KR102167550B1 - Dll3 결합 시약을 포함하는 암에 대한 치료적 및 진단적 타겟 - Google Patents

Dll3 결합 시약을 포함하는 암에 대한 치료적 및 진단적 타겟 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐암, 췌장암 및 피부암과 같은 암 치료, 스크리닝, 진단 및 예측용, 폐암, 췌장암 및 피부암과 같은 암 치료의 유효성 모니터링 및 약물 개발을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

DLL3 결합 시약을 포함하는 암에 대한 치료적 및 진단적 타겟{THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC TARGET FOR CANCER COMPRISING DLL3 BINDING REAGENTS}
본 발명은 암 치료를 위한 치료적 타겟으로서 또는 암에 대한 마커로서 유용성을 갖는 폐암, 췌장암 및/또는 피부암과 같은 암에 수반되는 막 단백질의 동정에 관한 것이다. 특히 상기 단백질은 치료적 항체 또는 기타 약제를 포함하는 친화성 시약(affinity reagents)이 제조될 수 있는 생물학적 타겟을 나타낸다. 본 발명은 또한 암의 치료 및/또는 진단을 위한 이러한 친화성 시약의 사용에 관한 것이다.
폐암, 췌장암 및 피부암과 같은 암 치료에 있어 주요 난제는 조기 발견율을 개선하고, 질병 진행을 추적하고 재발을 확인하는데 사용될 수 있는 새로운 비-침습적 마커를 발견하며, 특히 5년 생존율이 여전히 불량한 더욱 진전된 질병에 대한 개선되고 덜 독성적인 요법을 찾는 것이다. 암세포에 더욱 특이적인, 즉 면역치료적 및 타겟화된 독소와 같은 유망한 새로운 접근법에 의해 공격될 수 있도록 암세포의 표면에 발현되는 타겟의 규명이 매우 요망된다.
델타-유사 단백질 3은 I형 막 단백질이며, 델타 패밀리 중 하나이다. 본 발명자는 델타-유사 단백질 3이 암에서 발현되는 것을 확인하였으며, 이는 암환자를 비롯한 환자들에서 델타-유사 단백질 3에 대한 친화성-기반 치료가 치료적 효과가 있을 것임을 시사한다.
본 발명은 폐암, 췌장암 및 피부암과 같은 다양한 병적 조직(이하, "본 발명의 질병"으로 지칭)의 막 추출물에서, 델타-유사 단백질 3(이하, DLL3으로 지칭)의 검출을 개시한다.
DLL3의 다양한 암들에서의 차등 발현은 이 단백질이 이러한 암들에 대한 친화성 시약, 예컨대, 항체-기반 요법을 사용하여 타겟되도록 허용한다. 따라서 DLL3은 DLL3 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항체를 포함하는, 친화성 시약의 생성에 사용될 수 있으며, 치료에 대한 기초로서 이러한 친화성 시약에 의해 타겟될 수 있다. 암 세포의 세포 표면상의 단백질을 타겟하는 항체를 포함하는 친화성 시약은 (i) 보체 매개 또는 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)에 의한 용해 (ii) 이러한 친화성 시약에 콘쥬게이트된 약물 또는 독소에 의한 용해 또는 (iii) 신호 경로를 통하는 것과 같은 암 세포 성장을 추진할 수 있는, 이러한 단백질의 생리적 기능의 저해를 포함하는 다양한 기전을 통해 암 치료에 사용될 수 있다. 이러한 친화성 시약-기반 치료의 중요한 측면은 그 단백질 타겟의 정상 발현 프로파일이 조직 분포 및 발현 수준에 있어서 항체에 의한 정상 조직에서의 단백질 타겟에 대한 어떠한 타겟팅도 정상 조직에의 결합을 통한 유해한 부작용을 일으키지 않는 정도이라는 것이다.
본 발명은 치료적 유효량의 DLL3에 결합하는 친화성 시약을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 DLL3이 발현되는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
암은 바람직하게 본 발명의 질병 중 하나이다.
본 발명은 또한 암 치료 또는 예방에 사용되기 위한 DLL3에 결합하는 친화성 시약을 제공하며, 바람직하게 암은 본 발명의 질병 중 하나이다.
본 발명은 또한 암 치료 또는 예방용 의약품 제조를 위한 DLL3에 결합하는 친화성 시약의 용도를 제공하며, 바람직하게 암은 본 발명의 질병 중 하나이다.
본 발명에서 사용되기 위한 친화성 시약은 바람직하게 DLL3에 특이적으로 결합한다.
친화성 시약은 항체, 예를 들면 전 항체, 또는 그 기능적 단편 또는 항체 미메틱(antibody mimetic)일 수 있다. 바람직한 친화성 시약은 항체, 예를 들면 단클론 항체를 포함한다.
친화성 시약은 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 푸코실 제거 항체(defucosylated antibody) 또는 이중 특이성 항체(bispecific antibody)일 수 있다.
기능성 항체 단편은 유니바디(UniBody), 도메인 항체(domain antibody) 또는 나노바디(Nanobody)를 포함한다.
항체 미메틱은 아피바디(Affibody), 달핀(DARPin), 안티칼린(Anticalin), 아비머(Avimer), 버사바디(Versabody) 또는 듀오칼린(Duocalin)을 포함한다.
본 발명에 사용되기 위한 친화성 시약은 세포독성 모이어티 또는 방사성 동위원소와 같은 치료적 모이어티(moiety)를 포함하거나, 이들에 콘쥬게이트될 수 있다. 친화성 시약은 항체 약물 콘쥬게이트 또는 면역콘쥬게이트(immunoconjugate)일 수 있다.
친화성 시약은 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 유발하거나 보체 의존적 세포독성(CDC)을 유발할 수 있다. 친화성 시약은 암세포의 아폽토시스를 유도하거나, 암 줄기 세포를 죽이거나 또는 그 수를 줄이고/거나 순환 암 세포를 죽이거나 그 수를 줄일 수 있다. 친화성 시약은 DLL3의 생리적 기능을 조절하거나, DLL3에 대한 리간드 결합을 저해하고/거나 DLL3에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 저해할 수 있다.
대체 실시형태에서, 본 발명은 DLL3를 암호화하는 핵산에 혼성화될 수 있는 치료적 유효량의 혼성화제를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 DLL3가 발현되는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 암 치료 또는 예방에 사용되기 위한 DLL3를 암호화하는 핵산에 혼성화될 수 있는 혼성화제를 제공하며, 바람직하게 암은 본 발명의 질병 중 하나이다.
본 발명은 또한 암 치료 또는 예방용 의약품의 제조를 위한 DLL3를 암호화하는 핵산에 혼성화될 수 있는 혼성화제의 용도를 제공하며, 바람직하게 암은 본 발명의 질병 중 하나이다.
본 발명에서 사용되기 위한 혼성화제는 바람직하게 DLL3의 하나 이상의 세포외 도메인을 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 사용되기에 적합한 혼성화제는 저해 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티-센스 핵산, 상보적 DNA(cDNA), 올리고뉴클레오타이드 및 리보자임을 포함한다.
또한 본 발명은 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재 또는 수준을 검출하거나, DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 수준을 검출하는 것을 포함하거나 또는 상기 개체내 이들의 수준의 변화를 검출하는 것을 포함하는, 개체에서 DLL3가 발현되는 암을 검출, 진단 및/또는 스크리닝 또는 암의 진전을 모니터링하거나, 또는 DLL3가 발현되는 암에서 항암제 또는 항암 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.
이러한 방법은 DLL3, 또는 그 하나 이상의 단편, 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재를 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 (a) 건강한 개체에서의 수준에 비교하여 상승된 수준의 개체내 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편, 또는 상승된 수준의 DLL3 암호화 핵산의 존재, 또는 (b) 건강한 개체내 상응하는 검출불가능한 수준에 비교하여 검출가능한 수준의 개체내 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편, 또는 검출가능한 수준의 DLL3 암호화 핵산의 존재는 상기 개체에서 DLL3을 발현하는 암이 존재함을 나타낸다.
본 발명은 DLL3 또는 그의 하나 이상의 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재 또는 수준을 검출하는 것을 포함하는, 개체에서 DLL3가 발현되는 암을 검출, 진단 및/또는 스크리닝 또는 암의 진전을 모니터링하거나, 또는 DLL3가 발현되는 암에서 항암제 또는 항암 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에서, DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재, 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재, DLL3 또는 그 하나 이상의 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재 또는 수준은 개체에서 수득한 생물학적 시료을 분석함으로써 검출할 수 있다.
DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재는 DLL3에 결합하는 친화성 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 친화성 시약은 여기에 언급된 임의의 적합한 친화성 시약일 수 있다. 친화성 시약은 검출가능한 표지를 포함하거나 이에 콘쥬게이트될 수 있다.
여기에 참조된 본 발명의 임의의 측면에서, 개체는 인간일 수 있다.
본 발명은 또한 DLL3가 발현되는 암의 치료 또는 예방용 약제를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) DLL3 또는 그 하나 이상의 단편을 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 약제가 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 DLL3을 발현하는 암의 저해를 위해 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편에 결합하는 약제의 능력을 시험하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 약제는, 특히, DLL3의 활성을 조절하고, DLL3에 대한 리간드 결합을 감소하거나 DLL3 다이머화를 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에서, 특히 언급될 수 있는 암 타입은 본 발명의 질병 중 하나이다.
일 실시형태에서 검출, 예방 또는 치료될 암은 폐암, 예를 들어 비-소 세포 폐암 및/또는 소세포 폐암이다.
다른 실시형태에서 검출, 예방 또는 치료될 암은 췌장암이다.
다른 실시형태에서 검출, 예방 또는 치료될 암은 피부암, 예를 들어 흑색종이다.
본 발명의 다른 측면이 후술되며, 청구범위에 개시된다.
도 1a는 PabZAP 어세이를 사용하여, SHP-77 세포에 의한 항-DLL3 다클론 항체의 내재화를 보여준다.
도 1b는 PabZAP 어세이를 사용하여, N82 세포에 의한 항-DLL3 다클론 항체의 내재화를 보여준다.
도 2는 이중 특이성 항-DLL3-항-CD3 다클론 항체에 의해 T 세포 활성화에 의한 DMS79 DLL3 발현 세포의 특이적 용해를 보여준다.
하기 상세히 기술된 본 발명은 암, 예를 들면 본 발명의 질병을 치료 또는 예방하기 위해 개체, 예를 들면 포유류 개체에, 치료적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 특정 치료적 처치에 가장 잘 반응하는 환자를 확인하기 위한, 암, 예컨대 본 발명 질병의 임상적 스크리닝, 진단 및 예측을 위한 방법 및 조성물, 암, 예를 들어 본 발명의 질병의 결과 모니터링을 위한 방법 및 조성물 또는 약물 스크리닝 및 약물 개발을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 DLL3 단백질이 특정 암에 발현한다는 사실의 발견에 기초한다. 특히 폐암, 췌장암 및 피부암의 원형질막에서의 DLL3 단백질의 발현을 입증하는 지지 결과가 여기에 개시된다. 따라서 DLL3에 대한 항체는 이들 암 또는 DLL3의 발현을 보이는 다른 암 형태에서 치료제 및 진단제로서의 유용성을 가질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "개체"는 동물, 바람직하게 포유류를 지칭한다. 포유류 개체는 비-인간 포유류일 수 있으나, 일반적으로 성인과 같은 인간이다.
상기 개체는 일반적으로 살아있는 개체일 것이다. 본 발명의 용도, 방법 및 조성물은 생체의 스크리닝, 진단 및 예측에 특히 적합하지만, 예를 들어 동일한 질병을 발병할 위험이 있는 가족 구성원을 확인하기 위해 개체의 사후 진단에도 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "환자"는 본 발명의 하나 이상의 질병을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 개체를 지칭한다.
본 명세서에서, 용어 "본 발명의 단백질"은 델타-유사 단백질 3(GeneID: 10683)를 지칭하며, 여기에서 DLL3로 지칭된다. 이 단백질은 다양한 암에서 차등 발현되는 것으로 발견되었으며, 따라서 이들 암에 대한 친화성-기반 치료의 새로운 타겟을 제공한다. DLL3 단백질의 인간 서열은 서열번호: 1로 기재되었다. 용어 DLL3(단백질의 맥락에서)은 서열번호: 1에 주어진 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 이들의 유도체 또는 변이체, 특히 자연-발생적 인간 유도체 또는 변이체를 포함한다.
이 단백질은 실시예 1에 기재된 방법 및 기구를 통해 암 환자로부터 수득한 암 조직 시료의 막 단백질 추출물에서 확인되었다(예, 막 단백질 추출물의 액체 크로마토그라피-질량 분석에 의해). 펩티드 서열은 SWISS PROT 및 TrEMBL 데이타베이스(스위스 바이오인포매틱스 기관(SIB) 및 유럽 바이오인포매틱스 기관(EBI)에 의해 보유되며, www.expasy.org에서 입수가능함)와 비교되었고, 엔트리 Q9NYJ7, 델타-유사 단백질 3-DLL3가 확인되었다. 이 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 수납 번호 NM_016941로 찾을 수 있고, 서열번호: 3에 기재되었다.
SWISS-PROT에 의하면, 델타-유사 단백질 3은 델타 패밀리의 I형 막 단백질이며, 하나의 DSL 도메인, 여섯개의 EGF-유사 도메인, 하나의 경막 영역 및 서열번호: 1의 27-492 아미노산들 사이(서열번호: 12)에 하나의 세포외 꼬리로 이루어진다. 본 발명자는 델타-유사 단백질 3이 암에서 발현됨을 보였으며, 이는 델타-유사 단백질 3에 대한 친화성-기반 치료가 암 환자를 포함하는 환자에서 치료적 효과를 나타낼 것을 시사한다.
DLL3은 유용하며, 단백질의 단편, 특히 에피토프 함유 단편, 예를 들면, 항원성 또는 면역원성 단편 및 유도체, 특히 세포외 도메인을 포함하는 단편(예, 세포외 꼬리 또는 루프)도 역시 유용하다. 항원성 또는 면역원성 단편을 포함하는 에피토프 함유 단편은 통상 12 이상의 아미노산 길이, 예를 들어, 20 이상의 아미노산 길이, 예를 들어, 50 또는 100 이상의 아미노산 길이를 갖는다. 단편은 전체 단백질 길이의 95% 이상, 예를 들어 90% 이상, 예를 들어 75% 또는 50% 또는 25% 또는 10% 이상의 길이를 가질 수 있다.
또는, 여기에 사용되거나 지칭되는 단백질/폴리펩티드는 본 명세서에서 특히 기술/기재된 단백질/폴리펩티드 또는 이들과 최소한 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 아미노산 서열 상동성 또는 유사성을 갖는 변이체 또는 유도체로 제한될 수 있다. 아미노산 서열 상동성/유사성 퍼센트는 BLAST, CLUSTAL와 같은 임의의 적합한 알고리즘을 적합한 디폴트 파라미터를 사용하여 결정될 수 있다.
단백질 또는 폴리펩티드의 맥락에서 용어 "DLL3"는 그 아미노산 서열이 서열번호: 1 또는 2 중 어느 하나에 주어진 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 단백질 또는 서열번호: 1 또는 2 중 어느 하나에 최소한 90% 또는 95% 서열 상동성을 가지며 필수적으로 DLL3과 동일한 조직 분포를 갖는 유도체 또는 변이체를 지칭한다.
핵산의 맥락에서, 용어 "DLL3"는 그 뉴클레오타이드 서열이 서열번호: 1 또는 2 중 어느 하나에 주어진 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호: 1 또는 2 중 어느 하나에 최소한 90% 또는 95% 서열 상동성을 가지며 필수적으로 DLL3 단백질과 동일한 조직 분포를 갖는 유도체 또는 변이체를 암호화하는 핵산을 지칭한다.
핵산의 맥락에서 용어 "DLL3"은 또한 그 뉴클레오타이드 서열이 서열번호: 3 또는 4 중 어느 하나에 주어진 서열을 포함하고 있는 핵산 또는 서열번호: 3 또는 4 중 어느 하나와 최소한 90% 또는 95% 서열 상동성을 가지며 필수적으로 DLL3 단백질과 동일한 조직 분포를 갖는 단백질을 암호화하는 유도체 또는 변이체를 지칭한다.
항원성 또는 면역원성 단편을 포함하는 에피토프-함유 DLL3 단편은 환자에서 관련 면역 반응을 유발할 수 있을 것이다. DLL3를 암호화하는 DNA 및 이들의 단편, 예를 들어 그 면역원성 단편과 같은 DLL3의 단편을 암호화하는 DNA도 역시 유용하다. DLL3를 암호화하는 핵산의 단편(예, DNA)은 전체 코딩 영역 길이의 95% 이상, 예를 들어, 전체 코딩 영역 길이의 90% 이상, 예를 들어 75% 또는 50% 또는 25% 또는 10% 이상일 수 있다. 핵산의 단편(예, DNA)는 길이로 36 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 예를 들어 60 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 예를 들어 150 또는 300 뉴클레오타이드 또는 그 이상일 수 있다.
DLL3의 유도체는 하나 이상(예컨대, 1-20 아미노산, 예컨대 15 아미노산, 또는 단백질의 전체 길이에 기초한 아미노산 수로 20% 까지, 예를 들어 10% 또는 5% 또는 1% 까지)의 결실, 삽입 또는 치환이 이루어진 서열 변이체를 포함한다. 치환은 통상 보존적 치환일 것이다. 유도체는 통상적으로 이들이 유도된 단백질과 필수적으로 동일한 생물학적 기능을 가질 것이다. 유도체는 통상 이들이 유도된 단백질과 비슷하게 항원성 또는 면역원성일 것이다. 유도체는 통상 이들이 유도된 단백질의 리간드-결합 활성, 또는 활성 수용체-복합체 형성능 중 어느 하나 또는 바람직하게 이들 모두를 가질 것이다. 유도체 및 변이체는 일반적으로 DLL3와 동일한 조직 분포를 가질 것이다.
단백질 유도체는 또한 화학적으로 처리된 단백질, 예를 들면 정제중 처리된 카복시메틸화, 카복시아미드화, 아세틸화 단백질을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 DLL3 또는 DLL3을 포함하는 조성물을 제공한다. 단백질은 분리 또는 정제 형태일 수 있다. 본 발명은 나아가 DLL3 암호화 핵산 및 DLL3 암호화 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
추가적 측면에서, 개체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물이 제공되며, 이 조성물은 DLL3 폴리펩티드 및/또는 그 하나 이상의 항원성 또는 면역원성 단편, 및 하나 이상의 적합한 담체, 부형제, 희석제 또는 애쥬번트(적합한 애쥬번트는 후술된다)를 포함한다.
면역 반응을 유발할 수 있는 조성물은 예를 들면, DLL3 폴리펩티드 또는 그 유도체 또는 변이체, 및/또는 하나 이상의 이들의 항원성 또는 면역원성 단편을 임의로 하나 이상의 적합한 담체, 부형제, 희석제 또는 애쥬번트와 함께 포함하는 백신으로서 제공될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 예를 들면 하나 이상의 본 발명의 질병의 치료 또는 예방을 위한 DLL3 폴리펩티드, 또는 그 하나 이상의 단편 또는 유도체 또는 변이체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 예를 들면 하나 이상의 본 발명의 질병의 치료 또는 예방을 위한 DLL3 폴리펩티드, 또는 그 하나 이상의 단편 또는 유도체 또는 변이체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 예를 들면 하나 이상의 본 발명의 질병의 치료 또는 예방을 위한 의약품의 제조에서 DLL3 폴리펩티드, 또는 그 하나 이상의 단편 또는 유도체 또는 변이체의 용도를 제공한다.
일 측면에서 예를 들면 하나 이상의 본 발명의 질병의 치료 또는 예방을 위해 치료적 유효량의 DLL3 폴리펩티드, 그 하나 이상의 단편 또는 유도체 또는 변이체를 투여하는 것을 포함하는 치료방법이 제공된다.
본 발명은 추가적으로 개체에서 예를 들면 본 발명의 질병의 치료 또는 예방을 위한 방법, 또는 예를 들면 하나 이상의 본 발명의 질병에 대해 개체를 백신화하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 유효량의 DLL3 폴리펩티드 및/또는 그 하나 이상의 항원성 또는 면역원성 단편 또는 유도체 또는 변이체를, 예컨대 백신으로서 투여하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 예를 들면 본 발명의 질병의 개시 또는 전개를 예방하기 위해; (b) 예를 들면 본 발명의 질병의 진전을 예방하기 위해; 또는 (c) 예를 들면 본 발명의 질병의 증상을 경감하기 위해, 예를 들면 본 발명의 질병을 앓는 환자에서 DLL3을 조절(예, 상향 조절 또는 하향 조절)하거나 DLL3의 발현 또는 생물학적 활성을 보충하는 치료학적 유효량의 화합물을 환자에 투여하는 것을 포함하는 예를 들어 본 발명의 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
추가적 실시형태에서, 본 발명은 암치료, 바람직하게 본 발명의 질병 중 하나의 치료에서 동시, 순차 또는 별개 투여되기 위하여,
(a) DLL3, 및
(b) 항암제를 별개로 또는 함께 포함하는 의약품을 제공한다.
DLL3는 예를 들면 본 발명의 질병의 검출, 예측, 진단 또는 모니터링 또는 약물 개발을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 예를 들면 본 발명의 질병의 검출, 진단 및/또는 스크리닝 또는 진전의 모니터링 또는 개체에서 본 발명 질병에 대한 예를 들어 항암제 또는 항암 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공하며, 이는 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재 또는 수준, 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 수준 또는 DLL3 활성의 존재 또는 수준을 검출하는 것을 포함하거나 또는 상기 개체에서 이들의 수준 변화를 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 후보 개체에서 예를 들면 본 발명의 질병의 검출, 진단 및/또는 스크리닝 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 후보 개체내에서 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 DLL3 활성의 존재를 검출하는 것을 포함하며, 여기에서, (a) 건강한 개체내에서의 수준에 비교하여 상승된 수준의 후보 개체내 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 상승된 수준의 DLL3 활성의 존재 또는 (b) 건강한 개체내 상응하는 검출불가능한 수준에 비교하여 검출가능한 수준의 후보 개체내 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편 또는 검출가능한 수준의 DLL3 암호화 핵산의 존재 또는 검출가능한 수준의 DLL3 활성의 존재는 상기 개체내에서 예를 들면 본 발명의 질병이 존재함을 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 개체내에서 예를 들면 본 발명의 질병의 진전을 모니터링하거나 본 발명 질병에 대한 항암제 또는 항암 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공하며, 이는 상기 후보 개체에서 처음 시점 및 나중 시점에서의 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재, 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 DLL3 활성의 존재를 검출하는 것을 포함하고, 상기 처음 시점에서의 개체내의 수준에 비교하여 나중 시점에서의 개체내 상승 또는 저하된 수준의 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편, 또는 상승 또는 저하된 수준의 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 상승 또는 저하된 수준의 DLL3 활성의 존재는 예를 들면 본 발명의 질병의 진전 또는 재발을 나타내거나 또는 상기 개체에서 본 발명 질병에 대한 예를 들면 항암제 또는 항암 요법의 효과 있음 또는 없음을 나타낸다.
DLL3에 대해, 예를 들면 본 발명의 질병이 없는 개체에서 수득한 시료를 분석하여 얻어진 검출 수준에 비교된 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 개체에서 수득한 조직 시료를 분석하여 얻어진 검출 수준은 사용된 특정 분석 프로토콜 및 분석 기술에 의존할 것이다. 따라서 본 발명은 각 실험실이 진단 기술분야에서 통상적으로 행해지는 바와 같이 사용되는 분석 프로토콜 및 진단 기술에 따라 예를 들면 본 발명의 질병이 없는 개체에서의 기준 범위를 수립할 것으로 예상한다. 바람직하게, 예를 들면 본 발명의 질병을 앓는 것으로 알려진 개체에서 수득한 최소한 하나의 대조 양성 조직 시료 또는 예를 들면 본 발명의 질병이 없는 것으로 알려진 개체에서 수득한 최소한 하나의 대조 음성 조직 시료 (더 바람직하게는 양성 및 음성 대조 시료 둘 다)는 분석되는 시험 시료의 각 배치내에 포함된다.
본 발명의 일 측면에서, 예를 들면 본 발명의 질병의 스크리닝 또는 진단을 위한 DLL3 발현을 측정하거나, 본 발명 질병을 앓고 있는 환자를 예측하기 위해, 본 발명 질병에 대한 치료의 유효성을 모니터링하기 위해 또는 약물 개발을 위해, 액체 크로마토그라피-질량 분석 또는 다른 적합한 방법을 사용하여 개체, 바람직하게는 살아있는 개체에서 수득한 조직 시료에서 본 발명 질병을 분석한다.
상기 방법 중 임의의 방법에서, 암, 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 후보 개체에서 검출될 수 있는 수준은 바람직하게 건강한 개체에서의 수준보다 바람직하게 2배 이상 더 높다.
본 발명의 일 실시형태에서, 개체에서(예, 본 발명 질병을 갖는 것으로 의심되는 개체)의 조직 시료는 DLL3 검출을 위해 액체 크로마토그라피-질량 분석기로 분석된다. 본 발명 질병이 없는 개체(예, 대조 시료) 또는 미리 측정된 기준 범위에 대한 개체 조직에서의 DLL3 량의 증가는 본 발명의 질병이 존재함을 나타낸다.
DLL3의 단편, 에피토프 함유 단편, 면역원성 단편 또는 항원성 단편에 관련하여: 관련 암 적용을 위해, 본 발명의 일측면에서 이들은 실시예 1의 트립신(tryptic) 서열로서 확인되는 서열을 포함한다.
여기에서, DLL3는 오염 단백질이 실질적으로 없는 제제, 즉, 존재하는 전체 단백질의 10% 미만(예를 들여, 5% 미만, 예를 들어 1% 미만)이 오염 단백질인 제제로 존재할 때 "분리"된 것이다. 오염 단백질은 질량 분광 분석으로 측정시 분리된 DLL3과 실질적으로 다른 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 여기에서 "실질적으로 다른 서열"은 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 수행된 질량 분광 분석에 의해 오염 단백질이 DLL3로부터 분리되게 한다.
본 발명의 진단 및 예측 방법에서, DLL3는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 분석될 수 있으며, 이는 본 명세서에 기술된 바람직한 기술, 키나제 어세이, 효소 어세이, 결합 어세이 및 다른 기능적 어세이, 면역어세이 및 웨스턴 블롯팅을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
또는, DLL3는 면역 어세이에서 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 면역 어세이는 시험될 개체에서 수득한 시료를 항-DLL3 항체(또는 기타 친화성 시약)와 DLL3이 존재하는 경우 결합(예, 면역특이적 결합)이 일어나게 하는 조건하에서 접촉시키고, 및 이 물질에 의한 임의의 결합(예, 면역특이적 결합)을 검출하거나 그 양을 측정함으로써 수행된다. DLL3 결합제는 여기에 교시된 방법 및 기술에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, DLL3는 면역조직화학을 사용하여 분석된다.
DLL3는 이들의 단편, 예컨대 에피토프(예, 면역원성 또는 항원성) 함유 단편을 검출함으로써 검출할 수 있다. 단편은 최소한 10, 통상 최소한 20 아미노산 길이, 예를 들어, 최소한 50 또는 100 아미노산 길이, 예를들어 최소한 150 또는 200 아미노산 길이; 예를 들어, 최소한 300 또는 500 아미노산 길이; 예를 들어, 최소한 700 또는 900 아미노산 길이를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 조직 섹션에서 친화성 시약(예, 항체)의 결합은 이상(aberrant) DLL3 국재화 또는 DLL3의 이상 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 특정 일 실시형태에서, DLL3에 대한 항체(또는 다른 친화성 시약)는 환자 조직(예, 폐, 췌장 및 피부 조직)에서 DLL3 수준을 분석하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 DLL3의 이상 수준은 본 발명 질병을 나타낸다. 여기에서, "이상 수준"은 본 발명 질병이 없는 개체에서의 수준 또는 기준 수준에 비해 증가된 수준을 의미한다.
임의의 적합한 면역 어세이가 사용될 수 있으며, 비제한적으로 웨스턴 블롯, 방사성 면역 어세이, ELISA(효소 결합 면역흡착 어세이), "샌드위치" 면역 어세이, 면역침전 어세이, 침강소(precipitin) 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 어세이, 응집 어세이, 보체-고정 어세이, 면역방사 어세이, 형광 면역 어세이 및 단백질 A 면역 어세이와 같은 기술을 이용하는 경쟁 및 비-경쟁 어세이를 포함한다.
예를 들면, DLL3는 액체 시료(예, 혈액, 뇨, 또는 타액)에서 2단계 샌드위치 어세이에 의해 검출할 수 있다. 제1단계에서, 포획 시약(예, 항-DLL3 항체 또는 다른 친화성 시약)을 사용하여 DLL3를 포획한다. 포획 시약은 임의로 고체상에 고정될 수 있다. 제2단계에서, 직접 또는 간접 표지된 검출 시약을 사용하여 포획된 DLL3을 검출한다. 일 실시형태에서, 검출 시약은 렉틴이다. 이 목적을 위해 DLL3와 동일한 코어 단백질을 포함하는 다른 이소형 또는 항체에 의해 인식된 항원성 결정자를 공유하는 다른 단백질보다 DLL3에 우선적으로 결합하는 임의의 렉틴을 사용할 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 선택된 렉틴은 LL3와 동일한 코어 단백질을 포함하는 다른 이소형 또는 친화성 시약에 의해 인식된 항원성 결정자를 공유하는 다른 단백질보다 최소한 2배 이상의 친화성, 더 바람직하게는 최소한 5배 이상의 친화성, 더 바람직하게 최소한 10배 이상의 친화성으로 DLL3과 결합한다. 본 기재에 기초하여, DLL3 검출을 위해 적합한 렉틴은 본 기술분야에 잘 알려진 방법, 예를 들면 Sumar 등의 Lectins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, In: Gabius H-J & Gabius S (eds.), 1993, Lectins and Glycobiology, at pp. 158-174(본 명세서에 전부 참조로 포함된다)의 158-159면의 표 I에 열거된 하나 이상의 렉틴을 시험하여 용이하게 확인할 수 있다. 다른 실시형태에서, 검출 시약은 항체 (또는 다른 친화성 시약), 예를 들어, 특이적으로 다른 변역후 변형물을 특이적으로(예, 면역특이적으로) 검출하는 항체, 예를 들어 인산화 아미노산에 면역특이적으로 결합하는 항체이다. 이러한 항체의 예로는 포스포티로신에 결합하는 항체(BD Transduction Laboratories, catalog nos.: P11230-050/P11230-150; P11120; P38820; P39020), 포스포세린에 결합하는 항체(Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, catalog no. 61-8100) 및 포스포트레오닌에 결합하는 항체(Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, catalogue nos. 71-8200, 13-9200)를 포함한다.
요망되는 경우, DLL3을 암호화하는 유전자, 관련 유전자 또는 상보 서열을 포함을 포함하는 관련된 핵산 서열 또는 서브서열도 혼성화 어세이에서 사용될 수 있다. DLL3을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는, 최소한 8 뉴클레오타이드, 바람직하게 최소한 12 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게 최소한 15 뉴클레오타이드를 포함하는 이들의 서브서열이 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 혼성화 어세이는 DLL3를 암호화하는 유전자의 이상 발현이 수반되는 상태, 질병 또는 질환 상태의 검출, 예측, 진단, 또는 모니터링, 또는 예를 들면 본 발명의 질병을 시사하는 징후 또는 증상을 갖는 환자의 차별 진단을 위해 사용될 수 있다. 특히 이러한 혼성화 어세이는 핵산을 함유하는 개체의 시료를 혼성화가 일어날 수 있는 조건하에서 DLL3를 암호화하는 DNA 또는 RNA에 혼성화할 수 있는 핵산 프로브와 접촉시키고, 임의의 생성 혼성화를 검출 또는 측정하는 방법에 의해 수행된다.
따라서 DLL3 암호화 핵산(예, DNA 또는 더 적합하게 RNA)은 예컨대, DLL3를 암호화하는 핵산에 혼성화할 수 있는 혼성화제(특히 올리고뉴클레오타이드 프로브)를 사용하여 검출될 수 있다.
이러한 일 예시적 방법은 하기를 포함한다:
DLL3를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 10개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 개체에서 수득한 생물학적 시료에서 얻은 RNA 또는 이 RNA로부터 복사된 cDNA와 접촉시키는 단계, 여기에서 상기 접촉은 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 경우 이에 프로브가 혼성화할 수 있는 조건하에서 이루어진다;
존재하는 경우, 프로브 및 뉴클레오타이드 서열간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
존재하는 경우 단계 (b)에서 검출된 혼성화를 대조 시료에서 검출된 혼성화 또는 미리 측정한 기준 범위와 비교하는 단계.
본 발명은 또한 항-DLL3 항체(또는 다른 친화성 시약)을 포함하는 진단 키트를 제공한다. 또한, 이러한 키트는 임의로 하나 이상의 하기에 기재된 것들을 포함할 수 있다:
(1) 진단, 예측, 치료적 모니터링 또는 임의의 이들 적용의 조합을 위한 항-DLL3 친화성 시약을 사용하기 위한 지시;
(2) 친화성 시약에 대한 표지된 결합 파트너;
(3) 항-DLL3 친화성 시약이 고정된 고체상(예, 시약 스트립); 및
(4) 진단, 예측 또는 치료적 사용 또는 임의의 이들의 조합을 위한 규제기관의 승인을 나타내는 라벨 또는 인서트. 만약 친화성 시약에 대한 표지된 결합 파트너가 제공되지 않는 경우, 항-DLL3 친화성 시약 그 자체가 검출가능한 마커, 예를 들어 화학 발광성, 효소성, 형광성 또는 방사성 모이어티에 의해 표지될 수 있다.
본 발명은 또한 DLL3를 암호화하는 핵산, 적합하게 RNA에 혼성화할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는 키트를 제공한다. 일 특정 실시형태에서, 키트는 적절한 반응 조건하에서 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA 참조), 리가제 사슬 반응 (EP　320,308 참조) Qb 리플리카제의 사용, 사이클릭 프로브 반응 또는 당업계 공지된 다른 방법에 의해 DLL3를 암호화하는 핵산의 최소한 일부를 증폭을 프라임할 수 있는 하나 이상의 한 쌍의 프라이머 용기(예, 각각 6-30 뉴클레오타이드, 더 바람직하게 10-30 뉴클레오타이드 및 더 바람직하게 10-20 뉴클레오타이드 크기 범위)를 포함한다.
키트는 임의로 미리 결정된 양의 DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산을, 예를 들어, 표준 또는 대조로 사용되기 위해 포함할 수 있다.
여기에서, 용어 "시료"는 하나 이상의 본 발명 질병을 가질 우려가 있는 개체에서 수득한 체액(예, 혈액, 뇨 또는 타액) 및 조직 생검(예, 폐, 췌장 및 피부 생검과 같은 생검) 또는 이들의 호모지네이트(homogenate)를 포함한다.
예를 들면, 사용되는 생물학적 시료는 혈청 시료 또는 조직 시료 예, 폐, 췌장 및 피부 조직과 같은 임의의 공급원에서 수득 될 수 있다. 예를 들면, 본 발명 질병의 전이 증거를 찾을 때, 본 발명 질병 전이의 주요 부위 예컨대, 폐암에 대해 뇌, 간, 뼈 및 부신; 췌장암에 대해 간, 또는 피부암에 대해 폐, 뇌 및 뼈를 조사할 것이다.
또는 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 DLL3의 활성의 존재는 인 시투 분석에 의해 검출될 수 있다.
특정 실시형태에서, 여기에 기술된 진단 방법은 최소한 부분적으로 또는 전적으로 인 비트로 또는 엑스 비보로 수행될 수 있다.
적절하게 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재, 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 DLL3의 활성의 존재는 정량적으로 검출된다.
예를 들면, 정량적 검출은 다음을 포함할 수 있다:
생물학적 시료를 DLL3 특이적인 친화성 시약과 접촉시키는 단계, 여기에서 친화성 시약은 임의로 검출가능한 표지에 콘쥬게이트된다; 및
친화성 시약과 시료내 최소한 한 종간에 결합이 일어나는지 여부를 검출하는 단계, 여기에서 검출은 직접 또는 간접적으로 시행된다.
또는 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재, 또는 DLL3를 암호화하는 핵산의 존재 또는 DLL3 활성의 존재는 영상 기술을 사용하는 수단에 의해 정량적으로 검출될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 DLL3 또는 그 하나 이상의 단편의 존재, 또는 DLL3을 암호화하는 핵산의 존재 또는 DLL3 활성의 존재를 측정하여, 이로써 예를 들면 본 발명의 질병 세포를 국재화하기 위하여 예를 들어, 폐, 췌장 및 피부 조직 섹션상에서의 면역조직화학을 사용한다.
일 실시형태에서 DLL3 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편의 존재는 예를 들면 DLL3 또는 이의 하나 이상의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 친화성 시약, 예를 들어 항체를 사용하여 검출된다.
다른 실시형태에서 DLL3의 활성이 검출된다.
임상 연구에서의 사용
본 발명의 진단적 방법 및 조성물은 예를 들면 본 발명 질병의 치료를 위한 약물 평가를 위해 임상 연구의 모니터링에서 보조할 수 있다. 일 실시형태에서, 후보 분자는 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 개체에서 DLL3 수준을 본 발명 질병이 없는 개체에서 발견되는 수준으로 회복시키거나, 또는 처치된 개체에서 DLL3 수준을 비-폐암, 비-췌장암 또는 비-피부암 값에 또는 그 근처로 보존하는 능력에 대해 시험된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 방법과 조성물은 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 개인을 확인하기 위한 임상 연구를 위한 후보를 스크리닝하는데 사용된다; 이러한 개인은 이후 연구에서 배제되거나 치료 또는 분석을 위해 분리된 코호트에 배치될 수 있다.
본 발명 단백질 및 상응하는 핵산의 제조
일 측면에서 본 발명은 치료적 유효량의 DLL3을 암호화하는 핵산 또는 하나 이상의 그 단편 또는 유도체를 예를 들면 백신의 형태로 치료 또는 예방을 필요로하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 예를 들면 본 발명의 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 치료적 유효량의 DLL3의 기능 또는 발현을 저해하는 핵산을 치료 또는 예방을 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 예를 들면 본 발명의 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법(및/또는 여기 개시된 다른 DNA 측면들)은 예를 들면 핵산이 DLL3 안티-센스 핵산 또는 리보자임인 것을 포함한다.
따라서 본 발명은 예를 들면 본 발명의 질병의 치료 또는 예방용 의약품 제조에서 DLL3을 암호화하는 핵산 또는 하나 이상의 그 단편 또는 유도체의 용도를 포함한다.
또한 예를 들면 하나 이상의 본 발명 질병의 치료 또는 예방용 의약품 제조에서 DLL3의 기능 또는 발현을 저해하는 핵산의 용도를 제공한다.
본 발명에 사용되는 DNA는 상업적 mRNA를 스타터 물질로서 사용하고, 그 뉴클레오타이드 서열을 결정 및 확인하여 cDNA 라이브러리에서 수득한 cDNA 단편으로서 분리하여 수득할 수 있다. 즉, 특히 클론은 Ohara et al.의 방법(DNA Research Vol.4, 53-59 (1997))에 따라 제조되는 cDNA 라이브러리로부터 랜덤하게 분리된다. 다음, 혼성화를 통해, 복제된 클론(반복적으로 나타나는)이 제거된 후 인 비트로 전사 및 번역이 수행된다. 클론의 양쪽 말단의 뉴클레오타이드 서열이 결정되며, 이에 대해 50 kDa 이상의 산물이 확인된다.
나아가, 수득된 말단 뉴클레오타이드 서열을 쿼리로서 사용하여 그 상동성에 대해 공지 유전자의 데이타베이스를 서치한다.
상기 스크리닝 방법 이외에, cDNA의 5' 및 3' 말단 서열이 인간 게놈 서열에 관련된다. 이후 미지의 장쇄 유전자가 서열간 영역에서 확인되며, 전장 cDNA가 분석된다. 이런 식으로, 공지 유전자에 의존하는 통상적인 클로닝 방법으로 수득 될 수 없는 미지 유전자가 조직적으로 클로닝될 수 있다.
게다가, 본 발명의 DNA을 함유하는 인간-유래 유전자의 모든 영역은, 짧은 단편 또는 수득된 서열내에 인위적인 실수가 일어나지 않도록 충분히 주의하면서, RACE와 같은 PCR 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 전술한 바와 같이 본 발명의 DNA를 갖는 클론이 수득될 수 있다.
본 발명의 DNA를 클로닝하기 위한 다른 수단에서, 본 발명 폴리펩티드의 일 부분의 적합한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 합성 DNA 프라이머가 제조되고, 이어서 적합한 라이브러리를 사용하여 PCR 방법에 의해 증폭된다. 또는, 적합한 벡터내에 삽입되고 본 발명의 폴리펩티드의 일부 또는 모든 영역을 암호화하는 DNA 단편 또는 합성 DNA로 표지된 DNA와 본 발명의 DNA를 혼성화하여 선택이 수행될 수 있다. 혼성화는 예를 들면, Molecular Biology(Frederick M. Ausubel et al. 편집, 1987)의 현재 프로토콜에 기재된 방법으로 수행될 수 있다. 본 발명의 DNA는 전술한 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 임의의 DNA일 수 있다. 이러한 DNA는 폐, 췌장 및 피부 조직에서 유도된 cDNA 라이브러리 등에서 확인 및 분리된 cDNA일 수 있다. 이러한 DNA는 또한 합성 DNA 등일 수 있다. 라이브러리 구축에 사용되는 벡터는 임의의 박테리오파지, 플라즈미드, 코스미드(cosmids), 파지미드(phargemids) 등일 수 있다. 또한, 상기 세포 및/또는 조직에서 제조된 전체 RNA 분획 또는 mRNA 분획을 사용하여, 폴리머라제 사슬 반응이 커플링된 직접 역 전사(이하, "RT-PCR"으로 약칭)에 의해 증폭을 수행할 수 있다.
DLL3의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 이루어진 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 또는 아미노산 서열의 부분을 구성하는 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 DLL3의 아미노산 서열에서 유도되는 아미노산 서열로 이루어지는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 당업자에 알려진 점-돌연변이 방법, 유전자 상동 재조합법, 프라이머 신장법 및 PCR법의 적절한 조합에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 또한 이때, 폴리펩티드가 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖도록 하는 가능한 방법은 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 중에서 상동 아미노산(예, 극성 및 비극성 아미노산, 소수 및 친수 아미노산, 양 전하 및 음전하 아미노산, 및 방향족 아미노산)의 치환이다. 또한, 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 유지하기 위해, 본 발명의 폴리펩티드에 함유된 기능 도메인내 아미노산은 바람직하게 보존된다.
나아가, 본 발명의 DNA의 예는 DLL3의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 및 엄격한 조건하에서 상기 DNA와 혼성화하며 DLL3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성(기능)을 갖는 폴리펩티드 (단백질)를 암호화하는 DNA를 포함한다. 이러한 조건하에서, DLL3의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA와 혼성화할 수 있는 이러한 DNA의 예는 그 DNA의 전체 뉴클레오타이드 서열과 예컨대 약 80% 이상, 바람직하게 약 90% 이상, 더 바람직하게 약 95% 이상의 전체 평균 상동성 정도를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA이다. 혼성화는 Molecular Biology (Frederick M. Ausubel et al. 편집, 1987)의 현재 프로토콜에 기술된 방법 또는 여기에 따른 방법과 같은 당업계 공지 방법에 따라 수행될 수 있다. 여기에서, "엄격한 조건"은 예를 들면, 약 "1*SSC, 0.1% SDS, 및 37℃"의 조건이고, 더 엄격한 조건은 약 "0.5*SSC, 0.1% SDS, 및 42℃"이며, 보다 더 엄격한 조건은 약 "0.2*SSC, 0.1% SDS, 및 65℃"이다. 더 엄격한 혼성화 조건에서, 프로브 서열과 높은 상동성을 갖는 DNA의 분리가 예상된다. 상기 SSC, SDS 및 온도 조건의 조합은 예시적 목적을 위해 주어진다. 위와 유사한 엄격도는 상기 인자 또는 혼성화 엄격도 결정을 위한 다른 인자(예를 들면, 프로브 농도, 프로브 길이, 및 혼성화를 위한 반응 시간)의 적절한 조합을 사용하여 당업자에 의해 성취될 수 있다.
본 발명의 클로닝된 DNA는 목적에 따라 직접, 또는 요망되는 경우 제한 효소로의 소화 또는 링커 추가후 사용될 수 있다. DNA는 5' 말단 측에 번역 개시 코돈으로서 ATG를 가질 수 있으며, 3' 말단 측에 번역 종결 코돈으로서 TAA, TGA, 또는 TAG를 가질 수 있다. 이러한 번역 개시 및 번역 종결 코돈은 적합한 합성 DNA 어댑터를 사용하여 추가될 수 있다.
본 발명의 방법/사용에서, DLL3는 예를 들면 DLL3 폴리펩티드가 최소한 어느 정도 정제된 것과 같은 분리된 형태로 제공될 수 있다. DLL3 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 형태, 즉 다른 단백질이 실질적인 정도로 없는 형태로 제공될 수 있다. DLL3 폴리펩티드는 또한 재조합 방법, 합성법, 또는 이들 방법의 조합으로 제조될 수 있다. DLL3는 당업자에 공지된 임의의 방법으로 용이하게 제조될 수 있으며, 이들 방법은 적합한 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 DNA를 함유하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하고, 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 관련된 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 함유 재조합 단백질을 생성 및 축적한 후, 결과물을 수거하는 것을 포함한다.
재조합 DLL3 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 당업계에 잘 공지된 과정에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 DLL3 폴리펩티드 또는 핵산을 포함하는 발현 시스템, 이러한 발현 시스템으로 유전적으로 조작된 숙주 세포 및 재조합 기술로 DLL3 폴리펩티드를 제조하는 것에 관한 것이다. 재조합 DLL3 폴리펩티드 제조에 대해, 숙주 세포는 발현 시스템 또는 핵산에 대한 그 일부가 삽입되도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이러한 삽입은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들면 칼슘 포스페이트 트랜스팩션, DEAD-덱스트란 매개 트랜스팩션, 트랜스벡션(transvection), 마이크로인젝션, 양이온성 지질-매개 트랜스팩션, 전기천공법, 형질도입, 스크레입로딩법(scrape loading), 벌리스틱(ballistic) 도입 또는 감염(예컨대, Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986 and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbour laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989 참조) 등을 사용하여 수행될 수 있다.
숙주 세포로서, 예를 들면, 대장균(에스케리치아), 연쇄상구균(Streptococci), 포도상구균(Staphylococci), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 박테리아, 바실러스(Bacillus) 속 박테리아, 효모, 아스페르길루스(Aspergillus) 세포, 곤충 세포, 곤충 및 동물 세포가 사용된다. 여기에 사용되는 대장균 속 박테리아의 특정 예는 에스케리치아 콜라이 K12 및 DH1(Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A., Vol. 60, 160 (1968)), JM103(Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)), JA221(Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 517 (1978)), 및 HB101(Journal of Molecular Biology, Vol. 41, 459 (1969))을 포함한다. 바실러스 속 박테리아로서, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스 MI114(Gene, Vol. 24, 255 (1983)) 및 207-21(Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (1984))가 사용된다. 효모로서, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccaromyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 및 20B-12, 스 키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccaromyces pombe) NCYC1913 및 NCYC2036, 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)가 사용된다. 곤충 세포로서, 예를 들면, 초파리(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포가 사용된다. 동물 세포로서, 예를 들면, COS-7 및 베로 원숭이 세포, CHO 차이니즈 햄스터 세포(이하, CHO 세포로 약칭), dhfr-유전자-결여 CHO 세포, 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20 세포, 마우스 골수종 세포, 랫트 GH3 세포, 인간 FL 세포, COS, HeLa, C127, 3T3, HEK 293, BHK 및 바우스(Bowes) 흑색종 세포가 사용된다.
무-세포 번역 시스템을 사용하여 재조합 폴리펩티드를 제조할 수도 있다(예, 토끼 망상 적혈구 용해물, 밀 맥아 용해물, SP6/T7 인 비트로 T&T 및 RTS 100 E. Coli HY 전사 및 번역 키트(Roche Diagnostics Ltd., Lewes, UK) 및 전사/번역 시스템 커플링된 TNT 퀵(Promega UK, Southampton, UK)).
발현 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면,벡터는 (1) 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 DNA 함유 유전자를 함유하는 DNA 단편을 적출하고 (2) 적합한 발현 벡터 내 프로모터의 다운스트림에 DNA 단편을 결찰하여 제조할 수 있다. 다양한 발현 시스템이 사용될 수 있으며, 예를 들어 비제한적으로, 염색체-, 에피솜- 및 바이러스-유도된 시스템, 예컨대, 에스케리치아 콜라이에서 유도된 플라즈미드(예, pBR322, pBR325, pUC18, 및 pUC118), 바실러스 서브틸리스(예, pUB110, pTP5, 및 pC194), 박테리오파지, 트랜스포손, 효모 에피솜(예, pSH19 및 pSH15), 삽입 요소들에서, 효모 염색체의 요소들, 바큘로바이러스(baculovirus), SV40와 같은 파포바바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 위광견병 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로에서 유도된 플라즈미드, 및 이들의 조합에서 유도된 벡터, 예컨대 플라즈미드 및 박테리오파지(예, [람다]파지) 유전적 요소들로부터 유도된 것들, 예컨대 코스미드 및 파지미드 등이 사용될 수 있다. 발현 시스템은 발현을 생기게 할 뿐 아니라 조절하는 조절 영역을 함유할 수 있다. 본 발명에 사용된 프로모터는 유전자 발현에 사용되기 위해 숙주에 적합한 임의의 프로모터일 수 있다. 예를 들면, 숙주가 에스케리치아 콜라이인 경우, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, pL 프로모터, lpp 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 바 실러스 서브틸리스인 경우, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 효모인 경우, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다. 동물 세포가 숙주로서 사용되는 경우, 이 경우에 사용되기 위한 프로모터의 예는 SRa 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV 프로모터, 및 HSV-TK 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 숙주에서 폴리펩티드를 제조하기 위해 핵산을 유지, 번식 또는 발현시킬 수 있는 임의의 시스템 또는 벡터가 사용될 수 있다.
적합한 핵산 서열이 전술한 Sambrook et al.에 기재된 잘 알려지고 일상적인 임의의 다양한 기술에 의해 발현 시스템내에 삽입될 수 있다. 적합한 분비 시그널이 DLL3 폴리펩티드에 포함되어 번역된 단백질이 소포체의 내강, 원형질막주위 공간 또는 세포외 환경으로 분비되도록 할 수 있다. 이러한 시그널은 DLL3 폴리펩티드에 대해 내재성이거나 또는 이종 시그널일 수 있다. 숙주 세포의 변형은 당업계 공지 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 하기 문헌들이 참조될 수 있다: Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., Vol. 69, 2110 (1972); Gene, Vol. 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979); Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), Vol. 75, 1929 (1978); Cell Technology, separate volume 8, New Cell Technology, Experimental Protocol. 263-267 (1995)(Shujunsha 발행); 및 Virology, Vol. 52, 456 (1973). 이렇게 수득된 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 DNA를 함유하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 전환된 형질전환체는 당업계에 알려진 방법에 따라 배양될 수 있다. 예를 들면, 숙주가 에스케리치아 속 박테리아인 경우, 이 박테리아는 일반적으로 약 15℃ 내지 43℃에서 약 3 내지 24 시간 동안 배양된다. 필요한 경우, 폭기 또는 진탕이 추가될 수 있다. 숙주가 바실러스 속 박테리아인 경우, 이 박테리아는 일반적으로 약 30℃ 내지 40℃에서 약 6 내지 24 시간 동안 배양된다. 필요한 경우, 폭기 또는 진탕이 추가될 수 있다. 숙주가 효모인 형질전환체가 배양되는 경우, 배양은 약 5 내지 8로 pH가 조절된 배지를 사용하여 일반적으로 약 20℃ 내지 35℃에서 약 24 내지 72 시간 동안 수행된다. 필요한 경우, 폭기 또는 진탕이 추가될 수 있다. 숙주가 동물 세포인 형질전환체가 배양되는 경우, 세포는 일반적으로 약 30℃ 내지 40℃에서 약 15 내지 60 시간 동안 약 6 내지 8로 pH가 조절된 배지를 사용하여 배양된다. 필요한 경우, 폭기 또는 진탕이 추가될 수 있다.
DLL3 폴리펩티드가 세포-기반 스크리닝 어세이에서 사용되기 위해 발현되는 경우, 폴리펩티드는 세포 표면에서 제조되는 것이 바람직하다. 이 경우, 세포는 스크리닝 어세이에서 사용되기 전에 수확될 수 있다. DLL3 폴리펩티드가 배지내 분비되는 경우, 배지는 회수되어 상기 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 세포내로 제조되는 경우, 세포는 DLL3 폴리펩티드를 회수하기 전에 먼저 용해되어야 한다.
DLL3 폴리펩티드는 재조합 세포 배양물 또는 다른 생물학적 공급원으로부터, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그라피, 포스포셀룰로스 크로마토그라피, 친화성 크로마토그라피, 소수성 상호작용 크로마토그라피, 하이드록실아파타이트 크로마토그라피, 분자체 크로마토그라피, 원심분리법, 전기영동법 및 렉틴 크로마토그라피를 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 회수 및 정제될 수 있다. 일 실시형태에서, 이들 방법들의 조합이 사용된다. 다른 실시형태에서, 고성능 액체 크로마토그라피가 사용된다. 추가 실시형태에서, 상기 폴리펩티드의 DLL3 폴리펩티드를 포함하는 시료를 고갈시키거나 상기 폴리펩티드를 정제하기 위해, DLL3 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 사용될 수 있다.
배양 산물에서 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질을 분리하고 정제하기 위하여, 예를 들면 배양 후 미생물체(microbial bodies) 또는 세포를 알려진 방법으로 수거하고, 적합한 버퍼에 현탁하고, 미생물체 또는 세포를 예를 들면, 초음파, 리소자임 및/또는 동결-해동에 의해 파괴한 후 결과물을 원심분리 또는 여과하여 단백질의 조추출물을 수득할 수 있다. 버퍼는 또한 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드와 같은 단백질변성제 또는 트리톤 X-100(TM)과 같은 계면활성제를 포함할 수 있다. 단백질이 배양 용액에 분비된 때, 배양이 완료된 후 미생물체 또는 세포 및 상등액을 알려진 방법으로 분리한 후 상등액을 수거한다. 이렇게 수득한 배양 상등액 또는 추출물내 포함된 단백질은 알려진 분리 및 정제 방법을 적절히 조합하여 정제될 수 있다. 이렇게 수득된 본 발명의 폴리펩티드 (단백질)는 알려진 방법 또는 이에 따른 방법으로 염으로 전환될 수 있다. 역으로, 본 발명의 폴리펩티드 (단백질)이 염의 형태로 수득된 경우, 이는 알려진 방법 또는 이에 따른 방법으로 자유 단백질 또는 펩티드 또는 다른 염으로 전환될 수 있다. 또한 트립신 또는 키모트립신과 같은 적합한 단백질 변형 효소가 정제 전후 재조합에 의해 제조된 단백질에 작용하여, 변형이 임의로 가해지거나 또는 폴리펩티드가 부분적으로 제거되도록 할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 (단백질) 또는 그 염의 존재는 특이적 항체 등을 사용한 다양한 결합 어세이, 효소 면역 어세이에 의해 측정될 수 있다.
분리 및/또는 정제 중에 폴리펩티드가 변성된 경우, 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 DLL3 폴리펩티드의 자연 또는 활성 구조를 재생하도록 리폴딩할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, DLL3 폴리펩티드는 비제한적으로 혈액 시료 또는 조직 시료, 예컨대, 폐, 췌장 및 피부 조직 시료와 같이 임의의 공급원에서 얻어진 생물학적 시료로부터 수득될 수 있다.
DLL3 폴리펩티드는 "성숙 단백질"의 형태이거나 융합 단백질과 같은 큰 단백질의 부분일 수 있다. 종종 분비 또는 리더 서열, 프리-, 프로- 또는 프리프로-단백질 서열을 포함하는 부가적 아미노산 서열 또는 친화성 태그(tag), 예를 들면, 비제한적으로 다중 히스티딘 잔기, FLAG 태그, HA 태그 또는 myc 태그 등과 같은 정제를 보조할 수 있는 서열을 포함하는 것이 유리하다.
DLL3는 이종성 융합 파트너, 예를 들면 헤모필러스 인플루엔자 B에서의 단백질 D로 알려진 표면 단백질, NS1과 같은 인플루엔자 바이러스에서의 비구조 단백질, B형 간염에서의 S 항원 또는 예컨대 이들의 C 말단과 같은 LYTA로 알려진 단백질 등과 융합될 수 있다.
재조합 제조중 안정성을 제공할 수 있는 부가 서열도 사용될 수 있다. 이러한 서열은 부가 서열 또는 일부로서 분해가능한 서열을 삽입함으로써 요구되는 대로 임의로 제거될 수 있다. 따라서, DLL3 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들면, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 및 단백질 A)를 포함하는 다른 모이어티에 융합될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 적합한 프로테아제를 사용하여 분해된 후, 각 단백질로 분리될 수 있다. 이러한 부가 서열 및 친화성 태그는 당업계에 잘 공지되어 있다. 요망되는 경우, 전술한 것 이외에 당업계에 알려진 요소, 예컨대, 인핸서, 접합 시그널, polyA 부가 시그널, 선택 마커, 및 SV40 복제 오리진 등이 발현 벡터에 추가될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 질병, 예컨대 암, 특히 본 발명의 질병을 치료, 스크리닝, 검출 및/또는 진단하는데 사용되기 위한, DLL3 또는 그 단편에 특이 결합할 수 있는 물질 또는 DLL3를 암호화하는 핵산에 혼성화할 수 있는 혼성화제 또는 DLL3 활성을 검출할 수 있는 물질을 제공한다.
DLL3 에 대한 친화성 시약의 제조
일 측면에서, 본 발명은 DLL3 또는 그 단편에 특이 결합할 수 있는 친화성 또는 면역 친화성 시약, 예를 들면 검출가능한 표지를 포함하거나 이에 콘쥬게이트되거나, 또는 치료적 모이어티, 예컨대 세포독성 모이어티를 포함하거나 이에 콘쥬게이트되는 친화성 시약을 제공한다. 친화성 물질은 예를 들면 항체일 수 있다. 친화성 시약은 분리된 친화성 시약 또는 정제된 친화성 시약일 수 있다.
본 발명에 사용되기 위한 친화성 시약은 DLL3 상의 에피토프, 예컨대, 서열번호: 1 또는 2 중 어느 하나의 하나 이상의 부분에 결합할 수 있다. 바람직하게, 친화성 시약은 DLL3의 세포외 도메인(예, 세포외 꼬리 또는 세포외 루프) (예, 서열번호: 12에) 특이적으로 결합한다.
당업계의 기술에 따라, 세 가지 주요 타입의 면역 친화성 시약-단클론 항체, 파지 디스플레이 항체 및 소 항체-유도 분자 예컨대, 아피바디, 도메인 항체(dAbs), 나노바디, 유니바디, 달핀, 안티칼린, 듀오칼린, 아비머 또는 버사바디가 있다. 일반적으로 항체 사용이 언급되는 본 발명에 따른 적용에서, 다른 친화성 시약(예, 아피바디, 도메인 항체, 나노바디, 유니바디, 달핀, 안티칼린, 듀오칼린, 아비머 또는 버사바디)가 사용될 수 있다. 이러한 물질은 DLL3에 면역특이적 결합을 할 수 있다고 한다. 적절한 경우, 용어 "친화성 물질"은 면역 친화성 시약 및 비제한적으로 리간드, 렉틴, 스트렙타비딘, 항체 미메틱 및 합성 결합제를 포함하는 DLL3에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 물질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
DLL3 에 대한 항체 제조
본 발명에 따라 DLL3, DLL3 아날로그, DLL3-관련 단백질 또는 이들의 단편 또는 유도체가 면역원으로 사용되어 이러한 면역원에 면역특이적으로 결합하는 항체를 생성할 수 있다. 이러한 면역원은 전술한 방법을 포함하는 임의의 편리한 수단에 의해 분리될 수 있다. 용어 "항체"는 여기에서 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역글로불린 유전자 또는 그 단편으로부터 유래되거나, 이를 쫓아 모델링되거나 또는 이들에 의해 실질적으로 암호화되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 예컨대, Fundamental Immunology, 3rd Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. 방법 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem . Biophys . Methods 25:85-97 참조. 용어 항체는 항원-결합 부분, 즉 항원에의 결합능을 보유하는 "항원 결합 부위"(예, 단편, 서브서열, 상보성 결정 영역(CDRs))을 포함하며, 이는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 일가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에 디설파이드 브리지로 연결된 두개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 단쇄 항체도 참조로 용어 "항체"에 포함된다. 본 발명의 항체는 비제한적으로 다클론, 단클론, 이중 특이성, 인간화 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 단편 및 F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 단편, 항-유전자형(항-Id) 항체, 및 이들의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 클래스(예, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA, 예컨대 IgG) 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다.
용어 "특이적으로 결합" 또는 "특이결합"(또는 "면역특이적으로 결합")은 항체가 의도된 타겟에 배타적으로 결합하는 것을 지시하도록 의도된 것은 아니다. "특이적으로 결합하는" 항체는 그 의도된 타겟에의 친화성이 비-타겟 분자에 대한 친화성에 대비하여 통상 약 5배 이상인 것이다. 적합하게, 원하지 않는 물질, 특히 건강한 사람이나 동물의 자연 발생적 단백질 또는 조직과는 심각한 교차-반응 또는 교차-결합이 없다. 바람직하게 항체 친화성은 비-타겟 분자에 대한 친화성보다 타겟 분자에 대한 친화성이 최소한 약 5배, 바람직하게 10배, 더 바람직하게 25배, 더 바람직하게 50배, 가장 바람직하게 100배 이상 더 높다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 다른 결합제와 항원과의 특이적 결합은 최소 106 M-1의 결합 친화성을 의미한다. 항체는 예를 들면, 최소 약 107 M-1, 바람직하게는 약 108 M-1 내지 약 109 M-1, 약 109 M-1 내지 약 1010 M-1, 또는 약 1010 M-1 내지 약 1011 M-1의 친화성으로 결합할 수 있다.
친화성은 Kd =koff/kon(koff는 해리 속도상수이고, kon는 결합 속도상수이며, Kd는 평형 상수이다)로 산출된다. 친화성은 평형시 다양한 농도(c)에서 표지된 리간드의 결합 분획(r)을 측정함으로써 결정된다. 그 결과는 스캐챠드 반응식 r/c = K(n-r)을 사용하여 그라프로 도시된다:
식에서,
　　　　　　　 r = 평형시 결합 리간드의 몰/수용체의 몰;
　　　　　　　 c = 평형시 자유 리간드 농도;
　　　　　　　 K = 평형 결합 상수; 및
　 n = 수용체 분자당 리간드 결합 부위의 수
그라프 분석에 의해, r/c를 Y-축에 r을 X-축에 나타내어 스캐챠드 도면을 얻는다. 친화성은 선의 음의 기울기이다. koff 는 과잉의 비표지 리간드로 결합된 표지 리간드를 경쟁시켜 측정할 수 있다(예, 미국 특허 제6,316,409호 참조).　타겟 분자에 대한 타겟제의 친화성은 예를 들면 적어도 약 1 x 10-6 몰/리터, 예컨대 적어도 약 1 x 10-7 몰/리터, 예컨대 적어도 약 1 x 10-8 몰/리터, 특히 적어도 약 1 x 10-9 몰/리터, 특히 적어도 약 1 x 10-10 몰/리터이다. 스캐챠드 분석에 의한 항체 친화성 측정은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, van Erp et al., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson and Griswold, Comput . Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988 참조.
일 실시형태에서, DLL3을 암호화하는 유전자의 유전자 산물을 인식하는 임의의 공개적으로 입수가능한 항체가 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 당업자에 알려진 방법을 사용하여 DLL3, DLL3 아날로그, DLL3-관련 폴리펩티드, 또는 이들의 단편 또는 유도체를 인식하는 항체를 제조할 수 있다. 당업자는 예를 들면, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y의 항체편에 기재된 바와 같은 많은 방법을 사용하여 항체를 제조할 수 있음을 인식할 것이다. 당업자는 또한 다양한 방법(Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992))에 의해 유전자 정보로부터 항체를 모방하는 결합 단편 또는 Fab 단편을 제조할 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, DLL3의 특정 도메인에 대한 항체가 제조된다. 특정 실시형태에서, DLL3의 친수성 단편이 항체 제조를 위한 면역원으로 사용된다.
항체 제조에 있어서, 원하는 항체의 스크리닝은 당업계에 알려진 기술, 예컨대, ELISA (효소-결합 면역흡착 어세이)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, DLL3의 특정 도메인을 인식하는 항체를 선택하기 위해, 이러한 도메인을 포함하는 DLL3 단편에 결합하는 산물을 위해 생성된 히브리도마를 어세이할 수 있다. 제1 DLL3 호몰로그에는 특이적으로 결합하나 제2 DLL3 호몰로그에는 특이적으로 결합하지 않는(또는 덜 결합하는) 항체를 선택하기 위해, 제1 DLL3 호몰로그에는 양성결합을 나타내고 제2 LL3 호몰로그에는 결합하지 않는(또는 감소된 결합을 보이는) 것을 기초로 선택할 수 있다. 유사하게, DLL3에는 특이적으로 결합하나 동일한 단백질의 다른 이소형(예, DLL3과 동일한 코어 펩티드를 가지는 상이한 글리코형)에는 특이적으로 결합하지 않는(또는 덜 결합하는) 항체를 선택하기 위해, DLL3에는 양성결합을 나타내고 상이한 이소형(예, 상이한 글리코형)에는 결합하지 않는(또는 감소된 결합을 보이는) 것을 기초로 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명은 DLL3의 상이한 이소형 또는 이소형들(예, 글리코형)보다 더 큰 친화성(예를 들면 최소한 2배, 예컨대 최소한 5배 특히 최소한 10배 더 큰 친화성)으로 DLL3에 결합하는 항체(예, 단클론 항체)를 제공한다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다클론 항체는 면역 동물의 혈청에서 유래된 항체 분자의 이종 집단이다. 미분획 면역 혈청도 사용될 수 있다. 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용하여 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 단편에 대한 다클론 항체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 일 방법은 예컨대, 당업계에 잘 알려진 고상 펩티드 합성법을 사용하여 관심 폴리펩티드를 정제하거나 관심 폴리펩티드를 합성하는 것이다. 예를 들어, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth . Enzymol. Vol 182 (1990); Solid Phase Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth . Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem . Pharm . Bull. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed . Pept . Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujiwara et al., Chem . Pharm . Bull. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996 참조. 이후 선택된 폴리펩티드는 비제한적으로 토끼, 마우스, 랫트 등을 포함하는 다양한 숙주 동물에 주사하여 이들을 면역시켜 다클론 또는 단클론 항체을 생성하는데 사용될 수 있다. DLL3가 겔 전기영동에 의해 정제되는 경우, DLL3는 폴리아크릴아미드겔로부터 미리 추출하거나 또는 추출없이 면역에 사용될 수 있다. 다양한 애쥬번트(즉, 면역자극제)를 면역반응을 증강하기 위해 사용할 수 있으며, 이는 숙주 종에 따라 비제한적으로 완전 또는 불완전 프루인트 애쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드와 같은 광물성 겔, 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 또는 코리네박테리윰 파붐과 같은 애쥬번트 등을 포함한다. 부가 애쥬번트 또한 당업계에 잘 알려져 있다.
DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 단편에 대한 단클론 항체(mAbs)의 제조를 위해, 배양에서 연속 세포주에 의한 항체분자 제조에 제공되는 임의의 기술들이 사용될 수 있다. 예를 들면, Kohler 및 Milstein (1975, Nature 256:495-497)에 의해 처음 개발된 히브리도마 기술, 트리오마 기술, 인간 B-세포 히브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), 및 인간 단클론 항체 제조를 위한 EBV-히브리도마 기술(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 이들의 임의의 서브클래스일 수 있다. 본 발명의 mAbs를 생성하는 히브리도마는 인 비트로 또는 인 비보 배양될 수 있다. 본 발명의 부가적 실시형태에서, 단클론 항체는 공지된 기술을 사용하여 무균 동물에서 제조될 수 있다(PCT/US90/02545, 참조로 본 명세서에 포함).
단클론 항체는 비제한적으로 인간 단클론 항체 및 키메라 단클론 항체(예, 인간-마우스 키메라)를 포함한다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물종으로부터 유래된 분자로서, 예컨대 인간 면역글로불린 불변 영역 및 쥐 mAb로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체이다(예를 들어, Cabilly et al., 미국 특허 제 4,816,567호 및 Boss et al., 미국 특허 제 4,816,397호 참조, 이들은 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다). 인간화 항체는 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역과 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체분자이다(예, Queen, 미국 특허 제 5,585,089호 참조, 이는 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다).
키메라 및 인간화 단클론 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술 예를 들면 PCT 공개 WO 87/02671호; 유럽 특허출원 제184,187호; 유럽 특허출원 제 171,496호; 유럽 특허출원 제173,494호; PCT 공개 WO 86/01533; 미국 특허 제 4,816,567호; 유럽 특허출원 제125,023호; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc . Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; 및 Shaw et al., 1988, J. Natl . Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechnoques 4:214; 미국 특허 제5,225,539호; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
완전 인간 항체가 인간 개체의 치료적 처치에 특히 바람직하다. 이러한 항체는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 없으나, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예컨대 DLL3 전체 또는 일부로 정상적인 방식으로 면역된다. 항원에 대한 단클론 항체는 통상적인 히브리도마 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 서식된 인간 면역글로불린 이식유전자는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 진행된다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체의 제조가 가능하다. 인간 항체 제조기술의 개괄을 위해서는, Lonberg 및 Huszar 참조(1995, Int . Rev. Immunol. 13:65-93). 인간 항체 및 인간 단클론 항체 생산 기술에 대한 자세한 논의 및 이러한 항체 생성을 위한 프로토콜은 예컨대, 미국 특허 5,625,126; 미국 특허 5,633,425; 미국 특허 5,569,825; 미국 특허 5,661,016; 및 미국 특허 5,545,806 참조. 또한, Abgenix, Inc.(Freemont, CA) 및 Genpharm(San Jose, CA)와 같은 회사는 전술한 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는데 관여할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "안내 선택(guided selection)"으로 지칭되는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이 접근에서 선택된 비-인간 단클론 항체, 예, 마우스 항체가 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선택을 안내하기 위해 사용된다(Jespers et al. (1994) BioTechnology 12:899-903).
본 발명의 항체는 또한 선택된 타겟에의 결합을 위한 폴리펩티드 라이브러리를 제조하고 스크리닝하기 위해 파지 디스플레이 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예컨대, Cwirla et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87, 6378-82, 1990; Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990, Scott and Smith, Science 249, 386-88, 1990; 및 Ladner et al., 미국 특허 제 5,571,698호 참조. 파지 디스플레이 방법의 기본적 개념은 스크리닝될 폴리펩티드를 암호화하는 DNA와 폴리펩티드간의 물리적 결합의 수립이다. 이 물리적 결합은 파지 입자에 의해 제공되며, 이 입자는 폴리펩티드를 암호화하는 파지 게놈을 둘러싸는 캡시드의 부분으로서 폴리펩티드를 전시한다. 폴리펩티드와 그 유전적 물질간의 물리적 결합의 수립은 상이한 폴리펩티드를 갖는 매우 많은 수의 파지의 동시적인 대량 스크리닝이 가능하게 한다. 타겟에 대해 친화성을 가진 폴리펩티드를 전시하는 파지는 타겟에 결합하고, 이들 파지들은 타겟에 친화성 스크리닝에 의해 강화된다. 이들 파지에서 전시된 폴리펩티드의 확인은 이들 각각의 게놈로부터 결정될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 원하는 타겟에 대한 결합 친화성을 갖는 것으로 확인된 폴리펩티드는 이후 통상적인 방법에 의해 대량 합성될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제 6,057,098호 참조할 수 있고, 이 문헌은 모든 표, 도 및 청구항 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다. 특히 이러한 파지는 목록 또는 조합 항체 라이브러리 (예, 인간 또는 쥐(murine))에서 발현되는 항원 결합 도메인을 전시하는데 사용될 수 있다. 관심 항원과 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원에 의해, 예컨대 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선택되거나 확인될 수 있다. 이러한 방법에 사용된 파지는 통상 Fab, Fv 또는 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파지에서 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 섬유성 파지이다. 본 발명의 항체를 만드는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법은 Brinkman et al., J. Immunol . Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol . Methods. 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur . J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원 제PCT/GB91/01134호; PCT 공개 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,750,753호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호에 개시된 방법을 포함하며, 이들 각각은 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다.
전술한 문헌에 기술된 바와 같이, 파지 선택 후, 항체 코딩 영역은 파지로부터 분리되어, 인간 항체를 포함하는 전체 항체 또는 임의의 다른 요망되는 항원 결합 단편을 생성하는데 사용되고, 예컨대 하기에 자세히 후술되는 바와 같이 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들면, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 제조하는 기술도 PCT 공개 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); 및 Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); 및 Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (상기 참조문헌들은 전체로 여기에 포함된다)에 기재된 것과 같은 당업계 공지된 방법을 사용하여 사용될 수 있다.
단쇄 Fvs 및 항체 제조에 사용될 수 있는 기술의 예는 미국 특허 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에 개시된 것들을 포함한다.
나아가 본 발명은 이중 특이성 항체의 용도를 제공하며, 이 항체는 당업계 공지 방법에 의해 제조될 수 있다. 전장 이중 특이성 항체의 전통적인 제조는 두 개의 면역글로불린 중쇄-단쇄 쌍의 공발현에 기초하며, 여기에서 두 개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다(Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤한 결합 때문에, 이들 히브리도마(quadromas)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이 중 오직 하나만 올바른 이중 특이성 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상 친화성 크로마토그라피 단계들에 의해 이루어지며, 다소 힘들고 산물 수율이 낮다. 유사한 과정이 1993년 5월 13일 공개된 WO 93/08829 및 Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659에 개시되어 있다.
상이하고 더 선호되는 접근에 따라, 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게 최소한 힌지 부분, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 경쇄 결합에 필수적인 부위를 갖는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 융합 중 최소한 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합 및, 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA가 별개의 발현 벡터에 삽입되며, 적합한 숙주 유기체내에 공-형질감염된다. 이는 구축에 사용되는 세개의 폴리펩티드 사슬의 고르지 않은 비율이 적정 수율을 제공할 때, 실시형태에서 새개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 큰 유연성을 제공한다. 그러나 최소한 두개의 폴리펩티드 사슬이 동일한 비율일 때 더 높은 수율을 결과하거나 또는 비율이 특별한 의미가 없는 경우, 하나의 발현 벡터에 두개 또는 모든 세개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
이 접근의 바람직한 실시형태에서, 이중 특이성 항체는 한 암에 제1 결합 특이성을 갖는 히브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 암에 히브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이러한 비대칭적 구조는 원하지 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중 특이성 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 밝혀졌으며, 이중 특이성 분자의 오직 한쪽 반에만 면역글로불린 경쇄가 존재함으로써 분리가 수월해지기 때문이다. 이러한 접근은 1994년 3월 3일 공개된 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중 특이성 항체 제조에 대한 보다 자세한 것은, 예를 들면, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210 참조.
본 발명은 항-DLL3 면역글로불린 분자의 기능적으로 활성인 단편, 유도체 또는 아날로그를 제공한다. 기능적으로 활성은 상기 단편, 유도체 또는 아날로그가 유래된 항체에 의해 인식되는 동일한 항원을 인식하는 항-항-유전자형 항체(즉, 3차 항체)를 상기 단편, 유도체 또는 아날로그가 유발할 수 있다는 것을 의미한다. 특히, 바람직한 실시형태에서, 면역글로불린 분자의 유전자형의 항원성은 프레임워크 및 항원을 특이적으로 인식하는 CDR 서열의 C-말단인 CDR 서열을 삭제함으로써 증강될 수 있다. CDR 서열이 항원과 결합하는지를 결정하기 위해, 당업계에 공지된 임의의 결합 어세이 방법에 의해, CDR 서열을 함유하는 합성 펩티드를 항원과 함께 결합 어세이에 사용할 수 있다.
본 발명은 비제한적으로 F(ab')2 단편 및 Fab 단편과 같은 항체 단편을 제공한다. 특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인으로 이루어지며, 항체 분자를 펩신 소화하여 생성된다. Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브리지를 환원함으로써 생성된다. 본 발명은 또한 본 발명 항체의 중쇄 및 경쇄 다이머, 또는 Fvs 또는 단쇄 항체 (SCAs)와 같은 이들의 임의의 최소 단편(예, 미국 특허 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883; 및 Ward et al., 1989, Nature 334:544-54에 기술된 바와 같은), 또는 본 발명 항체와 동일한 특이성을 갖는 임의의 다른 분자를 제공한다. 단쇄 항체는 아미노산 브리지를 통해 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 결합하여 단쇄 폴리펩티드를 생성함으로써 형성된다. E. coli 내 기능적 Fv 단편의 어셈블리를 위한 기술이 사용될 수 있다(Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명 면역글로불린(또는 그 기능적으로 활성인 단편)의 융합 단백질을 제공하며, 예를 들면 여기에서 면역글로불린은 공유결합(예, 펩티드 결합)을 통해 면역글로불린이 아닌 다른 단백질(또는 그 부분, 바람직하게 단백질의 최소한 10, 20 또는 50 아미노산 부분)의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 융합한다. 바람직하게 면역글로불린, 또는 그 단편은 다른 단백질과 불변 도메인의 N-말단에서 공유 결합한다. 전술한 바와 같이 이러한 융합 단백질은 정제를 촉진하고, 인 비보 반감기를 증가시키며, 면역 시스템에 대한 상피 장애물을 넘어 항원을 송달하는 것을 증강시킨다.
본 발명의 면역글로불린은 즉 임의의 형태의 분자와의 공유적 결합이 면역 특이적 결합을 손상시키지 않는 한 이 결합에 의해 변형된 아날로그 및 유도체를 포함한다. 예를 들면, 면역글로불린의 유도체 및 아날로그는 비제한적으로 예컨대, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 알려진 보호/차단기로의 유도체화, 단백질성 분해, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에의 결합 등으로 추가 변형된 것들을 포함한다. 임의의 수많은 화학적 변형이 예컨대 비제한적으로 특정 화학적 분해, 아세틸화, 포름화 등을 포함하는 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다. 부가적으로, 아날로그 또는 유도체 하나 이상의 비-전형적 아미노산을 포함할 수 있다.
전술한 항체는 DLL3의 국재화 및 활성과 관련하여 당업계에 알려진 방법, 예컨대 이 단백질을 영상화하는 방법, 적합한 생리학적 시료, 진단적 방법내에서 이들의 수준을 측정하는 방법 등에 사용될 수 있다.
DLL3 에 대한 아피바디의 제조
아피바디 분자는 포도상구균 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나에서 유래된, 58-아미노산 잔기 단백질 도메인에 기초한 새로운 클래스의 친화성 단백질을 나타낸다. 이 세개의 헬릭스 번들 도메인은 조합 파지미드 라이브러리의 구축을 위한 스캐폴드로서 사용되어 왔으며, 이로부터 원하는 분자를 타겟하는 아피바디 변이체가 파지 디스플레이 기술을 사용하여 선택될 수 있다(Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human 면역globulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). 아피바디 분자의 간단하고 강한 구조 및 이들의 저분자량(6 kDa)은 이들이 광범위하게 적용되는데 예컨대 검출 시약으로서(Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211), 그리고 수용체 상호작용을 저해하는데 적합하게 한다(Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). 아피바디 및 그 제조 방법에 관해 더욱 자세한 것은 미국 특허 제5831012호를 참조하여 수득할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로 여기에 포함된다.
표지된 아피바디는 이소형의 양을 결정하기 위한 영상 적용에 유용할 수 있다.
DLL3 에 대한 도메인 항체의 제조
여기에서 항체를 지칭할 때에는 도메인 항체의 지칭도 포함한다. 도메인 항체(dAbs)는 항체의 가장 작은 기능적 결합 단위에며, 인간 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변영역에 상응한다. 도메인 항체는 약 13 kDa의 분자량을 갖는다. 도만티스는 전체 인간 VH 및 VL dAbs의 크고 고도로 기능화된 라이브러리 시리즈(각 라이브러리마다 100억개 이상의 상이한 서열)를 개발하고, 이 라이브러리를 치료적 타겟에 특이적인 dAbs를 선택하는데 사용하였다. 많은 통상적인 항체와 달리, 도메인 항체는 박테리아, 효모, 및 포유류 세포 시스템에 잘 발현된다. 도메인 항체 및 그 제조방법에 관해 더욱 자세한 것은 미국 특허 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; 미국 연속 번호 제2004/0110941호; 유럽 특허출원 제1433846호 및 유럽 특허 0368684 및 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609를 참조하여 수득할 수 있으며, 상기 각 문헌은 그 전체가 참조로 여기에 포함된다.
DLL3 에 대한 나노바디의 제조
나노바디는 자연 발생 중쇄 항체의 고유한 구조적 및 기능적 성질을 함유하는 항체-유래 치료적 단백질이다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인(VHH) 및 두개의 불변 도메인(CH2 and CH3)을 함유한다. 중요하게, 클로닝되고 분리된 VHH 도메인은 원래의 중쇄 항체의 전체 항원-결합능을 갖는 완전하게 안정한 폴리펩티드이다. 나노바디는 인간 항체의 VH 도메인과 높은 상동성을 가지며, 활성 손실없이 추가로 인간화될 수 있다. 중요하게, 나노바디는 낮은 면역원성 잠재성을 가지며, 이는 나노바디 선도 화합물의 영장류 연구에서 확인되었다.
나노바디는 통상적인 항체의 이점을 소 분자 약물의 중요한 특징과 결합한다. 통상적인 항체처럼, 나노바디는 높은 타겟 특이성, 타겟에 대한 높은 친화성과 낮은 내재 독성을 가진다. 그러나, 소 분자 약물처럼, 이들은 효소를 저해할 수 있으며, 용이하게 수용체 틈(clefts)에 접근할 수 있다. 게다가, 나노바디는 매우 안정하며, 주사이외의 수단으로 투여될 수 있으며(예컨대, 전체로 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 04/041867 참조), 제조가 쉽다. 나노바디의 다른 이점은 그 작은 크기로 인해 흔하지 않거나 숨겨진 에피토프를 인식할 수 있고, 그 고유한 3-차원적, 약물 형태의 유연성으로 인해 고 친화성 및 선택성으로 단백질 타겟의 강 또는 활성 부위내로 결합할 수 있으며, 반감기의 개조 및 약물 발견의 용이성 및 속도를 포함한다.
나노바디는 단일 유전자에 의해 암호화되며, 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예컨대 E. coli (예, 전체로 본 명세서에 참조로 포함되는 US 6,765,087 참조), 곰팡이(예를 들면 아스페르길러스 또는 트리코더마) 및 효모(예를 들면 사카로마이세 스( Saccharomyces ), 클루베로마이세스 ( Kluyveromyces ), 한세눌라( Hansenula ) 또는 피키아 ( Pichia ))(예, 전체로 본 명세서에 참조로 포함되는 US 6,838,254 참조)에서 효율적으로 제조된다. 제조 공정은 확장가능하며, 수 킬로그램 양의 나노바디가 제조된다. 나노바디는 통상적인 항체에 비해 우수한 안정성을 나타내므로 긴 저장 수명을 갖는 바로 사용하는(ready-to-use) 용액으로 제형화될 수 있다.
나노클론 방법(예, 전체로 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 06/079372 참조)은 B-세포의 자동화된 고효율 선택에 기초하여, 원하는 타겟에 대해 나노바디를 제조하는 특허방법이다.
DLL3 에 대한 유니바디의 제조
유니바디는 다른 항체 단편 기술이다; 그러나 이것은 IgG4 항체의 힌지 영역의 제거에 기초한다. 이러한 힌지 영역의 제거는 전통적인 gG4 항체의 거의 반의 크기를 가지며 IgG4 항체의 2가 결합 영역보다 일가 결합 영역을 갖는 분자를 생성한다. 또한 IgG4 항체가 불활성인 것은 잘 알려져 있고, 따라서 이는 면역 시스템과 반응하지 않아, 면역 반응이 바람직하지 않은 질병의 치료에 유용할 수 있으며, 이러한 이점은 유니바디에 전달된다. 예를 들면, 유니바디는 이들이 결합하는 세포를 저해하거나 침묵시킬 수 있으나 사멸하지는 않는다. 또한, 암세포에 결합하는 유니바디는 이들을 자극하여 증식시키지 않는다. 또한, 유니바디는 전통적인 IgG4 항체의 거의 반의 크기를 가지므로, 큰 고형암에 잠재적으로 유리한 효율로 더 양호하게 분포된다. 유니바디는 전체 IgG4 항체와 유사한 속도로 체부에서 소실되며 전체 항체와 유사한 항원 친화성으로 결합할 수 있다. 유니바디에 대한 보다 자세한 것은 전체로 본 명세서에 참조로 포함되는 특허 WO2007/059782를 참조하여 얻을 수 있다.
DLL3 에 대한 달핀 제조
달핀(디자인된 안키린 반복 단백질)은 비-항체 폴리펩티드의 결합능을 추구하기 위해 개발된 항체 미메틱 DRP(디자인된 반복 단백질) 기술의 일례이다. 안키린 또는 루이신-풍부 반복 단백질과 같은 반복 단백질은 항체와 달리 세포내 및 세포외에 발견되는 흔한 결합 분자이다. 이들 고유의 모듈성 아키텍쳐는 반복적인 구조적 단위(반복)를 특징으로 하며, 이 단위들은 함께 쌓여 가변적 및 모듈적인 타겟-결합 표면을 나타내는 신장된 반복 도메인을 형성한다. 이러한 모듈성에 기초하여, 고도로 다각화된 결합 특이성을 갖는 폴리펩티드 조합 라이브러리가 생성될 수 있다. 이 전략은 가변적인 표면 잔기를 나타내는 자가-호환적인 반복의 공통 디자인(consensus design) 및 이들의 반복 도메인으로의 랜덤 어셈블리를 포함한다.
달핀은 매우 높은 수율로 박테리아 발현 시스템에서 제조될 수 있으며, 알려진 가장 안정한 단백질에 속한다. 인간 수용체, 사이토킨, 키나제, 인간 프로테아제, 바이러스 및 막 단백질을 포함하는 광범위한 타겟 단백질에 고 특이성, 고-친화성 달핀이 선택되어 왔다. 한자리 숫자의 나노몰 내지 피코몰 범위의 친화성을 갖는 달핀이 수득될 수 있다.
달핀은 ELISA, 샌드위치 ELISA, 유동 세포측정 분석 (FACS), 면역조직화학(IHC), 칩 적용, 친화성 정제 또는 웨스턴 블롯팅을 포함하는 광범위한 적용에 사용되어 왔다. 달핀은 또한 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP)에 융합된 세포내 마커 단백질로서 세포내 구획내에서 매우 활성인 것으로 입증되었다. 달핀은 추가로 pM 범위의 IC50로 바이러스의 진입을 저해하는데 사용되었다. 달핀은 단백질-단백질 상호작용을 차단하는데, 또한 효소를 저해하는데 이상적이다. 프로테아제, 키나제 및 수송체(transporter)들이 종종 알로스테릭 저해 모드로 성공적으로 저해되었다. 달핀은 매우 신속하고 특이적으로 암에서 강화(enrichment)되고, 매우 유리한 혈액에 대한 암 비율을 가지므로, 인 비보 진단적 또는 치료적 접근법에 매우 적합하다.
달핀 및 다른 DRP 기술에 대한 부가적인 정보는 미국 출원 공개 제2004/0132028호 및 국제 특허출원공개 WO02/20565에서 찾을 수 있으며, 이들 둘다 전체로 여기에 참조로 포함된다.
DLL3 에 대한 안티칼린의 제조
안티칼린은 부가적인 항체 미메틱 기술이나, 이 경우 결합 특이성은 인간 조직 및 체액에 자연적으로 그리고 풍부하게 발현되는 저분자 단백질의 한 패밀리인 리포칼린에서 유래된다. 리포칼린은 화학적으로 민감하거나 불용성 화합물의 생리적 전달 및 저장에 관련된 다양한 인 비보 기능을 수행하도록 발달하여 왔다. 리포칼린은 단백질의 일 종점에서 4개의 루프를 지지하는 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는 튼튼한 내재성 구조를 갖는다. 이들 루프는 결합 포켓에 대한 입구를 형성하며, 이 분자 부분에서의 구조적 차이가 각 리포칼린간의 결합 특이성 차이를 설명한다.
보존된 β-시트 프레임워크에 의해 지지되는 초가변적 루프의 전체 구조가 면역글로불린을 연상시키나, 리포칼린은 그 크기의 측면에서 항체와 상당히 다르며, 단일 면역글로불린 도메인보다 조금 큰 160-180개의 아미노산으로 된 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된다.
리포칼린이 클론되고 그 루프를 조작하여 안티칼린을 생성한다. 구조적으로 다양한 안티칼린 라이브러리가 생성되었으며,안티칼린 디스플레이는 결합 기능의 선택 및 스크리닝을 허용하고, 원핵 또는 진핵 시스템에서의 추가 분석을 위해 가용성 단백질의 발현 및 제조가 뒤따른다. 연구 결과, 사실상 거의 모든 임의의 인간 타겟 단백질에 특이적인 안티칼린이 개발될 수 있고; 분리될 수 있으며, 나노몰 또는 그 이상의 범위의 결합 친화성이 얻어질 수 있음이 성공적으로 입증되었다.
안티칼린은 또한 이중 타겟팅 단백질, 소위 듀오칼린으로서 포맷될 수 있다. 듀오칼린은 표준 제조 공정을 사용하여 용이하게 제조된 하나의 모노머 단백질의 형태로 두 개의 분리된 치료적 타겟에, 이 두 결합 도메인의 구조적 배향에 관계없이 타겟 특이성 및 친화성을 보유하면서, 결합할 수 있다.
단일 분자를 통한 다중 타겟의 조절은 하나 이상의 원인 인자가 관여되는 것으로 알려진 질병에 특히 유용하다. 또한, 듀오칼린과 같은 이가- 또는 다가 결합 포맷은 질병에서 세포 표면 분자 타겟팅, 신호 전달 경로에 대한 작용효과의 매개, 또는 결합 및 세포 표면 수용체의 군집화를 통한 증강된 내재화 효과의 유도에 중요한 잠재력을 가진다. 나아가, 듀오칼린의 높은 내재적 안정성은 모노머 안티칼린에 필적하며, 듀오칼린에 대한 유연한 제형화 및 전달 잠재성을 제공한다.
안티칼린에 대한 추가 정보는 미국 특허 제7,250,297호 및 국제 특허출원 공개 WO 99/16873에서 찾을 수 있으며, 이들 두 문헌은 전체로 여기에 참조로 포함된다.
DLL3 에 대한 아비머의 제조
아비머는 인간 세포외 수용체 도메인의 큰 패밀리로부터 인 비트로 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 결합 및 저해 특성을 갖는 다중 도메인 단백질을 생성하여 발전된 것이다. 다중독립결합도메인의 결합은 친화력을 생성하고, 통상적인 단일-에피토프 결합 단백질에 비해 개선된 친화성 및 특이성을 결과하는 것으로 나타났다. 다른 잠재적 이점은 다중 타겟-특이성 분자를 에스케리치아 콜라이에서 간단하고 효율적으로 제조할 수 있는 점, 개선된 열안정성 및 프로테아제에 대한 저항성을 포함한다. 나노몰 이하의 친화성을 갖는 아비머가 다양한 타겟에 대해 수득되었다.
아비머에 관한 추가 정보는 미국 특허출원공개 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756에서 얻을 수 있으며, 이들 모두는 전체로 여기에 참조로서 포함된다.
DLL3 에 대한 버사바디의 제조
버사바디는 전형적인 단백질이 갖는 소수성 코어를 15%를 초과하는 고밀도 디설파이드 스캐폴드를 형성하는 시스테인으로 대체한 3-5 kDa의 소단백질이다. 소수성 코어를 포함하는 다수의 소수성 아미노산이 소수의 디설파이드로 대체됨으로써 더 작고 더 친수성이며(응집 및 비-특이적 결합이 적어짐), 프로테아제 및 열에 더욱 저항성이고, 저밀도의 T-세포 에피토프를 갖는 단백질이 생성되며, 이는 MHC 제시에 가장 기여하는 잔기들이 소수성이기 때문이다. 이들 4개의 모든 성질은 면역원성에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있으며, 면역원성의 대폭적인 감소를 유발하는 것으로 예상된다.
버사바디에 대한 영감은 비예측적인 낮은 면역원성을 나타내는 것으로 알려진 거머리, 뱀, 거미, 전갈, 달팽이 및 아네모네(anemones)에서 제조된 천연 주사가능한 생물약제에서 비롯되었다. 선택된 천연 단백질 패밀리에서 출발하여, 디자인 및 스크리닝에 의해 크기, 소수성, 단백분해 항원 프로세싱, 및 에피토프 밀도를 천연 주사가능한 단백질에 대한 평균보다 훨씬 아래 수준으로 최소화시켰다.
버사바디의 구조를 고려해볼때, 이 항체 미메틱은 다가(multi-valency), 다중-특이성, 다양한 반감기 기전, 조직 타겟팅 모듈 및 항체 Fc 영역의 결여를 포함하는 다양한 포맷을 제공한다. 더구나 버사바디는 E. coli에서 고수율로 제조되며, 그 친수성 및 작은 크기로 인해 매우 가용성이며 고농도로 제형화될 수 있다. 버사바디는 매우 열에 안정적이며(끓일 수 있다), 연장된 저장 수명을 제공한다.
버사바디에 관한 추가 정보는 미국 특허 출원공개 제2007/0191272호에 개시되어 있으며, 이는 전체로 본 출원에 참조로 포함된다.
친화성 시약의 발현
항체 발현
본 발명의 항체는 항체 합성에 대해 당업계에 알려져 있는 임의의 방법 특히 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의해 제조될 수 있으며, 바람직하게 재조합 발현 기술에 의해 제조된다.
항체, 그 단편, 유도체 또는 아날로그의 재조합 발현을 위해서는 항체를 암호화하는 핵산의 구축이 필요하다. 항체의 뉴클레오타이드 서열이 알려져 있는 경우, 항체를 암호화하는 핵산은 화학합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있으며(예, Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242에 기재된 바와 같이), 간략히 항체를 암호화하는 서열 부분을 포함하는 오버래핑 올리고뉴클레오타이드의 합성, 이들 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 및 접합, 그후 PCR에 의한 접합된 올리고뉴클레오타이드의 증폭을 포함한다.
또는, 항체를 암호화하는 핵산은 항체를 클로닝하여 수득될 수 있다. 특정 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 클론은 수득 가능하지 않으나, 항체분자의 서열은 알려진 경우, 항체를 암호화하는 핵산은 적당한 공급원으로부터(예, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포에서 생성된 cDNA 라이브러리), 서열의 3'- 및 5'-말단에 혼성화할 수 있는 합성 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 클로닝에 의해 수득할 수 있다.
특정 항원을 특이적으로 인식하는 항체 분자(또는 그러한 항체를 암호화하는 핵산을 클로닝하기 위한 cDNA 라이브러리 공급원)가 입수가능하지 않은 경우, 특정 항원에 특이적인 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 예를 들면, 토끼와 같은 동물을 면역시켜 다클론 항체를 생성하거나 또는 예를 들면 단클론 항체를 생성할 수 있다. 또는 항체의 최소한 Fab 부분을 암호화하는 클론은 특정 항원에 결합하는 Fab 단편의 클론을 위한 Fab 발현 라이브러리(예, Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281에 기술된 바와 같은)을 스크리닝하거나 또는 항체 라이브러리(예, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:4937 참조)를 스크리닝하여 수득할 수 있다.
일단 최소한 항체 분자의 가변 도메인을 암호화하는 핵산이 수득되면, 이는 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 벡터내로 도입될 수 있다(예, PCT 공개 WO 86/05807; PCT 공개 WO 89/01036; 및 미국 특허 제 5,122,464호 참조). 전체 항체 분자의 발현을 허용하는 핵산과의 공-발현을 위한 전체 경쇄 또는 중쇄를 함유하는 벡터도 입수가능하다. 이후, 항체를 암호화하는 핵산을 사용하여 사슬내 디설파이드 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역 시스테인 잔기를 설피딜기를 함유하지 않는 아미노산 잔기로 치환(또는 제거)하는데 필요한 뉴클레오타이드 치환 또는 결실을 도입할 수 있다. 이러한 변형은 뉴클레오타이드 서열 내에 특정 돌연변이 또는 결실을 도입하기 위해 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 비제한적으로 화학적 돌연변이, 인 비트로 위치지정-돌연변이 (Hutchinson et al., 1978, J. Biol . Chem. 253:6551), PCT 기반 방법 등에 의해 수행될 수 있다.
또한, 적합한 항원 특이성의 마우스 항체 분자에서 온 유전자와 적합한 생물학적 활성의 인간 항체 분자에서 온 유전자를 함께 접합하여 "키메라 항체"를 제조하기 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)이 사용될 수 있다. 전술된 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래하는 분자로서, 예컨대 쥐 mAb 유래의 가변 영역 및 인간 항체 불변 영역을 갖는, 예컨대 인간화 항체이다.
일단 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 핵산이 수득되면, 항체 분자 제조를 위한 벡터를 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술로 제조할 수 있다. 따라서, 항체 분자 서열을 함유하는 핵산을 발현하여 DLL3을 제조하는 방법이 여기에 기술된다. 당업자에 잘 알려진 방법을 사용하여 항체 분자 코딩 서열 및 적합한 전사 및 번역 조절 시그널을 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 인 비트로 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 인 비보 유전자 재조합을 포함한다. 예를 들면, Sambrook et al.(1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 및 Ausubel et al.(eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)에 개시된 기술 참조.
발현 벡터는 통상적인 기술로 숙주 세포에 이동되며, 이후 형질감염된 세포는 통상적인 기술로 배양되어 본 발명의 항체가 제조된다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하는데 사용된 숙주 세포는 에스케리치아 콜라이와 같은 박테리아 세포 또는 바람직하게는 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해 진핵 세포일 수 있다. 특히, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)와 같은 포유류 세포는 인간 시토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 연합하여 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2).
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 발명의 항체 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 제조, 후속하여 정제되는 비히클을 나타낼 뿐 아니라, 적합한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때 본 발명의 항체 분자를 인 시투 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 비제한적으로 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라즈미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예, E. coli, B. subtilis)와 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예, 사카로마이세스, 피키아); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 재조합 플라즈미드 발현 벡터(예, Ti 플라즈미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈(예, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스(예, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)에서 유래되는 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구축체를 포함하는 포유류 세포 시스템(예, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)를 포함한다.
박테리아 시스템에서, 많은 발현 벡터는 발현될 항체 분자에 의도된 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 생성을 위해 다량의 단백질이 제조되어야 하는 경우, 용이하게 정제되는 고수준의 융합 단백질 산물의 발현을 이끄는 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터는 비제한적으로, 융합 단백질이 제조되도록 항체 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역과 프레임내 개별적으로 벡터내 접합될 수 있는 E. coli 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791); pIN 벡터(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem . 24:5503-5509); 등을 포함한다. pGEX 벡터도 외래 폴리펩티드를 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)과 함께 융합 단백질로서 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타치온-아가로즈 비드에 흡착 및 결합시킨 후 자유 글루타치온의 존재하에서 용출시킴으로써 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 디자인되어 클론된 타겟 유전자 산물이 GST 부분으로부터 방출될 수 있도록 한다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포니카 뉴클레러 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV))가 외래 유전자를 발현하는 벡터로서 사용된다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기퍼다( Spodoptera frugiperda ) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비-필수적 영역(예를 들면 폴리헤드린 유전자)내로 개별적으로 클로닝되어, AcNPV 프로모터(예를 들면 폴리헤드린 프로모터)의 조절하에 위치될 수 있다. 포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템 (예, 아데노바이러스 발현 시스템)이 사용될 수 있다.
위에 논의된 바와 같이, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 유전자 산물을 원하는 특정 방식으로 변형하고 가공하는 숙주 세포 계통이 선택될 수 있다. 이러한 단백질 산물의 변형(예, 글리코실화) 및 가공(예, 분해)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다.
재조합 항체의 장기적이며 고수율 제조를 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 관심 항체를 안정적으로 발현하는 세포주는 항체 뉴클레오타이드 서열 및 선택가능한 뉴클레오타이드 서열(예, 네오마이신 또는 히그로마이신)을 포함하는 발현 벡터로 세포를 형질 감염시키고 선택 마커의 발현을 선택함으로써 제조될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 상승될 수 있다(개괄을 위해, Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987) 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 저해제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 연관되어 있으므로, 항체 생산 또한 증가될 것이다(Crouse et al., 1983, Mol . Cell. Biol. 3:257).
숙주 세포는 본 발명의 두 발현 벡터, 중쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터로 공-형질감염될 수 있다. 이 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 동등하게 발현시킬 수 있는 동일한 선택 마커를 포함할 수 있다. 또는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두를 암호화하는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 과량의 유독한 자유 중쇄를 회피하기 위해 경쇄가 중쇄 앞에 위치된다(Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:2197). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 이는 항체 분자의 정제에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 크로마토그라피(예, 이온 교환 크로마토그라피, 단백질 A 또는 특정 항원을 사용한 친화성 크로마토그라피, 및 크기 칼럼 크로마토그라피), 원심분리, 차등 용해성에 의해 또는 단백질 정제에 대한 임의의 다른 표준 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
또는 임의의 융합 단백질은 발현될 융합 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 용이하게 정제될 수 있다. 예를 들면, Janknecht et al.에 기술된 시스템을 사용하여 인간 세포주에서 발현된 비-변성 융합 단백질을 용이하게 정제할 수 있다(Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). 이 시스템에서, 관심 유전자는 유전자의 개방형 해독틀이 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 아미노-말단 태그에 번역적으로 융합되도록 백시니아 재조합 플라즈미드내로 서브클론된다. 태그는 융합 단백질에 대한 매트릭스 결합 도메인으로서 기능한다. 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포 추출물은 Ni2 + 니트릴로아세트산-아가로즈 칼럼에 로딩되고, 히스티딘-태그된 단백질이 이미다졸-함유 버퍼로 선택적으로 용출된다.
이 방법으로 생성된 항체는 이후 정제된 관심 폴리펩티드에 친화성 및 특이성에 대한 1차 스크리닝에 의해, 그리고 필요한 경우, 그 결과를 결합에서 배제되는 것이 요망되는 폴리펩타드와의 항체 친화성 및 특이성에 비교하여 선택될 수 있다. 스크리닝 과정은 마이크로타이터 플레이트의 격벽에 정제된 폴리펩타이드를 고정화하는 것을 포함할 수 있다. 잠재적 항체 또는 항체 그룹을 포함하는 용액은 이후 각각의 마이크로타이터 플레이트내로 위치시키고 약 30분 내지 2시간 동안 인큐베이션한다. 이후 마이크로타이터 플레이트를 세척하고, 표지된 제2 항체(예를 들면, 올려진 항체가 마우스 항체이면 알카리성 포스파타제에 콘쥬게이트된 항-마우스 항체)를 웰에 추가하고 약 30분간 인큐베이션한 후 세척한다. 기질을 웰에 가하면, 고정된 폴리펩티드에 대한 항체가 존재하는 경우 변색 반응이 나타난다.
이렇게 확인된 항체는 이후 선택된 어세이 디자인에서 그 친화성 및 특이성에 대해 분석될 수 있다. 타겟 단백질에 대한 면역 어세이 개발에서 정제된 타겟 단백질은 선택된 항체를 사용한 면역 어세이의 친화성 및 특이성을 판단하는 표준으로서 작용한다. 다양한 항체의 결합 친화성이 다를 수 있고; 특정 항체 쌍(예, 샌드위치 어세이에서)은 서로 공간적 등으로 저해할 수 있으므로, 항체의 어세이 성능은 항체의 절대적인 친화성 및 특이성보다 중요한 기준이 될 수 있다.
당업자는 항체 또는 결합 단편을 제조하는데, 그리고 다양한 폴리펩티드에 대한 친화성 및 특이성을 스크리닝하고 선택하는데 많은 접근이 사용될 수 있으며, 이러한 접근들은 본 발명의 범위를 변경하지 않음을 인식할 것이다.
치료적 응용을 위해, 항체(특히 단클론 항체)는 인간 또는 인간화 동물(예, 마우스) 항체가 적합할 수 있다. 동물 항체는 인간 단백질(예, DLL3)을 면역원으로 사용하는 동물에서 생성될 수 있다. 인간화는 일반적으로 확인된 CDR을 인간 프레임워크 영역내로 이식하는 것을 포함한다. 일반적으로 사슬의 구조를 적정화하기 위한 약간의 후속 레트로뮤테이션(retromutation)이 요구된다. 이러한 가공은 당업자에게 잘 알려져 있다.
아피바디의 발현
아피바디의 구축(Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen, M., Nygren P.A, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur . J. Biochem. 269, 2647-2655.) 및 아피바디 파지 디스플레이 라이브러리의 구축(Nord, K., Nilsson, J., Nilsson, B., Uhlen, M. & Nygren, P.A, A combinatorial library of an a-helical bacterial receptor domain, 1995, Protein Eng. 8, 601-608. Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhlen, M. & Nygren, P.A, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, 1997, Nat. Biotechnol.15, 772-777.)은 다른 곳에 개시된 바 있다.
바이오센서 결합 연구를 사용한 적정 아피바디 변이체를 연구하는 바이오센서 분석도 다른 곳에 개시된 바 있다(Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen, M., Nygren P.A, Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur . J. Biochem. 269, 2647-2655.).
친화성 시약 변형
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 그 단편과 같은 항-DLL3 친화성 시약은 진단 모이어티 (예, 검출가능한 표지) 또는 치료 모이어티에 콘쥬게이트된다. 항체는 진단을 위해 또는 주어진 치료 요법의 효과를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출가능한 물질(표지)에 항체를 연결시킴으로써 촉진된다. 검출가능한 물질의 예로서 다양한 효소, 치환기(prosthetic groups), 형광물질, 발광물질, 생발광물질, 방사성 핵종, 포지트론 방출물질(포지트론 방출 토모그라피에서 사용되기 위해) 및 비방사성 상자성 금속이온을 포함한다. 일반적으로 본 발명에 따른 진단제로서 사용되기 위한 항체에 콘쥬게이트될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제 4,741,900호 참조. 적합한 효소는 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알카리성 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 치환기로는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴을 포함하며; 적합한 형광물질은 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소치오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린(phycoerythrin)을 포함하며; 적합한 발광물질은 루미놀을 포함하고; 적합한 생발광물질은 루시페라제, 루시페린, 및 애쿠오린(aequorin)을 포함하고; 및 적합한 방사성 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc을 포함한다. 68Ga도 사용될 수 있다.
위에 기재한 바와 같이, 본 발명에서 사용되기 위한 항체와 같은 친화성 시약은 세포독소(cytotoxin), 약물(예, 면역 억제제) 또는 방사성독소와 같은 치료적 모이어티와 콘쥬게이트될 수 있다. 이러한 콘쥬게이트는 여기에서 "면역 콘쥬게이트"로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역콘쥬게이트는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한(예, 살해) 임의의 물질을 포함한다. 예로서, 탁솔, 시토칼라신 B(cytochalasin B), 그람시딘 D, 에티듐 브로마이드, 이메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신(colchicin), 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신디온, 미토산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신 및 이들의 아날로그 및 호몰로그를 포함한다. 치료제는 또한, 예를 들면, 항대사제(예, 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예, 메클로에타민, 티오에파클로람부실, 멜팔란(melphalan), 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파마이드(cyclothosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예, 다우노루비신(이전 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예, 닥티노마이신(이전 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신(mithramycin), 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열제(예, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.
본 발명의 항체에 콘쥬게이트될 수 있는 치료적 세포독소의 다른 바람직한 예는 두오카마이신(duocarmycins), 칼리케마이신(calicheamicins), 마이탄신( maytansines) 및 오리스타친(auristatins) 및 이들의 유도체를 포함한다. 칼리케미신 항체 콘쥬게이트의 일예는 상업적으로 입수할 수 있다(Mylotarg®; American Home Products).
세포독소는 당업계에서 사용가능한 링커 기술을 사용하여 본 발명의 항체에 콘쥬게이트될 수 있다. 세포독소를 항체에 콘쥬게이트하는데 사용되어온 링커 타입의 예는, 비제한적으로 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 디설파이드 및 펩티드-함유 링커를 포함한다. 링커는 예를 들면, 리소좀 구획내 낮은 pH로 분해되기 쉽거나 프로테아제, 예컨대 카텝신(예, 카텝신 B, C, D)과 같이 암 조직에 우선적으로 발현되는 프로테아제에 의해 분해되기 쉬운 것이 선택될 수 있다.
세포독소의 예는 예를 들면, 미국 특허 6,989,452, 7,087,600, 및 7,129,261, 및 PCT 출원 PCT/US2002/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US2006/37793, PCT/US2006/060050, PCT/US2006/060711, WO2006/110476, 및 미국 특허출원 60/891,028에 기술되어 있으며, 이들 모두는 전체로 본 명세서에 참조로 포함된다. 세포독소의 타입, 링커 및 항체에 치료제를 콘쥬게이트하는 방법 등에 대한 자세한 논의는, Saito, G. et al. (2003) Adv . Drug Deliv . Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol . Immunother . 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr . Opin. Investig . Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv . Drug Deliv . Rev. 53:247-264 참조.
친화성 시약은 방사성 동위원소에 콘쥬게이트되어 세포독성 방사성 약제를 생성할 수 있으며, 이는 방사성면역콘쥬게이트로 지칭된다. 진단적 또는 치료적으로 사용되기 위해 항체에 콘쥬게이트될 수 있는 방사성 동위원소의 예는, 비제한적으로 요오드131, 인듐111, 이트륨90 및 류테튬177을 포함한다. 방사성면역콘쥬게이트를 제조하는 방법은 당업계에 잘 수립되어 있다. 방사성면역콘쥬게이트의 예는 상업적으로 입수가능하며, Zevalin®(IDEC Pharmaceuticals) 및 Bexxar®(Corixa Pharmaceuticals)를 포함하고, 유사한 방법이 사용되어 본 발명 항체를 사용하는 방사성면역콘쥬게이트를 제조할 수 있다.
친화성 시약은 프탈로시아닌 염료에 콘쥬게이트될 수 있으며, 이는 프탈로시아닌콘쥬게이트로 지칭된다. 진단적 또는 치료적으로 사용되기 위해 항체에 콘쥬게이트될 수 있는 프탈로시아닌 염료의 예는, 비제한적으로 IR700를 포함한다. 프탈로시아닌콘쥬게이트를 제조하는 방법은 예를 들면, Mitsunaga M, Ogawa M, Kosaka N, Rosenblum LT, Choyke PL and Kobayashi H (2011) Nat Med. 2011 Nov 6. doi: 10.1038/nm.2554에 기술되어 있다.
콘쥬게이트들은 주어진 생물학적 반응을 변형하기 위해 사용될 수 있으며, 약물 모이어티는 전통적인 화학적 치료제에 제한되지 않는다. 예를 들면, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들면, 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 활성 단편, 예컨대 아브린(abrin), 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ와 같은 단백질; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들면 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 대식세포콜로니자극인자("GM-CSF"), 과립구콜로니자극인자("G-CSF"), 또는 다른 성장인자들을 포함한다. Senter P.D. (2009) Curr . Opin . Chem . Biol. 13(3):235-244; Kovtun et al. (2010) Cancer Res. 70(6):2528-2537.
이러한 치료적 모이어티를 항체에 콘쥬게이트하는 기술은 잘 알려져 있으며, 예컨대, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al.(eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson et al.(eds.), pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.(eds.), pp. 475-506(1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy" in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al.(eds.), pp. 303-16(Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58(1982) 참조.
또는 항체는 제2 항체에 콘쥬게이트되어 항체 헤테로콘쥬게이트를 형성할 수 있으며, 이는 Segal의 미국 특허 제 4,676,980호에 기재되어 있다.
치료적 모이어티가 콘쥬게이트되거나 되지 않은 항체는 단독으로 또는 세포독성 인자 및/또는 사이토킨과 배합되어 투여되는 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 항체-관련 세포-매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 완전 인간, 또는 인간화 항체에 대해 제공한다. 완전 인간 항체는 단백질 서열이 분리된 항체-생성 인간 B-림프구, 또는 뮤린 면역글로불린 코딩 염색체의 영역이 자가 이식 인간 서열로 대체된 마우스의 트랜스제닉 뮤린 B-림프구로부터 온 자연 발생 인간 면역글로불린 서열에 의해 암호화된 것이다. 나중 형태의 트랜스제닉 항체는 비제한적으로, HuMab(Medarex, Inc, CA) 및 XenoMouse(Abgenix Inc., CA)를 포함한다. 인간화 항체는 적합한 항원 특이성의 비-인간 항체 분자의 불변 영역이 적합한 이펙터 기능을 가진 인간 항체의 불변 영역, 바람직하게 IgG 서브타입의 불변 영역으로 대체된 항체이다(Morrison et al., 1984, Proc . Natl. Acad . Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454). 적합한 이펙터 기능은 자연적인 과정인 ADCC를 포함하며, 이에 의해 완전-인간 항체 또는 인간화 항체는 암 세포의 표면상의 타겟과 결합시 정상적인 면역 시스템의 일부인 림프구의 세포 살해 성질을 작동시킨다. 자연 살해(NK) 세포로 불리는 이러한 활성 림프구는 항체가 결합된 살아있는 세포를 파괴하는 세포독성 과정을 이용한다. ADCC 활성은 항원-특이적 항체 및 면역성을 가진 살아있는 인간 개체에서 추출된 말초 혈액 단핵세포의 존재하에 Eu3 + 표지된 살아있는 세포에서 유로퓸(Eu3 +)의 방출을 측정함으로써 검출 및 정량할 수 있다. ADCC 과정은 Janeway Jr. C.A. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:p2153-68 및 Weng, W.-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21:p 3940-3947에 자세히 기술되어 있다. ADCC를 검출하고 정량화하는 적절한 방법은 Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 86:p225-9; Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 21;92:p117-23 및 Patel & Boyd, Journal of Immunological Methods. 1995, 184:p29-38에 기재되어 있다.
ADCC는 통상 NK 세포 활성화가 관여하며, NK 세포 표면상의 Fc 수용체에 의해 항체-코팅된 세포의 인식에 의존한다. Fc 수용체는 타겟 세포 표면에 특이적으로 결합된 IgG와 같은 항체의 Fc(결정성) 부분을 인식한다. NK 세포의 활성화를 유발하는 Fc 수용체는 CD16 또는 FcγIIIa이다. FcγIIIa 수용체가 IgG Fc에 결합하면, NK 세포는 IFN-γ와 같은 사이토킨 및 타겟 세포에 들어가서 아폽토시스를 유발하여 세포 치사를 촉진하는 퍼포린 및 그랜자임을 함유하는 세포독성 과립을 방출한다.
항체에 의한 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)의 유도는 항체 불변 영역(Fc)과 면역 시스템 세포의 표면에 존재하는 다양한 수용체간의 상호작용을 변경하는 변형에 의해 증강될 수 있다. 이러한 변형은 포유류 세포 내 자연적 또는 재조합 합성 동안 항체의 Fc에 통상 추가되는 복합체 올리고사카라이드 사슬내 알파 1,6-결합 푸코스 모이어티의 감소 또는 결여를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 비-푸코실화 항-DLL3 친화성 시약, 예컨대 항체 또는 그 단편이 ADCC 반응의 유발능을 증강시키려는 목적으로 제조된다.
Fc의 올리고사카라이드 사슬내 알파 1,6-결합 푸코스 모이어티를 감소 또는 제거하는 기술은 잘 수립되어 있다. 일 실시예에서, 재조합 항체는 N-결합 바이안터너리(biantennary) 복합체-타입 Fc 올리고사카라이드의 맨 안쪽 N-아세틸글루코사민의 알파 1,6 결합에 푸코스를 추가하는 능력이 손상된 세포주에서 합성된다. 이러한 세포주는, 비제한적으로 알파 1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8을 감소된 수준으로 발현하는 랫트 히브리도마 YB2/0를 포함한다. 바람직하게, 항체는 FUT8 유전자의 양 카피의 결실로 인하여 복합체 올리고사카라이드 사슬에 알파 1,6-결합 푸코실 모이어티를 추가시키지 못하는 세포주에서 합성된다. 이러한 세포주는, 비제한적으로 FUT8-/- CHO/DG44 세포주를 포함한다. 부분적으로 푸코실화되거나 또는 비-푸코실화 항체 및 친화성 시약을 합성하는 기술은 Shinkawa et al., J. Biol . Chem. 278:3466-34735 (2003); Yamane-Ohnuki et al., Biotechnology and Bioengineering 87: 614-22 (2004) 및 WO00/61739 A1, WO02/31140 A1 및 WO03/085107 A1에 기재되어 있다. 두번째 예에서, 재조합 항체의 푸코실화는 바이섹팅 N-아세틸글루코사민을 포함하는 복합체 N-결합 올리고사카라이드의 제조를 최대화하는 수준으로 글리코단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제을 과발현하도록 유전자적으로 조작된 세포주에서 합성됨으로써 감소 또는 제거되었다. 예를 들면, 항체는 효소 N-아세틸 글루코사민 트랜스퍼라제 III(GnT III)를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 세포주에서 합성된다. 적합한 글리코단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제로 안정하게 형질감염된 세포주 및 이들 세포를 사용하여 항체를 합성하는 방법은 WO99/54342에 기재되어 있다.
비-푸코실화 항체 또는 친화성 시약은 단독 또는 세포독성 인자 및/또는 사이토킨과 배합하여 투여되는 치료제로서 사용될 수 있다.
추가적 변형에서, 항체 Fc의 아미노산 서열은 리간드 친화성에는 영향을 미치지 않으면서 ADCC 활성화를 증강시키는 방식으로 변경된다. 이러한 변형의 예는 Lazar et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 2006, 103: p4005-4010; WO03/074679 및 WO2007/039818에 기재되어 있다. 이들 예에서, 항체 Fc의 아미노산의 치환, 예컨대 239 위치에서 세린에 대한 아스파르테이트 및 332 위치에서 글루타메이트에 대한 이소루이신의 치환은 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화성을 변경시켜 ADCC 활성화를 증강시킨다.
아미노산 치환으로 인한 증강된 ADCC 활성화를 갖는 항체 시약은 단독 또는 세포독성 인자 및/또는 사이토킨과 배합하여 투여되는 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 제1 타겟 에피토프(즉, DLL3)에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 타겟 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중 특이성 분자를 제공한다. 제2 타겟 에피토프는 제1 결합 특이성에 의해 결합된 것과 동일한 타겟 단백질 상에 존재할 수 있고; 또는 제2 타겟 에피토프는 제1 결합 특이성에 의해 결합된 것에 제1 단백질에 의해 결합된 것과 상이한 타겟 단백질 상에 존재할 수도 있다. 제2 타겟 에피토프는 제1 타겟 에피토프(즉 DLL3)과 동일한 세포상에 존재할 수 있고; 또는 제2 타겟 에피토프는 제1 타겟 에피토프를 전시하는 세포에 의해 전시되지 않은 타겟상에 존재할 수도 있다. 여기에서, 용어 "결합 특이성"은 최소한 하나의 항체 가변 도메인을 포함하는 모이어티를 지칭한다.
일 실시형태에서, 이중 특이성 분자는 BiTE(이중 특이성 T-세포 인게이져)이다. 특히, 본 발명은 DLL3에 대한 제1 결합 도메인 및 T-세포 항원, 바람직하게 CD3에 대한 제2 결합 도메인을 포함하는 이중 특이성 친화성 시약(바람직하게 이중 특이성 항체)를 제공한다.
이들 이중 특이성 분자는 DLL3 발현 세포를 CD3 발현 이펙터 세포(예, CD3 발현 세포독성 T 세포)로 타겟하며, CD3-매개 이펙터 세포 활성, 예컨대 T 세포 클론 확장 및 T 세포 세포독성을 유발한다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 총 두개 또는 세개의 항체 가변 도메인을 가지며, 여기에서 이중 특이성 항체의 제1 부분은 인간 면역 이펙터 세포에 위치된 이펙터 항원에 특이적으로 결합하여 인간 면역 이펙터 세포의 활성을 모집할 수 있고, 여기에서 이펙터 항원은 인간 CD3 항원이며, 상기 제1 부분은 하나의 항체 가변 도메인으로 이루어지며, 이중 특이성 항체의 제2 부분은 이펙터 항원이외의 타겟 항원 예, DLL3와 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 타겟 항원은 상기 인간 면역 이펙터 세포이외의 타겟 세포에 위치하며, 상기 제2 부분은 하나 또는 두개의 항체 가변 도메인을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명은 폐암, 바람직하게 소세포 폐암의 치료를 위하여 DLL3 및 CD3에 결합하는 이중 특이성 항체 (바람직하게 BiTE)를 제공한다.
본 발명 질병을 포함하는 암 진단
본 발명의 다른 측면에 따라, 본 발명은 개체에서 암, 예를 들어 본 발명의 질병의 검출, 진단 및/또는 스크리닝 또는 진전의 모니터링, 또는 본 발명의 질병에 대한 예컨대, 항암제 또는 항암 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공하며, 이는 상기 개체에서 DLL3, 또는 그 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재 또는 수준을 검출하는 것을 포함하거나 또는 이들의 수준의 변화를 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 본 발명은 개체에서 암, 예를 들어 본 발명의 질병을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하는 방법을 제공하며, 이는 상기 개체에서 DLL3 또는 그 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하며, 여기에서 (a) 건강한 개체에서의 수준에 비교하여 상승된 수준의 개체내 DLL3 또는 그 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재, 또는 (b) 건강한 개체내 상응하는 검출불가능한 수준에 비교하여 검출가능한 수준의 개체내 DLL3 또는 그 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재는 상기 개체에서 상기 암이 존재함을 나타낸다.
암, 예를 들어 본 발명의 질병을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하는 일 방법은,
시험될 생물학적 시료를 DLL3, 또는 그의 하나 이상의 에피토프-함유 단편과 접촉시키는 단계; 및
DLL3, 또는 그의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 개체내 항체 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 본 발명은 개체에서 암, 예를 들어 본원 발명의 질병의 진전을 모니터링하거나, 또는 본원 발명의 질병에 대한 예컨대, 항암제 또는 항암 요법의 효과를 모니터링하는 방법을 제공하며, 이는 상기 개체에서 처음 시점 및 나중 시점에서의 DLL3 또는 그 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하고, 상기 처음 시점에서의 개체내의 수준에 비교하여 나중 시점에서의 개체내 상승 또는 저하된 수준의 DLL3 또는 그 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재는 상기 암의 진전 또는 재발을 나타내거나, 또는 상기 개체에서 항암제 또는 항암 요법의 효과 있음 또는 없음을 나타낸다.
DLL3 또는 그 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재는 일반적으로 상기 개체에서 수득한 생물학적 시료(예시적인 생물학적 시료는 전술되었으며, 예컨대 상기 시료는 폐, 췌장 및 피부 조직, 또는 혈액 또는 타액 시료이다)를 분석하여 검출한다. 상기 방법은 통상 상기 개체에서 분석을 위한 상기 생물학적 시료를 수득하는 단계를 포함한다. 검출가능한 항체는 IgA, IgM 및 IgG 항체를 포함한다.
본 발명에 따라, 본 발명 질병을 갖는 것으로 의심되거나 갖는 것으로 알려진 개체에서 수득한 시험 시료, 예컨대 폐, 췌장 또는 피부 조직, 혈청, 혈장 또는 뇨를 진단 또는 모니터링을 위해 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 대조 시료(본 발명 질병이 없는 개체에서 수득) 또는 미리 측정된 기준 범위에 대한 시험 시료에서 DLL3의 량의 변화는 본 발명 질병의 존재를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 대조 시료 또는 미리 측정된 기준 범위에 대한 시험 시료에서의 DLL3의 상대적인 풍부함(abundance)은 본 발명 질병의 서브타입을 나타낸다(예, 소세포암; 편평 세포폐암; 췌장의 내분비암 또는 편평 세포 피부암, 흑색종). 다른 실시형태에서, 대조 시료 또는 미리 측정된 기준 범위에 대한 시험 시료에서의 DLL3의 상대적인 풍부함은 본 발명 질병의 심각성을 나타낸다(예, 전이 가능성). 상기 임의의 방법중에서, DLL3 검출은 임의로 본 발명 질병에 대한 하나 이상의 부가적 바이오마커의 검출과 결합될 수 있다. 당업계의 적합한 방법을 사용하여, DLL3 수준을 측정할 수 있으며, 비제한적으로, DLL3를 검출 및/또는 영상화하는 여기 기재한 바람직한 기술들, 키나제어세이, 면역 어세이(예, 웨스턴 블롯, 면역침전후 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 면역세포화학 등)를 포함한다. 추가 실시형태에서, 대조 시료 또는 미리 측정된 기준 범위에 대한 시험 시료에서 DLL3 암호화 mRNA의 량의 변화는 본 발명 질병의 존재를 나타낸다. 임의의 적합한 혼성화 어세이를 사용하여 DLL3 암호화 mRNA를 검출 및/또는 영상화함으로써 DLL3 발현을 검출할 수 있다(예, 노던 어세이, 닷 블롯, 인 시투 혼성화, 등).
본 발명의 다른 실시형태에서, DLL3에 특이적으로 결합하는 표지된 항체(또는 다른 친화성 시약), 그 유도체 및 아날로그는 본 발명 질병의 검출, 진단 또는 모니터링을 위해 진단적 목적으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명 질병은 동물, 더 바람직하게 포유동물, 가장 바람직하게 인간에서 검출된다.
스크리닝 어세이
본 발명은 DLL3에 결합하거나 또는 DLL3의 발현 또는 활성에 자극 또는 저해 효과를 갖는 물질(예, 후보 화합물 또는 시험 화합물)을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 DLL3-관련 폴리펩티드 또는 DLL3 융합 단백질에 결합하거나 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 또는 DLL3 융합 단백질의 발현 또는 활성에 자극 또는 저해 효과를 갖는 물질, 후보 화합물 또는 시험 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 물질, 후보 화합물 또는 시험 화합물의 예는, 비제한적으로, 핵산(예, DNA 및 RNA), 탄수화물, 지질, 단백질, 펩티드, 펩티도미메틱, 소분자 및 기타 약물을 들 수 있다. 이들 물질들은 생물학적 라이브러리; 공간 주소화 가능한 평행 고상 또는 용액상 라이브러리; 데컨볼루션(deconvolution)이 요구되는 합성 라이브러리 방법; "한 구슬 한 화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법; 및 친화성크로마토그라피 선택을 사용하는 합성 라이브러리 방법을 포함하는, 당업계에 알려진 결합 라이브러리 방법에서 임의의 수많은 접근을 사용하여 수득될 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근은 펩티드 라이브러리에 제한되나, 다른 네 접근은 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 응용될 수 있다(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145; 미국 특허 제 5,738,996호; 및 미국 특허 제 5,807,683호, 이들 각각은 여기에 참조로 전체가 포함된다).
분자 라이브러리 합성을 위한 방법의 예는 당업계에서, 예를 들면 DeWitt et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med . Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew . Chem . Int . Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew . Chem . Int . Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop et al., 1994, J. Med . Chem. 37:1233에서 찾을 수 있으며, 이들 각각은 여기에 참조로 전체가 포함된다.
화합물 라이브러리는 예를 들어, 용액으로(예, Houghten, 1992, BioTechnoques 13:412-421), 또는 비드(Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩(Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아(미국 특허 제 5,223,409호), 포자(미국 특허 5,571,698; 5,403,484; 및 5,223,409), 플라즈미드(Cull et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:1865-1869) 또는 파지(Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:6378-6382; and Felici, 1991, J. Mol . Biol. 222:301-310)상에 제시될 수 있으며, 이들 문헌은 전체로 여기에 참조로 포함된다.
일 실시형태에서, DLL3, DLL3 단편(예, 기능적으로 활성인 단편), DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질과 상호작용(즉 결합)하는 물질은 세포-기반 어세이 시스템에서 확인된다. 이 실시형태에서, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질을 발현하는 세포는 후보 화합물 또는 대조 화합물과 접촉되며 DLL3와 상호작용하는 후보 화합물의 능력이 결정된다. 필요한 경우, 이 어세이는 복수의 후보 화합물(예, 라이브러리)을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 세포는 예를 들면, 원핵 기원(예, E. coli) 또는 진핵 기원(예, 효모 또는 포유류)일 수 있다. 나아가 세포는 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질을 내인적으로 발현하거나 또는 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 어떤 경우, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질 또는 후보 화합물은, DLL3 및 후보 화합물간의 상호작용이 검출될 수 있도록, 예를 들면 방사성활성 라벨(예, 32P, 35S, 및 125I) 또는 형광성 라벨(예, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드 또는 플루오레사민)으로 표지된다. 후보 화합물이 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질과 직접 또는 간접으로 상호작용하는 능력은 당업자에게 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 후보 화합물과 DLL3, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질 간의 상호작용은 유동 세포 분석, 신틸레이션 어세이, 면역침전 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정될 수 있다.
다른 실시형태에서, DLL3, DLL3 단편(예, 기능적으로 활성인 단편), DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질과 상호작용(즉 결합)하는 물질은 무-세포 어세이 시스템에서 확인된다. 이 실시형태에 따라, 천연 또는 재조합 DLL3 또는 그들의 단편, 천연 또는 재조합 DLL3-관련 폴리펩티드 또는 그들의 단편, 또는 DLL3 융합 단백질 또는 그 단편은 후보 화합물 또는 대조 화합물과 접촉되며, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드, 또는 DLL3 융합 단백질과 상호작용하는 후보 화합물의 능력이 결정된다. 필요한 경우, 이 어세이는 복수의 후보 화합물(라이브러리)를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질은, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질을 특이적으로 인식하고 결합하는 고정된 항체(또는 다른 친화성시약)와 접촉시키거나, 또는 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질의 정제된 제제를 이들 단백질과 결합하도록 디자인된 표면과 접촉시킴으로써 1차로 고정된다. DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질은 부분적으로 또는 전체로 정제되거나(예, 부분적으로 또는 전체로 다른 폴리펩티드가 없거나) 또는 세포 용해물의 일부일 수 있다. 또한, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 단편은 DLL3 또는 그 생물학적 활성 부분, 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 및 글루타티오닌-S-트랜스퍼라제와 같은 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 또는, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드 단편 또는 DLL3 융합 단백질은 당업자에 잘 알려진 기술을 사용하여 비오티닐화될 수 있다(예, 비오티닐화 키트, Pierce Chemicals; Rockford, IL). 후보화합물이 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질과 상호작용하는 능력은 당업자에 잘 알려진 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
다른 실시형태에서, 세포-기반 어세이 시스템은 DLL3의 제조 또는 분해를 담당하거나 또는 DLL3의 번역 후 변형을 담당하는 효소와 같은 단백질 또는 그 생물학적 활성 부분에 결합하거나 그 활성을 조절하는 물질을 확인하는데 사용된다. 제1 스크리닝에서, DLL3, DLL3 이소형, DLL3 호몰로그, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3 융합 단백질 또는 단편의 제조, 분해 또는 번역후 변형을 조절하는 화합물을 확인하기 위해, 복수의 화합물(예, 라이브러리)이 (i) DLL3, DLL3의 이소형, DLL3 호몰로그, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3 융합 단백질, 이들의 생물학적 활성 단편; 및 (ii) DLL3, DLL3 이소형, DLL3 호몰로그, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3 융합 단백질, 또는 그 단편의 가공을 담당하는 단백질을 천연 또는 재조합적으로 발현하는 세포와 접촉한다. 필요한 경우, 제1 스크리닝에서 확인된 화합물은 이후 DLL3을 천연 또는 재조합적으로 발현하는 세포에 대한 제2 스크리닝에서 어세이될 수 있다. 후보 화합물이 DLL3, 이소형, 호몰로그, DLL3-관련 폴리펩티드, 또는 DLL3 융합 단백질의 제조, 분해 또는 번역후 변형을 조절하는 능력은, 비제한적으로 유동 세포 분석, 신틸레이션 어세이, 면역침전 및 웨스턴 블롯 분석을 포함하는 당업자에 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다.
다른 실시형태에서, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질과 경쟁적으로 상호작용(즉, 결합)하는 물질이 경쟁 결합 어세이에서 확인된다. 이 실시형태에 따라, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질을 발현하는 세포는 후보 화합물 및 DLL3, a DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드 단편 또는 DLL3 융합 단백질과 상호작용하는 것으로 알려진 화합물과 접촉하고; 이후 후보 화합물의 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질과 우선적으로 상호작용하는 능력이 측정된다. 또는 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 단편과 우선적으로 상호작용(즉, 결합)하는 물질은 무-세포 어세이 시스템에서, DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질을 후보 화합물 및 DLL3, DLL3-관련 폴리펩티드 또는 DLL3 융합 단백질과 상호작용하는 것으로 알려진 화합물을 접촉시킴으로써 확인된다. 전술한 바와같이, 후보 화합물의 DLL3, DLL3 단편, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3-관련 폴리펩티드의 단편 또는 DLL3-융합 단백질과 상호작용할 수 있는 능력은 당업자에 잘 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 이들 어세이는, 세포-기반이든 무-세포 이든, 복수의 후보화합물(예, 라이브러리)을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 조절(즉, 상향조절 또는 하향조절)할 수 있는 물질은, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드를 발현하는 세포(예, 원핵 기원 또는 진핵 기원 세포)를 후보 화합물 또는 대조 화합물(예, 포스페이트 완충 식염수 (PBS))와 접촉시키고, DLL3, DLL3-관련 폴리펩티드, 또는 DLL3 융합 단백질, DLL3 암호화 mRNA, 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 암호화 mRNA의 발현을 측정함으로써 확인된다. 후보 화합물 존재하에 DLL3, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3 암호화 mRNA, 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 암호화 mRNA의 발현 수준이 후보 화합물 부재하(예, 대조 화합물의 존재)에 DLL3, DLL3-관련 폴리펩티드, DLL3 암호화 mRNA, 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 암호화 mRNA의 발현 수준과 비교된다. 이후 후보 화합물은 이 대비에 기초하여 DLL3, 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 발현 조절자로서 확인될 수 있다. 예를 들면, 후보 화합물의 존재하 DLL3 또는 mRNA의 발현이 그 부재시보다 상당히 큰 때, 그 후보 화합물은 DLL3 또는 mRNA의 발현의 자극제로 확인된다. 또는 후보 화합물의 존재하 DLL3 또는 mRNA의 발현이 그 부재시보다 상당히 적은 때, 그 후보 화합물은 DLL3 또는 mRNA의 발현의 저해제로 확인된다. DLL3 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현 수준은 당업자에 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, mRNA 발현은 노던 블롯 분석 또는 RT-PCR에 의해 분석될 수 있으며, 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 분석될 수 있다.
다른 실시형태에서, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 활성을 조절하는 물질은 DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 함유 제제 또는 DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 발현 세포(예, 원핵 또는 진핵 세포)를 시험 화합물 또는 대조 화합물과 접촉시키고, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 활성을 조절(자극 또는 저해)하는 시험 화합물의 능력을 측정함으로써 확인된다. DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 활성은 DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 세포성 신호 전달 경로(예, 세포내 Ca2 +, 디아실글리세롤, IP3 등)의 유도를 검출함으로써, 적합한 기질 상의 타겟의 촉매적 또는 효소적 활성을 검출함으로써, 리포터 유전자(예, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드에 반응성이며, 검출가능한 마커, 예, 루시퍼라제를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 요소)의 유도를 검출함으로써, 또는 세포성 반응, 예를 들면, 세포성 분화, 또는 세포 증식을 검출함으로써 평가될 수 있다. 본 명세서에 기초하여, 당업자에 알려진 기술을 사용하여 이러한 활성을 측정할 수 있다(예, 전체가 참조로 여기에 포함되는 미국 특허 제 5,401,639호 참조). 이후 후보 화합물은 대조 화합물에 대한 후보 화합물의 효과를 비교함으로써, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 활성의 조절자로서 확인될 수 있다. 적합한 대조 화합물은 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 및 일반 식염수(NS)를 포함한다.
다른 실시형태에서, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 발현 및 활성을 조절(즉, 상향조절 또는 하향조절)하는 물질은 동물 모델에서 확인된다. 적합한 동물의 예로서, 비제한적으로 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 귀니픽, 개 및 고양이를 포함한다. 바람직하게, 사용된 동물은 본 발명 질병 모델을 나타낸다(예, NCI-H345과 같은 소세포 폐암 세포주의 이종이식; A549 및 H460과 같은 비-소세포 폐암 세포주의 이종이식; 누드 마우스내 MIA PaCa-2과 같은 췌장암 세포주의 이종이식, Marincola et al., J Surg Res 1989 Dec;47(6):520-9, 또는 누드 마우스내 MV3과 같은 피부암 세포주의 이종이식,van Muijen et al., Int J Cancer 1991 Apr 22;48(1):85-91). 이들은 DLL3 수준을 조절하는 화합물을 시험하는데 사용될 수 있는데, 이들 모델에서 보이는 병리가 예를 들면 본 발명의 질병의 병리와 유사하기 때문이다. 이 실시형태에 따라, 시험 화합물 또는 대조 화합물은 적합한 동물에 투여되고(예, 경구로, 직장으로 또는 복강 또는 정맥과 같이 비경구로), 그 DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드의 발현, 활성 또는 발현 및 활성에 대한 효과가 측정된다. DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드 발현에서의 변화는 위에 기술된 방법으로 평가될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드는 2-히브리드 어세이 또는 3-히브리드 어세이에서 DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드에 결합 또는 상호작용하는 다른 단백질을 확인하기 위한 "미끼 단백질(bait protein)으로 사용된다(see, 예, 미국 특허 제 5,283,317호; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol . Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) BioTechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; 및 PCT 공개 No. WO 94/10300 참조). 당업자는, 이러한 결합 단백질도 역시 DLL3가 관여하는 신호 경로의 업스트림 또는 다운스트림 요소로서, DLL3에 의한 신호 전파에 관여할 개연성이 있음을 인식할 것이다.
본 발명은 또한 상기 전술한 스크리닝 어세이에 의해 확인되는 신규한 물질 및 이들의 여기에 기술된 바와 같은 치료를 위한 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명 질병 치료용 의약품의 제조에서 DLL3와 상호작용하거나 그 활성을 조절하는 물질의 용도를 제공한다.
DLL3 의 치료적 사용
본 발명은 치료적 화합물의 투여에 의한 다양한 질병 및 질환의 치료 또는 예방을 제공한다. 이러한 화합물은 비 제한적으로 DLL3, DLL3 아날로그, DLL3-관련 폴리펩티드, 그들의 유도체 및 변이체(단편 포함); 이들에 대한 항체 (또는 기타 친화성 시약); DLL3, DLL3 아날로그, DLL3-관련 폴리펩티드 및 이들의 단편을 암호화하는 핵산; DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드를 암호화하는 유전자에 대한 안티센스 핵산; 및 DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 조절제(예, 작용제 및 길항제)를 포함한다. 본 발명의 중요한 특징은 암, 예컨대 본 발명 질병에 관련된 DLL3를 암호화하는 유전자의 확인이다. 본 발명의 질병은 예를 들면, 본 발명 질병을 갖는 개체의 혈청 또는 조직내 DLL3의 기능 또는 발현을 감소시키는 치료적 화합물의 투여에 의해 치료(예, 증상의 감소 또는 개시 또는 진전의 지연)될 수 있다.
일 실시형태에서, 각각 DLL3에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 (또는 다른 친화성 시약)는 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 치료적 화합물 또는 치료와 조합하여 투여될 수 있다.
생물학적 산물, 예컨대 항체(또는 다른 친화성 시약)는 투여되는 개체에서 동종(allogeneic)이다. 일 실시형태에서, 인간 DLL3 또는 인간 DLL3-관련 폴리펩티드, 인간 DLL3 또는 인간 DLL3-관련 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 인간 DLL3 또는 인간 DLL3-관련 폴리펩티드에 대한 항체 (또는 다른 친화성시약)는 치료(예, 증상의 감소 또는 개시 또는 진전의 지연) 또는 예방을 위해 인간 개체에 투여된다.
이론에 제한됨 없이, DLL3에 특이적으로 결합하는 항체(또는 다른 친화성시약)의 치료적 활성은 항체 의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 현상에 의해 달성되는 것으로 생각된다(예, Janeway Jr. C.A. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:p2153-68 및 Weng, W-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21:p 3940-3947 참조).
본 발명 질병의 치료 및 예방
본 발명 질병은, 예를 들면, 본 발명 질병이 없는 개체의 혈청 또는 조직에 비해 본 발명의 하나 이상의 질병을 갖는 개체의 혈청 또는 조직에 차등적으로 존재하는 DLL3의 수준 또는 활성(즉 기능)을 조절(즉, 증가 또는 감소)하는 화합물을 본 발명의 하나 이상의 질병을 갖는 것으로 알려지거나 또는 의심되거나 또는 발생될 위험에 있는 개체에 투여함으로써, 치료 또는 예방된다. 일 실시형태에서, 본 발명 질병은, 본 발명의 하나 이상의 질병을 갖는 개체의 혈청 또는 조직에 증가된 DLL3의 수준 또는 활성(즉 기능)을 상향 조절(즉, 감소)하는 화합물을 본 발명의 하나 이상의 질병을 갖는 것으로 알려지거나 또는 의심되거나 또는 발생될 위험에 있는 개체에 투여함으로써, 치료 또는 예방된다. 이러한 화합물의 예로는, 비제한적으로, DLL3 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, DLL3에 대한 항체(또는 다른 친화성 시약), 및 DLL3의 효소 활성을 저해하는 화합물을 들 수 있다. 다른 유용한 화합물, 예컨대, DLL3 길항제 및 소분자 DLL3 길항제는 인 비트로 어세이를 사용하여 확인될 수 있다.
암, 예를 들면 본 발명의 질병은 이러한 암을 갖는 것으로 알려지거나 또는 의심되거나 또는 발생될 위험에 있는 개체에, 이러한 암을 갖는 개체의 혈청 또는 조직에 증가된 DLL3의 수준 또는 활성(즉 기능)을 하향조절하는 화합물을 투여함으로써 치료 또는 예방될 수 있다. 이러한 화합물의 예로는, 비제한적으로, DLL3, DLL3 단편 및 DLL3-관련 폴리펩티드; DLL3, DLL3 단편 및 DLL3-관련 폴리펩티드를 암호화하는 핵산(예, 유전자 치료에 사용되기 위한); 및 효소 활성을 갖는 DLL3 또는 DLL3-관련 폴리펩티드에 대해 효소 활성을 조절하는 것으로 알려진 화합물 또는 분자를 들 수 있다. 사용될 수 있는 다른 화합물,예컨대, DLL3 작용제는 인 비트로 어세이를 사용하여 확인될 수 있다.
다른 실시형태에서, 치료 또는 예방은 개별적인 개체의 요구에 따라 맞춰질 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, DLL3의 수준 또는 기능이 대조 또는 정상 기준 범위에 비해 없거나 또는 감소되어 있는, 암, 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 개체에, DLL3의 수준 또는 기능을 촉진하는 화합물이 치료적 또는 예방적으로 투여된다. 추가적 실시형태에서, DLL3의 수준 또는 기능이 대조 또는 정상 기준 범위에 비해 상승되어 있는, 암, 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 개체에, DLL3의 수준 또는 기능을 촉진하는 화합물이 치료적 또는 예방적으로 투여된다. 추가적 실시형태에서, DLL3의 수준 또는 기능이 대조 또는 기준 범위에 비해 상승되어 있는, 암, 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 개체에, DLL3의 수준 또는 기능을 감소시키는 화합물이 치료적 또는 예방적으로 투여된다. 추가적 실시형태에서, DLL3의 수준 또는 기능이 대조 또는 기준 범위에 비해 감소되어 있는, 암, 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 것으로 알려지거나 의심되는 개체에, DLL3의 수준 또는 기능을 감소시키는 화합물이 치료적 또는 예방적으로 투여된다. 이러한 화합물의 투여로 인한 DLL3의 기능 또는 수준의 변화는 예컨대, 시료(예, 혈액 또는 뇨)를 수득하고, DLL3의 수준 또는 활성, 또는 DLL3 암호화 mRNAs의 수준 또는 이들의 임의의 조합을 인 비트로 어세이하여, 쉽게 검출할 수 있다. 이러한 어세이는 여기 기재된 바와 같은 화합물의 투여 전후에 시행될 수 있다.
본 발명의 화합물은, DLL3 프로파일을 정상으로 회복시키는 임의의 화합물, 예컨대, 작은 유기분자, 단백질, 펩티드, 항체(또는 다른 친화성시약), 핵산 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 화합물은 다른 임의의 화학요법제와 조합하여 투여될 수 있다.
백신치료
본 발명의 다른 측면은 DLL3 또는 그 에피토프 함유 단편, 또는 DLL3을 암호화하는 핵산 또는 이들의 단편과 임의로 면역자극제를 함께 포함하는 면역원성 조성물, 적절하게는 백신 조성물이다.
또한, 이러한 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 면역 반응을 올리는 방법, 개체에 치료적 유효량의 이러한 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 예를 들면 본 발명의 질병을 치료 또는 예방하는 방법 및 본 발명의 질병을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 이러한 조성물을 제공한다.
따라서, DLL3는 항원성 물질로서 유용할 수 있으며, 암, 예를 들면 본 발명의 질병의 치료 또는 예방용 백신의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 물질은 "항원성" 및/또는 "면역원성"일 수 있다. 일반적으로, "항원성"은 개체 또는 실험 동물에서 항체(또는 다른 친화성 시약) 또는 실제 항체반응을 유발할 수 있는 단백질을 의미하는 것으로 사용된다. "면역원성"은 개체 또는 실험 동물에서 면역 반응, 예컨대 방어적 면역 반응을 유발할 수 있는 단백질을 의미하는 것으로 사용된다. 따라서, 후자의 경우 단백질은 항체 반응을 생성할 수 있을 뿐 아니라, 부가적으로 비-항체 기반 면역 반응도 생성할 수 있다. "면역원성"은 단백질이 인-비트로 세팅, 예컨대 T-세포 증식 어세이에서 면역-유사 반응을 유발하는 경우도 포함한다. 적합한 면역 반응의 생성을 위해 하나 이상의 애쥬번트 및/또는 적합한 항원 제시의 존재가 요구될 수 있다.
당업자는 DLL3의 호몰로그 또는 유도체가 항원성/면역원성 물질로서의 용도를 발견할 것임을 인식할 것이다. 따라서, 예컨대, 하나 이상의 부가, 결실, 치환 등을 포함하는 단백질도 본 발명에 포함된다. 또한, 한 아미노산을 다른 유사한 "형태"의 아미노산으로 대체할 수 있으며, 예컨대 하나의 소수성 아미노산을 다른 것으로 치환할 수 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 프로그램, 예컨대, CLUSTAL 프로그램을 사용할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고, 양 서열에 적합하게 간격을 삽입하여 적절한 정렬을 찾을 수 있다. 적절한 정렬에 대해 아미노산 상동성 또는 유사성(상동성과 아미노산 형태의 보존)을 산출할 수 있다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사한 서열의 최장 스트레치를 정렬하고 그 핏(fit)에 대해 값을 부여한다. 따라서 각각 다른 점수를 갖는 수개의 유사 영역이 발견되는 대비물을 수득할 수 있다. 양 형태의 분석이 본 발명에서 고려된다.
호몰로그 및 유도체의 경우, 여기에 기술된 바와 같은 단백질과의 상동성 정도보다 호몰로그 및 유도체가 그 항원성 및/또는 면역원성을 보유하는 것이 더 중요하다. 그러나, 적합하게 여기에 기술된 단백질 또는 폴리펩티드와 최소한 60% 유사성(위에 논의된 바와 같이), 예를 들면, 최소한 70% 유사성을 가진 호몰로그 및 유도체, 예컨대 최소한 80% 유사성을 가진 호몰로그 또는 유도체가 제공된다. 특히, 최소한 90%, 심지어 95% 유사성을 갖는 호몰로그 또는 유도체가 제공된다. 적합하게, 호몰로그 또는 유도체는 여기에 기술된 단백질 또는 폴리펩티드와 최소한 60% 서열 상동성을 가진다. 바람직하게 호몰로그 또는 유도체는 최소한 70% 상동성, 더 바람직하게 최소한 80% 상동성을 가진다. 가장 바람직하게, 호몰로그 또는 유도체는 최소한 90% 심지어 95% 상동성을 갖는다.
대안적 접근에서, 호몰로그 또는 유도체는 예컨대 원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 효과적으로 태깅함으로써 정제를 더 용이하게 하는 모이어티를 포함하는 융합단백질일 수 있다. "태그"를 제거하는 것이 필요하거나 또는 융합 단백질 자체가 유용한 충분한 항원성을 보유할 수 있다.
에피토프 영역, 즉 단백질 또는 폴리펩티드의 항원성 또는 면역원성을 담당하는 영역을 확인하기 위해 항원성 단백질 또는 폴리펩티드를 스크리닝할 수 있음이 잘 알려져 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 항원성에 대해 단편 및/또는 호몰로그 및/또는 유도체를 시험할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단편은 하나 이상의 이러한 에피토프 영역을 포함하거나 또는 그 항원성/면역원성 성질을 보유하기 위해 이러한 영역과 충분히 유사하여야 한다. 따라서 본 발명에 따른 단편은 여기에 기재된 단백질 또는 폴리펩티드, 호몰로그 또한 유도체의 특정 부분과 100% 동일할 것이기 때문에 그 동일성 정도는 아마 무의미할 것이다. 핵심 이슈는, 다시 한번, 이 단편이 유래된 단백질의 항원성/면역원성 성질을 보유하는 것이다.
호몰로그, 유도체 및 단편에 대해 중요한 것은 이들이 유래된 단백질 또는 폴리펩티드의 최소한 일정 정도의 항원성/면역원성을 갖는 것이다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에서, DLL3, 그 호몰로그 또는 유도체의 항원성/또는 면역원성 단편이 제공된다.
DLL3, 또는 그 항원성 단편은 정제 또는 분리된 제제로 단독으로 제공될 수 있다. 이들은 본 발명의 하나 이상의 다른 단백질, 또는 그들의 항원성 단편과 함께 혼합물의 일부로서 제공될 수 있다. 추가 측면에서, 따라서, 본 발명은 DLL3 및/또는 하나 이상의 그 항원성 단편을 포함하는 항원 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 암, 예를 들면 본 발명의 질병의 검출 및/또는 진단을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 예방적 또는 치료적 백신 조성물일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 애쥬번트 (면역자극제)를 포함할 수 있다. 당업계에 잘 알려진 예로 무기 겔, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드, 및 유중수 에멀젼, 예컨대 불완전 프루인트 애쥬번트를 포함한다. 다른 유용한 애쥬번트는 당업자에게 잘 알려져 있다.
암 치료용 백신 조성물에 사용하기 위한 적합한 애쥬번트는 3De-O-아세틸화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL로 알려져 있으며, 간단히 MPL로 칭함, WO92/116556 참조), 사포닌, 예를 들면 QS21 또는 QS7, 및 TLR4 작용제, 예컨대 WO95/26204에 개시된 바와 같은 CpG 함유분자를 포함한다. 사용된 애쥬번트는 이들 성분의 조합, 예를 들면 MPL 및 QS21 또는 MPL, QS21 및 CpG 함유 부분일 수 있다. 애쥬번트는 수중유 에멀젼 또는 리포좀 제형으로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 다른 비히클을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, DLL3 또는 DLL3 펩티드 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 제제가 암, 예를 들면 본 발명의 질병 치료용 백신으로서 사용된다. 이러한 제제는 애쥬번트 또는 다른 비히클을 포함할 수 있다.
본 발명 질병치료를 위한 DLL3 저해
본 발명의 일 실시형태에서 암, 예를 들면 본 발명의 질병은 이러한 암이 없는 개체의 혈청 또는 조직과 비교하여 이러한 암을 갖는 개체의 혈청 또는 조직에 상승되어 있는 DLL3의 수준 및/또는 기능을 길항(저해)하는 화합물을 투여함으로써 치료 또는 예방된다.
이 목적을 위해 유용한 화합물은, 비제한적으로 항-DLL3 항체(또는 다른 친화성 시약, 및 그 결합 영역을 함유하는 단편 및 유도체), DLL3 안티센스 또는 리보자임 핵산, 및 동종 재조합에 의해 내인성 DLL3 기능을 "녹아웃"하는데 사용될 수 있는 역기능 DLL3을 암호화하는 핵산(예, Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292 참조)를 포함한다. DLL3 기능을 저해하는 다른 화합물은 알려진 인 비트로 어세이, 예컨대 다른 단백질 또는 결합 파트너에 DLL3가 결합하는 것을 저해하거나 알려진 DLL3 기능을 저해하는 시험 화합물의 능력에 대한 어세이를 사용하여 확인될 수 있다.
이러한 저해는 예를 들면, 인 비트로 또는 세포 배양에서 분석될 수 있으나, 유전적 분석도 사용될 수 있다. 바람직한 기술을 사용하여 화합물의 투여 전후에 DLL3 수준을 검출할 수 있다. 적합한 인 비트로 또는 인 비보 어세이를 사용하여 특정 화합물의 효과 및 이들의 투여가 환부 조직의 치료를 가리키는지 여부를 결정할 수 있으며, 이에 대해 아래에 자세히 후술한다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 치료를 받지 않은 예를 들면 본 발명의 질병을 갖고 있는 개체의 혈청 또는 조직에 비하여, DLL3의 상승된 혈청 또는 조직 수준 또는 상승적 기능적 활성이 검출되는(즉, 정상 수준 또는 요망되는 수준보다 더 높은) 개체에, 또는 그 수준 또는 활성이 이러한 암이 없는 개체에서 발견되는 수준 또는 활성 또는 미리 측정된 기준 범위로 되게 하기 위해 DLL3 기능(활성)을 저해하는 화합물이 치료적 또는 예방적으로 투여된다. 위에 기술된 바와 같이, 당업계 표준 방법을 사용하여 DLL3 수준 또는 기능의 증가를 측정할 수 있다. 적합한 DLL3 저해제 조성물은 예를 들면, 소분자, 예컨대 1000 달톤 미만의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 소분자는 여기에 기술된 스크리닝 방법에 의해 확인될 수 있다.
치료적 또는 예방적 화합물에 대한 어세이
본 발명은 또한 DLL3을 발현하는 암, 예를 들면 본 발명의 질병의 치료 또는 예방을 위한 화합물 효능의 확인 또는 입증을 위해 약물 개발에서 사용되기 위한 어세이를 제공한다.
따라서, DLL3 활성을 조절하는 화합물에 대한 스크리닝 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) DLL3 또는 그 생물학적 활성 부분을 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 이로써 DLL3 활성이 조절되는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법은 (a) DLL3 또는 그 생물학적 활성 부분을 시료 내 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 후보 화합물과 접촉후 상기 시료내 DLL3 또는 그 생물학적 활성 부분의 활성을 상기 후보화합물 접촉전 상기 시료내 DLL3 또는 그 생물학적 활성 부분의 활성 또는 기준 활성 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
스크리닝 방법은 DLL3 활성을 저해하는 화합물에 대한 스크리닝 방법일 수 있다.
DLL3 또는 그 생물학적 활성 부분은 예를 들면 세포에 의해 또는 세포상에 발현될 수 있다. DLL3 또는 그 생물학적 활성 부분은 예를 들면 이를 발현하는 세포로부터 분리될 수 있다. DLL3 또는 그 생물학적 활성 부분은 예를 들면 고체상에 고정화될 수 있다.
DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산의 발현을 조절하는 화합물에 대한 스크리닝 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산을 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 이로써 DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산의 발현이 조절되는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법은 (a) DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산을 발현하는 세포를 시료내 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 후보 화합물과 접촉 후 상기 시료내 세포에 의한 DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산의 발현을 상기 후보화합물 접촉전 상기 시료내 세포에 의한 DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산의 발현 또는 기준 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산의 발현을 저해하는 화합물에 대한 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 전술한 스크리닝 방법으로 수득가능한 화합물, DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물, 예를 들면 DLL3 또는 DLL3 암호화 핵산의 활성 또는 발현을 저해하는 화합물을 포함한다.
이러한 화합물은 암, 예를 들면 본 발명의 질병의 치료 또는 예방에 사용되기 위해 제공된다. 또한 치료적 유효량의 이러한 화합물을 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암, 예를 들면 본 발명의 질병의 치료 또는 예방하기 위한 방법이 제공된다.
시험 화합물은 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 개체에서의 DLL3 수준을 이러한 암이 없는 개체에서 발견되는 수준으로 회복시키거나 또는 이러한 암의 실험 동물 모델에서 유사한 변화를 생산하도록 하는 능력에 대해 분석될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 개체에서의 DLL3 수준을 이러한 암이 없는 개체에서 발견되는 수준으로 회복시키거나 또는 이러한 암의 실험 동물 모델에서 유사한 변화를 생산하도록 할 수 있는 화합물은 추가 약물 개발에 대한 선도 화합물로서 사용되거나 또는 치료적으로 사용될 수 있다. DLL3 발현은 바람직한 기술, 면역 어세이, 겔 전기영동 및 그 후 영상화, DLL3 활성 검출, 또는 여기에 교시되거나 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 방법에 의해 분석될 수 있다. 이러한 어세이는 임상적 모니터링 또는 약물 개발에서 후보 약물을 스크리닝하는데 사용될 수 있으며, 이때 DLL3의 풍부성이 임상적 질환에 대한 대리 마커로서 기능할 수 있다.
다양한 특정 실시형태에서, 인 비트로 어세이는 화합물이 개체의 질병에 관여하는 세포 형태에서 원하는 효과를 나타내는지 여부를 결정하기 위해 이러한 세포 형태를 대표하는 세포로 수행할 수 있다.
치료에 사용되기 위한 화합물은 인간에 시험되기 전에 비제한적으로 랫트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 토끼, 등을 포함하는 적합한 동물 모델 시스템에서 시험될 수 있다. 인 비보 시험을 위해, 인간에 투여되기 전에 당업계에 알려진 임의의 동물 모델 시스템이 사용될 수 있다. 본 발명 질병의 동물 모델은, 비제한 적으로, NCI-H345와 같은 소세포 폐암 세포주의 이종이식; A549 및 H460와 같은 비-소세포 폐암 세포주의 이종이식; 누드 마우스에 MIA PaCa-2와 같은 췌장암 세포주의 이종이식(Marincola et al., J Surg Res 1989 Dec;47(6):520-9) 또는 누드 마우스에 MV3와 같은 피부암 세포주의 이종이식(van Muijen et al., Int J Cancer 1991 Apr 22;48(1):85-91)을 포함한다. 이들은 DLL3 수준을 조절하는 화합물을 시험하는데 사용될 수 있는데, 이들 모델에서 보이는 병리가 예를 들면 본 발명의 질병의 병리와 유사하기 때문이다. 본 발명의 개시에 기초하여, 트랜스제닉 동물이 유전자 또는 DLL3를 암호화하는 유전자의 "녹-아웃" 돌연변이로 제조될 수 있음이 당업자에 명백하다. 유전자의 "녹-아웃" 돌연변이는 돌연변이된 유전자가 발현되지 않거나, 또는 이상 형태 또는 저수준으로 발현되게 하여 유전자 산물에 관련된 활성이 거의 또는 전적으로 없도록 하는 돌연변이이다. 바람직하게, 트랜스제닉 동물은 포유류; 더 바람직하게, 트랜스제닉 동물은 마우스이다.
일 실시형태에서, DLL3 발현을 조절하는 시험 화합물은 비-인간 동물(예, 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼 및 귀니픽), 바람직하게 DLL3을 발현하는 본 발명 질병에 대한 비-인간 동물 모델에서 확인된다. 이 실시형태에 따라, 시험 화합물 또는 대조 화합물이 동물에 투여되며, DLL3 발현에 대한 시험 화합물의 효과가 측정된다. DLL3 발현을 변경하는 시험 화합물은 시험 화합물이 처리된 동물 또는 동물 그룹에서의 DLL3(또는 이를 암호화하는 mRNA)의 수준을 대조 화합물이 처리된 동물 또는 동물 그룹에서의 DLL3 또는 mRNA의 수준과 비교함으로써 확인될 수 있다. 당업자에게 알려진 기술, 예를 들면, 인 시투 혼성화를 사용하여 mRNA 및 단백질 수준을 측정할 수 있다. 동물은 시험 화합물의 효과를 분석하기 위해 희생되거나 희생되지 않을 수 있다.
다른 실시형태에서, DLL3 또는 생물학적 활성 부분의 활성을 조절하는 시험 화합물은 비-인간 동물(예, 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 및 귀니픽), 바람직하게 DLL3을 발현하는 본 발명 질병에 대한 비-인간 동물 모델에서 확인된다. 이 실시형태에 따라, 시험 화합물 또는 대조 화합물이 동물에 투여되며, DLL3 활성에 대한 시험 화합물의 효과가 측정된다. DLL3 활성을 변경하는 시험 화합물은 대조 화합물이 처리된 동물 및 시험 화합물이 처리된 동물을 분석함으로써 확인될 수 있다. DLL3 활성은 DLL3의 세포성 2차 메신저(예, 세포내 Ca2 +, 디아실글리세롤, IP3 등)의 유도를 검출함으로써, DLL3 또는 그 결합 파트너의 촉매 또는 효소 활성을 검출함으로써, 리포터 유전자(예, 검출가능한 마커, 예컨대, 루시퍼라제 또는 녹색 형광 단백질을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 DLL3에 반응성인 조절 요소)의 유도를 검출함으로써, 또는 세포성 반응(예, 세포성 분화 또는 세포 증식)을 검출함으로써 확인될 수 있다. 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 DLL3 활성 변화를 검출할 수 있다(예, 미국 특허 제 5,401,639호 참조, 이 문헌은 여기에 참조로 포함됨).
또 다른 실시형태에서, DLL3의 수준 또는 발현을 조절하는 시험 화합물은 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 인간 개체, 바람직하게 예를 들면 심각한 본 발명의 질병을 갖는 인간 개체에서 확인된다. 이 실시형태에 따라, 시험 화합물 또는 대조 화합물은 인간 개체에 투여되며, DLL3 발현에 대한 시험 화합물의 효과는 생물학적 시료(예, 혈청, 혈장 또는 뇨)에서 DLL3 또는 이를 암호화하는 mRNA의 발현을 분석함으로써 결정될 수 있다. DLL3 발현을 변경하는 시험 화합물은 대조 화합물이 처리된 개체 또는 개체 그룹에서의 DLL3 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 시험 화합물이 처리된 개체 또는 개체 그룹에서의 수준과 비교함으로써 확인될 수 있다. 또는 DLL3 발현의 변경은 시험 화합물의 투여 전 및 후의 개체 또는 개체 그룹에서의 DLL3 또는 이를 암호화하는 mRNA의 수준을 비교함으로써 확인될 수 있다. 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 생물학적 시료를 얻고, mRNA 또는 단백질 발현을 분석할 수 있다. 예를 들면, 여기에 기술된 바람직한 기술을 사용하여 DLL3 수준의 변화를 평가할 수 있다.
다른 실시형태에서, DLL3의 활성을 조절하는 시험 화합물은 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 인간 개체(바람직하게 예를 들면 심각한 본 발명의 질병을 갖는 인간 개체)에서 확인된다. 이 실시형태에서, 시험 화합물 또는 대조 화합물은 인간 개체에 투여되며, DLL3 활성에 대한 시험 화합물의 효과가 결정된다. DLL3 활성을 변경하는 시험 화합물은 대조 화합물이 처리된 개체에서의 생물학적 시료를 시험 화합물이 처리된 개체에서의 시료와 비교함으로써 확인될 수 있다. 또는 DLL3 활성의 변경은 시험 화합물의 투여 전 및 후의 개체 또는 개체 그룹에서의 DLL3의 활성을 비교함으로써 확인될 수 있다. DLL3 활성은 생물학적 시료(예, 혈청, 혈장 또는 뇨)내 DLL3의 세포성 신호 전달 경로(예, 세포내 Ca2+, 디아실글리세롤, IP3 등)의 유도, DLL3 또는 그 결합 파트너의 촉매 또는 효소 활성, 또는 세포성 반응, 예를 들면, 세포성 분화 또는 세포 증식을 검출함으로써 확인될 수 있다. 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 DLL3의 2차 메신저의 유도의 변화 또는 세포성 반응의 변화를 검출할 수 있다. 예를 들면, RT-PCR를 사용하여 세포성 2차 메신저의 유도의 변화를 검출할 수 있다.
다른 실시형태에서, DLL3의 수준 또는 발현을 대조 개체(예를 들면 본 발명의 질병이 없는 인간)에서 검출된 수준으로 변경하는 시험 화합물이 추가 시험 또는 치료적 사용을 위해 선택된다. 다른 실시형태에서, DLL3의 활성을 대조 개체(예를 들면 본 발명의 질병이 없는 인간)에서 발견된 활성으로 변경하는 시험 화합물이 추가 시험 또는 치료적 사용을 위해 선택된다.
다른 실시형태에서, 예를 들면 본 발명의 질병에 수반되는 하나 이상의 증상의 심각도를 감소시키는 시험 화합물이 예를 들면 본 발명의 질병을 갖는 인간 개체, 바람직하게 심각한 본 발명 질병을 갖는 개체에서 확인된다. 이 실시형태에 따라, 시험 화합물 또는 대조 화합물은 개체에 투여되며, 예를 들면 본 발명의 질병의 하나 이상의 증상에 대한 시험 화합물의 효과가 결정된다. 하나 이상의 증상을 감소시키는 시험 화합물은 대조 화합물이 처리된 개체와 시험 화합물이 처리된 개체를 비교함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 질병에 익숙한 의사들에게 알려진 기술을 사용하여, 시험 화합물이 예를 들면 본 발명의 질병에 수반되는 하나 이상의 증상을 감소시키는지를 결정할 수 있다. 예컨대, 예를 들어 본 발명의 질병을 갖는 개체에서 종양 크기(tumour burden)를 감소시키는 시험 화합물이 이러한 개체에 이로울 것이다.
다른 실시형태에서, 암, 예를 들면 본 발명의 질병에 수반되는 하나 이상의 증상의 심각도를 감소시키는 시험 화합물이 추가 시험 또는 치료적 사용을 위해 선택된다.
치료적 및 예방적 조성물 및 그 사용
본 발명은 유효량의 본 발명 화합물(예, DLL3 단백질, DLL3 또는 그 단편 에 특이적으로 결합할 수 있는 친화성 시약 또는 DLL3 암호화 핵산)을 개체에 투여하는 것을 포함하는 치료(및 예방) 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 화합물은 실질적으로 정제된다(예컨대, 그 효과를 제한하거나 바람직하지 않은 부작용을 일으킬 수 있는 물질이 실질적으로 없음).
화합물이 핵산을 포함할 때 사용될 수 있는 제형 및 투여 방법은 전술한 바와 같다; 부가적인 적합한 제형 및 투여 방법이 후술된다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명 화합물을 투여하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 리포좀에의 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 엔도시토시스(예, Wu and Wu, 1987, J. Biol . Chem. 262:4429-4432), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산 구축 등. 도입 방법은 경구(enteral) 또는 비경구일 수 있으며, 비제한적으로 진피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하내, 비강내, 경막외 및 경구 루트를 포함한다. 화합물은 임의의 편리한 경로, 예컨대 주입 또는 일시 주사(bolus injection), 상피 또는 점막(예, 구강 점막, 직장 및 장 점막)을 통한 흡수 등을 통해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 뇌실내(intraventricular) 및 인트라테칼(intrathecal) 주사를 포함하는 임의의 적합한 루트롤 통한 중추신경시스템으로 도입되는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실내 주사는 예를 들면 옴마야 저장소(Ommaya reservoir)와 같은 저장소에 부착된 뇌실내 카테타에 의해 촉진될 수 있다. 예컨대 흡입기 또는 분무기 및 에어로졸화제를 사용한 제형을 사용하여 폐 투여도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명에서 사용되는 핵산은 예컨대 입자 매개 상피 전달을 사용하여 진피로 전달될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여되는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 비제한적으로, 수술중 국소 주입, 예컨대 주사, 카테타, 또는 다공성, 비-다공성 또는 겔라틴성 물질이며, 실래스틱막(sialastic membranes)과 같은 막 또는 파이버를 포함하는 임플란트를 사용한 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 일 실시형태에서, 예컨대, 폐, 췌장 및 피부 조직내 또는 악성 종양 또는 신생 또는 신생-전 조직의 부위(또는 이전 부위)내로 바로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 화합물은 소포내, 특히 리포좀으로 전달될 수 있다(Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327 참조; 일반적으로 같은 책 참조).
또 다른 실시형태에서, 화합물은 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다(Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed . Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl . J. Med. 321:574 참조). 다른 실시형태에서, 폴리머성 물질이 사용될 수 있다(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol . Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol . 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조). 다른 실시형태에서, 조절 방출 시스템은 치료적 타겟, 예를 들면 본 발명의 질병 가까이 위치되어 전신 용량의 오직 일부만이 요구되게 할 수 있다(예, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 다른 조절 방출 시스템이 Langer의 평론에 논의되어 있다 (1990, Science 249:1527-1533).
본 발명의 화합물이 단백질을 암호화하는 핵산인 특정 실시형태에서, 상기 핵산은 그 암호화된 단백질의 발현을 촉진하도록 인 비보 투여될 수 있으며, 이는 상기 핵산을 적합한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구축하고, 이를 투여함으로써, 예컨대, 레트로바이러스 벡터(미국 특허 제 4,980,286호 참조)를 사용함으로써, 또는 직접 주사에 의해, 또는 마이크로입자 폭격(예, 유전자 총; Biolistic, Dupont)을 사용함으로써, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로 코팅에 의해 또는 핵내로 들어가는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩티드(예, Joliot et al., 1991, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 88:1864-1868 참조) 등과 연계하여 투여함으로써 세포내가 되게 한다. 또는, 핵산은 동종 재조합에 의해 세포내로 도입되어 발현용 숙주 세포 DNA내로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의해 허가에 적합하거나, 동물 및 특히 인간에서 사용되기 위해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 기재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 희석제, 보조제, 부형제 또는 치료제가 투여되는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 물이나 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는 오일과 같은 멸균 용액일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥 투여되는 경우, 물이 바람직한 담체이다. 식염 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액도 액체 담체로서, 특히 주사가능한 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 몰트, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 건조 스킴 밀크, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요한 경우, 조성물은 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충화제를 함유할 수 있다. 이 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 필, 캡슐, 분말, 서방출 제형 등의 형태를 가질 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세라이드와 함께 좌제로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 표준 담체, 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 개체에 적합하게 투여되기 위한 형태를 제공하도록 치료적 유효량의 화합물을, 예를 들면 정제된 형태로, 적합한 양의 담체와 함께 포함할 것이다. 제형은 투여 모드에 적합하여야 한다.
일 실시형태에서, 예를 들면 하나 이상의 항체가 사용되는 경우, 조성물은 인간에 정맥 투여되기에 적합한 제학적 조성물로서 통상적인 절차에 따라 제형화된다. 통상, 정맥 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 가용화제 및 리도카인과 같은 국소 마취제를 포함하여 주사 부위에서의 통증을 완화시킬 수 있다. 일반적으로, 성분들은 개별적으로 또는 한 단위 제형내에 혼합하여, 예컨대 일정량의 활성성분을 지시하는 앰플 또는 사쉐(sachette)와 같은 밀봉된 용기내에 동결건조 분말 또는 물이 없는 농축액으로서 제공될 수 있다. 조성물이 주입으로 투여되는 경우, 멸균된 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우, 투여전에 성분이 혼합되도록 주사용 멸균수 또는 식염수 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명 화합물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은, 적절한 경우, 자유 아미노기와 함께 형성된 것, 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등에서 유도된 것들 및 자유 카복실기와 함께 형성된 것, 예컨대 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유도된 것들을 포함한다.
암, 예를 들면, 본 발명 질병의 치료에 유효한 본 발명의 화합물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 인 비트로 어세이를 임의로 보조적으로 사용하여 적정 용량 범위를 확인할 수 있다. 제형내 사용되는 정확한 용량은 투여 루트 및 질병 또는 질환의 심각성에 의존하며, 시술자의 판단 및 각 개체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 정맥 투여를 위한 적합한 용량 범위는 일반적으로 체중 킬로그램당 활성 화합물 약 20-500 마이크로그램이다. 비강내 투여를 위한 적합한 용량 범위는 일반적으로 약 0.01 pg/체중kg 내지 1 mg/체중kg이다. 유효 용량은 인 비트로 또는 동물 모델 시험 시스템에서 얻어진 용량-반응 곡선에서 외삽될 수 있다.
좌제는 일반적으로 활성 성분을 0.5% 내지 10%(중량)의 범위로 포함하고; 경구 제형은 바람직하게 10% 내지 95%의 활성 성분을 함유한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기에 임의로 약제학적 또는 생물학적 산물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로서, (a) 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 상기 기관의 승인 (b) 사용 방법 또는 이들 양자를 반영한 설명서(notice)가 부수될 수 있다.
따라서 일 측면에서 키트는 본 발명에 사용된 항체를 포함하며, 예컨대 항체는 투여 또는 사용전에 재구성되기 위해 동결건조될 수 있다. 키트가 예컨대 암 치료/처치를 위한 것인 경우, 항체나 항체들은 임의로 키트내 제공될 수 있는 등장 수성 용액으로 재구성될 수 있다. 일 측면에서 키트는 예컨대 동결건조될 수 있는, 본 발명에 사용된 면역원성 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 후자의 키트는 면역원성 폴리펩티드를 재구성하기 위한 애쥬번트를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 여기에 기재된 바와 같은 조성물 예를 들면 개체에서 면역 반응을 유도하는데 사용되기 위한 약제학적 조성물 및/또는 백신 조성물에 관한 것이다.
다른 추가 실시형태에서, 본 발명은 암, 바람직하게 본 발명의 질병 중 하나를 치료하기 위해 동시, 순차 또는 분리 투여되기 위한
(a) DLL3에 결합하는 친화성 시약, 및
(b) 항암제 또는 다른 활성약제를 별개로 또는 같이 포함하는 의약품을 제공한다.
영상 기술에 의한 DLL3 의 풍부성 (abundance) 결정
영상 기술에 의해 DLL3의 풍부성을 결정하는 이점은 이러한 방법이 비-침습적이고(투여에 필요한 시약을 절약), 개체에서 시료를 추출할 필요가 없다는 것이다.
적합한 영상 기술은 포지트론 방출 토모그라피(PET) 및 단일 포톤 방출 컴퓨터 토모그라피(SPECT)를 포함한다. 이러한 기술을 사용하여 DLL3을 가시화하기 위해서는 적합한 표지, 예컨대 18F, 11C 또는 123I와 같은 방사성 추적자의 결합 또는 삽입이 필요하다(예, NeuroRx -The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics (2005) 2(2), 348-360 참조 및 기술의 자세한 사항은 361-371 참조). 방사성 추적자 또는 다른 표지는 적당히 표지된 특정 리간드를 개체에 투여(예, 주사)함으로써 DLL3에 포함될 수 있다. 또는 이들은 개체에 투여(예, 주사)될 DLL3에 특이적인 결합 친화성 시약(예, 항체)에 포함될 수 있다. 영상화를 위한 아피바디의 사용에 대한 논의는 예컨대, Orlova A, Magnusson M, Eriksson TL, Nilsson M, Larsson B, Hoiden-Guthenberg I, Widstrom C, Carlsson J, Tolmachev V, Stahl S, Nilsson FY, Tumor imaging using a picomolar affinity HER2 binding Affibody molecule, Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4339-48) 참조.
면역조직화학을 이용한 본 발명의 질병을 포함하는 암 진단 및 치료
면역조직화학은 우수한 검출 기술이며, 따라서 본 발명의 질병을 포함하는 암 진단 및 치료에 매우 유용하다. 면역조직화학은 특정 시약으로서 DLL3에 특이적으로 결합하는 표지된 항체(또는 다른 친화성 시약), 그 유도체 및 아날로그를 사용하여 DLL3 항원을 국재화하고, 항원-항체 상호작용을 형광 염료, 효소, 방사성 활성요소 또는 콜로이드성 금과 같은 마커에 의해 가시화하여, 조직 섹션에서 상기 언급된 바와 같은 암을 검출, 진단 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다.
단클론 항체 기술의 진보는 인간 종양의 현대적인 정확한 미시적 진단에서 면역조직화학의 위치를 확인하는데 매우 중요하다. 면역조직화학에 의한 산재된 종양적으로 형질전환된 세포들의 확인은 암 침범 및 전이뿐 아니라 면역표현형을 수반하는 암 세포의 악성 증가로 향한 변화를 보이는 더욱 선명한 영상을 가능하게 한다. 미래의 항신생물 치료 접근은 각 개별 환자의 신생물 질환에 수반되는 특정 면역표현형 패턴에 특이적인 다양한 개별적 면역 치료를 포함할 수 있다. 추가적 논의는 예컨대, Bodey B, The significance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms, Expert Opin Biol Ther. 2002 Apr; 2(4):371-93 참조.
본 발명의 각 측면의 바람직한 특징은 다른 측면의 각각에 대해 준용된다. 여기에 언급된 선행 문헌은 법에서 허용되는 전체 범위까지 포함된다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 설명된다.
실시예 1: 액체 크로마토그라피 -질량 분석(LC/MS)을 이용한 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암 및 피부암 조직 시료에 발현된 DLL3 의 확인
하기 프로토콜을 사용하여, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암 및 피부암 조직에서 추출된 막 단백질 및 상응하는 정상 또는 정상 주변 조직(NAT) 시료를 소화시키고 생성되는 펩티드를 탠덤 질량 분광기로 시퀀싱하였다.
1.1 물질 및 방법
1.1.1 원형질막 분획화
비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암 또는 피부암 또는 정상 또는 정상 주변 조직에서 수거한 세포를 균질화하고 1000 x g에서 원심분리하였다. 상등액을 취하고 49500 x g에서 초-원심분리하였다. 생성되는 펠렛을 다시 균질화하고 불연속 슈크로스 밀도 원심분리로 분리하였다. 107000 x g에서 초원심분리후, 상 경계(phase boundary)의 분획을 수거하고 펠렛화하였다.
1.1.2 원형질막 가용화
원형질막 분획을 SDS(소듐 도데실 설페이트)내에 재현탁하여 최종 0.5% SDS 농도, 원심분리 및 가용화된 추출 단백질을 수득하였다.
1.1.3 트립신분해
용액 내 소화를 위해, 50㎍ 단백질 용액의 부피를 200mM 암모늄바이카보네이트를 사용해 100㎕로 만들었다. 10㎕의 환원제 DL-디티오트레이톨(Dithiothreitol; 75mM)을 시료에 가하고, 80℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 이후 10㎕의 150mM 요오드아세타미드를 사용하여 시스테인 차단 단계를 시행하고, 실온에서 30분간 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 이후 초정제수를 추가하여 SDS 농도를 0.05%로 희석하였다. 2.75㎍의 단백질에 대해 1㎍의 트립신이 되도록 충분한 부피의 트립신(Promega V5111)을 혼합물에 가하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
또는 105㎍의 단백질 용액을 3㎕의 50mM TCEP을 사용하여 60℃에서 1시간 인큐베이션하여 환원시켰다. 이후 시료를 단백 소화 키트(Protein Discovery)의 FASP 여과 디바이스상에서 제조자 지시에 따라 가공하되, 암모늄 바이카보네이트 대신 트리에틸암모늄바이카보네이트를 사용하였다. 트립신 분해는 50㎍의 단백질에 대해 1㎍의 트립신을 사용하여, 최종 부피 75㎕에서 수행하였다.
1.1.4 펩티드 분획화
소화된 단백질 시료를 진공하 건조하고, 0.1% 수성 포름산에 재현탁하고, 트리플루오로아세트산(TFA)을 가하여 용액의 pH를 <3으로 감소시켰다. 펩티드를 아질런트 조박스 바이오-스트롱 양이온 교환 시리즈 II 칼럼을 사용하여 아질런트 LC1200 시리즈 액체 크로마토그라피 시스템 상에서 이온 교환으로 분리하였다. 또는 pI-기반 분리를 위해 아질런트 3100 OFFGEL 분획화 및 OFFGEL 키트 pH 3-10을 제조자 프로토콜에 따라 사용하였다. IPG 스트립을 재-수화한 후, 동일 부피의 막 소화물을 각 웰에 로딩하였다. 분리후, 생성되는 분획을 산성화하였다.
1.1.5 질량 분석
분획된 시료를 nanoACQUITY UPLC BEH 130 C18 칼럼, 75 ㎛ x 250mm(186003545) 및 LTQ Orbitrap Velos(Thermo Fisher Scientific)를 장착한 Waters nanoACQUITY UPLC 시스템을 사용하여 액체 크로마토그라피-질량 분석기로 분석하였다. 펩티드는 120분에 걸쳐 3%에서 35%까지 아세토니트릴 증강 구배 300nl/min로 용출하였다. Orbitrap내 400-2000 m/z 질량 범위에서 60000 해상력에서 풀-스캔 스펙트럼을 얻었다. 각 사이클에서, 기기상에 장착된 나노스프레이 이온 소스를 갖는 리니어 이온 트랩에서 CID MS/MS 스캔에 대해 20개의 가장 강력한 펩티드가 선택되었다.
1.1.6 펩티드의 아미노산 서열 분석
LTQ Orbitrap Velos에서 생성된 미가공 데이터를 모스 알고리즘(Curr Biol. 1993 Jun 1;3(6):327-3)을 사용하는 마스코트 소프트웨어(Matrix Science)를 통해 가공하여, 오염 단백질 서열과 함께 Ensembl (http://www.ensembl.org/index. html), IPI(www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) 및 SwissProt(http://www.uniprot. org)로 이루어진 서열 데이터베이스에 대해 검색하여, 피크 목록에서 아미노산 서열을 추론하였다. 펩티드 확인 기준은 트립신 소화, 2개 까지의 실종된(missed) 분해 부위 및 다양한 생물학적 및 화학적 변형(산화된 메티오닌, MMTS 또는 요오드아세타미드에 의한 시스테인 변형 및 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화)를 포함한다. 0.05% 이하의 기대값, 28 이상의 이온 스코어를 가지고 1로 랭크된 펩티드를 우리 OGAP 데이터베이스에 로딩하고, 여기에서 단백질 그룹으로 가공되었다.
1.1.7 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암 및 피부암 관련 단백질의 식별
DLL3 확인 과정은 공개된 인간 게놈 서열에서 코딩 엑손을 확인 및 조직하기 위해 자연 발생 인간 단백질의, 전술된 바와 같이 질량 분석기에 의해 실험적으로 수득된 펩티드 서열을 사용하였다. 이들 실험적으로 결정된 서열은 표 1에 나타내었으며, 이들은 국제 특허출원 WO2009/087462에 기재된 바와 같은 펩티드 매스, 펩티드 시그니쳐, EST 및 퍼블릭 도메인 게놈 서열 데이터의 가공 및 통합에 의해 편집된 OGAP®데이터베이스와 비교되었다. 표 1은 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암 및 피부암 조직 시료의 원형질막에서 LC/MS로 확인된 DLL3 특이적 펩티드를 나타낸 것이다.
서열번호 확인된 펩티드
서열번호:5 VCLKPGLSEEAAESPCALGAALSAR
서열번호:6 AGAWELR
서열번호:7 CEPPAVGTACTR
서열번호:8 AGCSPEHGFCEQPGECR
서열번호:9 SFECTCPR
서열번호:10 NGGLCLDLGHALR
서열번호:11 CSCALGFGGR
1.1.8 단백질 인덱스
단백질 인덱스는 단백질 우세 및 펩티드 풍부 양자의 척도이다. 알고리즘은 단백질이 관찰된 시료의 수 및 각 시료에서 관찰된 펩티드의 수 대 관찰가능한 펩티드의 수 양자를 고려한다. 생성값은 이후 상응하는 정상 시료 대 암 시료의 짝 비교에 의해 등급화된다.
1.2 결과
이 실험은 여기에 더 기재되는 바와 같이 DLL3를 확인하였다. 전장 DLL3가 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암 및 피부암 조직 시료의 원형질막에서 검출되었다. 표 2는 단백질 인덱스에 의해 측정된 DLL3의 발현 분포를 나타낸다. 이들 암 조직에서의 DLL3 발현은 DLL3가 이들 암에서 귀중한 치료적 및 진단적 타겟임을 나타낸다.
표 2. 단백질 인덱스(+++++ = 매우 높음; ++++ = 높음; +++ = 중간; ++ = 낮음; + = 매우 낮음; - = 관찰되지 않음)
조직 암 정상
비-소세포 폐 + -
췌장 + -
피부 + -
소세포 폐 + -
실시예 2: 유동 세포 분석에 의해 결정된 DLL3 에 대한 항체 특이성
DLL3에 대한 다클론 항체의 특이성을 DLL3-발현 세포주 내에서 유동 세포 분석을 수행하여 시험하였다.
물질 및 방법
항-DLL3 항체를 DLL3-발현 세포, SHP-77와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 버퍼(DPBS, 2% FBS)내에서 세척하고, 원심분리하고 100㎕의 희석 제1 SHP-77 항체(역시 FACS 버퍼에 희석) 내에 재현탁하였다. 항체-H322 복합체를 얼음상에서 60분간 인큐베이션한 후 전술한 바와 같이 FACS 버퍼로 2회 세척하였다. 세포-항체 펠렛을 100㎕의 희석 제2 항체(역시 FACS 버퍼에 희석) 내에 재현탁하고, 얼음상에서 60분간 인큐베이션하였다. 펠렛을 앞에서와 같이 세척하고, 200㎕의 FACS 버퍼에 재현탁하였다. 시료를 BD FACScanto II 유동 세포분석기에 로딩하고 BD FACSdiva 소프트웨어로 데이터를 분석하였다.
결과
유동 세포 분석결과는 항-SHP-77 다클론 항체가 효과적으로 세포-표면 인간 DLL3에 결합함을 입증하였다. 이 결과는 SHP-77 세포 상 DLL3에 대한 이들 항체의 강한 결합성을 나타낸다.
실시예 3: SHP -77 및 N82 세포에 의한 항- DLL3 다클론 항체의 내재화
항-DLL3 다클론 항체는 PabZAP 어세이를 사용하여 SHP-77(인간 소세포 폐암) 및 N82 세포에 결합하여 내재화되는 것으로 나타났다. PabZAP 항체는 제1 항체에 결합하였다. 다음, PabZAP 복합체가 세포에 의해 내재화되었다. 사포린의 세포내 입장은 단백질 합성 저해 및 종국적인 세포 치사를 초래하였다.
PabZAP 어세이는 하기와 같이 수행되었다. 각 세포는 웰당 5x103 세포 밀도로 씨딩되었다. 항-DLL3 다클론 항체 또는 이소형 대조 인간 IgG를 단계적으로 희석한 후 세포에 가하였다. 이후 PabZAP을 50㎍/ml의 농도로 가한 후 플레이트를 48 내지 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트의 세포 생육성을 CellTiter-Glo®Luminescent 세포 생육성 어세이 키트(Promega, G7571)로 검출하고, 플레이트를 490nM에서 루미노미터(Tuner Bio시스템, Sunnyvale, CA)로 판독하였다. 데이터를 Prism(Graphpad)으로 분석하였다 세포 치사는 항-DLL3 다클론 항체의 농도에 비례하였다.
결과는 항-DLL3 다클론 항체가 항-인간 IgG 이소형 대조 항체에 비해 SHP77(도 1a) 및 N82(도 1b)에 의해 효과적으로 내재화됨을 보여준다. 이 결과는 또한 항-DLL3 다클론 항체가 SHP77에서 1nmol/L에서 약 40% 세포 치사 및 N82에서 100nmol/L에서 25% 세포 치사를 유발함을 보여준다.
실시예 4: T 세포 활성화 및 DLL3 발현 세포의 특이적 용해
배경:
타겟이 BiTE 접근(타겟 세포 또는 조직 상의 특정 항원에 대한 결합 부위에 결합된 항-CD3 결합 에피토프를 결합한 이중 특이성 항체 단편)에 잘 따를 가능성이 있는지를 평가하기 위하여, 항-CD3 및 관심 타겟 항원에 특이적인 다클론 항체로 T 세포 활성화를 시험하는 어세이를 개발하였다.
방법:
이 어세이를 위해, 타겟 DLL3이 DMS79 세포에 발현된다. General Cell Membrane Labeling Catalog number PKH26GL에 대한 SIGMA PKH26 적색 형광 세포 링커 키트로, 15㎕의 염료를 0.5 ml의 버퍼 C(키트내 제공)내로 희석함으로써 세포를 채색하였다. DMS79 세포를 계수하고, 800 xg에서 원심분리하고, 무 혈청 배지내 0.5 ml 중 천만 세포로 재현탁하였다. 15㎕의 FKH26 염료를 함유하는 0.5 ml의 버퍼 C를 세포에 가하고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 1 내지 5분간 인큐베이션하였다. FBS 함유 배지를 가하여 염색을 중지시켰다. 세포를 위와 같이 원심분리하고, 어세이 배지(10% 초저 IgG FBS 함유 RPMI-Invitrogen catalog #16250078)내에 재현탁하고, 한번 더 원심분리하고, ml 당 200,000 세포로 어세이 배지내에 재현탁하였다. 10,000 세포(50㎕)를 96웰 평면바닥 조직배양 플레이트의 각 적합한 웰에 가하였다. 플레이트는 PBS 내 3㎍/ml의 염소 항-마우스 카파(Southern Biotech사, catalog # 1050-01)로 밤새 미리 코팅하였다. DMS69 세포를 가하기 전에 과량의 항체 용액을 플레이트에서 제거하였다. 인간 CD8+ T 세포(냉동)를 AllCell catalog number PB009-3F에서 구매하였다. 제조자 지시에 따라 T 세포를 해동하고 세척하였다. 세포를 어세이 배지내 ml 당 1,500,000 세포로 재현탁하였다. T 세포를 96 웰 항-카파 코팅된 플레이트 내 DMS79 세포에 웰 당 150,000 세포로 가하였다. DLL3 항체를 적합한 웰에 18 ㎍/ml, 6 ㎍/ml 또는 2 ㎍/ml으로 가하였다. 기능적 등급 항-CD3 클론 OKT3(eBioscience catalog number 16-0037-85)을 적합한 웰에 9㎍/ml, 3 ㎍/ml 또는 1 ㎍/ml으로 가하였다. 대조 웰에는 항체를 가하지 않았다. 플레이트를 2일간 5% CO2, 습윤 조직 배양 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
플레이트를 400 xg에서 5분간 원심분리하고, 세포를 FACS 버퍼(PBS + 5% FBS) 내에서 세척하고 다시 5분간 400 xg에서 원심분리하였다. 세포를 다시 FACS 버퍼 내에 재현탁하고 400 xg에서 원심분리하였다. 세포를 FACS 버퍼 각 웰당 200㎕로 재현탁하였다. 웰을 부드럽게 혼합하고 바로 Guava Easycyte 유동 세포 분석기 상에서 분석하였다. 적색 FKH26로 채색된 세포가 황색 채널 상에서 분석되었다. 각 웰에서 동일한 수의 총 세포를 수득하고 황색 내 세포(FKH26 채색 세포 게이트)를 계수하고 세포독성 퍼센트를 대조 웰 항-토끼, 항-CD3 또는 DLL3 다클론이 없는 T 세포 플러스 DMS79 세포에 대하여 산출하였다(평균 세포 계수는 동일 +/- 항-카파 항체 결합 플레이트).
결과:
도 2는 항-DLL3 다클론 항체에 의한 DMS69 세포의 특이적 용해 및 세포 치사가 항체 농도에 비례함을 보여준다. 따라서, 항-DLL3 다클론 항체는 CD3에 의한 활성화를 통해 T-세포 세포독성을 유도할 수 있다.
실시예 5: DLL3 에 대한 항체를 사용한 면역조직화학
하기 기준 프로토콜을 사용하여, FFPE 폐 종양 및 정상 조직 상에서 DLL3에 대한 다클론 항체를 사용하여 면역조직화학을 수행하였다.
5.1 물질 및 방법
5.1.1 물질
Citroclear (HC5005): TCS Biosciences, UK에서 입수.
시약 알콜(R8382): Sigma-Aldrich, UK에서 입수.
타겟 회수 용액, pH6(S2369): Dako, UK에서 입수.
REAL 퍼옥시다제 차단 용액 (S2023): Dako, UK에서 입수.
항체 희석제(S0809): Dako, UK에서 입수.
EnVision+ HRP-콘쥬게이트 폴리머, 마우스 (K4000): Dako, UK에서 입수.
액체 DAB+ 기질 (K3468):Dako, UK에서 입수.
Mayer's Hematoxylin (X0909): Dako, UK에서 입수.
Aquatex (1.08562.0050): VWR, UK에서 입수.
조직 섹션 및 어레이는 US Biomax Inc., MD, USA에서 입수하였다.
5.1.2 파라핀 제거 및 수화
슬라이드를 Citroclear 내에서 파라핀을 제거한 후(2 x 5분), 100% 알콜(2 x 5분), 50% 알콜(1 x 5분) 및 수도물(1 x 5분)로 수화시켰다.
5.1.3 항원 복구(가압 쿠커 )
DLL3 항원을 쿨핀 자내의 50ml 타겟 수거 용액에 20분간 가압하에서 수거하였다. 이후 슬라이드를 추가 20분간 두어 실온으로 냉각시켰다. 각 조직 섹션/TMA 주변을 소수성 배리어 펜으로 원을 그린 후 슬라이드를 PBS 내에서 2회 세척하였다(각 세척은 3분).
5.1.4 조직 염색
내인성 퍼옥시다제 활성은 습윤 챔버내에 실온에서 10분간 퍼옥시다제 차단 용액으로 조직을 인큐베이션함으로써 차단하였다. 이후 슬라이드를 PBS 내에 한번, PBS-T(Tween-20 함유 PBS, 0.125%v/v)내에서 한번, 각각 3분간 세척하였다. 제1 항체(항체 희석액내에서 1/160 희석)를 각 조직 섹션 및/또는 마이크로어레이에 가하고, 슬라이드를 습윤 챔버내에 실온에서 10분간 인큐베이션하였다. 이후 슬라이드를 PBS 내에 한번, PBS-T에서 한번, 각각 3분간 세척하였다. 이후 EnVision+ HRP-콘쥬게이트 폴리머를 조직에 적용하고 슬라이드를 습윤 챔버내에 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 이후 슬라이드를 PBS 내에 한번, PBS-T에서 한번, 각각 3분간 세척하였다. 이후 조직을 액체 DAB+기질 내에서 실온에서 10분간 습윤 챔버내에서 인큐베이션하였다. 이후 슬라이드를 PBS 내에 한번, PBS-T에서 한번 세척하고, 헤마톡실린으로 1분간 실온에서 습윤 챔버내에서 대비염색하고, 다시 PBS 내에 한번, PBS-T에서 한번, 각각 3분간 세척하였다. 이후 커버슬립을 Aquatex를 사용하여 슬라이드상에 장착하였다.
5.2 결과
항-DLL3 다클론 항체은 FFPE 폐 시료에서 양성을 보여주었으며, 여기에서 60%의 섹션들이 확고한(2+/3+) 염색을 나타내었다.
따라서 DLL3에 대한 항체는 시험된 암 및 가능하게는 DLL3 발현을 보이는 다른 암 형태에서 치료제 및 진단제로서 유용성을 가질 수 있다.
서열
Figure 112015088057356-pct00001
Figure 112015088057356-pct00002
Figure 112015088057356-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> Oxford BioTherapeutics Ltd <120> THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC TARGET <130> OB00134 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 618 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu 20 25 30 Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser 35 40 45 Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly 65 70 75 80 Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala 85 90 95 Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe 100 105 110 Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg 115 120 125 Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala 130 135 140 Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg 145 150 155 160 Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala 165 170 175 Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg 180 185 190 Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala 195 200 205 Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys 210 215 220 Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu 225 230 235 240 Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser 245 250 255 Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val 260 265 270 Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser 275 280 285 Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe 290 295 300 Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro 305 310 315 320 Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala 325 330 335 Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys 340 345 350 Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys 355 360 365 Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala 370 375 380 Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys 385 390 395 400 Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser 405 410 415 Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro 420 425 430 Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe 435 440 445 Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys 450 455 460 Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro 465 470 475 480 Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala 485 490 495 Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu 500 505 510 Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu 515 520 525 Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu 530 535 540 Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser 545 550 555 560 Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val 565 570 575 Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Val Ala Thr Pro Leu Phe 580 585 590 Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala Gly Gln Arg Gln His Leu Leu Phe 595 600 605 Pro Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser Val Lys 610 615 <210> 2 <211> 587 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu 20 25 30 Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser 35 40 45 Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly 65 70 75 80 Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala 85 90 95 Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe 100 105 110 Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg 115 120 125 Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala 130 135 140 Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg 145 150 155 160 Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala 165 170 175 Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg 180 185 190 Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala 195 200 205 Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys 210 215 220 Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu 225 230 235 240 Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser 245 250 255 Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val 260 265 270 Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser 275 280 285 Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe 290 295 300 Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro 305 310 315 320 Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala 325 330 335 Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys 340 345 350 Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys 355 360 365 Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala 370 375 380 Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys 385 390 395 400 Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser 405 410 415 Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro 420 425 430 Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe 435 440 445 Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys 450 455 460 Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro 465 470 475 480 Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala 485 490 495 Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu 500 505 510 Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu 515 520 525 Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu 530 535 540 Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser 545 550 555 560 Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val 565 570 575 Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala 580 585 <210> 3 <211> 2389 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agatataagg cttggaagcc agcagctgcg actcccgaga cccccccacc agaaggccat 60 ggtctcccca cggatgtccg ggctcctctc ccagactgtg atcctagcgc tcattttcct 120 cccccagaca cggcccgctg gcgtcttcga gctgcagatc cactctttcg ggccgggtcc 180 aggccctggg gccccgcggt ccccctgcag cgcccggctc ccctgccgcc tcttcttcag 240 agtctgcctg aagcctgggc tctcagagga ggccgccgag tccccgtgcg ccctgggcgc 300 ggcgctgagt gcgcgcggac cggtctacac cgagcagccc ggagcgcccg cgcctgatct 360 cccactgccc gacggcctct tgcaggtgcc cttccgggac gcctggcctg gcaccttctc 420 tttcatcatc gaaacctgga gagaggagtt aggagaccag attggagggc ccgcctggag 480 cctgctggcg cgcgtggctg gcaggcggcg cttggcagcc ggaggcccgt gggcccggga 540 cattcagcgc gcaggcgcct gggagctgcg cttctcgtac cgcgcgcgct gcgagccgcc 600 tgccgtcggg accgcgtgca cgcgcctctg ccgtccgcgc agcgccccct cgcggtgcgg 660 tccgggactg cgcccctgcg caccgctcga ggacgaatgt gaggcgccgc tggtgtgccg 720 agcaggctgc agccctgagc atggcttctg tgaacagccc ggtgaatgcc gatgcctaga 780 gggctggact ggacccctct gcacggtccc tgtctccacc agcagctgcc tcagccccag 840 gggcccgtcc tctgctacca ccggatgcct tgtccctggg cctgggccct gtgacgggaa 900 cccgtgtgcc aatggaggca gctgtagtga gacacccagg tcctttgaat gcacctgccc 960 gcgtgggttc tacgggctgc ggtgtgaggt gagcggggtg acatgtgcag atggaccctg 1020 cttcaacggc ggcttgtgtg tcgggggtgc agaccctgac tctgcctaca tctgccactg 1080 cccacccggt ttccaaggct ccaactgtga gaagagggtg gaccggtgca gcctgcagcc 1140 atgccgcaat ggcggactct gcctggacct gggccacgcc ctgcgctgcc gctgccgcgc 1200 cggcttcgcg ggtcctcgct gcgagcacga cctggacgac tgcgcgggcc gcgcctgcgc 1260 taacggcggc acgtgtgtgg agggcggcgg cgcgcaccgc tgctcctgcg cgctgggctt 1320 cggcggccgc gactgccgcg agcgcgcgga cccgtgcgcc gcgcgcccct gtgctcacgg 1380 cggccgctgc tacgcccact tctccggcct cgtctgcgct tgcgctcccg gctacatggg 1440 agcgcggtgt gagttcccag tgcaccccga cggcgcaagc gccttgcccg cggccccgcc 1500 gggcctcagg cccggggacc ctcagcgcta ccttttgcct ccggctctgg gactgctcgt 1560 ggccgcgggc gtggccggcg ctgcgctctt gctggtccac gtgcgccgcc gtggccactc 1620 ccaggatgct gggtctcgct tgctggctgg gaccccggag ccgtcagtcc acgcactccc 1680 ggatgcactc aacaacctaa ggacgcagga gggttccggg gatggtccga gctcgtccgt 1740 agattggaat cgccctgaag atgtagaccc tcaagggatt tatgtcatat ctgctccttc 1800 catctacgct cgggaggtag cgacgcccct tttccccccg ctacacactg ggcgcgctgg 1860 gcagaggcag cacctgcttt ttccctaccc ttcctcgatt ctgtccgtga aatgaattgg 1920 gtagagtctc tggaaggttt taagcccatt ttcagttcta acttactttc atcctatttt 1980 gcatccctct tatcgttttg agctacctgc catcttctct ttgaaaaacc tatgggcttg 2040 aggaggtcac gatgccgact ccgccagagc ttttccactg attgtactca gcggggaggc 2100 aggggaggca gaggggcagc ctctctaatg cttcctactc attttgtttc taggcctgac 2160 gcgtctcctc catccgcacc tggagtcaga gcgtggattt ttgtatttgc tcggtggtgc 2220 ccagtctctg ccccagaggc tttggagttc aatcttgaag gggtgtctgg gggaacttta 2280 ctgttgcaag ttgtaaataa tggttattta tatcctattt tttctcaccc catctctcta 2340 gaaacaccta taaaggctat tattgtgatc agttttgact aacaaaaaa 2389 <210> 4 <211> 2052 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agatataagg cttggaagcc agcagctgcg actcccgaga cccccccacc agaaggccat 60 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aatggaggca gctgtagtga gacacccagg tcctttgaat gcacctgccc 960 gcgtgggttc tacgggctgc ggtgtgaggt gagcggggtg acatgtgcag atggaccctg 1020 cttcaacggc ggcttgtgtg tcgggggtgc agaccctgac tctgcctaca tctgccactg 1080 cccacccggt ttccaaggct ccaactgtga gaagagggtg gaccggtgca gcctgcagcc 1140 atgccgcaat ggcggactct gcctggacct gggccacgcc ctgcgctgcc gctgccgcgc 1200 cggcttcgcg ggtcctcgct gcgagcacga cctggacgac tgcgcgggcc gcgcctgcgc 1260 taacggcggc acgtgtgtgg agggcggcgg cgcgcaccgc tgctcctgcg cgctgggctt 1320 cggcggccgc gactgccgcg agcgcgcgga cccgtgcgcc gcgcgcccct gtgctcacgg 1380 cggccgctgc tacgcccact tctccggcct cgtctgcgct tgcgctcccg gctacatggg 1440 agcgcggtgt gagttcccag tgcaccccga cggcgcaagc gccttgcccg cggccccgcc 1500 gggcctcagg cccggggacc ctcagcgcta ccttttgcct ccggctctgg gactgctcgt 1560 ggccgcgggc gtggccggcg ctgcgctctt gctggtccac gtgcgccgcc gtggccactc 1620 ccaggatgct gggtctcgct tgctggctgg gaccccggag ccgtcagtcc acgcactccc 1680 ggatgcactc aacaacctaa ggacgcagga gggttccggg gatggtccga gctcgtccgt 1740 agattggaat cgccctgaag atgtagaccc tcaagggatt tatgtcatat ctgctccttc 1800 catctacgct cgggaggcct gacgcgtctc ctccatccgc acctggagtc agagcgtgga 1860 tttttgtatt tgctcggtgg tgcccagtct ctgccccaga ggctttggag ttcaatcttg 1920 aaggggtgtc tgggggaact ttactgttgc aagttgtaaa taatggttat ttatatccta 1980 ttttttctca ccccatctct ctagaaacac ctataaaggc tattattgtg atcagttttg 2040 actaacaaaa aa 2052 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg 20 25 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys 1 5 10 15 Arg <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg 1 5 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 10 15 Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu 20 25 30 Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu 35 40 45 Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr 50 55 60 Thr Glu Gln Pro Gly Ala Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly 65 70 75 80 Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro 100 105 110 Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu 130 135 140 Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala 145 150 155 160 Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro 165 170 175 Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu 180 185 190 Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro 195 200 205 Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val 210 215 220 Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro 245 250 255 Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys 260 265 270 Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val 275 280 285 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly 290 295 300 Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln 305 310 315 320 Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys 325 330 335 Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg 340 345 350 Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp 355 360 365 Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly 370 375 380 Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys 385 390 395 400 Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly 405 410 415 Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly 420 425 430 Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser 435 440 445 Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg 450 455 460 Tyr Leu 465

Claims (28)

  1. DLL3 및 CD3에 결합하는 이중 특이성 항체의 치료적 유효량을 포함하는, DLL3이 발현되는 폐암의 치료 또는 예방용 약제.
  2. 제1항에 있어서, 암이 소세포 폐암인 약제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 특이성 항체가 암 세포의 아폽토시스를 유도하고, 암 줄기 세포를 사멸하거나 그 수를 감소시키고/거나 순환 암 세포를 사멸하거나 그 수를 감소시키는 약제.
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