JP2016513094A - Ｄｌｌ３結合試薬を含む治療薬及び診断薬の癌標的 - Google Patents

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Abstract

本開示は、癌（例えば肺癌、膵臓癌及び皮膚癌）の治療、スクリーニング、診断及び予後のための、癌（例えば肺癌、膵臓癌及び皮膚癌）治療の有効性の監視のための、薬の開発のための方法並びに組成物を提供する。【選択図】図２

Description

本発明は、癌（例えば肺癌、膵臓癌及び／又は皮膚癌）関連膜タンパク質の同定に関し、前記タンパク質は癌治療のための治療薬標的として又は癌マーカーとして有用である。特に、前記タンパク質は典型的な生物学的標的であり、前記標的に対して治療薬抗体を含む親和性試薬又は他の医薬製剤を製造できる。本発明はまた、癌の治療及び／又は診断のためにそのようは親和性試薬を使用することに関する。
癌（例えば肺癌、膵臓癌及び皮膚癌）治療における主要な目標は、早期発見率の向上、疾患進行の追跡及び再発認定に用いることができる新規な非侵襲性マーカーの発見、及び（特に5年生存がなお稀であるようなさらに進行した疾患のための）改善された低傷害性療法の発見である。癌細胞に対しより特異的である標的を同定することが強く求められている。前記標的は、例えば腫瘍細胞の表面で発現され、したがって有望な新規アプローチ（例えば免疫療法薬及び標的攻撃毒素）によって攻撃できる標的である。
デルタ様タンパク質3はI型膜タンパク質であり、デルタファミリーのメンバーである。本発明者はデルタ様タンパク質が癌で発現されることを示し、患者（癌を罹患する患者を含む）のデルタ様タンパク質3を対象とする親和性依拠療法は治療的効果を有するであろうと提唱した。
本発明は、多様な疾患（例えば肺癌、膵臓癌及び皮膚癌（以後‘本発明の疾患と称する’））組織の膜抽出物におけるデルタ様タンパク質3（以後DLL3と称する）の検出を開示する。
多様な癌におけるDLL3の弁別的発現は、そのような癌に対して親和性試薬（例えば抗体）依拠療法を用いて前記タンパク質を標的攻撃することを可能にする。したがって、DLL3内のエピトープと特異的に結合する親和性試薬（抗体を含む）の作出にDLL3を用いることができ、治療の根幹であるそのような親和性試薬によってDLL3を標的攻撃することができる。癌細胞の細胞表面のタンパク質を標的とする親和性試薬（抗体を含む）は、以下を含む多様なメカニズムにより癌の治療で利用することができる：（i）補体媒介又は抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）による溶解、（ii）そのような親和性試薬と複合化させた薬又は毒素による溶解、又は（iii）そのようなタンパク質(癌細胞の増殖を駆動する可能性がある)の生理学的機能の阻害(例えばシグナリング経路を介する)。そのような親和性試薬依拠療法の重要な特徴は、当該タンパク質標的の組織分布及び発現レベルに関して正常な発現プロフィールは、正常組織上の当該タンパク質標的の当該抗体による標的攻撃が正常組織との結合により有害な副作用を全く生じないようなプロフィールであるということである。
本発明は、癌（前記癌でDLL3が発現される）を治療又は予防する方法を提供し、前記方法は、その必要がある対象に、DLL3と結合する親和性試薬の治療的に有効な量を投与する工程を含む。
前記癌は好ましくは本発明の疾患の1つである。
本発明はまた、癌の治療又は予防で使用される、DLL3と結合する親和性試薬を提供し、好ましくは、前記癌は本発明の疾患の1つである。
本発明はまた、癌の治療用又は予防用医薬の製造における、DLL3と結合する親和性試薬の使用を提供し、好ましくは、前記癌は本発明の疾患の1つである。
本発明で使用される親和性試薬は、好ましくはDLL3と特異的に結合する。
親和性試薬は、抗体、例えば全抗体若しくはその機能的フラグメント又は抗体模倣物であり得る。好ましくは抗体に含まれる親和性試薬は例えばモノクローナル抗体である。
親和性試薬は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、脱フコシル化抗体又は二重特異性抗体であり得る。
機能的抗体フラグメントには、ユニボディ（UniBody）、ドメイン抗体又はナノボディが含まれる。
抗体模倣物には、アフィボディ（Affibody）、DARPin、アンチカリン（Anticalin）、アビマー（Avimer）、バーサボディ（Versabody）又はデュオカリン（Duocalin）が含まれる。
本発明で使用される親和性試薬は、治療薬部分を含むか又は治療薬部分と複合化させることができる。治療薬部分は例えば細胞傷害性部分又は放射性同位元素である。親和性試薬は抗体複合化物又は免疫複合化物であり得る。
親和性試薬は抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）を誘引することができるか、又は補体依存細胞傷害（CDC）を誘引することができる。親和性試薬は、癌細胞のアポトーシスを誘発するか、癌幹細胞を殺滅するか若しくはその数を減少させるか、及び／又は循環癌細胞を殺滅するか若しくはその数を減少させることができる。親和性試薬は、DLL3の生理学的機能を調整するか、DLL3とのリガンド結合を阻害するか、及び／又はDLL3によって媒介されるシグナルトランスダクション経路を阻害することができる。
また別の実施態様では、本発明はまた、癌（前記癌ではDLL3が発現される）を治療又は予防する方法を提供し、前記方法は、DLL3をコードする核酸とハイブリダイズすることができるハイブリダイズ作用因子の治療的に有効な量をその必要がある対象に投与する工程を含む。
本発明はまた、癌の治療又は予防に使用される、DLL3をコードする核酸とハイブリダイズすることができるハイブリダイズ作用因子を提供し、前記癌は、好ましくは本発明の疾患の1つである。
本発明はまた、癌の治療用又は予防用医薬の製造における、DLL3をコードする核酸とハイブリダイズすることができるハイブリダイズ剤の使用を提供し、好ましくは、前記癌は本発明の疾患の1つである。
本発明で使用されるハイブリダイズ作用因子は、好ましくはDLL3の1つ以上の細胞外ドメインをコードする核酸と特異的に結合する。
本発明で使用される適切なハイブリダイズ作用因子には、阻害性RNA、短い干渉性RNA（siRNA）、短いヘアピンRNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、アンチセンス核酸、相補性DNA（cDNA）、オリゴヌクレオチド及びリボザイムが含まれる。
本発明はまた、対象において癌（前記癌ではDLL3が発現される）を検出、診断及び／又はスクリーニングし又はその進行を監視するか、又は癌の薬若しくは療法の効果（前記癌ではDLL3が発現される）を監視する方法を提供し、前記方法は、DLL3若しくはその1つ以上のフラグメントの存在若しくはレベル、又はDLL3をコードする核酸の存在若しくはレベルを検出する工程を含むか、又は前記対象におけるそのレベルの変化を検出する工程を含む。
そのような方法は、DLL3若しくはその1つ以上のフラグメントの存在又はDLL3をコードする核酸の存在を検出する工程を含むことができ、ここで、（a）健康な対象のレベルと比較して、該対象におけるDLL3若しくは前記その1つ以上のフラグメントのレベル上昇又はDLL3をコードする核酸のレベル上昇の存在、又は（b）健康な対象の対応する検出不能なレベルと比較して、該対象におけるDLL3若しくは前記その1つ以上のフラグメントの検出可能なレベル又はDLL3をコードする核酸の検出可能なレベルの存在が、前記対象における癌（前記癌ではDLL3が発現される）の存在の指標となる。
本発明はまた、対象において癌（前記癌ではDLL3が発現される）を検出、診断及び／又はスクリーニングし又はその進行を監視するか、又は癌の薬若しくは療法の効果（前記癌ではDLL3が発現される）を監視する方法を提供し、前記方法は、DLL3又はその1つ以上のフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在又はレベルを検出する工程を含む。
本発明の方法では、DLL3若しくはその1つ以上のフラグメントの存在、又はDLL3をコードする核酸の存在、又はDLL3若しくはその1つ以上のフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在若しくはレベルは、対象から入手される生物学的サンプルの分析によって検出することができる。
DLL3若しくはその1つ以上のフラグメントの存在はDLL3と結合する親和性試薬を用いて検出することができる。前記親和性試薬は本明細書で言及する任意の適切な親和性試薬であり得る。親和性試薬は検出可能な標識を含むか又は前記と複合化させることができる。
本明細書で言及する本発明のいずれの特徴でも、対象はヒトであり得る。
本発明はまた、癌（前記癌ではDLL3が発現される）の治療又は予防のための薬剤を同定する方法を提供し、前記方法は、（a）DLL3又はその1つ以上のフラグメントを候補薬剤と接触させる工程、及び（b）該薬剤がDLL3又はその1つ以上のフラグメントと結合するか否かを決定する工程を含む。前記方法はまたさらにDLL3又はその1つ以上のフラグメントと結合する薬剤の癌（前記癌ではDLL3が発現される）を阻害する能力を試験する工程を含むことができる。該薬剤はとりわけDLL3の活性を調整するか、DLL3とのリガンド結合を低下させるか、又はDLL3のダイマー化を低下させることができる。
本明細書に記載する本発明の多様な実施態様で、例示し得る個々の癌タイプは本発明の疾患の1つである。
ある実施態様では、検出、予防又は治療される癌は、肺癌（例えば非小細胞肺癌及び／又は小細胞肺癌）である。
別の実施態様では、検出、予防又は治療される癌は膵臓癌である。
別の実施態様では、検出、予防又は治療される癌は皮膚癌（例えばメラノーマ）である。
本発明の他の特徴は下記及び特許請求の範囲で示される。
PabZAPアッセイを用いて、SHP-77細胞による抗DLL3ポリクローナル抗体の内在化を示す。 PabZAPアッセイを用いて、N82細胞による抗DLL3ポリクローナル抗体の内在化を示す。 二重特異性抗DLL3抗CD3ポリクローナル抗体を用いて、T細胞活性化によるDMS79 DLL3発現細胞の特異的溶解を示す。
下記に詳細に記載する本発明は、癌（例えば本発明の疾患）の治療又は予防のために対象（例えば哺乳類対象）に治療薬組成物を投与することを包含する。本発明はまた、個々の治療薬治療にもっとも応答しそうな患者を同定するために哺乳類対象において臨床的に癌（例えば本発明の疾患）をスクリーニングし、診断し及び予後判定するための、癌（例えば本発明の疾患）の療法の結果を監視するための、薬のスクリーニング及び薬の開発のための方法及び組成物を提供する。
本発明は、ある種の癌でDLL3タンパク質が発現されるという発見を根拠とする。特に、肺癌、膵臓癌及び皮膚癌の形質膜でDLL3タンパク質の発現を示す支持データが本明細書に含まれている。したがって、DLL3に対する抗体は、これらの癌及びDLL3の発現を示す他のタイプの癌で治療薬及び診断薬として有用であり得る。
本明細書で用いられるように、“対象”という用語は動物（好ましくは哺乳動物）を指す。哺乳類の対象は非ヒト哺乳動物でもよいが、一般的にはヒト（例えば成人）である。
対象は一般的には生きている対象である。しかしながら、本発明の使用、方法及び組成物は生きている対象のスクリーニング、診断及び予後判定に特に適切であるが、それらはまた、例えば同じ疾患を発症するリスクがある家族内メンバーの同定のために検死診断のために用いることができる。
本明細書で用いられるように、“患者”という用語は、本発明の疾患の1つ以上を有する又は有すると疑われる対象を指す。
本明細書で用いられるように、“本発明のタンパク質”という用語はデルタ様タンパク質3（GeneID:10683）を指す（前記は本明細書ではDLL3と称される）。このタンパク質は多様な癌で弁別的に発現されることが見出され、したがってこれらの癌の親和性依拠療法のための新規な標的を提供する。DLL3タンパク質のヒト配列は配列番号:1で与えられる。DLL3という用語（タンパク質の関係で）は、配列番号:1で与えられるアミノ酸配列又はその誘導体若しくは変種（特に天然に存在するそのヒト誘導体又は変種）から成るか又はそれらを含む。
このタンパク質は、実施例1に記載する方法及び装置により（例えば膜タンパク質抽出物の液体クロマトグラフィー-質量分析により）、癌患者の癌組織サンプルの膜タンパク質抽出物で同定された。ペプチド配列をSWISS PROT及びTrEMBLデータベース（バイオインフォーマティクススイスインスチチュート（SIB）及び欧州バイオインフォーマティクスインスチチュート（EBI）によって維持されている（前記はwww.expasy.orgで利用可能））と比較し、エントリーQ9NYJ7、デルタ様タンパク質3（DLL3）が同定された。このタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号:3で与えられるアクセッション番号NM_016941で見出される。
SWISS-PROTにしたがえば、デルタ様タンパク質3はデルタファミリーのI型膜タンパク質であり、1つのDSLドメイン、6つのEGF様ドメイン、1つのトランスメンブレン領域、及び配列番号:1のアミノ酸27−492の間の細胞外テール（配列番号:12）から成る。本発明はデルタ様タンパク質3が癌で発現されることを示し、患者（癌を罹患する患者を含む）のデルタ様タンパク質3を対象とする親和性依拠療法が治療的効果を有するであろうと提唱する。
DLL3はフラグメントとして、特にエピトープ含有フラグメント（例えばその抗原性又は免疫原性フラグメント）及びその誘導体、特に該タンパク質の細胞外ドメイン（例えば細胞外テール又はループ）を含むフラグメントは有用である。エピトープ含有フラグメント（抗原性又は免疫原性フラグメントを含む）は、典型的には12アミノ酸以上、例えば20アミノ酸以上、例えば50又は100アミノ酸以上の長さであろう。フラグメントは完全なタンパク質の長さの95％以上、例えば完全なタンパク質の長さの90％以上、例えば75％又は50％又は25％又は10％以上であり得る。
また別には、本明細書で用いられ又は言及されるタンパク質/ポリペプチドは、本明細書に具体的に列挙/記載されるタンパク質/ポリペプチド又は変種若しくは誘導体（前記と少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有する）に限定され得る。パーセンテージアミノ酸配列同一性/類似性は、適切なアルゴリズム（例えばBLAST、CLUSTAL）で適切なデフォルトパラメーターを用いて決定することができる。
したがって、タンパク質又はポリペプチドの関係では“DLL3”という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号:1又は2のいずれかで与えられるアミノ酸配列から成るか又は前記を含むタンパク質、又は配列番号:1若しくは2のいずれかと少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、当該タンパク質がDLL3と本質的に同じ組織分布を有する前記の誘導体又は変種を指す。
核酸の関係では、“DLL3”という用語は、そのヌクレオチド配列が、配列番号:1又は2のいずれかで与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号:1若しくは2のいずれかと少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、当該タンパク質がDLL3タンパク質と本質的に同じ組織分布を有する前記の誘導体又は変種をコードする核酸を指す。
核酸の関係での“DLL3”という用語はまた、そのヌクレオチド配列が配列番号:3又は4のいずれかで与えられる配列を含む核酸、又は配列番号:3若しくは4のいずれかと少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、DLL3タンパク質と本質的に同じ組織分布を有するタンパク質をコードする前記の誘導体又は変種を指す。
抗原性又は免疫原性フラグメントを含むDLL3のエピトープ含有フラグメントは、関係する免疫応答を患者で誘引することができるであろう。るDLL3をコードするDNAはフラグメントとして、例えばDLL3のフラグメント（例えばその免疫原性フラグメント）をコードするDNAもまた有用である。DLL3をコードする核酸（例えばDNA）のフラグメントは、完全なコード領域の長さの95％以上、例えば完全なコード領域の長さの90％以上、例えば75％又は50％又は25％又は10％以上であり得る。核酸（例えばDNA）のフラグメントは、長さが36ヌクレオチド以上、例えば60ヌクレオチド以上、例えば150又は300ヌクレオチド以上であり得る。
DLL3の誘導体には配列の変種が含まれ、前記配列には、1つ以上（例えば1−20（例えば15）アミノ酸、又は該タンパク質の全長を基準にしてアミノ酸の数で20％まで（例えば10％又は5％又は1％まで））の欠失、挿入又は置換が形成されてある。置換は典型的には保存的置換であり得る。誘導体は、典型的にはそれらが誘導されるタンパク質と本質的に同じ生物学的機能を有するであろう。誘導体は、典型的にはそれらが誘導されるタンパク質に匹敵する抗原性及び免疫原性を有するであろう。誘導体は、典型的にはそれらが誘導されるタンパク質のリガンド結合活性又は能動的な受容体複合体形成能力、又は好ましくはその両方を有するであろう。誘導体及び変種は、一般的にはDLL3と同じ組織分布を有するであろう。
タンパク質の誘導体には化学的に処理されたタンパク質、例えばカルボキシメチル化、カルボキシアミド化、アセチル化タンパク質が含まれ、例えばタンパク質は精製時に処理される。
ある特徴では、本発明はDLL3又はDLL3を含む組成物を提供する。前記タンパク質は単離形又は精製形であり得る。本発明はさらにDLL3コード核酸及びDLL3コード核酸を含む組成物を提供する。
さらに別の特徴では、対象において免疫応答を誘引することができる組成物が提供され、前記組成物は、DLL3ポリペプチド及び／又はその1つ以上の抗原性若しくは免疫原性フラグメント、並びに1つ以上の適切な担体、賦形剤、希釈剤又はアジュバント（適切なアジュバントは下記で考察される）を含む。
免疫応答を誘引することができる組成物は、例えば、DLL3ポリペプチド又はその誘導体若しくは変種及び／又はその1つ以上の抗原性若しくは免疫原性フラグメントを、場合によって1つ以上の適切な担体、賦形剤、希釈剤又はアジュバントと一緒に含むワクチンとして提供され得る。
別の特徴では、本発明は、例えば本発明の疾患の1つ以上の治療又は予防のためにDLL3ポリペプチド又はその1つ以上のフラグメント又は誘導体若しくは変種を提供する。
別の特徴では、本発明は、例えば本発明の疾患の1つ以上の治療又は予防のためにDLL3ポリペプチド又はその1つ以上のフラグメント又は誘導体若しくは変種の使用を提供する。
別の特徴では、本発明は、例えば本発明の疾患の1つ以上の治療又は予防のためにDLL3ポリペプチド又はその1つ以上のフラグメント又は誘導体若しくは変種の使用を提供する。
本発明はまた、例えば本発明の疾患の1つ以上の治療用又は予防用医薬の製造における、DLL3ポリペプチド、その1つ以上のフラグメント又は誘導体若しくは変種の使用を提供する。
ある特徴では、例えば本発明の疾患の1つ以上の治療又は予防のために、DLL3ポリペプチド、その1つ以上のフラグメント又は誘導体若しくは変種の治療的に有効な量を投与する工程を含む治療方法が提供される。
本発明はさらに、例えば本発明の疾患を対象において治療又は予防するための方法、又は例えば本発明の疾患の1つ以上に対して対象をワクチン免疫する方法を提供し、前記方法は、DLL3ポリペプチド及び／又は前記の1つ以上の抗原性若しくは免疫原性フラグメント又は誘導体若しくは変種の有効量を、例えばワクチンとして対象に投与する工程を含む。
別の特徴では、本発明は、例えば本発明の疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、例えば本発明の疾患を有する患者でDLL3の発現又は生物学的活性（又は両方）を調整する（例えばアップレギュレート又はダウンレギュレートする）又は補足する化合物の治療的に有効な量を患者に投与する工程を含み、（a）例えば本発明の疾患の開始又は発症を予防し、（b）例えば本発明の疾患の進行を予防し、又は（c）例えば本発明の疾患の症状を緩和する。
さらにまた別の実施態様では、本発明は、癌の治療で（好ましくは本発明の疾患の1つの治療で）同時に、連続して、又は別個に投与される、（a）DLL3及び（b）抗癌剤を別々に又は一緒に含む医薬を提供する。
DLL3は、例えば本発明の疾患の検出、予後判定、診断若しくは監視のために、又は薬の開発のために用いられ得る。
本発明の別の特徴にしたがえば、我々は、対象において例えば本発明の疾患の検出、診断及び／又はスクリーニング又はその進行を監視する、又は本発明の疾患を対象とする抗癌薬若しくは療法の効果を監視する方法を提供し、前記方法は、DLL3又はその1つ以上のフラグメントの存在若しくはレベル、又はDLL3をコードする核酸の存在若しくはレベル、又はDLL3の活性の存在若しくはレベルを検出する工程を含むか、又は前記対象において前記のレベルの変化を検出する工程を含む。
本発明の別の特徴にしたがえば、我々は、例えば本発明の疾患を候補対象において検出、診断及び／又はスクリーニングする方法を提供し、前記方法は、DLL3若しくはその1つ以上のフラグメントの存在、又はDLL3をコードする核酸の存在、又はDLL3の活性の存在を前記候補対象において検出する工程を含み、ここで（a）健康な対象のレベルと比較して、該候補対象におけるDLL3若しくは前記その1つ以上のフラグメントのレベル上昇又はDLL3をコードする核酸のレベル上昇の存在、又はDLL3活性のレベル上昇の存在、又は（b）健康な対象の対応する検出不能レベルと比較して、該候補対象におけるDLL3若しくは前記その1つ以上のフラグメントの検出可能レベル又はDLL3をコードする核酸の検出可能レベルの存在、又はDLL3活性の検出可能レベルの存在が、前記対象における例えば本発明の疾患の存在の指標となる。
本発明の別の特徴にしたがえば、我々は、対象において、例えば本発明の疾患の進行を監視する、又は本発明の疾患を対象とする抗癌薬若しくは療法の効果を監視する方法を提供し、前記方法は、前記候補対象において、第一の時点及び後の時点におけるDLL3若しくはその1つ以上のフラグメントの存在又はDLL3をコードする核酸の存在又はDLL3の活性の存在を検出する工程を含み、該対象において前記第一の時点における当該レベルと比較して、DLL3若しくは前記その1つ以上のフラグメントの上昇若しくは下降レベルの存在、又はDLL3をコードする核酸の上昇若しくは下降レベルの存在、又はDLL3活性の上昇若しくは下降レベルの存在が、前記対象における例えば本発明の疾患の進行若しくは軽減の指標となるか、又は本発明の疾患を対象とする例えば抗癌薬若しくは療法の有効若しくは無効の指標となる。
DLL3については、例えば本発明の疾患を罹患していない対象に由来する組織の分析で得られる検出レベルと比べて、例えば本発明の疾患を有する対象由来の組織サンプルの分析で得られる検出レベルは、用いる個々の分析プロトコル及び検出技術に左右されるであろう。したがって、本発明では、診断薬業界では一般的であるように、使用される分析プロトコル及び検出技術にしたがって、各実験室が例えば本発明の疾患に罹患していない対象の参照範囲を確立することが意図される。好ましくは、例えば本発明の疾患を有することが判明している対象に由来する少なくとも1つの陽性コントロール組織サンプル、又は例えば本発明の疾患に罹患していないことが判明している対象に由来する少なくとも1つの陰性コントロール組織サンプル（より好ましくは陽性及び陰性の両コントロールサンプル）が分析される試験サンプルの各バッチに含まれる。
本発明のある特徴では、液体クロマトグラフィー-質量分析法又は他の適切な方法を対象（好ましくは生きている対象）から得られる本発明の組織サンプルの疾患の分析に用いて、例えば本発明の疾患のスクリーニング又は診断のためにDLL3の発現を測定し、本発明の患者の疾患の進行を決定し、本発明の療法の疾患に対する有効性を又は薬の開発のために監視する。
上記方法のいずれでも、癌（例えば本発明の疾患）を有する候補対象において検出され得るレベルは、健康な対象のレベルよりも好ましくは2倍以上高い。
本発明のある実施態様では、対象（例えば本発明の疾患を有すると疑われる対象）の組織サンプルは、DLL3の検出のために液体クロマトグラフィー-質量分析法によって分析される。本発明の疾患に罹患していない1つの若しくは複数の対象に由来する組織（例えばコントロールサンプル）又は以前に決定した参照範囲と比べて、該対象に由来する組織におけるDLL3の豊富さの増加は本発明の疾患の存在を示す。
DLL3のフラグメント、エピトープ含有フラグメント、免疫原性フラグメント又は抗原性フラグメントに関しては対応する癌に適用する場合、本発明のある特徴では、これらは実施例1でトリプシン性配列として同定される配列を含む。
本明細書で用いられるように、DLL3が夾雑タンパク質を実質的に含まない調製物（すなわち存在する全タンパク質の10％未満（例えば5％未満、例えば1％未満）が夾雑タンパク質である調製物）中に存在するとき、DLL3は“単離されて”ある。夾雑タンパク質は、質量スペクトル分析によって決定したとき、単離されるDLL3のアミノ酸配列と顕著に異なるアミノ酸配列を有するタンパク質である。本明細書で用いられるように、“顕著に異なる”配列は、本明細書の実施例1に記載するプロトコルにしたがって実施される質量スペクトル分析によってDLL3から該夾雑タンパク質を分けることを可能にする配列である。
本発明の診断及び予後判定方法では、DLL3は当業者に公知の任意の方法によってアッセイでき、前記方法には本明細書に記載の好ましい技術、キナーゼアッセイ、酵素アッセイ、結合アッセイ及び他の機能的アッセイ、免疫アッセイ並びにウェスタンブロッティングが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
また別には、DLL3は免疫アッセイで検出できる。ある実施態様では、免疫アッセイは、被検対象のサンプルを抗DLL3抗体（又は他の親和性試薬）と、DLL3が存在する場合には結合（例えば免疫特異的結合）が生じ得るような条件下で接触させ、該薬剤による何らかの結合（例えば免疫特異的結合）の量を検出又は測定することにより実施される。DLL3結合薬剤は本明細書に教示する方法及び技術によって製造することができる。具体的な実施態様では、DLL3は免疫組織化学を用いて分析される。
DLL3は、そのフラグメント（例えばそのエピトープ含有（例えば免疫原性又は抗原性）フラグメント）を検出することにより検出できる。フラグメントは、少なくとも10、より典型的には少なくとも20アミノ酸、例えば少なくとも50又は100アミノ酸、例えば少なくとも150又は200アミノ酸；例えば少なくとも300又は500アミノ酸；少なくとも700又は900アミノ酸の長さを有し得る。
ある実施態様では、組織切片での親和性試薬（例えば抗体）の結合を用いて、異常なDLL3局在化又は異常なDLL3レベルを検出できる。特定の実施態様では、DLL3に対する抗体（又は他の親和性試薬）を用い、DLL3のレベルについて患者の組織（例えば肺臓、膵臓及び皮膚組織）をアッセイでき、ここで異常なDLL3レベルは本発明の疾患の指標である。本明細書で用いられるように、“異常なレベル”は、本発明の疾患に罹患していない対象のレベル又は参照レベルと比較して増加したレベルを意味する。
任意の適切な免疫アッセイを用いることができ、前記には競合及び非競合アッセイ系が含まれ（ただしこれらに限定されない）、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ELISA（酵素結合アッセイ）、“サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫沈澱アッセイ、プレシピチン反応、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射能測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ及びタンパク質A免疫アッセイのような技術が用いられる。
例えば、DLL3は、二工程サンドイッチアッセイの手段によって液体サンプル（例えば血液、尿又は唾液）中で検出できる。第一の工程では、捕捉試薬（例えば抗DLL3抗体又は他の親和性試薬）を用いてDLL3を捕捉する。捕捉試薬は、場合によって固相に固定できる。第二の工程では、直接的又は間接的に標識される検出試薬を用いて該捕捉DLL3を検出する。ある実施態様では、検出試薬はレクチンである。この目的のためには、DLL3と同じコアタンパク質を有する他のアイソフォーム又は当該抗体により認識される抗原決定基を共有する他のタンパク質ではなく、DLL3と優先的に結合する任意のレクチンを用いることができる。好ましい実施態様では、選択されるレクチンは、DLL3と同じコアタンパク質を有する前記他のアイソフォーム又は当該親和性試薬によって認識される抗原決定基を共有する前記他のタンパク質よりも少なくとも2倍強い親和性、より好ましくは少なくとも5倍強い親和性、さらに好ましくは少なくとも10倍強い親和性でDLL3と結合する。本記載に基づけば、DLL3の検出に適切なレクチンは、当業界で周知の方法によって、例えば下記文献（Sumar et al., Lectins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, In: Gabius H-J & Gabius S, ed., 1993, Lectins and Glycobiology（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））の158−159ページ、158−174ページの表Iに列挙された1つ以上のレクチンを試験して容易に認定することができる。また別の実施態様では、検出試薬は、抗体（又は他の親和性試薬）、例えば他の翻訳後改変を特異的に（例えば免疫特異的に）検出する抗体、例えばリン酸化アミノ酸と免疫特異的に結合する抗体である。そのような抗体の例には、ホスホチロシンと結合するもの（BD Transduction Laboratories, カタログ番号：P11230-050/P11230-150; P11120; P38820; P39020）、ホスホセリンと結合するもの（Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, カタログ番号：61-8100）、及びホスホスレオニンと結合するもの（Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, カタログ番号：71-8200, 13-9200）が含まれる。
所望の場合には、DLL3をコードする遺伝子、関連遺伝子、又は関連核酸配列若しくは部分配列（相補性配列を含む）もまたハイブリダイゼーションアッセイで用いることができる。DLL3をコードするヌクレオチド又はその部分配列（少なくとも8ヌクレオチド、好ましくは少なくとも12ヌクレオチド、及びもっとも好ましくは少なくとも15ヌクレオチドを含む）をハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイは、DLL3をコードする遺伝子の異常発現を伴う症状、異常又は病的状態の検出、予後判定、診断又は監視のために、又は例えば本発明の疾患を示唆する徴候又は症状を有する対象の弁別的診断のために用いることができる。特に、そのようなハイブリダイゼーションアッセイは、核酸を含む対象のサンプルを、DLL3をコードするDNA又はRNAとハイブリダイズする能力を有する核酸プローブと、ハイブリダイゼーションが生じ得るような条件下で接触させる工程及び生じた一切のハイブリダイゼーションを測定する工程を含む方法によって実施され得る。
したがって、DLL3をコードする核酸（例えばDNA又はより適切にはRNA）は、例えばDLL3をコードする核酸とハイブリダイズする能力を有するハイブリダイズ作用因子（特にオリゴヌクレオチドプローブ）を用いて検出できる。
そのような1つの典型的な方法は以下の工程を含む：
DLL3をコードするヌクレオチド配列に相補的な10以上の連続するヌクレオチドを含む1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを、対象の生物学的サンプルから入手したRNAと又は該RNAからコピーしたcDNAと接触させる工程（ここで前記接触工程は、該プローブと該ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション（存在するとして）が許容される条件下で生じる）；
該プローブと該ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーション（存在するとして）を検出する工程；及び
工程（b）のハイブリダイゼーション（存在するとして）をコントロールサンプルで検出されたハイブリダイゼーションと、又は以前に決定した参照範囲と比較する工程。
本発明はまた、抗DLL3抗体（又は他の親和性試薬）を含む診断キットを提供する。さらにまた、そのようなキットは場合によって以下の1つ以上を含むことができる：
（1）診断、予後判定、療法の監視又はこれらの用途の任意の組合せのために抗DLL3親和性試薬を用いるための指示；
（2）該親和性試薬に対する標識された結合パートナー；
（3）抗DLL3親和性試薬が固定されている固相（例えば試薬細片）；及び
（4）診断、予後判定若しくは治療的使用又は前記の組合せに対する規制上の承認を示す付箋又は挿入物。該親和性試薬に対する標識された結合パートナーを提供しない場合は、抗DLL3親和性試薬それ自体を検出可能マーカー（例えば化学発光部分、酵素部分、蛍光部分又は放射性部分）で標識することができる。
本発明はまた、DLL3をコードする核酸（適切にはRNA）とハイブリダイズする能力を有する核酸プローブを含むキットを提供する。特定の実施態様では、キットは、一対のプライマー（例えば各々は6−30ヌクレオチド、より好ましくは10−30ヌクレオチド、さらに好ましくは10−20ヌクレオチドのサイズ範囲にある）の1つ以上の容器を含む。前記プライマーは、適切な反応条件下で、例えばポリメラーゼ連鎖反応（例えば以下を参照されたい：Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA）、リガーゼ連鎖反応（EP320,308を参照されたい）、Qβレプリカーゼの使用、環状プローブ反応、又は当業界で公知の他の方法によって、DLL3をコードする核酸の少なくとも一部分の増幅をプライムすることができる。
キットは場合によってさらに予め決定された量のDLL3又はDLL3コード核酸を、例えば標準物又はコントロールとして含むことができる。
本明細書で用いられるように、“サンプル”という用語は、体液（例えば血液、尿又は唾液）及び本発明の疾患の１つ以上を有するリスクがある対象から採取された組織生検（例えば肺臓、膵臓及び皮膚生検）又はそのホモジネートを含む。
例えば使用される生物学的サンプルは任意の供給源に由来することができ、例えば血清サンプル又は組織サンプル（例えば肺臓、膵臓及び皮膚組織）である。例えば、本発明の疾患の転移の証拠を探すとき、本発明の疾患の主要な転移部位、例えば肺癌については脳、肝臓、骨及び副腎、膵臓癌については肝臓、又は皮膚癌については肺臓及び骨を見ることができよう。
また別には、DLL3若しくはその１つ以上のフラグメントの存在、又はDLL3をコードする核酸の存在、又はDLL3の活性の存在はin situでの分析によって検出できる。
ある種の実施態様では、本明細書に記載する診断の方法は、少なくとも部分的に又はその全体をin vitro又はex vivoで実施され得る。
適切には、DLL3若しくはその１つ以上のフラグメントの存在、又はDLL3をコードする核酸の存在、又はDLL3の活性の存在は定量的に検出される。
例えば、定量的検出は以下の工程を含む：
生物学的サンプルをDLL3に特異的な親和性試薬と接触させる工程（前記親和性試薬は場合によって検出可能な標識と複合化されてある）；及び
結合が、該親和性試薬とサンプル中の少なくとも1つの種との間で生じたか否かを検出する工程（前記検出は直接的に又は間接的に実施される）。
また別には、DLL3若しくはその１つ以上のフラグメントの存在、又はDLL3をコードする核酸の存在、又はDLL3の活性の存在は、画像化技術の使用を必要とする手段によって定量的に検出できる。
別の実施態様では、本発明の方法は、DLL3若しくはその１つ以上のフラグメントの存在、又はDLL3をコードする核酸の存在、又はDLL3の活性の存在を決定するために、例えば肺臓、膵臓及び皮膚組織の切片で免疫組織化学の使用を必要とし、それによって例えば本発明の疾患を細胞で局在化する。
ある実施態様では、DLL3又はその1つ以上のエピトープ含有フラグメントの存在は、例えばDLL3又はその1つ以上のフラグメントと特異的に結合することができる親和性試薬、例えば抗体を用いて検出される。
別の実施態様では、DLL3の活性が検出される。
臨床試験における使用
本発明の診断方法及び組成物は、臨床試験の監視において例えば本発明の疾患の療法で使用する薬の評価に役立つ。ある実施態様では、候補分子は、例えば本発明の疾患を有する対象においてDLL3レベルを、本発明の疾患に罹患していない対象において見出されるレベルに回復させるそれら分子の能力、又は治療を受けている対象においては、非肺癌値、非膵臓癌値若しくは非皮膚癌値又は前記に近いDLL3レベルを維持するそれら分子の能力について試験される。
別の実施態様では、本発明の方法及び組成物を用いて、例えば本発明の疾患を有する個体を同定する臨床試験のための候補者をスクリーニングする。該当する個体は続いて試験から排除するか、又は治療若しくは分析のために別個のコホートに入れることができる。
本発明のタンパク質及び対応する核酸の製造
ある特徴では、本発明は、例えば本発明の疾患を治療又は予防する方法を提供し、前記方法は、DLL3若しくは1つ以上のそのフラグメント又は誘導体をコードする核酸の治療的に有効な量を、例えばワクチンの形態でそのような治療又は予防の必要がある対象に投与する工程を含む。
別の特徴では、例えば本発明の疾患を治療又は予防する方法が提供され、前記方法は、DLL3の機能又は発現を阻害する核酸の治療的に有効な量をそのような治療又は予防の必要がある対象に投与する工程を含む。
例えば、該核酸がDLL3アンチセンス核酸又はリボザイムである、本発明の方法（及び／又は本明細書で開示される他の特徴のDNA）が含まれる。
したがって、本発明は、例えば本発明の疾患を治療又は予防する医薬の製造における、DLL3若しくはその1つ以上のフラグメント又は誘導体をコードする核酸の使用を含む。
例えば本発明の疾患の1つ以上を治療又は予防する医薬の製造における、DLL3の機能又は発現を阻害する核酸の使用もまた提供される。
本発明で用いられるDNAは、スターター物質として市販のmRNAを用いてcDNAライブラリーからcDNAフラグメントを単離し、そのヌクレオチド配列を同定することによって入手できる。すなわち、具体的には、Oharaらの方法（Ohara et al. DNA Research Vol.4, 53-59, 1997）にしたがって調製したcDNAライブラリーからクローンをランダムに単離する。次に、ハイブリダイゼーションにより複写されたクローン（前記は繰り返し出現する）を取り出し、続いてin vitroで転写及び翻訳を実施する。クローン（50kDaの生成物が確認されている）の両末端のヌクレオチド配列を決定する。
さらにまた、このようにして得た末端ヌクレオチド配列をクエリーとして用い、相同性について既知の遺伝子データベースを検索する。
上記のスクリーニング方法に加えて、cDNAの5’及び3’末端配列をヒトのゲノム配列と関係づける。続いてこれら配列間のある領域に未知の長鎖遺伝子を確認し、完全長の当該cDNAを分析する。このようにして、公知遺伝子に依拠する通常のクローニング方法では入手できない未知の遺伝子を系統的にクローニングできる。
さらにまた、短いフラグメント又は入手配列における人工的過誤の発生を防止するために十分な注意を払いながら、本発明のDNAを含むヒト由来遺伝子の領域の全てをまた、PCR方法（例えばRACE）を用いて調製することができる。上記の記載にしたがって、本発明のDNAを有するクローンを入手できる。
本発明のDNAをクローニングする別の手段では、本発明のポリペプチドの一部分の適切なヌクレオチド配列を有する合成DNAポリマーが生成され、その後に適切なライブラリーを用いたPCR方法が続く。また別には、選別は本発明のDNAとあるDNAとのハイブリダイゼーションによって実施でき、後者のDNAは、適切なベクターに取り込まれてあり、本発明のポリペプチドの領域のいくつか又は全部をコードするDNAフラグメント又は合成DNAで標識されてある。ハイブリダイゼーションは、例えば以下の文献に記載されている方法によって実施できる（Current Protocols in Molecular Biology, Frederick M. Ausubel et al., ed, 1987）。本発明のDNAは、それらが上記に記載の本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかぎり任意のDNAであり得る。そのようなDNAは、肺臓、膵臓及び皮膚組織に由来するcDNAライブラリーから同定されて単離されたcDNA又は同種類のものである。ライブラリー構築物で使用されるベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド又は同種類のもののいずれかであり得る。さらにまた、上記細胞及び／又は組織から調製される全RNA分画又はmRNA分画を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応と結合させた直接的逆転写（以降では“RT-PCR法”と略称する）によって増幅を実施することができる。
DLL3のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成る上記ポリペプチドをコードするDNA、又は当該アミノ酸配列の一部分を含む1つ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によってDLL3のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列から成る上記ポリペプチドをコードするDNAは、例えば部位特異的変異導入方法、遺伝子相同組換え方法、プライマー伸長方法及び当業者に公知のPCR方法の適切な組み合わせによって容易に生成できる。さらにまた、この時点で、ポリペプチドに実質的に等価の生物学的活性をもたせるために可能な方法は、該ポリペプチドを構成するアミノ酸で相同なアミノ酸（例えば極性及び非極性アミノ酸、疎水性及び親水性アミノ酸、陽性荷電及び陰性荷電アミノ酸、並びに芳香族アミノ酸）を置換することである。さらにまた、実質的に等価の生物学的活性を維持するために、本発明のポリペプチド内に含まれる機能的ドメイン内のアミノ酸は好ましくは保存される。
さらにまた、本発明のDNAの例には、DLL3のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むDNA、及び当該DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつDLL3のアミノ酸配列から成るポリペプチドの機能と等価の生物学的活性（機能）を有するポリペプチド（タンパク質）をコードするDNAが含まれる。そのような条件下で、DLL3のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むDNAとハイブリダイズすることができるそのようなDNAの例は、当該DNAの全ヌクレオチド配列とのある程度の全体平均相同性（例えば約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上）を有するヌクレオチド配列を含むDNAである。ハイブリダイゼーションは、当業界で公知の方法、例えば文献“Current Protocols in Molecular Biology”（Frederick M. Ausubel et al., ed, 1987）に記載の方法、又は前記に対応する方法にしたがって実施できる。ここで“ストリンジェントな条件”は例えば、約1*SSC、0.1％SDS及び37℃の条件、よりストリンジェントな条件は約0.5*SSC、0.1％SDS及び42℃の条件、さらにストリンジェントな条件は約0.2*SSC、0.1％SDS及び65℃の条件である。よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いれば、プローブ配列との高い相同性を有するDNAの単離が期待できる。SSC、SDS及び温度の条件の上記の組み合わせは例示的目的で提供される。上記と類似するストリンジェンシーは、上記因子又はハイブリダイゼーションストリンジェンシーの決定のための他の因子（例えばプローブ濃度、プローブの長さ及びハイブリダイゼーション反応時間）を適切に組み合わせることによって当業者が決定できる。
本発明のクローン化DNAは直接用いてもよいが、所望の場合は目的に応じて、制限酵素による消化後又はリンカー付加後に用いてもよい。該DNAは5’末端側に翻訳開始コドンとしてATGを、3’末端側に翻訳終止コドンとしてTAA、TGA又はTAGを有することができる。これらの翻訳開始及び翻訳終止コドンはまた適切な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
本発明の方法/使用では、DLL3は例えば単離形で、例えばDLL3ポリペプチドが少なくともある程度まで精製された状態で提供され得る。DLL3ポリペプチドは、実質的に精製形で、換言すれば他のタンパク質を実質的な程度まで含まないで提供される。DLL3ポリペプチドはまた、組換え方法を用いて製造されるか、合成により製造されるか、又はこれらの方法を組み合わせて製造され得る。DLL3は、当業者に公知の任意の方法によって容易に調製でき、前記方法は、本発明の適切なDNA又は本発明のDNAを含む遺伝子を含む発現ベクターを作製する工程、該発現ベクターを用いて形質転換した形質転換体を培養する工程、本発明の関連ポリペプチド又は該ポリペプチドを含む組換えタンパク質を生成し蓄積する工程、及び続いて生じたものを収集する工程を含む。
組換えDLL3ポリペプチドは、発現系を含む遺伝的に操作された宿主細胞から当業界で周知のプロセスによって調製できる。したがって、本発明はまた、DLL3ポリペプチド又は核酸を含む発現系、そのような発現系により遺伝的に操作された宿主細胞、及び組み換え技術によるDLL3ポリペプチドの製造に関する。組換えDLL3ポリペプチドの製造のために、宿主細胞を遺伝的に操作して発現系又は核酸のためのその部分を取り込むことができる。そのような取り込みは、当業界で周知の方法（例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAD-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスべクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、擦り傷ローディング、弾道導入又は感染）を用いて実施できる（例えば以下を参照されたい：Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986；及びSambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbour laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989）。
宿主細胞として、例えばエシェリキア属（Escherichia）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）の細菌、バシルス属（Bacillus）の細菌、酵母、アスペルギルス（Aspergillus）細胞、昆虫細胞、昆虫及び動物細胞が用いられる。エシェリキア属の細菌の具体的な例（前記は本明細書で用いられる）には、大腸菌（Escherichia coli）K12及びDH1（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 60, 160, 1968）、JM103（Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309, 1981）、JA221（Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 517, 1978）及びHB101（Journal of Molecular Biology, Vol. 41, 459, 1969）が含まれる。バシルス属の細菌として、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）MI114（Gene, Vol. 24, 255, 1983）及び207-21（Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87, 1984）が用いられる。酵母としては、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccaromyces cerevisiae）AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D及び20B-12、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccaromyces pombe）NCYC1913及びNCYC2036、並びにピキア・パストリス（Pichia pastoris）が用いられる。昆虫細胞としては、例えばドロソフィラ（Drosophila）S2及びスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞が用いられる。動物細胞としては、例えばCOS-7及びVeroサル細胞、CHOチャイニーズハムスター細胞（以下ではCHO細胞と略称する）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞株、マウスL細胞、マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞、COS、HeLa、C127、3T3、HEK293、BHK及びボウズメラノーマ細胞が用いられる。
無細胞翻訳系もまた組換えポリペプチドの製造に用いることができる（例えばウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽溶解物、SP6/T7in vitroT&T及びRTS100E.coliHY転写翻訳キット（Roche Diagnostics Ltd., Lewes, UK）、並びにTNTクイックカップルド（TNTQuick coupled）転写/翻訳系（Promega UK, Southampton, UK））。
発現ベクターは当業界で公知の方法にしたがって作製できる。例えば、ベクターは以下の工程によって作製できる：（1）本発明のDNAを含むDNAフラグメント又は本発明のDNAを含む遺伝子を切り出す工程及び（2）適切な発現ベクターでプロモーターの下流に該DNAフラグメントを連結する工程。例えば以下の非常に多様な発現系を用いることができる（ただしこれらに限定されない）：染色体、エピソーム及びウイルス由来系、例えば大腸菌由来プラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC18及びpUC118）、枯草菌由来プラスミド（例えばpUB110、pTP5及びpC194）、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来（例えばpSH19及びpSH15）、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス（例えばSV40）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス）に由来するもの、並びに前記の組み合わせに由来するベクター、例えばプラスミドとバクテリオファージ（例えばラムダファージ）の遺伝的エレメントに由来するもの（例えばコスミド及びファージミド）。発現系は、発現をもたらすと同様に調節する制御領域を含むことができる。本発明で用いられるプロモーターは、遺伝子発現のために用いられる宿主に適切であるかぎり任意のプロモーターであり得る。例えば、宿主が大腸菌であるときは、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、pLプロモーター、lppプロモーターなどが好ましい。宿主が枯草菌であるときは、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母であるときは、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。動物細胞が宿主として用いられるときは、この事例で使用されるプロモーターの例にはSraプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、HSV-TKプロモーターが含まれる。一般的には、宿主細胞でポリペプチドを生成するために核酸を維持し、増殖させ又は発現させることができる任意の系又はベクターを用いることができる。
適切な核酸配列は、周知で日常的な多様な技術（例えばSambrookらの上掲書に記載されたもの）のいずれかによって発現系に挿入され得る。適切な分泌シグナルをDLL3ポリペプチドに取り入れて、小胞体管腔、細胞周囲間隙又は細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌を可能にすることができる。これらのシグナルは、DLL3ポリペプチドにとって内因性でも異種シグナルであってもよい。宿主細胞の形質転換は当業界で公知の方法にしたがって実施できる。例えば以下の文書類を参照できる：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 69, 2110, 1972；Gene, Vol. 17, 107, 1982；Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111, 1979； Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187, 1991；Proc. Natl. Acad. Sci.（U.S.A.）, Vol. 75, 1929, 1978；Cell Technology, separate volume 8, New Cell Technology, Experimental Protocol. 263-267、1995（Shujunsha刊行）；及びVirology, Vol. 52, 456, 1973。本発明のDNA又は本発明のDNAを含む遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されたこのようにして入手した形質転換体は、当業界で公知の方法にしたがって培養できる。例えば、宿主がエシェリキア属の細菌であるときは、該細菌は一般的に約15℃から43℃で約3から24時間培養される。必要ならば、通気又は攪拌もまた付加できる。宿主がバシルス属の細菌であるときは、該細菌は一般的には約30℃から40℃で約6から24時間培養される。必要ならば、通気又は攪拌もまた付加できる。宿主が酵母である形質転換体を培養するときは、培養は、pHを約5から8に調整した培地を用いて約20℃から35℃で約24から72時間実施される。必要ならば、通気又は攪拌もまた付加できる。宿主が動物細胞である転換体を培養するときは、該細胞は一般的にpHを約6から8に調整した培地を用いて約30℃から40℃で約15から60時間培養される。必要ならば、通気又は攪拌もまた付加できる。
DLL3ポリペプチドが細胞系スクリーニングアッセイで使用するために発現される場合は、該ポリペプチドは細胞表面で生成されることが好ましい。この場合には、細胞はスクリーニングアッセイでの使用前に採集することができる。DLL3ポリペプチドが培地中に分泌される場合は、該培地を回収して前記ポリペプチドを単離することができる。細胞内で生成される場合は、細胞はDLL3ポリペプチドの回収前に先ず初めに溶解されねばならない。
DLL3ポリペプチドは、組換え細胞培養から又は他の生物学的供給源から以下を含む周知の方法によって回収及び精製できる：硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、遠心分離方法、電気泳動方法及びレクチンクロマトグラフィー。ある実施態様では、これらの方法の組合せが用いられる。別の実施態様では、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。さらに別の実施態様では、DLL3ポリペプチドと特異的に結合する抗体を用いて、DLL3ポリペプチドを含むサンプルから前記ポリペプチドを枯渇させるか又は前記ポリペプチドを精製することができる。
本発明のポリペプチド又はタンパク質を培養生成物から分離又は精製するために、例えば培養後に、微生物体又は細胞を公知の方法によって収集し、それらを適切な緩衝液に懸濁し、該微生物体又は細胞を例えば超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解によって破壊し、生じたものを続いて遠心分離又はろ過に付し、続いて該タンパク質の粗抽出物を入手できる。該緩衝液はまた、タンパク質変性剤（例えば尿素又は塩酸グアニジン）又は界面活性剤（例えばトリトンX-100（TM））を含むことができる。タンパク質が培養液に分泌されるとき、微生物体又は細胞と上清を培養完了後に公知の方法によって分離し、上清を収集する。このようにして入手した培養上清又は抽出物に含まれるタンパク質を、公知の分離及び精製方法を適切に組み合わせて精製することができる。このようにして入手した本発明のポリペプチド（タンパク質）を公知の方法又は前記に対応する方法によって塩に変換できる。逆に、本発明のポリペプチド（タンパク質）が塩の形で得られるとき、それは、公知の方法又は前記に対応する方法によって遊離タンパク質若しくはポリペプチド又は別の塩に変換できる。さらにまた、組換え体によって生成されたタンパク質に精製前又は精製後に適切なタンパク質改変酵素（例えばトリプシン又はキモトリプシン）を作用させて恣意的に改変を加えるか、又はポリペプチドを部分的に除去することができる。本発明のポリペプチド（タンパク質）又はその塩の存在は、多様な結合アッセイ、特異的抗体を用いる酵素免疫アッセイなどによって測定できる。
該ポリペプチドを単離又は精製中に変性させたときには、当業界で周知の技術を再折り畳みに用いて、本来の又は活性な形状のDLL3ポリペプチドを再生することができる。本発明の関係では、DLL3ポリペプチドは任意の供給源に由来する生物学的サンプル（例えば血液サンプル又は組織サンプル（例えば肺臓、膵臓及び皮膚組織）であるが、ただしこれらに限定されない）から入手できる。
DLL3ポリペプチドは“成熟タンパク質”の形態であっても、より大きなタンパク質（例えば融合タンパク質）の部分であってもよい。分泌性又はリーダー配列、プレ-、プロ-又はプレプロ-タンパク質配列、又は精製に役立つ配列（例えば親和性タグ（例えばマルチヒスチジン残基、FLAGタグ、HAタグ又はmycタグ））を含む付加的アミノ酸配列を含むことはしばしば有益である。
DLL3は、例えば異種融合パートナー、例えば表面タンパク質（ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus Influenza）Bのタンパク質Dとして知られている）、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質（例えばNS1）、肝炎BのS抗原、又はLYTAとして知られているタンパク質（例えばそのC末端）と融合させることができる。
組換え体の生成中に安定性を提供できる付加配列もまた用いることができる。そのような配列は、切断可能な配列を付加配列又はその部分として取り込むことによって、必要に応じて場合により除去することができる。したがって、DLL3ポリペプチドは、他のポリペプチド又はタンパク質（例えばグルタチオンS-トランスフェラーゼ及びタンパク質A）を含む他の部分と融合させることができる。そのような融合タンパク質は適切なプロテアーゼを用いて切断し、続いて各々のタンパク質を分離することができる。そのような付加配列及び親和性タグは当業界で周知である。上記に加えて、所望の場合は、当業界で公知の造作、例えばエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選別マーカー及びSV40複製起点を発現ベクターに付加することができる。
ある特徴では、本発明は、DLL3若しくはそのフラグメントと特異的に結合することができる薬剤、又はDLL3をコードする核酸とハイブリダイズする能力を有するハイブリダイズ作用因子、又は疾患（例えば癌）及び特に本発明の疾患の治療、スクリーニング、検出及び／又は診断で使用されるDLL3の活性を検出することができる薬剤を提供する。
DLL3に対する親和性試薬の製造
ある特徴では、本発明は、DLL3又はそのフラグメントと特異的に結合できる親和性又は免疫親和性試薬を提供し、親和性試薬は、例えば検出可能な標識を含むか若しくは前記と複合化されるか、又は治療薬部分（例えば細胞傷害性部分）を含むか若しくは前記と複合化される。親和性試薬は例えば抗体であり得る。親和性試薬は、単離された親和性試薬又は精製された親和性試薬であり得る。
本発明で使用される親和性試薬は、DLL3上のエピトープ、例えば配列番号:1又は2のいずれかの1つ以上の部分と結合することができる。好ましくは、親和性試薬はDLL3の細胞外ドメイン（例えば細胞外テール又は細胞外ループ）と（例えば配列番号:12と）特異的に結合する。
当業者によれば、3つの主要な免疫親和性試薬、すなわちモノクローナル抗体、ファージディスプレー抗体及びより小さな抗体誘導分子（例えばアフィボディ、ドメイン抗体（dAb）、ナノボディ、ユニボディ、DARPin、アンチカリン、デュオカリン、アビマー又はバーサボディ）が存在する。抗体の使用を述べる本発明の適用では、一般的に他の親和性抗体（例えばアフィボディ、ドメイン抗体（dAb）、ナノボディ、ユニボディ、DARPin、アンチカリン、デュオカリン、アビマー又はバーサボディ）を利用することができる。そのような物質はDLL3と免疫特異的に結合することができると言うことができる。適切な場合には、“親和性試薬”という用語は、免疫親和性試薬及びDLL3と特異的に結合できる他の物質（リガンド、レクチン、ストレプトアビジン、抗体模倣物及び合成結合剤が含まれるが、ただしこれらに限定されない）を包含すると解されるであろう。
DLL3に対する抗体の製造
本発明にしたがえば、DLL3、DLL3アナローグ、DLL3関連タンパク質、又は前述のいずれかのフラグメント若しくは誘導体を免疫原として用いて、そのような免疫原と免疫特異的に結合する抗体を生成することができる。そのような免疫原は、上記に記載の方法を含む任意の通常的手段によって単離できる。本明細書で用いられる“抗体”という用語は、1つの免疫グロブリン遺伝子若しくは複数の免疫グロブリン遺伝子又は前記のフラグメントから誘導されたか、前記に合わせて作られたか、又は前記によって実質的にコードされた、抗原又はエピトープと特異的に結合することができるペプチド又はポリペプチドを指す（例えば以下を参照されたい：Fundamental Immunology, 3rd Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. 1993；Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97。抗体という用語は、抗原結合部分、すなわち抗原と結合する能力を保持する“抗原結合部位”（例えばフラグメント、部分配列、相補性決定領域（CDR））を含み、以下が含まれる：（i）Fabフラグメント：VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価のフラグメント；（ii）F(ab’)2フラグメント：ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメント；（iii）VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント；（iv）抗体の単一アームのVL及びVHドメインから成るFvフラグメント；（v）dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、前記はVHドメインから成る；（vi）単離された相補性決定領域。一本鎖抗体はまた“抗体”という用語で呼んで抗体に含まれる。本発明の抗体には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、ヒト化又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント及びF(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって製造されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Id）抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（IgG、IgE、IgM、IgD及びIgA、例えばIgG）又はサブクラスであり得る。
“特異的に結合する”（又は“免疫特異的に結合する”）という用語は、抗体がその意図される標的ともっぱら結合することを示すことを意図しない。むしろ、その意図される標的に対する親和性が、非標的分子に対する親和性と比較したとき典型的には約5倍強いならば、抗体は“特異的に結合する”。適切には、所望されない物質、特に健康な人間又は動物の天然に存在するタンパク質又は組織との顕著な交差反応又は交差結合は存在しない。好ましくは、抗体の親和性は、非標的分子に対するその親和性よりも標的分子に対して少なくとも約5倍、好ましくは10倍、より好ましくは25倍、さらに好ましくは50倍、もっとも好ましくは100倍以上強い。いくつかの実施態様では、抗体又は他の結合薬剤と抗原との間の特異的結合とは少なくとも106M-1の結合親和性を意味する。抗体は、例えば少なくとも約107M-1の親和性、好ましくは約108M-1から約109M-1、約109M-1から約1010M-1、又は約1010M-1から約1011M-1の親和性で結合する。
親和性はKd＝koff/konとして計算される（koffは解離速度定数であり、konは結合速度定数であり、Kdは平衡定数である）。平衡状態の親和性は、種々の濃度（c）で標識リガンドの結合割合（r）を測定することによって決定できる。データはスキャチャード等式：r/c＝K(n-r)を用いてグラフに表される（式中、r＝平衡状態にある結合リガンドのモル/受容体のモル；c＝平衡状態にある遊離リガンド濃度；K＝平衡結合定数；及びn＝受容体分子当たりのリガンド結合部位の数）。グラフ分析では、r/cはY軸対X軸でプロットされ、したがってスキャチャードプロットを生じる。親和性はこの線の負の勾配である。koffは、結合標識リガンドを非標識過剰リガンドと競合させることによって決定できる（例えば以下を参照されたい：U.S. Pat No. 6,316,409）。標的攻撃薬剤のその標的に対する親和性は、例えば少なくとも約1ｘ10-6モル/リットル、例えば少なくとも約1ｘ10-7モル/リットル、例えば少なくとも約1ｘ10-8ル/リットル、特に少なくとも約1ｘ10-9モル/リットル、及び特に少なくとも約1ｘ10-10モル/リットルである。スキャチャード分析によって測定される抗体親和性は当業界では周知であり、例えば以下を参照されたい：van Erp et al., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991；Nelson and Griswold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988。
ある実施態様では、DLL3コード遺伝子の遺伝子生成物を認識する公開されている抗体を用いることができる。別の実施態様では、当業者に公知の方法を用いて、DLL3、DLL3アナローグ、DLL3関連ポリペプチド、又は前述のいずれかのフラグメント若しくは誘導体を認識する抗体が生成される。例えば以下の文献に記載されているように、抗体の製造のために多くの手順が利用可能であることを当業者は認識していよう（Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y.）。抗体を模倣した結合フラグメント又はFabフラグメントもまた多様な手順によって遺伝子情報から調製できることを当業者はまた理解していよう（Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920, 1992）。
本発明のある実施態様では、DLL3の特異的ドメインに対する抗体が製造される。具体的な実施態様では、DLL3の親水性フラグメントが抗体製造の免疫原として用いられる。
抗体の製造では、所望の抗体のスクリーニングは、当業界で公知の技術、例えばELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって実施できる。例えば、DLL3の特定のドメインを認識する抗体を選別するために、作製したハイブリドーマをそのようなドメインを含むDLL3フラグメントと結合する生成物についてアッセイできる。第一のDLL3ホモローグとは特異的に結合するが、第二のDLL3ホモローグとは特異的には結合しない（又はさほど強力には結合しない）抗体の選別のために、第一のDLL3ホモローグとの陽性結合及び第二のDLL3ホモローグとの結合の欠如（又は結合の低下）を基準にして選択を実施することができる。同様に、DLL3と特異的に結合するが同じタンパク質の種々のアイソフォーム（例えばDLL3と同じコアペプチドを有する種々の糖付加型）とは結合しない（又はさほど強力には結合しない）抗体の選別のために、DLL3との陽性結合及び種々のアイソフォーム（例えば種々の糖付加型）との結合の欠如（又は結合の低下）を基準にして選択を実施することができる。したがって、本発明は、DLL3の異なる1つのアイソフォーム又は複数のアイソフォーム（例えば糖付加型）と結合するよりも強い親和性（例えば少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍、特に少なくとも10倍強い親和性）で結合する抗体（例えばモノクローナル抗体）を提供する。
本発明の方法で用いることができるポリクローナル抗体は、免疫動物の血清に由来する抗体分子の不均質集団である。未分画の免疫血清もまた用いることができる。当業界で公知の多様な手順を、DLL3、DLL3のフラグメント、DLL3関連ポリペプチド、又はDLL3関連ポリペプチドのフラグメントに対するポリクローナル抗体の製造に用いることができる。例えば、問題のポリペプチドを精製する、又は問題のポリペプチドを合成する（例えば固相ペプチド合成方法を用いる）方法は当業界で公知である。例えば以下を参照されたい：Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. Vol 182, 1990；Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol 289, 1997；Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990；Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995；Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996。続いて選別したポリペプチドを用いて、多様な宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない）を注射によって免疫し、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を作製することができる。DLL3がゲル電気泳動で精製される場合、DLL3は、ポリアクリルアミドゲルから事前抽出して又は事前抽出せずに免疫に用いることができる。宿主の種に応じて、以下を含む（ただしこれらに限定されない）多様なアジュバント（すなわち免疫刺激物質）を用いて、免疫学的応答を強化することができる：完全又は不完全フロイントアジュバント、鉱物ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール）、多価陰イオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びBCG（カルメット-ゲラン杆菌）又はコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parvum）のようなアジュバント。また別のアジュバントもまた当業界では周知である。
DLL3、DLL3のフラグメント、DLL3関連ポリペプチド、又はDLL3関連ポリペプチドのフラグメントを対象とするモノクローナル抗体（mAb）の調製のために、培養状態の持続的細胞株による抗体分子の製造を提供する任意の技術を用いることができる。前記技術は例えば、最初にKohlerとMilstein（1975, Nature 256:495-497）によって開発されたハイブリドーマ技術とともに、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72）及び、ヒトモノクローナル抗体を製造するEBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）である。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及びそのサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitro又はin vivoで培養できる。本発明の追加の実施態様では、モノクローナル抗体は、公知の技術を利用して無菌動物で製造できる（PCT/US90/02545（前記文献は参照により本明細書に組み入れられる））。
モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体及びキメラモノクローナル抗体（例えばヒト-マウスキメラ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。キメラ抗体は異なる部分が異なる動物種から誘導される分子であり、例えばヒト免疫グロブリン定常領域及びネズミのmAbから誘導された可変領域を有するものである（例えば米国特許4,816,567号（Cabilly et al.）及び米国特許4,816,397号（Boss et al.）を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。ヒト化抗体は、非ヒトの種由来の１つ以上の相補性決定領域（CDR）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒトの種に由来する抗体分子である（例えば米国特許5,585,089号（Queen）を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。
キメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当業界で公知の組換えDNA技術、例えば以下に記載されている方法を用いて製造することができる：PCT公開公報WO 87/02671号；欧州特許公開公報184,187号；欧州特許公開公報171,496号；欧州特許公開公報173,494号；PCT公開公報WO 86/01533号；米国特許4,816,567号；欧州特許公開公報125,023号；Better et al., 1988, Science 240:1041-1043；Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526；Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005；Wood et al., 1985, Nature 314:446-449；及びShaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559；Morrison, 1985, Science 229:1202-1207；Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214；米国特許5,225,539号；Jones et al., 1986, Nature 321:552-525；Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534；及びBeidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060。
完全にヒトの抗体はヒト対象の治療的処置のために特に所望される。そのような抗体はトランスジェニックマウスを用いて製造することができる。前記マウスは内因性免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することはできないが、ヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子は発現することができる。トランスジェニックマウスは、選択した抗原（例えばDLL3の全部又は部分）を用いて通常の態様で免疫される。該抗原を対象とするモノクローナル抗体は通常のハイブリドーマ技術を用いて入手できる。トランスジェニックマウスによって保持されるヒト免疫グロブリントランスジーンはB細胞の分化中に再編され、続いてクラススイッチ及び体細胞性変異を受ける。したがって、そのような技術を用いて、治療的に有用なIgG、IgA、IgM及びIgE抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するこの技術の概説については以下を参照されたい：Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を製造するこの技術並びにそのような抗体を製造するプロトコルの詳細な考察については例えば以下を参照されたい：U.S. Patent 5,625,126；U.S. Patent 5,633,425；U.S. Patent 5,569,825；U.S. Patent 5,661,016；及びU.S. Patent 5,545,806。さらにまた、上記に記載した技術と類似する技術を用いて選択した抗原を対象とするヒト抗体の提供を、企業（例えばAbgenix, Inc.（Freemont, CA）及びGenpharm（San Jose, CA）に委託することができる。
選択したエピトープを認識する完全にヒトの抗体は、“ガイド選別”と称される技術を用いて製造できる。このアプローチでは、選択した非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）を用いて、同じエピトープを認識する完全にヒトの抗体がガイド選別される（Jespers et al. (1994) BioTechnology 12:899-903）。
本発明の抗体はまた、ファージディスプレー技術を使用して、選択した標的と結合するポリペプチドライブラリーを作製及びスクリーニングすることによって作出することができる。例えば以下を参照されたい：Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990；Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990；Scott and Smith, Science 249, 386-88, 1990；及び米国特許5,571,698号（Ladner et al.）。ファージディスプレー方法の基本的概念は、スクリーニングされるポリペプチドをコードするDNAと当該ポリペプチドとの物理的結合を樹立することである。この物理的結合はファージ粒子によって提供され、前記粒子は、ポリペプチドをコードするファージ遺伝子を包むキャプシドの部分として当該ポリペプチドをディスプレーする。ポリペプチドとそれらの遺伝物質との物理的結合の樹立は、種々のポリペプチドを保持する極めて多数のファージの同時大量スクリーニングを可能にする。標的との親和性を有するポリペプチドをディスプレーするファージは当該標的と結合し、これらのファージは当該標的との親和性スクリーニングによって濃縮される。これらのファージからディスプレーされるポリペプチドの同一性は、それらの対応するゲノムから決定できる。これらの方法を用いて、所望の標的に対して結合親和性を有すると認定されるポリペプチドを、通常的手段によって続いてバルクとして合成することができる。例えば米国特許6,057,098号を参照されたい（前記文献は参照によりその全体（全ての表、図及び特許請求の範囲を含む）が本明細書に組み入れられる）。特に、そのようなファージを利用して、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒト又はネズミ）から発現される抗原結合ドメインをディスプレーできる。問題の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、例えば標識抗原又は固相表面若しくはビーズに結合又は捕捉させた抗原を用いて選別又は同定することができる。これらの方法で用いられるファージは典型的にはfd及びM13を含む繊維状ファージで、前記は、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIタンパク質と組換えにより融合されたFab、Fv又はジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するファージから発現される結合ドメインを含む。本発明の抗体を作製するために用いることができるファージディスプレー方法には以下に開示された方法が含まれる：Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50, 1995；Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186, 1995；Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958, 1994；Persic et al., Gene 187 9-18, 1997；Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280, 1994；PCT公開公報PCT/GB91/01134；PCT公開公報WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；及び米国特許5,698,426号；5,223,409号；5,403,484号；5,580,717号；5,427,908号；5,750,753号；5,821,047号；5,571,698号；5,427,908号；5,516,637号；5,780,225号；5,658,727号；5,733,743号及び5,969,108号（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
上記の文献に記載されているように、ファージの選別後に、該抗体コード領域を全抗体（ヒト抗体を含む）又は任意の他の所望される抗原結合フラグメントを作製するためにファージから単離及び使用し、下記に詳細に記載するように任意の所望宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む）で発現させることができる。例えば、Fab、Fab’及びF(ab’)2フラグメントを組換えにより製造する技術もまた、例えば以下に開示されている当業界で公知の方法を用いて利用することができる：PCT公開公報WO 92/22324；Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869, 1992；及びSawai et al., AJRI 34:26-34, 1995；及びBetter et al., Science 240:1041-1043, 1988（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
一本鎖Fv及び抗体を製造するために用いることができる技術の例には以下に記載されている技術が含まれる：米国特許4,946,778号及び5,258,498号；Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88, 1991；Shu et al., PNAS 90:7995-7999, 1993；及びSkerra et al., Science 240:1038-1040, 1988。
本発明はさらに二重特異性抗体の使用を提供する（前記抗体は当業界で公知の方法によって作製できる）。完全長二重特異性抗体の伝統的な製造は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の共発現に依拠し、ここで前記2つの鎖は異なる特異性を有する（Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の無作為な取り合わせのために、これらのハイブリドーマ（クォドローマ）は10の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じ、そのうちの1つだけが正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製（親和性クロマトグラフィー工程によって実施される）はかなり面倒で製造収量は低い。類似の手順が以下の文献に開示されている：1993年5月13日公開のWO 93/08829；及びTraunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659。
異なるより好ましいアプローチにしたがえば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体-抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合は、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメイン（少なくともヒンジ、CH2及びCH3領域の少なくとも部分を含む）を用いる。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（CH1）が融合物の少なくとも1つに存在するようにするのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物（及び所望の場合は免疫グロブリン軽鎖）をコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に共トランスフェクトする。前記は、構築物で用いられる3つのポリペプチド鎖の不均等な割合が最適な収量を提供するとき、具体化例における3つのポリペプチドフラグメントの相互比率の調整に大きな融通性を提供する。しかしながら、少なくとも2つのポリペプチド鎖の均等な割合の発現が高収量をもたらすとき、又は割合が特に重要ではないときには、2つ又は3つ全てのポリペプチドのコード配列を1つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、一方のアームに第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）を含む。この非対称性構造は、所望の二重特異性化合物を望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせ物から分離するのを容易にすることが見出された。なぜならば、二重特異性分子の片側半分における免疫グロブリン軽鎖の存在は容易な分離方法を提供するからである。このアプローチは1994年3月3日公開のWO94/04690に開示されている。二重特異性抗体の作製の更なる詳細については例えば以下を参照されたい：Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210。
本発明は、抗DLL3免疫グロブリン分子の機能的に活性なフラグメント、誘導体又はアナローグを提供する。機能的に活性なとは、該フラグメント、誘導体又はアナローグが、同じ抗原を認識する抗抗イディオタイプ抗体、すなわち三次抗体（前記は当該フラグメント、誘導体又はアナローグが誘導された抗体によって認識される）を誘引する能力を有することを意味する。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、フレームワーク及び特異的に該抗原を認識するCDR配列のC-末端側のCDR配列の欠失によって強化され得る。どのCDR配列が該抗原と結合するかを決定するために、当該CDR配列を含む合成ペプチドを当業界で公知の任意の結合アッセイによって当該抗原との結合アッセイに用いることができる。
本発明は、抗体フラグメント、例えばF(ab’)2フラグメント及びFabフラグメント（ただしこれらに限定されない）を提供する。特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技術によって作出できる。F(ab’)2フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のCH1ドメインから成り、抗体分子のペプシン消化によって生じる。Fabフラグメントは、F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋の還元によって生じる。本発明はまた、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖のダイマー、又はその任意の最小フラグメント（例えばFv又は一本鎖抗体（SCA））を提供する（例えば以下に記載されている：米国特許4,946,778号；Bird, 1988, Science 242:423-42；Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；及びWard et al., 1989, Nature 334:544-54）。
他の実施態様では、本発明は、本発明の免疫グロブリン（又は機能的に活性なそのフラグメント）の融合タンパク質を提供し、例えばここでは、免疫グロブリンは、共有結合を介してN-末端又はC-末端のどちらかで、免疫グロブリンではない別のタンパク質（又はその部分、好ましくはタンパク質の少なくとも10、20又は50アミノ酸部分）のアミノ酸配列と融合される。好ましくは、免疫グロブリン又はそのフラグメントは、定常ドメインのN-末端で他のタンパク質と共有結合により連結される。上記で述べたように、そのような融合タンパク質は精製を容易にし、in vivo半減期を延長し、上皮障壁を通過して免疫系への抗原のデリバリーを強化する。
本発明の免疫グロブリンにはアナローグ及び誘導体が含まれ、それらは、すなわち任意のタイプの分子の共有結合によって改変されるが、ただしそのような共有結合が免疫特異的結合を障害しない場合に限られる。例えば、該免疫グロブリンの誘導体及びアナローグには例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護/封鎖基による誘導、タンパク分解切断、細胞性リガンド又は他のタンパク質への連結によってさらに改変されてあるものが含まれる（ただしこれらに限定されない）。多数の化学的改変のいずれも公知の技術によって実施でき、前記には特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらにまた、該アナローグ又は誘導体は1つ以上の古典的アミノ酸を含むことができる。
前述の抗体は、DLL3の局在化及び活性に関係する当業界で公知の方法で、例えばこのタンパク質の画像化、適切な生理学的サンプルにおけるそのレベルの測定、診断方法などで用いることができる。
DLL3に対するアフィボディの製造
アフィボディ分子は、スタフィロコッカスタンパク質AのIgG結合ドメインの1つから誘導される、58アミノ酸残基タンパク質ドメインを土台とする親和性タンパク質の新規なクラスである。この3ヘリックスバンドルドメインがコンビナトリアルファージミドライブラリーの構築のためのスキャフォールドとして用いられた（前記ライブラリーから、所望の分子を標的とするアフィボディ変種をファージディスプレー技術により選別できる（Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7；Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55））。それら自身の低分子量（6kDa）と一緒になってアフィボディ分子の単純で堅固な構造は、それらアフィボディを極めて多様な用途、例えば検出試薬として適切にし（Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211）、さらに受容体相互作用を阻害させる（Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7）。アフィボディ及びそれらの製造法の更なる詳細は米国特許5831012号（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）を参照して入手できる。
標識アフィボディもまた、アイソフォームが豊富に存在することを決定するために用いられる画像化で有用である。
DLL3に対するドメイン抗体の製造
本明細書で抗体と言えば、ドメイン抗体を包含する。ドメイン抗体（dAb）は抗体のもっとも小さな機能的結合ユニットであり、ヒト抗体の重鎖（VH）又は軽鎖（VL）のどちらかの可変領域に対応する。ドメイン抗体は約13kDaの分子量を有する。Domantisは、完全にヒトのVH及びVL dAbの大きくて高度に機能的な一連のライブラリー（各ライブラリーに100億を超える種々の配列を含む）を開発し、治療標的に特異的なdAbを選別するためにこれらライブラリーを用いる。多くの通常的抗体とは対照的に、ドメイン抗体は細菌、酵母及び哺乳動物細胞系で良好に発現される。ドメイン抗体及びその製造方法の更なる詳細は以下を参照して入手できる：米国特許6,291,158号；6,582,915号；6,593,081号；6,172,197号；6,696,245号；米国特許出願2004/0110941号；欧州特許出願1433846号並びに欧州特許0368684号及び0616640号；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019及びWO03/002609（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
DLL3に対するナノボディの製造
ナノボディは、天然に存在する重鎖抗体の固有の構造的及び機能的特性を含む抗体誘導治療薬タンパク質である。これらの重鎖抗体は一可変ドメイン（VHH）及び二定常ドメイン（CH2及びCH3）を含む。重要なことには、クローン化され単離されたVHHドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合性能を保持する完全に安定なポリペプチドである。ナノボディはヒト抗体のVHドメインと高い相同性を有し、活性を全く失うことなくさらにヒト化することができる。重要なことには、ナノボディは低い免疫原性潜在能を有し、前記はナノボディリード化合物による霊長動物試験で確認されている。
ナノボディは通常的抗体の利点と小分子薬の重要な特色を併せ持つ。通常的抗体と同様に、ナノボディは、高い標的特異性、それらの標的に対する高い親和性及び低い固有の毒性を示す。しかしながら、小分子薬と同様に、それらは酵素を阻害し、受容体の裂け目に容易に接近することができる。さらにまた、ナノボディは極めて安定であり、注射以外の手段で投与することができ（例えばWO04/041867を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））、さらに製造が容易である。ナノボディの他の利点には、それらの小さなサイズの結果として一般的ではない又は隠ぺいされたエピトープを認識すること、それらの固有の三次元によりタンパク質標的の窪み又は活性部位に高親和性及び選択性で結合すること、ドラッグフォーマットの融通性、半減期を調整できること、並びに薬の発見の容易さ及び速度が含まれる。ナノボディは一遺伝子によってコードされ、ほとんどすべての原核細胞及び真核細胞宿主によって効率的に製造される。前記宿主は例えば以下である：大腸菌（例えばUS6,765,087を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））、粘菌（例えばアスペルギルス（Aspergillus）又はトリコデルマ（Trichoderma））、及び酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ハンセヌラ（Hansenula）又はピキア（Pichia））（例えばUS 6,838,254を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。製造プロセスは規模の増減が可能であり、何キログラムもの量のナノボディが製造されている。ナノボディは、通常的抗体と比較して優れた安定性を示すので、それらは、保存期間が長く直ぐに使える溶液として処方できる。
ナノクローン法（例えばWO 06/079372を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））は、B細胞の自動化高処理選別に依拠する、所望の標的に対してナノボディを作製する特許方法である。
DLL3に対するユニボディの製造
ユニボディは別の抗体フラグメント技術であるが、この技術はIgG4抗体のヒンジ領域の除去に基づく。ヒンジ領域の欠失は、伝統的なIgG4抗体の本質的に半分のサイズであり、IgG4抗体の二価結合領域ではなく一価の結合領域を有する分子を生じる。IgG4抗体は不活性であり、したがって免疫系と相互作用をしないこともまたよく知られている（このことは、免疫応答が所望されない治療には有利であり得るので、したがってこの利点はユニボディに引き継がれる）。例えば、ユニボディは、それらが結合する細胞を阻害又はサイレント化するように機能するが殺すことはできない。さらにまた、癌細胞とユニボディとの結合はそれらを増殖するように刺激することはない。さらにまた、ユニボディは伝統的なIgG4抗体の約半分のサイズであるので、それらは、より大きな固形腫瘍上でより良好な分布を示し、潜在的に有利な効果を有することができる。ユニボディはIgG4抗体と同様な速度で身体から除去され、それらの抗原に対して全抗体と同様な親和性で結合することができる。ユニボディの更なる詳細は、特許WO2007/059782を参照することによって入手できる（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
DLL3に対するDARPinの製造
DARPin（設計されたアンキリンリピートタンパク質（Designed Ankyrin Repeat Protein））は、非抗体ポリペプチドの結合能力を利用するために開発された抗体模倣DRP（設計されたリピートタンパク質（Designed Repeat Protein））技術の一例である。リピートタンパク質、例えばアンキリン又はロイシンリッチリピートタンパク質は遍在する結合分子であり、前記は、抗体とは異なり細胞内及び細胞外に存在する。それらのモジュール式構造は反復する構造ユニット（リピート）を特徴とし、前記リピートは一緒に積み重なって、可変性でモジュール式の標的結合表面を展示する長く伸びたドメインを形成する。このモジュール性に基づいて、高度に多様化された結合特性を有する、ポリペプチドコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。この手法は、可変性表面残基及びそれらのリピートドメインへのランダムアッセンブリーを展示する自己適合性リピートのコンセンサス設計を含む。
DARPinは細菌発現系で非常に高い収量で製造することができ、それらは公知のもっとも安定なタンパク質に属する。広範囲の標的タンパク質（ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルス及び膜タンパク質を含む）に高度に特異的で高い親和性を有するDARPinが選択された。一桁のナノモル濃度からピコモル濃度の範囲の親和性を有するDARPinが入手できる。
DARPinは、広範囲に適用されて（ELISA、サンドイッチELISA、フローサイトメトリー分析（FACS）、免疫組織化学（IHC）、チップ適用、親和性精製又はウェスタンブロットを含む）用いられた。DARPinはまた、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）と融合された細胞内マーカータンパク質として細胞内区画で高い活性を有することを立証した。DARPinはさらにまた、pM範囲のIC50でウイルスの進入を阻害するために用いられた。DARPinは、タンパク質-タンパク質相互作用を阻害するだけでなく、酵素の阻害にもまた理想的である。プロテアーゼ、キナーゼ及びトランスポーターが、もっともしばしばアロステリックな阻害態様で首尾よく阻害された。腫瘍上での非常に迅速で特異的な濃縮及び非常に好ましい腫瘍対血液比は、DARPinをin vivo診断又は治療薬アプローチのために非常に適切なものにする。
DARPin及び他のDRP技術に関するさらに別の情報は以下で見出すことができる：米国特許出願公開公報2004/0132028及び国際特許出願公開公報WO02/20565（前記の両文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
DLL3に対するアンチカリンの製造
アンチカリンはまた別の抗体模倣技術であるが、しかしながらこの事例では、結合特異性はリポカリンに由来する（リポカリンは、ヒトの組織及び体液に天然にかつ豊富に存在する低分子量タンパク質の一ファミリーである）。リポカリンは、化学的に感受性であるか又は不溶性の化合物の生理学的輸送及び貯蔵に密接に関与する一続きのin vivo機能を達成するために導き出された。リポカリンは、高度に保存されたβバレル（当該タンパク質の一方の末端で4つのループを支える）を含む堅固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットの入り口を形成し、この部分における当該分子の形状的相違は個々のリポカリン間の結合特異性の多様性を説明する。
保存的β-シートフレームワークによって支えられる超可変ループの全体的構造は免疫グロブリンを連想させるが、リポカリンは大きさに関して抗体とは顕著に異なる。リポカリンは、160−180アミノ酸のただ1つのポリペプチド鎖を含み、これは単一免疫グロブリンドメインよりわずかに大きい。
リポカリンをクローン化し、アンチカリンを作製するためにリポカリンのループを操作する。構造的に多様なアンチカリンライブラリーを作製し、アンチカリンディスプレーは結合機能の選別及びスクリーニングを可能にし、続いて原核細胞又は真核細胞系で更なる分析のための可溶性タンパク質を発現及び製造する。実質的に任意のヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンを開発できることが複数の研究によって首尾よく示された。それらアンチカリンを単離してナノモル濃度又はそれより高い範囲の結合親和性を得ることができる。
アンチカリンはまた二重標的攻撃タンパク質（いわゆるデュオカリン）としてフォーマットすることができる。デュオカリンは、標準的な製造プロセスを用いて容易に製造される1つのモノマータンパク質として2つの別々の治療薬標的と結合するが、その2つの結合ドメインの構造的方向性とは無関係に標的特異性及び親和性を保持している。
単一分子による複数の標的の調整は、2つ以上の原因因子が関与することが判明している疾患では特に有益である。さらにまた、二価又は多価結合フォーマット（例えばデュオカリン）は、疾患の細胞表面分子の標的攻撃、シグナルトランスダクション経路におけるアゴニスト作用の媒介、又は細胞表面受容体の結合及びクラスター形成による内在化作用の強化で顕著な潜在能力を有する。さらにまた、デュオカリンの固有の高安定性はモノマーアンチカリンに匹敵し、デュオカリンの処方化の融通性及び潜在的デリバリー能力を提供する。
アンチカリンに関する更なる情報は以下で見出すことができる：米国特許7,250,297号及び国際特許出願公開公報WO 99/16873（前記両文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
DLL3に対するアビマーの製造
アビマーは、ヒトの細胞外受容体ドメインの大ファミリーから、in vitroエクソンシャッフリング及びファージディスプレーを実施して、結合及び阻害性特性を有するマルチドメインタンパク質を作製することによって得られる。多数の独立した結合ドメインの連結はアビジチーを作出し、通常的な一エピトープ結合タンパク質と比較して親和性及び特異性の改善をもたらすことが示された。他の潜在的な利点には、大腸菌におけるマルチ標的特異的分子の単純で効率的な製造、熱安定性及びプロテアーゼ耐性の改善が含まれる。ナノモル濃度以下の親和性を有するアビマーが多様な標的に対して得られている。
アビマーに関する更なる情報は以下で見出すことができる：米国特許出願公開公報2006/0286603号、2006/0234299号、2006/0223114号、2006/0177831号、2006/0008844号、2005/0221384号、2005/0164301号、2005/0089932号、2005/0053973号、2005/0048512号、2004/0175756号（前記文献のいずれも参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
DLL3に対するバーサボディの製造
バーサボディは3−5kDaの少タンパク質であり、システインが15％を超え、高ジスルフィド密度のスキャフォールドを形成して典型的なタンパク質が有する疎水性コアが取換えられている。多数の疎水性アミノ酸（疎水性コアを含む）を少数のジスルフィドに取換えることによって、より小さくより親水性で（凝集及び非特異的結合が少ない）、プロテアーゼ及び熱に対してより耐性であり、（MHC提示に最も寄与する残基は疎水性であるために）より低いT細胞エピトープ密度を有するタンパク質を生じる。これらの特性の4つはいずれも免疫原性に影響を及ぼすことは周知であり、それらは一緒になって免疫原性の大きな減少を引き起こすと期待される。
バーサボディの着想は、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、イソギンチャクによって産生される天然の注射可能な生物薬（それらは予想外に低い免疫原性を示すことが判明している）から来ている。設計によって及びサイズによって選択された天然のタンパク質ファミリーから出発して、疎水性、タンパク分解性抗原プロセッシング及びエピトープ密度は、天然の注射可能なタンパク質の平均よりはるかに低いレベルにまで減少する。
バーサボディの構造が与えられるならば、これらの抗体模倣物は多様なフォーマット（マルチ結合手、マルチ特異性、半減期メカニズムの多様性、モジュール式組織標的攻撃及び抗体Fc領域の不在を含む）を提供する。さらにまた、バーサボディは大腸菌により高収量で製造され、さらに親水性で及びサイズが小さいために、バーサボディは非常に可溶性であり、高濃度で処方化され得る。バーサボディは例外的に熱安定性であり（沸騰させることができる）、長期間の貯蔵寿命を提供する。
バーサボディの更なる情報は米国特許出願公開公報2007/0191272号で見出すことができる（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
親和性試薬の発現
抗体の発現
本発明の抗体は、抗体の合成について当業界で公知の任意の方法、特に化学的合成又は組換え発現によって製造でき、好ましくは組換え発現技術によって製造される。
抗体又はそのフラグメント、誘導体若しくはアナローグの組換え発現は、抗体をコードする核酸の構築を必要とする。抗体のヌクレオチド配列が判明している場合は、抗体をコードする核酸を化学的に合成したオリゴヌクレオチドからアッセンブリングすることができる（例えば以下に記載されている：Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242）。簡単に記せば、前記は以下の工程を含む：抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成、これらオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、前記に続くPCRによる該連結オリゴヌクレオチドの増幅。
また別には、抗体をコードする核酸は抗体をクローニングすることによって入手できる。当該抗体をコードする核酸を含むクローンは利用可能ではないが抗体分子の配列は公知である場合は、該抗体をコードする核酸は、適切な供給源（例えば抗体cDNAライブラリー又は該抗体を発現する任意の組織若しくは細胞から作製されたcDNAライブラリー）から当該配列の3’又は5’末端とハイブリダイズできる合成プライマーを用いてPCR増幅するか、又は当該遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングすることによって入手できる。
個々の抗体を特異的に認識する抗体分子（又はそのような抗体をコードする核酸をクローニングするためのcDNAライブラリーの供給源）が利用可能でない場合、個々の抗原に特異的な複数の抗体を当業界で公知の任意の方法によって、例えば動物（例えばウサギ）を免疫してポリクローナル抗体を作製することによって、又はモノクローナル抗体を作製することによって作製することができる。また別には、抗体の少なくともFab部分をコードするクローンは、Fab発現ライブラリー（例えば以下に記載されている：Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281）を特異的抗原と結合するFabフラグメントのクローンについてスクリーニングすることによって、又は抗体ライブラリー（例えば以下を参照されたい：Clackson et al., 1991, Nature 352:624；Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937）をスクリーニングすることによって入手できる。
いったん抗体分子の少なくとも可変ドメインをコードする核酸が入手されたら、前記を抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターに導入することができる（例えば以下を参照されたい：PCT公開公報WO 86/05807；PCT公開公報WO 89/01036；及び米国特許5,122,464号）。完全な抗体分子の発現を可能にする核酸との共発現のための完全な軽鎖及び重鎖を含むベクターもまた利用可能である。続いて、抗体をコードする核酸を用いて、鎖内ジスルフィド結合に加わる1つ以上の可変領域システイン残基をスルフヒドリル基を含まないアミノ酸残基で置換する（欠失する）ために必要なヌクレオチド置換又は欠失を導入することができる。そのような改変は、ヌクレオチド配列に特定の変異又は欠失を導入するために当業界で公知の任意の方法、例えば化学的変異導入、in vitro位置指定変異導入（Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551）、PCT依拠方法など（ただしこれらに限定されない）によって実施できる。
さらにまた、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性を持つヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる、“キメラ抗体”製造のために開発された技術を用いることもできる（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:851-855；Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608；Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454）。上記に記載したように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種から誘導される分子、例えばネズミmAbから誘導された可変領域及びヒト抗体定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体である。
いったん本発明の抗体分子をコードする核酸が入手されたら、当業界で周知の技術を用いて抗体分子製造用ベクターを組換えDNA技術により作製することができる。したがって、抗体分子配列を含む核酸を発現することによってDLL3を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に周知の方法を用いて、抗体分子コード配列並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、例えばin vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組み換えが含まれる。例えば以下の文献に記載されている技術を参照されたい：Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) and Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY。
発現ベクターは通常的な技術によって宿主細胞に移され、続いてトランスフェクト細胞を通常的技術によって培養して本発明の抗体を製造する。
本発明の組換え抗体の発現に用いられる宿主細胞は、細菌細胞（例えば大腸菌）又は特に全組換え抗体分子の発現のためには好ましくは真核細胞であり得る。特に、哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO））が、例えばヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターを含むベクターと共同して効率的な抗体発現系である（Foecking et al., 1986, Gene 45:101；Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2）。
多様な宿主-発現ベクター系を用いて本発明の抗体分子を発現することができる。そのような宿主-発現系は、それによって問題のコード配列が製造され続いて精製されるベヒクルであるが、前記はまた、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクトされるとき、本発明の抗体分子をin situで発現する細胞でもある。これらには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌（例えば大腸菌、枯草菌）；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス、ピキア）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、タバコモザイクウイルス（TMV））を感染させた、又は前記を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；又は哺乳動物細胞若しくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば前者ではメタロチオネインプロモーター、後者ではアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えばCOS、CHO、BHK、293、3T3細胞）。
細菌系では、多数の発現ベクターが、発現される抗体分子の意図される使用にしたがって有利なように選択できる。例えば、大量のそのようなタンパク質を製造しようとするとき（抗体分子を含む医薬組成物の生成のために）、容易に精製される融合生成物の高レベル発現を指令するベクターを所望することができる。そのようなベクターには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：大腸菌発現ベクターpUR278（Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791）（前記では、抗体コード配列は、融合タンパク質が製造されるように個々にlacZコード領域とインフレームでベクターに連結できる）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）など。pGEXベクターもまた、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために用いることができる。一般的には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースマトリックスビーズとの吸着及び結合とその後に続く遊離グルタチオン存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビン又はXa因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローン化標的遺伝子生成物はGST部分から遊離させることができる。
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして用いて外来遺伝子が発現される。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞で増殖する。抗体コード配列は、当該ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）で個々にクローン化し、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルス依拠発現系（例えばアデノウイルス発現系）を利用することができる。
上記で考察したように、挿入配列の発現を調整するか、又は特定の所望の態様で遺伝子生成物を改変及びプロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク生成物のそのような改変（例えばグリコシル化）及びプロセッシング（例えば切断）はタンパク質の機能のために重要である。
組換え抗体の長期間の高収量生産のためには安定な発現が好ましい。例えば、抗体のヌクレオチド配列及び選別可能なヌクレオチド配列（例えばネオマイシン又はヒグロマイシン）を含む発現ベクターを細胞にトランスフェクトし、該選別可能マーカーの発現について選別することによって、問題の抗体を安定的に発現する細胞株を製造することができる。そのような操作細胞株は、当該抗体分子と直接又は間接的に相互作用する化合物のスクリーニング及び評価で特に有用であり得る。
抗体分子の発現レベルはベクターの増幅によって増加させることができる（概説のためには以下を参照されたい：Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3., Academic Press, New York, 1987）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能なとき、宿主細胞の培養に存在する阻害物質のレベルの増加はマーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体産生もまた増加するであろう（Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257）。
宿主細胞には本発明の2つの発現ベクター（重鎖由来ポリペプチドをコードする第一のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二のベクター）を共トランスフェクトすることができる。2つのベクターは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選別可能マーカーを含むことができる。また別には、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを用いることができる。そのような状況では、軽鎖を重鎖の前に配置して、傷害物質を含まない重鎖の過剰発現を回避すべきである（Proudfoot, 1986, Nature 322:52；Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197）。重鎖及び軽鎖のコード配列はcDNA又はゲノムDNAを含むことができる。
いったん本発明の抗体分子が組換えによって発現されたら、精製のために当業界で公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（例えばタンパク質A又は特異的抗原による）、及びサイズによるカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、弁別的溶解性によって、又はタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、前記抗体を精製することができる。
また別には、任意の融合タンパク質は、発現された融合タンパク質に特異的な抗体を利用して容易に精製することができる。例えば、Janknechtらが記載した系は、ヒト細胞株で発現された非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897）。この系では、問題の遺伝子はワクシニア組換えプラスミドでサブクローニングされ、当該遺伝子のオープンリーディングフレームは翻訳により6ヒスチジン残基から成るアミノ末端タグと融合される。前記タグは融合タンパク質のためのマトリックス結合ドメインとして機能する。組換えワクシニアウイルス感染細胞の抽出物をNi2+ニトリル酢酸-アガロースカラムにロードし、ヒスチジンタグ付きタンパク質を選択的にイミダゾール含有緩衝液で溶出させる。
これらの方法によって作製される抗体は続いて対象の精製ポリペプチドを用いて親和性及び特異性について第一のスクリーニングよって、さらに必要な場合には、その結果を結合から排除することが所望されるポリペプチドを用いた抗体の親和性及び特異性と比較することによって精製できる。スクリーニングの手順は、マイクロプレートの別々のウェルに精製ポリペプチドを固定する工程を含むことができる。潜在能力を有する抗体又は複数の抗体群の溶液を続いて対応するマイクロタイターウェルに入れて約30分から2時間インキュベートする。続いてこのマイクロタイターウェルを洗浄して、標識二次抗体（例えば作製抗体がマウス抗体の場合はアルカリホスファターゼ結合抗マウス抗体）をウェルに添加して約30分インキュベートし、続いて洗浄する。基質をウェルに添加し、固定ポリペプチドに対する抗体が存在する場合には発色反応が出現するであろう。
続いて、そのようにして同定した抗体を選択したアッセイ設計で親和性及び特異性についてさらに分析できる。ある標的タンパク質に対する免疫アッセイの開発では、精製標的タンパク質は、選別した抗体を用いる免疫アッセイの感度及び特異性を判定する標準物質として機能する。多様な抗体の結合親和性は様々であり得るので（すなわち、ある種の抗体対は（例えばサンドイッチアッセイでは）、互いに立体的に干渉し得るので）、抗体のアッセイ性能は、抗体の絶対的親和性及び特異性よりも重要な尺度であり得る。
抗体又は結合フラグメントの製造並びに多様なポリペプチドに対する親和性及び特異性のためのスクリーニング及び選択で多くのアプローチを採用できることは当業者には理解されるであろうが、これらのアプローチは本発明の範囲を変更しない。
治療的用途には、抗体（特にモノクローナル抗体）はヒト又はヒト化動物（例えばマウス）の抗体が適切であり得る。動物の抗体は、免疫原としてヒトタンパク質（例えばDLL3）を用いて動物で作製することができる。ヒト化は典型的には、前記によって同定されたCDRをヒトフレームワーク領域に移植する工程を含む。通常は、鎖の形状を最適化するためにその後に続くいくつかの戻し変異が必要である。そのようなプロセスは当業者には公知である。
アフィボディの発現
アフィボディの構築は別のところで記載され（Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen, M., Nygren P.A, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655.）、前記にはアフィボディファージディスプレーライブラリーの構築が含まれている（Nord, K., Nilsson, J., Nilsson, B., Uhlen, M. & Nygren, P.A, A combinatorial library of an a-helical bacterial receptor domain, 1995, Protein Eng. 8, 601-608；Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhlen, M. & Nygren, P.A, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, 1997, Nat. Biotechnol.15, 772-777）。
バイオセンサー結合試験を用いて最適アフィボディを精査するバイオセンサー分析もまた別のところで記載されている（Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen, M., Nygren P.A, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655）
親和性試薬の改変
好ましい実施態様では、抗DLL3親和性試薬（例えば抗体又はそのフラグメント）は、診断薬部分（例えば検出可能標識）又は治療薬部分と複合化される。該抗体は診断のため、又はある治療レジメンの有効性の決定のために用いられる。検出は、抗体を検出可能物質（標識）と結合させることによって促進できる。検出可能物質の例には、多様な酵素、補てつ基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放射金属（ポジトロン放射断層撮影法で使用する）及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。本発明の診断として使用される抗体と複合化させることができる金属イオンについての概論には米国特許4,741,900号を参照されたい。適切な酵素には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補てつ基には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ、適切な蛍光物質には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリスリンが含まれ、適切な発光物質にはルミノールが含まれ、適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエキオリンが含まれ、適切な放射性核種には125I、131I、111In及び99Tcが含まれる。68Gaもまた用いることができる。
上記に示したように、本発明で使用される親和性試薬（例えば抗体）は、治療薬部分（例えばサイトトキシン、薬物（免疫抑制剤）又は放射性トキシン）と複合化させることができる。そのような複合化物は“免疫複合化物”と称される。1つ以上のサイトトキシンを含む免疫複合化物は“イムノトキシン”と称される。サイトトキシン又はサイトトキシン系薬剤には、細胞に有害な（例えば細胞を殺す）任意の薬剤が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアンタラシンヂオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロケイン、テトラケイン、リドケイン、プロプラノロール、並びにピューロマイシン及び前記のアナローグ又はホモローグが含まれる。治療薬剤にはまた、例えば以下が含まれる：抗代謝薬（例えばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）及びロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、及びcis-ジクロロジアミンプラチナム（II）（DDP）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前にはダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前にはアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（AMC））、及び抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）。
本発明の抗体と複合化させることができる治療薬サイトトキシンの他の好ましい例には、デュオカルマイシン、カリケアミシン、メイタンシン及びアウリスタチン、及び前記の誘導体が含まれる。カリケアミシン抗体複合化物の例は市場で入手できる（Mylotarg(商標)、American Home Products）。
サイトトキシンは、当業界で利用可能なリンカー技術を用いて本発明の抗体と複合化させることができる。抗体とサイトトキシンとの複合化に用いることができるリンカータイプの例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド及びペプチド含有リンカーが含まれるが、ただしこれらに限定されない。例えば、リソゾーム区画内の低pHによる切断に感受性であるか、又はプロテアーゼ（例えばもっぱら腫瘍組織で発現されるプロテアーゼ（例えばカテプシン、例えばカテプシンB、C、D））による切断に感受性であるリンカーを選択できる。
サイトトキシンの例は、例えば以下に記載されている：米国特許6,989,452号、7,087,600号、及び7,129,261号、並びにPCT出願PCT/US2002/17210、PCT/US2005/017804、PCT/US2006/37793、PCT/US2006/060050、PCT/US2006/060711、WO2006/110476並びに米国特許出願60/891,028（前記文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。サイトトキシンのタイプ、治療薬剤を抗体と複合化させるリンカー及び方法については、以下もまた参照されたい：Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215；Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212；Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。
親和性試薬はまた放射性同位元素と複合化させて細胞傷害性放射性医薬（放射性免疫複合化物とも称される）を作出することができる。診断薬又は治療薬として使用するために抗体と複合化させることができる放射性同位元素の例には、ヨウ素131、インジウム111、イットリウム90及びルテチウム177が含まれるが、ただしこれらに限定されない。放射性免疫複合化物の例は市場で利用可能であり、Zevalin(商標)（IDEC Pharmaceuticals）及びBexxar(商標)（Corixa Pharmaceuticals）が含まれ、本発明の抗体を用い同様な方法によって放射性免疫複合化物を調製できる。
親和性試薬はまたフタロシアニン染料と複合化させることができ、以下ではフタロシアニン複合化物と称する。診断薬又は治療薬として使用するために抗体と複合化させることができるフタロシアニン染料の例にはIR700が含まれるが、ただし前記に限定されない。フタロシアニン複合化物を調製する方法は例えば以下に記載されている：Mitsunaga M, Ogawa M, Kosaka N, Rosenblum LT, Choyke PL and Kobayashi H (2011) Nat Med. 2011 Nov 6. doi: 10.1038/nm.2554。
複合化物は与えられた生物学的応答を改変するために用いることができ、薬部分は古典的な化学的治療薬剤に限定されると解されるべきではない。例えば、薬部分は所望の生物学的活性を保有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には例えば以下が含まれ得る：酵素的に活性なトキシン又はその活性なフラグメント、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子又はインターフェロン-γ；又は生物学的応答の改変因子、例えばリンホカイン、インターロイキン-1（“IL-1”）、インターロイキン-2（“IL-2”)、インターロイキン-6（“IL-6”)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（“GM-CSF”）、顆粒球コロニー刺激因子（“G-CSF”)、又は他の増殖因子（Senter P.D. (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244；Kovtun et al. (2010) Cancer Res. 70(6):2528-2537）。
そのような治療薬部分を抗体と複合化させる技術は周知であり、例えば以下を参照されたい：Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)；及びThorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58, 1982。
また別には、抗体を第二の抗体と複合化させ、米国特許4,676,980号（Segal）に記載されたように抗体ヘテロ複合化物を形成することができる。
治療薬部分と複合化されてあるか又は治療薬部分とは複合化されていない抗体を治療薬として用いることができ、前記は単独で又は細胞傷害性因子及び／又はサイトカインと併用して投与される。
本発明はまた、抗体指令細胞媒介細胞傷害（ADCC）を誘発する完全にヒトの又はヒト化抗体を提供する。完全にヒトの抗体は、該タンパク質が、単離された抗体産生ヒトBリンパ球又はトランスジェニックマウス（ネズミ免疫グロブリンをコードする染色体領域がオルソロガスヒト配列によって取換えられている）のBリンパ球のどちらかに由来する天然に存在するヒト免疫グロブリン配列によってコードされる抗体である。後者のタイプのトランスジェニック抗体には、HuMab（Medarex, Inc, CA）及びXenoMouse（Abgenix Inc., CA）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ヒト化抗体は、適切な抗原特異性を有する非ヒト抗体分子の定常領域が、適切なエフェクター機能を有するヒト抗体（好ましくはIgGサブタイプ）の定常領域と取換えられている抗体である（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855；Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608；Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454）。適切なエフェクター機能にはADCCが含まれる。ADCCは正常なプロセスであり、そのプロセスによって、完全にヒトの抗体又はヒト化抗体は、癌細胞表面の標的と結合したとき、正常な免疫系の部分であるリンパ球の細胞殺滅特性にスイッチを入れる。これらの能動的リンパ球（ナチュラルキラー（NK）細胞と呼ばれる）は細胞傷害性プロセスを利用して、抗体が結合している生細胞を破壊する。ADCC活性は、抗原特異的抗体及び生きているヒト対象から抽出した末梢血単核球の存在下で、ユーロピウム（Eu3+）標識生細胞から放出されるEu3+を測定することによって検出及び定量することができる。ADCCのプロセスは以下に詳細に記載されている：Janeway Jr. C.A. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X；Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5；Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:p2153-68；及びWeng, W.-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21:p 3940-3947。ADCCの検出及び定量のための適切な方法は以下で見出すことができる：Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 86:p225-9；Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 21;92:p117-23；及びPatel & Boyd, Journal of Immunological Methods. 1995, 184:p29-38。
ADCCは典型的にはNK細胞の活性化を必要とし、NK細胞表面のFc受容体による抗体被覆細胞の認識に依存する。Fc受容体は、標的細胞の表面に特異的に結合した抗体（例えばIgG）のFc（結晶構造）部分を認識する。NK細胞の活性化を引き起こすFc受容体はCD16又はFcγRIIIaと呼ばれる。いったんFcγRIIIa受容体がIgG Fcと結合したら、NK細胞はサイトカイン（例えばIFN-γ）及び細胞傷害性顆粒を放出する。前記顆粒はパーホリン及びグランザイムを含み、これらは標的細胞に侵入しアポトーシスを引き起こすことによって細胞死を促進する。
抗体による抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）の誘発は、抗体定常領域（Fc）と免疫系の細胞の表面に存在する多様な受容体との相互作用を変化させる改変によって強化することができる。そのような改変には、哺乳動物細胞での天然の又は組換えによる合成中に抗体のFcに通常付加される複合オリゴ糖鎖のアルファ1,6-結合フコース部分の減少又は消失が含まれる。好ましい実施態様では、非フコシル化抗DLL3親和性試薬（例えば抗体又はそのフラグメント）は、ADCC応答を誘発するそれらの活性を強化する目的のために製造される。
Fcのオリゴ糖鎖のアルファ1,6-結合フコース部分を減少又は除去する技術はしっかり確立されている。ある例では、組換え抗体は、N-結合二分岐複合Fcオリゴ糖の最内部のN-アセチルグルコサミンにアルファ1,6結合でフコースを付加する能力が障害されている細胞株で合成される。そのような細胞株にはラットハイブリドーマYB2/0が含まれ（ただし前記に限定されない）、前記は、アルファ1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8を低レベルで発現する。好ましくは、該抗体は、FUT8遺伝子の両コピーの欠失のために、アルファ1,6-結合フコシル部分を複合オリゴ糖鎖に付加することができない細胞株で合成される。そのような細胞株にはFUT8-/-CHO/DG44細胞株が含まれる（ただし前記に限定されない）。部分的にフコシル化された又は全くフコシル化されない抗体及び親和性試薬を合成する技術は以下に記載されている：Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-34735, 2003；Yamane-Ohnuki et al., Biotechnology and Bioengineering 87: 614-22, 2004；並びにWO00/61739 A1、WO02/31140 A1及びWO03/085107 A1。第二の例では、組換え抗体のフコシル化は、二分N-アセチルグルコサミンを保持する複合N-結合オリゴ糖の産生を最大にするレベルで糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを過剰発現するように遺伝的に操作されてある細胞株で合成することによって低下又は停止される。例えば、抗体は、酵素N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼIII（GntIII）を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株で合成される。適切な糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを安定的にトランスフェクトされた細胞株、及びこれらの細胞を用いて抗体を合成する方法はWO99/54342に記載されている。
非フコシル化抗体又は親和性試薬を単独で又は細胞傷害性因子及び／又はサイトカインと併用して投与される治療薬として用いることができる。
さらに別の改変では、抗体Fcのアミノ酸配列は、リガンド親和性に影響を与えることなくADCC活性化を強化する態様で変更される。そのような改変の例は以下に記載されている：Lazar et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 2006, 103: p4005-4010；WO03/074679及びWO2007/039818。これらの例では、抗体Fcのアミノ酸の置換（例えば239位のセリンをアスパルテートに及び332位のグルタメートをイソロイシンに置換）は、Fc受容体に対する抗体の結合親和性を変化させてADCC活性化の増加をもたらす。
アミノ酸置換によりADCC活性化が強化された抗体試薬は、単独で又は細胞傷害性因子及び／又はサイトカインと併用して投与される治療薬として用いることができる。
本発明はまた、第一の標的エピトープ（すなわちDLL3）に対する少なくとも1つの第一の結合特異性及び第二の標的エピトープに対する第二の結合特性を含む二重特異性分子を提供する。第二の標的エピトープは、第一の結合特異性によって結合される標的タンパク質と同じ標的タンパク質に存在するか、又は第二の標的エピトープは、第一の結合特異性によって結合される第一のタンパク質とは異なる標的タンパク質に存在することができる。第二の標的エピトープは、第一の標的エピトープ（すなわちDLL3）と同じ細胞に存在するか、又は第二の標的エピトープは、第一の標的エピトープを提示する細胞が提示しない標的に存在することができる。本明細書で用いられるように、‘結合特異性’という用語は、少なくとも1つの抗体可変ドメインを含む部分を指す。
ある実施態様では、二重特異性分子はBiTE（二重特異性T細胞嵌合体）である。特に、本発明は二重特異性親和性試薬（好ましくは二重特異性抗体）を提供し、前記はDLL3のための第一の結合ドメイン及びT細胞抗原（好ましくはCD3）のための第二の結合ドメインを含む。
これらの二重特異性分子はDLL3発現細胞をCD3発現エフェクター細胞（例えばCD3発現細胞傷害性T細胞）へ向かわせ、CD3媒介エフェクター細胞活性（例えばT細胞クローン増殖及びT細胞細胞傷害性）を誘発する。本発明の二重特異性抗体は、合計して2つ又は3つの抗体可変ドメインを有することができ、ここで二重特異性抗体の第一の部分は、ヒト免疫エフェクター細胞に局在するエフェクター抗原に特異的に結合することによってヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することができ、ここで該エフェクター抗原はヒトCD3抗原で、前記第一の部分は1つの抗体可変ドメインから成り、二重特異性抗体の第二の部分はエフェクター抗原以外の標的抗原（例えばDLL3）と特異的に結合でき、前記標的抗原は前記ヒト免疫エフェクター細胞以外の標的細胞に局在し、さらに前記第二の部分は1つ又は2つの抗体可変ドメインを含む。
ある好ましい実施態様では、本発明は肺癌（好ましくは小細胞肺癌）の治療のためのDLL3及びCD3と結合する二重特異性抗体（好ましくはBiTE）を提供する。
本発明の疾患を含む癌の診断
本発明の別の特徴にしたがえば、対象において癌（例えば本発明の疾患）を検出、診断及び／又はスクリーニングするか、若しくはその進行を監視する、又は本発明の疾患を対象とする例えば抗癌薬又は療法の有効性を監視する方法が提供され、前記方法は、DLL3又は1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在又はレベルを検出する工程を含むか、又はそのレベルの変化を前記対象において検出する工程を含む。
本発明の別の特徴にしたがえば、対象において癌（例えば本発明の疾患）を検出、診断及び／又はスクリーニングする方法が提供され、前記方法は、前記対象においてDLL3又は1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在を検出する工程を含み、ここで（a）健康な対象のレベルと比較して、前記対象におけるDLL3又は前記1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体のレベル上昇の存在、又は（b）健康な対象の対応する検出不能なレベルと比較して、前記対象におけるDLL3又は前記1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の検出可能なレベルの存在が、前記対象における前記癌の存在の指標となる。
癌（例えば本発明の疾患）を検出、診断及び／又はスクリーニングするある具体的な方法は以下の工程を含む：
生物学的サンプルを被検DLL3又は1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントとの接触に至らせる工程；及び
DLL3又は1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在を該対象において検出する工程。
本発明の別の特徴にしたがえば、対象において癌（例えば本発明の疾患）の進行を監視するか、又は本発明の疾患を対象とする抗癌薬又は療法の有効性を監視する方法が提供され、前記方法は、前記対象において、第一の時点及びその後の時点におけるDLL3又は1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在を検出する工程を含み、前記対象において前記第一の時点における当該レベルと比較して、前記対象において後の時期におけるDLL3又は前記1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の上昇又は下降レベルの存在が、前記対象における前記癌の進行若しくは退縮、又は前記抗癌薬若しくは療法の有効若しくは無効の指標となる。
DLL3又は1つ以上のエピトープを含むそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在は、典型的には、前記対象から入手される生物学的サンプルの分析によって検出される（代表的な生物学的サンプルは上記に記載され、該サンプルは肺臓、膵臓及び皮膚組織サンプル、そうでなければ血液又は唾液サンプルである）。当該方法は、典型的には前記対象から分析のために前記生物学的サンプルを入手する工程を含む。検出できる抗体にはIgA、IgM及びIgG抗体が含まれる。
本発明にしたがえば、本発明の疾患を有すると疑われる又は有することが判明している対象から入手される、例えば肺臓、膵臓又は皮膚組織、血清、血漿又は尿の試験サンプルを診断又は監視に用いることができる。ある実施態様では、コントロールサンプル（本発明の疾患をもたない一人又は複数の対象から入手される）又は以前に決定した参照範囲と対比して試験サンプルにおけるDLL3の豊富さの変化が、本発明の疾患の存在の指標となる。別の実施態様では、コントロールサンプル又は以前に決定した参照範囲と対比して、試験サンプルにおけるDLL3の相対的豊富さは本発明の疾患の亜型（例えば小細胞癌、扁平上皮細胞肺癌、膵臓の内分泌腺腫瘍又は扁平上皮細胞皮膚癌、メラノーマ）の指標となる。さらにまた別の実施態様では、コントロールサンプル又は以前に決定した参照範囲と対比して試験サンプルにおけるDLL3の相対的豊富さは、本発明の疾患の程度又は重篤度（例えば転移の蓋然性）の指標である。前述の方法のいずれにおいても、DLL3の検出は、場合によって本発明の疾患のための1つ以上のさらに別のバイオマーカーの検出と組み合わせることができる。当業界の任意の適切な方法を利用してDLL3のレベルを測定でき、前記には本明細書に記載の好ましい技術、キナーゼアッセイ、DLL3を検出及び／又は可視化する免疫アッセイ（例えばウェスタンブロット、免疫沈澱とそれに続くドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学など）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらに別の実施態様では、コントロールサンプル又は以前に決定した参照範囲と対比して、試験サンプルにおけるDLL3をコードするmRNAの豊富さにおける変化は本発明の疾患の存在の指標となる。任意の適切なハイブリダイゼーションアッセイを用いて、DLL3をコードするmRNAの検出及び／又は可視化によりDLL3発現を検出することができる（例えばノザンアッセイ、ドットブロット、in situハイブリダイゼーションなど）。
本発明の別の実施態様では、標識抗体（又は他の親和性試薬）、その誘導体又はアナローグ（前記はDLL3と特異的に結合する）が診断目的に用いられ、本発明の疾患を検出、診断又は監視することができる。好ましくは、本発明の疾患は、動物で、より好ましくは哺乳動物で、最も好ましくはヒトで検出される。
スクリーニングアッセイ
本発明は、DLL3と結合するか、又はDLL3の発現又は活性に対して刺激性又は阻害性作用を有する薬剤（例えば候補化合物又は試験化合物）を同定する方法を提供する。本発明はまた、DLL3関連ポリペプチド若しくはDLL3融合タンパク質と結合するか、又はDLL3関連ポリペプチド若しくはDLL3融合タンパク質の発現又は活性に対して刺激性又は阻害性作用を有する薬剤、候補化合物又は試験化合物を同定する方法を提供する。薬剤、候補化合物又は試験化合物の例には、核酸（例えばDNA及びRNA）、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、小分子及び他の薬が含まれるが、ただしこれらに限定されない。薬剤は、以下を含む、当業界で公知のコンビナトリアルライブラリーの方法での多数のアプローチのいずれかを用いて入手できる：生物学的ライブラリー、空間的にアドレスできるパラレル固相又は液相ライブラリー、デコンボルーションを必要とする合成ライブラリー方法、“1ビーズ1化合物”ライブラリー方法、及び親和性クロマトグラフィー選別を必要とする合成ライブラリー方法。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーにも適用できる（Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145；米国特許5,738,996号；及び米国特許5,807,683号（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。
分子ライブラリーを合成する方法の例は例えば以下で見出すことができる：DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909；Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422；Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678；Cho et al., 1993, Science 261:1303；Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；及びGallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。
化合物ライブラリーは例えば以下の状態で提示できる：溶液として（例えば、Houghten, 1992, BioTechniques 13:412-421）又はビーズ上で（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌（米国特許5,223,409号）、種子（米国特許5,571,698号；5,403,484号；及び5,223,409号）、プラスミド（Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869）、又はファージ（Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390；Devlin, 1990, Science 249:404-406；Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382；及びFelici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。
ある実施態様では、DLL3、DLL3フラグメント（例えば機能的に活性なフラグメント）、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質と相互作用する（すなわち結合する）薬剤は、細胞依拠アッセイ系で同定される。この実施態様にしたがえば、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質を発現する細胞を、候補化合物又はコントロール化合物と接触させ、DLL3と相互作用する候補化合物の能力を決定する。所望の場合は、このアッセイを用いて複数の候補化合物（候補化合物ライブラリー）をスクリーニングすることができる。例えば細胞は、原核細胞起源（例えば大腸菌）又は真核細胞起源（例えば酵母又は哺乳動物）であり得る。さらにまた、細胞は、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質を内因的に発現するか、又は遺伝的に操作されてDLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質を発現することができる。ある種の事例では、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント若しくはDLL3融合タンパク質又は候補化合物は、例えば放射性標識（例えば32P、35S及び125I）又は蛍光標識（例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド又はフルオレスカミン）で標識して、DLL3と候補化合物との間の相互作用の検出を可能にする。候補化合物が、直接又は間接的にDLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質と相互作用する能力は、当業者に公知の方法によって決定できる。例えば、候補化合物とDLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質との間の相互作用は、フローサイトメトリー、シンチレーションアッセイ、免疫沈澱又はウェスタブロット分析によって決定できる。
別の実施態様では、DLL3、DLL3フラグメント（例えば機能的に活性なフラグメント）、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質と相互作用する（すなわち結合する）薬剤は、無細胞アッセイ系で同定される。この実施態様にしたがえば、自然のままの若しくは組換えのDLL3又はそのフラグメント、又は自然のままの若しくは組換えのDLL3関連ポリペプチド又はそのフラグメント、又はDLL3融合タンパク質又はそのフラグメントは、候補化合物又はコントロール化合物と接触され、DLL3、又はDLL3関連ポリペプチド又はDLL3融合タンパク質と相互作用する候補化合物の能力が決定される。所望される場合には、このアッセイを用いて複数の候補化合物（例えば候補化合物ライブラリー）をスクリーニングすることができる。好ましくは、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質は、先ず初めに、例えばDLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質を、前記を特異的に認識し結合する固定された抗体（又は他の親和性試薬）と接触させることによって、又はDLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質の精製調製物をタンパク質が結合するように設計された表面と接触させることによって固定される。DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質は部分的に若しくは完全に精製されるか、又は細胞溶解物の部分であり得る。さらにまた、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、又はDLL3関連ポリペプチドのフラグメントは、DLL3若しくはその生物学的に活性な部分、又はDLL3関連ポリペプチド及びドメイン、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼを含む融合タンパク質であり得る。また別には、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質は、当業者に周知の技術を用いてビオチニル化することができる。（例えばビオチニル化キット（Pierce Chemicals; Rockford, IL））。候補化合物のDLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質と相互作用する能力は、当業者に公知に方法によって決定することができる。
別の実施態様では、細胞依拠アッセイ系を用いて、DLL3の生成又は分解に必要な、又はDLL3の翻訳後改変に必要なタンパク質（例えば酵素）又はその生物学的に活性な部分と結合するか、又は前記の活性を調整する薬剤を同定する。一次スクリーニングでは、DLL3、DLL3のアイソフォーム、DLL3のホモローグ、DLL3関連ポリペプチド、DLL3融合タンパク質又はフラグメントの生成、分解又は翻訳後改変を調整する化合物を同定するために、複数の化合物（例えば化合物ライブラリー）が、以下を天然に又は組換えにより発現する細胞と接触させられる：（i）DLL3、DLL3のアイソフォーム、DLL3のホモローグ、DLL3関連ポリペプチド、DLL3融合タンパク質、又は前述のいずれかの生物学的に活性なフラグメント；及び（ii）DLL3、DLL3のアイソフォーム、DLL3のホモローグ、DLL3関連ポリペプチド、DLL3融合タンパク質又はフラグメントのプロセッシングに必要なタンパク質。所望される場合には、続いて、一次スクリーニングで同定された化合物を、天然に又は組換えによりDLL3を発現する細胞に対してアッセイすることができる。DLL3、アイソフォーム、ホモローグ、DLL3関連ポリペプチド又はDLL3融合タンパク質の生成、分解又は翻訳後改変を調整する候補化合物の能力は、当業者に公知の方法（フローサイトメトリー、シンチレーションアッセイ、免疫沈澱及びウェスタンブロット分析が含まれるが、ただしこれらに限定されない）によって決定できる。
別の実施態様では、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質と競合的に相互作用する（すなわち結合する）薬剤が、競合結合アッセイで同定される。この実施態様にしたがえば、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質を発現する細胞が、候補化合物及びDLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質と相互作用することが判明している化合物と接触され、続いて、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質と優先的に相互作用する候補化合物の能力が決定される。また別には、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド又はDLL3関連ポリペプチドのフラグメントと優先的に相互作用する（すなわち結合する）薬剤が、無細胞アッセイ系で、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質を、候補化合物及びDLL3、DLL3関連ポリペプチド又はDLL3融合タンパク質と相互作用することが判明している化合物と接触させることによって同定される。上記で述べたように、DLL3、DLL3フラグメント、DLL3関連ポリペプチド、DLL3関連ポリペプチドのフラグメント又はDLL3融合タンパク質と相互作用する候補化合物の能力は、当業者に公知の方法によって決定できる。細胞に依拠しようと又は無細胞であろうと、これらのアッセイを用いて複数の候補化合物（又は化合物ライブラリー）をスクリーニングすることができる。
別の実施態様では、DLL3又はDLL3関連ポリペプチドの発現又は活性を調整する（すなわちアップレギュレート又はダウンレギュレートする）薬剤は、DLL3又はDLL3関連ポリペプチドを発現する細胞（例えば原核細胞起源又は真核細胞起源の細胞）を候補化合物又はコントロール化合物（例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS））と接触させ、DLL3、DLL3関連ポリペプチド若しくはDLL3融合タンパク質、DLL3をコードするmRNA、又はDLL3関連ポリペプチドをコードするmRNAの発現を決定することによって同定される。候補化合物の存在下におけるDLL3、DLL3関連ポリペプチド、DLL3をコードするmRNA、又はDLL3関連ポリペプチドをコードするmRNAの発現のレベルが、候補化合物の非存在下における（例えばコントロール化合物の存在下における）DLL3、DLL3関連ポリペプチド、DLL3をコードするmRNA、又はDLL3関連ポリペプチドをコードするmRNAの発現のレベルと比較される。続いてこの比較に基づいて、候補化合物をDLL3又はDLL3関連ポリペプチドの発現の調整物として同定することができる。例えば、候補化合物の存在下におけるDLL3又はmRNAの発現が候補化合物の非存在下における発現よりも顕著に強いとき、候補化合物はDLL3又はmRNAの発現の刺激物質として同定される。或いは、候補化合物の存在下におけるDLL3又はmRNAの発現が候補化合物の非存在下における発現よりも顕著に低いとき、候補化合物はDLL3又はmRNAの発現の阻害物質として同定される。DLL3又は前記をコードするmRNAの発現のレベルは当業者に公知の方法によって決定できる。例えば、mRNAの発現はノザンブロット分析又はRT-PCRによって評価でき、タンパク質レベルはウェスタンブロット分析によって評価できる。
別の実施態様では、DLL3又はDLL3関連ポリペプチドの活性を調整する薬剤は、DLL3若しくはDLL3関連ポリペプチドを含む調製物又はDLL3若しくはDLL3関連ポリペプチドを発現する細胞（例えば原核細胞又は真核細胞）を試験化合物又はコントロール化合物と接触させ、試験化合物がDLL3又はDLL3関連ポリペプチドの活性を調整する（例えば刺激するか又は阻害する）能力を決定することによって同定される。DLL3又はDLL3関連ポリペプチドの活性は、DLL3又はDLL3関連ポリペプチドの細胞内シグナルトランスダクション経路の誘発（例えば細胞内Ca2+、ジアシルグリセロール、IP3など）の検出、適切な基質に対する該標的の触媒活性又は酵素活性の検出、レポーター遺伝子（例えばDLL3又はDLL3関連ポリペプチドに応答性を示し、検出可能なマーカー（例えばルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動できるように連結される調節エレメント）の誘発の検出、又は細胞性応答（例えば細胞分化又は細胞増殖）の検出によって評価することができる。本記載に基づいて、当業者に公知の技術をこれら活性の測定のために用いることができる（例えば米国特許5,401,639号を参照されたい（前記文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる））。続いて、候補化合物の作用をコントロール化合物と比較することによって、候補化合物をDLL3又はDLL3関連ポリペプチドの活性の調整物質として同定することができる。適切なコントロール化合物にはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び通常の生理食塩水（NS）が含まれる。
別の実施態様では、DLL3又はDLL3関連ポリペプチドの発現、活性又は発現及び活性の両方を調整する（すなわちアップレギュレートするか又はダウンレギュレートする）薬剤は動物モデルで同定される。適切な動物の例にはマウス、ラット、ウサギ、サル、モルモット、イヌ及びネコが含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましくは、用いられる動物は本発明の疾患のモデルである（例えば小細胞肺癌細胞株（例えばNCI-H345）の異種移植、非小細胞肺癌細胞株（例えばA549及びH460）の異種移植、膵臓癌細胞株（例えばMIA PaCa-2）のヌードマウスにおける異種移植（Marincola et al., J Surg Res 1989 Dec;47(6):520-9）、又は皮膚癌細胞株（例えばMV3）のヌードマウスにおける異種移植（van Muijen et al., Int J Cancer 1991 Apr 22;48(1):85-91））。これらはDLL3レベルを調整する化合物の試験に利用することができる。なぜならば、これらのモデルで示される病理学は、例えば本発明の疾患の病理学と類似するからである。この実施態様にしたがえば、試験化合物又はコントロール化合物が適切な動物に投与され（例えば経口的に、直腸に又は非経口的に（例えば腹腔内に又は静脈内に））、DLL3又はDLL3関連ポリペプチドの発現、活性又は発現及び活性の両方に対する影響が決定される。DLL3又はDLL3関連ポリペプチドの発現の変化を上記で概略した方法によって評価することができる。
さらにまた別の実施態様では、DLL3又はDLL3関連ポリペプチドを二ハイブリッドアッセイ又は三ハイブリッドアッセイで“おとりタンパク質”として用い、DLL3又はDLL3関連ポリペプチドと結合又は相互作用する他のタンパク質を同定する（例えば以下を参照されたい：米国特許5,283,317号；Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232；Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054；Bartel et al. (1993) BioTechniques 14:920-924；Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696；及びPCT公開公報WO 94/10300）。当業者には理解されるように、そのような結合タンパク質はまた、DLL3が中心的に関与するシグナリング経路の例えば上流又は下流エレメントとして、DLL3によるシグナルの伝播に同様に必要とされる。
本発明はさらに、上記に記載のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤及び本明細書に記載の治療のためのその使用を提供する。さらに、本発明はまた、DLL3と相互作用するか又はDLL3の活性を調節する薬剤の、本発明の疾患の治療用医薬の製造における使用を提供する。
DLL3の治療的使用
本発明は、治療的化合物の投与によって多様な疾患及び異常の治療又は予防を提供する。そのような化合物には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：DLL3、DLL3アナローグ、DLL3関連ポリペプチド並びにその誘導体及び変種（フラグメントを含む）；前述のものに対する抗体（又は他の親和性試薬）；DLL3、DLL3アナローグ、DLL3関連ポリペプチド及びそのフラグメントをコードする核酸；DLL3又はDLL3関連ポリペプチドをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸；及びDLL3又はDLL3関連ポリペプチドをコードする遺伝子の調整物質（例えばアゴニスト及びアンタゴニスト）。本発明の重要な特色は、癌（例えば本発明の疾患）に中心的に関与するDLL3をコードする遺伝子の同定である。例えば、本発明の疾患は、本発明の疾患を有する対象の血清又は組織でDLL3の機能又は発現を低下させる治療的化合物の投与によって治療（症状の緩和又は開始若しくは進行の遅滞）又は予防される。
ある実施態様では、1つ以上の抗体（又は他の親和性試薬）（各々は特異的にDLL3と結合する）は、単独で又は1つ以上のさらに別の治療的化合物又は治療と併用して投与される。
生物学的生成物、例えば抗体（又は他の親和性試薬）は、それが投与される対象にとって同種異系である。ある実施態様では、ヒトDLL3若しくはヒトDLL3関連ポリペプチド、ヒトDLL3若しくはヒトDLL3関連ポリペプチドをコードする核酸配列、又はヒトDLL3若しくはヒトDLL3関連ポリペプチドに対する抗体（又は他の親和性試薬）が、治療（症状の緩和又は開始若しくは進行の遅滞）又は予防のためにヒト対象に投与される。
理論に拘束されないが、DLL3に特異的に結合する抗体（又は他の親和性試薬）の治療的活性は抗体依存細胞媒介細胞傷害（ADCC）の現象を介して達成され得ると考えられる（例えば以下を参照されたい：Janeway Jr. C.A. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X；Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5；Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:p2153-68；及びWeng, W-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21:p 3940-3947）。
本発明の疾患の治療及び予防
例えば、本発明の疾患は、本発明の疾患の1つ以上を有すると疑われるか、又は前記を有すること若しくは本発明の疾患を発症させるリスクがあることが判明している対象に、本発明の疾患に罹患していない対象の血清又は組織と比較して本発明の疾患の1つ以上を有する対象の血清又は組織に弁別的に存在するDLL3のレベル又は活性（すなわち機能）を調整する（すなわち増加又は低下させる）化合物を投与することによって治療又は予防される。ある実施態様では、本発明の疾患は、本発明の疾患の1つ以上を有すると疑われるか、又は前記を有すること若しくは本発明の疾患を発症させるリスクがあることが判明している対象に、本発明の疾患の1つ以上を有する対象の血清又は組織で増加しているDLL3のレベル又は活性（すなわち機能）をアップレギュレートする（すなわち低下させる）化合物を投与することによって治療又は予防される。そのような化合物の例には、DLL3アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、DLL3に対する抗体（又は他の親和性試薬）、及びDLL3の酵素活性を阻害する化合物が含まれるが、ただしこれらに限定されない。他の有用な化合物、例えばDLL3アンタゴニスト及び小分子DLL3アンタゴニストはin vitroアッセイを用いて同定することができる。
癌（例えば本発明の疾患）はまた、そのような癌を有すると疑われるか、又はそのような癌を有すること若しくはそのような癌を発症させるリスクがあることが判明している対象に、そのような癌を有する対象の血清又は組織で増加しているDLL3のレベル又は活性（すなわち機能）をダウンレギュレートする化合物を投与することによって治療又は予防され得る。そのような化合物の例には、DLL3、DLL3のフラグメント及びDLL3関連ポリペプチド；DLL3、DLL3のフラグメント及びDLL3関連ポリペプチドをコードする核酸（例えば遺伝子療法での使用のため）；及び酵素活性を有するそれらDLL3又はDLL3関連ポリペプチドに対して、当該酵素活性を調整することが判明している化合物又は分子が含まれるが、ただしこれらに限定されない。用いることができる他の化合物は例えばDLL3アゴニストであり、前記はin vitroアッセイを用いて同定することができる。
別の実施態様では、療法又は予防法は個々の対象の必要性にしたがって調節される。したがって、特定の実施態様では、DLL3のレベル又は機能を促進する化合物は、癌（例えば本発明の疾患）を有すると疑われる又は有することが判明している対象（DLL3のレベル又は機能は存在しないか又はコントロール若しくは正常参照範囲と対比して低下している）に治療的に又は予防的に投与される。さらに別の実施態様では、DLL3のレベル又は機能を促進する化合物は、癌（例えば本発明の疾患）を有すると疑われる又は有することが判明している対象（DLL3のレベル又は機能はコントロール若しくは参照範囲と対比して増加している）に治療的に又は予防的に投与される。さらに別の実施態様では、DLL3のレベル又は機能を低下させる化合物は、癌（例えば本発明の疾患）を有すると疑われる又は有することが判明している対象（DLL3のレベル又は機能はコントロール若しくは参照範囲と対比して増加している）に治療的に又は予防的に投与される。さらに別の実施態様では、DLL3のレベル又は機能を低下させる化合物は、癌（例えば本発明の疾患）を有すると疑われる又は有することが判明している対象（DLL3のレベル又は機能はコントロール若しくは参照範囲と対比して低下している）に治療的に又は予防的に投与される。そのような化合物の投与によるDLL3機能又はレベルの変化は、例えばサンプル（例えば血液又は尿）を入手して、DLL3のレベル若しくは活性を、又はDLL3をコードするmRNAのレベルを、又は前述の任意の組み合わせをin vitroでアッセイすることによって容易に検出することができる。そのようなアッセイは、本明細書に記載の化合物の投与の前及び後で実施することができる。
本発明の化合物には、DLL3のプロフィールを正常に回復させる任意の化合物、例えば小さな有機分子、タンパク質、ペプチド、抗体（又は他の親和性試薬）、核酸などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の化合物は任意の他の化学療法薬と併用して投与できる。
ワクチン療法
本発明の別の特徴は、DLL3若しくはそのエピトープ含有フラグメント、又はDLL3若しくはそのフラグメントをコードする核酸を場合によって免疫刺激剤と一緒に含む免疫原性組成物（適切にはワクチン組成物）である。
そのような組成物を対象に投与する工程を含む免疫応答を惹起する方法、並びにそのような組成物の治療的に有効な量をその必要がある対象に投与する工程を含む癌（例えば本発明の疾患）を治療又は予防する方法、並びに本発明の疾患の予防又は治療で使用されるそのような組成物もまた提供される。
したがって、DLL3は抗原性物質として有用であり、癌（例えば本発明の疾患）の治療又は予防用ワクチンの製造で用いることができる。そのような物質は“抗原性”及び／又は“免疫原性”である。一般的に、“抗原性”は、当該タンパク質が抗体（又は他の親和性試薬）を生じるために用いることができるか、又は実際に対象又は実験動物で抗体応答を誘発できることを意味すると理解される。“免疫原性”は、当該タンパク質が対象又は実験動物で免疫応答（例えば防御性免疫応答）を誘引することができることを意味すると理解される。したがって、後者の事例では、当該タンパク質は、抗体応答だけでなく、さらにまた非抗体系免疫応答もまた生じることができる。“免疫原性”はまた、当該タンパク質がin vitro設定（例えばT細胞増殖アッセイ）で免疫様応答を誘引できるか否かにも及ぶ。適切な免疫応答の発生は1つ以上のアジュバントの存在及び／又は抗原の適切な提示を要求し得る。
DLL3のホモローグ又は誘導体もまた抗原性/免疫原性物質として有用であろうということは、当業者には理解されよう。したがって、例えば1つ以上の付加、欠失、置換などを含むタンパク質は本発明に包含される。さらにまた、1つのアミノ酸を類似する“タイプ”の別のものに取換えること、例えば1つの疎水性アミノ酸を別のものに取換えることが可能である。例えばCLUSTALのようなプログラムを用いてアミノ酸配列を比較することができる。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、どちらかの配列に適切なように空隙を挿入することによって最適なアラインメントを見つける。最適なアラインメントに対してアミノ酸同一性又は類似性（同一性プラスアミノ酸タイプの類似性）を計算することが可能である。BLASTxのようなプログラムは類似する配列の最長の一続きをアラインメントして、該適合性に数値を割り当てるであろう。したがって、類似性を有するいくつかの領域（各々が異なるスコアを有する）が見出される比較を得ることが可能である。本発明では両タイプの分析が意図される。
ホモローグ及び誘導体の事例では、本明細書に記載のタンパク質との同一性の程度は、ホモローグ又は誘導体がその抗原性及び／又は免疫原性を保持すべきであるということほど重要ではない。しかしながら、適切には本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチドと少なくとも60％の類似性（上記で考察したとおり）を有するホモローグ又は誘導体が提供され、例えば少なくとも70％の類似性、例えば少なくとも80％の類似性を有するホモローグ又は誘導体が提供される。特に少なくとも90％又は95％もの類似性を有するホモローグ又は誘導体が提供される。適切には、ホモローグ又は誘導体は、本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチドと少なくとも60％の配列同一性を有する。好ましくは、ホモローグ又は誘導体は少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも80％の同一性を有する。もっとも好ましくは、ホモローグ又は誘導体は少なくとも90％又は95％もの同一性を有する。
また別のアプローチでは、ホモローグ又は誘導体は融合タンパク質であることもでき、該融合タンパク質は、例えば所望のタンパク質又はポリペプチドに効率的にタグを付することによって精製を容易にする部分を取り込んでいる。“タグ”を除去することが必要であるが、融合タンパク質それ自体が有益である十分な抗原性を保持している場合もあり得る。
抗原性タンパク質又はポリペプチドをスクリーニングして、エピトープ領域（すなわちタンパク質又はポリペプチドの抗原性又は免疫原性に必要な領域）を同定することが可能なことは周知である。当業者に周知の方法を用いて、抗原性についてフラグメント及び／又はホモローグ及び／又は誘導体を試験することができる。したがって、本発明のフラグメントは、1つ以上のそのようなエピトープ領域又はそれらの抗原性/免疫原性特性を保持するためにそのような領域に十分に類似する領域を含むべきである。したがって本発明のフラグメントにとって同一性の程度はおそらく問題とされない。なぜならば、それらフラグメントは、本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチド、ホモローグ又は誘導体の特定の部分に対して100％同一であり得るからである。もう一度言えば、重要な問題は、フラグメントは、当該フラグメントが誘導されたタンパク質の抗原性/免疫原性特性を保持するということである。
ホモローグ、誘導体及びフラグメントにとって重要なことは、それらが誘導されたタンパク質又はポリペプチドの抗原性/免疫原性の少なくともある程度をそれらが保有しているということである。したがって、本発明のさらに別の特徴にしたがえば、DLL3又はそのホモローグ若しくは誘導体の抗原性/免疫原性フラグメントが提供される。
DLL3又はその抗原性フラグメントは、単独で、精製又は単離調製物として提供することができる。それらは、本発明の1つ以上の他のタンパク質又はその抗原性フラグメントとの混合物の部分として提供され得る。さらに別の特徴では、したがって本発明は、DLL3及び／又は1つ以上のその抗原性フラグメントを含む抗原性組成物を提供する。そのような組成物は、癌（例えば本発明の疾患）の検出及び／又は診断に用いることができる。
本発明のワクチン組成物は予防的又は治療的ワクチン組成物であり得る。
本発明のワクチン組成物は1つ以上のアジュバント（免疫刺激剤）を含むことができる。当業界で周知の例には、無機ゲル（例えば水酸化アルミニウム）及び油中水エマルジョン（例えば不完全フロイントのアジュバント）が含まれる。他の有用なアジュバントは当業者には周知であろう。
癌の治療用ワクチン組成物で使用される適切なアジュバントには以下が含まれる：3De-O-アセチル化モノホスホリル脂質A(3D-MPL又はMPLとして知られる（WO92/116556を参照）)、サポニン（例えばQS21又はQS7）、及びTLR4アゴニスト（例えばCpG含有分子）（例えばWO95/26204に記載されている）。用いられるアジュバントは、複数の成分の組合せ（例えばMPL及QS21又はMPL、QS21及びCpG含有分子）であり得る。アジュバントは水中油エマルジョン又はリポソーム処方物として処方することができる。そのような調製物は他のベヒクルを含むことができる。
別の実施態様では、DLL3又はDLL3ペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列に相補的な10以上の連続するヌクレオチドをを含むオリゴヌクレオチドの調製物が、癌（例えば本発明の疾患）のためのワクチンとして用いられる。そのような調製物はアジュバント又は他のベヒクルを含むことができる。
DLL3を阻害して本発明の疾患を治療する
本発明のある実施態様では、癌（例えば本発明の疾患）は、DLL3のレベル及び／又は機能に拮抗する（阻害する）化合物の投与によって治療又は予防される（DLL3は、癌に罹患していない対象の血清又は組織と比較してそのような癌を有する対象の血清又は組織で上昇する）。
この目的に有用な化合物には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：抗DLL3抗体（他の親和性試薬、並びに前記の結合領域を含むフラグメント及び誘導体）、DLL3アンチセンス又はリボザイム核酸、及び相同組換えによって内因性DLL3機能を“ノックアウト”するために用いることができる非機能性DLL3をコードする核酸（例えば以下を参照されたい：Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292）。DLL3機能を阻害する他の化合物は公知のin vitroアッセイを用いて同定することができる。前記in vitroアッセイは、例えばDLL3と別のタンパク質又は結合パートナーとの結合を阻害するか、又は公知のDLL3機能を阻害する試験化合物の能力のためのアッセイである。
そのような阻害は例えばin vitroで又は細胞培養でアッセイできるが、遺伝的アッセイもまた用いることができる。好ましい技術もまた、当該化合物を投与する前又は後でDLL3のレベルを検出するために用いることができる。下記でさらに詳細に記載するように、適切なin vitro又はin vivoアッセイを利用して、個々の化合物の効果及びその投与が罹患組織の治療に必要であるか否かを決定する。
具体的な実施態様では、DLL3機能（活性）を阻害する化合物は、本発明の治療を受けていない例えば本発明の疾患を有する対象の血清若しくは組織と比較して、DLL3の血清若しくは組織レベル又は機能的活性の増加（例えば正常レベル若しくは所望レベルより高い）が検出される対象に、又は当該レベル若しくは活性をそのような癌に罹患していない対象において見出されるものに又は予め決定した参照範囲にするために治療的又は予防的に投与される。当業界で標準的な方法を用いて、上記に概略したようにDLL3のレベル又は機能の増加を測定することができる。適切なDLL3阻害物質の組成物は、例えば小分子（すなわち1000ダルトン未満の分子）を含むことができる。そのような小分子は、本明細書に記載するスクリーニング方法によって同定できる。
治療的又は予防的化合物のアッセイ
本発明はまた、DLL3を発現する癌（例えば本発明の疾患）の治療又は予防用化合物の有効性を同定又は立証するために、薬の開発で使用されるアッセイを提供する。
したがって、DLL3の活性を調整する化合物のスクリーニング方法が提供され、前記方法は、（a）DLL3又はその生物学的に活性な部分を候補化合物と接触させる工程、及び（b）それによってDLL3の活性が調整されるか否かを決定する工程を含む。そのようなプロセスは、（a）DLL3又はその生物学的に活性な部分をサンプル中で候補化合物と接触させる工程、及び（b）前記候補化合物と接触させた後の前記サンプル中でのDLL3又は生物学的に活性なその部分の活性を、前記候補化合物と接触させる前の前記サンプル中でのDLL3又は生物学的に活性なその部分の活性と又は参照レベルの活性と比較する工程を含むことができる。
当該スクリーニング方法は、DLL3の活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であり得る。
DLL3又はその生物学的に活性な部分は、例えば細胞上で又は細胞によって発現され得る。DLL3又はその生物学的に活性な部分は、例えば前記を発現する細胞から単離され得る。DLL3又はその生物学的に活性な部分は、例えば固相に固定し得る。
DLL3又はDLL3をコードする核酸の発現を調整する化合物のスクリーニング方法もまた提供され、前記方法は、（a）DLL3又はDLL3をコードする核酸を発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、及び（b）それによってDLL3又はDLL3をコードする核酸の発現が調整されるか否かを決定する工程を含む。そのようなプロセスは、（a）DLL3又はDLL3をコードする核酸を発現する細胞をサンプル中で候補化合物と接触させる工程、及び（b）前記候補化合物と接触させた後の前記サンプル中での細胞によるDLL3又はDLL3をコードする核酸の発現を、前記候補化合物と接触させる前の前記サンプル中での細胞によるDLL3又はDLL3をコードする核酸の発現と又は参照レベルの発現と比較する工程を含むことができる。
当該方法は、DLL3又はDLL3をコードする核酸の発現を阻害する化合物のスクリーニング方法であり得る。
本発明の他の特徴は以下を含む：前述のスクリーニング方法によって入手できる化合物、DLL3又はDLL3をコードする核酸の活性若しくは発現を調整する化合物、例えばDLL3又はDLL3をコードする核酸の活性若しくは発現を阻害する化合物。
そのような化合物は、癌（例えば本発明の疾患）の治療又は予防で使用するために提供される。癌（例えば本発明の疾患）を治療又は予防する方法もまた提供され、前記方法は、その必要がある対象にそのような化合物の治療的に有効な量を投与する工程を含む。
試験化合物は、例えば本発明の疾患を有する対象においてDLL3のレベルをそのような癌を罹患していない対象において見出されるレベルに回復させるか、又はそのような癌の実験的動物モデルで類似の変化をもたらすそれら試験化合物の能力についてアッセイされ得る。例えば本発明の疾患を有する対象においてDLL3レベルをそのような癌を罹患していない対象において見出されるレベルに回復させるか、又はそのような癌の実験的動物モデルで類似の変化をもたらすことができる化合物は、更なる薬の発見のためのリード化合物として用いるか、又は治療的に用いることができる。DLL3の発現は、好ましい技術、免疫アッセイ、ゲル電気泳動とそれに続く可視化、DLL3の検出、又は本明細書に教示されている又は当業者に公知の任意の他の方法によってアッセイされ得る。そのようなアッセイを用いて、臨床的な監視又は薬の開発で候補薬をスクリーニングすることができる（前記スクリーニングでは、DLL3の豊富さを臨床症状の代用マーカーとして供することができる）。
様々な具体的実施態様では、対象の異常に中心的に関与する細胞タイプの代表的な細胞を用いてin vitroアッセイを実施して、化合物がそのような細胞タイプに所望の作用を有するか否かを決定することができる。
療法で使用される化合物は、ヒトで試験する前に適切な動物モデル系（ラット、マウス、ニワトリ、乳牛、サル、ウサギなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない）で試験することができる。in vivo試験では、ヒトに投与する前に、当業界で公知の任意の動物モデル系を用いることができる。本発明の疾患の動物モデルの例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：小細胞肺癌細胞株（例えばNCI-H345）の異種移植、非小細胞肺癌細胞株（例えばA549及びH460）の異種移植、膵臓癌細胞株（例えばMIA PaCa-2）のヌードマウスにおける異種移植（Marincola et al., J Surg Res 1989 Dec;47(6):520-9）、又は皮膚癌細胞株（例えばMV3）のヌードマウスにおける異種移植（van Muijen et al., Int J Cancer 1991 Apr 22;48(1):85-91）。これらはDLL3レベルを調整する化合物の試験に利用することができる。なぜならば、これらのモデルで示される病理学は、例えば本発明の疾患の病理学と類似するからである。本開示に基づいて、DLL3をコードする1つの遺伝子又は複数の遺伝子の“ノックアウト”変異を有するトランスジェニック動物を作製できることは当業者には明白であろう。遺伝子の“ノックアウト”変異は、変異導入遺伝子が発現されないか、又は当該遺伝子生成物に付随する活性がほとんど又は完全に欠如するように異常な形態で又は低レベルで発現される変異である。好ましくは、トランスジェニック動物は哺乳動物であり、より好ましくは、トランスジェニック動物はマウスである。
ある実施態様では、DLL3の発現を調整する試験化合物は非ヒト動物（例えばマウス、ラット、サル、ウサギ及びモルモット）、好ましくはDLL3を発現する本発明の疾患のための非ヒト動物モデルで同定される。この実施態様にしたがえば、試験化合物又はコントロール化合物は動物に投与され、DLL3発現に対する試験化合物の影響が決定される。DLL3の発現を変化させる試験化合物は、試験化合物で処置された動物又は動物群のDLL3（又は前記をコードするmRNA）のレベルをコントロール化合物で処置された動物又は動物群のDLL3又はmRNAのレベルと比較することによって同定できる。当業者に公知の技術（例えばin situハイブリダイゼーション）を用いてmRNA及びタンパク質レベルを決定できる。試験化合物の効果をアッセイするために動物がサクリファイスされることもされないこともあり得る。
別の実施態様では、DLL3又はその生物学的に活性な部分の活性を調整する化合物は非ヒト動物（例えばマウス、ラット、サル、ウサギ及びモルモット）、好ましくはDLL3を発現する本発明の疾患のための非ヒト動物モデルで同定される。この実施態様にしたがえば、試験化合物又はコントロール化合物は動物に投与され、DLL3の活性に対する試験化合物の影響が決定される。DLL3の活性を変化させる試験化合物は、コントロール化合物で処置された動物及び試験化合物で処置された動物をアッセイすることによって同定できる。DLL3の活性は、DLL3の細胞内の第二のメッセンジャー（例えば細胞内Ca2+、ジアシルグリセロール、IP3など）の誘発の検出、DLL3又はその結合パートナーの触媒活性又は酵素活性の検出、レポーター遺伝子（例えば、検出可能マーカー（例えばルシフェラーゼ又は緑色蛍光タンパク質）をコードする核酸に作動できるように連結されたDLL3に応答する調節エレメント）の誘発の検出、又は細胞性応答（例えば細胞分化又は細胞増殖）の検出によって評価することができる。当業者に公知の技術を利用してDLL3の活性の変化を検出できる（例えば米国特許5,401,639号を参照されたい（前記文献は参照により本明細書に組み入れられる））。
さらにまた別の実施態様では、DLL3のレベル又は発現を調整する試験化合物は、例えば本発明の疾患を有する対象、好ましくは重篤な本発明の疾患を有する対象において同定される。この実施態様にしたがえば、試験化合物又はコントロール化合物はヒト対象に投与され、DLL3発現に対する試験化合物の影響は、生物学的サンプル（例えば血清、血漿又は尿）でDLL3又は前記をコードするmRNAの発現を分析することによって決定される。DLL3の発現を変化させる試験化合物は、コントロール化合物で処置された対象又は対象群のDLL3又は前記をコードするmRNAのレベルを試験化合物で処置された対象又は対象群のそれと比較することによって同定できる。或いは、DLL3の発現の変化は、試験化合物の投与前及び投与後における対象又は対象群のDLL3又は前記をコードするmRNAのレベルを比較することによって同定できる。当業者に公知の技術を用いて生物学的サンプルを入手し、mRNA又はタンパク質の発現を分析することができる。例えば、本明細書に記載の好ましい技術を用いてDLL3のレベルの変化をアッセイできる。
別の実施態様では、DLL3の活性を調整する試験化合物は、例えば本発明の疾患を有するヒト対象（好ましくは重篤な本発明の疾患を有する者）で同定される。この実施態様では、試験化合物又はコントロール化合物はヒト対象に投与され、DLL3の活性に対する試験化合物の影響が決定される。DLL3の活性を変化させる試験化合物は、コントロール化合物で処置された対象の生物学的サンプルを試験化合物で処置された対象のサンプルと比較することによって同定できる。或いは、DLL3の活性の変化は、試験化合物の投与前及び投与後における対象又は対象群のDLL3の活性を比較することによって同定できる。DLL3の活性は、DLL3の細胞内シグナルトランスダクション経路（例えば細胞内Ca2+、ジアシルグリセロール、IP3など）の誘発、DLL3又はその結合パートナーの触媒活性又は酵素活性、又は細胞性応答（例えば細胞分化又は細胞増殖）を生物学的サンプル（例えば血清、血漿又は尿）で検出することによって評価することができる。当業者に公知の技術を用いて、DLL3の第二のメッセンジャーの誘発の変化又は細胞応答の変化を検出することができる。例えばRT-PCRを用いて、細胞の第二のメッセンジャーの誘発の変化を検出することができる。
別の実施態様では、DLL3のレベル又は発現をコントロール対象（例えば本発明の疾患に罹患していないヒト）のレベルへと変化させる試験化合物は、さらに別の試験的又は治療的使用のために選択される。別の実施態様では、DLL3の活性をコントロール対象（例えば本発明の疾患に罹患していないヒト）で見出される活性へと変化させる試験化合物は、さらに別の試験的又は治療的使用のために選択される。
別の実施態様では、例えば本発明の疾患に付随する1つ以上の症候の重篤度を軽減させる試験化合物は、例えば本発明の疾患を有するヒト対象（好ましくは、例えば重篤な本発明の疾患を有する対象）で同定される。この実施態様にしたがえば、試験化合物又はコントロール化合物は対象に投与され、例えば本発明の疾患の1つ以上の症候に対する試験化合物の影響が決定される。1つ以上の症候を軽減させる試験化合物は、コントロール化合物で処置された対象を試験化合物で処置された対象と比較することによって同定できる。例えば本発明の疾患を熟知する医師に公知の技術を用いて、試験化合物が例えば本発明の疾患に付随する1つ以上の症候を軽減するか否かを決定できる。例えば本発明の疾患を有する対象において腫瘍負荷を軽減する試験化合物は、例えばそのような対象において有益であろう。
別の実施態様では、癌（例えば本発明の疾患）に付随する1つ以上の症候の重篤度を軽減する試験化合物は、さらに別の試験的又は治療的使用のために選択される。
治療的及び予防的組成物及びそれらの使用
本発明は、本発明の化合物（例えばDLL3タンパク質、DLL3又はそのフラグメントと特異的に結合することができる親和性試薬、又はDll3をコードする核酸）の有効量を対象に投与する工程を含む、治療（及び予防）方法を提供する。具体的な特徴では、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を実質的に制限するか又は望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。
化合物が核酸を含むときに用いることができる処方及び投与方法は上記に記載され、追加される適切な処方及び投与ルートは下記に記載される。
例えば以下の多様なデリバリー系が公知であり、本発明の化合物の投与に用いることができる：リポソーム、ミクロ粒子、ミクロカプセルに被包化、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば以下を参照されたい：Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）、レトロウイルス又は他のベクターの部分としての核酸の構築など。導入方法は経腸的又は非経口的であることができ、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内及び経口ルートが含まれるが、ただしこれらに限定されない。化合物は、任意の便利なルートによって、例えば輸液又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜基底層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）からの吸収によって投与でき、さらに他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与できる。投与は全身的でも局所的でもよい、さらに、本発明の医薬組成物を中枢神経系に任意の適切なルート（脳室内及び脊髄内注射を含む）によって導入することを所望できる（脳室内注射は、例えばレザバー（例えばOmmayaレザバー）に結合された脳室内カテーテルによって促進できる）。肺投与もまた、例えば吸入装置又はネブライザーの使用及びエーロゾル化剤による処方によって利用され得る。
本発明のある特徴では、本発明で用いられる核酸は、例えば粒子媒介表皮デリバリーを用いて真皮にデリバーすることができる。
具体的な実施態様では、本発明の医薬組成物を治療が必要な領域に局所的に投与することを所望できる。前記は、例えば外科手術時の局所輸液、局部適用によって（例えば注射によって、カテーテルの手段によって、又は移植片の手段によって）達成できるが、ただしこれらに限定されない（前記移植片は、多孔性、無孔性又はゼラチン様物質（膜（例えばシラスチック（sialastic）膜）又はファイバー）である）。ある実施態様では、投与は、例えば肺臓、膵臓及び皮膚組織、又は悪性腫瘍若しくは新形成又は前新形成組織の部位（又は以前の部位）に直接注射によって実施できる。
別の実施態様では、化合物は小胞体中で、特にリポソーム中でデリバーできる（以下を参照されたい：Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365, 1989；Lopez-Berestein,（同書）、pp. 317-327；全般的には同書を参照されたい）。
さらにまた別の実施態様では、化合物は制御放出系でデリバーできる。ある実施態様では、ポンプを用いることができる（以下を参照されたい：Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574）。別の実施態様では、ポリマー物質を用いることができる（以下を参照されたい：Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida, 1974；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984；Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；例えば以下もまた参照されたい：Levy et al., 1985, Science 228:190；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105）。さらにまた別の実施態様では、制御放出系は治療薬標的（例えば本発明の疾患）（前記はしたがって全身的用量の部分のみを必要とする）に接近して配置することができる（例えば以下を参照されたい：Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984）。他の制御放出系は概論（Langer, 1990, Science 249:1527-1533）で考察される。
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である特定の実施態様では、核酸をin vivoで投与して、そのコードタンパク質の発現を促進することができる。前記コードタンパク質の発現は、適切な核酸発現ベクターの部分として前記核酸を構築し、前記核酸が細胞内に存在するように、例えばレトロウイルベクターによって（例えば米国特許4,980,286号を参照）又は直接注射によって、又はマイクロ粒子ボンバードメント（例えば遺伝子銃；バイオリスティック（Dupont））又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクト薬剤の使用によって、又は核に侵入することが判明しているホメオボックス様ペプチドと連結したものを投与することによって（Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868）、前記核酸を投与して促進される。或いは、核酸を細胞内に導入し、発現のために相同組換えによって宿主細胞DNA内にに取り込むことができる。
本発明はまた医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本発明の化合物の治療的に有効な量及び医薬的に許容できる担体を含む。具体的な実施態様では、“医薬的許容できる”という用語は、連邦政府又は州政府の規制庁の承認のために適切であること、又は米国局方若しくは動物（より具体的にはヒト）での使用について一般的に認知された他の薬局法に列挙されていることを意味する。“担体”という用語は、それと一緒に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はベヒクルを指す。そのような医薬担体は無菌的液体、例えば水及び油であり得る。前記には鉱油、動物、植物又は合成起源の油、例えば落花生油、大豆油、鉱物油、ごま油などが含まれる。医薬組成物が静脈内に投与されるときには、水は好ましい担体である。食塩水溶液及びデキストロース水並びにグリセロール溶液もまた、液体担体として特に注射用溶液のために用いることができる。適切な医薬賦形剤には、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、シュクロース、ゼラチン、麦芽、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリン一ステアリン酸、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望の場合には、組成物はまた、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、散剤、持続放出処方物などの形態をとることができる。組成物は、伝統的な結合剤及び担体（例えばトリグリセリド）を含む座薬として処方することができる。経口処方物は、標準的な担体（例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含むことができる。適切な医薬担体の例は以下に記載されている：“Remington’s Pharmaceutical Sciences”（E.W. Martin）。そのような組成物は、治療的に有効な量の化合物を例えば精製形で適切な量の担体と一緒に含み、対象への適切な投与のための形態を提供する。処方は投与態様に適合するべきである。
ある実施態様では（例えば1つ以上の抗体が用いられる）、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合する医薬組成物として日常的手順にしたがって処方される。典型的には、静脈内投与用組成物は無菌的な等張緩衝水溶液中の溶液である。必要な場合には、組成物はまた可溶化剤及び局所麻酔剤（例えばリドカイン）を含み、注射部位の痛みを和らげる。一般的には、成分は、別々に又は単位剤形として一緒に混合して、例えば凍結乾燥散剤又は無水濃縮物として密閉封入容器、例えば活性薬剤の量を表示したアンプル又はサシェで供給される。組成物が輸液によって投与される場合は、組成物は、無菌的な医薬等級の水又は食塩水を含む輸液ビンで適用される。組成物が注射によって投与される場合は、投与前に成分を混合することができるように無菌的な注射水又は食塩水のアンプルが提供される。
本発明の化合物は中性又は塩の形態として処方できる。医薬的に許容できる塩には、適切な場合には、遊離アミノ基で形成された塩（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される塩）及び遊離カルボキシル基で形成された塩（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、鉄、水酸化物、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導された塩）が含まれる。
癌（例えば本発明の疾患）の治療に有効な本発明の化合物の量は、標準的な臨床的技術によって決定できる。さらにまた、場合によってin vitroアッセイを用いて、最適な投薬範囲の同定に役立てることができる。処方に用いられるべき正確な用量はまた投与経路及び疾患又は異常の重篤度に左右され、医師の判断及び各対象の環境にしたがって決定されるべきである。しかしながら、静脈内投与のための適切な投薬範囲は、一般的には体重1kg当たり約20−500マイクログラムの活性化合物である。鼻内投与のための適切な投薬範囲は、一般的には約0.01pg/kg体重から1mg/kg体重である。有効用量は、in vitro又は動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿することができる。
一般的には、座薬は活性成分を重量で0.5％から10％の範囲で含み、経口処方物は好ましくは10％から95％の活性成分を含む。
本発明はまた医薬パック又はキットを提供し、前記は本発明の医薬組成物の1つ以上の成分を充填した1つ以上の容器を含む。場合によってそのような容器に加えられるものは、製造、医薬品若しくは生物学的生成物の使用又は規模を規制する政府機関が定めた書式での通知であり得る（前記通知は、（a）ヒトの投与のための製造、使用又は規模に関する規制庁の承認、（b）使用のための指示書、又はその両方を示す）。
したがってある特徴では、キットは本発明で用いられる抗体を含み、例えば、その抗体は投与又は使用前の再構成のために凍結乾燥されていてもよい。キットが例えば癌の療法/治療に使用するためのものである場合は、1つ又は複数の抗体を等張水溶液（場合によって当該キットと一緒に提供できる）で再構成することができる。ある特徴では、キットは、ポリペプチド、例えば本発明で用いられる免疫原性ポリペプチドを含むことができ、前記は例えば凍結乾燥できる。後者のキットは免疫原性ポリペプチドを再構成するためのアジュバントをさらに含むことができる。
本発明はまた、本明細書に記載の組成物、例えば対象においての免疫応答の誘発で使用される医薬組成物及び／又はワクチンに及ぶ。
さらにまた別の実施態様では、本発明は、癌の治療で（好ましくは本発明の疾患の1つの治療で）同時に、連続的に又は別々に投与される、（a）DLL3と結合する親和性試薬、及び（b）抗癌剤又は他の活性な薬剤を別々に又は一緒に含む医薬を提供する。
画像化技術によるDLL3の豊富さの決定
画像化技術によってDLL3の豊富さを決定することの利点は、そのような方法は非侵襲的で（当該試薬を投与する必要がある得るという点は除く）、対象からサンプルを抽出する必要がないということであろう。
適切な画像化技術には、陽電子放射断層撮影法（PET）及び一光量子放射コンピュータ支援断層撮影法（SPECT）が含まれる。そのような技術を用いるDLL3の可視化は、適切な標識、例えば放射性トレーサー（例えば18F、11C又は123I）の取り込み又は結合を必要とする（例えば以下を参照されたい：NeuroRx - The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics (2005) 2(2), 348-360；当該技術の更なる詳細については同書の361−371ページ）。放射性トレーサー又は他の標識は、適切に標識した特異的リガンドを対象に（例えば注射によって）投与することによりDLL3に取り込まれ得る。或いは、それらは、対象に（例えば注射により）投与できるDLL3特異的結合親和性試薬（例えば抗体）に取り込ませることができる。画像化のためにアフィボディを使用することに関する考察については例えば以下を参照されたい：Orlova A, Magnusson M, Eriksson TL, Nilsson M, Larsson B, Hoiden-Guthenberg I, Widstrom C, Carlsson J, Tolmachev V, Stahl S, Nilsson FY, Tumor imaging using a picomolar affinity HER2 binding Affibody molecule, Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4339-48。
免疫組織化学を用いた本発明の疾患を含む癌の診断及び治療
免疫組織化学は優れた検出技術であり、したがって癌（本発明の疾患を含む）の診断及び治療で非常に有用であり得る。免疫組織化学を用い組織切片でDLL3抗原の存在場所を標識抗体（又は他の親和性試薬）、その誘導体及びアナローグの使用により決定して、癌（例えば上記で述べたもの）を検出、診断又は監視することができる。前記抗体、その誘導体及びアナローグは特異的抗原としてのDLL3と抗原-抗体相互作用を介して特異的に結合し、マーカー（例えば蛍光染料、酵素、放射性成分又はコロイド金）によって可視化される。
モノクローナル抗体技術の進歩は、ヒト新形成の新しい正確な顕微鏡診断における免疫組織化学の役割を確認する上で極めて重要であった。播種的な新形成により形質転換された細胞の免疫組織化学による同定は、癌の侵襲及び転移とともに悪性度が増加した腫瘍細胞関連免疫表現型の出現の明瞭な画像を提供する。抗新形成療法の将来のアプローチには、個々の患者の新形成疾患に付随する具体的な免疫表現型パターンに特異的な個別化された多様な免疫療法が含まれ得る。更なる考察については例えば以下を参照されたい：Bodey B, The significance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms, Expert Opin Biol Ther. 2002 Apr; 2(4):371-93。
本発明のそれぞれの特徴の好ましい特色は必要な変更を加えた他の特徴の各々と同様である。本明細書に記載した従来技術の文書類は、法が許容する程度まで完全に参照により本明細書に組み入れられる。
本発明を以下の非限定的実施例によって詳述する。
液体クロマトグラフィー-質量分析法（LC/MS）を用いる非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膵臓癌及び皮膚癌組織サンプルで発現されるDLL3の同定
以下のプロトコルを用い、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膵臓癌及び皮膚癌組織並びに対応する正常又は正常隣接組織（NAT）サンプルから抽出した膜タンパク質を消化し、得られたペプチドをタンデム質量分析法によって配列決定した。
1.1材料と方法
1.1.1形質膜分画
非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膵臓癌若しくは皮膚癌又は正常若しくは正常隣接組織から回収した細胞を均質化し、1000ｘgで遠心分離に付した。上清を採取し、49500ｘgで超遠心分離を実施した。得られたペレットを再度均質化し、不連続ショ糖密度遠心分離によって分離した。107000ｘgでの超遠心分離後、境界相の分画を回収しペレットにした。
1.1.2形質膜可溶化
形質膜分画をSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）に再懸濁し、最終SDS濃度を0.5％にして遠心分離し、抽出タンパク質を可溶化した。
1.1.3トリプシン溶解
溶液中消化のために、200mM重炭酸アンモニウムを用いて50μgタンパク質溶液の体積を100μLにする。還元剤DL-ジチオスレイトール10μL（75mM）を該サンプルに加え、80℃で15分インキュベートした。続いて、10μLの150mMヨードアセトアミドを用いてシステイン封鎖工程を実施し、暗所にて30分室温でインキュベートした。続いて超純水を添加してSDS濃度を0.05％に希釈した。2.75μgのタンパク質に1μgのトリプシンとするために十分な体積のトリプシン（Promega V5111）を該混合物に添加し、37℃で一晩インキュベートした。
また別には、105μgのタンパク質の溶液に3μLのTCEP（50mM）を用い60℃で1時間インキュベートして還元した。続いてタンパク質消化キット（Protein Digestion Kit；Protein Discovery）のFASPろ過装置で前記サンプルを製造業者の指示にしたがい処理した（ただし重炭酸アンモニウムの代わりに重炭酸トリエチルアンモニウムを用いた）。トリプシン溶解は、50μgのタンパク質に1μgのトリプシンを用いて75μLの最終体積で実施した。
1.1.4ペプチド分画
消化したタンパク質サンプルを真空下で乾燥させて0.1％蟻酸水に再懸濁し、トリフルオロ酢酸（TFA）を加えてこの溶液のpHを＜3に低下させた。ペプチドをイオン交換によって分離し、イオン交換は、アジレント（Agilent）LC1200シリーズ液体クロマトグラフィー系でアジレントゾルバックスバイオストロング陽イオン交換シリーズII（Agilent Zorbax Bio-Strong Cation Exchange series II）カラムを用いて実施した。また別には、pI系分離のためにアジレント3100 OFFGEL分画装置及びOFFGELキットpH3−10を供給業者のプロトコルにしたがって用いた。IPG片の再水和に続いて、等体積の膜消化物を各ウェルにロードした。分離後に得られた分画を酸性化した。
1.1.5質量分析法
分画したサンプルを液体クロマトグラフィー-質量分析法によって分析した。ナノACQUITY UPLC BEH 130 C18カラム、75μmｘ250mm（186003545）及びLTQオービトラップベロス（LTQ Orbitrap Velos；Thermo Fisher Scientific）を取り付けたウォーターズナノ（Waters nano）ACQUITY UPLCを用いた。ペプチドは、120分で3％から35％に増加するアセトニトリ勾配を300nL/分で溶出させた。フルスキャンの質量スペクトルをオービトラップで400−2000m/zの質量範囲で6000解像力で得た。各サイクルで、当該装置に取り付けたナノスプレーイオン源により直線状イオントラップでCID MS/MSスキャンのために20の最も濃いペプチドを選択した。
1.1.6ペプチドのアミノ酸配列分析
LTQオービトラップベロスから得た生データをマスコットソフト（Mascot software；Matrix Science）で処理した。前記は、Mowseアルゴリズム（Curr Biol. 1993 Jun 1;3(6):327-3）を用いて、夾雑タンパク質配列とともにEnsembl（http://www.ensembl.org/index.html）、IPI（www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html）及びSwissProt（http://www.uniprot.org）から成る配列データベースを検索することによってピークリストからアミノ酸配列を推論する。ペプチド同定のための基準は、トリプシン消化物、2つまでの失われた切断部位並びに多様な生物学的及び化学的改変（酸化メチオニン、MMTS又はヨードアセトアミドによるシステイン改変、並びにセリン、スレオニン及びチロシンのリン酸化）を含んでいた。0.05％以下の期待値及び28以上のイオンスコアを有するランク1のペプチドを我々のOGAPデータベースにロードした（このデータベースでそれらペプチドは処理されてタンパク質グループに分けられる）。
1.1.7非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膵臓癌及び皮膚癌関連タンパク質の区別
DLL3を同定するプロセスは、上記に記載した天然に存在するヒトタンパク質の質量分析によって実験的に入手したペプチド配列を用いて、公表ヒトゲノム配列のコードエクソンを同定し編成した。これらの実験的に決定した配列は表1に示した。それらをOGAP(商標)データベースで比較した（前記データベースは、国際特許出願WO2009/087462に記載されたペプチド質量、ペプチドシグナチャー、EST及びパブリックドメインゲノム配列データの加工及び組み入れによってコンパイルされた）。
表1：非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膵臓癌及び皮膚癌組織サンプルの形質膜でLC/MSにより同定されたDLL3特異的ペプチド
1.1.8タンパク質インデックス
タンパク質インデックスは、タンパク質普及性及びペプチドの豊富さの両方を測定したものである。アルゴリズムは、当該タンパク質が観察されたサンプル数及び各サンプルからの観察可能なペプチドに対する観察されたペプチドの数の両方を考慮する。続いて得られた値を対応する正常サンプルと癌サンプルとの対比較によって類別する。
1.2結果
これらの実験によって、本明細書でさらに説明するようにDLL3が同定された。完全長DLL3は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膵臓癌及び皮膚癌組織サンプルの形質膜で検出された。表2は、タンパク質インデックスによって測定されたDLL3の発現分布を示す。これらの癌組織におけるDLL3の発現は、DLL3がこれらの癌で重要な治療的及び診断的標的であることを示す。
表2：DLL3タンパク質インデックス(+++++＝非常に高い、++++＝高い、+++＝中等度、++＝低い、+＝非常に低い、-＝観察されない)
フローサイトメトリー分析で決定したDLL3に対する抗体の特異性
ポリクローナル抗体のDLL3に対する特異性が、DLL3発現細胞株で実施したフローサイトメトリー分析によって試験された。
材料と方法
抗DLL3抗体をDLL3発現細胞（SHP-77）とともにインキュベートした。細胞をFACS緩衝液（DPBS、2％FBS）で洗浄して遠心分離し、100μLの希釈した一次SHP-77抗体（前記もFACS緩衝液で希釈）に再懸濁した。抗体-H322複合体を氷上で60分インキュベートし、続いて上記のようにFACS緩衝液で2回洗浄した。細胞-抗体ペレットを100μLの希釈二次抗体（前記もFACS緩衝液で希釈）に再懸濁し、氷上で60分インキュベートした。ペレットを以前のように洗浄し、200μLのFACS緩衝液に再懸濁した。サンプルをBD FACScanto IIフローサイトメーターにロードし、BD FACSdivaソフトを用いて分析した。
結果
フローサイトメトリー分析の結果は、抗SHP-77ポリクローナル抗体はヒトDLL3の細胞表面に効率的に結合することを示した。この結果は、SHP-77細胞上のDLL3に対するこれら抗体の強力な結合を示している。
SHP-77及びN82細胞による抗DLL3ポリクローナル抗体の内在化
抗DLL3ポリクローナル抗体は、PabZAPアッセイを用いて、細胞との結合に際してSHP-77（ヒト小細胞肺癌）及びN82によって内在化されることが示された。PabZAP抗体は一次抗体と結合した。次に、PabZAP複合体は該細胞によって内在化された。サポリン（Saporin）の細胞内進入はタンパク質合成阻害及び最終的な細胞死をもたらした。
PabZAPアッセイは以下のように実施した。各々の細胞を5ｘ103細胞/ウェルの密度で播種した。抗DLL3ポリクローナル抗体又はアイソタイプコントロールヒトIgGを連続希釈し、続いて該細胞に添加した。その後PabZAPを50μg/mLの濃度で添加し、プレートを48及び72時間インキュベートした。プレートの細胞生存度をセルタイター-グロ(商標)ルミネッセントセルバイアビリティーアッセイキット（CellTiter-Glo(商標) Luminescent Cell Viability Assay kit；Promega, G7571）によって検出し、このプレートをルミノミター（Luminomitor；Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA）により490nmで読み取った。データはプリズム（Prism、Graphpad）で分析した。細胞死は抗DLL3ポリクローナル抗体の濃度に比例した。
これらの結果は、抗DLL3ポリクローナル抗体は、抗ヒトIgGアイソタイプコントロール抗体と比較したとき、SHP77（図1a）及びN82（図1b）によって効率的に内在化されることを示している。
これらの結果はまた、抗DLL3ポリクローナル抗体は、SHP77では1nmol/Lで約40％の細胞殺滅、N82では100nmpl/Lで25％の細胞殺滅を誘発することを示している。
T細胞活性化及びDLL3発現細胞の特異的溶解
背景：
BiTEアプローチ（標的細胞又は組織上の特異的抗原に対する結合部位と結合した抗CD3結合エピトープを含む二重特異性抗体フラグメント）への順応性についての標的の可能性を評価するために、抗CD3及び問題の標的抗原に特異的なポリクローナル抗体によるT細胞の活性化を試験するアッセイを開発した。
方法：
このアッセイのために標的DLL3をDMS79細胞で発現させる。前記細胞を以下のキット（SIGMA PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling, Catalog number PKH26GL）を用い、15μLの当該染料を0.5mLの緩衝液（当該キット中で提供される）に希釈することによってペイントした。DMS79細胞を計数し、800ｘgで遠心分離し、無血清培養液に1千万細胞/0.5mLで再懸濁した。15μLのFKH26染料を含む0.5mLの緩衝液Cを前記細胞に添加し、穏やかに混合し、室温で1から5分インキュベートした。培養液＋FBSを加えて染料を消光した。上記のように細胞を遠心分離し、アッセイ培養液（RPMI＋10％のIgG極少FBS（Invitrogen catalog #16250078））に再懸濁し、もう一度遠心分離し、アッセイ培養液に200,000細胞/mLで再懸濁した。96ウェルの平底組織培養プレートのそれぞれ適切なウェルに10,000細胞（50μL）を添加した。前記プレートは以前に抗マウスカッパ（Southern Biotech, catalog # 1050-01）によりPBS中に3μg/mLで一晩被覆されてあった。過剰抗体溶液はDMS69細胞を添加する前にプレートから除去された。ヒトCD8+T細胞（凍結）はオールセル（AllCells（catalog number PB009-3F））から購入した。前記細胞を融解し、製造業者の指示にしたがって洗浄した。細胞をアッセイ培養液に1,500,000細胞/mLで再懸濁した。このT細胞を抗カッパ被覆96ウェルプレートのDMS79細胞に150,000細胞/ウェルで添加した。DLL3抗体の各々を適切なウェルに18μg/mL、6μg/mL又は2μg/mLで添加した。機能的グレードの抗CD3クローンOKT3（eBioscience catalog number 16-0037-85）を適切なウェルに9μg/mL、3μg/mL又は1ng/μLで添加した。コントロールセルには抗体を加えなかった。このプレートを37℃で2日間5％CO2の湿潤組織培養インキュベーターでインキュベートした。
プレートを400ｘgで5分間遠心分離し、細胞をFACS緩衝液（PBS＋5％FBS）で洗浄して再度400ｘgで5分間遠心分離した。前記細胞をFACS緩衝液に再懸濁し400ｘgで遠心分離した。細胞を200μL/ウェルでFACS緩衝液に再懸濁した。ウェルを穏やかに混合し、直ちにグアバイージーサイト（Guava Easycyte）フローサイトメーターで分析した。黄色チャネルで赤色FKH26ペイント細胞を分析した。各ウェルについて同数の全細胞を入手し、黄色で（FKH26ペイント細胞ゲート）細胞を計数し、コントロールウェルに対するパーセント細胞傷害性を計算した。コントロールウェルは、抗ウサギ、抗CD3又はDLL3ポリクローナル抗体を含まないT細胞＋DMS79であった（平均細胞数は、抗カッパ抗体結合、非結合プレートで同じであった）。
結果：
図2は、抗DLL3ポリクローナル抗体によるDMS69細胞の特異的溶解を示し、さらに細胞死が抗体濃度に比例することを示している。したがって、抗DLL3ポリクローナル抗体は、CD3による活性化を介してT細胞の細胞傷害性を誘発できる。
DLL3に対する抗体を用いる免疫組織化学
以下の参照プロトコルを用いて、FFPE肺腫瘍及び正常組織でDLL3に対するポリクローナル抗体により免疫組織化学を実施した。
5.1材料と方法
5.1.1材料
シトロクリア（Citroclear（HC5005）；TCS Biosciences, UK）
試薬アルコール（R8382；Sigma-Aldrich, UK）
標的捕捉溶液（pH6）（S2369；Dako, UK）
REALペルオキシダーゼブロッキング溶液（S2023；Dako, UK）
抗体希釈液（S0809；Dako, UK）
EnVision+HRP結合ポリマー、マウス（K4000；Dako, UK）
液体DAB+基質（K3468；Dako, UK）
メーヤーのヘマトキシリン（X0909；Dako, UK）
アクアテックス（Aquatex（1.08562.0050）；VWR, UK）
組織切片及びアレー（US Biomax Inc., MD, USA）
5.1.2脱パラフィン及び再水和
スライドをシトロクリア（2ｘ5分）で脱パラフィンし、続いて100％アルコール（2ｘ5分）、50％アルコール（1ｘ5分）及び水道水（1ｘ5分）により再水和した。
5.1.3抗原捕捉（圧力がま）
DLL3抗原をコプリン（Coplin）ジャー中の50mLの標的捕捉溶液で20分間加圧して捕捉した。続いてスライドを冷却温度から室温にさらに20分置いた。各組織切片/TMAの周囲に疎水性障壁ペンで円を描き、続いてスライドをPBSで2回洗浄した（各洗浄3分）。
5.1.4組織の染色
10分間湿潤チャンバーで組織をペルオキシダーゼブロッキング溶液で室温にてインキュベートすることによって内因性のペルオキシダーゼ活性を阻止した。続いて、スライドをPBSで1回及びPBS-T（トゥイーン20（0.125％v/v）を含むPBS）で1回洗浄した（各洗浄3分）。一次抗体（抗体希釈液で1/60に稀釈）を各組織切片及び／又はマイクロアレーに適用し、前記スライドを45分間湿潤チャンバーで室温にてインキュベートした。続いて、スライドをPBSで1回及びPBS-Tで1回洗浄した（各洗浄3分）。その後、EnVision+HRP結合ポリマーを組織に適用し、スライドを30分間湿潤チャンバーで室温にてインキュベートした。続いてスライドをPBSで1回及びPBS-Tで1回洗浄した（各洗浄3分）。組織を液体DAB+基質中にて10分間湿潤チャンバーで室温にてインキュベートした。続いてスライドをPBSで1回及びPBS-Tで1回洗浄し、湿潤チャンバーで室温にて1分間ヘマトキシリンで対比染色し、再びPBSで1回及びPBS-Tで1回洗浄した（各洗浄3分）。その後アクアテックスを用いてカバースリップをマウントした。
5.2結果
抗DLL3ポリクローナル抗体はFFPE肺サンプルで陽性を示し、切片の60％が激しい（2+/3+）染色を示した。
したがって、DLL3に対する抗体は、被検癌のいくつか及びおそらくはDLL3の発現を示す他の癌タイプで治療薬及び診断薬として有用性を有し得る。
配列

Claims (28)

  1. DLL3が発現される肺癌の治療又は予防の方法であって、DLL3及びCD3と結合する二重特異性抗体の治療的に有効な量をその必要がある対象に投与する工程を含む、前記方法。
  2. DLL3が発現される癌の治療又は予防の方法であって、DLL3と結合する親和性試薬の治療的に有効な量をその必要がある対象に投与する工程を含む、前記方法。
  3. 肺癌、膵臓癌及び皮膚癌から成る群から選択される癌、好ましくは小細胞肺癌を治療又は予防する、請求項2に記載の方法。
  4. 親和性試薬がDLL3と特異的に結合する、請求項2又は3に記載の方法。
  5. 親和性試薬が抗体若しくはその機能的フラグメント又は抗体模倣物である、請求項2から4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 親和性試薬がモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項5に記載の方法。
  7. 親和性試薬が、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、脱フコシル化抗体又は二重特異性抗体（好ましくはBiTE）である、請求項5又は6に記載の方法。
  8. （a）機能的抗体フラグメントがユニボディ、ドメイン抗体又はナノボディであるか、又は（b）抗体模倣物がアフィボディ、DARPin、アンチカリン、アビマー、バーサボディ又はデュオカリンである、請求項5に記載の方法。
  9. 親和性試薬が治療薬部分を含むか又は治療薬部分と複合化される、請求項2から8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 治療薬部分が細胞傷害性部分又は放射性同位元素である、請求項9に記載の方法。
  11. 該親和性試薬が抗体薬複合化物である、請求項9又は10に記載の方法。
  12. 親和性試薬が抗体依存細胞性細胞傷害（ADCC）を誘引する、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
  13. 親和性試薬が補体依存細胞傷害（CDC）を誘引する、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
  14. 親和性試薬がT細胞細胞傷害を誘引する、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
  15. 該親和性試薬が、癌細胞のアポトーシスを誘発するか、癌幹細胞を殺滅するか又はその数を減少させるか、及び／又は循環癌細胞を殺滅するか又はその数を減少させる、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
  16. 対象において、DLL3が発現される癌を検出、診断及び／又はスクリーニングし又はその進行を監視するか、又はDLL3が発現される癌で、癌の薬若しくは療法の効果を監視する方法であって、DLL3又はその1つ以上のフラグメントの存在若しくはレベル、又はDLL3をコードする核酸の存在若しくはレベルを検出する工程を含むか、又は前記対象におけるそのレベルの変化を検出する工程を含む、前記方法。
  17. DLL3若しくはその1つ以上のフラグメントの存在又はDLL3をコードする核酸の存在を検出する工程を含み、
    （a）健康な対象のレベルと比較して、該対象におけるDLL3若しくは前記その1つ以上のフラグメントのレベル上昇又はDLL3をコードする核酸のレベル上昇の存在、又は
    （b）健康な対象の対応する検出不能なレベルと比較して、該対象におけるDLL3若しくは前記その1つ以上のフラグメントの検出可能なレベル又はDLL3をコードする核酸の検出可能なレベルの存在、
    を前記対象におけるDLL3が発現される癌の存在の指標とする、請求項16に記載の方法。
  18. 対象においてDLL3が発現される癌を検出、診断及び／又はスクリーニングし又はその進行を監視するか、又はDLL3が発現される癌で癌の薬若しくは療法の効果を監視する方法であって、前記方法が、DLL3又はその1つ以上のフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在又はレベルを検出する工程を含む、前記方法。
  19. DLL3若しくはその1つ以上のフラグメントの存在、又はDLL3をコードする核酸の存在、又はDLL3若しくは1つ以上のそのフラグメントと免疫特異的に結合することができる抗体の存在若しくはレベルが、対象から入手される生物学的サンプルの分析によって検出される、請求項16から18のいずれか1項に記載の方法。
  20. DLL3又はその1つ以上のフラグメントの存在が、DLL3と結合する親和性試薬を用いて検出される、請求項16から19のいずれか1項に記載の方法。
  21. 親和性試薬が請求項3から8のいずれか1項に定義されるとおりである、請求項20に記載の方法。
  22. 親和性試薬が検出可能な標識を含むか、又は前記と複合化される、請求項20又は21に記載の方法。
  23. 癌が肺癌、膵臓癌及び皮膚癌から成る群から選択される、請求項16から22のいずれか1項に記載の方法。
  24. 対象がヒトである、請求項1から23のいずれか1項に記載の方法。
  25. DLL3が発現される癌の治療又は予防用薬剤を同定する方法であって、前記方法が、（a）DLL3又はその1つ以上のフラグメントを候補薬剤と接触させる工程、及び（b）該薬剤がDLL3又はその1つ以上のフラグメントと結合するか否かを決定する工程を含む、前記方法。
  26. DLL3又はその1つ以上のフラグメントと結合する薬剤の、DLL3が発現される癌を阻害する能力をさらに試験する工程を含む、請求項25に記載の方法。
  27. 親和性試薬が、DLL3の生理学的機能を調整するか、DLL3とのリガンド結合を阻害するか、及び／又はDLL3によって媒介されるシグナルトランスダクション経路を阻害する、請求項25又は26に記載の方法。
  28. 癌が、肺癌、膵臓癌及び皮膚癌から成る群から選択される、請求項25から27のいずれか1項に記載の方法。
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