CN103204919B - 胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型的胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用。本发明以自身免疫调节因子Aire序列中由C末端的部分氨基酸序列组成的多肽偶联载体蛋白KLH作为免疫原，制备的Aire多克隆抗体，以及直接以胚胎干细胞作为免疫原制备的兔单克隆抗体Glut3和/或GM-CSFRα，作为干细胞鉴定试剂，检测的特异性和灵敏度更高，且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测。包含上述Aire多克隆抗体、兔单克隆抗体Glut3和/或GM-CSFRα的胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能性以外，还可同时用于检测干细胞活性，拓展了检测试剂盒的功能。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学及免疫学领域，具体地说，涉及胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用。
背景技术
胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES cells）是指从胚胎内细胞团分离获得的，能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有三个胚层细胞潜能的正常二倍体细胞。胚胎干细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征，它的特异性分子标志，对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化机制的研究，有着十分重要的意义。目前常用的胚胎干细胞特异性标志包括转录因子OCT4、NANOG、REX1等；表面标志物SSEA-1、SSEA-3、TRA-1-60、CD9等；这些胚胎干细胞标志物相应抗体，已被广泛应用于干细胞检测试剂盒，用于干细胞的鉴定与分离。
目前大量研究结果表明，大部分已应用于检测试剂盒的胚胎干细胞特异性标志物抗体并不是直接从胚胎干细胞获得的，例如SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60等抗体是由畸胎瘤细胞免疫获得的；SSEA-3抗体是从小鼠胚胎免疫获得；OCT4、NANOG这些转录因子的抗体则直接使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。而且这些标志物的特异性有一定的局限性：它们在一些成体干细胞、正常组织或癌细胞中也有一定表达，胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此，开发更灵敏、特异性更高的胚胎干细胞鉴定试剂意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种胚胎干细胞特异性标志物Aire（自身免疫调节因子），其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
为了实现本发明目的，本发明的一种胚胎干细胞特异性标志物Aire（自身免疫调节因子），其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供一种胚胎干细胞特异性标志物Glut3（葡萄糖转运蛋白3），其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供一种胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRα（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α链），其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明直接以胚胎干细胞作为免疫原，免疫兔子，分离兔子脾脏细胞，与骨髓瘤细胞融合，分别筛选出产生Glut3兔单克隆抗体和GM-CSFRα兔单克隆抗体的杂交瘤细胞，应用于干细胞的鉴定与分离。
本发明还提供一种鉴定胚胎干细胞的方法，以Aire、Glut3和GM-CSFRα中的至少一种作为鉴定胚胎干细胞的标志物。Aire只在胸腺组织的极少量细胞中被检测到，其他标志物Nanog、Oct4等在许多肿瘤细胞上均能被检测到。Aire作为胚胎干细胞鉴定标志物，相比Nanog、Oct4等常规标志物，特异性更好。Glut3可作为胚胎干细胞功能性鉴定标志物。Glut3和GM-CSFRα兔单克隆抗体识别天然构象表位，除鉴定胚胎干细胞全能性以外，可同时用于检测干细胞活性。
本发明还提供胚胎干细胞特异性标志物Aire、Glut3和/或GM-CSFRα在鉴定胚胎干细胞中的应用，用Aire单克隆抗体、Aire多克隆抗体、Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体中的至少一种通过检测抗原抗体相互作用来鉴定胚胎干细胞。所述Aire多克隆抗体的制备方法为：分别合成由SEQ ID No.1所示的Aire序列C末端的21个氨基酸组成的多肽（其序列为ILQWAIQSMSRPLAETPPFSS）以及由SEQ ID No.2所示的Aire序列C末端的12个氨基酸组成的多肽（其序列为QSMARPAAPFPS）；分别将多肽偶联载体蛋白KLH，即为完全抗原；将完全抗原与完全弗氏佐剂混合，免疫新西兰大白兔；首免后，每隔两周加强免疫；四免后取全血，分离兔血清中的Aire兔多克隆抗体。所述Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体分别由杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39（保藏号CGMCC NO.7301）和ZJUESRMAB29（保藏号CGMCC NO.7302）产生。检测抗原抗体相互作用的方法，例如免疫细胞化学法ICC、IHC染色或免疫共沉淀等。
还可以通过检测细胞中Aire基因、Glut3基因和/或GM-CSFRα基因的表达量来鉴定胚胎干细胞。
本发明进一步提供一种胚胎干细胞检测试剂盒，所述试剂盒任选包含Aire多克隆抗体、Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体中的至少一种。所述Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体分别由杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39（保藏号CGMCC NO.7301）和ZJUESRMAB29（保藏号CGMCC NO.7302）产生。
本发明还提供产Glut3单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.7301，保藏日期2013年2月5日。
本发明还提供产GM-CSFRα单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB29，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.7302，保藏日期2013年2013年2月5日。
本发明还提供由所述Aire多克隆抗体、Glut3单克隆抗体和/或GM-CSFRα单克隆抗体在鉴定胚胎干细胞中的应用。
本发明以自身免疫调节因子Aire序列中由C末端的部分氨基酸序列组成的多肽偶联载体蛋白KLH作为免疫原，制备的Aire多克隆抗体，以及直接以胚胎干细胞作为免疫原制备的兔单克隆抗体Glut3和/或GM-CSFRα，作为干细胞鉴定试剂，检测的特异性和灵敏度更高，且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测。
本发明的胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能性以外，还可同时用于检测干细胞活性，拓展了检测试剂盒的功能。
附图说明
图1为本发明实施例2中ICC染色结果。
图2为本发明实施例2中RT-PCR结果。
图3为本发明实施例2中干扰Aire基因的实验结果；其中，A为细胞培养观察结果，干扰Aire基因，mES的克隆形成率明显降低；B为敲除Aire基因前后，mES克隆形成率数据统计。
图4为本发明实施例3中流式数据的统计结果；其中，A、C为阴性抗体对照；B为未分化的mES，D为经10μmol/L at RA诱导分化的mES。
图5为本发明实施例3中IP实验结果；其中，A表示细胞经条件I处理后，利用Glut3兔单克隆抗体#39，进行IP实验，无法检测到Glut3蛋白；Ｂ表示细胞经条件II处理后，利用Glut3兔单克隆抗体#39，进行IP实验，可检测到Glut3蛋白。
图6所示为本发明实施例3中经Glut3兔单抗封闭的mES，克隆大小的变化。
图7为本发明实施例4中IHC染色结果示意图。
图8为本发明实施例4中ICC染色结果示意图；其中，ZjuESrMab29为筛选到的GM-CSFRα兔单克隆抗体。
图9所示为本发明实施例4中免疫沉淀（IP）实验结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1兔多克隆抗体的制备
1.1材料及试剂
载体蛋白KLH购自Thermo Fisher。多肽交由杭州中肽生化有限公司合成。
1.2兔多克隆抗体的制备
分别合成由SEQ ID No.1所示的Aire序列C末端的21个氨基酸组成的多肽以及由SEQ ID No.2所示的Aire序列C末端的12个氨基酸组成的多肽；分别将多肽偶联载体蛋白KLH，即为完全抗原；将完全抗原与完全弗氏佐剂混合，免疫新西兰大白兔；首免后，每隔两周加强免疫；四免后取全血，用多肽-层析柱分离纯化Aire兔多克隆抗体。
实施例2Aire作为胚胎干细胞标志物的应用
1.1Aire基因维持胚胎干细胞的自我更新和分化能力
ICC染色：培养细胞用4%甲醛（Sigma）于37℃固定1.5小时；然后用封闭液（含10%山羊血清和1%BSA的PBS）于37℃封闭1小时；封闭后的细胞用一抗（实施例1中制备的Aire兔多克隆抗体）于37℃孵育1小时；PBS洗涤；洗涤后细胞加二抗37℃避光孵育45分钟；最后用0.5μg/ml Hochest33258(Sigma)核染色5分钟；荧光显微镜(Olympus IX-70)下观察并拍照。ICC染色结果如图1所示，Aire和SSEA-1双染色阳性，证明Aire在未分化胚胎干细胞上的表达。
RT-PCR实验：利用TRIzol试剂（Invitogen），从培养的未分化ES细胞和分化不同时间的ES细胞中提取总RNA，利用逆转录酶合成第一条cDNA；PCR扩增目的基因；目的基因引物利用Primer Premier5software(PREMIER Biosoft International,Palo Alto CA)设计。引物序列为：Aire(Mu)Sense5′-GACCAATCTCCGCTGCAAA-3′和Anti-sense5′-ACATAGAAGTGACTTTAATTCCAGGAT-3′。扩增条件：95℃预变性2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
RT-PCR结果显示（图2）：随着细胞的分化，ES细胞经典标志物Oct4和Nanog表达量显著下降，同时Aire的表达量也降低，证明Aire可作为胚胎干细胞标志物。
1.2干扰Aire基因，明显降低mES的克隆形成率
干扰实验：合成编码shRNA的DNA序列5′-CCGGCCAGTGGCAATTTGAAGAACACTCGAGTGTTCTTCAAATTGCCACTGGTTTTTG-3′，插入到pLKO.1TRC-cloning质粒中，将构建好的质粒命名为shAire质粒。用shAire质粒与PsPAX2质粒、pMD2.G质粒共转染293T细胞，包装Aire干扰慢病毒，并感染ES细胞。按500个细胞／24孔接种细胞，ALP染色检测克隆形成率，结果显示（图3）干扰Aire后，ES细胞的克隆形成率显著下降。
实施例3Glut3作为胚胎干细胞标志物的应用
1.1Glut3兔单克隆抗体的制备
以小鼠胚胎（mES）干细胞作为免疫原，用1×108个mES免疫3月龄新西兰大白兔，分离兔子脾脏细胞，与骨髓瘤细胞240E-W2（购自Epitomics公司）融合，筛选出产生Glut3兔单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39（保藏号CGMCC NO.7301），应用于干细胞的鉴定与分离。
1.2Glut3兔单克隆抗体识别天然构象表位，可用于胚胎干细胞的流式筛选
流式数据的统计结果表明Glu3的表达随ES细胞分化显著下降。
如图4所示：70%完整的mES可被实施例中制备的Glut3兔单克隆抗体阳性染色，而经10μmol/L at RA（维甲酸）诱导分化的mES细胞只有3%被阳性染色。
流式细胞术（FC）：无饲养层未分化和经10μmol/L at RA诱导分化的mES细胞被分离成单个细胞；分别与Glut3兔单克隆抗体和阴性对照抗体混合孵育；加入FITC-羊抗兔二抗孵育；PBS洗涤；流式读数观测。
IP实验结果如图5所示。其中，A表示细胞经条件I处理后，利用Glut3兔单克隆抗体，进行IP实验，无法检测到Glut3蛋白。Ｂ表示细胞经条件II处理后，利用Glut3兔单克隆抗体，进行IP实验，可检测到Glut3蛋白。
条件I：Glut3兔单抗1μg和50%(w/v)蛋白A纤维素凝胶（ProteinA-Sepharose bead slurry，GE，USA）20μL于4℃过夜孵育；将2×107个mES用细胞裂解液(1%Triton X-100,50mmol/L Tris-HCl pH7.4,300mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF)处理；离心后，上清分成两等分；一份与ProA-Glut3兔单抗凝胶混合，一份与ProA-阴性抗体混合；蛋白A纤维素凝胶颗粒用洗脱液(0.1%Triton X-100,50mmol/L Tris-HCl pH7.4,300mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA)清洗，SDS-PAGE电泳，银染显色。
条件II：向2×107个mES中加入0.05mmol/L EDTA，将其分离成单个细胞，用含有1μg Glut3兔单克隆抗体的细胞培养液1ml重悬细胞，于37℃反应1h，细胞用PBS清洗3次，再用细胞裂解液裂解；细胞裂解液经离心后，上清与蛋白A凝胶混合，显色步骤与条件I相同。
1.3经Glut3兔单抗封闭的mES，克隆大小和细胞形成率均明显降低
向细胞培养液中加入Glut3兔单抗，终浓度为5μg/mL，37℃，5%CO2培养3天，克隆明显减小，如图6.a所示。而向细胞培养液中加入阴性抗体，则不影响细胞增殖，见图6.b，图6.c为正常mES细胞培养，未加入任何抗体。
实施例4GM-CSFRα作为胚胎干细胞标志物的应用
1.1兔单克隆抗体的制备
以小鼠胚胎干细胞（mES）作为免疫原，每次用1×108个mES免疫3月龄新西兰大白兔，免疫4次，前后两次免疫间间隔3周。四次免疫后取血清，免疫细胞化学检测阳性后静脉注射1×108个mES细胞加强，加强3天后分离兔脾脏细胞，与骨髓瘤细胞240E-W2（购自Epitomics公司）融合，筛选出产生GM-CSFRα兔单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB29(保藏号CGMCC NO.7302)，应用于干细胞的鉴定与分离。
1.2GM-CSFRα作为胚胎干细胞标志物的应用
GM-CSFRα的表达将减少细胞的分化，在成体组织中局限表达，可作为新的胚胎干细胞鉴定标志物。
IHC染色实验：准备好各组织冷冻切片；将各组织冷冻切片置于3%过氧化氢中10分钟，使内源性过氧化物酶失活；冷冻切片用封闭液（含10%山羊血清和1%BSA的PBS）37℃封闭1小时；加入一抗（实施例1中制备的GM-CSFRα兔单克隆抗体）37℃孵育1小时；然后加入羊抗兔-HRP二抗37℃孵育1小时；最后用新鲜配制的3,3′-diaminobenzidine(DAB)于37℃显色5分钟，观察读片。结果如图7所示。IHC染色结果显示：GM-CSFRα在小鼠睾丸中高表达，在肾脏和脾脏中弱表达，在脑、心、肝和肺中无表达，特异性高。
1.3GM-CSFRα作为胚胎干细胞标志物的应用
ICC染色实验证明GM-CSFRα兔单抗可应用于胚胎干细胞的鉴定与分选。
ICC实验：培养细胞用4%甲醛（Sigma）于37℃固定1.5小时；然后用封闭液（含10%山羊血清和1%BSA的PBS）37℃封闭1小时；封闭后的细胞加入一抗（实施例1中制备的GM-CSFRα兔单克隆抗体）37℃孵育1小时；PBS洗涤；洗涤后的细胞加入二抗37℃避光孵育45分钟；最后用0.5μg/ml Hochest33258(Sigma)核染色5分钟；荧光显微镜(Olympus IX-70)下观察并拍照。结果如图8所示。GM-CSFRα兔单抗ICC染色结果显示：未分化的mES细胞与培养3天后分化的细胞对比，未分化的mES染色阳性，分化的mES染色阴性。
1.4GM-CSFRα作为胚胎干细胞标志物的应用
活细胞结合－免疫沉淀实验证明GM-CSFRα兔单抗识别天然构象抗原。
采用两种方法进行免疫沉淀（IP）实验：
1.4.1经典IP（Classic IP）
108个ES细胞采用RIPA裂解液裂解，与实施例1中制备的GM-CSFRα兔单抗充分混合，再使用ProA resin分离抗原抗体复合物，经SDS-PAGE分离蛋白，银染检测。
1.4.2活细胞IP（Live cell IP)
108个ES活细胞与实施例1中制备的GM-CSFRα兔单抗充分混合，然后采用RIPA裂解液裂解，再使用ProA resin分离抗原抗体复合物，经SDS-PAGE分离蛋白，银染检测。
结果显示：只有在活细胞IP条件下可以获得特异性条带，证明GM-CSFRα兔单抗识别天然构象表位。（图9）
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.胚胎干细胞特异性标志物Aire多克隆抗体在鉴定胚胎干细胞中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
用Aire多克隆抗体通过检测抗原抗体相互作用来鉴定胚胎干细胞，且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测；
所述Aire多克隆抗体的制备方法为：分别合成由SEQ ID No.1所示的Aire序列C末端的21个氨基酸组成的多肽以及由SEQ IDNo.2所示的Aire序列C末端的12个氨基酸组成的多肽；分别将多肽偶联载体蛋白KLH，即为完全抗原；将完全抗原与完全弗氏佐剂混合，免疫新西兰大白兔；首免后，每隔两周加强免疫；四免后取全血，分离兔血清中的Aire兔多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测抗原抗体相互作用的方法为免疫细胞化学法、免疫组织化学法染色、流式细胞术或免疫共沉淀。
3.胚胎干细胞检测试剂盒，其特征在于，包含Aire多克隆抗体；
所述Aire多克隆抗体的制备方法为：分别合成由SEQ ID No.1所示的Aire序列C末端的21个氨基酸组成的多肽以及由SEQ IDNo.2所示的Aire序列C末端的12个氨基酸组成的多肽；分别将多肽偶联载体蛋白KLH，即为完全抗原；将完全抗原与完全弗氏佐剂混合，免疫新西兰大白兔；首免后，每隔两周加强免疫；四免后取全血，分离兔血清中的Aire兔多克隆抗体。
4.Aire多克隆抗体在胚胎干细胞检测中的应用，其特征在于，所述Aire多克隆抗体的制备方法为：分别合成由SEQ ID No.1所示的Aire序列C末端的21个氨基酸组成的多肽以及由SEQ ID No.2所示的Aire序列C末端的12个氨基酸组成的多肽；分别将多肽偶联载体蛋白KLH，即为完全抗原；将完全抗原与完全弗氏佐剂混合，免疫新西兰大白兔；首免后，每隔两周加强免疫；四免后取全血，分离兔血清中的Aire兔多克隆抗体；
胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能性以外，还可同时用于检测干细胞活性。
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