KR20230142768A - Ccdc112를 기반으로 하는 종양세포 성장을 억제하는 방법 및 적용 - Google Patents

Ccdc112를 기반으로 하는 종양세포 성장을 억제하는 방법 및 적용 Download PDF

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Abstract

종양 억제에 CCDC112를 적용하면, CCDC112 기능 또는 활성의 억제를 통해 종양세포에 대한 면역세포의 살상 효과가 촉진된다. CCDC112는 항종양 약물 제조 및 동반 진단 마커 측면에서 적용 가치가 있다.

Description

CCDC112를 기반으로 하는 종양세포 성장을 억제하는 방법 및 적용
본 발명은 생물의약 분야에 관한 것이며, 구체적으로 CCDC112를 기반으로 종양을 억제하는 방법 및 적용에 관한 것이다.
[관련 출원에 대한 교차인용]
본 출원은 2021년 2월 8일 중국 특허청에 출원한 출원번호 202110172875.X, 출원명칭 “CCDC112를 기반으로 하는 종양세포 성장을 억제하는 방법의 중국 특허 출원에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 참조를 통해 본 출원에 포함된다.
말기 재발성 종양의 치료는 효과적인 방법이 부족하며, 그 기술 분야는 더 나은 효과의 대안 또는 개선 방안이 필요하다. 종양의 면역요법은 최근 중요한 발전을 이루었다. 면역 음성 관문 조절제(NCR) 경로는 이미 인간 면역 관련 질병의 치료에 탁월한 임상 표적으로 입증되었다. 단클론 항체(mAb)를 사용해 두 종류의 NCR, 즉 CTLA-4 및 PD-1을 차단하여 종양 면역성을 강화하는 것은 종양에 대한 치료를 완전히 바꾸고 있으며, 또 이들 경로는 인간의 질병 상태에서 임상 검증 표적으로 확정되었다. 보다 최근에는, NCR 경로를 유발하는 가용성 형태의 NCR 리간드는 이미 자가 면역 치료를 위한 면역 억제제(즉, 류마티스 관절염에 대한 AMP-110/B7-H4-Ig)로 임상 시험에 들어갔다. 주목할 점은, 면역관문 차단 요법은 유효율이 비교적 낮고, 초기에 효과가 있었던 환자는 장기간 치료 후 효과가 떨어진다는 점이다. 이는 종양 면역회피에 중요한 대체 메커니즘과 접근법이 있을 수 있음을 나타낸다. 암을 보다 효과적으로 치료하기 위해서는 반드시 새로운 종양 면역분자 표적과 치료 방법을 동정해야 한다.
최근의 연구에 따르면, 억제성 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 슈퍼패밀리 B(LILRB) 및 관련된 면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM)를 함유하는 수용체 LAIR1가 다양한 조혈과 고형암 세포에서 종양 촉진 기능을 갖고 있음이 발견되었다. ITIM을 함유한 수용체는 다양한 면역세포에서 발현되고 포스파타아제 SHP-1, SHP-2 또는 SHIP을 모집하여 신호를 전달함에 따라, 면역세포 활성화의 음성 조절로 이어진다. CTLA4 및 PD-1과 유사하게, LILRB는 면역관문 인자로 간주된다. LILRB2는 단핵구, 대식세포 및 수지상세포에서 발현되어, 세포자율 방식으로 선천 면역을 억제하고, 간접적인 메커니즘을 통해 T세포의 활성화를 억제할 수 있다. 이전 연구에서는 LILRB2의 길항제가 골수계 유래 억제성 세포(MDSC)와 조절 T세포(Treg)의 종양 국소 침윤을 감소시키고, 항종양 면역 반응을 촉진할 수 있다고 보고했다(Hui-Ming Chen 등, J Clin Invest. 2018;128(12):5647-5662). 이는 LILRB2가 이의 리간드에 결합된 후 MDSC 및 Treg를 통해 면역세포를 억제하는 효과를 발휘하여 종양 면역회피 과정에 참여할 수 있음을 나타낸다. LILRB4의 구조와 기능은 LILRB2와 유사하여 LILRB4가 MDSC 세포 표면에 발현되는 것으로 보고되었다(Pauline de Goeje 등, Oncoimmunology, 19 Mar 2015, 4(7):e1014242). 이의 리간드는 APOE（Cancer Immunol Res. 2019 Aug;7(8):1244-1257）를 포함하고, APOE와 LILRB4의 결합을 차단한다.
종양 괴사인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원3(TNFRSF3), 종양 괴사인자 수용체 Ⅲ형(TNF-RIII)으로도 불리는 림포톡신 β 수용체(LTBR)는 4개의 TNFR-Cys 반복영역을 포함하는 단일 막관통 I유형 막 단백질이다. HCV 코어 단백질과의 상호작용 이외에, LTBR은 자체 결합뿐 아니라, TRAF3, TRAF4 및 TRAF5에도 결합한다. 이전 연구에서는 마우스 체내에서 LTBR이 녹아웃되면 MDSC를 감소시킨다고 보고했는데, 이는 LTBR이 MDSC의 유도 및 유지에 중요한 작용을 할 수 있음을 나타낸다(Anja K Wege 등, Innate Immun. 2014 Jul;20(5):461-70). 현재 LTBR의 알려진 리간드는 림포톡신(lymphotoxin)이며, 다른 리간드에 대해 보고된 바는 아직 없다.
CCDC 단백질은 다양한 천연 단백질에 존재하는 단백질 도메인으로, 현재 적어도 200종의 CCDC 단백질이 발견되었으며, 다양한 CCDC 단백질의 생물학적 기능은 세포간 막횡단 신호 전달, 유전 신호 전사 참여, 세포 증식 및 사멸 촉진, 악성 종양세포의 침습 및 전이 조절 등의 다양한 생물학적 행위를 포함한다. CCDC112 유전자의 정식 명칭은 "코일드 코일 도메인 포함 단백질 112"(Coiled-coil domain-containing protein 112)이며, 이의 기능은 아직 보고된 바가 없고, CCDC112 기반 종양 억제에 관해 보고된 바도 없기 때문에, 종양 또는 종양세포 억제에 사용할 수 있는 새로운 마커는 당업계의 지속적인 과제이다.
이러한 관점에서, 본 발명이 개시된다.
본 발명의 주요 목적은 새로운 종양 면역분자 표적 및 치료 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 의해 사용된 기술적 방안은 하기와 같다.
일 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 시험관내 또는 체내에서 종양세포를 조절하는 방법을 제공한다:
a) CCDC112를 발현하는 종양세포에 대해, CCDC112의 기능 또는 활성을 변경시키는 단계, 여기서
바람직하게는, 상기 조절은 억제이고, 상기 변경은 억제이다.
추가적으로는, 상기 방법은 단계 b）를 더 포함한다;
b) 종양세포와 면역세포를 접촉시키는 단계; 상기 단계 b)는 단계 a) 이전 또는 이후일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 상기 억제는 단백질 수준 또는 유전자 수준일 수 있다.
바람직하게는, 상기 억제는 하기 방식 중 어느 하나를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
i. CCDC112 유전자를 유전자 편집(gene editing)하는 단계;
ii. CCDC112 유전자의 발현을 방해하는 단계; 및
iii. 항체를 통해 CCDC112 단백질의 기능 또는 활성을 억제하는 단계.
상기 억제는 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 중 어느 하나와의 결합에 영향을 미친다; 바람직하게는, 상기 영향은 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 중 어느 하나와의 결합에 대한 억제 또는 차단이다; 바람직하게는, 상기 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현된다.
추가적으로는, 상기 종양세포 및 면역세포는 시험관 내에서 단리된 종양세포 및 면역세포이거나, 또는 체내에 존재하는 종양세포 및 면역세포일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 세포 중의 CCDC112 기능 또는 활성을 변경시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시험관내 또는 체내에서 MDSC 또는 Treg세포 비율을 조절하는 방법을 더 제공한다.
일 측면에서, CCDC112 기능 또는 활성을 변경시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시험관내 또는 체내에서 세포 중의 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 활성을 조절하는 방법을 더 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 CCDC112와 수용체 LILRB2, LILRB4, LTBR 또는 CD30의 상호작용을 억제하는 억제제 또는 항체의 스크리닝을 통해, 후보 약물 또는 시약을 얻는 것을 특징으로 하는, 종양을 예방 또는 치료하기 위한 약제 또는 시약을 스크리닝하는 방법을 더 제공한다.
일 측면에서, 하기의 단계 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 억제분자 또는 억제제를 스크리닝 또는 동정하는 방법을 더 제공한다.
a) 후보 분자가 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 결합에 미치는 영향을 분석하는 방법;
b) 후보 분자가 골수계 유래 억제성 세포(MDSC)에 미치는 영향을 분석하는 방법;
c) 후보 분자가 조절 T세포(Treg)에 미치는 영향을 분석하는 방법;
d) 후보 분자가 면역세포가 종양세포를 살상하는 데 미치는 영향을 분석하는 방법.
상기 후보 분자는 CCDC112의 억제분자이다;
바람직하게는, 상기 억제분자 또는 억제제는 종양 억제분자 또는 억제제이다.
보다 바람직하게는 상기 억제분자 또는 억제제는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체의 제조 방법을 더 제공한다.
a) CCDC112에 대한 항체를 준비하는 단계, 및;
b) CCDC112와 LILRB2, LTBR, LILRB4, 또는 CD30의 결합에 영향을 미치는 항체를 스크리닝하는 단계.
바람직하게는, 상기 단계 a)는 CCDC112 단백질을 면역원으로 사용하여 마우스와 같은 대상체에게 주사하거나, 또는 천연물 라이브러리를 스크리닝하여 항체를 제조한다. 예시적으로는, 상기 CCDC112 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 화합물이 CCDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 어느 하나의 상호작용을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는, 작용성 또는 길항성 화합물을 더 제공한다.
바람직하게는, 상기 화합물은 저분자 억제제, 폴리펩티드, 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일 측면에서, 본 발명은 CCDC112 억제제의 하기 용도 중 어느 하나를 제공한다.
a) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 길항하는 용도, 바람직하게는, CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현된다;
b) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 길항하는 제품을 제조하는 데 사용되는 용도, 바람직하게는, CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현된다;
c) 종양을 예방 또는 치료하는 용도;
d) 종양을 예방 또는 치료하는 약제를 제조하는 데 사용되는 용도;
e) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 용도;
f) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 데 사용되는 약제를 제조하는 용도;
g) 체내 및 시험관 내에서 종양세포의 성장을 억제하는 용도;
h) 체내 및 시험관 내에서 종양세포의 성장을 억제하는 데 사용되는 시약을 제조하는 용도.
상기 억제제는 CCDC112와 이의 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 결합을 억제 또는 차단할 수 있다. 바람직하게는, 상기 억제제는 저분자 억제제, 폴리펩티드, 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 종양을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다:
대상체의 면역세포 또는 종양세포를 유효 용량의 CCDC112 항체와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 항체는 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4, 또는 CD30의 결합을 억제할 수 있다;
바람직하게는, 상기 대상체는 추가적 항앙요법을 이미 받았거나 또는 받고 있거나 또는 받을 예정이다.
보다 바람직하게는, 상기 추가적 항앙요법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 면역요법 또는 호르몬요법을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 면역요법 이전/이후 대상체 종양세포의 CCDC112 단백질 발현량 또는 기능을 검출하는 단계를 포함하는, 종양 면역요법 동반 진단 방법을 더 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 제공한다:
a) 상기 항체는 높은 친화도로 CCDC112 단백질에 특이적으로 결합하는 특성; 및
b) 상기 항체는 CCDC112와 LILRB2, LTBR, LILRB4, 또는 CD30 중 어느 하나와의 상호작용을 억제 또는 차단할 수 있는 특성.
일부 실시 양태에서, 상기 항체는 또한 하기의 특성 중 적어도 하나를 더 포함한다.
i. 상기 항체는 면역 억제성 세포 MDSC 세포 비율을 감소시키는 특성;
ii. 상기 항체는 면역 억제성 세포 Treg의 세포 비율을 감소시키는 특성; 및
iii. 상기 항체는 종양세포를 살상하는 면역세포(예를 들어, PBMC)의 효과를 강화하는 특성.
일부 실시 양태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 13으로 표시되는 중쇄가변영역 아미노산 서열 중 3개의 CDR 및 서열번호 14로 표시되는 경쇄가변영역 아미노산 서열 중 3개의 CDR; 또는 상기 6개의 CDR 영역과 각 CDR 영역에서 2개 미만의 아미노산이 변이하는 단일 또는 복수의 CDR 영역을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 항체의 CDR은 하기의 CDR 서열을 포함한다.
i. 서열번호 15, 21, 26, 38, 30 중 어느 하나로 표시되는 상기 HCDR1의 아미노산 서열;
ii. 서열번호 16, 22, 27, 29, 31 중 어느 하나로 표시되는 상기 HCDR2의 아미노산 서열;
iii. 서열번호 17, 23, 32 중 어느 하나로 표시되는 상기 HCDR3의 아미노산 서열;
iv. 서열번호 18, 24, 33 중 어느 하나로 표시되는 상기 LCDR1의 아미노산 서열;
v. 서열번호 19, 25, 34 중 어느 하나로 표시되는 상기 LCDR2의 아미노산 서열; 및
vi. 서열번호 20, 35 중 어느 하나로 표시되는 상기 LCDR3의 아미노산 서열; 또는
대안적으로, 상기 i- vi의 6개 CDR 영역에 대해 각 CDR 영역에서 2개 미만의 아미노산이 변이하는 단일 또는 복수의 CDR 영역을 갖는 변이체.
일부 구체적 실시 양태에서, 상기 CDR 서열은 IMGT 정의에 따른 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열의 중쇄가변영역; 및 IMGT 정의에 따른 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열의 경쇄가변영역이며, 서열은 하기와 같다.
i. 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시된다;
ii. 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시된다;
iii. 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시된다;
iv. 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시된다;
v. 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시된다; 및
vi. 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 20으로 표시된다; 또는
대안적으로, 상기 i- vi의 6개 CDR 영역에 대해 각 CDR 영역에서 2개 미만의 아미노산이 변이하는 단일 또는 복수의 CDR 영역을 갖는 변이체.
바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CCDC112에 결합하는 KD는 <2Х10-8이다.
보다 바람직하게는, 상기 KD는 <2Х10-8, <1Х10-8, <9Х10-9, <8Х10-9, <7Х10-9, <6Х10-9, <5Х10-9, <4Х10-9, <3Х10-9, <2Х10-9, <1Х10-9, <1Х10-10이다.
일부 실시 양태에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열이 하기에서 선택되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함한다.
a) 상기 중쇄가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 군 중의 서열이 적어도 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99% 서열 상동성을 갖는다;
b) 상기 경쇄가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 군 중의 서열이 적어도 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99% 서열 상동성을 갖는다.
일부 실시 양태에서, 상기 항체는 추가적으로 폴리펩티드에 연결되는 접합 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 접합 모이어티는 방사성 핵종, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 플루오레세인, 운반체 단백질, 지질, 및 비오틴 중 하나 이상에서 선택되며, 여기서, 상기 폴리펩티드 또는 항체는 상기 접합 모이어티와 선택적으로 링커를 통해 연결될 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
일부 바람직한 실시 양태에서, 상기 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 항혈청, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 항체는 다중특이 항체, 단일사슬 Fv（scFv）, 단일사슬 항체, 항-개별특이형 항체(항-Id) 항체, 이중 항체, 미니 항체, 나노 항체, 단일 도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화 결합된 이중특이 Fv（sdFv） 및 세포내 항체에서 선택된다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 단리된 폴리뉴클레오티드를 더 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 및 임의의 조절 서열을 포함하는 재조합 벡터를 더 제공한다; 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이다; 보다 바람직하게는, 상기 조절 서열은 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 서열, 전사 종결자, 또는 임의의 조합에서 선택된다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 숙주세포를 더 제공한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포이다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물 중의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물을 더 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 보조제를 더 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물 중의 하나 이상을 포함하고, 적절한 용기에 수용되는 것을 특징으로 하는, 키트를 더 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 중 어느 하나에 적용되는 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물의 용도를 더 제공한다:
a) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 작용 또는 길항하는 용도, 바람직하게는 상기 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현된다;
b) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 작용 또는 길항하는 데 사용되는 제품을 제조하는 용도, 바람직하게는 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현된다;
c) 종양을 예방 또는 치료하는 용도;
d) 종양을 예방 또는 치료하는 데 사용되는 약제를 제조하는 용도;
e) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 용도;
f) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 데 사용되는 약제를 제조하는 용도;
g) 체내 및 시험관 내에서 종양세포의 성장을 억제하는 용도;
h) 체내 및 시험관 내에서 종양세포의 성장을 억제하는 데 사용되는 시약을 제조하는 용도.
일 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 종양을 예방 또는 치료하는 방법을 더 제공한다:
대상체의 면역세포 및 종양세포를 유효 용량의 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계;
대안적으로는, 유효량의 화합물을 사용하여 대상체의 면역세포 및/또는 종양세포와 접촉시키기 전, 종양세포에서 CCDC112의 발현을 검출하는 단계;
바람직하게는, 상기 면역세포는 림프구이고, 보다 바람직하게는, T림프구이다;
보다 바람직하게는, 상기 대상체는 추가적 항앙요법을 이미 받았거나 또는 받고 있거나 또는 받을 예정이다;
더욱 바람직하게는, 상기 추가적 항앙요법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 면역요법 또는 호르몬요법을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 생체 시료를 유효 용량의 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 체내 및 시험관내 생체 시료 중 CCDC112의 존재 여부를 검출하는 방법을 더 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 종양의 성장을 억제하는 방법을 더 제공한다.
A) 종양세포에서 CCDC112의 발현을 분석하는 단계;
B) CCDC112를 인식할 수 있는 항체를 이용해 종양세포와 접촉시키는 단계; 및
C) T림프구, 상기 항체 및 종양세포를 상호간 접촉시키는 단계.
일부 실시 양태에서, 상기 항체가 CCDC112에 결합하는 KD는 <2Х10-8이며; 바람직하게는, 상기 KD는 <2Х10-8, <1Х10-8, <9Х10-9, <8Х10-9, <7Х10-9, <6Х10-9, <5Х10-9, <4Х10-9, <3Х10-9, <2Х10-9, <1Х10-9, <1Х10-10이다.
또 다른 일부 실시 양태에서, 상기 항체는 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 결합 작용을 억제 또는 차단한다.
일부 실시 양태에서, 상기 종양은 결장직장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 림프종, 간암, 두경부암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 유방암 및 난소암에서 선택되며, 종래 기술과 비교해, 본 발명의 유익한 기술적 효과는 적어도 하기의 측면을 포함한다.
1) 본 발명은 종양세포에서 종양 진단을 위한 바이오마커로 사용될 수 있는 CCDC112의 광범위한 발현을 정의한다.
2) 본 발명은 CCDC112의 새로운 결합 분자, LILBR2, LIRB4, LTBR 및 CD30을 발견하였으며, 상기 분자가 면역 조절 및 종양 발달에 중요한 작용을 한다는 점을 고려하여, CCDC112 분자는 골수계 유래의 억제성 세포(MDSC) 및 조절 T세포(Treg) 등을 증가시킴으로써 종양 발달에서 효과를 발휘할 수 있다.
3) 본 발명에 따르면, CCDC112의 항체 분자는 LILBR2, LIRB4, LTBR 및 CD30과 CCDC112의 결합을 차단할 수 있다.
4) 본 발명에 의해 발견된 항체 분자는 CCDC112를 발현하는 종양세포에 대한 PBMC세포의 살상 효과를 촉진할 수 있다.
5) 본 발명은 CCDC112를 발현하는 종양을 치료하기 위한 새로운 표적 접근법을 제공한다.
전술한 내용은 개괄적 설명이며, 필요한 경우 세부사항의 간략화, 요약 및 생략을 포함할 수 있다. 따라서, 당업자라면, 그 개괄적 설명은 예시적 설명일 뿐으로 임의의 방식으로 제한할 의도가 없음을 알 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 방법, 조성물 및/또는 장치 및/또는 다른 주제의 기타 측면, 특징 및 이점은 본 명세서에서 제공되는 교시에 의해 분명해진다. 일부 선택적인 개념을 개략적으로 소개하기 위해 개괄적인 설명을 제공하며, 이들 개괄적인 설명은 하기의 상세한 설명에서 추가적으로 설명된다. 위의 개괄적인 설명의 취지는 청구된 주제의 핵심 특징 또는 기본 특징을 정의하는 데 사용되지 않고, 청구된 주제의 범위를 정의하는 보조 수단으로도 사용되지 않는다. 또한, 본 출원에 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 개시된 특허 출원 내용은 참조를 통해 전체가 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 구체적 실시 양태 또는 종래 기술의 기술 방안을 보다 명확하게 설명하기 위해, 구체적 실시 양태 또는 종래 기술의 설명에 필요한 도면을 하기에서 간단하게 소개하며, 분명하게는, 하기의 설명 중의 도면은 본 발명의 일부 실시 양태이며, 당업자라면 창조적인 노력이 없는 전제 하에 이들 도면에 근거하여 기타 도면을 얻을 수 있다.
도 1은 공배양 세포에 대한 PBMC의 살상 효과이다. CCDC112를 발현하는 MCF7 인간 유방암 세포(좌) 및 결장직장암 세포 HCT116(우)의 종양세포와 활성화된 인간 말초혈액 단핵구(PBMC)의 공배양이다. 결과에 따르면, CCDC112의 과별현은 종양세포에 대한 PBMC의 살상 효과를 억제하며, CCDC112 유전자가 녹아웃되면 종양세포에 대한 PBMC의 살상 효과가 증가된다.
도 2는 공배양된 PBMC 중 MDSC（A）와 Treg（B）의 비율에 대한 종양세포의 효과이다. 일반적 HCT116 세포에 비해, CCDC112를 발현하는 HCT116 세포와 인간 말초혈액 단핵구의 공배양은, MDSC 세포(HLA-DR-CD11b+CD33+) 및 Treg(CD4+CD25+Foxp3+)의 비율을 증가시키며, CCDC112 유전자가 녹아웃된 종양세포는 MDSC 및 Treg 세포를 감소시킨다.
도 3은 LILRB2 및 LILRB4에 결합하는 CCDC112의 농도 구배 효과이다.
도 4는 상이한 pH값에서 LTBR에 결합하는 CCDC112의 농도 구배 효과이다.
도 5는 상이한 pH값에서 CD30에 결합하는 CCDC112의 농도 구배 효과이다.
도 6은 상이한 종양세포가 CCDC112를 발현하는 수준이다. RL 림프종 세포는 음성이고, A375 흑색종, RAJI 림프종은 발현이 낮고, MCF7 유방암, A549 폐암, HCT116, LOVO, SW1116 결장직장암은 양성 발현이다.
도 7은 ELISA에 의해 검출된 CCDC112 전장 단백질 및 CCDC112（73-227） 단편에 결합하는 CCDC112 항체의 농도 의존적 효과이다.
도 8은 CCDC112 녹아웃 HCT116 종양세포가 아닌 HCT116에 결합하는 항체를 나타내는 유세포 분석이다.
도 9는 CCDC112와 이의 수용체 LILRB2/LTBR 결합에 대한 상이한 농도의 CCDC112의 억제 효과이다.
도 10은 CCDC112 항체가 CCDC112 수용체(LILRB2)에 대한 종양세포의 결합을 억제하는 것을 나타내는 유세포 분석이다.
도 11은 CCDC112 항체가 CCDC112 수용체(LILR)에 대한 종양세포의 결합을 억제하는 것을 나타내는 유세포 분석이다.
도 12는 생물층 간섭계에 의해 측정된 S-78-02 및 CCDC112의 친화도 상수이다.
도 13은 다양한 종양세포를 살상하는 PBMC에 대한 항체의 촉진 효과이다.
도 14는 HCT116 종양세포를 탐식하는 대식세포를 촉진하는 CCDC112의 항체이다.
도 15는 PBMC 인간화 마우스 체내 SW48 결장직장암에 대한 CCDC112 항체의 억제 효과이다.
도 16은 PBMC 인간화 마우스 체내 HCT116 결장직장암에 대한 CCDC112 항체의 억제 효과이다.
도 17은 PBMC 인간화 마우스 체내 A549 폐암에 대한 CCDC112 항체의 억제 효과이다.
도 18은 PBMC 인간화 마우스 체내 MCF7 림프종 세포에 대해 CCDC112 항체가 뚜렷한 억제 효과가 없음을 나타낸 것이다.
도 19는 PBMC 인간화 마우스 체내 RL 림프종 세포에 대해 CCDC112 항체가 뚜렷한 억제 효과가 없음을 나타낸 것이다.
본 발명은 매우 다양한 형태로 구현될 수 있지만, 본 명세에는 본 발명의 원리를 검증하기 위한 구체적인 예시적 실시양태가 개시된다. 본 발명은 본 명세서에 예시적으로 개시되는 구체적 실시양태에 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서에 사용된 모든 장과 절의 제목은 구성 목적으로만 사용되며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
하기의 용어 또는 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위해서만 제공된다. 이들 정의는 당업자가 이해하는 범위보다 작게 이해되어서는 안 된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명의 구체적인 실시 양태에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 상동하다. 하기 용어는 당업자가 매우 잘 이해할 것으로 믿지만, 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 하기와 같이 정의된다.
용어 "포괄", "포함", "갖는", "함유" 또는 "관련"은 포괄적(inclusive) 또는 개방형이며, 기타 열거되지 않은 요소 또는 방법 단계가 배제되지 않는다. 용어 "…로 구성된"은 용어 "포함"의 바람직한 실시양태로 간주된다. 하기 명세서에서 특정 군이 적어도 일정한 수의 실시 양태를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이 또한 바람직한 실시 양태만으로 구성된 군을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
"하나" 또는 "일종", "상기" 등과 같은 단수형의 명사를 사용할 때 사용되는 부정관사 또는 정관사는 해당 명사의 복수형을 포함한다.
또한, 명세서 및 청구 범위에 사용된 제1, 제2, 제3, (a), (b), (c) 등과 같은 용어는 순서나 시간적 순서를 설명하기 위한 것이 아니라, 유사한 요소를 구별하기 위해 사용된다. 이러한 용어는 적절한 상황에서 상호교환적으로 사용될 수 있고, 본 발명에 설명된 실시 양태는 본 발명에 설명되거나 예시된 것과 다른 순서로 구현될 수 있음을 이해해야 한다.
용어 "및/또는"은 다른 두 개의 지정된 특징 또는 구성요소 각각에 대한 구체적 특징을 포함하거나 포함하지 않는 것으로 간주된다. 따라서, 본 명세서에서 예를 들어 "A 및/또는 B"에 사용되는 용어 "및/또는"은 모두 A 및 B; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"에 사용되는 용어 "및/또는"은 하기의 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 각각 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "예를 들어" 및 "즉"은 제한하려는 의도가 아닌 예시로만 사용되고, 명세서에 명시적으로 나열된 항목만 포함하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "이상", "적어도", "초과" 등 용어, 예를 들어 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 이상의 상기 값을 포함하나, 이에 국한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이 사이의 더 큰 임의의 숫자 또는 분수도 포함한다.
반대로, 용어 "초과하지 않는다"는 상기 값보다 작은 모든 값을 포함한다. 예를 들어, "100개의 뉴클레오티드를 초과하지 않는다"는 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 및 0개의 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 이 사이의 더 작은 임의의 숫자 또는 분수도 포함한다.
용어 "복수의", "적어도 2개", "2개 이상", "적어도 두 번째" 등은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,　20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 이상을 포함하나, 이에 국한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이 사이의 더 큰 임의의 숫자 또는 분수도 포함한다.
용어 "약" 또는 "실질적으로"는 당업자가 이해할 수 있고 언급된 특징의 기술적 효과가 보장될 수 있는 정확도 범위를 나타낸다. 그 용어는 통상적으로 표시된 값의 ±10%, 바람직하게는 ±5%를 의미한다.
본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 서술된 범위 내의 임의의 정수 값을 포함하고, 적절한 경우 이의 분수(예를 들어, 정수의 10분의 1 및 100분의 1 등)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"(Ab)는 항원에 특이적으로 결합하는 당단백질 면역글로불린을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 통상적으로, 항체는 이황화 결합을 통해 서로 연결되는 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄, 또는 이의 항원 결합 분자를 포함할 수 있다. 각 중쇄는 중쇄가변영역(본 명세서에서 VH로 약칭)과 중쇄불변영역을 포함한다. 중쇄불변영역은 3개의 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄가변영역(본 명세서에서 VL로 약칭)과 경쇄불변영역을 포함한다. 경쇄불변영역은 1개의 불변 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 추가적으로 상보성 결정영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 세분화될 수 있으며, 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역에 산재해 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. Ab의 불변영역은 면역글로불린과 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들어 효과기 세포) 및 전통적 보체 시스템의 제1 성분(CIq)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자의 결합을 매개할 수 있다.
경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 각각 3개의 초가변 영역("상보성 결정영역" 또는 "CDR"이라고도 한다)이 삽입된 "프레임워크" 영역을 포함한다. "상보성 결정영역" 또는 "CDR 영역" 또는 "CDR" 또는 "초가변 영역"(본 명세서에서 초가변 영역 "HVR"과 상호교환적으로 사용된다)은, 항체 가변 도메인에서 서열 변화가 크고 구조적으로 확정된 고리("초가변 고리")를 형성하고 및/또는 항원 접촉 잔기("항원 접촉점")를 함유하는 영역이다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 중쇄 및 경쇄의 CDR은 통상적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 불리며 N-말단부터 순차적으로 넘버링된다. 항체 중쇄가변 도메인 내에 위치하는 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 불리고, 항체 경쇄가변 도메인 내에 위치하는 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 불린다. 주어진 경쇄가변영역 또는 중쇄가변영역의 아미노산 서열에서, 각 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 알려진 많은 항체 CDR 할당 시스템 중 임의의 하나 또는 이의 조합을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 할당 시스템은 예를 들어, 항체의 3차원 구조와 CDR 고리의 위상기하학에 기반한 Chothia(Chothia 등, (1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani 등, “Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”, Journal of Molecular Biology, 273,927-948(1997))，항체 서열 가변성에 기반한 Kabat(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제4판, U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)), AbM (University of Bath), Contact(University College London), 국제 ImMunoGeneTics database(IMGT), 및 대량의 결정체 구조를 이용한 유사도 전파 군집화(affinity propagation clustering)에 기반한 North CDR 정의를 포함한다.
그러나, 다른 할당 시스템에 기반하여 수득된 동일 항체의 가변영역 CDR의 경계는 상이할 수 있음에 유의해야 한다. 즉, 다른 할당 시스템에 따라 정의된 동일 항체 가변영역의 CDR 서열은 상이하다. 예를 들어, Kabat 및 Chothia에 의해 넘버링된 CDR 영역이 다른 할당 시스템에 따라 정의된 잔기 범위는 하기 표 A와 같다.
표 A. 할당 시스템 정의에 따른 CDR 잔기 범위
따라서, 본 발명에 의해 정의되는 특정 CDR 서열로 항체를 한정하는 경우, 상기 항체 범위는 이러한 항체를 더 포함하고, 이의 가변영역 서열은 상기 특정 CDR 서열을 포함하지만, 다른 방식(예를 들어, 다른 할당 시스템 규칙 또는 조합)의 적용으로 인해 주장되는 CDR 경계는 본 발명에 의해 정의된 특정 CDR 경계와 상이하다.
본 발명의 항체의 CDR은 당업계의 임의의 방식 또는 이의 조합에 따라 인위적인 평가에 의해 경계가 결정될 수 있다. 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 용어 "CDR" 또는 "CDR 서열"은 상기 임의의 방식으로 결정된 CDR 서열을 포함한다.
항체는, 예를 들어, 단클론 항체, 재조합 항체, 단일특이 항체, 다중특이 항체(이중특이 항체 포함), 인간 항체, 조작된 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 세포내 항체, 항체 융합체(본 명세서에서 "항체 접합체"라 한다), 이형접합 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일가닥 항체 또는 단일가닥 Fv(scFv), 낙타 유래 항체, 친화체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 이황화 결합으로 연결된 Fv(sdFv), 항-개별특이형(항-Id) 항체(예를 들어, 항-항-Id 항체 포함), 미니 항체, 도메인 항체, 합성 항체(본 명세서에서 "항체 모사체"라 한다) 및 상기 임의의 항원 결합 단편을 포함한다.
용어 "인간화 항체"는 마우스 종과 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열을 인간 프레임워크 서열에 이식하여 수득된 항체를 의미한다. 인간 프레임워크 서열에서 다른 프레임워크 영역을 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 분자", "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"은 그 분자로부터 유래된 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, CDR)을 포함하는 모든 분자를 의미한다. 항원 결합 분자는 항원 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는, 항원 결합 분자로부터 형성된 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, dAb, 선형 항체, scFv 항체 및 다중특이 항체를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 항원 결합 분자는 CCDC112 단백질에 결합한다. 일부 실시 양태에서, 항원 결합 분자는 중화 활성을 가지므로 CCDC112가 LILRB2，LTBR，LILRB4 또는 CD30에 결합하는 것을 억제할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원"은 면역 반응을 유도하거나 항체 또는 항원에 의해 결합될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 면역 반응은 항체 생성 또는 특이적 면역 활성 세포의 활성화 또는 이 두 가지에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 임의의 고분자(거의 모든 단백질 또는 펩티드 포함)가 모두 항원으로 작용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 항원은 내인성 발현, 즉 게놈 DNA에 의해 발현되거나 또는 재조합에 의해 발현될 수 있다. 항원은 암세포와 같은 특정 조직에 대해 특이성을 갖거나 또는 광범위하게 발현될 수 있다. 또한, 고분자의 단편은 항원으로 작용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항원은 CCDC112 단백질 항원이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 일부 실시 양태에서, 항원 결합 분자, scFv, 항체 또는 이의 단편은 리간드의 결합 부위를 직접적으로 차단하거나 또는 간접 방식으로(예를 들어, 리간드의 구조 또는 에너지 변화) 리간드의 결합 능력을 간접적으로 변경시킨다. 일부 실시 양태에서, 항원 결합 분자, scFv, 항체 또는 이의 단편은 결합된 단백질의 생물학적 기능 수행을 방지한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 펩티드 결합을 통해 공유 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 의미한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수량은 제한이 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합으로 서로 연결된 두 개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 그 용어는 단쇄(당업계에서는 통상적으로 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머라 지칭한다) 및 더 긴 장쇄(당업계에서는 통상적으로 많은 유형을 갖는 단백질이라 지칭한다) 둘 다를 의미한다. "폴리펩티드"는 예를 들어, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성을 갖는 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다. 폴리펩티드는 자연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드 또는 이의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 두 분자 사이 예를 들어, 항체와 항원 사이의 비무작위적 결합 반응을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 억제", "결합 차단" 또는 "동일 에피토프 경쟁" 기능은 두 분자의 결합을 검출 가능한 수준으로 억제하는 항체의 기능을 의미한다. 일부 실시 양태에서, 두 분자 사이의 결합을 차단하는 항체는 두 분자 사이의 결합 상호작용을 적어도 50％ 억제한다. 일부 실시 양태에서, 그 억제는 60％ 이상일 수 있고, 70％ 이상일 수 있고, 80％ 또는 90％ 이상일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 나타내는 반면, 본 명세서에 사용되는 용어 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 나타낸다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "KD" 또는 "KD 값"은 Kd와 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)에서 수득되고 몰 농도(M)로 표시되는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 나타낸다. 항체의 KD 값은 당업계에 확립된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "고친화성" 항체는 표적 항원에 1×10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 5×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10-8 M 이하, 보다 더 바람직하게는 5×10-9 M 이하, 및 보다 더더욱 바람직하게는 1×10-9 M 이하의 KD 값을 갖는 항체를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체에 특이적으로 결합하는 항원 부분을 의미한다. "에피토프"는 "항원결정기"로도 칭한다. 에피토프 또는 항원결정기는 통상적으로 아미노산, 탄수화물 또는 당과 같은 분자의 측쇄의 화학적 활성 표면기로 구성되고, 통상적으로 특정 3차원 구조 및 특정 전하 특성을 갖는다. 예를 들어, 에피토프는 통상적으로 "선형 에피토프" 또는 "입체 구조 에피토프"일 수 있는 고유한 입체 구조 중의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속 또는 불연속 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G.E.Morris, Ed. (1996)을 참조한다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예를 들어 항체) 간의 모든 상호작용 부위는 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재한다. 배좌 에피토프에서, 상호작용 부위는 서로 분리된 단백질의 아미노산 잔기에 걸쳐 있다. 당업자가 이미 알고 있는 통상적인 기술을 통해 검출한 동일한 에피토프에 결합하는 경쟁성에 따라, 항체를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 경쟁 또는 교차 경쟁 연구를 수행하여 항원(예를 들어 CLDN18.2)에 결합하기 위해 서로 경쟁 또는 교차 경쟁적으로 결합하는 항체를 얻을 수 있다. 교차 경쟁을 기반으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 얻기 위해 사용되는 고처리량 방법은 국제 특허출원 WO 03/048731에 개시되어 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 이의 유사체 단위를 포함하는 임의의 분자, 바람직하게는 중합 분자를 의미한다. 상기 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 단일가닥 핵산은 변성된 이중가닥 DNA의 단일가닥 핵산일 수 있다. 또는 단일가닥 핵산은 임의의 이중가닥 DNA로부터 유래되지 않은 단일가닥 핵산일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상보성"은 두 개의 주어진 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 서로 어닐링될 때, DNA에서 A가 T와 짝을 이루고, G가 C와 짝을 이루고, RNA에서 G가 C와 짝을 이루고, A가 U와 짝을 이루게 하는 뉴클레오티드 염기 G, A, T, C 및 U 사이의 수소 결합 염기쌍과 관련된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 체내에서 제한 없이 비정상적으로 성장하는 특징을 갖는 질병군을 의미한다. 조절되지 않은 세포 분열 및 성장으로 인해 인접한 조직을 침습하고 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 다른 부분으로 전이될 수 있는 악성 종양을 형성한다. "암" 또는 "암 조직"은 종양은, 예를 들어 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑생종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위장암, 고환암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병(급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 포함), 소아기 고형종, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우암, 중추신경계(CNS) 신생물/종양, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생성, 척추(spinal axis) 종양, 뇌간교종, 뇌하수체 선종, 카포시(Kaposi) 육종, 표피암, 편평세포암, T세포 림프종, 환경유발암(석면에 의해 유발되는 암 포함), 및 상기 암의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CCDC112 관련 암"은 CCDC112가 비정상적으로 발현된 종양 유형, 또는 CCDC112의 증가 또는 감소로 인해 발현 또는 활성화, 악화 또는 기타 방식으로 이와 관련된 임의의 암을 의미한다. 일부 실시 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 결장직장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 림프종, 간암, 두경부암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 유방암 및 난소암에서 선택되는 암의 치료에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유효 사용량", "유효량" 또는 "치료 유효량"은 단독으로 사용하거나 또는 다른 치료제와 조합해서 사용할 때 대상체를 질환의 발병으로부터 보호하거나 또는 질환의 감퇴를 촉진하는 임의의 양이다. 상기 질환의 감퇴는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상기의 빈도 및 지속 기간 증가 또는 질환의 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방으로 입증된다. 질환 감퇴를 촉진하는 치료제의 효능은, 임상 시험 중 인간 대상체에서의 평가, 인체에서의 효능을 예측하는 데 사용되는 동물 모델 시스템에서의 평가 또는 시험관내 측정에서 시약의 활성 평가와 같은 당업자가에 공지된 다양한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 영장류(예를 들어, 인간 및, 원숭이와 같은 비인간 영장류) 및 설치류(예를 들어, 마우스, 랫)를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다. "대상체"는 "환자"일 수 있으며, 환자는 치료가 필요한 인간 대상체로, 결장직장암과 같은 CCDC112-관련 암을 앓고 있는 개체이고, 결장직장암과 같은 CCDC112-관련 암이 발병할 위험이 있는 대상체일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "체외 세포"는 체외에서 배양된 임의의 세포를 의미한다. 특히, 체외 세포는 T세포를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는"은 담체, 희석제, 부형제 및/또는 이의 염이 제제의 다른 성분과 화학적 및/또는 물리적으로 양립되고, 수용자와 생리학적으로 양립됨을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"는 당업계에 공지되어 있는(예를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company, 1995 참조) 약리학적 및/또는 생리학적으로 대상체 및 활성제와 양립하는 담체 및/또는 부형제를 의미하고, pH 조절제, 계면활성제, 면역보강제 및 이온 강도 증강제를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 인산염 완충액을 포함하나 이에 국한되지 않고, 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제(예를 들어 Tween-80)를 포함하나 이에 국한되지 않고, 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절"은 전반적으로 상향 조절 또는 하향 조절의 두 가지 방향의 의미를 지니며, 특정 경우에서 억제 또는 강화로 이해될 수 있고, 특정 경우에서 저하 또는 향상으로 이해될 수 있고, 특정 경우에서 감소 또는 증가 등으로 이해될 수 있으며, 구체적인 해석은 제한되지 않고 실제 적용 맥락에 따라 이해되고 해석된다. 예시적으로, 일부 실시 양태에서, 종양세포 성장의 "조절"은 종양세포의 성장을 억제 또는 촉진시키는 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "감소" 및 "저하"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 원래보다 작은 임의의 변화를 나타낸다. "감소" 및 "저하"는 상대적인 용어로 측정 전 및 측정 후를 비교해야 한다. "감소" 및 "저하"는 완전 소모를 포함한다. 마찬가지로, 용어 "증가" 및 "향상"은 반대로 해석된다.
대상체의 "치료" 또는 "처리"는 증상, 합병증, 또는 상태, 또는 질환과 관련된 생화학적 지표의 발생, 진행, 발전, 심화 또는 재발을 역전, 완화, 개선, 억제, 둔화 및 예방하는 목적을 달성하기 위해, 대상체에게 행하는 임의의 유형의 개입 또는 과정, 또는 그 대상체에게 활성제를 투여하는 것을 의미한다. 일부 실시 양태에서, "치료" 또는 "처리"는 부분적 완화를 포함한다. 또다른 실시 양태에서, "치료" 또는 "처리"는 완전한 완화를 포함한다.
본 발명에 개시되는 다양한 측면은 추가적으로 상세하게 설명된다.
1. CCDC112 단백질 및 종양 억제에서 이의 효과
단백질 CCDC112는 코일드 코일 도메인(CCDC) 계열 구성원에 속하는 "코일드 코일 도메인 포함 단백질 112"(Coiled-coil domain-containing protein 112)이다. 코일드 코일 도메인(CCDC) 단백질은 여러 가지 천연 단백질에 존재하는 단백질 도메인으로, 현재 적어도 200종의 CCDC 단백질이 발견되었으며, 다양한 CCDC 단백질의 생물학적 기능은, 세포간 막횡단 신호 전달, 유전 신호 전사 참여, 세포 증식 및 사멸 촉진, 악성 종양세포의 침습 및 전이 조절 등의 다양한 생물학적 행위를 포함한다. 일부 알려진 CCDC 단백질은 하기 표와 같다.
그러나, CCDC112 단백질 기능은 아직 밝혀진 바가 없고, CCDC112를 기반으로 종양을 억제한다는 보고도 아직 없다. 본 발명자는 유전자 침묵 녹아웃 및 면역학 등의 실험을 통해, CCDC112의 기능 또는 활성을 억제함으로써 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 간의 상호작용을 차단할 수 있고, 종양세포에 대한 면역세포의 살상 효과를 촉진함에 따라, 암의 치료 분야에 사용될 수 있음을 입증하였다.
일부 실시 양태에서, 상기 암은 CCDC112 관련 암이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CCDC112 관련 암"은 CCDC112가 비정상적으로 발현된 종양 유형, 또는 CCDC112의 증가 또는 감소로 인해 발현 또는 활성화, 악화 또는 기타 방식으로 이와 관련된 임의의 암을 의미한다.
일부 실시 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 결장직장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 림프종, 간암, 두경부암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 유방암, 및 난소암에서 선택되는 암의 치료에 사용될 수 있다.
2. CCDC112를 기반으로 종양세포를 조절하는 방법
본 발명의 상기 발견을 바탕으로, 시험관내 또는 체내에서 종양세포를 조절하는 방법을 개시한다. 그 방법은 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 중 어느 하나 사이의 결합 효과를 변경시킴으로써, 면역 억제성 세포 MDSC 또는 Treg의 세포 비율을 변경시키고, 종양세포에 대한 PBMC의 살상 효과를 조절한다.
당업계는, 이들 조절이 종양세포의 세포 활성, 또는 종양세포의 성장, 또는 종양세포의 전이 등을 조절할 수 있으나 이에 국한되지 않음을 알 수 있고, 당업자는 이들 조절이 다방면으로 이루어질 수 있다고 합리적으로 예상할 수 있다. "조절"은 강화 및 억제의 두 측면을 포함하며, 더 많은 실시 양태에서, 이들 조절은 억제 측면, 즉 종양세포 활성, 성장 또는 전이 등에 대한 억제 효과를 통해, 질병의 병소를 제거 또는 치료하는 목적을 구현한다.
일부 구체적 억제 실시 양태에서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다.
a） CCDC112를 발현하는 종양세포에 대해, CCDC112의 발현, 기능 또는 활성을 억제함으로써 상기 목적이 구현되는 단계. 대안적으로는, 단계 a 이전 종양세포에서 CCDC112의 발현을 검출하여 상기 방법을 보다 잘 구현할 수 있는 단계를 더 포함할 수 있다.
추가적으로는, 상기 방법은 단계 b를 더 포함한다.
b) 종양세포를 면역세포와 접촉시키는 단계; 단계 b)는 단계 a) 이전 또는 이후에 완료될 수 있고, 이는 그 방법의 수행에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
당업계는, 특정 단백질의 발현, 기능 또는 활성의 억제 방법은 복수이고, 이들 방법은 단백질 수준 또는 유전자 수준에서 수행될 수 있으며, 이는 모두 당업계에 알려진 통상의 방법임을 알 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 억제 방법은 하기 중 어느 하나일 수 있다.
a. CCDC112 유전자를 유전자 편집하여 그 유전자의 무결성을 파괴함에 따라, 그 유전자의 발현량 및 활성 등을 감소시키는 방법;
일부 바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템이다.
일부 보다 바람직한 실시 양태에서, 상기 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템은 sgRNA를 코딩하는 서열번호 1 내지 8에서 선택되는 올리고머 DNA 서열이다.
b. RANi 방식과 같이 CCDC112 유전자 발현을 방해하여 그 유전자의 발현량 또는 활성을 감소시키는 방법;
c. 항체를 통해 CCDC112 단백질의 기능 또는 활성을 억제하는 것과 같은 면역 수단 억제 방법.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 예를 들어, 체내 및 시험관 내에서 세포 중 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 활성을 조절하는 방법; 예를 들어, 체내 및 시험관 내에서 면역 억제성 세포 MDSC 또는 Treg 세포의 비율을 조절하는 방법; 또 하나의 예를 들어, 체내 및 시험관 내에서 종양세포에 대한 PBMC의 살상 효과를 조절하는 방법;과 같은, 다른 측면의 조절 방법을 더 제공한다. 이들 방법은 모두 종양세포 중 CCDC112의 기능 또는 활성을 변경시키는 단계를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 조절 방법은 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 활성을 억제하는 방법이고; 면역 억제성 세포 MDSC 또는 Treg 세포의 비율을 감소시키는 방법이고; 종양세포에 대한 PBMC의 살상 효과를 강화하는 방법;이다. 이들 방법은 각각 종양세포 중 CCDC112의 기능 또는 활성을 억제하는 단계를 포함한다.
3. 본 발명의 억제제 및 이의 스크리닝 또는 동정 방법
본 발명에 의해 발견된, LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 등의 수용체에 결합할 수 있는 CCDC112 단백질, 및 종양세포에서 CCDC112 단백질 발현이 골수계 유래 억제성 세포(MDSC), 조절 T세포(Treg) 및 면역세포에 미치는 영향을 기반으로 한다.
본 발명은 CCDC112 억제제를 제공하며, 본 발명에서 "억제제"는 유전자의 생성, 전사, 활성, 기능, 단백질의 발현, 활성, 기능 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 CCDC112 유전자 또는 단백질을 억제할 수 있는 단백질 수준 억제제 또는 유전자 수준 억제제일 수 있으며, 이는 모두 "억제제"의 범주에 속한다.
예시적으로는, 단백질 수준의 억제제인 경우, CCDC112 단백질에 결합할 수 있는 동시에 CCDC112와 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 중 어느 하나와의 상호작용을 억제 또는 차단할 수 있는 물질이다.
일부 실시 양태에서, 그 단백질 수준의 CCDC112 억제제는 CCDC112 단백질에 특이적으로 결합한다.
일부 실시 양태에서, 그 단백질 수준의 CCDC112 억제제는 CCDC112 단백질에 특이적이고 높은 친화도로 결합한다.
일부 실시 양태에서, 그 단백질 수준 억제제는 CCDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 작용 또는 길항하는 화합물이다.
일부 실시 양태에서, 상기 단백질 수준 억제제는 저분자 억제제, 폴리펩티드, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
유전자 수준 억제제인 경우, CCDC112 유전자의 활성 또는 기능을 변경시킴으로써, CCDC112와 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 중 어느 하나와의 상호작용을 억제 또는 차단할 수 있는 물질이다.
일부 실시 양태에서, 그 유전자 수준의 CCDC112 억제제는 프라이머, 프로브, sgRNA 등의 물질과 같은 CCDC112 유전자에 특이적인 저분자 물질, DNA 물질 또는 RNA 물질 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명은 상기 억제제의 스크리닝 또는 동정 방법을 더 제공하며, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다.
먼저 CCDC112 억제성 분자를 수득한 후, CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4, 또는 CD30의 결합에 대한 후보 분자의 효과를 분석하는 단계;
바람직하게는, 후보 분자가 길항 활성을 갖는지 여부를 분석한다.
일부 실시 양태에서, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다.
먼저 CCDC112 억제성 분자를 수득한 후, 골수계 유래 억제성 세포(MDSC)에 대한 후보 분자의 효과를 분석하는 단계; 바람직하게는, 후보 분자가 억제성 세포(MDSC)의 함량 또는 비율을 감소시킬 수 있는지 여부를 분석한다.
일부 실시 양태에서, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다.
먼저 CCDC112 억제성 분자를 수득한 후, 조절 T세포(Treg)에 대한 후보 분자의 효과를 분석하는 단계; 바람직하게는, 후보 분자가 조절 T세포(Treg)의 함량 또는 비율을 감소시킬 수 있는지 여부를 분석한다.
일부 실시 양태에서, 그 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다.
먼저 CCDC112 억제성 분자를 수득한 후, 종양세포를 살상하는 면역세포에 대한 후보 분자의 효과를 분석하는 단계; 바람직하게는, 후보 분자가 면역세포에 의한 종양세포의 살상 또는 억제 효과를 촉진할 수 있는지 여부를 분석한다.
일부 실시 양태에서, 그 방법은 상기 단계 중의 조합 또는 전부를 포함할 수 있다.
상기 방법을 통해, 당업계는 가치 있는 CCDC112 억제성 분자를 스크리닝 및/또는 동정할 수 있을 것으로 예상할 수 있다.
4. 본 발명의 항체 및 이의 제조 방법
본 발명의 항체
용어 "CCDC112에 대한 항체", "항-CCDC112의 항체", "항-CCDC112 단백질 항체", "CCDC112 단백질 항체", 또는 "CCDC112에 결합하는 항체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이를 의미하는 본 발명의 항체, 상기 항체는 충분한 친화도로 CCDC112 단백질에 결합할 수 있으므로, 상기 항체는 CCDC112 단백질을 표적으로 하는 진단제, 예방제 및/또는 치료제로 사용될 수 있다.
하기 특성을 갖는 임의의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이론적으로는 모두 본 발명의 개념 또는 청구범위에 속한다. 구체적으로는, 하기의 특성을 갖는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
a) CCDC112 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 특성; 및
b) CCDC112와 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 중 어느 하나와의 상호작용을 억제 또는 차단할 수 있는 특성.
일부 실시 양태에서, 상기 항체는 또한 하기의 특성 중 적어도 하나를 더 포함한다.
상기 항체가 면역 억제성 세포 MDSC 세포 비율을 감소시키는 특성;
상기 항체가 면역 억제성 세포 Treg의 세포 비율을 감소시키는 특성; 또는
상기 항체가 종양세포를 살상하는 면역세포(예를 들어 PBMC)의 효과를 강화시키는 특성.
부가적으로는/대안적으로는, 상기 항체는 하나 이상의 다른 상기 특성을 포함할 수 있다.
일부 구체적 실시 양태에서, 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하며, 구체적 서열은 하기일 수 있다.
서열번호 13으로 표시되는 중쇄가변영역 아미노산 서열 중 3개의 CDR 및 서열번호 14로 표시되는 경쇄가변영역 아미노산 서열 증 3개의 CDR; 또는 상기 6개의 CDR 영역과 각 CDR 영역에서 2개 미만의 아미노산이 변이하는 단일 또는 복수의 CDR 영역을 갖는 변이체.
여기서, 상기 아미노산 변이는 아미노산의 추가, 결실 또는 치환이며, 바람직하게는, 상기 아미노산 변이는 보존적 아미노산 치환이다.
일부 실시 양태에서, 항체는 하기와 같이 상이하게 정의된 방식의 CDR 서열을 포함한다.
따라서, 일부 실시 양태에서, 상기 항체는 하기의 CDR 서열을 포함한다.
i. 서열번호 15, 21, 26, 28, 30 중 어느 하나로 표시되는 상기 HCDR1의 아미노산 서열;
ii. 서열번호 16, 22, 27, 29, 31 중 어느 하나로 표시되는 상기 HCDR2의 아미노산 서열;
iii. 서열번호 17, 23, 32 중 어느 하나로 표시되는 상기 HCDR3의 아미노산 서열;
iv. 서열번호 18, 24, 33 중 어느 하나로 표시되는 상기 LCDR1의 아미노산 서열;
v. 서열번호 19, 25, 34 중 어느 하나로 표시되는 상기 LCDR2의 아미노산 서열;
vi. 서열번호 20, 35 중 어느 하나로 표시되는 상기 LCDR3의 아미노산 서열.
또는 상기 i- vi의 6개 CDR 영역과 각 CDR 영역에서 2개 미만의 아미노산이 변이하는 단일 또는 복수의 CDR 영역을 갖는 변이체.
일부 구체적 실시 양태에서, IMGT 정의에 따른 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열의 중쇄가변영역; 및 IMGT 정의에 따른 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄가변영역;의 서열은 하기와 같다.
i. 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시된다;
ii. 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시된다;
iii. 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시된다;
iv. 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시된다;
v. 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시된다;
vi. 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 20으로 표시된다.
또는 상기 i- vi의 6개 CDR 영역과 각 CDR 영역에서 2개 미만의 아미노산이 변이하는 단일 또는 복수의 CDR 영역을 갖는 변이체.
여기서, 상기 아미노산 변이는 아미노산의 추가, 결실 또는 치환이며, 바람직하게는, 상기 아미노산 변이는 보존적 아미노산 치환이다.
바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CCDC112에 결합하는 KD는 <2Х10-8이다;
보다 바람직하게는, 상기 KD<2Х10-8, <1Х10-8, <9Х10-9, <8Х10-9, <7Х10-9, <6Х10-9, <5Х10-9, <4Х10-9, <3Х10-9, <2Х10-9, <1Х10-9, <1Х10-10이다.
일부 실시 양태에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열이 하기에서 선택되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함한다.
a) 상기 중쇄가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 군 중의 서열이 적어도 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99% 서열 상동성을 갖는다;
b) 상기 경쇄가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열 또는 군 중의 서열이 적어도 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99% 서열 상동성을 갖는다.
보존적 치환은, 하나의 산성 아미노산이 다른 산성 아미노산으로 치환되고, 하나의 염기성 아미노산이 다른 염기성 아미노산으로 치환되거나, 또는 하나의 중성 아미노산이 다른 중성 아미노산으로 치환되는 것과 같이, 하나의 아미노산이 상동한 범주 내의 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 예시적 치환은 하기 표와 같다.
예시적 아미노산 치환은 하기와 같다.
바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 상기 아미노산 변이는 CDR 외부 영역(예를 들어, FR)에서 발생한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 상기 아미노산 변이는 Fc 영역에서 발생한다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 Fc 도메인을 포함한 항-CCDC112 단백질 항체를 제공하며, 그 돌연변이는 예를 들어 중성 pH에 비해 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체의 결합을 강화 또는 약화시킨다. 이러한 Fc 변형의 비제한적 사례는, 예를 들어, 250번째 위치 및(예를 들어 E 또는 Q), 250번째 위치 및 428번째 위치(예를 들어 L 또는 F), 252번째 위치(예를 들어 L/Y/F/W 또는 T), 254번째 위치(예를 들어 S 또는 T) 및 256번째 위치(예를 들어 S/R/Q/E/D 또는 T)의 변형; 또는 428번째 위치 및/또는 433번째 위치(예를 들어 H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434번째 위치(예를 들어 A, W, H, F 또는 Y[N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y])의 변형; 또는 250번째 및/또는 428번째 변형; 또는 307번째 또는 308번째(예를 들어 308F, V308F) 및 434번째의 변형;을 포함한다. 일 실시 양태에서, 그 변형은, 428L(예를 들어 M428L) 및 434S(예를 들어 N434S) 변형; 428L, 259I(예를 들어 V259I) 및 308F(예를 들어 V308F) 변형; 433K(예를 들어 H433K) 및 434(예를 들어 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예를 들어 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들어 T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예를 들어 308F 또는 308P);을 포함한다. 또 다른 실시 양태에서, 그 변형은 265A(예를 들어 D265A) 및/또는 297A(예를 들어 N297A) 변형을 포함한다.
예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인을 함유한 항-CCDC112 단백질 항체를 포함하며, 그 Fc 도메인은, 252Y, 254T 및 256E(예를 들어 M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예를 들어 M428L 및 N434S); 257I 및 311I(예를 들어 P257I 및 Q311I); 257I 및 434H(예를 들어 P257I 및 N434H); 376V 및 434H(예를 들어 D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A(예를 들어 T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F(예를 들어 H433K 및 N434F);에서 선택되는 단일 쌍(군) 또는 다중 쌍(군) 돌연변이를 포함한다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 Fc 도메인을 함유하는 항-CCDC112 단백질 항체를 포함하며, 그 Fc 도메인은 IgG4 힌지영역 중의 S108P 돌연변이를 포함하여 이량체의 안정화를 촉진한다. 전술한 Fc 도메인 돌연변이 및 본 명세서에 개시된 항체 가변 도메인 내의 기타 돌연변이의 임의의 가능한 조합은 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또 다른 일부 실시 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 CCDC112 단백질 항체는 변이를 통해 이의 글리코실화 정도를 증가 또는 감소시킬 수 있다. CCDC112 단백질 항체에 대한 글리코실화 부위의 추가 또는 결실은 아미노산 서열의 변경을 통해 하나 이상의 글리코실화 부위를 생성 또는 제거함으로써 편리하게 구현될 수 있다. CCDC112 단백질 항체가 Fc 영역을 포함하면, Fc 영역과 연결되는 당이 변경될 수 있다. 일부 적용에서, 푸코스 모이어티를 제거하여 항체 의존적 세포 독성(ADCC) 기능을 향상시키는 것과(Shield 등 (2002)JBC277:26733 참조) 같이, 필요 없는 글리코실화 부위를 제거하는 변형은 유용할 수 있다. 다른 적용에서, 갈락토실화 변형을 통해 보체 의존적 세포 독성(CDC)을 조정할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 코로나 바이러스 S단백질 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하고, 이를 통해 Fc 영역 항체를 생성함으로써, 코로나 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는 것처럼 본 발명의 코로나 바이러스 S 단백질 항체의 유효성을 강화할 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 바람직하게는, IgG1 또는 IgG4 항체이다. 보다 바람직하게는, 인간 또는 뮤린 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
일부 실시 양태에서, 항체는 추가적으로 폴리펩티드에 연결되는 접합 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 접합 모이어티는 방사성 핵종, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 플루오레세인, 운반체 단백질, 지질, 및 비오틴 중 하나 이상에서 선택되며, 여기서, 상기 폴리펩티드 또는 항체는 상기 접합 모이어티와 선택적으로 링커를 통해 연결될 수 있고, 바람직하게는 상기 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
당업자라면, 항체의 핵심 기능 영역을 변경하지 않는 상황에서, 상기 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 항혈청, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 제조 또는 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는, 상기 항체는 다중특이 항체, 단일사슬 Fv（scFv）, 단일사슬 항체, 항-개별특이형 항체(항-Id) 항체, 이중 항체, 미니 항체, 나노 항체, 단일 도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화 결합된 이중특이 Fv（sdFv） 및 세포내 항체로 제조 또는 선택될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 단리된 폴리뉴클레오티드를 더 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩한다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 및 임의의 조절 서열을 포함하는, 재조합 벡터를 더 제공한다.
바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이다. 보다 바람직하게는, 상기 조절 서열은 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 서열, 전사 종결자, 또는 임의의 조합에서 선택된다.
본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, 숙주세포를 더 제공한다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포이다.
본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물 중의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물을 더 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 벡터 또는 보조제를 더 포함한다.
본 발명은 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물 중의 하나 이상을 포함하고, 적절한 용기에 수용되는 것을 특징으로 하는, 키트를 더 제공한다.
본 발명의 항체 제조 방법
Kohler and Milstein (1975)Nature 256：495의 표준 세포 하이브리도마 기술과 같은 일반적 단클론 항체 방법론을 포함하는 다양한 기술을 통해, 본 발명의 항-CCDC112 단클론 항체(mAb) 및 인간 서열 항체를 생산할 수 있다. B림프구의 바이러스 또는 발암성 형질전환과 같은 단클론 항체를 생산하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 하이브리도마를 제조하는 데 사용되는 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마를 생산하는 것은 이미 완전하게 확립된 방법이다. 융합을 위해 면역화된 비장세포를 단리하는 데 사용되는 면역화 방안 및 기술은 당업계에 이미 알려져 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 재조합 CCDC112 단백질로 마우스를 다중 면역화하여 수득된다.
본 발명 항체의 활성 측정법
당업계에 널리 알려진 다양한 측정법을 통해 본 명세서에서 제공되는 CCDC112 단백질 항체에 대해 이의 물리적/화학적 및/또는 생물학적 활성을 동정, 스크리닝 또는 특성화할 수 있다. 일 측면에서, 본 발명의 CCDC112 단백질 항체에 대한 이의 항원 결합 활성은 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같이 이미 알려진 방법을 통해 측정된다. 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 CCDC112 단백질에 대한 결합을 측정할 수 있으며, 본 명세서에는 예시적인 방법이 개시된다. 일부 실시 양태에서, 생물층 간섭계를 사용하여 CCDC112 단백질에 대한 본 발명의 CCDC112 단백질 항체의 결합을 측정하고, 동시에 추가적으로 ELISA 실험을 통해 CCDC112와 이의 LILRB2, LILRB4, LTBR, CD30의 결합을 분석한다.
5. 본 발명의 약제학적 조성물
일부 실시 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 화합물, CCDC112 단백질 억제제, 길항제, 항체, 항원펩티드, 단백질 등을 포함하는 조성물을 제공하며, 바람직하게는 조성물은 약제학적 조성물이다.
일 실시 양태에서, 상기 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 면역접합체, 또는 이중특이 분자, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
일 실시 양태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 CCDC112 단백질 항체, 및 하나 이상의 다른 치료제의 조합을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제학적 제제는, 당업계에 널리 알려진 약제학적 담체, 약제학적 부형제와 같은 약제학적 보조제를 포함하고, 완충제를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약제학적 담체"는 생리학적으로 양립하는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 본 발명에 적용되는 약제학적 담체는 멸균 액체일 수 있으며, 예를 들어 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 공급원을 포함하는 물 및 오일일 수 있고, 예를 들어 땅콩기름, 콩기름, 광물유, 참기름 등일 수 있다. 약제학적 조성물을 정맥 내로 투여하는 경우, 선호되는 담체는 물이다. 또한 염수 용액과 수성 덱스트로스 및 글리세린 용액을 액체 담체로 사용할 수 있으며, 특히 주사 가능한 용액으로 사용할 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 말트, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 젤, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 프로펜, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 부형제의 사용 및 이의 용도는, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 제5판, R.C.Rowe,P.J.Seskey 및 S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London, Chicago를 참조한다. 필요에 따라, 상기 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 더 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현택액, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 분말, 지속방출 제제 등의 형태로 사용될 수 있다. 경구 제제는 약제학적 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린과 같은 표준 약제학적 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.
필요한 순도를 갖는 본 발명의 CCDC112 단백질 항체를 하나 이상의 임의의 약제학적 보조제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 제16판, Osol，A.편(1980))와 혼합시켜 본 명세서의 상기 CCDC112 단백질 항체의 약제학적 제제를 제조할 수 있으며, 바람직하게는 동결건조 제제 또는 수용액 형태이다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 제제는 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 상기 활성 성분은 특정 적응증을 치료하기 위해 필요하고, 바람직하게는 상호 역효과를 미치지 않은 상보적인 활성을 갖는 성분이다. 예를 들어, 이상적으로는 CTLA4 및 PD-1억제제 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 기타 활성 성분을 더 제공한다. 상기 활성 성분은 목적 용도에 유효한 양으로 적절하게 조합되어 존재한다.
6. 본 발명의 예방 또는 치료 용도
예방 또는 치료 방법
본 발명은 본 발명의 억제제, 항체 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 CCDC112 관련 암을 예방하는 방법을 제공한다. 예방제는 질환의 발생을 예방하거나, 또는 선택적으로 질환의 진행을 지연시키기 위해, 증상 특성이 발현되기 전에 투여될 수 있다.
바람직하게는, 상기 대상체는 추가적 항앙요법을 이미 받았거나 또는 받고 있거나 또는 받을 예정이다.
보다 바람직하게는, 상기 추가적 항앙요법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 면역요법 또는 호르몬요법을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 억제제, 항체 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 CCDC112 관련 암을 치료하는 방법을 제공한다. 치료제는 증상 특성이 발현된 이후에 투여될 수 있다.
바람직하게는, 상기 대상체는 추가적 항앙요법을 이미 받았거나 또는 받고 있거나 또는 받을 예정이다.
보다 바람직하게는, 상기 추가적 항앙요법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 면역요법 또는 호르몬요법을 포함한다.
CCDC112 관련 암은, 일반적인 결장직장암, 폐암, 흑색종, 림프종, 간암, 두경부암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 유방암, 및 난소암을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 암을 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 치료 방법은, 대상체의 면역세포 및 종양세포를 유효 용량의 본 발명의 상기 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물과 접촉시키는 것일 수 있다. 대안적으로는, 유효량의 화합물을 사용하여 대상체의 면역세포 및/또는 종양세포와 접촉시키기 전, 종양세포에서 CCDC112의 발현을 검출할 수 있다.
바람직하게는, 상기 면역세포는 림프구이다.
보다 바람직하게는, 상기 림프구는 T림프구이다.
예방 또는 치료 용도
본 발명의 상기 억제제, 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물은 적어도 하기의 예방 치료 용도 또는 상응하는 약제의 제조 용도를 포함할 수 있음을 알 수 있다.
a) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 작용 또는 길항하는 용도; 바람직하게는 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현된다.
b) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 작용 또는 길항하는 데 사용되는 제품을 제조하는 용도; 바람직하게는 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현된다.
c) 종양을 예방 또는 치료하는 용도;
d) 종양을 예방 또는 치료하는 데 사용되는 약제를 제조하는 용도;
e) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 용도;
f) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 데 사용되는 약제를 제조하는 용도;
g) 체내 및 시험관 내에서 종양세포의 성장을 억제하는 용도;
h) 체내 및 시험관 내에서 종양세포의 성장을 억제하는 데 사용되는 시약을 제조하는 용도.
7. 본 발명의 진단 용도
용어 "동반 진단"은 통상적으로 특정 치료 제품에서 이익을 얻을 수 있는 환자 그룹을 식별하는 데 도움을 주어, 치료 예후를 개선하고 건강관리 비용을 절감할 수 있도록, 특정 치료제에 대한 환자의 치료 반응에 관한 정보를 제공하는 것을 의미한다. 또한, 동반 진단은 또 치료제에 대한 반응 가능성이 가장 높은 환자 그룹을 식별하는 데 도움이 된다.
본 발명은 CCDC112 단백질을 CCDC112 관련 암의 치료 표적으로 사용할 수 있음을 입증한다. 즉, 종양세포에서 CCDC112 단백질이 발현되면, CCDC112 단백질 억제제(예를 들어 항체)를 도입하여 종양을 효과적으로 억제할 수 있다. 따라서, 해당되는 대상 종양 환자의 치료 과정에서(치료 전 및 치료 후 포함), 종양세포의 CCDC112 단백질 발현 상태를 검출함으로써, 치료 약제에 대해 가장 반응이 높은 환자 그룹을 확정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 동반 진단 방법을 제공하며, 그 방법은 면역요법 이전/이후 대상체의 종양세포에서 CCDC112 단백질 발현량 또는 기능을 검출함으로써 구현된다.
8. 본 발명의 키트
본 발명의 항체 또는 항체 조성물(예를 들어 항체, 이중특이 또는 다중특이 분자, 또는 면역접합체) 및 사용설명서를 포함하는 키트도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 키트는 적어도 하나의 다른 약제, 또는 하나 이상의 다른 항체 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다. 키트는 통상적으로 키트 내용물의 예상 용도를 명시하는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 위 또는 키트와 함께 제공되거나 또는 다른 방식으로 키트에 부착되거나, 작성되거나 또는 기록된 임의의 재료를 포함한다.
또한, 본 발명의 진단 용도를 기반으로, 본 발명의 키트는 종양세포 CCDC112 단백질 발현량 또는 활성을 검출할 수 있는 성분을 더 포함할 수 있다. 따라서, 상기 항체 조성물 이외에, 본 발명의 키트 성분은 프라이머, 프로브, 또는 단백질 발현 또는 활성을 검출할 수 있는 기타 재료를 포함할 수 있으며, 이에 국한되지 않는다.
실시 예
하기 실시 예의 실험 방법은, 특별한 설명이 없는 한, 모두 일반적인 방법이다. 본 발명은 하기의 비제한적 실험 실시 예를 참조하면 더욱 이해될 수 있다.
실시 예 1 : CCDC112는 면역세포에 의한 종양세포의 살상을 억제한다.
CCDC112를 중간 수준으로 발현하는 종양세포 HCT116 및 MCF7을 각각 선택하여 CCDC112를 녹아웃 또는 과발현시키고, CD3 및 CD28이 작용된 PBMC와 공배양한 후, Annexin-V 표지된 유세포 분석을 이용하여 CD45-의 종양세포 자멸사 비율을 분석한다.
CCDC112 유전자 편집은 구체적으로 하기 단계로 수행된다.
1. CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템, 즉 CCDC112를 특이적으로 절단하는 퓨로마이신 내성의 sgRNA를 포함하는 렌티바이러스를 구축한다.
실험의 전체적 과정 : 먼저 gRNA 서열의 단일가닥 DNA 올리고를 합성한 후, 어닐링하여 이중가닥 DNA 올리고를 생성한 다음, 이의 양단에 포함된 제한효소 절단부위를 통해 이를 직접 절단된 CRISPR/Cas9 벡터에 연결한다. 연결 생성물을 준비된 박테리아 컴피턴트 세포로 이전한 후, 성장한 단클론 콜로니를 시퀀싱 회사에 보내 시퀀싱을 분석하며, 정확하게 정렬된 클론이 성공적으로 구축된 CRISPR/Cas9 벡터이다. 타겟 유전자의 표적 유전자 서열의 경우, 공용 웹사이트에서 제공되는 gRNA 서열 설계 원칙을 이용하여, 유전자 서열에 따라 각각 gRNA 올리고머 단일가닥 DNA, 서열번호 1-8로 표시되는 올리고를 설계 및 합성한다. 올리고머 단일가닥 DNA를 이중가닥으로 어닐링하고, 이중가닥 gRNA 올리고를 각각 CRISPR/Cas9 벡터에 삽입하여 CRISPR/Cas9 재조합 플라스미드를 구축하고, 컴피턴트 세포 Stbl3으로 형질전환한다. 벡터를 구축하는 구체적 단계는 하기와 같다.
표 1R. gRNA 올리고머 단일가닥 DNA서열
1) gRNA의 어닐링 : 멸균된 TE 완충액을 이용해 프라이머를 최종 농도 100μMol로 희석한다. 각각 상류 및 하류 프라이머 10μl를 취해 혼합하고 고르게 피펫팅하여 PCR 튜브에 넣고 어닐링하며, 종료되면 얼음 위에 수 분 동안 놓아두어 직접 연결시키거나 또는 -20°C에서 냉동 보관한다.
2) CRISPR/Cas9 벡터의 효소 절단 및 회수 : 효소 절단 시스템은 하기와 같다. CRISPR/Cas9 벡터 5μg; 10* 완충액 5μl; BsmBI 4μl; ddH2O로 50μl까지 보충한다. 37°C에서 약 30분 동안 효소 절단한다. 이 기간 동안, 0.8% 아가로스 겔을 준비하고, 효소 절단이 종료되면 핵산 전기영동을 수행한다. 전기영동이 종료된 후 타겟 단편이 포함된 겔 스트립을 절단한다. 저울로 총 중량을 측정하고 빈 튜브의 무게를 차감해서 겔의 무게를 계산하며, 100mg을 약 100μl로 하여 겔의 부피를 계산하고, 겔 부피의 3배에 해당되는 QG 완충액을 첨가하여 50℃ 수조에 넣고 겔을 완전히 녹이고, 그 동안 EP 튜브를 적절히 흔들어 겔의 용해를 가속화시킨다. 겔이 완전히 녹으면, 겔과 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하여 균일하게 혼합한다. 상기 액체를 전부 필터 컬럼으로 옮기고, 13,000rpm으로 30초 동안 원심분리한다. 튜브 내의 액체를 버리고 컬럼에 750μl의 PE 완충액을 첨가하여 1분 동안 원심분리한다. 튜브 내의 액체를 버리고 다시 1분 동안 원심분리한다. 새로운 1.5ml의 EP 튜브로 교체하고, 컬럼에 50μl의 EB 완충액을 첨가한 후, 1분 동안 원심분리하면, 원심분리 튜브 내에 벡터가 회수된다.
3) CRISPR/Cas9 벡터와 프라이머의 연결. 연결 시스템은 하기와 같다. 회수 벡터 3μl(50ng); 올리고 프라이머 1μl(0.5μM); T4 DNA 리가제 완충액 1.5μl; T4 DNA 리가제 1μl; ddH2O로 15μl까지 보충한다. 25℃의 수조에서 30분 동안 배양한다.
4) 형질전환 : 컴피턴트 세포를 얼음 위에 놓고 자연 해동시킨 후, 연결 생성물을 모두 컴피턴트 세포에 첨가하고 얼음 위에 20분 동안 방치한 다음, 42°C의 수조에서 90초 동안 열충격을 가한다. 그후 신속하게 얼음 위로 옮겨 2-3분 동안 놓는다. 항생제를 함유하지 않은 LB 배지 1000μl를 첨가하여 37℃에서 150rpm으로 45분 동안 진탕 배양한다. 3000rpm으로 2분 동안 원심분리하고, 약 850μl의 상청액을 버린 후, 튜브 바닥의 박테리아 용액을 피펫팅으로 분산시키고, 해당 내성이 있는 페트리 접시에 넣어 멸균 처리된 어플리케이터로 골고루 편 후, 37°C 항온 인큐베이터에 거꾸로 넣어 밤새 배양한다.
5) 재조합 플라스미드의 제조 : 약간의 단일 콜로니를 선택하여 소량의 진탕 배양을 수행한다.
6) 양성 클론을 시퀀싱 동정하여 비교하면, 재조합 클론에 삽입된 단편의 서열과 설계된 올리고 서열이 완전히 일치하므로, 벡터가 성공적으로 구축되었다.
2. CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템을 이용해 유전자를 편집하여 HCT116-CCDC112 녹아웃 세포주를 구축한다.
HCT116 및 MCF7 세포(ATCC, VA, 미국)를 적절한 밀도(2일차에 밀도 약 30-40%로 성장)로 24웰 플레이트(Corning, NY, 미국)에 분주하고, 다음날 소화 및 계수하며, 먼저 GFP 대조 렌티바이러스(Genomeditech, 상하이, 중국)의 양적 구배로 세포를 감염시키고, 48시간 후에 용액을 교체하며, 72시간 후에 현미경으로 GFP 형광을 관찰함으로써, 최적의 바이러스 세포 감염 비율을 결정하여 MOI 값을 탐색한다. MOI 값이 결정되면, 다시 분주하여 블라스티시딘 내성을 함유한 Cas9 시스템 렌티바이러스(Genomeditech, 상하이, 중국)로 MOI 값을 이용해 HCT116 세포를 감염시키고, 48시간 후에 용액을 교체하며, 72시간 후에 농도 구배로 블라스티시딘(Invivogen, CA, 미국)을 첨가하여 10-14일 동안 스크리닝하면, 최종적으로 수득된 세포주는 Cas9 시스템을 함유한 HCT116 세포이다. 다시 Cas9 시스템을 함유하는 HCT116 세포를 24웰 플레이트에 분주하여 계수하고, CCDC112를 특이적으로 절단하는 퓨로마이신 내성의 sgRNA를 포함하는 렌티바이러스로 MOI 값을 이용해 감염시키고, 48시간 후에 용액을 교체하며, 72시간 후에 농도 구배로 퓨로마이신(Invivogen, CA, 미국)을 첨가하여 10-14일 동안 스크리닝하면, HCT116-CCDC112 녹아웃 세포주가 수득된다.
3. CCDC112 유전자의 과발현 : CCDC112 전장 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드(실시 예 3의 서열번호 9로 표시되는 말단 참조) 양단을 BamHI 및 KpnI 클로닝 부위에 연결하고, cDNA 서열을 완전 시험관내 합성하고, BamHI 및 KpnI로 효소 절단한 후 pcDNA3.1 벡터에 삽입하며, 성공적으로 연결된 클론을 선별하여 시퀀싱 검증을 수행한다. HCT116 및 MCF7 세포를 각각 형질감염시키고, G418로 안정화된 세포를 스크리닝하여, HCT116-CCDC112 및 MCF7-CCDC112의 안정화된 과발현 세포주를 수득한다.
CCDC112 뉴클레오티드 서열（서열번호 9）：
ATGGAAAAAGATAAACACAGTCATTTCTACAACCAAAAAAGTGACTTCAGAATTGAGCATAGTATGCTAGAAGAATTGGAAAATAAATTGATTCACAGCAGGAAAACAGAAAGAGCAAAAATCCAGCAACAATTGGCCAAAATACATAATAATGTAAAGAAACTTCAGCATCAATTAAAAGATGTGAAGCCTACACCTGATTTTGTTGAGAAGCTCAGAGAAATGATGGAAGAAATTGAAAATGCAATTAACACTTTTAAAGAAGAGCAGAGGTTGATATATGAAGAGCTAATTAAAGAAGAGAAGACAACTAATAATGAGTTGAGTGCCATATCAAGAAAAATTGACACATGGGCTTTGGGTAATTCAGAAACAGAGAAAGCTTTCAGAGCAATCTCAAGCAAAGTTCCTGTAGACAAAGTAACACCAAGTACTCTTCCAGAAGAGGTACTAGATTTTGAAAAATTCCTTCAGCAAACAGGAGGGCGACAAGGTGCCTGGGATGATTATGATCACCAGAACTTTGTAAAGGTGAGAAACAAACATAAAGGGAAGCCAACATTTATGGAAGAAGTTCTAGAACACCTTCCTGGAAAAACACAAGATGAAGTTCAACAGCATGAAAAATGGTATCAAAAGTTTCTGGCTCTAGAAGAAAGAAAAAAAGAGTCAATTCAGATTTGGAAAACTAAAAAGCAGCAAAAAAGGGAGGAAATTTTCAAGTTAAAGGAAAAGGCAGACAACACACCTGTGCTTTTTCATAATAAACAAGAGGATAATCAAAAGCAAAAAGAGGAACAAAGAAAGAAACAGAAATTGGCAGTTGAAGCTTGGAAGAAACAGAAAAGTATAGAAATGTCAATGAAATGTGCTTCCCAGTTAAAAGAAGAAGAAGAGAAAGAGAAAAAACATCAGAAAGAACGCCAGCGCCAGTTTAAGTTAAAATTACTACTAGAAAGTTATACCCAGCAGAAGAAAGAACAGGAAGAATTTTTGAGGCTTGAAAAGGAGATAAGGGAAAAGGCAGAAAAGGCAGAAAAAAGGAAAAATGCTGCTGATGAAATTTCCAGATTTCAAGAAAGAGATTTACATAAACTTGAACTGAAAATTCTAGATAGACAGGCAAAGGAAGATGAAAAGTCACAAAAACAAAGAAGACTGGCAAAATTAAAAGAAAAGGTTGAAAACAATGTTAGTAGAGATCCCTCTAGGCTTTACAAACCCACCAAAGGTTGGGAAGAACGAACCAAAAAGATAGGACCAACAGGCTCTGGGCCACTTCTACATATCCCACATAGGGCTATTCCAACCTGGAGACAAGGAATACAGAGAAGAGTATGA
4. 유세포 분석을 통해 종양세포에 발현되는 CCDC112를 녹아웃하면 인간 말초혈액 단핵구에 의한 종양세포 살상을 크게 증가시킬 수 있음이 입증된다.
CD3과 CD28 항체(Invitrogen, CA, 미국)를 PBMC(ATCC, VA, 미국)와 혼합하여 최종 농도 1μg/mL로 희석해 T세포를 활성화하고 밤새 배양한다. 다음날 PBMC와 상기 HCT116 또는 MCF7 세포(CCDC112를 녹아웃 또는 과발현하는 세포주 포함)를 계수하고, 각 세포 수를 1x106/mL로 조정하고, 각각 100μl씩 96웰 플레이트(Thermo Fisher, MA, 미국)에 첨가하여 인큐베이터에서 6시간 동안 배양한다. 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰의 세포를 EP 튜브(Axygen, CA, 미국)에 넣고 400rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 버린다. 500μl의 세포 염색 완충액(Invitrogen, CA, 미국)으로 세포를 재현탁 세척하고, 원심분리와 세척을 반복한다. 세포 염색 완충액으로 CD45-APC 항체(Invitrogen, CA, 미국)를 1:20으로 희석하고, 각 EP 튜브에 혼합액 200μl를 첨가하여 재현탁한 후, 실온에서 천천히 진탕시키며 30분 동안 배양한다. 400rcf에서 5분 동안 원심분리한 후 상청액을 버리고, 1ml의 결합 완충액(Meilun Biotech, 상하이, 중국)으로 세포를 재현탁 세척한 후, 원심분리와 세척을 반복한다. 각 실험군과 대조군을 설정하고, 조건에 따라 각각 결합 완충액 100μl, Annexin V-FITC(Meilun Biotech, 상하이, 중국) 5μl 및 PI(Meilun Biotech, 상하이, 중국) 10μl를 첨가한 후, 실온에서 천천히 진탕하면서 15분 동안 배양한 다음, 각각 결합 완충액 400μl를 첨가하여 유세포 분석 튜브(Falcon, NY, 미국)로 옮겨 유세포 분석기(Miltenyi Biotec, Cologne, 독일)로 분석한다.
결과에 따르면, CCDC112 과발현이 종양세포에 대한 PBMC의 살상 효과를 억제하고, CCDC112 유전자가 녹아웃되면 종양세포에 대한 PBMC의 살상이 증가되는 것으로 나타난다. 결과는 도 1에 도시된 바와 같다.
실시 예 2 : CCDC112는 골수계 유래 억제성 세포(MDSC) 및 조절 T세포(Treg)를 증가시킨다.
Treg/MDSC에 대한 CCDC112의 효과를 밝히기 위해, 먼저 세포를 준비한다. 웰당 1.5+10E5의 PBMC를 다양한 실험군으로 나누어 23시간(Treg 비율 검출에 사용) 또는 3일(MDSC 비율 검출에 사용) 동안 배양한다. 유세포 분석을 통해 표현형 CD4+CD25+Foxp3+, HLA-DR-CD11b+CD33+ 비율, 계수를 분석한다.
분석 결과에 따르면, 일반적인 HCT116 세포에 비해, CCDC112를 발현하는 HCT116 세포와 인간 말초혈액 단핵구를 공배양하면, MDSC 세포(HLA-DR-CD11b+CD33+) 및 Treg(CD4+CD25+Foxp3+)의 비율이 증가되고, CCDC112 유전자가 녹아웃된 종양세포는 MDSC 및 Treg 세포의 비율을 감소시키는 것으로 나타난다. 그 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
실시 예 3 : CCDC112와 수용체의 결합
ELISA 실험으로 CCDC112와 이의 LILRB2, LILRB4, LTBR, CD30의 결합 및 결합 강도를 분석한다.
구체적으로는, ELISA 전용 플레이트(costar, ME, 미국)를 사용한다. 먼저 다양한 농도의 CCDC112 재조합 단백질을 각각 100μl의 ELISA 코팅액(Solarbio, 베이징, 중국)에 용해시켜 코팅하고, 음성 대조군은 단백질을 포함하지 않은 코팅액 100μl을 사용하여 코팅한다. 밤새 4차례 코팅한다. PBST 세척 후 PBS에 용해된 5%의 BSA(VWR, PA, 미국) 100μl를 이용해 차단하고, 37°C의 인큐베이터에서 90분 동안 차단시킨다. PBST로 세척 후, 다시 1μg/mL의 수용체 단백질(LILRB2, LILRB4, LTBR, CD30) 세포외 영역 단백질 단편(Acrobiosystems 또는 Sino Biological, 베이징, 중국)으로 PBS 용액에서 결합 배양시키며(LTBR 및 CD30은 상이한 pH값으로 조절된 PBS에 첨가하여 보다 바람직한 결합 조건을 모색한다), 상기 수용체 단백질은 hFc로 태킹되고(P-Fc) 37°C의 인큐베이터에서 60분 동안 결합된다. PBST로 세척한 후, PBS로 희석된 특이적 항-인간 Fc 세그먼트 항체(Abcam, MA, 미국)를 37°C의 인큐베이터에서 30분 동안 배양 결합시킨다. PBST로 세척 후, 발색액(Sangon, 상하이, 중국)을 웰당 100μl 분주하여 인큐베이터에서 5~30분 동안 반응시킨 후, 정지액(Sangon, 상하이, 중국) 50μl를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher, MA, 미국) 450nm에서 발색을 판독한다.
결과에 따르면, CCDC112는 LILRB2, LILRB4, LTBR, CD30에 결합할 수 있고, LILRB2, LILRB4, LTBR, CD30 모두 CCDC112의 결합 수용체임이 입증된다. 여기서, LILRB2 및 LILRB4에 결합하는 CCDC112의 농도 구배 효과는 도 3에 도시된 바와 같다. 상이한 pH값에서 LTBR에 결합하는 CCDC112의 농도 구배 효과는 도 4에 도시된 바와 같다. 상이한 pH값에서 CD30에 결합하는 CCDC112의 농도 구배 효과는 도 5에 도시된 바와 같다.
실시 예 4 : 상이한 종양세포에서 CCDC112의 발현 수준 검출
RL 림프종 세포, A375 흑색종, RAJI 림프종, MCF7 유방암, A549 폐암, HCT116, LOVO, SW1116, SW48 결장직장암 세포를 포함하는 상이한 종양 세포주를 분석한다. 구체적으로는, 배양된 상기 세포를 계수하고, 4x106개 세포를 15ml 원심분리 튜브(Corning, NY, 미국)에 넣고 800rpm으로 4분 동안 원심분리한 후 상청액을 버린 다음, 10% 송아지 혈청이 포함된 RPMI1640 배지(Meilun, 다렌, 중국)에서 재현탁하고, 각각 1ml씩 12웰 플레이트(Corning, NY, 미국)의 각 웰에 넣어 충분하게 혼합한 후, 인큐베이터에서 10분 동안 배양한 다음 꺼내어 세포를 1.5ml EP 튜브(Axygen, CA, 미국)로 옮기고, 800rpm으로 4분 동안 원심분리한다. PBS로 재현탁 세척하고, 원심분리한 후, 세척을 반복한다. 원심분리 후 상청액을 버리고, RIPA 세포 용해액(Beyotime, 상하이, 중국)을 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, PMSF 트리플(Consun, 상하이, 중국)과 1:100의 비율로 준비하고, 각 튜브의 세포에 혼합 용해액 80μl를 첨가한다. 각 EP 튜브는 액체질소-얼음에서 3회 동결 3회 해동하고, 마지막 해동 후 12000rpm으로 4℃ 조건에서 15분 동안 원심분리한다. 원심분리 후 상청액을 취하여 상청액 대 5x 로딩 완충액(Beyotime, 상하이, 중국)을 4:1의 비율로 각 세포 시료를 준비한 후, 100℃의 메탈 베스에서 10분 동안 변성시켜 단백질 시료를 수득한다. 설명서에 따라 겔 플레이트(Bio-Rad, CA, 미국)에 10%의 PAGE 겔(EpiZyme, 상하이 중국)을 준비한 후, 준비된 겔을 전기영동 탱크(Bio-Rad, CA, 미국)에 넣고 전원(Bio-Rad, CA, 미국)을 연결하여 80볼트의 정압 조건으로 축적 겔을 통과시키고, 120V의 정압 조건으로 분리 겔을 통과시킨다. 밴드가 분해 겔 바닥에 도달하면 습식 멤브레인 전송을 이용하여 전송 탱크(Bio-Rad, CA, 미국)에서 350mA 정전류로 90분 동안 멤브레인을 전송한다. 멤브레인 전송이 완료되면, CCDC112와GAPDH 단백질의 질량 크기에 따라 멤브레인을 절단한다. 신속 차단 완충액(EpiZyme, 상하이, 중국)으로 10분 동안 차단하고, CCDC112 항체(제조 과정은 하기 실시 예에서 설명된다), GAPDH 항체(Consun, 상하이, 중국)를 사용해 각각 해당 밴드를 4°C에서 밤새 배양한다. 다음날 TBST로 세척한 후, TBS에 용해된 5% 탈지분유(Sangon, 상하이, 중국)로 희석한 특이적 항-토끼 2차 항체(Consun, 상하이, 중국)를 실온에서 1시간 동안 배양하고 TBST로 세척한 후, 혼합 발광액(Share-Bio, 상하이, 중국)에 1분간 넣어 겔 이미저(Bio-Rad, CA, 미국)에 노출시킨다.
결과는 도 6에 도시된 바와 같이, RL 림프종 세포는 CCDC112를 발현하지 않고(음성), A375 흑색종, RAJI 림프종은 CCDC112를 약간 낮은 수준으로 발현하고, MCF7 유방암, A549 폐암, HCT116, LOVO, SW1116 결장직장암은 강양성으로 발현한다.
실시 예 5 : CCDC112 단클론 항체의 제조
CCDC112 단백질 효모를 발현 및 정제하고, 검출을 통해 92% 순도에 달하고, ELISA 실험으로 CCDC112 단백질이 수용체 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30에 결합하는 활성을 가지고 있음을 검증한다. CCDC112 단백질(아미노산 서열은 서열번호 10으로 표시된다)을 이용해 하기와 같이 마우스 10마리를 면역화하고, 효과 강화를 위해 다중 면역화한다. (1) 1차 면역화, 항원 50μg/마리, 3주 간격으로 프로인트 완전 보조제 피하 다점 주사; (2) 2차 면역화, 용량 및 투여 경로는 1차와 상동, 프로인트 완전 보조제, 3주 간격; (3) 3차 면역화, 용량은 1차와 상동, 보조제 미첨가, 3주 간격으로 복강내 주사; (4) 부스터 면역화, 용량 50μg, 복강내 주사. 마지막 주사 3일 후 혈액을 채취하여 이의 역가를 측정하고, 면역 효과를 측정하며, 각각 역가가 더 높은 마우스를 선택해 하이브리도마 융합을 스크리닝한다. 서브클로닝 후 ELISA를 통해 단클론 항체와 표적 항원의 결합을 검출하고, ELISA 실험을 통해 CCDC112를 차단하는 상이한 단클론 항체가 수용체와 결합하는 기능을 검출한다.
CCDC112 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같다（서열번호 10）：
MEKDKHSHFYNQKSDFRIEHSMLEELENKLIHSRKTERAKIQQQLAKIHNNVKKLQHQLKDVKPTPDFVEKLREMMEEIENAINTFKEEQRLIYEELIKEEKTTNNELSAISRKIDTWALGNSETEKAFRAISSKVPVDKVTPSTLPEEVLDFEKFLQQTGGRQGAWDDYDHQNFVKVRNKHKGKPTFMEEVLEHLPGKTQDEVQQHEKWYQKFLALEERKKESIQIWKTKKQQKREEIFKLKEKADNTPVLFHNKQEDNQKQKEEQRKKQKLAVEAWKKQKSIEMSMKCASQLKEEEEKEKKHQKERQRQFKLKLLLESYTQQKKEQEEFLRLEKEIREKAEKAEKRKNAADEISRFQERDLHKLELKILDRQAKEDEKSQKQRRLAKLKEKVENNVSRDPSRLYKPTKGWEERTKKIGPTGSGPLLHIPHRAIPTWRQGIQRRV
실시 예 6 : 항원에 특이적으로 결합하는 CCDC112 단클론 항체의 스크리닝
항원에 특이적으로 결합하는 CCDC112 단클론 항체를 스크리닝하기 위해, ELISA를 이용해 CCDC112 전장 단백질과 CCDC112(73-227) 단편에 결합하는 CCDC112 항체의 농도 의존 의존적 효과를 검출하며, 후자는 그 항체가 CCDC112에 결합하는 부위, 즉 에피토프를 분석하는 데 사용된다.
도 7에 도시된 바와 같이, CCDC112 항체 농도가 증가함에 따라, CCDC112 전장 단백질 코팅 조건에서 ELISA 검출 결과 수치가 크게 증가하지만, CCDC112（73-227） 단편은 낮은 수준을 유지한다. 그 실험은 항체가 (73-227) 단편을 제외한 CCDC112의 일부에 특이적으로 결합함을 나타낸다.
추가적으로는, 유세포 분석을 통해 항원에 대한 CCDC112 항체의 특이적 결합을 검증한다. 리포솜의 안정적 형질감염을 통해 CCDC112를 과발현하는 HCT116 세포주를 구축하고, 세포를 CCDC112 항체와 공동 배양하여 결합되지 않은 항체를 세척한 후, 항-마우스 2차 항체(FITC 변형)로 유세포 분석 검출을 수행하여 양성으로 염색된 세포의 백분율을 분석한다.
결과는 도 8에 도시된 바와 같이, 유세포 분석에 따르면, 항체는 CCD112 녹아웃 HCT116 종양세포가 아닌 HCT116에 결합한다.
실시 예 7 : 수용체에 결합하는 CCDC112를 억제할 수 있는 CCDC112 단클론 항체의 스크리닝
CCDC112 기능을 차단할 수 있는 항체를 스크리닝 및 동정하기 위해, ELISA 실험으로 CCDC112와 이의 수용체 결합에 대한 항체의 효과를 분석한다. 구체적으로는, CCDC112 재조합 단백질을 ELISA 플레이트에 코팅하고, 상이한 농도의 항체(0, 1.1, 3.3, 10.0μg/mL)를 첨가한 후, LILRB2-hFc 또는 LTBR-hFc 수용체(인간 항체 Fc세그먼트 포함)를 추가로 첨가한다. 다시 항-인간 2차 항체로 겨자무과산화효소를 접합시키고, 최종적으로 기질로 발색하여 450nm의 흡수값을 검출해 CCDC112와 수용체의 결합 정도를 나타낸다.
도 9에 도시된 바와 같이, 항체는 CCDC112와 이의 수용체 LILRB2/LTBR의 결합에 대해 억제 효과를 나타내고, 억제 정도는 항체 농도와 관련이 있으며, 농도가 높을수록 억제 정도가 더 뚜렷하다.
추가적으로는, 종양세포 표면의 CCDC112와 이의 수용체(LILRB2, LTBR)의 결합에 대한 항체의 효과를 검출하기 위해, CCDC112를 안정적으로 과발현시키는 HCT116 세포를 LILRB2-hFc와 결합시킨 후, 상이한 농도의 CCDC112 항체 또는 대조군 마우스 IgG 항체와 배양하고, 최종적으로 FITC 접합 2차 항체로 검출한다. 유세포 분석에 따르면, 도 10에 도시된 바와 같이, CCDC112 항체는 종양세포가 CCDC112 수용체(LILRB2)에 결합하는 것을 억제한다. 도 11에 도시된 바와 같이, CCDC112 항체는 종양세포가 CCDC112 수용체(LTBR)에 결합하는 것을 억제한다.
스크리닝된 단클론 항체에 대해 단일항체 분자 초가변 영역의 일반적인 유전자 시퀀싱을 수행하여 경쇄 및 중쇄가변영역의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 코딩된 아미노산 서열을 수득한 후, 표 1과 같이 S-78-02 뉴클레오티드 서열을 클로닝한다. 아미노산 서열은 표 2와 같고, 단클론 항체의 CDR 분석에 대해 온라인 소프트웨어를 이용한 CDR 영역의 아미노산 서열 정의는 표 3과 같다.
단클론 항체의 초가변 영역의 뉴클레오티드 서열
단클론 항체 VH VL
S-78-02 CAGGTTCAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATACCCTGCAAGACTTCTGGATACTCATTCACTGACTACAACATAGACTGGGTGAAGCAGGGACTTGGAGAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACTATGGTGGAACTATGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAAGACACTGCAGTCTATTACTGTGCACATGACGAGTTTATTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA（서열번호 11） GACATCCAGATGAACCAGTCTCCATCTTCCATGTTTGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAGGGCGAGTCAGGACATTAATACCTATTTAAGCTGGATCCAGCGGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCTCACACGTTCGGTGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (서열번호 12)
단클론 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열
단클론 항체 VH VL
S-78-02 QVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKTSGYSFTDYNIDWVKQGLGESLEWIGDINPNYGGTMYNQKFKGKATLTVDKSSNTAYMELRSLTSEDTAVYYCAHDEFIYWGQGTLVTVSA(서열번호 13) DIQMNQSPSSMFASLGERVTITCRASQDINTYLSWIQRKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPHTFGGGTKLEIK
(서열번호 14)
단클론 항체 S-78-02의 CDR 아미노산 서열
CDR

방법		 CDRs
CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3 CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3
IMGT GYSFTDYN
(서열번호 15)		 INPNYGGT
(서열번호 16)		 AHDEFIY
(서열번호 17)		 QDINTY
(서열번호 18)		 RA
(서열번호 19)		 LQYDEFPHT
(서열번호 20)
Chothia GYSFTDY(서열번호 21) NPNYGG
(서열번호 22)		 DEFIY
(서열번호 23)		 RASQDINTYLS
(서열번호 24)		 RANRLVD
(서열번호 25)		 LQYDEFPHT
(서열번호 20)
AbM GYSFTDYNID(서열번호 26) DINPNYGGTM
(서열번호 27)		 DEFIY
(서열번호 23)		 RASQDINTYLS
(서열번호 24)		 RANRLVD
(서열번호 25)		 LQYDEFPHT
(서열번호 20)
Kabat DYNID(서열번호 28) DINPNYGGTMYNQKFKG
(서열번호 29)		 DEFIY
(서열번호 23)		 RASQDINTYLS
(서열번호 24)		 RANRLVD
(서열번호 25)		 LQYDEFPHT
(서열번호 20)
Contact TDYNID(서열번호 30) WIGDINPNYGGTM
(서열번호 31)		 AHDEFI
(서열번호 32)		 NTYLSWI
(서열번호 33)		 TLIYRANRLV
(서열번호 34)		 LQYDEFPH
(서열번호 35)
실시 예 8 : 생물층 간섭계 측정법에 의해 측정된 단클론 항체와 항원의 결합 동역학
생물층 간섭계 측정법(ProbeLife Gator 기기)을 사용해 일반적인 절차로 본 발명의 인간 CCDC112에 결합하는 항체의 평형 해리상수(KD)를 측정한다. CM5 칩에 200nM 항체를 고정하고, 15nM배 비율에서 1.875nM까지 항원을 희석하여 결합 및 해리를 테스트한다. 소프트웨어 분석을 통해, 측정된 친화도 상수는 4.68*10-10M이다. S-78-02 단클론 항체와 CCDC112의 친화도 해리 곡선은 도 12에 도시된 바와 같다.
실시 예 9 : 종양세포에 대한 CCDC112 단클론 항체의 시험관내 억제 효과
CCDC112를 발현하는 종양세포에 대한 CCDC112 항체(S-78-02)의 상기 억제 효과를 동정하기 위해, 하기의 시험관내 실험을 수행한다. 각각 먼저 상이한 종양세포(RL 림프종 세포, A375 흑색종, RAJI 림프종, MCF7 유방암, A549 폐암, HCT116, LOVO, SW1116, SW48 결장직장암 세포)를 취해 CCDC112 항체 또는 대조군 마우스 IgG와 배양한 후, 사전에 CD3 및 CD28에 의해 작용된 PBMC와 12시간 동안 공배양하고, Annexin-V 표지된 유세포 수를 이용해 CD45-의 세포 자멸사 비율을 분석한다.
결과는 도 13에 도시된 바와 같이, 항체는 PBMC의 종양세포 살상에 대해 상이한 정도의 촉진 효과를 갖고, CCDC112 발현 수준이 높은 세포일수록 이러한 촉진 효과가 더 강하다. 추가적으로는, 대식세포 탐식 실험을 통해 항체의 효과를 분석한다. THP1에 의해 유도되어 생성된 대식세포(APC 표지)를 HCT116 세포(녹색 형광 표지)와 공배양하고, 12시간째에 유세포 분석기로 탐식 정도를 분석한다. 결과는 도 14에 도시된 바와 같이, CCDC112 항체는 종양세포에 대한 대식세포의 탐식을 증가시킨다.
상기 결과에 따르면, CCDC112의 발현은 종양세포를 억제하기 위해 CCDC112 항체를 투여하기 위한 중요한 선택적 지표이고, CCDC112 항체가 CCDC112의 기능을 특이적으로 억제함으로써 효과가 발휘된다.
실시 예 10 : 종양세포에 대한 CCDC112 단클론 항체의 체내 억제 효과
CCDC112를 발현하는 종양세포에 대한 CCDC112 항체의 상기 억제 효과를 동정하기 위해, 상이한 체내 실험을 하기와 같이 수행한다.
6-8주령 수컷 NPSG 마우스 모델 30마리의 무게를 잰다. HCT116 세포(중간 발현), SW48(강한 발현), A549 폐암(중저 발현), MCF7(중간 발현), RL 세포(음성)이 포함된 상이한 수준의 CCDC112 발현 종양세포를 각각 시험관내 배양하여 1.8Х108 세포를 수득한다. 30마리 마우스에 PBMC를 접종하고, 3일째에 종양세포를 접종한 후, 매주 1회 마우스 혈액 중 hCD45+ 세포 비율 및 무게를 측정한다. 접종 후, 매주 1회 종양 부피를 측정하고, 평균 종양 부피가 약 40-80mm3에 달하면 마우스 혈액 중 hCD45+ 세포 비율을 측정한다. 종양 부피 및 마우스 혈액 중 hCD45+ 세포 비율에 따라 무작위로 마우스를 그룹화한 후, 투여를 시작한다. 투여 시작일을 0일로 간주한다. 투여 방안 : CCDC112 항체를 매주 3회 5mg/kg 복강내 주사한다. 투여 시작 후, 매주 마우스의 종양 부피 성장 상태를 관찰하고, 종양이 성장하면, 매주 3회 무게와 종양 부피를 측정하고, 매주 3회 유세포 분석으로 마우스 혈액 중 hCD45+ 세포의 상대 계수를 모니터링한다. 종양 부피가 종말점 기준에 달하면, 혈액을 취해 위와 같은 지표를 검출하고, 실험을 종료한다. 마우스에 대한 관찰은, 매일 관찰, 접종 후, 매일 동물의 발병 및 사망 상태 관찰을 포함한다. 종양 부피는, 접종 후부터 그룹화 전까지 종양이 발견되면, 매주 1회 실험 동물의 종양 부피를 측정하고, 그룹화 접종 후에는 실험 동물의 종양 부피를 매주 2회 측정한다. 종양 부피 측정은 양방향 측정법을 사용한다. 먼저 버니어 캘리퍼스를 이용해 종양의 장경과 단경을 측정한 후, 공식 TV = 0.5* a * b2를 사용해 종양 부피를 계산한다. 여기서 a는 종양의 장경이고, b는 종양의 단경이다. 결과는 하기와 같다.
CCDC112를 발현하는 SW48 결장직장암 세포의 경우, CCDC112 항체는 마우스 체내의 종양에 대해 뚜렷한 억제 효과가 있고, 모든 그룹 중에서 효과가 가장 강력하다(도 15). CCDC112를 중간 수준으로 발현하는 HCT116, A549, MCF7 종양세포의 경우, CCDC112 항체는 마우스 체내의 종양에 대해 뚜렷한 억제 효과가 있다(도 16 내지 도 18). CCDC112가 검출되지 않은 RL 림프종 세포의 경우, CCDC112 항체는 마우스 체내의 종양에 대해 뚜렷한 억제 효과가 없다(도 19).
상기 결과에 따르면, CCDC112 발현에 대한 분석은 CCDC112 항체의 투여에 중요한 의미를 가지며, CCDC112를 발현하는 종양세포는 CCDC112 항체에 대한 반응이 보다 뚜렷한 것으로 나타난다.
전술한 본 발명의 구체적 실시 양태에 대한 설명은 설명과 예시적 목적을 위한 것이다. 이러한 설명은 본 발명의 개시된 정확한 형태로 한정하려는 것이 아니며, 분명하게는, 상기 교시에 따라 많은 변경과 변화가 가능하다. 예시적 실시 예에 대한 선택 및 설명의 목적은 본 발명의 특정 원리 및 이의 실제 적용을 설명하는 데 있으므로, 당업자는 본 발명의 다양한 예시적인 실시 양태 및 다양한 선택 및 변경을 이용하고 구현할 수 있다. 본 발명의 범위는 청구범위 및 이의 등가 형태에 의해 정의되도록 의도된다.
<110> BIOTROY THERAPEUTICS <120> METHOD FOR INHIBITING TUMOUR CELL GROWTH BASED ON CCDC112 <160> 35 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequenceemia virus <220> <223> #1 <400> 1 cacttctaca tatcccacat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 <400> 2 ggtgggtttg taaagcctag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #3 <400> 3 ctggtgatca taatcatccc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #4 <400> 4 tccaggttgg aatagcccta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #5 <400> 5 aattctagat agacaggcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #6 <400> 6 tttacaaacc caccaaaggt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #7 <400> 7 tgtttattat gaaaaagcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #8 <400> 8 taaaaagcag caaaaaaggg 20 <210> 9 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial 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Lys Lys Gln Lys Ser Ile Glu Met Ser Met 275 280 285 Lys Cys Ala Ser Gln Leu Lys Glu Glu Glu Glu Lys Glu Lys Lys His 290 295 300 Gln Lys Glu Arg Gln Arg Gln Phe Lys Leu Lys Leu Leu Leu Glu Ser 305 310 315 320 Tyr Thr Gln Gln Lys Lys Glu Gln Glu Glu Phe Leu Arg Leu Glu Lys 325 330 335 Glu Ile Arg Glu Lys Ala Glu Lys Ala Glu Lys Arg Lys Asn Ala Ala 340 345 350 Asp Glu Ile Ser Arg Phe Gln Glu Arg Asp Leu His Lys Leu Glu Leu 355 360 365 Lys Ile Leu Asp Arg Gln Ala Lys Glu Asp Glu Lys Ser Gln Lys Gln 370 375 380 Arg Arg Leu Ala Lys Leu Lys Glu Lys Val Glu Asn Asn Val Ser Arg 385 390 395 400 Asp Pro Ser Arg Leu Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Trp Glu Glu Arg Thr 405 410 415 Lys Lys Ile Gly Pro Thr Gly Ser Gly Pro Leu Leu His Ile Pro His 420 425 430 Arg Ala Ile Pro Thr Trp Arg Gln Gly Ile Gln Arg Arg Val 435 440 445 <210> 11 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #11 <400> 11 caggttcaac tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 ccctgcaaga cttctggata ctcattcact gactacaaca tagactgggt gaagcaggga 120 cttggagaga gccttgagtg gattggagat attaatccta actatggtgg aactatgtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccaa cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaagac actgcagtct attactgtgc acatgacgag 300 tttatttact ggggccaagg gactctggtc actgtctctg ca 342 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #12 <400> 12 gacatccaga tgaaccagtc tccatcttcc atgtttgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca gggcgagtca ggacattaat acctatttaa gctggatcca gcggaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctca ccatcagcag cctggaatat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttcctcacac gttcggtggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 13 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #13 <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Ile Asp Trp Val Lys Gln Gly Leu Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Gly Thr Met Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala His Asp Glu Phe Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ala <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #14 <400> 14 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Met Phe Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Ile Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Phe Ile 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #33 <400> 33 Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Ile 1 5 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #34 <400> 34 Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val 1 5 10 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #35 <400> 35 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro His 1 5

Claims (27)

  1. 다음 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro) 또는 체내(in vivo)에서 종양세포를 조절하는 방법:
    a) CCDC112를 발현하는 종양세포에 대해, CCDC112의 기능 또는 활성을 변경시키는 단계;
    바람직하게는, 상기 조절은 억제이고, 상기 변경은 억제인 것을 특징으로 함.
  2. 제1항에 있어서, 다음 단계를 추가로 포함하는 시험관내 또는 체내에서 종양세포를 억제하는 방법:
    b) 종양세포와 면역세포를 접촉시키는 단계;
    상기 단계 b)는 단계 a) 이전 또는 이후일 수 있음.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CCDC112의 기능 또는 활성의 상기 억제는 단백질 또는 유전자 수준의 억제이고;
    바람직하게는, 상기 억제 방법은 다음 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지 않는 것을 특징으로 하는 방법:
    i. CCDC112 유전자를 유전자 편집(gene editing)하는 방식;
    ii. CCDC112 유전자의 발현을 방해하는 방식; 및
    iii. 항체를 통해 CCDC112 단백질의 기능 또는 활성을 억제하는 방식.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CCDC112의 기능 또는 활성을 억제함으로써, CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 결합 효과를 억제 또는 차단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 종양세포에서 CCDC112의 기능 또는 활성을 변경시키는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 체내에서 MDSC 또는 Treg 세포 비율을 조절하는 방법.
  6. 종양세포에서 CCDC112의 기능 또는 활성을 변경시키는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 체내에서 세포 중의 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30 활성을 조절하는 방법.
  7. CCDC112와 수용체 LILRB2, LILRB4, LTBR 또는 CD30의 상호작용을 억제하는 억제제 또는 항체의 스크리닝을 통해, 후보 약물 또는 시약을 수득하는 것을 특징으로 하는, 종양을 예방 또는 치료하기 위한 약제 또는 시약을 스크리닝하는 방법.
  8. 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는, 억제제를 스크리닝 또는 동정하는 방법:
    a) 후보 분자가 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 결합에 미치는 영향을 분석하는 단계;
    b) 후보 분자가 골수계 유래 억제성 세포(MDSC)에 미치는 영향을 분석하는 단계;
    c) 후보 분자가 조절 T세포(Treg)에 미치는 영향을 분석하는 단계; 및
    d) 후보 분자가 면역세포가 종양세포를 살상하는 데 미치는 영향을 분석하는 단계;
    여기서, 상기 후보 분자는 CCDC112 억제성 분자이고;
    바람직하게는, 상기 CCDC112 억제제는 항체 또는 항원 결합 단편인 것을 특징으로 함.
  9. 다음 단계를 포함하는 항체의 제조방법:
    a) CCDC112에 대한 항체를 제조하는 단계; 및
    b) 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30에 대한 CCDC112의 결합을 차단 또는 억제하는 효과를 갖는 항체를 스크리닝하는 단계.
  10. CCDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 조절할 수 있는 작용성 또는 길항성 화합물;
    바람직하게는, 상기 화합물은 저분자 억제제, 폴리펩티드, 항체 또는 항원 결합 단편인 것을 특징으로 함.
  11. 다음 중 어느 하나에 대한 CCDC112 억제제의 용도:
    a) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 길항하는 용도,
    바람직하게는, 상기 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현됨;
    b) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 길항하는 제품을 제조하는 용도,
    바람직하게는, 상기 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현됨;
    c) 종양을 예방 또는 치료하는 용도;
    d) 종양을 예방 또는 치료하는 약제를 제조하는 용도;
    e) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 용도;
    f) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 데 사용되는 약제를 제조하는 용도;
    g) 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro)에서 종양 세포 성장을 억제하는 용도; 및
    h) 생체내 및 시험관내에서 종양 세포 성장을 억제하기 위한 시약을 제조하는 용도;
    상기 억제제는 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 결합을 억제 또는 차단할 수 있고;
    바람직하게는, 상기 억제제는 소분자 억제제, 폴리펩티드, 항체 또는 항원 결합 단편임.
  12. 대상체의 면역세포 또는 종양세포를 유효 용량의 CCDC112 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양을 예방 또는 치료하는 방법으로,
    상기 항체는 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4, 또는 CD30의 결합을 억제할 수 있고;
    바람직하게는, 상기 대상체는 추가적 항암요법을 이미 받았거나 또는 받고 있거나 또는 받을 예정이며;
    보다 바람직하게는, 상기 추가적 항암요법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 면역요법 또는 호르몬요법을 포함하는 방법.
  13. 면역요법 이전/이후 대상체 종양세포의 CCDC112 단백질 발현량 또는 기능을 검출하는 단계를 포함하는, 종양 면역요법을 위한 동반 진단 방법.
  14. 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로,
    a) 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 높은 친화도로 CCDC112 단백질에 특이적으로 결합함; 및
    b) 상기 항체는 CCDC112와 LILRB2, LTBR, LILRB4, 또는 CD30 중 어느 하나 사이의 상호작용을 억제 또는 차단함;
    추가적으로, 상기 항체는 다음의 특성 중 적어도 하나를 가짐:
    i. 면역 억제성 세포 MDSC 세포 비율을 감소시키는 특성;
    ii. 면역 억제성 세포 Treg의 세포 비율을 감소시키는 특성; 및
    iii. 종양세포를 살상하는 면역세포(예를 들어, PBMC)의 효과를 강화하는 특성.
  15. 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄가변영역에 3개의 CDR 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄가변영역에 3개의 CDR을 포함하는 단리된 항원체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는
    상기 6개의 CDR 영역에 대해 2개 이하의 아미노산 변이를 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 변이체,
    바람직하게는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음의 CDR 서열을 포함함:
    i) 서열번호 15, 21, 26, 38 및 30 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1;
    ii) 서열번호 16, 22, 27, 29 및 31 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR2;
    iii) 서열번호 17, 23 및 32 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR3;
    iv) 서열번호 18, 24 및 33 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR1;
    v) 서열번호 19, 25 및 34 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR2;
    vi) 서열번호 20 또는 35로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 LCDR3; 또는
    상기 6개의 CDR i) 내지 vi)에 대해 각각 2개 이하의 아미노산 변이를 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 변이체,
    보다 바람직하게는, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음을 포함함:
    IMGT 정의에 따른 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 서열의 중쇄가변영역; 및
    IMGT 정의에 따른 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열의 경쇄가변영역,
    여기서,
    i) 상기 HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시되고;
    ii) 상기 HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되며;
    iii) 상기 HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시되고;
    iv) 상기 LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시되며;
    v) 상기 LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시되고;
    vi) 상기 LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 20으로 표시되며; 또는
    상기 6개의 CDR i) 내지 vi)에 대해 각각 2개 이하의 아미노산 변이를 갖는 하나 이상의 CDR을 갖는 변이체;
    보다 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 CCDC112에 대한 결합 KD는 <2Х10-8이고;
    더욱 바람직하게는, 상기 KD는 <2Х10-8, <1Х10-8, <9Х10-9, <8Х10-9, <7Х10-9, <6Х10-9, <5Х10-9, <4Х10-9, <3Х10-9, <2Х10-9, <1Х10-9, <1Х10-10인 것을 특징으로 함.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하고, 여기서,
    a) 상기 중쇄가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 13으로 구성되거나, 그룹 내의 서열과 적어도 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    b) 상기 경쇄가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 14로 구성되거나, 그룹 내의 서열과 적어도 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는;
    항체 또는 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 항체는 폴리펩티드에 연결되는 접합 모이어티를 추가로 포함하고,
    상기 접합 모이어티는 방사성 핵종, 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 플루오레세인, 운반체 단백질, 지질, 및 비오틴 중 하나 이상이며,
    상기 폴리펩티드 또는 항체는 상기 접합 모이어티와 링커를 통해 선택적으로 연결되고,
    바람직하게는 상기 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드이며;
    보다 바람직하게는, 상기 항체는 단클론 항체, 다클론 항체, 항혈청, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체에서 선택되고,
    보다 바람직하게는, 상기 항체는 다중특이 항체, 단일사슬 Fv（scFv）, 단일사슬 항체, 항-개별특이형 항체（항-Id） 항체, 이중 항체, 미니 항체, 나노 항체, 단일 도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화 결합된 이중특이 Fv（sdFv） 및 세포내 항체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항의 폴리뉴클레오티드, 및 임의의 조절 서열을 포함하는 재조합 벡터로;
    바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이고,
    보다 바람직하게는, 상기 조절 서열은 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 서열, 전사 종결자, 또는 임의의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  20. 제19항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포로;
    바람직하게는, 원핵세포 또는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물 중의 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물로,
    바람직하게는, 약학적으로 허용되는 담체 또는 보조제를 더 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 제14항 내제 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물 중의 하나 이상을 포함하고, 적절한 용기에 수용되는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물의 다음 어느 하나의 용도:
    a) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 작용 또는 길항하는 용도,
    바람직하게는 상기 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, 상기 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현됨;
    b) CDC112와 LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30의 상호작용을 작용 또는 길항하는 데 사용되는 제품을 제조하는 용도,
    바람직하게는 상기 CCDC112는 종양세포에서 발현되고, LILRB2, LILRB4, LTBR 및 CD30은 면역세포에서 발현됨;
    c) 종양을 예방 또는 치료하는 용도;
    d) 종양을 예방 또는 치료하는 데 사용되는 약제를 제조하는 용도;
    e) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 용도;
    f) 종양에 의해 유발되는 면역 반응을 조절하는 데 사용되는 약제를 제조하는 용도;
    g) 체내 및 시험관 내에서 종양세포의 성장을 억제하는 용도;
    h) 체내 및 시험관 내에서 종양세포의 성장을 억제하는 데 사용되는 시약을 제조하는 용도.
  24. 종양을 예방 또는 치료하는 방법으로,
    상기 방법은 대상체의 면역세포 및 종양세포를 유효 용량의 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고;
    바람직하게는, 유효량의 화합물을 사용하여 대상체의 면역세포 및/또는 종양세포와 접촉시키기 전, 종양세포에서 CCDC112의 발현을 검출하는 단계를 포함하며;
    바람직하게는, 상기 면역세포는 림프구이고, 보다 바람직하게는, T림프구이고;
    보다 바람직하게는, 상기 대상체는 추가적 항앙요법을 이미 받았거나 또는 받고 있거나 또는 받을 예정이며;
    더욱 바람직하게는, 상기 추가적 항앙요법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 면역요법 또는 호르몬요법인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 체내 및 시험관내 생체 시료 중 CCDC112의 존재 여부를 검출하는 방법으로,
    생체 시료를 제14항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 숙주세포 및 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 다음 단계를 포함하는, 종양의 성장을 억제하는 방법:
    A）종양세포에서 CCDC112의 발현을 분석하는 단계;
    B）CCDC112를 인식할 수 있는 항체를 이용해 종양세포와 접촉시키는 단계,
    바람직하게는, 상기 항체의 CCDC112에 대한 결합 KD는 <2Х10-8이고;
    구체적으로는, 상기 KD는 <2Х10-8, <1Х10-8, <9Х10-9, <8Х10-9, <7Х10-9, <6Х10-9, <5Х10-9, <4Х10-9, <3Х10-9, <2Х10-9, <1Х10-9, <1Х10-10이며;
    또는, 바람직하게는, 상기 항체는 CCDC112와 수용체 LILRB2, LTBR, LILRB4 또는 CD30의 결합 작용을 억제 또는 차단함; 및
    C）T림프구, 상기 항체를 종양세포와 접촉시키는 단계.
  27. 제1항 내지 제26항에 있어서, 상기 종양은 결장직장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 림프종, 간암, 두경부암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 유방암 및 난소암에서 선택되는 청구항.
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