JP5507086B2 - ヒト胚性幹細胞の方法及びｐｏｄｘｌの発現 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、試料中の未分化型ヒト胚性幹細胞を同定し、試料からその細胞を単離する方法、及び試料中でそのような細胞を枯渇させる方法に関する。本発明は、そのような方法において有用なキットにも関する。

未分化型ヒト胚性幹細胞は、医学において、例えば組織の再生及び修復において様々な用途を有し、将来はますます重要になると考えられる。今日、提供された臓器及び組織は、病的な状態にあるか、又は破壊された組織を置換するのに用いられることが多いが、移植可能な組織及び臓器に対する必要性は、入手可能な供給をはるかに上回っている。幹細胞、特にヒト胚性幹細胞は、特定の細胞型に分化するように誘導することができ、パーキンソン病及びアルツハイマー病、脊髄損傷、脳卒中、火傷、心臓疾患、糖尿病、骨関節炎、並びに関節リウマチを含めた疾患を治療するための、置換細胞及び組織の再生可能な供給源の可能性を提供している。

現在、ヒト胚性幹細胞を同定するのに用いられている試験には、以下のものが含まれている。

数カ月間の幹細胞の増殖及び継代培養。これにより、細胞が確実に長期間自己複製可能になる。細胞が健常に見え、未分化のままでいることを調べるために、培養物を顕微鏡によって検査する。

未分化型の細胞上だけに見出される表面マーカーの存在を決定するための特定の技術の使用。別の重要な試験は、未分化型の細胞が通常作製するＯｃｔ−４と呼ばれるタンパク質の存在に対するものである。Ｏｃｔ−４は、適切な時点に遺伝子のスイッチをオン及びオフにするのを助けることを意味する転写因子であり、これは細胞の分化及び胚の発生のプロセスの重要な部分である。

１）細胞培養物において細胞を自発的に分化させ、２）細胞が特定の細胞型へ分化するように操作し、又は３）奇形腫と呼ばれる良性腫瘍の形成について試験するために免疫抑制したマウス中に細胞を注射することによる、ヒト胚性幹細胞が多能性であるか否かの試験。奇形腫は、通常、多くの分化型、又は部分的に未分化型の細胞型の混合物を含んでおり、これは胚性幹細胞が、多数の細胞型に分化することができることを示すものである。

未分化型ヒト胚性幹細胞自体を細胞治療に用いることができるが、ヒト胚性幹細胞と比較すると、分化を開始した細胞又は分化している細胞を用いることが有益であると考えられている。未分化型ヒト胚性幹細胞の、特定の細胞系譜への分化を促す方法は、当技術分野ではよく知られている。この分化プロセスが開始し、又は進行した後は、他の場合には望ましくない奇形腫を形成し得る未分化型ヒト胚性幹細胞を除去又は破壊することが有益である。

したがって、（未分化型ヒト胚性幹細胞はそれ自体治療で用いることができ、又は治療で用いることができる特定の細胞系譜への分化を促し得るので、）未分化型ヒト胚性幹細胞を同定又は単離することは有用であると考えることができる。これらの分化型細胞は治療において有用であるので、いくつかの細胞が分化を開始し、又は分化している場合に、細胞の混合物から未分化型ヒト胚性幹細胞を除去又は破壊することも有用である。

未分化型ヒト胚性幹細胞を同定するさらなる方法が、依然として必要とされている。本発明者らは、現在、ポドカリキシン様タンパク質−１前駆物質が、未分化型ヒト胚性幹細胞のマーカーであることを見出している。

本明細書において、以前に公開された文書について列挙し又は論じることを、文書が最新技術の部分又は共通の一般的知識であるということを認めるものとして理解する必要はない。

本発明の第１の態様は、未分化型ヒト胚性幹細胞を含む可能性がある試料中で未分化型ヒト胚性幹細胞を同定する方法を提供し、この方法は、ポドカリキシン様タンパク質−１前駆物質（ＰＯＤＸＬ）を表面上に発現する１つ又は複数の細胞を試料内で同定するステップを含む。

この方法を用いて、特定の試料が未分化型ヒト胚性幹細胞を含むか否かを評価し、含む場合は未分化型ヒト胚性幹細胞の数を評価することができる。したがって、本発明は、未分化型ヒト胚性幹細胞の定量を含む。

本発明の第２の態様は、未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料から未分化型ヒト胚性幹細胞を単離する方法を提供し、この方法は、ＰＯＤＸＬを表面上に発現する１つ又は複数の細胞を試料内で単離するステップを含む。

濃縮又は実質的に単離された、未分化型ヒト胚性幹細胞の組成物を提供するのに、この方法を用いることができる。このような組成物を様々な方法において用いることができ、例えば、それ自体を以下でより詳しく論じる細胞治療で用いることができ、又は次いで特定の治療に有用である特定の細胞系譜に分化することを促す細胞の供給源として用いることができ、又はヒト胚性幹細胞が他の細胞に分化するのを可能にする因子を（ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで）調査するのに用いることができる。

通常、濃縮したヒト胚性幹細胞の組成物は、未分化型ヒト胚性幹細胞として少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の細胞を含む。組成物における細胞が全て、前記未分化型ヒト胚性幹細胞であることが好ましい。

本発明の第３の態様は、未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料から未分化型ヒト胚性幹細胞を除去する方法を提供し、この方法は、ＰＯＤＸＬを表面上に発現する１つ又は複数の細胞を試料から除去するステップを含む。

除去された細胞は、本発明の第２の態様におけるヒト胚性幹細胞の組成物を形成することができる。また、そこからヒト胚性幹細胞が除去された試料は、以下でより詳しく論じる治療において有用であり得る。

本発明の第４の態様は、未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料中で未分化型ヒト胚性幹細胞を破壊する方法を提供し、この方法は、試料中の、ＰＯＤＸＬを表面上に発現する１つ又は複数の細胞を破壊するステップを含む。

試料中の未分化型ヒト胚性幹細胞を破壊し又は死滅させることは有用である、というのは、以下で論じるように、未分化型及び分化型の細胞の混合物から未分化型ヒト胚性幹細胞を除去することが時に有益であるからである。

試料は、１つ又は複数の未分化型ヒト胚性幹細胞を含む、又は含むことが疑われる任意の試料であってよい。適切な試料には、ヒト胚又はヒト胚組織が含まれる。他の適切な試料には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた細胞の試料が含まれる。

本発明の第３及び第４の態様に関しては、試料は、未分化型ヒト胚性幹細胞が特定の細胞系譜に分化するよう促されて（又は促進されて）いる試料であることが特に好ましく、したがって試料は未分化型及び分化型の細胞の混合物を含んでいてもよい（なぜなら、分化は現在、効率的なプロセスではないからである）。通常、そのような試料では、未分化型ヒト胚性幹細胞は細胞の総数の数％を構成している。通常、試料における分化型細胞は、ヒト胚性幹細胞に（分化によって）由来している、心筋細胞、膵島、神経前駆細胞、又は間葉細胞であってよい。

このような試料から（又はこのような試料中の）、未分化型ヒト胚性幹細胞を除去（又は破壊）することは、未分化型細胞を含んでいる試料を臨床的に適用するのに先だって有用である、というのは、未分化型細胞は、潜在的に、望ましくない奇形腫を形成し得るからである。通常、少なくとも９５％の未分化型ヒト胚性幹細胞を除去又は破壊する。前記細胞を全て除去又は破壊することが好ましい。

試料における未分化型細胞の破壊又は死滅は、細胞のプロセシング又は分離におけるさらなるステップを最小にするように、それらを除去するのに好ましい。また、死滅は、細胞を除去する、より「絶対的な」形態であり得ると考えられている。

ポドカリキシン様タンパク質１前駆物質のアミノ酸配列を図９Ｂ（配列番号１）に示し、該アミノ酸配列は、ＥｎｔｒｅｚＰｕｂＭｅｄによってアクセス可能なＮＣＢＩタンパク質配列データベースのアクセッション番号Ｏ００５９２においても見られる（Ｋｅｒｓｈａｗら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、１５７０８〜１５７１４頁も参照されたい）。これはＰＣＬＰ１及びＰＯＤＸＬとも呼ばれている。便宜上、以下ではこれをＰＯＤＸＬと呼ぶ。本発明の方法で用いられるマーカーは、天然では未分化型ヒト胚性幹細胞に見られるＰＯＤＸＬであることが理解されよう。したがって、ＰＯＤＸＬは図９Ｂに示す正確な配列を有してもよく、又は天然に存在するその変異体であってもよい。例えば、Ｏ００５９２によると、Ｒは残基６２のＴに対する変異体であり、Ｓは残基１９６におけるＬの変異体である。

本発明の第１、第２、及び第３の態様の特に好ましい一実施形態では、試料が、ＰＯＤＸＬに結合する結合部分と接触し、前記ヒト胚性幹細胞が、結合部分に結合することによって試料中で同定され、又は試料から単離され、又は試料から除去される。

Ｏ００５９２によると、ＰＯＤＸＬは５２８残基のグリコシル化した細胞表面ポリペプチドであり、その残基１〜２２はシグナルペプチドであり、残基２３〜５２８は成熟タンパク質を表している。残基２３〜４３１はタンパク質の細胞外部分であると考えられており、残基４３２〜４５２は膜貫通領域である。

残基２３〜３０４はＳｅｒ／Ｔｈｒリッチな領域を表す。ＰＯＤＸＬに結合する結合部分がＰＯＤＸＬの細胞外領域に結合する場合、例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒリッチな領域内、又はこの領域の外部が好ましい。

好都合には、前記結合部分は、その用語にその断片若しくは誘導体が含まれる抗体、又は合成の抗体、又は合成の抗体断片である。

ＰＯＤＸＬに結合する抗体はすでに知られている。例えば、ポリクローナル抗血清が細胞外ドメインに結合する、ヒトポドカリキシンに特異的なヤギＩｇＧは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃより、カタログ番号ＡＦ１６５８の下に入手可能である。また、モノクローナル抗ヒトポドカリキシン抗体（マウスＩｇＧ_２Ａ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃより、カタログ番号ＭＡＢ１６５８の下に入手可能である。いずれの場合も、モノクローナル抗体技術に関する今日の技術で、殆どの抗原に対して抗体を調製することができる。抗原結合部分は、抗体の一部分（例えば、Ｆａｂ断片）又は合成の抗体断片（例えば、単鎖Ｆｖ断片［ＳｃＦｖ］）であってよい。選択された抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、知られている技術、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）及び「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２年）」に開示されている技術によって調製することができる。

キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８８年、第８回Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ パート２、７９２〜７９９頁）によって論じられている。

ポリクローナル抗体は、本発明の方法において有用である。単一特異性ポリクローナル抗体が好ましい。適切なポリクローナル抗体は、当技術分野ではよく知られている方法を用いて調製することができる。

遺伝子操作した抗体及び抗体断片を用いることができるのと同様に、Ｆａｂ及びＦａｂ_２断片などの抗体の断片を用いてもよい。

抗体の可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインは抗原の認識に関与するが、これは初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識される事実である。さらなる確認は、齧歯動物抗体の「ヒト化」によって見出された。齧歯動物由来の可変ドメインは、得られた抗体が齧歯動物を親とする抗体の抗原特異性を保持するように、ヒト由来の定常領域と融合することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻、６８５１〜６８５５頁）。

抗原特異性は、可変ドメインによって付与され、定常ドメインとは独立していることは、全てが１つ又は複数の可変ドメインを含んでいる抗体断片の細菌の発現に伴う実験から知られている。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０４１頁）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８頁）；柔軟性のオリゴペプチドによってＶ_Ｈ及びＶ_Ｌパートナードメインが連結している単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３頁；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、５８７９頁）、並びに単離されているＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁）が含まれる。その特異的な結合部位を保持する抗体断片の合成に関わる技術の一般評論は、Ｗｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３４９巻、２９３〜２９９頁に見られる。

「ＳｃＦｖ分子」とは、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌパートナードメインが、柔軟性のオリゴペプチドによって連結している分子を意味する。

Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｄＡｂ抗体断片は、全て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ、大腸菌から分泌させることができ、したがって大量の前記断片が容易に生成できるようになる。

抗体全体、及びＦ（ａｂ’）_２断片は「２価」である。「２価」とは、前記抗体及びＦ（ａｂ’）_２断片が２個の抗原結合部位を有することを意味する。それとは対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｄＡｂ断片は１価であり、抗原結合部位を１個だけ有する。

ＰＯＤＸＬに結合する合成の抗体は、当技術分野ではよく知られている、ファージディスプレイ技術を用いて作製してもよい。

本発明の方法及びキットで用いるための特に好ましい抗ＰＯＤＸＬ抗体を、以下により詳しく記載する。

通常、未分化型ヒト胚性幹細胞を同定する方法では、結合部分は検出可能に標識されており、又は少なくとも検出可能である。例えば、結合部分は、放射性原子、又は着色した分子、又は蛍光分子、又は任意の他の方法で容易に検出することができる分子で標識されている。結合部分は、検出可能な標識で直接標識されていてもよく、又は間接的に標識されていてもよい。例えば、結合部分は、それ自体が標識されている別の抗体によって検出され得る非標識の抗体であってよい。或いは、第２の抗体は、ビオチンに結合していてよく、標識されているストレプトアビジンのビオチンへの結合を用いて第１の抗体を間接的に標識している。

好ましい一実施形態では、本発明は、未分化型ヒト胚性幹細胞を含む可能性がある試料中の未分化型ヒト胚性幹細胞を同定する方法を含み、この方法は、試料を、前記細胞の表面上のＰＯＤＸＬに結合する結合部分（例えば抗体）と接触させ、結合部分（例えば抗体）を細胞の表面上のＰＯＤＸＬに結合させ、どの細胞がそれに結合する結合部分（例えば抗体）を有するかを決定することを含む。

通常、未分化型ヒト胚性幹細胞を単離する方法では、ヒト胚性幹細胞を親和性結合によって単離できるように、結合部分が固体支持体上に固定化されている。好都合には、固体支持体は、アガロース、アクリルアミド、セファロース（商標）、及びセファデックス（商標）などの任意の適切なマトリックスを含む。固体支持体は、マイクロタイタープレートなどの固体の基体であってもよい。

有利には、結合部分は、ヒト胚性幹細胞が結合している場合に、適切な磁場が提供されたときに、残りの試料から分離できるように磁気的に標識されている（直接的又は間接的のいずれかで）。磁気の細胞分離に用いられるマイクロビーズは、しばしば、ＭＡＣＳコロイド超常磁性マイクロビーズと呼ばれる。

この方法で標識されたヒト胚性幹細胞は、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）によって選別され得る。

適切には、結合部分を蛍光分子で標識し（直接的又は間接的のいずれかで）、ヒト胚性幹細胞を、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて単離する。

好ましい一実施形態では、本発明は、未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料から未分化型ヒト胚性幹細胞を単離する方法を含み、この方法は、前記細胞の表面上でＰＯＤＸＬに結合する結合部分（例えば抗体）と試料を接触させるステップと、結合部分（例えば抗体）を細胞の表面上のＰＯＤＸＬに結合させるステップと、試料の残りから結合部分−細胞結合体を分離するステップと、場合により、結合部分から細胞を放出するステップを含む。

本発明の第４の態様の特に好ましい一実施形態では、前記未分化型ヒト胚性幹細胞が、ＰＯＤＸＬに結合する結合部分に結合することによって破壊される。結合部分が抗体であると好都合である。

抗体は、それ自体が、未分化型ヒト胚性幹細胞の死滅をもたらすことがある。例えば、細胞表面上のＰＯＤＸＬに抗体が結合することにより、細胞透過性の増大（ヨウ化プロピジウム／トリパンブルーなどの色素に対する透過性亢進から明らかなように）、及び細胞の収縮がもたらされ得る。或いは、抗体（又は他の結合部分）は、細胞毒性部分にさらに連結することがあり、連結した抗体が細胞に結合した場合に前記細胞を破壊することができる。

抗体又は他の結合部分に連結することができる適切な細胞毒性部分には、放射性原子、細胞毒性薬物、細胞毒性タンパク質、及びプロドラッグを細胞毒性薬物に変換する酵素系が含まれる。これらは、当技術分野ではよく知られている。

好ましい一実施形態では、本発明は、未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料中で未分化型ヒト胚性幹細胞を破壊する方法を含み、この方法は、試料を前記細胞に対して毒性である結合部分（例えば抗体）と接触させるステップと、前記細胞の表面上のＰＯＤＸＬに結合部分（例えば抗体）を結合させるステップと、結合部分に前記細胞を死滅させるステップとを含む。結合部分は、それ自体が前記細胞に対して細胞毒性である抗体であってもよく、又は細胞に対して毒性であるさらなる部分を含んでいてもよい。

前述から、本発明は、未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料中で未分化型ヒト胚性幹細胞を同定するための、ＰＯＤＸＬに結合する部分の使用；未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料から未分化型ヒト胚性幹細胞を単離するための、ＰＯＤＸＬに結合する部分の使用；未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料から未分化型ヒト胚性幹細胞を除去するための、ＰＯＤＸＬに結合する部分の使用；未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料中で未分化型ヒト胚性幹細胞を破壊するための、ＰＯＤＸＬに結合する部分の使用も含むことが理解されよう。

好ましくは、結合部分が抗体である。

本発明は、検出可能な標識をさらに含むＰＯＤＸＬに結合する部分も提供する。本発明は、細胞毒性部分をさらに含むＰＯＤＸＬに結合する部分も提供する。結合部分が抗体であることが好ましい。

本発明のさらなる一態様は、ＰＯＤＸＬに結合する部分、及び他のヒト胚性幹細胞マーカーを検出するさらなる作用物質を含むパーツのキットを提供する。他のヒト胚性幹細胞マーカーが、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−ｌ−８１、及びＧＣＴＭ−２のいずれかであることが好ましい。他のヒト胚性幹細胞マーカーが、ｍＡｂ５、ｍＡｂ８、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ６３、ｍＡｂ８４、ｍＡｂ８５、ｍＡｂ９５、ｍＡｂ３７５、ｍＡｂ４３２、及びｍＡｂ５２９のいずれかをさらに含むことがさらに好ましい。

通常、キットは、ＰＯＤＸＬに対する抗体、並びにＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びＧＣＴＭ−２の１つ又は複数に対する抗体を含む。通常、キットは免疫化学において使用するための試薬；支持体に固定化された抗体；抗体を標識するための手段；抗体を細胞毒性部分に連結するための手段も含んでいてよい。

本発明の全ての実施形態に対して、抗体が選択的であることが好ましいことが理解されよう。したがって、ＰＯＤＸＬに対する抗体はＰＯＤＸＬに選択的に結合し、即ち、他のヒトタンパク質よりも大きな親和性でＰＯＤＸＬに結合することが好ましい。通常、抗ＰＯＤＸＬ抗体は、実質的に他のヒトタンパク質には結合しない。さらに、本発明の実践において有用な抗ＰＯＤＸＬ抗体を、以下により詳しく記載する。

本発明は、本発明の第２の態様の方法によって単離された、未分化型ヒト胚性幹細胞（又は、このような細胞について濃縮された組成物）も提供する。本発明は、その表面上にＰＯＤＸＬを発現する、単離された未分化型ヒト胚性幹細胞も含む。通常、単離されたヒト胚性幹細胞、又はヒト胚性幹細胞について濃縮された組成物は、薬剤組成物として提供される。

したがって、本発明は、本発明の第２の態様の方法を実施し、例えば、適切な滅菌パイロジェンフリー試薬を用いることによりそれを薬剤組成物に調製することによって、ヒト胚性幹細胞の薬剤組成物を製造する方法を含む。

単離又は濃縮された未分化型ヒト胚性幹細胞を、細胞治療を必要とする患者を治療するのに用いることができる。通常は医師の監督の下に、有効量の細胞を患者に投与することができる。

本発明は、（未分化型ヒト胚性幹細胞の分化を促進することによって作製された）分化型細胞を含むが、本発明の第３又は第４の態様の方法を用いて未分化型ヒト胚性幹細胞を枯渇させた組成物も提供する。本発明は、未分化型ヒト胚性幹細胞から分化した細胞を含む組成物も提供し、この組成物は、表面上にＰＯＤＸＬを発現する未分化型ヒト胚性幹細胞を実質的に含まない。

これらの組成物は、通常、薬剤組成物として提供される。このように、本発明は、上記に記載した分化型細胞を含む（が未分化型ヒト胚性幹細胞の枯渇した）組成物を提供し、それを薬剤組成物に調製することにより、薬剤組成物を作製する方法を含む。

分化型細胞を含むが未分化型ヒト胚性幹細胞の枯渇した（未分化型ヒト胚性幹細胞がないことが好ましい）組成物は、細胞治療を必要とする患者を治療するのに有用である。通常は医師の監督の下に、有効量の組成物を患者に投与することができる。

細胞又は組成物での治療に適する状態には、パーキンソン病及びアルツハイマー病、脊髄損傷、脳卒中、火傷、心臓疾患、骨関節炎、並びに関節リウマチが含まれる。

ｍＡｂ８４のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖のアミノ酸配列（及びコードするポリヌクレオチド配列）は、図１１及び１２に示すように決定されている。

したがって、本発明のさらなる一態様は、アミノ酸配列ｉ）からｉｉｉ）、又はアミノ酸配列ｉｖ）からｖｉ）、又は好ましくはアミノ酸配列ｉ）からｖｉ）を含む抗ＰＯＤＸＬ抗体：
ｉ） ＳＡＳＳＳＶＮＹＭＹ （配列番号２）
ｉｉ） ＤＴＳＮＬＡＳ （配列番号３）
ｉｉｉ） ＱＱＷＳＳＹＰＹＴ （配列番号４）
ｉｖ） ＮＹＷＭＮ （配列番号５）
ｖ） ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ （配列番号６）
ｖｉ） ＥＲＡ （配列番号７）
或いはその変異体であって、配列（ｉ）から（ｖｉ）の１つ又は複数における１個若しくは２個若しくは３個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている変異体を提供する。

抗体が、所与の特定のアミノ酸配列を含むことが好ましい。通常、所与のアミノ酸配列における変動が存在する場合、それは、配列（ｉ）から（ｖｉ）の１個又は２個又は３個又は４個における１個又は２個のアミノ酸置換である。通常、変異体は、配列（ｉ）から（ｖｉ）の１個又は２個において１個又は２個のアミノ酸置換を有する。好都合には、アミノ酸配列（ｉ）から（ｖｉ）の１個又は２個において１個のアミノ酸置換が存在する。いずれにしても、抗体はＰＯＤＸＬに結合する能力を保持している。

抗体がＰＯＤＸＬの細胞外領域に選択的に結合することが好ましく、ＰＯＤＸＬに対する選択的結合は、これらのアミノ酸配列の存在によって付与される。

抗体が、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１： ＳＡＳＳＳＶＮＹＭＹ （配列番号２）
ＣＤＲ２： ＤＴＳＮＬＡＳ （配列番号３）
ＣＤＲ３： ＱＱＷＳＳＹＰＹＴ （配列番号４）
を組み入れている少なくとも１個の軽鎖可変領域を有することが好ましい。

抗体が、図１１（配列番号８）に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１個の軽鎖可変領域を有することがより好ましい。

抗体が、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１： ＮＹＷＭＮ （配列番号５）
ＣＤＲ２： ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ （配列番号６）
ＣＤＲ３： ＥＲＡ （配列番号７）
を組み入れている少なくとも１個の重鎖可変領域を有することが好ましい。

抗体が、図１２（配列番号１０）に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１個の重鎖可変領域を有することがより好ましい。

抗体が、上記で定義した少なくとも１個の軽鎖可変領域、及び上記で定義した少なくとも１個の重鎖可変領域を有することが、さらにより好ましい。

抗体が、図１１（配列番号８）に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１個の軽鎖可変領域、及び図１２（配列番号１０）に示すアミノ酸配列を含む少なくとも１個の重鎖可変領域を有することが最も好ましい。

しかし、上記に列挙したｍＡｂ８４の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ１〜３は、図１１及び１２に示したもの以外のフレームワーク領域と接合するのにも特に有用であり得ることが理解される。したがって、一実施形態では、上記に列挙したｍＡｂ８４のＣＤＲ１〜３を有する軽鎖及び重鎖は、代替のフレームワーク領域を保有することができる。適切なフレームワーク領域は、当技術分野ではよく知られており、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Ｍ．Ｌｅｆｒａｎｃ及びＧ．Ｌｅｆｒａｎｃ（２００１年）「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。

抗体は検出可能に標識されていてよく、又は上記に記載したように細胞毒性部分で標識されていてもよい。抗体は、本発明の第１、第２、第３、又は第４の態様のいずれかの方法で用いることができ、パーツのキットで用いることもできる。

ＣＤＲ配列は、合成抗体及び上記で論じた抗体断片の産生に用いることができることが理解されよう。

本発明のさらなる態様は、上記で述べた抗体をコードするポリヌクレオチド、又は、このような抗体のＶ_Ｌ若しくはＶ_Ｈ鎖の一方又は両方を含む分子を提供する。ｍＡｂ８４のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ、図１１（配列番号９）及び図１２（配列番号１１）に示す。

本発明は、抗体を発現するのに必要とされる１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。通常、宿主細胞は、細菌、酵母菌、又は哺乳動物の細胞である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、抗体の生成に特に適している。

次に、本発明を以下の図及び実施例を参照して記載する。

実施例１：ポドカリキシン様タンパク質を標的とするモノクローナル抗体は、未分化型ヒト胚性幹細胞に結合し、死滅させる
［導入］
胚盤胞の内部細胞塊に由来する、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、未分化型の状態で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで無限に増殖する能力を有する多能性幹細胞である。好適な条件下では、ｈＥＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで３つの胚葉全て（中胚葉、内胚葉、及び外胚葉）を代表する細胞型に分化することもできる。形態学的には、この細胞は、細胞質に対する核の比が大きく、明瞭なコロニーとして成長する。この細胞は、また、アルカリホスファターゼ、テロメラーゼ、並びに転写因子Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇを高レベルで発現する［１−４］。日常的には、ｈＥＳＣは、発生期特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）−３、及びＳＳＥＡ−４、腫瘍拒絶抗原（Ｔｒａ）−１−６０及びＴｒａ−１−８１を含めた細胞表面マーカーの発現を特徴とする。しかし、これらの表面抗原は、ｈＥＳＣに独特ではなく、以前には、ヒト胚性癌（ＥＣ）細胞において特徴付けられていた［５、６］。さらに、これらの抗原を標的にするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、ヒトＥＣ細胞及びマウス胚に対して産生された。

現在まで、Ｓｏｎ及び仲間だけが、細胞表面マーカーに対してｍＡｂを産生するための免疫原としてのｈＥＳＣの使用を記載していた［７］。ｈＥＳＣ表面マーカーに特異的なｍＡｂを産生することは重要である、というのはそのｍＡｂを産生することにより、発現が未分化型ｈＥＳＣに限られている新規な抗原を同定することが可能になるからである。発生及び多能性におけるこれらの様々な細胞表面抗原の役割／メカニズムを解明すれば、幹細胞の制御の理解に貢献するであろう。ｈＥＳＣ表面に特異的なｍＡｂを有することに対する別の利点は、治療前にこのｍＡｂを細胞分離プロセスに組み入れる能力である。ｈＥＳＣが特定の系譜の細胞に分化した後、集団から、残りの未分化型ｈＥＳＣを排除することが重大である、というのは、これらの細胞は、移植後のｉｎ ｖｉｖｏでの奇形腫の形成を潜在的にもたらすからである［８、９］。

この研究では、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを生存ｈＥＳＣで免疫感作した後、１パネルの１０ｍＡｂを産生した。これらのｍＡｂは、未分化型ｈＥＳＣ系に対して強力な反応性を示したが、ｈＥＳＣ由来の胚様体、マウス胚性幹細胞、マウスフィーダー、ヒトＥＣ細胞、及び他のヒト細胞系において反応性が低減し、又はなかった。興味深いことに、クローンの１つであるｍＡｂ８４は、ポドカリキシン様タンパク質−１（ＰＯＤＸＬ）と反応し、インキュベートの１５〜３０分以内に、濃度依存的及び補体非依存的に未分化型ｈＥＳＣと結合するだけではなく、それをやはり死滅させる。細胞毒性は、未分化型の表現型に限られていたが、ｈＥＳＣの分化は、このｍＡｂによる死滅の効率における低減をもたらした。ｍＡｂ８４は、未分化型ｈＥＳＣに対して選択性があるので、分化型の細胞型の移植前に残余のｈＥＳＣを除去又は死滅させるのに用いることができた。我々の知る限りでは、これは、細胞毒性のｍＡｂが未分化型ｈＥＳＣを特異的に標的にする最初の報告である。

［材料と方法］
細胞培養
ヒト胚性幹細胞細胞系ＨＥＳ−２（４６Ｘ，Ｘ）、ＨＥＳ−３（４６Ｘ，Ｘ）、及びＨＥＳ−４（４６Ｘ，Ｙ）を、ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得た。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で、ゼラチンコーティングした器官培養皿（同時培養）中マイトマイシンＣで不活化したフィーダー（約７×１０^４細胞／ｃｍ^２）上、又は不死化したマウスフィーダーからの条件培地を補ったマトリゲルコーティングした器官培養皿であるＥ−ＭＥＦ（フィーダーフリー培養物）上のいずれかで培養した［１］。ＨＥＳ細胞を培養するのに用いた培地は、ＨＥＳ培地、又はＫＮＯＣＫＯＵＴ（ＫＯ）培地のいずれかであった。ＨＥＳ培地は、２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、インスリン−トランスフェリン−セレン溶液１０ｍｌ／培地１Ｌ、ペニシリン２５Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン酸２ｍＭ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）０．１ｍＭ、及び２−メルカプトエタノール０．１ｍＭを補った高グルコース含有８０％ＤＭＥＭを含んでおり、ＫＯ培地は、１５％ＫＯ血清リプレーサー（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｒ）、Ｌ−グルタミン１ｍＭ、ＮＥＡＡ０．１ｍＭ、及び２−メルカプトエタノール０．１ｍＭ、及びベーシック線維芽細胞成長因子４ｎｇ／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補った８５％ＫＯ−ＤＭＥＭを含んでいた。同時培養には、引っ張って作製したガラス毛細管を用いた機械的分裂によって、ｈＥＳＣコロニーを継代し［２］、フィーダーフリー培養用には、ｈＥＳＣを、先に記載したように酵素処理した後、継代した［２］。

マウス胚性幹細胞系（ｍＥＳＣ）であるＣＳ−１及びＥ１４は、それぞれＣｈｙｕａｎ−Ｓｈｅｎｇ Ｌｉｎ博士（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ［３］）及びＢｉｎｇ Ｌｉｍ博士（Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ［４］）から贈られたものであり、先に記載してあるように培養した［５］。ヒト胚性癌（ＥＣ）細胞系２１０２Ｅｐは、Ｐｅｔｅｒ Ａｎｄｒｅｗｓ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）から贈られたものであり、先に記載してあるように培養した［６］。ヒトＥＣ及び癌細胞系ＮＴＥＲＡ−２ｃＬ．Ｄ１（ＣＲＬ−１９７３）、ＮＣＣＩＴ（ＣＲＬ−２０７３）、並びにＨｅＬａ（ＣＣＬ−２）は、アメリカ培養細胞系統保存機関から購入したものであり、ＡＴＣＣの指示に従って培養した。ヒト胚性腎臓細胞系である２９３−ＨＥＫ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、提供されたプロトコールにしたがって培養した。ＨＥＳ−３細胞からの胚様体（ＥＢ）の形成を誘発するために（即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＥＳ−３細胞からのｈＥＳＣの分化を誘発するために）、ｈＥＳＣを凝集塊として回収し、凝集物として（即ち、胚様体として）、８日間、ＥＢ培地（８０％ＫＯ−ＤＭＥＭ、２０％ＦＣＳ、ペニシリン２５Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ＮＥＡＡ０．１ｍＭ、及び２−メルカプトエタノール０．１ｍＭ）で、非接着性懸濁培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で培養した。その後、ＥＢをトリプシンで解離し、さらなる１４日間、ゼラチン化した培養皿上ＥＢ培地中にプレーティングした［１６］。

モノクローナル抗体の産生
６週齢のメスＢａｌｂ／Ｃマウス２匹を、連続５週間毎週、腹腔内にＰＢＳ＋又はＭＰＬ＋ＴＤＭ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ）に懸濁した、マウス１匹あたり５×１０^６個のＨＥＳ−３細胞で免疫感作した。ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を用いて、マウスからの脾細胞を、ＳＰ２／０マウスミエローマ細胞と融合した。簡潔に述べると、脾細胞（１×１０^８細胞）の単一細胞の懸濁液を、供給されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＭｅｄｉｕｍＢを用いて、ＳＰ２／０細胞２×１０^７細胞と融合した。３７℃で一夜インキュベート後、メチルセルロースベースのＭｅｄｉｕｍＤを用いてハイブリドーマをプレーティングした。ハイブリドーマの個々のクローンをプレーティングから１０〜１４日後に単離し、ＭｅｄｉｕｍＥを含む９６ウェルの、その後２４ウェルの組織培養プレートで培養した。各ハイブリドーマからの培養上清液を回収し、ｈＥＳＣに対する反応性をフローサイトメトリーによって評価した。ＣｌｏｎａｌＣｅｌｌ（商標）−ＩｎｓｔａｎｔＣＨＥＫ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、抗体のアイソタイピングを行った。

フローサイトメトリー分析
様々な細胞集団上の、表面マーカーとの抗体の反応性を、フローサイトメトリーを用いて免疫蛍光法によって評価した。トリプシンを用いて単一細胞の懸濁液として細胞を回収し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにおける体積１０μｌあたり２×１０^５細胞で再懸濁し、各ｍＡｂクローン（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ２００μｌにおける培養上清液１５０μｌ若しくは精製ｍＡｂ５μｇ）又はＳＳＥＡ−４に対するｍＡｂ（ニート、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｂａｎｋ）、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ２００μｌに２．５μｇ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、ＭＡＢ４３６０／４３８１）、ヒトポドカリキシン（ＰＯＤＸＬ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ１６５８）、及びヒトＰＯＤＸＬに対するポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ２００μｌに５μｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と４５分間インキュベートした。次いで、細胞を１％冷ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、１：５００希釈のヤギα−マウス抗体ＦＩＴＣ−複合体（ＤＡＫＯ）で１５分間さらにインキュベートした。インキュベート後、細胞を再び洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）上での分析用に１％ＢＳＡ／ＰＢＳ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）１．２５ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。インキュベートは、別段の指示がなければ、全て４℃で行った。ネガティブコントロールとして、細胞を、好適なアイソタイプコントロールで染色した。

同時発現試験用に、ｈＥＳＣを１次抗体とインキュベートし、上記に記載したように１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。その後、細胞を固定し、透過処理し（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｏｃｔ−４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−５２７９）に対してマウスｍＡｂを１：２０希釈でインキュベートした。次いで、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、１：５００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋ鎖特異的）抗体ＦＩＴＣ複合体（Ｓｉｇｍａ）及びウサギ抗マウスＩｇＭ抗体ＰＥ複合体（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、暗所でインキュベートした。インキュベート後、再び細胞を洗浄し、分析用に１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁した。１次抗体以外のインキュベートは全て、室温で１５分間行った。ネガティブコントロールとして、細胞を好適なアイソタイプコントロールで染色した。

免疫細胞化学
細胞を、室温で４５分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、各ｍＡｂクローンからの培養上清と、室温で１時間インキュベートした。抗体の局在を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）（１：５００希釈、ＤＡＫＯ）のいずれかと複合させたヤギ抗マウス抗体を用いて可視化した。

細胞毒性アッセイ
細胞に対するｍＡｂ８４の細胞毒性を、ＰＩ排除アッセイ及びフローサイトメトリーを用いて評価した。上記に記載したように、１％ＢＳＡ／ＰＢＳにおける体積１０μｌあたり２×１０^５細胞の単一細胞の懸濁液をｍＡｂ８４（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ２００μｌ中、培養上清１５０μｌ又は精製ｍＡｂ５μｇ）、ヒトＰＯＤＸＬに対するｍＡｂ又はヒトＰＯＤＸＬに対するｐＡｂ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ２００μｌ中５μｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、４℃で４５分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳによる分析用に１％ＢＳＡ／ＰＢＳ及び１．２５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に再懸濁した。投与量試験には、ＨＥＳ−３細胞を、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ ２００μｌ中、０．１、０．５、１、５、及び１５μｇの精製ｍＡｂ８４とインキュベートした。時間経過試験には、ＨＥＳ−３細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ ２００μｌ中の精製ｍＡｂ８４ ５μｇとインキュベートし、ｍＡｂ添加から１５、３０、及び４５分後に、分析用に回収した。ハイパークロスリンキング（ｈｙｐｅｒｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）実験には、１次ｍＡｂインキュベート後のＨＥＳ−３細胞を洗浄し、ヤギ抗マウス２次抗体（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ２００μｌ中５μｇ、ＤＡＫＯ）と４５分間、さらにインキュベートした。ネガティブコントロールとして、細胞をアイソタイプコントロールのｍＡｂ８５とインキュベートした。インキュベートは全て、別段の指示がなければ４℃で行った。ＰＩ排除アッセイを用いて得られた結果を検証するために、各試料に対する生存性も、トリパンブルー排除を用いて決定した。

免疫沈降
ｍＡｂ８４を標的とする抗原を同定するために、ｈＥＳＣのフィーダーフリーの培養物を６ｃｍペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）でコンフルエントになるまで増殖させ、ＰＢＳ＋で洗浄し、２％Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ＋中に、こそげ落として溶解させた。細胞溶解物を遠心分離によって清澄にし、免疫沈降（ＩＰ）用に直ちに使用した。

抗原のＩＰを、自動化ＭＥＡシステム（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ，Ｉｎｃ）を用いて行った。簡潔に述べると、ｍＡｂ８４（〜１００μｇ）を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＰｈｙＴｉｐ（登録商標）カラム（５μｌレジンベッド、Ｐｈｙｎｅｘｕｓ，Ｉｎｃ）上に直接捕獲することによって、ハイブリドーマ培養物上清から単離した。上清中の非結合タンパク質をＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４／１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）で洗い流した後、約５×１０^６細胞から清澄にした細胞溶解物を、捕獲されたｍＡｂ８４で機能化したカラムに通過させた。カラムをＷａｓｈ ＢｕｆｆｅｒＩＩ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）でさらに洗浄し、結合しているタンパク質をＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４／１４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ２．５）で、低ｐＨでカラムから溶出させ、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ９．０で中性化した。溶出液を、さらなる分析用に４℃で貯蔵した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを、それぞれ、実質的にＬａｅｍｍｌｉ［７］及びＴｏｗｂｉｎ［８］の方法によって行った。簡潔に述べると、ＩＰからの溶出液を、減圧条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％グラジエントゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離し、その後ウエスタンブロッティング又はゲルの銀染色のいずれかを行った。ウエスタンブロッティングには、分解したタンパク質を、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、１００Ｖで２時間、電気泳動で移動させた。次いで、膜を、ｍＡｂ８４培養上清（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１：１希釈）、ヒトＰＯＤＸＬに対するマウスｍＡｂ若しくはヒトポドカリキシンに対するヤギｐＡｂ（２００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかでイムノブロッティングし、その後ヤギ抗マウス又はウサギ抗ヤギ抗体のＨＲＰ−複合体（１：１００００希釈、それぞれＤＡＫＯ及びＰｉｅｒｃｅ）でイムノブロッティングした。ＨＲＰ−複合２次抗体の結合を、ＥＣＬ検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって可視化した。銀染色を、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造元のプロトコールにしたがって行い、ウエスタンブロット上のバンドに対応するタンパク質バンドを手操作で切り出した。

質量分析
還元、アルキル化、及びタンパク質分解
切り出したゲルを、洗浄溶液（５０％アセトニトリル水溶液中２．５ｍＭ重炭酸アンモニウム）に４℃で一夜浸漬し、その後、洗浄バッファーを変更後３７℃でさらなる２０分間インキュベートした。次いで、ゲルを乾燥し、還元及びアルキル化した。簡潔に述べると、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム中１０ｍＭ ＤＴＴ ２０μｌを各ゲルスポットに加え、５６℃で１時間インキュベートした。その後、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム中５５ｍＭヨードアセトアミドＩＡＡ２０μｌを加え、室温、暗所で４５分間インキュベートした。次いで、ゲルスポットを、２回、それぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムで、及び１００％アセトニトリルで、洗浄及び脱水した。タンパク質分解では、各ゲルスポットにおけるタンパク質を、変性トリプシン（２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中０．０２μｇ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）で、振盪しながら３７℃で一夜消化した。トリプシン消化後、試料にギ酸１％及びメタノール２％を加えてＬＣ ＭＳ／ＭＳ分析用に最終体積９μｌとした。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及びタンパク質同定
消化した試料を、ナノフロー高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）を用いて分離した。各試料９μｌを注入し、流速２５μｌ／分で０．１％ギ酸水溶液中、トラップカートリッジ（μＰｒｅｃｏｌｕｍｎ、３００ｕｍ×５ｍｍ、Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐ１００、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）上に濃縮した。洗浄５分後、流れを１０ｃｍのＣ１８逆相充填材料（Ｃｏｌｕｍｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を有する分離カラム（内径７５ｕｍ Ｐｉｃｏｔｉｐ Ｅｍｉｔｔｅｒ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）へのラインに切り替え、流速を１００ｎｌ／分に落とした。次いで、６０分かけてグラジエントを０．１％ギ酸中アセトニトリルを０％から６０％に展開した。カラムの遠位末端の液絡を用いて、２３００Ｖの電圧を導入して四重極−飛行時間型（Ｑｑ−ｔｏｆ）ハイブリッドタンデム質量分析計（ＱＳＴＡＲ−ＸＬ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の入り口開口部に向けられたカラムの先端で噴霧を形成した。二重及び三重に電荷を帯びた質量イオンを自動的に捕獲し断片化するために、質量分析計をＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＩＤＡ）モードで運転した。８カウント／秒の最小のシグナルで選択された質量イオンを単離し、窒素ガスで断片化した。用いた衝突エネルギーは、ペプチドの質量に比例しており、分析中にＡｎａｌｙｓｔ−ＱＳソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて計算した。タンパク質は、ＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）検索エンジンを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔ（ＥＢＩ）タンパク質データベースに対してＭＳ／ＭＳスペクトルファイルを検索することによって同定した。

［結果］
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍＡｂのｈＥＳＣ及び他の細胞系との反応性
未分化型ｈＥＳＣ上の細胞表面マーカーに対する１パネルのｍＡｂを産生するために、生存しているＨＥＳ−３細胞を用いて、アジュバント非存在下のＰＢＳ、又はＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント中のいずれかにおいて、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを免疫感作した。全１１４個のハイブリドーマを融合物から単離した。フローサイトメトリーを用いてＨＥＳ−３細胞に対するこれらの反応性を１次スクリーニングした後、１パネルの１０個の抗体がｈＥＳＣ表面抗原に結合することが見出された（図１）。さらに、ＨＥＳ−３コロニーに対するｍＡｂの結合を、免疫細胞化学によって確認した（図２）。アイソタイピングによって、ｍＡｂのうち９個がＩｇＭであり、残りの１個がＩｇＧ_２ａ（ｍＡｂ８）であることが見出された。他のｈＥＳＣ系であるＨＥＳ−２及びＨＥＳ−４でスクリーニングすることで、反応性は免疫原であるＨＥＳ−３だけに限定されないことが明らかになった（表１）。さらに、抗体結合性は、胚様体（ＥＢ）を形成するために細胞が導入された後に低減し、分化の間における抗原発現の下方制御が示唆された。

これら１０個のクローンに対して２次スクリーニングを行って、他の細胞系、即ちマウスフィーダー（Ｅ−ＭＥＦ）、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）、ヒト胚性癌細胞（ＥＣ）、及び種々のヒト細胞系（ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ）とｍＡｂの交差反応性を決定した（表１）。ｍＡｂには、免疫感作前にｈＥＳＣを培養したマウスフィーダーとは反応性がなかったことが観察された。さらに、ｍＡｂの反応性（即ち、標的の抗原の発現）は、ｈＥＳＣ細胞に限定され、試験した２つのｍＥＳＣ系には限定されない（ＣＳ−１上のｍＡｂ１４を除く）。Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びＳＳＥＡ−４の、ヒトＥＣ細胞上の我々のパネルのｍＡｂとの反応性を比較した場合は、期待通り、試験したＥＣ系上の３つの抗体全て（Ｔｒａ−１−６０／８１及びＳＳＥＡ−４）に対して強力な反応性が観察された。これとは対照的に、我々のｍＡｂパネルの殆どは、３つのＥＣ系の少なくとも２つと弱い反応性を有していた。興味深いことに、ｍＡｂ８４、９５、３７５、４３２、及び５２９には、ＮＴＥＲＡ、２１０２Ｅｐ、又はＮＣＣＩＴとは全く反応性がないか、又は弱い反応性があった。この結果は、ｈＥＳＣとＥＣとの間には、また、異なるＥＣ細胞系の間でさえも、抗原プロファイル／発現において違いがあることを指摘するものである。さらに、他のヒト細胞系に対してスクリーニングした場合、ｍＡｂクローンのうち７個（ｍＡｂ８４、９５、１４、及び８５を含む）は、ＨＥＫ−２９３又はＨｅＬａ細胞に結合しなかった。しかし、ｍＡｂ５及びｍＡｂ６３では、これら２細胞系との反応性は、ｈＥＳＣに比べて増大し、細胞が終末的に分化するときに抗原の発現を上方制御することを意味していた。

ｍＡｂパネルをさらに特徴付けるために、我々は、ｈＥＳＣの多能性マーカーＯｃｔ−４の同時発現を、パネルにおいてＩｇＭ ｍＡｂが標的にする抗原と比べた。図３は、ＨＥＳ−３細胞系の２色フローサイトメトリー分析を示している。散布図から、ｍＡｂポジティブＨＥＳ−３細胞の＞９５％はＯｃｔ−４に対してポジティブであり、標的の抗原の発現とＯｃｔ−４の発現との間の強力な相関を示唆している。

細胞毒性抗体ｍＡｂ８４の特徴付け
抗体パネルのスクリーニングの間に、ｍＡｂ８４とインキュベートしたＨＥＳ−３細胞は、他のＩｇＭ ｍＡｂ（例えばｍＡｂ８５）とインキュベートした細胞に比べて、生存性が著しく低減したことが見出された（図４、カラム１）。ＰＩ排除アッセイに基づくと、ｍＡｂ８５に比べて、ｍＡｂ８４とのインキュベート期間（４℃で４５分）後も生存性を維持していた細胞は７％にすぎなかった。このｈＥＳＣに対するｍＡｂ８４の細胞毒性効果は、他の２つのｈＥＳＣ細胞系であるＨＥＳ−２及びＨＥＳ−４、並びにＥＣ系であるＮＣＣＩＴでも観察され（図４、カラム２〜４）、ｍＡｂ８４とインキュベート後、生存性はそれぞれ８％、４０％、及び９％であった。これとは対照的に、別のＥＣ系である２１０２Ｅｐは、インキュベート後、９４％の生存性を維持していた（図４、カラム５）。位相差顕微鏡下で細胞を可視化すると、ｍＡｂ８４とインキュベートしたＨＥＳ−３及びＮＣＣＩＴ細胞は、ｍＡｂ８４とインキュベートしたＮＴＥＲＡ及び２１０２Ｅｐ細胞、又はｍＡｂ８５とインキュベートしたＨＥＳ−３及びＮＣＣＩＴ細胞に比べて著しい凝集を示した（図５）。これらの結合性及び細胞毒性データに基づくと、ｍＡｂ８４に対する細胞毒性効果は、細胞系とのｍＡｂの結合に依存していると解釈することができる（表１）。ｍＡｂは、ｍＡｂに結合しない細胞に対して細胞毒性効果を発揮しない。

時間経過試験では、ＨＥＳ−３細胞を５μｇのｍＡｂ８４又はｍＡｂ８５とインキュベートし、細胞を、ＰＩ排除及びトリパンブルー排除アッセイにより分析するために１５分毎に回収した（図６Ａ及びＢ）。ＰＩ排除アッセイでは、ＨＥＳ−３細胞に対するｍＡｂ８４の細胞毒性効果は、ｍＡｂとのインキュベート１５分後という速さで観察され、生存性は３３％に低下した。４５分までさらにインキュベートすると、２０％の生存性までのさらなる低下がもたらされた。これらの結果は、トリパンブルー排除によって確認された。興味深いことに、このアッセイに基づいた生存性における低下は、インキュベート後１５〜３０分の間に起こったが、４５分のインキュベート期間後の最終的な生存性も約２０％に相当していた。ｍＡｂ８４の濃度を０．１〜１５μｇの範囲にわたって滴定すると、ＨＥＳ−３細胞に対するｍＡｂの細胞毒性効果は投与量依存性であることが見出された（図６Ｃ）。精製ｍＡｂ８４は、約１μｇ（１ｐｍｏｌ）で＜３０％のｈＥＳＣの生存性の低減をもたらすことができた（即ち、生存性における７０％の低減）。

この段階までは、細胞毒性アッセイは、抗原−抗体複合体の細胞内への内部移行の効果を最小にするために、４℃で行っていた。細胞毒性に対する温度の効果を調べるために、ｈＥＳＣを、精製及び非精製（培養上清）両方のｍＡｂ８４と、４℃及び３７℃でインキュベートした（図６Ｄ）。ＰＩ排除アッセイによって、温度は、ｍＡｂのｈＥＳＣに対する細胞毒性に影響を及ぼさないことが見出された（非精製のｍＡｂ８４で＞７５％の死滅）。さらに、図７は、ｍＡｂ８４が３７℃でもｈＥＳＣに対して細胞毒性であったことを実証していた。散布図から、精製ｍＡｂ８４及びｍＡｂ８４培養上清の両方に対してで、４℃及び３７℃でのｍＡｂ８４が媒介するＨＥＳ−３細胞の死滅に違いがなかったことが観察された。

さらに、ｍＡｂ８４は、タンパク質Ａによる精製後、ｈＥＳＣに対して同様に細胞毒性であった（４℃のインキュベートで、精製及び非精製両方のｍＡｂ８４に対して＞７７％の死滅が観察された）。この結果は、ｈＥＳＣに対するｍＡｂ８４が誘導する毒性は、補体媒介性ではなかったことを示唆していた、というのは、細胞の死滅の効率は、培地におけるウシ胎児血清の存在又は非存在において比較可能であったからである。我々は以前に、ｈＥＳＣに対するｍＡｂ８４の結合は、８日齢の胚様体において下方制御されたことを観察していた（表１）。ｍＡｂ８４の細胞毒性が未分化型の表現型に特異的であるかどうかを決定するために、培養物からＦＧＦ２を取り除くこと、又はＥＢを形成することのいずれかによって、ｈＥＳＣに分化を誘発した（図８Ａ）。分化は、多能性のマーカーであるＴｒａ−１−６０の発現に基づいて評価した。ＦＧＦ２を取り除いた１２日後に、ｈＥＳＣの部分的な分化が観察され、未分化型ｈＥＳＣ培養物に比べて、４９％の細胞集団だけが依然としてＴｒａ−１−６０を発現していた（＞９５％Ｔｒａ−１−６０＋ｖｅ）。ＥＢ経路による分化により、Ｔｒａ−１−６０−ｖｅ細胞の収量は＞９９％であった。これら３つの条件からの細胞をｍＡｂ８４とインキュベートした場合、細胞の死滅の効率は、Ｔｒａ−１−６０＋ｖｅ細胞のパーセント値と密接に対応していた（図８Ｂ）。未分化型ｈＥＳＣに対しては、ｍＡｂ８４との培養後も依然として生存していた細胞は、約１％にすぎなかった。このパーセント値は、ＦＧＦ−２欠乏及びＥＢ培養に対して、それぞれ６９％及び９９％に上昇した。

ｈＥＳＣを標的としたｍＡｂ８４抗原の同定及び確認
ｍＡｂ８４の細胞毒性効果を担うｈＥＳＣ上の標的抗原を同定するために、免疫沈降実験を行った。細胞溶解物全体を、タンパク質Ａ樹脂及びｍＡｂ８４を含むＰｈｙＴｉｐカラムを通過させた。親和性の相互作用によって捕獲されたタンパク質を、タンパク質ゲル上で分離し、ｍＡｂ８４でプローブした。分子量マーカーに基づいて、＜１９０ｋＤａの抗原のバンドを検出した（図９Ａレーン１）。２次抗体によって検出された約２５ｋＤａの、より低いバンドは、還元後、ｍＡｂ８４の軽鎖と同定された。銀染色ゲル上の対応するバンドを単離し、質量分析法によって同定した。得られたペプチドのタンパク質データベースの検索から、抗原のバンドは、ポドカリキシン様タンパク質１前駆物質と同定された（ＰＣＬＰ１又はＰＯＤＸＬ；アクセッション番号Ｏ０００５９２）。ＰＯＤＸＬ及び対応するペプチドのアミノ酸配列の一致を図９Ｂに示す。抗原の標的がＰＯＤＸＬであることを確認するために、ｍＡｂ８４との免疫沈降を繰返し、カラムからの溶出物をＰＯＤＸＬに対する市販の抗体でプローブした（図９Ａレーン２及び３）。ウエスタンブロットから、比較可能な分子量のバンドを３レーン全てにおいて検出し、ＰＯＤＸＬの同一性を確認した。ＲＴ−ＰＣＲによって、ＰＯＤＸＬの２つの変異体（変異体１及び２に対して、それぞれアクセッション番号ＮＰ ００１０１８１２１及びＯ００５９２）も、ｈＥＳＣにおいて転写されたことがやはり見出された（データは示さず）。

ｍＡｂ８４の抗原の標的を同定したので、我々は、ＰＯＤＸＬに対する市販の抗体が、ｈＥＳＣに対して同様の細胞毒性効果を発揮するか否かの調査を進めた。図１０Ａ及びＢから、抗体の３つの供給源（ｍＡｂ及びｐＡｂ）はヒトＰＯＤＸＬに特異的であるが、細胞毒性はｍＡｂ８４だけに観察されたにすぎず、抗ＰＯＤＸＬ抗体の市販の２つの供給源には観察されなかったことが明らかである。アポトーシスは、細胞上でＣＤ１９、２０、及び２２などの、細胞上の抗原に結合している１次抗体のハイパークロスリンキング（ｈｙｐｅｒｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）によって誘発され得ることが以前に報告されている［１９、２０］。ｍＡｂ８４はＩｇＭ（５量体）であるが、ｍＡｂ−ＰＯＤＸＬ及びｐＡｂ−ＰＯＤＸＬは両方ともＩｇＧ（２価）であるので、ｍＡｂ−ＰＯＤＸＬ又はｐＡｂ−ＰＯＤＸＬの、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）抗体とのハイパークロスリンキングは、ｍＡｂ８４が媒介するｈＥＳＣの死滅を模倣するか否かを、我々は調査した。１次抗体、その後ＧＡＭ抗体とｈＥＳＣをインキュベートしても、ｍＡｂ８４と類似の細胞毒性効果を誘発できなかった（図１０Ｂ）。

［考察］
細胞表面抗原の同定はｈＥＳＣの調査にとって重要である、というのは、それが分化の間の、多能性及び特定の細胞集団の発達をモニターするための貴重な手段だからである。さらに、これは非侵襲性であるので、細胞表面抗原に特異的な抗体を用いて、詳しい分析又は細胞移植用に、不均一なプール内でサブセットの細胞を精製することができる。多能性ｈＥＳＣを特徴付けるために日常的に用いられるいくつかのこのような細胞表面抗原は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１である。役に立たないことだが、これらの抗原はヒトＥＣ細胞上にも存在し、Ｄｒａｐｅｒら［２１］による最近の研究では、分化の間のｈＥＳＣにおけるこれらの抗原の発現における変更は、ヒトＥＣ細胞に非常に類似している。したがって、ｈＥＳＣにおける自己複製及び多能性の制御のよりよい理解を得るために、ｈＥＳＣ上で唯一発現される新しい細胞表面抗原の同定が必要とされており、これによってｈＥＳＣをヒトＥＣ細胞と区別することができるであろう。

本明細書に記載した試験では、生存ｈＥＳＣをマウスの免疫感作に使用し、また、ｈＥＳＣ表面マーカーに結合するｍＡｂに対するハイブリドーマを１次スクリーニングした後、１パネルの１０個のｍＡｂを同定した。ｈＥＳＣ及びヒトＥＣ細胞の両方と強く反応したＳＳＥＡ−４及びＴｒａ−１−６０／８１と異なり、我々の抗体の５個（ｍＡｂ８４、９５、３７５、４３２、５２９）はｈＥＳＣだけと強く反応し、ヒトＥＣ細胞との反応はネガティブ、又は弱かった。さらに、抗体の結合はＯｃｔ−４発現と相関し、ｈＥＳＣが分化してＥＢを形成するときに下方制御される。これらのデータは、未分化型ｈＥＳＣ上に唯一存在する抗原の存在を強く支持している。さらに、ｍＡｂのパネル全体をＨ１ ｈＥＳＣ系に対してスクリーニングした場合（データは示さず）、反応性プロファイルはＨＥＳ−２、３、及び４に類似しており、ｍＡｂは様々なｈＥＳＣ系にまたがって保存されている抗原に結合することを示唆していることを我々は見出した。

比類なく、ｍＡｂ８４は、ｈＥＳＣに結合するだけではなく、インキュベート１５〜３０分以内に細胞に対して細胞毒性でもある。細胞死を誘発するのに補体の活性化又はハイパークロスリンキングのいずれかを必要とすることがある他の細胞毒性のｍＡｂとは異なり［２０、２２］、ｍＡｂ８４が媒介するｈＥＳＣの死滅は両メカニズムとは独立している。ＩＰ及びＭＳ分析によって、我々は、ｈＥＳＣ上のｍＡｂ８４の標的抗原としてポドカリキシン様タンパク質−１（ＰＯＤＸＬ）を同定した。

ＰＯＤＸＬは、ＣＤ３４及びエンドグリカン（ｅｎｄｏｇｌｙｃａｎ）を含む、シアロムチンのＣＤ３４ファミリーに属する、高度にグリコシル化されているＩ型膜貫通タンパク質である［２３、２４］。ＰＯＤＸＬは、もともと、腎糸球体の足細胞上の主なシアロタンパク質として記載されているが［２５］、後になって血管内皮細胞及び初期造血前駆細胞上に発現されることが見出された［２６、２７］。より最近では、ＰＯＤＸＬは、乳癌、肝癌、及び前立腺癌における腫瘍の侵襲性の指標として意味づけられている［２８〜３０］。ヒトＰＯＤＸＬは、染色体７ｑ３２〜ｑ３３上に位置し、アミノ酸５２８個の成熟タンパク質をコードしている［３１］。しかし、ＰＯＤＸＬの細胞外ドメインは、シアル酸付加したＯ−連結した炭水化物、及びＮ−連結したグリコシル化のための５個の潜在的な部位で広範にグリコシル化されているので、ＰＯＤＸＬの好適な分子量は１６０〜１６５ｋＤａである［３２］。

機能上は、ＰＯＤＸＬは、それが発現される細胞型に応じて、極めて多様な役割を有すると報告されている。足細胞では、ＰＯＤＸＬは電荷の斥力によって、足細胞の足突起間に開くろ過スリットを維持する抗接着分子として働く［３３］。しかし、高内皮細静脈では、ＰＯＤＸＬはＬ−セレクチンに結合し、リンパ球の連結及び回転を媒介する接着分子として働く［２３］。ｈＥＳＣでは、ＰＯＤＸＬは、未分化型ｈＥＳＣにおいて高度に発現される遺伝子の１つとして転写的に同定された［３４、３５］。ＥＳＴの頻度の分析によって、ＰＯＤＸＬ発現のレベルは、７〜８日のＥＢでは殆ど２．５倍、並びに神経外胚葉様細胞及び肝細胞様細胞ではそれぞれ約７及び１２倍下方制御されていた［３４］。この結果は、ｈＥＳＣ及び８日のＥＢの免疫組織化学によって支持されたが、後者では染色が著しく低減した［３６］。別の試験では、Ｗｅｉらが、ｈＥＳＣとｍＥＳＣとのトランスクリプトームプロファイルを比較し、ＰＯＤＸＬの発現は、ｈＥＳＣに比べると、ｍＥＳＣ系Ｅ−１４においてＭＰＳＳによって検出されなかったことを観察した［３７］。まとめると、ＥＳＣにおけるＰＯＤＸＬ発現のこれらの報告は、未分化型ｈＥＳＣ、及びｍＥＳＣの非存在に比べると、８日目のＥＢにおいて結合反応性は低減されるという、フローサイトメトリーによるｍＡｂ８４の我々の観察と一致している。それに付随して、それぞれＦＧＦ２を除去したｈＥＳＣ及び２２日目のＥＢに対する、ｍＡｂ８４が媒介する死滅における低減又は喪失は、分化のときのＰＯＤＸＬ発現の下方制御に起因し得る。それでもやはり、未分化型ｈＥＳＣにおけるＰＯＤＸＬの発現に対するこれらの報告があっても、その機能は解明されていない。

ｍＡｂ８４がＰＯＤＸＬに結合した後、ｈＥＳＣの死滅を担うメカニズムも興味深い。Ｚｈａｎｇらによる報告では［３８］、細胞表面受容体であるＰｏｒｉｍｉｎ（膜の損傷を誘発するプロオンコシス（ｐｒｏ−ｏｎｃｏｓｉｓ）受容体）を標的にするＩｇＭ ｍＡｂは、腫瘍症と呼ばれるプロセスによってＪｕｒｋａｔ細胞における細胞死を誘発することが可能であった［３９］。Ｐｏｒｉｍｉｎは、タンパク質の細胞外ドメイン上に複数のＯ−及びＮ−結合したグリコシル化部位を有するので、ＰＯＤＸＬ同様、ムチンファミリーの１メンバーである［４０］。Ｊｕｒｋａｔ細胞を抗Ｐｏｒｉｍｉｎとインキュベートすると、インキュベート後たった２０分で、懸濁液における速やかな細胞の凝集、及び＞７５％の細胞において膜の透過性の増大がもたらされた。細胞の死滅は、補体及び温度にも非依存性である。アポトーシスとは異なり、ｍＡｂとインキュベートした後に、ＤＮＡの断片化又はアポトーシス小体は観察されなかった。電子顕微鏡を走査することによって、抗Ｐｏｒｉｍｉｎ処理した細胞は、膜の細孔、小疱、及び表面のしわが増大したことが見出された。これを我々のデータと比べると、ｍＡｂ８４と抗Ｐｏｒｉｍｉｎとは、細胞の死滅の、類似する顕著な特徴を多く共有していることは驚くべきことである。さらに、我々のグループからの予備結果により、ｍＡｂ８４処理した細胞は、アポトーシスの特徴であるカスパーゼのレベルの上昇を表さなかったことが見出された。したがって、理論によって拘泥するものではないが、我々は、ｍＡｂ８４が媒介するｈＥＳＣの死滅は、腫瘍症に類似するメカニズムによるものと仮定している。

身体における任意の細胞型に分化するための材料の出発源としてｈＥＳＣを使用することは、再生医学にとって重大な利益がある。しかし、分化後の主な問題は、残余の未分化型ｈＥＳＣは腫瘍原性であるので、移植前にこれらの細胞を除去することである。以前の研究では、ヌードマウス中に埋め込まれた２個程度のＥＳＣでも奇形腫の形成をもたらし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＥＳ細胞を移植してもやはり状況を緩和しなかったことが示されている［４１、４２］。さらに、Ｃｏｏｋｅらは、ｈＥＳＣを移植した部位は、形成された奇形腫の結果に影響を及ぼしたことを報告した。多能性マーカーであるＳＳＥＡ−３を発現する未成熟細胞の大型の腫瘍は、肝臓に対する移植において優勢であり、分化型の組織の、より小型の腫瘍は皮下の移植において一般的であった［９］。この問題を克服するために、いくつかの異なる戦略が開発されている。２つの別々の研究において、Ｃｈｕｎｇら［８］及びＦｕｋｕｄａら［４３］は、ｓｏｘ１−ＧＦＰレポーター遺伝子を保有する組換えマウスＥＳＣ系を用いて、蛍光励起細胞分取器（ＦＡＣＳ）によってＥＳＣからｓｏｘ１^＋／ＧＦＰ^＋分化型神経前駆体を精製することができたことを実証した。精製した細胞を移植しても奇形腫の形成をもたらさなかったが、ｓｏｘ１⁻／ＧＦＰ⁻細胞はもたらした。ｈＥＳＣでは、Ｈｅｗｉｔｔらは、ｈＴｅｒｔプロモーターの制御下で、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）を発現する系を操作した［４４］。未分化型ｈＥＳＣは、ＧａｌＴを発現し、ＧａｌＴは次に細胞表面上でα−ｇａｌエピトープを触媒し、提示する。エピトープの存在は、ヒト血清において循環する抗体に対して細胞を感受性にし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞死をもたらす。これらの戦略は成功しているのに関わらず、これらは全て選択可能な遺伝子を保有する組換えＥＳＣ系の産生を必要とする。それに反して、非操作の未分化型ｈＥＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＡｂ８４とインキュベート後に速やかに除去することができることを、我々は、今、実証している。現在、ｉｎ ｖｉｖｏの研究は、ｍＡｂ処理後ｈＥＳＣによる腫瘍形成の非存在又は低減を実証するために進行中である。さらに、ＰＯＤＸＬの下方制御によってｍＡｂ８４の死滅を生き残った可能性がある残存するｈＥＳＣを、確実に完全に除去するために、我々のパネルにおける他のｈＥＳＣ特異的なｍＡｂのいくつかを、ｍＡｂ８４と組み合わせて用いることも我々は提唱している。

結論として、これは、未分化型ｈＥＳＣに選択的に結合し、死滅させる細胞毒性ｍＡｂの最初の報告である。潜在的には、ｍＡｂ８４は、残存するｈＥＳＣを除去し、したがって移植片の成功及び安全性を増大するために細胞移植前に用いることができる。

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図１は、未分化型ｈＥＳＣ系に結合するｍＡｂのフローサイトメトリー分析を示す図である。ＨＥＳ−３細胞の単一細胞の懸濁液を、ｈＥＳＣ上の細胞表面抗原に対して産生した様々なｍＡｂクローン又はＴｒａ−１−６０に対するｍＡｂで染色した。細胞に結合した抗体を、ＦＩＴＣ複合体の抗マウス抗体で検出した。影付のヒストグラムはネガティブコントロールでの染色を、白抜きのヒストグラムは１次抗体での染色を表している。 図２は、ｈＥＳＣコロニー上の細胞表面抗原へのｍＡｂ結合の免疫細胞化学による分析を示す図である。ｈＥＳＣ上の細胞表面抗原に対して産生された様々なｍＡｂクローンとフィーダー上で培養したＨＥＳ−３コロニーの免疫染色。コロニーを、引き続き、ＦＩＴＣ（ｍＡｂ５、１４、６３、及び９５）又はＰＥ（ｍＡｂ８４及びｍＡｂ８５）のいずれかと複合した抗マウス検出抗体で染色した。アイソタイプコントロールのＳＳＥＡ−１ではネガティブ染色が観察された（データは示さず）。画像は４０×倍率で撮影し、スケールバーは２００μｍを表す。 図３は、様々なｈＥＳＣ結合性ｍＡｂ及びＯｃｔ−４に対するｍＡｂで染色したＨＥＳ−３細胞の２色フローサイトメトリー分析を示す図である。ｈＥＳＣの単一細胞の懸濁液を、様々なｈＥＳＣ結合性ｍＡｂクローンで、その後Ｏｃｔ４に対するｍＡｂで、連続的に染色した。細胞に結合した抗体を、抗マウスＩｇＧ特異的抗体ＦＩＴＣ複合体及び抗マウスＩｇＭ抗体ＰＥ複合体で、同時に検出した。プロットに対するマーカーを、左下象限において、好適なＦＩＴＣ複合体又はＰＥ複合体のアイソタイプコントロールの＞９５％の蛍光を表すように位置づけた。 図４は、ｈＥＳＣ及びＥＣ細胞に対するｍＡｂ８４の細胞毒性効果を示す図である。細胞懸濁液（２×１０^５）を、５μｇのｍＡｂ８４又はｍＡｂ８５（アイソタイプコントロール）と、４℃で４５分間インキュベートした。その後、フローサイトメーターでのＰＩ排除アッセイによる分析用に細胞を回収した。散布図での囲まれた領域は、生存細胞集団を表している。 図５は、ｍＡｂ８４とインキュベートしたｈＥＳＣ及びＥＣ細胞の顕微鏡分析を示す図である。単一細胞の懸濁液（２×１０^５）を、５μｇのｍＡｂ８４又はｍＡｂ８５（アイソタイプコントロール）と、２４ウェルプレートで、４℃で４５分間インキュベートし、顕微鏡で分析した。画像は１００×倍率で撮影し、スケールバーは１００μｍを表している。 図６は、ｍＡｂ８４が媒介するｈＥＳＣの死滅の特徴付けを示す図である。（Ａ及びＢ）時間経過試験。ＨＥＳ−３細胞を、５μｇのｍＡｂ８４（黒色三角）及びｍＡｂ８５（黒色四角、アイソタイプコントロール）と、４℃でインキュベートした。ｍＡｂ添加から１５、３０、及び４５分後に細胞を回収し、ＰＩ排除又はトリパンブルー排除アッセイによって細胞の生存性を分析した。（Ｃ）ｈＥＳＣ死滅に対するｍＡｂ８４投与量の効果。ＨＥＳ−３細胞（２×１０^５）を、０．１〜１５μｇのｍＡｂ８４（黒色三角）及びｍＡｂ８５（黒色四角）と４℃でインキュベートした。４５分後、細胞を回収し、ＰＩ排除アッセイによって生存性を評価した。（Ｄ）ＨＥＳ−３細胞を精製（灰色棒）及び非精製（培養上清）（黒色棒）ｍＡｂ８４と、４℃及び３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、フローサイトメータでのＰＩ排除アッセイによる分析用に細胞を回収した。ｍＡｂ８５とのインキュベートは、アイソタイプコントロール（白抜き棒）として働いた。 図７は、ｍＡｂ８４が媒介するｈＥＳＣの死滅に対する温度の効果を示す図である。ＨＥＳ−３細胞を精製ｍＡｂ８４又はｍＡｂ８４培養上清と、４℃及び３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、フローサイトメーターでのＰＩ排除アッセイによって分析するために細胞を回収した。散布図での囲まれた領域は、生存細胞集団を表している。ｍＡｂ８５とのインキュベートは、アイソタイプコントロールとして働いた。 図８は、ｈＥＳＣの万能性とｍＡｂ８４による死滅効率との間の関係を示す図である。未分化型及び分化型ＨＥＳ−３細胞の単一細胞の懸濁液を：（Ａ）Ｔｒａ−１−６０に対するｍＡｂで染色した。細胞に結合した抗体を、ＦＩＴＣ複合体の抗マウス抗体で検出した。影付のヒストグラムはネガティブコントロールでの染色を、白抜きのヒストグラムは抗Ｔｒａ−１−６０ｍＡｂでの染色を表している；（Ｂ）５μｇのｍＡｂ８４と、４℃で４５分間インキュベートした。その後、フローサイトメータでのＰＩ排除アッセイによって分析するために細胞を回収した。散布図での囲まれた領域は、生存細胞集団を表している。 図９Ａは、ｈＥＳＣ上のｍＡｂ８４標的抗原としてのＰＯＤＸＬの同定を示す図である。（Ａ）ｍＡｂ８４によって免疫沈降した標的抗原のウエスタンブロット分析。ｍＡｂ８４を含むＰｈｙＴｉｐカラムを用いてｈＥＳＣ溶解物からアフィニティー精製した標的抗原を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ウエスタンブロットにかけ、ｍＡｂ８４（レーン１）、ヒトＰＯＤＸＬに対するｍＡｂ（レーン２）、及びヒトＰＯＤＸＬに対するｐＡｂ（レーン３）でプローブした。 図９Ｂは、ｈＥＳＣ上のｍＡｂ８４標的抗原としてのＰＯＤＸＬの同定を示す図である。（Ｂ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＰＯＤＸＬの同定。タンパク質データベース検索から得たヒトＰＯＤＸＬのアミノ酸配列（配列番号１）、及びＰＯＤＸＬに対応するＭＳ分析からの６個のトリプシンペプチド（下線付及び太字）。 図１０Ａは、ｍＡｂ８４と比べた、ｈＥＳＣに対する市販の抗ＰＯＤＸＬ抗体の細胞毒性を示す図である。ＨＥＳ−３細胞を、５μｇのｍＡｂ８４、ｍＡｂ−ＰＯＤＸＬ、ｐＡｂ−ＰＯＤＸＬ、又はｍＡｂ８５（アイソタイプコントロール）と、４℃で４５分間インキュベートした。いくつかの実験では、ｈＥＳＣは、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）抗体とさらにハイパークロスリンキングしていた。その後、フローサイトメーター上でＰＩ排除アッセイによって分析するために細胞を回収した。散布図での囲まれた領域は、生存細胞集団を表している（Ａ）。結果を、表形式でも表してある（Ｂ）。 図１０Ｂは、ｍＡｂ８４と比べた、ｈＥＳＣに対する市販の抗ＰＯＤＸＬ抗体の細胞毒性を示す図である。ＨＥＳ−３細胞を、５μｇのｍＡｂ８４、ｍＡｂ−ＰＯＤＸＬ、ｐＡｂ−ＰＯＤＸＬ、又はｍＡｂ８５（アイソタイプコントロール）と、４℃で４５分間インキュベートした。いくつかの実験では、ｈＥＳＣは、ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）抗体とさらにハイパークロスリンキングしていた。その後、フローサイトメーター上でＰＩ排除アッセイによって分析するために細胞を回収した。散布図での囲まれた領域は、生存細胞集団を表している（Ａ）。結果を、表形式でも表してある（Ｂ）。 図１１は、ｍＡｂ８４のＶ_Ｌ鎖のアミノ酸配列（及びヌクレオチド配列）を示す図である。下線をつけていないアミノ酸はフレームワーク領域に相当する。下線付のアミノ酸は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に相当する。アミノ酸配列は配列番号８、ヌクレオチド配列は配列番号９である。 図１２は、ｍＡｂ８４のＶ_Ｈ鎖のアミノ酸配列（及びヌクレオチド配列）を示す図である。下線をつけていないアミノ酸はフレームワーク領域に相当する。下線付のアミノ酸は、ＣＤＲに相当する。アミノ酸配列は配列番号１０、ヌクレオチド配列は配列番号１１である。

Claims (14)

1. 未分化型ヒト胚性幹細胞を破壊することができる抗ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）抗体であって、当該抗体は、
   以下のＣＤＲ：
   ＣＤＲ１： ＳＡＳＳＳＶＮＹＭＹ （配列番号２）
   ＣＤＲ２： ＤＴＳＮＬＡＳ （配列番号３）
   ＣＤＲ３： ＱＱＷＳＳＹＰＹＴ （配列番号４）
   を組み入れている少なくとも１個の軽鎖可変領域、及び、
   以下のＣＤＲ：
   ＣＤＲ１： ＮＹＷＭＮ （配列番号５）
   ＣＤＲ２： ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ （配列番号６）
   ＣＤＲ３： ＥＲＡ （配列番号７）
   を組み入れている少なくとも１個の重鎖可変領域、
   を有する、前記抗体。
2. 図１１（配列番号８）に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する、請求項１に記載の抗体。
3. 図１２（配列番号１０）に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１個の重鎖可変領域を有する、請求項１に記載の抗体。
4. 検出可能な標識をさらに含む、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の抗体。
5. 細胞毒性部分をさらに含む、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の抗体。
6. 請求項１ないし５のいずれか一項に記載の抗体、又は該抗体中に含まれるＶＨ又はＶＬ鎖を含む分子、をコードするポリヌクレオチド。
7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
8. 請求項１ないし５のいずれか一項に記載の抗体、及び他のヒト胚性幹細胞マーカーを検出するさらなる作用物質を含む、パーツのキット。
9. 他のヒト胚性幹細胞マーカーが、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びＧＣＴＭ−２のいずれかである、請求項８に記載のパーツのキット。
10. 未分化型ヒト胚性幹細胞を含む試料中で未分化型ヒト胚性幹細胞を破壊する方法であって、該試料を請求項１ないし５のいずれか一項に記載の抗体と接触させるステップを含む、前記方法。
11. 前記試料がヒト胚由来の試料又はヒト胚組織である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記試料がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細胞の試料である、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
13. 前記試料が、該試料中で未分化型ヒト胚性幹細胞が特定の細胞系譜に分化するように促されている試料であり、かつ、前記試料が未分化型ヒト胚性幹細胞に由来する分化型細胞を含む、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
14. 分化型細胞を含むが未分化型ヒト胚性幹細胞が枯渇している薬剤組成物を作製する方法であって、
    分化型細胞と未分化型ヒト胚性幹細胞とを含む試料を請求項１ないし５のいずれか一項に記載の抗体と接触させて、実質的に未分化型ヒト胚性幹細胞を含まない組成物を得るステップと、
    さらに、前記組成物を薬剤組成物中に組み入れるステップと、を含む前記方法。

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