TW201946658A

TW201946658A - 抗ｇｉｔｒ抗體及其用途

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Publication number: TW201946658A
Application number: TW108113605A
Authority: TW
Inventors: 翟天航; 付鳳根; 黃威峰; 劉軍建
Original assignee: 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2019-12-16
Also published as: CN110386981A; CN111918878A; CN111918878B; WO2019201301A1; TWI743469B

Abstract

本發明涉及特異性結合GITR的新型抗體和抗體片段以及含有所述抗體或抗體片段的組合物。此外，本發明涉及編碼所述抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞，以及相關用途。此外，本發明涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。

Description

抗GITR抗體及其用途

糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor，GITR)，亦稱作CD357及GITR-D，最早是在多柔比星處理的小鼠T細胞中被發現的(Nocentin,PNAS.1997；94：6216-6221)，是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族的第18個成員(TNFRSF18)，其他成員包括CD40，CD27，4-1BB,OX40等。GITR由其同源配體，GITR配體(GITRL)活化，可以激活下游的NF-kappa B信號通路。

GITR在靜息T細胞中以低水平表達；在T細胞活化後，表達顯著上調。GITR在調節性T細胞(Treg)中高水平組成型表達，並且當這些細胞被活化時，表達進一步上調(Nocentini和Riccardi,E.J.Immunol.2005,35：1016-1022)。

GITR配體(GITRL)主要在抗原遞呈細胞(APC，包括巨噬細胞、B細胞、樹突狀細胞及內皮細胞)上表達。APC上的GITRL與應答T細胞上GITR的結合觸發GITR信號傳導，刺激效應性T細胞激活並抑制Treg細胞的活性。由此，GITR對效應T細胞和調節性T細胞具有若干作用，包括：共刺激和活化效應T細胞，降低Treg細胞對效應T細胞的抑制等(Nocentini,Eur.J.Immunol.2007,37：1165-1169)。

這些作用意味著GITR信號通路的活化可以導致免疫應答的增強。因此，能夠活化GITR信號通路的物質可以激活機體免疫應答，進而增加機體抗腫瘤和感染的能力等，同時GITR分子在腫瘤微環境中Treg細胞中高表達，因此利用GITR抗體的ADCC活性清除GITR分子高表達的Treg細胞可以進一步增強腫瘤殺傷活性。

現有技術研究了多種GITR的抗體(參見CN103951753A、CN105829343A、CN106459203A、WO2016196792A1、WO2017068186A9等)。這樣的抗體是GITR的激動劑(即，是激活型抗體)，可誘導或增強GITR信號傳導，在治療需要增強免疫應答的多種GITR相關疾病或病症中是有效的。由於這樣的抗GITR抗體是激活型抗體，故相對於其與抗原的結合親和力，其激活活性的高低是其發揮活性(例如。免疫增強活性)更為關鍵的指標。

因此，需要開發具有更好的激活活性，更好ADCC效應，以及具有更好的療效，例如抗腫瘤作用的抗體。

本發明因此提供了一種新的結合GITR的抗體，以及其抗原結合片段。

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體具有以下一個或多個特性：(i)以高親和力與GITR結合；(ii)與細胞表面的GITR有效結合；(iii)具有激動劑活性，例如能夠有效激活NF-kappaB信號通路；(iv)有效激活T細胞(例如CD4 T細胞)；(v)能夠有效介導ADCC效應；(vi)具有更好的抗腫瘤活性，例如能夠降低對象中的腫瘤體積，同時不影響對象的體重；(vii)與抗PD-1抗體組合能夠更好地抑制腫瘤活性，例如能夠降低對象中的腫瘤體積，同時不影響對象體重。

在一些實施方案中，本發明提供了結合GITR的抗體或其抗原結合片段，包含如SEQ ID NO：17、18、19或20所示的序列的3個重鏈CDR(HCDR)，和/或如SEQ ID NO：21、22、23或24所示的序列的3個輕鏈CDR(LCDR)。

在一些實施方案中，本發明提供了編碼本發明抗體或其片段的核酸，包含所述核酸的載體，包含所述載體的宿主細胞。

在一些實施方案中，本發明提供了製備本發明抗體或其片段的方法。

在一些實施方案中，本發明提供了包含本發明抗體的免疫綴合物、藥物組合物和組合產品。

本發明還提供了利用本發明抗體在對象中介導ADCC或激活NF-kappaB信號通路的方法，以及預防或治療癌症或感染的方法。

本發明還涉及在樣品中檢測GITR的方法。

在下面的圖式和具體實施方案中進一步說明本發明。然而，這些圖式和具體實施方案不應被認為限制本發明的範圍，並且本領域技術人員容易想到的改變將包括在本發明的精神和所附申請專利範圍的保護範圍內。

第1圖顯示了流式細胞術測定嵌合抗體與表達人GITR的CHO-S細胞株(CHO-hGITR)的結合能力。

第2圖顯示了流式細胞術測定人源化抗體與表達人GITR的CHO-S細胞株(CHO-hGITR)的結合能力。

第3圖顯示了流式細胞術測定人源化抗體與表達食蟹猴GITR的CHO-S細胞株(CHO-cynoGITR)的結合能力。

第4圖顯示了MOA法測定人源化抗體激活Hela-GITR-NF-Kappa B luciferace細胞株能力。

第5圖顯示了人源化抗體激活CD4 T細胞釋放IL-2能力檢測。

第6圖顯示了人源化抗體激活CD4 T細胞釋放IFN-γ能力檢測。

第7圖顯示了MOA法測定人源化抗體ADCC活性。

第8圖顯示了HZ37G5分子體內藥效檢測。

第9圖顯示了HZ22F4分子體內藥效檢測。

第10圖顯示了小鼠體重檢測。

發明詳述

I.定義

在下文詳細描述本發明前，應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而並不意圖限制本發明的範圍，其僅會由所附申請專利範圍限制。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域中普通技術人員通常的理解具有相同的含義。

為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。要理解，本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案，並且不意欲是限制性的。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

如本文所用，術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項。

如本文所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組合的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

如本文所用，術語“GITR”是指“糖皮質激素誘導的TNF相關基因和/或多肽”，在本領域中也稱為TNF受體超家族 18(TNFRSF18)，指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物諸如靈長類(例如人、食蟹猴)和齧齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然GITR，除非另有說明。該術語涵蓋“全長”，未加工的GITR以及因細胞中的加工所致的任何形式的GITR。該術語還涵蓋GITR的天然發生變體，例如剪接變體或等位變體。人GITR胺基酸序列可參見GenBank登記號Q9Y5U5。一個具體的人GITR多肽的胺基酸序列可見於SEQ ID NO：41中。一個具體的食蟹猴GITR多肽的胺基酸序列見SEQ ID NO：42。

本文所用的術語“抗GITR抗體”、“抗GITR”、“GITR抗體”或“結合GITR的抗體”是指這樣的抗體，所述抗體能夠以足夠的親合力結合(人或食蟹猴)GITR蛋白或其片段以致所述抗體可以用作靶向(人或食蟹猴)GITR中的診斷劑和/或治療劑。在一個實施方案中，抗GITR抗體與非(人或食蟹猴)GITR蛋白結合的程度低於所述抗體與(人或食蟹猴)GITR結合的約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%或以上，如例如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物光干涉測定法或MSD測定法測量的。

“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限於Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體(例如scFv)；單結構域抗體；雙價或雙特異性抗體或其片段；駱駝科抗體；和由抗體片段形成的雙特異性抗體或多特異性抗體。

如本文所用，術語“表位”指抗原(例如，GITR)中與抗體分子特異性相互作用的部分。

與參照抗體“結合相同或重疊表位的抗體”是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%以上的所述參照抗體與其抗原的結合，反言之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%以上的該抗體與其抗原的結合。

與參照抗體競爭結合其抗原的抗體是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗體是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。

抑制(例如競爭性抑制)參照抗體與其抗原的結合的抗體是指這樣的抗體，其抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。抗體與其抗原的結合可以親和力(例如平衡解離常數)衡量。測定親和力的方法是本領域已知的。

與參照抗體顯示相同或相似的結合親和力和/或特異性的抗體是指這樣的抗體，其能夠具有參照抗體的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合親和力和/或特異性。這可以藉由本領域已知的任何測定結合親和力和/或特異性的方法進行測定。

“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定，所述指派系統包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。

例如，根據不同的CDR確定方案，每一個CDR的殘基如下所述。

CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。

除非另有說明，否則在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。

除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。

在一個實施方案中，本發明抗體的CDR藉由AbM規則確定邊界，例如如表1所示。

然而，應該注意，基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，所述抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

術語“PD-1軸結合拮抗劑”是指如下的分子，其抑制PD-1軸結合配偶與一種或多種它的結合配偶相互作用，從而去除源自PD-1信號傳導軸上的信號傳導的T細胞功能障礙-一項結果是恢復或增強T細胞功能(例如增殖，細胞因子生成，靶細胞殺傷)。如本文中使用的，PD-1軸結合拮抗劑包括PD-1結合拮抗劑(例如抗PD-1抗體)，PD-L1結合拮抗劑(例如抗PD-L1抗體)和PD-L2結合拮抗劑(例如抗PD-L2抗體)。

術語“PD-1結合拮抗劑”指如下的分子，其降低、阻斷、抑制、消除或干擾源自PD-1與一種或多種它的結合配偶(諸如PD-L1，PD-L2)相互作用的信號轉導。在一些實施方案中，PD-1結合拮抗劑是抑制PD-1結合一種或多種它的結合配偶的分子。在一個特定方面，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1結合PD-L1和/或PD-L2。例如，PD-1結合拮抗劑包括降低、阻斷、抑制、消除或干擾源自PD-1與PD-L1和/或PD-L2相互作用的信號轉導的抗PD-1抗體，其抗原結合片段，免疫黏附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一個實施方案中，PD-1結合拮抗劑降低由或經由T淋巴細胞上表達的細胞表面蛋白質介導的負面共刺激信號(經由PD-1介導信號傳導)，從而使得功能障礙性T細胞不太功能障礙性(例如增強對抗原識別的效應器應答)。在一些實施方案中，PD-1結合拮抗劑是抗PD-1抗體。在一個具體實施方案中，PD-1結合拮抗劑是WO2015/095423中公開的MDX-1106(nivolumab)、MK-3475(pembrolizumab)、CT-011(pidilizumab)或AMP-224。在一個實施方案中，抗PD-1抗體是“Antibody C”(WO2017/133540)。

術語“PD-L1結合拮抗劑”指如下的分子，其降低、阻斷、抑制、消除或干擾源自PD-L1與一種或多種它的結合配偶(諸如PD-1，B7-1)相互作用的信號轉導。在一些實施方案中，PD-L1結合拮抗劑是抑制PD-L1結合它的結合配偶的分子。在一個特定方面，PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1結合PD-1和/或B7-1。在一些實施方案中，PD-L1結合拮抗劑包括降低、阻斷、抑制、消除或干擾源自PD-L1與一種或多種它的結合配偶(諸如PD-1，B7-1)相互作用的信號轉導的抗PD-L1抗體，其抗原結合片段，免疫黏附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一個實施方案中，PD-L1結合拮抗劑降低由或經由T淋巴細胞上表達的細胞表面蛋白質介導的負面共刺激信號(經由PD-L1介導信號傳導)，從而使得功能障礙性T細胞不太功能障礙性(例如增強對抗原識別的效應器應答)。在一些實施方案中，PD-L1結合拮抗劑是抗PD-L1抗體。在一個具體方面，抗PD-L1抗體是WO2015/095423中公開的YW243.55.S70、MDX-1105、MPDL3280A或MEDI4736。

術語“PD-L2結合拮抗劑”指如下的分子，其降低、阻斷、抑制、消除或干擾源自PD-L2與一種或多種它的結合配偶(諸如PD-1)相互作用的信號轉導。在一些實施方案中，PD-L2結合拮抗劑是抑制PD-L2結合一種或多種它的結合配偶的分子。在一個特定方面，PD-L2結合拮抗劑抑制PD-L2結合PD-1。在一些實施方案中，PD-L2拮抗劑包括降低，阻斷，抑制，消除或干擾源自PD-L2與一種或多種它的結合配偶(諸如PD-1)相互作用的信號轉導的抗PD-L2抗體，其抗原結合片段，免疫黏附素，融合蛋白，寡肽和其它分子。在一個實施方案中，PD-L2結合拮抗劑降低由或經由T淋巴細胞上表達的細胞表面蛋白質介導的負面共刺激信號(經由PD-L2介導信號傳導)，從而使得功能障礙性T細胞不太功能障礙性(例如增強對抗原識別的效應器應答)。在一些實施方案中，PD-L2結合拮抗劑是免疫黏附素。

“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”指其中結合到某些細胞毒性細胞(例如NK細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型免疫球蛋白使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨後用細胞毒素殺死靶細胞的細胞毒性形式。介導ADCC的主要細胞NK細胞只表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc γ RI，Fc γ RII和Fc γ RIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利No.5,500,362或5,821,337或美國專利No.6,737,056(Presta)中所記載的。可用於此類測定法的效應細胞包括PBMC和NK細胞。或者/另外，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。本文實施例中提供了用於評估ADCC活性的一種例示性測定法。

術語“細胞毒性劑”用在本發明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。

“化療劑”包括在治療癌症中有用的化學化合物。化療劑的例子參見WO2015/031667中所公開的那些，包括但不限於抗腫瘤劑，包括烷化劑；抗代謝物；天然產物；抗生素；酶；雜類試劑；激素和拮抗劑；抗雌激素；抗雄激素；以及非類固醇抗雄激素等。

術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的有機化合物。

“功能性Fc區”擁有天然序列Fc區的“效應器功能”。例示性的“效應器功能”包括C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)聯合，而且可以使用多種測定法來評估，例如本文所公開的那些。

術語“Fc區”在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，所述區域包含至少一部分的恆定區。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。在某些實施方案中，人IgG重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羰基端。然而，Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外說明，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，其也被稱為EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬於的IgG形式。所有同一型的抗體的重鏈恆定區都是相同的，不同型的抗體之間的重鏈恆定區不同。例如，IgG1形式的抗體是指其重鏈恆定區Ig結構域為IgG1的Ig結構域。

本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療腫瘤(例如癌症)和感染(例如慢性感染)中有效的任何物質，包括化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。

術語“有效量”指本發明的抗體或片段或綴合物或組合物的這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在需要治療或預防的患者中產生預期效果。有效量可以由作為本領域技術人員的主治醫師藉由考慮以下多種因素來容易地確定：諸如哺乳動物的物種；它的大小、年齡和一般健康；涉及的具體疾病；疾病的程度或嚴重性；個體患者的應答；施用的具體抗體；施用模式；施用製劑的生物利用率特徵；選擇的給藥方案；和任何伴隨療法的使用。

“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。抗體或抗體片段或其綴合物或組合物的治療有效量可以根據多種因素如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量和抗體或抗體部分在個體中激發所需反應的能力而變動。治療有效量也是這樣的一個量，其中抗體或抗體片段或其綴合物或組合物的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的對象，“治療有效量”較佳地抑制可度量參數(例如腫瘤生長率，腫瘤體積等)至少約20%、更佳地至少約40%、甚至更佳地至少約50%、60%或70%和仍更佳地至少約80%或90%。可以在預示人腫瘤中的功效的動物模型系統中評價化合物抑制可度量參數(例如，癌症)的能力。

“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。

術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可交換地使用且是指其中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，其包括初級轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。

“人抗體”指具有這樣的胺基酸序列的抗體，所述胺基酸序列對應於下述抗體的胺基酸序列，所述抗體由人或人細胞生成或來源於非人來源，其利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。

“人源化”抗體是指包含來自非人CDR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在一些實施方案中，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)對應於非人抗體的那些，並且所有或基本上所有的FR對應於人抗體的那些。人源化抗體視需要可以包含至少一部分的來源於人抗體的抗體恆定區。抗體(例如非人抗體)的“人源化形式”是指已經進行了人源化的抗體。

術語“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。

術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”，“癌性”，“細胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。

術語“感染性疾病”是指病原體引發的疾病，包括例如病毒感染、細菌感染、真菌感染或者原生動物例如寄生蟲感染。

術語“慢性感染”是指這樣的感染，其中傳染原(例如，病原體如病毒、細菌、原生動物例如寄生蟲、真菌或諸如此類)已經在感染的宿主中誘導了免疫應答，但尚未如在急性感染過程中一樣被從宿主中清除或消除。慢性感染可以是持續性的、潛伏性的或緩慢的。儘管急性感染(如流感)通常被免疫系統在數天或數週內解決，持續性的感染可以相對低的水平持續數月、數年、數十年或一生(例如，乙型肝炎)。相比之下，潛伏性的感染的特徵是長期的無症狀活動，被一段時間的迅速增加的高度感染和升高的病原體水平不時打斷(例如單純皰疹)。最後，緩慢感染的特徵是疾病症狀的逐漸和連續增加，諸如長期的潛伏期，隨後在臨床症狀出現後是延長的和進展的臨床過程開始。

“免疫綴合物”是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。

本文所使用的術語“標記”是指被直接或間接綴合或融合至試劑(諸如多核苷酸探針或抗體)並且促進其所綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組合物。標記本身可以是可檢測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)或在酶促標記的情況下可以催化可檢測的底物化合物或組合物的化學改變。術語旨在涵蓋藉由將可檢測物質偶聯(即，物理連接)至探針或抗體來直接標記探針或抗體以及藉由與直接標記的另一種試劑反應來間接標記探針或抗體。間接標記的實例包括使用螢光標記的二級抗體進行的一級抗體的檢測和具有生物素的DNA探針的末端標記，使得其可以用螢光標記的鏈黴抗生素蛋白來檢測。

“個體”或“對象”包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於，家養動物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)，兔，以及齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或對象是人。

“分離的”抗體是這樣的抗體，其已經與其天然環境的組分分離。在一些實施方案中，將抗體純化至超過95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)確定的。對於用於評估抗體純度的方法的綜述，參見，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分離的編碼抗GITR抗體或其片段的核酸”是指一個或多個核酸分子，其編碼抗體重鏈或輕鏈(或其片段)，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的核酸分子，以及存在於宿主細胞中的一個或多個位置處的這樣的核酸分子。

如下進行序列之間序列同一性的計算。

為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分數，將所述序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為了最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。在一個較佳實施方案中，為比較目的，所比對的參考序列的長度是至少30%、較佳地至少40%、更佳地至少50%、60%和甚至更佳地至少70%、80%、90%、100%的參考序列長度。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則所述分子在這個位置處是相同的。

可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。在一個較佳實施方案中，使用已經集成至GCG軟體包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。在又一個較佳的實施方案中，使用GCG軟體包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別佳的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum 62評分矩陣。

還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12，空位罰分4)，利用已經併入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，((1989)CABIOS,4：11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。

額外地或備選地，可以進一步使用本文所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共數據庫執行檢索，以例如鑒定其他家族成員序列或相關序列。

術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、賦形劑、載體或穩定劑等。

術語“藥物組合物”指這樣的組合物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用所述組合物的對象具有不可接受的毒性的另外的成分。

術語“組合產品”是指一種劑量單位形式的固定組合或非固定組合或用於組合施用的部分的試劑盒，其中兩種或更多種治療劑可以獨立地在同一時間或在時間間隔內分開施用，尤其是在這些時間間隔允許組合伴侶展示協作，例如，協同效應時。術語“固定組合”是指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑，例如抗PD1抗體、抗PDL1抗體或抗PDL2抗體)以單一實體或劑量的形式同時施用於患者。術語“非固定組合”意指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑，例如抗PD1抗體、抗PDL1抗體或抗PDL2抗體)作為分開的實體同時、並行或依次施用於患者，沒有特定的時間限制，其中這樣的施用提供了患者體內兩種化合物的治療有效水平。後者也適用於雞尾酒療法，例如施用三種或更多種治療劑。在一個較佳的實施方案中，藥物組合是非固定組合。

術語“組合療法”是指施用兩種或更多種治療劑以治療如本公開所述的癌症或感染。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑，例如以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者，這種施用包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。此外，這種施用還包括以大致相同的時間或在不同的時間以順序的方式使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。

用於本文時，“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重性。

用於本文時，“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有癌症家族病史的對象是預防性方案的候選。通常，在癌症的背景中，術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前，特別是在具有癌症風險的對象中發生前的藥物施用。

術語“抗感染活性劑”包括在施用濃度和給藥間隔下特異性抑制或消除微生物生長但對宿主不致命的任何分子，所述微生物諸如病毒、細菌、真菌或原生動物，例如寄生蟲。用於本文時，術語抗感染活性劑包括抗生素、抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗原生動物劑。在一個具體方面中，抗感染活性劑在施用濃度和給藥間隔對宿主是無毒的。

抗細菌的抗感染活性劑或抗菌劑可廣泛的分類為殺菌的(即，直接殺死)或抑菌的(即，阻止分裂)。抗菌的抗感染活性劑可進一步再分類為窄譜抗菌劑(即，僅影響小類細菌亞型，例如，革蘭氏陰性等)或廣譜抗菌劑(即，影響廣泛種類)。

術語“抗病毒劑”包括抑制或消除病毒生長、致病和/或存活的任何物質。

術語“抗真菌劑”包括抑制或消除真菌生長、致病和/或存活的任何物質。

術語“抗原生動物劑”包括抑制或消除原生動物生物體(例如寄生蟲)生長、發病和/或存活的任何物質。

術語“載體”當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。一些載體能夠指導與其可操作相連的核酸的表達。這樣的載體在本文中被稱為“表達載體”。

“對象/患者樣品”指從患者或對象得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自對象的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素等等。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不限於腫瘤活檢、細針吸出物、支氣管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手術標本、循環中的腫瘤細胞、血清、血漿、循環中的血漿蛋白質、腹水、衍生自腫瘤或展現出腫瘤樣特性的原代細胞培養物或細胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。

II.抗體

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體或其片段以高親和力結合GITR(例如人GITR或食蟹猴GITR)，例如，以以下平衡解離常數(K_D)與GITR結合，所述K_D小於大約10nM，較佳地，小於或等於大約7nM，更佳地小於或等於大約6nM，更佳地小於或等於大約5nM、4.9nM、4.8nM、4.7nM、4.6nM、4.5nM、4nM、或3nM，最佳地，所述K_D小於或等於大約2.5nM、2.4nM、2.3nM、2.2nM、2.1nM。在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體以1nM-6nM，較佳地1.5nM-5nM、1.7nM-5nM、1.8nM-5nM、1.9nM-5nM的K_D結合GITR。在一些實施方案中，GITR為人GITR。在一些實施方案中，抗體結合親和力是使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量)測定的。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段結合表達GITR的細胞，例如，以小於或等於大約2nM、1.9nM、1.5nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM的EC50。在一些實施方案中，所述結合用流式細胞術(例如FACS)測定。在一些實施方案中，表達GITR的細胞為表達GITR的CHO細胞(例如CHO-S細胞)。在一些實施方案中，GITR為人GITR或食蟹猴GITR。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段藉由與細胞表面的GITR分子結合而激活GITR下游的NF-kappaB信號通路。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段激活能力優於已知的抗GITR抗體，例如專利申請US20130183321A1(GITR,INC.(Cambridge,MA,US))中報導的GITR抗體。在一個實施方案中，已知的抗GITR抗體分子的輕鏈和重鏈序列在US20130183321A1中分別為SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：54。在一些實施方案中，本發明的GITR抗體分子相比對照抗體分子，能夠顯著有效激活NF kappa B信號通路。在一些實施方案中，所述激活是藉由螢光素酶檢測獲得的。

在一些實施方案中，本發明抗體或其片段提高效應T細胞功能，例如激活效應T細胞。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段能夠增強效應T細胞的增殖。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段提高干擾素(例如IFN-γ)分泌/表達。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段提高白細胞介素(例如IL-2)分泌/表達。在一些實施方案中，T細胞是CD4 T細胞。

在一些實施方案中，本發明的GITR抗體或其片段能夠激活調節T細胞(例如Treg細胞)中的GITR信號通路，進而藉由介導ADCC效應消除細胞。由此，一方面解除效應T細胞自身的抑制信號，增強CD4T細胞和/或CD8T細胞的活性，另一個方面消除調節T細胞對效應T細胞的抑制作用，從而最大程度地激活效應T細胞，增強針對腫瘤細胞的免疫應答反應。在一些實施方案中，藉由檢測NF-AT信號激活來檢測抗體的ADCC活性。在一些實施方案中，所述NF-AT信號的激活由螢光報告基因的表達體現。在一些實施方案中，本發明的GITR抗體分子相比已知的抗GITR抗體分子，能夠顯著有效激活NF-AT信號通路。在一些實施方案中，本發明的GITR抗體分子相比已知的抗GITR抗體分子，能夠顯著有效介導ADCC效應。在一些實施方案中，本發明的GITR抗體分子相比已知的抗GITR抗體分子，能夠顯著有效抑制或消除調節T細胞。在一些實施方案中，本發明的效應T細胞是CD4 T細胞。在一些實施方案中，已知的抗GITR抗體分子是例如專利申請US20130183321A1(GITR,INC.(Cambridge,MA,US))中報道的抗GITR抗體。在一個實施方案中，已知的抗GITR抗體分子的輕鏈和重鏈序列在US20130183321A1中分別為SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：54。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段(視需要地與治療方式和/或其它治療劑，例如PD-1軸結合拮抗劑組合)能夠預防或治療腫瘤。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段能夠用於抑制或減小腫瘤生長(例如減小腫瘤體積)。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段還能夠用於維持腫瘤患者體重。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段能夠與治療方式和/或其它治療劑，例如PD1-軸結合拮抗劑組合抑制或減小腫瘤生長(例如減小腫瘤體積)。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段能夠與治療方式和/或其它治療劑，例如PD1-軸結合拮抗劑組合維持腫瘤患者體重。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段(視需要地與治療方式和/或其它治療劑，例如PD-1軸結合拮抗劑組合)能夠抑制或減小腫瘤生長(例如減小腫瘤體積)，同時不影響腫瘤患者體重。較佳地，腫瘤為胃腸道腫瘤。較佳地，腫瘤為癌症，例如胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等。在一些實施方案中，本發明的抗體或其片段(視需要地與PD-1軸結合拮抗劑組合)能夠預防或治療感染，例如慢性感染，包括細菌感染、真菌感染、病毒感染、原生動物感染等。

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，其中所述VH包含(i)表B所列任一抗體的VH中所含的三個互補決定區域(CDR)，或(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)，其中所述VL包含：(i)表B所列任一抗體的VL中所含的三個互補決定區域(CDR)；或(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中(a)所述VH包含(i)表B所列任一抗體的VH中所含的三個互補決定區域(CDR)，或(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列；和/或(b)所述VL包含：(i)表B所列任一抗體的VL中所含的三個互補決定區域(CDR)；或(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在較佳的實施方案中，VH包含選自SEQ ID NO：17、18、19或20所示的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。

在較佳的實施方案中，VL包含選自SEQ ID NO：21、22、23或24所示的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。

在較佳的實施方案中，本發明抗GITR抗體或其抗原結合片段包含(i)如SEQ ID NO：17或19所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及如SEQ ID NO：21或23所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR，或者(ii)如SEQ ID NO：18或20所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及如SEQ ID NO：22或24所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，其中(i)所述VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含選自SEQ ID NO：1、2、3或4的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR1包含與選自SEQ ID NO：1、2、3或4的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；HCDR2包含選自SEQ ID NO：5或6的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR2包含與選自SEQ ID NO：5或6的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；HCDR3包含選自SEQ ID NO：7或8的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR3包含與選自SEQ ID NO：7或8的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；和/或 (ii)其中所述VL包含互補決定區域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含選自SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR1包含與選自SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；LCDR2包含選自SEQ ID NO：11、12、13或14的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR2包含與選自SEQ ID NO：11、12、13或14的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；LCDR3包含選自SEQ ID NO：15或16的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR3包含與選自SEQ ID NO：15或16的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在較佳的實施方案中，本發明提供抗GITR抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，其中(a)所述VH包含(i)表A所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的組合；或(ii)(i)的HCDR組合的變體，所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)；和/或(ii)所述VL包含(i)表A所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合；或者(ii)(i)的LCDR組合的變體，所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)。

在較佳的實施方案中，本發明提供抗GITR抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，其中所述VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合如下表(表A)所示：

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和/或輕鏈可變區VL，其中，(a)重鏈可變區VH(i)包含與選自SEQ ID NO：17、18、19或20的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：17、18、19或20的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)包含與選自SEQ ID NO：17、18、19或20的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中；和/或(b)輕鏈可變區VL(i)包含與選自SEQ ID NO：21、22、23或24的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；(ii)包含選自SEQ ID NO：21、22、23或24的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)包含與選自SEQ ID NO：21、22、23或24的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中。

在較佳的實施方案中，本發明提供抗GITR抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的組合如下表(表B)所示：

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體或其抗原結合片段包含重鏈和/或輕鏈，其中(a)重鏈(i)包含與選自SEQ ID NO：25、26、27或28的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；(ii)包含選自SEO ID NO：25、26、27或28的胺基酸序列或由其組成；或者 (iii)包含與選自SEQ ID NO：25、26、27或28的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中，更佳地，所述胺基酸改變不發生在重鏈可變區中；和/或(b)輕鏈(i)包含與選自SEQ ID NO：29、30、31或32的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；(ii)包含選自SEQ ID NO：29、30、31或32的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)包含與選自SEQ ID NO：29、30、31或32的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中，更佳地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中。

在較佳的實施方案中，本發明提供抗GITR抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈和輕鏈，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的重鏈和輕鏈的組合如下表(表C)所示：

在一些實施方案中，本發明抗GITR抗體或其片段的重鏈和/或輕鏈還包含信號肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：43)。

在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。

在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。

在一些實施方案中，置換為保守性置換。保守置換是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸置換，例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸置換，一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸置換，或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸置換。示例性的置換如下表D所示：

在某些實施方案中，置換發生在抗體的CDR區。通常，獲得的變體相對於親本抗體在某些生物學特性方面(例如，增加的親和力)具有修飾(例如，改善)和/或將具有親本抗體的基本上保留的某些生物學特性。示例性置換變體是親和力成熟抗體。

在某些實施方案中，本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體經糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。當抗體包含Fc區時，可以改變附著於其的糖類。在一些應用中，除去不想要的糖基化位點的修飾可以是有用的，例如除去岩藻糖模塊以提高抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield等(2002)JBC277：26733)。在其它應用中，可以進行半乳糖苷化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。

在某些實施方案中，可在本文中所提供抗體的Fc區中引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體，以便增強例如抗體治療癌症或細胞增殖性疾病的有效性。Fc區變體可包括在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如置換)的人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。關於Fc變體的實例參見美國專利號7,332,581，美國專利號6,737,056，美國專利號6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)，美國專利號6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)，美國專利號7,371,826，Duncan&Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；和WO 94/29351。

在某些實施方案中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。可以如，例如美國專利號7,521,541中所述地生成半胱胺酸改造的抗體。

在某些實施方案中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性：(i)顯示與表3所列的任一抗體對GITR相同或相似的結合親和力和/或特異性；(ii)抑制(例如，競爭性抑制)表3所列的任一抗體與GITR的結合；(iii)與表3所示的任一抗體結合相同或重疊的表位；(iv)與表3所示的任一抗體競爭結合GITR；(v)具有表3所列的任一抗體分子的一個或多個生物學特性。

在一些實施方案中，本發明的抗GITR抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG4形式的抗體。

在一些實施方案中，抗GITR抗體是單株抗體。

在一些實施方案中，抗GITR抗體是人源化的。用於使抗體人源化的不同方法是技術人員已知的，如由Almagro&Fransson綜述的，其內容藉由提述完整併入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers in Bioscience 13：1619-1633)。

在一些實施方案中，抗GITR抗體是人抗體。可使用本領域中已知的各種技術來製備人抗體。人抗體一般描述於van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol 5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol 20：450-459(2008)。

在一些實施方案中，抗GITR抗體是嵌合抗體。

在一些實施方案中，至少部分的抗GITR抗體的框架序列是人共有框架序列。在一個實施方案中，本發明的抗GITR抗體還涵蓋其抗體片段，較佳地選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)或(Fab’)₂、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。

在某些實施方案中，抗GITR抗體分子處於雙特異性或多特異性抗體分子形式。在一個實施方案中，雙特異性抗體分子具有針對GITR的第一結合特異性和針對PD-1或PD-L1或PD-L2的第二結合特異性。在一個實施方案中，雙特異性抗體分子與GITR和PD-1結合。在另一個實施方案中，雙特異性抗體分子與GITR和PD-L1結合。在又一個實施方案中，雙特異性抗體分子與GITR和PD-L2結合。多特異性抗體分子可以具有任何針對前述分子的結合特異性的組合。多特異性抗體分子例如可以是三特異性抗體分子，其包含針對GITR的第一結合特異性和針對以下一種或多種的分子的第二及第三結合特異性：PD-1、PD-L1或PD-L2。

II.本發明的核酸以及包含其的宿主細胞

在一方面，本發明提供了編碼以上任何抗GITR抗體或其片段的核酸。在一個實施方案中，提供包含所述核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體。在一個實施方案中，提供包含所述核酸或所述載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞或293細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是原核的。

在一方面，本發明提供了編碼以上任何抗GITR抗體或其片段的核酸。所述核酸可以包含編碼抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區的胺基酸序列的核酸，或包含編碼抗體的輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列的核酸。示例性的編碼抗體重鏈可變區的核酸序列包含與選自SEQ ID NO：33、34、35或36的核酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列，或者包含選自SEQ ID NO：33、34、35或36的核酸序列。示例性的編碼抗體輕鏈可變區的核酸序列包含與選自SEQ ID NO：37、38、39或40的核酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的核酸序列，或者包含選自SEQ ID NO：37、38、39或40的核酸序列。

在一個實施方案中，提供包含所述核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在一個實施方案中，載體是pTT5載體。

在一個實施方案中，提供包含所述載體的宿主細胞。用於選殖或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別當不需要糖基化和Fc效應子功能時。對於抗體片段和多肽在細菌中的表達，見，例如，美國專利號5,648,237，5,789,199和5,840,523，還見Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，編輯，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254頁，其描述抗體片段在大腸桿菌中的表達)。在表達後，抗體可以從可溶級分中的細菌細胞糊狀物分離，並且可以進一步純化。

在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。例如，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是關於編碼抗體的載體的合適純株或表達宿主。例如，糖基化途徑已經進行“人源化”的真菌和酵母菌株導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。參見Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。適於表達糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如，可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系的其它實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293HEK或293F或293細胞，如例如Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：216(1980)、CHO-S細胞等；以及骨髓瘤細胞系如Y0，NS0和Sp2/0。關於適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述見例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268頁(2003)。

在一個實施方案中，本發明提供製備抗GITR抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)的方法，其中所述方法包括在適於表達編碼所述抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)的核酸的條件下培養所述宿主細胞，以及視需要地分離所述抗體或其片段(較佳地抗原結合片段)。在某個實施方案中，所述方法還包括從宿主細胞回收抗GITR抗體或其片段(較佳地抗原結合片段)。

在一個實施方案中，提供了製備抗GITR抗體的方法，其中所述方法包括，在適合抗體表達的條件下，培養包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收所述抗體。為了重組產生抗GITR抗體，分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體)的核酸，並將其插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸易於使用常規規程分離和測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針進行)。

III.測定法

可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗GITR抗體鑒定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性，例如藉由已知的方法諸如ELISA、Western印跡等來進行。可使用本領域已知方法來測定對GITR的結合，本文中公開了例示性方法。在一些實施方案中，使用生物光干涉測定法(例如Fortebio親和測量)或MSD測定法。

另一方面，可使用競爭測定法來鑒定與本文中公開的任何抗GITR抗體競爭對GITR的結合的抗體。在某些實施方案中，此類競爭性抗體結合與本文中公開的任何抗GITR抗體所結合表位相同或重疊的表位(例如線性或構象表位)。用於定位抗體所結合表位的詳細例示性方法見Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。

本發明還提供了用於鑒定具有生物學活性的抗GITR抗體的測定法。生物學活性可以包括例如結合GITR(例如結合人和/或食蟹猴GITR)，提高GITR介導的信號轉導(例如提高NFkappa-B信號通路)，藉由ADCC消減表達GITR的細胞(例如Treg細胞)，增強T效應細胞功能(例如CD4效應T細胞)(例如藉由提高效應T細胞的細胞因子生成(例如干擾素如IFN-γ或白細胞介素如IL2))。還提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。

在某些實施方案中，對本發明的抗體測試此類生物學活性。

可以使用本領域已知的方法來測定T細胞活化。例如，藉由T細胞活化後釋放的細胞因子，例如干擾素(如IFN-γ)或白細胞介素(例如IL2)的水平來測定。還可以使用本領域公知的方法來測定GITR信號傳導(例如NF-kappaB信號通路)，從而測定T細胞的活化。在一個實施方案中，生成表達人GITR和報告基因(包含融合至報告基因(例如β螢光素酶)的NF-kappa B啟動子)的轉基因細胞。對細胞添加抗GITR抗體導致NF-kappa B轉錄升高，這使用針對報告基因的測定法(例如螢光素酶報告基因測定法)來檢測。

可以使用本領域已知的方法來測定抗體的ADCC效應。例如藉由NF-AT信號激活。在一個實施方案中，獲得ADCC效應細胞(包含融合至報告基因(例如β螢光素酶)的NF-AT啟動子)的轉基因細胞。對效應細胞與高表達GITR的細胞進行共培養，同時添加抗GITR抗體導致效應細胞NF-AT轉錄升高，這使用針對報告基因的測定法(例如螢光素酶報告基因測定法)來檢測。

供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表達GITR或經改造而表達GITR細胞系。此類細胞包括天然表達GITR的T細胞，Treg細胞和活化後的記憶T細胞。此類細胞還包括表達GITR和並非正常情況下表達GITR的編碼GITR DNA轉染的細胞系。

可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物替換或補充抗GITR抗體來進行任何上述測定法。

可以理解的是，能夠使用抗GITR抗體和別的活性劑來進行任何上述測定法。

IV.免疫綴合物

在一些實施方案中，本發明提供了免疫綴合物，其包含本文中提供的任何抗GITR抗體和其它物質，例如細胞毒性劑。在一些實施方案中，其它物質例如治療劑，如細胞毒性劑或免疫抑制劑或化療劑。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。適合於形成免疫綴合物的細胞毒性劑(例如化療劑)的例子是本領域中已知的。例如，細胞毒性劑包括但不限於：放射性同位素；生長抑制劑；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或變體；和已知的各種抗腫瘤或抗癌劑。

在一些實施方案中，所述免疫綴合物用於預防或治療腫瘤，例如胃腸道腫瘤。在一些實施方案中，腫瘤為癌症，例如胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等。在一些實施方案中，所述免疫綴合物用於預防或治療感染，例如慢性感染，例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。

V.藥物組合物和藥物製劑

在一些實施方案中，本發明提供包含本文所述的任何抗GITR抗體或其片段(較佳地其抗原結合片段)或其免疫綴合物的組合物，較佳地組合物為藥物組合物。在一個實施方案中，所述組合物還包含藥用輔料。在一個實施方案中，組合物，例如，藥物組合物，包含本發明的抗GITR抗體或其片段或其免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑，較佳地PD-1軸結合拮抗劑，例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體)的組合。

在一些實施方案中，所述組合物用於預防或治療腫瘤，例如胃腸道腫瘤。在一些實施方案中，腫瘤為癌症，例如胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等。在一些實施方案中，所述組合物用於預防或治療感染，例如慢性感染，例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。

本發明還包括包含抗GITR抗體或其免疫綴合物的組合物(包括藥物組合物或藥物製劑)和包含編碼抗GITR抗體的多核苷酸的組合物(包括藥物組合物或藥物製劑)。在某些實施方案中，組合物包含一種或多種結合GITR的抗體或其片段或一種或多種編碼一種或多種結合GITR的抗體或其片段的多核苷酸。這些組合物還可以包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。

適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些具有石油、動物、植物或合成起源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥物組合物時，水是較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體，特別是用於可注射溶液。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第五版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,PharmaceuticalPress,London,Chicago。若期望的話，所述組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、持續釋放配製劑等的形式。口服配製劑可以包含標準載體，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精。

可以藉由將具有所需純度的本發明的抗GITR抗體與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.編(1980))混合來製備包含本文所述的抗GITR抗體的藥物製劑，較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。

示例性的凍乾抗體製劑描述於美國專利號6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利號6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。

本發明的藥物組合物或製劑還可以包含一種或多種其它活性成分，所述活性成分是被治療的特定適應證所需的，較佳具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它抗癌活性成分，例如化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑，例如PD-1軸結合拮抗劑(例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體)等。所述活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質，所述基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

關於包含本發明抗體的藥物製劑/藥物組合物的其它組分，還可以參見WO2015/031667或WO2015/187835等中公開的那些。

VI.組合產品

在一些實施方案中，本發明還提供了組合產品，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段，或其免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如化療劑、其他抗體、細胞毒性劑、疫苗、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑等)。在一些實施方案中，其它抗體例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體。

在一些實施方案中，所述組合產品用於預防或治療腫瘤，例如胃腸道腫瘤。在一些實施方案中，腫瘤為癌症，例如胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等。在一些實施方案中，所述組合產品用於預防或治療感染，例如慢性感染，例如細菌感染、病毒感染、真菌感染、原生動物感染等。

VII.用途

本發明一方面提供了在對象中激活NF-KappaB信號通路的方法，包括向對象施用有效量的本發明的抗GITR的抗體或其抗原結合片段、免疫綴合物、藥物組合物或組合產品。

本發明還一方面提供了在對象中提高效應T細胞功能，例如激活效應T細胞的方法，包括向對象施用有效量的本發明的抗GITR的抗體或其抗原結合片段、免疫綴合物、藥物組合物或組合產品。在一些實施方案中，所述功能是效應T細胞增殖增強。在一些實施方案中，所述激活T細胞表現為干擾素或白細胞介素分泌/表達增加。在一些實施方案中，白細胞介素是IL2。在一些實施方案中，干擾素是IFN-γ。

本發明還一方面提供給了在對象中介導ADCC而消除調節T細胞的方法，包括向對象施用有效量的本發明的抗GITR的抗體或其抗原結合片段、免疫綴合物、藥物組合物或組合產品。在一些實施方案中，所述調節T細胞是Treg細胞。

本發明一方面還提供了在對象中預防或治療腫瘤的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗GITR抗體或其片段、免疫綴合物、藥物組合物或組合產品。

本發明一方面還提供了在對象中預防或治療感染的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗GITR抗體或其片段、免疫綴合物、藥物組合物或組合產品。

本發明還提供了在對象中預防或治療與Treg增殖有關的其它病狀或病況的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗GITR抗體或其片段、免疫綴合物、藥物組合物或組合產品。

對象可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳地，高級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的患者)。在一個實施方案中，對象患有本文所述疾病(例如，如本文所述的腫瘤或感染性疾病)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，對象接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。備選地或組合下，對象因感染而免疫受損或具有因感染而免疫受損的風險。

在一些實施方案中，本文所述的腫瘤，例如癌症，包括但不限於實體瘤、血液學癌、軟組織腫瘤和轉移性病灶。在一些實施方案中，本文所述的用於治療的癌症包括但乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、腦癌、皮膚癌、肝癌、胰腺癌或胃癌等實體瘤，以及血癌例如白血病和淋巴瘤。在一些實施方案中，癌症為胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等。

可以使用本文所述的抗體分子實現對轉移性癌(例如，表達GITR或PD1的轉移性癌)的治療。

在一個實施方案中，腫瘤是表達升高水平的GITR和/或PD1的癌症。

在一些實施方案中，本文所述的癌症是結腸癌及其轉移性癌症。

在一些實施方案中，所述感染是急性的或慢性的。在一些實施方案中，所述慢性感染是持續性的感染、潛伏的感染或緩慢感染。在一些實施方案中，所述慢性感染是由選自細菌、病毒、真菌和原生動物的病原體導致的。

在其他方面，本發明提供抗GITR抗體或其片段在生產或製備藥物中的用途，所述藥物用於治療本文提及的相關疾病或病症。

在一些實施方案中，本發明的抗體或抗體片段或免疫綴合物或組合物或產品會延遲病症和/或與病症相關的症狀的發作。

在一些實施方案中，本文所述的預防或治療方法還包括向所述對象或對象組合施用本文公開的抗體分子或藥物組合物或免疫綴合物，以及一種或多種其它療法，例如治療方式和/或其它治療劑。

在一些實施方案中，治療方式包括外科手術(例如腫瘤切除術)；放射療法(例如，外粒子束療法，它涉及其中設計照射區域的三維適形放射療法)、局部照射(例如，指向預選靶或器官的照射)或聚焦照射)等。

在一些實施方案中，治療劑選自化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑。

示例性的疫苗包括但不限於癌症疫苗。疫苗可以是基於DNA的疫苗、基於RNA的疫苗或基於病毒轉導的疫苗。癌症疫苗可以是預防性的或治療性的。

示例性的抗感染活性劑包括但不限於，抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑、抗菌劑，例如核苷類似物齊多夫定(AST)、更昔洛韋、膦甲酸或西多伏韋(cidovir)，如上文所述。

示例性的其它抗體包括但不限於抗PD-1抗體、抗PDL1抗體或抗PDL2抗體。本領域已知多種抗PD-1抗體、抗PDL1抗體或抗PDL2抗體，參見例如WO2007/005874、WO2009/101611、WO2009/114335、WO2010/027827和WO2011/066342等。

在一些實施方案中，本文中描述的抗體組合可以分別施用，例如，作為單獨的抗體分別施用，或連接時(例如作為雙特異性或三特異性抗體分子)施用。

更多的可以與抗GITR抗體或其片段組合的療法或治療劑可以參見WO2015/031667。

此類組合療法涵蓋組合施用(例如兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用別的治療劑和/或藥劑之前，同時，和/或之後發生本發明的抗體的施用。在一個實施方案中，抗GITR抗體的施用和別的治療劑的施用彼此在約一個月內，或約一，兩或三週內，或約1，2，3，4，5，或6天內發生。

待採用的含抗GITR抗體的藥物組合物的治療有效量將例如取決於治療背景和目標。本領域技術人員將理解用於治療的適當劑量水平將部分地根據以下因素而變化：遞送的分子、所針對使用的適應症、施用途徑、以及患者的體重、身體表面積或器官大小和/或情況(年齡和一般健康狀態)。在某些實施方案中，臨床醫師可滴定劑量並且更改施用途徑以獲得最佳治療效果。

給藥頻率將取決於在所用製劑中的具體抗GITR抗體的藥物代謝動力學參數。通常，臨床醫師施用組合物直到達到獲得預期效果的劑量。本發明的抗體因此可以單一劑量施用，或者在一定時間內以兩次或更多次劑量(其可包含相同或不同量的所需分子)施用，或者藉由植入裝置或導管連續輸注施用。適當的劑量可藉由使用適當的劑量反應數據確定。在某些實施方案中，可在延長的時間期限內向患者施用抗體。在某些實施方案中，抗體是每兩週、每月、每兩個月、每三個月、每四個月、每五個月或每六個月給藥。

藥物組合物的施用途徑是根據已知方法，例如，經口、藉由靜脈內注射、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門脈內或病灶內途徑；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。在某些實施方案中，組合物可藉由彈丸注射或藉由連續輸注或藉由植入裝置施用。

組合物還可經由植入膜、海綿或其上吸收或膠囊包封所需分子的另一種適當的材料被局部施用。在某些實施方案中，當使用植入裝置時，所述裝置可被植入到任何合適的組織或器官中，並且可經由擴散、定時釋放的大丸劑、或連續施用遞送所需分子。

可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物替換或補充抗GITR抗體來進行任何治療。

VIII.用於診斷和檢測的方法和組合物

在某些實施方案中，本文中提供的任何抗GITR抗體或其抗原結合片段可以用於檢測GITR在生物樣品中的存在。術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測，示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如，FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如，RT-PCR)。在某些實施方案中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中，生物樣品來自過度增生性或癌性病灶。

在一個實施方案中，提供用於診斷或檢測方法的抗GITR抗體。在另一個方面中，提供檢測GITR在生物樣品中的存在的方法。在某些實施方案中，方法包含檢測GITR蛋白在生物樣品中的存在。在某些實施方案中，GITR是人GITR。在某些實施方案中，所述方法包括將生物樣品與如本文所述的抗GITR抗體在允許抗GITR抗體與GITR結合的條件下接觸，並檢測在抗GITR抗體和GITR之間是否形成複合物。複合物的形成表示存在GITR。該方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，抗GITR抗體被用於選擇適合利用抗GITR抗體的治療的對象，例如其中GITR是用於選擇所述對象的生物標記物。

在一個實施方案中，可以使用本發明抗體診斷癌症或腫瘤，例如評價(例如，監測)對象中本文所述疾病(例如，癌症或腫瘤)的治療或進展、其診斷和/或分期。在某些實施方案中，提供標記的抗GITR抗體。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酶或配體，例如，藉由酶促反應或分子相互作用。示例性標記包括但不限於，放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I，螢光團如稀土螯合物或螢光素及其衍生物，羅丹明及其衍生物，丹醯(dansyl)，傘形酮(umbelliferone)，螢光素酶(luceriferase)，例如，螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶(美國專利號4,737,456)，螢光素，2，3-二氫酞嗪二酮，辣根過氧化物酶(HR)，鹼性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖澱粉酶，溶解酶，糖類氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環氧化酶如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，以及利用過氧化氫氧化染料前體的酶如HR，乳過氧化物酶，或微過氧化物酶(microperoxidase)，生物素/親和素，自旋標記，噬菌體標記，穩定的自由基等等。

在本文中提供的任何發明的一些實施方案中，樣品是在用抗GITR抗體治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用癌症藥物治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在癌症已經轉移之後獲得的。在一些實施方案中，樣品是福爾馬林固定、石蠟包膜(FFPE)的。在一些實施方案中，樣品是活檢(例如芯活檢)，手術標本(例如來自手術切除的標本)，或細針吸出物。

在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測GITR。

在一些實施方案中，提供了一種治療腫瘤或感染的方法，所述方法包括：對對象(例如，樣品)(例如，包含癌細胞的對象樣品)檢驗GITR的存在，因而確定GITR值，將GITR值與對照值比較，並且如果GITR值大於對照值，則向對象施用治療有效量的視需要與一種或多種其他療法組合的抗GITR抗體(例如，本文所述的抗GITR抗體)，因而治療腫瘤或感染。

IX 本發明的示例性抗GITR抗體

本發明的這些以及其它方面和實施方案在附圖(附圖簡述緊隨其後)和以下的發明詳述中得到描述並且示例於以下實施例中。上文以及整個本申請中所論述的任何或所有特徵可以在本發明的各種實施方案中組合。以下實施例進一步說明本發明，然而，應理解實施例以說明而非限定的方式來描述，並且本領域技術人員可以進行多種修改。

實施例

實施例1.融合瘤細胞的製備

融合瘤技術是藉由融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特徵。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細胞(B淋巴細胞)的主要特徵是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續培養，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即具有所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才能具有持續培養的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特徵的細胞純株。本實驗藉由人GITR蛋白免疫小鼠，再獲取小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合，獲得能夠表達陽性抗體的融合瘤細胞。

融合瘤融合

實驗動物及免疫信息

電融合皿準備：用70%乙醇徹底浸泡電融合皿，並於超淨台中吹乾備用。

分離脾細胞：頸脫位將小鼠處死，用75%酒精消毒體表5min，隨即放入超淨台內小鼠解剖板上，左側臥位，用7號針頭固定四肢。無菌打開腹腔取出脾臟，用基礎培養基(配置方法如下表)洗滌，並仔細去掉周圍附著的結締組織。隨後將脾臟轉移到另一個盛有基礎培養基的平皿中。以彎頭針頭壓住脾臟，用小針頭在脾臟上插孔，並用鑷子擠壓，使脾細胞充分釋放，製成脾細胞懸液。細胞懸液經70μM細胞篩網過濾後用30ml基礎培養基洗一遍，1200rpm離心6min。

裂解紅細胞：去除上清，用10ml RBC裂解緩衝液(GIBCO)重新懸浮細胞。然後再加入20ml RBC裂解緩衝液。懸液靜置5min後1100rpm離心6min。去上清後用10ml基礎培養基重新懸浮細胞，然後再加入30ml基礎培養基，1100rpm離心6min。去除上清後，細胞重新懸浮於20ml基礎培養基中並計數。

電融合：用20ml基礎培養基重新懸浮小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞(ATCC)並計數。將SP2/0和脾細胞以1：2~1：1的比例混合，1000rpm離心6min。去除上清後將混合的細胞重新懸浮於10ml融合緩衝液(BTXpress)中。再加入15ml融合緩衝液，1000rpm離心5min，去除上清。重複上述步驟一遍後，用適量融合緩衝液重懸細胞，調整混合細胞密度至1×10⁷個細胞/ml。電融合儀的參數設置如下。每個電融合皿中加入2ml細胞懸液進行電融合。

電融合後鋪板：細胞於電融合皿中室溫靜置5min。將細胞轉移入離心管中，用篩選培養基(配置方法如下表)稀釋細胞至1~2×10⁴個細胞/ml。96孔板中每孔加入100μl細胞懸液。融合後第7天更換篩選培養基。培養第10天(或更久，根據細胞生長狀態)後進行篩選。藉由FACS(C6(BD Biosciences))檢測篩選出表達特異性抗GITR抗體的融合瘤細胞。

陽性融合瘤細胞亞選殖

亞選殖步驟：準備一塊96孔板，第2至第8列每孔加入200μl如上所述的基礎培養基。將上述融合篩選出的陽性孔的細胞製成細胞懸液並加入第1列。將第1列細胞懸液取100μl加入第2列，充分混勻後取100μl加入下一列。重複上述步驟，直至最後一列體積變為300μl；靜置96孔板15min，顯微鏡下觀察計數。取100個細胞對應的體積加入20ml如上所述的基礎培養基中，並混勻鋪板，每孔200μl。一週後顯微鏡下觀察，判斷並標記出單純株孔，待測挑出陽性孔。

細胞凍存：觀察細胞狀態，等細胞生長良好，活力>90%時，1000rpm離心5min，去除上清。用凍存液(45.5%FBS，44.5%RPMI-1640，10%DMSO)重新懸浮細胞至1×10⁷個細胞/ml，分裝至凍存管，放入程序降溫盒中，-80℃凍存。

實施例2.嵌合抗體的生產和純化

本發明利用分子生物學技術，獲得抗GITR陽性融合瘤細胞中的抗體序列，並利用其構建人鼠嵌合抗體。

融合瘤測序

RNA抽提：新鮮細胞，300g離心5min，去除上清，沉澱中加入500μ l LY緩衝液(Biomiga)(在使用前每1ml加入20μ l β巰基乙醇)，混勻至澄清。加入到DNA去除管中，13000rpm離心2min，收集流穿液。按1/2的比例向流穿液中加入100%乙醇，混勻5次至澄清。將澄清的溶液加入到RNA收集管中，13000rpm離心1min去除液體，加入500μ l RB(Recovery Buffer，回收緩衝液)(Takara)，13000rpm離心30s，再加入500μ l RNA洗滌緩衝液(Biomiga)(用之前加入乙醇)，離心30s，重複一遍上述過程後，離心徹底揮發去除乙醇後，向收集柱中加入30μ l DEPC水，12000g離心2min，收集洗脫液。測定RNA濃度。

利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉錄獲得cDNA：配置反應體系I如下：

65℃溫育5min後，迅速置冰上冷卻。向反應體系I中加入下列反轉錄體系，總量為20μ l：

緩慢混勻後按下列條件進行反轉錄翻譯：42℃ 60min→95℃ 5min，然後放冰上冷卻，獲得cDNA。

將cDNA連接T載體：PCR分別擴增重鏈和輕鏈可變區，PCR反應體系如下：

PCR反應條件如下：

取4.5μ l上述PCR反應獲得的PCR產物，加入0.5μ l pMD20-T載體(Clontech)，5μ l Ligation Mighty Mix(Takara)，輕輕混勻，於37℃反應2h，獲得連接產物。

轉化細胞：

-80℃取出TOP10感受態細胞(天根生化科技(北京)有限公司)，冰上融化，取上述獲得的連接產物5μ l加入到融化的TOP10 感受態細胞中，混勻後冰上孵育30min。42℃熱激90s後迅速冰上冷卻2min，向EP管中補加900μ l LB培養基(生工生物工程(上海)股份有限公司)，37℃，220rpm搖床培養1h。3000g離心2min，吸除800μ l上清，用剩餘的培養基將菌體重新懸浮並塗布在胺苄青黴素抗性的平板上。於37℃培養過夜，挑純株測序。

構建嵌合抗體

PCR擴增已經測序的實施例1中融合瘤產生的鼠抗GITR抗體VH及VL區

PCR體系如下：

切膠回收PCR擴增產物。

同源重組反應：同源重組體系如下：

37℃反應30min，獲得重組產物。重組產物轉化TOP10感受態細胞，並挑取單純株測序，選擇包含插入方向正確的質粒的純株作為陽性純株，保存陽性純株。

嵌合抗體的表達和純化

從上文獲得的陽性純株中提取包含抗GITR抗體的質粒。

根據所需轉染體積傳代293F細胞(Invitrogen)，轉染前一天將細胞密度調整至1.5×10⁶個細胞/ml。轉染當天細胞密度約為3×10⁶個細胞/ml。取終體積1/10的F17培養基(Gibco，A13835-01)作為轉染緩衝液，加入適當的質粒，混勻。加合適的聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences，23966)到質粒中(質粒與PEI的比例在293F細胞中為1：3)，混勻後室溫孵育10min，獲得DNA/PEI混合物。用DNA/PEI混合物重新懸浮細胞後，36.5℃，8%的CO₂。24h後補加轉染體積2%的FEED(Sigma)，於36.5℃，120rpm，8%的CO₂條件下培養。連續培養至第6天或者細胞活力

60%時，收集細胞上清進行純化。

將純化使用的重力柱使用0.5M NaOH過夜處理，玻璃瓶等用蒸餾水洗淨後在180℃乾烤4h，獲得純化柱。純化前將收集的培養基4500rpm離心30min，棄掉細胞。再將上清使用0.22μ l的濾器過濾。每管裝填1ml Protein A，並使用10ml結合緩衝液(磷酸鈉20mM.NaCl 150mM,PH7.0)平衡。將過濾後的上清加入純化柱後使用15ml結合緩衝液再平衡。加5ml洗脫緩衝液(檸檬酸+檸檬酸鈉0.1M,PH3.5)，收集洗脫液，每1ml的洗脫液加入80μ l Tris-HCl。將收集的抗體超濾濃縮交換到PBS(Gibco，70011-044)中，並檢測濃度。

本發明獲得的2個嵌合抗體(CH22F4和CH37G5)的CDR、輕鏈可變區和重鏈可變區，輕鏈和重鏈的胺基酸序列，以及序列編號請參見上表1-3。

本發明所用的對照抗體為專利申請US20130183321A1(GITR,INC.(Cambridge,MA,US))中報道的GITR抗體，其輕鏈和重鏈序列在US20130183321A1中分別為SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：54，下文中將其簡稱為TRX518。

實施例3 生物膜薄層干涉技術測定本發明的嵌合抗體與抗原的結合動力學

採用生物膜薄層干涉測定技術(ForteBio)測定本發明抗體結合人GITR的平衡解離常數(KD)。ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：第270-8頁)進行。

實驗開始前半個小時，根據樣品數量，取合適數量的AMQ(Pall，1506091)(用於樣品檢測)或AHQ(Pall，1502051)(用於陽性對照檢測)傳感器浸泡於SD buffer(PBS 1×，BSA 0.1%，Tween-20 0.05%)中。

取100μl的SD緩衝液、抗體(CH22F4、CH37G5和TRX518)、抗原(包括人GITR、及食蟹猴GITR，均自Acrobiosystems購買)分別加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner，675076)中。根據樣品位置布板，選擇傳感器位置。儀器設置參數如下：運行步驟：Baseline、Loading~1nm、Baseline、Association和Dissociation；各個步驟運行時間取決於樣品結合和解離速度，轉速為400rpm，溫度為30℃。使用ForteBio分析軟體分析K_D值。

在以上測定法所述的實驗中，抗體CH22F4、CH37G5的親和力如表8所示：

在以上試驗中，嵌合抗體CH22F4、CH37G5的K_D值分別為1.96E-09M、2.04E-09M，與對照組的TRX518相比，本研究中的抗體具有更優的K_D值。

實施例4 嵌合抗體和過表達人GITR的CHO-S細胞的結合實驗

本研究利用流式細胞儀檢測了梯度稀釋的本發明的嵌合抗體與表面過表達人GITR的CHO-S穩定細胞株的結合情況。

將編碼人GITR(SEQ ID NO：41)的cDNA選殖到pCHO1.0載體(Invitrogen)中，將獲得的質粒轉染到CHO-S細胞(Invitrogen,ExpiCHO^TM Expression System Kit，貨號：A29133)，產生過表達人GITR的CHO-S細胞(CHO-hGITR)。

將CHO-hGITR細胞計數，並稀釋至2×10⁶個細胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。400g離心5min，去除細胞培養基。將樣品(分別是嵌合抗體CH22F4、CH37G5，以及TRX518)(抗體稀釋方法為：最高抗體濃度為400nM，三倍稀釋在PBS中，總共測試了12個濃度)加入U型板並重新懸浮細胞，100μl/孔，冰上靜置30min。400g離心5min去除上清，PBS洗細胞1遍。400g離心5min去除PBS，每孔加入100μl抗人Fc的PE標記的二抗(SoutherBiotech；2040-09)(1：200稀釋於PBS中)，在冰上避光孵育30min。400g離心5min去除上清，PBS洗細胞1遍。用80μl 1×PBS重新懸浮細胞，FACS檢測。

在以上測定法所述的實驗中，抗體CH22F4、CH37G5和CHO-hGITR細胞的結合情況如第1圖所示。

在以上試驗中，抗體CH22F4、CH37G5均結合CHO-S細胞上過表達的人GITR分子，EC50分別為0.4568nM、0.9069nM，與TRX518相比，結合能力相似。

實施例5 嵌合抗體的人源化

將實施例2得到的嵌合抗體進行人源化。並經過以下步驟進行人源化：①確定CDR環結構；②在人種系序列數據庫為重鏈和輕鏈的每個V/J區域找到最接近的同源序列；③篩選與重鏈輕鏈最匹配的人種系以及最低量的回復突變；④將嵌合抗體的CDR區構建至人的骨架區上；⑤使用序列和結構特徵，確定骨架區中起到維持CDR功能的胺基酸位置；⑥在確定為重要的序列位置進行回復突變(返回到輸入胺基酸類型)；⑦優化風險位點的胺基酸。

本發明獲得的2個人源化抗體(HZ22F4和HZ37G5)的CDR、輕鏈可變區和重鏈可變區，輕鏈和重鏈的胺基酸序列請參見如上文所述的表1-3。

實施例6 ForteBio測定人源化抗體與抗原的結合動力學

採用ForteBio測定法測定本發明的人源化抗體結合人GITR的平衡解離常數(K_D)。ForteBio親和力測定方法同實施例3，例外是使用的抗體是人源化抗體HZ22F4和HZ37G5。在以上測定法所述的實驗中，抗體HZ22F4和HZ37G5的親和力如表9所示：表9.ForteBio檢測抗原抗體結合的親和力常數

在以上試驗中，本文所述的人源化抗體HZ22F4、HZ37G5的K_D值分別為4.58E-09M、4.83E-09M，與對照抗體相比，本研究中的人源化抗體具有更優的K_D值。

實施例7 人源化抗體和過表達人GITR的CHO-S細胞的結合實驗

本研究利用流式細胞儀檢測了梯度稀釋的本發明的人源化抗體與CHO-hGITR細胞的結合情況。試驗方法同實施例4，例外是使用的抗體是人源化抗體HZ22F4和HZ37G5。結合情況如第2圖所示。

在以上試驗中，人源化抗體HZ22F4、HZ37G5結合CHO-S細胞上過表達的人GITR，EC50分別為0.5492nM、1.974nM，與TRX518相比，具有相似或更優的EC50數值，即相似或更優的結合能力。

實施例8 人源化抗體和過表達食蟹猴GITR的細胞的結合實驗

本研究利用流式細胞儀檢測了梯度稀釋的本發明的人源化抗體與表面過表達食蟹猴GITR的CHO-S穩定細胞株的結合情況。

將編碼食蟹猴GITR(SEQ ID NO：42)的cDNA選殖到pCHO1.0載體(Invitrogen)上，將質粒轉染到CHO-S細胞(Invitrogen,ExpiCHO^TM Expression System Kit，貨號：A29133)，產生過表達食蟹猴GITR的CHO-S細胞(CHO-cynoGITR)。其餘部分試驗方法同實施例 4，例外是使用的抗體是人源化抗體HZ22F4和HZ37G5，結合情況如第3圖所示。

在以上試驗中，人源化抗體HZ22F4、HZ37G5結合CHO-S細胞上過表達的食蟹猴GITR，EC50分別為0.3533nM、0.9931nM，與TRX518相比，具有相似或更優的結合能力。

實施例9 MOA方法檢測抗體的生物學活性

針對GITR的激活性抗體可以與細胞表面GITR分子結合激活下游NF-kappa B信號通路。本研究使用內部構建的Hela-GITR-NF kappa B luciferase(以下簡稱Hela-GITR)的檢測細胞株，藉由檢測螢光報告基因的表達反應出NF-kappa B信號的激活情況，從而檢測本發明抗體的激活作用。

Hela-GITR-NF kappa B luciferase細胞株的構建

將編碼人GITR(序列見SEQ ID NO：41)的cDNA選殖到pCHO1.0載體(Invitrogen)上，將獲得的質粒和NF-kappaB luciferace報告基因質粒(Promega)共轉染到Hela細胞(ATCC，貨號：CCL-2TM)，產生過表達人GITR同時帶有NF-kappaB luciferace報告基因系統的Hela細胞(Hela-GITR)。

取對數生長期的Hela-GITR細胞，棄培養上清，PBS(Gibco)洗一遍細胞。加入適量Trypsin(Gibco)於37℃、5% CO₂消化2min。加入4倍Trypsin體積的含10% FBS的DMEM培養基(ATCC)，轉移細胞至50ml離心管並計數，400g，離心5min。加入DMEM培養基(ATCC)，重新懸浮細胞至1×10⁵個細胞/mL。將細胞加入96孔白色細胞培養板(Nunclon)，50μl/孔。同時每孔加入50μl樣品 (本發明製備的人源化抗體HZ22F4、HZ37G5)及陽性對照TRX518)，(抗體稀釋方法為：最高抗體濃度為80nM，三倍稀釋在測定緩衝液(2%FBS DMEM培養基)中，總共測試了10個濃度)。於37℃/5% CO₂培養箱中培養6小時。

檢測：提前將Bio-GloTM緩衝液(promega)融化，加入Bio-GloTM底物(promega)，混勻，獲得Bio-GloTM試劑。向如上所述培養了6個小時的細胞中加入Bio-GloTM試劑，100μl/孔。立即讀數。

在以上試驗中，實驗結果如第4圖所示，抗體HZ22F4、HZ37G5均可以有效激活NF kappa B信號通路，EC50分別為0.3394nM、0.3208nM、與TRX518(1.139nM)相比，具有顯著更優的激活能力。

實施例10 CD4 T激活細胞實驗

本研究將抗體和激活過的CD4 T細胞共同孵育，藉由檢測體系中IL-2和IFN-γ的相對表達量，從而反應出不同抗體對CD4 T細胞的激活作用。

PBMC分離：取捐贈者新鮮血液50ml，添加2.5倍PBS，輕輕加入到FiColl(Thermo)，分4管，400g離心30min，升速度為7，減速度為0。離心結束，輕輕取出離心管，吸取中間白色雲霧狀細胞群至PBS中，PBS洗2次。

CD4⁺ T細胞分離：取如上所述分離的PBMC細胞，按照EasySep Human CD4⁺ T Cell Enrichment Kit(stem cell)說明書分離富集CD4⁺ T細胞，並使用T細胞培養基(配方見下表)重新懸浮。

CD4⁺ T細胞激活：取上述分離獲得的CD4⁺ T細胞，並用T細胞培養基調整細胞密度為1*10⁶/ml，按照細胞：beads(1：1)加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)，於37℃，5% CO₂培養箱中培養一週。

T細胞激活實驗：取Nunc 96孔平底板(Nunclon)，100μ l/孔加入PBS稀釋的0.25μ g/ml的Purified NA/LE Mouse抗人CD3 Clone UCHT1(BD Biosciences),37℃包被2小時，去除包被液。將上述激活一週的CD4⁺ T細胞去除beads，用T細胞培養基清洗兩次，並將細胞密度調整為1*10⁶/ml，每孔體積100μl細胞懸液加入上述96孔平底板中，，同時加入本發明的抗體(HZ22F4，HZ37G5)以及TRX518 100μl(抗體稀釋方法為：最高抗體濃度為400nM，三倍稀釋在T細胞培養基中，總共測試了10個濃度)以及Purified NA/LE Mouse抗人CD28 Clone CD28(BD Biosciences)(終濃度為2μ g/ml)，培養3和5天，分別用Human IL-2 Kit 1000 Test和Human IFN gamma 1000 test試劑盒(均購自cisbio)檢測IL-2和IFN-γ的相對表達量(以DeltaF%計)。

實驗結果如表10和11及第5圖、第6圖所示。本發明的抗體均可以在體外有效激活CD4⁺T細胞。其中表中的數據單位為DeltaF%平均值。

實施例11 ADCC效應實驗

針對GITR的IgG1亞型抗體可以與Treg表面高表達的GITR分子結合，進而介導ADCC效應清除Treg。本研究使用Promega的Jurkat-ADCCNF-AT luciferase效應細胞株(以下簡稱ADCC效應細胞)作為檢測細胞株與作為靶細胞的CHO-hGITR細胞(如上所述)和本發明的抗體共孵育，藉由檢測螢光報告基因的表達反應出NF-AT信號的激活情況，從而檢測抗體的ADCC活性。

取對數生長期的ADCC效應細胞(根據Promega公司說明培養)，離心去上清，PBS洗2遍，用檢測培養基(5% low IgG血清的1640培養基(Gibco))重新懸浮調整細胞密度為2*10⁷/ml，取如上所述製備並孵育的CHO-hGITR靶細胞，離心去上清，用檢測培養基重新懸浮調整細胞密度為2*10⁶/ml，將上述細胞按1：1比例混合，並加入到96孔白色細胞培養板(Nunclon)，50μl/孔。同時每孔加入50μl樣品(本發明製備的人源化抗體HZ22F4、HZ37G5)及陽性對照抗體(TRX518)，(抗體稀釋方法為：最高抗體終濃度為66.66nM，三倍稀釋在檢測培養基中，總共測試了12個濃度)。於37℃/5% CO₂培養箱中培養12小時。

檢測：提前將Bio-GloTM緩衝液(promega)融化，加入Bio-GloTM底物(promega)，混勻，得到Bio-GloTM試劑。向如上所述培養了12個小時的細胞中加入Bio-GloTM試劑，100μl/孔。立即讀數。

在以上試驗中，實驗結果如第7圖所示，抗體HZ22F4、HZ37G5均可以有效激活ADCC下游的NF-AT信號通路，EC50分別為0.02958nM、0.04056nM、與TRX518相比，具有顯著更優的EC50數值。

實施例12 抗腫瘤藥效試驗

本實驗採用MC38細胞接種hGITR轉基因小鼠測定本發明的GITR抗體的抗腫瘤作用。

人GITR轉基因小鼠：

雌性C57Bl/6背景的人GITR轉基因小鼠(約5週大)購自百奧賽圖實驗動物技術有限公司。小鼠在到達後馴化7天，隨後開始研究。

細胞：

小鼠MC38細胞購自南京銀河生物醫藥有限公司，並嚴格按照說明書進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞，在無菌PBS中重新懸浮細胞並調整細胞密度為5×10⁶個/ml。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至人GITR轉基因小鼠右側腹部區域中來建立MC38-hGITR荷瘤小鼠模型。

給藥：

腫瘤細胞接種6天後檢測各隻小鼠瘤體積，挑選出瘤體積在87.4mm³~228.4mm³範圍內的小鼠按瘤體積平均分組(每組5隻小鼠)分組，給藥劑量和方式如表12所示，其中Antibody C為抗PD-1的單株抗體“Antibody C”(WO2017/133540)。分別在接種後第6、10、13、17天給藥，在給藥期間監測各組小鼠瘤體積和體重變化，監測頻率均為2次/週，連續監測週。在每次給藥前測定體重和腫瘤體積，接種後第24天計算相對腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：TGI%=100% * (h-IgG對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(h-IgG對照組腫瘤體積-h-IgG對照組給藥前腫瘤體積)，其中h-IgG對照組給藥前腫瘤體積平均值為106mm³。腫瘤體積測定：採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W²/2。採用電子天平測定體重。

腫瘤抑制率結果如第8圖、第9圖9和表13所示：在接種後第24天，HZ37G5和HZ22F4單藥均顯示很好的腫瘤抑制率，分別為：53%和50%，優於TRX518組的36%。HZ37G5和HZ22F4與抗PD-1抗體Antibody C聯合用藥，腫瘤抑制效果均明顯優於Antibody C，HZ37G5，HZ22F4，以及TRX518單藥組。其中HZ37G5和Antibody C聯合用藥組，以及HZ22F4和Antibody C聯合用藥組5隻小鼠均有4隻腫瘤完全消失。同時我們對小鼠體重進行檢測，結果如第10圖所示小鼠體重無顯著差異。因此，本發明的針對GITR分子的抗體對腫瘤有明顯的抑制效果，且當所述抗體與PD-1抗體聯合用藥對腫瘤的抑制效果更加顯著。

<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司

<120> 抗GITR抗體及其用途

<130> PF 190065TWI

<160> 43

<170> PatentIn版本3.3

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<223> 抗體序列

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<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何胺基酸,較佳地N、Q、H、D、K或R,更佳地N或Q

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<220>

<223> 抗體序列

<400> 13

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何胺基酸,較佳地D、E或N,更佳地D或E

<400> 14

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 16

<210> 17

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 17

<210> 18

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 18

<210> 19

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 19

<210> 20

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 20

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 21

<210> 22

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 22

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 23

<210> 24

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 24

<210> 25

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 25

<210> 26

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 26

<210> 27

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 27

<210> 28

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 28

<210> 29

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 29

<210> 30

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 30

<210> 31

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 31

<210> 32

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 32

<210> 33

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 33

<210> 34

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 34

<210> 35

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 35

<210> 36

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 36

<210> 37

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 37

<210> 38

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 38

<210> 39

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 39

<210> 40

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗體序列

<400> 40

<210> 41

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 蛋白質

<400> 41

<210> 42

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 蛋白質

<400> 42

<210> 43

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 蛋白質

<400> 43

Claims

一種結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其包含(i)如SEQ ID NO：17或19所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及如SEQ ID NO：21或23所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR，或者(ii)如SEQ ID NO：18或20所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及如SEQ ID NO：22或24所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。
一種結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，以及輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR，其中(i)HCDR1包含SEQ ID NO：1或3或4所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：11、13或14所示的胺基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；或者(ii)HCDR1包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
一種結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含：(i)表B所列任一抗體的VH中所含的三個互補決定區域(HCDR)；(ii)表A所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的組合；(iii)(i)或(ii)的HCDR組合的變體，所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)；或(iv)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含選自SEQ ID NO：1、2、3或4的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR1包含與選自SEQ ID NO：1、2、3或4的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；HCDR2包含選自SEQ ID NO：5或6的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR2包含與選自SEQ ID NO：5或6的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；HCDR3包含選自SEQ ID NO：7或8的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR3包含與選自SEQ ID NO：7或8的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；和/或所述輕鏈可變區包含：(i)表B所列任一抗體的VL中所含的三個互補決定區域(LCDR)；(ii)表A所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合； (iii)(i)或(ii)的LCDR組合的變體，所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)；或(iv)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含選自SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR1包含與選自SEQ ID NO：9或10的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；LCDR2包含選自SEQ ID NO：11、12、13或14的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR2包含與選自SEQ ID NO：11、12、13或14的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；LCDR3包含選自SEQ ID NO：15或16的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR3包含與選自SEQ ID NO：15或16的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其包含(i)包含與SEQ ID NO：17或19所示的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和/或包含與SEQ ID NO：21或23所示的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區，或者(ii)包含與SEQ ID NO：18或20所示的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和/或包含與SEQ ID NO：22或24所示的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區，或者 (iii)包含SEQ ID NO：17或19所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和/或包含SEQ ID NO：21或23所示的胺基酸序列的輕鏈可變區，或者(iv)包含SEQ ID NO：18或20所示的胺基酸序列的重鏈可變區，和/或包含SEQ ID NO：22或24所示的胺基酸序列的輕鏈可變區。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其包含(i)包含與SEQ ID NO：25或27所示的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的重鏈，和/或包含與SEQ ID NO：29或31所示的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈，或者(ii)包含與SEQ ID NO：26或28所示的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的重鏈，和/或包含與SEQ ID NO：30或32所示的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈，或者(iii)包含SEQ ID NO：25或27所示的胺基酸序列的重鏈，和/或包含SEQ ID NO：29或31所示的胺基酸序列的輕鏈，或者(iv)包含SEQ ID NO：26或28所示的胺基酸序列的重鏈，和/或包含SEQ ID NO：30或32所示的胺基酸序列的輕鏈。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其具有以下一個或多個特性：(i)顯示與表3所列的任一抗體對GITR相同或相似的結合親和力和/或特異性；(ii)抑制(例如，競爭性抑制)表3所列的任一抗體與GITR的結合；(iii)與表3所示的任一抗體結合相同或重疊的表位；(iv)與表3所示的任一抗體競爭結合GITR；(v)具有表3所列的任一抗體分子的一個或多個生物學特性。
如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其具有以下一個或多個特性：(i)以高親和力結合GITR，例如人GITR；(ii)具有激動劑活性，例如能夠有效激活NF-kappaB信號通路；(iii)能夠有效介導ADCC效應；(iv)能夠激活T細胞，例如CD4 T細胞；(v)具有更好的抗腫瘤活性，例如能夠降低對象中的腫瘤體積，同時不影響對象的體重；(vi)與抗PD-1抗體組合能夠更好地抑制腫瘤活性，例如能夠降低對象中的腫瘤體積，同時不影響對象體重。
如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是IgG1形式或IgG2形式或IgG4形式的抗體或抗原結合片段。
如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是單株抗體。
如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是人源化的抗體或人抗體或嵌合抗體。
如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗原結合片段是選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)或(Fab’) ₂、單結構域抗體、雙抗體(dAb)或線性抗體。
如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體為雙特異性或多特異性抗體分子，較佳地，雙特異性抗體分子與GITR和PD-1、PD-L1或PD-L2結合。
一種經分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的結合GITR的抗體或其任意一條或多條鏈或其片段。
一種包含如申請專利範圍第13項所述的核酸的載體，較佳地所述載體是表達載體。
一種包含如申請專利範圍第13項所述的核酸或如申請專利範圍第14項所述的載體的宿主細胞，較佳地，所述宿主細胞是原核的或真核的，更佳的選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如293細胞或CHO細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。
一種製備結合GITR的抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括在適於表達編碼如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段的核酸或如申請專利範圍第13項所述的核酸的條件下培養如申請專利範圍第15項所述的宿主細胞，視需要地分離所述抗體或其抗原結合片段，視需要地所述方法還包括從所述宿主細胞回收所述結合GITR的抗體或其抗原結合片段。
一種免疫綴合物，其包含如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段和其它物質，例如細胞毒性劑或標記。
一種藥物組合物，其包含如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第17項所述的免疫綴合物，以及視需要地一種或多種其它治療劑，例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體，以及視需要地藥用輔料。
一種組合產品，其包含如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第17項所述的免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑，例如化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑，較佳地PD-1軸結合拮抗劑，例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體。
一種在對象中介導ADCC或激活效應T細胞或激活NF-kappaB信號通路或消除調節T細胞(例如Treg細胞)的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第17項的免疫綴合物、或如申請專利範圍第18項所述的藥物組合物，或如申請專利範圍第19項所述的組合產品。
一種預防或治療對象腫瘤或感染的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第17項所述的免疫綴合物、或如申請專利範圍第18項所述的藥物組合物、或如申請專利範圍第19項所述的組合產品，較佳地，所述腫瘤為癌症，例如胃腸道癌症，例如胃癌、直腸癌、結腸癌、結腸直腸癌等；較佳地，所述感染為例如細菌感染、病毒感染、真菌感染或原生動物感染，較佳地所述感染為慢性感染。
如申請專利範圍第21項所述的方法，其還包括向所述對象聯合施用一種或多種療法，例如治療方式和/或其它治療劑，較佳地，治療方式包括手術治療和/或放射療法，和/或其它治療劑選自化療劑、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、抗感染活性劑、小分子藥物或免疫調節劑，較佳地PD-1軸結合拮抗劑，例如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體。
一種檢測樣品中GITR的方法，所述方法包括(a)將樣品與如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的結合GITR的抗體或其抗原結合片段接觸；和(b)檢測結合GITR的抗體或其抗原結合片段與GITR間的複合物的形成；視需要地，結合GITR的抗體是被可檢測地標記的。