EA034182B1 - Способ лечения рака с использованием биспецифических антител против cd3*dll3 - Google Patents

Способ лечения рака с использованием биспецифических антител против cd3*dll3 Download PDF

Info

Publication number
EA034182B1
EA034182B1 EA201500835A EA201500835A EA034182B1 EA 034182 B1 EA034182 B1 EA 034182B1 EA 201500835 A EA201500835 A EA 201500835A EA 201500835 A EA201500835 A EA 201500835A EA 034182 B1 EA034182 B1 EA 034182B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
dll3
antibodies
protein
antibody
cancer
Prior art date
Application number
EA201500835A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201500835A1 (ru
Inventor
Линдси Джейн Хадсон
Original Assignee
Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47998983&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA034182(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх filed Critical Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх
Publication of EA201500835A1 publication Critical patent/EA201500835A1/ru
Publication of EA034182B1 publication Critical patent/EA034182B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1054—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу лечения рака, такого как рак легких, рак поджелудочной железы и рак кожи, который включает введение субъекту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества биспецифического антитела, которое связывается с DLL3* CD3.

Description

Представленное изобретение касается способа лечения рака. Для этого предварительно идентифицировали мембранный белок, связанный с раком, например раком легких, раком поджелудочной железы и/или раком кожи, который применяется в качестве терапевтической мишени для лечения рака или в качестве маркера рака. В частности, белок представляет собой биологическую мишень, против которой могут быть сделаны аффинные реагенты, в том числе терапевтические антитела. Изобретение также касается применения таких реагентов для лечения рака.
Предпосылки создания изобретения
Основными проблемами в лечении рака, такого как рак легких, рак поджелудочной железы и рак кожи, являются улучшение уровня раннего обнаружения, открытие новых неинвазивных маркеров, которые могут быть использованы для отслеживания прогрессирования заболевания и идентификации рецидива, и нахождение более эффективных и менее токсичных методов лечения, особенно для более поздних стадий заболевания, когда 5-летняя выживаемость до сих пор является низкой. Существует большая потребность в идентификации мишеней, которые являются более специфичными для раковых клеток, например, тех, которые экспрессируются на поверхности опухолевых клеток, таким образом, что они могут быть атакованы иммунотерапевтическими и целенаправленными токсинами.
Дельта-подобный белок 3 представляет собой мембранный белок I типа и является членом семейства дельта. Автор изобретения показал, что дельта-подобный белок 3 экспрессируется при раке, что дает основание предполагать, что лечение , направленное против дельта-подобного белка 3 у пациентов, в том числе у пациентов с раком, будет производить терапевтический эффект.
Сущность изобретения
Дельта-подобный белок 3 (DLL3) был обнаружен в мембранных экстрактах различных, пораженных болезнью тканей, например, раком легких, раком поджелудочной железы и раком кожи, далее в данном документе называемых как заболевания согласно изобретению.
Дифференциальная экспрессия DLL3 при различных раковых заболеваниях позволяет белку быть мишенью используемого антитела при терапии таких видов рака. Таким образом, DLL3 может быть использован для генерации антител, которые специфически связываются с эпитопами в пределах DLL3, и являться мишенями таких реагентов для лечения. Антитела, которые нацелены на поверхностный клеточный белок раковых клеток, могут быть использованы в лечении рака с помощью различных механизмов, в том числе (i) лизиса опосредованным комплементом или антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC), (ii) лизиса лекарственными средствами или токсином(ами), конъюгированными с такими аффинными реагентами, или (iii) ингибирования физиологической функции такого белка, который может управлять ростом раковых клеток, например, через сигнальные пути. Важным аспектом такого лечения является то, что нормальный профиль экспрессии белка-мишени, с точки зрения распределения в тканях и уровня экспрессии, является таким, что какое-либо нацеливание белка-мишени на нормальные ткани антителом не вызывает неблагоприятных побочных эффектов за счет связывания с нормальными тканями.
Изобретение предусматривает способ лечения рака, включающий введение субъекту, который нуждается в этом терапевтически эффективного количества биспецифического антитела, которое связывается с DLL3 и CD3, где указанный рак выбирают из группы, состоящей из рака легкого, рака поджелудочной железы и рака кожи.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный рак представляет собой мелкоклеточный рак легкого.
При этом биспецифическое антитело индуцирует апоптоз раковых клеток, уничтожает или уменьшает количество раковых стволовых клеток и/или уничтожает или уменьшает количество циркулирующих опухолевых клеток.
Присутствие DLL3 или его фрагментов может быть обнаружено с помощью аффинного реагента, который связывается с DLL3. Субъектом способа может быть человек.
Другие аспекты изобретения представлены ниже в данном документе и в формуле изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1а показывает интернализацию анти-ОВС3 поликлональных антител клетками SHP-77, используя PabZAP анализ;
фиг. 1b - интернализацию анти-DLL3 поликлональных антител клетками N82, используя PabZAP анализ;
фиг. 2 - специфический лизис DMS79 DLL3, эксприссирующий клетки путем активации Т клеток биспецифическими анти-DLL3-анти-CD3 поликлональными антителами.
Подробное описание изобретения
Изобретение, подробно описанное ниже, охватывает введение биспецифического антитела субъекту, например субъекту-млекопитающему, для лечения рака. Изобретение основывается на открытии того, что белок DLL3 экспрессируется при определенных видах рака. В частности, подтверждающие это данные содержатся в данном документе, которые демонстрируют экспрессию белка DLL3 в плазматической мембране рака легкого, рака поджелудочной железы и рака кожи. Поэтому антитела, нацеленные на
- 1 034182
DLL3, могут иметь применение как терапевтические средства при данных видах рака и других видах рака, демонстрирующих экспрессию DLL3.
Как используется в данном документе, термин субъект касается животного, предпочтительно млекопитающего. Субъектом-млекопитающим может быть не человекообразное млекопитающее, но, как правило, это человек, такой как взрослый человек.
Субъект вообще должен быть живым субъектом. Как используется в данном документе, термин пациент относится к субъекту, который имеет или предполагается, что имеет одно или несколько заболеваний согласно изобретению.
Как используется в данном документе, термин белок согласно изобретению касается дельтаподобного белка 3 (GeneID: 10683). Обнаружено, что данный белок дифференциально экспрессируется в различных видах рака, таким образом, он является новой мишенью для терапий данных видов рака. Человеческая последовательность белка DLL3 приводится как SEQ ID NO: 1. Термин DLL3 (в контексте белка) включает белки, чьи аминокислотные последовательности состоят из или содержат аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, или их производные или варианты, в частности, те, которые встречаются у человека.
Данный белок был идентифицирован в образцах экстрагированной раковой ткани мембранного белка от раковых пациентов, используя способы и устройства, описанные в примере 1 (например, используя жидкостную хроматографию-масс-спектроскопию экстрактов мембранного белка). Пептидные последовательности сравнивали с SWISS PROT и TrEMBL базами данных (held by Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) и European Bioinformatics Institute (EBI), которые являются доступными www.expasy.org) и идентифицировали вход Q9NYJ7, дельта-подобного белка 3 - DLL3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая данный белок, найден под номером доступа NM_016941, как приведено в SEQ ID NO: 3.
В соответствии с SWISS-PROT, дельта-подобный белок 3 является мембранным белком типа I семейства дельта и состоит из одного домена DSL, шести EGF-подобных доменов, одной трансмембранной области и внеклеточного хвоста между аминокислотами 27-492 SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 12). Автор изобретения показал, что дельта-подобный белок 3 экспрессируется при раке, что дает основание предполагать, что терапия, направленная против дельта-подобного белка 3 у пациентов, в том числе у пациентов с раком, будет производить терапевтический эффект.
DLL3 содержит фрагменты, в частности эпитопсодержащие фрагменты, например, их антигенные или иммуногенные фрагменты и их производные, в частности фрагменты, содержащие внеклеточные домены (например, внеклеточные хвосты или петли) белка. Эпитопсодержащие фрагменты включают антигенные или иммуногенные фрагменты, как правило, длиной 12 аминокислот или больше, например 20 аминокислот или больше, например 50 или 100 аминокислот или больше. Фрагменты могут составлять 95% или больше от длины полного белка, например 90% или больше, например 75%, или 50%, или 25%, или 10% или больше от длины полного белка.
Альтернативно, белок/полипептид, рассматриваемый в данном документе, может быть ограничен теми белками/полипептидами, в частности, перечисленными/описанными в представленном описании, или вариантом или производным, которое имеет по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность аминокислотной последовательности. Процентная идентичность аминокислотной последовательности может быть определена с помощью какого-либо приемлемого алгоритма, например BLAST, CLUSTAL, используя соответствующие параметры по умолчанию.
Таким образом, термин DLL3 в контексте белка или полипептида касается белка, чья аминокислотная последовательность состоит из или содержит аминокислотную последовательность, приведенную в какой-либо из SEQ ID NO: 1 или 2, или ее производное или вариант, который по меньшей мере на 90 или 95% идентичен последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, и который имеет, по существу, такое же распределение в ткани, как DLL3.
В контексте нуклеиновой кислоты термин DLL3 касается нуклеиновой кислоты, чья нуклеотидная последовательность кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или 2, или ее производное или вариант, который по меньшей мере на 90 или 95% идентичен последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, и который имеет, по существу, такое же распределение в ткани, как у белка DLL3.
Термин DLL3 в контексте нуклеиновой кислоты также касается нуклеиновой кислоты, чья нуклеотидная последовательность содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3 или 4, или ее производное или вариант, который по меньшей мере на 90 или 95% идентичен последовательности SEQ ID NO: 3 или 4, и которая кодирует белок, который имеет, по существу, такое же распределение в ткани, как у белка DLL3.
Эпитопсодержащие фрагменты DLL3, включающие антигенные или иммуногенные фрагменты, способны вызывать соответствующий иммунный ответ у пациента. ДНК, кодирующая DLL3, также подходит, поскольку содержит фрагменты, например фрагменты ДНК, кодирующие иммуногенные фрагменты DLL3. Фрагменты нуклеиновой кислоты (например, ДНК), кодирующие DLL3, могут составлять 95% или более от длины полной кодирующей области, например 90% или более, например 75%, или
- 2 034182
50%, или 25%, или 10% или более от длины полной кодирующей области. Фрагменты нуклеиновой кислоты (например ДНК) могут составлять в длину 36 нуклеотидов или более, например 60 нуклеотидов или более, например 150 или 300 нуклеотидов или более.
Производные DLL3 включают варианты последовательности, в которой были сделаны одна или более (например, 1-20) от количества аминокислот на основе общей длины белка делеций, вставок или замен. Замены, как правило, могут быть консервативными заменами. Производные, как правило, имеют, по существу, такую же биологическую функцию, как у белка, из которого они получены. Производные, как правило, сравнительно антигенны или иммуногенны к белку, из которого они получены. Производные, как правило, будут иметь или лиганд-связывающую активность, или способность к образованию комплекса с активным рецептором, или предпочтительно обе, как у белка, из которого они получены. Производные и варианты, как правило, будут иметь такое же распределение в ткани, как DLL3.
Производные белков также включают химически обработанные белки, такие как карбоксиметилированные, карбоксиамидированные, ацетилированные белки, например, обработанные в процессе очистки.
Применение в клинических исследованиях.
Диагностические способы и композиции для обнаружения DLL3 помогают в мониторинге клинического исследования, например, чтобы оценить пригодность лекарственного средства для терапии заболеваний. Молекулы-кандидаты испытывали на их способность восстанавливать уровни DLL3 у субъекта, имеющего, например, заболевания согласно изобретению, до уровней, найденных у субъектов, не имеющих заболевания согласно изобретению, или в лечении субъекта, чтобы сохранить уровни DLL3 такие же или близкие по значению, как у субъектов без рака легкого, без рака поджелудочной железы или без рака кожи.
Их используют для отбора кандидатов для клинического исследования, чтобы идентифицировать, индивидуумы имеющие, например, заболевания согласно изобретению; такие индивидуумы потом могут быть исключены из исследования или могут быть выделены в отдельную когорту для лечения или анализа.
Получение белка DLL3, а также соответствующей нуклеиновой кислоты.
ДНК, кодирующая DLL3, может быть получена путем выделения, как кДНК фрагмент из кДНК библиотек, используя в качестве исходных материалов коммерческие мРНК, и определение и идентификацию их нуклеотидных последовательностей. Другими словами, в частности, клоны случайно выделяют из кДНК библиотек, которые получают в соответствии со способами Ohara et al. (DNA Research Vol.4, 53-59 (1997)). Далее путем гибридизации дублированные клоны (которые регулярно появляются) удаляют и потом осуществляют транскрипцию и трансляцию in vitro. Кроме того, базы данных известных генов для установления гомологичности применяют терминальные нуклеотидные последовательности.
В дополнение к описанным выше способам скрининга 5' и 3' терминальные последовательности кДНК сопоставляют с последовательностями генома человека. Затем неизвестный ген с длинной цепью определяют в области между последовательностями и анализируют полную длину кДНК. Таким образом, неизвестный ген, который не может быть получен с использованием обычного способа клонирования, может быть систематически клонирован.
Кроме того, все области генсодержащей ДНК человеческого происхождения также могут быть получены с использованием метода ПЦР, такого как RACE, уделяя достаточное внимание предотвращению появления искусственных ошибок в коротких фрагментах или полученных последовательностях. Могут быть получены клоны, имеющие целевую ДНК.
Синтетический праймер ДНК, имеющий соответствующую нуклеотидную последовательность части полипептида, может быть получен с последующей амплификацией согласно способу ПЦР, используя соответствующую библиотеку. Альтернативно, выбор может быть выполнен путем гибридизации ДНК с ДНК, которая была встроена в соответствующий вектор, меченный ДНК фрагментом или синтетической ДНК, кодирующей некоторые или все области полипептида. Гибридизация может быть выполнена, например, согласно способу, описанному в Current Protocols in Molecular Biology (под ред. Frederick M. Ausubel et al., 1987). ДНК может быть любой ДНК при условии, что она содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие нужные полипептиды. Такие ДНК могут представлять собой кДНК, идентифицированную и выделенную из кДНК библиотек, которые получены из ткани легкого, поджелудочной железы и кожи. Такая ДНК, кроме того, может быть синтетической ДНК. Векторы для использования в конструкции библиотеки могут быть бактериофагами, плазмидами, космидами, фагмидами, или пр. Кроме того, при использовании фракции общей РНК или фракции мРНК, полученной из вышеуказанных клеток и/или тканей, амплификация может быть выполнена путем прямой обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией (далее в данном документе сокращается как ОТ-ПЦР способ).
ДНК, кодирующая указанный выше полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, которая, по существу, является идентичной аминокислотной последовательности DLL3, или ДНК, кодирующая указанный выше полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности DLL3 путем делеции, замены или вставки одной или больше
- 3 034182 аминокислот, составляющих часть аминокислотной последовательности, может быть легко получена путем соответствующей комбинации, например способа сайт-направленного мутагенеза, способа генгомологичной рекомбинации, способа удлинения праймера и способа ПЦР. Кроме того, на данный момент, возможный способ получения полипептида, для того чтобы иметь, по существу, эквивалентную биологическую активность, представляет собой замену гомологичных аминокислот (например, полярных и неполярных аминокислот, гидрофобных и гидрофильных аминокислот, положительно заряженных и отрицательно заряженных аминокислот и ароматических аминокислот) среди аминокислот, составляющих полипептид. Кроме того, для поддержания, по существу, эквивалентной биологической активности аминокислоты в пределах функциональных доменов, содержащихся в полипептиде, предпочтительно сохраняются.
Кроме того, примеры ДНК включают ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность DLL3, и гибридизацию ДНК в жестких условиях для получения ДНК, кодирующей полипептид (белок), имеющий биологическую активность (функцию), эквивалентную активности полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности DLL3. Пример такой ДНК, способной к гибридизации, представляет собой ДНК, которая включает нуклеотидную последовательность, которая имеет степень общей средней гомологии со всей нуклеотидной последовательностью ДНК, такую как приблизительно 80% или более, предпочтительно приблизительно 90% или более и более предпочтительно приблизительно 95% или более. Г ибридизация может быть выполнена в соответствии со способом, известным в данной области уровня техники, таким как, способ описанный в Current Protocols in Molecular Biology (под ред. Frederick M. Ausubel et al., 1987). В данном документе жесткие условия представляют собой, например, условия, приблизительно 1*SSC, 0,1% SDS и 37°С, более жесткие условия приблизительно 0,5*SSC, 0,1% SDS и 42°С или еще более жесткие условия приблизительно 0,2*SSC, 0,1% SDS и 65°С. Указанные выше комбинации SSC, SDS и температурные условия приведены в иллюстративных целях. Жесткость, аналогичная приведенной выше, может быть достигнута квалифицированным специалистом в данной области с использованием соответствующей комбинации перечисленных выше факторов или других факторов (например, концентрация зонда, длина зонда и время реакции гибридизации) для определения жесткости гибридизации.
Клонированную ДНК можно непосредственно использовать или использовать, при необходимости, после расщепления ферментом рестрикции или добавления линкера в зависимости от целей. ДНК может иметь ATG как кодон инициации трансляции на 5' терминальном конце, и может иметь ТАА, TGA или TAG как кодон терминации трансляции на 3' терминальном конце. Данный кодон инициации трансляции и кодон терминации трансляции также могут быть добавлены, используя соответствующий синтетический адаптер ДНК.
DLL3 может, например, быть в изолированной форме, при которой DLL3 полипептид был очищен, по меньшей мере, до некоторой степени. DLL3 полипептид может быть в практически чистом виде, т.е. свободный, в значительной степени, от других белков. DLL3 полипептид также может быть получен, используя рекомбинантные способы, синтетические способы или путем комбинации данных способов. DLL3 может быть легко получен согласно какому-либо способу, известному квалифицированному специалисту в данной области уровня техники, который включает получение вектора экспрессии, содержащего соответствующую ДНК, или ДНК, содержащей ген, культивирование трансформанта, трансформированного с использованием вектора экспрессии, генерирование и накопление соответствующего полипептида или рекомбинантного белка, содержащего полипептид, и потом сбор полученного в результате белка.
Рекомбинантный полипептид DLL3 может быть получен согласно способам, хорошо известным в данной области уровня техники, т.е. из генетически модифицированных клеток-хозяев, которые включают системы экспрессии. Для получения рекомбинантного DLL3 полипептида, клетки-хозяева могут быть генетически модифицированы, для введения систем экспрессии или их частей . Такое введение может быть осуществлено с использованием способов, хорошо известных в данной области уровня техники, таких как кальцийфосфатная трансфекция, DEAD-декстран опосредованная трансфекция, трансвекция, микроинъекция, катионная липид-опосредованная трансфекция, электропорация, трансдукция, введение при соскабливании, баллистическое введение или инфекция (см., например Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986 and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbour laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989).
Как клетки-хозяева используют, например, бактерии рода Escherichia, Streptococci, Staphylococci, Streptomyces, бактерии рода Bacillus, дрожжи, клетки Aspergillus, клетки насекомых, насекомые и клетки животных. Конкретные примеры бактерий рода Escherichia, которые используют в данном документе, включают Escherichia coli K12 и DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 517 (1978)), и НВ101 (Journal of Molecular Biology, Vol. 41, 459 (1969)). Из бактерий рода Bacillus используют, например, Bacillus subtilis MI114 (Gene, Vol. 24, 255 (1983)) и 207-21 (Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (1984)). Из дрожжей используют, например, Saccaromyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, и 20В-12,
- 4 034182
Schizosaccaromyces pombe NCYC1913 и NCYC2036 и Pichia pastoris. Из клеток насекомых используют, например, клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9. Из клеток животных используют, например, клетки COS-7 и клетки обезьяны Vero, клетки китайского хомячка СНО (далее в данном документе сокращается как клетки СНО), dhfr-ген-дефицитные клетки СНО, клетки мыши L, клетки мыши AtT-20, клетки мышиной миеломы, клетки крысы GH3, клетки человека FL, COS, HeLa, С127, 3Т3, HEK 293, BHK и клетки меланомы Боуэса.
Бесклеточные трансляционные системы также могут быть использованы для получения рекомбинантных полипептидов (например, лизат ретикулоцитов кролика, лизат зародышей пшеницы, SP6/T7 in vitro Т&Т и RTS 100 Е. Coli HY транскрипционные и трансляционные наборы от Roche Diagnostics Ltd., Lewes, UK и TNT быстро сочетаемая транскрипционная/трансляционная система от Promega UK, Southampton, UK).
Вектор экспрессии может быть получен в соответствии со способом, известным в данной области с уровня техники. Например, вектор может быть получен путем (1) вырезания ДНК фрагмента, содержащего ДНК, или ДНК, содержащей ген, и (2) сшивки ДНК фрагмента по ходу транскрипции промотора в соответствующем векторе экспрессии. Может быть использовано широкое разнообразие систем экспрессии, таких как и без ограничения, хромосомная, эписомальная и полученная из вируса система, например плазмиды, полученные из Escherichia coli (например pBR322, pBR325, pUC18 и pUC118), плазмиды, полученные из Bacillus subtilis (например, pUB110, pTP5 и рС194), из бактериофага, из транспозонов, из дрожжевых эписом (например, pSH19 и pSH15), из элементов вставки, из дрожжевых хромосомных элементов, из вируса, такого как бакуловирус, паповавирус, такой как SV40, вирус осповакцины, аденовирус, вируса птичьей оспы, вирус псевдобешенства и ретровирус, и векторов, полученных из их комбинаций, таких как те, что получены из плазмиды и бактериофага (такого как [лямбда] фаг), генетических элементов, таких как космиды и фагмиды. Системы экспрессии могут содержать контрольные области, которые регулируют, а также обеспечивают экспрессию. Промоторы могут представлять собой любые промоторы при условии, что они являются подходящими для хозяев, которые будут использоваться для генной экспрессии. Например, когда хозяин представляет собой Escherichia coli, предпочтительными являются trp промотор, lac промотор, recA промотор, pL промотор, lpp промотор, и т.д. Когда хозяин представляет собой Bacillus subtilis, предпочтительными являются SPO1 промотор, SPO2 промотор, penP промотор и т.д. Когда хозяин представляет собой дрожжи, предпочтительными являются РНО5 промотор, PGK промотор, GAP промотор, ADH промотор и т.д. Когда животную клетку используют как хозяин, примеры промоторов для использования в данном случае включают SRa промотор, SV40 промотор, LTR промотор, CMV промотор и HSV-TK промотор. Как правило, могут использовать любую систему или вектор, который способен поддерживать, репродуцировать или экспрессировать нуклеиновую кислоту, чтобы получить полипептид в хозяине.
Соответствующая последовательность нуклеиновой кислоты может быть встроена в систему экспрессии согласно любому хорошо известному и рутинному способу, такому, как описан в Sambrook et al. выше. Соответствующие сигналы секреции могут быть введены в DLL3 полипептид, чтобы дать секрецию транслируемого белка в просвет эндоплазматического ретикулума, периплазматическое пространство или внеклеточную среду. Данные сигналы могут быть эндогенными к полипептиду DLL3, или они могут быть гетерологичными сигналами. Трансформация клеток-хозяев может быть выполнена в соответствии со способами, известными в данной области уровня техники. Например, на следующие документы может быть сделана ссылка: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 69, 2110 (1972); Gene, Vol. 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979); Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), Vol. 75, 1929 (1978); Cell Technology, separate volume 8, New Cell Technology, Experimental Protocol. 263-267 (1995) (issued by Shujunsha); and Virology, Vol. 52, 456 (1973). Таким образом, полученный трансформант, трансформированный с вектором экспрессии, содержащим ДНК , или ДНК, содержащей ген, могут культивировать в соответствии со способом, известным в данной области уровня техники. Например, когда хозяевами являются бактерии рода Escherichia, бактерии, как правило, культивируют приблизительно от 15 до 43 °С в течение приблизительно 3-24 ч. При необходимости, также может быть осуществлена аэрация или перемешивание. Когда хозяевами являются бактерии рода Bacillus, то бактерии, как правило, культивируют приблизительно от 30 до 40°С в течение приблизительно 6-24 ч. При необходимости, также может быть осуществлена аэрация или перемешивание. Когда трансформанты, хозяевами которых являются дрожжи, культивируют, то культивирование, как правило, осуществляют приблизительно от 20 до 35°С в течение приблизительно 24-72 ч, используя среды с регулируемым рН от 5 до 8. При необходимости, также может быть осуществлена аэрация или перемешивание. Когда трансформанты, хозяевами которых являются клетки животных, то клетки, как правило, культивируют приблизительно от 30 до 40°С в течение приблизительно 15-60 ч, используя среды с регулируемым рН от 6 до 8. При необходимости, также может быть добавлена аэрация или перемешивание.
Если полипептид DLL3 должен экспрессироваться для использования в скрининговых анализах на основе клеток, предпочтительным является то, что полипептид продуцируется на поверхности клетки. В
- 5 034182 этом случае клетки могут быть собраны перед использованием в скрининг-анализе. Если полипептид DLL3 секретируется в среду, среда может быть восстановлена для того, чтобы выделить указанный полипептид. Если он продуцируется внутриклеточно, клетки сначала необходимо лизировать перед тем, как выделить полипептид DLL3.
DLL3 полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур или из других биологических источников с помощью хорошо известных способов, включающих, осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анион- или катионобменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию с гидрофобными взаимодействиями, хроматографию с гидроксилаппатитом, молекулярную просеивающую хроматографию, способы центрифугирования, способы электрофореза и лектиновую хроматографию. Можно применять комбинацию данных способов. Для того чтобы выделить и очистить полипептид или белок от продуктов культуральной среды, например, после того, как культуру, микробные тела или клетки собирают с помощью известного способа, их суспендируют в соответствующем буфере, микробные тела или клетки разрушают, например, действием ультразвуковых волн, лизоцимами и/или замораживаниемоттаиванием, полученный в результате продукт затем подвергают центрифугированию или фильтрованию, а затем может быть получен сырой экстракт белка. Буфер может также содержать агент денатурации белка, такой как мочевина или гидрохлорид гуанидина, или поверхностно-активное вещество, такое как Triton X-100 (TM). Когда белок секретируется в культуральной среде, микробные тела или клетки и супернатант разделяют с помощью известного способа после завершения культивирования, и затем собирают супернатант. Белок, содержащийся в полученном культуральном супернатанте или экстракте, может быть очищен с помощью соответствующей комбинации известных способов разделения и очистки. Таким образом, полученный полипептид (белок) может быть превращен в соль известным способом. И наоборот, когда полипептид (белок) получают в виде соли, его можно превратить в свободный белок, или пептид, или другую соль согласно известному способу или способу в соответствии с ним. Больше того, трипсин или химотрипсин можно использовать для воздействия на белок, получаемый по рекомбинантным способам, до или после очистки для его расщепления. Присутствие полипептида (белка) или его соли может быть измерено с помощью различных анализов связывания, ферментных иммунологических анализов, используя специфические антитела и т.д.
Способы, хорошо известные в данной области уровня техники, могут быть использованы для повторной укладки, чтобы регенерировать нативную или активную конформацию полипептида DLL3, когда полипептид был денатурирован в процессе выделения и/или очистки. DLL3 полипептид может быть получен из биологического образца из какого-либо источника, такого как образец крови или образец ткани, например образец ткани легкого, поджелудочной железы и кожи.
DLL3 полипептид может быть в виде зрелого белка или может быть частью более крупного белка, такого как слитый белок. Часто предпочтительным является включать дополнительную аминокислотную последовательность, которая содержит секреторные или лидерные последовательности, последовательность пре-, про- или препробелка, или последовательность, которая помогает в очистке, например, такая как аффинная метка, например несколько остатков гистидина, FLAG метка, НА метка или myc-метка.
DLL3 может, например, быть слитым с гетерологичным партнером слияния, таким как поверхностный белок, известный как белок D из Haemophilus Influenza В, неструктурный белок из вируса гриппа, такой как NS1, S антиген из вируса гепатита В, или белок, известный как LYTA, такой как его Стерминальная часть.
Может быть использована дополнительная последовательность, которая обеспечивает его стабильность во время рекомбинантного продуцирования. Такие последовательности необязательно могут быть удалены, по мере необходимости, путем включения расщепляемой последовательности в качестве дополнительной последовательности или ее части. Таким образом, DLL3 полипептид может быть слит с другими фрагментами, включающими другие полипептиды или белки (например, глутатион Sтрансферазы и белок А). Такой слитый белок может быть расщеплен с помощью соответствующей протеазы. Такие дополнительные последовательности и аффинные метки хорошо известны в данной области уровня техники. В дополнение к указанному выше энхансер, сигнал сплайсинга, сигнал полиаденелирования, селективный маркер и точка начала репликации SV40 могут быть включены в вектор экспрессии, при необходимости.
Получение аффинных реагентов к DLL3.
В данной области существует три основных типа иммуноаффинного реагента - моноклональные антитела, фаговый дисплей антитела и малые молекулы, полученные из антитела, такие как Affibodies, доменные антитела (dAbs), Nanobodies, UniBodies, DARPins, антикалины, дуокалины, Avimers или Versabodies. Такие вещества способны к иммуноспецифическому связыванию с DLL3.
Получение антител к DLL3.
Согласно изобретению DLL3, аналог DLL3, DLL3-связанный белок или фрагмент или их производное могут быть использованы в качестве иммуногена для получения антител, которые иммуноспецифически связывают такой иммуноген. Такие иммуногены могут быть получены с помощью приемлемого способа, включающего способы, описанные выше. Термин антитело, как используется в данном доку
- 6 034182 менте, касается пептида или полипептида и, по существу, кодируемого с помощью гена иммуноглобулина или генов иммуноглобулина или их фрагментов, способных к специфическому связыванию антигена или эпитопа. См., например, Fundamental Immunology, 3rd Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Способы 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97. Термин антитело включает антигенсвязывающие части, т.е. сайты связывания антигена (например, фрагменты, субпоследовательности, области, определяющие комплементарность (CDRs)), которые сохраняют способность связывать антиген, в том числе (i) Fab фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и СН1 доменов; (ii) F(ab')2 фрагмент, бивалентный фрагмент, который включает два Fab фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, состоящий из VH и СН1 доменов; (iv) Fv фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела, (v) dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из VH домена; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). Одноцепочечные антитела также охватываются термином антитело. Антитела включают, но не ограничиваются этим, поликлональные, моноклональные, биспецифические, гумманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, Fab фрагменты и F(ab')2 фрагменты, фрагменты, продуцированные библиотекой Fab экспрессии, антиидиотипические (анти-Id) антитела, и эпитопсвязывающие фрагменты. Молекулы иммуноглобулина могут быть из какого-либо класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA, такие как IgG) или подкласса молекулы иммуноглобулина.
Термин специфически связывает или связывается специфически (или иммуноспецифически связывает) не предназначен для того, чтобы показать, что антитело связывается исключительно с предназначенной для него мишенью.
Скорее антитело специфически связывает, если его аффинность в отношении предназначенной для него мишени составляет, как правило, приблизительно в 5 раз большее значение по сравнению с его аффинностью к молекуле-немишени. Соответственно, не существует никакой значительной перекрестной реакции или перекрестного связывания с нежелательными веществами, особенно белками или тканями, встречающимися в природе, здорового человека или животного. Предпочтительно аффинность антитела будет по меньшей мере приблизительно в 5 раз, предпочтительно в 10 раз, более предпочтительно в 25 раз, еще более предпочтительно в 50 раз и наиболее предпочтительно в 100 раз или более больше по отношению к молекуле-мишени, чем его аффинность к молекуле-немишени. Специфическое связывание между антителом или другим агентом связывания и антигеном означает, что аффинность связывания составляет по меньшей мере 10 М-1. Антитела могут, например, связываться с аффинностью по меньшей мере приблизительно 10 М-1 и предпочтительно от приблизительно 108 до приблизительно 109 М-1, от приблизительно 109 до приблизительно 1010 М-1 или от приблизительно 1010 до приблизительно 1011 M-1.
Аффинность рассчитывают как Kd = koff/kon (koff - это константа скорости диссоциации, k^ - это константа скорости ассоциации и Kd - это константа равновесия). Аффинность может быть определена в равновесии путем измерения связанной фракции (r) меченого лиганда при различных концентрациях (с). Данные представлены в виде графика, используя уравнение Скэтчарда r/с = K(n-r), где r = моль связанного лиганда/моль рецептора при равновесии;
с = концентрация свободного лиганда при равновесии;
K = равновесная константа ассоциации и n = количество сайтов лигандного связывания на молекулу рецептора.
Согласно графическому анализу r/с наносят на ось Y против r по оси X, таким образом получая график Скэтчарда. Аффинность представляет собой отрицательный наклон линии. koff может быть определен путем конкуренции связанного меченого лиганда с немеченным избыточным лигандом (см., например, патент США № 6316409). Аффинность целенаправленного агента к его молекуле-мишени составляет, например, по меньшей мере приблизительно 1х10-6 моль/л, по меньшей мере приблизительно 1х10-7 моль/л, по меньшей мере приблизительно 1х10-8 моль/л, особенно по меньшей мере приблизительно 1 х 10-9 моль/л и, в частности, по меньшей мере приблизительно 1 х 10-10 моль/л. Измерение аффинности антитела по анализу Скэтчарда хорошо известно в данной области уровня техники, см., например, van Erp et al., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson and Griswold, Comput. Methods Программы Biomed. 27: 65-8, 1988.
Могут быть использованы какие-либо общедоступные антитела, которые распознают продукты из генов, кодирующих DLL3. Способы, известные квалифицированному специалисту в данной области уровня техники, используются для получения антител, которые распознают DLL3, аналог DLL3, DLL3связанный полипептид или фрагмент или производное. Квалифицированному специалисту в данной области известны многие процедуры для получения антител, например, как описано в Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y. Квалифицированному специалисту в данной области известно также, что фрагменты или Fab фрагменты, которые имитируют антитела, также могут быть получены из генетической информации с помощью раз
- 7 034182 личных процедур (Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C, ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992)).
Фрагменты DLL3 могут использоваться как иммуногены для получения антитела.
При производстве антител скрининг требуемого антитела может быть достигнут, используя способы, известные в данной области уровня техники, например, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ). Например, для выбора антител, которые распознают специфический домен DLL3, их могут анализировать с помощью гибридом, продуцирующих продукт, который связывается с DLL3 фрагментом, содержащим такой домен. Для выбора антитела, которое специфически связывает первый DLL3 гомолог, но который специфически не связывается со (или связывается менее активно) вторым DLL3 гомологом, используют определение положительного связывания с первым DLL3 гомологом и отсутствие связывания со (или уменьшенное связывание с) вторым DLL3 гомологом. Аналогично, для выбора антитела, которое специфически связывает DLL3, но специфически не связываться с (или связывает менее активно) другой изоформой того же самого белка (например, отличающейся гликоформой, имеющей такой же основной пептид, как DLL3), применяют определение положительного связывания с DLL3 и отсутствия связывания с (или уменьшенное связывание с) другой изоформой (например, отличающейся гликоформой). Таким образом, предпочтительно антитело (такое как моноклональное антитело), которое связывается с большей аффинностью (например, по меньшей мере в 2 раза, например по меньшей мере в 5 раз, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз большей аффинностью) с DLL3, чем с другой изоформой или изоформами (например, гликоформами) с DLL3.
Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции антительных молекул, полученных из сывороток иммунизированных животных. Кроме того, можно использовать нефракционированную иммунную сыворотку. Различные способы, известные в данной области уровня техники, могут быть использованы для получения поликлональных антител к DLL3, фрагменту DLL3, DLL3соответствующему полипептиду или фрагменту DLL3-соответствующего полипептида. Например, один из способов состоит в очистке полипептидов, вызывающих интерес, или в синтезе полипептидов, вызывающих интерес, используя, например, способы твердофазного пептидного синтеза, хорошо известные в данной области уровня техники. См., например, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. Vol. 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996. Такие полипептиды затем можно использовать, чтобы иммунизировать путем инъекции различных хозяевживотных, включая, но не ограничиваясь этим, кроликов, мышей, крыс и т.д., чтобы генерировать поликлональные или моноклональные антитела. Если DLL3 очищают, используя гель-электрофорез, DLL3 могут быть использованы для иммунизации с или без предварительной экстракции из полиакриламидного геля. Различные вспомогательные вещества (т.е. иммуностимуляторы) могут быть использованы для повышения иммунного ответа в зависимости от вида хозяина, включая, но не ограничиваясь этим, полный или неполный адъювант Фрейнда, минеральный гель, такой как гидроксид алюминия, поверхностно-активное вещество, такое как лизолецитин, плуроник-полиол, полианион, пептид, масляная эмульсия, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол, и вспомогательное вещество, такое как BCG (бацилла Кальметта-Герена) или corynebacterium parvum. Дополнительные вспомогательные вещества также хорошо известны в данной области уровня техники.
Для получения моноклональных антител (mAbs), нацеленных на DLL3, фрагмент DLL3, DLL3связанный полипептид или фрагмент DLL3 соответствующего полипептида могут быть использованы непрерывные клеточные линии в культуре по методике, которая предусматривает получение молекул антитела. Например, гибридомный способ, первоначально разработанный Kohler и Milstein (1975, Nature 256:495-497), а также триомный способ, гибридомный способ на В-клетках человека (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) и EBV- гибридомный способ для получения моноклональных антител человека (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Такие антитела могут быть из любого класса иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и какой-либо из его подклассов. Гибридомы для получения mAbs можно культивировать in vitro или in vivo. Моноклональные антитела могут быть получены у животных, свободных от микробов, применяя известную технологию (PCT/US 90/02545, включенный в данный документ в качестве ссылки).
Моноклональные антитела включают, но не ограничиваются этим, человеческие моноклональные антитела и химерные моноклональные антитела (например, химеры человек-мышь). Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части происходят от разных видов животных, таких как те, которые имеют константную область и вариабельную область человеческого иммуноглобулина, полученного из мышиного mAb, (см., например Cabilly et al., патент США № 4816567; и Boss et al., патент США № 4816397, которые включены в данный документ в виде ссылки в полном объеме). Гумманизированные антитела представляют собой молекулы антитела от не человеческого вида, имеющие одну или больше определяющих комплементарность областей (CDRs) от не человеческого вида и каркасную область от молекулы иммуноглобулина человека (см., например, Queen, патент США № 5585089, которые включены в данный документ в виде ссылки в полном своем объеме).
- 8 034182
Химерные и гумманизированные моноклональные антитела могут быть получены согласно способам рекомбинантных ДНК, известным в данной области уровня техники, например, используя способы, описанные в публикации РСТ № WO 87/02671; заявке на европейский патент 184187; заявке на европейский патент 171496; заявке на европейский патент 173494; публикации РСТ № WO 86/01533; патенте США № 4816567; заявке на европейский патент 125023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cane. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; и Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; патенте США 5225539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; и Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
Полностью человеческие антитела особенно предпочтительны для терапевтического лечения субъектов-людей. Такие антитела могут быть получены с использованием трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать гены эндогенного иммуноглобулина с тяжелой и легкой цепью, но которые могут экспрессировать человеческие гены с тяжелой и легкой цепью. Трансгенных мышей иммунизируют обычным антигеном, например всем или частью DLL3. Моноклональные антитела, направленные против антигена, могут быть получены с использованием традиционной гибридомной технологии. Человеческие иммуноглобулиновые трансгены, введенные трансгенным мышам, перегруппировываются во время дифференциации В-клеток, а затем подвергаются классовому переключению и соматической мутации. Таким образом, используя такую методику, можно получить терапевтически эффективные IgG, IgA, IgM и IgE антитела. Для обзора этой технологии получения антител человека см. Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Более подробное обсуждение этой технологии для получения антител человека и моноклональных антител человека и протоколов получения таких антител, см., например, патенты США 5625126; 5633425; 5569825; 5661016 и 5545806. Кроме того, компании, такие как Abgenix, Inc. (Freemont, CA) и Genpharm (San Jose, CA), могут быть задействованы для получения антител человека, направленных против выбранного антигена.
Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, могут быть получены с использованием методики, которую называют как управляемая селекция. В данном подходе выбранное нечеловеческое моноклональное антитело, например антитело мыши, используется, для того, чтобы обеспечивать выбор полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп (Jespers et al. (1994) BioTechnology 12:899-903).
Антитела также могут быть получены с использованием технологии фагового дисплея, предназначенного для получения и скрининга библиотек полипептидов для связывания с выбранной мишенью. См., например, Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990, Scott and Smith, Science 249, 386-88, 1990; и Ladner et al., патент США № 5571698. Основная концепция способов фагового дисплея состоит в создании физической ассоциации между ДНК, кодирующей полипептид, который выявляется, и полипептидом. Данная физическая ассоциация обеспечивается фаговой частицей, которая отображает полипептид, как часть капсида, входящего в состав генома фага, который кодирует полипептид. Создание физической связи между полипептидами и их генетическим материалом позволяет одновременный массовый скрининг очень большого количества фагов несущих различные полипептиды. Итак, данный фаг является обогащенным за счет аффинного скрининга мишени. Идентичность полипептидов, отображаемая этими фагами, может быть определена на основе соответствующих геномов. Используя эти способы полипептид, идентифицированный как имеющий аффинность связывания с желаемой мишенью, может быть синтезирован с использованием обычных способов. См., например, патент США № 6057098, который включен в данный документ во всей его полноте, включая все таблицы, фигуры и формулу изобретения. В частности, такой фаг может быть использован для отображения доменов антигена связывания, экспрессированных из репертуарной или комбинаторной библиотеки антитела (например, человека или мышиного). Фаг, экспрессирующий домен антигена связывания, который связывает представляющий интерес антиген, может быть выбран из меченого антигена или антигена, связанного или нанесенного на твердую поверхность или шарик.
Фаг, использованный в данных способах, как правило, представляет собой нитевидный фаг, включающий fd и М13 домены связывания, экспрессированные фагогом Fab, Fv, или стабилизированные дисульфидом домены Fv антитела, рекомбинантно слитые с геном фага III или белком гена VIII. Способы фагового дисплея, которые могут быть использованы для создания антитела, включают те, которые раскрыты в Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); заявке № PCT/GB 91/01134; публикации PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; и патентах США №№ 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108; каждый из которых включен в данный документ в виде ссылки.
Как описано в вышеуказанных ссылках, после выбора фага, области, кодирующее антитело, из фага могут быть выделены и использованы для создания целых антител, в том числе человеческих антител,
- 9 034182 или антигенсвязывающего фрагмента и экспрессированы в хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии, например, как подробно описано ниже. Например, также могут быть применены методы рекомбинантного получения Fab, Fab' и F(ab')2 фрагментов с использованием способов, известных в данной области уровня техники, которые раскрыты в публикации РСТ; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992), Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); и Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (указанные ссылки, включены посредством ссылки во всей своей полноте).
Примеры способов, которые могут быть использованы для получения одноцепочечных Fvs и антител, включают те, которые описаны в патентах США 4946778 и 5258498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); и Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
Биспецифические антитела могут быть получены способами, известными в данной области уровня техники. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основывается на коэкспрессии двух иммуноглобулиновых пар тяжелая цепь-легкая цепь, где две цепи обладают различной специфичностью (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Из-за случайного выбора иммуноглобулина тяжелой и легкой цепей, данные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно осуществляют путем стадий аффинной хроматографии, является довольно громоздкой, и выходы продукта являются низкими. Аналогичные процедуры раскрыты в WO 93/08829, опубликованной 13 мая 1993, и в Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.
В соответствии с другим подходом вариабельные домены антитела с желаемой специфичностью связывания (антитело-антигенсвязывающими сайтами) сливают с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Слияние предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, который включает по меньшей мере часть шарнирной области, СН2, и СН3. Предпочтительным является то, что имеется первая константная область тяжелой цепи (СН1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующей по меньшей мере в одном из слияний. ДНК, кодирующая слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, при необходимости, легкой цепи иммуноглобулина, встраиваются в отдельные векторы экспрессии и совместно трансфицируют в приемлемый организм-хозяин. Это предусматривает большую гибкость в регулировании взаимных соотношений трех полипептидных фрагментов в вариантах, когда неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции, дают оптимальные выходы. Однако существует возможность вставить кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один вектор экспрессии, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях в результате приводит к высоким выходам, или когда соотношения не имеют особого значения.
Биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания в одном плече и гибридной парой иммуноглобулина тяжелая цепь-легкая цепь (это обеспечивает вторую специфичность связывания) в другом плече. Было обнаружено, что такая асимметричная структура облегчает отделение нужного биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы предусматривает простой способ разделения. Данный подход раскрыт в WO 94/04690, опубликованной 3 марта 1994. Для более подробной информации о генерировании биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210.
Функционально активный означает, что фрагмент, производное или аналог способен вызвать антиантиидиотипические антитела (т.е. третичные антитела), которые распознают один и тот же антиген, из которого получают фрагмент, производное или аналог. В частности, антигенность идиотипа молекулы иммуноглобулина может быть повышена путем делеции каркасной и CDR последовательностей, которые являются С-терминальными к CDR последовательности, которая специфически распознает антиген. Для того чтобы определить, какие CDR последовательности связывают антиген, синтетические пептиды, содержащие CDR последовательности, могут быть использованы в анализах связывания с антигеном согласно любому способу анализа связывания, известному в данной области из уровня техники.
Фрагменты антитела, которые распознают специфические эпитопы, могут быть сформированы с помощью известных методик. F(ab')2 фрагменты состоят из вариабельной области, константной области легкой цепи и СН1 домена тяжелой цепи и генерируются пепсиновым разложением молекулы антитела. Fab фрагменты генерируются восстановлением дисульфидных мостиков F(ab')2 фрагментов. Получение димеров тяжелой цепи и легкой цепи антитела или какого-либо его минимального фрагмента, такого как Fvs или одноцепочечного антитела (SCAs) (например, как описано в патенте США 4946778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; и Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), или какой-либо другой молекулы с такой же специфичностью, как у антитела, известно из уровня техники. Одноцепочечные антитела образуются путем связывания фрагментов тяжелой и легкой цепи Fv области через аминокислотный мостик с получением в результате одноцепочечного полипептида. При этом могут быть использованы способы сборки функциональных Fv фрагментов в Е. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
- 10 034182
Описано также получение слитых белков из иммуноглобулинов (или их функционально активных фрагментов), например, в которых иммуноглобулин сливается посредством ковалентной связи (например, пептидной связи), либо на N-конце, или С-конце с аминокислотной последовательностью другого белка (или его частью, предпочтительно по меньшей мере 10, 20 или 50 аминокислотной частью белка), который не является иммуноглобулином. Предпочтительно иммуноглобулин или его фрагмент может быть ковалентно связан с другим белком на N-конце константного домена. Как указано выше, такие слитые белки могут облегчить очистку, повысить период полувыведения in vivo и повысить доставку антигена через эпителиальный барьер в иммунную систему.
Иммуноглобулины включают аналоги и производные, которые модифицируются, т. е. путем ковалентного присоединения какого-либо типа молекулы при условии, что такое ковалентное присоединение не нарушает иммуноспецифическое связывание. Например, но не в качестве ограничения, производные и аналоги иммуноглобулинов включают те, которые были далее модифицированы, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пэгирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Какая-либо из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена с помощью известных способов, включая, но неограничиваясь этим, с помощью специфического химического расщепления, ацетилирования, формилирования и т.д. Кроме того, аналог или производное может содержать одну или больше неклассических аминокислот.
Вышеуказанные антитела могут быть использованы в способах, известных из уровня техники, касающихся локализации и активности DLL3, например, для визуализации данного белка, измерения их уровней в соответствующих физиологических образцах, в диагностических способах и т.д.
Получение аффиантител к DLL3.
Молекулы аффиантител представляют собой новый класс белков с аффинностью на основе 58аминокислотного остатка домена белка, полученного из одного из IgG-связывающих доменов стафилококкового белка А. Данный домен был использован в качестве каркаса для строительства комбинаторных фагмидных библиотек, из которых варианты аффиантител, которые нацелены на желаемые молекулы, могут быть выбраны с помощью технологии фагового дисплея (Nord K., Gunneriusson E., Ringdahl J., Stahl S., Uhlen M., Nygren P.A., Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997; 15:772-7. Ronmark J., Gronlund H., Uhlen M., Nygren P.A., Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur. J. Biochem. 2002; 269:2647-55). Простая прочная конструкция молекул аффиантител в сочетании с их низкой молекулярной массой (6 кДа) делают их пригодными для различных применений, например, в качестве реагентов обнаружения (Ronmark J., Hansson M., Nguyen T., et al. Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J. Immunol. Methods 2002; 261:199-211) и ингибирования рецепторных взаимодействий (Sandstorm K., Xu Z., Forsberg G., Nygren P.A., Inhibition of the CD28-CD80 costimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003; 16:691-7). Дальнейшие подробности относительно аффиантител и методы их получения раскрыты в патенте США № 5831012, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Меченые аффиантитела также могут быть полезны для определения обилия изоформ.
Получение доменных антител DLL3.
Ссылки на антитела в данном документе охватывают ссылки на доменные антитела. Доменные антитела (dAbs) являются наименьшими функциональными единицами связывания антител, соответствующих вариабельным областям или тяжелой (VH), или легкой (VL) цепи антител человека. Доменные антитела имеют молекулярную массу приблизительно 13 кДа. Domantis разработала ряд крупных и высоко функциональных библиотек полностью человеческих VH и VL dAbs (более десяти миллиардов различных последовательностей в каждой библиотеке), и использует эти библиотеки для выбора dAbs, которые являются специфическими для терапевтических мишеней. В отличие от многих традиционных антител, доменные антитела хорошо экспрессируются в бактериальных, дрожжевых клеточных системах и клеточных системах млекопитающих. Дальнейшие подробности, касающиеся доменных антител и способов их получения могут быть получены из патентов США 6291158; 6582915; 659081; 6172197; 6696245; США серийный № 2004/0110941; заявку на европейский патент № 1433846 и европейские патенты 0368684 и 0616640; WO 05/035572, WO 04/101790, WO 04/081026, WO 04/058821, WO 04/003019 и WO 03/002609, каждый из которых включен в данный документ в качестве ссылки в полном объеме.
Получение наноантител DLL3.
Наноантитела представляют собой терапевтические белки, производные от антитела, которые содержат уникальные структурные и функциональные свойства природных антител с тяжелой цепью. Данные антитела с тяжелой цепью содержат один вариабельный домен (VHH) и два константных домена (CH2 и CH3). Важно отметить, что клонированный и изолированный VHH домен представляет собой стабильный полипептид, сохранивший способность связывания с антигеном, присущую исходному антителу с тяжелой-цепью. Наноантитела имеют высокую гомологию с VH доменами человеческих антител, и могут быть в дальнейшем гуманизированными без потери активности. Важно отметить, что наноантите
- 11 034182 ла имеют низкий иммуногенный потенциал, который был подтвержден в исследованиях на приматах.
Наноантитела сочетают в себе преимущества обычных антител с важными особенностями низкомолекулярных лекарственных средств. Как и обычные антитела, наноантитела демонстрируют высокую специфичность в отношении мишени, высокую аффинность к мишени и низкую токсичность. Однако, подобно низкомолекулярным лекарственным средствам, они могут ингибировать ферменты и легко достигать рецепторов. Кроме того, наноантитела являются чрезвычайно устойчивыми, могут быть введены способами, отличными от инъекции (см., например, WO 04/041867, которая включена в данный документ в качестве ссылки в полном объеме) и просты в изготовлении. Другие преимущества наноантител включают распознавание необычных или скрытых эпитопов в результате их небольшого размера, связывание в полостях или в активных сайтах белковых мишеней с высокой аффинностью и избирательностью в связи с уникальным 3-мерным форматом гибкости этого лекарственного средства, заданным периодом полувыведения.
Наноантитела кодируются одиночными генами и эффективно продуцируются почти во всех эукариотических и прокариотических хозяевах, например Е. coli (см., например US 6765087, которая включена в данный документ в качестве ссылки в полном объеме), плесневых грибах (например, Aspergillus или Trichoderma) и дрожжах (например, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula или Pichia) (см, например, US 6838254, которая включена в данный документ в качестве ссылки в полном объеме). Поскольку наноантитела демонстрируют превосходную стабильность по сравнению с обычными антителами, они могут входить в состав готового к использованию раствора с длительным сроком годности.
Способ наноклонирования (см., например, WO 06/079372, которая включена в данный документ в качестве ссылки в полном объеме) является способом создания наноантител против нужной мишени на основании автоматизированного отбора В-клеток.
Получение унитела DLL3.
Унитело представляет собой другой фрагмент антитела; данный фрагмент представляет собой фрагмент с удаленной шарнирной областью IgG4 антител. Делеция шарнирной области в молекуле в результате приводит к молекуле, которая, по существу, по размеру в два раза меньше традиционных IgG4 антител и имеет одновалентную связывающую область, а не двухвалентную связывающую область IgG4 антител. Кроме того, хорошо известно, что IgG4 антитела являются инертными и, таким образом, не взаимодействуют с иммунной системой, что может быть предпочтительным для лечения заболеваний, где иммунный ответ не требуется, и данное преимущество присуще унителу. Например, оно может ингибировать, но не убивать клетки, к которым они присоединены. Кроме того, связывание унитела с раковыми клетками не стимулируют их к пролиферации. Кроме того, поскольку унитело имеют приблизительно половину размера традиционных IgG4 антител, они могут демонстрировать лучшее распределение на больших солидных опухолях, что обеспечивает лучшую эффективность. Унитела удаляются из организма с такой же скоростью, что и полноразмерные IgG4 антитела, и способны связываться с аналогичной аффинностью с антигенами, как и целые антитела. Дальнейшая подробная информация об унителах может быть получена из заявки на патент WO 2007/059782, которая включена в данный документ в качестве ссылки в полном объеме.
Получение DARPins DLL3.
DARPins (разработанные анкириновые повторные белки) являются одним из примеров миметика антитела DRP (разработанные повторяющиеся белки). Повторяющиеся белки, такие как анкирин- или лейцинбогатые повторяющиеся белки, являются молекулами связывания, которые возникают в отличие от антител внутри- и внеклеточно. Их уникальная модульная архитектурная характеристика повторяющихся структурных единиц (повторов), которые складываются вместе, чтобы сформировать удлиненные повторяющиеся домены, отображая вариабельные и модульные мишеньсвязывающие поверхности. Основываясь на данной модульности, могут быть получены комбинаторные библиотеки полипептидов с высокодиверсифицированной специфичностью связывания. Данная стратегия включает консенсусный дизайн самостоятельных совместимых повторов, которые отображают вариабельные поверхностные остатки и их случайную сборку в повторяющихся доменах.
DARPins могут быть получены в бактериальных системах экспрессии с очень высокими выходами, и они относятся к числу наиболее стабильных известных белков. Были получены высокоспецифические, высокоаффинные DARPins с широким диапазоном белков-мишеней, включающих человеческие рецепторы, цитокины, киназы, человеческие протеазы, вирусные и мембранные белки. DARPins могут обладать аффинностью от наномолярного до пикомолярного диапазонах.
DARPins используются в ИФА, сэндвич ИФА, анализе проточной цитометрии (FACS), иммуногистохимии (IHC), чипировании, аффинной очистке или Вестерн-блоттинге. Кроме того, DARPins являются высокоактивным во внутриклеточном пространстве, например, как внутриклеточные маркерные белки, слитые с флуоресцентным белком (GFP). DARPins, кроме того, использовали для ингибирования попадания вируса с IC50 в пМ диапазоне. DARPins не только идеально подходят для блокирования взаимодействий белок-белок, но также для ингибирования ферментов. Протеазы, киназы и транспортеры успешно ингибировались, наиболее часто аллостерическим способом. Очень быстрые и специфические накопления на опухоли и использование в качестве подходящей мишени рака крови делает возможным
- 12 034182 использование DARPins in vivo в качестве диагностических или терапевтических средств.
Дополнительную информацию относительно белков DARP и других технологий DRP можно найти в заявке на патент США № 2004/0132028 и в публикации международной патентной заявки № WO 02/20565, каждая из которых включена в данный документ в качестве ссылки в полном объеме.
Получение антикалинов к DLL3.
Антикалины представляют собой антитело миметической технологии, однако в данном случае специфичность связывания обусловлена липокалинами - семейство низкомолекулярных белков, которые естественным образом экспрессируются в человеческих тканях и жидкостях организма. Липокалины эволюционировали, чтобы выполнять ряд функций in vivo, связанных с физиологическим транспортом и хранением химически чувствительных или нерастворимых соединений. Липокалины имеют надежную внутреннюю структуру, которая включает высококонсервативный В-ствол, который поддерживает четыре петли на одном конце белка. Эти петли формируют вход в карман связывания и конформационные различия в этой части молекулы обеспечивают изменение специфичности связывания между отдельными липокалинами.
В то время как общая структура гипервариабельных петель, поддерживаемых консервативной βлистовой рамкой напоминает иммуноглобулины, липокалины значительно отличаются от антител с точки зрения размера, так как они состоят из одной полипептидной цепи из 160-180 аминокислот, которая незначительно больше, чем один иммуноглобулиновый домен.
Липокалины клонируют и их петли подвергаются инжинирингу, чтобы создать антикалины. Были получены библиотеки структурно различных антикалинов, и антикалиновый дисплей позволяет выбрать и скринировать функции связывания, с последующей экспрессией и получением растворимого белка для дальнейшего анализа в прокариотических или эукариотических системах. Было продемонстрировано, что могут быть разработаны антикалины , которые являются специфическими для любого человеческого белка-мишени. Они могут быть выделены, и они будут обладать аффинностью связывания в наномолярном или более высоком диапазоне.
Антикалины также могут быть отформатированы в качестве двойных нацеленных белков, так называемых дуокалинов. Дуокалин связывает две отдельные терапевтические мишени, сохраняя целевую специфичность и аффинность независимо от структурной ориентации двух его связывающих доменов.
Модуляция нескольких мишеней с помощью одной молекулы особенно выгодна при заболеваниях, обусловленных ни одной причиной. Кроме того, би- или поливалентные связывающие форматы, такие как дуокалины имеют значительный потенциал в ориентации молекул на клеточной поверхности при болезни, опосредуя агонистические воздействия на пути сигнальной трансдукции или индуцируя улучшенные эффекты интернализации за счет связывания и кластеризации рецепторов на клеточной поверхности. Кроме того, высокая внутренняя устойчивость дуокалинов сравнима с мономерными антикалинами.
Дополнительную информацию о антикалинах можно найти в патенте США № 7250297 и публикации международной заявки на патент WO 99/16873, оба эти документа включены в качестве ссылки в полном объеме.
Получение авимеров к DLL3.
Авимеры были получены из большого семейства внеклеточных доменов рецептора человека путем перетасовки экзона и фагового дисплея in vitro, в результате были созданы многодоменные белки со связывающими и ингибирующими свойствами. Они связывают многочисленные независимые домены, как было показано, создают авидности и в результате это приводит к улучшенной аффинности и специфичности по сравнению с обычными одноэпитопными связывающими белками. Другие потенциальные преимущества авимеров включают простое и эффективное получение мультимишень-специфических молекул в Escherichia coli, повышенную термостабильность и устойчивость к протеазам. Авимеры с субнаномолярными аффинностями были получены против различных мишеней.
Дополнительную информацию об авимерах можно найти в публикациях заявок на патенты США №№ 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Получение версател к DLL3.
Версатела представляют собой небольшие белки 3-5 кДа с более 15% цистеинов, которые образуют дисульфидный скаффолд высокой плотности , заменяя гидрофобное ядро, которое имеют типичные белки. Замещение большого количества гидрофобных аминокислот, которое содержит гидрофобное ядро с небольшим количеством дисульфидов, в результате приводит к белку, который более менее гидрофильный (меньше агрегации и неспецифического связывания), более устойчивый к протеазе и нагреванию и имеет более низкую плотность Т-клеточных эпитопов, поскольку остатки, которые в наибольшей степени способствуют презентации МНС, являются гидрофобными. Все эти четыре свойства, как хорошо известно, влияют на иммуногенность, и вместе они, как ожидается, вызывают значительное уменьшение иммуногенности.
Конструировние версател осуществляют с использованием естественных инъекционных биофарма
- 13 034182 цевтических препаратов, получаемых от пиявок, змей, пауков, скорпионов, улиток и анемонов, которые, как известно, демонстрируют неожиданно низкую иммуногенность. Выбранные природные белки подвергают дизайну и скринингу в отношении размера, гидрофобности, протеолитического процессинга антигена и плотности эпитопа, для минимизации этих параметров до уровня ниже среднего по отношению к природным инъекционным белкам.
Учитывая структуру версатела, данные миметики-антитела имеют универсальный формат, который включает мультивалентность, мультиспецифичность, разнообразие механизмов полувыведения, модули тканевой ориентации и отсутствие Fc области антитела. Кроме того, версатело получают в E.coli с высоким выходом из-за их гидрофильности и малого размера. Верасатела хорошо растворимы и могут быть включены в лекарственный препарат в высоких концентрациях. Версатела являются исключительно термостойкими и имеют длительный срок хранения.
Дополнительную информацию о версателах можно найти в публикации заявки на патент США № 2007/0191272, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.
Экспрессия аффинных реагентов.
Экспрессия антитела.
Антитела могут быть получены любым способом, известным в данной области уровня техники, в частности путем химического синтеза или путем рекомбинантной экспрессии.
Рекомбинантная экспрессия антител или их фрагментов, производных или аналогов требует конструирования нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело. Если нуклеотидная последовательность антитела известна, то нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, может быть собрана из химически синтезированных олигонуклеотидов (например, как описано в Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242). Этот способ включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей антитело, ренатурацию и сшивание данных олигонуклеотидов, а потом амплификацию сшитых олигонуклеотидов путем ПЦР.
Альтернативно, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, может быть получена путем клонирования антитела. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую конкретное антитело, не доступен, но последовательность молекулы антитела известна, то нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, может быть получена из соответствующего источника (например, библиотеки кДНК антитела, или библиотеки кДНК, генерированной из какой-либо ткани или клеток, экспрессирующих антитело), используя ПЦР амплификацию с использованием синтетических праймеров, способных гибридизоваться на 3' и 5' концах последовательности или путем клонирования с использованием олигонуклеотидного зонда, специфического для конкретной последовательности гена.
Если молекула антитела, которая специфически распознает специфический антиген не доступна, то антитела, специфичные к определенному антигену могут быть сгенерированы любым способом, известным в данной области уровня техники, например, путем иммунизации животного, такого как кролик, чтобы создать поликлональные антитела или, например, путем получения моноклональных антител. В качестве альтернативы клон, кодирующий, по меньшей мере, Fab часть антитела, может быть получен путем скрининга Fab библиотек экспрессии (например, как описано в Huse et al., 1989, Science 246:12751281) для клонов Fab фрагментов, которые связывают специфический антиген, или путем скрининга библиотек антитела (см., например, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).
После того как получают нуклеиновую кислоту, кодирующую, по меньшей мере, вариабельный домен молекулы антитела, она может быть введена в вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, публикации РСТ WO 86/05807; РСТ WO 89/01036 и патент США № 5122464). Векторы, содержащие полноразмерную легкую или тяжелую цепь для одновременной экспрессии нуклеиновой кислоты, для обеспечения экспрессии полноразмерной молекулы антитела, также доступны. Затем нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, используют для введения нуклеотидного(ых) замен или делеции(й), необходимых для замен (или делеции) одного или более остатков цистеина в вариабельных областях. Такие модификации могут быть выполнены любым способом, известным в данной области для введения специфических мутаций или делеций в нуклеотидную последовательность, например, но не ограничиваясь этим, химический мутагенез, in vitro сайт-направленный мутагенез (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), способы, основанные PCT и т.д.
Кроме того, могут быть использованы способы получения химерных антител (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) с использованием генов сплайсинга молекулы мышиного антитела с соответствующей специфичностью к антигену и генов молекулы человеческого антитела с соответствующей биологической активностью. Как описано выше, химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части происходят от разных видов животных, например вариабельную область, полученную из мышиного mAb, и константную область человеческого антитела.
После того как нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу антитела, была получена, соответствующий вектор может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК с использованием
- 14 034182 методов, хорошо известных в данной области уровня техники. Таким образом, способы получения DLL3 путем экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащей последовательности молекулы антитела, описаны в данном документе. Способы, которые хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области уровня техники, могут быть использованы для конструирования векторов экспрессии, содержащих молекулу антитела, кодирующего последовательности и соответствующие транскрипционные и трансляционные контрольные сигналы. Данные способы включают, например, способы рекомбинантных ДНК in vitro, синтетические способы и генетические рекомбинации in vivo. См., например, способы, описанные в Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) and Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
Вектор экспрессии переносят в клетку-хозяин с помощью обычных способов, и трансфицированные клетки затем культивируют обычными методами с получением антитела.
Клетки-хозяева, используемые для экспрессии рекомбинантного антитела, могут быть либо бактериальными клетками, такими как Escherichia coli, или предпочтительно эукариотическими клетками, особенно для экспрессии всей рекомбинантной молекулы антитела. В частности, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), в сочетании с вектором, таким как основной промежуточный элемент раннего промотора гена цитомегаловируса человека, являются эффективной системой экспрессии для антител (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2).
Разнообразие систем экспрессии вектор-хозяин может быть использовано, чтобы экспрессировать молекулу антитела. Такие системы-хозяева экспрессии представляют собой носители, с помощью которых могут быть получены кодирующие последовательности, которые затем очищают. Они также представляют собой клетки, которые при трансформации или трансфицировании соответствующими кодирующими последовательностями могут экспрессировать молекулу антитела in situ. Они включают, но не ограничиваются микроорганизмами, такими как бактерии (например, E.coli, В. Subtilis), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии на основе ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащей последовательности, кодирующие антитело; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей, содержащими последовательности, кодирующие антитело; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными векторами экспрессии вирусов (например, бакуловируса), содержащие последовательности, кодирующие антитело; клеточные системы растений, инфицированные рекомбинантными векторами экспрессии вирусов (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом табачной мозаики, TMV), или трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии плазмиды (например, Ti plasmid), содержащими последовательности, кодирующие антитело; или клеточные системы млекопитающих (например, COS, СНО, BHK, 293, 3Т3 клетки), несущие рекомбинантные конструкты экспрессии, содержащие промоторы, производные генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вируса млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор вируса осповакцины 7.5K).
В бактериальных системах ряд векторов экспрессии может быть выбран в зависимости от молекулы антитела, которая экспрессируется. Например, когда должно быть произведено большое количество такого белка, для создания фармацевтических композиций, содержащих молекулу антитела, желательно использовать векторы, которые обеспечивают экспрессию высоких уровней слитого белка. Такие векторы включают, но не ограничиваются вектором экспрессии pUR278 E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), в котором последовательность кодирующая антитело, может быть встроена в вектор в рамке считывания с lac Z-кодирующей областью, так что продуцируется слитый белок; pIN векторы (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509) и т.п. Векторы pGEX также могут быть использованы для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион S-трансферазой(GST). В общем, такие слитые белки являются растворимыми и могут быть легко очищены от лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матричными глутатион-агарозными шариками, с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX включают тромбин или сайты фактора расщепления Ха-протеазы таким образом, что клонированный продукт гена мишени может быть освобожден от GST фрагмента.
В системе насекомого, Autographa californica - вирус ядерного полиэдроза (AcNPV) используется в качестве вектора, чтобы экспрессировать чужеродные гены. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Последовательность, кодирующая антитело, может быть клонирована в неосновных областях (например, ген полиэдрина) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV (например, промотора полиэдрина). В клетках-хозяевах млекопитающих могут быть использованы ряды систем экспрессии на основе вируса (например, аденовирусная система экспрессии).
Как обсуждалось выше, штамм клеток-хозяев может быть выбран из тех, которые обеспечивают экспрессию встроенных последовательностей или модифицируют и обрабатывают генный продукт желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функции белка.
- 15 034182
Для долгосрочной перспективы предпочтительным является получение рекомбинантных антител с высоким выходом при стабильной экспрессии. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют целевое антитело могут быть получены путем трансфекции клетки вектором экспрессии, содержащим нуклеотидную последовательность антитела, и нуклеотидную последовательность, обеспечивающую селекцию (например, с помощью неомицина или гигромицина), Такие сконструированные клеточные линии могут быть особенно полезны в скрининге и оценке соединений, которые взаимодействуют непосредственно или опосредовано с молекулой антитела.
Уровни экспрессии молекулы антитела могут быть увеличены путем амплификации вектора (см. обзор Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3 (Academic Press, New York, 1987). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, способен к амплификации, увеличение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клетки-хозяина, будет обеспечивать увеличение количества копий маркерного гена. Поскольку амплифицированная область связана с геном антитела, то получение антитела также будет возрастать (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
Клетка-хозяин может быть трансфицирована двумя векторами экспрессии, где первый вектор кодирует тяжелую цепь полипептида, и где второй вектор кодирует легкую цепь полипептида. Два вектора могут содержать идентичные селективные маркеры, которые позволяют уравнять экспрессию тяжелых и легких цепей полипептидов. В качестве альтернативы может использоваться один вектор, кодирующий как тяжелую, так и легкую цепь полипептидов. В таких ситуациях легкая цепь должна быть помещена перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка токсичной свободной тяжелой цепи (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Кодирующие последовательности для тяжелой и легкой цепей могут содержать кДНК или геномную ДНК.
После того как молекула антитела была рекомбинантно экспрессирована, она может быть очищена любым способом, известным в данной области уровня техники, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, такой как с белком А или специфическим антигеном и колоночной хроматографии по размеру), центрифугирования, различий в растворимости или с помощью какого-либо другого стандартного метода очистки белков.
Альтернативно, слитый белок может быть легко очищен с использованием антитела, специфичного для слитого белка, который экспрессируется. Например, система, описанная Janknecht и соавт., позволяет легко очистить неденатурированные слитые белки, экспрессированные в человеческих клеточных линиях Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). В данной системе представляющий интерес ген субклонируют в плазмиде осповакцины, так что открытая рамка считывания гена трансляционно слита с аминотерминальной меткой, состоящей из шести остатков гистидина. Метка служит как матричный домен связывания для слитого белка. Экстракты из клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины, загружают в Ni2+ колонку с системой нитрилуксусная кислота-агароза, и гистидинмеченные белки избирательно элюируют буферными растворами, содержащими имидазол.
Антитела, генерированные данными способами, затем могут быть отобраны с использованием первого скрининга в отношении аффинности и специфичности с очищенным, представляющим интерес полипептидом и, при необходимости, сравнены с аффинностью и специфичностью антител, которые являются нежелательными. Процедура скрининга может включать иммобилизацию очищенных полипептидов в отдельных лунках микротитровальных планшетов. Раствор, содержащий потенциальное антитело или группы антител, затем помещают в соответствующие лунки для микротитрования и инкубируют в течение от 30 мин до 2 ч. Микротитровальные лунки потом промывают, и меченое вторичное антитело добавляют в лунки и инкубируют в течение приблизительно 30 мин, а затем промывают. Субстрат добавляют в лунки, и при этом цветная реакция указывает на присутствие антитела с иммобилизованным полипептидом(ами).
Антитела, идентифицированные таким образом, затем могут быть дополнительно проанализированы на аффинность и специфичность. При разработке иммунологических анализов для белка-мишени очищенный белок-мишень действует в качестве стандарта, по которому судят о чувствительности и специфичности иммунологического анализа с использованием антител, которые были выбраны. Поскольку аффинность связывания различных антител может отличаться; некоторые пары антител (например, в сэндвич-анализах) могут создавать пространственные помехи друг другу и т.д., эффективность анализа антитела является более важной мерой, чем абсолютная аффинность и специфичность антитела.
Квалифицированным специалистам в данной области понятно, что для получения антител или их фрагментов могут применяться многие подходы. Это также относится и к скринингу и отбору по аффинности и специфичности.
Для терапевтического применения антитела (особенно моноклональные антитела) могут быть соответственно человеческими или гуманизированными (например, мыши) антителами. Гуманизация, как правило, включает привитие CDR на человеческие каркасные области. Обычно требуются некоторые последующие ретромутации, чтобы оптимизировать конформацию цепей. Такие способы известны специалистам в данной области.
Экспрессия аффиантител.
- 16 034182
Конструирование аффиантител было уже описано (Ronnmark J., Gronlund Н., Uhlen, M., Nygren P.A., Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655), включая конструирование библиотек фагового дисплея аффиантитела (Nord,
K., Nilsson, J., Nilsson, В., Uhlen, M. & Nygren, P.A, A combinatorial library of an a-helical bacterial receptor domain, 1995, Protein Eng. 8, 601-608. Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhlen, M. & Nygren, P.A, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, 1997, Nat. Biotechnol.15, 772-777).
Для исследования оптимальных вариантов аффиантитела используют биосенсор связывания, такие исследования также были описаны (см. Ronnmark J., Gronlund H., Uhlen, M., Nygren P.A., Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655).
Модификации аффинных реагентов.
Анти-ЭЕЕ3 аффинные реагенты, такие как антитела или их фрагменты, можно конъюгировать с диагностическим фрагментом (такие как детектируемая метка) или терапевтическим фрагментом. Антитела могут быть использованы для диагностики или определения эффективности данной схемы лечения. Обнаружение может быть облегчено путем сочетания антитела с детектируемым веществом (меткой). Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радионуклиды, позитронизлучающие металлы (для использования в позитронно-эмиссионной томографии), и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов. В патенте США 4741900 описаны ионы металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами для использования в качестве диагностического средства. Подходящие ферменты включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; подходящие простетические группы включают стрептавидин, авидин и биотин; подходящие флуоресцентные материалы включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, флуоресцеина дихлортриазиниламин, дансилхлорид и фикоэритрин; подходящие люминесцентные материалы включают люминол; подходящие биолюминесцентные материалы включают люциферазу, люциферин и экворин; и подходящие радионуклиды включают 125I, 131I, 111In и 99Тс. 68Ga также может быть использован.
Как указано выше, аффинные реагенты, такие как антитела, могут быть конъюгированы с терапевтическим фрагментом, таким как цитотоксин, лекарственное средство (например, иммунодепрессант) или радиотоксин. Такие конъюгаты рассматриваются в данном документе как иммуноконъюгаты. Иммуноконъюгаты, которые включают один или больше цитотоксинов, называют иммунотоксинами. Цитотоксин или цитотоксический агент включает какой-либо агент, который пагубно влияет на (например, убивает) клетки. Примеры включают таксол, цитохалазин, грамицидин D, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты, кроме того, включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиоэпахлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклотосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, митомицин С, и цис-дихлордиамин платины(П), (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)), и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).
Другие предпочтительные примеры терапевтических цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы с антителом, включают дуокармицины, калихеамицины, майтансины и ауристатины и их производные. Пример конъюгата антитела с калихеамицином является коммерчески доступным (Mylotarg®; American Home Products).
Цитотоксины могут быть конъюгированны с антителами с использованием линкер-технологии, доступной в данной области уровня техники. Примеры типов линкеров, которые были использованы для конъюгации цитотоксина с антителом, включают, но не ограничиваются этим, гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и пептидсодержащие линкеры. Линкер может быть, например, чувствительным к расщеплению при низком рН или чувствительным к расщеплению протеазами, такими как протеазы преимущественно экспрессируемые в опухолевой ткани, такие как катепсины (например, катепсины В, С, D).
Примеры цитотоксинов приведены, например, в патентах США №№ 6989452, 7087600 и 7129261, а также в заявках РСТ №№ PCT/US 2002/17210, PCT/US 2005/017804, PCT/US 2006/37793, PCT/US 2006/060050, PCT/US 2006/060711, WO 2006/110476 и в заявке на патент США № 60/891028, они включены в данный документ в виде ссылки в полном объеме. Для дальнейшего обсуждения типов цитотоксинов, линкеров и способов конъюгации терапевтических агентов с антителами, см. также Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337;
- 17 034182
Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
Аффинные реагенты также могут быть конъюгированы с радиоактивным изотопом для создания цитотоксических радиофармацевтических препаратов, называемых также радиоиммуноконъюгатами. Примеры радиоактивных изотопов, которые могут быть конъюгированы с антителами для использования в диагностических или терапевтических целях, включают, но не ограничиваются йодом131, индием111, иттрием90 и лютецием177. Способы получения радиоиммуноконъюгатов известны в данной области. Примеры радиоиммуноконъюгатов являются коммерчески доступными, в том числе Зевалин®, (IDEC Pharmaceuticals) и Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), и подобные способы могут быть применены для получения радиоиммуноконъюгатов с использованием антител.
Аффинные реагенты также могут быть конъюгированы с фталоцианиновым красителем, далее в данном документе называются как фталоцианиноконъюгаты. Примеры фталоцианиновых красителей, которые могут быть конъюгированы с антителами для использования в диагностических или терапевтических целях, включают, но не ограничиваются ими, IR700. Способы получения фталоцианиноконъюгатов описаны, например, в Mitsunaga M., Ogawa M., Kosaka N., Rosenblum L.T., Choyke P.L. and Kobayashi H. (2011) Nat Med. 2011 Nov 6. doi: 10.1038/nm.2554.
Конъюгаты могут быть использованы для модификации биологического ответа, фрагмент, относящийся к лекарственному средству, не должен ограничиваться классическими химическими терапевтическими агентами. Например, фрагмент лекарственного средства может представлять собой белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин, или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин Pseudomonas, или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли или интерферон-γ; или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-6 (IL-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), или другие факторы роста. Senter P.D. (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244; Kovtun et al. (2010) Cancer Res. 70(6):2528-2537.
Способы конъюгирования таких терапевтических фрагментов хорошо известны, см., например, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, Antibody Носителе Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), и Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Альтернативно, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием антительного гетероконъюгата, как описано Segal в патенте США № 4676980.
Антитело с или без терапевтического фрагмента, конъюгированного с ним, можно использовать в качестве терапевтического средства, которое вводят самостоятельно или в сочетании с цитотоксическим фактором(ами) и/или цитокином(ами).
Полностью человеческое антитело представляет собой антитело, в котором белковые последовательности кодируются встречающимися в природе последовательностями иммуноглобулина человека, или антитело из выделенных продуцирующих антитела человеческих В-лимфоцитов или из трансгенных мышиных В-лимфоцитов, в которых мышиный иммуноглобулин, кодирующий хромосомные области, был заменен на ортологичные человеческие последовательности. Трансгенные антитела последнего типа включают, но не ограничиваются HuMab (Medarex, Inc, CA) and XenoMouse (Abgenix Inc., CA). Гуманизированное антитело представляет собой антитело, в котором константная область молекулы нечеловеческого антитела с соответствующей антигенной специфичностью замещается на константную область человеческого антитела, предпочтительно подтипа IgG, с соответствующими эффекторными функциями (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454). Соответствующие эффекторные функции включают ADCC, которая представляет собой естественный процесс, с помощью которого полностью человеческие антитела или гуманизированные антитела при связывании с мишенями на поверхности раковых клеток переключаются на уничтожение клеток лимфоцитами, которые являются частью нормальной иммунной системы.
Данные активные лимфоциты, называемые естественными киллерами (NK) клеток, используют цитотоксический процесс для разрушения живых клеток, с которыми данные антитела связываются. ADCC активность может быть обнаружена и количественно определена путем измерения высвобождения европия (Eu3+) из Eu3+ меченых живых клеток в присутствии антигенспецифического антитела и мононуклеарных клеток периферической крови, экстрагированных из иммунокомпетентного, живого человеческого субъекта. Процесс ADCC подробно описан в Janeway Jr. CA. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland
- 18 034182
Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:p2153-68 and Weng, W.-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21; p. 3940-3947. Suitable methods for the detection and quantification of ADCC can be found in Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 86; pp. 225-9; Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 21; 92; pp. 117-23 and Patel & Boyd, Journal of Immunological Methods. 1995, 184; pp. 29-38.
ADCC обычно включает активацию клеток NK и зависит от распознавания покрытых антителом клеток Fc рецептором на поверхности клетки NK. Рецепторы Fc распознают Fc (кристаллическую) часть антител, таких как IgG, связываются специфически с поверхностью клетки-мишени. Рецептор Fc, который вызывает активацию клетки NK, называется CD16 или FcyRIIIa. После этого рецептор FcyRIIIa связывается с Fc IgG, NK клетки высвобождают цитокины, такие как IFN-γ, и цитотоксические гранулы, содержащие перфорин и гранзимы, которые проникают в клетку-мишень и способствуют гибели клеток, вызывая апоптоз.
Индуцирование антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) антителом может быть увеличена путем модификации, которая изменяет взаимодействие между константной областью (Fc) антитела и различными рецепторами, которые присутствуют на поверхности клеток иммунной системы. Такие модификации включают уменьшение или отсутствие а-1,6-связанных фукозных фрагментов в комплексе олигосахаридных цепей, которые обычно добавляются к Fc антитела во время естественного или рекомбинантного синтеза в клетках млекопитающих. Не фукозилированные анти-ЭЕЕ3 аффинные реагенты, такие как антитела или их фрагменты, продуцируются с целью повышения их способности индуцировать ADCC ответ.
Способы уменьшения или удаления а-1,6-связанных фукозных фрагментов в олигосахаридных цепях Fc хорошо известны. Например, рекомбинантное антитело синтезируется в клеточной линии, которая не способна добавлять фукозу в а-1,6-связывание с внутренним N-ацетилглюкозамином из Nсвязанных биантенарных комплексного типа Fc олигосахаридов. Такие клеточные линии включают, но не ограничиваются крысиными гибридомами YB2/0, которые обеспечивают сниженный уровень экспрессии гена а-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8. Предпочтительно антитело синтезируется в клеточной линии, которая является не способной к добавлению а-1,6-связанных фукозильных фрагментов в сложные олигосахаридные цепи из-за делеции обеих копий гена FUT8. Такие клеточные линии включают, но не ограничиваются FUT8 -/- CHO/DG44 клеточными линиями. Способы синтеза частично фукозилированных или не фукозилированных антител и аффинных реагентов описаны в Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-34735 (2003); Yamane-Ohnuki et al., Biotechnology and Bioengineering 87: 614-22 (2004) и в WO 00/61739 A1, WO 02/31140 A1 и WO 03/085107 A1. Во втором примере фукозилирование рекомбинантного антитела уменьшается или подавляется при синтезе в клеточной линии, которая была генетически модифицированной, чтобы сверхэкспрессировать гликопротеин-модифицирующую гликозилтрансферазу на уровне, который максимизирует получение сложных N-связанных олигосахаридов, несущих разделенный пополам N-ацетилглюкозамин. Например, антитело, синтезируется в клеточной линии яичника китайского хомячка, экспрессирующей фермент N-ацетилглюкозаминтрансферазу III (GnT III). Клеточные линии, стабильно трансфицированные подходящими гликопротеин-модифицирующими гликозилтрансферазами, и способы синтеза антител с использованием данных клеток описаны в WO 99/54342.
Нефукозилированное антитело или аффинный реагент может быть использован в качестве терапевтического средства, которое вводят самостоятельно или в сочетании с цитотоксическим(ими) фактором(ами) и/или цитокином(ами).
Аминокислотные последовательности Fc антитела изменяют таким образом, что повышается ADCC активация без влияния на аффинность лиганда. Примеры таких модификаций описаны в Lazar et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 2006, 103: p. 4005-4010; WO 03/074679 и WO 2007/039818. В данных примерах замещение аминокислот в Fc антитела, такое как аспартат на серин в положении 239 и изолейцин на глутамат в положении в 332, изменяет аффинность связывания антитела с Fc рецепторами, что приводит к увеличению активации ADCC.
Антитело с повышенной ADCC активацией за счет аминокислотных замен может быть использовано в качестве терапевтического средства, которое вводят самостоятельно или в сочетании с цитотоксическим(ими) фактором(ами) и/или цитокином(ами).
Биспецифические молекулы включают по меньшей мере одну первую специфичность связывания для первого эпитопа-мишени (т.е. DLL3), и вторую специфичность связывания для второго эпитопамишени. Второй эпитоп-мишень может присутствовать на одном и том же белке-мишени; или второй эпитоп-мишень может присутствовать в другом белке-мишени. Второй эпитоп-мишень может присутствовать на одной и той же клетке, что и первый эпитоп-мишень (т.е. DLL3); или второй эпитоп-мишень может присутствовать на мишени, которая не отображается клеткой, которая отображает первый эпитопмишень. Как используется в данном документе, термин специфичность связывания касается фрагмента, который включает по меньшей мере один вариабельный домен антитела.
- 19 034182
Биспецифическая молекула может представлять собой BiTE (биспецифический Т-клеточный блокировщик). Биспецифический аффинный реагент (предпочтительно биспецифическое антитело) может содержать первый домен связывания для DLL3 и второй домен связывания для Т-клеточного антигена, предпочтительно CD3.
Биспецифические антитела могут иметь в общей сложности два или три вариабельных домена антитела, где первая часть биспецифического антитела способна подавлять активность человеческой иммунной эффекторной клетки за счет специфического связывания с эффекторным антигеном, расположенным на человеческой иммунной эффекторной клетке, в которой эффекторный антиген является человеческим CD3 антигеном, где указанная первая часть состоит из одного вариабельного домена антитела, и вторая часть биспецифического антитела способна к специфическому связыванию с другим антигеноммишенью, чем эффекторный антиген, например DLL3, где указанный антиген-мишень располагается на клетке-мишени другой, чем указанная человеческая иммунная эффекторная клетка, и указанная вторая часть включает один или два вариабельных домена антитела.
Биспецифическое антитело (предпочтительно BiTE) может связываться с DLL3 и CD3 для лечения рака легкого, предпочтительно мелкоклеточного рака легкого.
Диагностика рака.
Присутствие антител, способных к иммуноспецифическому связыванию с DLL3, или их эпитопсодержащих фрагментов, как правило, детектируется с помощью анализа биологического образца, полученного от указанного субъекта ( биологический образец представляет собой образец ткани легкого, поджелудочной железы и кожи, образец крови или слюны). Способ, как правило, включает стадию получения указанного биологического образца для анализа от указанного субъекта. Антитела, которые могут быть обнаружены, включают IgA, IgM и IgG антитела.
Образцы для исследования, например, ткани легкого, поджелудочной железы или кожи, сыворотки, плазмы или мочи, полученные от субъекта, могут быть использованы для диагностики или мониторинга. Изменение содержания DLL3 в образце для исследования по отношению к контрольному образцу (от субъекта или субъектов, не имеющих заболеваний), или предварительно определенному диапазону референсных значений, указывает на наличие заболеваний. Относительно увеличенное содержание DLL3 в образце для исследования по сравнению с контрольным образцом или предварительно определенным диапазоном референсных значений указывает на подтип заболеваний (например, мелкоклеточный рак; плоскоклеточный рак легкого; эндокринные опухоли поджелудочной железы или плоскоклеточный рак кожи, меланому). Относительно увеличенное содержание DLL3 в образце для исследования по отношению к контрольному образцу или предварительно определенному диапазону референсных значений указывает на степень или тяжесть заболеваний (например, вероятность метастазирования). В каком-либо из указанных выше способов, обнаружение DLL3 необязательно может быть комбинированным с обнаружением одного или большего количества дополнительных биомаркеров для заболеваний. Любой приемлемый способ в данной области может быть применен для измерения уровня DLL3, включая, в частности, предпочтительные технологии, описанные в данном документе, анализы киназы, иммунологические анализы для детектирования и/или визуализации DLL3 (например, Вестерн-блоттинг, иммунопреципитация с последующим натрий додецилсульфатным-полиакриламидным гелевым электрофорезом, иммуноцитохимический анализ и т.д.). Изменение относительного содержания мРНК, кодирующей DLL3 в образце для исследования по отношению к контрольному образцу или предварительно определенному диапазону референсных значений, указывает на наличие заболеваний. Любой приемлемый гибридизационный анализ может быть использован для обнаружения экспрессии DLL3 путем детектирования и/или визуализации мРНК, кодирующей DLL3 (например, Нозерн-анализы, дот-блоттинг, in situ гибридизация и т.п.).
Меченые антитела (или другие аффинные реагенты), их производные и аналоги, которые специфически связываются с DLL3, могут быть использованы для диагностических целей для обнаружения, диагностики или мониторинга заболеваний. Предпочтительно заболевания обнаруживают у животного, более предпочтительно у млекопитающего и наиболее предпочтительно у человека.
Анализы скрининга.
Возможна идентификация агентов, соединений-кандидатов или исследуемых соединений, которые связываются с DLL3-связанным полипептидом или DLL3 слитым белком или имеют стимулирующее или ингибиторное действие на экспрессию или активность DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитого белка. Примеры агентов, соединений-кандидатов или исследуемых соединений включают, но не ограничиваются нуклеиновыми кислотами (например, ДНК и РНК), углеводами белками, пептидами, пептидомиметиками, малыми молекулами и другими лекарственными средствами. Агенты могут быть получены, используя любой из многочисленных подходов с помощью комбинаторных библиотек, известных в данной области уровня техники, включая биологические библиотеки; пространственно адресуемую параллельную твердую фазу или фазу раствора библиотек; синтетические библиотеки, требующие деконволюции; один шарик, одно соединение библиотеки; и синтетические библиотеки, выбранные аффинной хроматографей. Биологические библиотеки ограничиваются пептидными библиотеками, тогда как другие библиотеки, применимы к пептиду, непептидному олигомеру или малым молекулам
- 20 034182 библиотек соединений (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145; патент США № 5738996 и патент США № 5807683, каждая из которых включена в данный документ в качестве ссылки).
Примеры способов синтеза молекулярных библиотек можно найти, например, в DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; и Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233, каждая из которых включена в данный документ в качестве ссылки.
Библиотеки соединений могут быть представлены, например, в растворе (например, Houghten, 1992, BioTechniques 13:412-421), или на шариках (Lam, 1991, Nature 354:82-84), чипах (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), бактериях (патент США № 5223409), спорах (патенты №№ 5571698; 5403484 и 5223409), плазмидах (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) или фаге (Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:63786382; и Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310), каждая из которых включена в данный документ в качестве ссылки.
Агенты, которые взаимодействуют с (т.е. связываются с) DLL3, фрагментом DLL3 (например, функционально активным фрагментом), с DLL3-связанным полипептидом, фрагментом DLL3связанного полипептида или DLL3 слитым белком, определяются на основе анализа. Клетки, экспрессирующие DLL3, фрагмент DLL3, DLL3-связанный полипептид, фрагмент DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитый белок, контактируют с соединением-кандидатом или контрольным соединением, и определяется способность соединения-кандидата взаимодействовать с DLL3. При необходимости, данный анализ может быть использован для скрининга множества (например, библиотеки) соединенийкандидатов. Клетка, например, может быть прокариотического происхождения (например, E.coli) или эукариотического происхождения (например, дрожжевой или млекопитающих). Кроме того, клетки могут экспрессировать DLL3, фрагмент DLL3, DLL3-связанный полипептид, фрагмент DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитый белок эндогенный или генетически модифицированный, для того чтобы экспрессировать DLL3, фрагмент DLL3, DLL3-связанный полипептид, фрагмент DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитый белок. В некоторых случаях DLL3, фрагмент DLL3, DLL3-связанный полипептид, фрагмент DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитый белок или соединение-кандидат метят, например, радиоактивной меткой (например, 32Р, 35S и 125I) или флуоресцентной меткой (такой как флуоресцеина изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид или флуорескамин), чтобы иметь возможность обнаружить взаимодействие между DLL3 и соединениемкандидатом. Способность соединения-кандидата взаимодействовать непосредственно или опосредованно с DLL3, фрагментом DLL3, DLL3-связанным полипептидом, фрагментом DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитым белком может быть определена с помощью способов, известных квалифицированным специалистам в данной области. Например, взаимодействие между соединением-кандидатом и DLL3, DLL3-связанным полипептидом, фрагментом DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитым белком может быть определено с помощью анализа проточной цитометрии, сцинтилляционного анализа, иммунопреципитации или анализа Вестерн-блоттинга.
Агенты, которые взаимодействуют с (т.е. связываются с) DLL3, фрагментом DLL3 (например, функционально активным фрагментом), DLL3-связанным полипептидом, фрагментом DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитым белком, можно определять в бесклеточной системе анализа. В соответствии с этим нативный или рекомбинантный DLL3 или его фрагмент, или нативный или рекомбинантный DLL3-связанный полипептид или его фрагмент, или ПЕЕ3-слитый белок или его фрагмент подвергают взаимодействию с соединением-кандидатом или контрольным соединением и определяют способность соединения-кандидата взаимодействовать с DLL3, или DLL3-связанным полипептидом, или DLL3 слитым белком. При необходимости, данный анализ может быть использован для скрининга множества (например, библиотеки) соединений-кандидатов. Предпочтительно DLL3, DLL3 фрагмент, DLL3-связанный полипептид, фрагмент DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитый белок сначала иммобилизуют, например, путем контактирования DLL3, DLL3 фрагмента, DLL3-связанного полипептида, фрагмента DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитого белка с иммобилизованным антителом (или другим аффинным реагентом), который специфически распознает и связывает его, или путем контактирования очищенного препарата DLL3, DLL3 фрагмента, DLL3-связанного полипептида, фрагмента DLL3связанного полипептида или DLL3 слитого белка с поверхностью, сконструированной для того, чтобы связывать белки. DLL3, DLL3 фрагмент, DLL3-связанный полипептид, фрагмент DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитый белок может быть частично или полностью очищенным (например, частично или полностью свободным от других полипептидов) или частью клеточного лизата. Кроме того, DLL3, DLL3 фрагмент, DLL3-связанный полипептид или фрагмент DLL3-связанного полипептида может представлять собой слитый белок, который включает DLL3 или его биологически активную часть или DLL3-связанный полипептид и домен, такой как домен глутатионин^-трансферазы. Альтернативно, DLL3, DLL3 фрагмент, DLL3-связанный полипептид, фрагмент DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитый белок может быть биотинилированным, используя способы, хорошо известные квалифицированным специалистам в данной области (например, с помощью набора биотинилирования, Pierce Chemicals;
- 21 034182
Rockford, IL). Способность соединения-кандидата взаимодействовать с DLL3, DLL3 фрагментом, DLL3связанным полипептидом, фрагментом DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитым белком может быть определена, используя способы, известные квалифицированным специалистам в данной области.
Система на основе анализа клеток может использоваться для идентификации агентов, которые связываются с или модулируют активность белка, такого как фермент, или его биологически активная часть, которая отвечает за получение или деградацию DLL3 или отвечает за посттрансляционную модификацию DLL3. В первичном скрининге множество (например, библиотека) соединений приводят в контакт с клетками, которые естественно или рекомбинантно экспрессируют: (i) DLL3, изоформу DLL3, гомолог DLL3, DLL3-связанный полипептид, DLL3 слитый белок или биологически активный фрагмент; и (ii) белок, который отвечает за обработку DLL3, изоформы DLL3, гомолога DLL3, DLL3-связанного полипептида, DLL3 слитого белка или фрагмента для того, чтобы идентифицировать соединения, которые модулируют получение, разложение или посттрансляционную модификацию DLL3, изоформы DLL3, гомолога DLL3, DLL3 связанного полипептида, DLL3 слитого белка или фрагмента. При необходимости, соединения, идентифицированные в первичном скрининге, затем могут быть проанализированы во вторичном скрининге против Т клеток, естественно или рекомбинантно экспрессирующих DLL3. Способность соединения-кандидата модулировать получение, разложение или посттрансляционную модификацию DLL3, изоформы, гомолога, DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитого белка может быть определена способами, известными квалифицированным специалистам в данной области, включающими без ограничения анализ проточной цитометрии, сцинтилляционный анализ, иммунопреципитацию или анализ Вестерн-блоттинга.
Агенты, которые конкурентно взаимодействуют с (т.е. связываются с) DLL3, DLL3 фрагментом, DLL3-связанным полипептидом, фрагментом DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитым белком, определяются в анализе конкурентного связывания. Клетки, экспрессирующие DLL3, DLL3 фрагмент, DLL3-связанный полипептид, фрагмент DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитый белок, подвергают контактированию с соединением-кандидатом и известным соединением для обеспечения взаимодействия с DLL3, DLL3 фрагментом, DLL3-связанным полипептидом, фрагментом DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитым белком; затем определяют способность соединения-кандидата предпочтительно взаимодействовать с DLL3, фрагментом DLL3, DLL3-связанным полипептидом, фрагментом DLL3-связанного полипептида или слитым белком DLL3. Альтернативно, агенты, которые предпочтительно взаимодействуют с (т.е. связываются с) DLL3, DLL3 фрагментом, DLL3-связанным полипептидом или фрагментом DLL3-связанного полипептида, определяются в бесклеточной системе анализа за счет контактирования DLL3, DLL3 фрагмента, DLL3-связанного полипептида, фрагмента DLL3связанного полипептида или DLL3 слитого белка с соединением-кандидатом и известным соединением для обеспечения взаимодействия с DLL3, DLL3-связанным полипептидом или DLL3 слитым белком. Как указано выше, способность соединения-кандидата взаимодействовать с DLL3, DLL3 фрагментом, DLL3связанным полипептидом, фрагментом DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитым белком может быть определена с помощью способов известных квалифицированным специалистам в данной области. Данные анализы, будь-то на основе клетки или бесклеточные, могут быть использованы для скрининга множества (например, библиотеки) соединений-кандидатов.
Агенты, которые модулируют (т.е. повышают регуляцию или понижают регуляцию) экспрессию или активность DLL3 или DLL3-связанного полипептида, определяют путем контактирования клеток (например, клетки прокариотического происхождения или эукариотического происхождения), экспрессирующих DLL3 или DLL3-связанный полипептид, с соединением-кандидатом или контрольным соединением (например, фосфатным буферным солевым раствором (PBS)) и определения экспрессии DLL3, DLL3-связанного полипептида или DLL3 слитого белка, мРНК, кодирующей DLL3, или мРНК, кодирующей DLL3-связанный полипептид. Уровень экспрессии DLL3, DLL3-связанного полипептида, мРНК, кодирующей DLL3, или мРНК, кодирующей DLL3-связанный полипептид, в присутствии соединениякандидата сравнивают с уровнем экспрессии DLL3, DLL3-связанного полипептида, мРНК, кодирующей DLL3, или мРНК, кодирующей DLL3-связанный полипептид, в отсутствие соединения-кандидата (например, в присутствии контрольного соединения). Соединение-кандидат затем могут идентифицировать как модулятор экспрессии DLL3 или DLL3-связанного полипептида на основе данного сравнения. Например, когда экспрессия DLL3 или мРНК является значительно большей в присутствии соединениякандидата, чем в его отсутствие, соединение-кандидат идентифицируют как стимулятор экспрессии DLL3 или мРНК. Альтернативно, когда экспрессия DLL3 или мРНК в присутствии соединениякандидата значительно меньше, чем в его отсутствие, то соединение-кандидат идентифицируют как ингибитор экспрессии DLL3 или мРНК. Уровень экспрессии DLL3 или мРНК, кодирующей его, можно определить с помощью указанных способов квалифицированными специалистами в данной области. Например, экспрессия мРНК может быть оценена с помощью анализа Нозерн-блоттинга или ОТ-ПЦР, и уровни белка могут быть оценены с помощью анализа Вестерн-блоттинга.
Агенты, которые модулируют активность DLL3 или DLL3-связанного полипептида, определяются путем контактирования препарата, содержащего DLL3 или DLL3-связанный полипептид или клетки (например прокариотические или эукариотические клетки), экспрессирующие DLL3 или DLL3-связанный
- 22 034182 полипептид, с исследуемым соединением или контрольным соединением и определения способности исследуемого соединения модулировать (например, стимулировать или ингибировать) активность DLL3 или DLL3-связанного полипептида. Активность DLL3 или DLL3-связанного полипептида может быть оценена путем определения индукции клеточного пути сигнальной трансдукции DLL3 или DLL3связанного полипептида (например, внутриклеточный Са2+, диацилглицерин, IP3 и т.д.), детектирования каталитической или ферментной активности мишени на приемлемом субстрате, детектирования индукции рецепторного гена (например, регуляторного элемента, который реагирует с DLL3 или DLL3связанным полипептидом и функционально связывается с нуклеиновой кислотой, кодирующей способный к детектированию маркер, например люциферазу), или детектирования клеточного ответа, например, клеточной дифференцировки или клеточной пролиферации. На основании представленного описания способы, известные квалифицированным специалистам в данной области, могут быть использованы для измерения данных активностей (см., например, патент США № 5401639, который включен в данный документ в качестве ссылки). Соединение-кандидат потом может быть идентифицировано в качестве модулятора активности DLL3 или DLL3-связанного полипептида путем сравнения эффектов соединениякандидата с контрольным соединением. Подходящие контрольные соединения включают фосфатный буферный солевой раствор (PBS) и физиологический солевой раствор (NS).
Агенты, которые модулируют (т.е. повышают регуляцию или понижают регуляцию) экспрессию, активность или как экспрессию, так и активность DLL3 или DLL3 -связанного полипептида, определяются в модели на животных. Примеры приемлемых животных включают мышей, крыс, кроликов, обезьян, морских свинок, собак и кошек. В качестве модели заболеваний предпочтительно используют например ксенотрансплантаты клеточных линий мелкоклеточного рака легких, такие как NCI-H345; ксенотрансплантаты клеточных линий немелкоклеточного рака легких, такие как А549 и Н460; ксенотрансплантаты клеточных линий рака поджелудочной железы, такие как MIA РаСа-2 у безтимусных мышей, Marincola et al., J. Surg Res 1989 Dec; 47(6):520-9; или ксенотрансплантаты клеточных линий рака кожи, такие как MV3 у безтимусных мышей, van Muijen et al., Int. J. Cancer 1991 Apr 22; 48(1):85-91. Они могут быть использованы для тестирования соединений, которые модулируют уровни DLL3, так как патология, продемонстрированная в данных моделях, является аналогичной. Исследуемое соединение или контрольное соединение вводят (например, перорально, ректально или парентерально, например внутрибрюшинно или внутривенно) приемлемому животному и определяют экспрессию, активность или как экспрессию, так и активность DLL3 или DLL3-связанного полипептида. Изменения в экспрессии DLL3 или DLL3связанного полипептида могут быть оценены с помощью способов, описанных выше.
DLL3 или DLL3-связанный полипептид используют как приманку-белок в двух гибридных анализах или трех гибридных анализах, чтобы идентифицировать другие белки, которые связываются с или взаимодействуют с DLL3 или DLL3-связанным полипептидом (см., например патент США № 5283317; Zervos et al. (1993) Cell. 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) BioTechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696 и публикацию РСТ № WO 94/10300). Квалифицированным специалистам в данной области понятно, что такие связывающие белки также могут быть вовлечены в распространение сигналов по DLL3, например, против хода транскрипции или по ходу транскрипции элементов сигнального пути с участием DLL3.
Терапевтические применения DLL3.
Лечение или предупреждения различных заболеваний и расстройств предусматривает введение терапевтического соединения. Такие соединения включают, но не ограничиваются этим, DLL3, DLL3 аналоги, DLL3-связанные полипептиды и его производные и варианты (включая фрагменты); антитела (или другие аффинные реагенты); нуклеиновые кислоты, кодирующие DLL3, DLL3 аналоги, DLL3-связанные полипептиды и их фрагменты; антисмысловые нуклеиновые кислоты гена, кодирующего DLL3 или DLL3-связанный полипептид; и модулятор (например, агонисты и антагонисты) гена, кодирующего DLL3 или DLL3-связанный полипептид. Заболевания , например, могут лечить (например, для уменьшения симптомов или замедления начала или прогрессирования) или предупреждают путем введения терапевтического соединения, которое уменьшает функцию или экспрессию DLL3 в сыворотке или ткани субъектов, имеющих эти заболевания.
Антитела (или другие аффинные реагенты), где каждое из них специфически связывается с DLL3, вводят самостоятельно или в комбинации с одним или больше дополнительных терапевтических соединений или лечений.
Биологический продукт, такой как антитело (или другой аффинный реагент), является аллогенным к субъекту, которому его вводят. Человеческий DLL3 или человеческий DLL3-связанный полипептид, нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий DLL3 или человеческий DLL3-связанный полипептид, или антитело (или другой аффинный реагент) к человеческому DLL3 или человеческому DLL3-связанному полипептиду можно вводить человеку-субъекту для терапии (например, для уменьшения симптомов или замедления начала или прогрессирования) или профилактики.
Не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагается, что терапевтическая активность антител (или других аффинных реагентов), которые специфически связываются с DLL3, может быть достигнута путем феномена антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) (см., например,
- 23 034182
Janeway Jr. C.A. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532; p. 2153-68 and Weng, W-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21; p. 39403947).
Лечение и предупреждения заболеваний.
Заболевания например, лечат или предупреждают путем введения субъекту соединения, которое модулирует (т.е. повышает или понижает) уровень или активность (т.е. функцию) DLL3, который присутствует в сыворотке или ткани субъектов, имеющих одно или больше заболеваний, по сравнению с сывороткой или тканью субъектов, не имеющих заболевания . Заболевания лечат или предупреждают путем введения субъекту соединения, которое повышает регулирование (т.е. понижает) уровень или активность (т.е. функцию) DLL3, который повышается в сыворотке или ткани субъектов, имеющих одно или больше заболеваний. Примеры таких соединений включают, но не ограничиваются этим, DLL3 антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, антитела (или другие аффинные реагенты), направленные против DLL3, и соединения, которые ингибируют ферментную активность DLL3. Другие подходящие соединения, например антагонисты DLL3 и малые молекулы антагонисты DLL3, могут быть идентифицированы, используя анализы in vitro.
Рак могут также лечить или предупреждать путем введения субъекту соединения, которое понижает уровень или активность (т.е. функцию) DLL3, которая повышается в сыворотке или ткани субъектов, имеющих такой рак. Примеры таких соединений включают, но не ограничиваются этим, DLL3, DLL3 фрагменты и DLL3-связанные полипептиды; нуклеиновые кислоты, кодирующие DLL3, DLL3 фрагмент и DLL3-связанный полипептид (например, для использования в генной терапии); и для тех DLL3 или DLL3-связанных полипептидов с ферментной активностью соединений или молекул, которые, как известно, модулируют ферментную активность. Другие соединения, которые могут быть использованы, например агонисты DLL3, могут быть идентифицированы, используя анализы in vitro.
Терапия или профилактика специально разрабатывается в соответствии с потребностями отдельного субъекта. Таким образом, соединения, которые влияют на уровень или функции DLL3, терапевтически или профилактически вводят субъекту, у которого подозревается или установлен рак, при котором уровни или активность DLL3 отсутствует или снижена по отношению к контрольному или нормальному диапазону референсных значений. Соединения, которые влияют на уровень или активность DLL3, терапевтически или профилактически вводят субъекту с подозрением или для которого известно, что у него рак, при котором уровни или активность DLL3 повышены по отношению к контрольному или нормальному диапазону референсных значений. Соединения, которые повышают уровень или активность DLL3, терапевтически или профилактически вводят субъекту с подозрением или о котором известно, что у него рак при котором уровни или активность DLL3 повышена по отношению к контрольному или диапазону референсных значений. Соединения, которые уменьшают уровень или активность DLL3, терапевтически или профилактически вводят субъекту с подозрением или о котором известно, что у него рак, у которого уровни или активность DLL3 снижена по отношению к контрольному или к диапазону референсных значений. Изменение DLL3 активности или уровня из-за введения таких соединений может быть легко обнаружена, например, путем получения образца (например, крови или мочи) и анализа in vitro уровней или активностей DLL3, или уровней мРНК, кодирующей DLL3, или их комбинации. Такие анализы могут быть выполнены перед и после введения соединения, как описано в данном документе.
Вакцинная терапия.
Иммуногенная композиция, соответствующая вакцинная композиция может содержать DLL3 или эпитоп, содержащий фрагмент или нуклеиновую кислоту, кодирующую DLL3 или его фрагмент необязательно вместе с иммуностимулятором.
Способ повышения иммунного ответа может включать введение субъекту таких композиций, а способ лечения или профилактики рака включать введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества таких композиций.
Таким образом, DLL3 может быть полезным в качестве антигенного материала и может быть использован в производстве вакцин для лечения или профилактики рака. Такой материал может быть антигенным и/или иммуногенным. Как правило, под антигенным понимается, что белок способен использоваться для вырабатывания антител (или других аффинных реагентов) или даже способен индуцировать гуморальный иммунный ответ у субъекта или экспериментального животного. Под иммуногенным понимается, что белок способен вызывать иммунный ответ, такой как защитный иммунный ответ у субъекта или экспериментального животного. Таким образом, в последнем случае белок может быть способен не только генерировать антительный ответ, но, кроме того, не основанный на антителе иммунный ответ. Генерирование соответствующего иммунного ответа может потребовать присутствия одного или больше вспомогательных веществ и/или соответствующего антигена.
Квалифицированному специалисту в данной области понятно, что гомологам или производным DLL3 также будет найдено применение в качестве антигенного/иммуногенного материала. Возможна замена одной аминокислоты на другие подобного типа, например, замена одной гидрофобной аминокислоты на другие. При этом может использоваться программа, такая как CLUSTAL программа, чтобы
- 24 034182 сравнивать аминокислотные последовательности. Данная программа сравнивает аминокислотные последовательности и находит оптимальное выравнивание путем вставки пробелов в каком-либо порядке. Существует возможность рассчитать аминокислотную идентичность или подобность (идентичность плюс сохранение аминокислотного типа) для оптимального выравнивания. Такая программа, как BLASTx, способна согласовывать самые длинные фрагменты секвенирования подобных последовательностей, и присваивать значение подгонки. Таким образом, можно установить несколько областей подобия, каждая из которых имеет различные оценки.
В случае гомологов и производных, степень идентичности с белком менее важна, чем то, что гомолог или производное должно сохранить свою антигенность и/или иммуногенность. Соответственно, предусмотрены гомологи или производные, имеющие по меньшей мере 60% подобия (как описано выше) с белками или полипептидами, описанными в данном документе, например предусмотрены гомологи или производные, имеющие по меньшей мере 70% подобия, например по меньшей мере 80% подобия. В частности, предусмотрены гомологи или производные, имеющие по меньшей мере 90 или даже 95% подобия. Соответственно, гомологи или производные по крайней мере на 60% идентичны последовательности белков или полипептидов, описанных в данном документе. Предпочтительно гомологи или производные по меньшей мере на 70% идентичны, более предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичны. Наиболее предпочтительно гомологи или производные по меньшей мере на 90 или даже 95% идентичны.
Гомологи или производные могут быть слитыми белками, включая фрагменты, которые делают очистку легче, например, путем введения метки целевому белку или полипептиду. При этом после удаления метки, слитый белок сохраняет достаточную антигенность, что делает его полезным.
Существует возможность осуществлять скрининг антигенного белка или полипептида для того, чтобы идентифицировать эпитопные области, т.е. те области, которые ответственны за антигенность или иммуногенность белка или полипептида. Такие способы, хорошо известные квалифицированному специалисту, могут быть использованы для исследования фрагментов, и/или гомологов, и/или производных на антигенность. Таким образом, фрагменты должны включать одну или больше эпитопных областей или быть в значительной степени подобными таким областям, чтобы сохранить их антигенные/иммуногенные свойства. Таким образом, для фрагментов степень идентичности возможно не имеет значения, так как они могут быть на 100% идентичными определенной части белка или полипептида, гомолога или производного, как описано в данном документе. Ключевой проблемой является лишь то, чтобы фрагмент сохранял антигенные/иммуногенные свойства белка, из которого его получают.
Что важно для гомологов, производных и фрагментов, это то, чтобы они сохраняли, по крайней мере, некоторую степень антигенности/иммуногенности белка или полипептида, из которого они получены..
DLL3 или антигенные его фрагменты могут быть очищены или выделены в виде отдельного препарата. Они могут быть включены в смеси с одним или несколькими другими белками или их антигенными фрагментами. Вакцинная композиция может быть или профилактической, или терапевтической вакцинной композицией.
Вакцинные композиции могут включать один или несколько вспомогательных веществ (иммуностимуляторов). Примеры хорошо известных в данной области вспомогательных веществ включают неорганические гели, такие как гидроксид алюминия, и эмульсии вода-в-масле, такие как неполный адъювант Фрейнда. Другие полезные вспомогательные вещества хорошо известны квалифицированному специалисту.
Подходящие вспомогательные вещества для использования в вакцинной композиции для лечения рака включают 3De-O- ацилированный монофосфориллипид А (известный как 3D-MPL или просто MPL, см. WO 92/116556), сапонин, например QS21 или QS7, и TLR4 агонисты, такие как CpG-содержащая молекула, например, как раскрыто в WO 95/26204. Используемые вспомогательные вещества могут представлять собой комбинацию компонентов, например MPL и QS21, или MPL, QS21 и CpG-содержащей фрагмент. Вспомогательные вещества могут быть включены в эмульсию масло-в-воде или липосомные препараты. Такие препараты могут включать другие носители.
Препарат из олигонуклеотидов, который включает 10 или больше следующих друг за другом нуклеотидов, комплементарных к нуклеотидной последовательности, кодирующей DLL3, или пептидные фрагменты DLL3, используют как вакцины для лечения рака. Такие препараты могут включать вспомогательные вещества или другие носители.
Ингибирование DLL3 для лечения заболеваний.
Рак можно лечить или предупреждать путем введения соединения, которое противодействует (ингибирует) уровень и/или активность DLL3, которые повышены в сыворотке или ткани субъекта, имеющего такой рак, по сравнению с сывороткой или тканью субъектов, у которых нет такого рака.
Соединения, применяемые для этой цели, включают, но не ограничиваются анти-ОКС3 антителами (или другими аффинными реагентами, и фрагментами и производными, содержащими область связывания), DLL3 антисмысловые или рибозимные нуклеиновые кислоты и нуклеиновые кислоты, кодирующие бифункциональный DLL3, которые могут быть использованы для нокаута эндогенной функции DLL3
- 25 034182 за счет гомологичной рекомбинации (см., например, Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Другие соединения, которые ингибируют активность DLL3, могут быть идентифицированы путем использования известных анализов in vitro, например анализов, которые касаются способности исследуемого соединения ингибировать связывание DLL3 с другим белком или его партнером или ингибировать активность DLL3.
Такое ингибирование, например, может быть проанализировано in vitro или в клеточной культуре, но также могут быть использованы генетические анализы. Предпочтительные технологии также могут использоваться для обнаружения уровней DLL3 перед и после введения соединения. Приемлемые in vitro или in vivo анализы применяют, чтобы определить эффект конкретного соединения, а также установить, обеспечит ли его введение лечение пораженной ткани, как описано более детально ниже.
Соединение, которое ингибирует функцию DLL3 (активность), вводят терапевтически или профилактически субъекту, у которого определяется повышенный сывороточный или тканевой уровень или функциональная активность DLL3 (который, например, больше чем нормальный уровень или требуемый уровень) по сравнению с сывороткой или тканью у субъектов, которые не получают лечения. При этом необходимо довести его до уровня или активности, которые имеются у субъектов без такого рака, или до уровня заранее определенного диапазона значений. Для измерения увеличения уровня или функции DLL3 могут быть использованы способы стандартные в данной области. Подходящие ингибирующие композиции DLL3 могут, например, включать малые молекулы, т.е. молекулы 1000 Да или меньше. Такие малые молекулы могут быть идентифицированы с помощью способов скрининга, описанных в данном документе.
Анализы терапевтических или профилактических соединений.
Можно проводить скрининг соединений, которые модулируют активность DLL3, для этого осуществляют: (а) контактирование DLL3 или биологически активной его части с соединением-кандидатом; и (b) определение, модулируется ли активность DLL3 таким образом. Такой способ может включать (а) контактирование DLL3 или его биологически активной части с соединением-кандидатом в образце; и (b) сравнение активности DLL3 или его биологически активной части в указанном образце после контакта с указанным соединением-кандидатом с активностью DLL3 или его биологически активной части в указанном образце перед контактированием с указанным соединением-кандидатом или сравнением с референсным уровнем активности.
Способ скрининга может представлять собой способ скрининга соединений, которые ингибируют активность DLL3.
DLL3 или его биологически активная часть может, например, быть экспрессирована на или в клетке. DLL3 или его биологически активная часть может, например, быть выделена из клеток, которые экспрессируют его. DLL3 или его биологически активная часть может, например, быть иммобилизованной на твердой фазе.
Кроме того, возможно проведение скрининга соединений, которые модулируют экспрессию DLL3 или нуклеиновой кислоты, кодирующей DLL3, которое включает: (а) контактирование клеток, экспрессирующих DLL3, или нуклеиновой кислоты, кодирующей DLL3, с соединением-кандидатом; и (b) определение модулируется ли экспрессия DLL3 или нуклеиновой кислоты, кодирующей DLL3. Такой способ может включать (а) контактирование клеток, экспрессирующих DLL3, или нуклеиновой кислоты, кодирующей DLL3, с соединением-кандидатом в образце; и (b) сравнение экспрессии DLL3 или нуклеиновой кислоты, кодирующей DLL3, в указанном образце после контактирования с указанным соединениемкандидатом, с экспрессией DLL3 или нуклеиновой кислоты, кодирующей DLL3, в указанном образце перед контактированием с указанным соединением-кандидатом или сравнением с референсным уровнем экспрессии.
Способ может представлять собой способ скрининга соединений, которые ингибируют экспрессию DLL3 или нуклеиновой кислоты, кодирующей DLL3.
Полученные в результате такого скрининга соединения можно применять для лечения или профилактики рака. Способ лечения или предупреждения рака включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества такого соединения.
Исследуемые соединения могут быть проанализированы на их способность восстанавливать уровни DLL3 у субъекта, болеющего раком, до уровней, найденных у субъектов без таких видов рака, или получить подобные изменения на экспериментальных моделях на животных с такими видами рака. Соединения, способные восстановить уровень DLL3 у субъекта, имеющего, например, болезни до найденных у субъектов без таких видов рака или до измеренных на экспериментальных моделях животных с такими раковыми заболеваниями, могут быть использованы в качестве соединений для получения нового лекарственного средства. Экспрессия DLL3 может быть проанализирована с помощью предпочтительных технологий, а именно иммунологическим анализом, гель-электрофорезом с последующей визуализацией, обнаружением активности DLL3, или каким-либо другим способом, предлагаемым в данном документе, или известным квалифицированному специалисту в данной области с уровня техники. Такие анализы могут быть использованы, чтобы выявить кандидата для лекарственного средства, клинического мониторинга, где относительное содержание DLL3 может служить маркером клинической картины заболевания.
- 26 034182
Анализы могут быть выполнены на клетках, на клетках, вовлеченных в расстройство субъекта, чтобы определить, обладает ли соединение требуемым эффектом на такие клетки.
Соединения для терапии могут быть исследованы в приемлемых системах моделей на животных перед исследованием на людях, включая, но не ограничиваясь крысами, мышами, курами, коровами, обезьянами, кроликами и т.д. Для исследования in vivo перед тем как вводить человеку может быть использована любая модельная система на животных, известная в данной области уровня техники. Примеры моделей заболеваний на животных включают клеточные линии ксенотрансплантатов мелкоклеточного рака легких, такие как NCI-H345; клеточные линии ксенотрансплантатов немелкоклеточного рака легких, такие как А549 и Н460; клеточные линии ксенотрансплантатов рака поджелудочной железы, такие как MIA РаСа-2 у безтимусных мышей, Marincola et al., J. Surg. Res. 1989 Dec; 47(6):520-9 или клеточные линии ксенотрансплантатов рака кожи, такие как MV3 у безтимусных мышей, van Muijen et al., Int. J. Cancer 1991 Apr 22; 48(1):85-91. Они могут быть использованы для тестирования соединений, которые модулируют уровни DLL3, так как патология, продемонстрированная на данных моделях, является аналогичной заболеваниям. Кроме того, квалифицированному специалисту очевидно, что трансгенные животные могут быть получены с нокаут мутациями в гене или генах, кодирующих DLL3. Нокаут мутация гена представляет собой мутацию, которая приводит к тому, что мутированный ген не экспрессируется или экспрессируется в аберрантной форме или на низком уровне так, что активность, связанная с генным продуктом почти или полностью, отсутствует. Предпочтительно трансгенное животное является млекопитающим; более предпочтительно трансгенное животное представляет собой мышь.
Тестируемые соединения могут быть проанализированы на их способность восстанавливать уровни DLL3 у субъекта, имеющего, например, заболевания по отношению к уровням, найденным у субъектов без рака. Причем изучить подобные изменения можно на экспериментальных моделях на животных с таким видом рака. Соединения, способные восстановить уровень DLL3 у субъекта, имеющего болезни, по отношению к уровням, определенным у субъектов без таких видов рака. Причем они могут произвести аналогичные изменения на экспериментальных моделях на животных с таким раковыми заболеваниями для дальнейшего создания новых лекарств. DLL3 могут быть проанализированы с помощью предпочтительных технологий, иммуноанализа, гель-электрофореза с последующим визуализацей, обнаружением DLL3 активности или любым другим способом, известным специалистам в данной области. Такие анализы могут быть использованы для скрининга лекарств-кандидатов, в клиническом мониторинге или при разработке лекарственных средств, где повышенное содержание DLL3 может служить в качестве маркера клинической картины заболевания.
Соединения, которые модулируют экспрессию DLL3, можно определять на животных (мышах, крысах, обезьянах, кроликах, морских свинках), предпочтительно в моделях заболеваний, экспрессирующих DLL3. Исследуемое соединение или контрольное соединение вводят животным и определяют эффект исследуемого соединения на экспрессию DLL3. Исследуемое соединение, которое меняет экспрессию DLL3, может быть идентифицировано путем сравнения уровня DLL3 (или мРНК, кодирующей DLL3) у животного или группы животных, которых лечат исследуемым соединением, с уровнем DLL3 или мРНК у животного или группы животных, которых лечат контрольным соединением. Способы, известные квалифицированным специалистам в данной области, могут быть использованы, чтобы определить уровни мРНК и белка, например, in situ гибридизацией in situ. Животные могут или не могут быть умерщвлены, чтобы проанализировать эффекты исследуемого соединения.
Соединения, которые модулируют активность DLL3 или его биологически активной части, определяются на животных (например, мышах, крысах, обезьянах, кроликах, морских свинках), предпочтительно на моделях заболеваний, экспрессирующих DLL3. Исследуемые соединения или контрольное соединение вводят животному и определяют эффект исследуемого соединения на активность DLL3. Исследуемое соединение, которое меняет активность DLL3, может быть идентифицировано путем анализа животных, которых лечат контрольным соединением, и животных, которых лечат исследуемым соединением. Активность DLL3 может быть оценена путем определения индукции клеточного вторичного мессенджера DLL3 (например, внутриклеточного Са2+, диацилглицерина, IP3 и т.д.), обнаружения каталитической или ферментативной активности DLL3 или его партнеров, обнаружения индукции репортерного гена (например, регуляторного элемента, который реагирует на DLL3, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей детектируемый маркер, такой как люцифераза или зеленый флуоресцентный белок) или обнаружения клеточного ответа (например, клеточной дифференциации или пролиферации клеток). Способы, известные квалифицированным специалистам в данной области, могут быть использованы для обнаружения изменений в активности DLL3 (см., например, в патенте США 5401639, который включен в данный документ в качестве ссылки).
Исследуемые соединения, которые модулируют уровень или экспрессию DLL3, определяются на человеке, имеющем заболевание, предпочтительно он имеет, например, тяжелое заболевание. Исследуемое соединение или контрольное соединение вводят человеку-субъекту, и эффект исследуемого соединения на DLL3 экспрессию определяется путем анализа экспрессии DLL3 или кодирующей мРНК в том же самом биологическом образце (например, сыворотка, плазма или моча). Исследуемое соединение, которое меняет экспрессию DLL3, может быть идентифицировано путем сравнения уровня DLL3 или
- 27 034182 кодирующей мРНК у субъекта или группы субъектов, которых лечат контрольным соединением. Кроме того, изменения в экспрессии DLL3 могут быть идентифицированы путем сравнения уровня DLL3 или кодирующей мРНК у субъекта или группы субъектов до и после введения исследуемого соединения. Чтобы получить биологические образцы и проанализировать экспрессию мРНК или белка, могут быть использованы способы, известные квалифицированным специалистам в данной области. Например, предпочтительные технологии, описанные в данном документе, могут быть использованы для оценки изменений в уровне DLL3.
Исследуемые соединения, которые модулируют активность DLL3 определяются у людей, имеющих заболевания (предпочтительно тяжелое заболевание). Исследуемое соединение или контрольное соединение вводят человеку-субъекту и определяют эффект исследуемого соединения на активность DLL3. Исследуемое соединение, которое меняет активности DLL3, может быть идентифицировано путем сравнения биологических образцов пациентов, получавших контрольное соединение, с образцами пациентов, получавших исследуемые соединения. Альтернативно, изменения в активности DLL3 могут быть идентифицированы путем сравнения активности DLL3 у субъекта или группы субъектов перед и после введения исследуемого соединения. Активность DLL3 может быть оценена путем обнаружения в биологическом образце (например, сыворотке, плазме или моче) индукции клеточного сигнального пути трансдукции DLL3 (например, внутриклеточный Са2+, диацилглицерин, IP3 и т.д.), каталитической или ферментной активности DLL3 или его партнера, или клеточного ответа, например клеточной дифференциации или клеточной пролиферации. Способы, известные квалифицированным специалистам в данной области, могут быть использованы, чтобы установить изменения в индукции вторичного мессенджера DLL3 или изменения в клеточном ответе. Например, РТ-ПЦР могут использовать, чтобы определить изменения в индукции клеточного вторичного мессенджера.
Исследуемое соединение, которое изменяет уровень или экспрессию DLL3 в направлении уровней, обнаруженных у контрольных субъектов (например, людей, не имеющих заболевания), выбирают для дальнейшего исследования или терапии. Исследуемое соединение, которое изменяет активность DLL3 до активности, найденной у контрольных субъектов (например, людей, не имеющих заболевания), выбирают для дальнейшего исследования или терапевтического использования.
Исследуемые соединения, которые снижают степень тяжести одного или нескольких симптомов, связанных с заболеваниями, определяются на человеке, который имеет заболевания, предпочтительно на субъектах с тяжелыми заболеваниями. Исследуемое соединение или контрольное соединение вводят субъектам и определяют эффект исследуемого соединения по меньшей мере на один из симптомов заболеваний. Исследуемое соединение, которое уменьшает по меньшей мере один из симптомов, может быть идентифицировано путем сравнения субъектов, которых лечат контрольным соединением, с субъектами, которых лечат исследуемым соединением. Способы, известные врачам, могут быть использованы, чтобы определить, уменьшает ли исследуемое соединение по меньшей мере один из симптомов. Например, исследуемое соединение, которое уменьшает нагрузку опухоли у субъекта, а значит будет полезным для него.
Исследуемое соединение, которое снижает степень тяжести по меньшей мере одного симптома, связанного с раком, выбирают для дальнейшего исследования или терапии.
Терапевтические и профилактические композиции и их использование.
Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения соединения, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать соединение, опосредованный эндоцитоз рецепторов (см., например, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструирование нуклеиновой кислоты в составе ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения могут быть энтеральными или парентеральными и включают, но не ограничиваются внутрикожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, подкожным, интраназальным, эпидуральным и пероральным введением. Соединения могут быть введены каким-либо удобным способом, например путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые накладки (например, через слизистую оболочку полости рта, прямой кишки и слизистую оболочку кишечника и т.д.) и могут быть введены вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, может быть осуществлено введение фармацевтических композиций в центральную нервную систему каким-либо подходящим способом, в том числе путем внутрижелудочкового и интратекального введения. Внутрижелудочковая инъекция может быть облегчена путем внутрижелудочкового катетера, например, прикрепленного к резервуару, такому как резервуар Ommaya. Легочное введение можно также использовать, например, путем использования ингалятора или распылителя и препарата с аэрозольным агентом.
Нуклеиновая кислота может быть доставлена в дерму, например, с использованием частиц опосредованной эпидермальной доставки.
Возможно введение фармацевтической композиции локально в область, нуждающуюся в лечении; это может быть достигнуто, например, местной инфузией во время операции, местным нанесением, например путем инъекции, посредством катетера или посредством имплантата, где указанный имплантат выполнен из пористого, не пористого или желатинового материала, включая мембраны или волокна.
- 28 034182
Введение может быть осуществлено путем непосредственной инъекции, например, в легкое, поджелудочную железу и ткани кожи или в место (или бывшее место) злокачественной опухоли или неопластической или пренеопластической ткани.
Соединение может быть доставлено в емкости, в частности в липосоме (см. Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; см. там же).
Соединение может быть доставлено в системе с контролируемым высвобождением. Может быть использован насос (см. Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Могут быть использованы полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). Система с регулируемым высвобождением может быть помещена вблизи терапевтической мишени, дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115138 (1984)). Другие системы с контролируемым высвобождением описаны в обзоре Langer (1990, Science 249:1527-1533).
Соединение согласно изобретению может представлять собой нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, нуклеиновая кислота может быть введена in vivo, чтобы способствовать экспрессии кодируемого ею белка, путем конструирования его, как части соответствующего вектора экспрессии, и введения его таким образом, что он становится внутриклеточным, например, с использованием ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или путем прямой инъекции, или путем использования бомбардировки микрочастицами (например, с помощью генной пушки; Biolistic, Dupont), или покрытия липидами, или рецепторами клеточной поверхности или трансфекции агентов, или путем введения его в связи с гомеобоксом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868) и т.д. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть введена внутриклеточно и включена в ДНК клетки-хозяина за счет гомологичной рекомбинации для экспрессии.
Композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления термин фармацевтически приемлемый означает одобренный Федеральным или государственным ведомством или перечисленный в Фармакопее США как правило, в общепризнанных фармакопеях для использования на животных и более конкретно на человеке. Термин носитель касается разбавителя, вспомогательного вещества, наполнителя или носителя, с которым вводят терапевтический агент. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масло, включая нефти, масло животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол. Композиция, при необходимости, могут также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН буферных агентов. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций с замедленным высвобождением и т.п. Композиция может быть приготовлена в виде суппозитория с традиционными связывающими агентами и носителями, такими как триглицериды. Пероральные препараты могут включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences от EW Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество соединения, например, в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя так, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения субъекту. Препарат должен соответствовать способу введения.
В случае применения одного или нескольких антител композицию получают в соответствии с рутинными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Если необходимо, композиция может также включать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Как правило, ингредиенты поставляются либо раздельно, либо в смеси вместе в единичной дозированной форме, например в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Когда композиция предназначена для введения путем инфузии, она может быть налита в инфузионный флакон, содержащий стерильную воду фармацевтической чистоты или физиологический раствор. Когда композицию вводят путем инъекции, ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора
- 29 034182 перед ведением содержит смесь ингредиентов.
Соединения могут быть приготовлены в виде нейтральной или солевой формы. Фармацевтически приемлемые соли, где это уместно, включают соли, образованные со свободными аминогруппами, которые получены из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные из свободных карбоксильных групп, которые получены из натрия, калия, аммония, кальция, железа гидроксида, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.п.
Количество соединения, которое будет эффективно для лечения рака, может быть определено стандартными клиническими методами. Кроме того, анализы in vitro могут быть использованы, чтобы помочь определить оптимальный диапазон доз. Точная доза, используемая в композиции, также будет зависеть от пути введения и серьезности заболевания или расстройства и должна устанавливаться в соответствии с решением врача и обстоятельствами каждого субъекта. Однако подходящие пределы доз для внутривенного введения, как правило, составляют приблизительно 20-500 мкг активного соединения на 1 кг массы тела. Подходящие диапазоны доз для интраназального введения, как правило, составляют приблизительно от 0,01 пг/кг массы тела до 1 мг/кг массы тела. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-эффект, полученных in vitro и в тест-системах модели на животных.
Суппозитории обычно содержат активный ингредиент в диапазоне от 0,5 до 10 мас.%; пероральные композиции предпочтительно содержат от 10 до 95% активного ингредиента.
Набор может содержать антитела. Они могут быть лиофилизированными для восстановления перед введением или использованием. Если набор предназначен для лечения рака, антитело может быть восстановлено изотоническим водным раствором, который необязательно может быть включен в набор. Набор может включать полипептид, такой как иммуногенный полипептид, который может быть, например, лиофилизированным. Набор дополнительно может содержать вспомогательное вещество для реконструирования иммуногенного полипептида.
Лекарственное средство может по отдельности или вместе содержать:
(а) аффинные реагенты, которые связываются с DLL3, и (б) противораковое средство или другой активный агент, для одновременного, последовательного или раздельного введения при лечении рака.
Определение избыточного содержания DLL3 с помощью технологии создания/обработки изображений.
Преимуществом определения избыточного содержания_DLL3 с помощью технологии создания/обработки изображений может быть то, что такой способ является неинвазивным (кроме того, что реагенты должны быть введены), и нет никакой необходимости извлекать образец у субъекта.
Приемлемая технология создания/обработки изображений включает изображение позитронноэмиссионной томографии (ПЭТ) и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ). Визуализация DLL3 с использованием таких методов требует включения или связывания с подходящей меткой, например, радиотрейсером, таким как 18F, 11C или 123I (см., например, NeuroRx - The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics (2005) 2(2), 348-360 and idem pages 361-371 для более подробной информации о методах). Радиоактивные или другие метки могут быть включены в DLL3 путем введения субъекту (например, путем инъекции) соответственно меченного специфически лиганда. В качестве альтернативы они могут быть включены в аффинный реагент связывания (например, антитела), специфический для DLL3, который можно вводить субъекту (например, путем инъекции). Для обсуждения использования аффибоди для работы с изображениями, например, см. Orlova A., Magnusson M., Eriksson T.L., Nilsson M., Larsson В., Hoiden-Guthenberg I., Widstrom С., Carlsson J., Tolmachev V., Stahl S., Nilsson F.Y., Tumor imaging using a picomolar affinity HER2 binding Affibody molecule, Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4339-48).
Диагностика и лечение рака с использованием иммуногистохимии.
Иммуногистохимия является отличной методикой обнаружения и, следовательно, может быть пригодна для диагностики и лечения рака. Иммуногистохимия может быть использована для обнаружения, диагностики или мониторинга рака через обнаружение DLL3 антигенов в срезах тканей путем использования меченых антител (или других аффинных реагентов), их производных и аналогов, которые специфически связываются с DLL3. Это осуществляется благодаря использованию специфических реагентов для выявления взаимодействия антиген-антитело, которое визуализируется благодаря маркеру, такому как флуоресцентный краситель, фермент, радиоактивный элемент или коллоидное золото.
Продвижение технологии моноклональных антител имеет большое значение для современной точной микроскопической диагностики новообразований человека. Идентификация распространяемых неопластических трансформированных клеток с помощью иммуногистохимии позволяет получить более четкое представление о раке и метастазах, а также эволюции опухолевых клеток, связанных с иммунофенотипом. Будущие противоопухолевые терапевтические подходы могут включать различные индивидуальные иммунотерапии, специфичные для конкретного иммунофенотипа, связанного с опухолевыми заболеваниями каждого отдельного пациента. Для дальнейшего обсуждения см., например Bodey В., The significance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms, Expert Opin Biol Ther. 2002 Apr; 2(4):371-93.
- 30 034182
Изобретение иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Идентификация DLL3, экспрессируемого в немелкоклеточном раке легкого, мелкоклеточном раке легкого, раке поджелудочной железы и раке кожи, в ткани образцов с использованием жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC/MS).
С помощью следующего протокола мембранные белки, выделенные из образцов ткани немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы и рака кожи и соответствующих нормальным или нормальных соседних тканей (HAT), были расщеплены, и полученные пептиды секвенировали тандемной масс-спектрометрией.
1.1. Материалы и методы.
1.1.1. Фракционирование плазматической мембраны.
Клетки, извлеченные из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы или рака кожи или нормальной или обычной прилегающей ткани, гомогенизировали и подвергали центрифугированию при 1000xg. Супернатант отделяли и ультрацентрифугировали при 49500xg. Полученный осадок повторно гомогенизировали и разделяли центрифугированием со ступенчатым градиентом плотности сахарозы. После ультрацентрифугирования при 107000xg фракции на границе раздела фаз извлекали и осаждали.
1.1.2. Растворение плазматической мембраны.
Плазменные мембранные фракции ресуспендировали в SDS (додецилсульфат натрия), чтобы получить конечную концентрацию SDS 0,5%, центрифугировали и экстрагировали растворенный белок.
1.1.3. Трипсинолиз.
Для расщепления в растворе объем раствора, содержащего 50 мкг белка, доводили до 100 мкл с помощью 200 мМ бикарбоната аммония. 10 мкл восстановителя DL-дитиотреитола (75 мМ) были добавлены к образцу и инкубировали при 80°С в течение 15 мин. Затем последовала стадия защиты цистеина с использованием 10 мкл 150 мМ иодацетамида и инкубирование в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Концентрацию SDS затем понижали до 0,05% добавлением сверхчистой воды. Достаточный объем трипсина (Promega V5111) добавляли к смеси из расчета 1 мкг трипсина на 2,75 мкг белка и инкубировали в течение ночи при 37°С.
Альтернативно, 105 мкг белкового раствора были восстановлены с помощью 3 мкл 50 мМ ТСЕР и инкубирования при 60°С в течение 1 ч. Затем образец обрабатывали на FASP фильтрации устройств расщепления Protein Digestion Kit (Protein Discovery) в соответствии с инструкциями заводаизготовителя, но с использованием бикарбоната триэтиламмония вместо бикарбоната аммония. Трипсинолиз проводили в конечном объеме 75 мкл, используя 1 мкг трипсина на 50 мкг белка.
1.1.4. Фракционирование пептидов.
Расщепленные образцы белка сушили под вакуумом, ресуспендировали в 0,1% водном растворе муравьиной кислоты и трифторуксусную кислоту (TFA) добавляли для снижения рН раствора до <3. Пептиды были разделены путем ионного обмена с использованием колонки Agilent Zorbax Bio-Strong Cation Exchange Series II на системе жидкостной хроматографии Agilent LC1200 Series. В качестве альтернативы фракционатор Agilent 3100 OFFGEL и OFFGEL Kit рН 3-10 были использованы для разделения на основе pI в соответствии с протоколом поставщика. После повторного увлажнения полос IPG равные объемы мембранного гидролизата были загружены в каждую лунку. После отделения полученные фракции подкисляли.
1.1.5. Масс-спектрометрия.
Фракционированные образцы были проанализированы с помощью жидкостной хроматографиимасс-спектрометрии с использованием Waters nanoACQUITY UPLC System, оснащенной колонкой nanoACQUITY UPLC ВЕН 130 C18, 75 мкм x 250 мм (186003545) и LTQ Orbitrap Velos (компании Thermo Fisher Scientific). Пептиды элюировали 300 нл/мин с градиентом повышения от 3 до 35% ацетонитрила в течение 120 мин. Масс-спектры полного сканирования были получены при разрешающей способности 60000 между 400-2000 м/з диапазона масс в Orbitrap. В каждом цикле двадцать наиболее интенсивных пептидов были отобраны для CID MS/MS сканирования в линейной ионной ловушке с нанораспылительным источником ионов, установленным на приборе.
1.1.6. Анализ аминокислотной последовательности пептида.
Исходные данные, полученные от LTQ Orbitrap Velos, были обработаны с помощью программного обеспечения талисман (Matrix Science), который использует алгоритм Mowse (Curr Biol. 1993 Jun 1; 3(6):327-3), для выведения аминокислотных последовательностей из пиковых списков путем поиска в базе данных последовательности, состоящей из Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), IPI (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) и Swissprot (http://www.uniprot.org) на фоне загрязняющих белковых последовательностей. В критерии для идентификации пептидов входит трипсиновое расщепление вплоть до 2 ошибочных сайтов расщепления и различные биологические и химические модификации (окисленный метионин, модифицированный цистеином MMTS или иодацетамидом и фосфорилированный серин, треонин и тирозин). Пептиды, имеющие ранг 1 с ожидаемым значением 0,05% или менее, ионным индексом 28 или выше, загружали в базе данных OGAP, где они были обработаны в белковые группы.
- 31 034182
1.1.7. Дискриминация белков, связанных с немелкоклеточным раком легкого, мелкоклеточным раком легкого, раком поджелудочной железы и раком кожи.
В процессе идентификации DLL3 использовали пептидные последовательности, полученные экспериментально путем масс-спектрометрии, как описано выше, из естественных белков человека, чтобы определить и упорядочить кодирующие экзоны в опубликованной последовательности генома человека. Эти экспериментально определенные последовательности, указанные в табл. 1, сравнивались с базой данных OGAP®, которая была составлена в результате обработки и интеграции пептидных масс, пептидных подписей, EST и Public Domain Genomic Sequence Data, как описано в международной патентной заявке WO 2009/087462.
Таблица 1 DLL3 специфические пептиды, идентифицированные ЖХ/МС в плазме мембран образцов тканей немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы и рака кожи
SEQ ID No Идентифицированный Пептид
SEQ ID No: 5 VCLKPGLSEEAAESPCALGAALSAR
SEQ ID No 6 AGAWELR
SEQ ID No 7 СЕРРА VGTACTR
SEQ ID No: 8 AGCSPEHGFCEQPGECR
SEQ ID No:9 SFECTCPR
SEQ ID No: 10 NGGLCLDLGHALR
SEQ ID No 11 CSCALGFGGR
1.1.8. Индекс белка.
Индекс белка является мерой как распространенности белка, так и относительного избытка пептида. Алгоритм учитывает как количество образцов, в которых наблюдался белок и количество наблюдаемых пептидов, против пептидов, способных наблюдаться в каждом образце. Полученное в результате значение затем ранжированы попарным сравнением соответствующих нормальных образцов против образцов рака.
1.2. Результаты.
Эти эксперименты идентифицировали DLL3, как в дальнейшем описано в данном документе. Полноцепочечный DLL3 был обнаружен в мембране образцов тканей немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы и рака кожи. Табл. 2 показывает распределение экспрессии DLL3, измеряемой индексом белка. Выражение DLL3 в этих раковых тканях указывает, что DLL3 является ценным терапевтической и диагностической мишенью в этих видах рака.
Таблица 2
Белки DLL3 индекс (+++++ = очень высокий; ++++ = высокий; +++ = средний; ++ = низкий; + = очень низкий; - = не наблюдается)
Ткань Раковая Нормальная
Немелкоклеточная легкого + -
Поджелудочная железа + -
Кожа + -
Мелкоклеточная легкого + -
Пример 2. Специфика антител к DLL3. Определяется проточной цитометрией.
Специфичность поликлональных антител к DLL3 была протестирована с помощью проточной цитометрии и осуществлялась для DLL3-экспрессирующих клеточных линий.
Материалы и методы.
Анти-ОЕЕЗ антитела инкубировали с DLL3-экспрессирующими клетками SHP-77. Клетки промывали в FACS буфере (DPBS, 2% FBS), центрифугировали и ресуспендировали в 100 мкл разбавленного первичного SHP-77 антитела (также разбавленном в FACS буфере). Комплекс антитело-Н322 инкубировали на льду в течение 60 мин, а затем дважды промывали FACS буфером, как описано выше. Пеллеты клеточных антител ресуспендировали в 100 мкл разбавленного вторичного антитела (также разбавленного в FACS буфере) и инкубировали в течение 60 мин на льду. Осадок промывали, как и прежде, и суспендировали в 200 мкл FACS буфера. Образцы были загружены в BD FACSCanto II цитометр и данные анализировали с помощью программного обеспечения BD FACSdiva.
Результаты.
Результаты проточной цитометрии показали, что анти-SHP-77 поликлональные антитела эффективно связаны с клеточно-поверхностным человеческим DLL3. Результаты показывают сильное связывание этих антител против DLL3 на SHP-77 клетках.
Пример 3. Интернализация анти-ОЕЕЗ поликлональных антител SHP-77 и N82 клетками.
При помощи PabZAP анализов было показано, что анти-ОЕЕЗ поликлональные антитела интернализировались SHP-77 (человеческий мелкоклеточный рак легких) и N82 после связывания с клетками. Антитела PabZAP связывались с первичными антителами. Далее PabZAP комплекс интернализировался клетками. Введение сапорина в клетки приводило к ингибированию синтеза белка и последующей гибели клеток.
- 32 034182
PabZAP анализ проводили следующим образом.
Каждую из клеток высевали при плотности 5x103 клеток на лунку. Анти-ОкЕ3 поликлональные антитела или контрольного изотипа IgG человека серийно разбавляли и затем добавляли к клеткам. После того PabZAP добавляли до концентрации 50 мкг/мл и планшеты подвергали инкубированию в течение 48 и 72 ч. Жизнеспособность клеток в планшетах определяли набором CellTiter-Glo® для люминесцентного анализа жизнеспособность клеток (Promega, G7571) и планшеты считывали при длине волны 490 нм с помощью Luminomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA). Данные анализировали с помощью Prism (GraphPad). Гибель клеток была пропорциональна концентрации анти-DLL3 поликлональных антител.
Результаты показывают, что анти-DLL3 поликлональные антитела были эффективно интернализованы SHP77 (фиг. 1А) и N82 (фиг. 1В) по сравнению с контрольным античеловеческим IgG изотипом. Результаты также показывают, анти-DLL3 поликлональные антитела, индуцировали примерно 40% гибели клеток в 1 нмоль/л у SHP77 и 25% гибели клеток в 100 нмоль/л у N82.
Пример 4. Т-клеточная активация и специфический лизис клеток, экспрессирующих DLL3. Справочная информация.
Для возможности оценки пригодности мишени для BiTE подхода (биспецифические фрагменты антитела, сочетающие анти-CD3 эпитоп связывания с сайтом связывания для специфического антигена на клетке-мишени или ткани) был разработан анализ для проверки Т-клеточной активации анти-CD3 и поликлональных антител, специфичных для антигена-мишени, представляющей интерес.
Методы.
Для этого анализа мишень DLL3 экспрессируется на DMS79 клетках. Клетки окрашивали SIGMA PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits для General Cell Membrane Labeling Catalog number PKH26GL путем разбавления 15 мкл красителя в 0,5 мл буфера С (поставляется в комплекте). DMS79 клетки подсчитывали, центрифугировали при 800xg, ресуспендировали в бессывороточной среде при 10 млн клеток в 0,5 мл. 0,5 мл буфера С, содержащего краситель 15 мкл FKH26, добавляли к клеткам, осторожно перемешивали и инкубировали от 1 до 5 мин при комнатной температуре. Среду FBS добавляли, чтобы погасить краситель. Клетки центрифугировали, как описано выше, ресуспендировали в среде для анализа (RPMI плюс 10% сверхнизким IgGFBS - Invitrogen каталог #16250078), центрифугировали еще раз и ресуспендировали в среде для анализа при 200,000 клеток на 1 мл. 10000 клеток (50 мкл) добавляли на дно в каждую соответствующую лунку 96-луночного планшета для культуры ткани. Планшет предварительно покрывали на ночь козьими антимышиными каппа от Southern Biotech (каталожный #1050-01) при 3 мкл/мл в PBS. Избыток раствора антител удаляли из планшетов перед добавлением DMS69 клеток. Человеческие CD8+ Т-клетки (замороженные) были приобретены в AllCells, каталожный номер PB009-3F. Т-клетки размораживали и промывали в соответствии с указаниями изготовителя. Клетки ресуспендировали в 1500000 клеток на мл в среде для анализа. Т-клетки были добавлены к DMS79 клеткам в 96луночные анти-каппа покрытые планшеты, по 150000 клеток на лунку. Каждое из антител DLL3 были добавлены в соответствующие лунки до 18 мкг/мл, 6 мкг/мл или 2 мкг/мл. Функциональный класс антиCD3 клон ОКТ3 (eBioscience, каталожный номер 16-0037-85) был добавлен в соответствующие лунки до 9 мкг/мл, 3 мкг/мл или 1 мкг/мл. Контрольные лунки не получили антитела. Планшет инкубировали в течение двух дней в 5% СО2, увлажненном инкубаторе тканевых культур при 37°C.
Планшет центрифугировали при 400xg в течение 5 мин, клетки промывали в FACS буфере (PBS + 5% FBS) и снова центрифугировали при 400xg в течение 5 мин. Клетки снова ресуспендировали в FACS буфере и центрифугировали при 400xg. Клетки ресуспендировали в 200 мкл на лунку FACS буфера. Лунки осторожно перемешивали и сразу анализировали на проточном цитометре Guava Easycyte. Клетки FKH26, окрашенные красным, анализировали на желтом канале. Такое же общее количество клеток было помещено в каждую лунку и клетки в желтом (FKH26 окрашенные клеточные ворота) были подсчитаны и процент цитотоксичности рассчитывали по сравнению с контрольными лунами Т-клетки плюс DMS79 клетки без антикролика, анти-CD3 или поликлональных DLL3 (среднее количество клеток было то же самое ± планшет связанное анти-каппа антитело).
Результаты.
Фиг. 2 показывает специфический лизис клеток DMS69 анти-ОЕЕ3 поликлональными антителами и что гибель клеток была пропорциональна концентрации антител. Таким образом, анти-ЭЕЕ3 поликлональные антитела способны индуцировать Т-клеточную цитотоксичность с помощью активации CD3.
Пример 5. Иммуногистохимическое использование антитела к DLL3.
Используя следующей Reference Protocol, иммуногистохимию проводили на FFPE опухоли легких и на нормальных тканях с использованием поликлональных антител к DLL3.
5.1. Материалы и методы.
5.1.1. Материалы.
Citroclear (HC5005) от TCS Biosciences, Великобритания. Реагент спирт (R8382) от Sigma-Aldrich, Великобритания. Target Retrieval Solution, pH 6 (S2369) от Dako, Великобритания. REAL Peroxidase Blocking Solution (S2023) от Dako, Великобритания. Разбавитель антител (S0809) от Dako, Великобритания. EnVision+ HRP-конъюгированный полимер, мышь (K4000) от Dako, Великобритания.
- 33 034182
Жидкость DAB + подложка (K3468) от Dako, Великобритания. Майера гематоксилин (Х0909) от Dako, Великобритания.
Aquatex (1.08562.0050) от VWR, Великобритании.
Тканевые участки и массивы были из США Biomax Inc., Мэриленд, США.
5.1.2. Депарафинирование и регидратация.
Срезы были депарафинизированы в Citroclear (2x5 мин), а затем регидратированы обработкой 100% спиртом (2x5 мин), 50%-м спиртом (1x5 мин) и водопроводной водой (1x5 мин).
5.1.3. Восстановление антигена (обработка под давлением).
DLL3 антиген был восстановлен под давлением в течение 20 мин в 50 мл Target Retrieval Solution в сосуде Коплина. Затем срезы оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение еще 20 мин. Круги были нарисованы вокруг каждой секции ткани/ТМА с гидрофобным барьером пера и стекла затем промывают дважды в PBS, 3 мин на каждое промывание.
5.1.4. Окрашивание тканей.
Активность эндогенной пероксидазы блокировали путем инкубирования ткани с Peroxidase Blocking Solution в течение 10 мин при комнатной температуре во влажной камере. Затем срезы промывали один раз PBS и один раз в PBS-T (PBS, содержащий твин-20, 0,125% об./об.), 3 мин на каждое промывание. Первичные антитела (разбавленный 1/160 в разбавителе антител) наносили на каждую секцию ткани и/или микропанель и срезы инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре во влажной камере. Затем срезы промывали один раз PBS в и один раз в PBS-T, 3 мин каждой промывки. EnVision + HRP-конъюгированные полимер затем применяется к тканям и предметные стекла инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере. Затем срезы промывали один раз в PBS и один раз в PBS-T, 3 мин каждой промывки. Ткани инкубировали в жидком DAB + субстрата при комнатной температуре в течение 10 мин во влажной камере. Затем срезы промывали один раз в PBS и один раз в PBS-T, гематоксилином в течение 1 мин при комнатной температуре во влажной камере, и снова промывают, один раз в PBS и один раз в PBS-T, 3 мин каждой промывки. Покровные стекла затем собираются со срезами с использованием Aquatex.
5.2. Результаты.
Анти-DLL3 поликлональные антитела показали положительный эффект в FFPE образцах легкого, где 60% из секций показали надежное (2+/3+) окрашивание.
Поэтому антитела, нацеленные HaDLL3, могут применяться в качестве терапевтических и диагностических средств в некоторых из тестируемых видов рака и, возможно, других видов рака, показывающих экспрессию DLL3.
Последовательности
SEQ ID № Описание Последовательность
1 Дельта-подобного белка 3 (DLL3) MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGA PRSPCSARLIILJPLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPV YTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGD QIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYR ARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLV CRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGP SSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGL RCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNC EKRVDRCSLQnUPNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLD dCaGRaCanGGtCveGGGahrCSCalGfGGRDCreradpCaa RPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALP AAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGH SQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDW NRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLF PYPSSILSVK
2 Изоформа 2 дельтаподобного белка 3 (NP_982353) MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGA PRSPCSARLnUPLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPV YTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGD QIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYR ARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLV CRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGP SSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGL RCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNC EKRVDRCSLQnUPNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLD dCaGRaCanGGtCveGGGahrCSCalGfGGRDCreradpCaa rpCahGGRCyahfSGlvCaCapGymGarCefpvhpdGaSalp aappglrpgdpqryllppalgllvaagvagaalllvhvrrrgh sqdagsrllagtpepsvhalpdalnnlrtqegsgdgpsssvdw nrpedvdpqgiyvisapsiyarea
- 34 034182
3 Дельта-подобный белок 3 (NM_016941) agatataaggcttggaagccagcagctgcgactcccgagacccccccaccagaaggccatggtc tccccacggatgtccgggctcctctcccagactgtgatcctagcgctcattttcctcccccagacac ggccegctggcgtcttcgagcigcagatccacictttcgggccgggtccaggccctggggcccc geggteeceeigcagegcccggctcccctgeegcctcttctteagagtcigectgaagcctggge tctcagaggaggccgccgagtccccgtgogccctgggcgcggcgctgagtgcgcgcggaccg gtctacaccgagcagcccggagcgcccgcgcctgatctcccactgcccgacggcctctigcagg tgcccttccgggacgcctggcctggcaccttctctitcatcatcgaaacctggagagaggagttag gagaccagattggagggcccgcctggagcctgctggcgcgcgtggctggcaggcggcgcttgg cagccggaggcccgtgggcccgggacattcagcgcgcaggcgcctgggagctgcgcttctcgt accgcgcgcgctgcgagccgcctgccgtcgggaccgcgtgcacgcgcctctgccgtccgcgca gcgceeeetcgcggtgcggtccgggactgcgeeectgcgcaccgetcgaggacgaatgtgagg cgccgctggtgtgccgagcaggctgcagccctgagcatggcttctgtgaacagcccggtgaatg ccgatgcctagagggctggactggacccctctgcacggtccctgtctccaccagcagctgcctca gccccaggggcccgtcctctgctaccaccggatgccttgtccctgggcctgggccctgtgacgg gaacccgtgtgccaatggaggcagctgtagtgagacacccaggtcctttgaatgcacctgcccgc gtgggttctacgggctgcggtgtgaggtgagcggggtgacatgtgcagatggaccctgcttcaac ggcggcttgtgtgtcgggggtgcagaccctgactctgcctacatctgccactgcccacccggtttc caaggctccaactgtgagaagagggtggaccggtgcagcctgcagccatgccgcaatggcgga ctctgcctggacctgggccacgccctgcgctgccgctgccgcgecggcttcgegggtcctegct gcgagcacgaectggacgactgcgegggecgcgccigcgctaacggcggcacgtgtgtggag ggcggcggcgcgcaccgctgctcctgcgcgctgggcttcggcggccgcgactgccgcgagcg cgcggacccgtgcgccgcgcgcccctgtgctcacggcggccgctgctacgcccacitctccggc ctcgtctgcgcttgcgctcccggctacatgggagcgcggtgtgagttcccagtgcaccccgacgg cgcaagcgccttgcccgcggccccgccgggcctcaggcccggggaccctcagcgctaccttttg cctccggctctgggactgctcgtggccgcgggcgtggccggcgctgcgctcttgctggtccacgt gcgccgccgtggccactcccaggatgctgggtctcgcttgctggctgggaccccggagccgtca gtccacgcacteccggatgcacicaacaacctaaggacgcaggagggnccggggatggtccga getegtccgtagattggaategccctgaagatgtagaeecteaagggatuatgtcatatetgctcei tccatctacgctcgggaggtagcgacgccccttttccccccgctacacactgggcgcgctgggca gaggcagcacctgctttttccctacccttcctcgattctgtccgtgaaatgaatigggtagagtcict ggaaggttttaagcccattttcagitctaacttactttcatcctatittgcatccctctiatcgttttgagct acctgccatcttctctttgaaaaacctatgggcttgaggaggtcacgatgccgactccgccagagc ttttccactgattgtactcagcggggaggcaggggaggcagaggggcagcctctctaatgcttcct actcattttgtttctaggcctgacgcgtetcctccatccgcacctggagtcagagcgtggatttttgta tttgcteggtggtgcccagtctctgccccagaggctttggagtteaatcttgaaggggtgtctgggg gaactttactgttgcaagttgtaaataatggttatttatatcctattttttctcaccccatctctctagaaa cacctataaaggctattattgtgatcagttttgactaacaaaaaa
4 Изоформа 2 дельтаподобного белка 3 (NM_20S486) agatataaggcttggaagccagcagctgcgactcccgagacccccccaccagaaggccatggtc teeccacggatgtccgggctcctctcccagactgtgatcctagcgctcatttteetcccccagaeac ggcccgctggcgtcttcgagctgcagatccactctttcgggccgggtccaggccctggggcccc gcggtceccctgcagcgcccggctceectgccgcctcttcttcagagtctgcctgaagcctgggc tetcagaggaggecgccgagtccccgtgcgccctgggcgcggcgctgagtgcgcgcggaccg gtctacaccgagcagcccggagcgcccgcgcctgatctcccactgcccgacggcctcttgcagg tgcccttccgggacgcctggcctggcaccttctctttcatcatcgaaacctggagagaggagttag gagaccagattggagggcccgcctggagcctgctggcgcgcgtggctggcaggcggcgcttgg cagccggaggcccgtgggcccgggacattcagcgcgcaggcgcctgggagctgcgcttctcgt accgcgcgcgctgcgagccgcctgccgtcgggaccgcgtgcacgcgcctctgccgtccgcgca gcgccccctcgcggtgcggtccgggactgcgcccctgcgcaccgctcgaggacgaaigtgagg cgccgctggtgtgccgagcaggctgcagccctgagcatggcttctgtgaacagcccggtgaatg ccgatgcctagagggctggactggacccctctgcacggtccctgictccaccagcagctgccica gccccaggggcccgtcctctgctaccaccggatgccttgtccctgggcctgggccctgtgacgg gaacccgtgtgccaatggaggcagctgtagtgagacacccaggtcctttgaatgcacctgcccgc gtgggttctacgggctgcggtgtgaggtgagcggggtgacatgtgcagatggaccctgcttcaac ggcggcttgtgtgtcgggggtgcagaccctgactctgcctacatctgccactgcccacccggtttc caaggctccaactgtgagaagagggtggaccggtgcagcctgcagccatgccgcaatggcgga ctctgcctggacctgggccacgccctgcgctgccgctgccgcgccggcttcgcgggtcctcgct gcgagcacgacctggacgactgcgcgggccgcgcctgcgctaacggcggcacgtgtgtggag ggcggcggcgcgcaccgctgctcctgcgcgctgggcttcggcggccgcgactgccgcgagcg cgeggacccgtgcgccgcgegcccctgtgctcacggeggccgctgctacgcccacttctccgge ctegtctgcgcttgcgctcccggctaeatgggagcgeggtgtgagttcccagtgcaccccgac gg cgeaagcgccttgeecgcggccccgccgggcctcaggeeeggggacccteagcgctaccttttg cctccggctctgggactgctcgtggccgcgggcgtggccggcgctgcgctcttgctggtccacgt gcgccgccgtggccactcccaggatgctgggtctcgcttgctggctgggaccccggagccgtca gtccacgcactcccggatgcactcaacaacctaaggacgcaggagggttccggggatggtccga gctcgtccgtagattggaatcgccctgaagatgtagaccctcaagggatttatgtcatatctgctcct tccatctacgctcgggaggcctgacgcgtctcctccatccgcacctggagtcagagcgtggattttt gtatttgctcggtggtgcccagtctctgccccagaggctttggagttcaatcttgaaggggtgtctg ggggaactttactgttgcaagttgtaaataatggttatttatatcctattttttctcaccccatctctctag aaacacctataaaggctattattgtgatcagttttgactaacaaaaaa
5 DLL3 Пептид 1 VCLKPGLSEEAAESPCALGAALSAR
6 DLL3 Пептид 2 AGAWELR
7 DLL3 Пептид 3 CEPPAVGTACTR
8 DLL3 Пептид 4 AGCSPEHGFCEQPGECR
9 DLLS Пептид 5 SFECTCPR
10 DLL3 Пептид 6 NGGLCLDLGHALR
11 DLLS Пептид 7 CSCALGFGGR
12 DLL3 ECD (аминокислоты 27-492 SEQ ID NO: 1) AGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLS EEAAESPCALGAALSAR GPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWRE ELGDQIGGPAWSLLARV AGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTAC TRLCRPRSAPSRCGPGLRP CAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLC TVPVSTSSCLSPRGPSSA TTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLR CEVSGVTCADGPCFNGGL CVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLC LDLGHALRCRCRAGFAGP RCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDC RERADPCAARPCAHGGRCYA HFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDP QRYL
- 35 034182
Перечень последовательностей <110> БЕРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ИНТЕРНАЦИОНАЛЬ <120> СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ CD3-*DLL3 <130> ОВ00134 <160> 12 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 618 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Met Vai Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu
5
Leu Ser Gin Thr Vai lie Leu
15
Ala Leu He Phe Leu Pro Gin Thr Arg
25
Fro Ala Gly Vai Phe Glu Leu
Gin He His Ser Phe Gly Pro Gly Pro
40
Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser
Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg
55
Leu Phe Phe Arg Vai Cys Leu
Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala
70
Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly
80
Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Vai
Tyr Thr Glu Gin Pro Gly Ala
95
Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp
100 105
Gly Leu Leu Gin Vai Pro Phe
110
Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser
115 120
Phe He He Glu Thr Trp Arg
125
Glu Glu Leu Gly Asp Gin He Gly Gly
130 135
Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala
140
Arg Vai Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala
145150
Asp He Gin Arg Ala Gly Ala Trp
165
Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg
155160
Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala
170175
Arg Cys Glu Pro Pro Ala Vai Gly
180
Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg
185 190
Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys
195 200
Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala
205
Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala
210 215
Pro Leu Vai Cys Arg Ala Gly Cys
220
Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu
225 230
Gin Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu
235 240
Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys
245
Thr Vai Pro Vai Ser Thr Ser Ser
250 255
Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser
260
Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Vai
265 270
Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly
275 280
Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser
285
Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe
290 295
Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe
300
Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Vai Ser
305 310
Gly Vai Thr Cys Ala Asp Gly Pro
315 320
Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Vai
325
Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
330 335
Tyr He Cys His Cys Pro Pro Gly
340
Phe Gin Gly Ser Asn Cys Glu Lys
345 350
Arg Vai Asp Arg Cys Ser Leu Gin
355 360
Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
365
Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg
370 375
Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
380
Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu
385 390
Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
395 400
Ala Asn Gly Gly Thr Cys Vai Glu
Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
- 36 034182
- 37 034182
Glu Gly Trp Thr Gly 245 Pro Leu Cys Thr Vai Pro 250 Vai Ser Thr Ser 255 Ser
Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Vai
260 265 270
Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser
275 280 285
Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe
290 295 300
Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Vai Ser Gly Vai Thr Cys Ala Asp Gly Pro
305 310 315 320
Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Vai Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala
325 330 335
Tyr He Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gin Gly Ser Asn Cys Glu Lys
34 0 34 5 350
Arg Vai Asp Arg Cys Ser Leu Gin Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys
355 360 365
Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala
370 375 3S0
Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys
385 390 395 400
Ala Asn Gly Gly Thr Cys Vai Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser
405 410 415
Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro
420 425 430
Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe
435 440 445
Ser Gly Leu Vai Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys
450 455 460
Glu Phe Pro Vai His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro
465 470 475 480
Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gin Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala
485 490 495
Leu Gly Leu Leu Vai Ala Ala Gly Vai Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu
500 505510
Vai His Vai Arg Arg Arg Gly His Ser Gin Asp Ala Gly Ser Arg Leu
515 520525
Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Vai His Ala Leu Pro Asp Ala Leu
530 535540
Asn Asn Leu Arg Thr Gin Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser
545 550 555560
Vai Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Vai Asp Pro Gin Gly lie Tyr Vai
565 570575 lie Ser Ala Pro Ser lie Tyr Ala Arg Glu Ala
580585 <210> 3 <211> 2389 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 3 agatataagg cttggaagcc agcagctgcg actcccgaga cccccccacc agaaggccat60 ggtctcccca cggatgtccg ggctcctctc ccagactgtg atcctagcgc tcattttcct120 cccccagaca cggcccgctg gcgtcttcga gctgcagatc cactctttcg ggccgggtcc180 aggccctggg gccccgcggt ccccctgcag cgcccggctc ccctgccgcc tcttcttcag240 agtctgcctg aagcctgggc tctcagagga ggccgccgag tccccgtgcg ccctgggcgc300 ggcgctgagt gcgcgcggac cggtctacac cgagcagccc ggagcgcccg cgcctgatct360 cccactgccc gacggcctct tgcaggtgcc cttccgggac gcctggcctg gcaccttctc420 tttcatcatc gaaacctgga gagaggagtt aggagaccag attggagggc ccgcctggag480 cctgctggcg cgcgtggctg gcaggcggcg cttggcagcc ggaggcccgt gggcccggga540 cattcagcgc gcaggcgcct gggagctgcg cttctcgtac cgcgcgcgct gcgagccgcc600 tgccgtcggg accgcgtgca cgcgcctctg ccgtccgcgc agcgccccct cgcggtgcgg660 tccgggactg cgcccctgcg caccgctcga ggacgaatgt gaggcgccgc tggtgtgccg720 agcaggctgc agccctgagc atggcttctg tgaacagccc ggtgaatgcc gatgcctaga780 gggctggact ggacccctct gcacggtccc tgtctccacc agcagctgcc tcagccccag840
gggcccgtcc tctgctacca ccggatgcct tgtccctggg cctgggccct gtgacgggaa 900
cccgtgtgcc aatggaggca gctgtagtga gacacccagg tcctttgaat gcacctgccc 960
gcgtgggttc tacgggctgc ggtgtgaggt gagcggggtg acatgtgcag atggaccctg 1020
cttcaacggc ggcttgtgtg tcgggggtgc agaccctgac tctgcctaca tctgccactg 1080
cccacccggt ttccaaggct ccaactgtga gaagagggtg gaccggtgca gcctgcagcc 1140
atgccgcaat ggcggactct gcctggacct gggccacgcc ctgcgctgcc gctgccgcgc 1200
cggcttcgcg ggtcctcgct gcgagcacga cctggacgac tgcgcgggcc gcgcctgcgc 1260
taacggcggc acgtgtgtgg agggcggcgg cgcgcaccgc tgctcctgcg cgctgggctt 1320
cggcggccgc gactgccgcg agcgcgcgga cccgtgcgcc gcgcgcccct gtgctcacgg 1380
cggccgctgc tacgcccact tctccggcct cgtctgcgct tgcgctcccg gctacatggg 1440
agcgcggtgt gagttcccag tgcaccccga cggcgcaagc gccttgcccg cggccccgcc 1500
gggcctcagg cccggggacc ctcagcgcta ccttttgcct ccggctctgg gactgctcgt 1560
ggccgcgggc gtggccggcg ctgcgctctt gctggtccac gtgcgccgcc gtggccactc 1620
ccaggatgct gggtctcgct tgctggctgg gaccccggag ccgtcagtcc acgcactccc 1680
ggatgcactc aacaacctaa ggacgcagga gggttccggg gatggtccga gctcgtccgt 1740
agattggaat cgccctgaag atgtagaccc tcaagggatt tatgtcatat ctgctccttc 1800
catctacgct cgggaggtag cgacgcccct tttccccccg ctacacactg ggcgcgctgg 1860
gcagaggcag cacctgcttt ttccctaccc ttcctcgatt ctgtccgtga aatgaattgg 1920
gtagagtctc tggaaggttt taagcccatt ttcagttcta acttactttc atcctatttt 1980
gcatccctct tatcgttttg agctacctgc catcttctct ttgaaaaacc tatgggcttg 2040
aggaggtcac gatgccgact ccgccagagc ttttccactg attgtactca gcggggaggc 2100
aggggaggca gaggggcagc ctctctaatg cttcctactc attttgtttc taggcctgac 2160
gcgtctcctc catccgcacc tggagtcaga gcgtggattt ttgtatttgc tcggtggtgc 2220
ccagtctctg ccccagaggc tttggagttc aatcttgaag gggtgtctgg gggaacttta 2280
ctgttgcaag ttgtaaataa tggttattta tatcctattt tttctcaccc catctctcta 2340
gaaacaccta taaaggctat tattgtgatc agttttgact aacaaaaaa 2389
<210> 4 <211> 2052
<212> ДНК <213> Homo sapiens
<400> 4 agatataagc j cttggaagcc agcagctgcg actcccgaga cccccccacc г igaaggccat 60
ggtctcccca cggatgtccg ggctcctctc ccagactgtg atcctagcgc tcattttcct 120
cccccagaca cggcccgctg gcgtcttcga gctgcagatc cactctttcg ggccgggtcc 180
aggccctggg gccccgcggt ccccctgcag cgcccggctc ccctgccgcc tcttcttcag 240
agtctgcctg aagcctgggc tctcagagga ggccgccgag tccccgtgcg ccctgggcgc 300
ggcgctgagt gcgcgcggac cggtctacac cgagcagccc ggagcgcccg cgcctgatct 360
cccactgccc gacggcctct tgcaggtgcc cttccgggac gcctggcctg gcaccttctc 420
tttcatcatc gaaacctgga gagaggagtt aggagaccag attggagggc ccgcctggag 480
cctgctggcg cgcgtggctg gcaggcggcg cttggcagcc ggaggcccgt gggcccggga 540
cattcagcgc gcaggcgcct gggagctgcg cttctcgtac cgcgcgcgct gcgagccgcc 600
tgccgtcggg accgcgtgca cgcgcctctg ccgtccgcgc agcgccccct cgcggtgcgg 660
tccgggactg cgcccctgcg caccgctcga ggacgaatgt gaggcgccgc tggtgtgccg 720
agcaggctgc agccctgagc atggcttctg tgaacagccc ggtgaatgcc gatgcctaga 780
gggctggact ggacccctct gcacggtccc tgtctccacc agcagctgcc tcagccccag 840
gggcccgtcc tctgctacca ccggatgcct tgtccctggg cctgggccct gtgacgggaa 900
cccgtgtgcc aatggaggca gctgtagtga gacacccagg tcctttgaat gcacctgccc 960
gcgtgggttc tacgggctgc ggtgtgaggt gagcggggtg acatgtgcag atggaccctg 1020
cttcaacggc ggcttgtgtg tcgggggtgc agaccctgac tctgcctaca tctgccactg 1080
cccacccggt ttccaaggct ccaactgtga gaagagggt g gaccggtgca gcctgcagcc 1140
atgccgcaat ggcggactct gcctggacct gggccacgcc ctgcgctgcc gctgccgcgc 1200
cggcttcgcg ggtcctcgct gcgagcacga cctggacgac tgcgcgggcc gcgcctgcgc 1260
taacggcggc acgtgtgtgg agggcggcgg cgcgcaccgc tgctcctgcg cgctgggctt 1320
cggcggccgc gactgccgcg agcgcgcgga cccgtgcgcc gcgcgcccct gtgctcacgg 1380
cggccgctgc tacgcccact tctccggcct cgtctgcgct tgcgctcccg gctacatggg 1440
agcgcggt gt gagttcccag tgcaccccga cggcgcaagc gccttgcccg cggccccgcc 1500
gggcctcagg cccggggacc ctcagcgcta ccttttgcct ccggctctgg gactgctcgt 1560
ggccgcgggc gtggccggcg ctgcgctctt gctggtccac gtgcgccgcc gtggccactc 1620
ccaggatgct gggtctcgct tgctggctgg gaccccggag ccgtcagtcc acgcactccc 1680
ggatgcactc aacaacctaa gga cgcagga gggttccggg gatggtccga gctcgtccgt 1740
agattggaat cgccctgaag atgtagaccc tcaagggatt tatgtcatat ctgctccttc 1800
catctacgct cgggaggcct gacgcgtctc ctccatccgc acctggagtc agagcgtgga 1860
tttttgtatt tgctcggtgg tgcccagtct ctgccccaga ggctttggag ttcaatcttg 1920
- 39 034182 aaggggtgtc tgggggaact ttactgttgc aagttgtaaa taatggttat ttatatccta 1980 ttttttctca ccccatctct ctagaaacac ctataaaggc tattattgtg atcagttttg 2040 actaacaaaa aa 2052 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Vai Cys Leu Lys Pro
5
Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu
Cys
Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg
25 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg
5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Cys Glu Pro Pro Ala Vai Gly Thr Ala Cys Thr Arg 15 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gin Pro Gly Glu Cys 15 10 15 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg
5 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu
5
Gly His Ala Leu Arg <210>11 <211>10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>11
Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly
Gly Arg <210>12 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>12
Ala Gly Vai Phe Glu Leu Gin He
His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly
15
Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys
Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu
30
Phe Phe Arg Vai Cys Leu Lys Pro
40
Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu
Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala
55
Leu Ser Ala Arg Gly Pro Vai Tyr
Thr Glu Gin Pro Gly Ala Pro Ala
70
Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly
80
Leu Leu Gin Vai Pro Phe Arg Asp
Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe
95
- 40 034182
Не He Glu Thr 100 Trp Arg Glu Glu Leu Gly 105 Asp Gin He Gly 110 Gly Pro
Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala
115 120 125
Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp He Gin Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu
130 135 140
Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala
145 150 155 160
Cys Thr Arg T .Al l Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro
165 170 175
Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu
180 185 190
Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gin Pro
195 200 205
Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val
210 215 220
Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala
225 230 235 240
Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro
245 250 255
Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys
260 265 270
Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val
275 280 285
Thr Cys Aila Asp Gly Pro Cys Phe fign Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly
290 295 300
Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr He Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gin
305 310 315 320
Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gin Pro Cys
325 330 335
Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg
340 345 350
Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp
355 360 365
Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala fign Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly
370 375 380
Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys
385 390 395 400
Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly
4 05 410 415
Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly
420 425 430
Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser
435 440 445
Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gin Arg
450 455 460
Tyr Leu
65

Claims (3)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения рака, включающий введение субъекту, который нуждается в этом, терапевтически эффективного количества биспецифического антитела, которое связывается с DLL3 и CD3, где указанный рак выбирают из группы, состоящей из рака легкого, рака поджелудочной железы и рака кожи.
  2. 2. Способ по п.1, где указанный рак представляет собой мелкоклеточный рак легкого.
  3. 3. Способ по любому п.1 или 2, в котором биспецифическое антитело индуцирует апоптоз раковых клеток, уничтожает или уменьшает количество раковых стволовых клеток и/или уничтожает или уменьшает количество циркулирующих опухолевых клеток.
EA201500835A 2013-02-12 2014-02-12 Способ лечения рака с использованием биспецифических антител против cd3*dll3 EA034182B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1302447.6A GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-02-12 Therapeutic and diagnostic target
PCT/GB2014/050407 WO2014125273A1 (en) 2013-02-12 2014-02-12 Therapeutic and diagnostic target for cancer comprising dll3 binding reagents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201500835A1 EA201500835A1 (ru) 2016-02-29
EA034182B1 true EA034182B1 (ru) 2020-01-15

Family

ID=47998983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201500835A EA034182B1 (ru) 2013-02-12 2014-02-12 Способ лечения рака с использованием биспецифических антител против cd3*dll3

Country Status (18)

Country Link
US (3) US20160032006A1 (ru)
EP (2) EP2956483B1 (ru)
JP (1) JP6654046B2 (ru)
KR (1) KR102167550B1 (ru)
CN (1) CN105143266B (ru)
AU (1) AU2014217611B2 (ru)
CA (1) CA2900134A1 (ru)
CL (1) CL2015002223A1 (ru)
DK (1) DK2956483T3 (ru)
EA (1) EA034182B1 (ru)
ES (1) ES2813360T3 (ru)
GB (1) GB201302447D0 (ru)
HU (1) HUE050828T2 (ru)
IL (1) IL239983B (ru)
MX (1) MX370597B (ru)
PH (1) PH12015501744A1 (ru)
PL (1) PL2956483T3 (ru)
WO (1) WO2014125273A1 (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PE20190658A1 (es) 2012-02-24 2019-05-08 Abbvie Stemcentrx Llc Moduladores y metodos de empleo novedosos
BR112016004242A8 (pt) 2013-08-28 2018-06-12 Stemcentrx Inc Métodos para conjugação sítio-específica de anticorpos e composições
CN105873612A (zh) * 2013-08-28 2016-08-17 施特姆森特克斯股份有限公司 改造的抗-dll3缀合物以及应用方法
US10308721B2 (en) 2014-02-21 2019-06-04 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-DLL3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
AU2015295242B2 (en) * 2014-07-31 2020-10-22 Amgen Research (Munich) Gmbh Bispecific single chain antibody construct with enhanced tissue distribution
EP3174901B1 (en) 2014-07-31 2019-06-26 Amgen Research (Munich) GmbH Optimized cross-species specific bispecific single chain antibody constructs
MA41613A (fr) * 2015-02-23 2018-01-02 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TW202346349A (zh) * 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
EA039859B1 (ru) * 2016-02-03 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
EA039325B1 (ru) * 2016-02-03 2022-01-13 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Конструкции биспецифических антител, связывающиеся с дпб3 (dll3) и кд3 (cd3)
AU2018280869A1 (en) 2017-06-08 2020-01-16 Black Belt Therapeutics Limited CD38 modulating antibody
SG11202003341UA (en) 2017-10-13 2020-05-28 Harpoon Therapeutics Inc B cell maturation antigen binding proteins
TW201938194A (zh) 2017-12-05 2019-10-01 日商中外製藥股份有限公司 包含結合cd3及cd137的改變的抗體可變區之抗原結合分子
TWI817974B (zh) * 2017-12-28 2023-10-11 日商中外製藥股份有限公司 細胞毒性誘導治療劑
CN110412179A (zh) * 2018-04-26 2019-11-05 缪荣明 一种液相色谱检测颗粒酶a的方法
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
US10815311B2 (en) * 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
CN113874526A (zh) * 2019-03-08 2021-12-31 肿瘤实验室诊断有限公司 癌症的诊断和预后
AU2020271012A1 (en) * 2019-04-08 2021-09-09 Phanes Therapeutics, Inc. Humanized anti-DLL3 chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3819312A1 (en) * 2019-11-10 2021-05-12 Amgen, Inc Dosing regimen for anti-dll3 agents
AU2021213840A1 (en) * 2020-01-31 2022-09-29 Gensun Biopharma Inc. Bispecific T cell engagers
CN115397866A (zh) 2020-03-31 2022-11-25 中外制药株式会社 靶向dll3的多特异性抗原结合分子及其用途
IL311510A (en) * 2021-09-17 2024-05-01 Wuxi Biologics Ireland Ltd D3 binding molecules and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007111733A2 (en) * 2005-12-16 2007-10-04 Genentech, Inc. Method for diagnosing, prognosing and treating glioma
EP2530091A1 (en) * 2010-01-29 2012-12-05 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-dll3 antibody
WO2013126746A2 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Stem Centrx, Inc. Novel modulators and methods of use

Family Cites Families (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
AU606320B2 (en) 1985-11-01 1991-02-07 International Genetic Engineering, Inc. Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
AU622426B2 (en) 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
DE68927933T2 (de) 1988-09-02 1997-08-14 Dyax Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
GB9106048D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
WO1992007088A1 (en) 1990-10-22 1992-04-30 Abbott Laboratories Stabilized anoxic diagnostic reagent solution
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DK0616640T3 (da) 1991-12-02 2004-12-20 Medical Res Council Fremstilling af anti-selv antistoffer fra repertoirer af antistofsegmenter og fremvist på fag
PT1696031E (pt) 1991-12-02 2010-06-25 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
EP0672131B1 (en) 1992-10-30 2003-12-17 The General Hospital Corporation A novel cell cycle control protein
US5807683A (en) 1992-11-19 1998-09-15 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
DE69534347T2 (de) 1994-01-31 2006-05-24 Trustees Of Boston University, Boston Bibliotheken aus Polyklonalen Antikörpern
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5738996A (en) 1994-06-15 1998-04-14 Pence, Inc. Combinational library composition and method
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
GB9608510D0 (en) 1996-04-25 1996-07-03 Medical Res Council Calcium dependent binding ligands
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
PT1176195E (pt) 1999-04-09 2013-07-18 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico
WO2002020565A2 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
EP3263702A1 (en) 2000-10-06 2018-01-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
JP4369662B2 (ja) 2001-04-26 2009-11-25 アビディア インコーポレイテッド 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
IL154183A0 (en) 2001-05-31 2003-07-31 Medarex Inc Cytotoxins, prodrugs, linkers and stabilizers useful therefor
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
WO2004081026A2 (en) 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
EP2366718A3 (en) 2002-06-28 2012-05-02 Domantis Limited Ligand
EP1558650A2 (en) 2002-11-08 2005-08-03 Ablynx N.V. Camelidae antibodies against immunoglobulin e and use thereof for the treatment of allergic disorders
EP1578801A2 (en) 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
WO2004101790A1 (en) 2003-05-14 2004-11-25 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
AU2004242845B2 (en) 2003-05-31 2011-06-02 Amgen Research (Munich) Gmbh Human-anti-human CD3 binding molecules
US20050164301A1 (en) 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
EP1824796A4 (en) 2004-11-16 2010-02-17 Avidia Res Inst PROTEIN SKELETONS AND USES THEREOF
CA2595682A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
RU2007145509A (ru) 2005-05-09 2009-06-20 Гликарт Биотехнологи Аг (Ch) Антигенсвязывающие молекулы, имеющие модифицированные fc-участки и измененное связывание с fc-рецепторами
CA2622441A1 (en) 2005-09-27 2007-04-05 Amunix, Inc. Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof
JP5525729B2 (ja) 2005-11-28 2014-06-18 ゲンマブ エー／エス 組換え一価抗体およびその作製方法
EP1973945A4 (en) 2006-01-16 2009-11-18 Compugen Ltd NEW NUCLEOTIDE AND AMINO ACID SEQUENCES AND METHOD FOR THEIR APPLICATION IN DIAGNOSIS
US7862813B2 (en) * 2006-07-29 2011-01-04 Bjork Jr Robert Lamar Bi-specific monoclonal antibody (specific for both CD3 and CD11b) therapeutic drug
PL2155783T5 (pl) 2007-04-03 2023-03-13 Amgen Research (Munich) Gmbh Swoista międzygatunkowo domena wiążąca CD3epsilon
JP2011509079A (ja) 2007-12-24 2011-03-24 オックスフォード ビオトヘラペウトイクス エルティーディー． エフリンａ型受容体１０タンパク質
CA2720763A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against the notch pathways and uses thereof
PL2307051T3 (pl) 2008-07-08 2015-07-31 Oncomed Pharm Inc Środki wiążące i antagoniści Notch oraz sposoby ich zastosowania
IN2012DN03172A (ru) 2009-09-18 2015-09-25 Micromet Ag
US9002545B2 (en) 2011-01-07 2015-04-07 Wabtec Holding Corp. Data improvement system and method
US20140170149A1 (en) * 2011-04-20 2014-06-19 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
BR122016016837A2 (pt) 2011-05-21 2019-08-27 Macrogenics Inc moléculas de ligação a cd3; anticorpos de ligação a cd3; composições farmacêuticas; e usos da molécula de ligação a cd3
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007111733A2 (en) * 2005-12-16 2007-10-04 Genentech, Inc. Method for diagnosing, prognosing and treating glioma
EP2530091A1 (en) * 2010-01-29 2012-12-05 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-dll3 antibody
WO2013126746A2 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Stem Centrx, Inc. Novel modulators and methods of use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENTARO MAEMURA: "Delta-like�3 is silenced by methylation and induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma", INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY, LYCHNIA, 17 January 2013 (2013-01-17), XP055109598, ISSN: 10196439, DOI: 10.3892/ijo.2013.1778 *
KROESEN, NIEKEN, SLEIJFER, MOLEMA, DE VRIES, GROEN, HELFRICH, THE, MULDER, DE LEIJ: "Approaches to lung cancer treatment using the CD3 x EGP-2-directed bispecific monoclonal antibody BIS-1.", CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY, SPRINGER-VERLAG, vol. 45, no. 3-4, 1 January 1997 (1997-01-01), pages 203 - 206, XP055110107, ISSN: 03407004, DOI: 10.1007/s002620050433 *
MARTIN SEBASTIAN ; BERNWARD PASSLICK ; HILKE FRICCIUS-QUECKE ; MICHAEL J�GER ; HORST LINDHOFER ; FRANK KANNIESS ; RAINER WIEWRODT : "Treatment of non-small cell lung cancer patients with the trifunctional monoclonal antibody catumaxomab (anti-EpCAM � anti-CD3): a phase I study", CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 56, no. 10, 5 April 2007 (2007-04-05), Berlin, DE, pages 1637 - 1644, XP019539101, ISSN: 1432-0851, DOI: 10.1007/s00262-007-0310-7 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016513094A (ja) 2016-05-12
EP3736293A1 (en) 2020-11-11
EP2956483A1 (en) 2015-12-23
EP2956483B1 (en) 2020-05-27
MX370597B (es) 2019-12-18
DK2956483T3 (da) 2020-08-10
GB201302447D0 (en) 2013-03-27
PL2956483T3 (pl) 2020-11-30
HUE050828T2 (hu) 2021-01-28
US20180201691A1 (en) 2018-07-19
AU2014217611B2 (en) 2018-05-17
IL239983B (en) 2021-02-28
IL239983A0 (en) 2015-09-24
PH12015501744B1 (en) 2015-12-07
WO2014125273A1 (en) 2014-08-21
US20160032006A1 (en) 2016-02-04
PH12015501744A1 (en) 2015-12-07
KR102167550B1 (ko) 2020-10-19
CL2015002223A1 (es) 2016-04-29
EA201500835A1 (ru) 2016-02-29
MX2015010372A (es) 2015-10-29
CN105143266A (zh) 2015-12-09
ES2813360T3 (es) 2021-03-23
US20210079114A1 (en) 2021-03-18
CA2900134A1 (en) 2014-08-21
CN105143266B (zh) 2021-08-13
JP6654046B2 (ja) 2020-02-26
KR20150119164A (ko) 2015-10-23
AU2014217611A1 (en) 2015-08-06
NZ710248A (en) 2021-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210079114A1 (en) Therapeutic and diagnostic target for cancer comprising dll3 binding reagents
JP7479435B2 (ja) 癌治療および判断ターゲットとしてのｌｙ７５
JP2019108354A (ja) 治療的及び診断的標的としての不活性Ｎ−アセチル化−α−結合型酸性ジペプチダーゼ−様タンパク質２（ＮＡＡＬＡＤＬ２）
US20150210770A1 (en) Therapeutic and diagnostic target
NZ710248B2 (en) Therapeutic and diagnostic target for cancer comprising dll3 binding reagents

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM