CN102731653B

CN102731653B - 一种抗磷酸化Oct4蛋白的抗体及其应用

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Publication number: CN102731653B
Application number: CN2011100852741A
Authority: CN
Inventors: 李凌松; 文锦华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-04-06
Filing date: 2011-04-06
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2031-04-06
Also published as: CN102731653A

Abstract

本发明涉及一种Oct蛋白的磷酸化位点及抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，具体讲，涉及Oct4蛋白343位磷酸化及一种针对Oct4蛋白343位磷酸化的抗体。所述的抗体的为单克隆抗体或多克隆抗体。本发明还涉及抗体用于检测Oct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化的应用。当Oct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化时，Oct4蛋白对下游基因Nanong、Sox2的正向调控能力下降，从而失去维持干细胞自我复制及多潜能分化的能力。所述的应用包括所述的抗体在检测干细胞增殖、细胞分化、干细胞多潜能性、干细胞自我复制能力中的应用。

Description

一种抗磷酸化Oct4蛋白的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，具体讲，涉及一种针对Oct4蛋白343位磷酸化的抗体。

背景技术

干细胞按分化能力分为全能性、多能性和专能性干细胞。Oct4是全能性或多能干细胞标记物，在胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和胚胎/生殖细胞肿瘤中阳性表达，但在分化的组织中均表达降低或消失，提示其在胚胎干细胞、生殖细胞和胚胎/生殖肿瘤中的表达与这些细胞的多能性分化特性密切相关。在成体组织和体细胞肿瘤中亦发现Oct4阳性表达。迄今为止，Oct4在成体组织中的表达主要局限于具有干细胞特性的细胞，如皮肤基底细胞层中的个别细胞、乳腺干细胞和胃干细胞等。

Oct4 mRNA及其蛋白质在未受精的卵母细胞中出现，也在桑椹胚期(32～64个细胞)的所有胚胎细胞中有丰富表达。进一步研究发现，Oct4在原肠胚前期的胚胎外胚层亦有表达。因此被认为是胚胎干细胞和生殖细胞的标记物。研究证实，内细胞群Oct4表达比分化的滋养外胚层细胞高31倍，与鼠类相同。因此，在植入前的桑椹胚阶段决定Oct4在内细胞群表达，在周围滋养层中表达下调的机制对植入前胚胎的正常发育具有关键作用。在桑椹胚阶段，Oct4表达使每个细胞都具有全能性。滋养层细胞形成过程是Oct4表达下降致细胞分化的结果，细胞失去全能性，分化为滋养层细胞利于胚泡进行子宫内膜植入。可见，Oct4在内细胞群持续表达和滋养层表达下降是形成不同的分工共同维持胚胎发育。

Oct4在胚胎生殖细胞中表达出现在睾丸生殖细胞的孕17～37周，高峰出现在性腺发育的孕17～24周。出生后睾丸曲精小管无阳性表达。此期可能是睾丸胚胎生殖细胞数最多时，而后逐渐向其他组织分化，形成睾丸的各种结构。最近，在羊水中发现有Oct4表达阳性的细胞，该细胞有活跃的分裂能力。因为被证实在细胞增殖时才表达的细胞周期调节剂cyclin A在这些细胞中表达。由于有三个胚层起源的不同胚胎/胎儿细胞存在于羊水中，要搞清这些阳性羊水细胞的细胞起源尚需进一步研究。

相对胚胎干细胞和生殖细胞而言，Oct4的表达在所有类型的分化细胞中均下降。Solter发现在排出的卵母细胞、小鼠植入前胚胎细胞、原胚腔的外胚层、原生殖细胞和胚胎干细胞中均有Oct4表达，而当这些细胞进入分化状态后其表达消失。在4～8个胚胎细胞组成的胚泡中，不同水平的Oct4表达预示胚泡或向内细胞群发育，或向滋养外胚层发育。Oct4在原肠胚形成前期的全能和多分化潜能细胞中表达，在分化成内胚层和中胚层过程中下调。同样，Yeom等也发现在鼠原肠胚形成前期的胚胎全能性细胞产生的各种胚胎体细胞组织和生殖细胞中均表达Oct4。此种表达在原肠胚期呈下降调节，此后仅维持在种系中表达。因此，高水平的Oct4表达认为与维持细胞全能性相关，而Oct4表达的下调认为与分化有关。Oct4通过结合位于转录起始点近侧或远侧的八聚体基序来激活转录，在胚胎发育过程中起重要作用。Oct4缺陷的小鼠胚胎迅速死去，不能引发胚胎发育。原因是缺少内细胞群形成，胚胎全能性细胞不能进行维持发育和自我修复。与基础表达水平相比，小于两倍的Oct4表达就可使胚胎全能性细胞分化成原始的内胚层和中胚层，而抑制其表达致使胚胎全能性细胞分化成滋养外胚层

综上所述，Oct4是胚胎早期发育过程中重要的决定和保护因素，其表达情况直接决定胚胎发育结果。Oct4是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的最为重要的转录因子之一，同时也是体外建立诱导多功能干细胞(iPS)的关键基因。在全能胚胎干细胞和生殖系干细胞表达。在早期胚胎中，在ICM阶段，Oct4为维持其全能性而发挥作用。传统认为Oct4的激活有3种模式：远端依赖性共激活，构象依赖性共激活，Oct4聚合体依赖性共激活。在本发明中，发明人提出了一种新的激活模式，即磷酸化依赖性激活。

发明内容

本发明首先发现Oct4蛋白的C末端的343位苏氨酸残基是一个新的磷酸化位点，此位点的磷酸化决定了Oct4作为转录因子对下游基因的调控，即343位苏氨酸残基突变为丙氨酸残基时，Oct4对下游基因Nanong、Sox2的正向调控能力下降，因而失去维持干细胞自我复制及多潜能分化的能力。

本发明的首要发明目的在于提出抗磷酸化Oct4蛋白的抗体。

本发明的第二发明目的在于提出这种抗体的应用。

为了实现本发明的第一发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，所述的抗体是针对Oct4蛋白343位磷酸化的抗体。

本发明的第一优选技术方案为：所述的抗体的为单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明的第二优选技术方案为：所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)合成多肽

合成第8位氨基酸磷酸化的多肽SEQ ID NO：1 50mg，

非磷酸化的多肽SEQ ID NO：1 20mg；

SEQ ID NO：1的氨基酸序列为：Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His；

第8位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO：1的氨基酸序列为Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-AlaLeu-Gly-Ser-Pro-Met-His；

(2)血清阶段

兔子经过5次免疫后，取全血，析出血清，检测血清的滴度，筛选出特异性较强的免疫兔；

(3)细胞融合

筛选出的兔子的脾细胞与小鼠SP2/0细胞进行融合；

(4)初筛

脾细胞融合后14～18天，筛选阳性克隆进行细胞培养；

(5)复筛

将孔板的上清进行ELISA复筛，复筛时，分别使用第8位氨基酸磷酸化的多肽SEQ ID NO：1和非磷酸化的多肽SEQ ID NO：1包被反应板，将血清添加入反应板进行抗原抗体反应，与磷酸化的多肽反应阳性而非磷酸化的多肽反应阴性克隆继续维护，得到上清中抗体与抗原反应的特异性的阳性克隆；

(6)腹水制备

在细胞株鉴定合格后，收集合格杂交瘤细胞稀释后对鼠进行腹腔注射；5-7天后取腹水，取腹水后置4℃过夜，离心、取上清获得单克隆抗体。

本发明的第二优选技术方案为：所述的多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)多肽合成

合成磷酸化的多肽：第10位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO：2 15mg，非磷酸化的多肽：SEQID NO：2 11mg；

其中SEQ ID NO：2的氨基酸序列为：Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-GlySer-Pro；第10位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO：2的氨基酸序列为：Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro；

(2)动物免疫

选用健康家兔2只，经过5ml/只、5次免疫后，收集血清50-70ml/只；

(3)免疫血清的鉴定

利用10ug/ml抗原包被，ELISA的方法鉴定血清的效价及特异性。

为了实现本发明的第二发明目的，采用的技术方案为：

本发明还涉及该抗体在检测Oct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化的应用。

本发明的第一优选技术方案为：当Oct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化时，Oct4蛋白对下游基因Nanong、Sox2的正向调控能力下降，从而失去维持干细胞自我复制及多潜能分化的能力。

本发明的第二优选技术方案为：所述的应用包括所述的抗体在检测干细胞增殖、细胞分化、干细胞多潜能性、干细胞自我复制能力中的应用。

本发明发现Oct4蛋白的C末端的343位苏氨酸残基是一个新的磷酸化位点，此位点的磷酸化决定了Oct4作为转录因子对下游基因的调控，即343位苏氨酸残基突变为丙氨酸残基时，Oct4对下游基因Nanong、Sox2的正向调控能力下降，因而失去维持干细胞自我复制及多潜能分化的能力。本发明根据以上对Oct4新的磷酸化位点的研究成果，制备了针对此位点的多克隆及单克隆特异性磷酸化抗体，此抗体能够特异识别Oct4的磷酸化状态。

附图说明

图1为构建质粒的示意图；

图2为截取掉T343位点后的质粒在293细胞中表达的免疫沉降及免疫印迹图谱；

图3为图2结果的辉度扫描后计算数值的比较结果；

图4为T343位点突变为非磷酸化的丙氨酸的质粒在293细胞中表达的免疫沉降及免疫印迹图谱；

图5为图4结果的辉度扫描后计算数值的比较结果；

图6为采用倒置显微镜10倍下病毒浓度感染胚胎干细胞系E14的照片，从左到右依次为对照组、Oct4组、T343A组碱性磷酸酶染色后的细胞集落数数量；

图7显示的是在倒置显微镜的观察病毒浓度感染胚胎干细胞系E14，在40倍下每个视野计数克隆的数目，统计得到的比较结果；

图8为Sox2、Nanog在T343A-Oct4的感染的细胞中表达的免疫印迹法的图谱，从左到右依次为对照组、Oct4组、T343A组碱性磷酸酶染色后的细胞集落数数量图；

图9为通过测量荧光素酶的表达量、荧光强度计算并统计得到的比较结果，其中pBK-null组为空白对照，pBK-Oct4组为将Oct4的表达质粒及Sox2启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞；T343A组为将T343A-Oct4的表达质粒及Sox2启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞；

图10为通过测量荧光素酶的表达量、荧光强度的计算并统计得到的比较结果，其中pBK-null组为对照，pBK-Oct4组为将Oct4的表达质粒及Nanog启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞中；T343A组为将T343A-Oct4的表达质粒及Nanog启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞中；

图11为Sox2、Nanog的拯救实验结果的明场照片，倒置显微镜放大40倍下胚胎干细胞E14碱性磷酸酶染色检测细胞集落数，从左到右依次为对照组、突变为T343A组、转入Sox2质粒组、转入Nanog质粒组；

图12为图11中的细胞集落数采用克隆数计数的方法统计得到的柱状图；

图13为小鼠受精卵注射Oct4或T343A-Oct4转录的mRNA后的发育状况图；采用倒置显微镜放大40倍后的照片，从左到右依次为对照组、注射Oct4组、注射T343A-Oct4组；

图14为采用实施例1制备的抗T343位苏氨酸磷酸化的单克隆抗体对本实施例中得到的空白质粒empty、野生型Oct4的pBK-wt组、pBK-M6A组、pBK-M6D组转入293细胞中表达得到的蛋白进行杂交后得到的图谱；

图15为采用Western Blot的方法检测细胞裂解液中total-Oct4的表达量的图谱。

下面对本发明的内容做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。本发明所用的试剂均为市售。

具体实施方式

实施例1 Oct4磷酸化位点单克隆抗体的制备方法；

1：多肽合成

合成磷酸化的多肽：Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His50mg，非磷酸化的多肽：Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His 20mg。

2：血清阶段

兔子经过5次免疫后，取全血，析出血清，检测血清的滴度。使用部分血清用western blot的方法检测与抗原反应的特异性，筛选出特异性较强的免疫兔。

3：细胞融合

筛选出的兔子的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例混合在一起，加入45％PEG溶液，37C水浴90s，加入培养液终止PEG作用，使用选择培养基进行培养，只有融合成功的细胞可以存活。

4：初筛

脾细胞融合后14-18天，对融合细胞进行酶联免疫试验(ELISA)进行初筛，使用非磷酸化的多肽Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His包被反应板，将血清添加入反应板进行抗原抗体反应，筛选出阳性克隆继续维护，然后将ELISA阳性的克隆转入24孔培养。

5：复筛

将24孔板的上清进行ELISA复筛，分别使用磷酸化的多肽Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Valp-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His和非磷酸化的多肽Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-Met-His包被反应板，将血清添加入反应板进行抗原抗体反应与磷酸化的多肽反应阳性而非磷酸化的多肽反应阴性克隆继续维护，得到上清中抗体与抗原反应的特异性的阳性克隆；用蛋白印迹方法(western blot)检测这些阳性克隆的上清中抗体与抗原反应的特异性，具体方法：分别将Oct4的磷酸化及非磷酸化表达质粒导入293细胞中，使其产生Oct4的磷酸化及非磷酸化的蛋白，将这些细胞裂解液中的蛋白转移到杂交膜上，用阳性克隆的上清进行抗原抗体免疫反应，进一步筛选出特定氨基酸位点磷酸化的特异性抗体。

6：腹水制备

在细胞株鉴定合格后，收集合格杂交瘤细胞加于PBS(PH值7.4)或生理盐水(无菌)中，200万～500万/只鼠进行腹腔注射。杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后5-7天即可产生腹水。用无菌注射器抽取约2～5ml/只。隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次。取腹水后置4℃过夜。离心500rpm×10min。取上清获得单克隆抗体。

实施例2 Oct4磷酸化位点多克隆抗体的制备方法

1：多肽合成

合成磷酸化的多肽Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser Pro-NH215mg，非磷酸化的多肽Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-NH211mg。

2：动物免疫

选用健康家兔2只，经过5ml/只、5次免疫后，收集血清50-70ml/只。

3：免疫血清的鉴定

应用酶联免疫试验，分别将10ug/ml抗原磷酸化的多肽Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-p-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-NH₂及非磷酸化的多肽Gly-Glu-Ala-Phe-Pro-Ser-Val-Pro-Val-Thr-Ala-Leu-Gly-Ser-Pro-NH₂包被反应板，将血清添加入反应板进行抗原抗体反应，筛选出与磷酸化的多肽反应阳性而非磷酸化的多肽反应阴性的动物血清；用蛋白印迹方法(western blot)检测这些动物血清中抗体与抗原反应的特异性，具体方法为：分别将Oct4的磷酸化及非磷酸化表达质粒导入293细胞中，使其产生Oct4的磷酸化及非磷酸化的蛋白，将这些细胞裂解液中的蛋白转移到杂交膜上，动物血清进行抗原抗体免疫反应，进一步确定特定氨基酸位点磷酸化的特异性抗体。

实施例3 Oct4磷酸化位点的分析实验

首先使用NetPhos software 2.0(Blom et al.，1999)分析Oct4蛋白的氨基酸残基，分析的结果是C末端的T343是潜在的磷酸化位点。

设计引物，用聚合酶链式反应(PCR)的方法截掉T343位点，构建N6蛋白表达质粒，构建质粒的示意图如附图1所示，将构建得到的N6蛋白表达质粒转入293细胞中使其表达，收集细胞裂解液，用Oct4抗体进行免疫沉降后转移至杂交膜上，用抗磷酸化苏氨酸的抗体进行杂交，同时设计对照组，对照组为全长的Oct4组，通过免疫沉降及免疫印迹实验得到图谱如附图2所示，同时通过Odyssey infrared imaging system对条带的粗细及辉度进行扫描，用扫描磷酸化Oct4条带获得的数值除以非磷酸化的Oct4的总蛋白的数值，计算得到其柱状图如附图3所示，根据附图3可看到，N6蛋白的磷酸化水平显著降低。

同样的，利用聚合酶链式反应(PCR)的方法把T343位点的苏氨酸突变为非磷酸化的丙氨酸T343A，同时设计对照组，对照组为正常野生Oct4。通过免疫沉降及免疫印迹实验得到实验结果如附图4所示，同时通过Odyssey infrared imaging system对条带的粗细及辉度进行扫描，用扫描磷酸化Oct4条带获得的数值除以非磷酸化的Oct4的总蛋白的数值，计算得到其柱状图如附图5所示，根据附图5可看到，T343A蛋白的磷酸化水平也显著降低，因此认为T343是Oct4蛋白的主要磷酸化位点。

实施例4：Oct4在343位苏氨酸的磷酸化通过对下游基因表达调控影响干细胞的自我复制及多潜能性实验

为了探讨Oct4的磷酸化的在自我更新和全能性的胚胎干细胞的生理功能，将非磷酸化状态的Oct4突变体T343A-Oct4(T343A)包装为腺病毒，用10⁵pfu/1000cells的病毒浓度感染胚胎干细胞系E14，以观察T343A-Oct4对胚胎干细胞的多潜能性及自我复制能力的影响，如图6和7所示，病毒感染后72小时，进行碱性磷酸酶染色实验，观察碱性磷酸酶阳性的E14细胞的克隆数，以评价胚胎干细胞的自我复制能力及多潜能性。突变组碱性磷酸酶染色检测细胞集落数数量明显减少与对照组(模拟组和正常Oct4组)，说明T343位苏氨酸的磷酸化对胚胎干细胞的多潜能性及自我复制能力的维持非常重要。

其中，采用倒置显微镜放大10倍后获得图6所示的照片，从左到右依次为对照组、Oct4组、T343A组碱性磷酸酶染色后的细胞集落数数量图，

图7显示的是在倒置显微镜的观察病毒浓度感染胚胎干细胞系E14，放大40倍后每个视野计数克隆的数目，统计比较结果。

当非磷酸化状态的Oct4突变体T343A-Oct4(T343A)的腺病毒感染胚胎干细胞后，收集细胞裂解液，用免疫印迹方法(western blot)测量下游基因Sox2、Nanog的表达，如附图8所示，这两个维持胚胎干细胞的多能性的分子Sox2、Nanog在T343A-Oct4的感染的细胞中表达减少，其中α-Tubulin作为对照表明免疫印迹实验电泳中各泳道的蛋白上样量相等。

附图8为为Sox2、Nanog在T343A-Oct4的感染的细胞中表达的免疫印迹法的图谱，从左到右依次为对照组、Oct4组、T343A组碱性磷酸酶染色后的细胞集落数数量图；

同时用荧光素酶报告系统分析T343A-Oct4对Nanog和Sox2的启动子活性的影响。将T343A-Oct4的表达质粒及Nanog或Sox2的启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞中，通过测量荧光素酶的表达量检测Oct4的T343位的突变体对下游基因的调控作用的变化，结果显示T343A-Oct4使得Nanog和Sox2的启动子的活性明显降低，如附图9、10所示：

其中在图9所示的实验结果中：分为3组，其中，pBK-null组为空白对照，pBK-Oct4组为将Oct4的表达质粒及Sox2启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞中；T343A组为将T343A-Oct4的表达质粒及Sox2启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞中；通过用荧光素酶检测试剂盒(Luciferase assay kit)，使用Multimode Microplate Reader仪器测量荧光素酶的表达量，通过荧光强度的计算可知，转入Oct4的T343位的突变体的荧光素酶的表达量较正常组显著下降，表明Oct4的非磷酸化状态影响了对下游基因Sox2的表达水平；

其中在图10所示的实验结果中：分为3组，其中，pBK-null组为对照，pBK-Oct4组为将Oct4的表达质粒及Nanog启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞中；T343A组为将T343A-Oct4的表达质粒及Nanog启动子荧光素酶报告质粒同时转入293细胞中；通过用荧光素酶检测试剂盒(Luciferase assay kit)，使用Multimode Microplate Reader仪器测量荧光素酶的表达量，通过荧光强度的计算可知，转入Oct4的T343位的突变体的荧光素酶的表达量较正常组显著下降，表明Oct4的非磷酸化状态影响了对下游基因Nanog的表达水平；

因此，Oct4的T343位点的磷酸化是Oct4调控下游基因Sox2及Nanog所必须的。

同时，我们还进行了利用胚胎干细胞碱性磷酸酶染色检测细胞集落数的拯救实验，在单独导入突变的T343A-Oct4时，胚胎干细胞的碱性磷酸酶阳性克隆数降低，如图11中的T343A组所示，在T343A-Oct4病毒感染的胚胎干细胞基础上分别导入Sox2或Nanog后，如图11中的T343A+Sox2组、T343A+Nanog组所示，细胞的克隆数有较大程度的恢复，因此，T343A-Oct4对胚胎干细胞的自我更新和全能性的影响是通过调节Sox2及Nanog的表达来实现，如附图11和附12所示。

其中图11为Sox2、Nanog的拯救实验结果。观察胚胎干细胞E14碱性磷酸酶染色检测细胞集落数，当Oct4突变为T343A后，观察胚胎干细胞E14的克隆形成能力有显著下降，当转入Sox2或Nanog的质粒使其表达后，E14细胞受损克隆形成能力得到恢复，本图是拯救实验的明场照片，采用倒置显微镜放大40倍后拍照；

图12为拯救实验结果采用克隆数计数的方法统计得到的柱状图，其中T343A+Sox2组、T343A+Nanog组与单独导入T343A-Oct4组相比，差异显著。

实施例5：Oct4在343位苏氨酸突变后对早期胚胎发育的影响

为了研究Oct4的磷酸化在胚胎胚胎发育中的作用，在体外将Oct4或T343A-Oct4转录为mRNA，用微量注射的方法注入小鼠受精卵。将小鼠受精卵分为三组：对照组、Oct4组(注射Oct4的mRNA)、T343A-Oct4组(注射T343A-Oct4的mRNA)，观察胚胎发育；

在24小时至92小时的时间段衡量胚胎发育，如图13和表1所示，在24小时的2细胞阶段Oct4及T343A-Oct4的注入没有差异。经过46小时，与对照组及正常Oct4组比较，注入T343A-Oct4 mRNA的组的胚胎发育迟缓，只有67.6％的胚胎发育到6-8细胞期。在68小时，只有35.3％的T343A-Oct4组胚胎发育为桑葚胚。在92小时，只有26.5％的T343A-Oct4组胚胎发育为囊胚。

图13为小鼠受精卵注射Oct4或T343A-Oct4转录的mRNA后的发育状况图；采用倒置显微镜放大40倍后的照片。

表1：T343A对于小鼠早期发育的效果比较表

	对照组	Oct4组	T343A组
				小鼠受精卵注射数量	32	33	34
24小时(2个细胞)	29(90.6％)	31(93.9％)	34(100％)
				46小时(6～8个细胞)	29(90.6％)	32(97.0％)	23(67.6％)
68小时(桑葚胚)	31(96.9％)	31(93.9％)	12(35.3％)
				92小时(胚囊)	27(94.4％)	27(81.5％)	9(26.5％)

结论：Oct4-343位苏氨酸的磷酸化是早期胚胎发育必不可少的。

实施例6：Oct4蛋白343位苏氨酸磷酸化抗体的特异性检测

用定点突变的方法在野生型Oct4表达质粒的基础上构建T343苏氨酸位点突变为丙氨酸Oct4-T343A的表达质粒pBK-M6A、构建T343苏氨酸位点突变为天冬氨酸Oct4-T343D的表达质粒pBK-M6D，并设计空白质粒empty，分别将这几种质粒转入293细胞中使其表达，用免疫印迹Western Blot的方法检测细胞裂解液中total-Oct4的表达量，如图15所示，野生型Oct4(wt)、Oct4-T343A、Oct4-T343D三组均表达total-Oct4。

图15为采用Western Blot的方法检测细胞裂解液中total-Oct4的表达量的图谱；

由于Oct4-T343D是磷酸化状态，而Oct4-T343A是非磷酸化状态，当用制备的抗T343位苏氨酸磷酸化的单克隆抗体进行杂交时，得到免疫印迹western blot的实验结果如图14所示。

其中图14为采用实施例1制备的抗T343位苏氨酸磷酸化的单克隆抗体对本实施例中得到的空白质粒empty、野生型Oct4的pBK-wt组、pBK-M6A组、pBK-M6D组转入293细胞中表达得到的蛋白进行杂交后得到的图谱；

由图14可以看到pBK-wt、pBK-M6D的蛋白显示了特异的条带，而pBK-M6A蛋白未见特异条带，因此，所制备的Oct4343位苏氨酸磷酸化抗体是非常特异的，能够有效识别Oct4蛋白在343位苏氨酸的磷酸化状态。

Claims

1.一种抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗体是针对Oct4蛋白343位氨基酸磷酸化的抗体，其中，所述的抗体为由第8位氨基酸磷酸化的多肽SEQ ID NO:1和非磷酸化的多肽SEQ ID NO:1进行筛选、得到与磷酸化的多肽反应为阳性而非磷酸化的多肽反应为阴性的克隆制备而成。

2.根据权利要求1所述的抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗体的为单克隆抗体或多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

（1）合成多肽

合成50mg的磷酸化的多肽第8位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO:1，20mg非磷酸化的多肽SEQID NO:1；

（2）血清阶段

（3）细胞融合

筛选出的兔子的脾细胞与小鼠SP2/0细胞进行融合；

（4）初筛

脾细胞融合后14～18天，筛选阳性克隆进行细胞培养；

（5）复筛

将孔板的上清进行酶联免疫试验复筛，复筛时，分别使用第8位氨基酸磷酸化的多肽：SEQ IDNO:1和非磷酸化的多肽：SEQ ID NO:1包被反应板，将血清添加入反应板进行抗原抗体反应，筛选出与磷酸化的多肽反应阳性而非磷酸化的多肽反应阴性克隆继续维护，得到上清中抗体与抗原反应的特异性的阳性克隆；

（6）腹水制备

4.根据权利要求2所述的抗磷酸化Oct4蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗体的为多克隆抗体的制备方法为包括以下步骤：

（1）多肽合成

合成磷酸化的多肽：第10位氨基酸磷酸化的SEQ ID NO:215mg，非磷酸化的多肽：SEQID NO:211mg；

（2）动物免疫

选用健康家兔2只，经过5ml/只、5次免疫后，收集血清50～70ml/只；

（3）免疫血清的鉴定

利用10ug/ml抗原包被，ELISA的方法鉴定血清的效价及特异性。

5.权利要求1所述的抗体用于检测Oct4蛋白343位苏氨酸的磷酸化的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当Oct4蛋白343位氨基酸磷酸化时，Oct4蛋白对下游基因Nanong、Sox2的正向调控能力下降，从而失去维持干细胞自我复制及多潜能分化的能力。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用包括所述的抗体在检测干细胞增殖、细胞分化、干细胞多潜能性、干细胞自我复制能力中的应用。