CN104232590A - 一种卵泡抑素样蛋白1的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发现涉及卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)在体内促进肺纤维化疾病进程的功能，以及抗FSTL1抗体用于治疗、缓解或改善肺纤维化疾病或症状中的用途。

Description

一种卵泡抑素样蛋白1的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，特别涉及一种中和卵泡抑素样蛋白1的单克隆抗体及其在调节组织纤维化中的用途。

背景技术

脏器纤维化的本质是组织遭受损伤后的修复反应，以保护组织器官的相对完整性。纤维化可发生于多种器官，主要病理改变为器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，增生的纤维结缔组织虽然修复了缺损，但却不具备原来器官实质细胞的结构和功能。纤维化持续进展可致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。据美国政府相关机构统计，发达国家各类因病死亡的病人中，45％～55％是死于某种类型的脏器纤维化疾病。脏器纤维化疾病是目前国际医学领域研究的重大难点和热点问题。

肺纤维化是最重要的脏器纤维化，它是因慢性、反复性、多灶性肺实质损伤而触发，以肌纤维母细胞积累和胶原等细胞外基质过度沉积为特征，从而导致肺泡和肺间质出现不同程度的炎症和纤维化，进而导致肺结构破坏和呼吸衰竭。肺纤维化严重威胁人类健康，发病机制未明确，尚无有效的药物治疗措施。肺移植是现在唯一有效的治疗手段。不幸的是，肺移植后的IPF病人5年生存率低于50％。因此，以肺纤维化发生发展的分子生理病理机制为基础，探讨新的潜在药物靶点，对于开发有效抗纤维化治疗具有重要的社会意义和科学意义。

肺纤维化成因复杂，TGF-β是目前已知最重要的一类促纤维化因子，具有诱导纤维母细胞增殖分化成肌纤维母细胞，促进胶原等ECM的合成等作用，是肺纤维化疾病发生发展的总开关(master switch)。TGF-β及其下游信号在IPF的发病机制中的关键作用，使之成为一个有吸引力的治疗目标。然而，由于TGF-β在正常组织稳态中的多效性，使得在治疗中完全抑制TGF-β将会产生严重的副作用。确定和靶向TGF-β信号的组织或疾病特异性的调控机制是近年来肺纤维药物研发重点。例如整合素αvβ6在肺纤维化发病时表达上调，可在肺局部微环境中结合并激活TGF-β前体。低剂量的整合素αvβ6抗体并不影响肺泡炎症细胞数以及巨噬细胞活化标志物，但可显著抑制胶原沉积，肺纤维化。目前，人源化的抗整合素β6单克隆抗体已进入治疗IPF患者的临床试验阶段。尽管近年来在肺纤维化的治疗领域已经取得了诸多进展，但是许多治疗方案和药物仍然无法获得令人满意的疗效。在世界范围，尤其是中国，肺纤维化的治疗仍然是临床上亟待解决的课题之一。因此，本领域非常需要发现更多的可干扰TGF-β信号的分子，为治疗IPF等肺纤维化疾病提供潜在的分子靶点和治疗手段。

卵泡抑素样蛋白1(Follistatin-like1，FSTL1)是最早由Shibanuma M等从小鼠成骨细胞MC3T3-E1中克隆得到一个可被TGF-β1诱导的基因。该基因编码一种可分泌的小分子糖蛋白(38kD)，已有的研究表明FSTL1作为BMP4的抑制因子在肺的发育过程中起重要作用。此外，FSTL1在肺癌和卵巢癌细胞中被认为是一个可能的肿瘤抑制基因，在类风湿关节炎中是一个免疫调节因子。研究表明FSTL1在心脏中是一个受Akt调控的心脏保护因子，可以通过介导心肌AMP激活的蛋白激酶活化来拮抗心肌肥厚。最近有报道关于FSTL1促进TGF-β在肺纤维化疾病中起作用，但没有人公开抗FSTL1抗体能够抑制肺纤维化。

滤泡素抑制素样蛋白1(FSTL1)是一种多功能的分泌性糖蛋白，是一个具有促进组织纤维化的调节因子。本发明涉及可阻断FSTL1生物活性的单克隆抗体及其制备方法，和该单克隆抗体在调节各种纤维化肺疾病(例如特发性肺纤维化疾病(IPF))中的用途，包括可以用来治疗、缓解或改善纤维化肺疾病或症状。

发明内容

本发明公开一种中和性抗体，其中所述抗体包含至少1个抗体重链可变区和至少1个抗体轻链可变区，并且其中所述抗体重链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1由SEQ ID NO：1组成、CDRL2由SEQ ID NO：2组成和CDRL3由SEQ IDNO：3组成；和其中所述抗体轻链可变区具有选自CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1由SEQ ID NO：4组成、CDRH2由SEQ ID NO：5组成和CDRH3由SEQ ID NO：6组成。

本发明公开一种分离的核酸，所述核酸编码本发明抗体的至少一个重链可变区SEQIDNO：7和轻链可变区SEQ IDNO：8。

本发明公开一种包括上述核酸的表达载体，其中在用所述载体转染宿主细胞时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。

本发明公开一种包括上述表达载体的宿主细胞。

本发明公开一种治疗、缓解或改善组织纤维化疾病的药物组合物，包含本发明的中和性抗体。

含有本发明的中和卵泡抑素样蛋白1的单克隆抗体重链和/或轻链可变区编码基因的表达载体，转基因细胞系和菌种均属于本发明的保护范围。

含有本发明的中和卵泡抑素样蛋白1的单克隆抗体重链和/或轻链可变区编码基因中的任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明公开一种生产多肽的方法，包括在表达核酸序列的条件下在培养基中培养宿主细胞，由此产生含有所述轻链和重链可变区的多肽；和由宿主细胞或培养基回收所述多肽。

本发明公开的中和性抗体在制备治疗或调节组织纤维化的药物中的应用，特别是对治疗、缓解或改善纤维化肺疾病的药物中的应用，优选针对特发性肺纤维化的应用，所述纤维化肺疾病症状选自：特发性肺纤维化、尘肺、放射线诱导肺纤维化。

本发明公开的中和性抗体通过抑制肌纤维母细胞的积累以及随后的胶原等胞外基质的合成和沉积达到治疗或调节组织纤维化的作用，具体地讲抗体具有在体外抑制原代肺纤维母细胞中TGF-b1/Smad2/3信号的作用。还可以通过抑制肌纤维母细胞特征蛋白(如a-SMA)表达上调来抑制肌纤维母细胞的积累，或通过抑制I型胶原(ColI)、纤粘连蛋白(fibronectin)等胞外基质蛋白表达上调来抑制胶原等胞外基质的合成和沉积。

发明人在研究中发现FSTL1通过促进肺肌纤维母细胞的积累以及随后的胶原等胞外基质的合成和沉积，参与纤维化肺疾病的进行性发展。本发明涉及可结合并阻断FSTL1生物活性的抗体及其在降低肺肌纤维母细胞的积累以及随后的胶原等胞外基质的合成和沉积从而治疗、缓解或改善纤维化肺疾病和症状中的用途。

进一步，发明人在研究中还发现FSTL1可促进TGF-β/Smad2/3信号，促进TGF-β诱导的肺纤维母细胞向肌纤维母细胞分化，进而促进肌纤维母细胞的大量积累以及随后的胶原等胞外基质的合成和沉积。本发明涉及可结合并阻断FSTL1生物活性的抗体及其在抑制TGF-β/Smad2/3信号从而治疗、缓解或改善纤维化肺疾病和症状中的用途。

本发明筛选出高亲和力及中和活性的单克隆抗体，从中克隆出可变区基因，在治疗、缓解或改善纤维化肺疾病或症状中具有巨大的应用前景。

本发明中名词术语的定义与解释

根据本发明，术语主要试剂是指博莱霉素(Bleomycin)购自日本化药株式会社(批号：Y91450)。

根据本发明，术语人类样本是指通过支气管镜肺活检获取IPF患者的肺组织样本。根据体检、肺功能测定(PET)、胸部高分辨率计算机断层(HRCT)扫描以及支气管肺泡灌洗(BAL)检测结果确诊为IPF患者(N＝5)。5名患者为2名女性、3名男性，平均年龄为63.2年(53-67)，平均FEV1为58.9±13.8％。北京朝阳医院组织库提供年龄和性别匹配的对照样本，包括肺癌患者(N＝4)和移植供体(N＝1)的正常组织学肺组织标本。这项研究获得北京朝阳医院医学研究伦理委员会的批准。

根据本发明，术语原代人类肺成纤维细胞是指原代人类肺成纤维细胞分离自IPF患者和对照组的肺组织，由C.A.Feghali-Bostwick提供(美国匹兹堡大学医学院，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)。

根据本发明，术语Fstl1单倍敲除小鼠(Fstl1^+/-)是指通过标准的同源重组方法获得Fstl1^flox/+小鼠(南京大学模式动物研究所提供)。Fstl1^flox/+小鼠中，Fstl1的外显子2(包含有信号肽)位于两个LoxP位点之间。Fstl1^flox/+小鼠与EIIa-Cre转基因小鼠(Jackson实验室，美国)进行交配，得到Fstl1表达缺失的嵌合鼠，嵌合鼠进一步与C57BL/6J小鼠回交以产生Fstl1单倍敲除小鼠(Fstl1^+/-)。在本研究中所用的Fstl1^+/-小鼠是与C57BL/6J小鼠回交至9代以后的Fstl1^+/-小鼠。

本研究所使用的小鼠规格均为SPF级，用于回交以及中和性抗体实验的C57BL/6J小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2009-0015。小鼠饲养于南开大学生命科学学院，恒温恒湿，自由饮食。

根据本发明，术语肺纤维化动物模型制备是指雄性Fstl1^+/-及同窝野生型(周龄8-10周)小鼠，以7.5％水合氯醛按0.6ml/100g腹腔(I.P.)注射麻醉小鼠，气管内注射博莱霉素2.5U/kg(低剂量)或5U/kg(高剂量)。具体方案如下：称量体重并记录后将小鼠固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，利用手术刀在小鼠颈部垂直划开大约1cm长，利用显微镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，然后按2.5U/kg或5U/kg的计量缓慢注入与其体重相适应体积的博莱霉素生理盐水溶液，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。假手术组气管内注射等量的注射用生理盐水。

根据本发明，术语小鼠存活率统计是指Fstl1^+/-及同窝野生型小鼠各19只，在5U/kg博莱霉素给药后第1天到第21天期间，每天同一时间10：00)对其称重，记录每只小鼠每天的体重变化及两组中各自死亡小鼠的数量。利用GraphPad Prism软件对量组小鼠21天内存活率进行比较。

根据本发明，术语支气管肺泡灌洗是指小鼠全身麻醉后，经气管插入导管，以0.8mlPBS灌洗肺部三次。第一次灌洗液经离心收集上清，用于ELISA检测。三管离心收集活细胞，血细胞计数器记录总细胞数，离心制作细胞涂片，苏木精-伊红(H&E)染色后，进行细胞分类计数，包括淋巴细胞、中性粒细胞以及巨噬细胞。

根据本发明，术语Masson trichrome染色组织学分析是指取小鼠左侧肺组织，中性福尔马林固定后石蜡包埋，从肺组织的肺门处开始进行切片，传统Masson染色观察纤维化状况、胶原沉积。应用正置透射荧光显微镜(LeicaDFC420C)采集图像数据(200倍放大)，在Image-Pro Plus Version6.0(Media Cybernetics，Inc.American)中打开，利用软件选区工具选定全部肺组织区域，利用软件自动计算功能得出所选区域的总像素Pw，然后用同样的方法选取该切片中纤维化的区域利用软件计算出纤维化区域的总像素Pf，纤维化区域总像素Pf与全肺总像素Pw之比即为纤维化所占比例。

根据本发明，术语羟脯氨酸含量测定是指每组选取7只雄性小鼠分别在博莱霉素注射0天、7天、14天和21天处死小鼠，取右肺，剔除支气管，放于5ml安瓿瓶，烘干，酸水解，调整其PH到6.5-8.0，过滤残渣，PBS调整其总体积为10ml，取50ul样品，加入350ul去离子水，加入200ul氯胺T(Chloramine T)溶液室温孵育20分钟；加入200ul高氯酸(perchloric acid)室温孵育5分钟；加入200ul对二甲氨基苯甲醛(P-DMAB)65℃孵育20分钟。取200ul至96孔板中测定样品557nm的吸光值，利用标准品读数绘制标准曲线，进而利用标准曲线所得公式求得所测样品羟脯氨酸浓度Cs。按以下公式换算为全部右肺所含羟脯氨酸的量W∶W＝Cs×8(所测样品稀释倍数)×10(样品总体积)。

根据本发明，术语免疫组织化学实验是指5-μm厚肺组织切片经脱蜡脱水，用柠檬酸盐缓冲液通过高压加热进行抗原修复，稀释在抗体稀释液中的抗-Fstl1一抗(Abmart，上海，中国)4度孵育过夜，PBS洗后，HRP聚合的鼠兔二抗(迈新，福州，中国)孵育15分钟，PBS洗后，在显微镜下进行DAB(迈新，福州，中国)显色观察，显色完毕，纯水洗后，进行逐步脱水，浸二甲苯，中性树脂封片，切片用正置透射荧光显微镜(LeicaDFC420C)采集图像数据。

根据本发明，术语用于免疫荧光的一抗为Endomucin(eBioscience)、α-SMA(Santa CruzBiotechnology)。一抗4度孵育过夜，PBS洗后，加入PBS稀释的荧光标记二抗(Invitrogen)，室温孵育2小时，PBS洗后，用带DAPI的封片剂(Santa Cruz Biotechnology)封片，切片用激光共聚焦显微镜(TCS SP5)采集图像数据并分析。

根据本发明，术语细胞培养是指小鼠原代肺成纤维细胞分离与培养，方法为：博莱霉素处理0、14天的小鼠麻醉后，PBS肺灌洗后，去除大气道，剪碎在消化液(2.4U/ml Dispase，0.05％四型胶原酶和50ug/ml DNase I)中，37度震荡消化1小时，离心沉淀细胞，加入含10％胎牛血清(Hyclone)和抗生素的DMEM培养基(Gibco)，放置于CO2培养箱中培养。原代肺成纤维细胞在3-6代使用。细胞100％长满后，血清饥饿24小时，加入5ng/ml TGF-β1和/或100ng/ml FSTL1蛋白进行不同时间的培养，刺激30分钟进行Smad信号通路检测，刺激24小时后检测α-SMA和ECM蛋白的表达水平。

根据本发明，术语Hep3B，HEK293细胞培养是指从American Type Culture Collection(ATCC)获得肝癌细胞系Hep3B和人胚肾细胞系HEK293，细胞在含10％胎牛血清(Hyclone)和抗生素的DMEM培养基(Gibco)中放置于CO2培养箱中培养。

根据本发明，术语FSTL1-His融合蛋白的生产和纯化是指本发明人将小鼠FSTL1去除信号肽的编码序列(序列参见GenBank登录号：NM_007085.4)插入pMT/Bip/V5-HisA质粒的Xho I/Nco I酶切位点内。通过cellfectin脂质体转染试剂将此质粒以及抗性筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞，利用25mg/L Blasticidin筛选获得稳定细胞系。细胞扩大培养到3×10⁶-5×10⁶/ml时，加入0.5mmol/L的硫酸铜诱导蛋白表达，72h后收集上清，利用超滤杯(Amicon Stirred Cell8003)浓缩蛋白，并通过Ni-NTA纯化。

根据本发明，术语Western Blotting检测是指小鼠右肺组织在含1mM PMSF的62.5mMTris溶液中匀浆，离心得到肺组织蛋白。细胞用RIPA裂解液裂解获得细胞总蛋白。利用BCA系统(Pierce)测定蛋白浓度。细胞上清蛋白用饱和三氯乙酸(TCA)沉淀，并溶于1×sample buffer；细胞与组织蛋白中加入sample buffer，100度变性，利用不同浓度的SDS-PAGE胶分离蛋白。将蛋白湿转到PVDF膜(Roche)上，牛奶封闭后，一抗4度孵育过夜，含0.1％的TBS溶液洗后，HRP酶标二抗室温孵育2小时。利用ECL系统(Pierce)检测蛋白表达量。用于Western blotting的一抗：FSTL1、Fibronectin、type I collagen、α-SMA、β-actin、His、HA and Myc(Santa Cruz Biotechnology)；phosphor-Smad2、total-Smad2、phosphor-Smad3and total Smad3(Cell Signaling Technology)；andTGF-β1(R&D).

根据本发明，术语Pull-down检测是指His标记的小鼠FSTL1蛋白与100ng重组人TGF-β1蛋白或IgG(阴性对照)在4℃孵育过夜。His标记的FSTL1蛋白被Ni-NTA琼脂糖凝胶捕获并浓缩。本发明人将小鼠FSTL1的编码序列(序列参见GenBank登录号：NM_007085.4)插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO质粒的Xho I/Nco I酶切位点内(pc-Fstl1质粒)。通过脂质体转染法将TβRII-HA(或TβRI-HA)和/或myc-His标记的Fstl1质粒转染到HEK293细胞中。而HA标记的TβRII(或TβRI)蛋白被HA琼脂糖凝胶捕获。通过脂质体转染法将HA标记的TβRII质粒转染到Cos7细胞中。利用HA琼脂糖凝胶浓缩TβRII蛋白，与100ng FSTL1蛋白以及不同浓度的TGF-β1蛋白在4℃孵育过夜。捕获的蛋白溶于2×sample buffer中，100度分离变性，离心取上清进行Western blot检测。

根据本发明，术语实时荧光定量PCR是指从人以及小鼠肺组织中利用Trizol(Invitrogen)制备总RNA，利用ThermoScript RT-PCR试剂盒(Invitrogen)合成cDNA，使用SYBR Green试剂盒(Roche)检测FSTL1，Fstl1，Fsp1，α-SMA，Colla1，fibronectin和TGF-β1的表达。GUSB和β-actin作为内参。各基因引物列于表1。

根据本发明，术语荧光素酶报告基因检测是指通过脂质体共转染CAGA-荧光素酶报告基因和持续激活ALK4(caALK4)或caALK5或/和pc-Fstl1质粒，Renilla荧光素酶质粒作为内参。转染36小时后，根据说明书(Promega)测定细胞裂解液中双荧光素酶的活性。

根据本发明，术语流式细胞仪分析(FACS)是指6对Fstl1^+/-及同窝野生型小鼠在博莱霉素处理7天后，利用消化液(含150U/ml的四型胶原酶，50U/ml的DNA酶I，5％小牛血清的PBS)在37度消化肺组织30分钟，过滤，PBS洗涤，收集细胞，利用CD3，CD4，CD8，NK1.1(CD161)，B220，CD11b，CD11c，Gr-1，IA-b抗体进行染色，通过FACScaliber分析流式细胞仪(Becton-Dickinson细胞免疫系统)对淋巴细胞以及巨噬细胞进行分型，并利用Flowjo软件进行分析。

根据本发明，术语酶联免疫吸附法(ELISA)是指小鼠肺灌洗液、肺组织蛋白以及原代肺成纤维细胞上清利用商业ELISA试剂盒检测活性TGF-β1，IL-13，IFN-γ(eBioscience)和一型胶原(Chondrex LLC)的表达。

根据本发明，术语统计学处理是指本实验所有数据以平均值±标准差(mean±SEM)，实验组和对照组测量数据间的差异，使用SPSS软件对线性数据进行t检验，对非线性数据进行Wilcoxon rank-sum检验，使用log-rank检验生存曲线比较。P＜0.05被认为具有显著统计学意义。

本发明首次揭示了FSTL1与肌纤维母细胞的积累以及随后的胶原等胞外基质的合成之间的关系，从而提供了一种通过调节肌纤维母细胞的积累以及胞外基质的合成，从而用于治疗、缓解或改善与组织纤维化相关的疾病或症状的新方法和组合物。

本发明为治疗组织纤维化疾病提供了药物的筛选提供了良好的途径。可以以肌纤维母细胞的积累以及胞外基质的合成作为药物筛选靶点，筛选治疗组织纤维化疾病的药物。也可以FSTL1作为药物筛选靶点，筛选抑制FSTL1表达和阻断FSTL1生物活性的物质从而用于制备治疗组织纤维化疾病的药物。

附图说明

图1：Fstl1在IPF患者和博莱霉素处理的小鼠肺组织中高表达。

图2：Fstl1缺失可减轻博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。

图3：Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠对博莱霉素诱导的肺损伤具有相似的炎症反应。

图4：Fstl1缺失抑制博莱霉素诱导的小鼠肺组织中肌纤维母细胞积累。

图5：Fstl1促进TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化。

图6：Fstl1通过促进TGF-β1信号来调控肌纤维母细胞的分化。

图7：Fstl1中和性抗体的筛选和验证。

图8：Fstl1中和性抗体阻断肌纤细胞活化和胞外基质合成的体外检测

图9：Fstl1中和性抗体减轻博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.Fstl1在IPF患者肺组织以及博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中高表达

为了确定Fstl1在特发性肺纤维化疾病中表达是否异常，首先，利用2005年Pardo等人所公布的IPF病人与正常人肺组织的基因分析数据，分析发现与正常肺组织相比，在IPF病人肺组织中FSLT1mRNA表达量增加了2.4倍(图1中A)。

利用实时定量PCR分析来自于北京朝阳医院的人肺组织，进一步确定FSTL1mRNA表达量在IPF病人肺组织中明显高于正常肺组织(1.7倍，P＜0.05，图1B)；而在IPF病人肺成纤维细胞中，FSTL1mRNA表达量是正常肺成纤维细胞的2.3倍(图1C)。

此外，利用博莱霉素诱导肺纤维化这一被广泛使用的动物模型进一步研究FSTL1的作用。在博莱霉素所诱导的肺纤维化发生过程中，FSTL1的mRNA以及蛋白表达水平在博莱霉素处理7天的时候开始增加，并在14天时达到最高，但在处理21天后恢复基础水平(图1D和E)。

同时，在博莱霉素处理14天的肺组织中，也观察到FSTL1染色主要集中在纤维化区域中(图1F)。

图1为Fstl1在IPF患者和博莱霉素处理的小鼠肺组织中高表达。(A)IPF患者与对照正常肺组织的全部差异表达基因的microarray数据(GEO数据库：GSE2052)比较分析显示IPF患者(n＝15)肺组织中Fstl1mRNA表达明显高于对照正常肺组织(n＝11)；边框表示中间两个四分位值，包含中位数，误差线代表四分位距的1.5倍；(B)实时定量PCR检测FSTL1mRNA在IPF患者肺组织(n＝5)和对照正常肺组织(n＝5)中表达情况；以葡糖苷酸酶做为上样量对照；(C)实时定量PCR检测FSTL1mRNA在来源于IPF患者原代肺成纤维细胞(n＝4)和对照正常原代肺成纤维细胞(n＝4)中表达情况；以葡糖苷酸酶做为上样量对照；(D)博莱霉素(2.5U/kg)由气管直接注入C57BL/6J小鼠(每组5只)，处理不同时间(0、7、14和21天)，实时定量PCR检测Fstl1mRNA在小鼠肺组织中的表达情况，以葡糖苷酸酶做为上样量对照；(E)博莱霉素(2.5U/kg)处理C57BL/6J小鼠(每组5只)后不同时间(0、7、14和21天)，蛋白印迹法检测FSTL1蛋白在肺组织中的表达情况，以肌动蛋白做为上样量对照；(F)免疫组化显示博莱霉素(2.5U/kg)或生理盐水处理14天的C57BL/6J小鼠肺组织中FSTL1蛋白表达情况。FSTL1蛋白在发生纤维化区域高表达。IgG抗体染色作为阴性对照，NA表示正常区域，FA表示纤维化区域，标尺：100μm。

这些数据表明，FSTL1是一个纤维化相关基因，并且在肺纤维化的发病机制中可能起到关建作用。

实施例2.单倍敲除的Fstl1杂合子小鼠中博莱霉素诱导的肺纤维化症状明显减轻

为了进一步研究肺纤维化过程中被诱导表达的Fstl1的生物学意义，建立了Fstl1基因工程小鼠的博莱霉素所诱导的肺纤维化疾病模型。由于Fstl1基因敲除的纯合子小鼠(Fstl1^-/-小鼠)出生后死于呼吸窘迫，同野生型小鼠无任何表型差异的Fstl1基因敲除的杂合子小鼠(Fstl1^+/-小鼠)被用来研究博莱霉素所诱导的肺纤维化。首先，相比野生型小鼠，Fstl1^+/-小鼠肺组织中的FSTL1蛋白表达明显减少，而博莱霉素所诱导增加的FSTL1蛋白在Fstl1^+/-小鼠肺组织中也明显降低(图2A)。

Fstl1^+/-小鼠对博莱霉素所诱导的肺损伤具有较强的耐受性，在大剂量的博莱霉素处理21天后，Fstl1^+/-小鼠死亡率明显低于同窝野生型小鼠(图2B)。

更重要的是，博莱霉素给药后7、14、21天的肺组织学分析显示Fstl1^+/-小鼠的纤维化发展受到抑制，而对照野生型小鼠则表现出更为严重的纤维化损伤且出现类似人类IPF患者“蜂窝状”肺结构(图2C)。

此外，羟脯氨酸测定(图2D)以及Masson trichrome染色(图2E)都表明在博莱霉素诱导后Fstl1^+/-小鼠肺部胶原沉积明显减轻。对Masson trichrome染色组织切片进行纤维化的定量统计，发现Fstl1^+/-小鼠肺纤维化面积明显低于野生型小鼠(图2F)。

同时，也发现Fstl1^+/-小鼠肺组织中的I型胶原(图2G和H)以及其他细胞外基质(ECM)蛋白如fibronectin(图2I和J)的mRNA和蛋白表达水平都明显低于野生型小鼠，进一步说明Fstl1^+/-小鼠纤维化程度较轻。

图2为Fstl1缺失可减轻博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化。(A)蛋白印迹法检测5U/kg博莱霉素处理14天的Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组5只)肺组织中的Fstl1蛋白表达的区别，以肌动蛋白做为上样量对照；(B)死亡曲线，Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组29只)在5U/kg博莱霉素处理21天期间记录死亡情况，用Log-rank检验比较两组间生存率；5U/kg博莱霉素处理Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组7只)后不同时间(7、14和21天)的肺组织通过(C)苏木精伊红(H&E)染色、(D)羟脯氨酸含量测定、(E)Masson trichrome染色，显示博莱霉素诱导的进行性肺组织纤维化在Fstl1^+/-小鼠肺中明显减轻，胶原合成和沉积明显减少。(F)5U/kg博莱霉素处理21天的Massontrichrome染色的肺组织切片进行纤维化面积百分比统计，验证博莱霉素诱导的肺组织纤维化在Fstl1^+/-小鼠肺中明显减轻；(G)实时定量PCR检测(H)ELISA检测5U/kg博莱霉素处理14天的Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组5只)肺组织中的I型胶mRNA和蛋白的表达情况。验证博莱霉素诱导的胶原合成在Fstl1^+/-小鼠肺中明显减少；(I）实时定量PCR检测(J)蛋白印迹法检测5U/kg博莱霉素处理14天的Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组5只)肺组织中的纤粘连蛋白mRNA和蛋白的表达情况。验证博莱霉素诱导的纤粘连蛋白合成在Fstl1^+/-小鼠肺中明显减少。标尺：100um；**，p＜0.01，*，p＜0.05，即统计学上具有显著性差异。

以上体内数据表明，Fstl1可以在肺损伤过程中被诱导，诱导产生的Fstl1又可以作为促纤维化因子参与了肺纤维化过程。降低Fstl1的表达将有助于肺纤维化症状的缓解。

实施例3.Fstl1缺失不影响博莱霉素处理引起的肺部炎症反应

在博莱霉素损伤模型中，持续性的炎症反应常常促进纤维化的进展，但是关于炎症在肺纤维化中的作用还存在争议。由于在类风湿关节炎和心脏异体移植中，Fstl1可以调控炎症反应，检测了Fstl1^+/-小鼠与野生型小鼠在博莱霉素处理后的炎症反应。博莱霉素处理7天后，检测支气管肺泡灌洗(BAL)液中的炎症细胞，显示Fstl1^+/-小鼠与野生型小鼠肺组织中炎症细胞总数以及各类炎症细胞数(包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞)都有所增加，但并无区别(表2，图3A)。

同样的，FACS分析表明Fstl1^+/-小鼠与野生型小鼠肺组织中的淋巴细胞亚群(如CD4⁺，CD8⁺，NKT，NK and B淋巴细胞)以及肺泡、间质巨噬细胞数都没有明显区别(图3B)。

Th1/Th2细胞因子失衡在肺纤维化过程中起重要作用，其中IL-13(Th2)和IFN-γ(Th1)这两个细胞因子在IPF病人以及动物模型中的肺组织表达异常，因此检测了这两个重要的细胞因子。ELISA检测表明Fstl1^+/-小鼠与野生型小鼠肺组织以及肺灌洗液中的IL-13和IFN-γ的表达量都有所升高，但没有区别(图3C)。

图3为Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠对博莱霉素诱导的肺损伤具有相似的炎症反应。2.5U/kg博莱霉素处理Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组9只)，7天后(A)收集支气管肺泡灌洗液，分类统计炎症细胞总数和不同炎症细胞的百分比；(B)收集肺组织中炎症细胞，FACS分析B细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD4⁺淋巴细胞，CD8⁺淋巴细胞、肺泡巨噬细胞以及间质巨噬细胞数目；(C)收集支气管肺泡灌洗液以及肺组织匀浆液，ELISA检测IL13和IFN-γ表达量。结果显示Fstl1缺失并不影响小鼠对博莱霉素诱导的肺损伤产生的炎症反应。

这些数据表明Fstl1缺失并不影响博莱霉素所引起的炎症反应，Fstl1^+/-小鼠纤维化症状减轻很可能与其他病理因素有关。

实施例4.Fstl1缺失抑制博莱霉素引起的肌纤维母细胞积累

由活化的肌纤维母细胞聚集而形成的纤维化病灶是渐进性肺纤维化疾病的典型特征。为了研究在纤维化过程中Fstl1是否与肌纤维母细胞的聚集有关，利用肌纤维母细胞标记物α-SMA的抗体对肺组织切片进行染色。

图4为Fstl1缺失抑制博莱霉素诱导的小鼠肺组织中肌纤维母细胞积累。2.5U/kg博莱霉素处理Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组6只)，14天后(A)免疫荧光染色检测肌纤维母细胞特征分子α-SMA的表达。博莱霉素上调的α-SMA阳性信号在Fstl1^+/-小鼠肺中明显减少。其中绿色表示肌纤维母细胞特征分子α-SMA的表达，红色表示血管内皮细胞特征分子Endomucin的表达，蓝色表示细胞核。左上方为相应切片的苏木精伊红(H&E)染色。标尺：100μm；(B)实时定量PCR检测α-SMA mRNA在肺组织中的表达情况。*，p＜0.05，即统计学上具有显著性差异。(C)蛋白印迹法检测α-SMA蛋白在肺组织中的表达情况。以肌动蛋白做为上样量对照；A-C结果验证博莱霉素诱导的肌纤维母细胞积累表达在Fstl1^+/-小鼠肺中明显减少；2.5U/kg博莱霉素处理Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组5只)，14天后分离原代肺纤维母细胞(P0代)，(D)免疫荧光双标染色法检测纤维母细胞特征分子vimentin和肌纤维母细胞特征分子α-SMA的表达。其中绿色表示纤维母细胞特征分子vimentin的表达，红色表示肌纤维母细胞特征分子α-SMA的表达。标尺：100μm；(E)统计D检测中双染色细胞所占比例。计算肌纤维母细胞在纤维母细胞中的百分比。**，p＜0.01，即统计学上具有显著性差异；(F)蛋白印迹法检测肌纤维母细胞特征分子α-SMA、两种胞外基质蛋白胶原和纤粘连蛋白(Fn)在原代肺纤维母细胞中的表达情况。以肌动蛋白做为上样量对照。D-F结果证实在分离的原代Fstl1^+/-小鼠肺纤维母细胞(P0代)中，博莱霉素诱导的肌纤维母细胞所占比例低于同窝野生型小鼠。

图4A显示野生型小鼠肺组织中博莱霉素诱导产生的肌纤维母细胞大量聚集，但Fstl1^+/-小鼠肺组织中肌纤维母细胞明显减少。

与此相一致的是，实时定量PCR和免疫印迹实验都表明在Fstl1^+/-小鼠肺组织中博莱霉素所诱导表达的α-SMA明显低于正常小鼠(图4B和C)。

这些数据说明，Fstl1^+/-小鼠中的Fstl1缺失可能通过限制博莱霉素诱导成纤维细胞/剂纤维母细胞的积累来缓解肺纤维化症状。

此外，进一步分离了博莱霉素处理14天后的小鼠原代肺成纤维细胞，以α-SMA和成纤维细胞的标记物vimentin抗体共染原代成纤维细胞。博莱霉素处理后的野生型小鼠的成纤维细胞中有大量共染的细胞，然而只有较少的肌纤维母细胞出现在Fstl1^+/-小鼠成纤维细胞中(图4D)。统计发现，博莱霉素处理14天后，相比野生型小鼠，Fstl1^+/-小鼠成纤维细胞中的肌纤维母细胞减少了78％(图4E)。

正如预期的，Western blotting分析发现博莱霉素处理的Fstl1^+/-小鼠成纤维细胞中α-SMA表达相比野生型小鼠明显下调，进一步证明Fstl1^+/-小鼠中肌纤维母细胞聚集减少，而低表达的一型胶原以及fibronectin蛋白进一步表明了Fstl1^+/-小鼠肺纤维化程度减轻(图4F)。

体内、体外实验均说明，Fstl1在肌纤维母细胞聚集中起关键作用。

实施例5.Fstl1可以促进TGF-β1所诱导的肌纤维母细胞分化

在纤维化过程中，肌纤维母细胞在TGF-β1等刺激下可以分化表达α-SMA。TGF-β1在肺纤维化中是关键的细胞因子。与FSTL1的表达相似，TGF-β1在活化的纤维化区域中明显高表达。同时发现，在小鼠原代肺成纤维细胞中，FSTL1蛋白可以被TGF-β1所诱导表达，并依赖于TGF-β1的刺激时间(图5A)。

为了进一步研究Fstl1的具体作用，使用了TGF-β1诱导肌纤维母细胞分化这一体外模型。在野生型肺成纤维细胞中，TGF-β1可以明显增加α-SMA蛋白的表达(图5B)，这说明TGF-β1确实可以诱导肌纤维母细胞的分化。而α-SMA表达上调的同时，α-SMA免疫荧光染色显示肌纤维母细胞形成聚合的α肌动蛋白纤维(图5C)。而在Fstl1^+/-小鼠肺成纤维细胞中，TGF-β1所诱导的肌纤维母细胞分化明显被抑制(图5B和C)。

同时，用FSTL1的重组蛋白刺激肺成纤维细胞，正如预期的，FSTL1重组蛋白能促进TGF-β1所诱导的α-SMA蛋白表达(图5D)。更为重要的是，FSTL1也可以调节随后TGF-β1所诱导的细胞外基质蛋白的表达。Fstl1缺失能够明显抑制TGF-β1所诱导的一型胶原和fibronectin的表达(图5B)，而FSTL1重组蛋白又能够明显促进TGF-β1所诱导的细胞外基质蛋白的表达(图5D)。

图5为Fstl1促进TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化。(A)5ng/ml TGF-β1处理野生型小鼠原代肺纤维母细胞(P2代)不同时间(0、3、6、12、24和48小时)后，蛋白印迹法检测TGF-β1对细胞内FSTL1蛋白的表达和培养基中FSTL1蛋白的分泌的影响；5ng/mlTGF-β1处理Fstl1^+/-与同窝野生型小鼠的原代肺纤维母细胞(P2代)24小时后，(B)蛋白印迹法检测肌纤维母细胞特征分子α-SMA、两种胞外基质蛋白胶原和纤粘连蛋白(Fn)在原代肺纤维母细胞中的表达情况；(C)免疫荧光染色法检测肌纤维母细胞特征分子α-SMA的表达。其中红色表示肌纤维母细胞特征分子α-SMA的表达，蓝色表示细胞核。标尺：100μm。B和C证实FSTL1缺失抑制TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化和随后的胞外基质蛋白的合成；(D)5ng/ml TGF-β1和100ng/ml Fstl1处理野生型小鼠原代肺纤维母细胞(P2代)24小时后，蛋白印迹法检测肌纤维母细胞特征分子α-SMA、两种胞外基质蛋白胶原和纤粘连蛋白(Fn)在原代肺纤维母细胞中的表达情况。结果证实外源FSTL1促进TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化和随后的胞外基质蛋白的合成。其中以肌动蛋白做为上样量对照。

FSTL1可以被TGF-β1所诱导，并且能够与TGF-β1共同作用促进肌纤维母细胞的分化以及随后的细胞外基质的生成。

实施例6.Fstl1通过促进TGF-β1下游信号通路调节肌纤维母细胞分化

为了确定Fstl1调控肌纤维母细胞以及随后的纤维化进程的分子机制，检测了Fstl1是否调控了TGF-β1下游的Smad2/3信号通路。与野生型小鼠相比，虽然Fstl1^+/-小鼠肺组织中TGF-β1的mRNA以及活化蛋白表达水平都没有改变(图6A和B)，但是博莱霉素处理14天后的Fstl1^+/-小鼠肺组织(图6C)以及肺成纤维细胞(图6D)中的Smad2/3的磷酸化水平明显降低，这表明，Fstl1在体内可以调控TGF-β1下游的Smad2/3信号。

同样的，在体外培养的原代肺成纤维细胞中，可以观察到Fstl1缺失能够明显降低TGF-β1所诱导的Smad2/3的磷酸化水平(图6E)，而外源加入FSTL1蛋白能明显增加TGF-β1所诱导的Smad2/3的磷酸化水平(图6F)。用ALK5的选择性抑制剂SB525334处理小鼠肺成纤维细胞中，阻断活化的Smad2/3信号，可以明显抑制Fstl1所促进的TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化及随后的细胞外基质生成(图6G)。

这些数据表明，FSTL1可以通过促进TGF-β1下游的Smad2/3信号通路来促进纤维母细胞的分化，进一步促进细胞外基质的生成，最终促进肺纤维化。

由于Fstl1是一种分泌型蛋白，有理由相信它可能以配体/受体的形式来起到作用。为了验证这一可能性，使用了在无配体以及二型受体情况下也可以激活Smad2/3的组成型活化的TGF-β一型受体(caALK4和caALK5)。在Hep3B细胞中，过表达Fstl1并不促进caALK4/5所诱导活化的CAGA荧光素酶活性(图6H)，这表明Fstl1作用在TGF-β一型受体的上游。

之前的研究发现FSTL1与TGF-β1之间有微弱的结合(KD＝36nM)。而pull-down实验证实了，Fstl1确实能够直接与TGF-β1(图6I)或TGF-β二型受体(TβRII)结合(图6J)，但不与TGF-β一型受体(TβRI)结合(图6K)。并且FSTL1可以协助TGF-β1与TβRII结合(图6L)。

图6为Fstl1通过促进TGF-β1信号来调控肌纤维母细胞的分化。2.5U/kg博莱霉素处理Fstl1^+/-小鼠与同窝野生型小鼠(每组5只)14天后，(A)实时定量PCR检测的TGF-β1mRNA在肺组织中的表达水平不受影响。*，p＜0.05，即统计学上具有显著性差异；(B)ELISA检测的TGF-β1蛋白活性形式在肺组织中的水平不受影响。*，p＜0.05，即统计学上具有显著性差异；(C)蛋白印迹法检测的Smad2和Smad3磷酸化水平在Fstl1^+/-小鼠的肺组织中明显降低；(D)蛋白印迹法检测的Smad2和Smad3磷酸化水平在Fstl1^+/-小鼠的原代肺纤维母细胞(P2代)中明显降低；(E)5ng/ml TGF-β1处理Fstl1^+/-与同窝野生型小鼠的原代肺纤维母细胞(P2代)30分钟后，蛋白印迹法检测的胞内Smad2和Smad3磷酸化水平。结果显示Fstl1缺失抑制TGF-β1诱导的Smad2和Smad3磷酸化水平上调；(F)5ng/mlTGF-β1和100ng/ml FSTL1处理野生型小鼠原代肺纤维母细胞(P2代)30分钟后，蛋白印迹法检测的胞内Smad2和Smad3磷酸化水平。结果显示外源FSTL1促进TGF-β1诱导的Smad2和Smad3磷酸化水平上调。其中C-F均以总Smad2和Smad3做为上样量对照；(G)TGF-β1信号通路抑制剂SB-525334(10μM)预处理1小时后，5ng/ml TGF-β1和100ng/ml Fstl1处理野生型小鼠原代肺纤维母细胞(P2代)24小时，蛋白印迹法检测肌纤维母细胞特征分子α-SMA、两种胞外基质蛋白胶原和纤粘连蛋白(Fn)在原代肺纤维母细胞中的表达情况。结果显示阻断TGF-β1信号通路，TGF-β1诱导的以及外源FSTL1促进的TGF-β1诱导的肌纤维母细胞分化和随后的胞外基质蛋白的合成受到抑制。其中以肌动蛋白做为上样量对照。(H)Hep3B细胞共转染CAGA-luc(0.2μg)、ca-ALK4(0.2μg)、ca-ALK5(0.1μg)和Fstl1(0.1μg、0.2μg)，过表达的Fstl1不影响持续激活的TGF-β1信号通路的活性。其中荧光素酶检测，以Renilla活性做为上样量对照；(I)Pull-down实验验证Fstl1与TGF-β1蛋白结合。Fstl1与TGF-β1蛋白结合后，利用镍珠拉下带有His标签的Fstl1蛋白，利用抗TGF-β1抗体进行免疫印迹检测TGF-β1(上)，进一步利用抗His抗体验证Fstl1蛋白的存在(下)；(J)Pull-down实验验证Fstl1与TGF-β1的II型受体结合。Fstl1与带HA标签的TβRII蛋白结合后，利用镍珠拉下带有His标签的Fstl1蛋白，利用抗HA抗体进行免疫印迹检测TβRII(上)，进一步利用抗Myc抗体验证Fstl1蛋白的存在(下)；(K)Pull-down实验验证Fstl1不与TGF-β1的I型受体结合。Fstl1与带HA标签的TβRI蛋白结合后，利用镍珠拉下带有His标签的Fstl1蛋白，利用抗HA抗体进行免疫印迹检测TβRI(上)，进一步利用抗Myc抗体验证Fstl1蛋白的存在(下)；(L)IP实验验证Fstl1促进TGF-β1与其II型受体结合。Cos7细胞转染带HA标签的TβRII质粒，利用偶联HA抗体的beads拉下TβRII蛋白，与不同浓度的FSTL1蛋白(25、100、200ng)和100ng TGF-β1结合后，利用抗TGF-β1抗体进行免疫印迹检测TGF-β1(上)，进一步利用抗HA抗体验证TβRII蛋白的存在(下)。

总的来说，这些结果表明，FSTL1通过与TGF-β1-受体复合物相互作用来调节下游Smad2/3信号通路，进一步调节肌纤维母细胞的分化和纤维化。

实施例7.抗FSTL1杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备

(一)免疫动物

用E-coli重组表达的FSTL1蛋白三次免疫BALB/C小鼠。

第一次免疫用弗氏完全佐剂与FSTL1蛋白等量混匀后乳化，静脉注射0.1mg/只，注射体积0.2～0.3mL。第二、第三免疫用弗氏不完全佐剂与FSTL1蛋白等量混匀后乳化，免疫方法与用量同第一次免疫。第一次免疫之后间隔两周进行第二次免疫，之后间隔一周。第三次免疫一个月后，腹腔注射0.1mg的FSTL1蛋白回忆刺激BALB/C小鼠。间接ELISA方法检测免疫后的血清效价，经过三次免疫之后，对重组FSTL1抗原的间接ELISA法检测血清的抗体效价为64000，而正常小鼠血清对重组FSTL1抗原没有反应。间接ELISA法检测中包被的FSTL1抗原浓度是1.5u g/ml。

(二)杂交瘤细胞株的制备和筛选

取回忆刺激3天后的小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-4000进行融合。用含1×HAT和10％小牛血清的RPMI-1640培养。融合后三天开始出现融合细胞，512个孔中335个为融合孔，融合率为65.4％。用ELISA法检测抗FSTL1单克隆抗体，检测281个孔，其中阳性孔为12个，阳性率为4.2％。经过三次有限稀释法克隆化，最后获得一批细胞株，经检测筛选出两株稳定分泌抗FSTL1单克隆抗体的细胞株，标记为22B6，1F12。其中细胞22B6已经于2013年5月3日提交中科院微生物研究所菌种保藏中心进行保藏，地址为北京市朝阳区大屯路，保藏编号为：CGMCC No.7557.

(三)腹水的制备及其效价和抗体亚型的鉴定

将阳性杂交瘤细胞株22B6以1×10⁶个/只的量腹腔注射预先致敏的6周龄的BABL/C雌性小鼠，10-14天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA方法检测22B6单抗腹水的效价。以骨髓瘤细胞系SP2/0腹水和正常小鼠血清为对照，包被的FSTL1抗原浓度是1.5u g/mL。

结果：SP2/0腹水和正常血清对重组FSTL1抗原无反应，单克隆抗体22B6的腹水效价为：1.024×10⁶。进而用标准抗亚类血清系统作双夹心ELISA确定细胞株22B6分泌的抗体亚型为IgG1，轻链均为K链。

实施例8.抗FSTL1单克隆抗体的制备

将阳性杂交瘤细胞株22B6以1×10⁶个/只的量腹腔注射预先致敏6周龄的BABL/C雌性小鼠，10-14天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA方法检测22B6单抗的效价。腹水4℃、12000rpm离心15min，取1份(体积)腹水与2份(体积)60mM、pH4.8的醋酸缓冲液混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸33u L/mL腹水，室温混合30min。4℃静置2小时以上使其充分沉淀，然后4℃、12000rpm离心30min，弃去沉淀，上清经砂芯漏斗过滤后加入1/10体积的0.1MpH7.4的PBS，用2MNaOH调节pH至7.4。冰浴下于30min内加入0.277g/mL的硫酸铵使饱和度达到45％，4℃静置1小时以上，然后4℃、10000rpm离心30min，弃去上清。沉淀用含有137mM NaCL、2.6mM KCL、0.2mMEDTA的pH7.4的PBS溶解，并于50-100倍体积的上述PBS中4℃透析过夜。

然后用Q Sepharose Fast Flow交换柱层析技术进一步纯化。平衡缓冲液为20mMpH7.5Tris-HCL缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0M NaCL的20mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液，层析柱XK16/20、Pharmacia AKTA FPLC层析系统。按照厂商提供的说明书装柱，平衡缓冲液平衡层析柱、流速5mL/min。上样完毕后用3倍柱体积的平衡缓冲液洗去未结合蛋白，以NaCL递增的线性梯度洗脱结合的抗体蛋白，线性梯度为0-1.0MNaCL/10倍柱体。检测A280，收集洗脱的抗体蛋白。SDS-PAGE检测纯度，用本领域常用的紫外分光光度法测定抗体含量，间接ELISA法检测抗体效价。

实施例9.抗FSTL1单克隆抗体(22B6)的特异性

利用编号1F12以及22B6的单克隆抗体处理原代肺成纤维细胞，发现22B6单克隆抗体能明显抑制TGF-β1诱导的Colla1的mRNA表达水平(图7A)，而1F12单克隆抗体并无作用。为了验证anti-Fstl1单克隆抗体(22B6)是中和性抗体，首先检测22B6结合Fstl1的特异性，如图7B，利用表面等离子体共振(SPR)对抗体KD进行测定。在检测芯片(CM5)上固定Fstl1蛋白，并用HEPES缓冲液平衡过夜，将22B6用HEPES缓冲淮稀释成不同浓度梯度。检测时上样量为35UL，流速为5UL/min，上样后数据滞后时间为120秒，并检测蛋白结合信号，最后用BIAcore公司分析软件读取数据并计算抗体的KD值，定量测定单克隆抗体22B6结合Fstl1蛋白的亲和力常数KD。

利用pull-down方法定性比较22B6与Fstl1重组蛋白、TGFβ1蛋白、家族蛋白follistatin结合能力，结果显示单克隆抗体22B6可特异性结合Fstl1蛋白，不结合TGFβ1或follistatin(图7C)。

图7为FSTL1中和性抗体的筛选和验证。(A)实时定量PCR检测抗FSTL1单克隆抗体(1F12，22B6)对TGF-β1诱导小鼠肺成纤维细胞表达胶原mRNA的影响。显示抗FSTL1抗体22B6可阻断TGF-β1诱导的小鼠肺成纤维细胞中胶原mRNA表达的上调，抗FSTL1抗体1F12不能。*，p＜0.05，即统计学上具有显著性差异；(B)SPR检测FSTL1与抗FSTL1抗体(22B6)的结合并测定其常数。以同家族成员卵泡抑素样蛋白(FST)为负对照；(C)IP实验验证抗体22B6特异结合FSTL1，但不结合FST或TGF-β1。

实施例10.抗FSTL1单克隆抗体(22B6)屏蔽Fstl1功能的生物活性

验证单克隆抗体22B6屏蔽Fstl1功能的生物活性。前期研究发现Fstl1能够明显抑制A549细胞中BMP4诱导的SPC表达上调(PNAS，2011)(图7D)；Hirsh课题组(J Immuno，2006)报道了Fstl1的促炎症活性，可促进Cos7细胞中IL-6的表达(图7E)；Walsh课题组(PNAS，2011)报道了Fstl1在心肌肥大病变中的作用，Fstl1能够抑制大鼠心肌细胞中苯肾上腺素(phenylephrine)诱导的心肌细胞肥厚(图7F)。在文献报道的不同实验体系中分别加入单克隆抗体22B6，研究发现单克隆抗体22B6具有屏蔽Fstl1不同功能的生物活性。

图7中(D)抗体22B6阻断FSTL1抑制BMP4诱导的肺上皮细胞表达SPC的活性。(E)抗体22B6阻断FSTL1诱导Cos7细胞表达IL-6的活性。(F)抗体22B6阻断FSTL1抑制新生大鼠心肌细胞中苯肾上腺素(phenylephrine，PE)诱导的心肌细胞肥厚。

实验说明，编号22B6抗体是抗Fstl1的中和性抗体。

实施例11.抗FSTL1中和性抗体(22B6)阻断肌纤细胞活化和胞外基质合成的体外检测

原代小鼠或IPF病人肺成纤维细胞长满后，血清饥饿24小时，1ug/ml FSTL1中和性抗体(22B6)或相应的IgGI处理1小时后，加入5ng/ml TGF-β1蛋白。TGF-β1处理12小时收集RNA检测Colla1；处理24小时后收集细胞及上清蛋白检测α-SMA、Fibronetin，一型胶原的表达；处理30分钟后检测细胞中Smad2和Smad3的磷酸化水平。

在TGF-β1处理小鼠肺成纤维细胞这一体外模型下，进一步发现22B6能够明显抑制TGF-β1下游Smad2/3的磷酸化水平(图8A)，并且能够明显抑制TGF-β1所诱导的α-SMA，fibronectin和I型胶原蛋白表达(图8B)。

由于22B6单克隆抗体的抗原是小鼠FSTL1全长蛋白，它与人类FSTL1蛋白同源性极高(＞92％的同源性)，因此，进一步使用22B6抗体处理IPF患者的肺成纤维细胞(n＝2)，发现22B6抗体能明显抑制IPF患者肺成纤维细胞本身以及TGF-β1诱导的α-SMA和细胞外基质蛋白的表达(图8C)。

图8为Fstl1中和性抗体在体外肺成纤维细胞培养中，通过抑制TGF-β1/Smad2/3信号，抑制TGF-β1诱导的肌纤维化母细胞分化和随后的胞外基质合成。原代野生型小鼠肺成纤维细胞经血清饥饿24小时，中和性抗体(22B6)预处理1小时后，蛋白印迹法检测中和性抗体22B6(1μg)阻断TGF-β1(5ng/ml)诱导的(A)Smad2和Smad3磷酸化水平上调；和(B)肌纤维化母细胞分化和随后的胞外基质合成；(C)原代IPF患者的肺成纤维细胞经血清饥饿24小时，中和性抗体(22B6)预处理1小时后，蛋白印迹法检测中和性抗体22B6(1μg)阻断TGF-β1(5ng/ml)诱导的肌纤维化母细胞特征分子a-SMA表达上调和随后的胶原和纤粘连蛋白胞外基质的合成。

体外实验说明，编号22B6抗体是抗Fstl1的中和性抗体，可阻断Fstl1的生物活性，主要反映在显著抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路，抑制纤维母细胞分化及随后的细胞外基质沉积。

实施例12.抗FSTL1中和性抗体(22B6)减轻肺纤维化疾病症状的体内检测

雄性C57BL/6J(周龄8-10周)小鼠，经气管注射2U/kg博莱霉素，在博莱霉素处理第5、8、11天时，通过腹腔注射50ug FSTL1中和性抗体(22B6)，相应IgG亚型IgG1为对照，共六对；博莱霉素处理14天后，检测肺纤维化及胶原含量。

博莱霉素(2U/kg)处理C57BL/6J小鼠诱导肺纤维化发生，处理后第5、8、11天经腹腔注射22B6抗体或相对应的亚型IgG1(50μg/只/次)，小鼠在博莱霉素处理14天后取组织观察纤维化程度(图9A)。与注射IgG1的小鼠相比，注射FSTL1中性抗体的小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量明显降低(图9B)，这说明22B6抗体确实能够减轻博莱霉素所诱导的胶原含量。而在Masson三染色中也得到了相似的结果(图9C)，对Masson三染色组织切片进行纤维化的定量统计，发现注射22B6抗体的小鼠肺纤维化面积明显低于注射亚型匹配的小鼠(图9D)。

图9为Fstl1中和性抗体减轻博莱霉素所诱导的小鼠肺纤维化。(A)中和性抗体22B6处理小鼠的图示。2U/kg博莱霉素处理C57BL/6J小鼠(每组6只)后，不同时间点(第5、8、11天)经腹腔注射50μg FSTL1中和性抗体(22B6)或相对应的亚型(IgG1)，博莱霉素处理14天后取样检测；(B)羟脯氨酸检测验证中和性抗体22B6抑制博莱霉素诱导的肺组织中胶原合成。**，p＜0.01，即统计学上具有显著性差异；(C)Masson trichrome染色验证中和性抗体22B6抑制博莱霉素诱导的进行性肺组织纤维化，胶原合成和沉积明显减少。标尺：100um；(D)Masson trichrome染色的肺组织切片进行纤维化面积百分比统计，验证验证中和性抗体22B6抑制博莱霉素诱导的肺组织纤维化。

体内实验进一步证明了肺损伤诱导产生的内源FSTL1确实参与纤维化发生。总体来说，的数据证明了FSTL1通过调控TGF-β1信号通路来调节了肌纤维母细胞聚集和细胞外基质沉积，最终在纤维化中起到关键的作用。阻断FSTL1活性的中和性抗体在体外成纤维细胞中可以明显降低TGF-β1所诱导的肌纤维母细胞分化以及细胞外基质的生成，在小鼠体内可以明显抑制博莱霉素诱导的肺纤维化。

基于以上研究成果，可阻断卵泡抑素样蛋白1活性的中和性抗体(22B6)可应用于治疗、缓解或改善肺纤维化疾病或症状的药物的制备中。

Claims (9)

1.一种杂交瘤细胞株，其CGMCC保藏号为No.7557。

2.一种中和卵泡抑素样蛋白1的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体由权利要求1的杂交瘤细胞株产生。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于所述抗体包含至少1个抗体重链可变区和至少1个抗体轻链可变区，并且其中所述抗体重链可变区具有CDR序列CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1由SEQ ID NO：1组成、CDRL2由SEQ ID NO：2组成和CDRL3由SEQ ID NO：3组成；和其中所述抗体轻链可变区具有选自CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRH1由SEQ ID NO：4组成、CDRH2由SEQ ID NO：5组成和CDRH3由SEQ ID NO：6组成。

4.一种分离的核酸，其特征在于所述核酸编码本发明抗体的至少一个重链可变区SEQID NO：7和轻链可变区SEQ ID NO：8。

5.一种包括权利要求4所述核酸的表达载体，其特征在于载体转染宿主细胞时所述核酸与宿主细胞识别的控制序列有效连接。

6.一种包括权利要求5表达载体的宿主细胞。

7.一种治疗或改善组织纤维化疾病的药物组合物，其特征在于该药物组合物包含权利要求2或3所述的单克隆抗体。

8.如权利要求7所述的药物组合物在制备治疗或调节组织纤维化的药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于其中组织纤维化指肺纤维化。