JP2021526816A - Dll3−cd3二重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
DLL3の発現は、神経内分泌腫瘍、たとえば、大細胞神経内分泌癌(LCNEC)、小細胞肺がん(SCLC)、小細胞膀胱がん、神経内分泌性前立腺がん、神経内分泌性膵臓がん、および神経膠芽腫において、説明されている(Saunders et al., Sci Transl Med. 2015 Aug 26;7(302):302ra136、Saunders et al., AACR 2017)。
標的化療法の1つのアプローチは、抗体薬物コンジュゲート(ADC)によって提供される。しかしながら、DLL3については、DLL3の細胞表面発現が低いことおよび化学療法に対する高い耐性率に起因して、この戦略は好ましくない。患者の大半が化学療法処置の後に再発するため、および細胞表面におけるDLL3の発現が低いことに起因して、ADCによるDLL3の標的化は、制限を有し得る。加えて、ADCのアプローチは、リンカーの不安定性または分解の結果として、遊離薬物によって引き起こされる標的外毒性を有することが多い。
i)配列番号1(CDR1)、配列番号2(CDR2)、および配列番号3(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号4(CDR1)、配列番号5(CDR2)、および配列番号6(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
ii)配列番号7(CDR1)、配列番号8(CDR2)、および配列番号9(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号10(CDR1)、配列番号11(CDR2)、および配列番号12(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
iii)配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号16(CDR1)、配列番号17(CDR2)、および配列番号18(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
iv)配列番号19(CDR1)、配列番号20(CDR2)、および配列番号21(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号22(CDR1)、配列番号23(CDR2)、および配列番号24(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
v)配列番号25(CDR1)、配列番号26(CDR2)、および配列番号27(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号28(CDR1)、配列番号29(CDR2)、および配列番号30(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
vi)配列番号31(CDR1)、配列番号32(CDR2)、および配列番号33(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号34(CDR1)、配列番号35(CDR2)、および配列番号36(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
vii)配列番号133(CDR1)、配列番号134(CDR2)、および配列番号135(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号136(CDR1)、配列番号137(CDR2)、および配列番号138(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
viii)配列番号139(CDR1)、配列番号140(CDR2)、および配列番号141(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号142(CDR1)、配列番号143(CDR2)、および配列番号144(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
ix)配列番号145(CDR1)、配列番号146(CDR2)、および配列番号147(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号148(CDR1)、配列番号149(CDR2)、および配列番号150(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
x)配列番号151(CDR1)、配列番号152(CDR2)、および配列番号153(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号154(CDR1)、配列番号155(CDR2)、および配列番号156(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xi)配列番号157(CDR1)、配列番号158(CDR2)、および配列番号159(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号160(CDR1)、配列番号161(CDR2)、および配列番号162(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xii)配列番号163(CDR1)、配列番号164(CDR2)、および配列番号165(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号166(CDR1)、配列番号167(CDR2)、および配列番号168(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xiii)配列番号169(CDR1)、配列番号170(CDR2)、および配列番号171(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号172(CDR1)、配列番号173(CDR2)、および配列番号174(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xiv)配列番号175(CDR1)、配列番号176(CDR2)、および配列番号177(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号178(CDR1)、配列番号179(CDR2)、および配列番号180(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xv)配列番号181(CDR1)、配列番号182(CDR2)、および配列番号183(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号184(CDR1)、配列番号185(CDR2)、および配列番号186(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xvi)配列番号187(CDR1)、配列番号188(CDR2)、および配列番号189(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号190(CDR1)、配列番号191(CDR2)、および配列番号192(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xvii)配列番号193(CDR1)、配列番号194(CDR2)、および配列番号195(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号196(CDR1)、配列番号197(CDR2)、および配列番号198(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、ならびに
xviii)配列番号199(CDR1)、配列番号200(CDR2)、および配列番号201(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号202(CDR1)、配列番号203(CDR2)、および配列番号204(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、多重特異性結合タンパク質を提供する。
i)配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ii)配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
iii)配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
iv)配列番号43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
v)配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
vi)配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
vii)配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
viii)配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ix)配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
x)配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xi)配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号214のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xii)配列番号215のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号216のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xiii)配列番号217のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号218のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xiv)配列番号219のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号220のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xv)配列番号221のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号222のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xvi)配列番号223のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号224のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xvii)配列番号225のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号226のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、ならびに
xviii)配列番号227のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号228のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される。
i)配列番号55(CDR1)、配列番号56(CDR2)、および配列番号57(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号58(CDR1)、配列番号59(CDR2)、および配列番号60(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
ii)配列番号61(CDR1)、配列番号62(CDR2)、および配列番号63(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号64(CDR1)、配列番号65(CDR2)、および配列番号66(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、ならびに
iii)配列番号96(CDR1)、配列番号97(CDR2)、および配列番号98(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号99(CDR1)、配列番号100(CDR2)、および配列番号101(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される。
i)配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号68のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ii)配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号70のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、ならびに
iii)配列番号102のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される。
一部の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、第1および第2のFcドメインをさらに含み、前記第1のFcドメインは、前記第1の抗原結合ユニットに共有結合により連結されており、前記第2のFcドメインは、前記第2の抗原結合ユニットに共有結合により連結されている。
i)第1のFcドメインが、366位にチロシン(Y)[T366Y]を含み、第2のFcドメインが、407位にスレオニン(T)[Y407T]を含むか、または
ii)第1のFcドメインが、366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、第2のFcドメインが、366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、および407位にバリン(V)[Y407V]を含むか、または
iii)第2のFcドメインが、366位にチロシン(Y)[T366Y]を含み、第1のFcドメインが、407位にスレオニン(T)[Y407T]を含むか、または
iv)第2のFcドメインが、366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、第1のFcドメインが、366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、および407位にバリン(V)[Y407V]を含み、
好ましくは、第1または第2のFcドメインが、435位にアルギニン[H435R]および436位にフェニルアラニン[Y436F]をさらに含む。一部の実施形態において、第1および/または第2のFcドメインは、234位にアラニン[L234A]および235位にアラニン[L235A]をさらに含む。一部の実施形態において、第1の軽鎖定常ドメインおよび第2の軽鎖定常ドメインは、ヒトカッパまたはラムダドメインを含む。
さらなる態様において、本発明は、i)本発明のタンパク質の第1の抗原結合ユニットおよび/もしくは第2の抗原結合ユニットをコードし、第1および/もしくは第2のFcドメインをさらにコードしてもよい、単離された核酸分子、またはii)本発明のタンパク質の第1および/もしくは第2のポリペプチド鎖をコードする、単離された核酸分子を提供する。さらなる態様において、本発明の核酸分子を含む発現ベクター、そのような発現ベクターがトランスフェクトされた宿主細胞、および本発明のタンパク質を製造する方法が、本明細書において提供される。
本発明の結合タンパク質に関与するさらなる態様、実施形態、使用、および方法は、以下の本発明の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から、明らかとなろう。
本発明は、DLL3を発現するがん、たとえば、SCLC、神経膠芽腫、またはDLL3を発現する神経内分泌腫瘍のより効率的な処置を可能にする、新規な結合タンパク質を提供する。
本発明の上記およびその他の態様および実施形態は、本明細書のさらなる説明から、明らかになろう。
本明細書において使用される場合、「含む(comprising)」という用語およびその変化形、たとえば、「含む(comprises)」および「含む(comprise)」は、「含む(containing)」または「含む(including)」または「有する(having)」で置き換えることができる。
本明細書において使用される「抗原結合ユニット」とは、その特定の標的または抗原に結合することができ、標的結合を可能にする抗体由来の(典型的に抗体に存在する)最低限の構造要件を含む、ポリペプチドを指す。したがって、抗原結合ユニットは、少なくとも、3つの軽鎖および3つの重鎖CDR配列の存在、好ましくは、少なくとも軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む。
全長抗体を、酵素、たとえば、パパインまたはペプシンで処理して、有用な抗体フラグメントを生成することができる。パパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Fab」フラグメントと称される2つの同一な抗原結合抗体フラグメント、ならびに残りの「Fc」フラグメントを産生するために使用される。Fabフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のCH1ドメインを含む。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、依然として抗原への架橋が可能なF(ab’)2フラグメントが得られる。
「Fv」フラグメントは、1つの重鎖可変ドメインおよび1つの軽鎖可変ドメインが緊密な非共有結合で会合した二量体からなる、完全な抗原認識および結合部位を含む。この構成では、それぞれの可変ドメインの3つのCDRが、相互作用して、VH−VL二量体の表面上の抗原結合性部位を定めている。まとめると、6つのCDRにより、抗体には、抗原結合特異性が付与される。
したがって、ヒト抗体、ヒト抗原結合ユニット、またはヒトVH/VLドメインは、たとえば、キメラまたはヒト化抗体とは区別される。ヒト抗体、ヒト抗原結合ユニット、またはヒトVH/VLドメインは、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン(たとえば、重鎖および/または軽鎖)遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核生物細胞もしくは真核生物細胞によって、産生させることができることが、指摘されている。
エピトープは、抗体または抗原結合部分(たとえば、本明細書に記載されるタンパク質の抗原結合ユニット)によって結合される、抗原の領域である。「エピトープ」という用語には、抗体または抗原結合部分に特異的に結合することができる、任意のポリペプチド決定基が含まれる。ある特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、グリカン側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基(surface grouping)を含み、ある特定の実施形態においては、特定の三次元構造特徴および/または特定の電荷特徴を有し得る。立体構造および非立体構造エピトープは、立体構造エピトープへの結合が変性溶媒の存在下において消失するが、非立体構造エピトープへの結合は消失しないという点で、区別される。
明示的な記述なしに、また別意図されない限り、本技術が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、そのようなものの同等物または生物学的同等物は、本技術の範囲内であることが意図されると推定される。
「検出可能なシグナル」は、光子(無線周波数、マイクロ波周波数、赤外線周波数、可視光周波数、および紫外線周波数の光子を含む)の吸収、放出、および/または散乱を含む、様々な機序によって生成され得、これには、比色、蛍光、電気、放射性、および化学発光性シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、生細胞に由来するかまたはそれが接触したサンプル材料を意味する。この用語は、対象から単離された組織、細胞、および生物学的流体を含むことを意図する。本明細書において使用される場合、「組織サンプル」という用語は、細胞がサンプルを得た対象内に存在していたように、細胞間の横断面の空間的関係性を保存する細胞サンプルを指すものとする。生物学的サンプルはまた、内部器官の生検またはがんから得られてもよい。
本発明は、DLL3に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ユニット(第1の抗原結合ユニット)と、CD3に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ユニット(第2の抗原結合ユニット)とを含む、多重特異性結合タンパク質を提供する。そのような(多重特異性)結合タンパク質はまた、本明細書において、(多重特異性)結合分子またはDLL3/CD3結合タンパク質またはDLL3/CD3結合分子とも称される。
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の多重特異性結合タンパク質が、T細胞の存在下において、DLL3陽性SCLC細胞株の選択的溶解を誘導し、低いエフェクター対標的細胞比ですら活性であることを見出した。重要なことに、本発明の結合タンパク質は、DLL3陽性細胞の不在下におけるT細胞活性化、T細胞増殖、およびサイトカイン分泌を引き起こさず、DLL3陰性細胞の溶解も引き起こさない。
曖昧さを回避するために、本明細書において使用されるDLL3は、UniProt Q9NYJ7のヒトDLL3、およびそのタンパク質をコードする核酸配列を指す。本明細書において使用されるCD3は、ヒトCD3イプシロン(UniProt P07766)およびCD3ガンマ(Uniprot:P09693)複合体(ヒトCD3εγ複合体)を指す。
i)配列番号1(CDR1)、配列番号2(CDR2)、および配列番号3(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号4(CDR1)、配列番号5(CDR2)、および配列番号6(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#1)、
ii)配列番号7(CDR1)、配列番号8(CDR2)、および配列番号9(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号10(CDR1)、配列番号11(CDR2)、および配列番号12(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#2)、
iii)配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号16(CDR1)、配列番号17(CDR2)、および配列番号18(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#3)、
iv)配列番号19(CDR1)、配列番号20(CDR2)、および配列番号21(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号22(CDR1)、配列番号23(CDR2)、および配列番号24(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#4)、
v)配列番号25(CDR1)、配列番号26(CDR2)、および配列番号27(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号28(CDR1)、配列番号29(CDR2)、および配列番号30(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#5)、
vi)配列番号31(CDR1)、配列番号32(CDR2)、および配列番号33(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号34(CDR1)、配列番号35(CDR2)、および配列番号36(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#6)、
vii)配列番号133(CDR1)、配列番号134(CDR2)、および配列番号135(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号136(CDR1)、配列番号137(CDR2)、および配列番号138(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#7)、
viii)配列番号139(CDR1)、配列番号140(CDR2)、および配列番号141(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号142(CDR1)、配列番号143(CDR2)、および配列番号144(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#8)、
ix)配列番号145(CDR1)、配列番号146(CDR2)、および配列番号147(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号148(CDR1)、配列番号149(CDR2)、および配列番号150(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#9)、
xi)配列番号157(CDR1)、配列番号158(CDR2)、および配列番号159(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号160(CDR1)、配列番号161(CDR2)、および配列番号162(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#11)、
xii)配列番号163(CDR1)、配列番号164(CDR2)、および配列番号165(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号166(CDR1)、配列番号167(CDR2)、および配列番号168(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#12)、
xiii)配列番号169(CDR1)、配列番号170(CDR2)、および配列番号171(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号172(CDR1)、配列番号173(CDR2)、および配列番号174(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#13)、
xiv)配列番号175(CDR1)、配列番号176(CDR2)、および配列番号177(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号178(CDR1)、配列番号179(CDR2)、および配列番号180(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#14)、
xv)配列番号181(CDR1)、配列番号182(CDR2)、および配列番号183(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号184(CDR1)、配列番号185(CDR2)、および配列番号186(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#15)、
xvi)配列番号187(CDR1)、配列番号188(CDR2)、および配列番号189(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号190(CDR1)、配列番号191(CDR2)、および配列番号192(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#16)、
xvii)配列番号193(CDR1)、配列番号194(CDR2)、および配列番号195(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号196(CDR1)、配列番号197(CDR2)、および配列番号198(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#17)、ならびに
xviii)配列番号199(CDR1)、配列番号200(CDR2)、および配列番号201(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号202(CDR1)、配列番号203(CDR2)、および配列番号204(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットDLL3#18)
からなる群から選択される。
好ましくは、本発明の結合タンパク質の第1の抗原結合ユニットは、上述のCDR配列によって定義されるi)〜iii)のうちのいずれか1つである。
曖昧さを回避するために、本明細書において列挙される特定の実施形態のそれぞれはまた、本発明の独立した態様と考えることができる。
i)配列番号55(CDR1)、配列番号56(CDR2)、および配列番号57(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号58(CDR1)、配列番号59(CDR2)、および配列番号60(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットCD3#1)、
ii)配列番号61(CDR1)、配列番号62(CDR2)、および配列番号63(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号64(CDR1)、配列番号65(CDR2)、および配列番号66(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットCD3#2)、ならびに
iii)配列番号96(CDR1)、配列番号97(CDR2)、および配列番号98(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号99(CDR1)、配列番号100(CDR2)、および配列番号101(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット(抗原結合ユニットCD3#3)
からなる群から選択される。
1つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR、ならびに配列番号16(CDR1)、配列番号17(CDR2)、および配列番号18(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDRを含む、DLL3に特異的に結合する第1の抗原結合ユニットと、配列番号55(CDR1)、配列番号56(CDR2)、および配列番号57(CDR3)のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR、ならびに配列番号58(CDR1)、配列番号59(CDR2)、および配列番号60(CDR3)のアミノ酸配列を含む重鎖CDRを含む、CD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む。
本明細書に記載されるCDR配列に加えて、本発明の結合タンパク質の抗原結合ユニットは、免疫グロブリンフレームワーク領域(FR)配列を含む。これらの配列は、好ましくは、ヒトにおいて免疫原性でなく、したがって、好ましくは、ヒトまたはヒト化FR配列である。好適なヒトまたはヒト化FR配列は、当該技術分野において公知である。特に好ましいFR配列は、完全な抗原結合ユニット、ならびにそれによってCDR配列およびFR配列を開示している、本明細書に示される実施形態から得ることができる。
本発明の好ましい実施形態において、第1の抗原結合ユニットの軽鎖/重鎖可変ドメインは、さらに、以下の通り定義される。
i)配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#1)、または
ii)配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#2)、または
iv)配列番号43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#4)、または
v)配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#5)、または
vi)配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#6)、または
vii)配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#7)、または
viii)配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#8)、または
ix)配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#9)、または
x)配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#10)、または
xi)配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号214のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#11)、または
xii)配列番号215のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号216のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#12)、または
xiii)配列番号217のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号218のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#13)、または
xiv)配列番号219のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号220のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#14)、または
xv)配列番号221のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号222のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#15)、または
xvi)配列番号223のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号224のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#16)、または
xvii)配列番号225のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号226のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#17)、または
xviii)配列番号227のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号228のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットDLL3#18)。
好ましくは、本発明の結合タンパク質の第1の抗原結合ユニットは、上述のVLおよびVH配列によって定義されるi)〜iii)のうちのいずれか1つである。
i)配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号68のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットCD3#1)、または
ii)配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号70のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットCD3#2)、または
iii)配列番号102のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(抗原結合ユニットCD3#3)。
1つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、(i)配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、DLL3に特異的に結合する第1の抗原結合ユニットと、(ii)配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号70のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、CD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む。
1つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、(i)配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、DLL3に特異的に結合する第1の抗原結合ユニットと、(ii)配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号70のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、CD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含む。
本発明の文脈において、CH1ドメインは、抗体重鎖の第1の定常ドメインである。CH1定常ドメインの例は、配列番号253に示される。
リンカー配列は、天然に存在する配列であってもよく、または非天然の配列であってもよい。治療目的で使用される場合、リンカーは、好ましくは、本発明の結合タンパク質が投与される対象において、非免疫原性である。
リンカー配列の1つの有用な群は、国際公開第1996/34103号および同第1994/04678号に記載される重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、Ala−Ala−Alaなどのポリ−アラニンリンカー配列である。
一部の実施形態において、第1のFcドメインは、366位におけるトリプトファン(W)[T366W]に加えて、354位にシステイン(C)[S354C]を含み、第2のFcドメインは、366位におけるセリン(S)[T366S]、368位におけるアラニン(A)[L368A]、および407位におけるバリン(V)[Y407V]に加えて、349位にシステイン(C)[Y349C]を含む。一態様において、そのようなFcドメインは、IgG4の重鎖に由来するFcドメインである。
一部の実施形態において、IgG1に由来する本発明の第1および/または第2のFcドメインはまた、「KO」突然変異(L234A、L235A)も含む。さらなる態様において、IgG4に由来する本発明の第1および/または第2のFcドメインはまた、Proヒンジ突然変異(S228P)も含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号73のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号79のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号74のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号79のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号75のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号79のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号73のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号80のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号74のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号80のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号75のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号80のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号73のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号105のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号74のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号105のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号75のアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖と、配列番号105のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖とを含む。
上述の実施形態のすべてについて、「含む」という用語を使用することにより、それぞれのドメインまたは分子が、示されるアミノ酸配列「からなる」実施形態も含むよう意図することを、理解されたい。
i)配列番号1(CDR1)、配列番号2(CDR2)、および配列番号3(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号4(CDR1)、配列番号5(CDR2)、および配列番号6(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
ii)配列番号7(CDR1)、配列番号8(CDR2)、および配列番号9(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号10(CDR1)、配列番号11(CDR2)、および配列番号12(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
iii)配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号16(CDR1)、配列番号17(CDR2)、および配列番号18(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
iv)配列番号19(CDR1)、配列番号20(CDR2)、および配列番号21(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号22(CDR1)、配列番号23(CDR2)、および配列番号24(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
v)配列番号25(CDR1)、配列番号26(CDR2)、および配列番号27(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号28(CDR1)、配列番号29(CDR2)、および配列番号30(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
vi)配列番号31(CDR1)、配列番号32(CDR2)、および配列番号33(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号34(CDR1)、配列番号35(CDR2)、および配列番号36(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
vii)配列番号133(CDR1)、配列番号134(CDR2)、および配列番号135(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号136(CDR1)、配列番号137(CDR2)、および配列番号138(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
ix)配列番号145(CDR1)、配列番号146(CDR2)、および配列番号147(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号148(CDR1)、配列番号149(CDR2)、および配列番号150(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
x)配列番号151(CDR1)、配列番号152(CDR2)、および配列番号153(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号154(CDR1)、配列番号155(CDR2)、および配列番号156(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xi)配列番号157(CDR1)、配列番号158(CDR2)、および配列番号159(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号160(CDR1)、配列番号161(CDR2)、および配列番号162(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xii)配列番号163(CDR1)、配列番号164(CDR2)、および配列番号165(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号166(CDR1)、配列番号167(CDR2)、および配列番号168(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xiii)配列番号169(CDR1)、配列番号170(CDR2)、および配列番号171(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号172(CDR1)、配列番号173(CDR2)、および配列番号174(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xiv)配列番号175(CDR1)、配列番号176(CDR2)、および配列番号177(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号178(CDR1)、配列番号179(CDR2)、および配列番号180(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xv)配列番号181(CDR1)、配列番号182(CDR2)、および配列番号183(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号184(CDR1)、配列番号185(CDR2)、および配列番号186(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xvi)配列番号187(CDR1)、配列番号188(CDR2)、および配列番号189(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号190(CDR1)、配列番号191(CDR2)、および配列番号192(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xvii)配列番号193(CDR1)、配列番号194(CDR2)、および配列番号195(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号196(CDR1)、配列番号197(CDR2)、および配列番号198(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、ならびに
xviii)配列番号199(CDR1)、配列番号200(CDR2)、および配列番号201(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号202(CDR1)、配列番号203(CDR2)、および配列番号204(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR
からなる群から選択されるCDR配列を含む。
i)配列番号55(CDR1)、配列番号56(CDR2)、および配列番号57(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号58(CDR1)、配列番号59(CDR2)、および配列番号60(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
ii)配列番号61(CDR1)、配列番号62(CDR2)、および配列番号63(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号64(CDR1)、配列番号65(CDR2)、および配列番号66(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、ならびに
iii)配列番号96(CDR1)、配列番号97(CDR2)、および配列番号98(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号99(CDR1)、配列番号100(CDR2)、および配列番号101(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR
からなる群から選択されるCDR配列を含む。
これらのCDR配列によって定義されるそれぞれの軽鎖/重鎖可変ドメインは、それぞれ、CD3#1、CD3#2、およびCD3#3と称される。
i)配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#1)、
ii)配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#2)、
iii)配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#3)、
iv)配列番号43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#4)、
v)配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#5)、
vi)配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#6)、
vii)配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#7)、
viii)配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#8)、
ix)配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#9)、
x)配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#10)、
xi)配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号214のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#11)、
xii)配列番号215のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号216のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#12)、
xiii)配列番号217のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号218のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#13)、
xiv)配列番号219のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号220のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#14)、
xv)配列番号221のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号222のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#15)、
xvi)配列番号223のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号224のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#16)、
xvii)配列番号225のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号226のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#17)、ならびに
xviii)配列番号227のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号228のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(DLL3#18)
からなる群から選択される、軽鎖可変ドメイン(第1の軽鎖可変ドメイン)および重鎖可変ドメイン(第1の重鎖可変ドメイン)を含む。
好ましくは、軽鎖可変および重鎖可変ドメインの配列は、上記に定義されるi)〜iii)(DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3)からなる群から選択される。
i)配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号68のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(CD3#1)、
ii)配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号70のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(CD3#2)、ならびに
iii)配列番号102のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン(CD3#3)
からなる群から選択される、軽鎖可変ドメイン(第2の軽鎖可変ドメイン)および重鎖可変ドメイン(第2の重鎖可変ドメイン)を含む。
1つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、(i)配列番号39の軽鎖可変ドメインおよび配列番号40の重鎖可変ドメインを含む、DLL3に特異的に結合する第1のポリペプチド鎖と、(ii)配列番号69の軽鎖可変ドメインおよび配列番号70の重鎖可変ドメインを含む、CD3に特異的に結合する第2のポリペプチド鎖とを含む。
1つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、(i)配列番号41の軽鎖可変ドメインおよび配列番号42の重鎖可変ドメインを含む、DLL3に特異的に結合する第1のポリペプチド鎖と、(ii)配列番号69の軽鎖可変ドメインおよび配列番号70の重鎖可変ドメインを含む、CD3に特異的に結合する第2のポリペプチド鎖とを含む。
好ましい実施形態において、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖は、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号229、配列番号230、配列番号231、配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235、配列番号236、配列番号237、配列番号238、配列番号239、または配列番号240のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含む。
1つの好ましい実施形態において、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖は、配列番号49のアミノ酸配列を含み、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含む。
1つの好ましい実施形態において、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖は、配列番号50のアミノ酸配列を含み、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含む。
1つの好ましい実施形態において、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖は、配列番号51のアミノ酸配列を含み、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖は、配列番号71のアミノ酸配列を含む。
1つの好ましい実施形態において、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖は、配列番号49のアミノ酸配列を含み、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖は、配列番号72のアミノ酸配列を含む。
1つの好ましい実施形態において、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖は、配列番号50のアミノ酸配列を含み、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖は、配列番号72のアミノ酸配列を含む。
1つの好ましい実施形態において、DLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖は、配列番号51のアミノ酸配列を含み、CD3に特異的な第2のポリペプチド鎖は、配列番号72のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、IgG1に由来する本発明の第1および/または第2の重鎖はまた、「KO」突然変異(L234A、L235A)も含む。さらなる態様において、IgG4に由来する本発明の第1および/または第2の重鎖はまた、Proヒンジ突然変異(S228P)も含む。
さらなる態様において、本発明のDLL3/CD3結合タンパク質は、実施例5において示されるように、DLL3陰性細胞には結合せず、ヒトおよびDLL3パラログDLL1およびDLL4と交差反応しない。
さらなる態様において、本発明のDLL3/CD3結合タンパク質は、T細胞活性を標的とされる腫瘍細胞に選択的に再指向させ、腫瘍細胞の溶解をもたらすために、DLL3を発現する腫瘍細胞とT細胞との間の細胞溶解性シナプスの形成に最適な立体条件を提供することによって、腫瘍細胞に対する細胞毒性を媒介することができる。
さらに好ましい実施形態において、発現ベクターは、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、もしくは配列番号252のうちのいずれか1つの第1のポリペプチド鎖、および/または配列番号80を含む第2のポリペプチド鎖をコードする、ヌクレオチド配列を含む。
好ましくは、発現ベクターは、少なくとも1つの制御配列に作動可能に連結された、前記核酸分子を含むベクターであり、ここで、そのような制御配列は、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター配列であり得、最も好ましくは、異種プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター配列であり得る。
別の態様において、本発明は、本発明のDLL3に特異的な第1のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターと、本発明のCD3に特異的な第2のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターとを有する、宿主細胞に関する。
特に好ましい実施形態によると、前記宿主細胞は、真核生物細胞、たとえば、哺乳動物細胞である。別の実施形態において、そのような宿主細胞は、細菌細胞である。他の有用な細胞は、酵母細胞または他の真菌細胞である。
好適な哺乳動物細胞としては、たとえば、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞などが挙げられる。しかしながら、当該技術分野において異種タンパク質の発現に使用される、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および任意の他の細胞を、同様に使用することができる。
DLL3は、通常、胎児(foetal)の脳におけるゴルジ体のものを含め、細胞内膜に発現され、傍軸中胚葉における体節形成に重要な役割を果たす(Geffers et al., J Cell Biol. 2007;178:465、Chapman et al., Hum. Mol. Genet. 2011;20:905-916)。SCLC、LCNEC、および神経膠芽腫を含む一部の腫瘍型におけるDLL3発現の著しい誘導は、細胞表面への局在化をもたらし、これが、非悪性細胞には検出可能な細胞表面DLL3が存在しないことと合わさって、腫瘍細胞特異的治療法ならびに診断および予後診断ツールとしての抗DLL3抗体の使用の新たな絶好の機会をもたらした。
i)配列番号1(CDR1)、配列番号2(CDR2)、および配列番号3(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号4(CDR1)、配列番号5(CDR2)、および配列番号6(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
ii)配列番号7(CDR1)、配列番号8(CDR2)、および配列番号9(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号10(CDR1)、配列番号11(CDR2)、および配列番号12(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
iii)配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号16(CDR1)、配列番号17(CDR2)、および配列番号18(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
iv)配列番号19(CDR1)、配列番号20(CDR2)、および配列番号21(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号22(CDR1)、配列番号23(CDR2)、および配列番号24(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
v)配列番号25(CDR1)、配列番号26(CDR2)、および配列番号27(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号28(CDR1)、配列番号29(CDR2)、および配列番号30(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
vi)配列番号31(CDR1)、配列番号32(CDR2)、および配列番号33(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号34(CDR1)、配列番号35(CDR2)、および配列番号36(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
vii)配列番号133(CDR1)、配列番号134(CDR2)、および配列番号135(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号136(CDR1)、配列番号137(CDR2)、および配列番号138(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
viii)配列番号139(CDR1)、配列番号140(CDR2)、および配列番号141(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号142(CDR1)、配列番号143(CDR2)、および配列番号144(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
ix)配列番号145(CDR1)、配列番号146(CDR2)、および配列番号147(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号148(CDR1)、配列番号149(CDR2)、および配列番号150(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
x)配列番号151(CDR1)、配列番号152(CDR2)、および配列番号153(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号154(CDR1)、配列番号155(CDR2)、および配列番号156(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xi)配列番号157(CDR1)、配列番号158(CDR2)、および配列番号159(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号160(CDR1)、配列番号161(CDR2)、および配列番号162(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xii)配列番号163(CDR1)、配列番号164(CDR2)、および配列番号165(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号166(CDR1)、配列番号167(CDR2)、および配列番号168(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xiii)配列番号169(CDR1)、配列番号170(CDR2)、および配列番号171(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号172(CDR1)、配列番号173(CDR2)、および配列番号174(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xiv)配列番号175(CDR1)、配列番号176(CDR2)、および配列番号177(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号178(CDR1)、配列番号179(CDR2)、および配列番号180(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、または
xv)配列番号181(CDR1)、配列番号182(CDR2)、および配列番号183(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号184(CDR1)、配列番号185(CDR2)、および配列番号186(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xvi)配列番号187(CDR1)、配列番号188(CDR2)、および配列番号189(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号190(CDR1)、配列番号191(CDR2)、および配列番号192(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xvii)配列番号193(CDR1)、配列番号194(CDR2)、および配列番号195(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号196(CDR1)、配列番号197(CDR2)、および配列番号198(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xviii)配列番号199(CDR1)、配列番号200(CDR2)、および配列番号201(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号202(CDR1)、配列番号203(CDR2)、および配列番号204(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR
を含む、抗DLL3抗体分子を提供する。
本発明の好ましい実施形態において、抗体分子は、DLL3#1またはDLL3#5に対応する上記のi)またはv)に定義されるCDR配列を含む。
アミノ酸配列同一性を計算する方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書では本明細書の定義の節においてさらに考察されている。
一部の実施形態において、抗DLL3抗体分子は、マウスDLL3には結合しない。
本発明の別の態様は、本発明の抗DLL3抗体分子の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードする、単離された核酸分子を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明の抗DLL3抗体分子の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子を含む、発現ベクターを提供する。
好ましくは、発現ベクターは、さらに、核酸分子、好ましくは、核酸分子に連結された重鎖の定常ドメインおよび/または軽鎖の定常ドメインそれぞれをコードするDNA分子、好ましくは、重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインそれぞれをコードするDNA分子を含む。
好ましくは、発現ベクターは、少なくとも1つの制御配列に作動可能に連結された、前記核酸分子を含むベクターであり、ここで、そのような制御配列は、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター配列であり得、もっとも好ましくは、異種プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター配列であり得る。
別の態様において、本発明は、本発明の抗DLL3抗体分子の重鎖をコードする発現ベクターと、本発明の抗DLL3抗体分子の軽鎖をコードする発現ベクターとを有する、宿主細胞に関する。
特に好ましい実施形態によると、前記宿主細胞は、真核生物細胞、たとえば、哺乳動物細胞である。別の実施形態において、そのような宿主細胞は、細菌細胞である。他の有用な細胞は、酵母細胞または他の真菌細胞である。
本発明は、本発明の多重特異性結合タンパク質を製造する方法であって、概して、
− 本発明の結合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、本発明の結合タンパク質の形成を可能にする条件下において培養するステップと、
− 宿主細胞によって発現された結合タンパク質を、培養物から回収するステップとを含み、
− さらに、本発明の結合タンパク質を精製および/または修飾および/または製剤化するステップを含んでもよい、方法をさらに提供する。
本発明は、本発明の抗DLL3抗体を製造する方法であって、概して、
− 本発明の抗体分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、抗体分子の形成を可能にする条件下において培養するステップと、
− 宿主細胞によって発現された抗体分子を、培養物から回収するステップとを含み、
− さらに、本発明の抗体分子を精製および/または修飾および/または製剤化するステップを含んでもよい、方法をさらに提供する。
本発明の核酸は、本明細書に提供される本発明のタンパク質のアミノ酸配列上の情報に基づいて、本質的に公知の様式で(たとえば、自動化されたDNA合成および/または組換えDNA技術によって)調製または獲得することができる。
本発明の核酸は、典型的に、発現ベクター、すなわち、好適な宿主細胞または他の発現系にトランスフェクトされるとタンパク質の発現をもたらすことができるベクターに、組み込まれるであろう。
本発明の結合タンパク質または抗体を製造するために、当業者であれば、当該技術分野において周知の様々な発現系、たとえば、Kipriyanow and Le Gall, 2004によって考察されているものから、選択することができる。
組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの全長CD3もしくはDLL3鎖、または抗DLL3抗体の軽鎖/重鎖の分泌を促進する、シグナペプチドもコードし得る。タンパク質鎖をコードするDNAは、シグナルペプチドが、成熟した全長鎖DNAのアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよく、または非免疫グロブリンタンパク質由来の異種ペプチドであってもよい。あるいは、本発明のタンパク質の全長鎖をコードするDNA配列が、シグナルペプチド配列をすでに含んでいてもよい。
好ましくは、本発明のタンパク質のDLL3およびCD3鎖をコードするDNA分子は、2つの発現ベクターに存在し、これらは、宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞に、コトランスフェクトされる。
曖昧さを回避するために、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質のうちのいずれかに関して、本明細書に記載される医薬組成物、キット、処置方法、医療上の使用、組合せ、投与の方法、および投薬量に関する実施形態のすべてが、単独またはさらなる治療剤(以下により詳細に示される)との組合せのいずれかで企図される。
本発明は、さらに、少なくとも1つの本発明の多重特異性結合タンパク質を含む、疾患(以下により詳細に示される)の処置のための医薬組成物に関する。本発明は、さらに、少なくとも1つの本発明の多重特異性タンパク質または以下に示される医薬組成物を使用して、疾患(以下により詳細に示される)を処置する方法を包含し、さらに、そのような本発明の結合タンパク質または医薬組成物を使用することによるそのような疾患の処置のための医薬の調製を包含する。
医薬での使用のために、本発明の結合タンパク質は、(i)少なくとも1つの本発明の結合タンパク質(たとえば、DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#4/CD3#1、DLL3#5/CD3#1、DLL3#6/CD3#1、DLL3#7/CD3#1、DLL3#8/CD3#1、DLL3#9/CD3#1、DLL3#10/CD3#1、DLL3#11/CD3#1、DLL3#12/CD3#1、DLL3#13/CD3#1、DLL3#14/CD3#1、DLL3#15/CD3#1、DLL3#16/CD3#1、DLL3#17/CD3#1、DLL3#18/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#4/CD3#2、DLL3#5/CD3#2、DLL3#6/CD3#2、DLL3#7/CD3#2、DLL3#8/CD3#2、DLL3#9/CD3#2、DLL3#10/CD3#2、DLL3#11/CD3#2、DLL3#12/CD3#2、DLL3#13/CD3#2、DLL3#14/CD3#2、DLL3#15/CD3#2、DLL3#16/CD3#2、DLL3#17/CD3#2、DLL3#18/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#3、DLL3#4/CD3#3、DLL3#5/CD3#3およびDLL3#6/CD3#3、DLL3#7/CD3#3、DLL3#8/CD3#3、DLL3#9/CD3#3、DLL3#10/CD3#3、DLL3#11/CD3#3、DLL3#12/CD3#3、DLL3#13/CD3#3、DLL3#14/CD3#3、DLL3#15/CD3#3、DLL3#16/CD3#3、DLL3#17/CD3#3、DLL3#18/CD3#3のうちのいずれか1つ、好ましくは、DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3のうちのいずれか1つ)と、(ii)少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、および/または安定剤とを含み、(iii)1つまたは複数のさらなる薬理学的に活性なポリペプチドおよび/または化合物を含んでもよい、医薬調製物として製剤化され得る。「薬学的に許容される」とは、それぞれの材料が、個別に投与した場合にいずれの生物学的作用もそれ以外の望ましくない作用も示さず、それが含まれている医薬組成物の他の成分(たとえば、薬学的に活性な成分)のうちのいずれとも有害な様式で相互作用しないことを意味する。具体的な例は、標準的な教本、たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)などに見出すことができる。たとえば、本発明の結合タンパク質は、従来的な抗体および抗体フラグメント、ならびに他の薬学的に活性なタンパク質に関して本質的に公知の任意の様式で製剤化および投与することができる。したがって、さらなる実施形態によると、本発明は、少なくとも1つの本発明の結合タンパク質と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、および/または安定剤とを含み、1つまたは複数のさらなる薬理学的に活性な物質を含んでもよい、凍結乾燥もしくはそうでない場合には乾燥された製剤、または水溶性もしくは非水溶性溶液もしくは懸濁液の形態の、医薬組成物または調製物に関する。
すべての事例において、最終的な剤形は、製造および保管の条件下において、滅菌、流体、かつ安定でなければならない。滅菌注射溶液は、必要に応じて、上記に列挙された様々な他の成分とともに、活性化合物を、必要とされる量で、適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の事例において、調製の好ましい方法は、事前に滅菌濾過した溶液中に存在する活性成分と任意の追加の所望される成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥の技法である。
− リン酸緩衝食塩水、pH7.4、
− 他のリン酸緩衝液、pH6.2〜8.2、
− 酢酸緩衝液、pH3.2〜7.5、好ましくはpH4.8〜5.5、
− ヒスチジン緩衝液、pH5.5〜7.0、
− コハク酸緩衝液、pH3.2〜6.6、および
− クエン酸緩衝液、pH2.1〜6.2とを含み、
溶液の等張性を提供するために、塩(たとえば、NaCl)ならびに/または糖(たとえば、スクロースおよびトレハロース)ならびに/または他の多価アルコール(たとえば、マンニトールおよびグリセロール)を含んでもよい、溶液である。
本発明のさらなる態様によると、本発明の結合タンパク質は、タンパク質の投与に有用なデバイス、たとえば、シリンジ、注射ペン、マイクロポンプ、または他のデバイスと組み合わせて使用され得る。
本発明のさらなる態様は、がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の本発明の結合タンパク質を投与するステップを含む、方法を提供する。
本発明のさらなる態様は、がんを処置する方法において使用するための本発明の結合タンパク質を提供する。
本発明のさらなる態様は、がんを処置するための医薬組成物を調製するための、本発明の結合タンパク質の使用である。
本明細書において使用される場合、「がん」という用語は、侵襲の組織病理学的種類または段階に関係なく、すべての種類のがん性成長もしくは発がんプロセス、転移組織、または悪性形質転換細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味する。
本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質を使用してその成長を阻害することができる追加のがんは、ある特定の遺伝子型、表現型、または生化学的特徴が、従来的に定義される神経内分泌腫瘍と共通している、偽神経内分泌腫瘍(pNET)である。
本発明の好ましい実施形態において、がんは、小細胞肺がん(SCLC)または神経膠芽腫である。
身体における特定の位置/起源によって特徴付けられる、上述のすべてのがん、腫瘍、新生物などは、原発性腫瘍およびそれに由来する転移性腫瘍の両方を含むことを意味する。
本発明の結合タンパク質は、第1選択肢、第2選択肢、または任意のさらなる選択肢の処置、および維持処置の状況における治療レジメンにおいて、使用することができる。
本発明の結合タンパク質は、上述の疾患の予防、短期または長期の処置に使用することができ、放射線療法、1つもしくは複数の追加の治療剤、および/または外科手術と組み合わせて使用してもよい。
PD1−2は、配列番号258のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号259のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
PD1−3は、配列番号260のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号261のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
PD1−4は、配列番号262のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号263のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
PD1−5は、配列番号264のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号265のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有する。
本発明の結合タンパク質は、それ自体で使用されてもよく、または1つもしくは複数の追加の治療剤との組合せ、特に、化学療法剤、たとえば、DNA損傷剤、血管新生を阻害する治療的に活性な化合物、シグナル伝達経路阻害剤、EGFR阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、有糸分裂チェックポイント阻害剤、またはホルモン療法剤との組合せで使用されてもよい。
追加の治療剤は、同時に投与されてもよく、任意に同じ医薬調製物の成分として同時に投与されてもよく、またはDLL3/CD3結合タンパク質の投与の前もしくは後に投与されてもよい。
一部の実施形態において、追加の免疫療法剤は、同族TNF受容体ファミリーメンバーに結合するTNFファミリーメンバーの分子であり、これには、CD40およびCD40L、OX−40、OX−40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4−lBBL、CD137、GITR、TRAIL/Apo2−L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TLlA、TRAMP/DR3、EDAR、EDAl、XEDAR、EDA2、TNFRl、リンホトキシンα/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、リンホトキシンα1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFRが含まれる。
一部の実施形態において、追加の免疫療法剤は、T細胞活性化を刺激するタンパク質、たとえば、CD28、GITRL、OX40L、CD27、およびCD28Hのアゴニストである。
本発明の抗DLL3抗体分子は、診断および予後診断方法において有用であり、異なる抗原に対する結合特異性を有する色素、薬物、または別の分子を付着させることによって、(たとえば、ELISAアッセイ、FACS分析、免疫組織学法などにおいて)DLL3を発現する細胞または組織の標識化、局在化、または特定のために用いることができる。たとえば、検出可能な標識を、本発明の抗DLL3抗体分子にコンジュゲートさせてもよく、または本発明の抗体分子に対して特異的に結合し、検出可能な標識(二次抗体)にコンジュゲートされている二次試薬を、そのような診断方法において使用してもよい。一部の実施形態において、DLL3に特異的な抗体は、細胞において、細胞質および/または細胞表面のいずれかに発現されるDLL3に特異的に結合し、そのような細胞を局在化および/または特定するために使用される。一部の実施形態において、本明細書に提供されるDLL3特異的抗体は、DLL3を発現する細胞または組織(たとえば、腫瘍細胞)を特定するために使用される。
本発明の抗体は、それらが、高いレベルのエピトープ結合特異性およびDLL3ポリペプチドに対する高い結合親和性を有するように、選択される。一般に、抗体の結合親和性が高いほど、よりストリンジェントな洗浄条件をイムノアッセイにおいて実行して、標的ポリペプチドを除去することなく、非特異的に結合した材料を除去することができる。
(a)サンプルを、本発明の抗体と接触させるステップと、
(b)DLL3に結合した抗DLL3抗体を検出するステップと
を含む、方法を提供する。
生物学的サンプルは、対象の任意の組織(生検を含む)、細胞、または体液から獲得/単離することができる。好ましい実施形態において、サンプルは、組織サンプル、好ましくは、腫瘍組織サンプルである。特定の実施形態において、サンプルは、固定(腫瘍)組織サンプル、好ましくはホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織サンプル、より好ましくはホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腫瘍組織サンプルである。
サンプル中のDLL3検出の例示的な方法は、免疫細胞化学法(ICC)、免疫組織化学法(IHC)、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、および/またはELISAである。
好ましい実施形態において、DLL3は、IHCを使用して検出される。
a)組織サンプル(たとえば、腫瘍組織、たとえば、SCLC、神経膠芽腫、または神経内分泌腫瘍)、好ましくは、固定組織サンプル(たとえば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋)を、本発明の抗体(たとえば、DLL3#1またはDLL3#5)と接触させるステップと、
b)サンプル中で、抗体−抗原複合体を形成させるステップと、
c)DLL3に結合した抗DLL3抗体を検出するステップと
を含む。
たとえば、検出可能な標識は、酵素、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリ性ホスファターゼ(AP)、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびβ−ラクタマーゼ、フルオロフォア、たとえば、フルオレセイン、発色団、クマリン、BODIPY色素、レゾルフィン、およびローダミン、ナノ粒子、たとえば、量子ドット(米国特許第6,815,064号、同第6,682,596号、および同第6,649,138号)、金属キレート剤、たとえば、放射性または常磁性金属イオン、たとえば、Gd<3+>のDOTAおよびDPTAキレート剤、ならびにリポソーム、たとえば、捕捉された蛍光分子を含有するリポソームであり得る。
一部の例において、検出可能な部分は、クマリン、フルオレセイン(またはフルオレセイン誘導体および類似体)、ローダミン、レゾルフィン、発光団、およびシアニンを含む、いくつかの一般的な化学クラスに属する、フルオロフォアである。
ハプテンは、抗体が特異的に結合する小分子であるが、それ自体は、動物において免疫応答を誘起せず、免疫応答を生成するには、まず、タンパク質などのより大きな担体分子に結合しなければならない。ハプテンの例としては、ジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、およびフルオレセインである。
本発明はまた、少なくとも、本発明の多重特異性結合タンパク質(たとえば、DLL3#1/CD3#1、DLL3#2/CD3#1、DLL3#3/CD3#1、DLL3#4/CD3#1、DLL3#5/CD3#1、DLL3#6/CD3#1、DLL3#7/CD3#1、DLL3#8/CD3#1、DLL3#9/CD3#1、DLL3#10/CD3#1、DLL3#11/CD3#1、DLL3#12/CD3#1、DLL3#13/CD3#1、DLL3#14/CD3#1、DLL3#15/CD3#1、DLL3#16/CD3#1、DLL3#17/CD3#1、DLL3#18/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#2/CD3#2、DLL3#3/CD3#2、DLL3#4/CD3#2、DLL3#5/CD3#2、DLL3#6/CD3#2、DLL3#7/CD3#2、DLL3#8/CD3#2、DLL3#9/CD3#2、DLL3#10/CD3#2、DLL3#11/CD3#2、DLL3#12/CD3#2、DLL3#13/CD3#2、DLL3#14/CD3#2、DLL3#15/CD3#2、DLL3#16/CD3#2、DLL3#17/CD3#2、DLL3#18/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#3、DLL3#4/CD3#3、DLL3#5/CD3#3およびDLL3#6/CD3#3、DLL3#7/CD3#3、DLL3#8/CD3#3、DLL3#9/CD3#3、DLL3#10/CD3#3、DLL3#11/CD3#3、DLL3#12/CD3#3、DLL3#13/CD3#3、DLL3#14/CD3#3、DLL3#15/CD3#3、DLL3#16/CD3#3、DLL3#17/CD3#3、DLL3#18/CD3#3のうちのいずれか1つ、好ましくは、DLL3#1/CD3#1、DLL3#1/CD3#2、DLL3#1/CD3#3、DLL3#2/CD3#1、DLL3#2/CD3#2、DLL3#2/CD3#3、DLL3#3/CD3#1、DLL3#3/CD3#2、DLL3#3/CD3#3のうちのいずれか1つ)を含み、上述の疾患および障害の処置に使用される他の薬物からなる群から選択される1つまたは複数の他の成分を含んでもよい、キットも包含する。
一実施形態において、キットは、単位剤形で有効量の本発明の結合タンパク質を含む、組成物を含む。
本発明はまた、少なくとも、本発明の多重特異性結合タンパク質と、上述の疾患および障害の処置に使用される他の薬物からなる群から選択される1つまたは複数の他の成分とを含む、キットも包含する。
本明細書に記載されるように、本開示は、生物学的サンプル中のDLL3の発現を判定するための診断方法をさらに提供する。一態様において、本開示は、これらの方法を実行するためのキット、ならびに本開示の方法を実行するため、たとえば、組織を採取するためおよび/または検出アッセイを実行するためおよび/または結果を分析するための説明書を提供する。
適宜、これらの提案されたキットの構成要素は、当業者による使用に慣例的な様式で、パッケージングされ得る。たとえば、これらの提案されたキットの構成要素は、溶液で、または分散液などとして、提供され得る。
CD3/DLL3結合タンパク質の設計および構築
本発明者らは、DLL3およびCD3に結合し、DLL3を発現する腫瘍細胞の溶解を引き起こすT細胞活性化を誘導する、多重特異性結合タンパク質を開発した。使用される分子設計は、IgG抗体スキャフォールドおよびIgG様構造を有する。これは、Fcにおけるノブ(抗DLL3)アームとホール(抗CD3)アームとのヘテロ二量体化のためのノブインホール技術を特徴とする。加えて、結合タンパク質は、それぞれのアームにおいて軽鎖と対応する重鎖との間に可動性ペプチド配列を有する。したがって、結合タンパク質は、一方がCD3に結合し、他方がDLL3に結合し、それぞれが一本鎖FabおよびFc領域を含む、2つのアームを含む。
好ましくは、結合分子は、二重特異性であり、二価である(2つの標的のそれぞれに対して一価である)。
抗DLL3結合物質を得るために、DLL3免疫付与野生型およびAlivaMabヒト化マウス(Ablexis、San Francisco、CA、USA、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いたAlivaMabトランスジェニックマウスプラットフォーム)に由来するハイブリドーマまたは単一B細胞を、インビトロで培養した。上清を、AlphaLISA(PerkinElmer、Waltham、MA、USA)によって組換えヒトDLL3に対する反応性についてスクリーニングし、フローサイトメトリーによってヒトDLL3を発現するSHP77細胞(ATCC(登録商標)、CRL−2195TM)に対する反応性についてスクリーニングした。
この手法を使用して、DLL3に対する特異性を有する結合ドメインをコードするIg VHおよびVL遺伝子の対を、調製した。CHO−E37細胞に、対応する重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトすることによって、組換え抗体を産生させた。
発現された組換え抗体を含有する上清を、ヒトまたはカニクイザルDLL3を発現する細胞株への結合について、フローサイトメトリーによってアッセイした。簡単に述べると、細胞を、組換え上清とともにインキュベートし、洗浄し、上清から結合したmAbを、抗ヒトIgG−APC(Jackson ImmunoResearch 109-136-098)を用いて検出した。シグナル対バックグラウンド比(S/B)は、サンプルの蛍光強度中央値(MFI)を、アイソタイプ対照(無関係のタンパク質に対する可変領域および異なる定常領域骨格)のもので除すことによって、計算した。
目的のクローン(Kd<300pM)を、多重特異性形式に関して選択した。多重特異性結合タンパク質を生成し、機械的および機能的スクリーニング(たとえば、以下に記載される細胞結合、細胞毒性、およびT細胞活性化)においてさらに評価した。
上述のDLL3結合物質、ならびに文献に記載されているCD3結合物質(Pessano et al., EMBO J. 1985 Feb; 4(2): 337-44、Salmeron A et al., J Immunol. 1991 Nov 1;147(9):3047-52)の配列を、ヒト化および/または最適化した。抗体の配列最適化/ヒト化は、治療薬として使用するために、ヒトにおいて産生される抗体に似させ、それによって、特異性を維持しながら免疫原性などの可能性のある副作用を排除する、(特定の抗原/エピトープに対して)非ヒト種において生じる抗体を操作するための手法である。利用される配列最適化/ヒト化アプローチは、Singh et al, 2015 (Singh S et al., mAbs 2015: 7(4):778-91)によって記載されている。簡単に述べると、緊密に一致するヒト生殖細胞系を、コンピュータで特定し、最適化/ヒト化バリアントを、ファージスクリーニング方法を使用して評価した。最終的なリード候補配列は、結合、ヒトパーセントスコア、およびEpivax(可能性のある免疫原性をコンピュータで予測するツール)スコアに基づいて選択した。
DLL3およびCD3結合物質の可変領域を、一般的な分子生物学技法を使用して発現ベクターpTT5(National Research Council、Canada)にクローニングして、DLL3に結合する一本鎖FabおよびFc領域を含む1つのDLL3特異的結合ユニット(そのような結合ユニットはまた、本明細書において、「DLL3アーム」または「DLL3鎖」とも称される)と、CD3に結合する一本鎖FabおよびFc領域を含むCD3特異的結合ユニット(そのような結合ユニットはまた、本明細書において、「CD3アーム」または「CD3鎖とも称される)とを有する二重特異性結合タンパク質を形成した。DLL3およびCD3アームのFc領域には、「ノブ」または「ホール」のいずれかの突然変異が含まれ(Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35)、それぞれの鎖は、ノブ鎖またはホール鎖と称される。多重フラグメントのDNAアセンブリについては、ギブソンアセンブリおよびNEBuilder HiFi DNAアセンブリのアプローチを、製造業者のプロトコールに従って使用した(New England Biolabs、Ipswich、MA、USA)。DNAミニプレップをシーケンシングした。
DLL3およびCD3に結合する二重特異性、二価結合タンパク質の発現および精製
DLL3およびCD3に結合する二重特異性分子を、DLL3/CD3鎖をコードする遺伝子を保持するpTT5ベクターをCHO−E細胞に一過的にトランスフェクトすることによって産生させた。簡単に述べると、無血清培地において懸濁液中で成長するトランスフェクトしたCHO−E細胞を、140rpmでの撹拌、37℃、および5% CO2下において、振盪フラスコ中で培養し、指数関数的成長の条件で維持した。トランスフェクションの日には、細胞に、ノブ鎖のプラスミドおよびホール鎖のプラスミドを1:3の質量比でトランスフェクトした。これらを、次いで、1〜2×10^6個の細胞/mlで、1LのGibco(登録商標)FreeStyle(商標)CHO発現培地(LifeTechnologies、NY、US)に播種した。細胞を、次いで、200mlの市販フィード溶液を一度にフィードして、10日間、回転振盪させながらインキュベートして、タンパク質の発現を可能にした。細胞培養上清中の抗体力価を、Octet(登録商標)機器(Pall ForteBio、CA、US)およびprotAバイオセンサーチップを製造業者の説明書に従って使用して判定した。
組換えタンパク質の産生
・ヒトDLL3−His
ヒトDLL3−Hisを産生するための細胞株を、HEK−293細胞(Thermo Fisher)、Lenti−Xレンチウイルス系(Clontech)、およびヒトDLL3−Hisをコードするプラスミド(ヒトDLL3、受託番号Q9NYJ7 huDLL3−His:配列番号106)を使用して生成した。発現のために、細胞を、37℃、5% CO2、および140rpmでの振盪で、培養し、増殖させた。発現の0日目に、細胞を、ペレット化し、Expi 293培地に再懸濁した。発現の3日目に、馴化させた培養上清を、細胞を40分間、4700rpmでペレット化することによって得た。プロテアーゼ阻害剤を、精製の前に生物材料(biomass)に添加した。発現を、ウエスタンブロットによって確認した。馴化した培養上清を、0.5mM TCEP、0.02% CHAPS、10mMイミダゾールを用いて調節した。精製は、HisTrap Niエクセルカラムおよび緩衝液A:50mM MES、50mM NaCl、0.5mM TCEP、0.02% CHAPS、pH6.5で実行した。目的のタンパク質を、20mMイミダゾールから500mMイミダゾールへの溶出勾配を使用して、0.5Mイミダゾール、pH8.5を補充した緩衝液Aにおいて溶出させた。プールした画分を、緩衝液:50mM MES、50mM NaCl、1mM TCEP、0.02% CHAPS、0.2Mアルギニン、3%グリセロール、pH6.5中に透析した。精製した材料を、質量分析法および超遠心分析法によって定量した。
カニクイザルDLL3−Hisを産生するための細胞株を、HEK−293細胞(Thermo Fisher)、Lenti−Xレンチウイルス系(Clontech)、およびカニクイザルDLL3−Hisをコードするプラスミド(カニクイザルDLL3、受託番号XM_005589196.1(RefSeq)、カニクイザルDLL3−His:配列番号107)を使用して生成した。発現のために、細胞を、37℃、5% CO2、および140rpmでの振盪で、培養し、増殖させた。発現の0日目に、細胞を、ペレット化し、Expi 293培地に再懸濁した。発現の3日目に、馴化させた培養上清を、細胞を40分間、4700rpmでペレット化することによって得た。プロテアーゼ阻害剤を、精製の前に生物材料に添加した。発現を、ウエスタンブロットによって確認した。馴化した培養上清を、0.5mM TCEP、0.02% CHAPS、10mMイミダゾールを用いて調節した。精製は、HisTrap Niエクセルカラムおよび緩衝液A:50mM MES、50mM NaCl、0.5mM TCEP、0.02% CHAPS、pH6.5で実行した。目的のタンパク質を、20mMイミダゾールから500mMイミダゾールへの溶出勾配を使用して、0.5Mイミダゾール、pH8.5を補充した緩衝液Aにおいて溶出させた。プールした画分を、緩衝液:50mM MES、50mM NaCl、1mM TCEP、0.02% CHAPS、0.2Mアルギニン、3%グリセロール、pH6.5中に透析した。精製した材料を、質量分析法および超遠心分析法によって定量した。
ヒトCD3 E+G HuFc−6xHisを産生するための細胞株を、HEK−293細胞(Thermo Fisher)、Lenti−Xレンチウイルス系(Clontech)、およびヒトCD3 E+G HuFc−6xHisをコードするプラスミド(ヒトCD3E、受託番号:P07766、ヒトCD3E+G−HuFc−His:配列番号108)を使用して生成した。発現のために、細胞を、Freestyle 293培地中で、37℃、加湿8% CO2環境、および135rpmでの振盪で、培養し、増殖させた。馴化させた培養上清を、9300xgで30分間の遠心分離によって、6日目に採取した。発現を、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングによってモニタリングした。馴化させた培養上清を、0.2Mスクロース、5%グリセロール、0.01% CHAPS、および10mMイミダゾールで調節した。pHを、次いで、7.2に調節した。精製は、Ni/NTA樹脂を使用した親和性精製(4℃で一晩のインキュベーション、および250mMイミダゾールでの溶出)、次いで、0.2Mスクロース、5%グリセロール、0.01% CHAPS、1mM TCEP、pH7.2を有する最終PBS緩衝液中、Superdex 200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーという2ステップのプロセスにおいて実行した。プールした材料を、最終的な分析および保管の前に、分画分子量(MWCO)が10,000のPES膜viva cell 100遠心分離デバイスを使用して、濃縮した。精製した材料を、質量分析法および超遠心分析法によって定量した。
カニクイザルCD3 E+G HuFc−6xHisを産生させるための細胞株を、HEK−293細胞(Thermo Fisher)、Lenti−Xレンチウイルスシステム(Clontech)、およびカニクイザルCD3 E+G HuFc−6xHisをコードするプラスミド(カニクイザルCD3E受託番号、Q95LI5、カニクイザルCD3 E+G huFc−His:配列番号109)を使用して生成した。発現のために、細胞を、Freestyle 293培地中で、37℃、加湿8% CO2環境、および135rpmでの振盪で、培養し、増殖させた。馴化させた培養上清を、9300xgで30分間の遠心分離によって、6日目に採取した。発現を、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングによってモニタリングした。馴化させた培養上清を、0.2Mスクロース、5%グリセロール、0.01% CHAPS、および10mMイミダゾールで調節した。pHを、次いで、7.2に調節した。精製は、Ni/NTA樹脂を使用した親和性精製(4℃で一晩のインキュベーション、および250mMイミダゾールでの溶出)、次いで、0.2Mスクロース、5%グリセロール、0.01% CHAPS、1mM TCEP、pH7.2を有する最終PBS緩衝液中、Superdex 200カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーという2ステップのプロセスにおいて実行した。プールした材料を、最終的な分析および保管の前に、分画分子量が10,000のPES膜viva cell 100遠心分離デバイスを使用して、濃縮した。精製した材料を、質量分析法および超遠心分析法によって定量した。
組換えDLL3およびCD3εγサブユニットに対する親和性ならびに種間交差反応性のSPRに基づく判定
精製したDLL3/CD3二重特異性コンストラクトの、組換えヒトおよびカニクイザルDLL3−ECDならびにヒトおよびカニクイザルCD3εγサブユニットのFc融合タンパク質に対する結合親和性を、ProteOn XPR36機器(Bio−Rad)を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって判定した。泳動緩衝液およびすべての希釈(示される場合を除く)を、PBS−T−EDTAにおいて行った。GLMセンサーチップ(Bio−Rad)を、製造業者の推奨に従って正規化し、事前に整えた。センサーチップを、30ul/分の流速で、300秒間、水平方向のEDC/s−NHSの等量混合物で活性化し、30ul/分の流速で、300秒間、水平方向のプロテインA/G(10mM酢酸、pH4.5中、20ug/ml)で固定化し、約5000RUのプロテインA/Gを表面上に得た。センサーチップを、30μl/分の流速で、300秒間、水平方向の1MエタノールアミンHClで脱活性化した。センサーチップを、100μl/分の流速で、18秒間、水平方向で3回、および垂直方向で3回、0.85%のリン酸で安定させた。
組換えDLL3およびCD3εγに対する親和性のSPRに基づく判定
精製したDLL3/CD3二重特異性コンストラクトの、組み換えヒトDLL3−ECDおよびヒトCD3εγサブユニットのFc融合タンパク質に対する結合親和性を、ProteOn XPR36機器(Bio−Rad)を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)によって判定した。この方法は、実施例4Aと類似であったが、以下に概説されるいくつかの違いを有する。
例示的なDLL3/CD3結合タンパク質(配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、または配列番号252のDLL3鎖と配列番号79のCD3鎖とを含むDLL3/CD3結合タンパク質、配列番号75のDLL3鎖と配列番号80のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質、ならびに配列番号75のDLL3鎖と配列番号105のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質)の親和性を、2Bに示す。
細胞外ドメインおよびそのサブドメインを細胞表面上に発現するHEK293細胞の生成
それぞれ、全長ヒトDLL3(Uniprot:Q9NYJ7)、カニクイザルDLL3(UPI0003AB95BD)、ヒトDLL1(Q00548)、およびヒトDLL4(Q9NR61)を発現する安定なHEK293細胞の生成のために、それぞれのコーディング配列を、pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific)にクローニングし、FLAG−タグを、シグナル配列と細胞外ドメインとの間に挿入した。細胞表面上の発現を、抗FLAG抗体(クローンM2、Sigma)、続いてモノクローナル抗マウスIgG1(Acris)を使用して検証した。
・ヒトDLL3シグナルペプチド:アミノ酸1〜26
・ヒトDLL3 N末端ECDドメイン:アミノ酸27〜175
・ヒトDLL3 DSL:アミノ酸176〜215
・ヒトDLL3 EGF1:アミノ酸216〜249
・ヒトDLL3 EGF2:アミノ酸274〜310
・ヒトDLL3 EGF3:アミノ酸312〜351
・ヒトDLL3 EGF4:アミノ酸353〜389
・ヒトDLL3 EGF5:アミノ酸391〜427
・ヒトDLL3 EGF6:アミノ酸429〜465
・膜近傍ペプチド:アミノ酸466〜492
・ヒトDLL3 EGF1+2:Uniprot:Q9NYJ7、アミノ酸216〜310
・ヒトDLL3 EGF 2+3:Uniprot:Q9NYJ7、アミノ酸274〜351
・ヒトDLL3 EGF3+4:Uniprot:Q9NYJ7、アミノ酸312〜389
・ヒトDLL3 EGF4+5:Uniprot:Q9NYJ7、アミノ酸353〜427
・ヒトDLL3 EGF5+6:Uniprot:Q9NYJ7、アミノ酸391〜465
・ヒトDLL3 EGF6+膜近傍ペプチド:Uniprot:Q9NYJ7、アミノ酸429〜492
DLL3/CD3結合タンパク質のエピトープドメインマッピング
エピトープドメインを、DLL3/CD3結合タンパク質の、DLL3のサブドメインを発現する組換え細胞株への結合によって、判定した(図2を参照されたい)。これらの細胞株の生成は、実施例5に記載されている。
DLL3/CD3結合タンパク質は、実施例2に記載されるように、鎖をコードする遺伝子を保持するpTT5ベクターをCHO−E細胞に一過的にトランスフェクトすることによって産生させた。
種間交差反応性
種間交差反応性は、DLL3/CD3結合タンパク質の、2つのSCLC細胞株であるNCI−H82細胞(HTB−175(商標))およびSHP77細胞(ATCC(登録商標)、CRL−2195(登録商標))、ならびにカニクイザルDLL3を発現する組換え細胞株への結合によって判定される(実施例5に記載される細胞株の生成)。
ヒトDLL1およびDLL4の結合の不在の確認
ヒトDLL1およびDLL4に対する交差反応性の不在を、DLL3/CD3結合タンパク質の、ヒトDLL1またはDLL4を発現する組換え細胞への結合によって判定した(細胞株の生成は、実施例5に記載されている)。
DLL3/CD3結合タンパク質は、実施例2に記載されるように、鎖をコードする遺伝子を保持するpTT5ベクターをCHO−E細胞に一過的にトランスフェクトすることによって産生させた。
DLL3/CD3結合タンパク質のSCLC細胞株およびT細胞への結合
DLL3/CD3結合タンパク質の、ヒトSCLC細胞株への結合を、NCI−H82(HTB−175(商標))およびSHP77(ATCC(登録商標)、CRL−2195(商標))のフローサイトメトリーによって、試験した。DLL3/CD3結合タンパク質は、実施例2に記載されるように産生させた。
刺激されていないPBMCをヒトSCLC細胞株に対して再指向させる有効性
乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出を細胞溶解の読取りとして使用して、SCLC細胞株に対する刺激されないPBMCの有効性を判定した。このアッセイにおいて、DLL3陽性SCLC細胞株であるSHP77およびNCI−H82を、エフェクター細胞としてヒトPBMCおよび漸増濃度のDLL3/CD3結合タンパク質とともに、エフェクター対標的細胞比10:1で、72時間、共培養した。DLL3/CD3結合タンパク質(配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78のDLL3鎖と配列番号79のCD3鎖とを含むDLL3/CD3結合タンパク質、および配列番号75のDLL3鎖と配列番号80のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質)を、実施例2に記載されるように、鎖をコードする遺伝子を保持するpTT5ベクターをCHO−E細胞に一過的にトランスフェクトすることによって、産生させた。
続いて、標的細胞であるSHP77およびNCI−H82、ならびにPBMCを、1:10の比で、0.0001nM〜100nMの濃度のDLL3/CD3結合タンパク質とともに、72時間インキュベートした。
最大溶解:標的細胞+5% Triton X−100
最小溶解:標的細胞
GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して、最大溶解対照に対する細胞毒性のパーセンテージを、対応するDLL3/CD3結合タンパク質濃度に対してプロットした。用量応答曲線を、シグモイドの用量応答曲線の評価のための4パラメーターのロジスティック方程式モデルを用いて分析し、EC90値を計算した(EC90値を、表4Aに示す)。
刺激されていないT細胞をヒトSCLC細胞株に対して再指向させることの有効性
T細胞を、実施例9に記載されるように単離した。続いて、実施例10Aに記載されるように、標的細胞としてSHP77およびNCI−H82細胞を用いた細胞毒性アッセイにおいて、精製したT細胞をエフェクター細胞として使用した。用量応答曲線を、図7B〜H(SHP77細胞)および図7I〜O(NCI−H82細胞)に示す。計算したEC90値を、表4Bに示す。
インビトロ内部移行アッセイ
標的細胞としてDLL3陽性SHP77細胞とともに事前インキュベートした後のDLL3/CD3結合タンパク質の有効性の変化を、測定した。DLL3/CD3結合タンパク質が内部移行された場合、有効濃度は、これにより減少するはずであり、したがって、見かけの有効性が減少するはずである。
DLL3/CD3結合タンパク質を、実施例2に記載されるように産生させた。ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、実施例10に記載されるように調製した。
SHP77標的細胞を、播種し、0.0001〜100nMの濃度でDLL3/CD3結合タンパク質とともに、2時間および4時間インキュベートした後、刺激されていないPBMCを48時間添加した。エフェクター対標的細胞の比は、10:1であった。実施例10に記載されるように、細胞毒性検出キットPLUS(Roche)を使用して、細胞毒性活性を判定した。
図8は、2つの例示的なDLL3/CD3結合タンパク質(配列番号75のDLL3鎖と配列番号79のCD3鎖とを含むDLL3/CD3結合タンパク質、および配列番号75のDLL3鎖と配列番号80のCD3鎖とを含むDLL3/CD3結合タンパク質)の細胞溶解の有効性および効果に違いがないことを示す。有効性および効果が、事前インキュベートしていないサンプル(0時間)と比較して観察された。結果は、DLL3/CD3結合タンパク質で有意な内部移行が生じないことを示唆する。
マウス薬物動態研究
DLL3/CD3結合タンパク質の薬物動態を、C57BL/6マウスにおいて、1mg/kgの単回静脈内投薬の後に評価した。DLL3/CD3結合タンパク質の血清濃度を、DLL3捕捉/CD3検出アッセイを使用して、判定した。
簡単に述べると、雄性C57BL/6マウスに、1mg/kgの単回静脈内(IV)投薬(n=分子当たり3)。血液サンプルを、投薬前、ならびに投薬の0.15時間後、2時間後、8時間後、24時間後、72時間後、96時間後、168時間後、240時間後、および336時間後に採取した。血清薬物レベルを、MSDに基づくリガンド結合アッセイで、捕捉試薬としてビオチン化DLL3および検出試薬としてスルホタグ化CD3を使用して、測定した。薬物動態(PK)パラメーターを、非コンパートメント分析を使用して、血清濃度時間プロファイルから計算した。以下の薬物動態パラメーターを評価した:AUCtlast(時間ゼロから、最後の定量可能時点までの血清濃度−時間曲線下の面積)、AUCinf(無限に外挿された血清濃度−時間曲線下の面積)、CL(全身クリアランス)、Vss(安定状態の体積分布)、ならびに1/2(消失半減期)。
インビボ異種移植片有効性研究
ヒトT細胞で再構成したヒト異種移植片マウスモデルを使用して、有効性研究を行った。詳細に述べると、ヒトSHP77小細胞肺がん細胞(2×107個)を、致死以下で照射した(2Gy、−1日目)雌性NOD.Cg−Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTacマウスの右背面腹部に皮下(s.c.)注射した(1日目)。並行して、ヒトCD3陽性T細胞(健常なヒト血液ドナーから単離した)を、インビトロで増殖させた。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、実施例10に記載されるように調製した。
DLL3/CD3結合タンパク質の単量体含量パーセント
例示的なDLL3/CD3結合タンパク質(配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、または配列番号252のDLL3鎖と配列番号79のCD3鎖とを含むDLL3/CD3結合タンパク質、配列番号75のDLL3鎖と配列番号80のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質、および配列番号75のDLL3鎖と配列番号105のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質)の単量体パーセントを、サイズ排除クロマトグラフィー分析(aSEC)によって判定した(表6に示される)。aSECは、Protein BEH SECカラム200Å、1.7μm、4.6×150mm(カタログ番号186005225)を使用して、Waters(Milfrod、MA、USA)Acquity UPLCシステムにおいて実行した。泳動条件は、次の通りであった:移動相:50mMリン酸ナトリウム、200mMアルギニン、および0.05%アジ化ナトリウム、流速:0.5ml/分、泳動時間:5分間、サンプルローディング量:10μg、ピーク検出:A280nm、自動化クロマトグラム処理方法。
熱安定性
熱安定性を、示差走査熱量測定(DSC)によって判定し、DLL3/CD3結合タンパク質の第1の融解転移(Tm1)の結果を、表7に示す。DSC熱融解は、緩衝液対照と比べた溶液中のタンパク質の熱安定性に関する情報を提供する。20mMクエン酸、115mM NaCl、pH6中の1mg/mlのタンパク質の溶液の熱変性および凝集を、20℃から110℃まで、60℃/時間の走査速度で、自動化キャピラリーDSCによってモニタリングした。
熱安定性
熱安定性を、熱シフト分析(TSA)によって判定し、DLL3/CD3結合タンパク質(配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、または配列番号252のDLL3鎖と配列番号79のCD3鎖とを含むDLL3/CD3結合タンパク質、配列番号75のDLL3鎖と配列番号80のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質、および配列番号75のDLL3鎖と配列番号105のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質)の第1の融解転移(Tm1)の結果を、表7Bに示す。SYPROオレンジ(Invitrogen、Carlsbad、CA)を外来フルオロフォアとして用いてQuantStudio 6 FlexリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、Waltham、MA)を使用して、温度に対する関数としての蛍光強度プロファイルを取得した。サンプルを、10mMヒスチジン、pH6.0中、40mM塩化ナトリウムおよび0.02%アジ化ナトリウムで0.4mg/mlに希釈した。融解曲線を、2℃/分の速度で、25℃から95℃の熱傾斜で生成し、データを、およそ0.4℃ごとに、「ROX」フィルターセット(励起:580±10nm、放出:623±14nm)を通じて取得した。データを、タンパク質熱シフトソフトウェアバージョン1.3(ThermoFisher Scientific、Waltham、MA)を使用して分析した。
Epivaxによるコンピュータでの免疫原性スコアの予測:
配列の免疫原性を、数学的アルゴリズムを用いてコンピュータで評価した。具体的には、免疫原性スコアの尺度として、DLL3/CD3結合タンパク質(配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、または配列番号252のDLL3鎖と配列番号79のCD3鎖とを含むDLL3/CD3結合タンパク質、配列番号75のDLL3鎖と配列番号80のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質、および配列番号75のDLL3鎖と配列番号105のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質)のEpiMatrix Treg調整済みスコア(EpiVax Inc.、Providence RI))を判定し、様々なFc配列のスコアと比較した。これらのスコアは、T細胞エピトープおよびTregエピトープを考慮に入れる。免疫原性スコアが低いほど、配列が免疫原性である可能性が低い。一般に、負のスコアは、免疫原性のリスクが低いと考えられ、一方で高度に正のスコアは、免疫原性の可能性を示すと解釈される。以下の表に示されるように、本明細書に記載されるDLL3/CD3結合タンパク質は、非常に低い免疫原性スコアを示し、免疫原性であるリスクが、これらの結合タンパク質については低いことを示す。
表面への非特異的結合
本発明のDLL3/CD3結合タンパク質の特異性を、高度に荷電したタンパク質を使用して、SPRに基づくアッセイにおいてさらに試験した。バイオセンサー技術を使用して、結合タンパク質が無関係の荷電タンパク質に対して有意な結合を有するかどうかを判定するための非特異的結合アッセイを開発した。このアッセイにおいて、DLL3/CD3結合タンパク質を、一方が負に荷電したタンパク質(トリプシン阻害剤)をコーティングし、一方が正に荷電したタンパク質(リゾチーム)をコーティングした、2つのSPR表面を通過させた。タンパク質が、これらの表面に対して有意な非特異的結合を示す場合、候補物上の正または負に荷電した表面パッチの存在が結合の原因である可能性が高い。タンパク質の非特異的結合は、薬物動態(PK)および生体分布の不良と解釈され得、下流の製造可能性の影響も有し得る。
実験を、Biacore T200において行った。希釈、表面調製、および結合実験を、10倍HBS−EPから調製した1倍HBS−EP緩衝液において、25℃で行った。固定化プロトコールおよび結合実験のいずれについても、流速は、5μL/分であった。
サンプルを、1倍HBS−EP緩衝液中、1μMで調製した。サンプルを、10分間の会合および10分間の解離で、活性化表面上に注射した。データは、Biacore T200コントロールソフトウェアバージョン2.0.1を使用して収集し、Biacore T200評価ソフトウェアバージョン3.0を使用して分析した。
表面への非特異的結合
DLL3/CD3結合タンパク質(配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、または配列番号252のDLL3鎖と配列番号79のCD3鎖とを含むDLL3/CD3結合タンパク質、配列番号75のDLL3鎖と配列番号80のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質、および配列番号75のDLL3鎖と配列番号105のCD3鎖とを含むDLL3結合タンパク質)の特異性を、実施例17aに記載されるように、10分間の会合および15分間の解離で、高度に荷電したタンパク質を使用してSPRに基づくアッセイにおいてさらに試験した。結果を、表10Bに示す。
DLL3陽性およびDLL3陰性腫瘍細胞の存在下における溶解、T細胞活性化、T細胞脱顆粒化、T細胞増殖、およびサイトカイン分泌の誘導
PBMCを、実施例9に記載されるように精製した。T細胞活性化、T細胞脱顆粒化、およびサイトカイン分泌を判定するために、PBMCおよびDLL3陽性SHP77またはDLL3陰性RKO−E6細胞を標的細胞として用いた細胞毒性アッセイを、実施例10Bに記載されるように、設定した。T細胞をヒトSHP77またはRKO−E6細胞へと再指向させることによる細胞溶解の有効性を、実施例10Aに記載されるように、判定した。T細胞活性化およびT細胞脱顆粒化を判定するために、細胞を、遠心分離し、CD4(BD、番号550630)、CD8(BD、番号557834)、CD25(BD、番号340907)に対する抗体で染色し、続いて、細胞を、固定/透過処理溶液(BD、番号554714)を使用して透過処理し、パーフォリン(BioLegend、番号308120)およびグランザイムB(BD、番号560221)に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって測定した。上清中のサイトカインレベルを、U−PLEX Biomarker Group 1(hu)アッセイ(MSD、番号K15067L−2、キット)によって判定した。
T細胞の増殖を判定するために、PBMCを、5μMのCell Trace(商標)CFSE(Invitrogen、C34554)で標識し、T細胞を、抗CD3抗体(BioLegendカタログ番号:317336)で染色した。続いて、標識したPBMCを、10:1の比のSHP77またはRKO−E6細胞、ならびに漸増濃度のDLL3/CD3結合タンパク質とともに、6日間インキュベートした。
図11〜15は、SHP77またはRO−E6細胞ならびにDLL3/CD3結合タンパク質の存在下における、T細胞再指向によるSHP77またはRKO−E6細胞の溶解の誘導(図11)、および用量依存的T細胞活性化の誘導(図12)、T細胞脱顆粒化(図)、サイトカインの分泌(図14A:インターフェロンガンマ、14B:MCP−1)、ならびにT細胞の増殖(図15)を示す。
T細胞サブセットのSHP77細胞への再指向
PBMCを、実施例10aに記載されるように単離した。続いて、T細胞サブセットを、以下の試薬およびプロトコールを使用して単離した。
図16〜20は、DLL3/CD3結合タンパク質による、パンT細胞(図16)、ナイーブT細胞(図16)、CD4+T細胞(図17、18)、CD4+エフェクターメモリーT細胞(図18)、CD4+セントラルメモリーT細胞(図17)、CD8+T細胞(図19、20)、CD8+CD45RA+エフェクターT細胞(図19)、CD8+メモリーT細胞(図20)の、ヒトSHP77細胞への再指向の有効性を示す。
例示的なDLL3/CD3結合タンパク質によるSHP77異種移植片腫瘍組織へのT細胞浸潤
実施例13に記載される研究におけるマウスに由来する残りの腫瘍組織を調製し、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。続いて、組織切片を調製し、T細胞上のCD3発現について染色した(2GV6 Ventana)。例示的なDLL3/CD3結合タンパク質によるSHP77異種移植片腫瘍組織へのT細胞浸潤を、図21に示す。表12におけるスコア付けを使用して、異種移植片腫瘍組織におけるCD3発現を定量した。
抗DLL3抗体の産生
抗DLL3結合物質を得るために、DLL3免疫付与野生型およびAlivaMabヒト化マウス(Ablexis、San Francisco、CA、USA、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いたAlivaMabトランスジェニックマウスプラットフォーム)に由来するハイブリドーマまたは単一B細胞を、インビトロで培養した。上清を、AlphaLISA(PerkinElmer、Waltham、MA、USA)によって組換えヒトDLL3に対する反応性についてスクリーニングし、フローサイトメトリーによってヒトDLL3を発現するSHP−77細胞(ATCC(登録商標)、CRL−2195TM)に対する反応性についてスクリーニングした。
この手法を使用して、DLL3に対する特異性を有する結合ドメインをコードするIg VHおよびVL遺伝子の対を、調製した。CHO−E37細胞に、対応する重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトすることによって、組換え抗体を産生させた。
発現された組換え抗体を含有する上清を、ヒトDLL3を発現する細胞株への結合について、フローサイトメトリーによってアッセイした。簡単に述べると、細胞を、組換え上清とともにインキュベートし、洗浄し、上清から結合したmAbを、抗ヒトIgG−APC(Jackson ImmunoResearch 109−136−098)を用いて検出した。シグナル対バックグラウンド比(S/B)は、サンプルの蛍光強度中央値(MFI)を、アイソタイプ対照のもので除すことによって、計算した。
目的のクローン(300pMを下回るKdを有する)を、選択し、以下に記載される様々な検出アッセイにおいてさらに評価した。
抗DLL3抗体の組換えヒトDLL3タンパク質への結合
抗体の結合を、ELISAにおいて行った。簡単に述べると、抗DLL3抗体を、4℃で一晩、2μg/mlの濃度でコーティングした。プレートを洗浄した後、室温で1時間、ブロッキング緩衝液(Gibco、Gibco番号043−90309A)でブロッキングし、続いて、洗浄し、漸増濃度の組換えDLL3タンパク質とともにインキュベートした。検出のために、結合したDLL3タンパク質を、ポリクローナル抗DLL3抗体(R&D Systems、AB4315)とともにインキュベートし、続いて、SULFO−TAG標識化抗ヤギ抗体(R32AG−1)とともに1時間インキュベートした。結合した抗体を、Sectorイメージャー6000(MSD)においてRead Buffer(MSD)を使用して定量した。図22は、3つの例示的な抗DLL3抗体の組換えタンパク質への結合を示す。膜近傍ペプチドドメインを標的とする抗DLL3抗体(DLL3#3)は、EGF4(DLL3#4)またはEGF1ドメイン(DLL3#5)を標的とする抗DLL3抗体と比較して、組換えDLL3タンパク質への強力な結合を示す。
抗DLL3抗体のSCLC細胞株への結合
細胞(T細胞またはヒトSCLC細胞)を、漸増濃度のFACS緩衝液(PBS/0.5%BSA/0.05%アジ化ナトリウム)中の漸増濃度の抗DLL3抗体で染色した。結合した分子を、FACS分析によってPEにコンジュゲートした抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research、115−116−072)で検出した。DSL(DLL3#6)、EGF1(DLL3#5)、またはEGF4(DLL3#4)ドメインを標的とする抗DLL3抗体は、図23に示されるように、C末端ペプチドを標的とする抗DLL3抗体(DLL3#1、DLL3#2、DLL3#3)よりも、DLL3を発現するSCLC細胞株への効力な結合を示す。
(IHC)
抗DLL3抗体を、20μg/mlの濃度で、Ventana Discovery ultra(Ventana Medical Systems, Inc、Arizona)を製造業者の説明書に従って使用して、DLL3 mRNA陽性SCLCサンプルにおいて試験した。簡単に述べると、IHCを、抗DLL3抗体で染色したホルマリン固定パラフィン包埋組織および切片(4μm)に行った。IHCアッセイを、RUO Discovery Universalプロトコールを使用して、Ventana Discovery Ultraプラットフォームで行った。抗DLL3抗体染色は、12分間、エピトープ賦活剤としてプロテイナーゼKを使用して最適化させた。抗DLL3抗体を、60分間インキュベートした後、抗マウスHQ検出システムおよび抗HQ HRPとともにいずれも12分間インキュベートした。陰性対照(IgG抗体)は、それぞれの組織切片に対して行い、試験スライドと同じように処理した。
ヒトSCLC細胞株SHP77を、陽性対照として使用した。全組織切片のデジタル画像を、Leica SCN400組織学スキャナー(Leica Microsystems、Milton Keynes、UK)を使用して取得した。
例示的な抗DLL3抗体を用いたヒトSCLCサンプルの免疫組織化学的分析を、図24に示す。
SCLC細胞株における発現レベルの判定
抗DLL3抗体の細胞表面発現を、QIFIKIT(K0078、Dako)を使用して定量した。簡単に述べると、SCLC細胞株(SHP77、NCI−H82、およびNCI−H2286)を、抗DLL3抗体(DL309、国際公開第2011/093097号)または無関係の抗体(アイソタイプ対照)で、5μg/mlで標識した。別個のバイアルにおいて。続いて、細胞およびキットに提供されているビーズを、並行して、フルオレセインをコンジュゲートした抗マウス二次抗体で標識した。サンプルを、BD CantoII Fluorocytometerにおいて測定したが、結果的に、蛍光は、細胞およびビーズ上に結合した抗DLL3抗体の数と相関する。表12は、3つのSCLC細胞株の細胞表面上に発現されるDLL3分子を示す。
SCLC細胞株ブロックにおけるIHCプロトコールの感度の判定
IHCプロトコールの感度を評価するために、SCLC細胞株(SHP77、NCI−H82、およびNCI−H2286)を、病院における組織のように処理し、ホルマリンに固定し、続いて、パラフィンに包埋した。
Claims (47)
- DLL3に特異的に結合する第1の抗原結合ユニットと、CD3に特異的に結合する第2の抗原結合ユニットとを含むタンパク質であって、DLL3に特異的に結合する前記第1の抗原結合ユニットが、i)〜xviii):
i)配列番号1(CDR1)、配列番号2(CDR2)、および配列番号3(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号4(CDR1)、配列番号5(CDR2)、および配列番号6(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
ii)配列番号7(CDR1)、配列番号8(CDR2)、および配列番号9(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号10(CDR1)、配列番号11(CDR2)、および配列番号12(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
iii)配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号16(CDR1)、配列番号17(CDR2)、および配列番号18(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
iv)配列番号19(CDR1)、配列番号20(CDR2)、および配列番号21(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号22(CDR1)、配列番号23(CDR2)、および配列番号24(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
v)配列番号25(CDR1)、配列番号26(CDR2)、および配列番号27(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号28(CDR1)、配列番号29(CDR2)、および配列番号30(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
vi)配列番号31(CDR1)、配列番号32(CDR2)、および配列番号33(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号34(CDR1)、配列番号35(CDR2)、および配列番号36(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
vii)配列番号133(CDR1)、配列番号134(CDR2)、および配列番号135(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号136(CDR1)、配列番号137(CDR2)、および配列番号138(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
viii)配列番号139(CDR1)、配列番号140(CDR2)、および配列番号141(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号142(CDR1)、配列番号143(CDR2)、および配列番号144(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
ix)配列番号145(CDR1)、配列番号146(CDR2)、および配列番号147(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号148(CDR1)、配列番号149(CDR2)、および配列番号150(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
x)配列番号151(CDR1)、配列番号152(CDR2)、および配列番号153(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号154(CDR1)、配列番号155(CDR2)、および配列番号156(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xi)配列番号157(CDR1)、配列番号158(CDR2)、および配列番号159(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号160(CDR1)、配列番号161(CDR2)、および配列番号162(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xii)配列番号163(CDR1)、配列番号164(CDR2)、および配列番号165(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号166(CDR1)、配列番号167(CDR2)、および配列番号168(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xiii)配列番号169(CDR1)、配列番号170(CDR2)、および配列番号171(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号172(CDR1)、配列番号173(CDR2)、および配列番号174(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xiv)配列番号175(CDR1)、配列番号176(CDR2)、および配列番号177(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号178(CDR1)、配列番号179(CDR2)、および配列番号180(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xv)配列番号181(CDR1)、配列番号182(CDR2)、および配列番号183(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号184(CDR1)、配列番号185(CDR2)、および配列番号186(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xvi)配列番号187(CDR1)、配列番号188(CDR2)、および配列番号189(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号190(CDR1)、配列番号191(CDR2)、および配列番号192(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
xvii)配列番号193(CDR1)、配列番号194(CDR2)、および配列番号195(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号196(CDR1)、配列番号197(CDR2)、および配列番号198(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、ならびに
xviii)配列番号199(CDR1)、配列番号200(CDR2)、および配列番号201(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号202(CDR1)、配列番号203(CDR2)、および配列番号204(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、タンパク質。 - DLL3に特異的に結合する前記第1の抗原結合ユニットが、第1の軽鎖可変ドメインおよび第1の重鎖可変ドメインを含み、i)〜xviii):
i)配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ii)配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
iii)配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
iv)配列番号43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
v)配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
vi)配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
vii)配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
viii)配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ix)配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
x)配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xi)配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号214のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xii)配列番号215のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号216のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xiii)配列番号217のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号218のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xiv)配列番号219のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号220のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xv)配列番号221のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号222のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xvi)配列番号223のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号224のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
xvii)配列番号225のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号226のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、ならびに
xviii)配列番号227のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号228のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、請求項1に記載のタンパク質。 - CD3に特異的に結合する前記第2の抗原結合ユニットが、i)〜iii):
i)配列番号55(CDR1)、配列番号56(CDR2)、および配列番号57(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号58(CDR1)、配列番号59(CDR2)、および配列番号60(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、
ii)配列番号61(CDR1)、配列番号62(CDR2)、および配列番号63(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号64(CDR1)、配列番号65(CDR2)、および配列番号66(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット、ならびに
iii)配列番号96(CDR1)、配列番号97(CDR2)、および配列番号98(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号99(CDR1)、配列番号100(CDR2)、および配列番号101(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDRを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、請求項1または2に記載のタンパク質。 - CD3に特異的に結合する前記第2の抗原結合ユニットが、i)〜iii):
i)配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号68のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、
ii)配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号70のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット、ならびに
iii)配列番号102のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、抗原結合ユニット
からなる群から選択される、第2の軽鎖可変ドメインおよび第2の重鎖可変ドメインを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質。 - i)DLL3に特異的に結合する前記第1の抗原結合ユニットが、そのNからC末端へ、第1の軽鎖可変ドメイン、第1の軽鎖定常ドメイン、第1のペプチドリンカー、第1の重鎖可変ドメイン、および第1の重鎖定常CH1ドメインを含み、
ii)CD3に特異的に結合する前記第2の抗原結合ユニットが、そのNからC末端へ、第2の軽鎖可変ドメイン、第2の軽鎖定常ドメイン、第2のペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、および第2の重鎖定常CH1ドメインを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 前記第1および/または第2のペプチドリンカーが、26〜42個のアミノ酸、好ましくは30〜40個のアミノ酸、34〜40個のアミノ酸、または36〜39個のアミノ酸のうちのいずれか1つ、より好ましくは38個のアミノ酸を含む、請求項5に記載のタンパク質。
- 前記第1のリンカーおよび/または第2のリンカーが、Gly−Serリンカーであり、好ましくは、配列番号89のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、前記第1および第2のペプチドリンカーが、同じ配列を含む、請求項5または6に記載のタンパク質。
- 第1および第2のFcドメインをさらに含み、前記第1のFcドメインが、前記第1の抗原結合ユニットに共有結合により連結されており、前記第2のFcドメインが、前記第2の抗原結合ユニットに共有結合により連結されている、請求項5〜7のいずれか1項に記載のタンパク質。
- i)前記第1のFcドメインが、366位にチロシン(Y)[T366Y]を含み、前記第2のFcドメインが、407位にスレオニン(T)[Y407T]を含むか、または
ii)前記第1のFcドメインが、366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、前記第2のFcドメインが、366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、および407位にバリン(V)[Y407V]を含むか、または
iii)前記第2のFcドメインが、366位にチロシン(Y)[T366Y]を含み、前記第1のFcドメインが、407位にスレオニン(T)[Y407T]を含むか、または
iv)前記第2のFcドメインが、366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、前記第1のFcドメインが、366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、および407位にバリン(V)[Y407V]を含み、
好ましくは、前記第1または前記第2のFcドメインが、435位にアルギニン[H435R]および436位にフェニルアラニン[Y436F]をさらに含む、請求項8に記載のタンパク質。 - 前記第1および/または前記第2のFcドメインが、234位にアラニン[L234A]および235位にアラニン[L235A]をさらに含む、請求項9に記載のタンパク質。
- 前記第1の軽鎖定常ドメインおよび前記第2の軽鎖定常ドメインが、ヒトカッパまたはラムダドメインを含む、請求項5〜10のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号241、配列番号242、配列番号243、配列番号244、配列番号245、配列番号246、配列番号247、配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251、および配列番号252からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、DLL3に特異的に結合する第1のポリペプチド鎖と、配列番号79、配列番号80、または配列番号105のアミノ酸配列を含む、CD3に特異的に結合する第2のポリペプチド鎖とを含む、タンパク質。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質の前記第1の抗原結合ユニットおよび/または前記第2の抗原結合ユニットをコードし、第1および/または第2のFcドメインをさらにコードしてもよい、単離された核酸分子。
- 請求項12に記載の第1および/または第2のポリペプチド鎖をコードする、単離された核酸分子。
- 請求項13または14に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
- 請求項15に記載の発現ベクターがトランスフェクトされた、宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質を製造する方法であって、
i)請求項16に記載の宿主細胞を、請求項1〜12のいずれか1項に記載のタンパク質の発現を可能にする条件下において培養するステップと、
ii)前記タンパク質を回収するステップと
を含み、
iii)さらに、前記タンパク質を精製および/または修飾および/または製剤化するステップ
を含んでもよい、方法。 - DLL3に特異的に結合する第1のポリペプチド鎖と、CD3に特異的に結合する第2のポリペプチド鎖とを含む、タンパク質であって、前記第1のポリペプチド鎖が、第1の軽鎖、第1のリンカー、および第1の重鎖を含み、前記第2のポリペプチド鎖が、第2の軽鎖、第2のリンカー、および第2の重鎖を含み、好ましくは、前記第1の軽鎖のC末端が、前記第1のペプチドリンカーを介して、前記第1の重鎖のN末端に共有結合により連結されており、前記第2の軽鎖のC末端が、前記第2のペプチドリンカーを介して、前記第2の重鎖のN末端に共有結合により連結されている、タンパク質。
- DLL3に特異的に結合する前記第1のポリペプチド鎖が、i)〜xviii):
i)配列番号1(CDR1)、配列番号2(CDR2)、および配列番号3(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号4(CDR1)、配列番号5(CDR2)、および配列番号6(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
ii)配列番号7(CDR1)、配列番号8(CDR2)、および配列番号9(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号10(CDR1)、配列番号11(CDR2)、および配列番号12(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
iii)配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号16(CDR1)、配列番号17(CDR2)、および配列番号18(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
iv)配列番号19(CDR1)、配列番号20(CDR2)、および配列番号21(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号22(CDR1)、配列番号23(CDR2)、および配列番号24(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
v)配列番号25(CDR1)、配列番号26(CDR2)、および配列番号27(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号28(CDR1)、配列番号29(CDR2)、および配列番号30(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
vi)配列番号31(CDR1)、配列番号32(CDR2)、および配列番号33(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号34(CDR1)、配列番号35(CDR2)、および配列番号36(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
vii)配列番号133(CDR1)、配列番号134(CDR2)、および配列番号135(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号136(CDR1)、配列番号137(CDR2)、および配列番号138(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
viii)配列番号139(CDR1)、配列番号140(CDR2)、および配列番号141(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号142(CDR1)、配列番号143(CDR2)、および配列番号144(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
ix)配列番号145(CDR1)、配列番号146(CDR2)、および配列番号147(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号148(CDR1)、配列番号149(CDR2)、および配列番号150(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
x)配列番号151(CDR1)、配列番号152(CDR2)、および配列番号153(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号154(CDR1)、配列番号155(CDR2)、および配列番号156(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xi)配列番号157(CDR1)、配列番号158(CDR2)、および配列番号159(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号160(CDR1)、配列番号161(CDR2)、および配列番号162(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xii)配列番号163(CDR1)、配列番号164(CDR2)、および配列番号165(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号166(CDR1)、配列番号167(CDR2)、および配列番号168(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xiii)配列番号169(CDR1)、配列番号170(CDR2)、および配列番号171(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号172(CDR1)、配列番号173(CDR2)、および配列番号174(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
配列番号175(CDR1)、配列番号176(CDR2)、および配列番号177(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号178(CDR1)、配列番号179(CDR2)、および配列番号180(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xiv)配列番号181(CDR1)、配列番号182(CDR2)、および配列番号183(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号184(CDR1)、配列番号185(CDR2)、および配列番号186(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xv)配列番号187(CDR1)、配列番号188(CDR2)、および配列番号189(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号190(CDR1)、配列番号191(CDR2)、および配列番号192(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
xvi)配列番号193(CDR1)、配列番号194(CDR2)、および配列番号195(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号196(CDR1)、配列番号197(CDR2)、および配列番号198(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、ならびに
xvii)配列番号199(CDR1)、配列番号200(CDR2)、および配列番号201(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号202(CDR1)、配列番号203(CDR2)、および配列番号204(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR
からなる群から選択されるCDR配列を含む、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む、請求項18に記載のタンパク質。 - CD3に特異的に結合する前記第2のポリペプチド鎖が、i)〜iii):
i)配列番号55(CDR1)、配列番号56(CDR2)、および配列番号57(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号58(CDR1)、配列番号59(CDR2)、および配列番号60(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、
ii)配列番号61(CDR1)、配列番号62(CDR2)、および配列番号63(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号64(CDR1)、配列番号65(CDR2)、および配列番号66(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、ならびに
iii)配列番号96(CDR1)、配列番号97(CDR2)、および配列番号98(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号99(CDR1)、配列番号100(CDR2)、および配列番号101(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR
からなる群から選択されるCDR配列を含む、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む、請求項18または19に記載のタンパク質。 - DLL3に特異的に結合する前記第1のポリペプチド鎖が、i)〜xviii):
i)配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号38のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ii)配列番号39のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号40のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
iii)配列番号41のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号42のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
iv)配列番号43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号44のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
v)配列番号45のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号46のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
vi)配列番号47のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号48のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
vii)配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号206のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
viii)配列番号207のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号208のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ix)配列番号209のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号210のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
x)配列番号211のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号212のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
xi)配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号214のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
xii)配列番号215のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号216のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
xiii)配列番号217のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号218のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
xiv)配列番号219のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号220のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
xv)配列番号221のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号222のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
xvi)配列番号223のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号224のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
xvii)配列番号225のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号226のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
xviii)配列番号227のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号228のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
からなる群から選択される軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む、請求項18〜20のいずれか1項に記載のタンパク質。 - CD3に特異的に結合する前記第2のポリペプチド鎖が、i)〜iii):
i)配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号68のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
ii)配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号70のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
iii)配列番号102のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
からなる群から選択される軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む、請求項19〜22のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 前記第1および/または第2のペプチドリンカーが、26〜42個のアミノ酸、好ましくは30〜40個のアミノ酸、34〜40個のアミノ酸、または36〜39個のアミノ酸のうちのいずれか1つ、より好ましくは38個のアミノ酸を含む、請求項18〜22のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記第1のリンカーおよび/または第2のリンカーが、Gly−Serリンカーであり、好ましくは、配列番号89のアミノ酸配列を含み、より好ましくは、前記第1および第2のペプチドリンカーが、同じ配列を含む、請求項23に記載のタンパク質。
- i)前記第1の重鎖が、366位にチロシン(Y)[T366Y]を含み、前記第2の重鎖が、407位にスレオニン(T)[Y407T]を含むか、または
ii)前記第1の重鎖が、366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、前記第2の重鎖が、366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、および407位にバリン(V)[Y407V]を含むか、または
iii)前記第2の重鎖が、366位にチロシン(Y)[T366Y]を含み、前記第1の重鎖が、407位にスレオニン(T)[Y407T]を含むか、または
iv)前記第2の重鎖が、366位にトリプトファン(W)[T366W]を含み、前記第1の重鎖が、366位にセリン(S)[T366S]、368位にアラニン(A)[L368A]、および407位にバリン(V)[Y407V]を含み、
好ましくは、前記第1または前記第2の重鎖が、435位にアルギニン[H435R]および436位にフェニルアラニン[Y436F]をさらに含む、請求項18〜24のいずれか1項に記載のタンパク質。 - 前記第1および/または前記第2の重鎖が、234位にアラニン[L234A]および235位にアラニン[L235A]をさらに含む、請求項25に記載のタンパク質。
- 前記第1の軽鎖および前記第2の軽鎖が、ヒトカッパまたはラムダドメインを含む、請求項18〜26のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 医薬において使用するための、請求項1〜12または18〜27のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜12または18〜27のいずれか1項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- がんを処置する方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の、請求項1〜12または18〜27のいずれか1項に記載のタンパク質を投与するステップを含む、方法。
- がんを処置するための医薬組成物を調製するための、請求項1〜12または18〜27のいずれか1項に記載のタンパク質の使用。
- がんを処置する方法において使用するための、請求項1〜12または18〜27のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記がんが、DLL3を発現する腫瘍であり、好ましくは、前記がんが、SCLC、神経膠芽腫、またはDLL3を発現する神経内分泌腫瘍である、請求項30に記載の方法、請求項31に記載の使用、または請求項32に記載の使用のためのタンパク質。
- 前記タンパク質が、化学療法剤、血管新生を阻害する治療的に活性な化合物、シグナル伝達経路阻害剤、EGFR阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、またはホルモン療法剤と組み合わせて使用される、請求項30もしくは33に記載の方法、請求項31もしくは33に記載の使用、または請求項32もしくは33に記載の使用のためのタンパク質。
- 前記タンパク質が、免疫チェックポイント阻害剤、好ましくは、抗PD−1抗体または抗PD−L1抗体と組み合わされる、請求項34に記載の方法、使用、または使用のためのタンパク質。
- 前記抗PD−1抗体が、PD1−1、PD1−2、PD1−3、PD1−4、およびPD1−5からなる群から選択される、請求項35に記載の方法、使用、または使用のためのタンパク質。
- 抗DLL3抗体分子であって、
i)配列番号1(CDR1)、配列番号2(CDR2)、および配列番号3(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号4(CDR1)、配列番号5(CDR2)、および配列番号6(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
ii)配列番号7(CDR1)、配列番号8(CDR2)、および配列番号9(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号10(CDR1)、配列番号11(CDR2)、および配列番号12(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
iii)配列番号13(CDR1)、配列番号14(CDR2)、および配列番号15(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号16(CDR1)、配列番号17(CDR2)、および配列番号18(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
iv)配列番号19(CDR1)、配列番号20(CDR2)、および配列番号21(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号22(CDR1)、配列番号23(CDR2)、および配列番号24(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
v)配列番号25(CDR1)、配列番号26(CDR2)、および配列番号27(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号28(CDR1)、配列番号29(CDR2)、および配列番号30(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
vi)配列番号31(CDR1)、配列番号32(CDR2)、および配列番号33(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号34(CDR1)、配列番号35(CDR2)、および配列番号36(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
vii)配列番号133(CDR1)、配列番号134(CDR2)、および配列番号135(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号136(CDR1)、配列番号137(CDR2)、および配列番号138(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
viii)配列番号139(CDR1)、配列番号140(CDR2)、および配列番号141(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号142(CDR1)、配列番号143(CDR2)、および配列番号144(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
ix)配列番号145(CDR1)、配列番号146(CDR2)、および配列番号147(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号148(CDR1)、配列番号149(CDR2)、および配列番号150(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
x)配列番号151(CDR1)、配列番号152(CDR2)、および配列番号153(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号154(CDR1)、配列番号155(CDR2)、および配列番号156(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xi)配列番号157(CDR1)、配列番号158(CDR2)、および配列番号159(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号160(CDR1)、配列番号161(CDR2)、および配列番号162(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xii)配列番号163(CDR1)、配列番号164(CDR2)、および配列番号165(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号166(CDR1)、配列番号167(CDR2)、および配列番号168(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xiii)配列番号169(CDR1)、配列番号170(CDR2)、および配列番号171(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号172(CDR1)、配列番号173(CDR2)、および配列番号174(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xiv)配列番号175(CDR1)、配列番号176(CDR2)、および配列番号177(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号178(CDR1)、配列番号179(CDR2)、および配列番号180(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xv)配列番号181(CDR1)、配列番号182(CDR2)、および配列番号183(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号184(CDR1)、配列番号185(CDR2)、および配列番号186(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xvi)配列番号187(CDR1)、配列番号188(CDR2)、および配列番号189(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号190(CDR1)、配列番号191(CDR2)、および配列番号192(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xvii)配列番号193(CDR1)、配列番号194(CDR2)、および配列番号195(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号196(CDR1)、配列番号197(CDR2)、および配列番号198(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR、または
xviii)配列番号199(CDR1)、配列番号200(CDR2)、および配列番号201(CDR3)のアミノ酸配列を含む、軽鎖CDR、ならびに配列番号202(CDR1)、配列番号203(CDR2)、および配列番号204(CDR3)のアミノ酸配列を含む、重鎖CDR
を含む、抗DLL3抗体分子。 - 前記抗体分子が、モノクローナル、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体分子である、請求項37に記載の抗DLL3抗体分子。
- 前記抗体分子が、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv、またはscFvである、請求項37または38に記載の抗DLL3抗体分子。
- 前記重鎖定常領域が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、およびIgE定常領域からなる群から選択される、請求項37〜39のいずれか1項に記載の抗DLL3抗体分子。
- 前記軽鎖定常領域が、カッパまたはラムダである、請求項37〜40のいずれか1項に記載の抗DLL3抗体分子。
- 生物学的サンプル中のDLL3を検出する方法であって、
(a)前記サンプルを、請求項37〜41のいずれか1項に記載の抗DLL3抗体と接触させるステップと、
(b)前記サンプル中で、抗体−抗原複合体を形成させるステップと、
(c)前記抗DLL3抗体を検出するステップと
を含む、方法。 - 前記抗DLL3抗体が、検出可能なシグナルによって検出され、好ましくは、前記シグナルが、免疫細胞化学法(ICC)、免疫組織化学法(IHC)、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、および/またはELISAによって検出される、請求項42に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、組織サンプル、好ましくは、固定組織サンプルであり、より好ましくは、ホルマリンで固定しパラフィン包埋処理した組織サンプルである、請求項42または43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗DLL3抗体が、IHCによって検出される、請求項44に記載の方法。
- 前記組織サンプルが、腫瘍組織サンプルであり、より好ましくは、SCLC、LCNEC、神経膠腫、神経膠芽腫、黒色腫、または他の神経内分泌腫瘍からなる群から選択される腫瘍から単離された腫瘍組織サンプルである、請求項42〜45のいずれか1項に記載の方法。
- DLL3を検出するためのキットであって、請求項37〜41のいずれか1項に記載の抗体と、使用のための説明書とを含む、キット。
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