TWI809426B

TWI809426B - 抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８.２抗體以及其用途

Info

Publication number: TWI809426B
Application number: TW110122381A
Authority: TW
Inventors: 周帥祥; 李莉; 管哲; 王杰
Original assignee: 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2023-07-21
Also published as: US20230235047A1; WO2021254481A1; EP4169947A1; CN115943162A; AU2021291259A1; WO2021254481A9; KR20230023664A; TW202204416A; CA3178855A1; JP2023530003A

Abstract

本發明係涉及特異性結合Claudin18.2的新穎抗體和抗體片段以及含有該抗體或抗體片段的組成物。此外，本發明復涉及編碼該抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞，以及相關用途。此外，本發明復涉及這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。

Description

抗Claudin18.2抗體以及其用途

本發明係以申請號為202010570517.X，申請日為2020年6月19日的中國專利申請案為基礎，並主張其優先權，該中國專利申請案的公開內容在此次作為整體引入本發明中。

Claudins是一個蛋白質家族，係構成細胞緊密連接的重要組成部分。它們建立了控制細胞間分子流動的細胞間障壁，可控制細胞之間分子的流動。Claudins家族蛋白具有四次跨膜結構域，其N端和C端均包括在細胞質中。不同的Claudins蛋白在不同的組織上表現，其功能的改變與各個組織的癌症形成有關，例如，Claudin-1表現在結腸癌中且具有預後價值，Claudin-18表現在胃癌中，Claudin-10表現在肝細胞癌中。Claudins作為細胞膜表面蛋白，是各種治療策略的有用靶標。

Claudin-18的同種型2(Claudin18.2或CLDN18.2)是高度選擇性的細胞譜系標記物，其在正常組織中的表現嚴格限制於胃黏膜分化的上皮細胞，但不表現於胃幹細胞區。CLDN18.2在相當一部分原發性胃癌中表現，並且在胃轉移的癌組織中保留其表現水平。除胃癌以外，在胰腺癌中也發現有CLDN18.2的表現，是治療這些癌症的理想的靶標分子(Singh,P.,Toom,S.& Huang,Y.Anti-CLDN18.2 antibody as new targeted therapy for advanced gastric cancer.J Hematol Oncol 10,105(2017).https：//doi.org/10.1186/s13045-017-0473-4)。

由於存在大量的未被滿足的臨床腫瘤治療的需求，開發靶向Claudin18.2的藥物十分必要。雖然，現有技術已經開發一些針對Claudin18.2的單株抗體，但是，這些抗體大多為嵌合抗體，具有潛在較高的免疫原性風險，且親和力較低，特異性差，ADCC活性一般。

因此，還需要開發新的針對Claudin18.2的抗體，其具有較低的免疫原性，與Claudin18.2的結合親和力更強，特異性佳，ADCC和CDC活性強且具有更好的抗腫瘤活性。

在一些方面，本發明涉及結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段，其包含本發明所述的3個重鏈可變區CDR和3個輕鏈可變區CDR。

在一些方面，本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段包含本發明所述的重鏈可變區和/或輕鏈可變區。

在一些方面，本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段還包含本發明所述的重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。

在一些方面，本發明還涉及以下實施方案：

1：本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是IgG1形式或IgG2形式或IgG3形式或IgG4形式的抗體或抗原結合片段，較佳的是IgG1形式的抗體或抗原結合片段。

2：本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是單株抗體。

3：本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是人源化的抗體或人類抗體或嵌合抗體。

4：本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段是選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)₂、例如VHH、dAb(domain antibody)之單結構域抗體或線性抗體。

5：本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有以下一種或多種性質：

(i)以高親和力結合CLDN18.2(例如，人類CLDN18.2)，而不結合CLDN18.1(例如，人類CLDN18.1)；

(ii)以下列平衡解離常數(K_D)與人類CLDN18.2結合，該K_D小於大約15nM，較佳地，小於或等於大約10nM、9.5nM、9nM、8.5nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM；

(iii)與細胞表面的CLDN18.2結合，不與細胞表面的CLDN18.1結合；

(iv)具有ADCC活性或CDC活性，例如，與已知抗體(例如，Zmab)相當的ADCC活性或CDC活性，或者更高的ADCC活性或CDC活性；

(v)抑制腫瘤細胞，例如，表現CLDN18.2的腫瘤細胞；

(vi)能夠有效抑制腫瘤生長，腫瘤抑制率係大於或等於約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%。

6：分離的核酸，其編碼本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段中的輕鏈可變區或重鏈可變區，或輕鏈或重鏈。

7：包含本發明的核酸的載體，較佳地，該載體是表現載體。

8：包含本發明的核酸或載體的宿主細胞，較佳地，該宿主細胞是原核的或真核的，更佳地，係選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如，293細胞或CHO細胞，如，CHO-S細胞或HEK293細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。

9：製備結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括在適於表現編碼本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段的核酸的條件下培養本發明的宿主細胞，視需要地分離該抗體或其抗原結合片段，視需要地該方法還包括從該宿主細胞回收該結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段。

10：免疫綴合物，其包含本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段和其它物質，例如，細胞毒性劑。

11：醫藥組成物，其包含本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段或本發明的免疫綴合物，以及視需要地一種或多種其它治療劑，例如，化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑，以及視需要地，藥用輔料。

12：藥物組合，其包含本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段或本發明的免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑，例如，化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑。

13：預防或治療受試者中之腫瘤的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、或本發明的免疫綴合物、醫藥組成物或藥物組合。

14：在受試者中引發ADCC和/或CDC的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的本發明的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、或本發明的免疫綴合物、醫藥組成物或藥物組合。

15：本發明的抗體或免疫綴合物在製備用於治療或預防腫瘤和/或引發ADCC和/或CDC的藥物或藥物組合中的用途。

16：本發明的方法或用途，其中該腫瘤為癌症，較佳地，該癌症具有升高水平的(例如，核酸或蛋白質水平的)CLDN18.2。

17：本發明的方法，其中該方法還包括向患者施用一種或多種療法，例如，治療方式和/或其它治療劑，較佳地，該治療方式包括手術治療和/或放射療法，其它治療劑選自化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑。

18：本發明的用途，其中該藥物或藥物組合能與一種或多種療法，例如，治療方式和/或其它治療劑聯合施用給受試者，較佳地，治療方式包括手術治療和/或放射療法，其它治療劑選自化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑。

19：檢測樣品中CLDN18.2的方法，該方法包括

(a)將樣品與本發明的抗體或其抗原結合片段接觸；以及

(b)檢測抗體或其抗原結合片段與CLDN18.2間的複合物的形成；視需要地，抗體是被可檢測地標記的。

圖1顯示抗CLDN18.2抗體特異性結合細胞表面的CLDN18.2。

圖2顯示抗CLDN18.2抗體不結合細胞表面的CLDN18.1。

圖3顯示抗CLDN18.2抗體對CHO-hCLDN18.2的基於報導基因的ADCC活性。

圖4顯示人源化抗CLDN18.2抗體對CHO-hCLDN18.2的基於報導基因的ADCC活性。

圖5顯示抗CLDN18.2抗體與胃癌細胞系NUGC-4、胃癌細胞系KATO III-hCLDN18.2和胰腺癌細胞系DAN-G-hCLDN18.2的結合。

圖6顯示抗CLDN18.2抗體的CDC活性檢測。

圖7顯示抗CLDN18.2抗體的ADCC活性檢測。

圖8顯示抗CLDN18.2抗體在胰腺癌小鼠模型的抗腫瘤效果。

圖9顯示抗CLDN18.2抗體在胃癌小鼠模型的抗腫瘤效果。

I.定義

在下文詳細描述本發明前，應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而並不意圖限制本發明的範圍，其僅會由所附申請專利範圍限制。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常的理解具有相同的含義。

為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。應理解，本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案，並且不意欲是限制性的。

術語「約」在與數位數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數位數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

如本文所用，術語「和/或」意指可選項中的任一項或可選項的兩項或多項。

如本文所用，術語「包含」或「包括」意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語「包含」或「包括」時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組合的情形。例如，當提及「包含」某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

本文所用的術語「CLAUDIN」或「CLDN」是決定細胞間緊密連接結構的最重要的骨架蛋白，其參與黏附連接，並且在腫瘤細胞的轉移和侵襲中具有重要作用。Claudin蛋白廣泛存在於哺乳動物上皮和內皮細胞中，其分佈主要是上皮細胞側面以及基底細胞質膜上。不同的Claudin蛋白在不同組織中具有各自特異性表現，其中Claudin18(CLDN18)基因定位於3q22.3，分子量24kDa，包含261個胺基酸殘基，屬於Claudins超家族成員，其蛋白結構包含2個細胞外環和4個穿膜區。人類CLDN18或Claudin18蛋白的兩個亞型分別是Claudin18.1或CLDN18.1(UniProt ID：P56856-1)，和Claudin18.2或CLDN18.2(UniProt ID：P56856-2)，在二者蛋白的一級結構序列中，僅N端信號肽至細胞外環1(Loop1)結構的某些位置的胺基酸殘基上有所區別，尤其是在細胞外環1上，CLDN18.1和CLDN18.2僅8個胺基酸不同。 CLDN18的兩種亞型蛋白的種屬間序列同源性也非常高。其中CLDN18.2的細胞外環1在人類、小鼠、獼猴等不同物種上序列完全一致，而人類與小鼠的CLDN18.2蛋白同源性達到84%，表明CLDN18.2蛋白序列之極端保守性(O.Tureci.等人，Gene 481：83-92,2011)。CLDN18.2或其任何變體和同種型可以從天然表現它們的細胞或組織中分離，或者使用所屬技術領域已知的技術和/或本文所述的那些技術重組產生。在一個實施方案中，本文所述的CLDN18.2是人類CLDN18.2。

本文所用的術語「抗CLDN18.2抗體」、「抗CLDN18.2」、「CLDN18.2抗體」或「結合CLDN18.2的抗體」是指能夠以足夠的親和力結合(人類)CLDN18.2以致該抗體可以用作靶向(人類)CLDN18.2的治療劑的抗體。在一個實施方案中，該(人類)CLDN18.2抗體在體外或體內以高親和力結合(人類)CLDN18.2。在一個實施方案中，該(人類)CLDN18.2抗體不結合CLDN18.1。在一個實施方案中，該(人類)CLDN18.2抗體與表現CLDN18.2的細胞結合而不結合表現CLDN18.1的細胞。在一些實施方案中，該結合係藉由例如，放射性免疫測定(RIA)、生物膜干涉測定法(BLI)、MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)或流式細胞術所測量的。

術語「抗體片段」包括完整抗體的一部分。在較佳的實施方案中，抗體片段為抗原結合片段。

「抗原結合片段」指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；dAb(domain antibody)；線性抗體；單鏈抗體(例如，scFv)；如VHH之單結構域抗體；雙價抗體或其片段；或駱駝科抗體。

術語「抗原」是指引發免疫反應的分子。這種免疫反應可能涉及抗體產生或特異性免疫細胞的活化，或兩者兼有。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。如本文所用，術語「表位」指抗原(例如，CLDN18.2)中與抗體分子特異性相互作用的部分。

與參考抗體「結合相同或重疊表位的抗體」是指在競爭測定中阻斷該參考抗體與其抗原50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合之抗體，反言之，參考抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。

與參考抗體競爭結合其抗原的抗體是指在競爭測定中阻斷該參考抗體與其抗原50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合之抗體。反言之，參考抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗體是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定。

抑制(例如競爭性抑制)參考抗體與其抗原的結合的抗體是指這樣的抗體，其抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該參考抗體與其抗原的結合。反言之，參考抗體抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。抗體與其抗原的結合可以親和力(例如，平衡解離常數)衡量。測定親和力的方法是所屬技術領域中已知的。

與參考抗體顯示相同或相似的結合親和力和/或特異性的抗體是指這樣的抗體，其能夠具有參考抗體的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合親和力和/或特異性。這可以藉由所屬技術領域中已知的任何測定結合親和力和/或特異性的方法進行測定。

「互補決定區」或「CDR區」或「CDR」是抗體可變結構域中在序列上高度變化並且形成在結構上確定的環(「超變環」)和/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸點」)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的 CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多周知的抗體CDR編號系統的任一種或其組合確定，該編號系統包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在全球資訊網imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播演算法(affinity propagation clustering)的North CDR定義。

例如，根據不同的CDR確定方案，每一個CDR的殘基如下所述。

CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一者)具有相同的Kabat編號位置而確定。

除非另有說明，否則在本發明中，術語「CDR」或「CDR序列」涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。

除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。

在一個實施方案中，本發明抗體的重鏈可變區CDR按照如下規則確定。

VH CDR1按照AbM規則確定；並且VH CDR2和VH CDR3均按照Kabat規則確定。

在一個實施方案中，本發明抗體的輕鏈可變區CDR按照Kabat規則確定。

在一個實施方案中，本發明抗體的重鏈可變區CDR按照如下規則確定：VH CDR1按照AbM規則確定；並且VH CDR2和VH CDR3均按照Kabat規則確定；且輕鏈可變區CDR按照Kabat規則確定。

應該注意的是，基於不同的編號系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同編號系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用不同的方案(例如，不同的編號系統規則或組合)而導致其所指代的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同之抗體。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR(在同一編號系統下)。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的「最小結合單位」。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如所屬技術領域中具有通常知識者所明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的CH2和CH3的恆定區域，該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。Fc區域能夠和免疫細胞表面的不同的Fc受體結合，從而能夠引起CDC\ADCC\ADCP效應功能。此類效應器功能一般要求Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)聯合，而且可以使用例如本文所公開之多種測定法來評估。

「IgG形式的抗體」是指抗體的重鏈恆定區所屬的IgG形式。所有同一型的抗體的重鏈恆定區都是相同的，不同型的抗體之間的重鏈恆定區不同。例如，IgG4形式的抗體是指其重鏈恆定區來自IgG4，或者IgG1形式的抗體是指其重鏈恆定區來自IgG1。

「人源化」抗體是指包含來自非人類CDR的胺基酸殘基和來自人類FR的胺基酸殘基的抗體。在一些實施方案中，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)對應於非人類抗體的那些，並且所有或基本上所有的FR對應於人類抗體的那些。人源化抗體視需要可以包含至少一部分的來源於人類抗體的抗體恆定區。抗體(例如非人類抗體)的「人源化形式」是指已經進行了人源化的抗體。

「人類抗體」或「全人抗體」或「全人源抗體」可以互換使用，其指具有這樣的胺基酸序列的抗體，該胺基酸序列對應於下述抗體的胺基酸序列，該抗體由人類或人類細胞生成或來源於非人類來源，其利用人類抗體庫或其它人類抗體編碼序列。人類抗體的這種定義明確排除包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。

如本文所用，術語「結合」或「特異性結合」意指結合作用對抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。抗原結合位點與特定抗原結合的能力可以藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或所屬技術領域中已知的一般結合測定法如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物膜干涉測定法或MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)測定。

「免疫綴合物」是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。

本文所述的術語「治療劑」涵蓋在預防或治療例如癌症之腫瘤中有效的任何物質，包括化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如，免疫抑制劑)。

在本發明中所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。

「化療劑」包括在治療免疫系統疾病中有用的化學化合物。

術語「小分子藥物」是指低分子量的能夠調節生物過程之有機化合物。「小分子」被定義為分子量小於10kD、通常小於2kD和較佳小於1kD的分子。小分子包括但不限於無機分子、有機分子、含無機組分的有機分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模擬物和抗體模擬物。作為治療劑，小分子可以比大分子更能透過細胞、對降解更不易感和更不易於引發免疫反應。

本文使用的術語「免疫調節劑」指抑制或調節免疫反應的天然或合成活性劑或者藥物。免疫反應可以是體液反應或細胞反應。免疫調節劑包含免疫抑制劑。

本文使用的「免疫抑制劑」、「免疫抑制藥物」或「免疫抑制物」是在免疫抑制治療中用於抑制或阻止免疫系統活性的治療劑。

術語「有效量」指本發明的抗體或片段或綴合物或組成物或組合的這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在需要治療或預防的患者中產生預期效果。

「治療有效量」指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。治療有效量也是抗體或抗體片段或其綴合物或組成物或組合的任何有毒或有害作用不及治療有益作用的量。相對於未治療的物件，「治療有效量」較佳地抑制可度量參數(例如，腫瘤體積)至少約20%、更佳地至少約40%、甚至更佳地至少約50%、60%或70%。

「預防有效量」指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在物件中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」和「宿主細胞培養物」可交換地使用且是指其中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括「轉化體」和「轉化的細胞」，其包括初級轉化的細胞和來自其的後代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。

本文所使用的術語「標記」是指被直接或間接綴合或融合至試劑(諸如多核苷酸探針或抗體)並且促進其所綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組成物。標記本身可以是可檢測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)或在酶促標記的情況下可以催化可檢測的基質化合物或組成物的化學改變。術語旨在涵蓋藉由將可檢測物質偶聯(即，物理連接)至探針或抗體來直接標記探針或抗體以及藉由與直接標記的另一種試劑反應來間接標記探針或抗體。

「個體」或「受試者」包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於，家養動物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長類動物(例如，人類和非人類靈長類動物如猴)，兔，以及齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或受試者是人類。

「分離的」抗體是已經與其天然環境的組分分離之抗體。在一些實施方案中，將抗體純化至超過95%或99%純度，如藉由例如，電泳(例如，SDS-PAGE，等電位聚焦(IEF)，毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)確定的。

「分離的編碼抗CLDN18.2抗體或其片段的核酸」是指一個或多個核酸分子，其編碼抗體重鏈或輕鏈(或其片段，例如重鏈可變區或輕鏈可變區)，包括在單一載體或分開的載體中的核酸分子，以及存在於宿主細胞中的一個或多個位置處的核酸分子。

如下進行序列之間序列同一性的計算。

為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分數，將該序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為了最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。在一個較佳實施方案中，為比較目的，所比對的參考序列的長度是至少30%、較佳地至少40%、更佳地至少50%、60%和甚至更佳地至少70%、80%、90%、100%的參考序列長度。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則該分子在這個位置處是相同的。

可以利用數學演算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。在一個較佳實施方案中，使用已經集成至GCG套裝軟體的GAP程式中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)演算法(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。在又一個較佳的實施方案中，使用GCG套裝軟體中的GAP程式(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別較佳的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum 62評分矩陣。還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12，空位罰分4)，利用已經併入ALIGN程式(2.0版)的E.Meyers和W.Miller演算法，((1989)CABIOS,4：11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。額外地或備選地，可以進一步使用本文所述的核酸序列和蛋白質序列作為「查詢序列」以針對公共資料庫執行檢索，以例如鑑定其他家族成員序列或相關序列。

如本文所用，術語「在嚴格條件下(例如在低嚴格性、中等嚴格性、高嚴格性或極高嚴格性條件下)融合」描述融合和洗滌條件。進行融合反應的指導可以在藉由引用方式併入的Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。參考文獻中描述了含水方法和非含水方法並且可以使用任一方法。本文中提及的較佳的融合條件如下：1)低嚴格性融合條件是在約45℃於6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，隨後至少在50℃(對於低嚴格性條件，可以增加洗滌的溫度至55℃)於0.2X SSC，0.1% SDS中洗滌兩次；2) 中等嚴格性融合條件是在約45℃於6 X SSC中、隨後在60℃在0.2 X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴格性融合條件是在約45℃在6 X SSC中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；並且較佳地4)極高嚴格性融合條件是在65℃於0.5M磷酸鈉、7%SDS中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次。極高嚴格性條件(4)是較佳的條件和除非另外說明，否則應當使用的一個條件。

術語「抗腫瘤作用」指可以藉由多種手段展示的生物學效果，包括但不限於例如，腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活減少。

術語「腫瘤」和「癌症」在本文中互換地使用，涵蓋實體瘤和液體腫瘤。

術語「癌症」和「癌性」指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。在某些實施方案中，適合於藉由本發明的抗體來治療的癌症包括胃癌或胰腺癌，包括那些癌症的轉移性形式。

術語「腫瘤」指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語「癌症」、「癌性」和「腫瘤」在本文中提到時並不互相排斥。

術語「藥用輔料」指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、賦形劑、載體或穩定劑等。

術語「醫藥組成物」指這樣的組成物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用該組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。

術語「藥物組合」是指非固定組合的產品或固定組合的產品，包括但不限於藥盒、醫藥組成物。術語「非固定組合」意指活性成分(例如，(i)抗 CLDN18.2抗體或其片段、以及(ii)其他治療劑)以分開的實體被同時、無特定時間限制或以相同或不同的時間間隔、依次地施用於患者，其中這類施用在患者體內提供預防或治療有效水平的兩種或更多種活性劑。在一些實施方案中，藥物組合中使用的抗CLDN18.2抗體或其片段和其他治療劑以不超過它們單獨使用時的水平施用。術語「固定組合」意指兩種或更多種活性劑以單個實體的形式被同時施用於患者。較佳為對兩種或更多種活性劑的劑量和/或時間間隔進行選擇，從而使各部分的聯合使用能夠在治療疾病或病症時產生大於單獨使用任何一種成分所能達到的效果。各成分可以各自呈單獨的製劑形式，其製劑形式可以相同也可以不同。

術語「組合療法」是指施用兩種或更多種治療劑或治療方式(例如放射療法或手術)以治療本文所述疾病。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑，例如，以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者，這種施用包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如，片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。此外，這種施用還包括以大致相同的時間或在不同的時間以順序的方式使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。

用於本文時，「治療」指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重性。

用於本文時，「預防」包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有癌症家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，在癌症的背景中，術語「預防」是指在癌症的病徵或症狀發生前，特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。

術語「載體」當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。一些載體能夠指導與其可操作相連的核酸的表現。這樣的載體在本文中被稱為「表現載體」。

「受試者/患者/個體樣品」指從患者或受試者得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素、等等。

II.抗體

在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段以高親和力結合CLDN18.2(例如，人類CLDN18.2)。在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體特異性結合CLDN18.2(例如，人類CLDN18.2)，而不結合CLDN18.1(例如，人類CLDN18.1)。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與人類CLDN18.2的結合親和力高於已知的CLDN18.2抗體，例如，Zolbetuximab(簡稱Zmab)抗體。在一些實施方案中，藉由生物膜干涉測定技術或表面電漿共振法測定抗體的親和力。

在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體，以下平衡解離常數(K_D)與人類CLDN18.2結合，該K_D小於大約15nM，較佳地，小於或等於大約10nM、9.5nM、9nM、8.5nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM，在一些實施方案中，該K_D在上述數值之間(包括端點)。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與細胞表面的CLDN18.2結合。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段不與細胞表面的CLDN18.1結合。在一些實施方案中，CLDN18.2在細胞表面表現或過表現。在一些實施方案中，細胞為表現CLDN18.2的CHO細胞或293細胞，例如，CHO-S細胞或HEK293細胞。在一些實施方案中，細胞為表現CLDN18.2的癌細胞，例如，天然表現CLDN18.2或經人工轉染表現CLDN18.2或經人工轉染具有增加的表現水平的CLDN18.2的細胞，例如，表現CLDN18.2的胃癌細胞或胰腺癌細胞系，例如，細胞系NUGC-4、KATO III和DAN-G細胞系，例如，過表現CLDN18.2的KATO III和DAN-G細胞系。

在一些實施方案中，利用流式細胞術檢測所述結合。在一些實施方案中，本發明的抗體以小於或等於大約15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5.5nM的EC50結合CHO細胞上過表現的CLDN18.2。在一些實施方案中，本發明的抗體以小於或等於大約4nM、3.7nM、3.5nM、3nM、2.5nM、2nM、1.5nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM的EC50結合表現CLDN18.2的癌細胞，例如，表現CLDN18.2的胃癌細胞系或胰腺癌細胞系，例如，細胞系NUGC-4、KATO III和DAN-G細胞系，例如，過表現CLDN18.2的KATO III和DAN-G細胞系。在一些實施方案中，本發明的抗體與表現CLDN18.2的細胞的結合的EC50與如Zmab之已知抗體相當，或小於已知抗體Zmab的EC50，或小於已知抗體Zmab的EC50的75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段具有ADCC活性或CDC活性，例如與已知抗體(例如Zmab)相當的ADCC活性或CDC活性，或者更高的ADCC活性或CDC活性。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段能夠抑制腫瘤細胞，例如表現CLDN18.2的腫瘤細胞。

在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段能夠用於治療癌症。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段，能夠有效抑制腫瘤生長，腫瘤抑制率大於或等於約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%。

在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)。

在一些方面中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VH)。在一些方面中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區(VH)。在一些實施方案中，該重鏈可變區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中，該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段還包含抗體重鏈恆定區HC。在一些實施方案中，本發明抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段還包含抗體輕鏈恆定區LC。在一些實施方案中，本發明抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段還包含重鏈恆定區HC和輕鏈恆定區LC。

在一些實施方案中，本發明的重鏈可變區

(i)包含與選自SEQ ID NO：4、15、21、26、27、36、37、45、48、53、56、61、66、72、73、80或85的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(ii)包含選自SEQ ID NO：4、15、21、26、27、36、37、45、48、53、56、61、66、72、73、80或85的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iii)包含與選自SEQ ID NO：4、15、21、26、27、36、37、45、48、53、56、61、66、72、73、80或85的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。

在一些實施方案中，本發明的輕鏈可變區

(i)包含與選自SEQ ID NO：9、19、22、31、32、40、41、47、49、55、57、65、68、75、76、83或86的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(ii)包含選自SEQ ID NO：9、19、22、31、32、40、41、47、49、55、57、65、68、75、76、83或86的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iii)包含與選自SEQ ID NO：9、19、22、31、32、40、41、47、49、55、57、65、68、75、76、83或86的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。

在一些實施方案中，本發明的3個來自重鏈可變區的互補決定區(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3選自

(i)如SEQ ID NO：4所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(ii)如SEQ ID NO：15或21所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(iii)如SEQ ID NO：26或27所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(iv)如SEQ ID NO：36或37所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(v)如SEQ ID NO：45或48所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(vi)如SEQ ID NO：53或56所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(vii)如SEQ ID NO：61或66所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(viii)如SEQ ID NO：72或73所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(ix)如SEQ ID NO：80或85所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，或

(x)相對於(i)至(ix)中任一項的序列，在該三個HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在一些實施方案中，本發明的3個來自輕鏈可變區的互補決定區(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3選自

(i)如SEQ ID NO：9所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(ii)如SEQ ID NO：19或22所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(iii)如SEQ ID NO：31或32所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(iv)如SEQ ID NO：40或41所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(v)如SEQ ID NO：47或49所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(vi)如SEQ ID NO：55或57所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(vii)如SEQ ID NO：65或68所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(viii)如SEQ ID NO：75或76所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，

(ix)如SEQ ID NO：83或86所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或

(x)相對於(i)至(ix)中任一項的序列，在該三個LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在一些實施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO：1、12、23、33、42、50、58、69或77的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者HCDR1包含與SEQ ID NO：1、12、23、33、42、50、58、69或77的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO：2、13、20、24、34、43、51、59、70、78、84、93或94的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者 HCDR2包含與SEQ ID NO：2、13、20、24、34、43、51、59、70、78、84、93或94的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列，其中

SEQ ID NO：93為YIAPFXGDSRYNQKFKG，其中X為任何胺基酸，較佳的N或Q或其保守胺基酸取代；或者

SEQ ID NO：94為VIWGDXSTNYHSVLIS，其中X為任何胺基酸，較佳的G或V或其保守胺基酸取代。

在一些實施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO：3、14、25、35、44、52、60、71或79的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者HCDR3包含與SEQ ID NO：3、14、25、35、44、52、60、71或79的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO：6、16、28、38、62、67或96的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR1包含與SEQ ID NO：6、16、28、38、62、67或11的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；

其中SEQ ID NO：11為KSSQSLLXGGNQKNYLT，其中X為任何胺基酸，較佳的N或Q或其保守胺基酸取代。

在一些實施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO：7、17、29、63或81的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR2包含與SEQ ID NO：7、17、29、63或81的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO：8、18、30、39、46、54、64、74或82的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者LCDR3包含與SEQ ID NO：8、18、30、39、46、54、64、74或82的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在一些實施方案中，本發明的抗體重鏈恆定區HC為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區，較佳為IgG1的重鏈恆定區。在一些實施方案中，本發明的抗體輕鏈恆定區LC為lambda或Kappa輕鏈恆定區，較佳為Kappa輕鏈恆定區。

在一些較佳的實施方案中，本發明的抗體重鏈恆定區HC

(i)包含與選自SEQ ID NO：5的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)包含選自SEQ ID NO：5的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iii)包含與選自SEQ ID NO：5的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

在一些實施方案中，該胺基酸改變發生在Fc區。在一個實施方案中，該Fc區的胺基酸改變增加抗體的CDC或ADCC活性。

在一些實施方案中，本發明的抗體輕鏈恆定區LC

(i)包含與選自SEQ ID NO：10的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；

(ii)包含選自SEQ ID NO：10的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者

(iii)包含與選自SEQ ID NO：10的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。

在本發明的一些具體實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含：

如SEQ ID NO：4所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：9所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

如SEQ ID NO：15或21所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：19或22所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

如SEQ ID NO：26或27所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：31或32所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

如SEQ ID NO：36或37所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：40或41所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

如SEQ ID NO：45或48所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：47或49所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

如SEQ ID NO：53或56所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：55或57所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

如SEQ ID NO：61或66所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：65或68所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

如SEQ ID NO：72或73所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：75或76所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3；

如SEQ ID NO：80或85所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：83或86所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。

分別如SEQ ID NO：1、2和3之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：6、7和8之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：12、13和14之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：16、17和18之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：12、20和14之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：16、17和18之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：12、93和14之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：16、17和18之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：23、24和25之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：28、29和30之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：33、34和35之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：38、17和39之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：42、43和44之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：38、17和46之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：50、51和52之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：28、17和54之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：58、59和60之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：62、63和64之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：58、59和60之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：67、63和64之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：58、59和60之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：11、63和64之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：69、70和71之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：38、17和74之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：77、78和79之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：28、81和82之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：77、84和79之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：28、81和82之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

分別如SEQ ID NO：77、94和79之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：28、81和82之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：15或21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：19或22所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：26或27所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：31或32所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：36或37所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：40或41所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：45或48所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：47或49所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：53或56所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：55或57所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：61或66所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：65或68所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：72或73所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：75或76所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：80或85所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：83或86所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL；

包含SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VH，和包含SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的VL。

在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。較佳地，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。

在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。在一些實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在抗體重鏈恆定區的Fc區上，在較佳的實施方案中，該Fc區上的胺基酸改變增加抗體的ADCC和/或CDC作用。

在一些實施方案中，置換為保守性置換。保守置換是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸置換，例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸置換，一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸置換，或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸置換。示例性的置換如下表所示：

在某些實施方案中，置換發生在抗體的CDR區。通常，獲得的變體相對於親本抗體在某些生物學特性方面(例如，增加的親和力)具有修飾(例如，改善)和/或將具有親本抗體的基本上保留的某些生物學特性。示例性置換變體是親和力成熟抗體。

在某些實施方案中，本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體經糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。當抗體包含Fc區時，可以改變附著於其的糖類。在一些應用中，除去不想要的糖基化位點的修飾可以是有用的，例如，除去岩藻糖基序以提高抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield等(2002)JBC277：26733)。在其它應用中，可以進行半乳糖苷化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。

在某些實施方案中，可在本文中所提供抗體的Fc區中引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體，以改變抗體的一種或多種功能特性，例如血清半衰期、補體結合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合和/或抗體依賴性細胞毒性。Fc區變體可包括在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸改變(例如置換)的人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。

在本發明的一個實施方案中，本文所述之抗體在Fc區引入改變，以提高抗體的ADCC活性或CDC活性。

在某些實施方案中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。

在某些實施方案中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有所屬技術領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。

在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性：

(i)顯示與本發明抗體對CLDN18.2相同或相似的結合親和力和/或特異性；

(ii)抑制(例如，競爭性抑制)本發明抗體與CLDN18.2的結合；

(iii)與本發明抗體結合相同或重疊的表位；

(iv)與本發明抗體競爭結合CLDN18.2；

(v)具有本發明抗體的一個或多個生物學特性。

在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG3形式的抗體或IgG4形式的抗體，較佳為IgG1形式的抗體。

在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體是單株抗體。

在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體是人源化的。

在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體是人類抗體。

在一些實施方案中，抗CLDN18.2抗體是嵌合抗體。

在一些實施方案中，至少部分的抗CLDN18.2抗體的框架序列是人類共有框架序列。

在一個實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體還涵蓋其抗體片段(例如抗原結合片段)，較佳地選自以下的抗體片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、(Fab’)₂、單結構域抗體例如VHH、dAb(domain antibody)或線性抗體。

III.本發明的核酸以及包含其的宿主細胞

在一方面，本發明提供編碼以上任何抗CLDN18.2抗體或其片段的核酸。在一個實施方案中，提供包含該核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表現載體，例如pcDNA3.1。在一個實施方案中，提供包含該核酸或該載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如，CHO細胞(例如，CHO-S)或293細胞(例如，293F或HEK293細胞))或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是原核的。

在一方面，本發明提供編碼本文所述任何抗CLDN18.2抗體或其片段的核酸。該核酸可以包含編碼抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區的胺基酸序列的核酸，或包含編碼抗體的輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列的核酸。

例如，本發明的核酸包含編碼選自SEQ ID NO：4、15、21、26、27、36、37、45、48、53、56、61、66、72、73、80或85，或者SEQ ID NO：9、19、22、31、32、40、41、47、49、55、57、65、68、75、76、83或86中任一項所示胺基酸序列的核酸，或編碼與選自SEQ ID NO：4、15、21、26、27、36、37、45、48、53、56、61、66、72、73、80或85，或者SEQ ID NO：9、19、22、31、32、40、41、47、49、55、57、65、68、75、76、83或86中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸。

本發明還涵蓋與下述核酸在嚴格性條件下融合的核酸或與下述核酸具有一個或多個置換(例如保守性置換)、缺失或插入的核酸：包含編碼選自SEQ ID NO：4、15、21、26、27、36、37、45、48、53、56、61、66、72、73、80或85，或者SEQ ID NO：9、19、22、31、32、40、41、47、49、55、57、65、68、75、76、83或86中任一項所示胺基酸序列的核酸序列的核酸；或包含編碼與選自SEQ ID NO：4、15、21、26、27、36、37、45、48、53、56、61、66、72、73、80或85，或者SEQ ID NO：9、19、22、31、32、40、41、47、49、55、57、65、68、75、76、83或86中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸序列的核酸。

在一個實施方案中，提供包含該核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中，載體是表現載體，例如，真核表現載體。載體包括但不限於病毒、質粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在一個實施方案中，載體是pcDNA3.1。

在一個實施方案中，提供包含該載體的宿主細胞。用於轉殖或表現編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別當不需要糖基化和Fc效應子功能時。在表現後，抗體可以從可溶組分中的細菌細胞糊狀物分離，並且可以進一步純化。

在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。例如，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物是關於編碼抗體的載體的合適轉殖或表現宿主。例如，糖基化途徑已經進行「人源化」的真菌和酵母菌株導致產生具有部分或完全人類糖基化模式的抗體。適於表現糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如，可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人類胚腎系(HEK293、293F或293T細胞)等。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞、CHO-S細胞、ExpiCHO等；以及如Y0，NS0和Sp2/0之骨髓瘤細胞系。所屬技術領域已知適合產生抗體的哺乳動物宿主細胞系。

IV.本發明的抗體分子的生產和純化

在一個實施方案中，本發明提供製備本發明抗體分子或其片段(較佳的抗原結合片段)的方法，其中該方法包括在適於表現編碼本發明抗體分子或其片段(較佳的抗原結合片段)的核酸的條件下培養該宿主細胞，以及視需要地分離該抗體或其片段(例如，抗原結合片段)。在某個實施方案中，該方法還包括從宿主細胞回收本發明抗體分子或其片段(例如，抗原結合片段)。

在一個實施方案中，提供了製備本發明抗體分子的方法，其中該方法包括，在適合抗體表現的條件下，培養包含編碼該抗體(例如，任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸或包含該核酸的表現載體的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。

為了重組產生本發明抗體分子，分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體，例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸，並將其插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步轉殖和/或表現。此類核酸易於使用一般規程分離和測序(例如，藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針進行)。

如本文所述製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對所屬技術領域中具有通常知識者是顯而易見的。可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，所述熟知分析方法包括尺寸排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。

V.測定法

可以藉由所屬技術領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗CLDN18.2抗體鑑定、篩選或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性，例如，藉由諸如ELISA，Western印跡等已知的方法來進行。可使用所屬技術領域已知方法來測定對CLDN18.2的結合，本文中公開例示性方法。在一些實施方案中，使用放射性免疫測定(RIA)或生物膜干涉測定法或MSD測定法或表面電漿體共振法(SPR)或流式細胞術測量的。

另一方面，可使用競爭測定法來鑑定與本文中公開的任何抗CLDN18.2抗體競爭對CLDN18.2的結合的抗體。在某些實施方案中，此類競爭性抗體結合與本文中公開的任何抗CLDN18.2抗體所結合表位相同或重疊的表位元(例如，線性或構象表位元)。

本發明還提供了用於鑑定具有生物學活性的抗CLDN18.2抗體的測定法。生物學活性可以包括例如，結合CLDN18.2(例如，結合人類CLDN18.2)，對表現CLDN18.2的細胞的結合，對細胞的CDC或ADCC的活性、對腫瘤細胞的抑制作用等。還提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。

在某些實施方案中，對本發明的抗體測試此類生物學活性。

供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表現CLDN18.2或經改造而表現或過表現CLDN18.2細胞系。此類細胞還包括表現CLDN18.2和並非正常情況下表現CLDN18.2的編碼CLDN18.2 DNA轉染的細胞系。在一些實施方案中，這類細胞是胃癌細胞或胰腺癌細胞。在一些實施方案中，這些細胞是表現CLDN18.2的CHO細胞。在一些實施方案中，這些細胞是細胞系NUGC-4、KATO III和DAN-G細胞系，例如過表現CLDN18.2的KATO III和DAN-G細胞系。

可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物替換或補充抗CLDN18.2抗體來進行任何上述測定法。

可以理解的是，能夠使用抗CLDN18.2抗體和別的活性劑的組合來進行任何上述測定法。

VI.免疫綴合物

在一些實施方案中，本發明提供免疫綴合物，其包含本文中提供的任何抗CLDN18.2抗體和其它物質，例如，治療劑，包括化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如，抗炎劑或免疫抑制劑)。在一個實施方案中，該其它物質例如細胞毒性劑，其包括任何對細胞有害的藥劑。

在一些實施方案中，該免疫綴合物用於預防或治療癌症。

VII.醫藥組成物和醫藥製劑

在一些實施方案中，本發明提供包含本文所述的任何抗CLDN18.2抗體或其片段(較佳地其抗原結合片段)或其免疫綴合物的組成物，較佳地組成物為醫藥組成物。在一個實施方案中，該組成物還包含藥用輔料。在一個實施方案中，組成物，例如，醫藥組成物，包含本發明的抗CLDN18.2抗體或其片段或其免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑的組合。

本發明還包括包含抗CLDN18.2抗體或其免疫綴合物的組成物(包括醫藥組成物或醫藥製劑)，或包含編碼抗CLDN18.2抗體的多核苷酸的組成物(包括醫藥組成物或醫藥製劑)。在某些實施方案中，組成物包含一種或多種結合CLDN18.2的抗體或其片段，或一種或多種編碼一種或多種抗CLDN18.2的抗體或其片段的多核苷酸。這些組成物還可以包含合適的藥用輔料，如所屬技術領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。

如本文所用，「藥用載體」包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。

對於藥用輔料的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第八版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。

本發明的組成物可以處於多種形式。這些形式例如，包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、散劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。

可以藉由將具有所需純度的本發明的抗體與一種或多種視需要的藥用輔料混合來製備包含本文所述的抗體的醫藥製劑，較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。

本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含超過一種活性成分，該活性成分是被治療的特定適應症所需的，較佳具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它治療劑，例如，化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑等。該活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質，該基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

VIII.藥物組合和藥盒

在一些實施方案中，本發明還提供藥物組合或藥物組合產品，其包含本發明的抗CLDN18.2抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)，或其免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑(例如，化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑等)。

本發明的另一個目的是提供一種成套藥盒，其包含本發明的藥物組合，較佳地，該藥盒為藥物劑量單元形式。由此，可以依據給藥方案或藥物施用間隔提供劑量單元。

在一個實施方案中，本發明的成套藥盒在同一包裝內包含：

- 含有包含抗CLDN18.2抗體或其片段的醫藥組成物的第一容器；

- 含有包含其它治療劑的醫藥組成物的第二容器。

IX.用途和方法

本發明一方面提供在受試者中預防或治療腫瘤(例如，癌症)的方法，包括向受試者施用有效量的本發明的抗CLDN18.2的抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)、免疫綴合物、醫藥組成物、藥物組合或藥盒。

在一些實施方案中，該腫瘤(例如癌症)患者中具有(例如，升高水平的，例如，核酸或蛋白質水平的)CLDN18.2。

在一些實施方案中，該腫瘤，例如癌症，包括實體腫瘤和血液腫瘤以及轉移性病灶。在一個實施方案中，實體瘤的例子包括惡性腫瘤。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。

在一些實施方案中，該腫瘤治療將受益於抑制核酸或蛋白質水平的CLDN18.2。在一些實施方案中，該腫瘤治療受益於本發明抗體所引發的ADCC或CDC作用。

在一個具體的實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體能夠抑制腫瘤細胞增殖，例如表現CLDN18.2的腫瘤細胞，例如胃癌細胞或胰腺癌細胞。

在一個具體的實施方案中，本發明的抗CLDN18.2抗體具有強的ADCC或CDC活性。

在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。

在一些實施方案中，該腫瘤是癌症，例如胃癌或胰腺癌。

受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳地，高級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的個體)。在一個實施方案中，受試者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。在一些實施方案中，受試者之前已經接受過或正在接受免疫療法。

在其他方面，本發明提供抗體分子或其片段或其免疫綴合物或醫藥組成物或藥物組合或藥盒在生產或製備藥物中的用途，該藥物用於本文所述的用途，例如，用於預防或治療本文提及的相關疾病或病症。

在一些實施方案中，本發明的抗體分子或其片段或其免疫綴合物或醫藥組成物或藥物組合或藥盒會延遲病症和/或與病症相關的症狀的發作。

在一些實施方案中，本發明的抗體分子或其片段或其免疫綴合物或醫藥組成物還能與一種或多種其它療法，例如，治療方式和/或其它治療劑組合施用，用於本文所述的用途，例如，用於預防和/或治療本文提及的相關疾病或病症。

在一些實施方案中，治療方式包括外科手術；放射療法、局部照射或聚焦照射等。

在一些實施方案中，治療劑選自化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、疫苗、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑。

示例性的免疫調節劑包括免疫抑制劑或抗炎劑。

在一些實施方案中，本文中描述的抗體組合可以分別施用，例如，作為單獨的抗體分別施用。

此類組合療法涵蓋組合施用(例如兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用別的治療劑和/或藥劑之前，同時，和/或之後發生本發明的抗體的施用。

醫藥組成物的施用途徑是根據已知方法，例如，經口、藉由靜脈內注射、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門脈內或病灶內途徑；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。在某些實施方案中，組成物可藉由彈丸注射或藉由連續輸注或藉由植入裝置施用。

組成物還可經由植入膜、海綿或其上吸收或膠囊包封所需分子的另一種適當的材料被局部施用。在某些實施方案中，當使用植入裝置時，該裝置可被植入到任何合適的組織或器官中，並且可經由擴散、定時釋放的大丸劑、或連續施用遞送所需分子。

X.用於診斷和檢測的方法和組成物

在某些實施方案中，本文中提供的任何抗CLDN18.2抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)可以用於檢測CLDN18.2在生物樣品中的存在。術語「檢測」用於本文中時，包括定量或定性檢測，示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如，FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如，RT-PCR)。在某些實施方案中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中，生物樣品來自過度增生性或癌性病灶相關病灶。

在一個實施方案中，提供用於診斷或檢測方法的抗CLDN18.2抗體或其片段。在另一個方面中，提供檢測CLDN18.2在生物樣品中的存在的方法。在某些實施方案中，方法包含檢測CLDN18.2蛋白在生物樣品中的存在。在某些實施方案中，CLDN18.2是人類CLDN18.2。在某些實施方案中，該方法包括將生物樣品與如本文所述的抗CLDN18.2抗體或其片段在允許抗CLDN18.2抗體或其片段與CLDN18.2結合的條件下接觸，並檢測在抗CLDN18.2抗體或其片段和CLDN18.2之間是否形成複合物。複合物的形成表示存在CLDN18.2。該方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，抗CLDN18.2抗體或其片段被用於選擇適合利用抗CLDN18.2抗體或其片段的治療的受試者，例如，其中CLDN18.2是用於選擇該受試者的生物標記物。

在一個實施方案中，可以使用本發明抗體診斷如癌症之腫瘤，例如，評價(例如，監測)個體中本文所述疾病的治療或進展、其診斷和/或分期。在某些實施方案中，提供標記的抗CLDN18.2抗體或其片段。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酶或配體，例如，藉由酶促反應或分子相互作用。

在本文中提供的一些實施方案中，樣品是在用抗CLDN18.2抗體或其片段治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法治療過程中，或者用其他療法治療後獲得的。

在一些實施方案中，樣品是福馬林固定、石蠟包膜(FFPE)的。在一些實施方案中，樣品是活檢(例如，芯活檢)，手術標本(例如，來自手術切除的標本)，或細針吸出物。

在一些實施方案中，在治療之前，例如，在開始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測CLDN18.2。

在一些實施方案中，提供一種治療本發明所述疾病的方法，該方法包括：對受試者(例如，樣品)(例如，受試者樣品)檢驗CLDN18.2的存在，因而確定CLDN18.2值，將CLDN18.2值與對照值比較，並且如果CLDN18.2值大於對照值，則向受試者施用治療有效量的視需要與一種或多種其他療法組合的抗CLDN18.2抗體或其片段(例如，本文所述的抗CLDN18.2抗體或其片段)，因而治療該疾病。

本發明的這些以及其它方面和實施方案在附圖(附圖簡述緊隨其後)和以下的發明詳述中得到描述並且示例於以下實施例中。上文以及整個本案中所論述的任何或所有特徵可以在本發明的各種實施方案中組合。以下實施例進一步說明本發明，然而，應理解實施例以說明而非限定的方式來描述，並且所屬技術領域中具有通常知識者可以進行多種修改。

實施例

表A：本發明的示例性抗體以及陽性對照抗體的序列SEQ ID NO編號(HCDR1使用AbM規則定義，HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3使用Kabat規則定義)

實施例1：穩定表現細胞株的構建

人源CLDN18.2的過表現細胞株的製備

根據製造商的說明書，使用Freedom® CHO-S®試劑盒(Invitrogen,A1369601)構建穩定表現人源Claudin18.2(簡稱CLDN18.2，以下相同)的細胞系。首先將人源CLDN18.2(UniProt ID：P56856-2)的全長基因構建到載體pCHO1.0中，採用化學轉染法和電轉染法將構建完成的質粒分別轉入CHO-S細胞(Invitrogen,A1369601)和HEK293細胞(Invitrogen,A14527)中，轉染後的細胞經過兩輪加壓篩選得到分別表現CLDN18.2的細胞池(pool)。然後利用流式細胞分選儀(MoFlo XDP，Beckman Coulter)將高表現CLDN18.2的細胞分選出來，藉由稀釋法獲得穩定表現CLDN18.2的單株細胞系CHO-hCLDN18.2和HEK293-hCLDN18.2。

人源CLDN18.1的過表現細胞株的製備

根據製造商的說明書，使用Freedom® CHO-S®試劑盒(Invitrogen,A1369601)構建穩定表現人源Claudin18.1(簡稱CLDN18.1，以下相同)的細胞系。首先將人源CLDN18.1(UniProt ID：P56856-1)全長基因構建到載體pCHO1.0(Invitrogen,A1369601)中，採用化學轉染法將構建好的質粒轉入CHO-S細胞(Invitrogen,A1369601)中，轉染後的細胞經過兩輪加壓篩選得到分別表現CLDN18.1的細胞池(pool)。然後利用流式細胞分選儀(MoFlo XDP,Beckman Coulter)將高表現CLDN18.1的細胞分選出來，藉由稀釋法獲得穩定表現CLDN18.1的單株細胞系CHO-hCLDN18.1。

過表現CLDN18.2的腫瘤細胞系的構建

將人源CLDN18.2(UniProt ID：P56856-2)的全長基因構建到載體pWPT-GFP(Addgene,12255)中，替換其中的GFP序列，與慢病毒的包裝載體psPAX2(Addgene,12260)和pMD2.G(Addgene,12259)共同轉染到HEK293T (ATCC,CRL-3216)細胞中，進行病毒的包裝。分別收集培養48小時和72小時後的培養上清，使用PEG8000進行慢病毒的濃縮。用濃縮後的病毒轉染胰腺癌DAN-G細胞和胃癌KATO III細胞，然後利用流式細胞分選儀(MoFlo XDP,Beckman Coulter)將表現CLDN18.2的細胞分選出來，獲得穩定轉染CLDN18.2的腫瘤細胞系DAN-G-CLDN18.2和KATO III-CLDN18.2。

實施例2：融合瘤篩選抗hCLDN18.2的單株抗體

本發明採用融合瘤技術，藉由實施例1獲得的細胞(CHO-huClaudin18.2)免疫小鼠(方法和過程見表1)，然後獲取小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，獲得能夠分泌CLDN18.2抗體的融合瘤細胞。

小鼠免疫

表1：實驗動物及免疫資訊

融合瘤之融合

將小鼠處死，無菌打開腹腔取出脾臟，去掉周圍附著的結締組織。用針頭擠壓使脾細胞充分釋放，製成脾細胞懸液。細胞懸液經70μM細胞篩網過濾後用RPMI-1640培養基洗一遍，1200rpm離心6min。去除上清液，用RBC裂解緩衝液(GIBCO)重新懸浮細胞後將紅細胞裂解，離心去除上清液後，細胞重新懸浮於RPMI-1640培養基中並計數。將SP2/0和裂解紅細胞後的脾細胞以1：2至1：1的比例混合，1000rpm離心6min。去除上清液後將混合的細胞重新懸浮於融合緩衝液中。再加入15ml的融合緩衝液，1000rpm離心5min，去除上清液。重複上述步驟一遍後，加入適量體積的融合緩衝液重新懸浮細胞，調整混合細胞密度至1×10⁷個細胞/mL。藉由電融合儀融合後，細胞於電融合皿中室溫靜置5min。將細胞轉移入離心管中，稀釋細胞至1至2×10⁴個細胞/mL。96孔板中每孔加入100μl細胞懸液。融合後第5天更換培養基。培養第10天(或更久，根據細胞生長狀態)後收集上清液進行流式細胞儀(FACS)檢測，篩選陽性株。

融合瘤細胞高通量篩選

藉由流式細胞儀(FACS)篩選出特異性表現抗CLDN18.2抗體的融合瘤細胞，且分泌的抗體不與CLDN18.1結合。

將實施例1獲得的待檢測細胞(HEK293-hCLDN18.2)計數，並稀釋至1×10⁶個細胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g 5min，離心，去除細胞培養基。將融合瘤96孔板培養上清加入U型板並重新懸浮細胞，每孔加100μl，冰上靜置30min。500g 5min去除上清，PBS洗細胞1遍。每孔加入100μl抗鼠Fab的FITC標記的二抗(1：500稀釋於PBS中)，陽性對照抗體加入100μl抗人類Fab的FITC標記的二抗。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗細胞1遍。用50μl 1×PBS重新懸浮細胞，FACS上機檢測。

將陽性株，再用上述同樣方法進行CHO-hCLDN18.1的複篩，共獲得9株與人類CLDN18.2結合且不與人類CLDN18.1結合的融合瘤細胞。其中8株來源於Bal b/c小鼠，1株來源於H2L2全人源轉基因小鼠，具體見表2。

表2：融合瘤高通量篩選獲得的候選抗體株

實施例3：抗體基因的獲取

利用分子生物學技術，對實施例2中獲得的9株融合瘤細胞(3G3,14A5,25C7,38F8,69H9,46F6,59C1,51H10和HB37A6)進行抗體輕重鏈基因序列的調取。藉由RNA提取試劑盒(Biomiga，R6311-02)萃取9個融合瘤細胞的總RNA，然後用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara，6110A)反轉錄總RNA獲得cDNA，分別用簡併引物擴增抗體的重鏈和輕鏈可變區序列，插入pMD20-T載體(Takara，6028)，連接轉化後挑轉殖測序。

抗體的序列參見表A。

實施例4：重組CLDN18.2抗體的製備

將實施例2篩選得到的9個抗體(3G3,14A5,25C7,38F8,69H9,46F6,59C1,51H10和HB37A6)以及對照抗體zolbetuximab(簡稱Zmab，序列來源於INN117)以全長單株抗體的形式表現在HEK293細胞(Invitrogen,A14527)中。首先構建表現載體，分別將9個配對重鏈可變區和輕鏈可變區放置在人源IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：5)和輕鏈kappa恆定區(SEQ ID NO：10)的N端，構建到帶有N端信號肽的pcDNA3.1表現載體中，獲得輕重鏈表現載體。將所獲得的輕、重鏈表現載體藉由PEI(Polysciences Inc,23966)共轉染對HEK293細胞進行暫態轉染，培養7天後收集培養基上清。上清藉由Protein A柱(Hitrap Mabselect Sure，GE 11-0034-95)進行純化，之後超濾並換液到PBS(Gibco，70011-044)中，採用A280法檢測濃度並用SEC-HPLC法測定純度，獲得純度大於95%的抗體溶液。

實施例5：BLI法測定重組CLDN18.2抗體與抗原的親和力

採用生物膜干涉技術(Biolayer Interferometry，BLI)測定本發明抗體結合人類CLDN18.2的平衡解離常數(K_D)。BLI法親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：第270-8頁)進行。將AHC(18-5060,Fortebio)感測器浸泡於SD緩衝液(1x PBS，BSA 0.1%，Tween-20 0.05%)中。取100μl的SD緩衝液、各個抗體、人類Claudin18.2蛋白(P50251802,GenScript)分別加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner，675076)中。使用Fortebio Octet Red96進行檢測，使用ForteBio Octet分析軟體分析K_D值。抗體的親和力數據如表3所示：9個抗體均具有高親和力，其中除3G3與對照抗體Zmab親和力相當，其他均優於對照抗體Zmab。

表3：CLDN18.2抗體的親和力常數

實施例6：CLDN18.2抗體與CLDN18細胞的結合特異性

藉由流式細胞術(FACS)測定上述9個抗體分別與實施例1獲得的穩定轉染人源CLDN18.2和人源CLDN18.1的CHO-S細胞系(即，如實施例所述製備的CHO-hCLDN18.2和CHO-hCLDN18.1)的結合。實驗方法參照實施例2，使用GraphPad Prism軟體分析實驗資料，得到圖1和圖2。如圖1和圖2所示，該9個抗體均特異地結合人類CLDN18.2，而不與人類CLDN18.1結合。

實施例7：CLDN18.2抗體的基於報導基因的ADCC活性檢測

使用含有螢光素酶報導基因的ADCC效應細胞(Promega，G7102)檢測上述9個抗體的ADCC活性。取對數生長期的靶細胞CHO-hCLDN18.2和ADCC效應細胞，分別進行計數，以1：6的比例，共50uL加入96孔白底板中，每孔共有細胞1.75×10⁵個，然後每孔分別加入上述抗體，37℃，5%CO₂孵育8至10小時，該抗體各自濃度如下：濃度起始點為3nM，然後3倍稀釋，共有9個濃度點，即每種抗體使用的濃度有：3nM、1nM、0.333nM、0.111nM、0.037nM、0.123nM、0.0041nM、0.0014nM、0.00046nM。根據製造商的說明，使用Bio-Glo^TM Luciferase reagent(Promega，G7940)進行螢光的檢測。如圖3結果顯示，9個抗體均具有與對照抗體Zmab相當的ADCC活性。

實施例8：鼠源抗體的人源化改造

選取實施例3中的8個鼠源抗體(3G3,14A5,25C7,38F8,69H9,46F6,59C1，和51H10)進行人源化改造。確定抗體的CDR區域，重鏈CDR1採用Abm命名規則，其餘CDR採用Kabat的命名規則。藉由序列相似性比對，選取與鼠源抗體可變區序列相似度最高的人類胚系(germline)基因序列作為人源化抗體的框架區範本，然後將CDR區域移植到各範本中。利用Discovery Studio軟體構建各抗體的三維結構，並將對CDR區有影響的框架區胺基酸進行回復突變，得到人源化的抗體序列。人源化抗體Hz3G3、Hz14A5、Hz25C7、Hz38F8、Hz69H9、Hz46F6、Hz59C1和Hz51H10的序列參見表A。

根據實施例4所述的方法對這些人源化重組抗體進行製備和純化，獲得大於95%純度的溶於PBS的抗體溶液。

實施例9：SPR法測定CLDN18.2抗體親和力

採用表面電漿共振法(Surface plasmon resonance,SPR)測定8個人源化抗體(Hz3G3、Hz14A5、Hz25C7、Hz38F8、Hz69H9、Hz46F6、Hz59C1和Hz51H10)和1個全人源抗體(HB37A6)結合人類CLDN18.2的平衡解離常數(K_D)。根據製造商的說明，使用胺基偶聯試劑盒(GE Healthcare，BR-1006-33)，將人類Claudin18.2(GenScrip，P50251802)偶聯在CM5晶片(GE Healthcare，29-1496-03)表面，偶聯後注入1M乙醇胺，對剩餘的活化位點進行封閉。根據製造商的說明，藉由Biacore(GE Healthcare，T200)檢測晶片表面抗原與流動相中的抗體之間的結合與解離獲得親和力及動力學常數。將梯度稀釋後的抗體(0至100nM)，由低濃度到高濃度的順序流過晶片表面，結合時間180s，解離時間600s。最後使用10mM Glycine pH 1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)對晶片進行再生。資料結果使用Biacore T200分析軟體，以1：1結合模型進行動力學的分析。如表4所示：除了Hz25C7和Hz3G3外，其他抗體的親和力均優於對照抗體Zmab。

表4：SPR法檢測CLDN18.2抗體的親和力常數(平衡解離常數)

實施例10：人源化抗體基於報導基因的ADCC活性檢測

基於SPR親和力資料，選擇Hz14A5、Hz38F8、Hz69H9、Hz46F6、Hz59C1和Hz51H10進行基於報導基因的ADCC活性檢測。實驗過程參照實施例7。如圖4所示，人源化抗體Hz14A5、Hz38F8、Hz69H9、Hz46F6、Hz59C1和Hz51H10均顯示與對照抗體相當的ADCC活性。

實施例11：CLDN18.2抗體與腫瘤細胞系的結合

基於以上結果選擇1個人源化抗體Hz69H9和1個全人源抗體HB37A6進行下一步檢測。參照實施例4，藉由FACS測定兩個抗體分別與胃癌細胞系NUGC-4、胃癌細胞系KATO III-hCLDN18.2和胰腺癌細胞系DAN-G- hCLDN18.2的結合。圖5顯示人源化抗體Hz69H9和全人源抗體HB37A6均具有較好的腫瘤細胞特異性結合，優於對照抗體Zmab。

實施例12：CLDN18.2抗體的CDC活性檢測

使用KATO III-CLDN18.2細胞系進行抗體分子的CDC活性。96孔板中加入1×10⁵個靶細胞KATO III-hCLDN18.2，然後加入合適濃度的抗體分子，37℃培養30分鐘後，加入現配置的人類血清補體(Sigma,S1764)，該抗體的分別濃度如下：系列稀釋濃度，起始濃度為150ug/ml，3倍稀釋，共9個濃度點。將反應體系再次置於37℃培養箱中孵育3小時，然後使用CCK-8試劑盒(同仁化學，CK04)利用酶標儀(ThermoFisher，MULTISKAN FC)讀取資料，結果如圖6所示，Hz69H9和HB37A6具有和對照抗體Zmab相當的CDC活性。

實施例13：CLDN18.2抗體的ADCC活性檢測

用完全培養基RPMI-1640(Hyclone,SH30809.01)+10%胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30084.03)重新懸浮人類外周血單個核細胞(PBMC,Allcells或Saily)，將PBMC調整為1×10⁷個/ml。將NUGC-4或過表現Claudin18.2的DAN-G腫瘤靶細胞DAN-G-CLDN18.2用Far-Red(Invitrogen)標記10min，洗滌兩次後重新懸浮在完全培養基RPMI-1640(Hyclone,SH30809.01)+10%胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30084.03)中，細胞濃度調整為2×10⁵個/ml。將PBMC與抗claudin18.2單株抗體Hz69H9和HB37A6及對照抗體Zmab混合(每種抗體的起始濃度為30nM，3倍系列稀釋，共計12個濃度點)，37度孵育30min，然後按照50：1的效靶比，將50ul腫瘤靶細胞(1×10⁴個)加入到50μl PBMC效應細胞中。37度孵育8小時，離心，用終濃度為10μg/ml的碘化丙啶(propidium iodide,PI,Invitrogen)重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD，FACSCELESTA)檢測Far-Red和PI雙陽的細胞。藉由FACSDiva software(BD,Celestsa)計算腫瘤靶細胞殺傷比例。

抗Claudin18.2單株抗體依賴的細胞介導的NUGC-4腫瘤細胞毒性結果如圖7A和B所示，Hz69H9和HB37A6及對照抗體Zmab均可劑量依賴性介導NK細胞對NUGC-4細胞的細胞毒性殺傷，Hz69H9和HB37A6對腫瘤細胞的最大殺傷強於對照抗體Zmab。表明Hz69H9和HB37A6具有更強的細胞介導的腫瘤細胞毒性作用。抗Claudin18.2單株抗體依賴的細胞介導的DAN-G腫瘤細胞毒性結果如圖7C和圖7D所示，Hz69H9和HB37A6及對照抗體Zmab均可劑量依賴性介導NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性殺傷。其中HB37A6和Hz69H9在2個不同供者的PBMC仲介導的最大殺傷均高於對照抗體Zmab。以上結果表明，相比對照抗體Zmab，Hz69H9和HB37A6具有更強的細胞介導的腫瘤細胞毒性作用。

實施例14：CLDN18.2抗體的體內抗腫瘤效果

1：抗體對DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型的活性

選取HZ69H9和HB37A6抗體測試其在帶有人類胰腺癌的NOD-SCID小鼠(雌性NOD-SCID小鼠(15-18g)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，數量60隻)內的抗腫瘤效果。將實施例1構建的人類胰腺癌細胞DAN-G-CLDN18.2進行一般傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞，以PBS(1×)分散DAN-G-CLDN18.2，獲得細胞密度為12×10^5個/ml的懸液。將細胞懸液與matrigel膠1：1混合製備成細胞濃度為6×10^5個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOD-SCID小鼠右側腹部區域中來建立DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型。

腫瘤細胞接種5天後檢測各隻小鼠的瘤體積，挑選出瘤體積在43.36mm³至89.47mm³範圍內的小鼠，按瘤體積大小蛇形分組(每組8隻小鼠)分組。

對每隻小鼠施用hIgG(Equitech-Bio，批號160308-02)、Hz69H9和HB37A6及對照抗體Zmab，給藥劑量為每次10mg/kg，分別在接種後第5、9、12、16天給藥，每週2至3次監測小鼠瘤體積。腫瘤體積測定：採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W²/2。採用電子天平測定體重。

2：抗體對NUCG-4荷瘤小鼠模型的活性

選取HZ69H9和HB37A6抗體測試其在帶有人類胃癌的NOG小鼠(雌性NOG小鼠(15-18g)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，數量100隻)內的抗腫瘤效果。將PBMC細胞(Allcells)復蘇，離心收集細胞，以PBS(1×)分散PBMC細胞，細胞密度為2.5×10^6個/ml細胞懸液，在第0天取0.2ml細胞懸液用於NOG小鼠眼靜脈注射，建立NOG人源化小鼠模型。

將NUGC-4細胞進行一般復蘇傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞，以PBS(1×)分散NUGC-4細胞，細胞密度為12×10^6個/ml與matrigel膠1：1混合製備成細胞濃度為6×10^6個/ml細胞懸液。在第5天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOG人源化小鼠右側腹部區域中來建立NUCG-4荷瘤小鼠模型。

腫瘤細胞接種後第1天隨機分組，每組7隻，對每隻小鼠施用hIgG(Equitech-Bio，批號160308-02)、Hz69H9和HB37A6及對照抗體Zmab，給藥劑量為每次10mg/kg，分別在接種後第1、5、8、12天給藥，每週2至3次監測小鼠的瘤體積與體重。腫瘤體積測定：採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W²/2。採用電子天平測定體重。

3：結果

結果如圖8所示，Hz69H9和HB37A6及對照抗體Zmab在人類胰腺癌DAN-G-hCLDN18.2小鼠模型上都能抑制腫瘤生長。如圖9所示，Hz69H9和HB37A6在人類胃癌NUGC-4小鼠模型上比對照抗體Zmab展示出更佳的抗腫瘤效果。

在接種第26天計算相對腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：

TGI%=100% *(對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。

其中在DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型中，Hz69H9和HB37A的TGI分別為70%和28%，Zmab的TGI為24%；

在NUGC-4荷瘤小鼠模型中，Hz69H9和HB37A的TGI分別為46%和31%，Zmab的TGI為0%。

序列資訊：

<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司(INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.)

<120> 抗Claudin18.2抗體以及其用途

<130> PF 210417PCT

<140> 110122381

<141> 2021-06-18

<150> CN 202010570517.X

<151> 2020-06-19

<160> 94

<170> PatentIn version 3.3

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<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸

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<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸

<400> 94

本案圖式均為實驗數據，故本案無指定代表圖。

Claims

一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO：4所示的VH中所含的三個互補決定區域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO：9所示的VL中所含的三個互補決定區域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段，其包含分別如SEQ ID NO：1、2和3之胺基酸序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及分別如SEQ ID NO：6、7和8之胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
如請求項3所述之抗體或其抗原結合片段，其包含由SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列組成的VH，和由SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列組成的VL。
如請求項1、2或4所述之抗體或其抗原結合片段，其復包含重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。
如請求項5所述之抗體或其抗原結合片段，其中，重鏈恆定區HC(i)包含與選自SEQ ID NO：5的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或(ii)包含與選自SEQ ID NO：5的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；和/或輕鏈恆定區LC (i)包含與選自SEQ ID NO：10的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或(ii)包含與選自SEQ ID NO：10的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體是IgG1形式或IgG2形式或IgG3形式或IgG4形式的抗體或抗原結合片段。
如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體是單株抗體。
如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體是人源化的抗體或人類抗體或嵌合抗體。
如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其中，該抗原結合片段是選自以下的抗體片段；Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、(Fab’)₂或線性抗體。
如請求項1或2所述之抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段具有一種或多種以下性質：(i)以高親和力結合人類CLDN18.2，而不結合人類CLDN18.1；(ii)以下列平衡解離常數(K_D)與人類CLDN18.2結合，該K_D小於或等於10nM、9.5nM、9nM、8.5nM、8nM、7.5nM、7nM、6.5nM、6nM、5.5nM、5nM、4.5nM、4nM、3.5nM、3nM；(iii)與細胞表面的CLDN18.2結合，不與細胞表面的CLDN18.1結合；(iv)具有與已知抗體Zolbetuximab相當的ADCC活性或CDC活性，或者更高的ADCC活性或CDC活性； (v)抑制表現CLDN18.2的腫瘤細胞；(vi)能夠有效抑制腫瘤生長，腫瘤抑制率大於或等於25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%。
一種分離的核酸，其編碼如請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段中的輕鏈可變區或重鏈可變區，或輕鏈或重鏈。
一種包含如請求項12所述之核酸的載體。
一種宿主細胞，包含如請求項12所述之核酸或如請求項13所述之載體。
一種製備結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括在適於表現編碼請求項1至11中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的核酸的條件下培養如請求項14所述之宿主細胞。
一種免疫綴合物，其包含如請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段和其它物質。
一種醫藥組成物，其包含請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項16所述之免疫綴合物。
一種藥物組合，其包含請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項16所述之免疫綴合物，以及一種或多種其它治療劑。
一種如請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段、或如請求項16所述之免疫綴合物、或如請求項17所述之醫藥組成物在製備藥物的用途，其中，該藥物用於預防或治療受試者中的癌症。
一種如請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段、或如請求項16所述之免疫綴合物、或如請求項17所述之醫藥組成物在製備藥物的用途，其中，該藥物用於在受試者中引發ADCC和/或CDC，且該受試者患有癌症。
如請求項19或20所述之用途，其中，該癌症具有升高水平的核酸或蛋白質的CLDN18.2。
如請求項19或20所述之用途，其中，該癌症為胰腺癌或胃癌。
如請求項19或20所述之用途，其中該藥物與一種或多種療法組合施用，且該一種或多種療法為治療方式和/或其它治療劑。
如請求項23所述之用途，其中，該治療方式包括手術治療和/或放射療法，且其它治療劑選自化療劑、細胞激素、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑。
一種檢測樣品中CLDN18.2的方法，該方法包括(a)將樣品與根據如請求項1至11中任一項所述之抗體或其抗原結合片段或如請求項17的免疫綴合物接觸；以及(b)檢測抗體或其抗原結合片段與CLDN18.2間的複合物的形成。