JP2023529010A - Ｔｎｆｒ２に結合する抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する新規抗体および抗体断片、および前記抗体または抗体断片を含む組成物に関する。また、本発明は、前記抗体またはその抗体断片をコードする核酸およびそれらを含む宿主細胞、ならびにその関連用途に関する。さらに、本発明は、治療および診断のための前記抗体および抗体断片の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する新規抗体またはその抗体断片、および該抗体またはその抗体断片を含む組成物に関する。また、本発明は、前記抗体またはその抗体断片をコードする核酸およびそれらを含む宿主細胞、ならびにその関連用途に関する。さらに、本発明は、治療および診断のための抗体または抗体断片の使用に関する。

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、様々な免疫細胞および非免疫細胞の機能を媒介可能な関連構造を有する２９受容体の大きなクラスである（Ｍａｙｅｓ ＰＡ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８年７月；１７（７）：５０９－５２）。いくつかの受容体は、免疫共刺激因子（ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０としても知られる）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０としても知られる）、ＴＮＦＲＳＦ９（４－１ＢＢとしても知られる）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７としても知られる）およびＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲとしても知られる）として役割を果たすことを特徴としている。これらの共刺激受容体は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む多くの免疫細胞型で発現でき、免疫細胞の機能、増殖、および生存を促進することが示されている。

腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）は、実質的に全てのタイプの細胞に影響を及ぼす非常に多面的なサイトカインである。これは、炎症性遺伝子発現プログラムの誘導から、細胞増殖および分化の刺激を経て、アポトーシスや壊死などの細胞自殺プログラムの活性化に至る、細胞応答を引き起こす（Ｗａｊａｎｔ Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２００３年１月；１０（１）：４５－６５．）。ＴＮＦ－αの膜貫通型と可溶型の両方とも、ＴＮＦ－α、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２の２つの既知の受容体と相互作用する。これらの２つの受容体はＴＮＦＲＳＦの異なるサブグループ（下位群）に属する。ＴＮＦＲ１は死の受容体（ＤＲ）であり、デスドメインを有する。ＴＮＦＲ２はデスドメインを持たず、プロトタイプのＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）と相互作用するＴＮＦＲＳＦ受容体である（Ｘｉｅ Ｐ，Ｊ Ｍｏｌ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３年６月１３日；８（１）：７）。したがって、ＴＮＦＲ２のＣ末端付近に短いアミノ酸モチーフが存在し、これは、ＴＲＡＦ１や、アポトーシスタンパク質１（ｃＩＡＰ１）およびｃＩＡＰ２の細胞阻害剤などのアダプタータンパク質ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ２関連タンパク質の動員を可能にする。したがって、ＴＮＦＲ２は、本質的な細胞死誘導活性を有さないが、ＮＦ－κΒシグナル伝達および様々なキナーゼの活性化を刺激する。

ＴＮＦＲ１は、ほぼ全ての細胞型で発現する。ＴＮＦＲ２の発現は、骨髄細胞、制御性Ｔ細胞、グリア細胞、一部の内皮細胞型を含む特定の細胞型に限定されるが、上皮細胞、線維芽細胞、および特定のＴ細胞およびＢ細胞のサブセットでも誘導される（Ｍｅｄｌｅｒ ａｎｄ Ｗａｊａｎｔ， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１９年４月；２３（４）：２９５－３０７）。

Ｈｅａｔｈｅｒ Ｔｏｒｒｅｙらによる最近の研究（Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１７年１月１７日；１０（４６２））は、拮抗抗体を用いたＴＮＦＲ２阻害の効果を特徴づけた。培養ベースのアッセイでは、２つのＴＮＦＲ２拮抗薬（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）がＴｒｅｇｓの増殖を阻害し、正常細胞からの可溶性ＴＮＦＲ２分泌を減少させ、Ｔエフェクター細胞の拡大を可能にすることがわかった。これらのＴＮＦＲ２抗体は、卵巣癌腹水から分離されたＴｒｅｇｓを、健康なドナーサンプルからＴｒｅｇｓを死滅させるよりも強力に死滅させ、これらの抗体が腫瘍微小環境に対する特異性を有する可能性を示唆している。

別の研究では、Ｅｒｉｃ Ｍ．Ｔａｍ（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１９年１０月２日；１１（５１２））は、抗ＴＮＦＲ２抗体が共刺激シグナル伝達を提供し、これは、インビトロではＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞の両方で増殖、活性化マーカー、サイトカインの増加をもたらし、ヒト化マウスモデルでも抗腫瘍効果を示すと述べた。

抑制性受容体であるＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、またはＰＤ－Ｌ１を標的とする免疫療法は、癌において実質的な臨床的進歩を遂げているが、かなりの割合の患者が治療に反応しないままである。新規の免疫腫瘍経路を単独で、または既存の免疫療法と併用して標的とする免疫療法は、臨床転帰を改善する可能性がある。現在、抗ＴＮＦＲ２抗体は臨床研究されておらず、そのため、癌治療に用いられる、エフェクターＴ細胞の機能を活性化し、Ｔ細胞の増殖を促進し、および／またはＴｒｅｇｓの機能を阻害することができる、ＴＮＦＲ２標的療法が必要とされている。

本発明は、ＴＮＦＲ２に結合する抗体またはその断片またはその抗原結合断片に関する。一実施形態において、ＴＮＦＲ２は、ヒトまたはカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）に由来する。別の実施形態において、ＴＮＦＲ２は、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０を含む。さらなる実施形態において、抗体が結合できるＴＮＦＲ２の断片は、ＴＮＦＲ２の細胞外領域を含み、例えば、この領域は、配列番号５０を含むかまたは配列番号５０からなる。さらなる実施形態において、抗体が結合できるＴＮＦＲ２の断片は、配列番号５０の１Ｌ～３１Ｃのアミノ酸配列、または配列番号５０の１Ｌ～９６Ｃまたは配列番号５０の１７Ｔ～５４Ｄのアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、抗体が結合できるＴＮＦＲ２の断片は、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質上のＱ２６、またはヒトＴＮＦＲ２タンパク質上の２６位に対応する位置のアミノ酸Ｑを含む。
一実施形態において、本発明の抗体は、ＴＮＦＲ２のエピトープに結合する。本発明の一実施形態において、本発明の抗体が結合するＴＮＦＲ２のエピトープは、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質上の２６位に対応する位置に、ヒトＴＮＦＲ２のＱ２６またはアミノ酸Ｑを含む。一実施形態において、エピトープは、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外領域、例えば、配列番号５０からなるかまたはそれを含む領域に含まれる。別の実施形態において、エピトープは、ヒトＴＮＦＲ２またはそれに対応する断片における配列番号５８の１Ｌから３１Ｃまでのアミノ酸配列に含まれる。別の実施形態において、エピトープは、ヒトＴＮＦＲ２またはそれに対応する断片における配列番号６２の１Ｌから９６Ｃまでのアミノ酸配列に含まれる。別の実施形態において、エピトープの１つ以上のアミノ酸は、ヒトＴＮＦＲ２またはそれに対応する断片における配列番号５２の１７Ｔ～５４Ｄのアミノ酸配列に含まれる。

一態様において、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、以下の特性（プロパティー）の１つ以上を有する：
（１）インビトロでヒトおよび／またはカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質またはその断片に高親和性で結合すること、
（２）細胞表面、例えば２９３Ｔ細胞の細胞表面、または抗ＣＤ３によって刺激されたＰＢＭＣなどの活性化細胞上に発現されるヒトおよび／またはカニクイザルＴＮＦＲ２に結合すること、
（３）ＴＮＦ－αと、細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）上に発現されるヒトおよび／またはカニクイザルＴＮＦＲ２との間の相互作用／結合をブロッキングすること、
（４）（例えば、ヒト）Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）を活性化すること、例えば、ＩＦＮ－γのようなサイトカインの分泌を増加させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させること、
（５）ＴＮＦＲ２、例えば、ヒトまたはカニクイザルＴＮＦＲ２の下流シグナル経路を刺激すること、
（６）免疫応答を増強すること、
（７）誘導されたＴ細胞、例えば、誘導されたＴｒｅｇ細胞または誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＤＣＣ効果を誘導しないこと、
（８）薬物動態のパラメータが良好であるため、医薬品の有効成分として使用できること、
（９）例えば、腫瘍体積を減少させることによる抗腫瘍効果を有し、例えば、腫瘍体積を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上減少させることができること。

一態様において、本発明は、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関する。
別の態様において、本発明は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関する。
さらなる態様において、本発明は、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関する。

別の態様において、本発明は、重鎖可変領域を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関する。
別の態様において、本発明は、軽鎖可変領域を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関する。
さらなる態様において、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関する。
一実施形態において、重鎖可変領域は、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
別の実施形態において、軽鎖可変領域は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。

一実施形態において、３つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、以下の通りである：
（ｉ） ＨＣＶＲが配列番号７、１５、２５または３７で表される配列を含むかまたはそれらからなる、重鎖可変領域ＨＣＶＲに由来するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または
（ｉｉ） （ｉ）の３つのＣＤＲと比較して、合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３。
一実施形態において、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、以下の通りである：
（ｉ） ＬＣＶＲが配列番号８、１６、２６、２８または３８で表される配列を含むかまたはそれらからなる、軽鎖可変領域ＬＣＶＲに由来するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または
（ｉｉ） （ｉ）の３つのＣＤＲと比較して、合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３。
一実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関し、以下を含む、ＨＣＶＲが配列番号７、１５、２５または３７で表される配列からなる、重鎖可変領域ＨＣＶＲに由来する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、およびＬＣＶＲが配列番号８、１６、２６、２８または３８で表される配列からなる、軽鎖可変領域ＬＣＶＲに由来する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３。
別の実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関し、以下を含む：
（１） 配列番号７または２５で表される配列からなる重鎖可変領域ＨＣＶＲに由来する３つのＨＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および配列番号８または２６または２８で表される配列からなる軽鎖可変領域ＬＣＶＲに由来する３つのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、
（２） 配列番号１５または３７で表される配列からなる重鎖可変領域ＨＣＶＲに由来する３つのＨＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および配列番号１６または３８で表される配列からなる軽鎖可変領域ＬＣＶＲに由来する３つのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３。

一実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号１または９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、あるいは、ＨＣＤＲ１は、配列番号１または９からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号２または１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、あるいは、ＨＣＤＲ２は、配列番号２または１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号３または１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、あるいは、ＨＣＤＲ３は、配列番号３または１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号４または１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、あるいは、ＬＣＤＲ１は、配列番号４または１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号５または１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、あるいは、ＬＣＤＲ２は、配列番号５または１３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番号６または１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、あるいは、ＬＣＤＲ３は、配列番号６または１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ、２つまたは３つの変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

一実施形態において、３つの重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、以下の通りである：
（ｉ） それぞれ配列番号１、２および３で表される配列からなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または
（ｉｉ） それぞれ配列番号９、１０および１１で表される配列からなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、または
（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）の３つのＣＤＲと比較して、合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）または（ｉｉ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３。
一実施形態において、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、以下の通りである：
（ｉ） それぞれ配列番号４、５および６で表される配列からなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または
（ｉｉ） それぞれ配列番号１２、１３および１４で表される配列からなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、または
（ｉｉｉ） （ｉ）の３つのＣＤＲと比較して、合計で１つ以上５つ以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）をさらに含む、（ｉ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３。
別の実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関し、以下を含む：
（ｉ） それぞれ配列番号１、２および３で表される配列からなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに、それぞれ配列番号４、５および６で表される配列からなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、
（ｉｉ） それぞれ配列番号９、１０および１１で表される配列からなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および、それぞれ配列番号１２、１３および１４で表される配列からなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３。

一実施形態において、重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号７、１５、２５または３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉ）配列番号７、１５、２５または３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉｉ）配列番号７、１５、２５または３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、好ましくは、アミノ酸変化がＣＤＲ領域で生じず、より好ましくは、アミノ酸変化がフレームワーク領域（ＦＲ領域）、例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域で生じる、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号８、１６、２６、２８または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉ）配列番号８、１６、２６、２８または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉｉ）配列番号８、１６、２６、２８または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、好ましくは、アミノ酸変化がＣＤＲ領域で生じず、より好ましくは、アミノ酸変化がＦＲ領域、例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域で生じ、好ましくは、該変化がＦＲ３におけるＩ８３で生じ、特に、該変化がＩからＶまたはその保存的アミノ酸への変化である、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関し、以下を含む：
配列番号７、１５、２５または３７で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または
配列番号８、１６、２６、２８または３８で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域。
別の実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関し、以下を含む：
（１） 配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（２） 配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（３） 配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（４） 配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（５） 配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

さらなる態様において、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の形態である。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ１の形態である。
さらなる態様において、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含む。
一実施形態において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１定常領域であるか、あるいは、ヒトＩｇＧ定常領域に由来する。
別の実施形態において、重鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号４０または配列番号７３で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉ）配列番号４０または配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉｉ）配列番号４０または７３で表されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、軽鎖定常領域は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）軽鎖定常領域、例えば、ヒトκまたはλ軽鎖定常領域、好ましくは、ヒトκ軽鎖定常領域であるか、あるいは、κまたはλ軽鎖定常領域に由来する。
別の実施形態において、軽鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号４２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉ）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉｉ）配列番号４２で表されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

一実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、シグナルペプチド配列をさらに含む。

別の実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。

別の実施形態において、本発明の抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ′）２、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）または線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）からなる群から選択される抗体断片である。

別の実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体は、二重特異性または多重特異性の抗体分子であり、好ましくは、二重特異性の抗体分子は、ＴＮＦＲ２および免疫チェックポイントに結合する。

さらなる態様において、本発明はさらに、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体のいずれか１つ以上の鎖をコードする単離された核酸に関する。

さらなる態様において、本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクターに関する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターである。

さらなる態様において、本発明はさらに、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり、より好ましくは、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ－Ｓ細胞または２９３細胞または２９３Ｔ細胞）、または抗体またはその抗原結合断片の調製に適した他の細胞から選択される。

さらなる態様において、本発明はさらに、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を調製する方法に関し、この方法は、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸の発現に適した条件下で、本発明による宿主細胞を培養することを含み、必要に応じて、該宿主細胞から該抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を回収することをさらに含む。

さらなる態様において、本発明はさらに、本発明による抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片と、他の薬剤（例えば、細胞毒性剤などの治療剤やマーカー）と、を含む免疫複合体に関する。

さらなる態様において、本発明はさらに、本発明による抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明の免疫複合体、および必要に応じて薬学的に許容されるアジュバントを含む医薬組成物に関する。

さらなる態様において、本発明はさらに、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明の免疫複合体、および１つ以上の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子実体、または免疫調節剤）を含む組み合わせ品に関する。

さらなる態様において、本発明はさらに、抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明の免疫複合体、または医薬組成物、または本発明の組み合わせ品を、対象に投与することを含む、対象におけるＴ細胞の活性化、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍活性の誘導、Ｔ細胞媒介性免疫の増強、またはＴ細胞の増殖を刺激する方法に関する。

さらなる態様において、本発明はさらに、抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその抗原結合断片、または免疫複合体、または医薬組成物、または本発明の組み合わせ品を、対象に投与することを含む、対象における癌または感染症を予防または治療する方法に関する。
一実施形態において、癌は、高レベルのＴＮＦＲ２（例えば、ＴＮＦＲ２の高タンパク質または高核酸レベル）を伴う癌である。別の実施形態において、前記癌は、非小細胞肺癌、乳癌、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、および胃腸消化管の癌（例えば、結腸直腸癌、直腸癌または大腸癌）である。
一実施形態において、感染は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または、寄生虫感染などの原虫感染である。
一実施形態において、本発明の方法はさらに、１つ以上の治療法（例えば、治療モダリティおよび／または他の治療剤）と組み合わせて該対象に投与することを含み、該治療モダリティは、手術および／または放射線療法を含むことが好ましく、および／または他の治療剤は、化学療法剤、他の抗体、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子実体、または免疫調節剤からなる群から選択される。

さらなる態様において、本発明はさらに、サンプル中のＴＮＦＲ２を検出する方法に関し、前記方法は、以下のステップを含む：
（ａ）サンプルを、本発明による任意の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片と接触させるステップ、
（ｂ）抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片とＴＮＦＲ２との間の複合体の形成を検出するステップであって、必要に応じて、抗ＴＮＦＲ２抗体を検出可能に標識するステップ。

さらなる態様において、本発明はさらに、抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその抗原結合断片、または本発明の免疫複合体を含む、ＴＮＦＲ２を検出するためのキットに関する。

本発明はまた、本明細書に記載の実施形態のいずれかの任意の組み合わせを包含する。本明細書に記載の実施形態のいずれか、またはそれらの任意の組み合わせは、本明細書に記載の本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体または断片、ならびにその方法および用途のいずれかおよびすべてに適用可能である。

ヒトおよびカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質に対するキメラ抗体の結合を示す。 キメラ抗体が、細胞表面でカニクイザルまたはヒトＴＮＦＲ２に結合し、細胞表面でＴＮＦ－αとヒトＴＮＦＲ２との結合をブロックすることを示す。 ヒト化抗体がヒトＴＮＦＲ２に結合し、ヒトＴＮＦＲ２のＴＮＦ－αへの結合をブロックすることを示す。 ヒト化抗体が細胞表面でカニクイザルＴＮＦＲ２に結合し、ヒトＴＮＦＲ２のＴＮＦ－αへの結合をブロックすることを示す。 ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に対するヒト化抗体の共刺激を示す。 ヒト化抗体がＴ細胞の増殖を共刺激することを示す。 ヒト化抗体がＴ細胞をＦｃ架橋型で活性化することを示す。 ヒト化抗体のＴＮＦＲＳＦタンパク質への結合を示す。 ＳＥＣ－ＨＰＬＣにおけるヒト化抗体ｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３２Ｃ－Ｖ１の純度を示す。 抗ＴＮＦＲ２抗体ｈｕ３－Ｅエピトープマッピングを示す。 抗ＴＮＦＲ２抗体ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１エピトープマッピングを示す。 活性化ＰＢＭＣ細胞上のＴＮＦＲ２に結合した抗ＴＮＦＲ２抗体ｈｕ３－Ｅを示す。 Ｔｒｅｇ細胞に対する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体のＡＤＣＣ効果を示す。 ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗ヒトＴＮＦＲ２抗体のＡＤＣＣ効果を示す。

定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が使用され、単数形で使用される用語は複数形を含むこともあり、適切な場合はその逆も同様である。本明細書で使用される技術用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、限定を意図したものではないことが理解される。

本明細書で使用される用語「および／または」は、２つ以上の特定の特性または構成要素の各々の、他のものを伴うかまたは伴わない具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。

本明細書において、態様が言語「含む」で説明される場合は常に、さもなければ「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で説明される類似の態様もまた提供されることが理解される。

用語「約」は、数値に関して使用される場合、特定の数値より１０％または５％未満の下限と、特定の数値より１０％または５％超過の上限との間の範囲内の数値を包含することを意味する。

「腫瘍壊死因子受容体２型（ＴＮＦＲ２）」は、腫瘍浸潤性免疫抑制性ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）によって高度に発現され、これらの細胞に対する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の刺激作用を媒介することが示されている。最近の研究では、抗腫瘍免疫応答の主要なチェックポイントであるＴｒｅｇの活性化と増殖の刺激において、ＴＮＦＲ２が重要な役割を果たすことが示されている（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ １０：ｅａａｌ２３２８，２０１７）。ＴＮＦＲ２は、ある種の悪性細胞によっても発現され、ＴＮＦＲ２のリガンドがこれらの腫瘍細胞の生存と増殖を促進する。一実施形態において、本発明におけるＴＮＦＲ２は、ヒト由来であり、例えば、配列番号４８で表されるアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、ＴＮＦＲ２はカニクイザル由来であり、例えば、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を有する。本明細書に使用されるＴＮＦＲ２の断片は、ＴＮＦＲ２の任意の部分、特に本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体が結合する部分を指す。一実施形態において、前記断片は、ＴＮＦＲ２の細胞外領域、例えば、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を有する領域である。

「抗抗原」抗体とは、抗原に特異的に結合する抗体のことを指す。例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体はＴＮＦＲ２に特異的に結合する。

「単離された」抗体は、その自然環境の構成要素（コンポーネント）から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される９０％または９５％または９９％の純度を超えるまで精製される。本発明の一実施形態において、抗ＴＮＦＲ２抗体が単離される。

本明細書で使用される用語「抗ＴＮＦＲ２抗体」、「抗ＴＮＦＲ２」、「ＴＮＦＲ２抗体」または「ＴＮＦＲ２に結合する抗体」とは、抗体が（ヒトまたはカニクイザル）ＴＮＦＲ２を標的とする診断剤および／または治療剤として使用できるように、（例えば、ヒトまたはカニクイザル）ＴＮＦＲ２タンパク質またはその断片に十分な親和性で結合することができる抗体を指す。一実施形態において、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）またはバイオライト干渉法またはＭＳＤアッセイによって測定されるように、抗ＴＮＦＲ２抗体は、（例えば、ヒトまたはカニクイザル）ＴＮＦＲ２への抗体の結合の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％未満またはそれ以上の程度で、非ＴＮＦＲ２タンパク質（例えば、非ヒトまたは非カニクイザルＴＮＦＲ２）に結合する。一実施形態において、抗体がインビトロでヒトまたはカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質またはその断片に高親和性で結合することは、非ＴＮＦＲ２タンパク質（例えば、それぞれ非ヒトまたは非カニクイザルＴＮＦＲ２）への結合と比較して、結合の延長が約７０％、約８０％または約９０％またはそれ以上であることを意味する。一実施形態において、抗体がインビトロでカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質またはその断片に高親和性で結合することは、カニクイザルＴＮＦＲ２に結合する抗体のＫ_Ｄが、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭより低く、または上記の値の間、例えば、約０．５ｎＭ～１０ｎＭ、０．５ｎＭ～８ｎＭ、０．５ｎＭ～６ｎＭ）であることを意味する。一実施形態において、抗体がインビトロでヒトＴＮＦＲ２タンパク質またはその断片に高親和性で結合することは、ヒトＴＮＦＲ２に結合する抗体のＫ_Ｄが、１００ｎＭ，９０ｎＭ，８０ｎＭ，７０ｎＭ，６０ｎＭ，５０ｎＭ，４０ｎＭ，３０ｎＭ，２０ｎＭ，１０ｎＭ，９ｎＭ，８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭより低く、または上記の値の間、例えば、約０．３ｎＭ～５ｎＭまたは０．３ｎＭ～４ｎＭであることを意味する。

該抗体は、（例えば、挿入、欠失、置換、非抗体部分への結合によって）変化した抗体であってもよい。例えば、抗体は、抗体の特性（例えば、機能特性）を変化させる（天然に存在する抗体と比較して）１つ以上の変異型アミノ酸を含んでもよい。例えば、患者における抗体に対する半減期、エフェクター機能、および／または免疫応答などに影響を及ぼすいくつかの変化が、当技術分野において知られている。

用語「モノクローナル抗体」（「ｍＡｂ」）とは、単一分子組成の抗体分子、すなわち、特定の抗原に対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、単離された抗体の一例である。ＭＡｂは、ハイブリドーマ、組換え、トランスジェニック、または当業者に知られている他の技術によって製造される。

「ヒト」抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。

「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。抗体のヒト化形態の一実施形態において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分、または全ては未変化である。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、抗体が特定の抗原に結合する能力を抑制しない限り許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。

「キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体などの、可変領域がある種由来であり、定常領域が他の種由来である抗体を指す。

抗体の「抗原結合断片」とは、抗体全体によって結合された抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合断片」の中に包含される結合断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′－ＳＨ、Ｆ（ａｂ′）２、ダイアボディー、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、および抗体断片から形成される多種特異抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を用いて得られ、断片は無傷の抗体と同様に有用性についてスクリーニングされる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または正常な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって産生できる。

本明細書で使用される用語「エピトープ」は、抗体分子と特異的に相互作用する抗原（例えば、ＴＮＦＲ２）の部分を指す。この部分（本明細書ではエピトープ決定基と呼ばれる）は、典型的には、アミノ酸側鎖または糖側鎖またはその成分などの要素を含む。エピトープ決定基は、当技術分野で知られている方法または本明細書に開示されている方法（例えば、結晶学または水素－重水素交換）によって定義され得る。典型的には、エピトープは特定の３次元構造特性を有する。典型的には、エピトープは特定の電荷特性を有する。一部のエピトープは線状エピトープである一方、他のエピトープは立体配座エピトープである。本発明の一実施形態において、本発明の抗体が結合するＴＮＦＲ２のエピトープは、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質上の２６位に対応する位置に、ヒトＴＮＦＲ２のＱ２６またはアミノ酸Ｑを含む。一実施形態において、エピトープは、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外領域、例えば、配列番号５０からなるかまたはそれを含む領域に含まれる。別の実施形態において、エピトープは、ヒトＴＮＦＲ２またはそれに対応する断片における配列番号５８の１Ｌから３１Ｃまでのアミノ酸配列に含まれる。別の実施形態において、エピトープは、ヒトＴＮＦＲ２またはそれに対応する断片における配列番号６２の１Ｌから９６Ｃまでのアミノ酸配列に含まれる。別の実施形態において、エピトープは、ヒトＴＮＦＲ２またはそれに対応する断片における配列番号５２の１７Ｔ～５４Ｄのアミノ酸配列に含まれる。

レファレンス抗体と「同一または重複するエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）において、レファレンス抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に、レファレンス抗体は、競合アッセイにおいて、前記抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。

抗原への結合についてのレファレンス抗体と競合する抗体とは、競合アッセイにおいて、レファレンス抗体のその抗原への結合の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上をブロックする抗体である。換言すれば、レファレンス抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原への結合の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上をブロックする。抗原結合タンパク質が、固相直接または間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイなどの別のアッセイと競合するかどうかを判定するために、多数のタイプの競合結合アッセイを用いることができる。

レファレンス抗体のその抗原への結合を阻害する（例えば、競合的に阻害する）抗体とは、レファレンス抗体のその抗原への結合を５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上に阻害する抗体である。逆に、レファレンス抗体は、前記抗体のその抗原に対する結合を５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上に阻害する。抗体のその抗原への結合は親和性によって測定できる。親和性を決定する方法は、当技術分野で知られている。

レファレンス抗体と同一または類似の結合親和性および／または特異性を示す抗体とは、レファレンス抗体の結合親和性および／または特異性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上を有する抗体を指す。これは、結合親和性および／または特異性を決定するための、当技術分野で知られている方法により決定されてもよい。

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、配列が高度に可変であり、構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接点」）を含む、抗体可変ドメインにおける領域である。ＣＤＲは主にエピトープへの結合を担っている。重鎖および軽鎖のＣＤＲは、一般にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順に番号が付けられている。抗体重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と呼ばれる一方、抗体軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。軽鎖可変領域または重鎖可変領域の所定のアミノ酸配列において、各ＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、例えば、抗体の三次元構造とＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３：９２７－９４８（１９９７））、抗体配列変動に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（バース大学）、Ｃｏｎｔａｃｔ（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース（ＩＭＧＴ）（ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｏｎ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ）、および多数の結晶構造を用いた親和性伝搬クラスタリングに基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含む、多くの周知の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１つまたは組合せを用いて決定することができる。

例えば、種々のＣＤＲ決定スキームによる、各ＣＤＲの残基は次の通りである。

ＣＤＲはまた、参照ＣＤＲ配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＣＤＲ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（例えば、本発明の例示的ＣＤＲのいずれか）と同じＫａｂａｔナンバリング位置を有することに基づいて決定することもできる。

特に明記しない限り、本発明では、用語「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」は、上記の方法のいずれかによって決定されたＣＤＲ配列を包含する。

特に明記しない限り、本発明では、抗体可変領域の残基（重鎖可変領域残基および軽鎖可変領域残基を含む）の位置を言及する場合、それはＫａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に従うナンバリング位置を指す。

一実施形態において、本発明の抗体のＣＤＲの境界は、Ｋａｂａｔスキームによって決定される。

異なる割り当てシステムによって得られた抗体の可変領域のＣＤＲの境界は異なる場合があることに留意すべきである。すなわち、異なる割り当てシステムによって定義された抗体の可変領域のＣＤＲ配列は異なる。したがって、本発明で定義される特定のＣＤＲ配列を有する抗体を定義するということになると、その抗体の範囲はまた、可変領域配列がその特定のＣＤＲ配列を含んでなるが、異なるプロトコール（例えば、異なる割り当てシステム規則またはそれらの組み合わせ）が適用される場合に、本発明により定義されるような特定のＣＤＲ境界とは異なるＣＤＲ境界が特許請求されるような抗体を包含する。

異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲ（同じ割り当てシステム下）を有する。しかしながら、ＣＤＲは抗体ごとに異なるものの、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、およびＮｏｒｔｈ法の少なくとも２つを用いて最小の重複領域を決定することができ、抗原結合のための「最小結合単位」が得られる。この最小結合単位は、ＣＤＲの下位部分であり得る。当業者には自明であるように、残りのＣＤＲ配列の残基は、抗体構造およびタンパク質フォールディングによって決定することができる。したがって、本発明では、本明細書に示されるＣＤＲのいずれの変異体も考慮される。例えば、１つのＣＤＲ変異体では、最小結合単位内のアミノ酸残基は不変のままであり得るが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより定義される他のＣＤＲ残基は、保存的アミノ酸残基により置換されてもよい。

当技術分野で公知である抗体には：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらの抗体のいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。当業者は、本発明の適切なクラスの抗体を実際の要望に応じて選択して得ることができる。

「ＩｇＧ形態の抗体」とは、抗体の重鎖定常領域が属すＩｇＧ型を指す。同じタイプの全ての抗体の重鎖定常領域は同一であり、異なるタイプの抗体の重鎖定常領域は異なる。例えば、ＩｇＧ１型の抗体とは、その重鎖定常領域のＩｇドメインがＩｇＧ１であるＩｇドメインを指す。

「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞に含有されるが、染色体外に、またはその本来の染色体の場所とは異なる染色体の場所に存在する核酸分子を含む。

本明細書で使用される用語「ベクター」とは、それが連結された別の核酸を伝搬し得る核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造として働くベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。特定のベクターは、それらが機能的に連結される核酸の発現を導くことが可能である。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

用語「宿主細胞」とは、外因性核酸が導入される細胞を、そのような細胞の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）を含めて指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには初代形質転換細胞およびそれらに由来する子孫が継代数に関係なく含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異子孫が含まれる。

参照ポリペプチド配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列し、配列同一性最大パーセントを実現するために必要な場合はギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合（パーセント）として定義される。当該技術分野の範囲内の種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の一般的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメント（整列）を達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大のアライメント（整列）を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列するための適切なパラメータを決定することができる。
本願において配列同一性のパーセンテージが言及される場合、これらのパーセンテージは、特に指示のない限り、より長い配列の全長に対して計算される。より長い配列の全長に対する計算は、核酸配列とポリペプチド配列の両方に適用される。

用語「医薬組成物」とは、その中に含有される有効成分の生物学的活性を有効にする形態の製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）であって、当該製剤が投与される対象に対して許容できない毒性を有する付加成分を含有しない製剤を指す。

用語「薬学的に許容可能なアジュバント」とは、治療剤と同時投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全））、賦形剤またはビヒクルを指す。

本明細書で使用される用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（またはｔｒｅａｔまたはｔｒｅａｔｉｎｇ））」とは、既存の症状、障害、病態、または疾患の進行または重症度の緩徐化、中断、休止、緩和、停止、軽減、または逆転を指す。

本明細書で使用される「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（またはｐｒｅｖｅｎｔまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ））」とは、疾患もしくは障害または特定の疾患もしくは障害の症状の発症または進行の阻害を含む。いくつかの実施態様において、癌の家族歴を有する対象は、予防レジメンの候補である。一般に、癌の文脈において、用語「予防」とは、特に癌のリスクのある対象において癌の徴候または症状が発症する前の薬物の投与を指す。

「Ｔ細胞を活性化する」とは、エフェクターまたは記憶Ｔ細胞が、再生し、持続し、または増幅した生物学的機能を有するように誘導し、誘発し、または刺激することを意味する。Ｔ細胞機能を増強する例には、介入前のレベルと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのγ－インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γ）の分泌増加、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖増加、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖増加などが含まれる。

本明細書で使用される用語「治療剤」は、化学療法剤、細胞毒性剤、ワクチン、その他の抗体（例えば、免疫チェックポイント分子に対する抗体）、活性抗感染症剤、免疫調節剤、および小実体を含め、腫瘍（癌など）および感染症の予防または治療に有効ないずれの物質も包含する。

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物を含む。

用語「免疫チェックポイント分子」とは、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の細胞表面上の分子群を指す。これらの分子は、抗腫瘍免疫応答をダウンレギュレートまたは抑制する「ブレーキ」として効果的に作用できる。

用語「抗感染剤」には、ウイルス、細菌、真菌、または原虫、例えば、寄生虫などの微生物の成長を特異的に阻害または排除し、かつ、その投与濃度および投与間隔では宿主に致死的でないいずれの分子も含まれる。本明細書において使用する用語「抗感染剤」は、抗生物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗原虫剤を含む。一特定の態様において、抗感染剤は、投与濃度および投与間隔において宿主に対して非毒性である。

免疫調節剤には、免疫チェックポイント分子阻害剤および共刺激分子活性化剤が含まれる。

用語「小分子」とは、分子量が約２０００ダルトン以下、好ましくは約５００ダルトン以下の任意の分子を指す。

用語「組み合わせ品」とは、２つ以上の治療剤を同時に独立して投与するか、または特定の時間間隔で別々に投与することができる、組み合わせ投与用単位剤形の固定または非固定の組み合わせ、または組み合わせ投与用のパーツのキットを指し、特に、これらの時間間隔が、組み合わせパートナーがコラボレーション、例えば相乗効果を発揮することができる。用語「固定組み合わせ」とは、本発明の抗体および組み合わせパートナー（例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤のような免疫調節剤などの他の治療剤）が、単一の実体または用量の形で同時に患者に投与されることを意味する。用語「非固定組み合わせ」とは、本発明の抗体および組み合わせパートナー（例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤のような免疫調節剤などの他の治療剤）が、同時に、一緒に、または別個の実体として連続的に患者に投与されることを意味し、そして、そのような投与が患者に対して治療的に有効なレベルの２つの化合物を提供する場合には、特定の時間制限はない。後者は、３つ以上の治療剤の投与などのカクテル療法にも適用される。好ましい実施形態において、薬物の組み合わせは非固定組み合わせである。

用語「癌（ｃａｎｃｅｒ）」および「癌性（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」とは、通常、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的疾患を指し、または説明する。

用語「腫瘍」とは、悪性か良性かに関係なく、全ての腫瘍性細胞の成長および増殖、ならびに全ての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、および「腫瘍」とは、本明細書において言及される場合、互いに排他的ではない。

用語「感染症」とは、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、または、寄生虫感染症などの原虫を含む病原体によって引き起こされる疾患を指す。

用語「腫瘍免疫回避」とは、免疫認識およびクリアランスを回避する腫瘍を指す。したがって、治療の概念として、腫瘍免疫は「治療」され、回避が弱まると、腫瘍は免疫系によって認識され攻撃される。腫瘍認識の例には、腫瘍結合、腫瘍縮小、および腫瘍クリアランスが含まれる。

本明細書で使用される用語「標識（ｌａｂｅｌ）」とは、ポリヌクレオチドプローブまたは抗体などの薬剤（ａｇｅｎｔ）に直接的または間接的に結合または融合され、結合または融合される薬剤の検出を容易にする化合物または組成物を指す。標識はそれ自体検出可能であり（例えば放射性同位体標識または蛍光性標識）、または酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒することができる。この用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合（すなわち、物理的連結）させることによるプローブまたは抗体の直接標識、および直接標識された別の試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）と反応させることによるプローブまたは抗体の間接標識を包含することを意図している。

用語「有効量」とは、治療または予防を必要とする患者において、その患者に単回または複数回の用量で投与した後に期待される効果を生じる本発明の抗体、断片、複合体または組成物の量または用量（投与量）を指す。有効量は、次のような様々な因子を考慮することにより当業者としての主治医によって容易に決定され得る：哺乳動物などの種、そのサイズ、年齢、および全般的な健康状態、関与する特定の疾患、その疾患の程度または重症度、個々の患者の反応、特定の抗体の投与、投与経路、投与製剤の生物学的利用能の特性、選択される投与計画、および並行療法の使用。

「治療有効量」とは、所望の期間、必要な投与量で所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。抗体もしくは抗体断片、または複合体もしくは組成物の治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き起こす抗体または抗体部分の能力などの様々な要因に応じて変化し得る。治療有効量はまた、抗体もしくは抗体断片、または複合体もしくは組成物の毒性もしくは不所望な効果が、治療上有益な効果よりも劣る量でもある。「治療有効量」は、未治療の対象に対して、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、６０％または７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％または９０％の測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍増殖率）を阻害する。

「予防有効量」とは、所望の期間、必要な投与量で所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。一般に、予防投与量（予防用量）は、疾患の前または初期段階で対象に投与されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少なくなる。

「個体」または「対象」には哺乳類が含まれる。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えば、ネズミおよびラット）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体または対象はヒトである。

本明細書で使用される用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」とは、当業者に知られている様々な方法および送達システムのいずれかを用いて、治療剤（例えば、抗ＴＮＦＲ２抗体）を含む組成物を対象に物理的に導入することを指す。投与経路には、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または他の非経口投与経路、例えば注射または注入が含まれる。本明細書で使用される語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与モードを意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および注入、ならびにインビボエレクトロポレーション（生体内での電気穿孔）を含むが、これらに限定されない。他の非－非経口投与経路には、局所、表皮または粘膜の投与経路（例えば、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下または局所）が含まれる。

対象／患者からの「試料（サンプル）」とは、癌患者や癌対象から得た細胞または体液の集合体を意味する。組織または細胞試料のソースは、新鮮、凍結および／または保存臓器または組織試料または生検または吸引物からの固形組織、血液または血液成分、脳脊髄液、羊水、腹膜液（腹水）、または組織間液（間質液）などの体液、対象の妊娠中または発育中の任意の時点からの細胞、であってもよい。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などの、天然の組織と自然に混在していない化合物を含有してもよい。本明細書における腫瘍試料（ｔｕｍｏｒ ｓａｍｐｌｅ）の例としては、腫瘍生検、微細針吸引、気管支肺胞洗浄、胸膜液、痰、尿、摘出標本、循環腫瘍細胞、血清、血漿、循環血漿タンパク質、腹水、腫瘍に由来するまたは腫瘍類似特性を示している初代細胞培養または細胞株、ならびに保存腫瘍試料、例えば、ホルマリン－固定、パラフィン－包埋腫瘍試料または凍結腫瘍試料が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体

本発明の一実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸変化は、アミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変化は、アミノ酸置換、好ましくは保存的置換である。

好ましい実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸変化は、ＣＤＲの外側の領域（例えば、ＦＲ）に生じる。一実施形態において、アミノ酸変化は、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲのＦＲ領域、好ましくはＬＣＶＲにおいて、例えば、ＬＣＶＲのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４において生じる。いくつかの実施形態において、ＦＲ領域には、１つ、２つ、または３つの変化がある。特定の実施形態において、変化は、ＦＲ３のＩ８３におけるものであり、例えば、ＩからＶへの置換またはその保存アミノ酸の８３位にある。

より好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変化は、重鎖可変領域の外側および／または軽鎖可変領域の外側の領域で生じる。

いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。保存的置換とは、同一クラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換、例えば、別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸置換、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸置換、または別の中性アミノ酸による中性アミノ酸置換を指す。置換の例を以下の表に示す：

場合により、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体は、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、または重鎖への翻訳後修飾を含む。例示的な翻訳後修飾には、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、ＰＥＧ化、脂質化（リピデーション）、アセチル化、リン酸化、またはその他の操作（標識成分との抱合など）が含まれる。

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作成または除去されるようにアミノ酸配列を変えることにより、簡便に達成することができる。

本明細書に記載の抗体またはその断片に対する、本発明により包含される別の修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ＰＥＧ化である。抗体をＰＥＧ化して、例えば、抗体の生物学的（例えば血清）半減期を延長することができる。抗体をＰＥＧ化するために、通常、抗体またはその断片を、（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などの）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片と付着される条件下で反応させる。

特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入して、それにより、例えば、癌または細胞増殖性疾患の治療における抗体の有効性を高めるようにＦｃ領域変異体を生成してもよい。例えば、抗体のＡＤＣＣ機能を除去または増加させるために、またはＦｃγ受容体への抗体の結合を除去するために、修飾を組み込むことができる。一実施形態において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａおよび／またはＰ３２９Ａ（ＥＵナンバリング）、またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｐ３２９Ａ（ＥＵナンバリング）をＦｃ領域に組み込むことができる。

一実施形態において、抗体のシステイン残基の数を変更して、抗体の特性を改変することができる。

一実施形態において、抗体の産生を改善するために、例えば、細胞における抗体の発現を改善するために、または産生された抗体の純度を改善するために、１つ以上のアミノ酸修飾をＦＲ領域に導入することができる。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域、例えばＦＲ３領域、例えばＩ８３位に修飾が存在し得る。具体的には、修飾は、８３位のＩからＶまたはその保存アミノ酸への置換であり得る。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片は、本発明の抗体ｈｕ３２－Ｃ、ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１またはｈｕ３－Ｅと同一または類似の結合親和性および／または特異性を示す、および／または本発明の抗体ｈｕ３２－Ｃ、ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１またはｈｕ３－ＥのＴＮＦＲ２への結合を阻害（例えば、競合阻害）し、および／または本発明の抗体ｈｕ３２－Ｃ、ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１またはｈｕ３－Ｅと同じまたは重複するエピトープに結合する、および／またはＴＮＦＲ２への結合について本発明の抗体ｈｕ３２－Ｃ、ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１またはｈｕ３－Ｅと競合する、および／または本発明の抗体ｈｕ３２－Ｃ、ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１またはｈｕ３－Ｅの１つ以上の生物学的特徴を有する。
本発明の核酸およびそれを含む宿主細胞

一態様において、本発明は、上記の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその断片のいずれかをコードする核酸を提供する。核酸は、抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含むアミノ酸配列、または抗体の軽鎖および／または重鎖を含むアミノ酸配列をコードすることができる。

一実施形態において、本発明の例示的な核酸は、配列番号７、８、１５、１６、２５、２６、２８、３７、３８のいずれかから選択されるアミノ酸配列をコードする核酸、または、配列番号７、８、１５、１６、２５、２６、２８、３７、３８のいずれかから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。

別の実施形態において、本発明の核酸は、配列番号２３、２４、２７、３５または３６のいずれかから選択されるヌクレオチド配列、または、配列番号２３、２４、２７、３５または３６のいずれかから選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

一実施形態において、核酸のいずれかを含む１つ以上のベクターが提供される。一実施形態において、ベクターは、真核発現ベクターなどの発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。多くのベクター系が使用できる。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターは、ｐＣＤＮＡ、例えば、ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターである。

一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体の領域または本明細書に記載のベクターをコードする核酸を含有する宿主細胞を提供する。抗体またはベクターをコードする核酸をクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。抗体は、例えば、細菌において産生することができる。発現後、可溶性画分中の細菌ペーストから抗体を単離し、さらに精製することができる。一実施形態において、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。

別の実施形態において、宿主細胞は真核性である。宿主細胞は、酵母、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、昆虫細胞、植物細胞、または抗体またはその抗原結合断片の調製に適する他の細胞からなる群から選択され得る。例えば、糸状菌や酵母などの真核微生物は、真菌および酵母菌株を含む、抗体をコードするベクターの適切なクローニングまたは発現宿主である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胚性腎臓株（２９３ＨＥＫまたは２９３または２９３Ｔ細胞）などが挙げられる。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＹ０、ＮＳ０とＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。
本発明の抗体またはその抗原結合断片の調製および精製方法

一実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体を調製する方法を提供し、前記方法は、抗体または抗原結合断片を発現するのに適した条件下で、本発明の抗体または抗原結合断片（抗体のいずれか１つ以上の領域または鎖）をコードする核酸を含む宿主細胞をインキュベートするステップを含み、および必要に応じて、該宿主細胞から（または宿主細胞培養物）から該抗体または該断片を回収するステップを含む。

抗体の組換え生産のために、抗体をコードする核酸（例えば、ＶＨまたはＶＬまたは重鎖または軽鎖をコードする核酸）を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために１つ以上のベクターに挿入する。従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、核酸を容易に単離および配列する。

一実施形態において、宿主細胞は、抗体のＶＬのアミノ酸配列をコードする核酸と、抗体のＶＨのアミノ酸配列をコードする核酸とを含むベクターを含む。一実施形態において、宿主細胞は、抗体のＶＬのアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクターと、抗体のＶＨのアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターとを含む。

本明細書に記載のように調製される抗体分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ）、サイズ排除クロマトグラフィー等の公知の技術により精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、正味の電荷、疎水性および親水性などの要因にも依存し、これらは当業者には明らかであろう。本発明の抗体分子の純度は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
アッセイ

本明細書で提供される抗ＴＮＦＲ２抗体は、当技術分野で知られている種々のアッセイを通じて、その物理的／化学的特性および／または生物学的活性を同定、スクリーニングまたは特徴付けることができる。一態様において、本発明の抗体の抗原結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリーおよび抗体分子でコーティングされた磁気ビーズなどの公知の方法によって試験される。

別の態様において、ＴＮＦＲ２への結合について、本明細書に開示される抗ＴＮＦＲ２抗体のいずれかと競合する抗体を同定するために、競合結合アッセイを用いることができる。いくつかの実施形態において、このような競合抗体は、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体のいずれかと同じエピトープ（例えば、線状または立体配座エピトープ）に結合する。

本発明はさらに、上記の特性の１つ以上を有する抗ＴＮＦＲ２抗体を同定するためのアッセイを提供する。さらに、このようなインビボおよび／またはインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体が提供される。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、上記の特性の１つ以上について試験される。

本発明のインビトロアッセイのいずれかで使用される細胞には、ＴＮＦＲ２を自然に発現するかまたはＴＮＦＲ２を発現するように操作された細胞または細胞株が含まれる。一実施形態において、細胞は２９３細胞株または２９３Ｔ細胞株またはＴ細胞である。

抗ＴＮＦＲ２抗体の代わりに、または抗ＴＮＦＲ２抗体に加えて、本発明の免疫複合体を用いて、前記アッセイのいずれかを実施できることが理解される。

前記アッセイのいずれも、抗ＴＮＦＲ２抗体および他の薬剤を使用することによって行うことができることが理解される。
免疫複合体

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で提供される任意の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を含む免疫複合体、および、化学療法剤、他の抗体、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子実体、または免疫調節剤（例えば、抗炎症剤または免疫抑制剤）を含む治療剤などの他の薬剤を提供する。一実施形態において、細胞毒性剤などの他の薬剤には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。いくつかの実施形態において、免疫複合体は、癌または感染症を診断、予防または治療するために使用される。
医薬組成物、医療製剤または組み合わせ品

本発明はさらに、抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその抗原結合もしくはその免疫複合体、または、抗ＴＮＦＲ２抗体もしくはその断片をコードする核酸を含む、医薬組成物、医薬製剤、または組み合わせ品を提供する。

このような組成物、製剤または組み合わせ品は、緩衝剤を含む、当技術分野で知られている医薬担体や賦形剤などの適切な医薬補助剤をさらに含んでいてもよい。

本発明における使用に適した医薬担体は、水や（石油、または動物起源、植物起源もしくは合成起源の油（例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油）などを含む）油の無菌の液体であり得る。水は、医薬組成物が静脈内に投与される際の好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体として採用され、特に注射溶液に使用され得る。

好適な賦形剤には、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。

組成物は、所望により、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤（バッファー）をさらに含有してもよい。

医薬品補助剤の用途については、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”， 第５版，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｊ．Ｓｅｓｋｅｙ ａｎｄ Ｓ．Ｃ．Ｏｗｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏ参照。

組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態をとってもよい。

本発明の組成物は、種々の形態であってもよい。これらの形態には、例えば、液体溶液（例えば、注射用溶液および注入用溶液）、分散液または懸濁液、リポソームおよび坐薬などの、液体、半固体および固体形態が含まれる。好ましい形態は、投与および治療用途の意図された様式（モード）によって変わる。一般的に好ましいのは、注射可能な溶液または注入可能な溶液の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内）注射または注入である。好ましい実施形態において、抗体分子は、静脈内注入または注射により投与される。別の好ましい実施形態において、抗体分子は、筋肉内、腹腔内または皮下注射により投与される。

所望の純度を有する本発明の抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上の任意の医薬補助剤と混合して、本発明の抗体の医薬製剤を調製することができる。医薬製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態であることが好ましい。

本発明の医薬組成物または医薬製剤は、治療すべき特定の徴候によって必要とされる複数の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼすことなく相補的な活性を有する有効成分を含んでいてもよい。例えば、他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子実体、または免疫調節剤）をさらに提供することが望ましい。有効成分は、意図する目的に有効な量で好適に組み合わされる。有効成分は、抗ＴＮＦＲ２抗体と組み合わせられる、当技術分野で知られている任意の物質であってもよい。一実施形態において、他の抗体は、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体であり、例えば、ヒトＰＤ－１抗体またはヒトＰＤ－Ｌ１抗体である。

徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の好適な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形物、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。

本発明はさらに、本発明の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片、および他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子実体、または免疫調節剤）を含む組み合わせ品を提供する。一実施形態において、他の抗体は、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体である。
用途および方法

一態様において、本発明は、対象における免疫応答を調節する方法を提供する。

別の態様において、本発明は、Ｔ細胞を活性化するか、またはＴ細胞媒介性の抗腫瘍活性を誘導する方法を提供する。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
一実施形態において、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞のサイトカイン分泌、例えば、Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌を刺激することを含む。
別の実施形態において、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞の増殖を刺激することを含む。

別の態様において、本発明は、対象における腫瘍（例えば、癌）を予防または治療する方法に関する。いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍免疫回避である。
一実施形態において、癌患者では、ＴＮＦＲ２タンパク質の発現レベルが上昇しているか、またはＴＮＦＲ２タンパク質をコードする核酸のレベルが上昇している。
いくつかの実施形態において、癌などの腫瘍は、固形腫瘍および血液腫瘍および転移性病変を含む。一実施形態において、固形腫瘍の例としては、悪性腫瘍が挙げられる。癌は、早期癌、中期癌、または進行癌もしくは転移性癌のいずれもありうる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、癌などの、Ｔ細胞の活性化を必要とする腫瘍であり、例えば、Ｔ細胞機能障害を有する腫瘍または癌である。
好ましくは、前記癌は、非小細胞肺癌、乳癌、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、および消化管癌（例えば結腸直腸癌、直腸癌または大腸癌）である。
いくつかの実施形態において、腫瘍療法は以下の利点を得る：
（ｉ） ＴＮＦＲ２核酸またはタンパク質レベルの阻害、
（ｉｉ） ＴＮＦＲ２のそのリガンド（ＴＮＦ－α等）への結合のブロッキング、
（ｉｉｉ） Ｔ細胞の活性化、例えば、ＩＦＮ－γ等のサイトカインの分泌の増加、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の増加、
（ｉｖ） 上記のうちのいずれか１つ以上の組み合わせが挙げられる。

別の態様において、本発明は、対象における感染症を予防または治療する方法に関する。
いくつかの実施形態において、感染は急性または慢性である。いくつかの実施形態において、慢性感染は、持続性感染、潜伏性感染、または遅発性感染である。いくつかの実施形態において、慢性感染は、細菌、ウイルス、真菌および原虫からなる群から選択される病原体によって引き起こされる。

いくつかの実施形態において、上記方法は、本発明の抗体または抗原結合断片、免疫複合体、医薬組成物または製剤、組み合わせ品、または核酸を投与することを含む。

一実施形態において、上記方法は、１つ以上の治療法（例えば、治療モダリティおよび／または他の治療剤）と組み合わせて当該対象に投与することをさらに含み、該治療モダリティは、手術および／または放射線療法を含むことが好ましく、および／または他の治療剤は、化学療法剤、他の抗体、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子実体、または免疫調節剤からなる群から選択される。
一実施形態において、免疫調節剤には、免疫抑制剤または抗炎症剤が含まれる。
一実施形態において、抗体は、免疫チェックポイント分子に結合する抗体であり得る。一実施形態において、他の抗体は、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体の組み合わせは、例えば、別々に、例えば別個の抗体として、または連結して（例えば、二重特異性または三重特異性抗体分子として）投与することができる。
このような併用療法には、併用投与（例えば、２つ以上の治療剤が同一の製剤または別個の製剤に含まれる）および個別投与が含まれる。一実施形態において、本発明の抗体の投与は、他の１つ以上の治療法の投与前、同時に、および／または投与後に行われる。

対象は、哺乳動物（例えば霊長類）、好ましくは高等霊長類（例えばヒト（例えば、本明細書に記載の疾患を有するか、または有するリスクのある患者））であり得る。一実施形態において、対象は、強化された免疫応答を必要とする。いくつかの実施形態において、免疫応答は抗腫瘍応答である。一実施形態において、対象は、本明細書に記載の疾患（例えば、本明細書に記載の腫瘍または感染症）を有するか、または有するリスクがある。

他の態様において、本発明は、上記用途（例えば、上記関連疾患または状態の予防または治療）のための医薬品の製造または調製における、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその断片またはその免疫複合体の用途を提供する。
実施例

実施例１：ハイブリドーマスクリーニングによるＴＮＦＲ２結合抗体の生成
ｈＴＮＦＲ２－ｍＦｃタンパク質（配列番号４５）とヒトＴＮＦＲ２（配列番号４８）を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株とを交互に注射して５匹のＳＪＬ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）マウスに免疫を行った。表１の免疫（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）スケジュールに従い、２週ごとにタンパク質と細胞を交互に注入し、４回の免疫を行った。２回目、３回目、４回目の免疫後の免疫マウスの血液を、ＴＮＦＲ２タンパク質ＨｕＴＮＦＲ２－ｈｕＦｃ（配列番号４６）に対してＥＬＩＳＡによりテストし、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号４８）を安定して発現する２９３Ｔ細胞株に対してＦＡＣＳによりテストした。

ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳの結果により、次の融合ステップのための脾細胞の供給源としてマウス５＃を選んだ。結果は、マウス５＃からの血清が、細胞ブロッキングアッセイでＴＮＦ－α（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号ＴＮＡ－Ｈ５２２８）のＴＮＦＲ２への結合を阻害する最も強力な能力を持っていることを示した。

１回の電気融合を行った。融合細胞を９６ウェルプレートに播種した。陽性クローンをＥＬＩＳＡとＦＡＣＳでスクリーニングした。ヒトＴＮＦＲ１タンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号ＴＮ１－Ｈ５２２２）、ヒトＬＴＢＲ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号ＬＴＲ－Ｈ５２５１）、ヒトオステオプロテゲリン（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号ＴＮＢ－Ｈ５２２０）を、カウンタースクリーンに用いた。陽性クローンを２４ウェルプレートに拡大した。スクリーニングをさらに確認するために上清を採取した。その結果、１５個のクローンが配列決定に選ばれた。実施例４では、スクリーニングの具体的な手順を特定した。

実施例２：ハイブリドーマの配列決定および当該配列

マウス抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の軽鎖および重鎖可変領域の配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法により得た。１５抗体の全ＲＮＡをＲＮＡｐｒｅｐ純細胞キット（ＴＩＡＮＧＥＮ，カタログ番号ＤＰ４３０）を用いて単離し、Ｆａｓｔ Ｋｉｎｇ ｇＤＮＡ Ｄｉｓｐｅｌｌｉｎｇ ＲＴ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ（ＴＩＡＮＧＥＮ，カタログ番号ＫＲ１１８）を用いてｃＤＮＡを合成した。重鎖および軽鎖可変領域をＰＣＲによりクローン化した。すべてのＰＣＲは、高忠実度ポリメラーゼを用いて行った。ＰＣＲで増幅した各抗体のＤＮＡを、ＧＥＮＥＷＩＺ社より配列決定するためにＴＡクローニングベクターにクローニングした。

マウス抗体クローン３２Ａ１Ｄ５および４３Ｂ７Ａ４の可変領域のアミノ酸配列は、以下の通りである：
＞３２Ａ１Ｄ５重鎖可変領域（３２Ａ１Ｄ５－ＶＨ）：配列番号７
＞３２Ａ１Ｄ５軽鎖可変領域（３２Ａ１Ｄ５－ＶＬ）：配列番号８
＞４３Ｂ７Ａ４重鎖可変領域（４３Ｂ７Ａ４－ＶＨ）：配列番号１５
＞４３Ｂ７Ａ４軽鎖可変領域（４３Ｂ７Ａ４－ＶＬ）：配列番号１６

実施例３：キメラ抗体の発現および精製

１５キメラＩｇＧ１抗体を産生する方法を確立した。配列解析後、キメラ抗体の可変領域は、この配列に基づく遺伝子合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって生成された。軽鎖可変領域を、配列番号４２（配列番号４１）で表される軽鎖定常領域をコードする核酸を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に挿入し、抗体の軽鎖を発現するベクターを構築し、重鎖可変領域を、配列番号４０（配列番号３９）で表される重鎖定常領域をコードする核酸を含む発現ベクターｐｃｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン）に挿入し、抗体の重鎖を発現するベクターを構築する。プラスミドは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｍｉｄｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＴＩＡＮＧＥＮ，カタログ番号ＤＰ１０８）を用いて抽出した。また、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターを、ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ番号Ａ２９１３３）を用いてＣＨＯ－Ｓ細胞に１：１の比率で同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標）発現培地で１２日間培養した後、培養上清を採取し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア）による精製に供した。

１５種のクローンはすべてサイズ排除クロマトグラフィーで試験した。各クローンからの試料２０μｇを、ランニングバッファーとして１００ｍＭリン酸ナトリウム＋１００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ７．０を用いてＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラムに注入した。実行時間は３０分であった。測定はすべてＷａｔｅｒｓ ｅ２６９５ ＨＰＬＣで行った。データは、ＯｐｅｎＬＡＢソフトウェアを使用して分析した。１３種のクローンのメインピークはＳＥＣで９５％以上であり、精製キメラ抗体の高純度と完全性を示唆している。

実施例４：キメラ抗体のスクリーニングおよび同定

１５個のキメラ抗体すべてを、ＥＬＩＳＡ結合、細胞ブロッキングによってさらに試験した。また、この抗体は、ＴＮＦＲ２陰性細胞への非特異的結合についても試験され、これは、この抗体が細胞表面でヒトＴＮＦＲ２発現なしに細胞に結合しないことを示した。
ヒト／カニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質に結合した抗ＴＮＦＲ２抗体

ヒトＴＮＦＲ２、ヒトＦｃタグタンパク質（ｈｕＴＮＦＲ２－ｈｕＦｃ、配列番号４６）またはカニクイザルＴＮＦＲ２、ヒトＦｃタグタンパク質（ｃｙｎｏ－ＴＮＦＲ２－ｈｕＦｃ、配列番号４７）を、９６ウェルプレート（Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｘｉｎｙｏｕ，カタログ番号１０００９６Ｈ）上に一晩中４℃でＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）でインキュベーションすることにより固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。実施例３で得られた、段階希釈した抗ＴＮＦＲ２抗体、およびネガティブコントロールＩｇＧ（重鎖：配列番号４３、軽鎖：配列番号４４、ＷＯ２００８０６８２４６Ａ１）を、希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中に用意し、上記固定化タンパク質とともに希釈バッファー中で３７℃にて１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、３７℃でペルオキシダーゼ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ ヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆ（ａｂ′）_２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－０３５－０９７）で１時間インキュベートし、希釈バッファー中で１／２０，０００希釈した後、再びＰＢＳＴで洗浄した。５０μＬ／ｗｅｌｌのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号３４０２８）をプレートに添加し、１５分後、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止した。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。クローンのヒト／カニクイザルＴＮＦＲ２への結合に対するＥＣ_５０および代表的な結合曲線を、図１に示した。

これらの結果は、２つのキメラ抗体３２Ａ１Ｄ５および４３Ｂ７Ａ４が、ヒト（それぞれＥＣ_５００．０４８２０ｎＭおよび０．０６２７２ｎＭで）およびカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質（ＥＣ_５００．００８２０１ｎＭおよび０．００８９７４ｎＭで）に結合できることを示した。
２９３Ｔ細胞の細胞表面に発現したカニクイザルＴＮＦＲ２に結合した抗ＴＮＦＲ２抗体

本発明の抗ヒトＴＮＦＲ２抗体が、細胞表面に発現したカニクイザルＴＮＦＲ２に結合できるかどうかを決定するために、細胞ベースの結合アッセイを確立した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１１６６８０１９）を用いて、２９３Ｔ細胞株を、カニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質（配列番号４９）をコードするヌクレオチドでトランスフェクションした。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号Ａ１１１３８０２）を用いて細胞をスクリーニングした後、カニクイザルサルＴＮＦＲ２を高度に発現する細胞プールを選択した。抗ＴＮＦＲ２抗体３２Ａ１Ｄ５の８点階希釈（段階希釈、濃度は２０μｇ／ｍＬから開始し、４倍希釈）を細胞に加え、得られた混合物をＰＢＳ中で４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。Ｒ－ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ＨｕｍａｎＩｇＧ、Ｆｃ γ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－１１６－０９８）を二次試薬として用いて、２９３Ｔ細胞上に発現したカニクイザルＴＮＦＲ２に対する抗ＴＮＦＲ２抗体の結合活性を検出し、混合物を４℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、ＰＢＳで細胞を再懸濁した。ＴＮＦＲ２結合の解析は、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ５ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。その結果を図２Ａに示した。

これらの結果は、抗体３２Ａ１Ｄ５が、０．９６８２ｎＭのＥＣ_５０で細胞表面に発現したカニクイザルＴＮＦＲ２に特異的に結合したことを示した。
抗ＴＮＦＲ２抗体は、２９３Ｔ細胞の細胞表面に発現するヒトＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－αの結合をブロックした。

本発明の抗ヒトＴＮＦＲ２抗体が、細胞表面に発現したヒトＴＮＦＲ２へのＴＮＦ－αの結合をブロックできるかどうかを決定するために、細胞ベースのアッセイを行う。２９３Ｔ細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号１１６６８０１９）を用いて、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質（配列番号４８）をコードするヌクレオチド分子でトランスフェクションした。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号Ａ１１１３８０２）を用いてスクリーニングを行い、ヒトＴＮＦＲ２を高度に発現する細胞クローンを選抜した。２０μｇ／ｍＬから開始して４倍に希釈した濃度の抗ＴＮＦＲ２抗体（３２Ａ１Ｄ５および４３Ｂ７Ａ４）の８点階希釈を細胞に加え、混合物をＰＢＳ中で４℃で３０分間インキュベーションした。次に、細胞を５０μｇ／ｍＬビオチン－ＴＮＦ－α（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＴＮＡ－Ｈ８２１１）とともに４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＥ－ストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号４０５２０３）を二次試薬として用いて、２９３Ｔ細胞表面に発現したヒトＴＮＦＲ２へのビオチンＴＮＦ－αの結合を検出し、混合物をＰＢＳ中で４℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、ＰＢＳで細胞を再懸濁した。ビオチン－ＴＮＦ－α結合の解析は、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ５フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。その結果を、図２Ｂ（３２Ａ１Ｄ５用）および図２Ｃ（４３Ｂ７Ａ４用）に示した。

これらの結果は、２つのキメラ抗体が、細胞表面に発現したＴＮＦＲ２のＴＮＦ－αへの結合をブロックできることを示した。

実施例５：ヒト化抗体の生成と特徴

２つのキメラ抗体３２Ａ１Ｄ５および４３Ｂ７Ａ４をそれぞれヒト化した。マウス抗体の可変領域の配列を用いて、マウスフレームワークに最も相同性の高いヒト生殖細胞系列を同定した。ＣＤＲ移植と逆突然変異はヒト化で取られた。
３２Ａ１Ｄ５ヒト化

ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従って、６つのＣＤＲを最も適切なヒト生殖細胞系列に挿入することにより、これらの抗体をヒト化した。軽鎖のヒト生殖細胞系列ＩＧＫＶ１－２７＊０１および重鎖のＩＧＫＶ２－５＊０９を、それぞれＣＤＲ移植に使用した。３つのＣＤＲを生殖細胞系列に移植して変異型重鎖可変領域（ＶＨ／ＨＣＶＲ）Ｈｕ３２－Ｈ１およびＨｕ３２－Ｈ２を得、Ｈｃｖｒ上でＨｕ３２－Ｈ２に対するＳ３０Ｎの逆突然変異を作製した。

＞ＩＧＨＶ２－５＊０９（３２Ａ１Ｄ５ＶＨの生殖細胞系列）
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＶＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＬＩＹＷＤＤＤＫＲＹＧＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＨＲＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号６３）
＞Ｈｕ３２－Ｈ１ ＶＨ配列：配列番号２５
＞Ｈｕ３２－Ｈ２ ＶＨ配列：
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＮＴＬＧＭＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＷＷＤＡＤＫＹＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＭＴＧＴＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号６４）

変異型軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ／ＶＬ）Ｈｕ３２－Ｌ１、Ｈｕ３２－Ｌ２、Ｈｕ３２－Ｌ３およびＨｕ３２－Ｌ２Ｖを、３つのＣＤＲを生殖細胞系列に移植して得、Ｈｕ３２－Ｌ２についてはＱ３８Ｈ、Ｙ４９Ｈ、Ｔ６９Ｓ、およびＦ７１Ｙの逆突然変異、Ｈｕ３２－Ｌ３についてはＹ４９Ｈ、Ｔ６９Ｓ、およびＦ７１Ｙの逆突然変異、ならびにＨｕ３２－Ｌ２ＶについてはＱ３８Ｈ、Ｙ４９Ｈ、Ｔ６９Ｓ、およびＦ７１Ｙの逆突然変異及びＩ８３Ｖの突然変異を、それぞれＬＣＶＲ上で作製した。

＞ＩＧＫＶ１－２７＊０１（３２Ａ１Ｄ５ ＶＬの生殖細胞系列）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＫＹＮＳＡＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６５）
＞Ｈｕ３２－Ｌ１
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＩＮＫＦＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＬＱＹＧＶＬＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６６）
＞Ｈｕ３２－Ｌ２
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＩＮＫＦＩＡＷＹＱＨＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＬＱＹＧＶＬＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６７）
＞Ｈｕ３２－Ｌ３ ：配列番号２６
＞Ｈｕ３２－Ｌ２Ｖ ：配列番号２８

４３Ｂ７Ａ４ヒト化

軽鎖のヒト生殖細胞系列ＩＧＫＶ３Ｄ－７＊０１および重鎖のＩＧＨＶ１－１８＊０１を、それぞれＣＤＲ移植に使用した。

変異型重鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＶＨ）Ｈｕ３－Ｈ１、Ｈｕ３－Ｈ２およびＨｕ３－Ｈ３を、３つのＣＤＲを生殖細胞系列に移植して得、Ｈｕ３－Ｈ１についてはＶ２Ｉ、Ｖ６７Ｆ、Ｍ６９Ｆ、およびＴ７１Ｌの逆突然変異、Ｈｕ３－Ｈ２についてはＶ２Ｉ、Ｍ６９Ｆ、およびＴ７１Ｌの逆突然変異、Ｈｕ３－Ｈ３についてはＶ２Ｉ、Ｖ６７Ｆ、Ｔ６８Ａ、Ｍ６９Ｆ、およびＴ７１Ｌの逆突然変異を、それぞれＨＣＶＲ上で作製した。

＞ＩＧＨＶ１－１８＊０１（４３Ｂ７Ａ４ ＶＨの生殖細胞系列）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６８）
＞Ｈｕ３－Ｈ１
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＨＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＴＦＴＬＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＹＧＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６９）
＞Ｈｕ３－Ｈ２
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＨＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＶＴＦＴＬＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＹＧＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７０）
＞Ｈｕ３－Ｈ３ ：配列番号３７

変異軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ／ＶＬ）Ｈｕ３－Ｌ１およびＨｕ３２－Ｌ２を、３つのＣＤＲを生殖細胞配列に直接移植して得、Ｈｕ３－Ｌ１についてはＧ６８Ａの逆突然変異、Ｈｕ３－Ｌ２についてはＩ５８Ｖ、Ａ６０Ｄ、Ｓ６３Ｔ、およびＧ６８Ａの逆突然変異を、それぞれＬＣＶＲ上で作製した。

＞ＩＧＫＶ３Ｄ－７＊０１（４３Ｂ７Ａ４ ＶＬの生殖細胞系列）
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＤＹＮＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号７１）
＞Ｈｕ３－Ｌ１ ：配列番号３８
＞Ｈｕ３－Ｌ２
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＡＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＧＱＳＹＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号７２）

上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＤＮＡを合成し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号：４０、登録番号：Ｐ０１８５７）をコードするヌクレオチド（配列番号３９）を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン）と、ヒトκ軽鎖定常領域（配列番号４２、登録番号Ｐ０１８３４）をコードするヌクレオチド（配列番号４１）を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１とにそれぞれサブクローニングした。プラスミドは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｍｉｄｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＴＩＡＮＧＥＮ，カタログ番号ＤＰ１０８）を用いて抽出した。この抗体の発現と精製は、実施例３で説明した手順に従う。。

ヒト化抗体ｈｕ３２－Ｃは、ＶＨ Ｈｕ３２－Ｈ１およびＶＨ Ｈｕ３２－Ｌ３を含み、ヒト化抗体ｈｕ３－Ｅは、ＶＨＨｕ３－Ｈ３およびＶＬＨＵ３－Ｌ１を含む。ｈｕ３２－Ｃ、ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１の変異体は、ＶＨ Ｈｕ３２－Ｈ１およびＶＬＨｕ３２－Ｌ２Ｖを含む。

実施例６：抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体の評価

予備的評価は、実施例４で説明したように、ＥＬＩＳＡ結合、ＥＬＩＳＡブロッキング、細胞ブロッキングを含む、キメラ抗体のスクリーニングおよび同定手順に従う。これらの結果に基づき、ヒト化抗体ｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３－Ｅを選択し、さらなるインビトロとインビボの機能評価を行った。

ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、抗ＴＮＦＲ２抗体がｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３－Ｅであり、コーティングされたタンパク質がヒトＴＮＦＲ２、マウスＦｃ－ｔａｇ（配列番号４５）に置き換えられたことを除いては、実施例４と同様に行われた。

ヒト化抗体のヒトＴＮＦＲ２タンパク質への結合の結果は、図３Ａ（ｈｕ３２－Ｃ）および図３Ｂ（ｈｕ３－Ｅ）に見られる。

これらの結果は、２つのヒト化抗体が両方とも、０．０６９７０ ｎＭ （ｈｕ３２－Ｃ）および０．０５０７９ ｎＭ（ｈｕ３－Ｅ）のＥＣ_５０で、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合できることを示した。
抗ＴＮＦＲ２抗体はＴＮＦＲ２とＴＮＦ－α間の相互作用を阻害した

高結合性の透明ポリスチレン９６ウェルプレートを、ヒトＴＮＦ－αタンパク質１μｇ／ｍＬの５０μＬ／ｗｅｌｌでコーティングし、そのタグ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号ＴＮＡ－Ｈ５２２８）を炭酸塩バッファーに入れ、４℃で一晩インキュベートした。次いで、洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を使用して自動プレートウォッシャーでプレートを１回洗浄した。２００μＬのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベーションした。段階希釈した抗体（ｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３－Ｅ）、および希釈バッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）（開始濃度：２０μｇ／ｍＬ（混合前の濃度）、４倍希釈）で希釈したネガティブコントロールＩｇＧを調製し、０．１μｇ／ｍＬ（混合前濃度）ｈＴＮＦＲ２－ｍＦｃ（配列番号４５）と体積比１：１で混合し、次いで、混合希釈を９６ウェルプレートに加え、希釈バッファー（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡ）中で室温にて１時間インキュベートした。自動プレートワッシャーで洗浄バッファーを使用して２回の洗浄を行った。希釈バッファー中のＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１５－０３５－１６４）５０μＬ／ｗｅｌｌを、プレートの各ウェルに添加した。その後、ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間インキュベートし、２５０μＬ／ウェル洗浄バッファーでプレートを２回洗浄した。最後に、５０μＬ／ｗｅｌｌのＴＭＢを各ウェルに加え、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を終了した。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。

ヒト化抗体によるＴＮＦαへのヒトＴＮＦＲ２結合をブロッキングした結果は、図３Ａ（ｈｕ３２－Ｃ）および図３Ｂ（ｈｕ３－Ｅ）に見られる。

これらの結果は、２つのヒト化抗体がＴＮＦＲ２のＴＮＦ－αへの結合をブロックできることを示した。

また、細胞表面でのカニクイザルＴＮＦＲ２に結合する、および細胞表面でのＴＮＦ－αのヒトＴＮＦＲ２への結合をブロッキングする、ヒト化抗体の能力を調べた。アッセイ手順は、実施例４と同様であった。細胞ベースのアッセイの結果を図４に示した。

細胞ベースのアッセイの結果は、ヒト化抗体ｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３－Ｅが両方とも、ＴＮＦＲ２に結合する、およびＴＮＦ－α－ＴＮＦＲ２相互作用をブロッキングする能力を有することを示した。

実施例７：抗ＴＮＦＲ２抗体の結合親和性

この例では、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６（ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を用いて、抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の結合親和性（一価ＫＤ）を測定した。

簡単に言えば、ＩｇＧ Ｆｃキャプチャーセンサーのヒント（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，カタログ番号１８－５０６０）をＰＢＳ中、室温で１０分間水和した。動態アッセイを９６ウェルプレートで行い、各ステップで次の時間を用いて実施した；ａ）ＰＢＳで１００秒間のベースラインのバランスを取る；ｂ）抗ヒトＴＮＦＲ２抗体（ｈｕ３－Ｅ、ｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３２Ｃ－Ｖ１）を少なくとも０．３ナノメートルまで負荷する；ｃ）１０００秒間のベースラインのバランスを取る；ｄ）１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２ｎＭ、および１．５６ｎＭの連続濃度（ｓｅｒｉａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）で、それぞれ８０秒間、タグ付きヒトＴＮＦＲ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号１０４１７－Ｈ０８Ｈ）またはカニクイザルＴＮＦＲ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号９０１０２－Ｃ０８Ｈ）と結合する；ｅ）ＰＢＳで６００秒間解離を行う。Ｏｃｔｅｔソフトウェアを使用して、データセットに１：１グローバル フィッティング モデルを適用した。

３つの抗ヒトＴＮＦＲ２抗体の親和性を測定し、以下の表３に示した。

これらの結果は、３つの抗体がいずれも、ヒトＴＮＦＲ２に特異的に結合することを示唆した。特に、抗体ｈｕ３－ＥはヒトＴＮＦＲ２に対して５．３２ｎＭ、カニクイザルＴＮＦＲ２に対して３．６２ｎＭの一価ＫＤを示した、抗体ｈｕ３２－Ｃは、ヒトＴＮＦＲ２に対して０．６１ｎＭ、カニクイザルＴＮＦＲ２に対して０．３７ｎＭの一価ＫＤを示した、抗体ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１は、ヒトＴＮＦＲ２に対して０．９１ｎＭ、カニクイザルＴＮＦＲ２に対して０．４１ｎＭの一価ＫＤを示した。

実施例８：ヒト化抗体のインビトロ評価
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を共刺激してＩＦΝγを放出させる

ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから採取した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｅｐＭａｔｅ５０チューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で単核細胞を分離した。

全ＣＤ８＋Ｔ細胞をネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９６－４９５）で製造元の指示に従って精製した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３７９９）を、０．５μｇ／ｍＬの機能グレード抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１６－００３７－８５）および抗ＴＮＦＲ２抗体（ｈｕ３－Ｅおよびｈｕ３２－Ｃ）の段階希釈またはネガティブ コントロールＩｇＧ（開始濃度６０μｇ／ｍＬから希釈、３倍段階希釈）でＰＢＳ中、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングされたプレートをＤＰＢＳバッファー（Ｈｙｃｌｏｎｅ，カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）で２回洗浄した。２００μＬの培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号２２４００）完全培地、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）および１μｇ／ｍＬ可溶性抗ＣＤ２８ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号３０２９３４）を含む）中の１×１０^５ＣＤ８＋Ｔ細胞を、各ウェルに添加し、３７℃で７２時間培養した。培養上清を集め、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ２０２）でＩＦνγレベルについて試験を行った。その結果を図５に示した。図中のアッセイバッファーは、ＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍＬの機能グレード抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１６－００３７－８５）のみを指す。

これらの結果は、ｈｕ３－ＥがＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して用量依存的にＩＦΝγを放出できるが、ｈｕ３２－Ｃは上記濃度では明らかな効果がないことを示した。

抗ＴＮＦＲ２抗体共刺激によるＴ細胞の増殖

ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから採取した。上記のように、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｅｐＭａｔｅ５０チューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で単核細胞を分離した。後で使用するために、全ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、ネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９６－４９５およびカタログ番号１３０－０９６－５３３）で精製した。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３７９９）を、０．５μｇ／ｍＬの機能グレードの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１６－００３７－８５）および抗ＴＮＦＲ２抗体（ｈｕ３－Ｅおよびｈｕ３２－Ｃ）の段階希釈またはネガティブ コントロールＩｇＧ（開始濃度６０μｇ／ｍＬから希釈、３倍段階希釈）でＰＢＳ中、４℃で一晩コーティングした。翌日、コーティングされたプレートをＤＰＢＳバッファー（Ｈｙｃｌｏｎｅ，カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）で２回洗浄した。２００μＬの培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号２２４００）完全培地、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）および１μｇ／ｍＬ可溶性抗ＣＤ２８ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号３０２９３４）を含む）中の１×１０^５ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、各ウェルに添加し、３７℃で７２時間培養した。７２時間後、ウェル当たり１００μＬの細胞培養上清を廃棄し、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ７５７２）を添加し、よく混合した。５分後、１００μＬの混合物を、新しい９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３９１７）に移した。マイクロプレートリーダーＦ２００（Ｔｅｃａｎ，カタログ番号Ｆ２００）を用いて、アッセイプレートを読み取った。結果を図６に示した。図中のアッセイ用バッファーは、０．５μｇ／ｍＬの機能グレードの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１６－００３７－８５）コーティング用バッファーのみを指す。

これらの結果は、ｈｕ３－Ｅが、Ｔ細胞の増殖を刺激するが、ｈｕ３２－Ｃは上記濃度では明らかな効果がないことをさらに示した。

インビトロでの抗ＴＮＦＲ２抗体共刺激によって媒介されるＴ細胞の活性化はＦｃ架橋に依存していた。

ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから採取した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｅｐＭａｔｅ５０チューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で単核細胞を分離した。

後で使用するために、全ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９６－４９５）で精製した。プレート結合抗体アッセイ（ｐｌａｔｅ－ｂｏｕｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓｓａｙ）では、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３７９９）を、０．５μｇ／ｍＬの機能グレードの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１６－００３７－８５）および抗ＴＮＦＲ２抗体（ｈｕ３－Ｅおよびｈｕ３２－Ｃ）の段階希釈またはネガティブ コントロールＩｇＧ（開始濃度３０μｇ／ｍＬから希釈、３倍段階希釈）で、４℃で１晩コーティングした。可溶性抗体のアッセイでは、９６ウェルプレートを０．５μｇ／ｍＬの機能グレードの抗ＣＤ３のみでコーティングした。

翌日、コーティングされたプレートをＤＰＢＳバッファー（Ｈｙｃｌｏｎｅ，カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）で２回洗浄した。プレート結合抗体アッセイでは、２００μＬの培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号２２４００）完全培地、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）および１μｇ／ｍＬ可溶性抗ＣＤ２８ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号３０２９３４）を含む）中の１×１０^５ＣＤ８＋Ｔ細胞を、各ウェルに添加し、３７℃で７２時間培養した。

可溶性抗体アッセイでは、２００μＬの培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号２２４００）完全培地、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）および１μｇ／ｍＬ可溶性抗ＣＤ２８ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号３０２９３４）を含む）中の１×１０^５ＣＤ８＋Ｔ細胞を、各ウェルに添加し、その次、抗ＴＮＦＲ２抗体（ｈｕ３－Ｅおよびｈｕ３２－Ｃ）の段階希釈物およびネガティブコントロールＩｇＧ（３０μｇ／ｍＬの開始濃度から希釈、および３倍段階希釈）をそれぞれ添加した。培養物を３７℃で７２時間培養した。７２時間後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＤＹ２０２）でＩＦＮγレベルをテストし、その結果を図７に示した。

これらの結果は、ｈｕ３－ＥがＦｃ架橋に依存して、インビトロで共刺激によってＴ細胞を活性化できることを示した。

実施例９：ラットにおけるヒト化抗体の薬物動態

ラットにおける抗ＴＮＦＲ２ヒト化抗体の薬物動態プロファイルを評価した。研究における動物のケアと用途（使用）を含む手順は、ＰｈａｍａＬａｇａｎｃｙによって審査および承認された。

３匹のナイーブラット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｉｐｐｒ－ＢＫ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を各抗体に使用した。この研究では、抗ＴＮＦＲ２抗体（ｈｕ３－Ｅ、ｈｕ３２－Ｃ）を、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇの単回投与でラットに静脈内注射した。血液試料（サンプル）を、０～３３６時間（０～１４日、０日目、１日目で１０分、３０分、１時間、４時間目、６時間目、および２日目、４日目、７日目、１０日目および１４日目）の様々な時点で採取した。全試料を処理して血清を得た後、分析するまで血清を－７０℃～－８６℃で凍結保存した。血清中の抗ＴＮＦＲ２抗体の濃度を測定した。薬物動態パラメータを表４に示した。

ヒトＴＮＦＲ２、ヒトＦｃタグタンパク質（ｈｕＴＮＦＲ２－ｈｕＦｃ，配列番号４６）を、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）中、４℃で一晩インキュベートすることにより、０．５μｇ／ｍＬで９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，カタログ番号４２５９２）に固定化した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡと３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。抗ＴＮＦＲ２抗体（ｈｕ３２－Ｃまたはｈｕ３－Ｅ）を、血清希釈バッファー（ＰＢＳは、２％ｖ／ｖラット血清を含む、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含む）で０．１２μｇ／ｍＬで希釈し、３倍段階希釈を６回行い、合計７濃度の抗体溶液を標準曲線として得た。同時に、それぞれ高、中、低品質コントロールとして４０ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬの抗体を、血清希釈バッファーで希釈した。全てのラット血清試料（サンプル）を、投与前の混合ラット血清と希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で希釈し、最終濃度を４０～０．４ｎｇ／ｍＬの範囲に保ち、試料希釈には２％ｖ／ｖのラット血清が含まれた。標準曲線、品質管理および試料をプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、希釈バッファーで１／２０，０００に希釈したペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ′）_２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－０３５－０９７）で３７℃にて１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴで再度洗浄した。５０μＬ／ｗｅｌｌ ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号３４０２８）をプレートに加え、１５分後、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止した。４５０ｎｍ～６２０ｎｍでの吸光度を測定した。

２つのヒト化抗体ｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３－Ｅの薬物動態は、ラットでは正常である。

実施例１０：ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質へのファミリー交差結合

ハイブリドーマクローンは、ＴＮＦＲ１、ＬΤβＲ、およびオステオプロテゲリンには結合できなかったが、他のタイプのＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質が存在する。ヒト化抗体ｈｕ３－Ｅとｈｕ３２－Ｃのヒト４－１ ＢＢ、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭへの結合を試験した。

４－１ＢＢ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号＃１００４１－Ｈ０８Ｈ），ＣＤ４０（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号１０７７４－Ｈ０８Ｈ），ＯＸ４０（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号１０４８１－Ｈ０８Ｈ），ＧＩＴＲ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号１３６４３－Ｈ０８Ｈ），ＣＤ２７（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号１００３９－Ｈ３１Ｈ）およびＨＶＥＭ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１０３３４－Ｈ０３Ｈ）を、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）で一晩４℃でインキュベーションし、９６－ｗｅｌｌプレート上に固定化した。プレートを、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで３７℃にて１時間ブロックした。ブロッキング後、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。段階希釈した抗ＴＮＦＲ２抗体を希釈バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）（開始濃度０．４μｇ／ｍＬ、３倍希釈）で調製し、プレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）。次に、希釈バッファーで１：２００００に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ′）_２ ＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－０３５－０９７）を、ＥＬＩＳＡプレートとしてプレートの各ウェルに加えた。その後、ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。最後に、５０μＬ／ｗｅｌｌのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号３４０２８）を各ウェルに加え、１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を終了した。プレートを４５０ｎｍでマイクロプレートリーダー上で読み取った。

結果を図８に示した。これらの結果は、ヒト４－１ＢＢ、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、またはＨＶＥＭタンパク質にはヒト化抗体ｈｕ３－Ｅおよびｈｕ３２－Ｃが結合しないことを示唆した。

実施例１１：抗ＴＮＦＲ２抗体はインビボで抗腫瘍効果を示した。

抗ＴＮＦＲ２抗体のインビボでの効果を、結腸癌を有するｈＴＮＦＲ２ ＫＩマウスで調べた。

この実験では、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外部分を発現するヒト化マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ^{ｅｍ２（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）Ｓｍｏｃ}（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｂｉｏｄｉｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）を４～５週間用いた。

ＭＣ３８細胞（ＯＢｉＯ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏｒｐ．，Ｌｔｄ．）は、レトロウイルス形質導入を用いて、卵白アルブミン（ＯＶＡ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ５９９５６．１）をコードする核酸で形質導入された。続いて、細胞を限界希釈によってクローン化した。ＯＶＡタンパク質を高度に発現するクローンをＭＣ３８－ＯＶＡクローンとして選択した。ＭＣ３８－ＯＶＡクローンは、１０％のウシ胎児血清および４μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号Ａ１１１３８－０３）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１１９９５－０６５）で維持された。

５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ^{ｅｍ２（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）Ｓｍｏｃ}マウスに１×１０^６個のＭＣ３８－ＯＶＡ細胞を皮下移植し、０日目に平均腫瘍体積が約６０ｍｍ^３（長さ×幅^２／２）に達した０日目に３群にランダム化した。０日目、３日目、７日目、１０日目には、マウスにｈｕ３２－Ｃ（１５ｍｇ／ｋｇ）、ｈｕ３－Ｅ（１５ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳをそれぞれ腹腔内投与した。試験中、週に２回キャリパー測定により腫瘍容積をモニタリングした。

２つの抗ＴＮＦＲ２抗体による治療（処置）は両方とも、ＰＢＳ群と比較して有意な腫瘍増殖阻害（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）をもたらした。データを以下表５に示す。

実施例１２：ｈｕ３２－Ｃ純度の向上

ｈｕ３２－Ｃ純度を向上させるために、ＦＲ領域に対する単一の点変異を行った。Ｑ３８ＨおよびＩ８３Ｖ置換をｈｕ３２－Ｃ軽鎖のＦＲ領域で行い、ｈｕ３２－Ｖ１と名付けられた抗体を得た。ｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３２Ｃ－Ｖ１は、実施例３で説明したように、同じ生成物下で両方とも発現および精製された。生成物の純度はＳＥＣ－ＨＰＬＣにより測定し、親和性はＦｏｒｔｅｂｉｏにより測定した（実施例７参照）。ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を図９に示し、親和性結果を表３に示した。

これらの結果から、ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１の親和性はｈｕ３２－Ｃと一致するが、発現産物の純度は大幅に向上したことがわかった。抗体のメインピークの割合は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣで９１．４％（ｈｕ３２－Ｃ）から９７．０％（ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１）に増加した。

これらの結果は、Ｉ８３Ｖ変異が抗体ｈｕ３２－Ｃの純度を向上できるが、親和性などのその特性に影響を与えないことを示唆した。

実施例１３：エピトープマッピング

本発明のヒト化抗体がその標的タンパク質であるヒトＴＮＦＲ２に結合するエピトープを調べるために、ヒトＴＮＦＲ２（配列番号５０）の細胞外ドメインの１１個のセグメントを構築し、マウスＴＮＦＲ２タンパク質（配列番号５１）の細胞外ドメインの対応するセグメントを置換した。その結果、当該領域のヒトＴＮＦＲ２の各セグメントが置換された１１個のマウスＴＮＦＲ２変異体（配列番号５２～６２）を得た。

１１個のＴＮＦＲ２タンパク質セグメント配列を構築し、以下の表６にリストした。

結合アッセイＥＬＩＳＡによれば、１１個の変異体、ヒトＴＮＦＲ２およびマウスＴＮＦＲ２タンパク質を、本発明の抗体（ｈｕ３－Ｅおよびｈｕ３２Ｃ－Ｖ１）との結合について試験した。異なるＴＮＦＲ２タンパク質をプレート上に０．５μｇ／ｍＬでコーティングし、一晩ブロックした。抗体を開始濃度０．４μｇ／ｍＬから３倍段階希釈してマイクロタイタープレートに加え、３７℃でインキュベートした。その後のステップは、ＥＬＩＳＡ結合法と一致していた（実施例４参照）。

結合アッセイの結果は、ｈｕ３－Ｅおよびｈｕ３２Ｃ－Ｖ１が両方ともヒトＴＮＦＲ２に結合するが、マウスＴＮＦＲ２には結合しないことを示した。

これらの結果はさらに、ヒト化抗体ｈｕ３－Ｅが、（０１９－０－０．５に結合する）１Ｌ－３１Ｃ上のヒトＴＮＦＲ２のエピトープに結合することを示唆した。ヒト化抗体ｈｕ３－Ｅは、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質の変異体０１９－０－０．５と０１９－０－１を除いて、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質の変異体（ｖａｒｉａｎｔ）０１９－１，０１９－２，０１９－３，０１９－４，０１９－５，０１９－６，０１９－０．５－１および０１９－０．５－２には結合しなかった。したがって、ヒトＴＮＦＲ２の結晶構造解析によれば、Ｑ４Ａ、Ｅ１３Ａ、Ｓ１６ＡおよびＱ２６Ａのアミノ酸変異をヒトＴＮＦＲ２に対して別々に行い、上記ステップによるＥＬＩＳＡ結合法でｈｕ３－Ｅへの結合を調べた。これらの結果は、ヒトＴＮＦＲ２の配列上の２６番目のグルタミンが、ヒトＴＮＦＲ２に結合したｈｕ３－Ｅの重要なアミノ酸であることを示した。異なるＴＮＦＲ２に対する抗体ｈｕ３－Ｅ結合の結果を、図１０に示した。

別のヒト化抗体ｈｕ３２－Ｃは、（０１９－１２に結合する）１Ｌ－９６ＣＴＮＦＲ２タンパク質に結合した。突然）変異体（ｍｕｔａｔｉｏｎ）ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１は、ｈｕ３２－Ｃと同じヒトＴＮＦＲ２の結合エピトープを有する。異なるＴＮＦＲ２セグメントへの抗体ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１の結合の結果を、図１１に示した。ヒト化抗体ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１は０１９－１２のみに結合し、ヒトＴＮＦＲ２タンパク質の他の変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、０１９－２、０１９－３、０１９－４、０１９－５、０１９－６、０１９－０．５－１、０１９－０．５－２、および０１９－０－０．５は、ヒト化抗体ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１と結合しなかった。また、０１９－１および０１９－０－１は、ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１との弱いが無視できない結合シグナルを示し、これは、配列１７Ｔ－５４Ｄがｈｕ３２Ｃ－Ｖ１のエピトープにアミノ酸を含み得ることを示唆した。

実施例１４：抗ＴＮＦＲ２抗体は、抗マウスＰＤ１抗体との組み合わせの有無にかかわらず、およびＦｃ効果の有無にかかわらず、インビボで抗腫瘍効果を示した。

インビボでの抗ＴＮＦＲ２抗体の有効性を、結腸癌を有するｈＴＮＦＲ２ ＫＩマウスで調べた。

Ｈｕ３－Ｅ（ｍｕ）、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ（ＥＵナンバリング）アミノ酸（突然）変異（Ｆｃ機能削除）を有する抗ＴＮＦＲ２抗体を構築した。この抗体の発現と精製は、実施例３で説明した手順に従う。

この実験では、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外部分を発現する４～５週齢のヒト化マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ－ＴＮＦＲＳＦ１ｂ^{ｅｍ２（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）Ｓｍｏｃ}は、上海モデル生物センター（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）から購入した。

ＭＣ３８細胞（ＯＢｉＯ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏｒｐ．，Ｌｔｄ．）は、レトロウイルス形質導入を用いて、卵白アルブミン（ＯＶＡ ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ５９９５６．１）をコードする核酸で形質導入された。続いて、細胞を限界希釈によってクローン化した。ＯＶＡタンパク質を高度に発現するクローンをＭＣ３８－ＯＶＡクローンとして選択した。ＭＣ３８－ＯＶＡクローンは、１０％のウシ胎児血清および４μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号Ａ１１１３８－０３）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１１９９５－０６５）で維持された。

５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ^{ｅｍ２（ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）Ｓｍｏｃ}マウスに１×１０^６個のＭＣ３８－ＯＶＡ細胞を皮下移植し、０日目に平均腫瘍体積が８０～１００ｍｍ^３（長さ×幅^２／２）に達した時点で６群にランダム化した。０日目、３日目、７日目、１０日目、および１４日目に、マウスにｈｕ３－Ｅ（ｍｕ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、ｈｕ３－Ｅ（３ｍｇ／ｋｇ）、ｈｕ３－Ｅ（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ１抗体（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ，カタログ番号ＢＥ０１４６）（１ｍｇ／ｋｇ）、ｈｕ３－Ｅ（１０ｍｇ／ｋｇ）付き抗ＰＤ１抗体（１ｍｇ／ｋｇ）、およびＰＢＳをそれぞれ腹腔内投与した。試験中、週に２回キャリパー測定により腫瘍容積をモニタリングした。各群に６匹のマウスが存在する。

両方の抗ＴＮＦＲ２抗体の治療（処置）は、ＰＢＳ群と比較して有意な腫瘍増殖阻害をもたらした。Ｆｃ部分は、ｈｕ３－Ｅの有効性に直接関連している。（突然）変異によりＦｃ－ＦｃγＲの相互作用を除去することで、抗ＴＮＦＲ２抗体の抗腫瘍効果を低下させる、同時に、抗ＴＮＦＲ２抗体は、抗ＰＤ１抗体と組み合わせて有意な抗腫瘍効果を示した。これらの２つの抗体を単独で使用する場合より、組み合せ効果の方が良好である。グループ化の詳細と結果を以下の表７に示した。

実施例１５：活性化ＰＢＭＣ上で発現するヒトＴＮＦＲ２に結合する抗ＴＮＦＲ２抗体

本発明の抗ヒトＴＮＦＲ２抗体が、活性化ＰＢＭＣｓ上で発現しているヒトＴＮＦＲ２に結合できるかどうかを決定するために、細胞ベースの結合アッセイを確立した。ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから採取した。ＰＢＭＣを、コーティングされた機能グレードの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１６－００３７－８５、１μｇ／ｍＬ）で２日間刺激し、次いで、完全培地（９０％ＲＰＭＩ １６４０ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号２４０００８９）と１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）とを含有）で培養した。その後１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を培地に加えて、さらに７日間培養した。次に、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）を使用して２回洗浄した。１．５×１０^５個のＰＢＭＣ細胞を、抗ＴＮＦＲ２抗体ｈｕ３－Ｅ（開始濃度２０μｇ／ｍＬから希釈、および４倍段階希釈）およびネガティブコントロール ＩｇＧの段階希釈でそれぞれ再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳを用いて洗浄した後、二次試薬（１：２００希釈）としてＲ－ＰＥ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１０９－１１６－０９８）試薬を用いて細胞を再懸濁した。混合物をＰＢＳ中、４℃で３０分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞をＰＢＳに再置換した。特異的結合の解析は、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ５フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。

結果を図１２に示した。結果から、ｈｕ３－Ｅが、二人のドナーからの活性化ＰＢＭＣ上で発現したＴＮＦＲ２に結合できることが分かった。そうでない場合、ＩｇＧコントロールは、二人のドナーから混合された活性化ＰＢＭＣに対する特異的結合能を持たなかった。

実施例１６：Ｔｒｅｇｓに対するインビトロでのＡＤＣＣ効果

９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３５９９）を４℃で一晩、３μｇ／ｍＬの機能グレード抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１６－００３７－８５）でコーティングした。翌日、コートされたバッファーを廃棄し、後で使用するためにプレートを２回洗浄した。Ｓｃｈｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した健康なドナーからのＰＢＭＣ細胞を解凍して採取した。ＰＢＭＣ細胞からの全ＣＤ４＋Ｔ細胞をメーカーの指示に従ってネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９６－５３３）で精製した。そして、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、２００μＬのＴｒｅｇ誘導バッファー（１０％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８および０．０４ｍＭのβ－メルカプトエタノールを含有）中の１～５×１０^４細胞／ウェルで、抗ＣＤ３コーティング９６ウェルプレートにプレーティングし、５日間培養して、次の用途のために、誘導されたＴｒｅｇ細胞を得た。

ＰＢＭＣ細胞からの全ＮＫ細胞を、メーカーの指示に従い、ネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９２－６５７）で精製した。ＡＤＣＣアッセイでは、５０μＬアッセイバッファー（１％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）を含む９９％ＭＥＭ－α（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号４１０６１－０２９））中の２０，０００細胞／ウェルのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導Ｔｒｅｇ細胞を、９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３５９９）に添加した。５０μＬ／ウェルのｈｕ３－Ｅまたはｈｕ３２－Ｃの６点段階希釈（段階希釈、最終アッセイ濃度は１．２μｇ／ｍＬから開始し、５倍希釈）および抗ＴＮＦＲ２抗体－００１－Ｈ１０（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ、ＷＯ２０２００８９４７４Ａ１、重鎖：配列番号７４、軽鎖：配列番号７５）を、コントロールとしてそれぞれ細胞に添加した。次に、１％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）を含む１００μＬ９９％ＭＥＭ－α（カタログ番号４１０６１－０２９）と２００ＩＵ／ｍＬヒト組み換えＩＬ－２アッセイバッファー中の２００，０００細胞／ウェルの精製ヒトＮＫエフェクタ細胞を、各ウェルに添加した。９６ウェルプレートを３７℃，５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、９６ウェルプレートを３分間低速（２０００ｒｐｍ）で遠心分離し、細胞ペレットを沈殿させた。その後、５０μＬ／ｗｅｌｌの上清をプレートから慎重に吸引し、新しい９６ウェルプレートに移した。同量のＬＤＨ細胞毒性検出溶液（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１１６４４７９３００１）をプレートに加え、室温で３０分間インキュベートした。波長４９０ｎｍのＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０プレートリーダーにより吸光度を読み取った。その結果を図１３に示した。

これらの結果は、ｈｕ３－Ｅは誘導Ｔｒｅｇ細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘導できず、ｈｕ３２－Ｃは細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘導できることを示した。

実施例１７：ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するインビトロでのＡＤＣＣ効果

９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３５９９）を４℃で一晩、１μｇ／ｍＬの機能グレード抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号１６－００３７－８５）でコーティングした。翌日、コートされたバッファーを廃棄し、後で使用するためにプレートを２回洗浄した。Ｓｃｈｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した健康なドナーからのＰＢＭＣ細胞を解凍して採取した。ＰＢＭＣ細胞からの全ＣＤ８＋Ｔ細胞をメーカーの指示に従ってネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９６－４９５）で精製した。そして、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、２００μＬアッセイバッファー（１０％ＦＢＳ、１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８を含むＲＰＭＩ１６４０）中の１×１０^５細胞／ウェルで、抗ＣＤ３コーティング９６ウェルプレートにメッキし、４日間培養した。

ＰＢＭＣ細胞からの全ＮＫ細胞を、メーカーの指示に従い、ネガティブセレクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０－０９２－６５７）で精製した。ＡＤＣＣアッセイでは、５０μＬアッセイバッファー（１％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）を含む９９％ＭＥＭ－α（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号４１０６１－０２９））中の１５，０００細胞／ウェルのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を、９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ番号３５９９）に添加した。５０μＬ／ウェルのｈｕ３－Ｅまたはｈｕ３２－Ｃの６点段階希釈（段階希釈、最終アッセイ濃度は１．２μｇ／ｍＬから開始し、５倍希釈）および抗ＴＮＦＲ２抗体－００１－Ｈ１０（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ、ＷＯ２０２００８９４７４Ａ１、重鎖：配列番号７４、軽鎖：配列番号７５）を、コントロールとしてそれぞれ細胞に添加した。次に、１％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１００９９－１４１）を含む１００μＬ９９％ＭＥＭ－α（カタログ番号４１０６１－０２９）と２００ＩＵ／ｍＬヒト組み換えＩＬ－２アッセイバッファー中の１５０，０００細胞／ウェルの精製ヒトＮＫエフェクタ細胞を、各ウェルに添加した。９６ウェルプレートを３７℃，５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、９６ウェルプレートを３分間低速（２０００ｒｐｍ）で遠心分離し、細胞ペレットを沈殿させた。その後、５０μＬ／ｗｅｌｌの上清をプレートから慎重に吸引し、新しい９６ウェルプレートに移した。同量のＬＤＨ細胞毒性検出溶液（Ｒｏｃｈｅ，カタログ番号１１６４４７９３００１）をプレートに加え、室温で３０分間インキュベートした。波長４９０ｎｍのＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０プレートリーダーにより吸光度を読み取った。その結果を図１４に示した。

結果によれば、ｈｕ３２－ＣがＡＤＣＣ効果を誘導できる一方で、ｈｕ３－Ｅは誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対してＡＤＣＣ効果を誘導できないことが分かった。

配列表
Ｉｇ ｂｌａｓｔおよびａｂｙｓｉｓによって分析された配列であり、結果はＫａｂａｔ形式で表される。
キメラ抗体配列
３２Ａ１Ｄ５の配列

＞３２Ａ１Ｄ５－ＶＨ：配列番号７
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＮＴＬＧＭＧＶＧＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＷＷＤＡＤＫＹＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＤＴＳＫＮＨＶＦＬＫＩＡＮＡＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲＭＴＧＴＲＹＦＤＶＷＧＴＧＴＴＶＴＶＳＳ

＞３２Ａ１Ｄ５－ＶＬ：配列番号８
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＫＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＩＮＫＦＩＡＷＹＱＨＫＰＧＥＧＰＲＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＹＳＦＳＩＮＮＬＥＰＥＤＩＡＳＹＹＣＬＱＹＧＶＬＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ

４３Ｂ７Ａ４の配列

＞４３Ｂ７Ａ４－ＶＨ：配列番号１５
ＱＡＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＧＭＳＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＨＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＦＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＬＹＧＶＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ

＞４３Ｂ７Ａ４－ＶＬ：配列番号１６
ＮＩＶＭＴＱＳＰＫＳＭＳＭＳＶＧＥＲＶＴＬＳＣＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＥＱＳＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＡＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＤＹＨＣＧＱＳＹＴＹＰＹＴＦＧＧＧＴＴＬＥＩＫ
ｈｕ３２－Ｃの配列（Ｈｕ３２－Ｈ１／Ｈｕ３２－Ｌ３）

＞ＶＨ核酸配列（Ｈｕ３２－Ｈ１）：配列番号２３
ＣＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＡＧＴＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＡＧＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＴＡＴＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
＞ＶＬ核酸配列（Ｈｕ３２－Ｌ３）：配列番号２４
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＴＴＴＡＴＣＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ

＞ｈｕ３２－Ｃ（Ｈｕ３２－Ｈ１／Ｈｕ３２－Ｌ３）
＞ＶＨアミノ酸配列（Ｈｕ３２－Ｈ１）：配列番号２５
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＬＧＭＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＷＷＤＡＤＫＹＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＭＴＧＴＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

＞ＶＬアミノ酸配列（Ｈｕ３２－Ｌ３）：配列番号２６
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＩＮＫＦＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＬＱＹＧＶＬＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

配列ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１（Ｈｕ３２－Ｈ１／Ｈｕ３２－Ｌ２Ｖ）（Ｉｇｂｌａｓｔおよびａｂｙｓｉｓにより解析され、Ｋａｂａｔ形式で表された結果）

＞ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１（Ｈｕ３２－Ｈ１／Ｈｕ３２－Ｌ２Ｖ）
ＶＨ核酸配列（Ｈｕ３２－Ｈ１）：配列番号２３
ＣＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＴＡＡＧＴＡＣＴＡＴＡＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＡＧＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＣＧＧＴＡＴＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
＞ＶＬ核酸配列（Ｈｕ３２－Ｌ２Ｖ）：配列番号２７
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＡＴＡＡＧＴＴＴＡＴＣＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ

＞ＶＨアミノ酸配列（Ｈｕ３２－Ｈ１）：配列番号２５
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＬＧＭＧＶＧＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＷＷＤＡＤＫＹＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＭＴＧＴＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ

＞ＶＬアミノ酸配列（Ｈｕ３２－Ｌ２Ｖ）：配列番号２８
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＩＮＫＦＩＡＷＹＱＨＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＬＱＹＧＶＬＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ

ｈｕ３－Ｅ（Ｈｕ３－Ｈ３／Ｈｕ３－Ｌ１）（Ｉｇｂｌａｓｔおよびａｂｙｓｉｓで解析、結果はＫａｂａｔ形式で記述）およびＨｕ３－Ｅ（ｍｕ）（（Ｈｕ３－Ｈ３／Ｈｕ３－Ｌ１、Ｆｃ領域でのみ変異、変異Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｄ２６５Ａ，Ｐ３２９Ａ（Ｅｕナンバリング））の配列

＞ＶＨ核酸配列（Ｈｕ３－Ｈ３）：配列番号３５
ＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＴＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＣＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＴＣＴＧＡＣＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＴＡＧＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣ

＞ＶＬ核酸配列（Ｈｕ３－Ｌ１）：配列番号３６
ＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＧＣＴＴＣＣＡＡＴＡＧＧＴＡＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＴＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＧＣＣＡＧＴＣＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ

＞ＶＨアミノ酸配列（Ｈｕ３－Ｈ３）：配列番号３７
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＨＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＡＦＴＬＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＹＧＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

＞ＶＬアミノ酸配列（Ｈｕ３－Ｌ１）：配列番号３８
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＥＮＶＶＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＡＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＧＱＳＹＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ

キメラ抗体３２Ａ１Ｄ５および４３Ｂ７Ａ４、ならびにヒト化抗体ｈｕ３２－Ｃ（Ｈｕ３２－Ｈ１／Ｈｕ３２－Ｌ３）ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１（Ｈｕ３２－Ｈ１／Ｈｕ３２－Ｌ２Ｖ）およびｈｕ３－Ｅ（Ｈｕ３－Ｈ３／Ｈｕ３－Ｌ１）：Ｐ０１８５７ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０１８５７
＞ＣＨ核酸配列：配列番号３９

ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＴＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＴＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＴＡＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＧＣＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＴＡＡ

＞ＣＨアミノ酸配列：配列番号４０
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

ＣＨ ｆｏｒ ｈｕ３－Ｅ（ｍｕ） （Ｈｕ３－Ｈ３ ／Ｈｕ３－Ｌ１）
＞ＣＨアミノ酸配列：配列番号７３
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＡＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

キメラ抗体３２Ａ１Ｄ５および４３Ｂ７Ａ４、ならびにヒト化抗体 ｈｕ３２－Ｃ（Ｈｕ３２－Ｈ１／Ｈｕ３２－Ｌ３）ｈｕ３２Ｃ－Ｖ１（Ｈｕ３２－Ｈ１／Ｈｕ３２－Ｌ２Ｖ）およびｈｕ３－Ｅ（Ｈｕ３－Ｈ３／Ｈｕ３－Ｌ１）およびＨｕ３－Ｅ（ｍｕ）（Ｈｕ３－Ｈ３／Ｈｕ３－Ｌ１）：Ｐ０１８３４ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０１８３４
＞ＣＬ核酸配列：配列番号４１
ＣＧＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＣＴＡＡ

＞ＣＬアミノ酸配列：配列番号４２
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ＊

ＩｇＧ（ネガティブコントロール）
ＷＯ２００８０６８２４６Ａ１ フォラビルマブ

＞重鎖アミノ酸配列：配列番号４３
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＡＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＬＹＤＧＳＤＫＦＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＶＡＶＡＧＴＨＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ

＞軽鎖アミノ酸配列：配列番号４４
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＮＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

ｈｕＴＮＦＲ２アミノ酸配列
＞ｈｕＴＮＦＲ２－ｍＦｃアミノ酸配列：配列番号４５
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ
ＧＣＫＰＣＩＣＴＶＰＥＶＳＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＶＬＴＩＴＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＡＩＳＫＤＤＰＥＶＱＦＳＷＦＶＤＤＶＥＶＨＴＡＱＴＱＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＳＶＳＥＬＰＩＭＨＱＤＷＬＮＧＫＥＦＫＣＲＶＮＳＡＡＦＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＲＰＫＡＰＱＶＹＴＩＰＰＰＫＥＱＭＡＫＤＫＶＳＬＴＣＭＩＴＤＦＦＰＥＤＩＴＶＥＷＱＷＮＧＱＰＡＥＮＹＫＮＴＱＰＩＭＮＴＮＧＳＹＦＶＹＳＫＬＮＶＱＫＳＮＷＥＡＧＮＴＦＴＣＳＶＬＨＥＧＬＨＮＨＨＴＥＫＳＬＳＨＳＰＧＫ

＞ｈｕＴＮＦＲ２－ｈｕＦｃアミノ酸配列：配列番号４６
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ－

＞ｃｙｎｏ－ＴＮＦＲ２－ｈｕＦｃアミノ酸配列：配列番号４７
ＭＡＰＡＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＧＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＧＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＰＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＱＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＨＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＡＰＳＴＡＰＧＴＳＦＬＬＰＶＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ－

細胞スクリーニングおよび細胞免疫のための発現配列
＞ＨｕＴＮＦＲ２：配列番号４８
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＦＡＬＰＶＧＬＩＶＧＶＴＡＬＧＬＬＩＩＧＶＶＮＣＶＩＭＴＱＶＫＫＫＰＬＣＬＱＲＥＡＫＶＰＨＬＰＡＤＫＡＲＧＴＱＧＰＥＱＱＨＬＬＩＴＡＰＳＳＳＳＳＳＬＥＳＳＡＳＡＬＤＲＲＡＰＴＲＮＱＰＱＡＰＧＶＥＡＳＧＡＧＥＡＲＡＳＴＧＳＳＤＳＳＰＧＧＨＧＴＱＶＮＶＴＣＩＶＮＶＣＳＳＳＤＨＳＳＱＣＳＳＱＡＳＳＴＭＧＤＴＤＳＳＰＳＥＳＰＫＤＥＱＶＰＦＳＫＥＥＣＡＦＲＳＱＬＥＴＰＥＴＬＬＧＳＴＥＥＫＰＬＰＬＧＶＰＤＡＧＭＫＰＳ－

＞ＣｙｎｏＴＮＦＲ２：配列番号４９
ＭＡＰＡＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＧＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＧＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＰＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＱＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＨＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＡＰＳＴＡＰＧＴＳＦＬＬＰＶＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤＩＶＬＰＶＧＬＩＶＧＶＴＡＬＧＬＬＩＩＧＶＶＮＣＶＩ－

抗ヒトＴＮＦＲ２抗体エピトープマッピング
（シグナルペプチドには下線が引かれている）
＞ヒトＴＮＦＲ２の細胞外領域：配列番号５０
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ

＞マウスＴＮＦＲ２の細胞外領域：配列番号５１
ＭＡＰＡＡＬＷＶＡＬＶＦＥＬＱＬＷＡＴＧＨＴＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＥＣＱＩＳＱＥＹＹＤＲＫＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧ

＞０１９－１：配列番号５２
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－２：配列番号５３
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＥＣＱＩＳＱＥＹＹＤＲＫＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－３：配列番号５４
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＥＣＱＩＳＱＥＹＹＤＲＫＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－４：配列番号５５
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＥＣＱＩＳＱＥＹＹＤＲＫＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－５：配列番号５６
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＥＣＱＩＳＱＥＹＹＤＲＫＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－６：配列番号５７
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＥＣＱＩＳＱＥＹＹＤＲＫＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－０－０．５：配列番号５８
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－０－１：配列番号５９
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－０．５－１：配列番号６０
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＶＰＡＱＶＶＬＴＰＹＫＰＥＰＧＹＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－０－０．５－２：配列番号６１
ＭＹＬＧＬＮＣＶＦＩＶＦＬＬＫＧＶＱＳＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＥＣＱＩＳＱＥＹＹＤＲＫＡＱＭＣＣＡＫＣＰＰＧＱＹＶＫＨＦＣＮＫＴＳＤＴＶＣＡＤＣＥＡＳＭＹＴＱＶＷＮＱＦＲＴＣＬＳＣＳＳＳＣＴＴＤＱＶＥＩＲＡＣＴＫＱＱＮＲＶＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞０１９－１２：配列番号６２
ＭＡＰＶＡＶＷＡＡＬＡＶＧＬＥＬＷＡＡＡＨＡＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＡＣＥＡＧＲＹＣＡＬＫＴＨＳＧＳＣＲＱＣＭＲＬＳＫＣＧＰＧＦＧＶＡＳＳＲＡＰＮＧＮＶＬＣＫＡＣＡＰＧＴＦＳＤＴＴＳＳＴＤＶＣＲＰＨＲＩＣＳＩＬＡＩＰＧＮＡＳＴＤＡＶＣＡＰＥＳＰＴＬＳＡＩＰＲＴＬＹＶＳＱＰＥＰＴＲＳＱＰＬＤＱＥＰＧＰＳＱＴＰＳＩＬＴＳＬＧＳＴＰＩＩＥＱＳＴＫＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

＞抗ＴＮＦＲ２抗体－００１－Ｈ１０
重鎖：配列番号７４
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＳＳＳＷＹＲＤＧＭＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊

軽鎖：配列番号７５
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＳＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＲＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ＊

一実施形態において、重鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号７、１５、２５または３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉ）配列番号７、１５、２５または３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉｉ）配列番号７、１５、２５または３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、好ましくは、アミノ酸変化がＣＤＲ領域で生じず、より好ましくは、アミノ酸変化がフレームワーク領域（ＦＲ領域）、例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域で生じる、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、軽鎖可変領域は、
（ｉ）配列番号８、１６、２６、２８または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉ）配列番号８、１６、２６、２８または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、または
（ｉｉｉ）配列番号８、１６、２６、２８または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、好ましくは、アミノ酸変化がＣＤＲ領域で生じず、より好ましくは、アミノ酸変化がＦＲ領域、例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域で生じ、好ましくは、該変化がＦＲ１におけるＱ３８で生じ、特に、該変化がＱからＨまたはその保存的アミノ酸への変化である、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関し、以下を含む：
配列番号７、１５、２５または３７で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または
配列番号８、１６、２６、２８または３８で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域。
別の実施形態において、本発明は、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片に関し、以下を含む：
（１） 配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域、
（２） 配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域、
（３） 配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域、
（４） 配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域、
（５） 配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖可変領域。

好ましい実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸変化は、ＣＤＲの外側の領域（例えば、ＦＲ）に生じる。一実施形態において、アミノ酸変化は、ＨＣＶＲまたはＬＣＶＲのＦＲ領域、好ましくはＬＣＶＲにおいて、例えば、ＬＣＶＲのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４において生じる。いくつかの実施形態において、ＦＲ領域には、１つ、２つ、または３つの変化がある。特定の実施形態において、変化は、ＦＲ１のＱ３８におけるものであり、例えば、ＱからＨへの置換またはその保存アミノ酸の３８位にある。

一実施形態において、抗体の産生を改善するために、例えば、細胞における抗体の発現を改善するために、または産生された抗体の純度を改善するために、１つ以上のアミノ酸修飾をＦＲ領域に導入することができる。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域、例えばＦＲ１領域、例えばＱ３８位に修飾が存在し得る。具体的には、修飾は、３８位のＱからＨまたはその保存アミノ酸への置換であり得る。

変異型軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ／ＶＬ）Ｈｕ３２－Ｌ１、Ｈｕ３２－Ｌ２、Ｈｕ３２－Ｌ３およびＨｕ３２－Ｌ２Ｖを、３つのＣＤＲを生殖細胞系列に移植して得、Ｈｕ３２－Ｌ２についてはＱ３８Ｈ、Ｙ４９Ｈ、Ｔ６９Ｓ、Ｆ７１Ｙ及びＶ８３Ｉの逆突然変異、Ｈｕ３２－Ｌ３についてはＹ４９Ｈ、Ｔ６９Ｓ、およびＦ７１Ｙの逆突然変異、ならびにＨｕ３２－Ｌ２ＶについてはＱ３８Ｈ、Ｙ４９Ｈ、Ｔ６９Ｓ、およびＦ７１Ｙの逆突然変異を、それぞれＬＣＶＲ上で作製した。

ｈｕ３２－Ｃ純度を向上させるために、ＦＲ領域に対する単一の点変異を行った。Ｑ３８Ｈ置換をｈｕ３２－Ｃ軽鎖のＦＲ領域で行い、ｈｕ３２－Ｖ１と名付けられた抗体を得た。ｈｕ３２－Ｃおよびｈｕ３２Ｃ－Ｖ１は、実施例３で説明したように、同じ生成物下で両方とも発現および精製された。生成物の純度はＳＥＣ－ＨＰＬＣにより測定し、親和性はＦｏｒｔｅｂｉｏにより測定した（実施例７参照）。ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を図９に示し、親和性結果を表３に示した。

これらの結果は、Ｑ３８Ｈ変異が抗体ｈｕ３２－Ｃの純度を向上できるが、親和性などのその特性に影響を与えないことを示唆した。

Claims (24)

1. 抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片であって、
   配列番号７、１５、２５または３７で表される配列からなる重鎖可変領域ＨＣＶＲに由来する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と、
   配列番号８、１６、２６、２８または３８で表される配列からなる軽鎖可変領域ＬＣＶＲに由来する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
   を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
2. （１）配列番号７または２５で表される配列からなる重鎖可変領域ＨＣＶＲに由来する３つのＬＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および、配列番号８、２６または２８で表される配列からなる軽鎖可変領域ＬＣＶＲに由来する３つのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
   （２）配列番号１５または３７で表される配列からなる重鎖可変領域ＨＣＶＲに由来する３つのＬＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および、配列番号１６または３８で表される配列からなる軽鎖可変領域ＬＣＶＲに由来する３つのＬＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
   を含む、請求項１に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
3. 抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片であって、
   （ｉ）それぞれ配列番号１、２および３で表される配列を含むかまたはそれらからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および、それぞれ配列番号４、５および６で表される配列を含むまたはそれらからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
   （ｉｉ）それぞれ配列番号９、１０および１１で表される配列からなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、および、それぞれ配列番号１２、１３および１４で表される配列からなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
   を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
4. 配列番号７、１５、２５または３７で表されるアミノ酸配列、または、配列番号７、１５、２５または３７で表される前記アミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号７、１５、２５または３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有し、好ましくは、前記アミノ酸変化がＣＤＲ領域で生じず、より好ましくは、前記アミノ酸変化がフレームワーク領域（ＦＲ領域）、例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域で生じるアミノ酸配列、を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域と、
   配列番号８、１６、２６、２８または３８で表されるアミノ酸配列、または、配列番号８、１６、２６、２８または３８で表される前記アミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列、または、配列番号８、１６、２６、２８または３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つ以上（好ましくは１０以下、より好ましくは５以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的置換）を有し、好ましくは、前記アミノ酸変化がＣＤＲ領域に生じず、より好ましくは、前記アミノ酸変化がフレームワーク領域（ＦＲ領域）、例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４領域で生じ、好ましくは、前記変化がＦＲ３のＩ８３で生じ、特に、前記変化がＩからＶまたはその保存的アミノ酸への変化であるアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域と、
   を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
5. （１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
   （２）配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
   （３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号２６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
   （４）配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号２８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
   （５）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる重鎖可変領域、および／または配列番号３８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
   を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
6. 重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域をさらに含み、
   前記重鎖定常領域は、
   （１）ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、好ましくはＩｇＧ１定常領域であるまたはそれに由来し、
   （２）配列番号４０または配列番号７３で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、または
   （３）配列番号４０または配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、
   および／または、
   前記軽鎖定常領域は、
   （１）κ（カッパ）またはλ（ラムダ）軽鎖定常領域、例えば、ヒトκまたはλ軽鎖定常領域、好ましくは、ヒトκ軽鎖定常領域であるまたはそれに由来し、
   （２）配列番号４２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、または
   （３）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、
   請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
7. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
8. 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、
   請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
9. 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ′）２、シングルドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、ダイアボディドメイン抗体（ｄＡｂ）または線状抗体からなる群から選択される抗体断片である、
   請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
10. 前記抗体が、二重特異性または多重特異性抗体分子であり、好ましくは、前記二重特異性抗体分子が、ＴＮＦＲ２および免疫チェックポイントに結合する、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその断片のいずれか１つ以上の鎖をコードする、
    単離核酸。
12. 好ましくは発現ベクターである、
    請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
13. 請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞であって、
    好ましくは、前記宿主細胞が、原核細胞または真核細胞であり、より好ましくは、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ－Ｓ細胞または２９３細胞）、または、抗体またはその抗原結合断片の調製に適した他の細胞から選択される、
    宿主細胞。
14. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸の発現に適した条件下で、請求項１３に記載の宿主細胞を培養するステップを含み、
    必要に応じて、前記宿主細胞から前記ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片を回収するステップをさらに含む、
    抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片の調製方法。
15. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片と、
    他の薬剤（例えば、細胞毒性剤などの治療剤またはラベル）と、
    を含む、免疫複合体。
16. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片、または、
    請求項１５に記載の免疫複合体、および、
    必要に応じて薬学的に許容されるアジュバント、
    を含む、医薬組成物。
17. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片、または
    請求項１５に記載の免疫複合体、および
    １つ以上の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体（例えば、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１抗体）、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子実体、または免疫調節剤）、
    を含む、組み合わせ品。
18. 対象において、Ｔ細胞を活性化する、またはＴ細胞媒介性抗腫瘍活性を誘導する、またはＴ細胞の増殖を刺激する方法であって、
    有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片、または、請求項１５に記載の免疫複合体、または、請求項１６に記載の医薬組成物、または、請求項１７に記載の組み合わせ品を対象に投与するステップを含む、
    方法。
19. 対象において、癌または感染症を予防または治療する方法であって、
    有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片、または、請求項１５に記載の免疫複合体、または、請求項１６に記載の医薬組成物、または、請求項１７に記載の組み合わせ品を対象に投与するステップを含み、
    好ましくは、前記癌が、非小細胞肺癌、乳癌、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚非ホジキンリンパ腫、および卵巣癌、胃腸消化管の癌（例えば、結腸直腸癌、直腸癌または大腸癌）である、
    方法。
20. １つ以上の治療法（例えば、治療モダリティおよび／または他の治療剤）と組み合わせて前記対象に投与するステップをさらに含み、
    好ましくは、前記治療モダリティは、手術および／または放射線療法を含み、および／または前記他の治療剤は、化学療法剤、他の抗体（例えば、ＰＤ－１またははＰＤ－Ｌ１抗体）、細胞毒性剤、ワクチン、抗感染剤、小分子実体、または免疫調節剤からなる群から選択される、
    請求項１８または１９に記載の方法。
21. （Ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片と試料とを接触させるステップと、
    （Ｂ）前記抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片と前記ＴＮＦＲ２との間の複合体の形成を検出するステップであって、必要に応じて、前記抗ＴＮＦＲ２抗体を検出可能に標識するステップと、
    を含む、試料中のＴＮＦＲ２を検出する方法。
22. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片、または、
    請求項１５に記載の免疫複合体
    を含む、ＴＮＦＲ２検出用キット。
23. 配列番号５０からなるまたはそれらを含むヒトＴＮＦＲ２の細胞外領域に含まれるＴＮＦＲ２のエピトープを結合し、
    好ましくは、前記エピトープは、ヒトＴＮＦＲ２における配列番号５８の１Ｌから３１Ｃまでのアミノ酸配列、または、ヒトＴＮＦＲ２における、配列番号６２の１Ｌから９６Ｃまでのアミノ酸配列、または配列番号５２の１７Ｔから５４Ｄまでのアミノ酸配列に含まれる、
    抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。
24. （１）インビトロでヒトおよび／またはカニクイザルＴＮＦＲ２タンパク質またはその断片に高親和性で結合すること、
    （２）細胞表面、例えば２９３Ｔ細胞の細胞表面、または抗ＣＤ３によって刺激されたＰＢＭＣなどの活性化細胞上に発現されるヒトおよび／またはカニクイザルＴＮＦＲ２に結合すること、
    （３）ＴＮＦ－αと、細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）上に発現されるヒトおよび／またはカニクイザルＴＮＦＲ２との間の相互作用／結合をブロッキングすること、
    （４）（例えば、ヒト）Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）を活性化すること、例えば、ＩＦＮ－γのようなサイトカインの分泌を増加させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させること、
    （５）ＴＮＦＲ２、例えば、ヒトまたはカニクイザルＴＮＦＲ２の下流シグナル経路を刺激すること、
    （６）免疫応答を増強すること、
    （７）誘導されたＴ細胞、例えば、誘導されたＴｒｅｇ細胞または誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＤＣＣ効果を誘導しないこと、
    （８）薬物動態のパラメータが良好であるため、医薬品の有効成分として使用できること、
    （９）例えば、腫瘍体積を減少させることによる抗腫瘍効果を有し、例えば、腫瘍体積を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上減少させることができること、
    という特性の１つ以上を有する、抗ＴＮＦＲ２抗体またはその抗原結合断片。

Images