CN105143266B - 包含dll3结合试剂的癌症的治疗和诊断靶标 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于癌症(如肺癌、胰腺癌、和皮肤癌)的治疗、筛选、诊断和预后的、用于监测对癌症(如肺癌、胰腺癌和皮肤癌治疗)的功效的、和用于药物开发的方法和组合物。

Description

包含DLL3结合试剂的癌症的治疗和诊断靶标
发明介绍
本发明涉及对癌症相关的膜蛋白的鉴定，所述癌症例如肺癌、胰腺癌和/或皮肤癌，所述膜蛋白具有作为癌症治疗的治疗靶标或作为癌症标记物的实用性。具体而言，所述蛋白表现为一种生物靶标，可以针对其制造亲和性试剂，包括治疗性抗体或其他药物制剂。本发明还涉及这些亲和性试剂用于治疗和/或诊断癌症的用途。
发明背景
癌症(如肺癌、胰腺癌和皮肤癌)治疗中的主要挑战是提高早期检测率，以发现新的无创标记物，其能用于追踪疾病进展并识别复发，并发现改进的和较低毒性的治疗，尤其是5年生存率依然较差的更晚期的疾病。对于癌症细胞特异性的靶标的鉴定有着很大的需求，例如在肿瘤细胞表明表达的靶标，其从而能通过有前途的新方法如免疫治疗和靶向毒素来攻击那些肿瘤细胞。
δ-样蛋白3是一种I型膜蛋白，并且是δ家族成员。发明人已显示了δ-样蛋白3在癌症中表达，这表明了在患者(包括患有癌症的那些)中基于亲和性的针对δ-样蛋白3的治疗具有治疗效果。
发明概述
本发明还公开了在多种疾病组织的膜提取物中对δ-样蛋白3(下文中称为DLL3)的检测，所述疾病例如肺癌、胰腺癌和皮肤癌，下文称为“本发明的疾病”。
DLL3在多种癌症中的差异表达，使得能够基于对这些癌症的治疗用亲和性试剂例如抗体来靶向所述蛋白。因此，DLL3能用于产生特异性地结合至DLL3内的表位的亲和性试剂，包括抗体，并且DLL3能被这些亲和性试剂所靶向，作为治疗的基础。靶向癌症细胞表面蛋白的亲和性试剂，包括抗体，可以通过多种机制用于癌症治疗中，所述机制包括(i)通过补体介导的或抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)的裂解，(ii)通过与这些亲和性试剂缀合的药物或毒素的裂解或(iii)对这些蛋白的生理功能的抑制，所述蛋白可例如通过信号传输途径来驱动癌细胞的生长。这种基于亲和性试剂的治疗的一个重要方面是，蛋白靶标的正常表达谱在组织分布和表达水平方面是这样的，以致于通过抗体对正常组织蛋白靶标的任何靶向都不会因与正常组织结合而引起不良副作用。
本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，其中DLL3在所述癌症中表达，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的结合至DLL3的亲和性试剂。
所述癌症优选为本发明的疾病的一种。
本发明还提供结合至DLL3的亲和性试剂，其用于治疗或预防癌症，优选的是其中所述癌症是本发明的疾病的一种。
本发明还提供结合至DLL3的亲和性试剂用于制备治疗或预防癌症的药物的用途，优选的是其中所述癌症是本发明的疾病的一种。
用于本发明中的用途的亲和性试剂优选为特异性地结合至DLL3。
亲和性试剂可以是抗体，例如完整抗体，或其功能性片段或抗体模拟物。优选的亲和性试剂包括抗体，例如单克隆抗体。
亲和性试剂可以是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体、去岩藻基化抗体或双特异性抗体。
功能性的抗体片段包括UniBody、域抗体或纳米抗体(Nanobody)。
抗体模拟物包括亲和抗体(Affibody)、DARPin、Anticalin、Avimer、Versabody或Duocalin。
用于本发明中的用途的亲和性试剂可含有或缀合至治疗性部分，如细胞毒素部分或放射性同位素。亲和性试剂可以是抗体药物缀合物或免疫缀合物。
亲和性试剂可引发抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)或可引发补体依赖性的细胞毒性(CDC)。亲和性试剂可以诱发癌症细胞凋亡、杀死癌症干细胞或减少其数量和/或杀死循环癌细胞或减少其数量。亲和性试剂可以调节DLL3的生理功能，抑制配体与DLL3结合和/或抑制由DLL3介导的信号转导途径。
在另一个实施方案中，本发明还提供用于治疗或预防癌症的方法，其中DLL3在所述癌症中表达，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的能与编码DLL3的核酸杂交的杂交剂。
本发明还提供能与编码DLL3的核酸杂交的杂交剂，其用于治疗或预防癌症的用途，优选的是其中所述癌症是本发明的疾病的一种。
本发明还提供能与编码DLL3的核酸杂交的杂交剂用于制造治疗或预防癌症的药物的用途，优选的是其中所述癌症是本发明的疾病的一种。
用于本发明中的用途的杂交剂优选为特异性地结合至编码DLL3的一个或多个胞外结构域的核酸。
适合用于本发明用途的杂交剂包括抑制性的RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、反义核酸、互补DNA(cDNA)、寡核苷酸和核酶。
本发明还提供在受试者中检测、诊断和/或筛选癌症或监测其进展的方法，其中DLL3在所述癌症中表达，或监测癌症药物或治疗效果的方法，其中DLL3在所述癌症中表达，所述方法包括在所述受试者中检测DLL3或其一个或多个片段的存在或水平，或检测编码DLL3的核酸的存在或水平，或其包括在所述受试者中检测其水平的变化。
这种方法可包括检测DLL3或其一个或多个片段的存在，或编码DLL3的核酸的存在，其中其中(a)在受试者中与健康受试者中的水平相比，存在升高水平的DLL3或其所述一个或多个片段，或升高水平的编码DLL3的核酸，或是(b)在受试者中与健康的受试者中相应的不可检测的水平相比，存在可检测水平的DLL3或其所述一个或多个片段，或可检测水平的编码DLL3的核酸，指示存在癌症，其中DLL3在所述癌症中表达。
本发明还提供在受试者中检测、诊断和/或筛选癌症或监测其进展的方法，其中DLL3在所述癌症中表达，或监测癌症药物或治疗效果的方法，其中DLL3在所述癌症中表达，所述方法包括检测抗体的存在或水平，所述抗体能免疫特异性地结合至DLL3或其一个或多个片段。
在根据本发明的方法中，DLL3或其一个或多个片段的存在，或编码DLL3的核酸的存在，或能免疫特异性地结合至DLL3或其一个或多个片段的抗体的存在或水平，可以通过分析从受试者获得的生物样品来进行检测。
DLL3或其一个或多个片段的存在可用结合至DLL3的亲和性试剂来检测。亲和性试剂可为本文所述任何合适的亲和性试剂。亲和性试剂可含有或缀合至可检测的标志。
在此处提及的本发明任何方面，受试者可以是人。
本发明还提供鉴定用于治疗或预防癌症的制剂的方法，其中DLL3在所述癌症中表达，其中所述方法包括(a)用候选制剂接触DLL3或其一个或多个片段；和(b)确定所述制剂是否结合至DLL3或其一个或多个片段。所述方法还包括测试制剂结合至DLL3或其一个或多个片段以抑制癌症的能力的步骤，其中DLL3在所述癌症中表达。所述制剂还可调节DLL3的活性、减少与DLL3结合的配体或减少DLL3二聚化。
在本文所述的本发明许多实施方案中，尤其是可能提及的癌症类型，是本发明的疾病的一种。
在一个实施方案中，要检测、预防或治疗的癌症是肺癌，例如非小细胞肺癌和/或小细胞肺癌。
在另一个实施方案中，要检测、预防或治疗的癌症是胰腺癌。
在另一个实施方案中，要检测、预防或治疗的癌症是皮肤癌，例如黑素瘤。
本发明的其他方面在下文中以及本申请的权利要求书中说明。
附图简述
图1a显示了抗DLL3多克隆抗体的内化，其通过SHP-77细胞用PabZAP测定法来进行。
图1b显示了抗DLL3多克隆抗体的内化，其通过N82细胞用PabZAP测定法来进行。
图2显示了表达DMS79DLL3的细胞的特异性裂解，其通过由双特异性的抗-DLL3-CD3多克隆抗体来激活T细胞而进行。
发明详述
下文对本发明进行详述，本发明包含了对受试者(例如哺乳动物受试者)使用治疗组合物以治疗或预防癌症，例如本发明的疾病。本发明还提供用于对哺乳动物受试者中的癌症(例如本发明的疾病)进行临床筛选、诊断或预后，用于鉴定最可能响应于具体治疗性治疗的患者，用于监测癌症(例如本发明的疾病)治疗的结果，用于药物筛选和药物开发的方法和组合物。
本发明是基于发现了DLL3蛋白在某些癌症中表达。具体而言，支持数据在此附上，其证明了DLL3蛋白在肺癌、胰腺癌和皮肤癌的质膜中的表达。因此针对DLL3的抗体在这些癌症或显示出DLL3表达的其他癌症类型中可具有作为治疗和诊断的实用性。
此处所用的术语“受试者”意指动物，优选为哺乳动物。哺乳动物受试者可以是非人哺乳动物，但通常是人，如成人。
受试者通常是活的受试者。然而，虽然本发明的用途、方法和组合物特别适合于活的受试者的筛选、诊断和预后，它们也可用于受试者的尸检诊断，例如鉴定有患上同样疾病的风险的家庭成员。
此处所用的术语“患者”意指患有或被怀疑患有一种或多种本发明的疾病的受试者。
此处所用的术语“本发明的蛋白”意指δ-样蛋白3(GeneID:10683)，其在此处称为DLL3。据发现，这种蛋白在多种癌症中差异表达，因此提供了用于这些癌症的基于亲和性的治疗的新靶标。DLL3蛋白的人序列在SEQ ID NO:1中给出。术语DLL3(在蛋白的语境中)涵盖这样的蛋白或其衍生物或变体(尤其是其天然形成的人衍生物或变体)，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列或是由其组成。
通过实施例1中所述的方法和设备(例如通过膜蛋白提取物的液相色谱-质谱法)，已在来自癌症患者的癌症组织样品的膜蛋白提取物中鉴定出这种蛋白。将肽序列与SWISSPROT和TrEMBL数据库(由瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics,SIB)和欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute,EBI)所有，可在www.expasy.org查到)对比，并鉴定出条目Q9NYJ7，δ-样蛋白3-DLL3。发现编码这个蛋白的核苷酸序列的登录号为NM_016941，如SEQ ID NO:3中所给出的。
根据SWISS-PROT，δ-样蛋白3是δ家族的I型膜蛋白，且由一个DSL结构域、6个EGF-样结构域、一个跨膜区和一个SEQ ID NO:1的氨基酸27-492的胞外尾部(SEQ ID NO:12)组成。发明人已显示了δ-样蛋白3在癌症中表达，这表明了在患者(包括患有癌症的那些)中针对δ-样蛋白3的基于亲和性的治疗具有治疗效果。
DLL3作为片段是有用的，尤其是含有片段的表位，例如其抗原性或免疫原性的片段及其衍生物，具体而言片段包括蛋白的胞外结构域(例如胞外尾部或环)。含有表位的片段，包括抗原性或免疫原性的片段，通常长度为12个或更多氨基酸，例如20个或更多的氨基酸，例如50或100个或更多的氨基酸。片段可以是完整蛋白长度的95％或更多，例如90％或更多，例如完整蛋白长度的75％或50％或25％或10％或更多。
或者，此处采用的或提到的蛋白/多肽可限定至在本发明说明书中具体记载/描述的那些蛋白/多肽，或是与之具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％氨基酸序列同一性或相似性的变体或衍生物。百分比氨基酸序列同一性/相似性可以用适当的默认参数通过任何合适的算法例如BLAST、CLUSTAL来确定。
因此，对于蛋白或多肽情况下的的术语“DLL3”意指这样的蛋白或其衍生物或变体，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或2任一中给出的氨基酸序列或由其组成，所述衍生物或变体与SEQ ID NO:1或2任一具有至少90％或95％序列同一性，并且其蛋白具有与DLL3基本相同的组织分布。
在核酸的语境中，术语“DLL3”也意指这样的核酸或其衍生物或变体，所述核酸的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3或4任一中给出的序列或由其组成，所述衍生物或变体与SEQID NO:3或4任一具有至少90％或95％序列同一性，并且其编码具有与DLL3基本相同的组织分布的蛋白。
含有表位的DLL3片段包括抗原性或免疫原性的片段，其能在患者中引发相关免疫响应。编码DLL3的DNA也是有用的，其片段也是如此，例如编码DLL3的片段如其免疫原性片段的DNA。编码DLL3的核酸片段(例如DNA)可为完整编码区的长度的95％或更多，例如90％或更多，例如完整编码区的长度的75％或50％或25％或10％或更多。核酸片段(例如DNA)长度可为36个核苷酸或更多，例如60个核苷酸或更多，例如150或300个核苷酸或更多。
DLL3的衍生物包括序列的变体，其中有一个或多个(例如1-20个如15个氨基酸，或基于蛋白总长度的多达20％如10％或5％或1％的氨基酸数目)缺失、插入或取代。典型的取代可为保守取代。典型的衍生物具有与其源蛋白基本相同的生物学功能。典型的衍生物具有与其来源蛋白基本相当的抗原性或免疫原性。典型的衍生物具有其来源蛋白的配体结合活性或活化的受体-复合体形成能力，或优选二者兼具。衍生物和变体通常具有与DLL3相同的组织分布。
蛋白的衍生物还包括经化学处理的蛋白，如羧甲基化、羧酰胺化、乙酰化的蛋白，例如在纯化过程中进行处理。
在一个方面，本发明提供DLL3或包含DLL3的组合物。所述蛋白可为分离的或纯化的形式。本发明还提供编码DLL3的核酸和包含编码DLL3的核酸的组合物。
在进一步的方面，提供能在受试者中引发免疫响应的组合物，该组合物包含DLL3多肽和/或其一个或多个抗原性或免疫原性的片段，以及一个或多个合适的载体、赋形剂、稀释剂或佐剂(合适的佐剂在下文讨论)。
能引发免疫响应的组合物是作为例如疫苗提供的，所述疫苗包含DLL3多肽或其衍生物或变体，和/或其一个或多个抗原性或免疫原性的片段，任选地连同一个或多个合适的载体、赋形剂、稀释剂或佐剂。
在另一个方面，本发明提供DLL3多肽，或其一个或多个片段或衍生物或变体，其用于治疗或预防例如一种或多种本发明的疾病。
在另一个方面，本发明提供DLL3多肽或其一个或多个片段或衍生物或变体用于治疗或预防例如一种或多种本发明的疾病的用途。
本发明还提供DLL3多肽、其一个或多个片段或衍生物或变体在制造用于治疗或预防例如一种或多种本发明的疾病的药物中的用途。
在一个方面，提供治疗方法，所述治疗包括施用治疗有效量的DLL3多肽、其一个或多个片段或衍生物或变体，用于治疗或预防例如一种或多种本发明的疾病。
本发明还提供用于在受试者中治疗或预防例如本发明的疾病的方法，或为受试者接种针对例如一种或多种本发明的疾病的疫苗的方法，其包括对受试者施用治疗有效量的DLL3多肽和/或其一种或多种抗原性或免疫原性的片段或衍生物或变体的步骤，例如作为疫苗施用。
在另一个方面，本发明提供治疗例如本发明的疾病的方法，包括对患者施用治疗有效量的化合物，所述化合物在患有例如本发明的疾病的患者中调节(例如上调或下调)或补充DLL3的表达或生物活性(或二者兼有)，从而(a)预防例如本发明的疾病的发作或进展；(b)预防例如本发明的疾病的进展；或(c)减轻例如本发明的疾病的症状。
在又一个进一步的实施方案中，本发明提供分别或一起包含如下的药物：
(a)DLL3，和
(b)抗癌剂，
其用于在癌症治疗中同时、序贯或分别施用，优选为在一种或多种本发明的疾病的治疗中施用。
DLL3能用于例如本发明的疾病的检测、预后、诊断或监测或用于药物开发。
根据本发明的另一个方面，我们提供用于在受试者中检测、诊断和/或筛选例如本发明的疾病或监测其进展的方法，或监测例如针对本发明的疾病的抗癌药物或治疗的效果的方法，其包括在所述受试者中检测DLL3或其一个或多个片段存在或水平，或编码DLL3的核酸的存在或DLL3活性的水平，或其包括在所述受试者中检测其水平的变化。
根据本发明的另一个方面，我们提供了在候选受试者中检测、诊断和/或筛选例如本发明的疾病的方法，其方法包括在候选受试者中检测DLL3或其一个或多个片段的存在，或编码DLL3的核酸的存在或DLL3的活性的存在，其中(a)在受试者中与健康受试者中的水平相比，存在升高水平的DLL3或其所述一个或多个片段，或升高水平的编码DLL3的核酸，或是(b)在受试者中与健康的受试者中相应的不可检测的水平相比，存在可检测水平的DLL3或其所述一个或多个片段，或可检测水平的编码DLL3的核酸，指示在所述受试者中存在例如本发明的疾病。
根据本发明另一个方面，我们提供了在受试者中监测例如本发明的疾病的进展或监测针对本发明的疾病的抗癌药物或治疗的效果的方法，其包括在所述候选受试者中检测DLL3或其一个或多个片段的存在，或编码的核酸的存在或DLL3活性的存在，所述检测是在第一时间点和较晚些的时间点处进行的；与受试者中第一时间点处的水平相比，在受试者中于稍晚些的时间点处有DLL3或其所述一个或多个片段的升高的或降低的水平的存在，或编码DLL3的核酸的升高的或降低的水平的存在，或DLL3活性的升高的或降低的水平的存在，指示在所述受试者中例如本发明的疾病的进展或消退，或指示在所述受试者中针对本发明的疾病的抗癌药物或治疗的有效或无效。
对于DLL3，与分析来自未患例如本发明的疾病的受试者的组织样品时获得的检测到的水平相比，分析来自患有例如本发明的疾病的受试者的组织样品时获得的检测到的水平取决于所使用的具体分析方案和检测技术。因而，本发明认为每个实验室都会根据使用的分析方案和检测技术，在未患例如本发明的疾病的受试者中建立参考范围，这在诊断领域中是常规的。优选的是，分析的每一批样品都包含了来自已知患有例如本发明的疾病的受试者的至少一个对照阳性组织样品，或来自已知未患例如本发明的疾病的受试者的至少一个对照阴性组织样品(更优选为阳性和阴性对照样品均包含在内)。
在本发明的一个方面，用液相色谱-质谱分析或其他合适的方法来分析来自受试者组织样品的本发明的疾病，优选为活的受试者，以测量DLL3的表达从而筛选或诊断例如本发明的疾病，以确定患者的本发明的疾病的预后，从而监测本发明的疾病的治疗有效性，或用于药物开发。
在上述方法的任一种中，在患癌症(例如本发明的疾病)的候选受试者中可检测的水平优选为健康受试者中的水平的2或更多倍高。
在本发明的一个实施方案中，来自受试者(例如被怀疑患有本发明的疾病的受试者)的组织样品通过液相色谱-质谱分析进行分析以检测DLL3。与来自未患本发明的疾病的受试者的组织(例如对照样品)相比或是与之前确定的参考范围相比，来自受试者组织中DLL3丰度的增加说明存在本发明的疾病。
对于DLL3的片段、含有表位的片段、免疫原性片段或抗原性片段：
对于相关的癌症应用，在本发明的一方面这些包含了在实施例1中鉴定为胰蛋白酶序列的序列。
如此处所用，当基本不含污染蛋白的制备物中存在时，例如在污染蛋白低于存在的总蛋白的10％(例如低于5％，如低于1％)的制备物中存在时，DLL3是“分离的”。污染蛋白是具有与分离的DLL3显著不同的氨基酸序列的蛋白，如通过质谱分析所确定的那样。如此处所用，“显著不同的”序列是使污染蛋白能通过质谱分析从DLL3解析区分开来的序列，所述质谱分析是按照此处实施例1中所述试验方案进行的。
在本发明的诊断和预后方法中，DLL3能通过本领域技术人员已知的任何方法来测定，包括但不限于此处所述优选的技术(Preferred Technologies)，激酶测定法、酶测定法、结合测定法和其他功能性测定法、免疫测定法、和Western印迹。
或者，可在免疫测定法中检测DLL3。在一个实施方案中，通过使来自要测试的受试者的样品在这样的条件下接触抗DLL3抗体(或其他亲和性试剂)，在所述条件下如果存在DLL3则能发生结合(例如免疫特异性结合)，并且通过药剂检测或测量任何结合的量(例如免疫特异性结合)，来进行免疫测定法。DLL3结合剂能通过此处所教导的方法和技术来生产。在一个具体的实施方案中，DLL3是用免疫组化来分析的。
DLL3的检测可以通过检测其片段来进行，例如其含有表位(例如免疫原性的或抗原性的)的片段。片段长度可为至少10个，更典型为至少20个氨基酸，例如至少50或100个氨基酸，例如至少150或200个氨基酸；例如至少300个或500个氨基酸；例如至少700或900个氨基酸。
在一个实施方案中，在组织切片中亲和性试剂(例如抗体)的结合可用于检测异常的DLL3定位或DLL3的异常水平。在一个具体实施方案中，DLL3的抗体(或其他亲和性试剂)能用于测定患者组织(例如肺、胰腺和皮肤组织)的DLL3水平，此时DLL3的异常水平指示本发明的疾病。如此处所用，“异常水平”意指与未患本发明的疾病的受试者中的水平相比或与参考水平相比增加的水平。
可使用任何合适的免疫测定，包括但不限于使用技术如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体-结合测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法的的竞争性和非竞争性测定系统。
例如，DLL3能在液体样品中(例如血液、尿液或唾液)通过两步夹心测定方法检测到。在第一步中，用捕获试剂(例如抗DLL3抗体或其他亲和性试剂)来捕获DLL3。可任选将捕获试剂固定到固相上。在第二步中，将直接或间接地带标志的检测试剂用于检测捕获的DLL3。在一个实施方案中，检测试剂是凝集素。任何凝集素可用于此优先结合至DLL3而非其他同种型或其他蛋白的目的，所述其他同种型具有与DLL3相同的核心蛋白，所述其他蛋白具有相同的由抗体识别的抗原决定簇。在优选的实施方案中，选择的凝集素以所述其他同种型或其他蛋白的至少2倍大的亲和性结合DLL3，更优选至少5倍大的亲和性，更优选至少10倍大的亲和性，所述其他同种型具有与DLL3相同的核心蛋白，所述其他蛋白具有相同的由抗体识别的抗原决定簇。基于本说明书，适合于检测DLL3的凝集素完全可通过本领域已知的方法来鉴定，例如在Sumar等,Lectins as Indicators of Disease-AssociatedGlycoforms,In:Gabius H-J&Gabius S(编),1993,Lectins and Glycobiology,于pp.158-174(在此通过提述以其整体并入)第158-159页表I中枚举的对一种或多种凝集素的测试中。在另一个实施方案中，检测试剂是抗体(或其他亲和性试剂)，例如特异性地(例如免疫特异性地)检测其他翻译后修饰的抗体，如免疫特异性地结合至磷酸化的氨基酸的抗体。这些抗体的例子包括结合至磷酸酪氨酸的抗体(BD Transduction Laboratories,编号:P11230-050/P11230-150；P11120；P38820；P39020)、结合至磷酸丝氨酸的那些(ZymedLaboratories Inc.,South San Francisco,CA,编号61-8100)和结合至磷酸苏氨酸的抗体(Zymed Laboratories Inc.,South San Francisco,CA,编号71-8200,13-9200)。
如果需要的话，编码DLL3的基因、相关的基因、或相关的核酸序列或亚序列(包括互补序列)也可用于杂交测定。可用包含至少8个核苷酸，优选包含至少12个核苷酸，最优选包含至少15个核苷酸的编码DLL3的核苷酸或其亚序列作为杂交探针。杂交测定可用于对与编码DLL3的基因异常表达有关的病情、病症、或疾病状况的检测、预后、诊断或监测，或是用于鉴别诊断具有暗示例如本发明的疾病的迹象或症状的受试者。具体而言，这种杂交测定能通过这样的方法来进行，所述方法包括在能发生杂交的条件下使受试者的含核酸的样品与能杂交至编码DLL3的DNA或RNA的核酸探针接触，并检测或测量任何所得的杂交。
因此，编码DLL3的核酸(例如DNA或更适合的是RNA)可例如用能杂交至编码DLL3的DNA的杂交剂(具体为寡核苷酸探针)来检测。
一个示例性的这种方法包括：
使一种或多种包含10个或更多连续核苷酸的寡核苷酸探针与从来自受试者的生物样品的获得RNA接触或与来自所述RNA的cDNA接触，所述连续核苷酸与编码DLL3的核苷酸序列是互补的，其中所述接触发生在允许探针杂交至核酸序列(如果存在的话)的条件下；
检测探针和核酸序列之间的杂交，如果存在的话；和
将步骤(b)中检测出的杂交(如果存在的话)与在对照样品中检测出的杂交进行比较，或与之前确定的参考范围进行比较。
本发明还提供了诊断试剂盒，其包含抗DLL3抗体(或其他亲和性试剂)。此外，这种试剂盒可以任选地包含一种或多种如下：
(1)用于使用抗DLL3亲和性试剂的说明书，所述亲和性试剂用于诊断、预后、治疗或监测或是这些应用的任何组合；
(2)带标志的针对亲和性试剂的结合伴侣(binding partner)；
(3)固相(例如试剂条(reagent strip))，其上固定有抗DLL3亲和性试剂；和
(4)指示对诊断、预后或治疗用途或其任何组合的监管批准的标志或插页。如果没有提供针对亲和性试剂的结合伴侣，则抗DLL3亲和性试剂自身可用可检测的标记物，例如化学发光的、酶的、荧光的、或放射性的部分标记。
本发明还提供一种试剂盒，其包含能杂交至编码DLL3的核酸(合适为RNA)的核酸探针。在一个具体实施方案中，试剂盒包含一个或多个容器、一对引物(例如各自在6-30个核苷酸、更优选10-30个核苷酸、还更优选10-20个核苷酸的尺寸范围内)，所述引物在适当反应条件下能引发至少一部分编码DLL3的核酸的扩增，如通过聚合酶链式反应(参见例如Innis等,1990,PCR Protocols,Academic Press,Inc.,San Diego,CA)，连接酶链式反应(参见EP 320,308)、复制酶Qβ的使用、循环探针反应、或本领域已知的其他方法。
试剂盒可任选地进一步包含预先确定量的DLL3或编码DLL3的核酸，例如作为标准或对照来使用。
此处所用的术语“样品”包括取自有患一种或多种本发明的疾病风险的受试者的体液(例如血液、尿液或唾液)和活组织(例如活组织如肺、胰腺和皮肤活组织)或其匀浆。
例如，所用的生物样品可来自任何来源如血清样品或组织样品例如活组织如肺、胰腺和皮肤组织。例如，当寻找本发明的疾病的转移证据时，人们会观察本发明的疾病转移的主要部位，例如对于肺癌而言是脑、肝脏、骨和肾上腺，对于胰腺癌而言是肝脏，或对于皮肤癌而言是肺、脑和骨。
或者，DLL3或其一个或多个片段的存在，或编码DLL3的核酸的存在或DLL3活性的存在可以通过原位分析来检测。
在一些实施方案中，此处所述诊断的方法可为至少部分或完全地体外(in vitro)或离体(ex vivo)进行的。
适当地，DLL3或其一个或多个片段的存在，或编码DLL3的核酸的存在或DLL3活性的存在是定量地检测的。
例如，定量检测可以包括：
使生物样品与对DLL3特异性的亲和性试剂接触，所述亲和性试剂任选地缀合至可检测的标签；和
检测亲和性试剂是否与样品中的至少一种之间发生结合，所述检测或是直接或是间接地进行。
或者，DLL3或其一个或多个片段的存在，或编码DLL3的核酸的存在或DLL3活性的存在可以通过涉及使用成像技术的手段来定量地检测。
在另一个实施方案中，本发明的方法涉及在肺、胰腺和皮肤组织切片上使用免疫组化以确定DLL3或其一个或多个片段的存在，或编码DLL3的核酸的存在或DLL3活性的存在，并由此对本发明的疾病的细胞进行定位。
在另一个实施方案中，例如用能特异性地结合至DLL3或其一个或多个片段的亲和性试剂(如抗体)，检测到了DLL3或其一个或多个含有表位的片段的存在。
在另一个实施方案中，检测到了DLL3的活性。
临床研究中的用途
本发明的诊断方法和组合物能有助于监测临床研究，例如评估用于治疗本发明的疾病的药物。在一个实施方案中，测试候选分子在患有例如本发明的疾病的受试者中将DLL3水平恢复至未患本发明的疾病的受试者中水平的能力，或在被治疗的受试者中将DLL3水平保持在非肺癌、非胰腺癌或非皮肤癌值的能力。
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物用于筛选候选者用于临床研究以鉴定患有例如本发明的疾病的个体；随后可将这种个体从研究排除或可置于分开的治疗或分析群体中。
发明的蛋白及相应核酸的产生
在一个方面，本发明提供了治疗或预防例如本发明的疾病的方法，包括对需要这种治疗或预防的受试者施用治疗有效量的编码DLL3或其一个或多个片段或衍生物的核酸，例如以疫苗的形式施用。
在另一个方面，提供了治疗或预防例如本发明的疾病的方法，包括对需要这种治疗或预防的受试者施用治疗有效量的抑制DLL3功能或表达的核酸。
本发明的方法(和/或此处公开的其他DNA方面)可例如包括其中核酸是DLL3反义核酸或核酶。
因此，本发明包括编码DLL3或其一个或多个片段或衍生物的核酸用于制造治疗或预防例如本发明的疾病的药物的用途。
还提供了抑制DLL3的功能或表达的核酸在制造用于治疗或预防例如一种或多种本发明的疾病的药物中的用途。
可通过将用作起始材料市售mRNAs的cDNA文库分离为cDNA片段，并确定和鉴定其核苷酸序列来获得本发明所采用的DNA。换言之，具体来说，克隆是随机分离自cDNA文库的，所述cDNA文库根据Ohara等的方法(DNA Research Vol.4,53-59(1997))来制备。然后，通过杂交将复制的克隆(其重复出现)移除，然后进行体外转录和翻译。确定了克隆的两个末端的核苷酸序列，所述克隆的产物被确认为50kDa或更大。
并且，用因此获得的末端核苷酸序列作为查询，检索了已知基因的数据库以检索同源性。
除了上述筛选方法外，cDNA的5'和3'末端序列与人基因组序列有关。然后在序列之间的区域确认了未知的长链基因，并分析了全长cDNA。用这种方法，可以系统性地克隆那些不能通过基于已知基因的常规克隆方法获得的未知基因。
此外，来源于人的含有本发明的DNA的基因的所有区域也能用PCR方法如RACE来制备，并要足够注意预防在短片段或获得的序列中发生的人为误差。具有本发明DNA的克隆可以如上所述来获得。
在用于克隆本发明的DNA的另一个手段中，产生了的合成DNA引物，所述引物具有本发明多肽的一部分合适的核苷酸序列，然后通过PCR方法用合适的文库进行扩增。或者，可通过将本发明的DNA与已整合到合适载体中且用DNA片段或合成DNA进行标志的DNA杂交来进行选择，所述DNA片段或合成DNA编码本发明的多肽的一些或所有区域。可通过例如Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.Ausubel等主编,1987)中所述的方法来进行杂交。本发明的DNA可为任何DNA，只要其含有编码如上所述本发明的多肽的核苷酸序列。这种DNA可为鉴定并分离自cDNA文库等的cDNA，其来源于肺、胰腺和皮肤组织。这种DNA还可为合成的DNA等。用于文库构建的载体可为任何噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒，等等。此外，通过使用制备自上述细胞和/或组织的总RNA级分或mRNA级分，可通过直接反转录偶联聚合酶链式反应(下文简称为“RT-PCR方法”)进行扩增。
通过例如本领域技术人员已知的定点诱变方法、基因同源重组方法、引物延伸方法、以及PCR方法的合适组合，可以容易地产生编码上述由氨基酸序列组成的多肽的DNA，其中所述氨基酸序列与DLL3的氨基酸序列是基本完全相同的，或编码所述由氨基酸序列组成的多肽的DNA，其中所述氨基酸序列来源于DLL3的氨基酸序列通过缺失、取代或添加组成氨基酸序列的一部分的一个或多个氨基酸。此外，此时，用于使多肽具有基本相等的生物学活性的可能的方法是在组成所述多肽的氨基酸中取代同源性的氨基酸(例如极性和非极性氨基酸、亲水和疏水氨基酸、带正电荷的和带负电荷的氨基酸、以及芳香族氨基酸)。此外，为了生物学活性维持基本相当，包含在本发明多肽中的功能结构域内的氨基酸优选的是保守的。
此外，本发明DNA的例子包括包含编码DLL3的氨基酸序列的DNA，和与所述DNA在高严格条件下杂交的DNA，以及编码具有生物学活性(功能)的多肽(蛋白)的DNA，所述生物学活性与由DLL3的氨基酸序列组成的多肽的功能相等。在这种条件下，这种能与包含编码DLL3的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA杂交的DNA的例子是包含与所述DNA整体核苷酸序列具有如约80％或更多，优选约90％或更多，和更优选约95％或更多的总体平均同源性程度的核苷酸序列的DNA。杂交可根据本领域已知的方法来进行，如Current Protocols inMolecular Biology(Frederick M.Ausubel等主编,1987)中所述的方法或与其一致的方法。在此，“严格条件”是例如约“1*SSC、0.1％SDS、和37℃、更严格条件为约”0.5*SSC、0.1％SDS、和42℃、或甚至更严格条件为约“0.2*SSC、0.1％SDS、和65℃。在更严格的杂交条件下，可预期分离与探针序列具有高同源性的DNA。上述SSC、SDS和温度条件的组合在此仅出于阐述目的提供。本领域技术人员使用上述因素或其他因素(例如杂交的探针浓度、探针长度、和反应时间)的合适组合可达到与上述相似的严格度，用于确定杂交的严格度。
本发明的克隆的DNA可直接使用，或者如果需要的话可在用限制性内切酶消化或添加接头之后使用，这取决于目的。DNA可具有ATG作为5'末端的翻译起始密码子，并具有TAA、TGA、或TAG作为3'末端的翻译终止密码子。这些翻译起始和翻译终止密码子也可用适当的合成DNA衔接头来添加。
在本发明的方法/用途中，DLL3可例如以分离的形式提供，如当DLL3多肽已被纯化至至少一定程度时。DLL3多肽可以基本纯的形式提供，即在基本程度上没有其他蛋白。DLL3多肽还可用重组方法来生产、合成地生产或通过这些方法的组合来生产。DLL3可通过本领域技术人员已知的任何方法容易地制备，其涉及生产含有合适本发明DNA的或含有本发明DNA的基因的表达载体、培养用所述表达载体转化的转化株、产生并积累相关的本发明的多肽或含有所述多肽的重组蛋白、以及随后收集所得物。
重组DLL3多肽可通过本领域所熟知的方法，从经遗传工程改造的包含表达系统的宿主细胞制备。因此，本发明还涉及包含DLL3多肽或核酸的表达系统、涉及用这种表达系统来遗传工程改造的宿主细胞以及涉及通过重组技术来生产DLL3多肽。对于重组DLL3多肽的生产而言，宿主细胞可经遗传工程改造以并入核酸的表达系统或其部分。这种并入可用本领域熟知的方法来进行，例如磷酸钙转染、DEAD-右旋糖酐介导的转染、平延(transvection)、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrapeloading)、射弹导入(ballistic introduction)或感染(参见例如Davis等,Basic Methodsin Molecular Biology,1986和Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbour laboratory Press,Cold Spring Harbour,NY,1989)。
作为宿主细胞，可使用例如埃希氏菌属(Escherichia)、链球菌属(Streptococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、链霉菌属(Streptomyces)的细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌、酵母、曲霉属(Aspergillus)细胞、昆虫细胞、昆虫、和动物细胞。此处所用的埃希氏菌属细菌的具体例子，包括大肠杆菌(Escherichia coli)K12和DH1(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.60,160(1968))、JM103(Nucleic Acids Research,Vol.9,309(1981))、JA221(Journal of Molecular Biology,Vol.120,517(1978))和HB101(Journal of Molecular Biology,Vol.41,459(1969))。作为芽孢杆菌属的细菌,使用例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MI114(Gene,Vol.24,255(1983))和207-21(Journalof Biochemistry,Vol.95,87(1984))。作为酵母，使用例如酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、和20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)NCYC1913和NCYC2036、和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。作为昆虫细胞，使用例如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞。作为动物细胞，使用例如COS-7和Vero猴细胞、CHO中国仓鼠细胞(下文简称为CHO细胞)、dhfr基因缺乏的CHO细胞、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3细胞、人FL细胞、COS、HeLa、C127、3T3、HEK 293、BHK和Bowes黑色素瘤细胞。
还能采用无细胞翻译系统来产生重组多肽(例如兔网织红细胞裂解物、小麦胚裂解物、来自Roche Diagnostics Ltd.,Lewes,UK的SP6/T7体外T&T和RTS 100大肠杆菌HY转录和翻译试剂盒，和来自Promega UK,Southampton,UK的TNT快速偶联转录/翻译系统)。
可根据本领域已知方法来生产表达载体。例如，可以通过(1)切割含有本发明DNA的或含有本发明DNA的基因的DNA片段和(2)将DNA片段连接到合适表达载体中启动子的下游来产生载体。可以使用多种多样的表达系统，例如且不限于：染色体的、附加体的和来源于病毒的系统，例如来源于大肠杆菌的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC18、和pUC118)、来源于枯草芽孢杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5、和pC194)、来自噬菌体、来自转座子、来自酵母附加体(例如pSH19和pSH15)、来自插入元件、来自酵母染色体元件、来自病毒如杆状病毒、乳多泡病毒(papova virus)如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒(pseudorabies virus)和逆转录病毒，以及来源于其组合的载体，如来源于质粒和噬菌体(例如λ噬菌体)遗传元件，如粘粒和噬菌粒的那些。表达系统可含有对照区，所述对照区调节并引起表达。用于本发明中的启动子可为任何启动子，只要其适合于待用于基因表达的宿主。例如，当宿主是大肠杆菌时，优选为trp启动子、lac启动子、recA启动子、pL启动子、lpp启动子等。当宿主是枯草芽孢杆菌时，优选为SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。当宿主是酵母时，优选为PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。当用动物细胞作宿主时，这种情况下使用的启动子的例子包括SRa启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、和HSV-TK启动子。一般来说，能够在宿主中维持、增殖或表达核酸以产生多肽的任何系统或载体都可使用。
可通过任何的大量已知和常规的技术将合适的核酸序列插入到表达系统中，例如前述Sambrook等中所述的那些。可将合适的分泌信号整合到DLL3多肽中，以使翻译的蛋白被分泌到内质网的内腔中、细胞周质间隙中或是细胞外环境中。这些信号对于DLL3多肽可为内源性的或其可为外源信号。对宿主细胞的转化可根据本领域已知技术来进行。例如，可参考如下文献：Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.69,2110(1972)；Gene,Vol.17,107(1982)；Molecular&General Genetics,Vol.168,111(1979)；Methods in Enzymology,Vol.194,182-187(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),Vol.75,1929(1978)；Cell Technology,单行卷8,New Cell Technology,Experimental Protocol.263-267(1995)(Shujunsha发行)；和Virology,Vol.52,456(1973)。因此获得的用含有本发明DNA的或含本发明DNA的基因的表达载体转化的转化体可根据本领域已知技术来培养。例如，当宿主是埃希氏菌属的细菌时，通常在约15℃-43℃培养细菌约3-24h。若有需要，还可以增加通气和搅拌。当宿主是芽孢杆菌属的细菌时，通常在约30℃-40℃培养细菌约6-24h。若有需要，还可以增加通气和搅拌。当对宿主为酵母的转化株进行培养时，通常用pH调整至约5-8的培养基在约20℃-35℃培养细菌约24-72h。若有需要，还可以增加通气和搅拌。当对宿主为动物细胞的转化株进行培养时，通常用pH调整至约6-8的培养基在约30℃-40℃培养细菌约15-60h。若有需要，还可以增加通气和搅拌。
如果要表达DLL3多肽用于在基于细胞筛选的测定法中使用，优选为在细胞表面产生多肽。在这个事件中，可在将细胞用于筛选测定法之前收获细胞。如果DLL3多肽被分泌到培养基中，可回收培养基以分离所述多肽。如果在细胞内产生，则细胞必须首先在回收DLL3多肽之前裂解。
可通过熟知的方法从重组细胞培养物或从其他生物来源回收并纯化DLL3多肽，所述方法包括：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，亲和层析，疏水相互作用层析，羟基磷灰石层析，分子筛层析，离心法，电泳法以及凝集素层析。在一个实施方案中，使用了这些方法的组合。在另一个实施方案中，使用了高效液相层析。在进一步的实施方案中，使用了特异性地结合至DLL3多肽的抗体以使含DLL3多肽的样品耗尽所述多肽或纯化所述多肽。
为了从培养产物分离并纯化本发明的多肽或蛋白，例如，在培养后通过已知方法收集微生物菌体或细胞，将其悬浮于合适的缓冲液中，通过例如超声波、溶菌酶和/或冻融来破坏微生物菌体或细胞，然后将生成物进行离心或过滤，然后得到蛋白的粗提取物。缓冲液还可含有蛋白质变性剂如尿素或盐酸胍或表面活性剂如Triton X-100(TM)。当蛋白被分泌于培养溶液中时，在完成培养后通过已知方法将微生物菌体或细胞和上清分离出来，然后收集上清。因此获得的培养物上清或提取物中含有的蛋白可通过已知分离和纯化方法的合适组合来进行纯化。因此获得的本发明的多肽(蛋白)可通过已知方法或与其一致的方法转换为盐。相反地，当本发明的多肽(蛋白)是以盐的形式获得时，可通过已知方法或与其一致的方法将其转换为游离蛋白或多肽或其他盐。此外，在纯化之前或之后使合适的蛋白修饰酶如胰蛋白酶或糜蛋白酶作用于重组产生的蛋白，从而能够任意地添加修饰或能够部分地去除多肽。本发明的多肽(蛋白)或其盐的存在能用特异性地抗体等通过多种结合测定法、酶免疫测定法来测量。
当多肽已在分离和纯化期间变性时，可用本领域熟知的技术来进行重折叠，以再次产生DLL3多肽的天然或活性构象。在本发明的条件下，可从来自任何来源的生物样品获得DLL3多肽，例如且不限于：血液样品或组织样品，例如肺、胰腺和皮肤组织样品。
DLL3多肽可为“成熟蛋白”的形式或是较大蛋白如融合蛋白的一部分。包含附加的氨基酸序列通常更是为有利的，所述氨基酸序列含有分泌或前导序列，前(pre-)、原(pro-)或前原(prepro-)蛋白序列、或有助于纯化的序列如亲和性标签，例如但不限于：多组氨酸残基、FLAG标签、HA标签或myc标签。
DLL3可例如与异源融合伴侣融合，所述异源融合伴侣如表面蛋白，其被称为来自嗜血杆菌流感B的蛋白D，是一种来自流感病毒如NS1的非结构性蛋白、来自乙型肝炎(Hepatitis B)的S抗原或称为LYTA的蛋白如其C末端。
还可使用能在重组生产期间提供稳定性的附加序列。这些序列可任选地根据需要来去除，所述去除是通过整合一个可切割序列作为附加序列或其部分而进行的。因此，可将DLL3多肽融合至其他基团，包括其他多肽或蛋白(例如谷胱甘肽S-转移酶和蛋白A)。这种融合蛋白可用合适的蛋白酶来切割，然后分离到各蛋白中。这种附加序列和亲和性标签是本领域所熟知的。除上述外，若有需要，还可向表达载体添加本领域已知的特征，如增强子、剪接信号、多聚A添加信号、选择标记物、和SV40复制起点。
在一个方面，本发明提供了能特异地结合至DLL3或其片段的药剂，或能杂交至编码DLL3的核酸的杂交剂，或能检测DLL3活性的药剂，用于治疗、筛选或检测和/或诊断疾病的用途，所述疾病如癌症，并且具体为本发明的疾病。
针对DLL3的亲和性试剂的生产
在一个方面，本发明提供了能特异性地结合至DLL3或其片段的亲和性或免疫亲和性试剂，例如含有或缀合至可检测标志物的或含有或缀合至治疗部分(如细胞毒性部分)的亲和性试剂。亲和性剂可例如为抗体。亲和性试剂可以是分离的亲和性试剂或纯化的亲和性试剂。
本发明使用的亲和性试剂可以结合至DLL3上的表位，例如SEQ ID NO:1或2任一的一个或多个部分。优选地，亲和性试剂特异性地结合至DLL3的胞外结构域(例如胞外尾部或胞外环)(例如结合至SEQ ID NO:12)。
根据本领域的那些，有三种主要的免疫亲和性试剂：单克隆抗体、噬菌体展示抗体和较小的抗体来源分子如Affibodies、域抗体(Domain Antibodies,dAbs)、纳米抗体、UniBodies、DARPins、Anticalins、Duocalins、Avimers或Versabody。通常，在根据本发明(其中叙述了抗体的使用)的应用中，可采用其他亲和性试剂(例如Affibodies、域抗体、纳米抗体、UniBodies、DARPins、Anticalins、Duocalins、Avimers或Versabody)。这些物质据说能免疫特异性地结合至DLL3。适当时，术语“亲和剂”应理解为包含免疫亲和性试剂和其他能特异性地结合至DLL3的物质，包括但不限于配体、凝集素、链霉亲和素、抗体模拟物和合成结合剂。
针对DLL3的抗体的生产
根据本发明，可将DLL3、DLL3类似物、DLL3相关蛋白或前述任一项的片段或衍生物用作免疫原以产生特异性地结合至这种免疫原的抗体。这种免疫原能通过任何便捷的方法来分离，包括上述方法。此处所用的术语“抗体”意指来源于、模拟自或基本编码自一种或多种免疫球蛋白基因或其片段的肽或多肽，所述免疫球蛋白基因或其片段能特异性地结合至抗原或表位。参见例如Fundamental Immunology,第3版,W.E.Paul编,Raven Press,N.Y.(1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。术语抗体包括抗原结合部分，即保留了结合抗原的能力的“抗原结合位点”(例如片段、亚序列、互补决定区(CDRs))，包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区由二硫桥连接；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)由VH域组成的dAb片段(Ward等,(1989)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。术语“抗体”通过提述还包括单链抗体。本发明的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、双特异性、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab')2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-Id)抗体、和前述任何的表位结合片段。本发明的免疫球蛋白分子可为任一类(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA如IgG)的或亚类的免疫球蛋白分子。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”(或“免疫特异性地结合”)并非意欲指示抗体唯一地结合至其目的靶标。其更应理解为，如果抗体对其目的靶标的亲和性典型地比其对非靶标分子的亲和性约高5倍时，抗体则“特异性地结合”。合适的是，与不需要的物质(特别是健康的人或动物天然形成的蛋白或组织)没有显著的交叉反应或交叉结合。抗体对靶标分子的亲和性优选为比其对非靶标分子的亲和性高至少约5倍，优选为10倍，更优选为25倍，更优选为50倍，最优选为100倍或更高。在一些实施方案中，抗体或其他结合剂与抗原之间的特异性结合意味着结合亲和性为至少106 M-1。抗体可例如以至少约107 M-1，优选约108M-1至约109 M-1，约109 M-1至约1010 M-1，或约1010 M-1至约1011 M-1的亲和性结合。
亲和性计算为Kd＝koff/kon(koff是解离速率常数，kon是结合速率常数，而Kd是平衡常数)。可通过在多种浓度(c)测量带标志的配体的结合分数(r)在平衡处确定亲和性。数据用Scatchard等式来绘图表示：r/c＝K(n-r)：
其中
r＝在平衡处结合配体的摩尔数/受体的摩尔数
c＝在平衡处游离配体浓度
K＝平衡缔合常数；和
n＝每个受体分子的配体结合位点的数目
通过图形分析，将r/c标绘在Y轴上对比r标在X轴上，从而产生了Scatchard图。亲和性是直线的负斜率。koff可以通过竞争结合的带标志的配体与未带标志的多余配体来确定(参见例如美国专利号6,316,409)。靶向剂对于其靶标分子的亲和性是例如至少约1 x10-6摩尔/升，例如至少约1 x 10-7摩尔/升，例如至少约1 x 10-8摩尔/升，特别是至少约1 x10-9摩尔/升，和特别是至少约1 x 10-10摩尔/升。通过Scatchard分析的抗体亲和性测量是本领域所熟知的，参见例如van Erp等,J.Immunoassay 12:425-43,1991；Nelson和Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27:65-8,1988。
在一个实施方案中，任何可公开获得的识别编码DLL3的基因的基因产物的抗体都可使用。在另一个实施方案中，用本领域技术人员已知的方法来生产识别DLL3、DLL3类似物、DLL3相关多肽或前述任一项的片段或衍生物的抗体。本领域技术人员了解，许多程序可用于生产抗体，例如Antibodies,A Laboratory Manual,Ed Harlow和David Lane,ColdSpring Harbor Laboratory(1988),Cold Spring Harbor,N.Y中所述。本领域技术人员还了解，模拟抗体的结合片段或Fab片段也能通过多种方法由遗传信息来制备(AntibodyEngineering:A Practical Approach(Borrebaeck,C.编),1995,Oxford UniversityPress,Oxford；J.Immunol.149,3914-3920(1992))。
在本发明的一个实施方案中，制备了针对DLL3的特异性结构域的抗体。在一个具体实施方案中，将DLL3的亲水性片段用作免疫原用于抗体生产。
在生产抗体时，可通过本领域已知技术来完成对所需抗体的筛选，所述技术例如ELISA(酶联免疫吸附测定法)。例如，为了筛选识别DLL3的特异性结构域的抗体，可测定生成的杂交瘤中结合至含有此种结构域的DLL3片段的产品。对于特异性结合第一DLL3同源物但不特异性结合至(或较为不积极地结合至)第二DLL3同源物的筛选，可基于对第一DLL3同源物的积极结合和对第二DLL3同源物的缺乏结合(或结合降低)来进行筛选。类似地，对于特异性地结合DLL3但不特异性地结合至(或较为不积极地结合至)同一蛋白的不同的同种型(例如具有DLL3作为相同核心肽的不同糖型)，可基于对DLL3的积极结合和对不同的同种型(例如不同的糖型)的缺乏结合(或结合降低)来进行筛选。因此，相比于DLL3的不同的一种或多种同种型(例如不同的糖型)，本发明提供了以更大的亲和性(例如至少2倍、如至少5倍、特别是至少10倍的亲和性)结合至DLL3的抗体(如单克隆抗体)。
可用于本发明的方法的多克隆抗体是来源于人源化动物血清的抗体分子的异源群体。可使用未分级的(unfractionated)免疫血清。多种本领域已知程序可用于生产针对DLL3、DLL3的片段、DLL3相关多肽、或DLL3相关多肽片段的多克隆抗体。例如，一个方法是纯化感兴趣的多肽或用例如本领域熟知的固相肽合成方法来合成感兴趣的多肽，参见例如Guide to Protein Purification,Murray P.Deutcher编,Meth.Enzymol.Vol 182(1990)；Solid Phase Peptide Synthesis,Greg B.Fields编,Meth.Enzymol.Vol 289(1997)；Kiso等,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)38:1192-99,1990；Mostafavi等,Biomed.Pept.ProteinsNucleic Acids 1:255-60,1995；Fujiwara等,Chem.Pharm.Bull.(Tokyo)44:1326-31,1996。选出的多肽可随后用于通过注射免疫各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以产生多克隆或单克隆抗体。如果通过凝胶电泳来纯化DLL3，可将DLL3用于免疫，在免疫之前可进行或不进行从聚丙烯酰胺凝胶的提取。多种佐剂(即免疫刺激剂)可用于增强免疫响应，这取决于宿主物种，包括但不限于完全或不完全弗氏佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普兰尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳剂(oilemulsion)、钥孔虫戚血兰素、二硝基酚、和佐剂如BCG(卡介苗杆菌(bacille Calmette-Guerin))或短小棒状杆菌(corynebacterium parvum)。额外的佐剂也是本领域熟知的。
为了制备针对DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、或DLL3相关多肽的片段的单克隆抗体(mAb)，任何可供通过连续细胞系在培养液中生产抗体分子的技术都可使用。例如，最早由Kohler和Milstein(1975,Nature 256:495-497)开发的杂交瘤技术，以及三体瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等,1983,Immunology Today 4:72)、和用于生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等,1985,于Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。这些抗体可为任何免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。产生本发明的mAbs的杂交瘤可在体外或体内培养。在本发明的另一个实施方案中，可利用移植技术在无菌(germ-free)动物中生产单克隆抗体(PCT/US90/02545，通过提述在此并入)。
单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体和嵌合单克隆抗体(例如人-小鼠嵌合体)。嵌合抗体是这样的分子，在其中不同的部分来源于不同的动物物种，如具有人免疫球蛋白恒定区和来源于鼠mAb的可变区的抗体(参见例如Cabilly等,美国专利号4,816,567；和Boss等,美国专利号4,816,397，在此通过提述以其整体并入)。人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(参见例如Queen,美国专利号5,585,089，在此通过提述以其整体并入)。
嵌合和人源化单克隆抗体能通过本领域已知的重组DNA技术来生产，例如用PCT公开WO 87/02671号；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开WO 86/01533号；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等,1988,Science 240:1041-1043；Liu等,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等,1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等,1987,Canc.Res.47:999-1005；Wood等,1985,Nature 314:446-449；和Shaw等,1988,J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison,1985,Science 229:1202-1207；Oi等,1986,BioTechniques 4:214；美国专利5,225,539；Jones等,1986,Nature 321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239:1534；和Beidler等,1988,J.Immunol.141:4053-4060中所述的技术来生产。
完全的人抗体特别合意地用于治疗人受试者。这种抗体能用转基因小鼠来生产，所述小鼠不能表达内源的免疫球蛋白重链和轻链基因，但能表达人重链和轻链基因。用选出的抗原以正常方式来免疫转基因小鼠，所述抗原例如完整的或部分的DLL3。针对抗原的单克隆抗体能用常规杂交瘤技术获得。通过B细胞分化期间的转基因小鼠重排和随后进行的类型转换和体细胞突变来保护人免疫球蛋白转基因。因此，用这种技术，可能产生治疗有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。此用于生产人抗体的技术综述，参见Lonberg和Huszar(1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93)。此用于生产人抗体和人单克隆抗体的技术的详细讨论以及用于产生这种抗体的实验方案，参见例如美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；和美国专利5,545,806。此外，可接洽公司如Abgenix,Inc.(Freemont,CA)和Genpharm(San Jose,CA)以提供使用类似上述的技术直接针对所选抗原的人抗体。
识别所选表位的完全人抗体可用称为“指导选择(guided selection)”的技术来产生。在这个方法中，将所选的非人单克隆抗体例如小鼠抗体用于指导对完全人抗体的选择，所述完全人抗体识别相同的表位(Jespers等.(1994)BioTechnology 12:899 903)。
还能通过使用噬菌体展示技术来产生并筛选用于结合至所选靶标的多肽的文库，从而产生本发明的抗体。参见例如Cwirla等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990；Devlin等,Science 249,404-6,1990,Scott和Smith,Science 249,386-88,1990；和Ladner等,美国专利号5,571,698。噬菌体展示方法的基本概念是建立编码要筛选的多肽的DNA和所述多肽之间的物理联系。这种物理联系是通过噬菌体颗粒提供的，其展示了多肽作为衣壳的一部分，所述衣壳包被了编码所述多肽的噬菌体基因组。多肽及其遗传物质之间物理联系的建立，使得能同时对极大量的携带不同多肽的噬菌体进行大规模筛选。展示出具有对靶标亲和性的多肽的噬菌体结合至靶标，并且这些噬菌体通过对靶标的亲和性筛选而富集。从这些噬菌体展示出的多肽的同一性可以由它们各自的基因组来确定。用这些方法，被鉴定为具有结合所需靶标的亲和性的多肽可随后通过常规方法大量合成。参见例如美国专利号6,057,098，在此通过提述以其整体并入，包括所有表格、图表、和权利要求。具体而言，这种噬菌体可用来展示从整套或组合抗体文库(例如人或鼠)表达的抗原结合域。表达结合感兴趣的抗原的抗原结合域的噬菌体可用抗原来选择或鉴定，例如用带标志的抗原或被结合或捕获至固相表面或珠子的抗原来进行选择或鉴定。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，其包含从这样的噬菌体表达的fd和M13结合域，所述噬菌体含有Fab、Fv或二硫化物稳定化的Fv抗体结构域，其重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。能用于制造本发明抗体的噬菌体展示方法包括Brinkman等,J.Immunol.Methods 182:41-50(1995)；Ames等,J.Immunol.Methods 184:177-186(1995)；Kettleborough等,Eur.J.Immunol.24:952-958(1994)；Persic等,Gene 1879-18(1997)；Burton等,Advances in Immunology 57:191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT申请WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的那些；其各自在此通过提述以其整体并入。
如上述参考文献中所述，在噬菌体选择后，可分离来自噬菌体的抗体编码区并将其用于产生完整抗体，包括人抗体，或其他所需的抗体结合片段，并在任何所需的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、和细菌，例如下文中详述的那样。例如，重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术也能用本领域已知的方法来使用，例如PCT公开WO92/22324；Mullinax等,BioTechniques 12(6):864-869(1992)；和Sawai等,AJRI 34:26-34(1995)；和Better等,Science 240:1041-1043(1988)中公开的那些(所述参考文献通过提述以其整体并入)。
能用于生产单链Fv和抗体的技术的例子包括美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)；Shu等,PNAS 90:7995-7999(1993)；和Skerra等,Science 240:1038-1040(1988)中公开的那些。
本发明还提供了双特异性抗体的用途，所述双特异性抗体能通过本领域已知方法来制造。全长双特异性抗体的传统生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达的，其中两条链具有不同的特异性(Milstein等,1983,Nature 305:537-539)。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来进行，所述纯化非常繁冗且产品产率低。类似的方法在WO 93/08829(1993年5月13日出版)以及在Traunecker等,1991,EMBO J.10:3655-3659中公开。
根据不同的且更为优选的方法，将具有所需的结合特异性的抗体可变域(抗体-抗原结合位点)融合至免疫球蛋白恒定域序列。所述融合优选是与免疫球蛋白重链恒定域进行，其包含至少一部分铰链区、CH2和CH3区。优选的是，使第一重链恒定区(CH1)含有轻链结合所必需的位点，其存在于融合物的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合物(若需要则还编码免疫球蛋白轻链)的DNA插入到单独表达载体中，并共转染至合适的宿主生物体中。当三种多肽链在构建物中按不均等比例使用提供最适产量时，这为调节实施方案中三种多肽片段的相互比例提供了极好的灵活性。然而，当至少两种多肽链以等比例表达导致高产量时或比例没有特别显著性时，则可将两种或全部三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。
在这种方法的一个优选的实施方案中，双特异性抗体由一个臂中的具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链、以及另一个臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称结构有助于将所需的双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合中分离出来，因为简易分离方法提供的双特异性分子仅有一半中存在免疫球蛋白轻链。这种方法在WO 94/04690(1994年3月3日出版)中公开。对于产生双特异性抗体的详情参见例如Suresh等,Methods in Enzymology,1986,121:210。
本发明提供抗DLL3免疫球蛋白分子的功能活性片段、衍生物或类似物。功能活性的意为能引起抗-抗-独特型抗体(即三级抗体)的片段、衍生物或类似物，所述抗-抗-独特型抗体识别与所述片段、衍生物或类似物来源的抗体所识别的相同的抗原。具体而言，在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白分子的独特型的抗原性可通过缺失框架和CDR序列来增强，所述框架和CDR序列位于特异性地识别抗原的CDR序列的C末端。为了确定是哪个CDR序列结合抗原，可将含有CDR序列的合成多肽伴随抗原用于结合测定中，其通过本领域已知的结合测定方法来进行。
本发明提供抗体片段，例如但不限于F(ab’)2片段和Fab片段，可以通过已知技术来产生。F(ab’)2片段由可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域组成，并通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生。Fab片段通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而产生。本发明还提供本发明抗体的重链和轻链二聚体，或其任何最小片段，如Fv或单链抗体(SCA)(例如美国专利4,946,778；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；and Ward等,1989,Nature 334:544-54中所述)，或与本发明抗体具有相同特异性的任何其他分子。单链抗体是通过氨基酸桥来连接Fv区的重链和轻链片段而形成的，得到单链多肽。可使用用于在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等,1988,Science242:1038-1041)。
在其他实施方案中，本发明提供本发明免疫球蛋白(或其功能活性片段)的融合蛋白，例如其中所述免疫球蛋白通过，共价键(例如肽键)融合于另一个非免疫球蛋白的蛋白的氨基酸序列(或其部分，优选为蛋白的至少10、20或50个氨基酸的部分)的N末端或C末端处。优选的免疫球蛋白或其片段是共价连接至其他蛋白的恒定域N末端处。如上所述，这种融合蛋白可促进纯化、增加体内半衰期、以及增强抗原的递送，穿过上皮屏障将其送至免疫系统。
本发明的免疫球蛋白包括经修饰的类似物和衍生物，所述修饰例如通过任何类型分子的共价连结，只要这种共价连结不损害免疫特异性结合。例如但并非限制，免疫球蛋白的衍生物和类似物包括被进一步修饰的那些，例如通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化(phosphylation)，酰胺化，衍生化通过已知的保护/阻断基团，蛋白水解切割，与细胞配体或其它蛋白质的连接等来修饰。多种化学修饰的任一可通过已知的技术来进行，包括但不限于特异性化学切割，乙酰化，甲酰化等。另外，类似物或衍生物可含有一种或多种非经典的氨基酸。
上述抗体可用于本领域已知的方法中，所述方法涉及DLL3的定位和活性，例如在诊断方法中用于这种蛋白的成像，测量其在合适生理样品中的水平，等等。
针对DLL3的亲和抗体(Affibody)的产生
亲和抗体分子代表新类型的基于58个氨基酸残基蛋白结构域的亲和性蛋白，所述结构域来源于葡萄球菌蛋白A的IgG结合域的一种。该三螺旋束结构域已被用作支架用于组合噬菌粒文库的构建，从其中靶向期望分子的亲和抗体变体可用噬菌体展示技术选择(Nord K,Gunneriusson E,Ringdahl J,Stahl S,Uhlen M,Nygren PA,Binding proteinsselected from combinatorial libraries of anα-helical bacterial receptordomain,Nat Biotechnol 1997；15:772-7.Ronmark J,Gronlund H,Uhlen M,Nygren PA,Human Immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineeringof protein A,Eur J Biochem 2002；269:2647-55.)。亲和抗体分子的简单稳固结构结合其低分子量(6kDa)，使其适于广泛大量的应用，例如作为检测试剂(Ronmark J,Hansson M,Nguyen T等,Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras producedin Escherichia coli,J Immunol Methods 2002；261:199-211)以及抑制受体相互作用(Sandstorm K,Xu Z,Forsberg G,Nygren PA,Inhibition of the CD28-CD80co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed bycombinatorial protein engineering,Protein Eng 2003；16:691-7)。亲和抗体及其生产方法的进一步的细节可通过参考美国专利5831012获得，其在此通过提述以其整体并入。
带标志的亲和抗体还可用于用来确定同种型丰度的成像应用中。
针对DLL3的结构域抗体的生产
此处对抗体的提述引用结构域抗体。结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单位，对应于人抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体具有约13kDa的分子量。Domantis开发了一系列的完全人VH和VL dAb(每个库中超过一百亿个不同序列)的大型及高度功能性文库，并使用这些文库来选择对治疗靶标具有特异性的dAb。与许多常规抗体相对比的是，域抗体在细菌，酵母，和哺乳动物细胞系统中表达良好。结构域抗体及其生产方法的进一步的细节可通过参考美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美国序列号2004/0110941；欧洲专利申请号1433846和欧洲专利0368684和0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609获得，其各自在此通过提述以其整体并入。
针对DLL3的纳米抗体的生产
纳米抗体(Nanoantibody)是源于抗体的治疗性蛋白，其含有天然形成的重链抗体的独特结构及功能性质。这些重链抗体含有单个可变域(VHH)和两个恒定域(CH2和CH3)。重要的是，克隆并分离的VHH结构域是完全稳定的多肽，其具有原始重链抗体的全部抗原结合能力。纳米抗体与人抗体的VH结构域具有高同源性，并且能被进一步人源化而不损失任何活性。重要的是，纳米抗体具有低免疫原性的潜力，这已经在灵长类动物中用纳米抗体铅化合物的研究得到了证实。
纳米抗体结合了传统抗体的优点与小分子药物的重要特征。与传统的抗体相似，纳米抗体显示出高度的靶标特异性、对其靶标的高亲和性和低内在毒性。与小分子药物相似，它们能抑制酶且易于接近受体裂口(cleft)。此外纳米抗体极为稳定，可通过除注射之外的方法施用(参见例如WO04/041867，其在此通过提述以其整体并入)，并且易于制造。纳米抗体的其他优点包括识别不常见的或隐藏的表位(这是由于其尺寸小)、以高亲和性和选择性结合到蛋白靶标的空腔或活性位点中(这是由于其独特的三维、药物形式灵活性、半衰期的调整以及药物开发的方便和速度)。
纳米抗体由单一基因编码，并且在几乎所有的原核和真核宿主中产生，例如大肠杆菌(参见例如US 6765087，其在此通过提述以其整体并入)，霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))和酵母(例如酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia))(参见例如US6838254，其在此通过提述以其整体并入)。生产过程中是可扩展的，并且已经生产了多千克量的纳米抗体。因为纳米抗体显示出比常规抗体更优异的稳定性，可将它们配制为保质期长的即用型溶液。
纳米克隆(Nanoclone)方法(参见例如WO 06/079372，其在此通过提述以其整体并入)是用于产生针对所需靶标的抗体的专利方法，其基于对B细胞的自动化高通量筛选。
针对DLL3的UniBody的生产
UniBody是另一种抗体片段技术，然而这种技术是基于去除IgG4抗体的铰链区的。缺失铰链区得到了这样的分子，所述分子基本上是传统IgG4抗体尺寸的一半，并且具有单价结合区而非IgG4抗体的二价结合区。还已知的是，IgG4抗体是惰性的，因此不与免疫系统相互作用，这可能有利于治疗不希望发生免疫响应的疾病，而这种优势被传递到了UniBody上。例如，UniBody可起到抑制或沉默但不杀死其结合的细胞的作用。此外，结合到癌症细胞的UniBody并不刺激它们增殖。而且，由于UniBody都是传统IgG4抗体的约一半尺寸，它们在较大的实体瘤可显示出更好的分布并具有潜在的有利功效。UniBody以与完整IgG4抗体相似的速度从体内清除，并能以与完整抗体相似的亲和性与他们的抗原结合。UniBody的进一步细节可通过参考专利WO2007/059782获得，其在此通过提述以其整体并入。
针对DLL3的DARPin的生产
DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白(Designed Ankyrin Repeat Protein))是抗体模拟物DRP(设计的重复蛋白)的一个例子，其已被开发来利用非抗体多肽的结合能力。重复蛋白，如锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白，是普遍存在的结合分子，与抗体不同，重复蛋白在细胞内和细胞外形成。它们独特的模块化架构是重复结构单元(重复)的特征，其堆叠在一起形成延长的重复结构域，显示出可变的和模块化的靶标结合表面。基于这种模块性，可产生具有高度多样化的结合特异性的多肽的组合文库。这种策略包括自我兼容的重复的共有设计(consensus design)，其展示出可变的表面残基并且它们随机组装成重复结构域。
DARPin可在细菌表达系统中制造，其产率非常高，并且其属于已知的最稳定的蛋白质。选出了对广范围靶标蛋白高度特异性的、高亲和性DARPin，包括人受体，细胞因子，激酶，人蛋白酶，病毒和膜蛋白。可获得在个位数纳摩尔至皮摩尔范围内具有亲和性的DARPin。
DARPin应用广泛，包括ELISA，夹心ELISA，流式细胞术分析(FACS)，免疫组化(IHC)，芯片应用，亲和纯化或Western印迹。DARPin也证明在胞内区室中是高活性的，例如作为融合至绿色荧光蛋白(GFP)的细胞内标记蛋白。DARPin还用于抑制在pM范围内具有IC50的病毒进入。DARPin不仅完美地阻断蛋白-蛋白相互作用，还抑制酶。已成功地抑制了蛋白酶、激酶和转运蛋白，最常见的是变构抑制模式。在肿瘤上非常快速和特异性富集和非常有利的肿瘤/血比值使DARPin良好适于体内诊断或治疗方法。
关于DARPin和其他DRP技术的附加信息可在美国专利公开2004/0132028号以及国际专利申请公开WO02/20565号中找到，其均在此通过提述以其整体并入。
针对DLL3的Anticalin的生产
Anticalin是另一种抗体模拟物技术，然而，在这种情况下，结合特异性是来源于脂质运载蛋白(Lipocalin)，这是一个低分子量蛋白的家族，其天然在人组织和血液中大量表达。脂质运载蛋白已经逐渐表现出一系列与化学敏感的或不溶的化合物的体内生理运输和贮藏相关的功能。脂质运载蛋白具有稳固的内在结构，其包括高度保守的β-桶(β-barrel)，在蛋白的一个末端支持着四个环。这些环形成了结合带的入口，而这部分分子中的构象差异是个体脂质运载蛋白之间结合特异性变化的原因。
当通过保守的β-折叠框架支撑的高变环的整体结构让人联想起免疫球蛋白时，脂质运载蛋白与抗体在尺寸方面极为不同，其由160-180个氨基酸的单一肽链组成，比单一免疫球蛋白结构域稍大。
克隆脂质运载蛋白，并将它们的环进行工程改造以产生Anticalin。已经生成了结构多样的Anticalin文库且Anticalin展示允许对结合功能进行选择和筛选，以及可溶性蛋白随后的表达和生产，用于在原核或真核系统中的进一步分析。研究已经成功地证明了可开发出特异性地针对几乎任何人类靶蛋白的Anticalin；可将它们分离，并可获得在纳摩尔或更高范围内的结合亲和性。
Anticalin也可制成为双重靶向蛋白的形式，即所谓Duocalin。采用标准制造工艺，一个Duocalin结合一个产生的单体蛋白中的两个单独的治疗靶标，而同时保留靶标特异性和亲和性，无论其两个结合域的结构取向如何。
通过单个分子调节多个靶标在已知涉及多于单个致病因素的疾病中是特别有利的。此外，二价或多价结合形式如Duocalin在疾病中对于靶向细胞表面分子、介导对信号转导途径的激动作用或通过细胞表面受体的结合和聚簇诱导增强的内在作用方面具有显著的潜力。此外，Duocalin的高内在稳定性堪比单体Anticalin，这给Duocalin提供了灵活的配制和递送潜力。
关于Anticalin的另外的信息可在美国专利No.7,250,297和国际专利申请公开WO99/16873号中找到，二者在此均通过提述以其整体并入。
针对DLL3的Avimer的生产
Avimer从人胞外受体结构域的大家族通过体外外显子重排和噬菌体展示演化而来，其产生具有结合和抑制性能的多结构域蛋白。连接多个独立的结合域已经显示产生亲合力(avidity)，并得到比传统的单表位结合蛋白提高的亲和性和特异性。其它潜在的优点包括简单且高效地在大肠杆菌中生产多靶标特异性的分子，改善热稳定性和蛋白酶抗性。已获得了针对各种目标的具有亚纳摩尔亲和性的Avimer。
关于Avimers附加的信息可以在美国专利申请公开2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756号中找到，其全部在此通过提述以其整体并入。
针对DLL3的Versabody的生产
Versabody是3-5kDa的含有>15％半胱氨酸的小蛋白，其形成高二硫化物密度支架，而替换了典型蛋白所具有的疏水核心。用少量的二硫化物来替换包括疏水核心在内的大量的疏水氨基酸，产生了更小的、更为亲水性的(低聚合及非特异性结合)、对蛋白酶更有抗性的且具有较低的T细胞表位密度的蛋白，这是由于对MHC的呈现(presentation)贡献最大的残基是疏水性的。所有这四种特性都已知是影响免疫原性的，并且预期它们共同引起免疫原性的大大降低。
对Versabody的启示是来自通过水蛭，蛇，蜘蛛，蝎子，蜗牛和海葵生产的天然可注射的生物药品，其已知展示出出乎意料的低免疫原性。从选择的天然蛋白家族开始，通过设计和通过筛选，将其尺寸、疏水性、蛋白水解抗原加工、以及表位密度最小化至远低于天然可注射蛋白平均水平的水平。
考虑到Versabody的结构，这些抗体模拟物提供了一个通用的形式，其包括多价，多特异性，半衰期机制的多样性，组织靶向模块和缺乏抗体Fc区。此外，Versabody在大肠杆菌中制造的收率高，并且由于它们的亲水性和小尺寸，Versabody是高度可溶的，并且能配制至高浓度。Versabody是极为热稳定性的(它们可以煮)并提供延长保质期。
关于Versabody的附加信息可在美国专利申请公开2007/0191272号中找到，其在此通过提述以其整体并入。
亲和性试剂的表达
抗体的表达
本发明的抗体可通过本领域已知的用于抗体合成的任何方法来生产，特别是通过化学合成或通过重组表达生产，并且优选通过重组表达技术来生产。
抗体或其片段、衍生物或类似物的重组表达，需要构建编码所述抗体的核酸。如果抗体的核苷酸序列是已知的，则可以从化学合成的寡核苷酸来组装编码所述抗体的核酸(例如Kutmeier等,1994,BioTechniques 17:242中所述)，简单来说，其涉及含有部分编码抗体的序列的的重叠寡核苷酸的合成、退火和这些寡核苷酸的连接，以及随后通过PCR对连接的寡核苷酸的扩增。
或者，编码抗体的核酸可通过克隆抗体来获得。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆无法得到，但抗体分子的序列是已知的，编码所述抗体的核酸可以从适当的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞产生的cDNA文库)通过使用能与序列3'和5'末端杂交的引物的PCR扩增或通过使用特异性针对特定基因序列的寡核苷酸探针的克隆来获得。
如果特异性地识别特定抗原的抗体分子无法得到(或用于对编码这种抗体的核酸进行克隆的cDNA文库的来源)，特异性针对特定抗原的抗体可通过本领域任何已知方法来产生，例如通过对动物(例如兔)进行免疫以产生多克隆抗体，或是例如通过产生单克隆抗体。或者，编码抗体的至少Fab部分的克隆可通过筛选Fab表达文库(例如Huse等,1989,Science 246:1275-1281中所述)来获得，所述Fab表达文库是用于与特异性抗原结合的Fab片段的克隆的，或是通过筛选抗体文库来获得(参见例如Clackson等,1991,Nature 352:624；Hane等,1997 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937)。
一旦获得了编码抗体分子的至少一个可变域的核酸，可将所述核酸导入含有编码抗体分子恒定区核酸序列的载体(参见例如PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)。还可得到含有完整轻链或重链的用于与核酸共表达的载体，所述共表达是为了表达完整抗体分子。然后，可用编码所述抗体的核酸来导入核苷酸取代或缺失，所述核苷酸取代或缺失是用不含巯基基团的氨基酸残基取代(或缺失)一个或多个参与了链内二硫键的可变区半胱氨酸残基所必需的。这种修饰可通过本领域任何已知的用于导入具体核苷酸序列突变或缺失的方法来进行，例如但并不限于：化学诱变、体外定点诱变(Hutchinson等,1978,J.Biol.Chem.253:6551)、基于PCT的方法等。
此外，开发来用于生产“嵌合抗体”(Morrison等，1984年，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:851-855；Neuberger等,1984,Nature 312:604-608；Takeda等,1985,Nature 314:452-454)的技术是可使用的，所述生产是通过将来自小鼠的适当抗原特异性的抗体分子的基因与来自人的适当的生物活性的抗体分子的基因进行剪接来进行的。如上文所描述，嵌合抗体是这样的分子，在所述分子中不同的部分来源于不同的动物物种，例如具有来源于鼠mAb的可变区和人抗体的恒定区的抗体，例如人源化抗体。
一旦已获得了本发明的编码抗体分子的核酸，可通过使用本领域熟知技术通过重组DNA技术来生产用于生产抗体分子的载体。因此，在此处描述了通过表达含有抗体分子序列的核酸来制备DLL3的方法。可用本领域技术人员所熟知的方法来构建含有抗体分子的编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术，合成技术，以及体内遗传重组。参见例如Sambrook等(1990,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)和Ausubel等(编,1998,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)中所述的技术。
通过常规技术将表达载体通过常规技术转移至宿主细胞然后对转染的细胞进行培养以生产本发明的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞可为细菌细胞如大肠杆菌，或优选为真核细胞(尤其对于完整的重组抗体分子的表达)。具体而言，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，以及载体如来自人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件，对于抗体而言是有效的表达系统(Foecking等,1986,Gene 45:101；Cockett等,1990,BioTechnology 8:2)。
可利用多种宿主表达载体系统来表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统代表这样的运载体，通过所述运载体可生产并随后纯化感兴趣的编码序列；但也表示这样的细胞，所述细胞在用合适的核苷酸编码序列进行转化或转染时可以原位表达本发明的抗体分子。这些包括但不限于微生物如用含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌，枯草杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如酵母属、毕赤酵母属)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的、或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带着含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或含有源自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS，CHO，BHK，293，3T3细胞)。
在细菌系统中，根据意在表达抗体分子的用途，可有利地选出许多表达载体。例如，当要生产大量的这种蛋白质时，为了产生包含抗体分子的药物组合物，可能需要的是指导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这样的载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等,1983,EMBO J.2:1791)，其中编码序列的抗体可单独连接到载体中，与lac Z编码区同在一个框中从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,1985,NucleicAcids Res.13:3101-3109；Van Heeke&Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等等。pGEX载体也可用于表达外来多肽，其作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶的，并能容易地从裂解的细胞纯化出来，所述纯化是通过吸附并结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱来进行的。pGEX被设计为含有凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而使克隆的靶基因产物能从GST部分释放。
在昆虫系统中，用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体来表达外来基因。该病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可单独克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。在哺乳动物宿主细胞中，也可使用一些基于病毒的表达系统(例如腺病毒表达系统)。
如上所讨论的，可选择以所需的特定方式来调节插入序列的表达、或修饰并加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可对蛋白的功能是重要的。
对于重组抗体的长期、高产率生产，稳定表达是优选的。例如，可以通过用包含所述抗体核苷酸序列和选择性核苷酸序列(例如新霉素或潮霉素)的表达载体来转染细胞，并对选择性标记物的表达进行筛选，从而生产稳定表达感兴趣的抗体的细胞系。这种工程改造的细胞系在直接或间接与抗体分子相互作用的化合物的筛选和评估中可为特别有用的。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增来增加(对于综述，参Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,卷3.Academic Press,NewYork,1987)。当表达抗体的载体系统中标记物是可扩增的时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂水平增加会增加标记物基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因是有关联的，抗体的生产也会增加(Crouse等,1983,Mol.Cell.Biol.3:257)。
宿主细胞可与本发明的两个表达载体共转染，第一载体编码重链衍生的多肽而第二载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可含有相同的选择性标记物，其使重链和轻链多肽同等表达。或者，可使用编码重链和轻链多肽的单一载体。在这样的情况下，轻链应该置于重链之前以避免过量的有毒游离重链(Proudfoot,1986,Nature 322:52；Kohler,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体分子被重组表达，其可通过本领域已知的用于抗体分子的纯化的任何方法来纯化，例如通过层析法(如离子交换层析，亲和层析(如用蛋白A或特定抗原)，和大小柱层析(sizing column chromatography))，离心，差异溶解度或通过任何其它用于蛋白纯化的标准技术。
或者，任何融合蛋白都可通过利用对所表达的融合蛋白特异性的抗体快速地进行纯化。例如，Janknecht等所描述的系统允许对人细胞系中表达的非变性融合蛋白进行容易的纯化(Janknecht等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-897)。在这个系统中，感兴趣的基因被亚克隆到牛痘重组质粒中，从而使该基因的开读框被翻译性地融合至由6个组氨酸残基组成的氨基末端标签。该标签充当融合蛋白的基质结合域。将来自用重组牛痘病毒感染的细胞的提取物装载到Ni2+次氨基乙酸-琼脂糖柱上，并用含咪唑的缓冲液选择性地洗脱组氨酸标记的蛋白质。
通过这些方法所产生的抗体可随后进行选择，所述选择是通过针对亲和力和特异性的第一筛选用感兴趣的纯化的多肽进行的，若有需要，将结果与抗体与那些需要排除在结合之外的多肽的亲和力和特异性进行比较。筛选过程可涉及在微量滴定板的分开的孔中对纯化多肽的固定化。然后将含有潜在抗体或抗体组的溶液置于各自的微量滴定孔中并温育约30分钟至2小时。然后洗涤微量滴定孔，并将标记的二级抗体(例如缀合至碱性磷酸酶的抗小鼠抗体，如果培养的抗体是小鼠抗体的话)加入到孔中并温育约30分钟，然后洗涤。将底物加入孔中，并且当针对被固定的多肽的抗体存在时出现颜色反应。
如此鉴定的抗体可随后进一步在选择的测定设计中针对亲和力和特异性进行分析。在用于靶蛋白的免疫测定的发展中，纯化的靶蛋白作为标准来判断使用所选抗体的免疫测定的灵敏度和特异性。因为各种抗体的结合亲和性可能不同；某些抗体对(例如，在夹心测定法中)可在空间上互相干扰，等等，抗体的测定性能可为比抗体的绝对亲和性和特异性更重要的测量。
本领域技术人员了解，已采用了许多方法来生产抗体或结合片段并对其针对多种多肽的亲和性和特异性进行选择，但这些方法不改变本发明的范围。
对于治疗应用，抗体(特别是单克隆抗体)合适地可为人抗体或人源化的动物(如小鼠)抗体。动物抗体可用人蛋白(例如DLL3)作为免疫原在动物中培育。人源化通常包括鉴定出由此进入人的框架区中的移植的(grafting)CDR。通常随后需要一些的对链构象进行优化的反向突变。这样的方法是本领域技术人员已知的。
亲和抗体的表达
亲和抗体的构建在别处(Ronnmark J,Gronlund H,Uhlen,M.,Nygren P.A,HumanImmunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering ofprotein A,2002,Eur.J.Biochem.269,2647-2655.)已有描述，包括亲和抗体噬菌体展示文库的构建(Nord,K.,Nilsson,J.,Nilsson,B.,Uhlen,M.&Nygren,P.A,A combinatoriallibrary of an a-helical bacterial receptor domain,1995,Protein Eng.8,601-608.Nord,K.,Gunneriusson,E.,Ringdahl,J.,Stahl,S.,Uhlen,M.&Nygren,P.A,Bindingproteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterialreceptor domain,1997,Nat.Biotechnol.15,772-777.)。
使用生物感应器结合研究来调查最佳亲和抗体变体的生物感应器分析也在别处有描述(Ronnmark J,Gronlund H,Uhlen,M.,Nygren P.A,Human Immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A,2002,Eur.J.Biochem.269,2647-2655.)。
亲和性试剂修饰
在优选的实施方案中，抗DLL3亲和性试剂如抗体或其片段缀合至诊断部分(例如可检测的标志物)或治疗部分。抗体能用于诊断或用于确定给定的治疗方案的效力。可通过将抗体偶联至可检测的基质(标志物)来促进检测。可检测的基质包括多种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性核素，发射正电子的金属(在正电子发射断层成像术中使用)，和非放射性顺磁金属离子。对于能缀合至抗体用于本发明的诊断法的金属离子，一般参见美国专利号4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素，抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，二氯三嗪胺(dichlorotriazinylamine)荧光素，丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺(luminol)；合适的生物发光材料包括荧光素酶，荧光素和水母发光蛋白；而合适的放射性核素包括125I，131I，111In和99Tc。还可采用68Ga。
如上面所示的用于在本发明中使用的亲和性试剂，如抗体，可以缀合至治疗性部分，例如细胞毒素，药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素。这种缀合物在此处称为“免疫缀合物”。包含一个或多个细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒素剂包括任何对细胞有害(例如杀死细胞)的试剂。例子包括泰素(taxol)，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春新碱，长春碱，秋水仙素，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽二酮(dihydroxy anthracin dione)，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括，例如抗代谢物(例如甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)，三胺硫磷(thioepa)苯丁酸氮芥(chlorambucil)，美法仑(melphalan)，卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲霉素，丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类(如柔红霉素(原称道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(如更生霉素(原称放线菌素)，博来霉素，光神霉素，和氨茴霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))。
能缀合至本发明的抗体的细胞毒素的其他优选例子包括多卡米星(duocarmycins)，卡奇霉素(calicheamicins)，美登素(maytansines)和阿里他汀(auristatin)，及其衍生物。卡奇霉素抗体缀合物的例子是可商购的(
Figure GDA0000837616500000371
；(麦罗塔)American Home Products)。
可用本领域已知的接头技术将细胞毒素缀合至本发明的抗体。已用于将细胞毒素缀合至抗体的接头类型的例子包括但不限于：腙，硫醚，酯，二硫化物和含肽的接头。可选择这样的接头，例如，易于通过低pH值在溶酶体区室中切割的或易被蛋白酶，如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(cathepsin)(例如组织蛋白酶B，C和D)切割的接头。
细胞毒素的例子在例如美国专利号6,989,452,7,087,600和7,129,261中,以及在PCT申请号PCT/US2002/17210，PCT/US2005/017804，PCT/US2006/37793，PCT/US2006/060050，PCT/US2006/060711，WO2006/110476中，以及在美国专利申请号60/891,028中描述，其全部在此通过提述以其整体并入。关于细胞毒素、接头和将治疗剂缀合至抗体的方法的讨论，也参见Saito,G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D和Springer,C.J.(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。
也可将亲和性试剂缀合至放射性同位素以产生细胞毒性放射性药物，也称为放射免疫缀合物。能缀合至抗体用于诊断或治疗用途的放射性同位素的例子包括但不限于：碘131，铟111，钇90和镥177。用于制备放射性免疫方法是本领域中已成型的。放射免疫缀合物的例子是可商购的，包括
Figure GDA0000837616500000381
(泽维宁)(IDEC Pharmaceuticals)和
Figure GDA0000837616500000382
(百克沙)(Corixa Pharmaceuticals)，并且类似的方法可用于用本发明的抗体来制备放射免疫缀合物。
也可将亲和性试剂缀合至酞菁染料，下文称为酞菁染料缀合物。能缀合至抗体用于诊断或治疗用途的放射性同位素的例子包括但不限于：IR700。用于制备酞菁染料缀合物的方法在例如Mitsunaga M,Ogawa M,Kosaka N,Rosenblum LT,Choyke PL and KobayashiH(2011)Nat Med.2011Nov 6.doi:10.1038/nm.2554中描述。
缀合物能用于修饰给定的生物学响应，并且药物部分不应理解为限于经典的化学治疗剂。例如，所述药物部分可为具有所需生物活性的蛋白或多肽。此类蛋白可包括例如，酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白，蓖麻毒素A，假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白如肿瘤坏死因子或干扰素γ；或者生物响应修饰剂如，例如淋巴因子，白细胞介素-1(“IL-1”)，白细胞介素-2(“IL-2”)，白细胞介素-6(“IL-6”)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其他生长因子。Senter P.D.(2009)Curr.Opin.Chem.Biol.13(3):235-244；Kovtun等(2010)Cancer Res.70(6):2528-2537。
用于将这类治疗部分缀合至抗体的技术是为人所熟知的，参见例如Arnon等,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编),pp.243-56(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等,"Antibodies For Drug Delivery,”in ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等(编),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”inMonoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编),pp.475-506(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy”in Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy,Baldwin等(编),pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等,Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
或者，能缀合至第二抗体以形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)的抗体如Segal在美国专利号4,676,980中所述。
有或没有缀合的治疗性部分的抗体能用作单独施用的或与细胞毒性因子(多个)和/或细胞因子(多个)的组合施用的治疗剂。
本发明还提供诱导抗体定向的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的完整人或人源化的抗体。完整人抗体是这样的人抗体，其中蛋白序列由天然形成的人免疫球蛋白序列编码，所述序列或是来自分离的产生抗体的人B淋巴细胞，或是来自小鼠的转基因鼠B淋巴细胞，其中编码鼠免疫球蛋白的染色体区域已被直向同源人序列取代。后一类型的转基因抗体包括但不限于：HuMab(Medarex,Inc,CA)和XenoMouse(Abgenix Inc.,CA)。人源化抗体这样的抗体，其中合适抗原特异性的非人抗体分子的恒定区被人抗体的恒定区取代，优选为被IgG亚型的恒定区取代，具有合适的效应器功能(Morrison等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等,1984,Nature 312:604-608；Takeda等,1985,Nature 314:452-454)。合适的效应器功能包括ADCC，其是一种天然过程，通过ADCC，完整人抗体或人源化抗体在结合至癌细胞表面上的靶标时，开启淋巴细胞的细胞杀伤特性，所述淋巴细胞是正常免疫系统的一部分。这些活性淋巴细胞称为自然杀伤(NK)细胞，其用细胞毒性程序来消灭抗体所结合的活细胞。ADCC活性可通过测量来自用Eu3+标记的、存在抗原特异性抗体的活细胞和提取自免疫活性的活人受试者的外周血单核细胞的铕(Eu3+)的释放来检测和定量。ADCC程序在Janeway Jr.C.A.等,Immunobiology,第5版,2001,Garland Publishing,ISBN0-8153-3642-X；Pier G.B.等,Immunology,Infection,and Immunity,2004,p246-5；Albanell J.等,Advances in Experimental Medicine and Biology,2003,532:p2153-68和Weng,W.-K.等,Journal of Clinical Oncology,2003,21:p 3940-3947中详细描述。合适的用于对ADCC进行检测和定量的方法可在Blomberg等,Journal of ImmunologicalMethods.1986,86:p225-9；Blomberg等,Journal of Immunological Methods.1986,21；92:p117-23和Patel&Boyd,Journal of Immunological Methods.1995,184:p29-38中找到。
ADCC典型地涉及NK细胞的激活，并且依赖于通过NK细胞表面的Fc受体对抗体包被的细胞的识别。Fc受体识别抗体(如IgG)的Fc(晶体的)部分，特异性地结合至靶细胞表面。触发NK细胞的活化的Fc受体被称为CD16或FcγRIIIa。一旦FcγRIIIa受体结合至IgG Fc，NK细胞就释放细胞因子如IFN-γ，和含有穿孔蛋白和颗粒酶的细胞毒性颗粒，其进入靶细胞并通过触发细胞凋亡而促进细胞死亡。
通过抗体对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的诱导，可通过改变抗体恒定区(Fc)和各种受体直接按的相互作用的修饰来增强，所述受体是存在于免疫系统的细胞的表面上的。此类修饰包括复合寡糖链中α1,6-连接的岩藻糖部分的减少或不存在，所述复合寡糖链在哺乳动物细胞中的天然或重组合成期间通常被添加至抗体的Fc。在一个优选的实施方案中，非岩藻糖基的抗DLL3亲和性试剂，如抗体或其片段，是出于增强其诱导的ADCC响应的能力的目的而生产的。
用于在Fc的寡糖链中减少或除去的α1,6-连接的岩藻糖部分的技术已经发展完善。在一个实例中，重组抗体是在这样的细胞系中合成的，所述细胞系向N连接的二分枝复合型Fc寡糖的最内部N-乙酰葡糖胺添加α1,6-连接的岩藻糖的能力是受损的。这样的细胞系包括但不限于：大鼠杂交瘤YB2/0，其表达降低水平的α1,6-岩藻糖转移酶基因，FUT8。优选的抗体是在这样的细胞系中合成，所述细胞系不能将α1,6-连接的岩藻糖基部分添加至复合寡糖链，这是由于FUT8基因的两个拷贝都被缺失了。这样的细胞系包括但不限于：FUT8-/-CHO/DG44细胞系。用于合成部分岩藻糖基化的，或非岩藻糖基化的抗体和亲和性试剂的技术在Shinkawa等,J.Biol.Chem.278:3466–34735(2003)；Yamane-Ohnuki等,Biotechnology and Bioengineering 87:614-22(2004)中和在WO00/61739 A1，WO02/31140 A1和WO03/085107 A1中描述。在第二个例子中，通过在已被遗传工程改造而以将携带二分N-乙酰葡糖胺的复合N-连接的寡糖生产最大化的水平过表达糖蛋白修饰性糖基转移酶的细胞系中的合成，而将重组抗体的岩藻糖基化减少或除去。例如，该抗体在表达酶N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT III)的中国仓鼠卵巢细胞系中合成。用合适的糖蛋白修饰性糖基转移酶稳定转染的细胞系，以及用这些细胞合成抗体的方法在WO99/54342中描述。
非岩藻糖基化的抗体或亲和性试剂能用作治疗剂，其单独使用或与细胞毒性因子(多种)和/或细胞因子(多种)组合施用。
在进一步的修饰中，抗体Fc的氨基酸序列以增强ADCC激活而不影响配体亲和性的方式而改变。这些修饰的例子在Lazar等,Proceedings of the National Academy ofSciences 2006,103:p4005-4010；WO03/074679和WO2007/039818中描述。在这些例子中，抗体Fc中氨基酸的取代，例如在位置239处用天冬氨酸取代丝氨酸，以及在位置332处用异亮氨酸取代谷氨酸，改变了抗体对Fc受体的结合亲和性，导致ADCC的激活增加。
由于氨基酸取代，具有增强的ADCC激活的抗体试剂可用作单独施用或与细胞毒性因子(多个)和/或细胞因子(多个)组合施用的治疗剂。
本发明还提供了包括至少一个针对第一靶表位(即DLL3)的第一结合特异性的，和针对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。第二靶表位可能存在于与第一结合特异性所结合的相同的靶蛋白上，或第二靶表位可能存在于与不同于第一蛋白通过第一结合特异性所结合的靶蛋白上。第二靶表位可存在于与第一靶表位(即DLL3)相同的细胞上；或第二靶表位可存在于展示出第一靶表位的细胞所不展示的靶标上。如本文所用，术语“结合特异性”指的是包含至少一个抗体可变域的部分。
在一个实施方案中，双特异性分子是BiTE(双特异性T细胞衔接头)。具体而言，本发明提供了双特异性亲和性试剂(优选的双特异性抗体)，其包括DLL3的第一结合域和T细胞抗原的第二结合域，所述T细胞抗原优选为CD3。
这些双特异性分子将表达DLL3的细胞靶向至表达CD3的效应细胞(例如表达CD3的细胞毒性T细胞)，并引发CD3介导的效应细胞活性，如T细胞克隆扩充和T细胞的细胞毒性。本发明的双特异性抗体可具有总共两个或三个抗体可变域，其中双特异性抗体的第一部分能够通过特异性地结合到位于人免疫效应细胞的效应抗原而招募人免疫效应细胞的活性，其中所述效应抗原是人CD3抗原，所述第一部分由一个抗体可变域组成，而双特异性抗体的第二部分能够特异性地结合至除效应抗原(例如DLL3)外的其它靶抗原，所述靶抗原位于除了所述人免疫效应细胞之外的靶细胞上，并且所述第二部分包含一个或两个抗体可变域。
在一个优选的实施方案中，本发明提供结合至DLL3和CD3的双特异性抗体(优选为BiTE)，其用于治疗肺癌，优选为小细胞肺癌。
癌症包括本发明的疾病的诊断
根据本发明的另一个方面，提供了在受试者中检测、诊断和/或筛选癌症(例如本发明的疾病)或监测其进展的方法，或监测例如针对本发明疾病的抗癌药物或治疗的效果的方法，包括检测能免疫特异性结合至DLL3的抗体或其一种或多种含有表位的片段的存在或水平，或包括检测受试者中其水平的变化。
根据本发明的另一个方面，提供了在受试者中检测、诊断和/或筛选癌症(例如本发明的疾病)的方法，其包括检测能免疫特异性结合至DLL3的抗体或其一种或多种含有表位的片段的存在或水平，其中(a)在受试者中与健康受试者中的水平相比，存在升高水平的能免疫特异性结合至DLL3的抗体或其所述一个或多个含有表位的片段，或是(b)在受试者中与健康的受试者中相应的不可检测的水平相比，存在可检测水平的能免疫特异性结合至DLL3的抗体或其一种或多种含有表位的片段，指示在所述受试者中存在癌症。
一个用于检测、诊断和/或筛选癌症(例如本发明的疾病)的具体方法包括：
使要测试的生物样品与DLL3或其一个或多个含表位的片段接触；并
检测受试者中能免疫特异性结合至DLL3的抗体或其所述一个或多个含有表位的片段的存在。
根据本发明的另一个方面，提供了在受试者中监测癌症(例如本发明的疾病)的进展的方法，或监测例如针对本发明疾病的抗癌药物或治疗的效果的方法，其包括在受试者中检测能免疫特异性结合至DLL3的抗体或其一种或多种含有表位的片段的存在，所述检测是在第一时间点和较晚些的时间点处进行的；与受试者中第一时间点处的水平相比，在受试者中于稍晚些的时间点处有能免疫特异性结合至DLL3的抗体或其一种或多种含有表位的片段的升高的或降低的水平的存在，指示在所述受试者中所述癌症的进展或消退，或所述抗癌药物或治疗的有效或无效。
能免疫特异性结合至DLL3的抗体或其一种或多种含有表位的片段的存在，能典型地通过对获取自所述受试者的生物样品的分析而检测到(示例性的生物样品如上所述，例如所述样品是肺、胰腺或皮肤组织的样品，亦或是血液或唾液样品)。所述方法典型地包括从所述受试者获得所述生物样品用于分析的步骤。可检测的抗体包括IgA、IgM和IgG抗体。
根据本发明，来自怀疑患有或已知患有本发明的疾病的受试者的例如肺、胰腺或皮肤组织、血清、血浆或尿液的测试样品，可用于诊断或监测。在一个实施方案中，测试样品中DLL3丰度相对于对照样品(来自未患本发明的疾病的受试者)或之前确定的参考范围的改变，指示本发明的疾病的存在。在另一个实施方案中，测试样品中DLL3与对照样品或之前确定的参考范围相比的相对丰度指示本发明的疾病亚型(例如，小细胞癌；鳞状细胞肺癌；胰腺的内分泌肿瘤或鳞状细胞皮肤癌，黑素瘤)。在又一个实施方案中，测试样品中DLL3与对照样品或之前确定的参考范围相比的相对丰度指示本发明的疾病的程度或严重性(例如转移的可能性)。在任何上述方法中，对DLL3的检测可任选与一种或多种用于本发明的疾病的其他生物标记物的检测组合。本领域的任何合适的方法都可用来测量DLL3的水平，所述方法包括但不限于本文描述的优选的技术，激酶测定法，检测DLL3和/或将其可视化的免疫测定法(例如Western印迹，免疫沉淀然后是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫细胞化学等)。在进一步的实施方案中，测试样品中编码DLL3的mRNA丰度相对于对照样品或之前确定的参考范围的变化，指示存在本发明的疾病。任何合适的杂交测定法都可用于检测DLL3表达，所述检测是通过检测编码DLL3的mRNA和/或将其可视化来进行的(例如Northern测定法、斑点印记、原位杂交等)。
在本发明的另一个实施方案中，特异性结合至DLL3的带标志物的抗体(或其他亲和性试剂)、其衍生物和类似物可用于诊断目的以检测、诊断或监测本发明的疾病。优选地，本发明的疾病在动物中，更优选在哺乳动物中，最优选在人中检测到。
筛选测定法
本发明提供了用于鉴定制剂(例如候选化合物或测试化合物)的方法，所述制剂结合到DLL3或对DLL3的表达或活性具有刺激或抑制作用。本发明还提供了鉴定结合至DLL3相关多肽或DLL3融合蛋白的、或对DLL3相关多肽或DLL3融合蛋白的表达或活性具有刺激或抑制作用的制剂、候选化合物或测试化合物的方法。制剂、候选化合物或测试化合物的例子包括但不限于，核酸(如DNA和RNA)，碳水化合物，脂质，蛋白质，肽，肽模拟物，小分子和其它药物。制剂可用本领域已知的大量方法的任一种在组合文库方法中获得，其包括：生物文库；空间可寻址平行固相或溶液相文库(spatially addressable parallel solid phase orsolution phase libraries)；需要去卷积的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；以及使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145；美国专利号5,738,996；和美国专利号5,807,683，其各自在此通过提述以其整体并入)。
用于合成分子文库的方法的例子可在本领域中找到，例如在DeWitt等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909；Erb等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422；Zuckermann等,1994,J.Med.Chem.37:2678；Cho等,1993,Science 261:1303；Carrell等,1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等,1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop等,1994,J.Med.Chem.37:1233中，其各自在此通过提述以其整体并入。
化合物的文库可存在于，例如存在于溶液中(例如Houghten,1992,BioTechniques13:412-421)，或在珠上(Lam,1991,Nature 354:82-84)、芯片上(Fodor,1993,Nature 364:555-556)、细菌上(美国专利号5,223,409)、孢子上(专利号5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、质粒上(Cull等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869)或噬菌体(Scott和Smith,1990,Science 249:386-390；Devlin,1990,Science 249:404-406；Cwirla等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382；和Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301-310)上，其各自在此通过提述以其整体并入。
在一个实施方案中，与DLL3、DLL3片段(例如功能活性片段)、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用(例如与之结合)的制剂是在基于细胞的测定系统中鉴定出来的。根据这个实施方案，表达DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白的细胞与候选化合物或对照化合物接触，并且确定了候选化合物与DLL3相互作用的能力。若需要的话，这个测定法可用于筛选多数的候选化合物(例如文库)。例如，细胞可为原核细胞(例如大肠杆菌)来源的或真核细胞(例如酵母或哺乳动物)来源的。进一步地，细胞能内源地表达DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白，或被遗传工程改造来表达DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白。在一些例子中，DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白或候选化合物是带标志的，例如用放射性标志物，如32P、35S和125I；或是荧光标志物，如异硫氰酸荧光素，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二醛或者荧光胺来进行标志，以使能够检测DLL3与候选化合物之间的相互作用。候选化合物直接或间接与DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用的能力可通过本领域技术人员已知的方法来确定。例如，候选化合物与DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用能通过流式细胞术、闪烁测定法(scintillation assay)、免疫沉淀法或Western印迹分析来确定。
在另一个实施方案中，与DLL3、DLL3片段(例如功能活性片段)、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用(例如与之结合)的试剂是在无细胞的测定系统中鉴定出来的。根据这个实施方案，天然或重组的DLL3或其片段、或天然或重组的DLL3相关多肽或其片段、或DLL3融合蛋白或其片段与候选化合物或对照化合物接触，并确定候选化合物与DLL3或DLL3相关多肽、或DLL3融合蛋白相互作用的能力。若需要的话，这个测定法可用于筛选多数的候选化合物(例如文库)。优选地，首先将DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白固定，所述固定是通过例如用特异性地识别并结合如下的固定化的抗体(或其他亲和性试剂)来接触DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白来进行的，或是通过用设计用于与蛋白结合的表面来接触DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白来进行。DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白可为部分或完全纯化的(例如部分或完全没有其他多肽的)或是细胞裂解物的一部分。进一步地，DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、或DLL3相关多肽的片段可为包含DLL3的融合蛋白或其生物活性的部分，或是DLL3相关多肽和结构域如谷胱甘肽-S-转移酶。或者，DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白可用本领域技术人员所熟知的技术(例如生物素酰化试剂盒，Pierce Chemicals；Rockford,IL)来生物素酰化。候选化合物与DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用的能力可通过本领域技术人员已知的方法来确定。
在另一个实施方案中，用基于细胞的测定系统来鉴定结合至蛋白或调节其活性的制剂，比如酶，或其生物活性片段，这对DLL3产生或降解起关键作用，或是对DLL3翻译后修饰起关键作用。在初级筛选中，用天然或重组表达以下蛋白的细胞来接触多个化合物(例如文库)：(i)DLL3、DLL3的同种型、DLL3同源物、DLL3相关多肽、DLL3融合蛋白、或前述任一的生物活性片段；和(ii)对于DLL3、DLL3的同种型、DLL3同源物、DLL3相关多肽、DLL3融合蛋白、或片段的生产起关键作用的蛋白，以便鉴定出调节DLL3、DLL3的同种型、DLL3同源物、DLL3相关多肽、DLL3融合蛋白、或片段的产生、降解、或翻译后修饰的化合物。如果需要的话，在初级筛选中鉴定出的化合物可随后在针对天然或重组表达DLL3的细胞的二级筛选中进行测定。候选化合物调节DLL3、同种型、同源物、DLL3相关多肽、或DLL3融合蛋白的产生、降解或转录后修饰的能力可通过本领域技术人员已知方法来确定，所述方法包括但不限于流式细胞术、闪烁测定法、免疫沉淀和Western印迹分析。
在另一个实施方案中，竞争性地与DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用(例如与之结合)的制剂是在竞争性结合测定法中鉴定的。根据这个实施方案，用候选化合物和已知与DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用的化合物来接触表达DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白的细胞；然后确定候选化合物优先地与DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用的能力。或者，优先地与DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用(例如与之结合)的制剂是在无细胞测定系统中通过用候选化合物和已知与DLL3、DLL3相关多肽或DLL3融合蛋白相互作用的化合物来接触DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白来鉴定的。如上所述，候选化合物与DLL3、DLL3片段、DLL3相关多肽、DLL3相关多肽的片段、或DLL3融合蛋白相互作用的能力能通过本领域技术人员已知的方法来确定。这些测定无论是基于细胞的或是无细胞的，都能用于筛选多个候选化合物(例如文库)。
在另一个实施方案中，调节(即上调或下调)DLL3或DLL3相关多肽的表达或活性的制剂是通过用候选化合物或对照化合物(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))接触表达DLL3或DLL3相关多肽的细胞(例如原核来源的或真核来源的细胞)并确定DLL3、DLL3相关多肽或DLL3融合蛋白、编码DLL3的mRNA、或编码DLL3相关多肽的mRNA的表达而鉴定出来的。将存在候选化合物时的DLL3、DLL3相关多肽、编码DLL3的mRNA、或编码DLL3相关多肽的mRNA的表达水平与不存在候选化合物时(例如存在对照化合物)的DLL3、DLL3相关多肽、编码DLL3的mRNA、或编码DLL3相关多肽的mRNA的表达水平进行比较。基于该比较，随后能将候选化合物鉴定为DLL3或DLL3相关多肽的表达的调节剂。例如，当存在候选化合物时DLL3或mRNA的表达比不存在时显著更高时，则将候选化合物鉴定为DLL3或mRNA的表达刺激剂。或者，当存在候选化合物时DLL3或mRNA的表达比不存在时显著更低时，则将候选化合物鉴定为DLL3或mRNA的表达抑制剂。DLL3或编码它的mRNA的表达水平能通过本领域技术人员已知方法来确定。例如，mRNA表达能通过Northern印迹分析或RT-PCR来评估，而蛋白水平能通过Western印迹分析来评估。
在另一个实施方案中，调节DLL3或DLL3相关多肽活性的制剂是通过用测试化合物或对照化合物接触含有DLL3或DLL3相关多肽或表达DLL3或DLL3相关多肽的细胞(例如原核或真核细胞)的制备物，并确定测试化合物调节(例如刺激或抑制)DLL3或DLL3相关多肽活性的能力而鉴定的。可通过检测对DLL3或DLL3相关多肽的细胞信号转导途径的诱导(例如细胞内Ca2+、二酰基甘油、IP3等)、在合适底物上检测靶标的催化活性或酶活性、检测对报告基因(例如响应于DLL3或DLL3相关多肽且可操作地连接至编码可检测标记物(例如荧光素酶)的核酸的调控元件)的诱导、或检测细胞响应(例如细胞分化或细胞增殖)来评估DLL3或DLL3相关多肽的活性。基于本说明书，可将本领域技术人员已知的技术用于测量这些活性(参见例如美国专利号5,401,639，其在此通过提述并入)。随后可将候选化合物鉴定为DLL3或DLL3相关多肽活性的调节剂，所述鉴定是通过将候选化合物与对照化合物的作用进行比较来进行的。合适的对照化合物包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)和生理盐水(NS)。
在另一个实施方案中，调节(即上调或下调)DLL3或DLL3相关多肽的表达、活性或表达和活性两者的制剂是在动物模型中鉴定的。合适的动物例子包括但不限于：小鼠、大鼠、兔、猴、豚鼠、狗和猫。优选地，使用的动物代表本发明的疾病的模型(例如小细胞肺癌细胞系的异种移植物如NCI-H345；非小细胞肺癌细胞系的异种移植物如A549和H460；胰腺癌细胞系的异种移植物如裸鼠中的MIA PaCa-2，Marincola等,J Surg Res 1989Dec；47(6):520-9，或皮肤癌细胞系的异种移植物如裸鼠中的MV3，van Muijen等,Int J Cancer 1991Apr 22；48(1):85-91)。可利用这些来测试调节DLL3水平的化合物，这是由于这些模型中展示出的病理学与例如本发明的疾病的病理学是相似的。根据这种实施方案，将测试化合物或对照化合物施用(例如口服、经直肠、或非经肠道地如腹膜内或静脉内)于合适的动物，并确定对DLL3或DLL3相关多肽的表达、活性或表达和活性二者的作用。DLL3或DLL3相关多肽表达的变化能通过如上概述的方法来评估。
在又一个实施方案中，DLL3或DLL3相关多肽在二杂交测定或三杂交测定中用作“诱饵蛋白”，以鉴定与DLL3或DLL3相关多肽结合或相互作用的其他蛋白(参见例如美国专利号5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；Bartel等(1993)BioTechniques 14:920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene8:1693-1696；和PCT公开No.WO 94/10300)。正如本领域技术人员所了解的，此类结合蛋白还可能涉及通过DLL3的信号传递，所述DLL3作为例如涉及DLL3的信号传输途径的上游或下游元件。
本发明还提供通过上述筛选测定法鉴定出的新的药剂，及其如本文所述的治疗用途。此外，本发明还提供与DLL3的相互作用或调节DLL3的活性的药剂在制造用于治疗本发明的疾病的药物中的用途。
DLL3的治疗用途
本发明提供对多种疾病和病症的治疗或预防，所述治疗或预防是通过施用治疗化合物来进行的。此类化合物包括但不限于：DLL3、DLL3类似物、DLL3相关多肽及其衍生物和变体(包括片段)；针对前述项的抗体(或其他亲和性试剂)；编码DLL3、DLL3类似物、DLL3相关多肽及其片段的核酸；针对编码DLL3或DLL3相关多肽的基因的反义核酸；以及编码DLL3或DLL3相关多肽的基因的调节剂(例如激动剂和拮抗剂)。本发明的一个重要特征是对编码涉及癌症(如本发明的疾病)的DLL3的基因的鉴定。例如，可通过施用在患有本发明的疾病的受试者的血清或组织中减少DLL3的功能或表达的治疗化合物来治疗(例如减轻症状或延缓进展的发作)或预防本发明的疾病。
在一个实施方案中，一种或多种各自特异性地结合至DLL3的抗体(或其他亲和性试剂)是单独施用或与一种或多种附加的治疗化合物或治疗组合施用。
生物学产品如抗体(或其他亲和性试剂)对于其所施用的受试者来说是异体的。在一个实施方案中，将人DLL3或人DLL3相关多肽、编码人DLL3或人DLL3相关多肽的核苷酸序列、或针对人DLL3或人DLL3相关多肽的抗体(或其他亲和性试剂)施用于人受试者用于治疗(例如减轻症状或延缓进展的发作)或预防。
不受理论的束缚，人们认为特异性地结合至DLL3的抗体(或其他亲和性试剂)的治疗活性可通过抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)现象来实现(参见例如JanewayJr.C.A.等,Immunobiology,第5版,2001,Garland Publishing,ISBN 0-8153-3642-X；PierG.B.等,Immunology,Infection,and Immunity,2004,p246-5；Albanell J.等,Advancesin Experimental Medicine and Biology,2003,532:p2153-68和Weng,W-K.等,Journalof Clinical Oncology,2003,21:p 3940-3947)。
本发明的疾病的治疗和预防
例如，本发明的疾病是通过对怀疑患有或已知患有一种或多种本发明的疾病或具有患上一种或多种本发明的疾病风险的受试者施用化合物来治疗和预防的，所述化合物调节(即增加或减少)DLL3的水平或活性(即功能)，所述DLL3在患有一种或多种本发明的疾病的受试者的血清或组织中的存在与未患本发明的疾病的受试者的血清和组织中相比是差异性的。在一个实施方案中，本发明的疾病是通过对怀疑患有或已知患有一种或多种本发明的疾病或具有患上一种或多种本发明的疾病风险的受试者施用化合物来治疗和预防的，所述化合物下调(即减少)DLL3的水平或活性(即功能)，所述DLL3在患有一种或多种本发明的疾病的受试者的血清或组织中是增加的。这种化合物的例子包括但不限于：DLL3反义寡核苷酸、核酶、针对DLL3的抗体(或其他亲和性试剂)、和抑制DLL3酶活性的化合物。可用体外测定来鉴定其他有用的化合物，例如DLL3拮抗剂和小分子DLL3拮抗剂。
癌症，例如本发明的疾病，也可通过对怀疑患有或已知患有这种癌症的受试者或具有患上这种癌症风险的受试者施用化合物来治疗或预防，所述化合物下调DLL3的水平或活性(即功能)，所述DLL3在患有这种癌症的受试者的血清和组织中是增加的。这种化合物的例子包括但不限于：DLL3、DLL3片段和DLL3相关多肽；编码DLL3、DLL3片段和DLL3相关多肽的核酸(例如用于基因治疗的用途)；以及对于那些具有酶活性的DLL3或DLL3相关多肽而言，还有已知调节这种酶活性的化合物或分子。其他可使用的化合物(例如DLL3激动剂)能通过体外测定来鉴定。
在另一个实施方案中，对治疗或预防进行调整以符合个体受试者的需要。因此，在具体的实施方案中，促进DLL3水平或功能的化合物是治疗性地或预防性地施用于受试者的，所述受试者被怀疑患有或已知患有癌症例如本发明的疾病，在所述受试者中DLL3的水平或功能是缺失的或相对于对照或正常参考范围是减少的。在进一步的实施方案中，促进DLL3的水平或功能的化合物是治疗性地或预防性地施用于受试者的，所述受试者被怀疑患有或已知患有癌症例如本发明的疾病，在所述受试者中DLL3的水平或功能相对于对照或正常参考范围是增加的。在进一步的实施方案中，减少DLL3的水平或功能的化合物是治疗性地或预防性地施用于受试者的，所述受试者被怀疑患有或已知患有癌症例如本发明的疾病，在所述受试者中DLL3的水平或功能相对于对照或正常参考范围是增加的。在进一步的实施方案中，减少DLL3的水平或功能的化合物是治疗性地或预防性地施用于受试者的，所述受试者被怀疑患有或已知患有癌症例如本发明的疾病，在所述受试者中DLL3的水平或功能相对于对照或正常参考范围是减少的。由于施用此类化合物所致的DLL3功能或水平的变化可容易地检测到，例如通过获得样品(例如血或尿)并体外测定DLL3的水平或活性或编码DLL3的mRNA的水平或前述的任何组合来检测到。此类测定法可在施用如本文所述的化合物之前或之后进行。
本发明的化合物包括但不限于将DLL3谱(profile)朝正常恢复的任何化合物，例如小有机分子、蛋白、肽、抗体(或其他亲和性试剂)、核酸等。本发明的化合物可与任何其他化疗药物组合给予。
疫苗治疗
本发明的另一方面是一种免疫原性组合物，合适的为疫苗组合物，其包含DLL3或其含有表位的片段，或编码DLL3或其片段的核酸，以及任选地伴随免疫刺激剂。
还提供了提高免疫响应的方法，其包括对受试者施用此类组合物；以及用于治疗或预防癌症(例如本发明的疾病)的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的此类组合物；以及此类组合物，其用于预防或治疗本发明的疾病。
因此，DLL3作为抗原性材料可为有用的，并可用于生产用于治疗或预防癌症(例如本发明的疾病)的疫苗。这种材料可为“抗原性的”和/或“免疫原性的”。通常，“抗原性的”意指蛋白能用于产生抗体(或其他亲和性试剂)或确实能在受试者或实验动物中诱导抗体响应。“免疫原性的”意指蛋白能在受试者或实验动物中诱发免疫响应，如保护性免疫响应。因此，在后一情况下，所述蛋白可能能够不仅产生抗体响应，另外还能产生非基于抗体的免疫响应。“免疫原性的”还包括蛋白是否可在体外环境(例如T细胞增殖测定法)中引发免疫样的响应。合适的免疫响应的产生可需要存在一种或多种佐剂和/或合适的抗原提供。
技术人员可知，DLL3的同源物或衍生物也会用作抗原性/免疫原性材料。因此，例如包含一个或多个添加、缺失、取代等的蛋白也包含在本发明内。此外，可将一个氨基酸用另一个类似的“类型”来替代，例如用另一个疏水氨基酸来替换一个疏水氨基酸。人们可用如CLUSTAL的程序来对比氨基酸序列。该程序将氨基酸序列进行对比，并通过在两条序列之一中适当地插入空格来找到最佳比对。可计算对于最佳比对的氨基酸同一性或相似性(同一性加氨基酸类型的保守性)。像BLASTx这样的程序会比对相似序列的最长延伸并给合适匹配赋值。因此可获得对比，其中发现了一些区域的相似性，其各自具有不同的分数。两种类型的分析都在本发明的预期内。
在同源物和衍生物的情况下，与如本文所述的蛋白的同一性程度的重要性低于同源物或衍生物应当维持其抗原性和/或免疫原性的重要性。然而，合适地，提供了与本文所述的蛋白或多肽具有至少60％相似性(如上所述)的同源物或衍生物，例如提供了具有至少70％相似性，如至少80％相似性的同源物和衍生物。具体而言，提供了具有至少90％或甚至95％相似性的同源物或衍生物。合适地，同源物或衍生物具有与本文所述的蛋白或多肽至少60％序列同一性。优选地，同源物或衍生物具有至少70％同一性，更优选为至少80％同一性。最优选为同源物或衍生物具有至少90％或甚至95％相似性。
在另一个可供选择的方法中，所述同源物或衍生物可为融合蛋白，其并入使纯化更容易的部分，例如通过对合意的蛋白或多肽有效地添加标签来进行。去除“标签”可为必须的，或者可能是这样的情况，融合蛋白本身保留足够的抗原性从而使其是有用的。
已知，可筛选抗原性蛋白或多肽以鉴定表位区，即这些对蛋白或多肽的抗原性或免疫原性起关键作用的区域。能用本领域技术人员所熟知的方法来测试片段和/或同源物和/或衍生物的抗原性。因此，本发明的片段应包括一种或多种此类表位区或是与此类区域足够相似的，以保留其抗原性/免疫原性特性。因此，对于根据本发明的片段，同一性程度可能是无关的，因为它们可能与本文所述的蛋白或多肽、同源物或衍生物的特定部分是100％相同的。再一次，关键的问题在于所述片段保留了其来源蛋白的抗原性/免疫原性特性。
对于同源物、衍生物和片段重要的是，它们具有至少其来源蛋白或多肽的一定程度的抗原性/免疫原性。因此，本发明的一个额外的方面，提供了DLL3的抗原性/免疫原性片段，或其同源物或衍生物。
DLL3或其抗原性片段可单独提供，作为纯化的或分离的制备物。它们可作为含有本发明的一种或多种其他蛋白或其片段的混合物的一部分来提供。因此，在进一步的方面，本发明提供了包含DLL3和/或其一种或多种抗原性片段的抗原组合物。这种组合物可用于检测和/或诊断癌症，例如本发明的疾病。
根据本发明的疫苗组合物可为预防性或治疗性疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物可包括一种或多种佐剂(免疫刺激剂)。本领域所熟知的例子包括无机凝胶，如氢氧化铝，以及油包水乳剂，如不完全弗氏佐剂。其他有用的佐剂是本领域技术人员已知的。
在用于治疗癌症的疫苗组合物中使用的合适的佐剂包括：3De-O-酰化单磷酰基脂质A(称为3D-MPL或简称为MPL，参见WO92/116556)，皂素(例如QS21或QS7)，以及TLR4激动剂如含CpG的分子(例如WO95/26204中公开的那些)。采用的佐剂可为组分(例如MPL和QS21或者MPL、QS21和含CpG的部分)的组合。可将佐剂配制为水包油乳剂或脂质体制剂。此类制备物可包含其他运载体。
在另一个实施方案中，将包含10个或更多连续核苷酸的寡核苷酸的制备物用作治疗癌症(例如本发明的疾病)的疫苗，所述连续核苷酸与编码DLL3或DLL3多肽片段的核苷酸序列是互补的。此类制备物可包含佐剂或其他运载体。
抑制DLL3以治疗本发明的疾病
在本发明的一个实施方案中，通过施用化合物来治疗或预防癌症(例如本发明的疾病)，所述化合物拮抗(抑制)DLL3的水平和/或功能，所述DLL3在患有这种癌症的受试者的血清或组织中与在未患这种癌症的受试者的血清或组织中相比是升高的。
对这种目的有用的化合物包括但不限于：抗DLL3抗体(或其他亲和性试剂，及其包含结合位点的片段和衍生物)、DLL3反义或核酶核酸、以及编码功能障碍的DLL3的核酸，其可用于通过同源重组“敲除”内源性的DLL3功能(参见例如Capecchi,1989,Science 244:1288-1292)。抑制DLL3功能的其他化合物可通过使用已知的体外测定法来鉴定，例如用于测试化合物抑制DLL3结合至另一蛋白或结合伴侣的能力、或抑制已知的DLL3功能的能力的测定。
例如，这种抑制可体外测定或在细胞培养物中测定，但也可采用遗传测定法。还可使用优选的技术来检测施用所述化合物之前和之后DLL3的水平。采用合适的体外或体内测定来确定具体化合物的效果，以及确定其施用是否适应于(indicated for)被影响的组织的治疗，详情如下文所述。
在一个具体实施方案中，将抑制DLL3功能(活性)的化合物治疗性地或预防性地施用于受试者，在所述受试者中检测到了与患有例如本发明的疾病且未接受根据本发明的治疗的(从而将水平或活性带到未患这种癌症的受试者中所发现的情况或预先确定的参考范围)受试者的血清或组织相比增加的(例如比正常水平或所需水平更高)DLL3的血浆或组织水平或功能活性。如上所述，可采用本领域的方法标准来测量DLL3水平或功能的增加。合适的DLL3抑制剂组合物可例如包括小分子，即1000道尔顿或更低的分子。此类小分子可通过本文所述的筛选方法来鉴定。
对治疗性或预防性化合物的测定
本发明还提供用于药物发现用途的测定法，其用于鉴定或验证用于治疗或预防表达DLL3的癌症(例如本发明的疾病)的化合物的效力。
因此，提供了筛选调节DLL3活性的化合物的方法，该方法包括：(a)用候选化合物接触DLL3或其生物活性部分；和(b)确定DLL3的活性是否因此受到了调节。这种方法可包括：(a)在样品中用候选化合物接触DLL3或其生物活性部分；和(b)将所述样品中接触所述候选化合物后的DLL3或其生物活性部分的活性与所述样品中接触所述候选化合物前的DLL3或其生物活性部分的活性进行比较，或与参考水平的活性比较。
筛选方法可为筛选抑制DLL3活性的化合物的方法。
DLL3或其生物活性部分可例如在细胞上表达或由细胞表达。可例如将DLL3或其生物活性部分从表达其的细胞分离。可例如将DLL3或其生物活性部分固定化至固相上。
还提供了对调节DLL3或编码DLL3的核酸的表达的化合物进行筛选的方法，所述方法包括：(a)用候选化合物接触表达DLL3或编码DLL3的核酸的细胞；和(b)确定DLL3或编码DLL3的核酸的表达是否受到了调节。这种方法可包括(a)在样品中用候选化合物接触表达DLL3或编码DLL3的核酸的细胞；和(b)将所述样品中接触所述候选化合物后细胞的DLL3或编码DLL3的核酸的表达与所述样品中接触所述候选化合物前细胞的DLL3或编码DLL3的核酸的表达进行比较，或与参考水平的表达比较。
所述方法可为对抑制DLL3或编码DLL3的核酸的表达的化合物进行筛选的方法。
本发明的其他方面包括：可通过前述筛选方法获得的化合物，调节DLL3或编码DLL3的核酸的活性或表达的化合物，例如抑制DLL3或编码DLL3的核酸的活性或表达的化合物。
提供这种化合物用于治疗或预防癌症(例如本发明的疾病)的用途。还提供了用于治疗或预防癌症(例如本发明的疾病)的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的这种化合物。
可对测试化合物在患有例如本发明的疾病的受试者中将DLL3水平向未患这种癌症的受试者中发现的水平恢复的能力进行测定，或是对其在这种癌症的实验动物模型中产生相似变化的能力进行测定。能在患有例如本发明的疾病的受试者中将DLL3水平向未患这种癌症的受试者中发现的水平恢复、或是在这种癌症的实验动物模型中产生相似变化的化合物可用作先导化合物用于进一步的药物发现，或在治疗上使用。DLL3表达可通过优选的技术、免疫测定法、凝胶电泳然后是可视化、DLL3活性检测、或本文教导的或本领域技术人员所知的任何其他方法来测定。此类测定可用于在临床监测或在药物开发中筛选候选药物，其中DLL3的丰度对于临床疾病能够充当替代标记物。
在多种具体实施方案中，可用代表了涉及受试者病症的细胞类型的细胞来进行体外测定，以确定化合物是否对这些细胞类型具有所需的功效。
在人体测试之前，用于治疗用途的化合物可在合适的动物模型系统中进行测试，所述动物包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。对于人体施用之前的体内测试，可使用任何本领域已知的动物模型系统。本发明的疾病的动物模型的例子包括但不限于小细胞肺癌细胞系的异种移植物如NCI-H345；非小细胞肺癌细胞系的异种移植物如A549和H460；胰腺癌细胞系的异种移植物如裸鼠中的MIA PaCa-2，Marincola等,J Surg Res 1989 Dec；47(6):520-9；或皮肤癌细胞系的异种移植物如裸鼠中的MV3，van Muijen等,Int J Cancer1991Apr 22；48(1):85-91。可利用这些来测试调节DLL3水平的化合物，这是由于这些模型中展示出的病理学与例如本发明的疾病的病理学是相似的。对于本领域技术人员同样明显的是，基于本公开内容，转基因动物可用编码DLL3的一个或多个基因的“敲除”突变来产生。基因的“敲除”突变是一种导致突变的基因不表达、或以异常形式或以低水平表达的突变，从而使与所述基因产物相关的活性接近或完全丧失。优选地，转基因动物是哺乳动物，更优选地，转基因动物是小鼠。
在一个实施方案中，调节DLL3表达的测试化合物是在非人动物(例如小鼠、大鼠、猴、兔和豚鼠)，优选用于本发明疾病的表达DLL3的非人动物模型中鉴定的。根据这个实施方案，对动物施用测试化合物或对照化合物，并确定测试化合物对DLL3的表达的效果。可通过将用测试化合物处理的动物或一组动物中DLL3的水平(或编码同样水平DLL3的mRNA)与用对照化合物处理的动物或一组动物中的DLL3或mRNA水平进行对比，鉴定出改变DLL3表达的测试化合物。可用本领域技术人员已知的方法来确定mRNA和蛋白水平，例如原位杂交。可将动物处死或不处死以测定测试化合物的效果。
在另一个实施方案中，调节DLL3或其生物活性部分的活性的测试化合物是在非人动物(例如小鼠、大鼠、猴、兔、和豚鼠)，优选用于本发明疾病的表达DLL3的非人动物模型中鉴定的。根据这个实施方案，对动物施用测试化合物或对照化合物，并确定测试化合物对于DLL3活性的效果。可通过对用对照化合物处理的动物和用测试化合物处理的动物进行测定，以鉴定出改变DLL3活性的测试化合物。可通过检测对DLL3的细胞第二信使(例如细胞内Ca2+、二酰基甘油、IP3等)的诱导、检测DLL3或其结合伴侣的催化活性或酶活性、检测对报告基因(例如响应于DLL3且可操作地连接至编码可检测标记物(例如荧光素酶或绿色荧光蛋白)的核酸的调控元件)的诱导、或检测细胞响应(例如细胞分化或细胞增殖)，以评估DLL3的活性。可利用本领域技术人员已知技术来检测DLL3活性的变化(参见例如美国专利号5,401,639，其在此通过提述并入)。
在又一个实施方案中，调节DLL3水平或表达的测试化合物是在患有例如本发明的疾病的人受试者，优选为患有例如严重的本发明疾病的那些中鉴定出的。根据这个实施方案，对人受试者施用测试化合物或对照化合物，并通过在生物样品(例如血清、血浆、或尿液)中分析DLL3或编码DLL3的mRNA的表达来确定测试化合物对DLL3表达的效果。可通过将用对照化合物处理的受试者或一组受试者中的DLL3水平或编码DLL3的mRNA水平与用测试化合物处理的受试者或一组受试者的所述水平进行对比，从而鉴定出改变DLL3表达的测试化合物。或者，可通过将受试者或一组受试者中施用测试化合物之前或之后的DLL3水平或编码DLL3的mRNA水平进行对比，从而鉴定出DLL3表达的变化。可用本领域技术人员已知的方法来得到生物样品并分析mRNA或蛋白表达。例如，可用本文所述的优选的技术来评估DLL3水平的变化。
在另一个实施方案中，调节DLL3活性的测试化合物是在患有例如本发明的疾病的人受试者(优选为患有例如严重的本发明疾病)中鉴定的。在这个实施方案中，对人受试者施用测试化合物或对照化合物，并确定测试化合物对DLL3活性的效果。可通过将来自用对照化合物处理的受试者的生物样品与来自用测试化合物处理的受试者的样品进行对比，从而鉴定出改变DLL3活性的测试化合物。或者，可通过将受试者或一组受试者中施用测试化合物之前或之后的DLL3活性进行对比，从而鉴定出DLL3活性的改变。可通过在生物样品(例如血清、血浆、或尿液)中检测对DLL3细胞信号转导途径的诱导(例如细胞内Ca2+、二酰基甘油、IP3等)、DLL3或其结合伴侣的催化活性或酶活性、或细胞响应(例如细胞分化或细胞增殖)来评估DLL3的活性。可用本领域技术人员已知技术来检测对DLL3第二信使的诱导的变化或细胞响应的变化。例如，可用RT-PCR来检测细胞第二信使的诱导的变化。
在另一个实施方案中，选择将DLL3的水平或表达向对照受试者(例如未患例如本发明的疾病的人)中检测到的水平改变的测试化合物用于进一步的测试或治疗用途。在另一个实施方案中，选择将DLL3的活性向对照受试者(例如未患例如本发明的疾病的人)中发现的活性改变的测试化合物用于进一步的测试或治疗用途。
在另一个实施方案中，降低一种或多种与例如本发明疾病有关的症状的测试化合物是在患有例如本发明的疾病的人受试者，优选为患有例如严重的本发明疾病的受试者中鉴定的。根据这个实施方案，对受试者施用测试化合物或对照化合物，并确定测试化合物对例如本发明的疾病的一种或多种症状的效果。可通过将用对照化合物处理的受试者与用测试化合物处理的受试者进行对比，从而鉴定出减少一种或多种症状的测试化合物。可用熟悉例如本发明的疾病的医师所知的技术来确定测试化合物是否减少一种或多种与例如本发明的疾病有关的症状。例如，在患有例如本发明的疾病的受试者中减少肿瘤负担的测试化合物对这种受试者是有益的。
在另一个实施方案中，选择降低与癌症(例如本发明的疾病)有关的一种或多种症状的严重性的测试化合物用于进一步的测试或治疗用途。
治疗和预防组合物及其用途
本发明提供治疗(和预防)的方法，包括对受试者施用治疗有效量的本发明化合物(例如DLL3蛋白、能特异性地结合至DLL3或其片段的亲和性试剂，或编码DLL3的核酸)。在一个具体的方面，所述化合物是基本纯化的(例如，基本上不含限制其效果的或是产生不想要的副作用的物质)。
当化合物包含核酸时可采用的制剂和施用方法如上文所述，额外的合适制剂和施用途径如下文所述。
可用多种已知递送系统来施用本发明的化合物，例如包囊于脂质体、微粒、微囊、能表达所述化合物的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见例如Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429 4432)，作为逆转录病毒或其他载体一部分的核酸构建，等等。导入方法可为经肠道的或非经肠道的，并包括但不限于：皮内，肌内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内，硬膜外和口服途径。化合物可通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤内层吸收(例如口腔粘膜，直肠和肠粘膜等)，并且可与其它生物活性剂一起施用。施用可为全身或局部的。此外，可为合意的是通过任何合适的途径将本发明的药物组合物导入中枢神经系统，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可通过例如附接于储液器(如Ommaya储液器)的心室内导管来促进。可采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化剂的制剂。
在本发明的一个方面，可将本发明采用的核酸递送到真皮层，例如，采用粒子介导的表皮递送。
在一个具体的实施方案中，可为合意的是将本发明的药物组合物局部地向需要治疗的部位施用；这可以通过例如(而不是限制)在手术期间局部输注，局部施用，例如通过注射，借助导管，或借助植入物来实现，所述植入物是多孔的，非多孔的，或凝胶状材料，包括膜，如硅橡胶(Sialastic)膜，或纤维。在一个实施方案中，施用可通过直接注射入例如肺、胰脏和皮肤组织或注射于恶性肿瘤或赘生组织或赘生前组织的部位处(或前部位)来进行。
在另一个实施方案中，可在囊泡(vesicle)中，特别是脂质体中递送化合物(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat等,in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,同上,pp.317-327；参见一般同上的出处)。
在又一个实施方案中，可在控释系统中递送化合物。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer,supra；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等,1980,Surgery 88:507；Saudek等,1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(编),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,DrugProduct Design and Performance,Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Rangerand Peppas,J.,1983,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；也参见Levy等,1985,Science 228:190；During等,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等,1989,J.Neurosurg.71:105)。在又一个实施方案中，控释系统可置于治疗靶标(例如本发明的疾病)的临近处，从而仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,in Medical Applications of ControlledRelease,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。其他控释系统在Langer的综述(1990,Science249:1527-1533)中进行了讨论。
在一个具体的实施方案中，其中本发明的化合物是编码蛋白质的核酸，通过将其构建为合适的核酸表达载体的一部分并将其施用使其成为细胞内的(例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic,Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂，或通过将其以与已知进入核的同源框样肽连接的形式施用(参见例如Joliot等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)，等等)，所述核酸可体内施用以促进其编码的蛋白质的表达。或者，可通过同源重组将核酸导入细胞内并整合到宿主细胞DNA中用于表达。
本发明还提供药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的本发明化合物，以及药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指适于联邦或州政府监管部门批准的或美国药典或其他公认的药典中列出的用于在动物中使用的，更具体而言是在人中使用的。术语“载体(carrier)”指的是与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或运载体。此类药物载体可为无菌液体，如水或油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物以静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇，等等。如果需要的话，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。组合物可配制成栓剂，伴随传统的粘合剂和载体如甘油三酯。口服制剂可以包括标准载体如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的例子由E.W.Martin在“Remington’s PharmaceuticalSciences”中描述。此类组合物含有例如纯化形式的治疗有效量的化合物，以及适量的载体，以便提供适于对受试者施用的形式。制剂应当适合于施用模式。
在一个实施方案中，例如其中采用了一种或多种抗体，该组合物根据例行程序来配制为药物组合物，所述药物组合物经调整适于对人类静脉内施用。典型地，用于静脉施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以缓解注射部位的疼痛。通常，成分或是单独提供的，或是混合在一起以单位剂型提供的，例如，作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物在密闭容器例如指示活性剂的量的安瓿或小袋中提供。当组合物通过输注施用时，其可用盛有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配。当组合物通过注射施用时，可提供盛有注射用无菌水或盐水的安瓿，使得成分可以在施用前混合。
本发明的化合物可配制为中性或盐形式。在适当情况下，药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的那些盐，如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，以及与游离羧基形成的那些盐，如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些盐。
对癌症(例如本发明的疾病)的治疗有效的本发明化合物的量，可通过标准临床技术来确定。此外，可任选地采用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中采用的精确剂量也取决于施用途径，和疾病或病症的严重性，并应根据从业者的判断和各受试者的情况来决定。然而，合适的静脉内施用剂量范围一般是每千克体重约20-500微克的活性化合物。合适的用于鼻内施用的剂量范围通常为约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。有效剂量可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线来外推。
栓剂通常含有范围为0.5％-10％体重的活性成分，口服制剂优选为含有10％-95％活性成分。
本发明还提供了包含一个或多个容器的药物包或试剂盒，所述容器填充有本发明的药物组合物的一种或多种成分。可任选地将通知(notice)以政府机构规定的形式关联于此类容器上，所述政府机构监管药物或生物制品的制造、使用或销售，所述通知反映出(a)所述制造、使用或销售的机构批准对人体施用的批准，(b)使用指导；或是二者兼有。
因此，在一个方面，所述试剂盒包含本发明所采用的抗体，例如所述抗体可为冻干的并在施用或使用前复水。当试剂盒用于在(如癌症)疗法/治疗中时，一种或多种抗体可用等渗水溶液来复水(reconstitute)，其可任选地与试剂盒一起提供。在一个方面，试剂盒可包含多肽如本发明所采用的免疫原性的多肽，其可例如是冻干的。后一种试剂盒可进一步包含用于将免疫原性的多肽复水的佐剂。
本发明还延伸至如本文所述的组合物，例如药物组合物和/或疫苗组合物，其用于在受试者中诱导免疫响应。
在又一个实施方案中，本发明提供了分开地或一起地包含如下项的药物：
(a)结合至DLL3的亲和性试剂，和
(b)抗癌剂或其他活性剂。
用于同时地、序贯地或分开地在癌症治疗中施用，优选为在本发明的疾病之一的治疗中施用。
通过成像技术确定DLL3丰度
通过成像技术确定DLL3丰度的优势可能在于，这种方法是非介入性的(除了需要这样施用试剂的之外)并且不需要从受试者身上提取样品。
合适的成像技术包括正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层摄影(SPECT)。用此类技术对DLL3进行可视化需要整合或结合合适的标签，例如放射性示踪剂如18F，11C或123I(技术的进一步细节参见例如NeuroRx–The Journal of the AmericanSociety for Experimental NeuroTherapeutics(2005)2(2),348-360，以及同上的第361-371页)。通过对受试者施用(例如通过注射)带合适的标签的特异性配体，可将放射性示踪剂或其它标签整合到DLL3。或者，它们可被整合到特异性针对DLL3结合的亲和性试剂(例如抗体)中，其可施用于受试者(例如通过注射)。对于Affibody用于成像的用途的讨论，参见例如Orlova A,Magnusson M,Eriksson TL,Nilsson M,Larsson B,Hoiden-Guthenberg I,Widstrom C,Carlsson J,Tolmachev V,Stahl S,Nilsson FY,Tumor imaging using apicomolar affinity HER2binding Affibody molecule,Cancer Res.2006Apr 15；66(8):4339-48)。
使用免疫组化对癌症(包括本发明的疾病)的诊断和治疗
免疫组化是一种优秀的检测技术并因此可在癌症(包括本发明的疾病)的诊断和治疗中非常有用。可用免疫组化来检测、诊断或监测癌症，例如上文所提及的那些，所述免疫组化是使用带标志的特异性地结合至DLL3的抗体(或其他亲和性试剂)、其衍生物和类似物，通过对DLL3抗原在组织切片中的定位来进行的，而特异性的试剂经过抗原-抗体的相互作用通过标记物如荧光染料、酶、放射性元素或胶体金而被可视化。
单克隆抗体技术的进步对于确保免疫组化在人赘生物的现代精确微观诊断中的地位具有重大意义。通过免疫组化对弥散性的(disseminated)赘生物转化的细胞的鉴定，允许给出癌侵入和转移，以及与肿瘤细胞有关的免疫表型向增加的恶性演化的更清晰图景。未来的抗肿瘤治疗方法可包括多种个体化的免疫治疗，其是特异性针对每个个体患者的肿瘤疾病相关的具体免疫表型模式的。进一步的讨论参见例如Bodey B,Thesignificance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy ofneoplasms,Expert Opin Biol Ther.2002 Apr；2(4):371-93。
本发明各个方面的优选特征加以必要的变通(mutatis mutandis)用于各个其他方面。此处提及的现有技术文件以法律允许的最大程度并入。
本发明通过如下非限制性的实施例进行阐述。
实施例1：用液相层析-质谱法(LC/MS)对非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰腺癌和皮 肤癌组织样品中表达的DLL3的鉴定
用如下实验方案，对提取自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰腺癌和皮肤癌组织及相应的正常或正常邻近组织(NAT)样品的膜蛋白进行消化，并将所得的肽通过串联质谱法测序。
1.1材料与方法
1.1.1质膜分级
将从非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰腺癌和皮肤癌或正常或正常邻近组织回收的细胞进行匀浆，并以1000x g进行离心。取上清并于49500x g进行超速离心。将所得的沉淀再次匀浆，并通过不连续蔗糖密度离心进行分离。于107000x g超速离心后，将相边界的级分回收并沉淀。
1.1.2质膜溶液化
将质膜级分重悬于SDS(十二烷基磺酸钠)中，以提供0.5％的SDS终浓度，离心，并提取溶液化的蛋白。
1.1.3胰蛋白酶水解
为了进行溶液内消化，用200mM碳酸氢铵将50μg的蛋白溶液的体积补足至100μl。将10μl的还原剂DL-二硫苏糖醇(75mM)添加至样品并于80℃温育15分钟。然后是使用10μl的150mM碘乙酰胺的半胱氨酸封闭步骤，并在暗处于室温温育30分钟。然后通过添加超纯水将SDS浓度稀释至0.05％。向混合物添加足够体积的胰蛋白酶(Promega V5111)使得1μg的胰蛋白酶对2.75μg的蛋白，并于37℃温育过夜。
或者，用3μl的50mM TCEP来还原(reduced)105μg的蛋白溶液并于60℃温育1小时。然后在Protein Digestion Kit(Protein Discovery)的FASP过滤装置上根据制造商的说明书来处理样品，但用三乙基碳酸氢铵代替碳酸氢铵。胰蛋白酶水解是以75μl的最终体积、用1μg的胰蛋白酶对50μg的蛋白来进行的。
1.1.4肽分级
在真空中对经消化的蛋白样品进行干燥，重悬于0.1％甲酸水溶液，并添加三氟乙酸(TFA)以降低溶液的pH至<3。在Agilent LC1200Series液相层析系统上用AgilentZorbax Bio-Strong Cation Exchange系列II柱通过离子交换将肽分离。或者，将Agilent3100 OFFGEL Fractionator和OFFGEL Kit pH 3-10按照供应商的实验方案用于基于pI的分离。在将IPG条(strips)复水(re-hydration)后，将等量的膜消化物加载到每个孔中。在分离之后，将所得的级分酸化。
1.1.5质谱术
经分级的样品用装有nanoACQUITY UPLC BEH 130 C18柱，75μm x 250mm(186003545)和LTQ Orbitrap Velos(Thermo Fisher Scientific)的Waters nanoACQUITYUPLC System通过液相层析-质谱进行分析。在120分钟用300nl/min从3％增加至35％乙腈的梯度来洗脱肽。在Orbitrap中在400-2000m/z质量范围之间以60000分辨力获得了全扫描质谱。在每个循环中，选择20个强度最高的肽用于在具有在仪器上安装的纳喷雾离子源的线性离子阱中的CID MS/MS扫描。
1.1.6肽的氨基酸序列分析
将从LTQ Orbitrap Velos产生的原始数据通过Mascot软件(Matrix Science)进行处理，所述软件通过检索由Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)、IPI(www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html)和SwissProt(http://www.uniprot.org)组成的序列数据库以及污染物蛋白序列，使用Mowse算法(Curr Biol.1993 Jun 1；3(6):327-3)来从峰列表推断氨基酸序列。用于肽鉴定的标准包括胰蛋白酶消化、多达2个错过的切割位点和多种生物和化学修饰(氧化甲硫氨酸，通过MMTS或碘乙酰胺的半胱氨酸修饰以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化)。将排位1的具有0.05％或更低的预期值、离子得分为28或更高的肽加载到我们的OGAP数据库中，其中将它们加工至蛋白组中。
1.1.7非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰腺癌和皮肤癌相关蛋白的区分
鉴定DLL3的方法使用了通过如上所述的天然存在的人蛋白的质谱实验得到的肽序列，以在出版的人基因组序列中鉴定和组织编码的外显子。将表1中指出的这些在实验上鉴定的序列，与
Figure GDA0000837616500000631
数据库进行对比，其通过如国际专利申请WO2009/087462中所述的肽质量、肽特征(peptide signatures)、EST和公共结构域基因组序列数据(Public DomainGenomic Sequence Data)的加工和整合来进行编辑的。
表1.通过LC/MS在非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰腺癌和皮肤癌组织样品的质膜中鉴定出的DLL3特异性肽
SEQ ID No 鉴定出的肽
SEQ ID No:5 VCLKPGLSEEAAESPCALGAALSAR
SEQ ID No:6 AGAWELR
SEQ ID No:7 CEPPAVGTACTR
SEQ ID No:8 AGCSPEHGFCEQPGECR
SEQ ID No:9 SFECTCPR
SEQ ID No:10 NGGLCLDLGHALR
SEQ ID No:11 CSCALGFGGR
1.1.8蛋白指数
蛋白指数是蛋白广度和肽丰度的量度。算法考虑到在其中观察到蛋白的样品的数量和观察到的肽数量对比各样品可观察到的肽。然后通过相应的正常样品对比癌症样品的成对比较将所得的值进行分级。
1.2结果
这些实验鉴定了DLL3，如此处进一步描述的。在非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胰腺癌和皮肤癌组织样品的质膜中检测出了全长DLL3。表2显示了DLL3的表达分布，其通过蛋白指数测出。DLL3在这些癌症组织中的表达说明DLL3在这些癌症中是有价值的治疗和诊断靶标。
表2.DLL3蛋白指数(+++++＝非常高；++++＝高；+++＝中；++＝低；+＝非常低；-＝未观察到)
组织 癌症 正常
非小细胞肺 + -
胰腺 + -
皮肤 + -
小细胞肺 + -
实施例2：通过流式细胞术分析确定针对DLL3的抗体的特异性
针对DLL3的多克隆抗体的特异性是通过在表达DLL3的细胞系中进行的流式细胞术分析测试的。
材料与方法
将抗DLL3抗体与表达DLL3的细胞SHP-77一起温育。在FACS缓冲液(DPBS,2％FBS)中洗涤细胞，离心并重悬于100μl的稀释的初级SHP-77抗体(也稀释于FACS缓冲液中)中。将抗体-H322复合物于冰上温育60分钟然后用如上所述的FACS缓冲液洗涤2次。将细胞-抗体沉淀重悬于100μl的稀释后的二级抗体(也稀释于FACS缓冲液中)中并在冰上温育60分钟。如前文洗涤沉淀并重悬于200μl FACS缓冲液中。将样品装载到BD FACScanto II流式细胞仪上并用BD FACSdiva软件来分析数据。
结果
流式细胞术分析的结果证明了抗SHP-77多克隆抗体有效结合至细胞表面的人DLL3。结果指示SHP-77细胞上这些抗体针对DLL3的强结合。
实施例3：抗DLL3多克隆抗体通过SHP-77和N82细胞的内化
显示抗DLL3多克隆抗体通过SHP-77(人小细胞肺癌)和N82在结合至细胞时用PabZAP测定法内化。PabZAP抗体被结合至初级抗体。随后，PabZAP复合物被细胞内化。Saporin进入细胞，导致蛋白合成抑制和最终细胞死亡。
PabZAP测定法如下进行。将每个细胞以每孔5x103的密度接种。将抗DLL3多克隆抗体或同种型对照人IgG连续稀释然后添加至细胞。然后将PabZAP以50μg/ml的浓度添加并且允许将平板温育48和72小时。通过
Figure GDA0000837616500000651
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega,G7571)来检测平板中的细胞活力，并通过Luminomitor(TunerBioSystems,Sunnyvale,CA)在490nM处读取平板。通过Prism(Graphpad)分析数据。细胞死亡与抗DLL3多克隆抗体的浓度是成比例的。
结果显示，与抗人IgG同种型对照抗体相比，抗DLL3多克隆抗体被SHP77(图1a)和N82(图1b)有效地内化。结果还显示，抗DLL3多克隆抗体在SHP77中以1nmol/L诱导约40％细胞杀伤，而在N82中以100nmol/L诱导25％细胞杀伤。
实施例4：T细胞激活和表达DLL3的细胞的特异性裂解
背景：
为了评估靶标适从于BiTE方法(组合抗CD3结合表位的双特异性抗体片段，所述表位与针对靶标细胞或组织上特异性抗原的结合位点组合)的可能性，开发了一种测定法来使用特异性针对感兴趣的靶抗原的抗CD3和多克隆抗体测试T细胞激活。
方法：
为了这个测定，在DMS79细胞上表达靶标DLL3。采用用于General Cell MembraneLabeling目录号PKH26GL的SIGMA PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits通过将15ul的染料稀释入0.5ml的缓冲液C(试剂盒中提供)来涂染(paint)细胞。对DMS79细胞计数，于800xg离心，以0.5ml中1000万个细胞重悬于无血清培养基中。向细胞添加含有15ul FKH26染料的0.5ml缓冲液C，轻柔混合并在室温温育1-5分钟。添加培养基加FBS以淬灭(quench)染料。将细胞如上所述离心，重悬于测定培养基(RPMI加10％超低IgG FBS–Invitrogen目录#16250078)中，再次离心并以每毫升200,000个细胞重悬于测定培养基中。向96孔平底组织培养板的每个合适的孔添加10,000个细胞(50ul)。在这之前用来自Southern Biotech(目录#1050-01)的山羊抗小鼠κ以PBS中的3ug/ml过夜涂覆平板。从平板除去多余的抗体溶液，然后添加DMS69细胞。人CD8+T细胞(冰冻的)购自AllCells目录号PB009-3F。融化T细胞并按照制造商的说明书洗涤。将细胞以每毫升1,500,000个细胞重悬于测定培养基中。将T细胞添加至96孔抗κ涂覆的平板中的DMS79细胞，每孔150,000个细胞。以18ug/ml、6ug/ml或2ug/ml将每个DLL3抗体添加至合适的孔。将功能级的抗CD3克隆OKT3(eBioscience目录号16-0037-85)以9ug/ml、3ug/ml或1ug/ml添加至合适的孔。对照孔不接受抗体。在5％CO2、湿润的组织培养箱中于37度温育平板2天。
将平板于400Xg离心5分钟，在FACS缓冲液(PBS+5％FBS)中洗涤细胞然后再次于400xg离心5分钟。再次重悬细胞于FACS缓冲液中并于400xg离心。将细胞以每孔200ul重悬于FACS缓冲液中。将孔轻柔混合并立即在Guava Easycyte流式细胞仪上分析。在黄色通道上分析红色FKH26涂染的细胞。从每孔取得了相同的总细胞数，并对黄色(FKH26涂染的细胞门)中的细胞进行计数，并计算相对于没有抗兔、抗CD3或DLL3单克隆抗体的对照孔T细胞加DMS79细胞的百分比细胞毒性(平均细胞计数是相同的+/-平板与抗κ抗体结合)。
结果：
图2显示了DMS69细胞通过抗DLL3多克隆抗体的的特异性裂解，以及细胞死亡与抗体浓度是成比例的。因此抗DLL3多克隆抗体能通过CD3的激活诱导T细胞细胞毒性。
实施例5：用针对DLL3的抗体的免疫组化
用如下参考实验方案，可在FFPE肺肿瘤和正常组织上用针对DLL3的抗体进行免疫组化。
5.1材料与方法
5.1.1材料
来自TCS Biosciences,UK的Citroclear(HC5005)。
来自Sigma-Aldrich,UK的Reagent alcohol(R8382)。
来自Dako,UK的Target Retrieval Solution,pH6(S2369)。
来自Dako,UK的REAL Peroxidase Blocking Solution(S2023)。
来自Dako,UK的Antibody Diluent(S0809)。
来自Dako,UK的EnVision+HRP-缀合聚合体，小鼠(K4000)。
来自Dako,UK的Liquid DAB+底物(K3468)。
来自Dako,UK的Mayer’s Hematoxylin(X0909)。
来自VWR,UK的Aquatex(1.08562.0050)。
组织切片和阵列(arrays)来自US Biomax Inc.,MD,USA。
5.1.2脱蜡和复水
将载玻片置于Citroclear(2 x 5分钟)中脱蜡然后经过100％醇(2 x 5分钟)、50％醇(1 x 5分钟)和自来水(1 x 5分钟)复水。
5.1.3抗原修复(压力蒸煮器)
在压力下于Coplin缸中的50ml Target Retrieval Solution中修复DLL3抗原20分钟。然后将载玻片进一步放置冷却至室温20分钟。用疏水屏障笔在每个组织切片/TMA周围画圈，然后在PBS中洗涤载玻片2次，每次洗涤3分钟。
5.1.5组织染色
通过用过氧化物酶封闭溶液(Peroxidase Blocking Solution)在湿润室(humidified chamber)中室温温育组织10分钟来封闭内源性的过氧化物酶活性。然后在PBS中洗涤载玻1次并在PBS-T(含有Tween-20的PBS，0.125％v/v)中洗涤一次，每次洗涤3分钟。将初级抗体(在抗体稀释液中稀释1/160)施用于各组织切片和/或微阵列，并将载玻片在湿润室中室温温育45分钟。然后在PBS中洗涤载玻1次并在PBS-T中洗涤一次，每次洗涤3分钟。然后将EnVision+HRP-缀合聚合物施用于组织并将载玻片在湿润室中室温温育30分钟。然后在PBS中洗涤载玻1次并在PBS-T中洗涤一次，每次洗涤3分钟。于湿润室中在液体DAB+底物中室温温育组织10分钟。然后在PBS中洗涤载玻1次并在PBS-T中洗涤一次，在湿润室中用苏木素(hematoxylin)在室温复染1分钟，并再次洗涤，在PBS中1次并在PBS-T中一次，每次洗涤3分钟。然后用Aquatex将盖玻片装到载玻片上。
5.2结果
抗DLL3多克隆抗体在FFPE肺样品中显示出阳性，其中60％的切片显示出稳固的(2+/3+)染色。
因此，针对DLL3的抗体可在一些测试的癌症以及可能在显示DLL3表达的其他癌症类型中具有作为治疗剂和诊断剂的功用。
序列
Figure GDA0000837616500000681
Figure GDA0000837616500000691
Figure IDA0000817898720000011
Figure IDA0000817898720000021
Figure IDA0000817898720000031
Figure IDA0000817898720000041
Figure IDA0000817898720000051
Figure IDA0000817898720000061
Figure IDA0000817898720000071
Figure IDA0000817898720000081
Figure IDA0000817898720000091

Claims (3)

1.双特异性抗体在制备用于在有需要的受试者中治疗癌症的药物中的用途，其中，所述双特异性抗体包括DLL3的第一结合域和CD3的第二结合域，所述癌症是肺癌，且DLL3在所述肺癌中表达。
2.根据权利要求1的用途，其中，所述癌症是小细胞肺癌。
3.根据权利要求1或2的用途，其中，所述双特异性抗体诱发癌症细胞的凋亡、杀死癌症干细胞或减少其数量、和/或杀死循环癌细胞或减少其数量。
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