 부분은 세포독성 약물이나 박테리아 또는 식물 기원의 효소 활성 독소(예를 들어, 겔로닌), 또는 이러한 독소의 효소 활성 단편("A 사슬")일 수 있다. 효소 활성 독소 및 이의 단편이 바람직하며, 이는 겔로닌, 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 사슬(Pseudomonas aeruginosa로부터 유래하는), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공(Phytoiacca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(Momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀(saponaria officinalis) 저해제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신에 의해 예시된다. 또한, 세포독성 부분은 방사성 제제일 수 있다. 특히, 세포독성 부분은 방사성 핵종, 예를 들어 이트륨-90(90Y), 인듐-111(111In), 요오드-131(131I) 또는 구리-67(67Cu)일 수 있다. 바람직하게, 세포독성 부분은 독소, 화학치료제, 또는 방사성 제제이다.
본 발명에서 사용될 수 있는, mFLC와 결합하는 항체와 결합될 수 있는 생물학적 반응 변형제는, 제한되는 것은 아니지만, IL-2 및 인터페론(α, β 또는 γ)과 같은 림포카인 및 사이토카인을 포함한다. 이러한 생물학적 반응 변형제는 세포에 여러 효과를 가진다. 특히, 직접 작용에 의해서 세포 사멸이 증가되는 효과뿐만 아니라, 숙주방어 매개 과정이 증가함으로써 세포 사멸이 증가되는 효과가 있다. mFLC와 결합하는 항체와 이러한 생물학적 반응 변형제의 콘쥬게이션은 형질 세포 전구체 내에 항체를 선택적 국소화되게 하여, 비표적 세포에 독성을 미치는 비특이적 효과를 억제한다. 생물학적 반응 변형제로서는 림포카인, 사이토카인 또는 인터페론이 바람직하다.
다른 구체예에서, 세포독성 부분은 세포독성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자이다.
본 발명의 방법에서는 mFLC와 결합하는 적합한 항체가 어느 것이든 사용될 수 있지만, 한 구체예에서는 항체가 KMA 또는 LMA와 결합한다. 한 특정 구체예에서, 항체는 KMA와 결합한다.
한 구체예에서, mFLC와 결합하는 항체는 K121 유사 항체이다. 바람직하게, K121 유사 항체는 서열번호 1에 제시된 VH 영역과 서열번호 2에 제시된 VL 영역을 포함하거나, 또는 카파 골수종 항원(KMA)와의 결합에 있어서 서열번호 1에 제시된 VH 영역과 서열번호 2에 제시된 VL 영역을 가진 항체와 경쟁한다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해서 치료되는 B 세포 매개 장애는 자가면역 질환이다. 한 특정 구체예에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 당뇨병, 및 다발성 경화증으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 피험자에서 형질 세포 전구체의 성장을 저해하거나 또는 형질 세포 전구체를 사멸시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 mFLC와 결합하는 항체의 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 예로서, 형질 세포 전구체의 저해 또는 사멸은 세포자살(apoptosis)에 의해서, 또는 피험자의 면역세포에 의해서(예를 들어, 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)에 의해서), 및/또는 항체 의존성 세포성 포식작용에 의해서 행해질 수 있다.
또한, 본 발명은 세포독성 부분 또는 생물학적 변형제와 콘쥬게이션된 mFLC와 결합하는 항체를 투여함에 의한, 피험자에서 형질 세포 전구체를 저해하거나 사멸시키는 방법을 제공한다.
바람직하게, 세포독성 부분은 독소, 화학치료제, 또는 방사성 제제이다.
한 구체예에서, 세포독성 부분은 세포독성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자이다.
다른 구체예에서, 생물학적 반응 변형제는 림포카인, 사이토카인 또는 인터페론이다.
더 나아가, 본 발명은 피험자에서 형질 세포 전구체를 국소화시키기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 mFLC와 결합하는 항체를 피험자에게 투여하는 단계, 항체가 피험자 내의 세포와 결합되도록 하는 단계, 및 피험자 내 항체의 위치를 결정하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 항체는 검출 가능하게 표지된다.
바람직하게, 본 발명의 방법들에서 사용되는 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체이다.
또한, 본 발명은 B 세포 매개 면역 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 mFLC와 결합하는 항체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 피험자에서 자가 조혈세포 이식을 위한 방법을 제공하며, 이 방법은
(i) 피험자로부터 조혈 선조세포 집단을 제거하는 단계,
(ii) mFLC와 결합하는 항체로 세포 집단을 처리하는 단계, 및
(iii) 단계 (ii)의 처리된 세포 집단을 피험자에 이식하는 단계
를 포함한다.
mFLC와 결합하는 항체로 선조세포 집단을 처리하는 단계는 바람직하게는, mFLC와 결합하는 항체와 세포 집단에 존재하는 형질 세포 전구체가 결합하여 형질 세포 전구체의 성장을 저해하거나, 또는 형질 세포 전구체를 사멸시킬 수 있는 충분한 조건에서 세포 집단을 mFLC와 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 수반한다.
한 구체예에서, 상기 방법은 피험자에게 mFLC와 결합하는 항체를 정맥내 주입하는 것을 더 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 자가 이식 방법은 세포축소 요법 동안 또는 세포축소 요법 후에 피험자에게 수행된다.
또 다른 바람직한 구체예에서, mFLC와 결합하는 항체는 고체 지지체에 결합된다.
본 발명의 한 양태의 바람직한 특징과 특성은 본 발명의 많은 다른 양태들에도 적용될 수 있다는 것이 자명할 것이다.
본 명세서 전체적으로 " 포함한다(복수 구문) "라는 용어나 " 포함한다(단수 구문) " 또는 "포함하는"과 같은 변형된 용어들은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹이 포함되고, 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹도 배제되지 않는다는 의미로서 이해될 것이다.
본 발명은 이제부터 비제한적 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 설명된다.
도 1. IL-21, 항CD40 및 항IgM 활성화된 B 세포(CD 19+)에서 KMA의 발현. IL-21, 항CD40 및 항IgM의 존재하에 말초 B 세포가 활성화되었다. 제6일에 세포가 수거되고, KMA, IgD, CD27 및CD38에 대해 염색되었다. 게이트 1 = CD38low, 게이트 2 = CD38+ 및 게이트 3 = CD38++.
도 2. SAC 활성화된 형질모세포에서 KMA의 발현. IL-21, 항CD40 및 항IgM의 존재하에 말초 B 세포가 활성화되었다. 제6일에 세포가 수거되고, KMA, IgD, CD27 및CD38에 대해 염색되었다. 게이트 1 = CD38low, 게이트 2 = CD38+ 및 게이트 3 = CD38++.
도 3. KMA는 CD38++ CD45+ 미성숙 형질 세포에서 발현된다. 편도선 유래 단핵 세포가 KMA, CD19, CD38, CD45 및 SYTOX Green에 대해 염색되었다. (a) 생육성 B 세포가 CD19 및 SYTOX Green 염색 결여에 따라서 개폐되었다. 다음에, CD38 발현에 따라서 세포가 개폐되었다. 게이트 1 = CD38low, 게이트 2 = CD38+ 및 게이트3 = CD38++. (b) 세포가 KMA, CD38, CD45 및 SYTOX Green에 대해 염색되었다. 생육성 세포가 CD38++ 발현에 따라서 개폐되고, KMA 및 CD45 양성에 대해 분석되었다.
도 4. IHC에 의한 형질모세포 및 형질 세포 형태에 따른 KMA 발현 세포의 확인. 정상 조직으로부터의 미고정 절편이 FITC 표지된 MDX1097로 염색된 후, 마우스 항FITC 2차 항체와 항마우스 퍼옥시다제로 차례로 염색되었다. 절편이 크로마겐 기질을 사용하여 전개되었다. 패널 1 = 편도선 절편, 패널 2 = 침샘 및 패널 3 = 말초혈액. 화살표는 KMA+ 세포를 표시한다.
도 5. KMA는 IL-21, 항CD40 및 항IgM 활성화된 형질모세포에서 발현된다. IL-21, 항CD40 및 항IgM의 존재하에 말초 B 세포가 활성화되었다. 제6일에 세포가 수거되고, KMA, CD27, CD38, CD45 및 표면IgD에 대해 염색되었다(도시되지 않음). 패널 (a)는 수거된 세포의 산란 프로파일이다. 모든 후속 분석은 라이브 게이트(게이트 2)에서 수행되었다. 패널 (b)는 개폐된 집단의 CD27 및 CD38 프로파일을 나타낸다. 패널 (c)는 패널 (b)의 착색된 집단에서 KMA에 대해 양성인 세포의 퍼센트를 나타낸다(이소타입 대조군과 비교하여). 게이트 3 = CD38+/- CD27-, 게이트 4 = CD38+/- CD27+ 및 게이트 5 = CD38++ CD27++. KMA는 APC 표지된 MDX-1097을 사용하여 검출되었고, 이소타입 대조군은 APC 표지된 인간 IgG1 항체이었다. 나타낸 결과는 5회의 독립된 실험에 대한 것이다.
도 6. LMA는 IL-21, 항CD40 및 항IgM 활성화된 형질모세포에서 발현된다. IL-21, 항CD40 및 항IgM의 존재하에 말초 B 세포가 활성화되었다. 제6일에 세포가 수거되고, LMA, CD27, CD38, CD45 및 표면IgD에 대해 염색되었다(도시되지 않음). 패널 (a)는 수거된 세포의 산란 프로파일이다. 모든 후속 분석은 라이브 게이트(게이트 1)에서 수행되었다. 패널 (b)는 개폐된 집단의 CD27 및 CD38 프로파일을 나타낸다. 패널 (c)는 패널 (b)의 착색된 집단에서 LMA에 대해 양성인 세포의 퍼센트를 나타낸다(이소타입 대조군과 비교하여). 게이트 2 = CD38+/- CD27-, 게이트 3 = CD38+/- CD27+ 및 게이트 4 = CD38++ CD27++. LMA는 APC 표지된 4G7을 사용하여 검출되었고, 이소타입 대조군은 APC 표지된 마우스 IgG1 항체였다. 나타낸 결과는 5회의 독립된 실험에 대한 것이다.
일반적인 기술 및 선정된 정의
구체적으로 다른 의미로 한정되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 업계에서(예를 들어, 면역학, 면역조직화학, 세포배양, 분자유전학, 단백질화학, 및 생화학 분야에서) 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다.
다른 의미가 명시되지 않는다면, 본 발명에서 활용된 재조합 단백질, 세포배양, 및 면역학적 기술은 당업자가 잘 알고 있는 표준 과정이다. 이러한 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley 및 Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), T.A. Brown (편집자), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 및 2, IRL Press (1991), D.M. Glover 및 B.D. Hames (편집자), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), F.M. Ausubel et al. (편집자), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 개정본을 포함), Ed Harlow 및 David Lane (편집자) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan et al. (편집자) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(현재까지의 모든 개정본을 포함)와 같은 출처의 문헌에 잘 기재 및 설명되어 있다.
"막 결합 자유 경쇄"는 무손상 면역글로불린과 회합되지 않은 막 결합 경쇄를 의미한다. 막 결합 경쇄는 막 결합 카파 경쇄 및/또는 막 결합 람다 경쇄를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "형질 세포 전구체"는 장수 항체 분비 형질 세포의 활성화된, 증식하는 전구체와 유사한 특성을 갖는 세포를 말한다. 형질 세포 전구체는 프로 B 세포, 프레 B 세포, 미성숙 B 세포, 나이브(naive) B 세포, 활성화된 나이브 B 세포, 배중심(germinal centre) B 세포, 배중심 뒤(post germinal centre) B 세포, 기억 B 세포, 및 형질모세포를 포함한다.
세포가 주어진 마커에 대해 "양성"이라는 것은, 마커가 세포 표면에 존재하는 정도에 따라서 그 세포가 해당 마커의 저(+, lo 또는 흐림) 또는 고(++, 밝음, bri) 발현인자가 될 수 있다는 것을 의미하며, 이러한 용어는 세포의 색 정렬 과정에서 사용되는 형광 또는 다른 색의 강도와 관련된다. 저 발현인자인가 고 발현인자인가의 구별은 정렬되는 특정 세포 집단에서 사용되는 마커와 관련하여 이해될 것이다. 세포가 주어진 마커에 대해 "음성"이라는 것은, 세포에 의해 마커가 전혀 발현되지 않는다는 의미가 아니다. 이것은 해당 세포에 의해 마커가 상대적으로 매우 낮은 수준으로 발현될 수 있고, 검출 가능하게 표지되었을 때는 매우 적은 신호를 생성한다는 의미이다.
본원에서 사용된 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 B 세포 매개 면역 장애의 개시 또는 진행을 감소 또는 지연시키거나, 또는 B 세포 매개 면역 장애의 적어도 하나의 증상을 감소 또는 제거하기에 충분한 정도의 본원에 설명된 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
막 결합 자유 경쇄와 결합하는 항체
본 발명자는 막 결합 자유 경쇄가 형질 세포 전구체의 표면에서 발현된다는 것을 최초로 밝혀냈다. mFLC에 대한 항체는 ADCC, 보체 의존성 세포용해, 항체 의존성 세포성 포식작용, 및 세포자살과 같은 메커니즘을 통해 형질 세포 전구체를 사멸시킬 수 있고, 따라서 B 세포 매개 면역 장애에 대항하는 효과적인 치료제가 될 것이다. 또한, mFLC에 대한 항체를 사용하여 세포독소를 형질 세포 전구체에 직접 송달할 수 있다.
필수적인 것은 아니지만, 항체는 mFLC에 특이적으로 결합할 수 있다. "특히적으로 결합한다"라는 말은 특정 조건에서 항체가 mFLC와 결합하고, 다른 단백질이나 탄수화물과는 유의한 양으로 결합하지 않는다는 의미이다. mFLC와 특이적으로 결합하는 항체는 무손상 면역글로불린과 회합된 경쇄와는 결합하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 조건에서 mFLC와 특이적으로 결합하려면 특이성에 따라서 항체가 선택될 필요가 있을 수 있다. 다양한 면역분석 방법을 사용하여 mFLC와 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 단백질이나 탄수화물과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 때는 고체상 ELISA 면역분석이 일반적으로 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하는데 사용될 수 있는 면역분석 방법 및 조건의 설명은 Harlow 및 Lane (1988) Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York을 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 다클론 항체, 단클론 항체, 이중특이성 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 헤테로콘쥬게이트 항체, 키메라 항체(무손상 분자뿐만 아니라 이들의 단편도 포함한다), 및 그 외 다른 항체 유사 분자를 포함한다. 항체는 다양한 형태의 변형을 포함하며, 이러한 변형에는 제한은 아니지만, 예를 들어 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 도메인 항체, 중쇄 가변 영역의 다이머(카멜리드에 대해 설명된 VHH), 경쇄 가변 영역의 다이머(VLL), 직접 또는 링커를 통해 연결될 수 있는 경쇄(VL)와 중쇄(VH) 가변 영역만을 함유하는 Fv 단편, 또는 중쇄 가변 영역과 CH1 도메인을 함유하는 Fd 단편이 포함된다. 또한, 함께 연결되어 단쇄 항체를 형성한 중쇄와 경쇄의 가변 영역으로 구성된 scFv(Bird et al., 1988; Huston et al., 1988) 및 디아바디 및 트리아바디와 같은 scFV들의 올리고머도 "항체"라는 용어에 포함된다. 또한, 불변 영역의 일부분과 가변 영역을 함유하는 Fab, (Fab')2 및 FabFc2와 같은 항체의 단편들도 포함된다. 또한, 상보성 결정 영역(CDR)이 접목된 항체 단편과 항체 단편의 올리고머도 포함된다. Fv의 중쇄 및 경쇄 성분은 동일한 항체로부터 유래될 수도 있고, 또는 상이한 항체로부터 유래될 수도 있으며, 이 경우 키메라 Fv 영역이 만들어진다. 항체는 동물(예를 들어, 마우스, 토끼 또는 래트) 또는 인간 기원일 수 있거나, 또는 키메라 항체(Morrison et al., 1984) 또는 인간화된 항체(Jones et al., 1986)일 수 있는데, 이것은 영국 특허출원 제8707252호에 공개된다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 이러한 다양한 형태를 포함한다. 본원에 제공된 가이드라인과 상기 인용된 참고자료들 및 Harlow & Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)와 같은 간행물에 설명된 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여, 본 발명의 방법에서 사용되는 항체가 쉽게 제조될 수 있다.
mFLC-결합 항체는 가변 경쇄(VL)와 가변 중쇄(VH)를 포함하는 Fv 영역일 수 있으며, 여기서 경쇄와 중쇄가 직접 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 본원에서 사용된 링커는 경쇄와 중쇄에 공유 결합된 분자를 말하며, 링커에 의해 두 사슬 사이에 충분한 공간과 가요성이 제공되어, 경쇄와 중쇄는 이들이 향하는 에피토프와 특이적으로 결합할 수 있는 입체형태를 달성할 수 있다. 단백질 링커가 융합 폴리펩티드의 Ig 부분의 고유 성분으로서 발현될 수 있으므로 특히 바람직하다.
다른 구체예에서, 재조합된 단쇄 scFv 항체, 바람직하게 인간화된 scFv가 본 발명의 방법에서 사용된다.
단클론 항체
mFLC 에피토프에 대한 단클론 항체는 당업자에 의해서 쉽게 제조될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단클론 항체를 제조하는 일반적인 방법론이 잘 알려져 있다. 세포 융합에 의해서, 또한 암유전자 DNA에 의한 B 림프구의 직접 형질변형, 또는 엡스타인-바 바이러스에 의한 트랜스펙션과 같은 다른 기술에 의해 불멸성 항체 생성 세포주가 만들어질 수 있다. mFLC 에피토프에 대해 생성된 단클론 항체 집단은 다양한 특성에 대해, 즉 이소타입 및 에피토프 친화성에 대해서 스크리닝될 수 있다.
동물 유래 단클론 항체는 생체내에 직접 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 체외 면역치료법에서도 사용될 수 있다. 그러나, 예를 들어 마우스 유래 단클론 항체가 치료제로서 인체에 사용된 경우, 인간 항마우스 항체가 환자에서 발생한다는 것이 관찰되었다. 따라서, 동물 유래 단클론 항체는 치료제로서, 특히 장기 사용을 위한 치료제로서 바람직하지 않다. 그러나, 확립된 유전자 조작 기술을 사용하여, 동물 유래 부분과 인간 유래 부분을 가진 키메라 항체나 인간화된 항체를 만드는 것이 가능하다. 동물은 예를 들어 마우스 또는 래트와 같은 다른 설치류일 수 있다.
키메라 항체의 가변 영역은, 예를 들어 마우스 유래이고, 불변 영역은 인간 유래라면, 이 키메라 항체는 일반적으로 "순수한" 마우스 유래 단클론 항체보다 면역성이 적을 것이다. "순수한" 마우스 유래 항체는 부적합한 것으로 드러났으므로, 이러한 키메라 항체는 치료 용도에 더 적합할 수 있다.
키메라 항체를 생성하는 방법을 당업자가 이용할 수 있다. 예를 들어, 경쇄와 중쇄가, 예를 들어 별개의 플라스미드에 존재하는 면역글로불린 경쇄와 면역글로불린 중쇄를 이용해서 개별적으로 발현될 수 있다. 다음에, 이들이 정제되고, 시험관내에서 완전한 항체로 조립될 수 있으며, 이러한 조립을 달성하는 방법은 이미 설명되었다(예를 들어, Sun et al., 1986 참조). 이러한 DNA 구성물은 인간 불변 영역을 암호화하는 DNA에 연결된 항mFLC 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에 대한 기능적으로 재배열된 유전자를 암호화하는 DNA를 포함할 수 있다. 경쇄 및 중쇄에 대한 이 DNA 구성물로 트랜스펙션된 하이브리도마 또는 골수종과 같은 림프양 세포가 항체 사슬을 발현하고 조립할 수 있다.
축소되고 분리된 경쇄 및 중쇄로부터 IgG 항체를 형성하는 것에 관한 시험관내 반응 파라미터도 역시 설명되었다(예를 들어, Beychok, 1979 참조). 동일한 세포에서 경쇄와 중쇄를 공발현(co-expression)시켜, 중쇄와 경쇄가 완전한 H2L2 IgG 항체로 세포내 회합되어 결합되도록 하는 것도 역시 가능하다. 이러한 공발현은 동일한 숙주 세포에서 동일한 또는 상이한 플라스미드를 사용하여 달성될 수 있다.
인간화 방법/기술
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 항mFLC 항체는 인간화되는데, 즉 예를 들어, 모 래트, 토끼 또는 뮤린 항체의 가변 영역에 기인하는 결합 친화성은 거의 또는 전혀 손실되지 않도록 하면서 항체의 인간 내용물은 최대화하는 분자 모델링 기술에 의해 항체가 만들어진다.
항체는 EP-A-0239400에 따라서 인간 프레임워크 위에 원하는 CDR을 접목시킴으로써 인간화될 수 있다. 따라서, 원하는 개조된 항체를 암호화하는 DNA 서열은 개조하고자 하는 CDR을 가진 인간 DNA에서 시작하여 제조될 수 있다. 원하는 CDR을 함유하는 동물 유래 가변 도메인 아미노산 서열이 선택된 인간 항체 가변 도메인 서열과 비교된다. 인간 가변 영역과 동물 유래 CDR을 통합하기 위해서 동물의 상응하는 잔기로 변경되어야 하는 인간 가변 도메인의 잔기가 표지된다. 또한, 인간 서열의 잔기는 치환되거나, 부가되거나, 또는 결실될 수도 있다.
원하는 잔기를 함유하도록 인간 가변 도메인 프레임워크에 돌연변이를 유발하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 임의의 편리한 크기를 가질 수 있다. 이것은 일반적으로는 이용된 특정 합성기의 역량에 따라서 길이만 제한된다. 올리고뉴클레오티드-지정 시험관내 돌연변이유발 방법은 잘 공지되어 있다.
대안으로서, WO 92/07075의 재조합 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법을 이용하여 인간화가 달성될 수 있다. 이 방법을 이용하면, 인간 항체의 프레임워크 영역 사이에서 CDR이 스플라이스될 수 있다. 일반적으로, WO 92/07075의 기술은 2개의 인간 프레임워크 영역, 즉 AB와 CD를 포함하고, 또한 이들 사이에 도너 CDR로 치환될 수 있는 CDR을 포함하는 주형을 사용하여 수행될 수 있다. 프라이머 A와 B를 사용해서 프레임워크 영역 AB를 증폭시키고, 프라이머 C와 D를 사용해서 프레임워크 영역 CD를 증폭시킨다. 그러나, 프라이머 B와 C는 각각 자신의 5' 도너 CDR 서열의 적어도 일부분 또는 전부분에 상응하는 추가의 서열을 또한 함유한다. 프라이머 B와 C는 PCR이 수행될 수 있는 조건에서 5' 단부끼리의 아닐링을 허용하기에 충분한 길이만큼 중첩된다. 따라서, 증폭된 영역 AB와 CD에는 중첩 확장에 의한 유전자 스플라이싱이 일어날 수 있고, 이로써 단일 반응에서 인간화된 산물이 생성될 수 있다.
항체를 개조하기 위한 돌연변이유발 반응 후, 돌연변이된 DNA는 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 암호화하는 적절한 DNA에 연결되고, 발현 벡터에 클로닝되고, 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포에 트랜스펙션될 수 있다. 이 단계는 통상의 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 개조된 항체는 하기 단계 (a)-(d)를 포함하는 과정에 의해서 제조될 수 있다:
(a) 적어도 Ig 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인(상기 가변 도메인은 인간 항체로부터의 프레임워크 영역을 포함함), 및 본 발명의 인간화된 항체에 필요한 CDR을 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함하는 제 1 복제가능한 발현 벡터를 제조하는 단계;
(b) 적어도 상보성 Ig 경쇄 또는 중쇄 각각의 가변 도메인을 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 적합한 프로모터를 포함하는 제 2 복제가능한 발현 벡터를 제조하는 단계;
(c) 제조된 제 1 벡터로, 또는 두 가지 벡터로 모두로 셀라인을 형질전환하는 단계; 및
(d) 상기 형질전환된 셀라인을 배양하여 상기 변경된 항체를 생산하는 단계.
바람직하게, 단계 (a)에서 DNA 서열은 인간 항체 사슬의 가변 도메인과 각 불변 도메인을 모두 암호화한다. 인간화된 항체는 적합한 재조합 발현 시스템을 사용해서 제조될 수 있다. 변경된 항체를 생산하도록 형질전환되는 셀라인은 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 셀라인 또는 불멸화된 포유류 셀라인일 수 있으며, 포유류 셀라인은 골수종, 하이브리도마, 트리오마(trioma) 또는 쿼드로마(quadroma) 셀라인과 같은 림프양 기원인 것이 유리하다. 또한, 셀라인은 B 세포와 같은 정상 림프양 세포를 포함할 수 있는데, 이것은 엡스타인-바 바이러스와 같은 바이러스로의 형질전환에 의해 불멸화된다. 불멸화된 세포는 골수종 셀라인 또는 이의 유도체인 것이 가장 바람직하다.
항체의 발현에 사용되는 CHO 세포는 디히드로폴레이트 환원효소(dhfr)가 결핍될 수 있으며, 이 때문에 티미딘과 하이포크산틴에 의존하여 성장할 수 있다(Urlaub 및 Chasin, 1980). 모 dhfr- CHO 셀라인이 항체 및 dhfr 유전자를 암호화하는 DNA로 트랜스펙션되며, 이로써 dhfr 양성 표현형을 가진 CHO 세포 형질전환체를 선택할 수 있게 된다. 선택은 티미딘과 하이포크산틴이 없는 배지 위에서 콜로니를 배양함으로써 수행되는데, 티미딘과 하이포크산틴의 부재는 형질전환되지 않은 세포가 성장하는 것과 형질전환된 세포에서 폴레이트(folate) 경로가 다시 부활되고, 이로써 선택 시스템을 빗겨가게 되는 것을 방지한다. 이러한 형질전환체는 일반적으로 트랜스펙션된 해당 DNA와 dhfr을 암호화하는 DNA가 동시 통합되기 때문에 해당 DNA를 낮은 수준으로 발현한다. 항체를 암호화하는 DNA의 발현 수준은 메토트렉세이트(MTX)를 사용한 증폭에 의해 증가될 수 있다. 이 약물은 효소 dhfr의 직접 저해제로서, 내성 콜로니를 분리시켜 이의 dhfr 유전자 카피수를 이러한 조건에서 생존할 수 있을 만큼 충분히 증폭시킨다. Dhfr 및 항체를 암호화하는 DNA 서열은 원래 형질전환체에서 가까이 연결되므로, 일반적으로 동시에 증폭되어 원하는 항체의 발현도 증가된다.
CHO 또는 골수종 세포와 함께 사용되는 다른 바람직한 발현 시스템으로서 WO 87/04462에 설명된 글루타민 합성효소(GS) 증폭 시스템이 있다. 이 시스템은 효소 GS를 암호화하는 DNA와 원하는 항체를 암호화하는 DNA로 세포를 트랜스펙션하는 것을 포함한다. 다음에, 글루타민 무함유 배지에서 성장한 세포가 선택되며, 따라서 이는 GS를 암호화하는 DNA와 통합되었다고 가정될 수 있다. 다음에, 선택된 클론들은 메티오닌 술폭시민(Msx)을 사용해서 효소 GS로 저해된다. 세포는 생존하기 위해서 GS를 암호화하는 DNA를 증폭시킬 것이며, 그와 동시에 항체를 암호화하는 DNA도 증폭될 것이다.
인간화된 항체를 생산하는데 사용되는 셀라인은 포유류 셀라인인 것이 바람직하지만, 박테리아 셀라인이나 효모 셀라인과 같은 다른 적합한 셀라인도 대신 사용될 수 있다. 특히, E. coli 유래 박테리아 균주가 사용될 수 있다고 생각된다. 얻어진 항체는 기능성에 대해 조사된다. 기능성이 상실된 경우, 단계 (2)로 되돌아가서 항체의 프레임워크를 변경해야 한다.
일단 발현된 후에는, 전체 항체, 항체의 다이머, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태가 본 분야의 표준 과정에 따라서 회수되어 정제될 수 있으며, 이러한 표준 과정에는 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등이 포함된다(일반적으로 Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)을 참조한다). 적어도 약 90~95%의 동질성(homogeneity)을 나타내는 실질적으로 순수한 면역글로불린이 제약 용도로서 바람직하고, 가장 바람직한 것은 98~99% 또는 그 이상의 동질성을 나타내는 것이다. 부분적으로든 또는 원하는 동질성까지든 일단 정제된 후에는, 인간화된 항체는 치료적으로 사용될 수 있거나, 또는 분석 과정, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 사용될 수 있다(일반적으로 Immunological Methods, Vols.I and II, Lefkovits and Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 and 1981)를 참조한다).
Greenwood et al.(1993)에 의해 수행된 연구에서는, 인간 이펙터(effector) 세포에 의한 항체 Fc 영역의 인식이 면역글로불린 분자의 불변 영역을 조작함으로써 최적화될 수 있음이 입증되었다. 이것은 인간 피험자에서 효과적인 ADCC가 입증된 면역글로불린 이소타입, 예를 들어 IgG1 및 IgG3 이소타입을 암호화하는 인간 불변 영역 유전자와, 원하는 특이성으로, 항체의 가변 영역 유전자를 융합하는 것에 의해 달성될 수 있었다(Greenwood 및 Clark (1993) Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man. Edited by Mike Clark, Academic Titles. Section II 85-113). mFLC에 대한 결과의 키메라 항체나 인간화된 항체는 ADCC를 유도하는데 특히 효과적일 것이다.
또한, mFLC에 대한 전체 인간 가변 영역을 가진 항체가, 항원 시험감염에 응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었고, 내인성 유전자좌는 무력화된 트랜스제닉(transgenic) 동물에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 항체 자체 또는 이의 유사체를 얻기 위한 다양한 후속 조작이 수행될 수 있다(예를 들어, 미국특허 제6,075,181호 참조).
항체 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자의 제조
항체를 암호화하는 유전자, 즉 경쇄와 중쇄 유전자 또는 이의 일부분, 예를 들어 단쇄 Fv 영역이 하이브리도마 셀라인으로부터 클로닝될 수 있다. 이는 모두 동일한 일반 전략을 이용하여 클로닝될 수 있다. 전형적으로, 예를 들어 하이브리도마 세포로부터 추출된 폴리(A)+mRNA가 프라이머로서 랜덤 헥사머를 사용하여 역전사된다. Fv 영역의 경우, VH 및 VL 도메인이 2번의 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해서 개별적으로 증폭된다. 중쇄 사슬 서열은 항mFLC 중쇄 각각의 아미노 말단 단백질 서열에 따라 설계된 5 ' 단부 프라이머와 컨센서스(consensus) 면역글로불린 불변 영역 서열에 따른 3' 단부 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edition. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 경쇄 Fv 영역은 항mFLC 경쇄의 아미노 말단 단백질 서열에 따라 설계된 5 단부 프라이머를 사용하여 프라이머 C-카파와 조합하여 증폭된다. 당업자라면 많은 적합한 프라이머를 사용해서 Fv 영역을 얻을 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
PCR 산물은 적합한 클로닝 벡터에서 서브클로닝된다. DNA 제한에 의해서 정확한 크기의 삽입체를 함유하는 클론이 확인된다. 다음에, 중쇄 또는 경쇄 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열이 클로닝 부위에 인접한 시퀀싱 프라이머를 사용하여 이중가닥 플라스미드 DNA로부터 결정될 수 있다. 시중 입수가능한 키트(예를 들어, SequenaseTM 키트, United States Biochemical Corp., 미국 오하이오 클리블랜드) 를 사용하여 DNA 시퀀싱을 쉽게 수행할 수 있다. Fv 영역을 암호화하는 DNA는, 예를 들어 PCR 및 LCR과 같은 증폭 기술을 포함하는 적합한 방법에 의해서 제조될 수 있다.
단일가닥 올리고뉴클레오티드는 화학 합성에 의해서 생성된다. 이것은 상보성 서열과의 혼성화에 의해, 또는 주형으로서 단일가닥을 사용하는 DNA 중합효소에 의한 중합에 의해 이중가닥 DNA로 변환될 수 있다. 단쇄 Fv 영역 전체를 화학적으로 합성하는 것이 가능하지만, 짧은 서열(약 100~150개 염기)을 여러 개 합성한 다음, 나중에 함께 리게이션(ligation)하는 것이 바람직하다.
대안으로서, 하위서열(subsequence)이 클로닝될 수 있으며, 적절한 제한 효소를 사용해서 적절한 하위서열이 절단된다. 다음에, 이 단편들을 리게이션해서 원하는 DNA 서열을 만들 수 있다.
일단 Fv 가변 경쇄 및 중쇄 DNA가 얻어지면, 당업자에게 잘 공지된 기술을 이용하여, 이 서열이 직접 또는 펩티드 링크를 암호화하는 DNA 서열을 통해서 함께 리게이션될 수 있다. 한 구체예에서, 중쇄 Fv 도메인의 카르복실 단부에서 시작해서 경쇄 Fv 도메인의 아미노 말단에서 끝나는 유연한 펩티드 링커(예를 들어, (Gly4Ser)3)에 의해서 중쇄 영역과 경쇄 영역이 연결된다. 이 전체 서열은 단쇄 항원 결합 단백질의 형태로 Fv 도메인을 암호화한다.
항 KMA 항체
한 구체예에서, mFLC와 결합하는 항체는 항KMA 항체이다. 예를 들어, 항체는 K121 또는 K121 유사 항체일 수 있다. K121은 인간 자유 카파 경쇄와 카파-형 골수종 세포의 표면에서 발현된 항원을 특이적으로 인식하는 뮤린 단클론 항체(mAb)이다. 이 항원은 카파 골수종 항원 또는 KMA로 지칭된다(Boux, HA. et al., 1983). KMA는 세포막 상의 액틴과 비공유 회합된 상태로 발현되는 자유 카파 경쇄로 구성된다는 것이 확립되어 있다(Goodnow et al., 1985).
본원에서 사용되었을 때, 용어 "K121 유사 항체"는 서열번호 1에 제시된 VH 영역과 서열번호 2에 제시된 VL 영역을 포함하는 항체, 또는 카파 골수종 항원(KMA)과의 결합에 있어서 서열번호 1에 제시된 VH 영역과 서열번호 2에 제시된 VL 영역을 가진 항체와 경쟁하는 항체를 말한다.
K121 유사 항체는 HMy2 세포 상에서 KMA와 결합하는데 있어서 K121(또는 K121의 키메라 형태나 인간화된 형태)과 경쟁하는 능력에 의해서 확인될 수 있다. 이 과정에서, K121은 확립된 과정에 의해 비오틴과 콘쥬게이션될 수 있다(Hofmann et al., 1982). 다음에, HMy2 세포 상의 KMA와 비오틴화된 K121의 결합과 경쟁하는 역량에 따라서 K121 유사 항체가 평가된다. 비오틴화된 K121과 HMy2 세포의 결합은 K121 분자 상의 비오틴과 결합하는 플루오레세인 표지된 스트렙토아비딘을 첨가함으로써 평가될 수 있다. 다음에, 세포의 형광 염색이 유세포분석기에 의해 정량되고, 경쟁자의 부재시 얻어진 형광 수준 대비 퍼센트로서 K121 유사 항체의 경쟁 효과가 표시된다.
항 LMA 항체
본 발명의 한 구체예에서, mFLC와 결합하는 항체는 항LMA 항체이다. 본원에서 사용되었을 때, 용어 "LMA"는 람다-형 면역글로불린으로부터 유래된 경쇄와 등가인 임의의 자유 람다 경쇄를 포함한다. 따라서, 이 용어는 가변 영역 서열에 차이가 있을 수 있는 일군의 람다 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
항LMA 항체는 당업자에게 알려져 있을 것이다. 예를 들어, LMA에 대해 생긴 항체가 다발성 골수종을 진단하기 위한 검사에서 혈청 또는 소변 중의 자유 람다 경쇄를 검출하기 위해 사용되었다(Bradwell et al., 2001). 그러나, LMA는 지금까지는 B 세포 매개 면역 장애의 치료 표적으로서는 환자에서 사용된 적이 없다.
적합한 항LMA 항체의 예는 3D12(제품 # ab1944; AbCam Ltd, 영국 캠브리지), CBL317(Cymbus Biotechnology Ltd, 영국), 4G7(제품 # ab54380; AbCam Ltd), ME-154(제품 # ab9245; AbCam Ltd), 26D(제품 # CBL317; Chemicon Australia Pty Ltd, 호주 빅토리아) 또는 2G9(제품 # CBL109; Chemicon Australia Pty Ltd)를 포함한다.
세포독성 부분
본 발명에서의 사용에 적합한 세포독성 부분은 제한되는 것은 아니지만 박테리아 또는 식물 독소 등의 제제, 즉 약물, 예를 들어 시클로포스파미드(CTX; 시톡산), 클로람부실(CHL; 류케란), 시스플라틴(CisP; CDDP; 플라티놀), 부술판(밀레란), 멜팔란, 카르뮤스틴(BCNU), 스트렙토조토신, 트리에틸렌멜라민(TEM), 미토마이신 C, 및 그 외 다른 알킬화제; 메토트렉세이트(MTX), 에토포시드(VP-16; 베페시드), 6-메르캅토퓨린(6MP), 6-티오구아닌(6TG), 시타라빈(Ara-C), 5-플루오로우라실(5FU), 다카르바진(DTIC), 2-클로로데옥시아데노신(2-CdA), 및 그 외 다른 항대사산물; 악티노마이신 D, 독소루비신(DXR; 아드리아마이신), 다우노루비신(다우노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 그 외 다른 항생제를 포함하는 항생제; 빈크리스틴(VCR), 빈블라스틴 등과 같은 알칼로이드; 뿐만 아니라 덱사메타손(DEX; 데카드론)과 같은 세포증식억제제인 글루코코르티코이드와 프레드니손 등의 코르티코스테로이드, 히드록시유레아 등의 뉴클레오티드 효소 저해제 등을 포함하는 그 외 다른 항암제를 포함한다.
당업자는 매우 많은 다른 방사성 동위원소와 화학세포독성제가 잘 공지된 기술에 의해 항체와 결합된 다음 송달되어 병에 걸린 조직을 특이적으로 파괴할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 미국특허 제4,542,225호(Blattler et al.)를 참조한다. 광활성화 독소의 예는 디히드로피리딘- 및 오메가-코노톡신을 포함한다(Schmidt et al., 1991). 사용될 수 있는 조영제 및 세포독성 시약의 예는 125I, 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 3H, 및 14C; 형광 표지, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민; 및 화학발광제, 예를 들어 루시페린을 포함한다. 항체는 본 분야에 공지된 기술을 이용해서 이러한 시약들로 표지될 수 있다. 예를 들어, 항체의 방사성표지화에 관한 기술에 대해서는 Wenzel and Meares, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983)를 참조한다(또한, Colcher et al., 1986; "Order, Analysis, Results and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al. (eds), pp. 303-16 (Academic Press 1985) 참조).
한 예로서, 링커-킬레이터 티우엑수탄(tiuexutan)이 안정한 티오우레아 공유 결합에 의해서 mFLC와 결합하는 항체와 콘쥬게이션되어 인듐-111 또는 이트륨-90에 대한 친화성이 높은 킬레이션 부위를 제공한다.
세포독성제를 암호화하는 DNA 분자가 본 발명의 치료 조성물에 존재하는 경우에는, 이 DNA는 박테리아 또는 식물 독소인 폴리펩티드를 암호화하는 것이 바람직하다. 이러한 폴리펩티드는 제한되는 것은 아니지만, 자생 또는 변형된 슈도모나스 엑소톡신(PE), 디프테리아 독소(DT), 리신, 아브린, 겔로닌, 모모르딘 II, 박테리아 RIP, 예를 들어 시가(shiga) 및 시가 유사 독소 a-사슬, 루핀(Islam et al., 1990), 아트리코산틴(Chow et al., 1990), 모모르딘 I(Ho et al., 1991), 미라빌리스 항바이러스 단백질(Habuka et al., 1989), 미국자리공 항바이러스 단백질(Kung et al., 1990), 비오딘 2(미국특허 제5,597,569호), 가포린(Benatti et al., 1989)과 이의 유전자 조작된 변이체와 같은 폴리펩티드를 포함한다. 자생 PE 및 DT는 매우 독성인 화합물로서, 전형적으로는 간 독성으로 인한 사망을 야기한다. 바람직하게, PE와 DT는 독소의 원래 표적화 성분, 예를 들어 PE의 도메인 Ia 및 DT의 B 사슬을 제거한 형태로 변형된다. 당업자는 본 발명이 특정 세포독성제에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 용어 "슈도모나스 엑소톡신"(PE)은 전장 자생(자연 발생) PE 또는 변형된 PE를 말한다. 이러한 변형은 제한되는 것은 아니지만, 도메인 Ig의 제거, 도메인 II 및 III에서의 다양한 아미노산 결실, 단일 아미노산 치환(예를 들어, 위치 590 및 606에서 Lys의 Gln로의 치환), 및 카르복실 말단에 하나 이상의 서열의 부가를 포함할 수 있다(Siegall et al., 1989 참조). 따라서 예를 들어, PE38은 아미노산 253~364와 381~613으로 이루어진 절단형(truncated) 슈도모나스 엑소톡신을 말한다. PE의 원래 C 말단인 REDLK(잔기 609~613)가 KDEL, REDL 서열로 치환될 수 있고, Lys-590 및 Lys-606은 각각 Gln으로 돌연변이될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "디프테리아 독소"(DT)는 전장 자생 DT 또는 변형된 DT를 말한다. 변형은 전형적으로 B 사슬에 있는 표적화 도메인의 제거를 포함하며, 더 구체적으로는 B 사슬의 카르복실 영역의 절단을 포함한다.
치료 방법
본 발명의 방법은 자가면역 장애, 염증성 장애 및 패혈증과 같은 B 세포 매개 면역 장애의 치료 또는 예방에 유용하다. 당업자는 B 세포 매개 면역 장애에는 B 세포 악성질환은 포함되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 자가면역 장애는 제한되는 것은 아니지만, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 당뇨병, 다발성 경화증, 크론병, 면역 혈소판감소 자색반병, 심상성 천포창, 자가면역성 두드러기, 셀리악병, 포진성 피부염, 급성 류마티스열, 그레이브스병, 중증 근무력증, 쇼그렌 증후군, 굿페스쳐 증후군, 연쇄구균 감염후 사구체신염, 접촉성 피부염, 자가면역성 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 에디슨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 악성빈혈, 항호중구 세포질 항체(ANCA)로 인해 발생한 맥관염, 결절성 다발동맥염, 자가면역성 간염, 및 원발성 담도 경화증을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 방법은 변형되지 않은 항체 또는 결합 단편을 이용하며, 항체 또는 단편과 형질 세포 전구체의 표면 mFLC의 원위치(in situ) 결합에 의한 면역 공격의 자극에 의존한다. 예를 들어, 항원 결합 부위가 인간 Fc 영역, 예를 들어 IgG1과 연결된 키메라 항체를 사용해서 항체 의존성 매개 세포독성 또는 보체 매개 세포독성을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 치료 방법은 mFLC 결합 부분, 예를 들어 mFLC와 결합한 항체를 사용하여 수행될 수 있는데, 여기에 세포독성제나 생물학적 반응 변형제가 결합된다. 결과의 콘쥬게이트와 형질 세포 전구체의 결합이 세포의 성장을 저해하거나, 또는 세포를 사멸시킨다.
당업자에게 자명한 대로, 일부 B 세포 매개 면역 장애 환자는 순환계 중에 상당한 수준의 자유 람다 경쇄를 가질 수 있다. 항mFLC 항체가 이러한 자유 경쇄와 반응하기 때문에, 피험자의 체액에 이것이 존재하면 치료 효능이 감소할 수 있다. 따라서 본 발명의 한 구체예에서, 치료 방법은 항mFLC 항체의 투여 전에 피험자의 체액(예를 들어, 혈액) 중에서 순환하는 자유 람다 경쇄의 수준을 감소시키기 위해 피험자를 치료하는 단계를 더 포함한다. 이런 추가 치료 단계는 예를 들어 혈장분리반출술(plasmapheresis)을 포함할 수 있다. 당업자에게 알려진 대로, 혈장분리반출술은 세포 분리기로 알려진 장치에 의해 혈액 세포에서 혈장이 제거되는 과정이다. 이 분리기는 혈액을 고속 회전시켜 유체로부터 세포를 분리하거나, 또는 혈액을 혈장만 통과될 만큼 작은 공극을 가진 멤브레인을 통과시킴으로써 작동한다. 세포는 피험자에게 되돌아가고, 자유 경쇄를 함유하는 혈장은 폐기되고 다른 유체로 교체된다. 혈액이 응고되는 것을 막는 약제(예를 들어, 항응고제)가 과정 동안 정맥을 통해 제공될 수 있다.
항mFLC 항체의 사용을 포함하는, 예를 들어 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 당뇨병, 및 다발성 경화증과 같은 B 세포 매개 면역 장애를 치료하는 방법이 다른 공지된 치료법과는 분리하여 또는 이들 치료법에 수반되어 수행될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 항mFLC 항체는 환자에게 재도입하기 전에 골수와 같은 환자의 시료로부터 형질 세포 전구체를 제거하기 위해서 사용될 수 있다. 한 비제한적 예에서, 항체는 비드와 같은 매트릭스에 부착된다. 이것은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 친화성 매트릭스를 제조하는 몇 가지 잘 공지된 방법 중 하나에 의해서 달성될 수 있다. 다음에, 환자 시료가 매트릭스에 노출되는데, 이것은 예를 들어 항원/항체 상호작용을 통해서 시료 중의 형질 세포 전구체와 매트릭스에 부착된 항체 또는 결합 단편의 결합을 촉진하는 조건에서 매트릭스를 함유하는 컬럼을 세포를 통과시킴으로써 이루어진다. 시료 중의 형질 세포 전구체가 매트릭스에 부착되는 한편, 컬럼 유출물, 즉 비부착 세포 집단은 형질 세포 전구체로부터 고갈된다. 잔류 형질 세포 전구체에 대하여 세포를 시험함으로써, 예를 들어 하기 설명되는 검출 가능하게 표지된 항체를 사용함으로써 이 과정의 효능이 모니터링될 수 있다. 이 과정은 효능을 높이기 위해서 반복되거나 변형될 수 있다.
진단 분석 및 키트
또한, mFLC에 결합하는 항체는 자유 경쇄를 발현하는 형질 세포 전구체를 검출하기 위한 시험관내 및 생체내 진단 용도에 모두 유용하다. 시험관내 진단 방법은 세포의 면역조직학적 검출을 포함한다. 면역조직화학 기술은 조직 견본과 같은 생물학적 견본을 mFLC와 결합하는 항체로 염색한 다음, 항원-항체 복합체로서 해당 항원과 복합체를 이룬 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 견본에서 이러한 항체-항원 복합체의 형성은 조직에 자유 경쇄를 발현하는 형질 세포 전구체가 존재한다는 것을 나타낸다. 견본에서 항체의 검출은 면역효소 기술, 예를 들어 면역퍼옥시다제 염색 기술, 또는 아비딘-비오틴 기술, 또는 면역형광 기술과 같은 본 분야에 공지된 기술을 이용해서 달성될 수 있다(예를 들어, Ciocca et al., "Immunohistochemical Techniques Using Monoclonal Antibodies", Methods Enzymol, 121:562-79, 1986 및 Kimball, (ed), Introduction to Immunology(2.sub.nd Ed), pp. 113-117 (Macmillan Pub. Co., 1986) 참조).
적합한 표지가 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "표지"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 수단에 의해서 검출될 수 있는 조성물을 말한다. 예를 들어, 유용한 표지는 32P, 14C, 125I, 3H 및 35S와 같은 방사성 분자, 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 염료, 전자 밀집 시약, 이소티오시아네이트, 발색단, 효소(ELISA에서 통상 사용되는 것), 루시페라제와 같은 발광 효소 등을 포함한다.
이러한 표지된 항체는, 예를 들어 항원의 조직학적 국소화, ELISA, 세포 정렬, 및 항원 및 항원 보유 세포를 검출 및/또는 정량하기 위한 다른 면역학적 기술에서 사용될 수 있다. 상기 주지된 대로, 이러한 표지된 항체, 또는 이의 단편의 특정 용도는 이식, 특히 자가골수이식 전에 골수조직으로부터 형질 세포 전구체 고갈의 효과를 결정하는데 사용되는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 설명된 항mFLC 항체를 사용한 B 세포 매개 면역 장애에 대한 조영 방법에 관한 것이다. 이 방법은 여기 설명된 항체의 투여나 주입을 포함하며, 항체는 방사성 핵종과 같은 검출가능한 부분과 콘쥬게이션되거나 콘쥬게이션되지 않는다. 투여 또는 주입 후, 항체, 또는 항체 단편은 형질 세포 전구체와 결합되고, 이후 항체의 위치가 검출된다. 검출 가능하게 표지된 항체의 경우, 예를 들어 방사성 핵종으로 표지된 것은 조영 기기를 사용해서 체내에서 해당 제제의 위치를 확인할 수 있다. 표지되지 않은 항체를 사용한 경우, 항체를 찾아 자리잡는 제 2의 검출가능한 시약이 투여될 수 있고, 따라서 적절히 검출될 수 있다. 이러한 방법은 다른 항체에 대해서도 사용된 것이며, 당업자는 체내에서 항체 또는 단편의 위치를 조영하는 다양한 방법을 충분히 알고 있을 것이다.
또한, 본 발명은 연구 또는 진단 목적의 키트를 포함한다. 키트는 전형적으로 항mFLC 항체를 함유하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 항mFLC 항체는 표지로 유도체화될 수 있거나, 또는 대안으로서 후속 검출을 제공하는 2차 표지와 결합될 수 있다. 상기 설명된 대로, 이러한 표지는 방사성 표지, 형광 표지, 효소 표지, 즉 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 적절한 2차 표지(예를 들어, 양 항마우스-HRP 등)를 함유할 수 있다. 또한, 키트는 융합 폴리펩티드의 결합, 비특이적 결합 항체의 제거, 및 결합된 표지의 검출을 용이하게 하는 다양한 시약을 함유할 수 있다. 이러한 시약은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명의 추가의 양태로서, 고체 지지체에 결합된 항mFLC 항체를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명에서 사용되는 고체 지지체는 결합 반응 조건에서 불활성일 것이다. 본 발명에서 사용되는 고체상 지지체는 단클론 항체 또는 이의 결합 파트너를 고체상 지지체에 부착하기 위한 반응성 기 또는 활성화된 기를 가져야 한다. 다른 구체예에서, 고체상 지지체는 유용한 크로마토그래피 지지체, 예를 들어 탄수화물 중합체인 SEPHAROSE.RTM., SEPHADEX.RTM., 또는 아가로오스일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 고체상 지지체는 특정 종류의 지지체로 제한되지 않는다. 오히려 다수의 지지체가 이용될 수 있으며, 당업자에게 공지되어 있다. 고체상 지지체는, 예를 들어 실리카겔, 레진, 유도체화된 플라스틱 필름, 유리 비드, 코튼, 플라스틱 비드, 알루미나 겔, 자석 비드, 멤브레인(제한은 아니지만 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 나일론, 및 글라스울(glass wool)을 포함한다), 플라스틱 및 유리 접시나 웰 등을 포함한다.
상기 설명된 연구 및 진단 키트를 이용하는 방법은 일반적으로 잘 공지되어 있으며, 키트의 사용을 위한 지시 매뉴얼에 일반적으로 제공된다.
실시예
실시예 1. 정상 인간 말초혈 B 세포의 시험관내 활성화
CD19+ 말초혈 유래 B 세포를 2가지 상이한 프로토콜을 사용해서 시험관내 활성화시켰는데, 제 1번은 IL-21, 항CD-40 및 항IgM의 조합을 사용했고, 제 2번은 포르말린 고정된 Staphylococcus aureus 박테리아(SAC)를 사용했다.
IL-21, 항CD40 및 항IgM에 의한 정제된 B 세포의 활성화에 의해 형질 세포가 생성되었으며, 이 중 일부에는 표면에 KMA가 발현되었다(KMA는 mKap [K121] 반응성에 의해 한정된다). 유세포분석기에 의한 KMA 발현 세포의 표현형 분석에 의해서 이들이 표면 IgD-, CD27++ 및 CD38++에 의해 한정되는 형질 세포의 하위군이라는 것이 밝혀졌다(도 1). 이들 KMA+/IgD-/CD27++/CD38++은 전체 CD38++ B 세포 중 약 12%이었다. 반대로, SAC 자극에 의해서는 형질 세포가 생성되지 않았다. 그러나, KMA 발현이 두 상이한 집단에서 발견되었는데, CD27++ 및 CD38low 형질모세포(CD38low 집단의 약 10%)와 CD27+/++ 및 CD38+ 형질모세포(CD38+ 집단의 약 14%; 도 2)가 그것이다.
실시예 2. 정상 인간 림프양 B 세포에서 KMA 의 생체내 발현
시험관내 활성화 시스템에서 얻어진 결과를 가지고, 본 발명자는 유사한 타입의 세포가 생체내에서 KMA를 발현하는지의 여부를 결정했다. 인간 편도선으로부터 얻은 단핵 세포를 B 세포 마커인 CD19, CD38 및 CD45와 함께 KMA 발현에 대해서 FACS로 분석했다.
본 발명자는 CD38++ 형질 세포 분획에서 KMA 발현 세포의 작은 집단을 발견했다(이소타입 대조군보다 약 7.8% 더 높음; 도 3a, 게이트 3). 흥미롭게도 이들 세포는 또한 미성숙 형질 세포 표현형인 CD45도 발현했다(도 3b).
KMA 발현 세포의 유세포분석 평가에 더하여, 정상 조직에 대해 면역조직화학(IHC) 연구를 수행했다. 정상 기증자로부터 얻은 동결보존된 미고정 조직 절편을 FITC 표지된 MDX1097(mKap 가변 도메인을 포함하는 인간-마우스 키메라 항체)로 염색한 다음, 마우스 항FITC 2차 및 염소 항마우스 퍼옥시다제로 염색했다. 크로마겐 기질로 슬라이드를 처리하고, 발현에 대해 분석했다.
MDX1097에 의한 정상 인간 조직의 IHC 염색은 편도선과 침샘에 형질 세포 및 형질모세포 형태(즉, 큰 세포질과 원형 핵을 가진 세포)의 KMA 양성 세포가 소수 존재함을 나타냈다. KMA로서 막 상에서 그리고 세포내에서 염색을 관찰한 바, 이들 세포는 자유 kLC의 큰 풀을 함유한다는 것을 나타냈다. 정상 말초혈에서는 KMA 발현 세포가 관찰되지 않았으며, 이로써 앞서의 결과가 확인되었다(도 4; Walker et al., 1985).
실시예 3. 활성화된 말초혈 B 세포에서 KMA 및 LMA 발현
C19+ 말초혈 B 세포를 오스트레일리아 적십자사로부터 얻은 기증자의 시료로부터 분리했다. 밀도 구배 원심분리하여 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 분리한 후, 자기 마이크로비드 및 MACS 분리 시스템 또는 autoMACS Pro 기기(Miltenyi Biotec, 독일)를 이용해서 CD19+ 세포를 정제했다. 37 ℃, 5% CO2에서 6~7일간 IL-21(1μg/mL; Invitrogen, USA), 항CD40 항체(10 μg/mL; R & D Systems, USA) 및 항IgM 항체(50 μg/mL; Sigma-Aldrich, USA)를 함유하는 배지 중에서 인큐베이션하여 CD19+ 세포를 활성화시켰다.
IL-21, 항CD40 및 항IgM으로 CD19+ 말초혈 B 세포를 활성화시킨 결과로서, KMA+ 및 LMA+ 세포가 생성되었다. KMA 및 LMA 발현 세포의 표현형은 CD27++, CD38++, CD45+ 및 IgD-이었고, 따라서 후기 형질모세포의 하위군에서 보였던 이전의 KMA 발현 결과가 확인되었다(CD45 발현은 앞서 조사되지 않았었다).
이 연구에서, KMA는 CD38++/CD27++/CD45+ 집단의 6~60%에서 관찰되었는데, 이것은 활성화된 CD19+ B 세포의 하위군의 약 14%에서 KMA 발현이 나타난 이전의 증거에 의해 뒷받침된다. LMA의 발현은 앞서 조사되지 않았으며, 우리는 시험관내 활성화된 CD19+ 세포에서 LMA의 존재/부재를 시험하고 싶었다. 이 연구에서는 CD27++, CD38++, CD45++ 및 IgD- 세포의 10~20%가 LMA를 발현했음이 입증되었다. 얻어진 결과를 표 1에 요약한다.
활성화된 형질모세포에서 KMA 및 LMA 발현의 요약
기증자 활성화 후 경과일 KMA 발현 LMA 발현
1 6 60.00% 20.80%
2 6 0.00%* 10.00%
3 7 12.54% 12.52%
4 6 6.12% 13.73%
5** 6 9.09% 0.00%
IL-21, 항CD40 및 항IgM 항체의 존재하에 말초 B 세포를 활성화시킨 후, KMA 및 LMA 발현을 조사했다. CD27++, CD38++, CD45+ 및 IgD- 세포 상에서 상기 나타낸 퍼센트로서 KMA 및 LMA가 검출되었다. 기증자 1~3의 경우 MACS 분리 시스템이 사용되었고, 기증자 4~5의 경우 autoMACS Pro 기기가 사용되었다.
* 유세포분석기 1회 동작에서 수집 회수 적음
** 생육성 낮음
고찰
표현형 분석과 형태학적 분석에서는, KMA와 LMA가 mFLC로서 정상 형질모세포와 미성숙 형질 세포의 하위군에서 발현된다는 것이 입증되었다. 이들 세포 타입은 항체 분비 세포 중 기능적으로 독특한 아집단이다(Shapiro-Shelef et al., 2005).
정상 면역반응 동안에는 항체 생산의 초기 단계가 대부분 형질모세포와 미성숙 형질 세포에 의해 좌우된다. 결국 이런 세포들은 마지막에 성숙 형질 세포로 분화되는데, 이들은 빠르게 사멸되거나, 또는 골수로 이주해서 골수 미소환경으로부터 생존 신호를 받아서 수명이 오래 지속된다(Manz et al., 1997).
많은 연구로 다양한 자가면역 병리현상에서 형질모세포와 형질 세포의 역할을 분석했다. 형질모세포와 미성숙 형질 세포는 모두 자가항체의 공급원이고, 성숙 형질 세포의 전구체이기 때문에, 이들은 수많은 자가면역 질환에서의 주된 이펙터 세포 타입의 일부인 것으로 생각된다. 예를 들어, 형질모세포와 미성숙 형질 세포의 관련성이 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 쇼그렌 증후군, 당뇨병 및 반응성 형질세포증가증에서 나타났다(Cepok et al., 2005; William et al., 2005; 및 Jego et al., 1999). KMA와 LMA가 mFLC로서 이들 세포 타입에서 특이적으로 발현된다면, KMA와 LMA는 다양한 자가면역 상태의 치료를 위한 매력적인 치료 표적이 된다.
실시예 4. mFLC 와 결합하는 항체에 의해 매개되는 직접적인 세포성 세포독성
4. 1증식 분석
세포 성장에 적합한 배지 및 조건에서 mFLC와 결합하는 다양한 농도의 항체와 함께 세포가 인큐베이션된다. 예로서, 항체는 1시간 내지 4일의 다양한 시간 길이 동안 37 ℃에서 5% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 세포와 함께 인큐베이션될 수 있다. 세포만의 경우와 비교해서, 항체 처리된 세포의 증식 상태가 세포 집단의 대사 건강성을 측정하는 시약을 사용하여 측정된다. 이러한 시약의 하나로서 MTS 용액(Promega, USA)이 있는데, 이것은 대사 활성 세포에 의해서 포르마잔으로 전환된다. 이 전환은 490nm에서 발생하는 흡광도와 연계되며, 이것은 흡광도 판독 기기에서 측정될 수 있다.
4.2 세포자살 분석
세포 성장에 적합한 배지 및 조건에서 다양한 농도의 항체와 함께 세포가 인큐베이션된다. 예를 들어, 세포는 37 ℃에서 4시간 동안 5% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 다양한 농도의 항체와 함께 인큐베이션된다. 세포만의 경우와 비교해서, 항체 처리된 세포의 세포자살 상태가 Annexin-V-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 또는 요오드화 프로피듐(PI) 시약을 사용해서 유세포분석기에서 조사된다. Annexin-V는 음으로 하전된 포스포리피드 포스파티딜세린(PS)과 결합하여, 세포자살 초기 단계에서 세포막의 내엽에서 외엽으로 재분포된다. 괴사성 세포가 PI에 의해 검출된다. 유세포분석기에서는 PI 및 FITC 형광이 측정되고, 이로써 세포자살성 세포와 괴사성 세포가 구별될 수 있다.
4.3 항체 교차결합
상기 설명된 것과 같은 세포 성장에 적합한 배지 및 조건에서 다양한 농도의 항체, 및 교차결합 시약과 함께 세포가 인큐베이션된다. 교차결합 시약은 세포 표적화에 사용된 항체와 결합하는 항체 제제이다. 예를 들어, 항KMA 또는 항LMA 항체가 인간 IgG1인 경우, 교차결합 항체는 인간 IgG1에 특이적인 다클론성 제제이다. 항체 교차결합은 항체의 직접적 세포독성 효과를 강화한다고 알려져 있다. 상기 설명된 증식 및 세포자살 분석 방법을 사용하여 표적 세포 증식에 대한 항체 교차결합의 효과가 측정된다.
실시예 5. mFLC 와 결합하는 항체에 의한 세포-매개 세포성 세포독성
5.1 항체 의존성 세포성 세포독성( ADCC )
ADCC 분석에서 사용되는 이펙터 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC) 제제이거나, 또는 PMBC 제제 내에 함유된 자연사멸(NK) 세포 또는 단핵구와 같은 특정 세포 집단이다. PBMC는 Ficoll 밀도 구배를 이용해서 혈액으로부터 분리된다. 혈액이 Ficoll 위에 놓이고, 이 구배가 원심분리되고, 구배의 계면으로부터 PBMC가 수집된다.
자성(magnetic) 표지된 항체 제제(Miltenyi Biotec, 독일)를 사용하여 원치 않는 세포를 고갈시킴으로써 상기한 대로 생성된 PBMC 제제로부터 특정 세포 집단이 분리된다. 예를 들어, PMBC 제제로부터 비NK 세포를 고갈시키는 자성 표지된 항체 칵테일을 사용하여 NK 세포가 분리된다. 자성 표지된 세포는 보유되고(AutoMacs Pro 기기, Miltenyi Biotec, 독일), NK 세포가 수집된다.
ADCC 분석에서, 다양한 농도의 항체로 코팅된 이펙터 세포와 표적 세포가 다양한 이펙터 세포:표적 세포 비율로 혼합되고, 이 혼합물이 세포 성장에 적합한 조건에서 적합한 배지 중에서 인큐베이션된다. 예를 들어, 혼합물은 37 ℃에서 16시간 동안 10% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 중에서 인큐베이션될 수 있다. 분석 마지막에 세포의 용해 정도가 측정된다. 예를 들어, 세포 용해 지시자로서 세포내 락테이트 디히드로게나제(LDH) 방출 수준이 CytoTox-ONE 균질 막 통합 분석 키트(Promega, USA)를 사용하여 측정된다.
5.2 항체 의존성 세포성 포식작용( ADCP )
ADCD 분석에서 포식작용성 이펙터 세포가 시험관내 생성된다. PMBC 제제를 사용해서, 자성 표지된 항체 칵테일 및 AutoMacs Pro 기기(Miltenyi Biotec, 독일)의 사용을 통해 비단핵구성 세포를 고갈시켜서 단핵구를 분리한다. 정제된 단핵구가 배양 및 단핵구의 대식세포로의 분화에 적합한 배지 중에서 시험관내 배양된다.
공초점 현미경을 이용한 세포 상호작용 연구에 적합한, 세포 부착을 지지하는 배양 챔버에 대식세포가 평판된다. pH 감응성인 pHRodo(Invitrogen, USA)와 같은 형광 염료로 표적 세포가 염색되고, 다양한 농도의 항체로 코팅되어, 대식세포를 함유하는 챔버에 놓는다. pHRodo 염료의 형광 스펙트럼이 일단 변화되면, 산성 pH에 노출된다. 적합한 조건에서 세포 혼합물이 인큐베이션된다. 예를 들어, 37℃에서 2시간 동안 10% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 1640 중에서 세포 혼합물이 배양될 수 있다. 분석 마지막에 미결합 세포는 세척되고, 대식세포가 대식세포의 표면에서만 발현되는 마커에 특이적인 형광 콘쥬게이션된 항체로 염색된다. 마지막으로, 공초점 현미경을 사용하여 세포가 분석된다.
세포막의 특이적 표지화로 인하여 나타나는 형광을 통해서 대식세포가 확인된다. 표적 세포를 섭취한 대식세포는 세포막의 염색에 더하여, 세포의 산성 엔도솜 내에 pHRodo 염료에 의해서 부여되는 형광을 나타낸다. 현미경 시야 내에 보이는 특정 개수, 총 세포수 및 포식작용성 세포수를 계수함으로써 포식작용이 측정된다.
5.3 보체 의존성 세포독성( CDC )
세포 성장을 지원하는 조건에서 보체(정제된 것 또는 보체를 함유하는 인간 혈청) 및 항체의 존재하에 표적 세포가 인큐베이션된다. 예를 들어, 37 ℃에서 30분 내지 12시간 동안 10% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 중에서 보체 및 항체의 존재하에 표적 세포가 인큐베이션될 수 있다. 분석 마지막에 세포의 용해 정도 또는 세포의 대사상태(세포 성장을 반영한다)가 측정된다. 세포 용해는 상기 5.1 절에 설명된 방법에 의해 측정된다. 세포의 대사상태는 알라마르 블루(Invitrogen, USA)와 같은 시약을 사용하여 측정된다. 알라마르 블루 첨가 후, 보체 및 항체 처리된 세포 혼합물에서 검출되는 형광은 생육성 세포의 수에 비례한다.
본원에서 논의되고/논의되거나 참조된 모든 간행물은 그 전체가 본원에 포함된다.
특정 구체예로서 나타낸 본 발명에 대해서, 광의의 범위로 설명된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 많은 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 구체예는 모든 면에서 예시적인 것이지 제한적인 것은 아니라고 간주되어야 한다.
본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 관한 논의는 오직 본 발명의 배경을 제공하기 위한 것이다. 선행 기술 내용 부분은 일부든 전부든, 본 출원의 각 청구항의 우선일 전에 이미 존재했지만, 그 때문에 선행 기술 내용이 본 발명이 관련된 분야의 공통된 일반적인 기술이거나 그것의 기초가 되었다고 인정되는 것은 아니다.
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Claims (25)

  1. 막 결합 자유 경쇄(mFLC)와 결합하는 항체의 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 피험자에서 B 세포 매개 면역 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항체는 형질 세포 전구체 상의 mFLC와 결합하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항체는 세포독성 부분 또는 생물학적 반응 변형제와 콘쥬게이션되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 세포독성 부분은 독소, 화학치료제 또는 방사성 제제인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 세포독성 부분은 세포독성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 생물학적 반응 변형제는 림포카인, 사이토카인, 또는 인터페론인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 KMA 또는 LMA와 결합하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항체는 KMA와 결합하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항체는 K121 유사 항체인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 항체는 서열번호 1에 제시된 VH 영역과 서열번호 2에 제시된 VL 영역을 포함하거나, 또는 카파 골수종 항원(KMA)과의 결합에 있어서 서열번호 1에 제시된 VH 영역과 서열번호 2에 제시된 VL 영역을 가진 항체와 경쟁하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 LMA와 결합하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포 매개 면역 장애는 자가면역 질환인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 당뇨병 및 다발성 경화증으로부터 선택되는 방법.
  14. mFLC와 결합하는 항체의 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 피험자에서 형질 세포 전구체의 성장을 저해하거나 또는 사멸시키는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항체는 세포독성 부분 또는 생물학적 반응 변형제와 콘쥬게이션되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 세포독성 부분은 독소, 화학치료제 또는 방사성 제제인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 세포독성 부분은 세포독성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 생물학적 반응 변형제는 림포카인, 사이토카인 또는 인터페론인 방법.
  19. mFLC와 결합하는 항체를 피험자에게 투여하는 단계, 항체가 피험자 내의 세포와 결합되도록 하는 단계, 및 피험자 내 항체의 위치를 결정하는 단계를 포함하는, 피험자에서 형질 세포 전구체를 국소화하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 항체가 검출 가능하게 표지되는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, mFLC와 결합하는 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체인 방법.
  22. B 세포 매개 면역 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서 mFLC와 결합하는 항체의 용도.
  23. 피험자에서 자가 조혈세포 이식을 위한 방법으로서,
    (i) 피험자로부터 조혈 선조세포 집단을 제거하는 단계,
    (ii) mFLC와 결합하는 항체로 세포 집단을 처리하는 단계, 및
    (iii) 피험자에게 단계 (ii)의 처리된 세포 집단을 이식하는 단계
    를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 방법은 피험자에게 mFLC와 결합하는 항체를 정맥내 주입하는 단계를 더 포함하는 방법.
  25. 제24항 또는 제25항에 있어서, 자가 이식 방법은 세포축소 요법 동안 또는 이후에 피험자에서 수행되는 방법.
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