CN116472286A - 结合tnfr2的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合TNFR2的新型抗体其抗原特异性结合片段以及包含所述抗体或其抗原特异性结合片段的组合物。此外，本发明涉及编码抗体或其抗原特异性结合片段的核酸和包含其的宿主细胞，以及其相关用途。此外，本发明涉及抗体和抗原特异性结合片段用于治疗和诊断的用途。

Description

结合TNFR2的抗体及其用途
本发明涉及特异性结合TNFR2的新型抗体或其抗体片段，以及涉及包含所述抗体或其抗体片段的组合物。此外，本发明涉及编码该抗体或其抗体片段的核酸和包含其的宿主细胞，以及其相关用途。此外，本发明涉及抗体和抗体片段用于治疗和诊断的用途。
背景技术
肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)是一大类具有相关结构的29种受体，能够介导一系列免疫和非免疫细胞功能(Mayes PA等人，Nat Rev Drug Discov.2018Jul；17(7):509-52)。几种受体已被表征为具有作为免疫共刺激剂(TNFRSF5(也称为CD40)、TNFRSF4(也称为OX40)、TNFRSF9(也称为4-1BB)、TNFRSF7(也称为CD27)和TNFRSF18(也称为GITR))的作用。这些共刺激受体可以在多种免疫细胞类型上表达，包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞以及抗原呈递细胞(APC)，并已被证明可以驱动免疫细胞功能、增殖和存活。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种高度多效性的细胞因子，几乎影响任何类型的细胞。它触发细胞反应，从炎症基因表达程序的诱导、遍及细胞增殖和分化的刺激到诸如细胞凋亡和坏死性凋亡等细胞自杀程序的激活(Wajant H等，Cell Death Differ.2003Jan；10(1)):45-65.)。TNF-α的跨膜和可溶形式都与两种已知的TNF-α受体TNFR1和TNFR2相互作用。这两种受体属于TNFRSF的不同亚组。TNFR1是死亡受体(DR)，具有死亡结构域。TNFR2没有死亡结构域，是一种原型的TNF受体相关因子(TRAF)相互作用的TNFRSF受体(Xie P,JMol Signal.2013Jun 13；8(1):7)。因此，在TNFR2的C端附近有一个短氨基酸基序，它能够募集接头蛋白TRAF2和TRAF2相关蛋白诸如TRAF1和细胞凋亡抑制蛋白1(cellularinhibitor of apoptosis protein 1,cIAP1)和cIAP2的细胞抑制剂。因此，TNFR2没有内在的细胞死亡诱导活性，但会刺激NF-κB信号转导和各种激酶的激活。
TNFR1由几乎任何细胞类型表达。然而TNFR2的表达则仅限于某些细胞类型，包括骨髓细胞、调节性T细胞、神经胶质细胞和一些内皮细胞类型，但也可以在上皮细胞、成纤维细胞和某些T和B细胞亚群中被诱导(Medler and Wajant,Expert Opin TherTargets.2019Apr；23(4):295-307)。
Heather Torrey等人(Sci Signal.2017Jan 17；10(462))最近的研究表征了使用拮抗性抗体抑制TNFR2的效果。在基于培养的分析中，他们发现两种TNFR2拮抗剂抑制了Treg增殖，减少了正常细胞的可溶性TNFR2分泌，并使T效应细胞扩增。这些TNFR2抗体杀死从卵巢癌腹水中分离的Treg比杀死来自健康供体样本的Treg更有效，这表明这些抗体可能对肿瘤微环境具有特异性。
在另一项研究中，Eric M.Tam(Sci Transl Med.2019Oct 2；11(512))描述了他们的抗TNFR2抗体提供共刺激信号，导致在体外CD4+和CD8+T细胞中增殖、激活标志物和细胞因子的增加，在人源化小鼠模型中也具有抗肿瘤作用。
尽管靶向抑制性受体CTLA-4、PD-1或PD-L1的免疫治疗在癌症方面取得了实质性的临床进展，但相当一部分患者仍然对治疗无反应。单独针对新的免疫肿瘤学通路的免疫治疗，或与当前的免疫疗法相结合，可能会改善临床结果。目前没有抗TNFR2抗体正在进行临床研究，因此，需要可以激活效应T细胞功能并增强T细胞增殖和/或抑制Treg功能的TNFR2靶向疗法，其旨在用于癌症。
发明内容
本发明涉及结合TNFR2的抗体或它的片段或其抗原结合片段。在一个实施方案中，TNFR2来源于人或食蟹猴。在另一个实施方案中，TNFR2包含SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50。在另一个实施方案中，抗体可结合的TNFR2片段包含TNFR2的胞外区，例如，该区域包含或由SEQ ID NO:50组成。在进一步的实施方案中，抗体可结合的TNFR2的片段包含SEQ ID NO:50的1L至31C的氨基酸序列或SEQ ID NO:50的1L至96C的氨基酸序列或SEQID NO:50的17T至54D的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，抗体可结合的TNFR2片段包含人TNFR2蛋白上的Q26，或对应于人TNFR2蛋白上26位的位置处的氨基酸Q。
在一个实施方案中，本发明的抗体结合TNFR2的表位。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体结合的TNFR2的表位包含人TNFR2的Q26或对应于人TNFR2蛋白上26位的位置处的氨基酸Q。在一个实施方案中，表位包含在人TNFR2的胞外区中，例如，由SEQ ID NO:50组成或包含SEQ ID NO:50的区域。在另一个实施方案中，表位包含在人TNFR2或其对应的片段中SEQ ID NO：58的1L至31C的氨基酸序列中。在另一个实施方案中，表位包含在人TNFR2或其对应片段中SEQ ID NO：62的1L至96C的氨基酸序列中。在另一个实施方案中，表位的一个或多个氨基酸包含在人TNFR2或其对应片段中SEQ ID NO：52的17T-54D的氨基酸序列中。
在一方面，抗TNFR2抗体或其抗原结合片段具有以下一种或多种特性：
(1)在体外与人和/或食蟹猴TNFR2蛋白或其片段具有高亲和力结合；
(2)与表达于细胞表面的人和/或食蟹猴TNFR2结合，例如293T细胞的细胞表面，或活化的细胞，诸如抗CD3刺激的PBMC；
(3)阻断TNF-α与表达于细胞(例如293T细胞)上的人和/或食蟹猴TNFR2之间的相互作用/结合；
(4)激活(例如，人)T-细胞(例如，CD8+T细胞或CD 4+T细胞)，例如，增加细胞因子如IFN-γ的分泌，增加CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖；
(5)刺激TNFR2(例如人或食蟹猴TNFR2)的下游信号通路；
(6)增强免疫反应；
(7)在诱导的T细胞，如诱导的Treg细胞或诱导的CD8+T细胞上，不诱导ADCC作用；
(8)由于具有良好的药代动力学参数，适合作为药物中的活性成分使用；
(9)具有抗肿瘤作用，例如通过减小肿瘤体积，例如可以使肿瘤体积减小至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
一方面，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3。
另一方面，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含三个轻链互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在另一方面，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含
三个重链互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
三个轻链互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3。
另一方面，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区。
另一方面，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段,其包含轻链可变区。
在另一方面，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区。
在一个实施方案中，重链可变区包含三个重链互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在另一个实施方案中，轻链可变区包含三个轻链互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一个实施方案中，三个重链互补决定区HCDRl、HCDR2和HCDR3是
(i)源自重链可变区HCVR的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCVR包含或由SEQ ID NO:7、15、25或37表示的序列组成，或
(ii)(i)的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其与(i)的三个CDR相比，进一步包含总共至少一个且不超过5个氨基酸变化(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个实施方案中，三个轻链互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3是
(i)源自轻链可变区LCVR的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCVR包含或由SEQ ID NO:8、16、26、28或38表示的序列组成，或
(ii)(i)的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其与(i)的三个CDR相比，其进一步包含总共至少一个且不超过5个氨基酸变化(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含
源自重链可变区HCVR的三个重链互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCVR由SEQ ID NO:7、15、25或37表示的序列组成；和源自轻链可变区LCVR的三个轻链互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCVR由SEQ ID NO:8、16、26、28或38表示的序列组成。在另一个实施方案中，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含
(1)源自由SEQ ID NO:7或25表示的序列组成的重链可变区HCVR的三个HCDRHCDR1、HCDR2和HCDR3；和源自由SEQ ID NO:8或26或28表示的序列组成的轻链可变区LCVR的三个LCDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(2)源自由SEQ ID NO:15或37表示的序列组成的重链可变区HCVR的三个HCDRHCDR1、HCDR2和HCDR3；和源自由SEQ ID NO:16或38表示的序列组成的轻链可变区LCVR的三个LCDR LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一个实施方案中，HCDRl包含SEQ ID NO:1或9的氨基酸序列，或由其组成，或者HCDRl包含与SEQ ID NO:1或9的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个变化(优选氨基酸取代，优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:2或10的氨基酸序列，或由其组成，或HCDR2包含与选自由SEQ ID NO:2或10的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个变化(优选氨基酸取代、优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:3或11的氨基酸序列，或由其组成，或HCDR3包含与选自由SEQ ID NO:3或11的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个变化(优选氨基酸取代、优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，LCDRl包含SEQ ID NO:4或12的氨基酸序列，或由其组成，或者LCDRl包含与选自由SEQ ID NO:4或12的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个变化(优选氨基酸取代、优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO:5或13的氨基酸序列，或由其组成，或者LCDR2包含与选自由SEQ ID NO:5或13的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个变化(优选氨基酸取代、优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO:6或14的氨基酸序列，或由其组成，或者LCDR3包含与选自由SEQ ID NO:6或14的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个变化(优选氨基酸取代、优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，三个重链互补决定区HCDRl、HCDR2和HCDR3是
(i)分别由SEQ ID NO:1、2和3表示的序列组成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或
(ii)分别由SEQ ID NO:9、10和11表示的序列组成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或
(iii)(i)或(ii)的HCDR1、HCDR2和HCDR3，，进一步包含与(i)或(ii)的三个CDR相比总共至少一个且不超过5个氨基酸变化(优选氨基酸取代，优选保守性取代)。
在一个实施方案中，三个轻链互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3是
(i)分别由SEQ ID NO：4、5和6表示的序列组成的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(ii)分别由SEQ ID NO:12、13和14表示的序列组成的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(iii)(i)的LCDR1、LCDR2和LCDR3，，其进一步包含与(i)的三个CDR相比总共至少一个且不超过5个氨基酸变化(优选氨基酸取代，优选保守性取代)。
在另一个实施方案中，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含
(i)分别由SEQ ID NO：1、2和3表示的序列组成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别由SEQ ID NO：4、5和6表示的序列组成的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
(ii)分别由SEQ ID NO：9、10和11表示的序列组成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别由SEQ ID NO：12、13和14表示的序列组成的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一个实施方案中，重链可变区
(i)包含或由与选自由SEQ ID NO：7、15、25或37组成的组的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成；或
(ii)包含或由选自由SEQ ID NO:7、15、25或37组成的组的氨基酸序列组成；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO：7、15、25或37组成的组的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸变化(优选氨基酸取代，更优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区，更优选地，所述氨基酸变化发生在FR区，例如FR1、FR2、FR3或FR4区。
在另一个实施方案中，轻链可变区
(i)包含或由与选自由SEQ ID NO：8、16、26、28或38组成的组的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成；或
(ii)包含或由选自由SEQ ID NO:8、16、26、28或38组成的组的氨基酸序列组成；或
(iii)包含与选自SEQ ID NO：8、16、26、28或38组成的组的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸变化(优选氨基酸取代，更优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区，更优选地，所述氨基酸变化发生在FR区，例如FR1、FR2、FR3或FR4区域，优选地，变化发生在FR3中的I83，特别地该变化是从I到V或它的保守性氨基酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含或由SEQ ID NO:7、15、25或37表示的氨基酸序列组成，和/或
轻链可变区，其包含或由SEQ ID No：8、16、26、28或38表示的氨基酸序列组成。
在另一个实施方案中，本发明涉及抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)包含或由SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ IDNO：8表示的氨基酸序列组成的轻链可可变区；
(2)包含或由SEQ ID NO：15表示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ IDNO：16表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(3)包含或由SEQ ID NO：25表示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ IDNO：26表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(4)包含或由SEQ ID NO：25表示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ IDNO：28表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(5)包含或由SEQ ID NO：37表示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ IDNO：38表示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在另一方面，抗TNFR2抗体或其抗原结合片段是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的形式。优选地，本发明的抗体是IgG1的形式。
在另一方面，抗TNFR2抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在一个实施方案中，重链恒定区是或源自人IgG恒定区，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgGl恒定区。
在另一个实施方案中，重链恒定区
(i)包含或由与SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:73所表示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成；或者
(ii)包含或由SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:73所表示的氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:73所表示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸变化(优选氨基酸取代，更优选保守性取代)的氨基酸序列，或由其组成。
在一个实施方案中，轻链恒定区是或源自κ或λ轻链恒定区，例如人κ或λ轻链恒定区，优选人κ轻链恒定区。
在另一个实施方案中，轻链恒定区
(i)包含或由与SEQ ID NO:42所表示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO:42所表示的氨基酸序列或由其组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO：42所表示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸变化(优选氨基酸取代，更优选保守性取代)的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段的重链还包含信号肽序列。
在另一个实施方案中，本发明的抗TNFR2抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在另一个实施方案中，本发明的抗原结合片段是选自由Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、单链抗体(例如，scFv)、(Fab')2、单域抗体(例如，VHH)、域抗体(dAb)或线性抗体组成的组的抗体片段。
在另一个实施方案中，本发明的抗TNFR2抗体是双特异性或多特异性抗体分子，优选地，该双特异性抗体分子结合TNFR2和免疫检查点。
在另一方面，本发明进一步涉及编码本发明抗TNFR2抗体的任一或更多链的分离的核酸。
在另一方面，本发明进一步涉及包含本发明核酸的载体。在一个实施方案中，所述载体是表达载体。
在另一方面，本发明进一步涉及包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。优选地，宿主细胞是原核或真核细胞，更优选地选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如，CHO细胞或CHO-S细胞或293细胞或293T细胞)，或适用于制备抗体或抗原结合片段的其他细胞。
在另一方面，本发明进一步涉及制备抗-TNFR2抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适合表达编码本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段核酸的条件下培养根据本发明的宿主细胞。任选地，所述方法进一步包括从宿主细胞回收抗TNFR2抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明进一步涉及免疫缀合物，其包含根据本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段和其他活性剂，例如治疗剂或标志物，诸如细胞毒剂。
在另一方面，本发明进一步涉及药物组合物，其包含根据本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，或本发明的免疫缀合物，以及任选的药学上可接受的辅助剂。
在另一方面，本发明进一步涉及组合产品，其包含本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，或本发明的免疫缀合物，以及一种或多种其他治疗剂，例如化学治疗剂、其他抗体、细胞毒类药物、疫苗、抗感染剂、小分子实体或免疫调节剂。
在进一步的方面，本发明进一步涉及在受试者中激活T细胞、或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性、或增强T细胞介导的免疫、或刺激T细胞增殖的方法，包括向所述受试者施用本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段、或免疫缀合物、或药物组合物、或组合产品。
在另一方面，本发明进一步涉及在受试者中预防或治疗癌症或感染的方法，包括向所述受试者施用本发明的抗-TNFR2抗体或其抗原结合片段，或免疫缀合物，或药物组合物或组合产品。
在一个实施方案中，癌症是具有高水平TNFR2(例如，高蛋白质或核酸水平的TNFR2)的癌症。在另一个实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤非霍奇金淋巴瘤和卵巢癌、胃肠道癌症，例如结直肠癌、直肠癌或结肠癌。
在一个实施方案中，感染是病毒感染、细菌感染、真菌感染或原生动物诸如寄生虫感染。
在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括向所述受试者联合施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其他治疗剂，优选地，所述治疗方式包括手术和/或放射疗法，和/或其他选自由化学治疗剂，其他抗体，细胞毒类药物，疫苗，抗感染剂，小分子实体或免疫调节剂组成的组的治疗剂。
在另一方面，本发明进一步涉及一种检测样品中TNFR2的方法，所述方法包括：
(a)使样品与根据本发明的任何抗TNFR2抗体或其抗原结合片段接触；
(b)检测抗TNFR2抗体或其抗原结合片段与TNFR2之间的复合物的形成；任选地，抗TNFR2抗体被可检测地标记。
在另一方面，本发明进一步涉及用于检测TNFR2的试剂盒，其包含本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，或免疫缀合物。
本发明还包含本文所述的任何实施例的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任意组合适用于本文所描述的本发明的任何和所有抗TNFR2抗体或片段及其方法和用途。
附图说明
图1显示嵌合抗体与人和食蟹猴TNFR2蛋白的结合。
图2显示嵌合抗体与细胞表面上的食蟹猴或人TNFR2结合，并阻断TNF-α与细胞表面上的人TNFR2的结合。
图3显示了人源化抗体结合到人TNFR2并阻断人TNFR2结合TNF-α。
图4显示了人源化抗体与细胞表面的食蟹猴TNFR2结合以及阻断人TNFR2与TNF-α的结合。
图5显示了人源化抗体对人CD8+T细胞的共刺激。
图6显示人源化抗体共同刺激T细胞的增殖。
图7显示人源化抗体以Fc交联形式激活T细胞。
图8显示了人源化抗体与TNFRSF蛋白的结合。
图9显示了在SEC-HPLC中人源化抗体hu32-C和hu32C-V1的纯度。
图10显示了抗TNFR2抗体hu3-E的表位作图
图11显示了抗-TNFR2抗体hu32C-V1的表位作图
图12显示了抗TNFR2抗体hu3-E与活化的PBMC细胞上的TNFR2结合。
图13显示了抗人TNFR2抗体对Treg细胞的ADCC作用。
图14显示了抗人TNFR2抗体对CD8+T细胞的ADCC作用。
发明详述
定义
为了解释本说明书的目的，将使用以下定义，并且如果合适，以单数形式使用的术语还可以包括复数，反之亦然。应当理解，这里使用的术语是为了描述特定实施方案的目的而不是限制性的。
在此使用的术语“和/或”将被视为两个或更多个指定特征或组件中的每一个的具体公开，其中包含或不包含另一个。因此，在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A(单独的)”和“B(单独的)”。
应当理解，无论在何处用语言“包括”在本文中描述方面，还提供了在“由……组成”和/或“基本上由……组成”方面描述的其他类似方面。
当与数值结合使用时，术语“约”意在涵盖在比指定数值小10％或5％的下限和大于指定的数值10％或5％的上限之间的范围内的数值。
“2型肿瘤坏死因子受体(TNFR2)”在肿瘤浸润性免疫抑制性CD4+FoxP3+调节性T细胞(Treg)高度表达，并且已证明为介导肿瘤坏死因子(TNF)对这些细胞的刺激作用。最近的研究表明，TNFR2在刺激Treg的激活和增殖方面起着至关重要的作用，Treg是抗肿瘤免疫反应的主要检查点(Chen和Oppenheim，Sci Signal 10：eaal2328，2017)。TNFR2也由某些类型的恶性细胞表达，并且这些肿瘤细胞的存活和生长由TNFR2的配体促进。在一个实施方案中，本发明中的TNFR2源自人，例如，其具有SEQ ID NO：48所表示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，TNFR2源自食蟹猴，例如，其具有SEQ ID NO:49所表示的氨基酸序列。本文所用的TNFR2片段是指TNFR2的任何部分，尤其是本发明的抗TNFR2抗体所结合的部分。在一个实施方案中，该片段是TNFR2的胞外区，例如具有由SEQ ID NO:50表示的氨基酸序列的区域。
“抗-抗原”抗体是指与抗原特异性结合的抗体。例如，抗TNFR2抗体与TNFR2特异性结合。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于90％或95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所确定的纯度。在本发明的一个实施方案中，抗TNFR2抗体是分离的。
如本文所用，术语“抗-TNFR2抗体”、“抗-TNFR2”、“TNFR2抗体”或“结合TNFR2的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力地结合到(例如，人或食蟹猴)TNFR2或其片段，以致该抗体可用作靶向(人或食蟹猴)TNFR2的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体以小于约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或更高的抗体与(例如，人或食蟹猴)TNFR2的结合的程度结合非TNFR2蛋白(例如，非人或非食蟹猴TNFR2)，如通过例如放射免疫测定(RIA)或Bio-light干涉测量法或MSD分析法所测量的。在一个实施方案中，抗体与人或食蟹猴TNFR2或其片段在体外以高亲和力方式结合，从而与结合到非TNFR2蛋白(例如，分别地非人或非食蟹猴TNFR2)相比，结合高出约70％、约80％或约90％或更高。在一个实施方式中，抗体与食蟹猴TNFR2或其片段在体外以高亲和力方式结合，从而该抗体与食蟹猴TNFR2结合的KD低于100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM，或在以上所列值之间，例如约0.5nM-10nM、0.5nM-8nM、0.5nM-6nM。在一个实施方式中，抗体与人TNFR2或其片段在体外以高亲和力方式结合，从而该抗体与人TNFR2结合的KD低于100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM，或在以上所列值之间，例如约0.3nM-5nM或0.3nM-4nM。
抗体可以是已经变化的抗体(例如，通过插入，缺失，取代，与非抗体部分缀合)。例如，抗体可以包括一种或多种改变抗体特性(例如功能特性)的变体氨基酸(与自然形成的抗体相比)。例如，若干变化，其影响例如抗体在患者体内的半衰期、效应子功能和/或免疫应答，在本领域是已知的。
术语“单克隆抗体”(“mAb”)是指单分子组成的抗体分子的制备物，即对特定抗原表现出单一结合特异性和亲和力的抗体分子。单克隆抗体是分离抗体的一个例子。MAb可以通过杂交瘤、重组、转基因或其他本领域技术人员已知的技术产生。
“人”抗体(HuMAb)是指具有其中框架区和CDR区均源自人种系(germline)免疫球蛋白序列的可变区的抗体。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。
“人源化抗体”是指这样一种抗体，其中非人抗体的CDR结构域外的一些、大部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应氨基酸取代。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR域外的一些、大部分或全部氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸替换，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或全部氨基酸未改变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是允许的，只要它们不会破坏抗体与特定抗原结合的能力。“人源化”抗体保留了与原始抗体相似的抗原特异性。
“嵌合抗体”是指其中可变区源自一个物种而恒定区源自另一物种的抗体，例如其中可变区源自小鼠抗体且恒定区源自人抗体的抗体。
抗体的“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留与被完整抗体结合的抗原特异性结合的能力。包含在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；单域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选其效用。抗原结合片段可以通过重组DNA技术产生，或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解产生。
如本文所用，术语“表位”是指与抗体分子特异性相互作用的抗原(例如，TNFR2)的一部分。该部分(在本文中称为表位决定簇)通常包含诸如氨基酸侧链或糖侧链或其组分的元件。表位决定簇可以根据本领域已知的或本文公开的方法(例如，通过晶体学或通过氢-氘交换)来定义。通常，表位具有特定的三维结构特征。通常，表位具有特定的电荷特性。一些表位是线性表位，而其他表位是构象表位。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体结合的TNFR2的表位包含人TNFR2的Q26或对应于人TNFR2蛋白上26位的位置处的氨基酸Q。在一个实施方案中，表位包含在人TNFR2的胞外区(例如，由SEQ ID NO:50组成或包含SEQ IDNO:50的区域)中。在另一个实施方案中，表位包含在人TNFR2或其对应的片段中SEQ ID NO：58的从1L至31C的氨基酸序列中。在另一个实施方案中，表位包含在人TNFR2或其对应片段中SEQ ID NO：62的从1L至96C的氨基酸序列中。在另一个实施方案中，表位包含在人TNFR2或其对应片段中SEQ ID NO：52的从17T至54D的氨基酸序列中。
作为参考抗体的“结合相同或重叠表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％或更多的抗体，反之，参考抗体在竞争测定中阻断该抗体与其抗原的结合达50％或更多。
与参考抗体竞争结合其抗原的抗体是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合的50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多的抗体。换言之，在竞争测定中，参考抗体阻断了该抗体与其抗原的结合的50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多。许多类型的竞争性结合测定可用于确定抗原结合蛋白是否与另一种竞争，诸如固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定。
抑制(例如，竞争性抑制)参考抗体与其抗原结合的抗体是指抑制参考抗体与其抗原的50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多的结合的抗体。相反，参考抗体抑制该抗体与其抗原的结合达50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多。抗体与其抗原的结合可以通过亲和力来测量。确定亲和力的方法是本领域已知的。
表现出与参考抗体相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％或更多参考抗体的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的用于确定结合亲和力和/或特异性的任何方法来确定。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中序列高度可变并形成结构限定环(“高变环”)和/或包含抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责结合表位。重链和轻链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始依次编号。位于抗体重链可变结构域的CDR被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域的CDR被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。在给定的轻链可变区或重链可变区的氨基酸序列中，每个CDR的确切氨基酸序列边界可以使用多种众所周知的抗体CDR分配系统的任何一种或组合来确定，包括，例如，基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑结构的Chothia(Chothia等人(1989)Nature 342：877-883；Al-Lazikani等人，"Standard conformations for the canonical structuresof immunoglobulins"，Journal of Molecular Biology,273:927-948(1997))，基于抗体序列变异性的Kabat(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，美国卫生与人类服务部，美国国立卫生研究院(1987))、AbM(巴斯大学)、Contact(伦敦大学学院)、国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(万维网上的imgt.cines.fr/)，以及基于使用大量晶体结构的亲和传播聚类的North CDR定义。
例如，根据不同的CDR确定格式，每个CDR的残基如下。
CDR还可以基于具有与参考CDR序列(例如，本发明的任何示例性CDR)相同的Kabat编号位置来确定。
除非另有说明，在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”包括通过上述任何方式确定的CDR序列。
除非另有说明，在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，均指按照Kabat编号系统的编号位置(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991年))。
在一个实施方案中，本发明抗体的CDR的边界由Kabat方案确定。
需要说明的是，通过不同的分配系统获得的抗体可变区CDR的边界可能不同。即，由不同分配系统定义的抗体可变区的CDR序列不同。因此，当涉及定义具有本发明定义的特定CDR序列的抗体时，该抗体的范围还包括其可变区序列包含特定CDR序列、但由于应用了不同方案而具有不同于本发明定义的具体CDR边界的要求保护的CDR边界的抗体。
具有不同特异性(即，不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR(在相同的分配系统下)。然而，尽管CDR因抗体而异，但CDR中只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。可以使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少两种方法确定最小重叠区域，从而为抗原结合提供“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的子部分。本领域技术人员清楚，其余CDR序列的残基可以通过抗体结构和蛋白质折叠来确定。因此，在本发明中也将考虑本文给出的CDR的任何变体。例如，在一个CDR变体中，最小结合单位中的氨基酸残基可能保持不变，而由Kabat或Chothia定义的其他CDR残基可能被保守性氨基酸残基取代。
本领域已知的抗体主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。本领域技术人员可以根据实际需要选择并获得本发明的合适类别的抗体。
“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属的IgG形式。所有同类型抗体的重链恒定区都是相同的，不同类型抗体的重链恒定区不同。例如，IgGl形式的抗体是指重链恒定区Ig结构域为IgGl的Ig结构域。
“分离的”核酸是指已经与其自然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括包含在细胞中的核酸分子，该细胞通常含有该核酸分子，但存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合到它被引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，它们包括初级转化细胞和由其衍生的后代，无论传代次数如何。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可能包含突变。具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变后代包括在本文中。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基在比对之后的相同的百分比，并在必要时引入缺口以实现最大的序列同一性百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域中多种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
当在本申请中提及序列同一性的百分比时，除非另外特别指明，这些百分比是相对于较长序列的全长计算的。相对于较长序列全长的计算适用于核酸序列和多肽序列。
术语“药品组合物”，是指以使得其所含有效成分的生物活性有效，且不含有对被施予对象具有不可接受毒性的额外成分的形式的制剂。
术语“药学上可接受的辅助剂”是指与治疗剂共同给药的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂或载体。
如本文所用，“治疗”是指减缓、中断、阻止、减轻、停止、减少或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度。
如本文所用，“预防”包括抑制疾病或病症的发作或进展或特定疾病或病症的症状。在一些实施方案中，具有癌症家族史的受试者是预防方案的候选者。通常，在癌症的上下文中，术语“预防”是指在癌症的体征或症状出现之前给予药物，特别是在有患癌症风险的受试者中。"
“激活T细胞”是指诱导、引起或刺激效应T细胞或记忆T细胞具有更新的、持续的或放大的生物学功能。增强T细胞功能的例子包括:与干预前的水平相比，CD8+T细胞分泌γ-干扰素(例如，IFN-γ)增加，CD4+T细胞增殖增加，CD8+T细胞增殖增加。
如本文所述的术语“治疗剂”包括有效预防或治疗肿瘤(例如癌症)和感染的任何物质，包括化学治疗剂、细胞毒类药物、疫苗、其他抗体(例如，针对免疫检查点分子的抗体))、活性抗感染剂、免疫调节剂、小实体。
“化学治疗剂”包括可用于治疗癌症的化合物。
术语“免疫检查点分子”是指CD4 T细胞和CD8 T细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子可以有效地充当“刹车”，下调或抑制抗肿瘤免疫反应。
术语“抗感染剂”包括在施用浓度和施用间隔下特异性抑制或消除微生物诸如病毒、细菌、真菌或原生动物(例如寄生)的生长并且对宿主不致死的任何分子。如本文所用，术语抗感染剂包括抗生素、抗菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。在一个具体方面，抗感染剂以施用浓度和施用间隔对宿主无毒。
免疫调节剂包括免疫检查点分子抑制剂和共刺激分子激活剂。
术语“小分子”是指任何分子量为约2000道尔顿或更小，优选为约500道尔顿或更小的分子。
术语“组合产品”是指用于组合给药的剂量单位形式或试剂盒的部件的固定或非固定组合，其中两种或多种治疗剂可以同时独立给药或在一个时间间隔内分别给药，尤其是当这些时间间隔允许这些组合伙伴表现协作(例如，协同效应)时。术语“固定组合”是指本发明的抗体和组合伙伴(例如，其他治疗剂，例如免疫调节剂，例如免疫抑制剂或抗炎剂)被以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”是指本发明的抗体和组合伙伴(例如，其他治疗剂，例如免疫调节剂，例如免疫抑制剂或抗炎剂)以单独的实体同时、同步或序贯地施用于患者，并且没有具体的时间限制，其中这种施用在患者体内提供治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，诸如施用三种或更多种治疗剂。在优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理疾病，其通常以不受调节的细胞生长为特征。
术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌变细胞和组织。当在本文中提及时，术语“癌症”、“癌性的”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”并不相互排斥。
术语“感染性疾病”是指由病原体引起的疾病，包括例如病毒感染、细菌感染、真菌感染或原生动物诸如寄生虫感染。
术语“肿瘤免疫逃逸”是指肿瘤逃避免疫识别和清除。因此，作为治疗的概念，肿瘤免疫被“治疗”，肿瘤在逃逸减弱时被免疫系统识别和攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合、肿瘤缩小和肿瘤清除。
本文使用的术语“标记物”是指直接或间接偶联或融合至试剂，例如多核苷酸探针或抗体，并有助于检测与其偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测底物化合物或组合物的化学变化。该术语旨在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)到探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。
术语“有效剂量”是指在对需要治疗或预防的患者进行一次或多次给药后，本发明的抗体或片段或缀合物或组合物产生预期效果的量或剂量。有效剂量可以很容易地由一名作为本领域技术人员的主治医生通过考虑以下各种因素来确定:物种，如哺乳动物；它的大小、年龄和一般健康状况；所涉及的特定疾病；疾病的程度或严重程度；单个患者的反应；特定的抗体施用；给药途径；所给制剂的生物利用度特征；选择剂量方案；以及任何伴随治疗的使用。
“治疗有效量”是指在所需时间段内以所需剂量有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段、或其缀合物或组合物的治疗有效量可根据多种因素而变化，例如个体的病态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分在个人中引起所需的反应的能力。治疗有效量也是这样的量，其中抗体或抗体片段、或其缀合物或组合物的任何毒性或不希望的作用次于治疗有益作用。“治疗有效量”优选地将可测量的参数(例如，肿瘤生长速率)相对于未治疗的受试者抑制至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约50％、60％或70％，并且仍然更优选至少约80％或90％。
“预防有效量”是指在所需时间段内以所需剂量有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防剂量是在疾病发生之前或早期阶段对受试者施用，因此预防有效量将小于治疗有效量。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、山羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物诸如猴子)、兔、和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一些实施例中，个体或受试者是人。
如本文所用，术语“施用”或“给药”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任一种将包含治疗剂(例如抗TNFR2抗体)的组合物物理引入受试者和。给药途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外给药”是指肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内。经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。其他非肠胃外给药(non-parenteral)途径包括局部、表皮或粘膜给药途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。
来自受试者/患者的“样品”是指从癌症患者或癌症受试者获得的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检或抽吸物的固体组织；血液或任何血液成分；体液，例如脑脊液、羊水、腹膜液或间质液；对象妊娠或发育过程中任何时间的细胞。组织样品可包含在自然界中不与组织自然混合的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。本文的肿瘤样品的例子包括但不限于肿瘤活检、细针抽吸物、细支气管灌洗液、胸水、痰、尿液、手术标本、循环肿瘤细胞、血清、血浆、循环血浆蛋白、腹水、原代细胞培养物或源自肿瘤或表现出肿瘤样特性的细胞系，以及保存的肿瘤样品，例如福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻肿瘤样品。
本发明的抗体
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸变化包括氨基酸取代、插入或缺失。优选地，本文所述的氨基酸变化是氨基酸取代，优选保守性取代。
在一个优选的实施方案中，本文所述的氨基酸变化发生在CDR之外的一个或多个区域中(例如，在FR中)。在一个实施方案中，氨基酸改变发生在HCVR或LCVR的FR区，优选LCVR，例如，在LCVR的FR1、FR2、FR3和/或FR4。在一些实施例中，FR区有一个、两个或三个变化。在一个特定的实施方案中，变化是在FR3的I83处，例如，在位置83处的从I替换为V或它的保守性氨基酸。
更优选地，本文所述的氨基酸变化发生在重链可变区之外和/或轻链可变区之外的一个或多个区域中。
在一些实施例中，取代是保守性取代。保守性取代是指一个氨基酸被同类的另一个氨基酸取代，例如，酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸取代，碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸取代，或中性氨基酸由另一种中性氨基酸取代。示例性取代如下表所示：
任选地，本发明的抗TNFR2抗体包含对轻链可变区、重链可变区、轻链或重链的翻译后修饰。示例性的翻译后修饰包括二硫键形成、糖基化、聚乙二醇化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，例如与标记成分的偶联。
在某些实施方案中，本文提供的抗体被改变以增加或减少抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现向抗体添加或删除糖基化位点。
本发明涵盖的对本文所述的抗体或其片段的另一种修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化到例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常在一个或多个PEG基团连接到抗体或抗体片段的条件下与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入此处提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体，例如，增强抗体治疗癌症或细胞增生性疾病的功效。例如，可以结合修饰来消除或增加抗体的ADCC功能，或消除抗体与Fcγ受体的结合。在一个实施例中，L234A、L235A、D265A和/或P329A(EU编号)或L234A/L235A/D265A/P329A(EU编号)可以并入Fc区域。
在一个实施方案中，可以改变抗体的半胱氨酸残基的数量以改变抗体特性。
在一个实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入FR区以提高抗体的产生，例如提高抗体在细胞中的表达或提高所产生抗体的纯度。例如，在FR1、FR2、FR3或FR4区域，例如FR3区域，例如在位置I83处可以有修饰。具体地，修饰可以是从第83位的I替换为V或它的保守性氨基酸。
在一些实施方案中，本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段表现出与本发明的抗体hu32-C、hu32C-V1或hu3-E相同或相似的结合亲和力和/或特异性；和/或抑制(例如，竞争性抑制)本发明的抗体hu32-C、hu32C-V1或hu3-E与TNFR2的结合和/或结合与本发明的抗体hu32-C、hu32C-V1或hu3-E相同或重叠的表位；和/或与本发明的抗体hu32-C、hu32C-V1或hu3-E竞争结合TNFR2；和/或具有本发明的抗体hu32-C、hu32C-V1或hu3-E的一种或多种生物学特性。
本发明的核酸和包含其的宿主细胞
一方面，本发明提供了编码任何上述抗TNFR2抗体或其片段的核酸。核酸可编码包含抗体轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列，或包含抗体轻链和/或重链的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的示例性核酸包括编码选自SEQ ID NO:7、8、15、16、25、26、28、37、38中任一项的氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:7、8、15、16、25、26、28、37、38中任一项的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的核酸。
在另一个实施方案中，本发明的核酸包含选自SEQ ID NO:23、24、27、35或36中任一个的核苷酸序列，或与选自SEQ ID NO:23、24、27、35或36中任一个的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种或多种含有任一核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。可以使用多种载体系统。在一个优选的实施方案中，本发明的表达载体是pCDNA，例如pCDNA3.1表达载体。
在一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其含有编码本文所述抗体区域或本文所述载体的核酸。用于克隆或表达编码抗体的核酸或载体的合适宿主细胞包括如本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体。表达后，抗体可以从可溶部分的细菌糊状物中分离出来，并可以进一步纯化。在一个实施例中，宿主细胞是大肠杆菌。
在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞。宿主细胞可选自酵母、哺乳动物细胞(例如，人细胞)、昆虫细胞、植物细胞或适合制备抗体或其抗原结合片段的其他细胞。例如，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)、人胚胎肾系(293HEK或293或293T细胞)等。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。
本发明的抗体或抗原结合片段的制备和纯化方法
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备抗-TNFR2抗体的方法，其中该方法包括在适合表达抗体或抗原结合片段的条件下孵育含有编码本发明的抗体或抗原结合片段的核酸(任何一个或多个抗体区域或抗体链)，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养物)中回收抗体或片段。
对于抗体的重组生产，分离编码抗体的核酸(例如，编码VH或VL或重链或轻链的核酸)并插入一种或多种载体中用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。通过使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，可以容易地分离和测序核酸。
在一个实施方案中，宿主细胞含有载体，该载体包括编码抗体VL的氨基酸序列的核酸和编码抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞含有包含编码抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。
如本文所述制备的抗体分子可以通过已知技术纯化，例如高效液相色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、亲和色谱(例如蛋白A)、尺寸排阻色谱等。用于纯化特定蛋白质的实际条件还取决于诸如净电荷、疏水性和亲水性等因素，这些对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的抗体分子的纯度可以通过多种众所周知的分析方法中的任一种来确定，包括尺寸排阻色谱、凝胶电泳、高效液相色谱等。.
测定
本文提供的抗TNFR2抗体可以通过本领域已知的多种测定对于其物理/化学特性和/或生物活性进行鉴定、筛选或表征。在一个方面，本发明的抗体的抗原结合活性通过例如已知方法如ELISA、Western印迹、流式细胞术和用抗体分子包被的磁珠来测试。
另一方面，竞争性结合测定可用于鉴定与本文公开的任何抗TNFR2抗体竞争结合TNFR2的抗体。在一些实施方案中，此类竞争性抗体与本发明的任何抗TNFR2抗体结合相同的表位(例如，线性或构象表位)。
本发明进一步提供了用于鉴定具有上述一种或多种特性的抗TNFR2抗体的测定法。进一步提供了在体内和/或体外具有这种生物活性的抗体。
在一些实施方案中，测试本发明的抗体的一种或多种上述特性。
用于任何所述体外测定的细胞包括天然表达TNFR2或被工程化以表达TNFR2的细胞或细胞系。在一个实施方案中，细胞是293或293T细胞系或T细胞。
值得注意的是，上述任何检测都可以使用本发明的免疫缀合物来代替或补充抗TNFR2抗体。
值得注意的是，上述任何一种检测方法都可以使用抗TNFR2抗体和其他试剂进行。
免疫缀合物
在一些实施方案中，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含本文提供的任何抗TNFR2抗体或其抗原结合片段和其他活性剂，例如治疗剂，包括化疗剂、其他抗体、细胞毒类药物、疫苗、抗感染剂、小分子实体或免疫调节剂(例如，抗炎剂或免疫抑制剂)。在一个实施方案中，其他活性剂例如细胞毒类药物包括对细胞有害的任何活性剂。在一些实施方案中，免疫缀合物用于诊断、预防或治疗癌症或感染。
药物组合物、制剂或组合产品
本发明进一步提供了一种药物组合物，或药物制剂，或它们的组合产品，其包含抗TNFR2抗体或其抗原结合或其免疫缀合物，或所述核酸编码抗TNFR2抗体或其片段。
这样的组合物、制剂或组合产品可以进一步包含合适的药物辅助剂，例如药物载体、赋形剂等本领域已知的，包括缓冲剂。
适用于本发明的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油，或动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油，等等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。
合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。
如果需要，该组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。
对于药物辅助剂的用途，参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第八版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
组合物可以采用溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。
本发明的组合物可以是各种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体形式，例如液体溶液(例如，可注射溶液和不溶性溶液)、分散体或悬浮液、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的给药方式和治疗用途。通常优选的是可注射溶液或不溶性溶液的形式。优选的给药方式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内(i.p.)、肌肉内)注射或输注。在一个优选的实施方案中，抗体分子通过静脉输注或注射给药。在另一个优选的实施方案中，通过肌内、腹膜内或皮下注射施用抗体分子。
具有所需纯度的本发明抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种任选的药物佐剂混合以制备本发明抗体的药物制剂。药物制剂优选为冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含多于一种待治疗的特定适应症所需的活性成分，优选具有互补活性而不会对彼此产生不利影响的活性成分。例如，需要进一步提供其他治疗剂，例如化疗剂、其他抗体、细胞毒类药物、疫苗、抗感染剂、小分子实体或免疫调节剂。活性成分以对预期目的有效的量适当地组合。活性成分可以是本领域已知的并且能够与抗TNFR2抗体组合的任何物质。在一个实施方案中，另一种抗体是PD-1抗体或PD-L1抗体，例如人PD-1抗体或人PD-L1抗体。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质为成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。
本发明进一步提供组合产品，其包含本发明的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，以及其他治疗剂，例如化疗剂、其他抗体、细胞毒类药物、疫苗、抗-感染剂、小分子实体或免疫调节剂。在一个实施方案中，另一种抗体是PD-1抗体或PD-L1抗体。
用途及方法
一方面，本发明提供了一种调节受试者免疫反应的方法。
另一方面，本发明提供了一种用于激活T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性的方法。在一个实施方案中，T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在一个实施方案中，T细胞的活化包括刺激T细胞的细胞因子分泌，例如T细胞的IFN-γ分泌。
在另一个实施方案中，T细胞的活化包括刺激T细胞的增殖。
另一方面，本发明涉及预防或治疗受试者的肿瘤(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。
在一个实施方案中，癌症患者的TNFR2蛋白表达水平增加，或编码TNFR2蛋白的核酸水平增加。
在一些实施方案中，肿瘤，例如癌症，包括实体瘤和血液肿瘤和转移性病变。在一个实施例中，实体瘤的实例包括恶性肿瘤。癌症可以是早期、中期或晚期或转移性癌症。在一些实施方案中，肿瘤是需要T细胞活化的肿瘤，例如癌症，例如伴随T细胞功能障碍的肿瘤或癌症。
优选地，所述癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤非霍奇金淋巴瘤和卵巢癌、胃肠道癌症，例如结直肠癌、直肠癌或结肠癌.
在一些实施方案中，肿瘤治疗将受益于
(i)TNFR2核酸或蛋白质水平的抑制；
(ii)阻断TNFR2与其配体如TNF-α的结合，
(iii)T细胞的活化，例如增加细胞因子如IFN-γ的分泌，增加CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖；
(iv)以上任何一项或多项的组合。
在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗受试者的感染性疾病的方法。
在一些实施例中，感染是急性的或慢性的。在一些实施方案中，慢性感染是持续感染、潜伏感染或缓慢感染。在一些实施方案中，慢性感染由选自细菌、病毒、真菌和原生动物的病原体引起。
在一些实施方案中，上述方法包括施用本发明的抗体或抗原结合片段、免疫缀合物、药物组合物或制剂、组合产品或核酸。
在一些实施方案中，上述方法还包括向所述受试者联合一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其他治疗剂，优选地，所述治疗方式包括手术和/或放射疗法，和/或其他选自由化学治疗剂，其他抗体，细胞毒类药物，疫苗，抗感染剂，小分子实体或免疫调节剂组成的组的治疗剂。
在一个实施例中，调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。
在一个实施方案中，抗体可以是结合免疫检查点分子的抗体。在一个实施方案中，另一种抗体是PD-1抗体或PD-L1抗体。
在一些实施方案中，本文所述的抗体组合可以单独施用，例如，作为单独的抗体，或连接的(例如，作为双特异性或三特异性抗体分子)。
此类联合治疗包括联合施用(例如，两种或更多种治疗剂包含在同一制剂或分开的制剂中)和分开施用。在一个实施方案中，本发明的抗体的施用发生在其他一种或多种疗法的施用之前、同时和/或之后。
受试者可以是哺乳动物，例如灵长类动物，优选高等灵长类动物，例如人(例如患有或有患本文所述疾病的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者需要增强的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是抗肿瘤应答。在一个实施方案中，受试者患有或有风险患有本文所述的疾病(例如，本文所述的肿瘤或感染性疾病)。
在其他方面，本发明提供了抗TNFR2抗体或其片段或其免疫缀合物在制造或制备用于上述用途例如预防或治疗上述相关疾病或适应症的药物中的用途。
实施例
实施例1通过杂交瘤筛选产生TNFR2结合抗体
通过交替注射hTNFR2-mFc蛋白(SEQ ID NO:45)和表达人TNFR2(SEQ ID NO:48)的CHO-K1细胞系来免疫五只SJL(Charles River)小鼠。根据表1中的免疫程序，通过每2周交替注射蛋白质和细胞实施4轮免疫。通过针对TNFR2蛋白HuTNFR2-huFc(SEQ ID NO:46)的ELISA和针对稳定表达人TNFR2(SEQ ID NO:48)的293T细胞系的FACS测试第2次、第3次和第4次免疫后免疫小鼠的血液。
表1免疫程序
根据ELISA和FACS的结果，选择小鼠5#作为随后融合步骤的脾细胞来源。结果表明，5#小鼠血清在细胞阻断试验中抑制TNF-α(ACRO Biosystem，Cat#TNA-H5228)与TNFR2结合的能力最强。
进行一次电融合。融合的细胞接种在96孔板上。通过ELISA和FACS筛选阳性克隆。人TNFR1蛋白(Acro Biosystem，Cat#TN1-H5222)、人LTBR(ACRO Biosystem，Cat#LTR-H5251)、人骨保护素(ACRO Biosystem，Cat#TNB-H5220)用于反向筛选。阳性克隆扩增到24孔板中。收集上清液用于进一步确认筛选。根据结果筛选出15个克隆进行测序。实施例4详细说明了筛选的具体程序。
实施例2杂交瘤的测序和相应序列
通过聚合酶链反应(PCR)扩增技术获得小鼠抗人TNFR2抗体轻链和重链可变区的序列。使用RNAprep pure Cell Kit(TIANGEN,Cat#DP430)从15种抗体中分离出总RNA，并使用Fast King gDNA Dispelling RT Super Mix(TIANGEN,Cat#KR118)合成cDNA。通过PCR克隆重链和轻链可变区。所有PCR均使用高保真聚合酶进行。将PCR扩增的每种抗体的DNA克隆到TA克隆载体中，由金唯智进行测序。
小鼠抗体克隆32A1D5和43B7A4可变区的氨基酸序列如下：
>32A1D5重链可变区(32A1D5-VH):SEQ ID NO:7
>32A1D5轻链可变区(32A1D5-VL):SEQ ID NO:8
>43B7A4重链可变区(43B7A4-VH):SEQ ID NO:15
>43B7A4轻链可变区(43B7A4-VL):SEQ ID NO:16.
实施例3嵌合抗体的表达和纯化
建立了产生15种嵌合IgGl抗体的方法。序列分析后，嵌合抗体的可变区是基于上述序列通过基因合成(金斯瑞)产生的。将轻链可变区插入包含编码SEQ ID NO:42所表示的轻链恒定区的核酸(SEQ ID NO:41)的表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中，以构建表达抗体轻链的载体，将重链可变区插入包含编码SEQ ID NO:40所表示的重链恒定区的核酸(SEQID NO:39)的表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中，以构建表达抗体重链的载体。使用EndoFree Midi Plasmid Kit(TIANGEN,Cat#DP108)提取质粒。此外，根据制造商的说明，使用ExpiCHOTM表达系统(ThermoFisher，Cat#A29133)将重链和轻链载体以1:1的比例共转染到CHO-S细胞中。将转染的细胞在ExpiCHOTM表达培养基中培养12天，然后收集培养上清液并用蛋白A亲和层析(GE Healthcare)进行纯化。
在尺寸排阻色谱法中测试了所有15个克隆。将来自每个克隆的20μg样品注射到TSK G3000SWXL柱中，使用100mM磷酸钠+100mM Na2SO4，pH 7.0，作为运行缓冲液。运行时间为30分钟。所有测量均在Waters e2695 HPLC上进行。使用OpenLAB软件分析数据。13个克隆的主峰在SEC中均在95％以上，表明纯化的嵌合抗体具有高纯度和完整性。
实施例4嵌合抗体的筛选和鉴定
通过ELISA结合、细胞水平阻断实验进一步测试了所有15种嵌合抗体。还测试了抗体与TNFR2阴性细胞的非特异性结合，这表明抗体不与细胞表面上没有人TNFR2表达的细胞结合。
抗TNFR2抗体与人/食蟹猴TNFR2蛋白结合
人TNFR2，人Fc标签蛋白(huTNFR2-huFc，SEQ ID NO:46)或食蟹猴TNFR2，人Fc标签蛋白(cyno-TNFR2-huFc，SEQ ID NO:47)通过在PBS(Hyclone，Cat#SH30256.01)中于4℃孵育过夜被固定在96-孔板(杭州欣友，Cat#100096H)。然后通过与PBS中的1％BSA在37℃下孵育1小时来封闭板。封闭后，将板用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤3次。在稀释缓冲液(含有0.05％吐温和0.5％BSA的PBS)中制备逐级稀释的实施例3中获得的抗TNFR2抗体和阴性对照IgG(重链：SEQ ID NO：43，轻链：SEQ ID NO：44，WO2008068246A1)，并与上述固定蛋白在稀释缓冲液中37℃孵育1小时。然后，将板用PBST洗涤3次，与在稀释缓冲液中1/20000稀释的Peroxidase AffiniPure山羊抗人IgG,F(ab')2片段特异性(JacksonImmunoResearch，Cat#109-035-097)一起在37℃下孵育一小时，然后再次用PBST洗涤。将50μL/孔TMB(Thermo，Cat#34028)加入板中，15分钟后，用1M H2SO4终止反应。测定在450nm-620nm处的吸光度。与人/食蟹猴TNFR2结合的克隆的EC50和代表性结合曲线如图1所示。
结果表明两种嵌合抗体32A1D5和43B7A4可以结合人(EC50分别为0.04820nM和0.06272nM)和食蟹猴TNFR2蛋白(EC50为0.008201nM和0.008974nM)。
抗TNFR2抗体与在293T细胞的细胞表面上表达的食蟹猴TNFR2结合
建立了基于细胞的结合测定以确定本发明的抗人TNFR2抗体是否可以结合在细胞表面上表达的食蟹猴TNFR2。使用LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen，Cat#11668019)，用编码食蟹猴TNFR2蛋白(SEQ ID NO:49)的核苷酸转染293T细胞系。在使用二盐酸嘌呤霉素(Gibco,Cat#A1113802)筛选细胞后，选择了高表达食蟹猴TNFR2的细胞库。将抗TNFR2抗体32A1D5的八点逐级稀释液(逐级稀释液，浓度从20μg/mL开始，稀释4倍)加入细胞中，所得混合物在PBS中4℃孵育30分钟。然后用PBS洗涤细胞两次。使用R-PE偶联的AffiniPure山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-116-098)作为二级试剂检测抗TNFR2抗体与293T细胞上表达的食蟹猴TNFR2的结合活性，其中混合物在4℃下孵育30分钟，然后用PBS洗涤两次。然后，将细胞重新悬浮在PBS中。使用BD AccuriC5流式细胞仪(BD Bioscience)进行TNFR2结合分析。结果如图2A所示。
结果表明，抗体32A1D5特异性结合细胞表面表达的食蟹猴TNFR2，EC50为0.9682nM。
抗-TNFR2抗体阻断了TNF-α与293T细胞细胞表面表达的人TNFR2的结合
进行基于细胞的测定以确定本发明的抗人TNFR2抗体是否可以阻断TNF-α与细胞表面表达的人TNFR2的结合。使用LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen，Cat#11668019)用编码人TNFR2蛋白(SEQ ID NO:48)的核苷酸分子转染293T细胞系。使用二盐酸嘌呤霉素(Gibco,Cat#A1113802)筛选后选择高表达人TNFR2的细胞克隆。将浓度从20μg/mL开始和4倍稀释的抗TNFR2抗体(32A1D5和43B7A4)的八点逐级稀释液加入细胞中，并将混合物在PBS中于4℃孵育30分钟。然后将细胞与50μg/mL生物素-TNF-α(ACRO Biosystems,Cat#TNA-H8211)在4℃下孵育30分钟，然后用PBS洗涤两次。使用PE-链霉亲和素(Biolegend，Cat#405203)作为二级试剂检测生物素-TNF-α与293T细胞表面表达的人TNFR2的结合，其中混合物在PBS中4℃孵育30分钟然后用PBS洗涤两次。然后，将细胞重悬在PBS中。使用BDAccuri C5流式细胞仪(BD Bioscience)进行生物素-TNF-α结合分析。结果示于图2B(对于32A1D5)和图2C(对于43B7A4)。
结果表明，两种嵌合抗体可以阻断细胞表面表达的TNFR2与TNF-α的结合。
实施例5人源化抗体的产生和表征
分别对两种嵌合抗体32A1D5和43B7A4进行人源化。小鼠抗体可变域的序列用于鉴定与鼠框架具有最高同源性的人种系序列。人源化采用CDR移植和回复突变。
32A1D5人源化
根据IMGT数据库(http://www.imgt.org)，通过将6个CDR插入到最合适的人种系框架序列中来人源化抗体。轻链的人种系框架序列IGKV1-27*01和重链的IGHV2-5*09分别用于CDR移植。变异重链可变区(VH/HCVR)Hu32-H1和Hu32-H2是通过将三个CDR移植到种系序列上获得的，并对于Hu32-H2在HCVR上进行S30N的回复突变。
>IGHV2-5*09(32A1D5 VH种系序列)
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYGPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHRYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:63)
>Hu32-H1 VH序列:SEQ ID NO:25
>Hu32-H2 VH序列:
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLNTLGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDADKYYNPALKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMTGTRYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:64)
轻链可变区(LCVR/VL)Hu32-L1、Hu32-L2、Hu32-L3和Hu32-L2V是通过将三个CDRs移植到种系序列获得，并且Hu32-L2的回复突变Q38H、Y49H、T69S和F71Y，Hu32-L3的回复突变Y49H、T69S和F71Y，以及Hu32-L2V的回复突变Q38H、Y49H、T69S和F71Y和突变I83V在各自LCVR上进行。
>IGKV1-27*01(32A1D5 VL种系序列)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:65)
>Hu32-L1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKFIAWYQQKPGKVPKLLIYYTSTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYGVLWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:66)
>Hu32-L2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKFIAWYQHKPGKVPKLLIHYTSTLQPGVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDIATYYCLQYGVLWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:67)
>Hu32-L3:SEQ ID NO:26
>Hu32-L2V:SEQ ID NO:28.
43B7A4人源化
轻链的人种系框架序列IGKV3D-7*01和重链的IGHV1-18*01分别用于CDR移植。
变体重链可变区(HCVR/VH)Hu3-H1、Hu3-H2和Hu3-H3通过将三个CDR移植到种系序列上获得，Hu3-H1的回复突变V2I、V67F、M69F、T71L，Hu3-H2的V2I、M69F、T71L和Hu3-H3的V2I、V67F、T68A、M69F、T71L在各自HCVR上进行。
>IGHV1-18*01(43B7A4 VH种系序列)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:68)
>Hu3-H1
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMSWVRQAPGQGLEWMGWIHTYSGVPTYADDFKGRFTFTLDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGLYGVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:69)
>Hu3-H2
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMSWVRQAPGQGLEWMGWIHTYSGVPTYADDFKGRVTFTLDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGLYGVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:70)
>Hu3-H3:SEQ ID NO:37
轻链可变区(LCVR/VL)Hu3-L1和Hu32-L2通过将三个CDR直接移植到种系序列上获得，Hu3-L1的G68A回复突变，Hu3-L2的I58V、A60D、S63T、G68A在各自LCVR上改造。
>IGKV3D-7*01(43B7A4 VL种系序列)
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLSWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNLPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:71)
>Hu3-L1:SEQ ID NO:38
>Hu3-L2
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASENVVTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSLQPEDFAVYYCGQSYTYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:72)
将上述重链和轻链可变区的DNA合成并分别亚克隆到包含编码人IgGl重链恒定区(SEQ ID NO:40，登录号#P01857)的核苷酸(SEQ ID NO:39)的表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)和包含编码人κ轻链恒定区(SEQ ID NO:42，登录号#P01834)的核苷酸(SEQID NO:41)的pcDNA3.1之中。使用EndoFree Midi Plasmid Kit(TIANGEN,Cat#DP108)提取质粒。抗体的表达和纯化遵循实施例3中所述的程序。
人源化抗体hu32-C包含VH Hu32-H1和VH Hu32-L3，人源化抗体hu3-E包含VH Hu3-H3和VL Hu3-L1。hu32-C的变体hu32C-V1包含VH Hu32-H1和VL Hu32-L2V。
实施例6抗TNFR2人源化抗体的评价
初步评价与嵌合抗体的筛选和鉴定程序相符，包括ELISA结合、ELISA封闭、细胞封闭，如实施例4所述。基于这些结果，人源化抗体hu32-C和hu3-E被选择用于进一步的体外和体内功能评估。
ELISA结合测定按照实施例4进行，不同之处在于抗TNFR2抗体是hu32-C和hu3-E，包被蛋白被人TNFR2、小鼠Fc-标签(SEQ ID NO：45)替代。
人源化抗体与人TNFR2蛋白结合的结果见图3A(hu32-C)和图3B(hu3-E)。
结果显示两种人源化抗体均能特异性结合人TNFR2，EC50为0.06970nM(hu32-C)和0.05079nM(hu3-E)。
抗-TNFR2抗体阻断了TNFR2和TNF-α之间的相互作用
高结合透明聚苯乙烯96孔板用在碳酸盐缓冲液中的1μg/mL人TNF-α蛋白、his标签(Acro Biosystem,Cat#TNA-H5228)以50μL/孔在4℃孵育过夜包被。然后使用洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween 20)在自动洗板机上洗涤板一次。每孔加入200μL封闭缓冲液(PBS+1％BSA)，室温孵育1小时。用稀释缓冲液(PBS+0.5％牛血清白蛋白+0.05％吐温20)制备逐级稀释抗体(hu32-C和hu3-E)和阴性对照IgG(起始浓度：20μg/mL(混合前浓度)，4倍稀释)并以1:1的体积比与0.1μg/mL(混合前浓度)hTNFR2-mFc(SEQ ID NO:45)混合，然后将混合稀释液加入96孔板中并在稀释缓冲液(含有0.05％吐温20和0.5％牛血清白蛋白的PBS)中在室温下孵育1小时。在自动洗板机上用洗涤缓冲液将板洗涤两次。然后将稀释缓冲液中的50μL/孔的HRP偶联山羊抗小鼠Fc抗体(Jackson Immunoresearch，目录号#115-035-164)加入板的每个孔中。之后，将ELISA板在RT温育60分钟，然后用250μL/孔洗涤缓冲液洗涤板两次。最后，每孔加入50μL/孔的TMB，用1M H2SO4终止反应。测定在450nm-620nm处的吸光度。
人源化抗体阻断人TNFR2与TNFα结合的结果可见于图3A(hu32-C)和图3B(hu3-E)。
结果显示两种人源化抗体可以阻断TNFR2与TNF-α的结合。
还检测了人源化抗体结合细胞表面食蟹猴TNFR2和阻断TNF-α结合细胞表面人TNFR2的能力。测定步骤与实施例4一致。基于细胞的测定结果如图4所示。
基于细胞的测定结果显示人源化抗体hu32-C和hu3-E均具有结合TNFR2和阻断TNF-α-TNFR2相互作用的能力。
实施例7抗TNFR2抗体的结合亲和力
在该实施例中，使用ForteBio Octet RED 96(生物层干涉测量法)测定抗人TNFR2抗体的结合亲和力(单价KD)。
简而言之，IgG Fc捕获传感器尖端(ForteBio，Cat#18-5060)在室温下在PBS中水合10分钟。动力学分析在96孔板中进行，每个步骤使用以下时间进行：a)在PBS中平衡基线100秒，b)加载抗人TNFR2抗体(hu3-E、hu32-C和hu32C-V1)至至少0.3纳米，c)平衡基线1000秒，d)与带有His标签的人TNFR2(Sino Biological，Cat#10417-H08H)或食蟹猴TNFR2(SinoBiological，Cat#90102-C08H)以逐级浓度为100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM和1.56nM分别缔合80秒，和e)在PBS中解离600秒。使用Octet软件对数据集进行1:1全局拟合模型拟合。
测定了三种抗人TNFR2抗体的亲和力并将其列于如下表3中。
Table 3.Affinities of anti-TNFR2 antibodies to recombinant human andcynomolgus monkey TNFR2
结果表明，这三种抗体都与人类TNFR2特异性结合。其中，抗体hu3-E显示出对人TNFR2的5.32nM的单价KD，对食蟹猴TNFR2为3.62nM；抗体hu32-C显示出对人TNFR2的0.61nM的单价KD，对食蟹猴TNFR2为0.37nM；抗体hu32C-V1显示出对人TNFR2的0.91nM的单价KD，对食蟹猴TNFR2为0.41nM。
实施例8人源化抗体的体外评价
共刺激人CD8+T细胞释放IFNγ
人PBMC获自健康供体。在含有Lymphoprep密度梯度试剂(StemCellTechnologies)的SepMate-50管(StemCell Technologies)中分离单个核细胞。
根据制造商的说明，用阴性选择试剂盒(Miltenyi,Cat#130-096-495)纯化总CD8+T细胞。96孔板(Corning，Cat#3799)用0.5μg/mL功能级抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)和逐级稀释的抗TNFR2抗体(hu3-E和hu32-C)或阴性对照IgG(从60μg/mL的起始浓度稀释和3倍逐级稀释)在PBS中于4℃过夜包被。第二天，用DPBS缓冲液(Hyclone，Cat#SH30256.01)洗涤包被的板两次。向每个孔中加入200μl培养基(包含90％RPMI 1640(Gibco，Cat#22400)完全培养基，10％FBS(Gibco，Cat#10099-141)和1μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend，Cat#302934))中的1×105CD8+T细胞，，37℃培养72h。收集培养物上清液并用ELISA试剂盒(R&D Systems，Cat#DY202)测试IFNγ水平。结果如图5所示。图中的测定缓冲液指PBS中仅含有0.5μg/ml功能级抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)。
结果表明，hu3-E可以以剂量依赖性方式刺激CD8+T细胞释放IFNγ，而hu32-C在上述浓度下无明显作用。
抗TNFR2抗体共刺激介导的T细胞增殖
人PBMC获自健康供体。在含有Lymphoprep密度梯度试剂(StemCellTechnologies)的SepMate-50管(StemCell Technologies)中分离单个核细胞，如上所述。使用阴性选择试剂盒(Miltenyi，Cat#130-096-495和Cat#130-096-533)纯化总CD8+和CD4+T细胞以备后用。96孔板(Corning，Cat#3799)用0.5μg/ml功能级抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)和逐级稀释的抗TNFR2抗体(hu3-E和hu32-C)或阴性对照IgG(从60μg/mL的起始浓度稀释和3倍逐级稀释)在PBS中于4℃过夜包被。第二天，用DPBS缓冲液(Hyclone，Cat#SH30256.01)洗涤包被的板两次。在每孔中加入200μl培养基(包含90％RPMI 1640(Gibco，Cat#22400)完全培养基，10％FBS(Gibco，Cat#10099-141)和1μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend),Cat#302934))中的1×105CD8+或CD4+T细胞，37℃培养72h。72小时后，弃去每孔100μl细胞培养上清液，加入100μl发光细胞活力测定试剂(Promega，Cat#G7572)并充分混合。5分钟后，将100μl混合物转移到新的96孔检测板(Corning，Cat#3917)。使用酶标仪F200(Tecan,Cat#F200)读取测定板。结果如图6所示。图中的检测缓冲液指仅含有0.5μg/ml功能级抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)包被缓冲液。
结果进一步证实了hu3-E可以刺激T细胞增殖，而hu32-C在上述浓度下没有明显作用。
体外抗TNFR2抗体共刺激介导的T细胞活化依赖于Fc交联
人PBMC获自健康供体。在含有Lymphoprep密度梯度试剂(StemCellTechnologies)的SepMate-50管(StemCell Technologies)中分离单个核细胞。
总CD8+T细胞用阴性选择试剂盒(Miltenyi，Cat#130-096-495)纯化以备后用。96孔板(Corning，Cat#3799)用0.5μg/ml功能级抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)和逐级稀释的抗TNFR2抗体(hu3-E和hu32-C)或阴性对照IgG(从30μg/mL的起始浓度稀释，并3倍逐级稀释)在4℃过夜包被，用于板结合抗体测定。对于可溶性抗体测定，96孔板仅用0.5μg/ml功能级抗CD3包被。
第二天，用DPBS缓冲液(Hyclone，Cat#SH30256.01)洗涤包被的板两次。对于板结合抗体测定，向每孔加入200μl培养基(包含90％RPMI 1640(Gibco,Cat#22400)完全培养基、10％FBS(Gibco,Cat#10099-141)和1μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend，Cat#302934))中的1×105CD8+T细胞，37℃培养72h。
对于可溶性抗体测定，向每个孔中添加在200μl培养基(包含90％RPMI 1640(Gibco,Cat#22400)完全培养基、10％FBS(Gibco,Cat#10099-141)和1μg/ml可溶性抗CD28(Biolegend,Cat#302934))中的1x105CD8+T细胞，然后分别加入逐级稀释的抗TNFR2抗体(hu3-E和hu32-C)和阴性对照IgG(从30μg/mL的起始浓度稀释和3倍逐级稀释)培养物于37℃培养72h。72小时后，收集培养上清液并用ELISA试剂盒(R&D Systems，Cat#DY202)检测IFNγ水平，结果如图7所示。
结果表明hu3-E可以通过体外共刺激激活T细胞，这取决于Fc交联。
实施例9人源化抗体在大鼠体内的药代动力学
评价了大鼠中抗TNFR2人源化抗体的药代动力学特征。研究中涉及动物护理和使用的程序由PhamaLagancy审查和批准。
每种抗体使用三只未经处理的大鼠(上海Sippr-BK实验动物有限公司)。在研究中，抗TNFR2抗体(hu3-E、hu32-C)分别以10mg/kg的单剂量静脉注射到大鼠体内。在0到336小时的一系列时间点(0-14天，第0天、第1天的10分钟、30分钟、1小时、4小时、6小时和第2天、第4天、第7、第10天和第14天)获取血样。所有样品均经处理获得血清，血清在-70～-86℃冷冻保存待分析。测定血清中存在的抗-TNFR2抗体的浓度。药代动力学参数列于表4中。
人TNFR2，人Fc标签蛋白(huTNFR2-huFc，SEQ ID NO:46)通过在PBS(Hyclone,Cat#SH30256.01)中以0.5μg/mL的浓度4℃过夜固定在96孔板上(Costar,Cat#42592))。然后通过与PBS中的1％BSA在37℃下孵育1小时来封闭板。封闭后，将板用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤3次。抗TNFR2抗体(hu32-C或hu3-E)在血清稀释缓冲液(含有0.05％Tween 20和0.5％BSA的PBS，包括2％v/v大鼠血清)中稀释为0.12μg/mL，并3倍逐级稀释6次，共7个浓度的抗体溶液获取作为标准曲线。同时用血清稀释缓冲液分别稀释40ng/mL、4ng/mL和0.4ng/mL抗体作为高、中、低质控。所有大鼠血清样品均用预剂量混合大鼠血清和稀释缓冲液(含0.05％Tween 20和0.5％BSA的PBS)稀释，使终浓度保持在40-0.4ng/mL范围内，并在样品稀释液中含有2％v/v大鼠血清。将标准曲线、质控品和样品加入平板中，37℃孵育1小时。然后，将板用PBST洗涤3次，与以1/20,000稀释在稀释缓冲液中的过氧化物酶AffiniPure羊抗人IgG,F(ab')2片段特异性(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-035-097)一起在37℃下孵育一小时，然后再次用PBST洗涤。将50μL/孔TMB(Thermo，Cat#34028)加入板中，15分钟后，用1M H2SO4停止反应。测定在450nm-620nm处的吸光度。
表4.大鼠抗TNFR2抗体的PK参数
两种人源化抗体hu32-C和hu3-E在大鼠体内的药代动力学均正常。
实施例10与TNFR超家族蛋白的同家族交叉结合
虽然杂交瘤克隆不能与TNFR1、LTβR和骨保护素结合，但存在其他类型的TNFR超家族蛋白。在这里，我们测试了人源化抗体hu3-E和hu32-C与人4-1BB、CD40、OX40、GITR、CD27和HVEM蛋白的结合。
4-1BB(Sino Biological,Cat#10041-H08H)、CD40(Sino Biological,Cat#10774-H08H)、OX40(Sino Biological,Cat#10481-H08H)、GITR(Sino Biological,Cat#13643-H08H)、CD27(Sino Biological,Cat#10039-H31H)和HVEM(Sino Biological,Cat#10334-H03H)通过与PBS(Hyclone,Cat#SH30256.01)在4℃下孵育过夜而固定在96孔板上。将平板与PBS中的1％BSA在37℃下孵育1小时进行封闭。封闭后，将板用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤3次。在稀释缓冲液(含0.05％Tween20和0.5％BSA的PBS)中制备逐级稀释的抗TNFR2抗体(起始浓度0.4μg/mL，3倍稀释)并加入平板中，然后在37℃下孵育1小时。然后用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤板3次。然后将在稀释缓冲液中以1:20000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗人F(ab’)2IgG(JacksonImmuno Research，Cat#109-035-097)添加到板的每个孔中，作为ELISA板。之后，将ELISA板在RT温育60分钟，然后用PBST洗涤3次。最后，将50μL/孔TMB(Thermo,Cat#34028)添加到每个孔中，并使用1M H2SO4终止反应。在微孔板读数器上在450nm处读取板。
结果显示在图8中。这表明人源化抗体hu3-E和hu32-C不结合人4-1BB、CD40、OX40、GITR、CD27或HVEM蛋白。
实施例11抗TNFR2抗体具有体内抗肿瘤作用
在患有结肠癌的hTNFR2 KI小鼠中研究了抗TNFR2抗体的体内功效。
对于本文的实验，使用了表达人TNFR2细胞外部分的4-5周人源化小鼠C57BL/6J-Tnfrsf1bem2(hTNFRSF1B)Smoc(上海南方模式生物科技股份有限公司)
使用逆转录病毒转导，用编码卵清蛋白(OVA GenBank:AAB59956.1)的核酸转导MC38细胞(和元生物技术(上海)股份有限公司)。随后通过有限稀释克隆细胞。选择高表达OVA蛋白的克隆作为MC38-OVA克隆。MC38-OVA克隆保持在含有10％胎牛血清和4μg/mL嘌呤霉素(Gibco，Cat#A11138-03)的DMEM(Gibco，Cat#11995-065)中。
将5-6周的C57BL/6J-Tnfrsf1bem2(hTNFRSF1B)Smoc小鼠皮下植入1x106MC38-OVA细胞,并在第0天平均肿瘤体积达到约60mm3(LengthxWidth2/2)时随机分为3组。在第0、3、7、10天分别腹腔注射hu32-C(15mg/kg)、hu3-E(15mg/kg)和PBS。在研究过程中，每周两次使用卡尺测量肿瘤体积。
与PBS组相比，用两种抗TNFR2抗体处理均导致显著的肿瘤生长抑制。数据如下表5所示。
表5.MC38-OVA肿瘤生长抑制
a肿瘤体积数据表示为平均值±SEM；
bTGI＝(1-治疗组相对肿瘤体积/PBS组相对肿瘤体积)*100％
c与PBS组相比，进行双向方差分析，然后进行Tukey多重比较检验。
实施例12 hu32-C纯度的改进
在FR区上进行单点突变以提高hu32-C的纯度。在hu32-C轻链的FR区进行Q38H和I83V取代，得到抗体，命名为hu32C-V1。hu32-C和hu32C-V1都在相同的产物下表达和纯化，如实施例3中所述。产物的纯度通过SEC-HPLC测定并且亲和力通过Fortebio测定(如实施例7中所述)。SEC-HPLC结果见图9，亲和结果见表3。
从结果可以看出，hu32C-V1的亲和力与hu32-C一致，而表达产物的纯度得到显著改进。在SEC-HPLC上，抗体主峰的比例从91.4％(hu32-C)增加到97.0％(hu32C-V1)。
结果表明，I83V突变可以提高抗体hu32-C的纯度，同时不影响其性质如亲和力。
实施例13表位作图
为了检测本发明的人源化抗体与其靶蛋白人TNFR2上结合的表位，构建了来自人TNFR2(SEQ ID NO:50)胞外域的11个片段以分别替换小鼠TNFR2蛋白的胞外结构域(SEQ IDNO:51)的相应部分。结果，获得了11个小鼠TNFR2变体(SEQ ID NO:52-62)，其中人TNFR2的每个片段替换了相应区域。
构建了十一个TNFR2蛋白质区段序列并列在下表6中，如下。
表6：来自人氨基酸序列的片段和序列编号。
根据结合测定ELISA，测试了11个变体、人TNFR2和小鼠TNFR2蛋白与本发明的抗体(hu3-E和hu32C-V1)的结合。将不同的TNFR2蛋白以0.5μg/mL包被在板上并封闭过夜。抗体从0.4μg/mL的起始浓度开始稀释，3倍逐级稀释，加入微量板中，37℃孵育。后续步骤与ELISA结合方法一致(见实施例4)。
结合测定的结果显示hu3-E和hu32C-V1均与人TNFR2结合，但不与小鼠TNFR2结合。
结果进一步表明，人源化抗体hu3-E结合人TNFR2在1L-31C上的表位(结合019-0-0.5)。人源化抗体hu3-E不与人TNFR2蛋白变体019-1、019-2、019-3、019-4、019-5、019-6、019-0.5-1和019-0.5-2结合，除了019-0-0.5和019-0-1.因此，根据人TNFR2的晶体结构分析，对人TNFR2分别进行Q4A、E13A、S16A和Q26A的氨基酸突变，并按照上述步骤在ELISA结合法中检测与hu3-E的结合.结果表明，人TNFR2序列第26位谷氨酰胺是hu3-E与人TNFR2结合的关键氨基酸。hu3-E抗体结合不同TNFR2的结果见图10。
另一种人源化抗体hu32-C结合1L-96C(结合019-12)TNFR2蛋白。突变体hu32C-V1具有与hu32-C相同的人TNFR2结合表位。hu32C-V1抗体与不同TNFR2片段结合的结果如图11所示。人源化抗体hu32C-V1仅结合019-12，其他人TNFR2蛋白变体019-2、019-3、019-4、019-5、019-6、019-0.5-1、019-0.5-2和019-0-0.5不与hu32C-V1结合。此外，019-1和019-0-1显示出微弱但不可忽略的与hu32C-V1结合的信号，这表明序列17T-54D可能包含了hu32C-V1的表位中的氨基酸。
实施例14与或不与抗小鼠PD1抗体组合、和有或没有Fc效应的抗TNFR2抗体在体内 的抗肿瘤作用
在患有结肠癌的hTNFR2 KI小鼠中研究了抗TNFR2抗体的体内功效。
构建了具有L234A，L235A，D265A，P329A(EU编号)的氨基酸突变(去除Fc功能)的抗TNFR2抗体Hu3-E(mu)。抗体的表达和纯化遵循如实施例3中所述的步骤。
对于此实验，表达人TNFR2胞外部分的4-5周人源化小鼠C57BL/6J-Tnfrsf1bem2 (hTNFRSF1B)Smoc购自上海南方模式生物科技股份有限公司。
使用逆转录病毒转导，用编码卵清蛋白(OVA GenBank:AAB59956.1)的核酸转导MC38细胞(和元生物技术(上海)股份有限公司)。随后通过有限稀释克隆细胞。选择高表达OVA蛋白的克隆作为MC38-OVA克隆。将MC38-OVA克隆维持在含有10％胎牛血清和4μg/mL嘌呤霉素(Gibco，Cat#A11138-03)的DMEM(Gibco，Cat#11995-065)中。
5-6周的C57BL/6J-Tnfrsf1bem2(hTNFRSF1B)Smoc小鼠皮下植入1x106MC38-OVA细胞，并在第0天平均肿瘤体积达到80-100mm3(LxW2/2)时随机分为6组。在第0、3、7、10、14天，分别对小鼠腹腔注射hu3-E(mu)(10mg/kg)、hu3-E(3mg/kg)、hu3-E(10mg/kg)、抗PD1抗体(Bio XCell，Cat#BE0146)(1mg/kg)、抗PD1抗体(1mg/kg)与hu3-E(10mg/kg)联用以及PBS。在研究期间每周两次通过卡尺测量监测肿瘤体积。每组6只小鼠。
与PBS组相比，两种抗TNFR2抗体的处理都导致显著的肿瘤生长抑制。Fc部分与hu3-E的功效直接相关。通过突变去除Fc-FcγR相互作用会降低抗TNFR2抗体的抗肿瘤作用；同时，抗TNFR2抗体与抗PD1抗体联用显示出显著的抗肿瘤作用。联合使用效果优于单独使用这两种抗体。分组细节和结果如下表7所示。
表7.MC38-OVA肿瘤生长抑制
a肿瘤体积数据表示为平均值±SEM；
bTGI＝(1-治疗组相对肿瘤体积/PBS组相对肿瘤体积)*100％
cP<0.01与PBS组显著不同(Dunnett的多重比较检验).
实施例15抗TNFR2抗体与活化的PBMC上表达的人TNFR2结合
建立了基于细胞的结合测定以确定本发明的抗人TNFR2抗体是否可以结合在活化的PBMC上表达的人TNFR2。人PBMC来自健康供体。PBMC通过包被的功能级抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85，1μg/mL)刺激2天，然后用完全培养基(包含90％RPMI1640HEPES(Gibco，Cat#22400089)和10％FBS(Gibco，Cat#10099-141))培养。然后再将100IU/mL IL-2添加到培养基中再培养7天。然后收集PBMC并使用PBS(Hyclone，Cat#SH30256.01)洗涤两次。1.5×105PBMC细胞分别用逐级稀释的抗TNFR2抗体hu3-E(从起始浓度20μg/ml稀释，4倍逐级稀释)和阴性对照IgG重悬，4℃孵育30分钟。使用PBS洗涤后，用R-PE偶联的AffiniPure山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性(Jackson ImmunoResearch，Cat#109-116-098)作为二级试剂(1:200稀释)重悬细胞。将混合物在PBS中于4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤两次。然后，将细胞重悬于PBS中。使用BD Accuri C5流式细胞仪(BD Bioscience)进行特异性结合的分析。
结果显示在图12中。显示hu3-E可以结合在来自两个供体的活化PBMC上表达的TNFR2。而IgG对照对来自两个供体的活化的PBMC没有特异性结合能力。
实施例16体外对Treg的ADCC效应
96孔板(Corning，Cat#3599)在4℃下用3μg/ml功能级抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)包被过夜。第二天，丢弃包被的缓冲液并且将板洗涤两次以备后用。从SchbioBiotech购买的来自健康供体的PBMC细胞被解冻并收集。根据制造商的说明，使用阴性选择试剂盒(Miltenyi，Cat#130-096-533)纯化来自PBMC细胞的总CD4+T细胞。并将纯化的CD4+T细胞以1～5×104个细胞/孔在200μL Treg诱导缓冲液(RPMI1640培养基，含10％FBS、20ng/mL TGFβ1、100IU/mL IL-2、2μg/mL anti-CD28和0.04mMβ-巯基乙醇)中接种于抗CD3包被的96孔板中，并培养5天，以获得诱导的Treg细胞供后续使用。
用阴性选择试剂盒(Miltenyi,Cat#130-092-657)根据制造商的说明从PBMC细胞中纯化总NK细胞。在ADCC测定中，体外诱导的Treg细胞在50μl测定缓冲液(含1％FBS(Gibco，Cat#10099-141)的99％MEM-α(Gibco，Cat#41061-029))中以20,000个细胞/孔添加到96孔测定板(Corning，Cat#3599)。hu3-E或hu32-C的6点逐级稀释液(逐级稀释液，最终测定浓度从1.2μg/mL开始并5倍稀释)和抗TNFR2抗体-001-H10(BioInvent，WO2020089474A1，重链：SEQ ID NO：74；轻链：SEQ ID NO：75)作为阳性对照按50μl/孔分别加入细胞。然后的纯化人NK效应细胞在100μl含有1％FBS(Gibco，Cat#10099-141)的99％MEM-α(Gibco，Cat#41061-029)中以200,000个细胞/孔和200IU/ml人重组IL-2测定缓冲液加入板中。将96孔板在37℃、5％CO2下孵育24小时。孵育后，将96孔板以低速(2000rpm)离心3分钟，使细胞沉淀沉淀。然后，从板中小心地吸出50μL/孔的上清液并转移到新的96孔板中。将等体积的LDH细胞毒性检测溶液(Roche，Cat#11644793001)加入板中并在室温下孵育30分钟。通过Infinite F50读板仪在490nm波长处读取吸光度。结果如图13所示。
结果表明hu3-E不能对诱导的Treg细胞诱导ADCC作用，而hu32-C可以诱导对细胞的ADCC作用。
实施例17体外对CD8+T细胞的ADCC效应
96孔板(Corning，Cat#3599)在4℃下用1μg/ml功能级抗CD3(eBioscience，Cat#16-0037-85)包被过夜。第二天，丢弃包被的缓冲液并且将板洗涤两次以备后用。从SchbioBiotech购买的来自健康供体的PBMC细胞被解冻并收集。根据制造商的说明，使用阴性选择试剂盒(Miltenyi，Cat#130-096-495)从PBMC细胞纯化总CD8+T细胞。将纯化的CD8+T细胞以1×105个细胞/孔在200μL检测缓冲液(含10％FBS、1μg/mL抗CD28的RPMI1640培养基)中接种到抗CD3包被的96-w板中并培养4天获得活化的CD8+T细胞供后续使用。
用阴性选择试剂盒(Miltenyi,Cat#130-092-657)根据制造商的说明从PBMC细胞中纯化总NK细胞。在ADCC测定中，体外活化CD8+T细胞在50μl测定缓冲液(99％MEM-α(Gibco，Cat#41061-029，含有1％FBS(Gibco，Cat#10099-141))以15,000个细胞/孔加入96孔测定板(Corning,Cat#3599)。hu3-E或hu32-C的6点逐级稀释液(逐级稀释液，最终测定浓度从1.2μg/mL开始并5倍稀释)和抗TNFR2抗体-001-H10(BioInvent，WO2020089474A1，重链：SEQ ID NO：74；轻链：SEQ ID NO：75)作为阳性对照以50μl/孔分别加入细胞。然后纯化人NK效应细胞在含有1％FBS(Gibco，Cat#10099-141)的100μl 99％MEM-α(Gibco，Cat#41061-029)中以150,000个细胞/孔，和200IU/ml人重组IL-2加入板中。将96孔板在37℃、5％CO2下孵育24小时。孵育后，将96孔板以低速(2000rpm)离心3分钟，使细胞沉淀沉淀。然后，从板中小心地吸出50μL/孔的上清液并转移到新的96孔板中。将等体积的LDH细胞毒性检测溶液(Roche，Cat#11644793001)加入板中并在室温下孵育30分钟。通过Infinite F50读板仪在490nm波长处读取吸光度。结果如图14所示。
结果表明hu3-E对诱导的CD8+T细胞不能诱导ADCC作用，而hu32-C可以诱导对细胞的ADCC作用。
序列表
Ig blast and abysis序列分析,结果以Kabat格式描述。
嵌合抗体序列
32A1D5序列
表I.32A1D5可变区CDR序列
SEQ ID NO: CDR 32A1D5-VH重链可变区CDR
1 CDR 1 TLGMGVG
2 CDR 2 HIWWDADKYYNPALKS
3 CDR 3 MTGTRYFDV
32A1D5-VL轻链可变区CDR
4 CDR 1 KASQNINKFIA
5 CDR 2 YTSTLQP
6 CDR 3 LQYGVLWT
>32A1D5-VH:SEQ ID NO:7
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTLGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDADKYYNPALKSRLTISKDTSKNHVFLKIANADTADTATYYCARMTGTRYFDVWGTGTTVTVSS
>32A1D5-VL:SEQ ID NO:8
DIQMTQSPSSLSASLGDKVTITCKASQNINKFIAWYQHKPGEGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGSDYSFSINNLEPEDIASYYCLQYGVLWTFGGGTKLEIK
43B7A4序列
表II.43B7A4可变区CDR序列
SEQ ID NO CDR 43B7A4-VH重链可变区CDR
9 CDR 1 TYGMS
10 CDR 2 WIHTYSGVPTYADDFKG
11 CDR 3 GLYGVDY
43B7A4-VL轻链可变区CDR
12 CDR 1 KASENVVTYVS
13 CDR 2 GASNRYT
14 CDR 3 GQSYTYPYT
>43B7A4-VH:SEQ ID NO:15
QAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTTYGMSWVKQAPGKGLKWMGWIHTYSGVPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTATYFCARGLYGVDYWGQGTTLTVSS
>43B7A4-VL:SEQ ID NO:16
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYTYPYTFGGGTTLEIK
hu32-C序列(Hu32-H1/Hu32-L3)
表III.hu32-C(Hu3-H1重链和Hu3-L3轻链)可变区CDR序列
>VH核酸序列(Hu32-H1):SEQ ID NO:23
CAGGTGACACTGAAGGAGTCTGGCCCAACCCTGGTGAAGCCCACCCAGACACTGACCCTGACATGTACCTTCTCTGGCTTTTCTCTGTCCACCCTGGGAATGGGAGTGGGATGGATCAGACAGCCACCTGGCAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCTCACATCTGGTGGGACGCCGATAAGTACTATAATCCTGCTCTGAAGTCCCGCCTGACAATCACCAAGGACACAAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACAATGACCAATATGGACCCAGTGGATACAGCCACCTACTATTGCGCTAGGATG ACAGGCACCCGGTATTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCCAGC
>VL核酸序列(Hu32-L3):SEQ ID NO:24
GACATCCAGATGACACAGAGCCCATCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACATGCAAGGCCTCCCAGAACATCAATAAGTTTATCGCTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCCACTATACCAGCACACTGCAGCCCGGCGTGCCTTCTAGGTTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCTCCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATGTGGCCACCTACTATTGTCTGCAGTATGGCGTGCTGTGGACCTTTGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAG
>hu32-C(Hu32-H1/Hu32-L3)
>VH氨基酸序列(Hu32-H1):SEQ ID NO:25
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTLGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDADKYYNPALKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMTGTRYFDVWGQGTTVTVSS
>VL氨基酸序列(Hu32-L3):SEQ ID NO:26
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKFIAWYQQKPGKVPKLLIHYTSTLQPGVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDVATYYCLQYGVLWTFGGGTKVEIK
hu32C-V1序列(Hu32-H1/Hu32-L2V)(Igblast and abysis分析,结果以Kabat格式描述)
表IV.hu32C-V1序列(Hu32-H1重链和Hu32-L2V轻链)可变区CDR
>hu32C-V1(Hu32-H1/Hu32-L2V)
VH核酸序列(Hu32-H1):SEQ ID NO:23
CAGGTGACACTGAAGGAGTCTGGCCCAACCCTGGTGAAGCCCACCCAGACACTGACCCTGACATGTACCTTCTCTGGCTTTTCTCTGTCCACCCTGGGAATGGGAGTGGGATGGATCAGACAGCCACCTGGCAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCTCACATCTGGTGGGACGCCGATAAGTACTATAATCCTGCTCTGAAGTCCCGCCTGACAATCACCAAGGACACAAGCAAGAACCAGGTGGTGCTGACAATGACCAATATGGACCCAGTGGATACAGCCACCTACTATTGCGCTAGGATG ACAGGCACCCGGTATTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACAGTGACCGTGTCCAGC
>VL核酸序列(Hu32-L2V):SEQ ID NO:27
GACATCCAGATGACACAGAGCCCATCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATCGGGTGACCATCACATGCAAGGCCTCCCAGAACATCAATAAGTTTATCGCTTGGTACCAGCACAAGCCAGGCAAGGTGCCCAAGCTGCTGATCCATTATACCAGCACACTGCAGCCCGGCGTGCCTTCTAGGTTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCTCCGACTACACCCTGACAATCTCTTCCCTGCAGCCTGAGGATGTGGCCACCTACTATTGTCTGCAGTATGGCGTGCTGTGGACCTTTGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAG
>VH氨基酸序列(Hu32-H1):SEQ ID NO:25
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTLGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDADKYYNPALKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMTGTRYFDVWGQGTTVTVSS
>VL氨基酸序列(Hu32-L2V):SEQ ID NO:28
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNINKFIAWYQHKPGKVPKLLIHYTSTLQPGVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDVATYYCLQYGVLWTFGGGTKVEIK
hu3-E(Hu3-H3/Hu3-L1)(Igblast and abysis分析,结果以Kabat格式描述)和Hu3-E(mu)((Hu3-H3/Hu3-L1,只突变Fc区,L234A，L235A，D265A，P329A(Eu编号)突变)序列
表V.hu3-E(Hu3-H3/Hu3-L1)和Hu3-E(mu)(Hu3-H3/Hu3-L1)可变区CDR序列
>VH核酸序列(Hu3-H3):SEQ ID NO:35
CAGATCCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCTTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCTGGCTACACATTCACCACATATGGCATGTCTTGGGTGAGACAGGCTCCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCTGGATTCACACATACTCCGGCGTGCCTACCTATGCCGACGACTTCAAGGGCCGCTTCGCTTTTACACTGGACACCTCTACATCCACCGCCTATATGGAGCTGAGGAGCCTGCGGTCTGACGATACCGCCGTGTACTATTGCGCTAGGGGCCTG TACGGCGTGGATTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGTCCAGC
>VL核酸序列(Hu3-L1):SEQ ID NO:36
GAGATCGTGATGACCCAGAGCCCAGCTACACTGTCTCTGTCCCCAGGAGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAAGGCTTCTGAGAACGTGGTGACATACGTGTCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCTAGGCTGCTGATCTATGGCGCTTCCAATAGGTACACCGGCATCCCAGCTCGGTTTAGCGGCTCTGGCTCCGCTACAGACTTCACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGATTTTGCCGTGTACTATTGTGGCCAGTCTTACACCTATCCTTACACATTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAG
>VH氨基酸序列(Hu3-H3):SEQ ID NO:37
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYGMSWVRQAPGQGLEWMGWIHTYSGVPTYADDFKGRFAFTLDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGLYGVDYWGQGTLVTVSS
>VL氨基酸序列(Hu3-L1):SEQ ID NO:38
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASENVVTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYTGIPARFSGSGSATDFTLTISSLQPEDFAVYYCGQSYTYPYTFGQGTKLEIK
嵌合抗体32A1D5和43B7A4，和人源化抗体hu32-C(Hu32-H1/Hu32-L3)hu32C-V1(Hu32-H1/Hu32-L2V)和hu3-E(Hu3-H3/Hu3-L1)的CH:P01857https://www.uniprot.org/uniprot/P01857
>CH核酸序列:SEQ ID NO:39
GCCAGCACCAAGGGACCATCCGTGTTCCCACTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCAGCGGAGGAACAGCCGCTCTGGGATGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACAGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTCCAGTCTTCCGGCCTGTACTCTCTGAGCTCTGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCAATACAAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGTCTTGTGATAAGACCCATACATGCCCCCCTTGTCCTGCTCCAGAGCTGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAACTCTACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACACTGCCTCCATCTCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCTTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCAGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGATAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCTTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAATCATTATACACAGAAGAGCCTGTCTCTGTCCCCTGGCAAGTAA
>CH氨基酸序列:SEQ ID NO:40
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
hu3-E(mu)CH(Hu3-H3/Hu3-L1)
>CH氨基酸序列:SEQ ID NO:73
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
嵌合抗体32A1D5和43B7A4，和人源化抗体hu32-C(Hu32-H1/Hu32-L3)hu32C-V1(Hu32-H1/Hu32-L2V)和hu3-E(Hu3-H3/Hu3-L1)和Hu3-E(mu)(Hu3-H3/Hu3-L1)的CL:P01834https://www.uniprot.org/uniprot/P01834
>CL核酸序列:SEQ ID NO:41
CGGACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGAAACAGCCAGGAAAGCGTGACAGAGCAGGATTCCAAGGATTCCACATACAGCCTGAGCAGCACACTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACACACCAGGGACTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTCAACAGAGGAGAATGCTAA
>CL氨基酸序列:SEQ ID NO:42
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
IgG(阴性对照)
WO2008068246A1福拉韦单抗
>重链氨基酸序列:SEQ ID NO:43
QVQLVESGGGAVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVILYDGSDKFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVAVAGTHFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
>轻链氨基酸序列:SEQ ID NO:44
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
huTNFR2氨基酸序列
>huTNFR2-mFc氨基酸序列:SEQ ID NO:45
MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
>huTNFR2-huFc氨基酸序列:SEQ ID NO:46
MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK-
>cyno-TNFR2-huFc氨基酸序列:SEQ ID NO:47
MAPAAVWAALAVGLELWAAGHALPAQVAFTPYAPEPGGTCRLREYYDQTAQMCCSKCPPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAQLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICHVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPAPSTAPGTSFLLPVGPSPPAEGSTGDDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK-
细胞筛选和细胞免疫表达序列
>HuTNFR2:SEQ ID NO:48
MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDFALPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQREAKVPHLPADKARGTQGPEQQHLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDSSPSESPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS-
>CynoTNFR2:SEQ ID NO:49
MAPAAVWAALAVGLELWAAGHALPAQVAFTPYAPEPGGTCRLREYYDQTAQMCCSKCPPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAQLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICHVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPAPSTAPGTSFLLPVGPSPPAEGSTGDIVLPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVI-
抗人TNFR2抗体表位作图
(信号肽加下划线)
>人TNFR2胞外域:SEQ ID NO:50
MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGD
>小鼠TNFR2胞外域:SEQ ID NO:51
MAPAALWVALVFELQLWATGHTVPAQVVLTPYKPEPGYECQISQEYYDRKAQMCCAKCPPGQYVKHFCNKTSDTVCADCEASMYTQVWNQFRTCLSCSSSCTTDQVEIRACTKQQNRVCACEAGRYCALKTHSGSCRQCMRLSKCGPGFGVASSRAPNGNVLCKACAPGTFSDTTSSTDVCRPHRICSILAIPGNASTDAVCAPESPTLSAIPRTLYVSQPEPTRSQPLDQEPGPSQTPSILTSLGSTPIIEQSTKGG
>019-1:SEQ ID NO:52
MYLGLNCVFIVFLLKGVQSVPAQVVLTPYKPEPGYTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDDCEASMYTQVWNQFRTCLSCSSSCTTDQVEIRACTKQQNRVCACEAGRYCALKTHSGSCRQCMRLSKCGPGFGVASSRAPNGNVLCKACAPGTFSDTTSSTDVCRPHRICSILAIPGNASTDAVCAPESPTLSAIPRTLYVSQPEPTRSQPLDQEPGPSQTPSILTSLGSTPIIEQSTKGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
>019-2:SEQ ID NO:53
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>019-5:SEQ ID NO:56
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>019-6:SEQ ID NO:57
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>019-12:SEQ ID NO:62
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>抗TNFR2抗体-001-H10
重链:SEQ ID NO:74EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRSSSWYRDGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
轻链:SEQ ID NO:75
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*

Claims (24)

1.一种抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含
源自重链可变区HCVR的三个重链互补决定区(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3和源自轻链可变区LCVR的三个轻链互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中HCVR由SEQ ID NO:7、15、25或37所表示的序列组成；其中LCVR由SEQ ID NO:8、16、26、28或38所表示的序列组成。
2.根据权利要求1所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含
(1)源自由SEQ ID NO:7或25表示的序列组成的重链可变区HCVR的三个LCDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及源自由SEQ ID NO:8或26或28表示的序列组成的轻链可变区LCVR的三个LCDR LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(2)源自由SEQ ID NO:15或37表示的序列组成的重链可变区HCVR的三个LCDR HCDR1、HCDR2和HCDR3；和源自由SEQ ID NO:16或38表示的序列组成的轻链可变区LCVR的三个LCDRLCDR1、LCDR2和LCDR3。
3.一种抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)分别包含或由SEQ ID NO:1、2和3所表示的序列组成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别包含或由SEQ ID NO:4、5和6所表示的序列组成的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(ii)分别由SEQ ID NO:9、10和11所表示的序列组成的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及分别由SEQ ID NO:12、13和14所表示的序列组成的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
4.一根据权利要求1至3中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:7、15、25或37所表示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:7、15、25或37所表示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或与选自SEQ ID NO：7、15、25或37组成的组的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸变化(优选氨基酸取代，更优选保守性取代)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区，更优选地，所述氨基酸变化发生在FR区，例如FR1、FR2、FR3或FR4区，以及
轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:8、16、26、28或38表示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:8、16、26、28或38表示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；或与选自SEQ ID NO：8、16、26、28或38组成的组的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5个)氨基酸变化(优选氨基酸取代，更优选保守性取代)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸变化不发生在CDR区，更优选地，所述氨基酸变化发生在FR区，例如FR1、FR2、FR3或FR4区，优选地，变化发生在FR3中的I83，特别地该变化是从I到V或它的保守性氨基酸。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)包含或由SEQ ID NO：SEQ ID NO：7表示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(2)包含或由SEQ ID NO：SEQ ID NO：15表示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(3)包含或由SEQ ID NO:SEQ ID NO:25代表的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ ID NO:26代表的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(4)包含或由SEQ ID NO：SEQ ID NO：25表示的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
(5)包含或由SEQ ID NO:SEQ ID NO:37代表的氨基酸序列组成的重链可变区，和/或由SEQ ID NO:38代表的氨基酸序列组成的轻链可变区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其进一步包含重链恒定区，和/或轻链恒定区，其中：
重链恒定区
(1)是或源自人IgG恒定区，例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgGl恒定区；
(2)包含或由与SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:73所表示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成；或者
(3)包含或由SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:73所表示的氨基酸序列组成；
和/或
轻链恒定区
(1)是或源自κ或λ轻链恒定区，例如人κ或λ轻链恒定区，优选人κ轻链恒定区；
(2)包含或由与SEQ ID NO:42所表示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成；或者
(3)包含SEQ ID NO:42所表示的氨基酸序列或由其组成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其中抗体是单克隆抗体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其中抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合片段是选自由Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、单链抗体(例如，scFv)、(Fab')2、单域抗体(例如，VHH)、或双体域抗体(dAb)或线性抗体组成的组的抗体片段。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是双特异性或多特异性抗体分子，优选地，该双特异性抗体分子结合TNFR2和免疫检查点。
11.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至10中任一项所述的抗TNFR2抗体或其片段的任何一条或多条链。
12.一种包含根据权利要求10的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。
13.一种包含权利要求12所述载体的宿主细胞，优选所述宿主细胞是原核或真核细胞，更优选选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或CHO-S细胞或293细胞)或其他合适的用于制备抗体或其抗原结合片段的细胞。
14.一种制备抗TNFR2抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适合于表达编码根据权利要求1-10任一项的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求13所述的宿主细胞，任选地所述方法进一步包括从宿主细胞回收抗TNFR2抗体或其抗原结合片段。
15.一种免疫缀合物，其包含根据权利要求1至10中任一项的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段和其他活性剂，例如治疗剂或标记物，例如细胞毒类药物。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求15所述的免疫缀合物，以及任选的药学上可接受的辅助剂。
17.组合产品，包含根据权利要求1至10中任一项的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求15的免疫缀合物，以及一种或多种其他治疗剂，例如化疗剂，其他抗体、细胞毒类药物、疫苗、抗感染剂、小分子实体或免疫调节剂，例如，其他抗体是PD-1或PD-L1抗体。
18.一种在受试者中激活T细胞或诱导T细胞介导的抗肿瘤活性或刺激T细胞增殖的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至10任一项的的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求15的免疫缀合物，或根据权利要求16的药物组合物，根据权利要求17的组合产品。
19.一种在受试者中预防或治疗癌症或感染的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求15的免疫缀合物、或根据权利要求16的药物组合物、或根据权利要求17的组合产品，优选地，所述癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤非霍奇金淋巴瘤，和卵巢癌、胃肠道癌症，例如结直肠癌、直肠癌或结肠癌。
20.如权利要求18或19所述的方法，进一步包括向所述受试者联合施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其他治疗剂，向所述受试者施用，优选地，所述治疗方式包括手术和/或放射疗法，和/或其他治疗剂选自化疗剂、其他抗体、细胞毒类药物、疫苗、抗感染剂、小分子实体或免疫调节剂，例如，其他抗体是PD-1或PD-L1抗体。
21.一种检测样品中TNFR2的方法，所述方法包括：
(A)使样品与根据权利要求1至11中任一项所述的任何抗TNFR2抗体或其抗原结合片段接触；
(B)检测抗TNFR2抗体或其抗原结合片段与TNFR2之间复合物的形成；任选地，抗TNFR2抗体被可检测地标记。
22.一种用于检测TNFR2的试剂盒，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求15的免疫缀合物。
23.一种抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其结合到被包含在人TNFR2胞外区之中的表位，所述人TNFR2胞外区包含SEQ ID NO:50或由其组成，优选地，表位包含在人TNFR2中SEQID NO：58的1L至31C的氨基酸序列中，或包含在人TNFR2中SEQ ID NO：62的1L至96C的氨基酸序列或SEQ ID NO：52的17T-54D的氨基酸序列中。
24.一种抗TNFR2抗体或其抗原结合片段，其具有下列一种或多种特性：
(1)在体外与人和/或食蟹猴TNFR2蛋白或其片段具有高亲和力结合；
(2)与表达于细胞表面的人和/或食蟹猴TNFR2结合，例如293T细胞的细胞表面，或活化的细胞，诸如抗CD3刺激的PBMC；
(3)阻断TNF-α与表达于细胞(例如293T细胞)上的人和/或食蟹猴TNFR2之间的相互作用/结合；
(4)激活(例如，人)T-细胞(例如，CD8+T细胞或CD 4+T细胞)，例如，增加细胞因子如IFN-γ的分泌，增加CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖；
(5)刺激TNFR2(例如人或食蟹猴TNFR2)的下游信号通路；
(6)增强免疫反应；
(7)在诱导的T细胞，如诱导的Treg细胞或诱导的CD8+T细胞上，不诱导ADCC作用；
(8)由于具有良好的药代动力学参数，适合作为药物中的活性成分使用；
(9)具有抗肿瘤作用，例如通过减小肿瘤体积，例如可以使肿瘤体积减小至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。
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