CN116848143A - 基于ccdc112抑制肿瘤细胞生长的方法 - Google Patents

基于ccdc112抑制肿瘤细胞生长的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116848143A
CN116848143A CN202280013892.1A CN202280013892A CN116848143A CN 116848143 A CN116848143 A CN 116848143A CN 202280013892 A CN202280013892 A CN 202280013892A CN 116848143 A CN116848143 A CN 116848143A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ccdc112
antibody
tumor
cells
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280013892.1A
Other languages
English (en)
Inventor
许杰
孙玉凡
赵雪花
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Baiquan Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Baiquan Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Baiquan Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Baiquan Biotechnology Co ltd
Publication of CN116848143A publication Critical patent/CN116848143A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Abstract

CCDC112在肿瘤抑制中的应用，通过抑制CCDC112功能或活性，促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。CCDC112在制备抗肿瘤药物以及伴随诊断标志物方面具有应用价值。

Description

基于CCDC112抑制肿瘤细胞生长的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年2月8日提交中国专利局的申请号为202110172875.X、名称为“基于CCDC112抑制肿瘤细胞生长的方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于CCDC112的肿瘤抑制方法及应用。
背景技术
晚期复发肿瘤的治疗缺少有效的方法，该技术领域需要效果更好的替代或改良方案。肿瘤的免疫治疗近年来出现了重要的发展。免疫负性检查点调节剂(NCR)路径已被证明是治疗人免疫相关疾病的卓越临床靶标。使用单克隆抗体(mAb)阻断两种NCR即CTLA-4和PD-1以增强肿瘤免疫性正在彻底改变对癌症的治疗，并且已将这些路径确定为人疾病情况下的临床验证靶标。更新近地，触发NCR路径的可溶性形式的NCR配体已作为用以治疗自体免疫性的免疫抑制性药物(即针对类风湿性关节炎的AMP-110/B7-H4-Ig)进入临床试验。值得注意的是，免疫检查点阻断疗法的有效率比较低，而且起初有效的患者在长期治疗后会失去疗效。这提示肿瘤免疫逃逸可能存在重要的替代机制和途径。为了更有效地治疗癌症，必须鉴定新的肿瘤免疫分子靶点和治疗方法。
近期研究已经发现抑制性白细胞免疫球蛋白样受体(LILRB)和含有相关的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的受体LAIR1在多种造血和实体癌细胞中具有肿瘤促进功能。含有ITIM的受体在多种免疫细胞中表达并且通过募集磷酸酶SHP-1、SHP-2或SHIP传导信号，导致对免疫细胞激活产生负向调控。与CTLA4和PD-1类似，认为LILRB是免疫检验点因子。LILRB2在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上表达，可以以细胞自主方式抑制先天免疫，并通过间接机制抑制T细胞活化。既往研究报道LILRB2的拮抗剂可减少髓系来源的抑制性细胞(MDSC)和调节性T细胞(Treg)在肿瘤局部的浸润，并促进抗肿瘤免疫反应(Hui-Ming Chen等，J Clin Invest.2018；128(12):5647–5662)。这表明LILRB2结合其配体后可通过MDSC和Treg发挥抑制免疫细胞的作用并参与肿瘤免疫逃逸的过程。LILRB4的结构和功能与LILRB2相似，LILRB4被报道表达在MDSC细胞表面(Pauline de Goeje等，Oncoimmunology,19Mar2015,4(7):e1014242)。其配体包括APOE(Cancer Immunol Res.2019Aug；7(8):1244-1257)，且阻断APOE和LILRB4的结合对于。
淋巴毒素β受体(LTBR)又称肿瘤坏死因子受体超家族成员3(TNFRSF3)、肿瘤坏死因子受体Ⅲ型(TNF-RIII)，是一种含有4个TNFR-Cys重复区的单次跨膜I型膜蛋白。除了与HCV核心蛋白相互作用外，LTBR不仅与自身结合，还与TRAF3、TRAF4和TRAF5结合。既往有研究报道LTBR在小鼠体内的敲除引起了MDSC的降低，这表明LTBR可能对于MDSC的诱导和维持具有重要的作用(Anja K Wege等，Innate Immun.2014Jul；20(5):461-70)。目前LTBR的已知配体为淋巴毒素(lymphotoxin)，尚未见其它配体的报道。
卷曲螺旋结构域(CCDC)蛋白是存在于多种天然蛋白质中的一种蛋白质结构域，目前已发现至少200种CCDC蛋白，不同CCDC蛋白生物学功能多样，包括参与细胞间跨膜信号转导、遗传信号转录、促进细胞增殖和凋亡、调控恶性肿瘤细胞的侵袭和转移等多种生物学行为。CCDC112基因全名为“包含卷曲螺旋结构域蛋白112”(Coiled-coil domain-containing protein 112)，其功能尚未被公开，亦未见基于CCDC112抑制肿瘤的报道，因此进一步寻求新的能够用于肿瘤或肿瘤细胞抑制的标记物是本领域的持续需求。
有鉴于此，提出本发明。
发明概述
本发明的首要目的是寻求新的肿瘤免疫分子靶点和治疗方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种在体外或体内调控肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
a)对表达CCDC112的肿瘤细胞，改变CCDC112的功能或活性；
优选的，所述调控为抑制，所述改变为抑制。
进一步的，该方法还可包括步骤b)：
b)使肿瘤细胞与免疫细胞接触；所述步骤b)可以在步骤a)之前或之后。
在一些实施方式中，所述抑制可以是蛋白层面或是基因层面。
优选的，所述抑制包括但不限于如下任一一种方式：
i.对CCDC112基因进行基因编辑；
ii.干扰CCDC112基因表达；
iii.通过抗体抑制CCDC112蛋白的功能或活性。
上述抑制导致CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30任一之间结合受影响；优选的，所述影响为抑制或阻断CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30任一之间的结合；优选的，所述CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞。
进一步的，所述肿瘤细胞与免疫细胞可以为体外分离的肿瘤细胞与免疫细胞，或为存在于体内的肿瘤细胞与免疫细胞。
一方面，本发明还提供一种在体外或体内调控MDSC或Treg细胞比率的方法，其特征在于，包括改变细胞中CCDC112功能或活性的步骤。
一方面，本发明还提供一种在体外或体内调控细胞中LILRB2，LTBR，LILRB4或CD30活性的方法，其特征在于，包括改变细胞中CCDC112功能或活性的步骤。
一方面，本发明还提供一种筛选用于预防或治疗肿瘤的药物或试剂的方法，特征在于，通过筛选抑制CCDC112和受体LILRB2、LILRB4、LTBR或CD30相互作用的抑制剂或抗体，进而获得候选药物或试剂。
一方面，本发明还提供一种抑制分子或抑制剂的筛选或鉴定方法，其特征在于，包括以下任一或多个步骤：
a)分析候选分子对CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30结合的影响；
b)分析候选分子对髓系来源的抑制性细胞(MDSC)的影响；
c)分析候选分子对调节性T细胞(Treg)的影响；
d)分析候选分子对免疫细胞杀伤肿瘤细胞的影响；
所述候选分子为CCDC112的抑制性分子；
优选的，所述抑制分子或抑制剂为肿瘤抑制分子或抑制剂。
更优选的，所述抑制分子或抑制剂为抗体或抗原结合片段。
一方面，本发明还提供一种抗体的制备方法，其特征在于，
a)制备针对CCDC112抗体的步骤，以及：
b)筛选出对CCDC112与LILRB2，LTBR，LILRB4，或CD30结合有影响的抗体。
优选的，所述步骤a)是以CCDC112蛋白作为免疫原注射受试者，例如小鼠，或筛选天然库以制备抗体；示例性，所述CCDC112蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
一方面，本发明还提供一种激动或拮抗性化合物，其特征在于，所述化合物能够调节CCDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30任一相互作用。
优选的，所述化合物为小分子抑制剂、多肽、抗体或抗原结合片段。
一方面，本发明提供一种CCDC112抑制剂的如下任一用途：
a)在拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用中的用途；优选的， CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
b)在制备用于拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用的产品中的用途；优选的，CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
c)在预防或治疗肿瘤中的用途；
d)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途；
e)在调节针对肿瘤所引起的免疫反应中的用途；
f)在制备用于调节针对肿瘤所引起的免疫反应的药物中的用途；
g)在体内外抑制肿瘤细胞生长中的用途；
h)在制备用于体内外抑制肿瘤细胞生长的试剂中的用途。
所述抑制剂能够抑制或阻断CCDC112与其受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30的结合；优选的，所述抑制剂为小分子抑制剂、多肽、抗体或抗原结合片段。
一方面，本发明还提供一种预防或治疗肿瘤的方法，其包括：
使受试者的免疫细胞或肿瘤细胞与有效剂量的CCDC112抗体接触；所述抗体能够抑制CCDC112与受体LILRB2，LTBR，LILRB4，或CD30结合；
优选的，所述受试者已经接受或正在接受或将要接受额外的抗癌疗法；
更优选的，所述额外的抗癌疗法包括手术、放疗、化疗、免疫疗法或激素疗法。
一方面，本发明还提供一种肿瘤免疫治疗伴随诊断方法，其包括：检测经免疫治疗前/后受试者肿瘤细胞的CCDC112蛋白表达量或功能。
一方面，本发明还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
a)所述抗体以高亲和力特异性结合CCDC112蛋白；且
b)所述抗体能够抑制或阻断CCDC112与LILRB2，LTBR，LILRB4，或CD30中任一之间的相互作用。
在一些实施方式中，所述抗体另外还包含至少一项下列性质：
i.所述抗体降低免疫抑制性细胞MDSC细胞比率；
ii.所述抗体降低免疫抑制性细胞Treg的细胞比率；或
iii.所述抗体增强免疫细胞(如PBMC)对肿瘤细胞的杀伤作用。
在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段，包含SEQ ID NO:13所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:14所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与上述6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
在一些实施方式中，所述抗体的CDR包含如下CDR序列：
i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15、21、26、38、30任一所示；
ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16、22、27、29、31任一所示；
iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17、23、32任一所示；
iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18、24、33任一所示；
v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19、25、34任一所示；
vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20、35任一所示。
或者与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
在一些具体的实施方式中，所述CDR序列为根据IMGT定义的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区；以及包含根据IMGT定义的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，序列如下：
i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；
v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
或者与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体；
优选的，所述抗体或其抗原结合片段与CCDC112的结合KD<2×10 -8；
更优选的，所述KD<2×10 -8、<1×10 -8、<9×10 -9、<8×10 -9、<7×10 -9、<6×10 -9、<5×10 -9、<4×10 -9、<3×10 -9、<2×10 -9、<1×10 -9、<1×10 -10。
在一些实施方式中，所述所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，序列选自如下：
a)所述重链可变区的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NOs﹕13所组成的组中的氨基酸序列或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性；
b)所述轻链可变区的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NOs﹕14所组成的组中的氨基酸序列或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施方式中，所述抗体可进一步包含连接至多肽的偶联部分，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种，其中所述多肽或抗体与所述偶联部分可选择性通过连接子相连。
优选的，所述连接子为肽或多肽。
在一些优选实施方式中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体；更优选的，所述抗体选自多特异性抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体。
一方面，本发明还提供一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码上述的抗体或抗原结合片段。
一方面，本发明还提供一种重组载体，其包含上述的多核苷酸，以及任选的调控序列；优选的，所述重组载体为克隆载体或表达载体；更优选的，所述调控序列选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合。
一方面，本发明还提供一种宿主细胞，其特征在于，包含上述的重组载体；优选的，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
一方面，本发明还提供一种药物组合物，其特征在于，包含上述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物中的一种或更多种；
优选的，所述组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
一方面，本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，包含上述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物中的一种或更多种，并容纳于合适的容器中。
一方面，本发明还提供上述抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物的如下任一应用：
a)在激动或拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用中的用途；优选CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
b)在制备用于激动或拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用的产品中的用途；优选CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
c)在预防或治疗肿瘤中的用途；
d)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途；
e)在调节针对肿瘤所引起的免疫反应中的用途；
f)在制备用于调节针对肿瘤所引起的免疫反应的药物中的用途；
g)在体内外抑制肿瘤细胞生长中的用途；
h)在制备用于体内外抑制肿瘤细胞生长的试剂中的用途。
一方面，本发明还提供一种预防或治疗肿瘤的方法，其特征在于，包括：
使受试者的免疫细胞和肿瘤细胞与有效剂量的上述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物接触；
可选的，在使用有效量的化合物和受试者的免疫细胞和/或肿瘤细胞接触前，检测CCDC112在肿瘤细胞的表达；
优选的，所述免疫细胞为淋巴细胞，更优选的，为T淋巴细胞；
更优选的，所述受试者已经接受或正在接受或将要接受额外的抗癌疗法。
进一步优选的，所述额外的抗癌疗法包括手术、放疗、化疗、免疫疗法或激素疗法。
一方面，本发明还提供一种体内外检测生物样本中CCDC112存在与否的方法，其特征在于，使生物样本与上述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物化合物接触。
一方面，本发明还提供一种抑制肿瘤细胞生长的方法，包括以下步骤：
A)分析CCDC112在肿瘤细胞的表达；
B)利用可以识别CCDC112的抗体与肿瘤细胞接触；
C)使T淋巴细胞、所述抗体和肿瘤细胞相接触。
在一些实施方式中，所述抗体与CCDC112的结合KD<2×10 -8；优选的，所述KD<2×10 -8、<1×10 -8、<9×10 -9、<8×10 -9、<7×10 -9、<6×10 -9、<5×10 -9、<4×10 -9、<3×10 -9、<2×10 -9、<1×10 -9、<1×10 -10；
在另一些实施方式中，所述抗体抑制或阻断CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30的结合作用。
在一些实施方式中，上述所述肿瘤选自结直肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、乳腺癌、和卵巢癌相比于现有技术，本发明有益的技术效果至少包括如下几方面：
1)本发明定义了CCDC112在肿瘤细胞的广泛表达，可以作为肿瘤诊断的生物标记物。
2)本发明发现了CCDC112新的结合分子，LILBR2、LIRB4、LTBR以及CD30，鉴于上述分子在免疫调控以及致肿瘤发展中的重要作用，CCDC112分子在肿瘤发展中可通过增加髓系来源的抑制性细胞(MDSC)以及调节性T细胞(Treg)等发挥作用。
3)本发明发现了CCDC112的抗体分子可以阻断LILBR2、LIRB4、LTBR以及CD30与CCDC112的结合。
4)本发明发现的抗体分子可以促进PBMC细胞对表达CCDC112的肿瘤细胞的杀伤作用。
5)本发明为治疗表达CCDC112肿瘤提供了一种新的靶向途径。
以上内容是概括性的描述，必要时可包含细节的简化、概括和省略。因此，本领域技术人员将认识到，该概括性的描述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概括性的描述以简化地介绍一些选择的概念，这些概括性的描述将在下面的详细描述中进一步描述。以上概括性的描述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。此外，贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用整体并入本文。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.PBMC对共培养细胞的杀伤作用。表达CCDC112的MCF7人类乳腺癌细胞(左)和结直肠癌细胞HCT116(右)肿瘤细胞与激活的人外周血单核细胞(PBMC)共培养。结果表明CCDC112过表达抑制了PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用，而敲除CCDC112基因增加了PBMC对肿瘤的杀伤。
图2.肿瘤细胞对共培养的PBMC中MDSC(A)与Treg(B)比例的影响。相对于普通的HCT116细胞，表达CCDC112的HCT116细胞与人外周血单核细胞共培养，增加了MDSC细胞(HLA-DR-CD11b+CD33+)和Treg(CD4+CD25+Foxp3+)的比率，而敲除CCDC112基因的肿瘤细胞降低了MDSC和Treg细胞的比率。
图3.CCDC112结合LILRB2和LILRB4的浓度梯度效应。
图4.在不同的pH值下CCDC112结合LTBR的浓度梯度效应。
图5.在不同的pH值下CCDC112结合CD30的浓度梯度效应。
图6.不同肿瘤细胞表达CCDC112的水平。RL淋巴瘤细胞阴性，A375黑色素瘤、RAJI淋巴瘤低表达，MCF7乳腺癌、A549肺癌、HCT116、LOVO、SW1116结直肠癌阳性表达，SW48结直肠癌强阳性表达。
图7.ELISA检测CCDC112抗体结合CCDC112全长蛋白与CCDC112(73-227)片段的浓度依赖作用。
图8.流式细胞术表明抗体结合HCT116而非敲除CCDC112的HCT116肿瘤细胞。
图9.不同浓度的CCDC112抗体对CCDC112与其受体LILRB2/LTBR结合的抑制作用
图10.流式细胞术表明CCDC112抗体抑制了肿瘤细胞对CCDC112受体(LILRB2)的结合。
图11.流式细胞术表明CCDC112抗体抑制了肿瘤细胞对CCDC112受体(LTBR)的结合。
图12.生物膜干涉测定S-78-02与CCDC112的亲和力常数。
图13.抗体对PBMC杀伤不同肿瘤细胞的促进作用。
图14.CCDC112的抗体促进巨噬细胞吞噬HCT116肿瘤细胞。
图15.CCDC112抗体对PBMC人源化小鼠体内SW48结直肠癌的抑制作用。
图16.CCDC112抗体对PBMC人源化小鼠体内HCT116结直肠癌的抑制作用。
图17.CCDC112抗体对PBMC人源化小鼠体内A549肺癌的抑制作用。
图18.CCDC112抗体对PBMC人源化小鼠体内MCF7淋巴瘤细胞缺乏显著的抑制作用。
图19.CCDC112抗体对PBMC人源化小鼠体内RL淋巴瘤细胞缺乏显著的抑制作用。
发明详述
虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方式。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方式。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方式。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方式，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方式组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方式能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，如在本文中的短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
术语“例如”和“即”仅作为实例使用，而无意于限制，并且不应当诠释为仅涉及在说明书中明确列举的那些项目。
术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一种”应当理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。
相反地，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。
术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。
术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
如文本所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。
如本文所用，术语“抗体”(Ab)包括但不限于，特异性结合抗原的糖蛋白免疫球蛋白。通常，抗体可以包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合分子。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域，CL。VH和VL区域可以进一步细分为高变的区域，称为互补决定区(CDR)，散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。 重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。Ab的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
轻链可变区和重链可变区分别包含间插有三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)的“构架”区。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”或“高变区”(在本文中与超变区“HVR”可以互换使用)，是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。
然而，应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。例如，对使用Kabat和Chothia编号的CDR区域在不同指派系统定义下的残基范围如下表A所示。
表A.不同指派系统定义下的CDR残基范围
因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
本发明抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合人工地评估确定边界。除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
抗体可以包括例如，单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)、异缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼源化抗体、亲和体、 Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，抗-抗Id抗体)、微抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)和以上任何的抗原结合片段。
术语“人源化抗体”意图指将源自另一哺乳动物物种，诸如小鼠种系的CDR序列嫁接到人框架序列上获得的抗体。可以在人框架序列中进行别的框架区修饰。
如本文所用，“抗原结合分子”、“抗原结合片段”或“抗体片段”是指包含从该分子所源于的抗体的抗原结合片段(例如，CDR)的任何分子。抗原结合分子可以包括抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的实例包括但不限于，从抗原结合分子形成的Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。在一些实施方式中，抗原结合分子结合CCDC112蛋白，在一些实施方式中，抗原结合分子具有中和活性，能够抑制CCDC112与受体LILRB2，LTBR，LILRB4，或CD30结合。
如本文所用，术语“抗原”是指引发免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可以牵涉抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或这两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)均可以充当抗原。抗原可以内源性表达，即由基因组DNA表达或可以重组表达。抗原可以对某些组织，例如癌细胞具有特异性或者其可以广泛地表达。此外，较大分子的片段可以起抗原作用。在一些实施方式中，抗原为CCDC112蛋白抗原。
如本文所用，在一些实施方式中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段直接阻断配体上的结合位点或者通过间接方式(如配体的结构或能量改变)改变配体的结合能力。在一些实施方式中，抗原结合分子、scFv、抗体或其片段防止与其结合的蛋白质行使生物学功能。如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用并且是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽含有至少两个氨基酸并且可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中也通常称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长的链(其在本领域中通常称为蛋白质，其具有许多类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然的肽、重组的肽、合成的肽或其组合。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合至”是指两个分子之间例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。
如本文所用，“抑制结合”、“阻断结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体抑制两个分子的结合至任何可检测的程度的能力。在一些实施方式中，阻断两个分子之间结合的抗体将两个分子之间的结合相互作用抑制至少50％。在一些实施方式中，该抑制可以大于60％，大于70％，大于80％或大于90％。
如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”或“KD值”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域良好建立的方法来确定。
如本文所用，术语“高亲和力”的抗体是指针对靶抗原具有1×10 -7M或更低，更优选5×10 -8M或更低，甚至更优选1×10 -8M或更低，甚至更优选5×10 -9M或更低，和甚至更优选1×10 -9M或更低的KD值的抗体。
如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性表位”或“构象表位”。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例 如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如CLDN18.2)的抗体。在国际专利申请WO 03/048731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。
本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。本文所使用的术语“互补”涉及核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。
如本文所用，术语“癌症”是指一大组各种疾病，其特征为体内异常细胞不受控制的生长。不受调节的细胞分裂和生长导致形成入侵相邻组织且也可以通过淋巴系统或血流转移到身体远程部分的恶性肿瘤。“癌症”或“癌症组织”可以包括肿瘤。比如：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃肠、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物/肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴(spinal axis)肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、及所述癌症的组合。
如本文所用，术语“与CCDC112相关的癌症”是指存在CCDC112异常表达的肿瘤类型，或者由CCDC112的增加或减少的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何癌症，在一些实施方式中，本文公开的方法可以用于选自结直肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、乳腺癌、和卵巢癌。
如本文所用，“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或者促进疾病消退的任何量，所述疾病消退的证据为疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续期间增加或防止由于疾病折磨导致的损伤或残疾。可以使用熟练从业人员已知的各种方法评估治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间在人受试者中评估、在用于预测在人体中的效力的动物模型系统中评估或通过在体外测定法中测定试剂的活性评估。
如本文所用，“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方式中，个体或受试者是人。“受试者”可以是“患者”–患者是需要治疗的人类受试者，可以是患有CCDC112相关癌症如结直肠癌的个体，处于发生CCDC112相关癌症如结直肠癌的风险的受试者。
如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。特别地，体外细胞可以包括T细胞。
如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性 剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文所用，术语“调控”总体上包含了上调或下调两个不同方向的意思，在某些情况下可以理解了抑制或增强，在某些情况下可以理解为降低或提高，在某些情况下可以理解为减少或增多等，具体解释不做限制，根据实际应用语境理解和解释。示例性的，在一些实施方式中，“调控”肿瘤细胞生长可以理解为抑制或增强肿瘤细胞生长。
如本文所用，术语“减少”和“降低”可互换使用并且表示小于原来的任何变化。“减少”和“降低”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比较。“减少”和“降低”包括完全消耗；同理术语“增多”和“提高”是相反解释。
受试者的“治疗”或“处理”是指在受试者上进行任何类型的干预或过程，或对该受试者施用活性剂，以达到逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症或状况或与疾病相关的生化指标的发作、进展、发展、严重或复发的目的。在一些实施方式中，“治疗”或“处理”包括部分缓解。在另一个实施方式中，“治疗”或“处理”包括完全缓解。
本公开的各种方面进一步详细描述
1.CCDC112蛋白及其在肿瘤抑制中的作用
蛋白CCDC112是一种“包含卷曲螺旋结构域蛋白112”(Coiled-coil domain-containing protein 112)，隶属于卷曲螺旋结构域(CCDC)家族成员。卷曲螺旋结构域(CCDC)蛋白是存在于多种天然蛋白质中的一种蛋白质结构域，目前已发现至少200种CCDC蛋白，不同CCDC蛋白生物学功能多样，包括参与细胞间跨膜信号转导、遗传信号转录、促进细胞增殖和凋亡、调控恶性肿瘤细胞的侵袭和转移等多种生物学行为。下表列举部分已知的CCDC蛋白。
然而，CCDC112蛋白功能尚未被公开，亦未见基于CCDC112抑制肿瘤的报道，本发明人通过基因沉默敲除以及免疫学等实验证实了通过抑制CCDC112功能或活性，能够阻断CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30之间的相互作用，促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，从而可用于癌症的治疗领域。
在一些实施方式中，所述癌症为与CCDC112相关的癌症。
如本文所用，术语“与CCDC112相关的癌症”是指存在CCDC112异常表达的肿瘤类型，或者由CCDC112的增加或减少的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何癌症。
在一些实施方式中，本文公开的方法可以用于选自结直肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、乳腺癌、和卵巢癌。
2.基于CCDC112的肿瘤细胞调控的方法
基于本发明的上述发现，公开了一种在体外或体内调控肿瘤细胞的方法。该方法通过改变CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30任一之间的结合作用，改变免疫抑制性细胞MDSC或Treg的细胞比率，调控PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用。
本领域可以理解，这种调控可以是调控肿瘤细胞的细胞活性，或是肿瘤细胞生长，或是肿瘤细胞迁移等，在此并不做限制，本领域可以合理预期这种调控可以是多方面的。而“调控”包含了增强和抑制两个方面，在更多实施方式中，这种调控是抑制方面，即对于肿瘤细胞活性、生长或迁移等的抑制作用，以实现疾病的病灶去除或治疗目的。
在一些具体的抑制实施方式中，所述方法可以包括以下步骤：
a)对表达CCDC112的肿瘤细胞，通过抑制CCDC112的表达、功能或活性进而实现上述目的。可选的，在步骤a之前还可以包括对于肿瘤细胞的CCDC112表达进行检测，进而更好的实现上述方法。
进一步的，所述方法还包括步骤b：
b)使肿瘤细胞与免疫细胞接触；可以理解的是，步骤b)可以在步骤a)之前或之后完成，这都不影响该方法实施。
本领域可以理解，对于特定蛋白的表达、功能或活性的抑制方法有多种，这些方法可以是蛋白层面或基因层面来开展，其都是本领域公知的；
在一些实施方式中，上述抑制方法可以为如下任一一种：
a、对CCDC112基因进行基因编辑，以破坏该基因的完整性，进而降低该基因的表达量和活性等；
在一些优选的实施方式中，本发明的基因编辑系统为CRISPR/Cas9基因编辑系统；
在一些更优选的实施方式中，所述CRISPR/Cas9基因编辑系统用于编码sgRNA的寡聚DNA序列选自SEQ ID NO:1-8。
b、干扰CCDC112基因表达，比如RNAi方式，以降低该基因的表达量或活性；
c、免疫手段抑制，比如通过抗体抑制CCDC112蛋白的功能或活性。
另一方面，本发明还可提供了其他方面的调控的方法，比如，在体内外调控细胞中LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30活性的方法；比如，在体内外调控免疫抑制性细胞MDSC或Treg细胞比率的方法；再比如，在体内外调控PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用的方法。这些方法都包括了改变肿瘤细胞中CCDC112的功能或活性的步骤。
在一些实施方式中，上述调控方法是抑制LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30活性的方法；是降低免疫抑制性细胞MDSC或Treg细胞比率的方法；是增强PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用的方法。这些方法分别包括抑制肿瘤细胞中CCDC112的功能或活性的步骤。
3.本发明的抑制剂及其筛选或鉴定方法
基于本发明发现了CCDC112蛋白能够与LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30等受体结合，以及肿瘤细胞中CCDC112蛋白表达对于髓系来源的抑制性细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)以及免疫细胞的影响。
本发明提供了一种CCDC112抑制剂，本发明中的“抑制剂”，其可以是蛋白层面抑制剂或基因层面抑制剂，但凡能够抑制CCDC112基因或蛋白的，包括但不限于基因的生成、转录、活性、功能等，蛋白的表达、活性、功能等，都属于“抑制剂”范畴。
示例性的，
当是蛋白层面抑制剂时，其是这样的物质，其能够结合CCDC112蛋白同时抑制或阻断CCDC112与LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30中任一之间的相互作用。
在一些实施方式中，该蛋白层面的CCDC112抑制剂特异性结合于CCDC112蛋白。
在一些实施方式中，该蛋白层面的CCDC112抑制剂特异性并高亲和力结合CCDC112蛋白。
在一些实施方式中，该蛋白层面抑制剂为激动或拮抗CCDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用的化合物。
在一些实施方式中，所述蛋白层面抑制剂包括但不限于小分子抑制剂、多肽、抗体或抗原结合片段。
当是基因层面抑制剂时，其是这样的物质，其能够通过改变CCDC112基因的活性或功能，进而抑制或阻断CCDC112与LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30中任一之间的相互作用。
在一些实施方式中，该基因层面的CCDC112抑制剂包括但不限于特异性针对CCDC112基因的小分子物质、DNA类物质或RNA类物质等，比如引物、探针、sgRNA等物质。
本发明还提供上述抑制剂的筛选或鉴定方法，该方法可以包括以下步骤：
首先获得CCDC112抑制性分子，再分析候选分子对CCDC112与受体LILRB2，LTBR，LILRB4，或CD30结合的影响；
优选的，分析候选分子是否具有拮抗活性。
在一些实施方式中，该方法可以包括以下步骤：
首先获得CCDC112抑制性分子，再分析候选分子对髓系来源的抑制性细胞(MDSC)的影响；优选的，分析候选分子是否能够降低抑制性细胞(MDSC)的含量或比率。
在一些实施方式中，该方法可以包括以下步骤：首先获得CCDC112抑制性分子，再分析候选分子对调节性T细胞(Treg)的影响；优选的，分析候选分子是否能够降低调节性T细胞(Treg)的含量或比率。
在一些实施方式中，该方法可以包括以下步骤：首先获得CCDC112抑制性分子，再分析候选分子对免疫细胞杀伤肿瘤细胞的影响；优选的，分析候选分子是否能够促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤或抑制作用。
在一些实施方式中，该方法可以包括上述步骤中的组合或全部。
通过上述方法，本领域可以预期能够筛选和/或鉴定出有价值的CCDC112抑制性分子。
4.本发明的抗体及其制备方法
本发明的抗体
术语“针对CCDC112的抗体”、“抗CCDC112的抗体”、“抗CCDC112蛋白抗体”、“CCDC112蛋白抗体”、或“结合CCDC112的抗体”在本文中可互换地使用。是指这样的本发明的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合CCDC112蛋白，由此所述抗体可以用作靶向CCDC112蛋白的诊断剂、预防剂和/或治疗剂。
任何具备如下性质的抗体或其抗原结合片段理论上都属于本发明的发明构思或权利范围，具体的：这种分离的抗体或其抗原结合片段具有：
a)能够特异性结合CCDC112蛋白；且
b)能够抑制或阻断CCDC112与LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30中任一之间的相互作用。
在一些实施方式中，所述抗体另外还包含至少一项下列性质：
所述抗体降低免疫抑制性细胞MDSC细胞比率；
所述抗体降低免疫抑制性细胞Treg的细胞比率；或
所述抗体增强免疫细胞(如PBMC)对肿瘤细胞的杀伤作用。
另外/或者，所述抗体可以包含一种或多种其它的上述特征。
在一些具体的实施方式中，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，具体序列可以是如下各种：
SEQ ID NO:13所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:14所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；或者与上述6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体。
其中，所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，优选的的，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
在一些实施方式中，抗体包含了如下不同定义方式的CDR序列:
因此，在一些实施方式中，所述抗体包含如下CDR序列：
i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15、21、26、28、30任一所示；
ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16、22、27、29、31任一所示；
iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17、23、32任一所示；
iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18、24、33任一所示；
v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19、25、34任一所示；
vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20、35任一所示。
或者与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体；
在一些具体的实施方式中，根据IMGT定义的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区；以及包含根据IMGT定义的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，序列如下：
i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；
v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
或者与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体；
其中，所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代，优选的的，所述氨基酸变化是保守氨基酸取代。
优选的，所述抗体或其抗原结合片段与CCDC112的结合KD＜2×10 -8；
更优选的，所述KD＜2×10 -8、＜1×10 -8、＜9×10 -9、＜8×10 -9、＜7×10 -9、＜6×10 -9、＜5×10 -9、＜4×10 -9、＜3×10 -9、＜2×10 -9、＜1×10 -9、＜1×10 -10。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，序列选自如下：
a)所述重链可变区的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NOs：13所组成的组中的氨基酸序列或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性；
b)所述轻链可变区的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NOs：14所组成的组中的氨基酸序列或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。
保守取代是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。示例性的取代如下表所示：
示例的氨基酸取代如下：
原始残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
原始残基 示例性取代 优选的取代
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
在优选的实施方式中，本发明所述的氨基酸变化发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸变化发生在Fc区。在一些实施方式中，提供了包含含有一个或多个突变的Fc结构域的抗CCDC112蛋白抗体，该突变增强或减弱抗体例如与中性pH相比在酸性pH下与FcRn受体的结合。这类Fc修饰的非限制性实例包括，例如：250位(例如E或Q)、250位和428位(例如L或F)、252位(例如L/Y/F/W或T)、254位(例如S或T)和256位(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或428位和/或433位(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434位(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])的修饰；或250位和/或428位的修饰；或307位或308位(例如308F、V308F)和434位的修饰。在一个实施方式中，该修饰包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；及307和/或308修饰(例如308F或308P)。还在另一实施方式中，该修饰包括265A(例如D265A)和/或297A(例如N297A)修饰。
例如，本发明包括含有Fc结构域的抗CCDC112蛋白抗体，该Fc结构域包含选自以下的一对(组)或多对(组)突变：252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。在一个实施方案中，本发明包括含有Fc结构域的抗CCDC112蛋白抗体，该Fc结构域包含IgG4铰链区中的S108P突变以促进二聚体稳定化。前述Fc结构域突变和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变的任意可能的组合都包含在本发明的范围之内。
在另一些实施方式中，本文中所提供的CCDC112蛋白抗体可经改变以增加或降低其糖基化的程度。对CCDC112蛋白抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一个或多个糖基化位点而方便地实现。当CCDC112蛋白抗体包含Fc区时，可以改变与Fc区连接的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等(2002)JBC277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以调节补体依赖性细胞毒性(CDC)。在某些实施方式中，可在本文中所提供冠状病毒S蛋白抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如本发明的冠状病毒S蛋白抗体预防和/或治疗冠状病毒感染的有效性。
在一些实施方式中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体；优选地，其是IgG1或IgG4抗体；更优选地，其是人或鼠IgG1或IgG4抗体。
在一些实施方式中，抗体可进一步包含连接至多肽的偶联部分，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种，其中所述多肽或抗体与所述偶联部分可选择性通过连接子相连，优选所述连接子为肽或多肽。
本领域可以理解，在不改变抗体核心功能区的情况下，所述抗体可制备成或选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体；更优选的，所述抗体可制备成或选自多特异性抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体。
本发明还提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码上述抗体或抗原结合片段。
本发明还提供一种重组载体，其包含上述的多核苷酸，以及任选的调控序列；
优选的，所述重组载体为克隆载体或表达载体；更优选的，所述调控序列选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合。
本发明还提供一种宿主细胞，其特征在于，包含上述的重组载体；优选的，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
本发明还提供一种药物组合物，其特征在于，包含上述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物中的一种或更多种；优选的，所述组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，包含上述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物中的一种或更多种，并容纳于合适的容器中。
本发明的抗体制备方法
可以通过多种技术来生产本发明的抗CCDC112的单克隆抗体(mAb)和人序列抗体，包括常规单克隆抗体方法学，例如Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。可以采用生产单克隆抗体的任何技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。一种用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中生产杂交瘤是已完全建立的方法。用于分离供融合用的经免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。在一些实施方式中，本发明是利用重组CCDC112蛋白多次免疫小鼠获得。
本发明抗体的活性测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的CCDC112蛋白抗体鉴定、筛选或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的CCDC112蛋白抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对CCDC112蛋白的结合，本文中公开了例示性方法。在一些实施方式中，使用生物膜层干涉测定本发明的CCDC112蛋白抗体对CCDC112蛋白的结合，同时进一步通过ELISA实验分析CCDC112与其LILRB2、LILRB4、LTBR、CD30的结合。
5.本发明的药物组合物
在一些实施方式中，本发明提供包含本文所述的任何化合物、CCDC112蛋白抑制剂、拮抗剂、抗体、抗原肽、蛋白等的组合物，优选地组合物为药物组合物。
在一个实施方式中，所述组合物含有本发明的抗体或其抗原结合片段，或免疫偶联物，或双特异性分子，及药学可接受载体。
在一个实施方式中，药物组合物包含本发明的CCDC112蛋白抗体，以及一种或多种其它治疗剂的组合。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物或药物制剂包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第五版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。
可以通过将具有所需纯度的本发明的CCDC112蛋白抗体与一种或多种任选的药用辅料(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的CCDC112蛋白抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它活性成分，包括但不限于CTLA4和PD-1抑制剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
6.本发明的预防或治疗用途
预防或治疗方法
本发明提供了用于预防受试者中CCDC112相关癌症的方法，其包括向受试者施用本发明的抑制剂、抗体或药物组合物。预防剂的施用可以在表现出症状特征之前施用，以便阻止疾病发生，或可选择地延迟疾病的进展。
优选的，所述受试者已经接受或正在接受或将要接受额外的抗癌疗法；
更优选的，所述额外的抗癌疗法包括手术、放疗、化疗、免疫疗法或激素疗法。
本发明提供了用于治疗受试者中CCDC112相关癌症的方法，其包括向受试者施用本发明的抑制剂、抗体或药物组合物。治疗剂的施用可以在表现出症状特征之后施用。
优选的，所述受试者已经接受或正在接受或将要接受额外的抗癌疗法；
更优选的，所述额外的抗癌疗法包括手术、放疗、化疗、免疫疗法或激素疗法。
CCDC112相关癌症包括但不限于各类癌症，比如常见的结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、乳腺癌、和卵巢癌等。
本发明提供的治疗方法也可以是，使受试者的免疫细胞和肿瘤细胞与有效剂量的本发明所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物接触；可选的，在使用有效量的化合物和受试者的免疫细胞和/或肿瘤细胞接触前，检测CCDC112在肿瘤细胞的表达；
优选的，所述免疫细胞为淋巴细胞；
更优选的，所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
预防或治疗用途
可以理解，利用本发明所述的抑制剂、抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物至少可包括如下预防治疗用途或相应药物的制备用途：
a)在激动或拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用中的用途；优选CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
b)在制备用于激动或拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用的产品中的用途；优选CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
c)在预防或治疗肿瘤中的用途；
d)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途；
e)在调节针对肿瘤所引起的免疫反应中的用途；
f)在制备用于调节针对肿瘤所引起的免疫反应的药物中的用途；
g)在体内外抑制肿瘤细胞生长中的用途；
h)在制备用于体内外抑制肿瘤细胞生长的试剂中的用途。
7.本发明的诊断用途
术语“伴随诊断”通常是指提供有关患者针对特定治疗药物的治疗反应的信息，有助于确定能够从某一治疗产品中获益的患者群体，从而改善治疗预后并降低保健开支。此外，伴随诊断还有助于确定最有可能针对治疗药物产生响应的患者群体。
本发明证实了CCDC112蛋白可作为CCDC112相关癌症的治疗靶点，即当肿瘤细胞中表达CCDC112蛋白时，可通过引入CCDC112蛋白抑制剂(比如抗体)有效抑制肿瘤。因此，在相应受试肿瘤患者治疗过程中(包括治疗前和治疗后)，可通过检测肿瘤细胞的CCDC112蛋白表达情况，确定最有可能针对治疗药物产生响应的患者群体。所以本发明提供了一种伴随诊断的方法，该方法通过检测经免疫治疗前/后受试者肿瘤细胞的CCDC112蛋白表达量或功能来完成。
8.本发明的试剂盒
包含本发明的抗体或抗体组合物(例如人抗体、双特异性或多特异性分子、或免疫偶联物) 及使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒还可进一步包含至少一种别的药剂，或一种或多种别的抗体等。试剂盒通常包括标签，其指明试剂盒内容物的预期用途。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或者以其它方式随附于试剂盒的、任何书写的或记录的材料。
此外，基于本发明的诊断用途，本发明的试剂盒还可以是包含能够检测肿瘤细胞CCDC112蛋白表达量或活性的组分。因此，除了上述抗体组合物外，本发明试剂盒组分还可以是包含诸如引物、探针等，或者其他能够检测蛋白表达或活性的材料，在此不作限制。
实施例
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。将参照下述非限制性实验实施例进一步理解本发明。
实施例1：CCDC112抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤
分别选取中等水平表达CCDC112的肿瘤细胞HCT116和MCF7，进行CCDC112的敲除或过表达，并与CD3和CD28激活的PBMC共培养，利用Annexin-V标记的流式细胞术分析CD45-的肿瘤细胞凋亡比率。
CCDC112基因编辑具体分以下步骤进行实施：
1.构建CRISPR/Cas9基因编辑系统，即含有嘌呤霉素抗性的特定切割CCDC112的sgRNA的慢病毒。
实验总体流程：首先合成gRNA序列的单链DNA oligo，然后退火配对产生双链DNA oligo，再通过其两端所含酶切位点将其直接连入酶切后的CRISPR/Cas9载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的CRISPR/Cas9载体。针对目的基因靶基因序列，利用公用网站中提供的gRNA序列设计原则，根据基因序列分别设计并合成gRNA寡聚单链DNA，oligo序列如SEQ ID NO.1-8所示，并设计相应的双链序列；将寡聚单链DNA退火成双链，将双链的gRNA oligo分别插入到CRISPR/Cas9载体中，构建CRISPR/Cas9重组质粒，并转化至感受态细胞Stbl3。载体的构建包括以下具体步骤：
表1R gRNA寡聚单链DNA序列
单链DNA编号 核苷酸序列 序列编号
sgRNAsequence.1 CACTTCTACATATCCCACAT SEQ ID NO.1
sgRNAsequence.2 GGTGGGTTTGTAAAGCCTAG SEQ ID NO.2
sgRNAsequence.3 CTGGTGATCATAATCATCCC SEQ ID NO.3
sgRNAsequence.4 TCCAGGTTGGAATAGCCCTA SEQ ID NO.4
sgRNAsequence.5 AATTCTAGATAGACAGGCAA SEQ ID NO.5
sgRNAsequence.6 TTTACAAACCCACCAAAGGT SEQ ID NO.6
sgRNAsequence.7 TGTTTATTATGAAAAAGCAC SEQ ID NO.7
sgRNAsequence.8 TAAAAAGCAGCAAAAAAGGG SEQ ID NO.8
1)gRNA的退火：用无菌的TE buffer稀释引物使终浓度为100μMol。分别吸取10μl的上下游引物混合并吹打均匀放入PCR管内进行退火，结束后置于冰上放置几分钟可直接连接或于-20℃冷冻保存。
2)CRISPR/Cas9载体的酶切及回收：酶切体系如下：CRISPR/Cas9vector 5μg；10*Buffer5μl；BsmBI4μl；ddH2O补足50μl。于37℃酶切约30min。在此期间，可配置0.8％的琼脂糖凝胶，待酶切结束后进行核酸电泳。电泳结束后切下包含目的片段的胶条。用天平称量总重量并减去空管的重量算出凝胶的重量，按100mg约为100μl来计算凝胶的体积，并加入3倍胶体积的QG buffer置于50℃水浴内将凝胶彻底融化，期间适当摇晃EP管，加快凝胶的溶解。等凝胶彻底融化后，加入与凝胶等体积的异丙醇并混合均匀。将上述液体全部转移到滤柱内，13000rpm离心30s。弃掉管内液体，向柱子内加入750μl的PE buffer，离心1min。弃掉管 内液体，再次空离1min。换一个新的1.5ml的EP管，向柱子内加入50μl的EB buffer，离心1min，离心管中即为回收的载体。
3)CRISPR/Cas9载体与引物的连接。连接体系如下：回收载体3μl(50ng)；Oligo引物1μl(0.5μM)；T4DNA ligase buffer1.5μl；T4DNA连接酶1μl；ddH2O补足15μl。于25℃水浴中孵育30min。
4)转化：将感受态细胞置于冰上待其自然解冻后，把连接产物全部加入感受态细胞中，于冰上放置20min，后于42℃水浴中热击90S。然后迅速置于冰上放置2-3min。加入1000μl不含抗生素的LB培养基于37℃，150rpm振荡培养45min。3000rpm离心2min，弃掉约850μl的上清液，将管底的菌液吹打散开，加入到含有相应抗性的培养皿中，用灭菌的涂布器涂匀，倒置于37℃恒温培养箱内过夜培养。
5)重组质粒的制备：挑取若干个单菌落，进行小量摇菌培养。
6)测序鉴定阳性克隆，经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致，因此载体构建成功。
2.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑并构建HCT116-CCDC112敲除细胞系。
将HCT116和MCF7细胞(ATCC，VA，美国)以合适的密度(第二日生长至密度约30-40％左右)铺置于24孔板(康宁，NY，美国)中，次日消化计数，先以GFP对照慢病毒(吉满，上海，中国)数量梯度以感染细胞，48小时后换液，72小时后镜下观察GFP荧光以确定最佳病毒细胞感染比，以探索MOI值。确定MOI值后，重新铺板，以含有杀稻瘟菌素抗性的Cas9系统慢病毒(吉满，上海，中国)以MOI值感染HCT116细胞，48小时后换液，72小时后加入浓度梯度的杀稻瘟菌素(Invivogen，CA，美国)以筛选10-14天，最终筛选所得的细胞系即含有Cas9系统的HCT116细胞。再将含有Cas9系统的HCT116细胞于24孔板中铺板计数，以含有嘌呤霉素抗性的特定切割CCDC112的sgRNA的慢病毒以MOI值进行感染，48小时后换液，72小时后进入浓度梯度的嘌呤霉素(Invivogen，CA，美国)进行筛选10-14天，即得HCT116-CCDC112敲除细胞系。
3.CCDC112基因的过表达：将编码CCDC112全长蛋白的核苷酸序列(见实施例3末尾：如SEQ ID NO.9所示)两端连接BamHI和KpnI克隆位点，对cDNA序列进行全体外合成，并以BamHI和KpnI酶切后插入pcDNA3.1载体，挑选连接成功的克隆并进行测序验证。对HCT116和MCF7细胞分别进行转染，并以G418进行稳定细胞的筛选，从而的到HCT116-CCDC112和MCF7-CCDC112稳定过表达细胞株。
CCDC112核苷酸序列(SEQ ID NO.9)：
4.流式细胞术证明敲降肿瘤细胞表达的CCDC112可显著增加人外周血单核细胞对肿瘤细胞的杀伤。
将CD3与CD28抗体(Invitrogen，CA，美国)与PBMC(ATCC，VA，美国)混合稀释使得其终浓度为1微克每毫升以激活T细胞，培养过夜。次日将PBMC与上述HCT116或MCF7细胞(含敲除或过表达CCDC112的细胞株)计数，分别调整细胞数为1x10 6每毫升，各加入100微升至96孔板(赛默飞，MA，美国)中，置于培养箱中孵育6小时。取出96孔板，将各孔细胞置于EP管(Axygen，CA,美国)中，400rcf离心5分钟后弃去上清。用500微升细胞染色缓冲液(Invitrogen，CA，美国)重悬洗涤细胞，重复离心与洗涤。用细胞染色缓冲液按1:20稀释CD45-APC抗体(Invitrogen，CA，美国)，各EP管加入200微升混合液重悬，室温慢摇孵育30分钟。400rcf离心5分钟后弃去上清，用1毫升binding buffer(美仑，上海，中国)重悬清洗细胞；重复离心与洗涤。设置各种实验和对照组，依据条件分别加入100微升binding buffer，5微升Annexin V-FITC(美仑，上海，中国)与10微升PI(美仑，上海，中国)，室温慢摇孵育15分钟，再各自加入400微升binding buffer，转移至流式管(Falcon，NY，美国)中上机(美天旎，科隆，德国)。
结果表明CCDC112过表达抑制了PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用，而敲除CCDC112基因增加了PBMC对肿瘤的杀伤，结果如图1所示。
实施例2：CCDC112增加髓系来源的抑制性细胞(MDSC)以及调节性T细胞(Treg)
为了阐明CCDC112对Treg/MDSC的影响，首先进行细胞的准备：1.5+10E 5每孔的PBMC，进行不同的实验分组，培养24h(用于检测Treg比例)或3天(用于检测MDSC比例)。通过流式细胞术分析表型CD4+CD25+Foxp3+、HLA-DR-CD11b+CD33+比例、计数。
分析结果表明，相对于普通的HCT116细胞，表达CCDC112的HCT116细胞与人外周血单核细胞共培养，增加了MDSC细胞(HLA-DR-CD11b+CD33+)和Treg(CD4+CD25+Foxp3+)的比率，而敲除CCDC112基因的肿瘤细胞降低了MDSC和Treg细胞的比率，结果如图2所示。
实施例3：CCDC112与受体的结合
利用ELISA实验分析CCDC112与其LILRB2、LILRB4、LTBR、CD30的结合与结合强度。
具体地，使用ELISA专用板(costar，ME，美国)。首先用不同浓度的CCDC112重组蛋白各溶于100微升ELISA包被液(Solarbio，北京，中国)包板，阴性对照采用不含蛋白的100微升包被液包板。四度包被过夜。PBST清洗后用100微升5％溶于PBS的BSA(VWR，PA，美国)进行封闭，温箱37度封闭90分钟。PBST清洗后，再以用1微克每毫升的受体蛋白(LILRB2,LILRB4,LTBR,CD30)胞外区蛋白质片段(百普赛斯或义翘神州，北京，中国)PBS溶液中进行孵育结合(LTBR和CD30加入调节为不同pH值的PBS以摸索更优的结合条件)，上述受体蛋白带有hFc标签(P-Fc)，温箱37度结合60分钟。PBST清洗后，用PBS稀释的特异性抗人Fc段抗体(Abcam，MA，美国)进行孵育结合，温箱37度结合30分钟。PBST清洗后，用显色液(生工，上海，中国)进行显色，每孔100微升，置于温箱反应5-30分钟，再予以50微升终止液(生工，上海，中国)，置于酶标仪(赛默飞，MA，美国)下450nm显色读数。
结果表明：CCDC112能够结合LILRB2、LILRB4、LTBR、CD30，证明LILRB2、LILRB4、LTBR、CD30均为CCDC112的结合受体。其中，CCDC112结合LILRB2和LILRB4的浓度 梯度效应如图3所示；在不同的pH值下CCDC112结合LTBR的浓度梯度效应如图4所示；在不同的pH值下CCDC112结合CD30的浓度梯度效应如图5所示。
实施例4：CCDC112在不同肿瘤细胞中表达水平的检测。
将不同的肿瘤细胞系，包括RL淋巴瘤细胞、A375黑色素瘤、RAJI淋巴瘤，MCF7乳腺癌、A549肺癌、HCT116、LOVO、SW1116、SW48结直肠癌细胞进行分析。具体地，将培养的上述细胞计数，取4x10 6个细胞至15ml离心管(康宁，NY，美国)，800rpmx4分钟离心后弃去上清，含10％小牛血清的RPMI1640培养基(美仑，大连，中国)重悬，各取1毫升于12孔板(康宁，NY，美国)各孔中，充分混匀后置于培养箱中培养10min后取出，将细胞转移至1.5ml的EP管(Axygen，CA,美国)中，800rpmx4分钟离心，PBS重悬清洗并离心，重复清洗。离心完成后弃去上清，按1:100配置RIPA裂解液(碧云天，上海，中国)与蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF三联(康臣，上海，中国)，每管细胞加入80微升混合裂解液。各EP管于液氮-冰上进行三冻三融，最后一次融化后12000rpm 4摄氏度条件下离心15分钟。离心完成后取上清，离心后上清:5x上样缓冲液(碧云天，上海，中国)按4:1配置成各细胞样品，置于100摄氏度金属浴中10分钟变性以制得蛋白样品。再按照说明书于胶板(伯乐，CA，美国)中配置10％PAGE凝胶(雅酶，上海，中国)，将配置好的胶置于电泳槽(伯乐，CA，美国)中，接好电源(伯乐，CA，美国)以80伏恒压的条件让条带跑完浓缩胶，以120伏恒压的条件跑完分离胶。待条带跑至分离胶底部时，运用湿法转膜，转膜槽(伯乐，CA，美国)350毫安恒流90分钟转膜。待转膜完成后，以CCDC112与GAPDH蛋白的质量大小进行剪膜处理。用快速封闭液(雅酶，上海，中国)封闭十分钟，用CCDC112抗体(制备过程如下实施例所述)、GAPDH抗体(康臣，上海，中国)分别孵育相应条带，四度过夜。次日经TBST清洗后，用5％溶于TBS的脱脂奶粉(生工，上海，中国)稀释的特异性抗兔二抗(康臣，上海，中国)室温孵育一小时，经TBST清洗后，置于混合发光液(圣尔，上海，中国)中一分钟，于凝胶成像仪(伯乐，CA，美国)下曝光。
结果如图6所示，RL淋巴瘤细胞不表达CCDC112(阴性)；A375黑色素瘤、RAJI淋巴瘤表达CCDC112单水平略低；MCF7乳腺癌、A549肺癌、HCT116、LOVO、SW1116结直肠癌阳性表达；SW48结直肠癌强阳性表达。
实施例5：CCDC112单克隆抗体的制备
将CCDC112蛋白用酵母进行表达和纯化，经过检测达到92％纯度，并利用ELISA实验验证了CCDC112蛋白质具备结合受体LILRB2、LILRB4、LTBR和CD30的活性。利用CCDC112蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)免疫10只小鼠，进行多次免疫以增强效果：(1)初次免疫，抗原50μg/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，间隔3周；(2)第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周；(3)第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射间隔3周；(4)加强免疫，剂量50μg，腹腔注射。最后一次注射3天后采血测其效价，检测免疫效果，分别选择效价较高的小鼠进行杂交瘤融合筛选。亚克隆后通过ELISA检测单克隆抗体与目标抗原的结合，并通过ELISA实验检测不同的单克隆抗体阻断CCDC112与受体结合的功能。
CCDC112蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.10)：
实施例6：筛选与抗原特异性结合的CCDC112单克隆抗体。
为筛选与抗原特异性结合的CCDC112单克隆抗体，利用ELISA检测CCDC112抗体结合CCDC112全长蛋白与CCDC112(73-227)片段的浓度依赖作用，后者用于分析该抗体与CCDC112结合的部位即表位。
如图7所示，随着CCDC112抗体浓度的升高，在CCDC112全长蛋白包板的条件下ELISA检测的结果数值随之显著升高，而CCDC112(73-227)片段保持低水平。该实验表明抗体特异性结合了CCDC112除(73-227)片段以外的部分。
进一步地，通过流式细胞术验证CCDC112抗体对抗原的特异性结合。通过脂质体稳定转染构建过表达CCDC112的HCT116细胞株，并将细胞与CCDC112抗体共同孵育，洗去未结合抗体后再以抗鼠二抗(FITC修饰)进行流式细胞术检测，分析染色为阳性的细胞百分比。
结果如图8所示，流式细胞术表明抗体结合HCT116而非敲除CCDC112的HCT116肿瘤细胞。
实施例7：筛选能够抑制CCDC112与受体结合的CCDC112单克隆抗体
为了筛选鉴定能够阻断CCDC112功能的抗体，利用ELISA实验分析了抗体对于CCDC112与其受体结合的影响。具体地，将CCDC112重组蛋白包被在ELISA板上，并加入不同浓度的抗体(0，1.1，3.3，10.0微克每毫升)，进一步加入LILRB2-hFc或LTBR-hFc受体(含人类抗体Fc段)，再以抗人二抗偶联辣根过氧化物酶，最后以底物显色，检测450nm的吸收值以表明CCDC112与受体的结合程度。
如图9所示，抗体对CCDC112与其受体LILRB2/LTBR的结合显示出抑制作用，且抑制的程度与抗体浓度相关，浓度愈高抑制程度越显著。
进一步地，为了检测抗体对肿瘤细胞表面的CCDC112与其受体(LILRB2、LTBR)结合的影响，将稳定过表达CCDC112的HCT116细胞与LILRB2-hFc结合，再与不同浓度的CCDC112抗体或对照鼠IgG抗体孵育，最后以FITC偶联的抗人二抗进行检测。流式细胞术表明CCDC112抗体抑制了肿瘤细胞对CCDC112受体(LILRB2)的结合，如图10所示。且CCDC112抗体抑制了肿瘤细胞对CCDC112受体(LTBR)的结合，如图11所示。
对筛选到的单克隆抗体进行单抗分子高变区的常规基因测序，得到的轻链与重链可变区的核苷酸序列以及相应编码的氨基酸序列，克隆S-78-02核苷酸序列如表1所示，氨基酸序列如表2所示，利用线上软件对单克隆抗体的CDR分析定义CDR区氨基酸序列如表3所示。
表1，单克隆抗体的高变区的核苷酸序列
表2单克隆抗体的VH与VL氨基酸序列
表3单克隆抗体S-78-02的CDR氨基酸序列
实施例8:生物膜干涉测定法测定单克隆抗体与抗原的结合动力学
采用生物膜干涉测定法(ProbeLife Gator仪器)使用常规程序测定本发明抗体结合人CCDC112的平衡解离常数(KD)。在CM5芯片上固定200nM抗体，从15nM倍比稀释到1.875nM的抗原进行结合与解离测试。经过软件分析，测得的亲和力常数为4.68*10 -10M。S-78-02单克隆抗体与CCDC112的亲和解离曲线如图12所示。
实施例9：CCDC112单克隆抗体对肿瘤细胞的体外抑制作用
为了鉴定所述的CCDC112抗体(S-78-02)对表达CCDC112的肿瘤细胞的的抑制作用，进行了下述的体外实验：分别选取不同的肿瘤细胞(RL淋巴瘤细胞、A375黑色素瘤、RAJI淋巴瘤，MCF7乳腺癌、A549肺癌、HCT116、LOVO、SW1116、SW48结直肠癌细胞)，先与CCDC112抗体或对照鼠IgG孵育，再与预先经过CD3和CD28激活的PBMC共培养12小时，利用Annexin-V标记的流式细胞数分析CD45-的肿瘤细胞凋亡比率。
结果如图13所示，抗体对PBMC杀伤肿瘤细胞具有不同程度的促进作用，且表达CCDC112水平越高的细胞，这种促进作用越强，如图13所示。进一步地，通过巨噬细胞吞 噬实验分析抗体的作用。将THP1诱导产生的巨噬细胞(APC标记)与HCT116细胞(绿色荧光标记)共培养，并在12小时候通过流式细胞术分析吞噬的程度。结果如图14所示，CCDC112抗体增加了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。
上述结果表明，CCDC112的表达是施用CCDC112抗体用于抑制肿瘤细胞的重要选择性指标，且CCDC112抗体是通过特异性抑制CCDC112的功能而发挥作用。
实施例10：CCDC112单克隆抗体对肿瘤细胞在体内的抑制作用
为了鉴定所述的CCDC112抗体对表达CCDC112的肿瘤细胞的的抑制作用，进行了不同的体内实验，如下所述：
将30只6-8周龄雄性NPSG小鼠模型称重。将表达不同水平CCDC112的肿瘤细胞包括HCT116细胞(中等表达)、SW48(强表达)、A549肺癌(中低表达)、MCF7(中等表达)、RL细胞(阴性)分别进行体外培养，获得1.8×10 8细胞。30只小鼠接种PBMC后,第3天接种肿瘤细胞，其后每周一次测定小鼠血液中hCD45+细胞比例及体重。接种后，每周1次测量肿瘤体积，当平均肿瘤体积达到约40-80mm 3时测量小鼠血液中hCD45+细胞比例。依据肿瘤体积和小鼠血液中hCD45+细胞比例，小鼠随机分组，随即开始给药。给药开始日期视为第0天。给药方案：CCDC112抗体腹腔注射5mg/kg每周三次。给药开始后，小鼠每周观测瘤体生长状况，瘤体生长后，每周3次测量体重和瘤体积，每周3次流式监控小鼠血液中hCD45+细胞相对计数。当肿瘤体积达到终点标准后，取血检测同上指标，结束实验。对小鼠的观察包括：日常观察，接种后，每工作日观察动物发病及死亡情况。肿瘤体积测量：接种后至分组前，当肿瘤可见时，每周一次测量实验动物肿瘤体积，接种分组后，实验中的动物肿瘤体积每周测量2次。肿瘤体积测量采用双向测量法，首先利用游标卡尺测量肿瘤长短径，再使用公式TV＝0.5*a*b2计算肿瘤体积。其中a是肿瘤的长径，b是肿瘤的短径。结果显示：
对于高表达CCDC112的SW48结直肠癌细胞，CCDC112抗体对小鼠体内的肿瘤产生了显著的抑制作用，且在所有分组中效果最强(图15)。对于中等表达CCDC112的HCT116、A549、MCF7肿瘤细胞，CCDC112抗体对小鼠体内的肿瘤产生了显著的抑制作用(图16-18)。对于未检测到CCDC112的RL淋巴瘤细胞，CCDC112抗体对小鼠体内的肿瘤没有明显的抑制作用(图19)。
上述结果表明，CCDC112表达的分析对于CCDC112抗体的施用具有重要的意义，表达CCDC112的肿瘤细胞对CCDC112抗体的反应更显著。
前述对本发明的具体示例性实施方式的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方式以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (27)

  1. 一种在体外或体内调控肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
    a)对表达CCDC112的肿瘤细胞，改变CCDC112功能或活性；
    优选的，所述调控为抑制，所述改变为抑制。
  2. 权利要求1所述的在体外和体内抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
    b)使肿瘤细胞与免疫细胞接触；
    所述步骤b)可以在步骤a)之前或之后。
  3. 权利要求1-2任一所述的在体外和体内抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述抑制CCDC112的功能或活性是在蛋白或基因层面的抑制；
    优选的，包括但不限于如下任一一种抑制方式：
    i.对CCDC112基因进行编辑；
    ii.干扰CCDC112基因表达；
    iii.通过抗体抑制CCDC112蛋白的功能或活性。
  4. 权利要求1-3任一所述的在体外和体内抑制肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述抑制CCDC112的功能或活性，导致抑制或阻断CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30的结合作用。
  5. 一种在体外或体内调控MDSC或Treg细胞比率的方法，其特征在于，包括改变肿瘤细胞中CCDC112功能或活性的步骤。
  6. 一种在体外或体内调控细胞中LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30活性的方法，其特征在于，包括改变肿瘤细胞中CCDC112功能或活性的步骤。
  7. 一种筛选用于预防或治疗肿瘤的药物或试剂的方法，其特征在于，通过筛选抑制CCDC112和受体LILRB2、LILRB4、LTBR或CD30相互作用的抑制剂或抗体，获得候选药物或试剂。
  8. 一种筛选或鉴定抑制剂方法，其特征在于，包括以下任一或多个步骤：
    a)分析候选分子对CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30的结合的影响；
    b)分析候选分子对髓系来源的抑制性细胞(MDSC)的影响；
    c)分析候选分子对调节性T细胞(Treg)的影响；
    d)分析候选分子对免疫细胞杀伤肿瘤细胞的影响；
    所述候选分子为CCDC112抑制性分子，
    优选的，所述CCDC112抑制剂为抗体或抗原结合片段。
  9. 一种抗体制备方法，其特征在于，
    a)制备针对CCDC112抗体的步骤，以及：
    b)筛选出阻断或抑制CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30的结合作用。
  10. 一种激动或拮抗化合物，其特征在于，所述化合物能够调节CCDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR或CD30相互作用；优选的，所述化合物为小分子抑制剂、多肽、抗体或抗原结合片段。
  11. CCDC112抑制剂的如下任一用途：
    a)在拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用中的用途；优选的，CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
    b)在制备用于拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用的产品中的用途；优选的，CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
    c)在预防或治疗肿瘤中的用途；
    d)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途；
    e)在调节针对肿瘤所引起的免疫反应中的用途；
    f)在制备用于调节针对肿瘤所引起的免疫反应的药物中的用途；
    g)在体内外抑制肿瘤细胞生长中的用途；
    h)在制备用于体内外抑制肿瘤细胞生长的试剂中的用途。
    所述抑制剂能够抑制或阻断CCDC112与其受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30的结合；优选的，所述抑制剂为小分子抑制剂、多肽、抗体或抗原结合片段。
  12. 一种预防或治疗肿瘤的方法，其包括：
    使受试者的免疫细胞或肿瘤细胞与有效剂量的CCDC112抗体接触；所述抗体能够抑制CCDC112与受体LILRB2，LTBR，LILRB4，或CD30结合；
    优选的，所述受试者已经接受或正在接受或将要接受额外的抗癌疗法；
    更优选的，所述额外的抗癌疗法包括手术、放疗、化疗、免疫疗法或激素疗法。
  13. 一种肿瘤免疫治疗伴随诊断方法，其包括：
    检测经免疫治疗前/后受试者肿瘤细胞的CCDC112蛋白表达量或功能。
  14. 一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
    a)所述抗体或其抗原结合片段以高亲和力特异性结合CCDC112蛋白；且
    b)所述抗体能够抑制或阻断CCDC112与LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30中任一之间的相互作用。
    优选的，所述抗体还包含至少一项下列性质：
    i.所述抗体降低免疫抑制性细胞MDSC细胞比率；
    ii.所述抗体降低免疫抑制性细胞Treg的细胞比率；或
    iii.所述抗体增强免疫细胞(如PBMC)对肿瘤细胞的杀伤作用。
  15. 一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包含SEQ ID NO:13所示的重链可变区氨基酸序列中的3个CDR和SEQ ID NO:14所示的轻链可变区氨基酸序列中的3个CDR；
    或者与上述6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体；
    优选的，所述抗体或抗原结合片段包含如下CDR序列：
    i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15、21、26、38、30任一所示；
    ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16、22、27、29、31任一所示；
    iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17、23、32任一所示；
    iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18、24、33任一所示；
    v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19、25、34任一所示；
    vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20、35任一所示；
    或者，与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体；
    更优选的，所述抗体或抗原结合片段包含根据IMGT定义的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区；以及包含根据IMGT定义的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区，序列如下：
    i.所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
    ii.所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
    iii.所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
    iv.所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；
    v.所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
    vi.所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
    或者与上述i-vi的6个CDR区具有单个或者多个CDR不超过每个CDR区2个氨基酸变化的变体；
    进一步优选的，所述抗体或其抗原结合片段与CCDC112的结合KD<2×10 -8；
    更进一步优选的，所述KD<2×10 -8、<1×10 -8、<9×10 -9、<8×10 -9、<7×10 -9、<6×10 -9、<5×10 -9、 <4×10 -9、<3×10 -9、<2×10 -9、<1×10 -9、<1×10 -10。
  16. 权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，序列选自如下：
    a)所述重链可变区的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NOs﹕13所组成的组中的氨基酸序列或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性；
    b)所述轻链可变区的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NOs﹕14所组成的组中的氨基酸序列或与组中的序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。
  17. 权利要求16所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体可进一步包含连接至多肽的偶联部分，所述偶联部分选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种，其中所述多肽或抗体与所述偶联部分可选择性通过连接子相连，优选所述连接子为肽或多肽；
    更优选的，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗血清、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体；更优选的，所述抗体选自多特异性抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、双抗体、微型抗体、纳米抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)和胞内抗体。
  18. 一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求14-17任一所述的抗体或抗原结合片段。
  19. 一种重组载体，其包含权利要求18所述的多核苷酸，以及任选的调控序列；
    优选的，所述重组载体为克隆载体或表达载体；
    更优选的，所述调控序列选自前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列、转录终止子，或其任何组合。
  20. 一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求19所述的重组载体；
    优选的，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
  21. 一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求14-20任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物中的一种或更多种；
    优选的，所述组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
  22. 一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求14-21任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物中的一种或更多种，并容纳于合适的容器中。
  23. 权利要求14-21任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物的如下任一应用：
    a)在激动或拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用中的用途；优选CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
    b)在制备用于激动或拮抗CDC112和LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30相互作用的产品中的用途；优选CCDC112表达于肿瘤细胞，LILRB2、LILRB4、LTBR以及CD30表达于免疫细胞；
    c)在预防或治疗肿瘤中的用途；
    d)在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途；
    e)在调节针对肿瘤所引起的免疫反应中的用途；
    f)在制备用于调节针对肿瘤所引起的免疫反应的药物中的用途；
    g)在体内外抑制肿瘤细胞生长中的用途；
    h)在制备用于体内外抑制肿瘤细胞生长的试剂中的用途。
  24. 一种预防或治疗肿瘤的方法，其特征在于，包括：
    使受试者的免疫细胞和肿瘤细胞与有效剂量的权利要求14-21任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物组合物接触；
    优选的，在使用有效量的化合物和受试者的免疫细胞和/或肿瘤细胞接触前，检测CCDC112在肿瘤细胞的表达；
    优选的，所述免疫细胞为淋巴细胞，更优选的，为T淋巴细胞；
    更优选的，所述受试者已经接受或正在接受或将要接受额外的抗癌疗法。
    更更优选的，所述额外的抗癌疗法包括手术、放疗、化疗、免疫疗法或激素疗法。
  25. 一种体内外检测生物样本中CCDC112存在与否的方法，其特征在于，使生物样本与权利要求14-21任一所述的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、重组载体、宿主细胞和药物化合物接触。
  26. 一种抑制肿瘤细胞生长的方法，包括以下步骤：
    A)分析CCDC112在肿瘤细胞的表达；
    B)利用可以识别CCDC112的抗体与肿瘤细胞接触；
    优选的，所述的抗体与CCDC112的结合KD<2×10 -8；具体的，所述KD<2×10 -8、<1×10 -8、<9×10 -9、<8×10 -9、<7×10 -9、<6×10 -9、<5×10 -9、<4×10 -9、<3×10 -9、<2×10 -9、<1×10 -9、<1×10 -10；或，优选的，所述抗体抑制或阻断CCDC112与受体LILRB2、LTBR、LILRB4或CD30的结合作用；
    C)使T淋巴细胞、所述抗体和肿瘤细胞相接触。
  27. 前述任一权利要求，其特征在于，所述肿瘤选自结直肠癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、头颈癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫内膜癌、乳腺癌、和卵巢癌。
CN202280013892.1A 2021-02-08 2022-01-26 基于ccdc112抑制肿瘤细胞生长的方法 Pending CN116848143A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110172875X 2021-02-08
CN202110172875 2021-02-08
PCT/CN2022/073951 WO2022166700A1 (zh) 2021-02-08 2022-01-26 基于ccdc112抑制肿瘤细胞生长的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116848143A true CN116848143A (zh) 2023-10-03

Family

ID=82740889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280013892.1A Pending CN116848143A (zh) 2021-02-08 2022-01-26 基于ccdc112抑制肿瘤细胞生长的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240101663A1 (zh)
EP (1) EP4289864A1 (zh)
JP (1) JP2024508673A (zh)
KR (1) KR20230142768A (zh)
CN (1) CN116848143A (zh)
AU (1) AU2022216578A1 (zh)
CA (1) CA3207787A1 (zh)
WO (1) WO2022166700A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
WO2018223093A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Universal cancer vaccines and methods of making and using same
JPWO2020116536A1 (ja) * 2018-12-05 2021-10-21 日東電工株式会社 がんを処置するための組合せ

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022216578A1 (en) 2023-09-28
CA3207787A1 (en) 2022-08-11
JP2024508673A (ja) 2024-02-28
US20240101663A1 (en) 2024-03-28
WO2022166700A1 (zh) 2022-08-11
EP4289864A1 (en) 2023-12-13
KR20230142768A (ko) 2023-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11680100B2 (en) B7-H3 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
US20200157180A1 (en) FUSION PROTEIN CONTAINING TGF-ß RECEPTOR AND MEDICINAL USES THEREOF
CA2932966C (en) Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
WO2017071625A1 (zh) 一种抗pd-1单克隆抗体、其药物组合物及其用途
JP2021526816A (ja) Ｄｌｌ３−ｃｄ３二重特異性抗体
CN113248618B (zh) 抗pd-l1/抗lag3双特异性抗体及其用途
CN110678484B (zh) 抗pd-l1/抗lag3双特异性抗体及其用途
CN114751983A (zh) Her3抗原结合分子
KR20220154140A (ko) Pvrig 결합 단백질 및 이의 의학적 용도
WO2020114479A1 (zh) 多特异性蛋白分子
CN116178547A (zh) Cd3抗原结合片段及其应用
US20220242953A1 (en) Cd3 antibody and pharmaceutical use thereof
WO2021098822A1 (zh) 一种双特异性抗体
WO2021013142A1 (zh) 抗4-1bb抗体、其抗原结合片段及双特异性抗体
WO2021249542A1 (en) Antibodies binding tnfr2 and uses thereof
KR20230104256A (ko) 증가된 선택성의 다중표적화 이중특이적 항원 결합 분자
WO2022166700A1 (zh) 基于ccdc112抑制肿瘤细胞生长的方法
WO2022193993A1 (zh) 精液凝固蛋白的中和抗体及其表位和应用
CN114773467B (zh) 抗SIRPα抗体或其抗原结合片段及应用
WO2023134766A1 (zh) 靶向cd25的抗体及其制备方法和应用
AU2021206586A1 (en) Epithelial cadherin-specific antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination