DLL3调节剂及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月24日提交的美国临时申请号61/603,173和2012年10月29日提交的美国临时申请号61/719,803的优先权,各案通过引用以其全文结合于此。
序列表
本申请含有一份已经以ASCII格式经EFS-Web递交的序列表并且该序列表通过引用以其全文结合于此。所述ASCII复本于2013年2月19日创建,命名为11200.0013-00304_SL.txt并且大小为381,637个字节。
发明领域
本申请总体上涉及诊断、预防、治疗或改善增生性病症及其任何扩张、复发、再发或转移的新颖化合物、组合物及其使用方法。在一个广泛方面,本发明涉及δ样配体3(DLL3)调节剂(包括抗DLL3抗体和融合构建体)的用途,这些调节剂用于治疗、诊断或预防赘生性病症。本发明的所选实施例提供了此类DLL3调节剂(包括抗体药物偶联物)的用途,这些调节剂用于恶性疾病的免疫治疗性治疗,优选地包括肿瘤起始细胞的频率的降低。
发明背景
干细胞和祖细胞分化和细胞增殖是用于在器官发生期间支持组织生长并且在所有活生物体的寿命期间修复大部分组织的正常的正在进行的过程。在这些事件的正常过程中,细胞分化和增殖是通过众多因素和信号进行控制,这些因素和信号一般经过平衡以维持细胞命运决定和组织架构。因此,在很大程度上,这一得到控制的微环境调控了细胞分裂和组织成熟,其中信号是基于该生物体的需求而适当地产生。就这一点来说,细胞增殖和分化通常仅仅视受损或死亡的细胞的替代或者视生长的需要而发生。不幸的是,细胞增殖和/或分化的破坏可以由诸多因素引起,包括例如,不同信号传导化学品的不足或过剩、改变的微环境的存在、遗传突变或其某一组合。当正常细胞增殖和/或分化被打乱或以某种方式破坏时,它可能导致不同疾病或病症,包括增生性病症,如癌症。癌症的常规治疗包括化学疗法、放射疗法、手术、免疫疗法(例如,生物反应改良剂、疫苗或靶向性治疗剂)或其组合。不幸的是,某些癌症对于这些治疗是无反应性或最低反应性的。举例来说,在一些患者中,尽管所选疗法具有总体效用,但肿瘤展现出使其无反应性的基因突变。此外,取决于癌症的类型和它呈现的形式,一些可用的治疗,如手术,可能无法作为可行的替代方案。当试图对曾经历过先前治疗并且随后再发的患者时,当前的医疗标准治疗法中固有的局限是特别显而易见的。在这些情形中,治疗方案失败和由此引起的患者恶化可能引起难治性肿瘤,这些肿瘤本身经常表现为一种侵袭性相对较高的疾病,该疾病最终被证实是不可治愈的。尽管多年来,在癌症的诊断和治疗中已经取得极大改善,但许多实体肿瘤的总体存活率因现有疗法无法预防再发、肿瘤复发及转移而在很大程度上保持不变。因此,开发对于增生性病症更具靶向性并且有效的疗法仍是一个挑战。
发明概述
这些和其他目的是通过本发明提供,在广义上,本发明针对可以用于治疗DLL3相关病症(例如增生性病症或赘生性病症)的方法、化合物、组合物及制品。为此,本发明提供了新颖的δ样配体3(或DLL3)调节剂,这些调节剂有效地靶向肿瘤细胞和/或癌症干细胞,并且可以用于治疗罹患多种恶性疾病的多位患者。如在此将更详细地论述,存在至少两种天然存在的DLL3同功异型物或变体,并且所披露的调节剂可以包含一种同功异型物或另一种同功异型物或两者,或与一种同功异型物或另一种同功异型物或两者选择性缔合。此外,在某些实施例中,所披露的DLL3调节剂可以另外与一个或多个DLL家族成员(例如DLL1或DLL4)反应,或在其他实施例中,可以被产生并且选择以便仅仅与一种或多种DLL3同功异型物缔合或反应。在任何情形中,这些调节剂可以包含识别DLL3基因型或表型决定子(或其片段)、与其相竞争、对其提供激动作用、对其进行拮抗、与其相互作用、与其结合或与其缔合并且调节、调整、改变、调控、变化或改良该DLL3蛋白对一个或多个生理路径的影响,和/或消除DLL3缔合的细胞的任何化合物。因此,在广义上,本发明总体上针对分离的DLL3调节剂和其用途。在优选的实施例中,本发明更特定地针对分离的DLL3调节剂,这些调节剂包含抗体(即,与DLL3的至少一种同功异型物免疫优先地结合、反应或缔合的抗体),在特别优选的实施例中,这些抗体与一种或多种细胞毒性剂缔合或偶联。另外,如以下详尽地论述的,这些调节剂可以用于提供多种可用于预防、诊断或治疗增生性病症(包括癌症)的药物组合物。
在本发明的所选实施例中,DLL3调节剂可以包含一种呈分离的形式,或与其他部分融合或缔合(例如,Fc-DLL3、PEG-DLL3或与靶向性部分缔合的DLL3)的DLL3多肽或其片段。在其他所选实施例中,DLL3调节剂可以包含DLL3拮抗剂,出于本申请的目的,这些拮抗剂应当被视作意谓识别DLL3、与其相竞争、与其相互作用、与其结合或与其缔合并且对包括肿瘤起始细胞在内的赘生性细胞进行中和、消除、减少、敏化、再编程,对其生长进行抑制或控制的任何构建体或化合物。在优选的实施例中,本发明的DLL3调节剂包含抗DLL3抗体,或者其片段或衍生物,已经出乎意料地发现,它们对肿瘤起始细胞繁殖、维持、扩增、增殖或以其他方式促进赘生性细胞存活、复发、再生和/或转移的能力进行沉默、中和、减少、降低、耗竭、缓和、减小、再编程、消除或以其他方式进行抑制。在特别优选的实施例中,这些抗体或免疫反应性片段可以与一种或多种抗癌剂(例如细胞毒性剂)缔合或偶联。
就这些调节剂来说,应理解的是,可相容的抗体可以呈现多种形式中的任一种,包括例如,多克隆和单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、人源化抗体及人类抗体,以及前述各自的免疫反应性片段和/或变体。优选的实施例将包含相对无免疫原性的抗体,如人源化或完全人类构建体。当然,鉴于本披露,本领域的普通技术人员无需过度实验,就可以容易地鉴别出与DLL3抗体调节剂的重链和轻链可变区缔合的一个或多个互补决定区(CDR)并且使用那些CDR来工程改造或制造嵌合、人源化或CDR移植的抗体。因此,在某些优选的实施例中,该DLL3调节剂包含一种抗体,该抗体并入了一个或多个如图11A和11B中所定义的互补决定区(CDR)并且衍生自在此所陈述的连续轻链(图11A)或重链(图11B)鼠类可变区(SEQ ID NOS:20-203)。这些CDR移植的可变区也示于图11中,这些可变区包含SEQ ID NOS:204-213。在优选的实施例中,这些抗体将包含单克隆抗体,并且在甚至更优选的实施例中,将包含嵌合抗体、CDR移植的抗体或人源化抗体。
编码图11A和11B中所陈述的每一氨基酸序列的示例性核酸序列在序列表中附上并且包含SEQ ID NOS:220到413。就这一点来说,应理解的是,本发明另外包含编码所披露的抗体可变区氨基酸序列(包括所附序列表中所陈述的那些)的核酸分子(和相关构建体、载体及宿主细胞)。更明确地说,在所选实施例中,可相容的DLL3调节剂可以包含一种抗体,该抗体具有一个轻链可变区和一个重链可变区,其中所述轻链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如以下各项中所陈述的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:202,并且其中所述重链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如以下各项中所陈述的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201及SEQ ID NO:203。在其他优选的实施例中,这些所选调节剂将包含与以上提到的鼠类序列包含65%、70%、75%或80%的一致性的重链和轻链可变区。在又其他实施例中,这些调节剂将包含与所披露的鼠类序列包含85%、90%或甚至95%的一致性的重链和轻链可变区。
在其他优选的实施例中,这些所选的调节剂将包含从前述轻链和重链可变区氨基酸序列中的任一种获得的一个或多个CDR。因此,本发明的所选实施例包括包含来自SEQ ID NOS:20到203中的任一种的一个或多个CDR的一种DLL3调节剂。在又其他实施例中,本发明的调节剂将包含与任何前述调节剂竞争结合的任何抗体或其免疫反应性片段。
本发明的另一个方面包含获自或衍生自SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.39、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150的调节剂。在其他实施例中,本发明将包含一种具有来自任何以上提到的调节剂的一个或多个CDR的一种DLL3调节剂。
在又其他可相容的实施例中,本发明将包含CDR移植的或人源化的DLL3调节剂hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56。又其他实施例针对一种DLL3调节剂,该调节剂包含一种人源化抗体,其中所述人源化抗体包含一个轻链可变区和一个重链可变区,其中所述轻链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210及SEQ ID NO:212中所陈述的氨基酸序列组成,并且其中所述重链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211及SEQ ID NO:213中所陈述的氨基酸序列组成。此外,如以上刚刚描述的,编码这些人源化重链和轻链可变区的核酸序列在所附序列表中以SEQ ID NOS:404-413陈述。
除以上提到的多个方面外,本发明的其他优选实施例将包含与一种或多种药物缔合或偶联以提供调节剂偶联物的DLL3调节剂,这些偶联物可以特别有效地治疗增生性病症(单独或与其他药物活性剂组合)。更总体而言,一旦制造并选择了本发明的调节剂,就可以将其与药物活性或诊断部分或生物可相容的改良剂连接、融合、偶联(例如,共价或非共价地)或以其他方式缔合。如在此所使用,术语“偶联物”或“调节剂偶联物”或“抗体偶联物”将被广泛使用并且被视作意谓与所披露的调节剂缔合的任何生物活性或可检测分子或药物,不管缔合方法如何。就这一点来说,应了解的是,这些偶联物除所披露的调节剂外,还可以包含肽、多肽、蛋白质、在体内代谢成一种活性剂的前药、聚合物、核酸分子、小分子、结合剂、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子及放射性同位素。另外,如以上所指示,所选偶联物可以与该调节剂共价或非共价缔合或连接,并且至少部分取决于用于实现该偶联的方法而展现不同的化学计量的摩尔比率。
本发明的特别优选的方面将包含抗体调节剂偶联物或抗体-药物偶联物,这些偶联物可以用于诊断和/或治疗增生性病症。这些偶联物可以通过公式M-[L-D]n表示,其中M代表一种所披露的调节剂或靶结合部分,L是一种任选的连接子或连接子单元,D是一种可相容的药物或前药,并且n是从约1到约20的一个整数。应理解的是,除非上下文另外规定,否则术语“抗体-药物偶联物”或“ADC”或公式M-[L-D]n应当被视作涵盖同时包含治疗部分和诊断部分的偶联物。在这些实施例中,抗体-药物偶联物化合物将典型地包含作为调节剂单元(M)的抗DLL3、一个治疗或诊断部分(D),及将该药物与该抗原结合剂相接合的任选地一个连接子(L)。在一个优选的实施例中,该抗体为一种DLL3mAb,它包含至少一个来自如以上所描述的重链和轻链可变区的CDR。
如先前所指示,本发明的一个方面可以包含DLL3多肽与癌症干细胞的出乎意料的治疗性缔合。因此,在某些其他实施例中,本发明将包含一种DLL3调节剂,该调节剂在给与一名受试者之后使肿瘤起始细胞的频率降低。优选地,该频率的降低将使用体外或体内限制性稀释分析来测定。在特别优选的实施例中,此类分析可以使用体内限制性稀释分析来进行,该分析包括将活的人类肿瘤细胞移植到免疫功能低下的小鼠中(例如,参见以下实例17)。作为替代方案,该限制性稀释分析可以使用体外限制性稀释分析来进行,该分析包括将活的人类肿瘤细胞限制性稀释沉积于体外集落支持条件中。在任一情形中,有关该频率的降低的分析、计算或定量将优选地包含使用泊松分布统计学来提供一个准确的核算。应理解的是,尽管这些定量方法是优选的,但也可以使用其他劳动密集性更低的方法,如流式细胞术或免疫组织化学,来提供所希望的值,并且因此,这些方法明确地涵盖在本发明的范围内。在这些情形中,该频率的降低可以使用对已知肿瘤起始细胞富集的肿瘤细胞表面标记物进行流式细胞分析或免疫组织化学检测来测定。
因此,本发明的另一个优选实施例包含一种治疗DLL3相关病症的方法,该方法包括向一位有需要的受试者给与一种治疗有效量的DLL3调节剂,藉此使肿瘤起始细胞的频率降低。优选地,该DLL3相关病症包含一种赘生性病症。又,该肿瘤起始细胞频率的降低将优选地使用体外或体内限制性稀释分析来测定。
就这一点来说,应理解的是,本发明至少部分基于以下发现:DLL3免疫原在治疗上与肿瘤保持细胞(即,癌症干细胞)相关联,这些细胞涉及包括赘瘤在内的不同增生性病症的病因学。更具体地说,本申请出乎意料地证实,给与不同的示例性DLL3调节剂可以介导、减少、耗竭、抑制或消除由肿瘤起始细胞引起的肿瘤发生信号传导(即,降低肿瘤起始细胞的频率)。这一减少的信号传导,无论是通过这些肿瘤起始细胞的耗竭、中和、减少、消除、再编程或沉默还是通过改变肿瘤细胞形态(例如诱导的分化、小生境破坏)引起,又允许通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持、扩张和/或转移及复发来对DLL3相关病症进行更有效的治疗。
除以上提到的与癌症干细胞关联之外,有证据证实,DLL3同功异型物可能牵涉到包含或展现神经内分泌特征或决定子(基因型或表型)的肿瘤的生长、复发或转移潜力。出于本发明的目的,这些肿瘤将包含神经内分泌肿瘤和假神经内分泌肿瘤。因此,使用在此描述的新颖DLL3调节剂干预这些肿瘤发生细胞的增殖可以通过超过一种机制(例如,肿瘤起始细胞减少和致癌路径信号传导的破坏)提供加和或协同作用来改善或治疗一种病症。又其他优选的实施例可以利用细胞表面DLL3蛋白的细胞内化来传递一种调节剂介导的抗癌剂。就这一点来说,应理解的是,本发明不受任何特定作用机制的限制,而是涵盖所披露的调节剂治疗DLL3相关病症(包括不同赘瘤)的广泛用途。
因此,在其他实施例中,本发明将包含所披露的调节剂治疗一位有需要的受试者的包含神经内分泌特征的肿瘤的用途。当然,这些调节剂可以用于这些相同的肿瘤的预防、预后、诊断、治疗诊断、抑制或维持疗法。
本发明的其他方面利用了所披露的调节剂潜在地破坏致癌路径(例如,Notch),同时使肿瘤起始细胞沉默的能力。这些多活性DLL3调节剂(例如DLL3拮抗剂)当与医疗标准抗癌剂或减瘤剂组合使用时,可以证明是特别有效的。因此,本发明的优选实施例包含在初始治疗之后,使用所披露的调节剂作为维持疗法的抗转移剂。此外,根据本传授内容,可以组合使用两种或更多种DLL3拮抗剂(例如,特异性结合到DLL3上的两个离散表位的抗体)。另外,如以下相当详细地论述的,使用的本发明的DLL3调节剂可以呈一种偶联或未偶联状态,并且任选地,作为一种敏化剂与多种化学或生物抗癌剂组合。
因此,本发明的另一个优选实施例包含一种使受试者体内的肿瘤敏感用于用抗癌剂进行治疗的方法,该方法包括向所述受试者给与一种DLL3调节剂的步骤。其他实施例包含一种在治疗之后减少转移或肿瘤复发的方法,该方法包括向一位有需要的受试者给与一种DLL3调节剂。在本发明的一个特别优选的方面,如使用体外或体内限制性稀释分析所测定,该DLL3调节剂将特定地引起肿瘤起始细胞频率的降低。
更总体来说,本发明的优选实施例包含一种治疗有需要的受试者的DLL3相关病症的方法,该方法包括向该受试者给与一种DLL3调节剂的步骤。在特别优选的实施例中,该DLL3调节剂将与一种抗癌剂缔合(例如,偶联)。在又其他实施例中,该DLL3调节剂在与该细胞表面上或附近的DLL3缔合或结合之后将内化。另外,不管该受试者肿瘤组织如与正常邻近组织相比较是展现升高的DLL3水平,还是降低或减低的DLL3水平,都可以实现本发明的有益方面,包括信号传导路径的任何破坏和间接益处。特别优选的实施例将包含如与正常组织或非肿瘤发生细胞相比较,在肿瘤发生细胞上展现升高的DLL3水平的病症的治疗。
在又另一个方面,本发明将包含一种治疗罹患赘生性病症的受试者的方法,该方法包括给与治疗有效量的至少一种内化性DLL3调节剂的步骤。优选的实施例将包含内化性抗体调节剂的给与,其中这些调节剂与一种细胞毒性剂偶联或缔合。
其他实施例针对一种治疗罹患DLL3相关病症的受试者的方法,该方法包括给与治疗有效量的至少一种耗竭性DLL3调节剂的步骤。
在又另一个实施例中,本发明提供了维持疗法的方法,其中在被设计用于去除至少一部分肿块的一种初始程序(例如,化学治疗、放射或手术)之后,在一段时间内给与所披露的效应物或调节剂。这些治疗维持方案可以在数周时间、数月时间或甚至是数年时间内给与,其中这些DLL3调节剂可以起预防作用以抑制转移和/或肿瘤复发。在又其他实施例中,所披露的调节剂可以联合已知的减瘤方案给与,以预防或延迟转移、肿瘤维持或复发。
如先前所暗指的,本发明的DLL3调节剂可以被制造和/或选择用来与DLL3的两种同功异型物或该蛋白质的单一同功异型物反应,或相反地,可以包含一种全DLL调节剂,除DLL3外,该调节剂还与至少一个另外的DLL家族成员反应或缔合。更具体地说,可以产生并选择优选的调节剂(如抗体),以使得它们与仅DLL3展现的结构域(或其中的表位)或与在多个或所有DLL家族成员间至少有些保守的结构域反应。
在又其他优选实施例中,这些调节剂将与DLL3的一个特定表位、部分、基元或结构域缔合或结合。如将在以下相当详细地论述的,两种DLL3同功异型物并入了一个一致的细胞外区域(参见图1F),该区域包含至少一个N末端结构域、一个DSL(δ/Serrate/lag-2)结构域及六个EGF样结构域(即,EGF1-EGF6)。因此,在某些实施例中,这些调节剂将与DLL3的N末端结构域(即,成熟蛋白质中的氨基酸27-175)结合或缔合,而在其他所选实施例中,这些调节剂将与该DSL结构域(即,氨基酸176-215)或其中的表位缔合。本发明的其他方面包含与位于DLL3的一个特定EGF样结构域中的一个特定表位缔合或结合的调节剂。就这一点来说,该特定调节剂可以与位于EGF1(氨基酸216-249)、EGF2(氨基酸274-310)、EGF3(氨基酸312-351)、EGF4(氨基酸353-389)、EGF5(氨基酸391-427)或EGF6(氨基酸429-465)中的一个表位缔合或结合。当然,应理解的是,以上提到的结构域各自可以包含超过一个表位和/或超过一个面元(bin)。在特别优选的实施例中,本发明将包含与该DSL结构域或其中的一个表位结合、反应或缔合的一种调节剂。在其他优选的实施例中,本发明将包含与一个特定的EGF样结构域或其中的一个表位结合、反应或缔合的多种调节剂。在又其他优选的实施例中,这些调节剂将与N末端结构域或其中的一个表位结合、反应或缔合。
就调节剂或抗体“面元”来说,应理解的是,该DLL3抗原可以使用本领域认可的技术,通过竞争性抗体结合来分析或定位以确定位于该蛋白质上或沿该蛋白质的特定面元。尽管在此更详细地论述并且以下在实例9和10中显示,但如果两种抗体(其中一种可以称为一种“参考抗体”、“面元划界抗体”或“划界抗体”)彼此竞争与靶抗原的结合,那么它们可以视为在同一面元中。在这些情形中,主题抗体表位可以一致、实质上一致或足够接近(在它们通过数个氨基酸隔开的线性意义上或在构象上),以致两种抗体在空间上或在静电上被抑制或阻止与该抗原结合。这些确定的面元一般可以与某些DLL3结构域缔合(例如,该参考抗体将与一个特定结构域中所含的一个表位结合),不过该相关性不总是精确的(例如,在一个结构域中可以存在超过一个面元或该面元可以是构象上确定的并且包含超过一个结构域)。应理解的是,本领域的普通技术人员可以容易地确定这些DLL3结构域与凭经验确定的面元之间的关系。
就本发明来说,使用本领域认可的技术(例如,ELISA、表面等离子共振或生物层干涉)进行的竞争性结合分析确定了至少九个相异的面元,发现这些面元各自含有多种抗体调节剂。出于本披露的目的,这九个面元称为面元A到面元I。因此,在所选实施例中,本发明将包含驻留在选自下组的一个面元中的一种调节剂,该组由以下各项组成:面元A、面元B、面元C、面元D、面元E、面元F、面元G、面元H及面元I。在其他实施例中,本发明包含驻留在通过一种参考抗体所确定的一个面元中的一种调节剂,该参考抗体选自下组,该组由以下各项组成:SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.39、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。在又其他实施例中,本发明将包含来自面元A的调节剂、来自面元B的调节剂、来自面元C的调节剂、来自面元D的调节剂、来自面元E的调节剂、来自面元F的调节剂、来自面元G的调节剂、来自面元H的调节剂或来自面元I的调节剂。又其他优选的实施例将包含一种参考抗体调节剂及与该参考抗体竞争的任何抗体。
术语“竞争”或“竞争抗体”当在所披露的调节剂的上下文中使用时意谓如通过一种检验所测定的抗体之间的结合竞争,在该检验中,一种参考抗体或免疫功能片段实质上防止或抑制(例如,大于40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%)一种测试抗体与一种共同抗原的特异性结合。用于测定此类竞争的可相容的方法包含本领域中已知的技术,如例如双层干涉法、表面等离子共振、流式细胞术、竞争性ELISA等。
除以上提到的调节剂外,在所选实施例中,本发明包含一种全DLL调节剂,该调节剂与DLL3和至少一个其他DLL家族成员缔合。在其他所选实施例中,本发明包含一种DLL3调节剂,它与DLL3的一种或多种同功异型物免疫特异性缔合,但不与任何其他DLL家族成员免疫特异性缔合。在又其他实施例中,本发明包含一种治疗有需要的受试者的方法,该方法包括给与一种治疗有效量的全DLL调节剂。又其他实施例包含一种治疗有需要的受试者的方法,该方法包括给与一种治疗有效量的DLL3调节剂,该调节剂与DLL3的一种或多种同功异型物免疫特异性缔合,但不与任何其他DLL家族成员免疫特异性缔合。
除以上论述的治疗用途外,还应理解的是,本发明的调节剂可以用于对DLL3相关病症并且特别是增生性病症进行检测、诊断或分类。它们还可以用于这些病症的预后和/或治疗诊断。在一些实施例中,该调节剂可以给与该受试者并且在体内进行检测或监测。本领域的普通技术人员将理解,这些调节剂可以用如以下所披露的效应物、标记物或报告子进行标记或与其缔合,并且使用多种标准技术(例如,MRI、CAT扫描、PET扫描等)中的任一种进行检测。
因此,在一些实施例中,本发明将包含一种在体内诊断、检测或监测有需要的受试者的DLL3相关病症的方法,该方法包括给与一种DLL3调节剂的步骤。
在其他情况下,这些调节剂可以被用于一种使用本领域认可的程序(例如,免疫组织化学或IHC)的体外诊断环境中。因此,一个优选的实施例包含一种诊断有需要的受试者的过度增生性病症的方法,该方法包括以下步骤:
a.从所述受试者获得一份组织样品;
b.使该组织样品与至少一种DLL3调节剂接触;并且
c.对与该样品缔合的DLL3调节剂进行检测或定量。
这些方法可以结合本申请容易地分辨,并且可以容易地使用一般可用的商业技术,如自动读板器、专用报告子系统等进行。在所选实施例中,该DLL3调节剂将与该样品中存在的肿瘤保持细胞(即,癌症干细胞)缔合。在其他优选的实施例中,该检测或定量步骤将包含肿瘤起始细胞频率的一种降低,这可以如在此所描述进行监测。
在一种类似情形(vein)中,本发明还提供了可用于诊断并监测DLL3相关病症(如癌症)的试剂盒或装置及相关方法。为此,本发明优选地提供一种可用于检测、诊断或治疗DLL3相关病症的制品,该制品包括含有一种DLL3调节剂的一个容器及有关使用所述DLL3调节剂治疗、监测或诊断该DLL3相关病症的指导材料。在所选实施例中,这些装置和相关方法将包括接触至少一个循环的肿瘤细胞的步骤。
本发明的其他优选实施例还利用了所披露的调节剂作为一种仪器的特性,该仪器可用于通过如免疫组织化学、流式细胞分析(包括荧光活化的细胞分选(FACS))或激光介导的切割等方法对肿瘤起始细胞群或亚群进行鉴别、表征、分离、分组(sectioning)或富集。
因此,本发明的另一个优选的实施例针对一种对肿瘤起始细胞群进行鉴别、分离、分组(sectioning)或富集的方法,该方法包括使所述肿瘤起始细胞与一种DLL3调节剂接触的步骤。
前述是一种概述并因此,在必要时,含有简化、概括及细节的省略;因此,本领域的普通技术人员将理解,该概述只是说明性的并且不打算以任何方式限制。在此描述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题内容的其他方面、特征及优势将于在此所陈述的传授内容而变得显而易见。提供的概述以一种简化的形式介绍了众多观念的一种选择,以下在详细说明中将对其作进一步描述。这一概述不打算鉴别所要求的主题内容的关键特征或基本特征,也不打算被用作确定所主张的主题内容的范围一种辅助手段。
附图简要说明
图1A-1F是包括核酸或氨基酸序列在内的DLL3的不同表示,其中含有编码DLL3同功异型物的ORF(带下划线)的全长mRNA描绘于图1A和1B(SEQ ID NOS:1和2)中,图1C和1D对应地提供了图1A和1B中所表示的ORF的翻译(SEQ ID NOS:3和4),其中带下划线的残基指示每种蛋白质同功异型物的预测的跨膜结构域,图1E描绘了这两种蛋白质同功异型物的比对,说明了每种同功异型物细胞质末端的序列差异,又其中带下划线的残基指示预测的跨膜结构域,并且图1F提供了DLL3蛋白细胞外区域的一种示意性表示,图解了不同结构域的位置;
图2A和2B是人类基因组中DLL3与其他δ样家族成员之间(图2A),或DLL3的最接近人类的同功异型物与恒河猴、小鼠及大鼠DLL3蛋白之间(图2B)在蛋白质水平上的一致性百分比的表格表示;
图3示意性图解了与导致神经内分泌或非神经内分泌表型的细胞命运选择相关的若干“主要”基因之间的遗传相互作用(箭头指示基因表达的促进作用并且条状的箭头指示基因表达的抑制作用),其中转录因子ASCL1的表达起始了一个导致神经内分泌表型的基因级联(空心箭头),同时活化了DLL3,该活化又抑制NOTCH1和其效应物HES1,这两者通常负责ASCL1的抑制和导致非神经内分泌表型的基因级联的活化;
图4A和4B是DLL3的基因表达水平的表格(图4A)和图形(图4B)描绘,并且在图4A中为如使用衍生自肿瘤细胞亚群或正常组织的RNA的全转录组(SOLiD)测序所测量的其他Notch路径基因或与内分泌表型相关的基因;
图5是如在衍生自肺癌的所选非传统异种移植(NTX)肿瘤中通过全转录组(SOLiD)测序所测定的DLL3mRNA转录物变体1和2的相对表达水平的图形描绘;
图6A-6D示出了展现神经内分泌特征的肿瘤的基因表达数据和群集,其中图6A描绘了包含所选肿瘤和正常对照组织的46个肿瘤株和2种正常组织的微阵列分布的无监督群集,图6B和6C是对应于与神经内分泌表型(图6B)或Notch信号传导路径(图6C)相关的所选基因的相对表达水平的归一化强度值的表格表示,其中没有阴影的细胞和相对较小的数字指示极少到无表达,并且更暗的细胞和相对更大的数字指示更高的表达水平,并且图6D是示出了如使用qRT-PCR所测量的在不同肿瘤和正常组织中HES6mRNA的相对表达水平的图形表示;
图7是示出了在从正常组织、原代、未传代患者肿瘤试样(以“p0”表示),或衍生自肺、肾及卵巢赘瘤的块状NTX肿瘤分离的多种RNA样品中如通过qRT-PCR测量的DLL3转录物的相对表达水平的图形表示,其中特定NTX肺肿瘤是通过小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)分组(用p1、p2、p3或p4表示以反映通过小鼠传代的次数),其中肿瘤类型是使用以上所陈述的缩写表示;
图8A-8C是示出了在来自患有十八种不同实体肿瘤类型之一的患者的完整肿瘤试样(灰白色点)或相配的正常相邻组织(NAT;白色点)中如通过qRT-PCR所测量的人类DLL3的相对(图8A)或绝对(图8B)基因表达水平的图形表示,而图8C示出了如使用电化学发光夹心ELISA检验所测量的人类DLL3的相对蛋白质表达;
图9提供了在衍生自肾、卵巢及小细胞肺NTX肿瘤的个别人类肿瘤细胞群中不同Notch受体和配体(例如DLL1、DLL4)的表面蛋白质表达的基于流式细胞术的测定的图形表示,这些肿瘤是参照荧光补偿(FMO)同型对照染色的群体(实心灰色)以直方图(黑线)呈现,其中指示了平均荧光强度(MFI);
图10A-10D对应地提供了克隆到慢病毒表达载体中的编码成熟鼠类DLL3蛋白的cDNA序列(图10A;SEQ ID NO:5)和氨基酸序列(图10B;SEQ ID NO:6)及克隆到慢病毒表达载体中的编码成熟食蟹猕猴DLL3蛋白的cDNA序列(图10C;SEQ ID NO:7)和氨基酸序列(图10D;SEQ ID NO:8),其中这些载体被用于产生过表达鼠类和食蟹猕猴DLL3的细胞;
图11A和11B以表格形式提供了如在此的实例中所描述进行分离、克隆并工程改造的多种鼠类和人源化示例性DLL3调节剂的轻链和重链可变区的连续氨基酸序列(SEQ ID NOS:20-213);
图12陈述了示例性DLL3调节剂的生物化学和免疫学特性,以及它们在体外杀灭KDY66NTX细胞的能力,如以表格形式表示;
图13A-13C图解了所选调节剂的结合特征,其中图13A和13B示出了使用表面等离子共振得到的所选鼠类调节剂和其人源化对应物的比较性结合特征,而图13C以表格形式提供了人源化构建体的某些特性;
图14A和14B对应地以示意性和图形的形式描绘了如在此的实例中所描述进行分离、克隆并工程改造的示例性DLL3调节剂的结构域水平定位分析的结果(图14A),以及所选调节剂的结合结构域与在体外杀灭表达KDY66NTX细胞的DLL3的能力之间的相关性(图14B);
图15A-15C是流式细胞术直方图,示出了在天然293细胞(图15A)、工程改造成过表达人类DLL3蛋白的293细胞(h293-hDLL3;图15B)或工程改造成过表达鼠类DLL3蛋白的293细胞(h293-mDLL3;图15C)上使用示例性抗DLL3调节剂SC16.56进行的DLL3表达;
图16A-16F包含流式细胞术直方图(图16A-16C)和呈表格形式的免疫组织化学结果(图16D-16F),对应地图解了在来自卵巢(OV26;图16A)、肾(KDY66;图16B)及肺大细胞神经内分泌癌瘤(LU37;图16C)NTX肿瘤的活人类细胞上使用示例性抗DLL3调节剂SC16.56进行的相对较高的DLL3表面表达,以及在不同NTX肿瘤(图16D)和原发小细胞癌瘤(图16F)肿瘤细胞中DLL3蛋白的表达,同时证实,正常组织缺乏DLL3表达(图16E);
图17A-17C图解了所披露的调节剂将细胞毒性载荷有效地引导到表达DLL3的细胞的能力,其中图17A证明了示例性调节剂杀灭KDY66NTX肿瘤或过表达hDLL3的293细胞的能力,并且图17B和17C证实了所披露的调节剂将细胞毒性载荷递送到OV26(图17B)和LU37(图17C)的能力,其中向下倾斜的曲线是通过内化的细胞毒素进行细胞杀灭的指示;
图18A-18E图解了所披露的调节剂的不同特性,其中图18A和18C通过流式细胞术证实,DLL3NSHP KDY66和天然KDY66具有DLL3的表达,而在DLL3HP2KDY66细胞中DLL3的表达被有效地敲除,图18B显示,DLL3HP2肿瘤细胞的生长落后于天然KDY66细胞,并且图18D和18E证实,本发明的偶联实施例免疫特异性靶向并杀灭表达DLL3的KDY66肿瘤细胞,但不靶向并杀灭敲除了DLL3的KDY66;
图19A-19C显示了本发明的所选偶联实施例在体内杀灭和/或抑制示例性肺肿瘤发生细胞的生长的能力;
图20A-20F描绘了本发明的偶联调节剂在体内实质上根除肿瘤并预防肿瘤复发的能力—实现了移入示例性卵巢肿瘤(图20A)、肺肿瘤(图20B-20D)及肾肿瘤(图20E和20F)的免疫缺陷小鼠的持久缓解;并且
图21A-21F证实,如通过针对两种示例性小细胞肺肿瘤LU95(图21A-21C)和LU64(图21D-21F)的限制性稀释检验(LDA)所测定,本发明的偶联调节剂使癌症干细胞的频率降低,其中图21A和21D示出了这些偶联物对肿瘤生长的影响,图21B和21E示出了LDA的结果,并且图21C和21F以图形呈现了通过用所选抗DLL3抗体偶联物治疗所引起的癌症干细胞频率的降低。
发明详细说明
I.引言
尽管可以按许多不同的方式实施本发明,但在此披露了其具体的说明性实施例,这些实施例举例说明了本发明的原理。应当强调的是,本发明不限于所说明的这些具体的实施例。另外,在此使用的任何章节标题只是出于组织的目的,而不应解释为限制所描述的主题内容。最后,除非另外指出,否则出于本披露的目的,所有标识的序列登记号都可以见于NCBI参考序列(RefSeq)数据库和/或NCBI档案序列数据库。
如以上所论述,已经意外地发现,DLL3基因型和/或表型决定子与不同的增生性病症(包括展现神经内分泌特征的赘瘤)相关联,并且DLL3和其变体或同功异型物提供了可以用于治疗相关疾病的有用肿瘤标记物。另外,如本申请中所示,已经出乎意料地发现,DLL3标记物或决定子(如细胞表面DLL3蛋白)在治疗上与癌症干细胞(又称为肿瘤保持细胞)相关联并且可以被有效地用于使癌症干细胞消除或沉默。选择性减少或消除癌症干细胞(例如,通过使用偶联的DLL3调节剂)的能力特别令人意外是因为已知这些细胞一般对许多常规治疗具有抗性。也就是说,传统以及更近期的靶向性治疗方法的效用经常受到抗性癌症干细胞的存在和/或出现的限制,这些癌症干细胞甚至在面临这些各样的治疗方法时也能够保持肿瘤生长。另外,与癌症干细胞相关联的决定子因表达量低或不一致、无法保持与肿瘤发生细胞的关联或无法存在于细胞表面处而经常产生较弱的治疗靶。与现有技术的传授内容形成鲜明的对比,本披露的化合物和方法有效地克服了这一固有的抗性并且使这些癌症干细胞的分化特异性消除、耗竭、沉默或促进,藉此打消了它们的持续或再诱导潜在肿瘤生长的能力。另外,由于DLL3蛋白的表达在很大程度上已经与细胞内位置(如高尔基体)相关联,故不确定的是,表型决定子可以如在此所传授作为治疗靶而被成功地利用。
因此,特别值得注意的是,DLL3调节剂(如在此所披露的那些)可以被有利地用于有需要的受试者的所选增生性(例如赘生性)病症的预后、诊断、治疗诊断、治疗和/或预防。应理解的是,尽管以下,特别是在特定结构域、区域或表位方面,或在包含神经内分泌特征的癌症干细胞或肿瘤及它们与所披露的调节剂的相互作用的上下文中将详尽地论述本发明的优选实施例,但本领域的普通技术人员应理解的是,本发明的范围不受这些示例性实施例限制。相反地,本发明的最广泛的实施例和所附权利要求广泛地并且明确地针对DLL3调节剂(包括偶联的调节剂)和它们在多种DLL3相关或介导的病症(包括赘生性或细胞增殖性病症)的预后、诊断、治疗诊断、治疗和/或预防方面的用途,不管任何特定的作用机制或特异性靶向的肿瘤、细胞或分子组分如何。
为此,并且如本申请中所证实的,已经出乎意料地发现,所披露的DLL3调节剂可以被有效地用于靶向并消除增殖性或肿瘤发生细胞或以其他方式使其失能,并且治疗DLL3相关病症(例如赘瘤)。如在此所使用,“DLL3相关病症”应当被视作意谓在疾病或病症的过程或病因学期间,通过DLL3遗传组分或表达(“DLL3决定子”)的表型或基因型异常来标记、诊断、检测或鉴别的任何病症或疾病(包括增生性病症)。就这一点来说,DLL3表型异常或决定子可以例如包含DLL3蛋白表达的水平升高或减低、在某些可确定的细胞群上的异常DLL3蛋白表达或在细胞生命周期的不当时期或阶段时的异常DLL3蛋白表达。当然,应理解的是,DLL3基因型决定子(例如,mRNA转录水平)的类似表达模式也可以用于对DLL3病症进行分类、检测或治疗。
如在此所使用,术语“决定子”或“DLL3决定子”应当意谓可鉴别地与特定细胞、细胞群或组织相关联,或者特定地见于特定细胞、细胞群或组织中或其上的任何可检测的性状、特性、标记物或因素,包括在受DLL3相关疾病或病症影响的组织、细胞或细胞群之中或之上鉴别的那些。在所选的优选实施例中,这些DLL3调节剂可以直接地与该DLL3决定子(例如细胞表面DLL3蛋白或DLL3mRNA)缔合、结合或反应,并藉此改善该病症。更总体而言,决定子可以是形态性的、功能性的或生物化学性的,并且可以是基因型或表型。在其他优选实施例中,该决定子是由特定细胞类型(例如癌症干细胞)或由细胞在某些条件下(例如在该细胞周期的特定时间期间或在特定小生境中的细胞)有差别地或优先地表达(或不表达)的一种细胞表面抗原或遗传组分。在又其他优选实施例中,该决定子可以包含在特定细胞或离散的细胞群中受到不同地调控(上调或下调)的一种基因或遗传实体、针对物理结构和化学组成进行有差别地修饰的一种基因,或与显示出有差别的化学修饰的基因物理地关联的一种蛋白质或蛋白质集合。在此涵盖的决定子特定地被视作呈阳性或阴性,并且可以通过其存在(阳性)或不存在(阴性)来表示一种细胞、细胞亚群或组织(例如肿瘤)。
在一种类似情形中,本发明的“DLL3调节剂”广泛地包含对DLL3变体或同功异型物(或其特定结构域、区域或表位)或其遗传组分进行识别、与其反应、与其相竞争、对其进行拮抗、与其相互作用、与其结合、对其提供激动作用或与其缔合的任何化合物。通过这些相互作用,这些DLL3调节剂可以有利地消除、降低或缓和肿瘤发生细胞(例如,肿瘤保持细胞或癌症干细胞)的频率、活性、复发、转移或迁移率。在此披露的示例性调节剂包含核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽或多肽。在某些优选实施例中,所选调节剂将包含针对DLL3蛋白同功异型物或者其免疫反应性片段或衍生物的抗体。这些抗体可以是拮抗性或激动性的,并且可以任选地与一种治疗或诊断剂偶联或缔合。另外,这些抗体或抗体片段可以包含对多种抗体进行耗竭、中和或内化。在其他实施例中,在本发明范围内的调节剂将构成一种包含DLL3同功异型物或其反应性片段的DLL3构建体。应理解的是,这些构建体可以包含融合蛋白,并且可以包括来自如免疫球蛋白等其他多肽的反应性结构域或生物反应改良剂。在又其他方面,该DLL3调节剂将包含一个在基因组水平上发挥所希望的作用的核酸部分(例如,miRNA、siRNA、shRNA、反义构建体等)。与本传授内容可相容的又其他调节剂将于以下详细地论述。
更总体而言,本发明的DLL3调节剂广泛地包含对包括细胞表面DLL3蛋白在内的DLL3决定子(基因型或表型)进行识别、与其反应、与其相竞争、对其进行拮抗、与其相互作用、与其结合、对其提供激动作用或与其缔合的任何化合物。不管最终选择何种形式的调节剂,它在引入受试者中之前优选地处于一种分离并且纯化的状态。就这一点来说,术语“分离的DLL3调节剂”或“分离的DLL3抗体”应当在广义上并且根据标准药学实践进行解释,意味着包含处于实质上不含不想要的污染物(生物或其他方面)的状态的调节剂的任何制剂或组合物。另外,必要时,这些制剂可以使用不同的本领域认可的技术进行纯化并配制。当然,应理解的是,必要时,这些“分离的”制剂可以有意地与惰性或活性成分一起配制或组合以改进成品的商业、制造或治疗方面,并且提供药物组合物。在更广泛的含义上,这些综合考虑可以适用于“分离的”DLL3同功异型物或编码其的“分离的”核酸。
另外,已经意外地发现,与特定DLL3结构域、基元或表位相互作用、缔合或结合的调节剂在消除肿瘤发生细胞和/或使癌症干细胞对肿瘤生长或繁殖的影响沉默或衰减方面尤其有效。也就是说,与邻近于细胞表面的结构域(例如,EGF样结构域之一)反应或缔合的调节剂在耗竭或中和肿瘤发生细胞方面有效,同时已经出乎意料地发现,与相对更远离细胞表面的结构域、基元或区域缔合或结合的调节剂在使肿瘤发生细胞消除、中和、耗竭或沉默方面也有效。明确地说,并且如所附实例中所示,已经发现,与DLL3蛋白的DSL或N末端区反应、缔合或结合的调节剂意外地在消除或中和肿瘤发生细胞(包括展现内分泌特征的那些和/或癌症干细胞)方面有效。这对于包含细胞毒性剂的偶联的调节剂(如例如抗DLL3抗体药物偶联物)尤其如此。因此,应理解的是,本发明的某些优选实施例针对包含DLL3调节剂的化合物、组合物及方法,这些调节剂与DLL3的相对较远的部分(包括DSL结构域和N末端区)缔合、结合或反应。
尽管本发明清楚地涵盖任何DLL3调节剂在治疗任何DLL3病症(包括任何类型的赘瘤)方面的用途,但在特别优选的实施例中,所披露的调节剂可以用于对包括神经内分泌肿瘤在内的包含神经内分泌特征(基因型或表型)的肿瘤进行预防、治疗或诊断。真性或“典型神经内分泌肿瘤”(NET)由弥散性内分泌系统引起并且典型地为高度侵袭性的。神经内分泌肿瘤发生于肾、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(胃、结肠)、甲状腺(髓样甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤和大细胞神经内分泌癌瘤)中。另外,所披露的调节剂可以有利地用于治疗、预防或诊断假神经内分泌肿瘤(pNET),这些肿瘤在基因型上或表型上模拟、包含、类似或展现与典型神经内分泌肿瘤共同的性状。“假神经内分泌肿瘤”是由弥散神经内分泌系统的细胞或由神经内分泌分化级联已经在癌发生过程期间异常地再活化的细胞引起的肿瘤。这些pNET常常与传统上确定的神经内分泌肿瘤共有某些基因型、表型或生物化学特征,包括产生多种生物活性胺、神经递质及肽激素的子集的能力。因此,出于本发明的目的,短语“包含神经内分泌特征的肿瘤”或“展现神经内分泌特征的肿瘤”应当被视作包含神经内分泌肿瘤和假神经内分泌肿瘤两者,除非上下文另外规定。
除与以上总体上论述的肿瘤相关联外,还存在所选肿瘤起始细胞(TIC)与DLL3决定子之间表型或基因型关联的指示。就这一点来说,当与正常组织和非肿瘤发生细胞(NTG)相比较时,所选TIC(例如,癌症干细胞)可以表达升高的水平的DLL3蛋白,这些TIC一起典型地构成实体肿瘤的大部分。因此,DLL3决定子可以包含一种肿瘤相关标记物(或者抗原或免疫原)并且所披露的调节剂可以提供多种用于检测并抑制因细胞表面上或肿瘤微环境中这些蛋白质的含量改变而引起的TIC和相关赘瘤的有效药剂。因此,DLL3调节剂,包括与这些蛋白质缔合、结合或反应的免疫反应性拮抗剂和抗体,可以有效地降低肿瘤起始细胞的频率,并且可以用于使这些肿瘤起始细胞消除、耗竭、失能、减少,促进其分化,或以其他方式排除或限制这些细胞保持休眠状态和/或继续为患者体内的肿瘤生长、转移或复发提供燃料的能力。就这一点来说,本领域的普通技术人员应理解的是,本发明另外提供了DLL3调节剂和它们在降低肿瘤起始细胞的频率方面的用途。
II.DLL3生理学
Notch信号传导路径最先在秀丽隐杆线虫和果蝇中鉴别并且随后被显示从无脊椎动物到脊椎动物在进化上为保守的,它参与一系列基础生物过程,包括正常胚胎发育、成人组织恒定及干细胞维持(德索乍(D’Souza)等,2010;刘(Liu)等,2010)。Notch信号传导对于多种细胞类型在特化、图形化及形态发生期间至关重要。这常常通过侧抑制机制发生,在该机制中,表达一种(或多种)Notch配体的细胞采用默认的细胞命运,但经由刺激Notch信号传导抑制相邻细胞中的这一命运(斯特伯格(Sternberg),1988,卡贝拉(Cabrera)1990)。已发现,这种由Notch信号传导介导的二元细胞命运在众多组织中起到作用,包括发育的神经系统(德拉庞贝(de la Pompa)等,1997)、造血和免疫系统(毕加斯(Bigas)和艾斯派索(Espinosoa),2012;霍尼(Hoyne)等,2011;纳加斯(Nagase)等,2011)、消化道(弗瑞(Fre)等,2005;弗瑞等,2009)、内分泌胰腺(阿佩奎斯特(Apelqvist)等,1999;詹森(Jensen)等,2000)、垂体(雷兹曼(Raetzman)等,2004)及弥散内分泌系统(埃托(Ito)等,2000;斯查诺夫(Schonhoff)等,2004)。用于实行这种二元转换的一种通用机制看来是保守的,尽管Notch起到作用的发育系统的范围广泛—在默认细胞命运选择是由称为碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白质的转录调控子决定的细胞中,Notch信号传导引起一类Notch反应性基因的活化,而该活化又抑制这些bHLH蛋白质的活性(鲍尔(Ball),2004)。这些二元决定在发育和信号传导线索的更广泛情形中发生,从而使得Notch信号传导实现增殖或抑制增殖,并且触发自更新或抑制自更新。
在果蝇中,Notch信号传导主要由一个Notch受体基因和两个配体基因(称为Serrate和δ)介导(沃顿(Wharton)等,1985;雷贝(Rebay)等,1991)。在人类中,存在四种已知的Notch受体,及五种DSL(δ-Serrate LAG2)配体—两种Serrate的同源物(称为Jagged 1和Jagged2)及三种δ同源物,称为δ样配体或DLL1、DLL3及DLL4。总体而言,在信号接收细胞的表面上的Notch受体是通过与在相对的信号发送细胞的表面上表达的配体相互作用来活化(称为反式相互作用)。这些反式相互作用引起一系列蛋白酶介导的Notch受体裂解。结果是,Notch受体细胞内结构域自由地从膜转位到核,在其中它与CSL家族转录因子(人体中的RBPJ)配对并将其从转录阻遏子转变成Notch反应性基因的活化子。
在人类Notch配体中,DLL3的不同之处在于,它看起来无法经由反式相互作用活化Notch受体(拉迪(Ladi)等,2005)。Notch配体还可以与Notch受体顺式(在同一细胞上)相互作用,导致Notch信号的抑制,不过顺式抑制作用的确切机制仍不明了并且可能取决于该配体而变化(例如,参见克雷恩(Klein)等,1997;拉迪等,2005;盖特伯格(Glittenberg)等,2006)。两种假定的抑制模式包括通过防止反式相互作用,或者通过干扰受体的加工或以物理方式引起受体在内质网或高尔基体中的滞留来减少细胞表面上Notch受体的量,从而调节细胞表面处的Notch信号传导(川崎(Sakamoto)等,2002;顿伍迪(Dunwoodie),2009)。然而,很明显,相邻细胞上Notch受体和配体表达的随机差异可以通过转录和非转录过程来扩增,并且顺式-和反式相互作用的微妙平衡可以在相邻组织中引起Notch介导的分歧的细胞命运的划界的精细调整(斯皮扎克(Sprinzak)等,2010)。
DLL3(又称为δ样3或SCDO1)是δ样家族Notch DSL配体的一个成员。代表性DLL3蛋白直系同源物包括但不限于,人类(登记号NP_058637和NP_982353)、黑猩猩(登记号XP_003316395)、小鼠(登记号NP_031892)及大鼠(登记号NP_446118)。在人类中,DLL3基因由位于染色体19q13上跨9.5kBp的8个外显子组成。在最后一个外显子内的替代性剪接产生两种加工的转录物,一个为2389个碱基(登记号NM_016941;图1A,SEQ ID NO:1)并且一个为2052个碱基(登记号NM_203486;图1B,SEQ ID NO:2)。前一转录物编码一种618个氨基酸的蛋白质(登记号NP_058637;图1C,SEQ ID NO:3),而后一者编码一种587个氨基酸的蛋白质(登记号NP_982353;图1D,SEQ ID NO:4)。DLL3的这两种蛋白质同功异型物在其细胞外结构域和其跨膜结构域内共有总计100%一致性,不同之处仅在于,更长的同功异型物含有在该蛋白质的羧基末端处含32个另外的残基的一个延长的细胞质尾(图1E)。这些同功异型物的生物相关性不明了,不过两种同功异型物可以在肿瘤细胞中检测到(图5)。在人类中δ样蛋白质家族的每一成员的一致性百分比示于图2A中,并且跨物种的一致性示于图2B中。
总体而言,DSL配体由一系列结构的结构域构成:一个独特的N末端结构域,随后为一个保守的DSL结构域、多个串联的表皮生长因子(EGF)样重复序列、一个跨膜结构域,及一个在配体间不高度保守而是含有多个赖氨酸残基的细胞质结构域,这些赖氨酸残基是被独特E3泛素连接酶泛素化的潜在位点。DSL结构域是一种简并EGF结构域,它是与Notch受体相互作用必需的但非充分的(清水(Shimizu)等,1999)。另外地,大多数DSL配体的前两个EGF样重复序列含有一种更小的蛋白质序列基元,称为DOS结构域,当活化Notch信号传导时,该基元与该DSL结构域协作地相互作用。
图1F提供了DLL3蛋白的细胞外区域的示意图,图解了六个EGF样结构域、单个DSL结构域及N末端结构域的总体并置。总体而言,这些EGF结构域被识别为出现在约氨基酸残基216-249(结构域1)、274-310(结构域2)、312-351(结构域3)、353-389(结构域4)、391-427(结构域5)及429-465(结构域6)处,其中DSL结构域在hDLL3的约氨基酸残基176-215处并且N末端结构域在约氨基酸残基27-175处(SEQ ID NOS:3和4)。如在此更详细地论述并且以下实例10中所示,EGF样结构域、DSL结构域及N末端结构域各自包含如由相异的氨基酸序列确定的DLL3蛋白质的一部分。应注意,出于本披露的目的,对应的EGF样结构域可以称为EGF1到EGF6,其中EGF1最接近该蛋白质的N末端部分。就该蛋白质的结构组成来说,本发明的一个重要方面是可以产生、制造、工程改造或选择所披露的DLL3调节剂,从而使其与所选结构域、基元或表位反应。在某些情形中,这些位点特异性调节剂可以取决于其主要作用模式而提供增强的反应性和/或功效。
应注意,如在此所使用,术语“成熟蛋白质”或“成熟多肽”如在此用于指通过在哺乳动物细胞中表达所产生的蛋白质的形式。一般假定,一旦起始了在整个粗糙内质网内生长的蛋白质链的输出,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有一种信号肽(SP)序列,该序列从完整多肽裂解,产生该蛋白质的“成熟”形式。在DLL3的两种同功异型物中,该成熟蛋白质包含一个具有26个氨基酸的信号肽,该信号肽可以在细胞表面表达之前得到修剪。因此,在成熟蛋白质中,N末端结构域将从该蛋白质中的27位延伸直到DSL结构域的开始。当然,如果该蛋白质没有以这种方式进行加工,那么该N末端结构域将被视作延伸到SEQ IDNOS:3和4的一位。
在不同的δ样配体中,DLL3是与该家族中的其他配体最不同的,因为它含有一个简并DSL结构域、无DOS基元及一个缺乏赖氨酸残基的细胞内结构域。该简并DSL以及缺乏DOS基元与DLL3无法以反式作用触发Notch信号传导(细胞之间)相符,表明不像DLL1或DLL4,DLL3仅充当Notch信号传导的抑制剂(拉迪等,2005)。研究已显示,DLL3可以主要驻留于顺式-高尔基体中(盖福斯(Geffers)等,2007),这将与假定的在细胞内保持Notch受体,或干扰Notch受体的加工的能力相符,从而防止输出到细胞表面而是使其再靶向溶酶体(查普曼(Chapman)等,2011)。然而,当某种DLL3蛋白在模型系统中人工地过表达时,该蛋白质可以出现在细胞表面处(拉迪等,2005),不过显然,这不是正常生物背景中也不是DLL3mRNA转录物增多的肿瘤中的的情形;有些意外的是,在此所披露的肿瘤类型中检测到的蛋白质水平指示大量的DLL3蛋白逃到不同肿瘤的细胞表面。
DLL3基因的缺陷已经与人类的脊椎肋骨发育不全相联系,这是一种先天性出生缺陷,导致异常椎骨形成和肋骨异常(道伍迪(Dunwoodie),2009)。这与Notch信号传导的改变相联系,已知它在决定体节的极性和图案化方面起到关键作用,体节是椎骨的胚胎前体,这些前体需要Notch、Wnt与FGF信号传导路径之间的精细调控的振荡相互影响以供适当发育(卡哥雅玛(Kageyama)等,2007;古德贝特(Goldbeter)和珀尔奎因(Pourquie),2008)。尽管DLL1和DLL3典型地在发育的小鼠胚胎内类似的位置中表达,但用转基因小鼠进行的实验已经证实,DLL3不补偿DLL1(吉福斯(Geffers)等,2007)。DLL1基因敲除的小鼠是胚胎致死性的,但DLL3突变体小鼠存活,仍显示出与患有脊椎肋骨发育不全的人类中所见类似的表型(久住(Kusumi)等,1998;新海(Shinkai)等,2004)。这些结果数据与对于正常发育至关重要的Notch反式-和顺式相互作用的微妙相互影响相符。
另外,如以上所论述,Notch信号传导在神经内分泌细胞和展现神经内分泌特征的肿瘤的发育和维持方面起到作用。就这一点来说,Notch信号传导涉及正常内分泌器官以及弥散神经内分泌系统中的多种细胞命运决定。举例来说,在胰腺中,需要Notch信号传导来抑制由bHLH转录因子NGN3所介导的默认内分泌表型的发育(哈勃纳(Habener)等,2005)。类似的Notch介导的内分泌细胞命运抑制出现在肠内分泌细胞(斯查诺夫等,2004)、甲状腺滤泡旁细胞(库克(Cook)等,2010)中,指定垂体中神经内分泌细胞类型的相对比率(杜塔(Dutta)等,2011),并且可能涉及到肺内采用神经内分泌或非神经内分泌表型的细胞的决定(陈(Chen)等,1997;埃托等,2000;撒伦庞格(Sriuranpong)等,2002)。因此,很明显,在许多组织中,Notch信号传导的抑制与神经内分泌表型相联系。
发育的信号传导路径的不当再活化或正常信号传导路径的失调常常在肿瘤中观察到,并且在Notch信号传导的情形中,已经与多种肿瘤类型相关联(寇克(Koch)和雷德克(Radtke),2010;哈瑞斯(Harris)等,2012)。已经将Notch路径作为淋巴瘤、结肠直肠、胰腺及一些类型的非小细胞肺癌的致癌基因进行研究(参见扎伦克占(Zarenczan)和陈(Chen),2010,及其中的参考文献)。相比之下,已报导Notch在具有神经内分泌特征的肿瘤中充当肿瘤抑制物(参见扎伦克占和陈,2010,同上文)。具有神经内分泌特征的肿瘤在许多原发位点很少见,并且尽管其详尽分类仍成问题(姚(Yao)等,2008;柯林斯塔(Klimstra)等,2010;克罗佩尔(),2011),但它们可以分为四种主要类型:低级别良性类癌瘤、具有恶性行为的低级别分化良好的神经内分泌肿瘤、具有混合的神经内分泌和上皮特征的肿瘤及高级别分化不良的神经内分泌癌瘤。在这些分类中,分化不良的神经内分泌癌瘤(包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)子集)是具有可怕预后的癌症类型。据假设,SCLC是支气管原起源的,部分地由肺部内分泌细胞引起(加伦佐(Galluzzo)和博查特(Bocchetta),2011)。不管具有神经内分泌表型的这些肿瘤各自的起源的具体细胞来源如何,可以预期的是,通过Notch路径基因本身的直接损害或通过抑制Notch信号传导的其他基因的活化来抑制Notch信号传导可以导致获取这些肿瘤的神经内分泌表型。进而言之,导致Notch路径的扰动的基因可以提供治疗靶,用于治疗具有神经内分泌表型的肿瘤,特别是用于当前具有不良临床结果的适应症。
ASCL1是看来经由DLL3与Notch信号传导路径相互作用的一种此类基因。很明显,许多神经内分泌肿瘤显示出一种分化不良(即,部分地完全)内分泌表型;举例来说,不同内分泌蛋白质和多肽(例如,嗜铬粒蛋白A,CHGA;降钙素,CALCA;阿片黑素促皮质素原,POMC;生长抑素,SST)、与分泌泡相关的蛋白质(例如,突触素,SYP)及涉及到负责生物活性胺的合成的生物化学路径的基因(例如,多巴脱羧酶,DDC)的明显增多或表达。也许不令人意外的是,这些肿瘤常常过表达ASCL1(在小鼠中又称为mASH1,或在人类中为hASH1),一种已知在协调基因级联引起神经和神经内分泌表型方面起到作用的转录因子。尽管该级联的具体分子细节仍不确定,但越来越明显的是,对于某些细胞类型,特别是甲状腺滤泡旁细胞(卡米达(Kameda)等,2007)、肾上腺髓质的嗜铬性细胞(虎伯(Huber)等,2002)及在肺的弥散神经内分泌系统中发现的细胞(陈等,1997;埃托等,2000;撒伦庞格等,2002),ASCL1是一个精细调谐的发育调控环的一部分,在该环中,细胞命运的选择是由ASCL1介导的基因表达级联与Notch介导的基因表达级联的平衡所介导(图3)。举例来说,已发现ASCL1将在正常小鼠肺部内分泌细胞中表达,而Notch信号传导效应物HES1是在肺部非神经内分泌细胞中表达(埃托等,2000)。日益理解的是,这两种级联是处在具有潜在交叉调控的精细平衡中。已经显示,Notch效应物HES1使ASCL1的表达下调(陈等,1997;撒伦庞格等,2002)。这些结果清楚地证实,Notch信号传导可以抑制神经内分泌分化。然而,结合到DLL3启动子的ASCL1使DLL3表达活化的论证(亨克(Henke)等,2009)及DLL3使Notch信号传导衰减的观察结果(拉迪等,2005)接近了神经内分泌与非神经内分泌表型之间细胞命运选择的遗传线路。
已知Notch信号传导看来已经进化到扩大相邻细胞之间的微妙差异以使清晰地界定的组织结构域具有发散的分化路径(例如,“侧抑制”,如以上所描述),这些数据一起表明,精细调谐的发育调控环(图3)已经变得在具有神经内分泌表型的癌症中再活化并且失调。尽管DLL3将为抗体治疗学的开发提供一种适合的细胞表面靶是不太明显的,但已知它通常在细胞的内部膜隔室内驻留(盖福斯等,2007)并且推测它在其中与Notch相互作用,故有可能的是,神经内分泌肿瘤中由此引起的DLL3表达增多可以为具有神经内分泌表型的肿瘤(例如,NET和pNET)提供一种独特的治疗靶。常常观察到,在实验室系统中蛋白质的大量过表达可以引起该细胞内过表达的蛋白质的错误定位。因此,一个合理但不太明显的未经过实验验证的假说是,肿瘤中DLL3的过表达可以导致该蛋白质的某种细胞表面表达,并由此为抗体治疗学的开发提供一个靶。
III.癌症干细胞
如以上所暗指的,已经意外地发现,异常的DLL3表达(基因型和/或表型)与不同的肿瘤发生细胞亚群相关联。就这一点来说,本发明提供了DLL3调节剂,这些调节剂可以特别适用于靶向这些细胞,并且尤其是肿瘤保持细胞,藉此促进赘生性病症的治疗、管理或预防。因此,在优选的实施例中,根据本传授内容,DLL3决定子(表型或基因型)的调节剂可以有利地用于降低肿瘤起始细胞频率,并且藉此促进增生性病症的治疗或管理。
出于本申请的目的,术语“肿瘤起始细胞”(TIC)涵盖“肿瘤保持细胞”(TPC;即,癌症干细胞或CSC)以及高增殖性的“肿瘤祖细胞”(称为TProg),这些细胞一起一般包含块状肿瘤或大块体的独特亚群(即,0.1%-40%)。出于本披露的目的,术语“肿瘤保持细胞”和“癌症干细胞”或“赘生性干细胞”是等效的并且可以在此互换使用。TPC与TProg的不同之处在于,TPC可以完全地重现肿瘤内存在的肿瘤细胞的组成,并且如通过较低数量的分离的细胞的连续移植(通过小鼠进行两次或更多次传代)所证实,它具有无限的自更新能力,而TProg将不呈现无限的自更新能力。
本领域的普通技术人员应理解,使用适当细胞表面标记物进行的荧光活化的细胞分选(FACS)至少部分由于它在单个细胞与细胞丛(即,成对物等)之间进行区别的能力而成为分离高度富集的癌症干细胞亚群(例如,>99.5%的纯度)的一种可靠方法。使用这些技术,已经显示,当将较低细胞数量的高度纯化的TProg细胞移植到免疫功能低下的小鼠中时,它们可以为原代移植物中肿瘤的生长提供燃料。然而,不同于纯化的TPC亚群,TProg产生的肿瘤不会完全地以表型细胞异质性反映亲本肿瘤并且在随后的移植物中再起始连续肿瘤发生方面可证实地无效。相比之下,TPC亚群完全地重新构成亲本肿瘤的细胞异质性并且当连续地分离并移植时,可以有效地起始肿瘤。因此,本领域的普通技术人员将认识到,虽然TPC和TProg都可以在原代移植物中产生肿瘤,但这两者之间的确定性差异是TPC在以较低细胞数量连续移植时为异种肿瘤生长永久地提供燃料的独特能力。对TPC进行表征的其他常用方法涉及细胞表面标记物的形态和检查,转录谱及药物反应,不过标记物表达可以随培养条件和体内细胞系传代而变化。
因此,出于本发明的目的,肿瘤保持细胞,像在正常组织中支持细胞分层的正常干细胞一样,优选地通过它们无穷地自更新同时维持多谱系分化能力的能力来定义。因此,肿瘤保持细胞能够产生肿瘤发生子代(即,肿瘤起始细胞:TPC和TProg)和非肿瘤发生(NTG)子代。如在此所使用,“非肿瘤发生细胞”(NTG)是指由肿瘤起始细胞产生,但自身不具有自更新或产生多个包含肿瘤的异质细胞谱系的能力的一种肿瘤细胞。根据实验,NTG细胞不能在小鼠中可再现地形成肿瘤,即使是在移植过量的细胞数量时。
如所指示,TProg因它们在小鼠中产生肿瘤的能力有限,也被归为肿瘤起始细胞(或TIC)。TProg是TPC的子代并且典型地能够进行有限次数的非自更新细胞分裂。另外,TProg细胞可以进一步分成早期肿瘤祖细胞(ETP)和晚期肿瘤祖细胞(LTP),这些细胞各自可以通过表型(例如,细胞表面标记物)和重现肿瘤细胞架构的不同能力来区别。尽管存在这些技术差异,但ETP和LTP两者与TPC在功能上的不同之处在于,它们当以较低细胞数量移植时一般不太能够连续地重新构成肿瘤并且典型地不反映亲本肿瘤的异质性。尽管存在前述差别,但也已经显示,不同的TProg群在个别情况下可以得到通常归因于干细胞的自更新能力并且自身变为TPC(或CSC)。在任何情形中,两种类型的肿瘤起始细胞可能以单一患者的典型肿块形式呈现,并且经历用如在此所披露的调节剂进行的治疗。也就是说,所披露的组合物一般在降低这些DLL3阳性肿瘤起始细胞的频率或改变其化学敏感性方面有效,不管以肿瘤代表的特定实施例或混合物如何。
在本发明的上下文中,TPC比TProg(ETP和LTP)、NTG细胞及构成肿块的肿瘤浸润性非TPC衍生的细胞(例如,成纤维细胞/基质、内皮及造血细胞)更易发生肿瘤,相对更静止并且经常更具化学抗性。鉴于常规疗法和方案在很大程度上已经被设计成使肿瘤减负荷并且迅速地攻击增殖性细胞,TPC对于常规疗法和方案的抗性可能比更快增殖的TProg和其他块状肿瘤细胞群更强。另外,TPC经常表达其他特征,这些特征使其对于常规疗法相对具有化学抗性,如多药抗性转运体表达的增加、DNA修复机制的增强及抗细胞凋亡蛋白。这些特性(它们各自有助于TPC的药物耐受性)构成了用以确保大多数晚期赘瘤患者的长期益处的标准肿瘤学治疗方案失败的一个关键原因;即,无法适当地靶向并且根除为持续肿瘤生长和复发提供燃料的那些细胞(即,TPC或CSC)。
不同于许多现有技术治疗,本发明的新颖组合物优选地在给与受试者之后使肿瘤起始细胞的频率降低,不管所选调节剂的形式或具体靶(例如,遗传物质、DLL3抗体或配体融合构建体)如何。如以上所述,肿瘤起始细胞频率的降低可以因以下原因而发生:a)肿瘤起始细胞的消除、耗竭、敏化、沉默或抑制;b)控制肿瘤起始细胞的生长、扩增或复发;c)干扰肿瘤起始细胞的起始、繁殖、维持或增殖;或d)通过其他方式妨碍这些肿瘤发生细胞的存活、再生和/或转移。在一些实施例中,肿瘤起始细胞的频率降低由于一个或多个生理路径的改变而发生。该路径的改变,无论是通过肿瘤起始细胞的减少或消除还是通过改良其潜能(例如,诱导分化、小生境破坏)或以其他方式干扰它们影响肿瘤环境或其他细胞的能力引起,又允许通过抑制肿瘤发生、肿瘤维持和/或转移及复发来进行DLL3相关病症的更有效治疗。
在可以用于评估此种肿瘤起始细胞频率的降低的本领域认可的方法中有在体外或体内进行的限制性稀释分析,优选地随后为使用泊松分布统计学进行的计数或评估预先确定的确定性事件(如在体内产生或不产生肿瘤的能力)的频率。尽管此类限制性稀释分析包含计算肿瘤起始细胞频率的降低的优选方法,但也可以使用其他要求不太高的方法有效地测定所希望的值,即使有些不太准确,并且与在此的传授内容为完全可相容的。因此,如本领域的普通技术人员所理解,通过众所周知的流式细胞或免疫组织化学手段测定频率值的降低也是可能的。有关所有以上提到的方法,参见例如,黛拉(Dylla)等,2008,PMID:18560594及霍依(Hoey)等,2009,PMID:19664991;这些文献各自以引用以其全文并且明确地说有关所披露的方法结合于此。
关于限制性稀释分析,肿瘤起始细胞频率的体外计数可以通过将分级分离或未分级分离的人类肿瘤细胞(例如,对应地来自经过治疗和未治疗的肿瘤)沉积于促进集落形成的体外生长条件中来实现。以这种方式,可能通过对集落的简单计数和表征,或通过由例如将人类肿瘤细胞以连续稀释液沉积于板中并在接种之后至少10天将每一细胞评为对集落形成呈阳性或阴性组成的分析来对集落形成细胞进行计数。体内限制性稀释实验或分析(它们测定肿瘤起始细胞频率的能力一般更准确)涵盖将来自未治疗对照或经过治疗的群体的人类肿瘤细胞以连续稀释液移植到免疫功能低下的小鼠中,并且在移植之后至少60天,随后将每一小鼠评为对肿瘤形成呈阳性或阴性。由体外或体内限制性稀释分析引起的细胞频率值优选地通过将泊松分布统计学应用于已知的阳性和阴性事件的频率得出,藉此提供有关满足阳性事件的定义的事件的频率;在这一情形中,对应地为集落或肿瘤形成。
关于与本发明可相容的可以用于计算肿瘤起始细胞频率的其他方法,最常用的包括可定量的流式细胞技术和免疫组织化学染色程序。虽然不如以上刚刚描述的限制性稀释分析技术那么精确,但这些程序的劳动密集性低得多并且在一个相对较短的时间框中提供合理的值。因此,应理解的是,熟练的业内人士可以使用流式细胞术细胞表面标记物谱测定,采用一种或多种抗体或试剂,该一种或多种抗体或试剂结合已知肿瘤起始细胞富集的本领域认可的细胞表面蛋白质(例如潜在地可相容的标记物,如PCT申请2012/031280中所陈述,该案通过引用以其全文结合于此)并藉此测量不同样品中的TIC水平。在又另一种可相容的方法中,本领域的普通技术人员可能通过使用一种或多种抗体或试剂进行的免疫组织化学,对TIC频率进行原位(例如,在组织切片中)计数,这些抗体或试剂能够结合被认为区分这些蛋白质的细胞表面蛋白质。
本领域的普通技术人员将认识到,众多标记物(或其不存在)已经与不同的癌症干细胞群相关联,并且被用于分离或表征肿瘤细胞亚群。在这一方面,示例性癌症干细胞标记物包括OCT4、Nanog、STAT3、EPCAM、CD24、CD34、NB84、TrkA、GD2、CD133、CD20、CD56、CD29、B7H3、CD46、转铁蛋白受体、JAM3、羧肽酶M、ADAM9、抑瘤素M、Lgr5、Lgr6、CD324、CD325、巢蛋白、Sox1、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、mf2、yy1、smarcA3、smarckA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、(TCF4)SLC7A8、IL1RAP、TEM8、TMPRSS4、MUC16、GPRC5B、SLC6A14、SLC4A11、PPAP2C、CAV1、CAV2、PTPN3、EPHA1、EPHA2、SLC1A1、CX3CL1、ADORA2A、MPZL1、FLJ10052、C4.4A、EDG3、RARRES1、TMEPAI、PTS、CEACAM6、NID2、STEAP、ABCA3、CRIM1、IL1R1、OPN3、DAF、MUC1、MCP、CPD、NMA、ADAM9、GJA1、SLC19A2、ABCA1、PCDH7、ADCY9、SLC39A1、NPC1、ENPP1、N33、GPNMB、LY6E、CELSR1、LRP3、C20orf52、TMEPAI、FLVCR、PCDHA10、GPR54、TGFBR3、SEMA4B、PCDHB2、ABCG2、CD166、AFP、BMP-4、β-连环蛋白、CD2、CD3、CD9、CD14、CD31、CD38、CD44、CD45、CD74、CD90、CXCR4、decorin、EGFR、CD105、CD64、CD16、CD16a、CD16b、GLI1、GLI2、CD49b及CD49f。参见例如,斯托伦伯格(Schulenburg)等,2010,PMID:20185329、U.S.P.N.7,632,678及U.S.P.Ns.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221,各自通过引用结合于此。另外应理解的是,在本发明的双特异性或多特异性抗体的情况下,以上提到的标记物各自还可以被用作二次靶抗原。
类似地,与某些肿瘤类型的癌症干细胞相关联的细胞表面表型的非限制性实例包括CD44hiCD24low、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38-、CD44+CD24-、CD46hiCD324+CD66c-、CD133+CD34+CD10-CD19-、CD138-CD34-CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 hiCD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本领域中已知的其他癌症干细胞表面表型。参见例如,斯托伦伯格等,2010,同上文;维斯维达(Visvader)等,2008,PMID:18784658;及U.S.P.N.2008/0138313,各自通过引用以其全文结合于此。本领域的普通技术人员应理解的是,标记物表型(如以上刚刚举例说明的那些)可以与标准流式细胞分析和细胞分选技术联合使用以对TIC和/或TPC细胞或细胞群进行表征、分离、纯化或富集以供进一步分析。关于本发明值得关注的是,CD46、CD324,及任选地CD66c在许多人类结肠直肠(“CR”)癌、乳房(“BR”)癌、非小细胞肺(NSCLC)癌、小细胞肺(SCLC)癌、胰腺(“PA”)癌、黑素瘤(“Mel”)、卵巢(“OV”)癌及头颈癌(“HN”)肿瘤细胞的表面上高水平或异质地表达,而不管所分析的肿瘤试样是原发患者肿瘤试样还是患者衍生的NTX肿瘤。
使用如本领域中已知(并且在以下实例17中所显示)的以上参考的任何方法和所选标记物,则有可能的是,根据在此的传授内容,对由所披露的DLL3调节剂(包括偶联到细胞毒性剂的那些)所提供的TIC(或其中的TPC)频率的降低进行定量。在一些情形中,本发明的化合物可以使TIC或TPC的频率降低(通过以上所述的多种机制,包括消除、诱导分化、小生境破坏、沉默等)10%、15%、20%、25%、30%或甚至是35%。在其他实施例中,TIC或TPC频率的降低可以为约40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些实施例中,所披露的化合物可以使TIC或TPC的频率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至是95%。当然,应理解的是,TIC或TPC频率的任何降低都可能引起赘瘤的肿瘤发生、持续、复发及侵袭性的相应降低。
IV.DLL3调节剂
在任何情形中,本发明针对DLL3调节剂(包括DLL3拮抗剂)的用途,这些调节剂用于进行包括多种DLL3相关恶性疾病中任一种在内的不同病症的诊断、治疗诊断、治疗和/或预防。所披露的调节剂可以单独或联合多种抗癌化合物使用,这些抗癌化合物如化学治疗剂或免疫治疗剂(例如治疗性抗体)或生物反应改良剂。在其他所选实施例中,可以组合使用两种或更多种离散的DLL3调节剂以提供增强的抗赘瘤作用或可以用于制造多特异性构建体。
在某些实施例中,本发明的DLL3调节剂将包含核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、肽或多肽。更明确地说,示例性的本发明调节剂可以包含抗体及其抗原结合片段或衍生物、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、反义构建体、siRNA、miRNA、生物有机分子、肽模拟物、药剂和其代谢物、转录和翻译控制序列等。在某些实施例中,这些调节剂将包含可溶性DLL3(sDLL3)或其一种形式、变体、衍生物或片段,包括例如DLL3融合构建体(例如DLL3-Fc、DLL3靶向性部分等)或DLL3偶联物(例如,DLL3-PEG、DLL3-细胞毒性剂、DLL3-brm等)。在其他优选实施例中,这些DLL3调节剂包含抗体或其免疫活性片段或衍生物。在特别优选的实施例中,本发明的调节剂将包含中和抗体、耗竭抗体或内化抗体,或其衍生物或片段。另外,如同以上提到的融合构建体一样,这些抗体调节剂可以与所选细胞毒性剂、聚合物、生物反应改良剂(BRM)等偶联、连接或以其他方式缔合,以提供利用不同(并且任选地多种)作用机制的定向免疫疗法。如以上所暗指的,这些抗体可以为全DLL抗体并且与两个或更多个DLL家族成员缔合,并且在替代方案中,包含与DLL3的一种或两种同功异型物选择性反应的抗原结合分子。在又其他优选实施例中,这些调节剂可以在基因水平上起作用并且可以包含与DLL3决定子的基因型组分相互作用或缔合的化合物,如反义构建体、siRNA、miRNA等。
还应理解的是,取决于例如DLL3调节剂的形式、任何相缔合的载荷或给药及传递方法,所披露的DLL3调节剂可以通过多种机制,包括对所选路径提供激动作用或拮抗作用,或消除特定细胞,来耗竭肿瘤细胞(包括TPC)和/或相关赘瘤、使其沉默、对其进行中和、使其消除或者抑制其生长、繁殖或存活。因此,尽管在此披露的优选实施例针对特定肿瘤细胞亚群(如肿瘤保持细胞)的耗竭、抑制或沉默,或针对与特定表位或结构域相互作用的调节剂,但必须强调的是,这些实施例只是说明性的并且在任何意义上都不是限制。而是如所附权利要求书所陈述,本发明广泛地针对DLL3调节剂及它们在不同DLL3相关病症的治疗、管理或预防方面的用途,不管任何特定机制、结合区或靶肿瘤细胞群如何。
无论所选调节剂的形式如何,应理解的是,所选化合物可以是拮抗性的。如在此所使用,“拮抗剂”是指能够对特定或指定的靶(例如DLL3)的活性(包括受体与配体的结合,或酶与底物的相互作用)进行中和、阻断、抑制、废除、降低或干扰的一种分子。就这一点来说,应理解的是,本发明的DLL3拮抗剂可以包含对DLL3蛋白或其片段进行识别、与其反应、与其结合、与其组合、与其相竞争、与其相缔合或以其他方式与其相互作用并且使肿瘤起始细胞或其他赘生性细胞(包括肿块)或NTG细胞的生长消除、沉默、减少、抑制、妨碍、约束或控制的任何配体、多肽、肽、融合蛋白、抗体或其免疫活性片段或衍生物。可相容的拮抗剂可以另外包括小分子抑制剂、适体、反义构建体、siRNA、miRNA等,其受体或配体分子及衍生物,它们识别DLL3基因型或表型决定子或与其相缔合,藉此改变表达模式或隔绝它与底物、受体或配体的结合或相互作用。
如在此所使用并且应用于两种或更多种分子或化合物的术语“识别”或“缔合”应当被视作意谓这些分子的共价或非共价反应、结合、特异性结合、组合、相互作用、连接、键联、统一、聚结、合并或接合,藉此一个分子对另一个分子发挥作用。
另外,如在此的实例中所证实(例如,参见图2B),一些人类DLL3调节剂在某些情形中可以与来自除人类外的物种(例如鼠类)的DLL3交叉反应。在其他情形中,示例性调节剂可以对人类DLL3的一种或多种同功异型物具有特异性,并且不会展现与来自其他物种的DLL3直系同源物的交叉反应性。当然,联合在此的传授内容,这些实施例可以包含与来自单一物种的两个或更多个DLL家族成员缔合的全DLL抗体,或只与DLL3缔合的抗体。
在任何情形中,并且如以下将更详细地论述,本领域的普通技术人员应理解,使用的所披露的调节剂可以呈一种偶联或未偶联形式。也就是说,该调节剂可以与药物活性化合物、生物反应改良剂、抗癌剂、细胞毒性或细胞生长抑制剂、诊断部分或生物可相容改良剂缔合或偶联(例如共价或非共价地)。就这一点来说,应了解的是,这些偶联物可以包含肽、多肽、蛋白质、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子及放射性同位素。
V.调节剂的制造和供应
A.抗体调节剂
1.综述
如先前所暗指的,本发明的特别优选的实施例包含呈抗体形式的DLL3调节剂,这些调节剂优先地与DLL3蛋白和任选地其他DLL家族成员的一种同功异型物的一个或多个结构域缔合。本领域的普通技术人员应理解充分开发的基于抗体的知识,如例如以下各项中所陈述:阿巴斯(Abbas)等,《细胞与分子免疫学》(Cellular and MolecularImmunology),第6版,W.B.桑德公司(W.B.Saunders Company)(2010)或墨菲(Murphey)等,《简氏免疫学》(Janeway’s Immunobiology),第8版,加兰德科技出版社(Garland Science)(2011),各自通过引用以其全文结合于此。
术语“抗体”打算涵盖多克隆抗体(polyclonal antibody)、多克隆抗体(multiclonal antibody)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、人类抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗独特型抗体、合成抗体(包括突变蛋白及其变体);抗体片段,如Fab片段、F(ab')片段、单链FvFc、单链Fv;及其衍生物,包括Fc融合物和其他修饰,及任何其他免疫活性分子,只要它们展现所希望的生物活性(即,抗原缔合或结合)即可。另外,除非上下文另外规定,否则该术语另外包含抗体的所有类别(即,IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有亚型(即,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2),以及其变体。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域对应地由相应的小写希腊字母α、δ、ε、γ及μ表示。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配到两种明显相异的类型之一,称为κ和λ。
尽管所有这些抗体都在本发明的范围内,但出于说明的目的,只在此相当详细地论述包含免疫球蛋白的IgG类别的优选实施例。然而,应了解的是,该披露只是对实行本发明的示例性组合物和方法的论证,并且不打算以任何方式限制本发明或其所附权利要求书的范围。
众所周知,轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定了抗原识别和特异性,并且轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予并且调控多种重要的生物特性,如分泌、经胎盘迁移率、循环半衰期、补体结合等。
“可变”区包括轻链和重链可变结构域中的高变位点,这些位点本身以常称为互补决定区(CDR)的三个区段显现。侧接CDR的可变结构域的更高度保守的部分称为构架区(FR)。举例来说,当抗体在一种水性环境中呈现其三维构象时,在天然存在的单体免疫球蛋白G(IgG)抗体中,存在于“Y”的每个臂上的六个CDR是较短的不连续氨基酸序列,它们被特定地定位以形成抗原结合位点。因此,每种天然存在的IgG抗体包含邻近于Y的每个臂的氨基末端的两个一致的结合位点。
应理解的是,CDR的位置可以由本领域的普通技术人员使用标准技术容易地鉴别。本领域的技术人员也熟悉卡贝特(Kabat)等(1991,NIH出版(NIH Publication)91-3242,国家技术信息服务公司(NationalTechnical Information Service),弗吉尼亚州西斯普林菲尔德(Springfield,Va.))中所描述的编号系统。就这一点来说,卡贝特等定义了一种针对可变结构域序列的编号系统,它可适用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以将这一“卡贝特编号”系统明确地分配给任何可变结构域序列,无需依靠除序列本身外的任何实验数据。除非另外说明,否则提到的一种抗体中多个特定氨基酸残基位置的编号是根据卡贝特编号系统。
因此,根据卡贝特,在VH中,残基31-35构成CDR1,残基50-65构成CDR2,并且95-102构成CDR3,而在VL中,残基24-34是CDR1,50-56构成CDR2并且89-97构成CDR3。对于上下文,在VH中,FR1对应于可变区中涵盖氨基酸1-30的结构域;FR2对应于可变区中涵盖氨基酸36-49的结构域;FR3对应于可变区中涵盖氨基酸66-94的结构域,并且FR4对应于可变区中从氨基酸103到该可变区结束的结构域。轻链的FR类似地由每一轻链可变区CDR分开。
应注意,CDR随抗体而变化极大(并且根据定义,将不与卡贝特共有序列展现同源性)。此外,由于种间或等位基因分歧,在任何给定的卡贝特位点编号处某些个别残基的身份可以随抗体链而变化。替代性编号陈述于查赛(Chothia)等,《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)196:901-917(1987)及麦克卡伦(MacCallum)等,《分子生物学杂志》262:732-745(1996)中,不过如在卡贝特中一样,FR边界是由如以上所描述的对应CDR末端分开。也参见查赛(Chothia)等,《自然》(Nature)342,第877-883页(1989)及S.杜贝儿(S.Dubel)编,《治疗性抗体手册》(Handbook of Therapeutic Antibodies),第3版,德国威利出版公司(WILEY-VCH Verlag GmbH and Co.)(2007),其中定义包括当针对彼此相比较时的氨基酸残基重叠或子集。以上提到的参考文献各自通过引用以其全文结合于此并且构成了如以上引用的每一参考文献所定义的结合区或CDR的氨基酸残基被陈述用于以下的比较。
CDR定义
|
卡贝特1 |
查赛2 |
麦克卡伦3 |
VH CDR1 |
31-35 |
26-32 |
30-35 |
VH CDR2 |
50-65 |
50-58 |
47-58 |
VH CDR3 |
95-102 |
95-102 |
93-101 |
VL CDR1 |
24-34 |
23-34 |
30-36 |
VL CDR2 |
50-56 |
50-56 |
46-55 |
VL CDR3 |
89-97 |
89-97 |
89-96 |
1残基编号遵循卡贝特等,同上文的命名法
2残基编号遵循查赛等人,同上文的命名法
3残基编号遵循麦克卡伦等,同上文的命名法
在本发明的上下文中,应理解的是,衍生自图11A或图11B中所陈述的鼠类可变区氨基酸序列的任何所披露的轻链和重链CDR都可以组合或重排以提供根据本传授内容的优化的抗DLL3(例如人源化或嵌合抗DLL3)抗体。也就是说,衍生自图11A中所陈述的连续轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOS:20-202,偶数)或图11B中所陈述的连续重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NOS:21-203,奇数)的一个或多个CDR可以并入一种DLL3调节剂中,并且在特别优选的实施例中,并入到与一种或多种DLL3同功异型物免疫特异性缔合的CDR移植抗体或人源化抗体中。这些人源化调节剂的轻链(SEQ ID NOS:204-212,偶数)和重链(SEQ ID NOS:205-213,奇数)可变区氨基酸序列的实例也陈述于图11A和11B中。总体而言,这些新颖的氨基酸序列描绘了根据本发明的九十二种鼠类和五种人源化示例性调节剂。另外,图11A和11B中所陈述的这九十二种示例性鼠类调节剂和五种人源化调节剂各自的相应序列包括在本申请所附的序列表中(SEQ ID NOS:220-413)。
在图11A和11B中,注释的CDR是使用查赛编号来定义。然而,如在此所论述并且在以下实例8中所证实,本领域的普通技术人员可以容易地对如由卡贝特等、查赛等或麦克卡伦等关于图11A或图11B中所陈述的每一对应重链和轻链序列所定义的CDR进行定义、鉴别、衍生化和/或计数。因此,通过所有这些命名法定义的主题CDR和包含CDR的抗体各自明确地包括在本发明的范围内。更广泛地,术语“可变区CDR氨基酸残基”或更简单地“CDR”包括如使用如以上所陈述的基于任何序列或结构的方法所鉴别的CDR中的氨基酸。
2.抗体调节剂的产生
a.多克隆抗体
在不同宿主动物(包括兔、小鼠、大鼠等)中多克隆抗体的产生是本领域中众所周知的。在一些实施例中,含有多克隆抗DLL3抗体的血清是通过对该动物进行抽血或将其处死来获得的。该血清可以呈从该动物获得的形式用于研究目的,或在替代方案中,这些抗DLL3抗体可以部分地或完全地纯化以提供免疫球蛋白部分或均质抗体制剂。
简单地说,用一种DLL3免疫原(例如,可溶性DLL3或sDLL3)对所选动物进行免疫接种,该免疫原可以例如包含所选同功异型物、结构域和/或肽,或者表达DLL3或其免疫反应性片段的活细胞或细胞制剂。取决于接种的物种,可以用于增加免疫反应的本领域已知的佐剂包括但不限于,弗氏(Freund's)(完全和不完全)佐剂;矿物凝胶,如氢氧化铝;表面活性物质,如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇类、聚阴离子类、肽类、油乳液类、匙孔血蓝蛋白类、二硝基苯酚;及潜在地有用的人用佐剂,如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))和短小棒杆菌。这些佐剂可以通过以一种局部沉积物隔绝抗原来保护其免于快速分散,或它们可以含有多种刺激宿主分泌因子的物质,这些因子是巨噬细胞和免疫系统的其他组分的趋化因子。优选地,免疫接种方案将涉及在一段预定的时间内,扩散开的所选免疫原的两次或更多次给与。
可以对如图1C或1D所示的DLL3蛋白的氨基酸序列进行分析以选择DLL3蛋白的特定区域用于产生抗体。举例来说,使用DLL3氨基酸序列的疏水性和亲水性分析来鉴别该DLL3结构中的亲水性区域。DLL3蛋白中显示免疫原性结构的区域,以及其他区域和结构域,可以使用本领域中已知的不同其他方法,如周-法斯曼(Chou-Fasman)、加纳-罗伯森(Garnier-Robson)、凯特-多利特(Kyte-Doolittle)、艾森伯格(Eisenberg)、卡普拉斯-斯图尔兹(Karplus-Schultz)或詹姆森-沃尔夫(Jameson-Wolf)分析容易地鉴别。平均柔性轮廓可以使用巴克卡伦R.(Bhaskaran R.),庞努斯瓦米P.K.(Ponnuswamy P.K.),1988,《国际肽研究杂志》(Int.J.Pept.Protein Res.)32:242-255的方法产生。β-转角轮廓可以使用德勒吉G.(Deleage,G.),洛克斯B.(Roux B.),1987,《蛋白质工程》(Protein Engineering)1:289-294的方法产生。因此,通过这些程序或方法鉴别的每一DLL3区域、结构域或基元都在本发明的范围内并且可以经过分离或工程改造以提供免疫原,从而产生多种包含所希望的特性的调节剂。用于产生DLL3抗体的优选方法是借助于在此提供的实例进一步说明。用以制备用作免疫原的蛋白质或多肽的方法是本领域中众所周知的。本领域中也众所周知用于制备蛋白质与载体(如BSA、KLH或其他载体蛋白)的免疫原性偶联物的方法。在一些情况下,使用了使用例如碳化二亚胺试剂进行的定向偶联;在其他情况下,连接试剂是有效的。如本领域中所了解,DLL3免疫原的给与经常是通过在一段适合的时期内并且使用适合的佐剂进行注射来进行。在免疫接种方案中,抗体滴度可以如以下实例中所描述来取得以确定抗体形成的适合性。
b.单克隆抗体
此外,本发明还涵盖单克隆抗体的使用。如本领域中所知,术语“单克隆抗体”(或mAb)是指从实质上均质的抗体群获得的一种抗体,即,构成该群体的个别抗体除可能以微量存在的可能的突变(例如,天然存在的突变)外是一致的。在某些实施例中,此类单克隆抗体包括包含与抗原结合或缔合的多肽序列的一种抗体,其中该抗原结合多肽序列是通过一种方法获得的,该方法包括从多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列。
更总体而言,并且如在此的实例6中举例说明的,单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备,包括杂交瘤、重组技术、噬菌体呈现技术、转基因动物(例如,)或其中某一组合。举例来说,可以使用杂交瘤以及本领域认可的生物化学和遗传工程技术来产生单克隆抗体,如以下各项中更详细地描述:安志刚(An,Zhigiang)(编)《治疗性单克隆抗体:从工作台到诊所》(Therapeutic MonoclonalAntibodies:From Bench to Clinic),约翰威立公司(John Wiley andSons),第1版,2009;夏尔(Shire)等(编)《当前单克隆抗体开发和制造的趋势》(Current Trends in Monoclonal Antibody Developmentand Manufacturing),施普林格科学+商业媒体公司(Springer Science+Business Media LLC),第1版,2010;哈罗(Harlow)等,《抗体技术实验指南》(Antibodies:A Laboratory Manual),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),第2版,1988;哈姆林(Hammerling)等,《单克隆抗体及T细胞杂交瘤》(MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas)563-681(纽约爱思唯尔(Elsevier,N.Y.),1981),这些文献各自通过引用以其全文结合于此。应当了解的是,所选结合序列可以进一步改变,例如以改善对于靶的亲和力,使靶结合序列人源化,改善它在细胞培养物中的产量,降低其体内免疫原性,产生多特异性抗体等,并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的抗体。
c.嵌合抗体
在另一个实施例中,本发明的抗体可以包含嵌合抗体,这些抗体衍生自来自至少两种不同物种或抗体类型的共价接合的蛋白质区段。如本领域中所知,术语“嵌合”抗体是针对这样一些构建体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源,而该(这些)链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源,以及这些抗体的片段,只要它们展现出所希望的生物活性即可(U.S.P.N.4,816,567;和莫里森(Morrison)等,《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:6851-6855(1984))。
在一个实施例中,根据在此的传授内容的嵌合抗体可以包含鼠类VH和VL氨基酸序列及衍生自人类来源的恒定区。在其他可相容的实施例中,本发明的嵌合抗体可以包含如以下所描述的人源化抗体。在另一个实施例中,所谓的“CDR移植”的抗体,该抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多个CDR,而该(这些)抗体链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列一致或同源。对于用于人类中,所选啮齿动物CDR可以移植到人类抗体中,替代该人类抗体的一个或多个天然存在的可变区或CDR。这些构建体一般具有以下益处:提供全强度的调节剂功能(例如,CDC(补体依赖性细胞毒性)、ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)等),同时减少了受试者对该抗体的不想要的免疫反应。
d.人源化抗体
与该CDR移植的抗体类似的是“人源化”抗体。如在此所使用,非人类抗体(例如,鼠类)的“人源化”形式是含有了衍生自一种或多种非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中,人源化抗体是这样一种人类免疫球蛋白(接受者或受体抗体),其中来自接受者的CDR的残基经来自具有所希望的特异性、亲和力和/或能力的如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物等非人类物种(供体抗体)CDR的残基替代。在某些优选实施例中,该人类免疫球蛋白可变结构中的一个或多个FR中的残基被来自供体抗体的相应非人类残基替代,从而帮助维持移植的CDR的适当三维构型,并藉此改善亲和力。另外,人源化抗体可以包含在接受者抗体中或在供体抗体中未发现的残基,进一步精制抗体性能。
CDR移植和人源化抗体描述于例如U.S.P.N.6,180,370和5,693,762中。人源化抗体任选地还可以包含免疫球蛋白Fc的至少一部分,典型地人类免疫球蛋白Fc的至少一部分。有关进一步细节,参见例如,琼斯(Jones)等,《自然》321:522-525(1986);及U.S.P.N.6,982,321和7,087,409。又另一种方法称为“人类工程改造(humaneering)”,它描述于例如U.S.P.N.2005/0008625中。另外地,非人类抗体还可以通过WO 98/52976和WO 00/34317中所披露的方法特定地缺失人类T细胞表位或“去免疫”来进行修饰。以上提到的参考文献各自以其全文结合于此。
人源化抗体也可以使用常用分子生物学技术,如对编码来自重链或轻链中至少一种的全部或一部分免疫球蛋白可变区的核酸序列进行分离、操作并表达,来进行生物工程改造。除以上所述的该核酸的来源外,人类生殖系序列也是可用的,如例如以下各项中所披露:汤姆林森I.A.(Tomlinson,I.A.)等(1992)《分子生物学杂志》227:776-798;库克G.P.(Cook,G.P.)等(1995)《今日免疫学》(Immunol.Today)16:237-242;查夏D.(Chothia,D.)等(1992)《分子生物学杂志》227:799-817;及汤姆林森等(1995)《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBOJ)14:4628-4638。V-BASE名录(VBASE2-瑞特(Retter)等,《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)33;671-674,2005)提供了人类免疫球蛋白可变区序列的一个全面名录(由汤姆林森I.A.等,MRC蛋白质工程中心(MRC Centre for Protein Engineering),英国剑桥(Cambridge,UK))。也可以使用共有人类FR,例如,如U.S.P.N.6,300,064中所描述。
在所选实施例中并且如以下实例8中详述,人源化或CDR移植的抗体重链或轻链可变区氨基酸残基中至少60%、65%、70%、75%或80%将对应于接受者人类FR和CDR序列的那些。在其他实施例中,这些人源化抗体可变区残基中至少85%或90%将对应于接受者FR和CDR序列的那些。在另一优选实施例中,这些人源化抗体可变区残基中超过95%将对应于接受者FR和CDR序列的那些。
e.人类抗体
在另一个实施例中,这些抗体可以包含完全人类抗体。术语“人类抗体”是指这样一种抗体,它具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的一个氨基酸序列和/或已经使用任何用于制备人类抗体的技术来产生。
人类抗体可以使用本领域中已知的不同技术产生。一项技术是噬菌体呈现,其中在噬菌体上合成(优选地人类)抗体的文库,用所关注抗原或其抗体结合部分对该文库进行筛选,并且分离出结合该抗原的噬菌体,由此可以获得免疫反应性片段。用于制备并筛选这些文库的方法是本领域中众所周知的并且用于产生噬菌体呈现文库的试剂盒是可商购的(例如,法玛西亚重组噬菌体抗体系统(Pharmacia Recombinant PhageAntibody System),目录号27-9400-01;及斯特塔杰(Stratagene)的SurfZAPTM噬菌体呈现试剂盒,目录号240612)。还存在其他方法和试剂可以用于产生并筛选抗体呈现文库(参见例如,U.S.P.N.5,223,409;PCT公开号WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690;及巴贝斯(Barbas)等,《美国国家科学院院刊》88:7978-7982(1991))。
在一个实施例中,可以通过对如以上制备的重组的组合抗体文库进行筛选来分离重组人类抗体。在一个实施例中,该文库是使用由从B细胞分离的mRNA制备的人类VL和VH cDNA产生的一种scFv噬菌体呈现文库。
由天然文库(自然或合成的)产生的抗体可以具有适度亲和力(Ka为约106到107M-1),但也可以如本领域中所描述,通过构建第二文库并从其中再选择,在体外模拟亲和力成熟。举例来说,可以在体外通过使用易错聚合酶随机引入突变(报导于梁(Leung)等,《技术》(Technique),1:11-15(1989)中)。另外地,可以通过在所选个别Fv克隆中,例如使用以带有跨所关注CDR的随机序列的引物进行的PCR使一个或多个CDR随机突变,并针对更高亲和力的克隆进行筛选来进行亲和力成熟。WO9607754描述了一种用于在免疫球蛋白轻链的CDR中诱导诱变以建立轻链基因文库的方法。另一种有效的方法是将通过噬菌体呈现所选择的VH或VL结构域与自未免疫接种的供体获得的天然存在的V结构域变体谱系重组并在若干轮链重新改组中针对更高亲和力进行筛选,如马克斯(Marks)等,《生物技术》(Biotechnol.),10:779-783(1992)中所描述。这一技术允许产生解离常数KD(koff/kon)为约10-9M或更低的抗体和抗体片段。
在其他实施例中,可以采用类似的程序,使用多个包含在表面上表达结合对的真核细胞(例如酵母)的文库。参见例如,U.S.P.N.7,700,302和U.S.S.N.12/404,059。在一个实施例中,人类抗体选自一个噬菌体文库,其中该噬菌体文库表达人类抗体(沃格汉(Vaughan)等,《自然-生物技术》(Nature Biotechnology)14:309-314(1996):夏特(Sheets)等,《美国国家科学院院刊》95:6157-6162(1998))。在其他实施例中,人类结合对可以从在如酵母等真核细胞中产生的组合抗体文库分离。参见例如,U.S.P.N.7,700,302。这些技术有利地允许进行大量候选调节剂的筛选并且提供对候选序列的相对容易的操作(例如,通过亲和力成熟或重组改组)。
还可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物中来制备人类抗体,这些转基因动物例如为已经使内源免疫球蛋白基因部分地或完全地失活并且引入了人类免疫球蛋白基因的小鼠。在激发之后,观察到人类抗体的产生,这在所有方面都紧密地类似于在人类中所见,包括基因重排、组装及抗体谱系。这一方法描述于例如U.S.P.N.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;及关于XenoMouse技术的U.S.P.N.6,075,181和6,150,584;以及隆伯格(Lonberg)和胡斯扎(Huszar),《国际免疫学评述》(Intern.Rev.Immunol.)13:65-93(1995)中。作为替代方案,可以经由产生针对靶抗原的抗体的人类B淋巴细胞(这些B淋巴细胞可以从罹患赘生性病症的个体回收或可以已经在体外进行免疫接种)进行永生化来制备人类抗体。参见例如,寇勒(Cole)等,《单克隆抗体和癌症疗法》(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy),艾伦R.李斯(Alan R.Liss),第77页(1985);博纳(Boerner)等,《免疫学杂志》(J.Immunol),147(l):86-95(1991);及U.S.P.N.5,750,373。
3.进一步加工
不管如何获得,都可以针对所希望的特征(包括稳固生长、高抗体产量及如以下更详细地论述的所希望的抗体特征)对调节剂产生细胞(例如,杂交瘤、酵母集落等)进行选择、克隆并且进一步筛选。杂交瘤可以在体内在同系动物中、在缺乏免疫系统的动物(例如裸小鼠)中,或在体外于细胞培养物中扩增。选择、克隆并扩增杂交瘤和/或集落(它们各自产生离散的抗体种类)的方法是本领域的普通技术人员众所周知的。
B.重组调节剂的产生
1.综述
一旦来源是完善的,就可以容易地使用常规程序(例如,通过使用能够特异性结合到编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)对编码所希望的DLL3调节剂的DNA进行分离并测序。如果该调节剂是一种抗体,那么分离并且亚克隆的杂交瘤细胞(或噬菌体或酵母衍生的集落)可以用作此类DNA的一种优选来源。必要时,可以如在此所描述对该核酸进行进一步操作以产生多种试剂,包括融合蛋白,或嵌合、人源化或完全人类抗体。更明确地说,可以使用分离的DNA(它可以是经过修饰的)来克隆这些制造抗体的恒定区和可变区序列。
因此,在示例性实施例中,可以使用常规程序(如以下各项中陈述的那些:奥鲁贝(Al-Rubeai)、安(An)及夏利(Shire)等,都同上文,及萨姆布鲁克J.(Sambrook J.)和鲁塞尔D.(Russell D.),《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第3版,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)(2000);奥苏贝尔(Ausubel)等,《精编分子生物学实验指南:当代分子生物学实验指南的方法概要》(Short Protocols in MolecularBiology:A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology),约翰威立公司(Wiley,John & Sons,Inc.)(2002))重组产生抗体,其中分离并且亚克隆的杂交瘤细胞(或噬菌体或酵母衍生的集落)用作核酸分子的优选来源。
如在此所使用,术语“核酸分子”打算包括DNA分子和RNA分子及其人工变体(例如,肽核酸),不管是单链还是双链的。这些核酸可以编码本发明抗体的一条或两条链,或其片段或衍生物。本发明的核酸分子还包括足以用作杂交探针的多核苷酸;用于对编码多肽的多核苷酸进行鉴别、分析、突变或扩增的PCR引物或测序引物;用于抑制多核苷酸的表达的反义核酸;以及互补序列。这些核酸可以是任何长度。它们可以为例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000或更多个核苷酸长度,和/或可以包含一个或多个另外的序列,例如调控序列,和/或作为一个更大核酸(例如载体)的一部分。应理解的是,这些核酸序列可以进行进一步操作以产生多种调节剂,包括嵌合、人源化或完全人类抗体。更明确地说,可以使用分离的核酸分子(它可以是经过修饰的)来克隆这些制造抗体的恒定区和可变区序列,如U.S.P.N.7,709,611中所描述。。
术语“分离的核酸”意谓该核酸(i)在体外例如通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增,(ii)通过克隆来重组地产生,(iii)例如通过裂解和凝胶电泳分级分离来纯化,或(iv)例如通过化学合成来合成。分离的核酸是可用于通过重组DNA技术进行操作的一种核酸。
不管编码该抗体的所希望的免疫反应性部分的核酸的来源是获自或衍生自噬菌体呈现技术、酵母文库、基于杂交瘤的技术还是合成的,应了解的是,本发明涵盖了编码这些抗体或其抗原结合片段或衍生物的核酸分子和序列。另外,本发明针对包含这些核酸分子的载体和宿主细胞。
2.杂交和序列一致性
如所指示的,本发明另外提供了在特定杂交条件下与其他核酸杂交的核酸。更具体地说,本发明涵盖在中等或高严格度杂交条件(例如,如以下所定义)下与本发明的核酸分子杂交的核酸分子。用于杂交核酸的方法是本领域中众所周知的。如众所周知的,中等严格的杂交条件包含一种含5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的预洗涤溶液,具有约50%甲酰胺、6x SSC的杂交缓冲液,及55℃的杂交温度(或其他类似的杂交溶液,如含有约50%甲酰胺的杂交溶液,以及42℃的杂交温度),以及60℃在0.5x SSC、0.1%SDS中的洗涤条件。通过比较,在高度严格的杂交条件下进行的杂交包含在45℃下用6x SSC洗涤,随后在68℃下于0.1x SSC、0.2%SDS中洗涤一次或多次。另外,本领域的普通技术人员可以操作这些杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交的严格度,由此使包含彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致的核苷酸序列的核酸典型地保持彼此杂交。
本发明还包括与所描述的核酸分子“实质上一致”的核酸分子。在一个实施例中,关于核酸序列的术语实质上一致意思可以解释为一系列核酸分子展现出至少约65%、70%、75%、80%、85%或90%的序列一致性。在其他实施例中,这些核酸分子与参考核酸序列展现95%或98%的序列一致性。
影响杂交条件的选择的基本参数以及有关设计适合条件的指导是例如由以下各项陈述:萨姆布鲁克,傅雷特奇(Fritsch)及马纳提斯(Maniatis)(1989,《分子克隆实验指南》,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港,第9和11章;及《现代分子生物学实验技术》(CurrentProtocols in Molecular Biology),1995,奥苏贝尔等编,约翰威立公司,第2.10和6.3-6.4节),并且可以由本领域的普通技术人员基于例如该核酸的长度和/或碱基组成容易地确定。
多肽的序列相似性,又称为序列一致性,典型地使用序列分析软件进行测量。蛋白质分析软件使用了分配不同取代、缺失及其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性措施来匹配相似序列。举例来说,序列分析工具GCG(艾克斯软件公司(Accelrys Software Inc.))含有如“GAP”和“BEST-FIT”等程序,这些程序可以在默认参数下使用以确定紧密相关的多肽(如来自不同生物体物种的同源多肽)之间,或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。(参见例如,6.1版GCG或杜冰(Durbin)等,《生物序列分析:蛋白质和核酸的概率模型》(Biological Sequence Analysis:Probabilistic models of proteinsand nucleic acids.),剑桥出版社(Cambridge Press)(1998))。
也可以使用FASTA,使用默认的或推荐的参数(6.1版GCG中的程序)来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(佩尔森(Pearson)(2000),同上文)。当比较本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库时,另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST,尤其是blastp或tblastn。参见例如,奥特查尔(Altschul)等(1990)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)215:403410;及奥特查尔等(1997)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)25:3389402,各自通过引用结合于此。
就这一点来说,本发明还包括编码关于抗体可变区多肽序列(例如,供体轻链或重链可变区,或受体轻链或重链可变区)“实质上一致”的多肽的核酸分子。当应用于这些多肽时,术语“相当大一致性”或“实质上一致”意谓着,两个肽序列当如通过程序GAP或BEST-FIT,使用默认空格权重最佳地比对时,共有至少60%或65%序列一致性,优选地至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性,甚至更优选地至少93%、95%、98%或99%序列一致性。优选地,不一致的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸残基被具有化学特性(例如,电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体来说,保守氨基酸取代不会实质上改变一种蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情形中,序列一致性百分比或相似性程度可以向上调整以校正该取代的保守性质。
3.表达
重组表达的不同方法,即RNA或RNA和蛋白质/肽的产生,是众所周知的,如例如以下各项中所陈述:伯格(Berger)和凯米尔(Kimmel),《分子克隆技术指南》(Guide to Molecular Cloning Techniques),酶学方法(Methods in Enzymology)第152卷,学术出版公司(AcademicPress,Inc.),加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.);萨姆布鲁克等,《分子克隆实验指南》(第3版),第1-3卷,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港,(2000);及《现代分子生物学实验技术》,F.M.奥苏贝尔等编,《实验室指南》(Current Protocols),格林出版协会公司(Greene Publishing Associates,Inc.)与约翰威立公司(John Wiley & Sons,Inc.)之间的合资企业,(2006年增刊)。
所关注的某些术语包括“表达控制序列”,它包含启动子、核糖体结合位点、增强子及调控基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。如众所周知的,“启动子”或“启动子区”涉及一般位于所表达的核酸序列的上游(5')并且通过为RNA聚合酶提供识别和结合位点来控制序列表达的一种核酸序列。
根据本发明的可相容的示例性启动子包括SP6、T3及T7聚合酶的启动子、人类U6RNA启动子、CMV启动子,及其人工杂交启动子(例如CMV),其中一个部分或多个部分与其他细胞蛋白质(如例如人类GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶))的基因并且包括或不包括一个(多个)另外的内含子的启动子的一个部分或多个部分融合。
在某些实施例中,该核酸分子可以存在于载体中,适当时,带有控制该核酸表达的启动子。众所周知的术语“载体”包含用于核酸的任何中间运载工具,它使得所述核酸例如能够被引入原核和/或真核细胞中,并且适当时,整合到基因组中。转化哺乳动物细胞的方法是本领域中众所周知的。参见例如,U.S.P.Ns.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。这些载体可以包括一个编码本发明抗体的核苷酸序列(例如,完整抗体、抗体重链或轻链、抗体的VH或VL,或其一部分,或者重链或轻链CDR、单链Fv,或其片段或变体),它可操作地连接到一个启动子(参见例如,PCT公开WO 86/05807;PCT公开WO 89/01036;及U.S.P.N.5,122,464)。
多种宿主表达载体系统是可商购的,并且许多与在此的传授内容可相容并且可以用于表达的本发明的调节剂。这些系统包括但不限于,用含有调节剂编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或柯斯质粒DNA表达载体转化的微生物,如细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌);用含有调节剂编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(例如酵母属、毕赤酵母属);用含有调节剂编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;用含有调节剂编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒;烟草花叶病毒)感染或用含有调节剂编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转染的植物细胞系统(例如烟草、阿布属、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等);或带有重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如,COS、CHO、BHK、293、3T3细胞等),这些构建体含有衍生自哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子;牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。
如在此所使用,术语“宿主细胞”涵盖了可以工程改造成产生本发明的多肽和抗原结合分子的任何种类的细胞系统。在一个实施例中,该宿主细胞被工程改造成允许产生一种具有经过修饰的糖型的抗原结合分子。在一个优选实施例中,该抗原结合分子,或变体抗原结合分子,是一种抗体、抗体片段或融合蛋白。在某些实施例中,这些宿主细胞已经进一步操作以表达水平增加的一种或多种具有N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTI11)活性的多肽。可相容的宿主细胞包括培养的细胞,例如(仅举几个例子)哺乳动物的培养细胞,如CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞;酵母细胞;昆虫细胞;及植物细胞,而且包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
对于长期高产率产生重组蛋白来说,稳定表达是优选的。因此,稳定地表达所选调节剂的细胞系可以使用标准的本领域认可的技术进行工程改造。除使用含有病毒复制起点的表达载体外,可以用通过适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸位点等)和可选择标记物控制的DNA来转化宿主细胞。可以使用本领域中众所周知的任何选择系统,包括谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统),该系统提供了一种用于在某些条件下增强表达的有效方法。GS系统是完整或部分结合EP专利0216846、0256055、0323997及0338841以及U.S.P.N.s 5,591,639和5,879,936(各自通过引用结合于此)进行论述。另一个优选的表达系统,FreedomTMCHO-S试剂盒在商业上是由生命技术公司(Life Technologies)(目录号A13696-01)提供的,也允许开发出可以用于产生调节剂的稳定细胞系。
这些宿主表达系统表示多种运载工具,通过这些运载工具,可以产生所关注的编码序列并且随后进行纯化,而且还表示多种细胞,这些细胞当用适当核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本发明的分子。该宿主细胞可以用本发明的两个表达载体共转染,例如,第一载体编码一个重链衍生的多肽并且第二载体编码一个轻链衍生的多肽。
因此,在某些实施例中,本发明提供了允许表达抗体或其部分的重组宿主细胞。通过在这些重组宿主细胞中表达来产生的抗体在此称为重组抗体。本发明还提供了这些宿主细胞的子代细胞,以及由其产生的抗体。
C.化学合成
此外,这些调节剂可以使用本领域中已知的技术化学地合成(例如参见,克雷顿(Creighton),1983,《蛋白质结构与分子原理》(Proteins:Structures and Molecular Principles),纽约W.H.弗雷曼公司(W.H.Freeman & Co.,N.Y.),及汉克派勒M.(Hunkapiller,M.)等,1984,《自然》310:105-111)。另外,必要时,可以将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物(如常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、a-胺基丁酸、4-胺基丁酸等)作为一种取代或添加引入到一个多肽序列中。
D.转基因系统
在其他实施例中,可以通过产生对于如免疫球蛋白重链和轻链序列等重组分子来说为转基因并且产生一种可回收形式的希望化合物的哺乳动物或植物,以转基因方式产生调节剂。这包括例如山羊、牛或其他哺乳动物的乳汁中蛋白质调节剂(例如抗体)的产生及其回收。参见例如,U.S.P.Ns.5,827,690、5,756,687、5,750,172及5,741,957。在一些实施例中,对包含人类免疫球蛋白基因座的非人类转基因动物进行免疫接种以产生抗体。
其他转基因技术陈述于以下各项中:霍甘(Hogan)等,《小鼠胚胎操作实验指南》(Manipulating the Mouse Embryo:A LaboratoryManual)第2版,冷泉港出版社(1999);杰克森(Jackson)等,《小鼠遗传学与转基因学实践方法》(Mouse Genetics and Transgenics:APractical Approach),牛津大学出版社(Oxford University Press)(2000);及皮克特(Pinkert),《转基因动物技术实验手册》(TransgenicAnimal Technology:A Laboratory Handbook),学术出版社(1999),和U.S.P.N.6,417,429。在一些实施例中,这些非人类动物是小鼠、大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马,并且所希望的产物是在血液、乳汁、尿、唾液、泪、粘液及易于使用本领域认可的纯化技术可获得的其他体液中产生的。
其他可相容的产生系统包括用于在植物中制备抗体的方法,如描述于例如U.S.P.Ns.6,046,037和5,959,177(这些文献关于这些技术结合于此)中。
E.分离/纯化
一旦已经通过重组表达或任何其他所披露的技术产生了本发明的调节剂,就可以通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白或蛋白质的任何方法对其进行纯化。就这一点来说,该调节剂可以是“分离的”,意谓它已经从其天然环境的组分鉴别并分离和/或回收。其天然环境的污染组分是会干扰该多肽的诊断或治疗应用的材料,并且可以包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的调节剂包括一种在重组细胞内原位的调节剂,因为该多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。
如果在细胞内产生所希望的分子,那么作为一个第一步骤,可以例如通过离心或超滤来去除宿主细胞或溶解的片段的颗粒状碎片。在将该调节剂分泌到培养基中的情况下,一般首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器,例如艾美康(Amicon)或佩利康(Pellicon)超滤单元(密理博公司(Millipore Corp.)),对来自这些表达系统的上清液进行浓缩。一旦去除了不溶性污染物,就可以使用标准技术,如例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析及亲和色谱法对该调节剂制剂进行进一步纯化,其中亲和色谱法特别值得关注。就这一点来说,蛋白质A可以用来纯化基于人类IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体(林德马克(Lindmark)等,《免疫方法杂志》(J Immunol Meth)62:1(1983)),而蛋白质G被推荐用于所有小鼠同型和人类IgG3(古斯(Guss)等,《欧洲分子生物学学会杂志》5:1567(1986))。取决于有待回收的抗体,也可使用其他用于蛋白质纯化的技术,如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素上进行的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的琼脂糖凝胶色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE及硫酸铵沉淀。在特别优选的实施例中,本发明的调节剂将至少部分使用蛋白质A或蛋白质G亲和色谱法进行纯化。
VI.DLL3调节剂片段和衍生物
无论选择何种产生和生产方法,本发明的调节剂都将与靶决定子(例如抗原)反应、结合、组合、复合、连接、附接、接合、相互作用或以其他方式缔合,并藉此提供所希望的结果。在该调节剂包含一种抗体或其片段、构建体或衍生物的情况下,这些缔合可以通过在该抗体上表达的一个或多个“结合位点”或“结合组分”进行,其中一个结合位点包含一种多肽中负责选择性地结合到所关注的靶分子或抗原的区域。结合结构域包含至少一个结合位点(例如,完整IgG抗体将具有两个结合结构域和两个结合位点)。示例性结合结构域包括抗体可变结构域、配体的受体结合结构域、受体的配体结合结构域或酶结构域。
A.抗体
如以上所述,术语“抗体”打算至少涵盖多克隆抗体(polyclonalantibody)、多克隆抗体(multiclonal antibody)、嵌合抗体、CDR移植的抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、人类抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗独特型抗体以及合成抗体。
B.片段
无论选择何种形式的调节剂(例如,嵌合、人源化等形式)来实行本发明,应理解的是,其免疫反应性片段都可以根据在此的传授内容使用。“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用,术语抗体分子的“片段”包括抗体的抗原结合片段,并且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体中与所选抗原或其免疫原性决定子免疫特异性结合或反应,或与衍生这些片段的完整抗体竞争特异性抗原结合的多肽片段。
示例性片段包括:VL、VH、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体片段、微型双功能抗体、线性抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。此外,活性片段包含该抗体中保持它与抗原/底物或受体相互作用的能力并且以类似于完整抗体的方式(不过可能具有略微降低的效率)对其进行修饰的一部分。
在其他实施例中,抗体片段是包含Fc区并且保持当存在于完整抗体中时通常与Fc区相关的至少一种生物功能(如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能及补体结合)的抗体片段。在一个实施例中,抗体片段是具有的体内半衰期实质上类似于完整抗体的一种单价抗体。举例来说,此类抗体片段可以包含一个连接到能够赋予该片段体内稳定性的Fc序列的抗原结合臂。
如本领域的普通技术人员将充分认识到的,片段可以经由化学或酶处理(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)完整或完全抗体或抗体链,或者通过重组手段获得。有关抗体片段的更详细说明,参见例如,《基础免疫学》(Fundamental Immunology),W.E.鲍尔(W.E.Paul)编,纽约瑞文出版社(Raven Press,N.Y.)(1999)。
C.衍生物
本发明另外包括包含一种或多种修饰的免疫反应性调节剂衍生物和抗原结合分子。
1.多价抗体
在一个实施例中,本发明的调节剂可以是单价或多价(例如二价、三价等)的。如在此所使用,术语“价态”是指与一种抗体缔合的潜在靶结合位点的数目。每一靶结合位点特异性结合一个靶分子或在靶分子上的特定位置或基因座。当一种抗体是单价时,该分子的每个结合位点将特异性结合到单一抗原位置或表位。当一种抗体包含超过一个靶结合位点(多价)时,每个靶结合位点可以特异性结合相同或不同的分子(例如,可以结合到不同的配体或不同的抗原,或在同一抗原上的不同表位或位置)。参见例如,U.S.P.N.2009/0130105。在每一情形中,这些结合位点中至少一个将包含与一种DLL3同功异型物缔合的表位、基元或结构域。
在一个实施例中,这些调节剂是双特异性抗体,其中两条链具有不同的特异性,如米尔斯坦(Millstein)等,1983,《自然》,305:537-539中所描述。其他实施例包括具有另外的特异性的抗体,如三特异性抗体。其他更复杂的可相容多特异性构建体及其制造方法陈述于U.S.P.N.2009/0155255,以及WO 94/04690;苏瑞希(Suresh)等,1986,《酶学方法》(Methods in Enzymology),121:210;及WO96/27011中。
如以上暗指的,多价抗体可以免疫特异性结合到所希望的靶分子的不同表位或可以免疫特异性结合到靶分子以及异源表位,如异源多肽或固体支撑材料。尽管抗DLL3抗体的优选实施例仅结合两个抗原(即,双特异性抗体),但本发明也涵盖具有另外的特异性的抗体,如三特异性抗体。双特异性抗体还包括交联或“异种偶联”抗体。举例来说,在该异种偶联物中的一种抗体可以偶合到抗生物素蛋白,另一种偶合到生物素。已经例如提出这些抗体使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(U.S.P.N.4,676,980),并且用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。异种偶联抗体可以使用任何常规的交联方法制备。适合的交联剂以及多种交联技术是本领域中众所周知的,并且披露于U.S.P.N.4,676,980中。
在又其他实施例中,使用本领域的普通技术人员众所周知的方法,将具有希望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列(如包含铰链区、CH2和/或CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域)融合。
2.Fc区修饰
除对于以上陈述的所披露的调节剂(例如,Fc-DLL3或抗DLL3抗体)的可变区或结合区的不同修饰、取代、添加或缺失以外,本领域的普通技术人员应理解的是,所选本发明的实施例还可以包含恒定区(即,Fc区)的取代或修饰。更明确地说,预期本发明的DLL3调节剂可以尤其含有一个或多个另外的氨基酸残基取代、突变和/或修饰,它们产生一种具有优选的特征的化合物,这些特征包括但不限于:改变的药物动力学、增加的血清半衰期、增加的结合亲和力、降低的免疫原性、增加的产量、改变的与Fc受体(FcR)的Fc配体结合、增强或减弱的“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)或“CDC”(补体依赖性细胞毒性)活性、改变的糖基化和/或二硫键及改良的结合特异性。就这一点来说,应理解的是,这些Fc变体可以有利地用于增强所披露的调节剂的有效抗赘生特性。
为此,本发明的某些实施例可以包含Fc区的取代或修饰,例如一个或多个氨基酸残基的添加、取代、突变和/或修饰,以产生一种具有增强的或优选的Fc效应功能的化合物。举例来说,涉及Fc结构域与Fc受体(例如,FcγRI、FcγRIIA和B、FcγRIII及FcRn)之间的相互作用的氨基酸残基的变化可以导致细胞毒性增加和/或药物动力学改变,如血清半衰期增加(参见例如,拉维奇(Ravetch)和金纳特(Kinet),《免疫学年鉴》(Annu.Rev.Immunol)9:457-92(1991);卡佩尔(Capel)等,《免疫方法》(Immunomethods)4:25-34(1994);及德哈斯(de Haas)等,《实验与临床医学杂志》(J.Lab.Clin.Med.)126:330-41(1995),各自通过引用结合于此)。
在所选实施例中,具有增加的体内半衰期的抗体可以通过对鉴别为涉及Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基进行修饰(例如,取代、缺失或添加)来产生(参见例如,国际公开号WO 97/34631;WO 04/029207;U.S.P.N.6,737,056和U.S.P.N.2003/0190311)。就这些实施例来说,Fc变体可以在哺乳动物,优选人类中提供超过5天、超过10天、超过15天、优选超过20天、超过25天、超过30天、超过35天、超过40天、超过45天、超过2个月、超过3个月、超过4个月或超过5个月的半衰期。半衰期的增加引起更高的血清滴度,由此使抗体给与的频率降低和/或使有待给与的抗体的浓度降低。可以例如在表达人类FcRn的转基因小鼠或转染的人类细胞系中,或在给与了具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中,对人类FcRn高亲和力结合多肽在体内与人类FcRn的结合及血清半衰期进行检验。WO 2000/42072描述了与FcRn的结合改善或减少的抗体变体。也参见例如,谢尔德(Shields)等,《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)9(2):6591-6604(2001)。
在其他实施例中,Fc变化可以引起ADCC或CDC活性的增强或减弱。如本领域中所知,CDC是指在补体存在下靶细胞的溶解,并且ADCC是指一种细胞毒性形式,其中结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如,自然杀手细胞、中性粒细胞及巨噬细胞)上的FcR的分泌型Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合到带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀灭靶细胞。在本发明的上下文中,提供了具有“变化的”FcR结合亲和力的抗体变体,如与亲本或未修饰抗体或与包含天然序列FcR的抗体相比较,它具有增强或减少的结合。呈现出减少的结合的这些变体可以具有极少或没有可感知的结合,例如与天然序列相比较,0-20%结合到FcR,例如,如通过本领域中众所周知的技术所测定。在其他实施例中,如与天然免疫球蛋白Fc结构域相比较,该变体将展现增强的结合。应理解的是,这些类型的Fc变体可以有利地用于增强所披露的抗体的有效抗赘生特性。在又其他实施例中,这些变化引起结合亲和力的增加、免疫原性的降低、产量增加、糖基化和/或二硫键(例如,对于偶联位点)变化、结合特异性改良、胞噬作用增加,和/或细胞表面受体(例如,B细胞受体;BCR)下调等。
3.变化的糖基化
又其他实施例包含一种或多种工程改造的糖型,即,包含变化的糖基化模式或变化的共价附接到该蛋白质(例如,在Fc结构域中)的碳水化合物的组成的DLL3调节剂。参见例如,谢尔德R.L.等(2002),《生物化学杂志》277:26733-26740。工程改造的糖型可以用于多种目的,包括但不限于,增强或减弱效应功能、增加调节剂对靶的亲和力或促进调节剂的产生。在希望降低效应功能的某些实施例中,该分子可以工程改造成表达一种去糖基化的形式。可以引起一个或多个可变区构架糖基化位点的消除以藉此消除该位点处的糖基化的取代是众所周知的(参见例如,U.S.P.Ns.5,714,350和6,350,861)。相反地,可以通过在一个或多个另外的糖基化位点中进行工程改造来赋予含Fc分子增强的效应功能或改善的结合。
其他实施例包括一种具有变化的糖基化组成的Fc变体,如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的对分GlcNAc结构的抗体。已证明这些变化的糖基化模式可增加抗体的ADCC能力。工程改造过的糖型可以通过本领域的普通技术人员已知的任何方法产生,例如,通过使用工程改造的或变体表达株、通过与一种或多种酶(例如,N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnTI11))共表达、通过在不同生物体或来自不同生物体的细胞系中表达一种包含Fc区的分子、或通过在表达了包含Fc区的分子之后对碳水化合物进行修饰(参见例如,WO 2012/117002)。
4.另外的加工
这些调节剂可以在产生期间或之后有差别地进行修饰,例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、以已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、连接到抗体分子或其他细胞配体等。众多化学修饰中的任一种可以通过已知技术进行,包括但不限于,通过溴化氰进行特异性化学裂解、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4、乙酰化、甲酰化、氧化、还原、在衣霉素存在下进行代谢合成等。
本发明还涵盖不同的翻译后修饰,包括例如N连接或O连接的碳水化合物链、N末端或C末端加工、化学部分附接到氨基酸主链、N连接或O连接的碳水化合物链的化学修饰,及由原核宿主细胞表达引起的N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。另外,这些调节剂还可以用如酶标记、荧光标记、放射性同位素标记或亲和标记等可检测标记进行修饰,以允许该调节剂的检测和分离。
VII.调节剂特征
不管如何获得调节剂或该调节剂呈现何种以上提到的形式,所披露的调节剂的不同实施例都可以展现某些特征。在所选实施例中,可以针对有利的特性,包括例如稳固生长、高调节剂产量及如以下更详细地论述的所希望的调节剂特征,对抗体产生细胞(例如,杂交瘤或酵母集落)进行选择、克隆并且进一步筛选。在其他情形中,可以通过选择用于接种动物的特定抗原(例如,特定DLL3同功异型物)或靶抗原的免疫反应性片段来赋予或影响该调节剂的特征。在又其他实施例中,所选调节剂可以如以上所描述进行工程改造以增强或精制免疫化学特征,如亲和力或药物动力学。
A.中和调节剂
在某些实施例中,这些调节剂将包含“中和”抗体或者其衍生物或片段。也就是说,本发明可以包含多个抗体分子,这些抗体分子结合特定结构域、基元或表位并且能够使DLL3的生物活性阻断、降低或抑制。更总体来说,术语“中和抗体”是指与靶分子或配体结合或相互作用并且防止该靶分子与结合搭配物(如受体或底物)结合或缔合,藉此中断另外将由这些分子的相互作用引起的生物反应的一种抗体。
应理解的是,可以使用本领域中已知的竞争性结合检验来评估抗体或其免疫功能片段或衍生物的结合和特异性。就本发明来说,当如例如通过Notch受体活性或在体外竞争性结合检验中所测量,过量的抗体使结合到DLL3的结合搭配物的量减少至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多时,抗体或片段将被视作抑制或减少DLL3与结合搭配物或底物的结合。在针对例如DLL3的抗体的情形中,中和抗体或拮抗剂将优选使Notch受体活性变化至少约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多。应理解的是,这一改良的活性可以使用本领域认可的技术直接地测量,或可以通过变化的活性的下游影响(例如,瘤发生、细胞存活或Notch反应性基因的活化或抑制)来测量。优选地,抗体中和DLL3活性的能力是通过抑制DLL3与Notch受体的结合或通过评估它减轻DLL3介导的Notch信号传导的阻遏的能力来评估。
B.内化调节剂
有证据证明,相当大部分的所表达的DLL3蛋白保持与肿瘤发生细胞表面的缔合,藉此允许所披露的调节剂的定位和内化。在优选实施例中,这些调节剂可以与在内化之后杀灭细胞的抗癌剂(如细胞毒性部分)缔合或偶联。在特别优选的实施例中,该调节剂将包含一种内化抗体药物偶联物。
如在此所使用,“内化”的调节剂是在结合到所缔合的抗原或受体之后被细胞吸收(以及任何载荷)的调节剂。如所理解的,在优选实施例中,该内化调节剂可以包含一种抗体(包括抗体片段及其衍生物),以及抗体偶联物。内化可以在体外或体内发生。对于治疗应用,内化将优选在有需要的受试者中在体内发生。内化的抗体分子的数量可以足以或适于杀灭抗原表达细胞,尤其是抗原表达癌症干细胞。取决于抗体或抗体偶联物的效力,在一些情况下,将单个抗体分子吸收到细胞中足以杀灭该抗体所结合的靶细胞。举例来说,某些毒素高度有效以致偶联到抗体的数分子毒素的内化就足以杀灭肿瘤细胞。抗体在结合到哺乳动物细胞之后是否内化可以通过不同的检验来测定,包括以下实例(例如实例12和15-17)中所描述的那些。检测一种抗体是否内化到细胞中的方法也描述于U.S.P.N.7,619,068中,该案通过引用以其全文结合于此。
C.耗竭调节剂
在其他实施例中,这些抗体将包含耗竭抗体或其衍生物或片段。术语“耗竭”抗体是指优选地与在细胞表面之上或附近的抗原结合或缔合并且诱导、促进或引起该细胞的死亡或消除(例如,通过CDC、ADCC或引入细胞毒性剂)的一种抗体。在一些实施例中,所选耗竭抗体将与一种细胞毒性剂缔合或偶联。
优选地,耗竭抗体将能够使预定的细胞群中至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的DLL3肿瘤发生细胞去除、失能、消除或杀灭。在一些实施例中,该细胞群可以包含富集、分割、纯化或分离的肿瘤保持细胞。在其他实施例中,该细胞群可以包含完整肿瘤样品或异种肿瘤提取物,它们包含肿瘤保持细胞。本领域的普通技术人员应理解,可以使用如以下实例(例如实例13和14)中所描述的标准生物化学技术,根据在此的传授内容对肿瘤发生细胞或肿瘤保持细胞的耗竭进行监测并定量。
D.面元划分和表位结合
还应理解的是,所披露的抗DLL3抗体调节剂将与由所选靶或其片段呈现的离散的表位或免疫原性决定子缔合或结合。在某些实施例中,表位或免疫原性决定子包括化学活性表面分子群,如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基,并且在某些实施例中,可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。因此,如在此所使用,术语“表位”包括能够特异性结合到免疫球蛋白或T细胞受体,或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定子。在某些实施例中,当一种抗体优先地识别它在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时,认为它与抗原特异性结合(或免疫特异性结合或反应)。在优选实施例中,当平衡解离常数(KD)小于或等于10-6M或更低,或等于10-7M时,更优选地当平衡解离常数小于或等于10-8M,并且甚至更优选地当解离常数小于或等于10-9M时,认为抗体特异性结合抗原。
更直接地,术语“表位”是以其常用的生物化学含义使用并且是指靶抗原的能够被特定抗体调节剂识别并特异性结合的部分。当该抗原为一种多肽(如DLL3)时,表位一般可以由通过蛋白质的三级折叠而并置的连续氨基酸和不连续氨基酸形成(“构象表位”)。在此类构象表位中,相互作用的点横过蛋白质上彼此线性地分开的氨基酸残基发生。由连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)在蛋白质变性之后典型地保留,而通过三级折叠形成的表位在蛋白质变性之后典型地丧失。在任何情形中,抗体表位典型地在独特的空间构象中包括至少3个并且更通常,至少5个或8-10个氨基酸。
就这一点来说,应理解的是,在某些实施例中,表位可以与DLL3蛋白的一个或多个区域、结构域或基元(例如,同功异型物1的氨基酸1-618)缔合或驻留在该一个或多个区域中。如在此更详细地论述的,DLL3蛋白的细胞外区域包含一系列一般认可的结构域,包括六个EGF样结构域和DSL结构域。出于本披露的目的,术语“结构域”将根据它一般认可的意义使用并且将被视作是指在蛋白质内展现显著的二级结构含量的一种可鉴别或可确定的保守结构实体。在许多情形中,具有共同功能的同源结构域通常将显示出序列相似性并且在许多全异的蛋白质中发现(例如,EGF样结构域被报导在至少471种不同蛋白质中发现)。类似地,本领域认可的术语“基元”将根据其常用的意义使用并且一般应当指蛋白质中典型地十到二十个连续氨基酸残基的一个短的保守区域。如通篇所论述,所选实施例包含与DLL3特定区域、结构域或基元内的一个表位缔合或结合的调节剂。
在任何情形中,一旦在抗原上确定了所希望的表位,就有可能例如通过使用本发明中所描述的技术,用包含该表位的肽进行免疫接种来产生针对该表位的抗体。作为替代方案,在该发现过程期间,抗体的产生和表征可以阐明有关位于特定结构域或基元中的所希望的表位的信息。从这一信息,然后有可能针对结合到同一表位竞争性筛选抗体。实现这一点的一种方法是进行进行竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体,即,竞争与该抗原的结合的抗体。基于交叉竞争对于抗体进行面元划分的高通量方法描述于WO 03/48731中。以下实例9和10中陈述了面元划分或结构域水平或表位定位的其他方法,包括调节剂竞争或在酵母上进行抗原片段表达。
如在此所使用,术语“面元划分”是指基于抗原结合特征和竞争而对于抗体进行分组或分类而使用的方法。尽管这些传授内容可用于对本发明的调节剂进行定义并分类,但这些结合不总是与表位直接地相关并且表位结合的这些初始确定可以通过如在此所描述的其他本领域认可的方法进一步精制并确定。然而,如以下实例中所论述并显示,将抗体调节剂凭经验分配到个别面元提供了可以指示所披露的调节剂的治疗潜力的信息。
更具体地说,可以通过使用本领域中已知并且在此的实例中所陈述的方法确定所选参考抗体(或其片段)是否与第二测试抗体(即,在同一面元中)结合相同的表位或交叉竞争结合。在一个实施例中,参考抗体调节剂在饱和条件下与DLL3抗原缔合,并且然后,使用标准免疫化学技术测定第二或测试抗体调节剂结合到DLL3的能力。如果该测试抗体能够与参考抗DLL3抗体同时实质上结合到DLL3,那么该第二或测试抗体结合到与一次或参考抗体不同的表位。然而,如果该测试抗体不能够同时实质上结合到DLL3,那么该测试抗体结合到相同表位、重叠表位或与一次抗体所结合的表位紧密邻近(至少在空间上)的表位。也就是说,该测试抗体竞争抗原结合并且与参考抗体处于相同面元中。
当用于所披露的调节剂的上下文中时,术语“竞争”或“竞争抗体”意谓如通过一种检验所测定的抗体之间的竞争,在该检验中,测试抗体或免疫功能片段在测试时阻止或抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合。典型地,此类检验涉及使用结合到固体表面或带有未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白这些中的任一种的细胞的纯化抗原(例如,DLL3或其结构域或片段)。竞争性抑制是通过在测试免疫球蛋白存在下,测定结合到固体表面或细胞的标记的量来测量。通常,该测试免疫球蛋白是以过量存在和/或允许首先结合。通过竞争检验(竞争抗体)鉴别的抗体包括结合到与参考抗体相同的表位的抗体及结合到与参考抗体所结合的表位足够地邻近以致发生空间位阻的相邻表位的抗体。有关用于测定竞争性结合的方法的其他细节提供于在此的实例中。通常,当竞争抗体过量存在时,它将使参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情况下,结合被抑制至少80%、85%、90%、95%或97%,或更多。
相反地,当参考抗体结合时,它将优选地使随后添加的测试抗体(即,DLL3调节剂)的结合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情况下,测试抗体的结合被抑制至少80%、85%、90%、95%或97%,或更多。
就本发明来说并且如以下实例9和10中所陈述,已经确定(经由表面等离子共振或生物层干涉法)的是,DLL3的细胞外结构域通过竞争性结合确定至少九个面元,在此称为“面元A”到“面元I”。已知通过调节剂面元划分技术所提供的解决方案,相信这九个面元包含存在于DLL3蛋白的细胞外区域中的大多数面元。
就这一点来说,并且如本领域中已知并如以下实例中所详述,所希望的面元划分或竞争性结合数据可以使用固相直接或间接放射性免疫检验(RIA)、固相直接或间接酶免疫检验(EIA或ELISA)、夹心竞争检验、BiacoreTM2000系统(即,表面等离子共振—GE医疗集团(GEHealthcare))、分析仪(即,生物层干涉法—福特生物有限公司(ForteBio,Inc.))或流式细胞法获得。如在此所使用,术语“表面等离子共振”是指一种光学现象,它允许通过检测生物传感器矩阵内蛋白质浓度的变化来分析实时特异性相互作用。术语“生物层干涉法”是指分析从以下两个表面反射的白光的干涉图案的一种光学分析技术:生物传感器尖端上固定的蛋白质层和内部参考层。结合到生物传感器尖端的分子数量的任何改变都引起可以实时测量的干涉图案的转变。在特别优选的实施例中,该分析(无论是表面等离子共振、生物层干涉法还是流式细胞术)是使用Biacore或ForteBio仪器或流式细胞仪(例如,FACSAria II)进行的,如以下实例中所证实。
为了进一步表征所披露的DLL3抗体调节剂所缔合或结合的表位,使用寇克伦(Cochran)等(《免疫方法杂志》(J Immunol Methods.)287(1-2):147-158(2004),通过引用结合于此)所描述的方案的改良方案来进行结构域水平的表位定位。简单地说,在酵母表面上对包含特定氨基酸序列的DLL3的个别结构域进行表达并且通过流式细胞术测定每一DLL3抗体的结合。结果论述于下实例10中并且示于图14A和14B中。
其他可相容的表位定位技术包括丙氨酸扫描突变体、肽印迹(雷纳克(Reineke)(2004)《分子生物学方法》(Methods Mol Biol)248:443-63)(通过引用以其全文特定地结合于此)或肽裂解分析。此外,可以采用如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰等方法(汤莫(Tomer)(2000)《蛋白质科学》(Protein Science)9:487-496)(通过引用以其全文特定地结合于此)。在其他实施例中,修饰辅助的谱分析(MAP),又称为基于抗原结构的抗体谱分析(ASAP)提供了这样一种方法,该方法根据每一抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合谱的相似性对针对相同抗原的大量单克隆抗体(mAb)进行分类(U.S.P.N.2004/0101920,通过引用以其全文特定地结合于此)。每一类别可以反映与另一类别所代表的表位明显不同或部分地重叠的独特表位。这一技术允许对遗传上一致的抗体进行快速过滤,由此表征可以集中在遗传上相异的抗体。应理解的是,可以使用MAP将本发明的hDLL3抗体调节剂分选到结合不同表位的抗体组中。
可用于改变固定的抗原的结构的试剂包括多种酶,如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)。可用于改变固定的抗原的结构的试剂还可以是化学试剂,如琥珀酰亚胺基酯及其衍生物、含伯胺化合物、肼及碳酰肼、游离氨基酸等。
抗原蛋白可以固定在生物传感器芯片表面或聚苯乙烯珠粒上。后者可以用例如一种检验(如多重LUMINEXTM检测检验(路明克斯公司(LuminexCorp.))进行加工。由于LUMINEX能够以多达100种不同类型的珠粒处理多重分析,故LUMINEX提供了几乎无限的具有不同修饰的抗原表面,使得经生物传感器检验进行抗体表位谱分析的解决方案得以改善。
E.调节剂结合特征
除表位特异性外,所披露的抗体可以使用如例如结合亲和力等物理特征来表征。就这一点来说,本发明另外涵盖了对一种或多种DLL3同功异型物具有高结合亲和力或在全抗体情形中对于DLL家族的超过一个成员具有高结合亲和力的抗体的使用。
如在此所使用,术语“KD”打算是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。当解离常数KD(koff/kon)≤10-7M时,本发明的抗体被认为免疫特异性结合其靶抗原。当KD≤5×10-9M时,该抗体以高亲和力特异性结合抗原,并且当KD≤5×10-10M时以极高亲和力特异性结合抗原。在本发明的一个实施例中,该抗体具有≤10-9M的KD及约1×10-4/sec的解离速率。在本发明的一个实施例中,解离速率<1×10-5/sec。在本发明的其他实施例中,这些抗体将以介于约10-7M与10-10M之间的KD结合到DLL3,并且在又另一实施例中,它将以KD≤2×10-10M结合。本发明的又其他所选实施例包含具有的解离常数或KD(koff/kon)小于10-2M、小于5×10-2M、小于10-3M、小于5×10-3M、小于10-4M、小于5×10-4M、小于10-5M、小于5×10-5M、小于10-6M、小于5×10-6M、小于10-7M、小于5×10-7M、小于10-8M、小于5×10-8M、小于10-9M、小于5×10-9M、小于10-10M、小于5×10-10M、小于10-11M、小于5×10-11M、小于10-12M、小于5×10-12M、小于10-13M、小于5×10-13M、小于10-14M、小于5×10-14M、小于10-15M或小于5×10-15M的抗体。
在具体实施例中,免疫特异性结合到DLL3的本发明抗体具有的缔合速率常数或kon(或ka)速率(DLL3(Ab)+抗原(Ag)k on←Ab-Ag)为至少105M-ls-l、至少2×105M-ls-l、至少5×105M-ls-l、至少106M-ls-l、至少5×106M-ls-l、至少107M-ls-l、至少5×107M-ls-l或至少108M-ls-l。
在另一个实施例中,免疫特异性结合到DLL3的本发明抗体具有的解离速率常数或koff(或kd)速率(DLL3(Ab)+抗原(Ag)k off←Ab-Ag)小于10-1s-1、小于5×10-1s-1、小于10-2s-1、小于5×10-2s-1、小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于10-7s-1、小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-1。
在本发明的其他所选实施例中,抗DLL3抗体具有的亲和力常数或Ka(kon/koff)将为至少102M-1、至少5×102M-1、至少103M-1、至少5×103M-1、至少104M-1、至少5×104M-1、至少105M-1、至少5×105M-1、至少106M-1、至少5×106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×1010M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、至少5×1012M-1、至少1013M-1、至少5×1013M-1、至少1014M-1、至少5×1014M-1、至少1015M-1或至少5×1015M-1。
除以上提到的调节剂特征外,本发明的抗体可以使用包括例如热稳定性(即,熔融温度;Tm)和等电点在内的另外的物理特征进一步表征。(参见例如,布杰奎斯特(Bjellqvist)等,1993,《电泳》(Electrophoresis)14:1023;维摩(Vermeer)等,2000,《生物物理学杂志》(Biophys.J.)78:394-404;维摩等,2000,《生物物理学杂志》79:2150-2154,各自通过引用结合于此)。
VIII.偶联的调节剂
A.综述
一旦根据在此的传授内容产生和/或制造并选择了本发明的调节剂,就可以将其与药物活性或诊断部分或生物可相容的改良剂相连接、融合、偶联(例如,共价或非共价地)或以其他方式缔合。如在此所使用,术语“偶联物”或“调节剂偶联物”或“抗体偶联物”将在广义上使用并且被视作意谓与所披露的调节剂缔合的任何生物活性或可检测分子或药物,不管缔合方法如何。就这一点来说,应了解的是,这些偶联物除所披露的调节剂外,还可以包含肽、多肽、蛋白质、在体内代谢成一种活性剂的前药、聚合物、核酸分子、小分子、结合剂、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子及放射性同位素。另外,如以上所指示,所选的偶联物可以与该调节剂共价或非共价缔合或连接,并且至少部分取决于用于实现该偶联的方法而展现不同的化学计量的摩尔比率。
本发明的特别优选的方面将包含抗体调节剂偶联物或抗体-药物偶联物,这些偶联物可以用于诊断和/或治疗增生性病症。应理解的是,除非上下文另作规定,否则术语“抗体-药物偶联物”或“ADC”或公式M-[L-D]n应当被视作涵盖同时包含治疗部分和诊断部分的偶联物。在这些实施例中,抗体-药物偶联物化合物将包含作为调节剂或细胞结合单元(在此缩写为CBA、M或Ab)的DLL3调节剂(典型地为抗DLL3调节剂)、治疗部分(例如抗癌剂)或诊断部分(D)及任选地一种将该药物与该抗原结合剂接合的连接子(L)。出于本披露的目的,“n”应当被视作意谓从1到20的一个整数。在一个优选的实施例中,该调节剂为一种DLL3mAb,它包含至少一个如以上所描述的来自重链和轻链可变区的CDR。
本领域的普通技术人员应理解,许多不同的反应可用于治疗部分或诊断部分和/或连接子与结合剂的附接或缔合。在所选实施例中,这可以通过结合剂(例如抗体分子)的氨基酸残基的反应来实现,包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的硫氢基及芳香族氨基酸的不同部分。最常用的非特异性共价附接方法之一是用以将化合物的羧基(或氨基)连接到抗体的氨基(或羧基)的碳化二亚胺反应。另外地,已经使用了如二醛或酰亚胺酯等双官能试剂来连接化合物的氨基与抗体分子的氨基。也可用于附接药物与结合剂的是席夫碱反应。这一方法涉及含有二醇或羟基的药物的高碘酸盐氧化,由此形成一种醛,该醛然后与该结合剂反应。附接是经由与结合剂的氨基形成席夫碱来发生。也可以使用异硫氰酸酯和吖内酯作为偶合剂用于共价地附接药物与结合剂。
在其他实施例中,所披露的本发明调节剂可以与赋予所选特征的蛋白质、多肽或肽(例如生物毒素、生物标记物、纯化标签等)偶联或缔合。在某些优选实施例中,本发明涵盖了与异源蛋白质或肽重组地融合或化学地偶联(包括共价和非共价偶联)的调节剂或其片段的用途,其中该蛋白质或肽包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸。该构建体未必需要直接地连接,而是可以通过氨基酸连接子序列发生。举例来说,可以使用抗体,通过将本发明的调节剂与特定细胞表面受体特异性抗体融合或偶联以提供双特异性构建体来使异源多肽在体外或体内靶向表达DLL3的特定细胞类型。另外,与异源多肽融合或偶联的调节剂也可以用于体外免疫检验中并且可以与如本领域中已知的纯化方法(例如his标签)特定地可相容。参见例如,国际公开号WO93/21232;欧洲专利号EP 439,095;楢村(Naramura)等,1994,《免疫学快报》(Immunol.Lett.)39:91-99;美国专利号5,474,981;吉利斯(Gillies)等,1992,PNAS 89:1428-1432;及费尔(Fell)等,1991,《免疫学杂志》(J.Immunol.)146:2446-2452。
B.连接子
除以上提到的肽连接子或间隔子外,应理解的是,可以使用若干其他种类或类型的连接子将所披露的调节剂与药物活性或诊断部分或生物可相容改良剂缔合。在一些实施例中,该连接子在细胞内条件下为可裂解的,由此使该连接子的裂解在细胞内环境中从该抗体释放出药物单元。在又其他实施例中,该连接子单元是不可裂解的,并且该药物是例如通过抗体降解来释放。
ADC的连接子优选在细胞外是稳定的,防止ADC分子聚集并且使ADC在水性介质中并且在单体状态下保持自由地可溶。在运输或传递到细胞中之前,抗体-药物偶联物(ADC)优选地为可溶的并且保持完整,即,该抗体保持连接到药物部分。这些连接子在靶细胞外是稳定的并且可以在细胞内部以某一有效速率裂解。一种有效的连接子将:(i)维持该抗体的特异性结合特性;(ii)允许该偶联物或药物部分的细胞内传递;(iii)保持稳定和完整(即,未裂解),直到该偶联物已经被传递或运输到其靶位点;并且(iv)维持PBD药物部分的细胞毒性、杀细胞作用或细胞生长抑制作用。ADC的稳定性可以通过标准分析技术,如质谱法、HPLC及分离/分析技术LC/MS来测量。抗体与药物部分的共价附接需要该连接子具有两个反应性官能团,即,在反应性的意义上为二价的。可用于附接两个或更多个功能性或生物活性部分(如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原及报告子基团)的二价连接子试剂是已知的,并且由其产生偶联物的方法已经加以描述(赫曼森G.T.(Hermanson,G.T.)(1996)《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques);学术出版社:纽约,第234-242页)。
为此,本发明的某些实施例包含使用通过裂解剂可裂解的一种连接子,该连接子存在于细胞内环境中(例如,在溶酶体或核内体或细胞凹陷内)。该连接子可以例如为一种肽基连接子,它被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于,溶酶体或核内体蛋白酶)裂解。在一些实施例中,该肽基连接子为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。裂解剂可以包括组织蛋白酶B和D及纤溶酶,已知它们各自水解二肽药物衍生物,引起靶细胞内部活性药物的释放。通过硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B可裂解的示例性肽基连接子是包含Phe-Leu的肽,因为已经发现组织蛋白酶-B在癌组织中高度表达。此类连接子的其他实例描述于例如U.S.P.N.6,214,345和U.S.P.N.2012/0078028,各自通过引用以其全文结合于此。在一个特别优选的实施例,通过细胞内蛋白酶可裂解的肽基连接子为Val-Cit连接子、Ala-Val连接子或Phe-Lys连接子,如U.S.P.N.6,214,345中所描述。使用该治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优势是当偶联时典型地衰减,并且该偶联物的血清稳定性典型地高。
在其他实施例中,可裂解连接子是pH敏感性的,即,对在某些pH值下水解敏感。典型地,该pH敏感性连接子在酸性条件下可水解。举例来说,可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定性连接子(例如,腙、肟、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺-乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等)(参见例如,U.S.P.N.5,122,368;5,824,805;5,622,929)。这些连接子在中性pH条件(如在血液中的那些)下相对稳定,但在低于pH 5.5或5.0(近似为溶酶体的pH值)下不稳定。
在又其他实施例中,该连接子在还原条件下为可裂解的(例如,二硫化物连接子)。本领域中已知多种二硫化物连接子,包括例如,可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)及SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成的那些。在又其他特定实施例中,该连接子是一种丙二酸酯连接子(琼森(Johnson)等,1995,《抗癌研究》(Anticancer Res.)15:1387-93)、顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基连接子(罗(Lau)等,1995,《生物有机化学与医药化学》(Bioorg-Med-Chem.)3(10):1299-1304),或3′-N-酰胺类似物(罗等,1995,《生物有机化学与医药化学》3(10):1305-12)。在又其他实施例中,该连接子单元是不可裂解的,并且该药物是通过抗体降解来释放。(参见美国公开号2005/0238649,通过引用以其全文结合于此并用于所有目的)。
更明确地说,在优选实施例中(陈述于U.S.P.N.2011/0256157中,通过引用以其全文结合于此),可相容连接子将包含:
其中星号指示与细胞毒性剂的连接点,CBA是一种细胞结合剂/调节剂,L1为一种连接子,A为一种将L1连接到该细胞结合剂的连接基团,L2为一个共价键或连同-OC(=O)-一起形成一种自分解型连接子,并且L1或L2是一种可裂解连接子。
L1优选为该可裂解连接子,并且可以被视为用于活化该连接子以进行裂解的引发剂。
当存在时,L1和L2的性质可以变化极大。这些基团是基于其裂解特征选择,这些特征可以通过传递该偶联物的位点处的条件规定。在酶作用下裂解的那些连接子是优选的,不过也可以使用通过pH值(例如,酸或碱不稳定的)、温度改变或在照射时(例如,光不稳定的)而可裂解的连接子。在还原或氧化条件下可裂解的连接子也可以用于本发明中。
L1可以包含一个连续的氨基酸序列。该氨基酸序列可以是酶裂解的靶底物,藉此允许从N10位置释放R10。
在一个实施例中,L1是通过酶作用可裂解的。在一个实施例中,该酶是一种酯酶或一种肽酶。
在一个实施例中,L2是存在的并且连同-C(=O)O-形成一种自分解型连接子。在一个实施例中,L2为酶活性的一种底物,藉此允许从N10位置释放R10。
在一个实施例中,在L1在酶作用下可裂解并且L2存在的情况下,该酶将L1与L2之间的键裂解。
L1和L2,当存在时,可以通过选自以下各项的键连接:
-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
L1中连接到L2的氨基可以是氨基酸的N末端,或可以衍生自氨基酸侧链的氨基,例如赖氨酸氨基酸侧链。
L1中连接到L2的羧基可以是氨基酸的C末端,或可以衍生自氨基酸侧链的羧基,例如谷氨酸氨基酸侧链。
L1中连接到L2的羟基可以衍生自氨基酸侧链的羟基,例如丝氨酸氨基酸侧链。
术语“氨基酸侧链”包括见于以下各项中的那些基团:(i)天然存在的氨基酸,如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸;(ii)微量氨基酸,如鸟氨酸和瓜氨酸;(iii)非天然氨基酸、β-氨基酸、天然氨基酸的合成类似物和衍生物;及(iv)其所有对映异构体、非对映异构体、富集异构体、同位素标记(例如,2H、3H、14C、15N)、被保护形式及外消旋混合物。
在一个实施例中,-C(=O)O-和L2一起形成以下基团:
其中星号指示与药物或细胞毒性剂位置的附接点,波浪线指示与连接子L1的附接点,Y为-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-,并且n为0到3。亚苯基环任选地被一个、两个或三个如在此所描述的取代基取代。在一个实施例中,该亚苯基任选地被卤代、NO2、R或OR取代。
在一个实施例中,Y是NH。
在一个实施例中,n是0或1。优选地,n为0。
在Y为NH并且n为0时,自分解型连接子可以称为对氨基苯甲基羰基连接子(PABC)。
当远端位点活化时,该自分解型连接子将允许释放被保护的化合物,沿以下所示的线进行(对于n=0):
其中L*是该连接子的其余部分的活化形式。这些基团具有从受保护的化合物分离活化位点的优势。如以上所描述,亚苯基可以是任选地取代的。
在本文所描述的一个实施例中,基团L*是如在此所描述的连接子L1,它可以包括二肽基团。
在另一个实施例中,-C(=O)O-和L2一起形成选自以下各项的基团:
其中星号、波浪线、Y及n如以上所定义。每个亚苯基环任选地被一个、两个或三个如在此所描述的取代基取代。在一个实施例中,具有Y取代基的亚苯基环是任选地取代的并且不具有Y取代基的亚苯基环为未取代的。在一个实施例中,具有Y取代基的亚苯基环是未取代的并且不具有Y取代基的亚苯基环为未取代的。
在另一个实施例中,-C(=O)O-和L2一起形成选自以下各项的基团:
其中星号、波浪线、Y及n如以上所定义,E为O、S或NR,D为N、CH或CR,并且F为N、CH或CR。
在一个实施例中,D是N。
在一个实施例中,D是CH。
在一个实施例中,E是O或S。
在一个实施例中,F是CH。
在一个优选实施例中,连接子为一种组织蛋白酶不稳定性连接子。
在一个实施例中,L1包含一种二肽。该二肽可以表示为-NH-X1-X2-CO-,其中-NH-和-CO-对应地表示氨基酸基团X1和X2的N末端和C末端。该二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。在该连接子为一种组织蛋白酶不稳定性连接子的情况下,该二肽可以为组织蛋白酶介导的裂解的作用位点。
另外地,对于具有羧基或氨基侧链官能团的那些氨基酸,对应地例如Glu和Lys,CO和NH可以表示该侧链的官能团。
在一个实施例中,二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自:
-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-及-Trp-Cit-,其中Cit为瓜氨酸。
优选地,二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自:
-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-及-Val-Cit-。
最优选地,二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-为-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
可以使用其他二肽组合,包括杜波维克(Dubowchik)等,《生物偶联化学》,2002,13,855-869(通过引用结合于此)所描述的那些。
在一个实施例中,适当时,氨基酸侧链被衍生化。举例来说,一个氨基酸侧链的氨基或羧基可以被衍生化。
在一个实施例中,侧链氨基酸(如赖氨酸)的氨基NH2是一种选自下组的衍生化形式,该组由NHR和NRR’组成。
在一个实施例中,侧链氨基酸(如天冬氨酸)的羧基COOH是一种选自下组的衍生化形式,该组由COOR、CONH2、CONHR及CONRR’组成。
在一个实施例中,适当时,氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基可以是如以下关于基团RL所论述的一种基团。被保护的氨基酸序列是通过酶可裂解的。举例来说,已经确定的是,包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列是通过组织蛋白酶可裂解的。
用于氨基酸侧链的保护基是本领域中众所周知的并且描述于诺瓦生物化学目录(Novabiochem Catalog)中。另外的保护基策略陈述于格里尼与伍兹(Greene and Wuts)的《有机合成中的保护基》中。
用于具有反应性侧链官能团的那些氨基酸的可能的侧链保护基显示于下:
Arg:Z、Mtr、Tos;
Asn:Trt、Xan;
Asp:Bzl、t-Bu;
Cys:Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt;
Glu:Bzl、t-Bu;
Gln:Trt、Xan;
His:Boc、Dnp、Tos、Trt;
Lys:Boc、Z-Cl、Fmoc、Z、Alloc;
Ser:Bzl、TBDMS、TBDPS;
Thr:Bz;
Trp:Boc;
Tyr:Bzl、Z、Z-Br。
在一个实施例中,当存在时,所选的侧链保护与作为封端基团或作为封端基团的一部分提供的一个基团正交。因此,侧链保护基的去除不会去除封端基团或作为该封端基团的一部分的任何保护基官能团。
在本发明的其他实施例中,所选氨基酸是不具有反应性侧链官能性的那些。举例来说,氨基酸可以选自:Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro及Val。
在一个实施例中,该二肽是与自分解型连接子组合使用。该自分解型连接子可以连接到-X2-。
在存在自分解型连接子的情况下,-X2-直接地连接到该自分解型连接子。优选地,基团-X2-CO-连接到Y(其中Y为NH),藉此形成基团-X2-CO-NH-。
-NH-X1-直接地连接到A。A可以包含官能团-CO-,藉此与-X1-形成一个酰胺键。
在一个实施例中,L1和L2连同-OC(=O)-一起构成基团NH-X1-X2-CO-PABC。该PABC基团直接地连接到细胞毒性剂。优选地,自分解型连接子和二肽一起形成基团-NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-,该基团图解于下:
其中星号指示与所选细胞毒性部分的附接点,并且波浪线指示与连接子L1的其余部分的附接点或与A的附接点。优选地,波浪线指示与A的附接点。Lys氨基酸的侧链可以例如用Boc、Fmoc或Alloc进行保护,如以上所描述。
作为替代方案,自分解型连接子和二肽一起形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-,该基团图解于下:
其中星号和波浪线如以上所定义。
作为替代方案,自分解型连接子和二肽一起形成基团-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-,该基团图解于下:
其中星号和波浪线如以上所定义。
在本发明的一些是势力中,可以优选的是,如果药物部分含有一个未保护的亚胺键,例如,如果存在部分B,那么该连接子不含游离氨(H2N-)基。因此,如果该连接子具有结构-A-L1-L2-,那么这将优选地不含游离氨基。当该连接子含有一种二肽时,这一优先选择特别相关,例如作为L1;在这一实施例中,优选的是,两个氨基酸之一不是选自赖氨酸。
不希望受理论的束缚,药物部分中的未保护亚胺键与该连接子中的游离氨基的组合可以引起药物-连接子部分的二聚化,这可能干扰此类药物-连接子部分与抗体的偶联。在游离氨基是作为铵离子(H3N+-)存在的情形中,如当使用了强酸(例如TFA)来使游离氨基脱保护时,这些基团的交叉反应可以加速。
在一个实施例中,A是一个共价键。因此,L1与细胞结合剂直接地连接。举例来说,在L1包含连续氨基酸序列的情况下,该序列的N末端可以直接地连接到细胞结合剂。
因此,在A为共价键的情况下,细胞结合剂与L1之间的连接可以选自:
-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-、-NHC(=O)NH-、-C(=O)NHC(=O)-、-S-、-S-S-、-CH2C(=O)-及=N-NH-。
L1中连接到DLL3调节剂的氨基可以是氨基酸的N末端,或可以衍生自氨基酸侧链的氨基,例如赖氨酸氨基酸侧链。
L1中连接到该调节剂的羧基可以是氨基酸的C末端,或可以衍生自氨基酸侧链的羧基,例如谷氨酸氨基酸侧链。
L1中连接到细胞结合剂的羟基可以衍生自氨基酸侧链的羟基,例如丝氨酸氨基酸侧链。
L1中连接到调节剂的硫醇基可以衍生自氨基酸侧链的硫醇基,例如丝氨酸氨基酸侧链。
以上关于L1的氨基、羧基、羟基及硫醇基的评论也适用于细胞结合剂。
在一个实施例中,L2连同-OC(=O)-一起表示:
其中星号指示与N10位置的附接点,波浪线指示与L1的附接点,n为0到3,Y是共价键或官能团,并且E是一种例如通过酶作用或光可活化的基团,藉此产生一种自分解型单元。亚苯基环任选地被一个、两个或三个如在此所描述的取代基进一步取代。在一个实施例中,该亚苯基任选地被卤代、NO2、R或OR进一步取代。优选地,n为0或1,最优选地为0。
E经过选择以致该基团易受活化(例如,通过光或通过酶作用)的影响。E可以是-NO2或葡糖醛酸。前者可能易受硝基还原酶的作用影响,后者易受-葡萄糖苷酸酶的作用影响。
在这一实施例中,当E活化时,该自分解型连接子将允许释放被保护的化合物,沿以下所示的线进行(对于n=0):
其中星号指示与N10位置的附接点,E*为E的活化形式,并且Y如以上所描述。这些基团具有从受保护的化合物分离活化位点的优势。如以上所描述,亚苯基可以任选地被进一步取代。
基团Y可以是与L1的共价键。
基团Y可以是选自以下各项的官能团:
-C(=O)-、-NH-、-O-、-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-、-NHC(=O)NH-、-NHC(=O)NH、-C(=O)NHC(=O)-及-S-。
在L1为二肽的情况下,优选的是,Y为-NH-或-C(=O)-,藉此在L1与Y之间形成酰胺键。在这一实施例中,该二肽序列无需为酶活性的底物。
在另一个实施例中,A是间隔基。因此,L1与细胞结合剂间接地连接。
L1与A可以通过选自以下各项的键连接:
-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
优选地,该连接子含有一个亲电子官能团以与该调节剂上的亲核官能团反应。在抗体上的亲核基团包括但不限于:(i)N末端胺基;(ii)侧链胺基,例如赖氨酸;(iii)侧链硫醇基,例如半胱氨酸;及(iv)糖羟基或氨基,其中该抗体为糖基化的。胺、硫醇及羟基是亲核性的并且能够与连接子部分和连接子试剂上的亲电子基团反应形成共价键,这些连接子部分和连接子试剂包括:(i)顺丁烯二酰亚胺基;(ii)活化的二硫化物;(iii)活性酯,如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯、HOBt(N-羟基苯并三唑)酯、卤代甲酸酯及酸卤化物;(iv)烷基和苯甲基卤化物,如卤代乙酰胺;及(v)醛、酮、羧基,并且其中有一些举例说明如下:
某些抗体具有可还原的链间二硫键,即,半胱氨酸桥。可以通过用如DTT(二硫苏糖醇)等还原剂处理来使抗体对于与连接子试剂偶联具有反应性。每个半胱氨酸桥在理论上将由此形成两种反应性硫醇亲核试剂。另外的亲核基团可以通过赖氨酸与2-亚胺基硫杂环戊烷(托特氏试剂(Traut’s reagent))反应,使得胺转变成硫醇而引入抗体中。反应性硫醇基团可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基而引入抗体中(例如,制备出包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)。US 7521541传授了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸来工程改造抗体。
在一些实施例中,连接子具有一个反应性亲核基团,该基团与抗体上存在的亲电子基团具有反应性。抗体上的有用亲电子基团包括但不限于,醛和酮羰基。连接子的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并且与抗体单元形成共价键。连接子上的有用亲核基团包括但不限于,酰肼、肟、氨基、羟基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯及芳基酰肼。抗体上的亲电子基团提供了一个便利的位点用于与连接子附接。
在一个实施例中,基团A为:
其中星号指示与L1的附接点,波浪线指示与细胞结合剂的附接点,并且n为0到6。在一个实施例中,n是5。
在一个实施例中,基团A为:
其中星号指示与L1的附接点,波浪线指示与细胞结合剂的附接点,并且n为0到6。在一个实施例中,n是5。
在一个实施例中,基团A为:
其中星号指示与L1的附接点,波浪线指示与细胞结合剂的附接点,n为0到1,并且m为0到30。在一个优选实施例中,n为1并且m为0到10、1到8,优选地为4到8并且最优选地为4或8。在另一个实施例中,m为10到30,并且优选地为20到30。作为替代方案,m为0到50。在这一实施例中,m优选地为10到40并且n为1。
在一个实施例中,基团A为:
其中星号指示与L1的附接点,波浪线指示与细胞结合剂的附接点,n为0到1,并且m为0到30。在一个优选实施例中,n为1并且m为0到10、1到8,优选地为4到8并且最优选地为4或8。在另一个实施例中,m为10到30,并且优选地为20到30。作为替代方案,m为0到50。在这一实施例中,m优选地为10到40并且n为1。
在一个实施例中,细胞结合剂与A之间的连接是通过细胞结合剂的硫醇残基与A的顺丁烯二酰亚胺基进行。
在一个实施例中,细胞结合剂与A之间的连接为:
其中星号指示与A的其余部分的附接点,并且波浪线指示与细胞结合剂的其余部分的附接点。在这一实施例中,S原子典型地衍生自调节剂。
在以上每一实施例中,可以使用替代性官能团代替以下所示的顺丁烯二酰亚胺衍生的基团:
其中如前述,波浪线指示与细胞结合剂的附接点,并且星号指示与A基团的其余部分的键。
在一个实施例中,顺丁烯二酰亚胺衍生的基团被以下基团置换:
其中波浪线指示与细胞结合剂的附接点,并且星号指示与A基团的其余部分的键。
在一个实施例中,顺丁烯二酰亚胺衍生的基团被一个基团置换,该基团任选地连同细胞结合剂一起选自:
-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-、-NHC(=O)NH-、-NHC(=O)NH、-C(=O)NHC(=O)-、-S-、-S-S-、-CH2C(=O)-、-C(=O)CH2-、=N-NH-及-NH-N=。
在一个实施例中,顺丁烯二酰亚胺衍生的基团被一个基团置换,该基团任选地连同细胞结合剂一起选自:
其中波浪线指示与细胞结合剂的附接点或与A基团的其余部分的键,并且星号指示与细胞结合剂的另一附接点或与A基团的其余部分的键。
适于将L1连接到所选调节剂的其他基团描述于WO 2005/082023中。
在另一个优选实施例中,本发明的调节剂可以与包含药物连接子单元的生物可相容聚合物缔合。就这一点来说,一个此种类型的可相容聚合物包含聚合物(莫萨纳治疗剂公司(MersanaTherapeutics))。这些聚合物被报导为生物可降解的,耐受性良好并且已经在临床得到验证。另外,这些聚合物与多种可定制的连接子技术和化学可相容,从而允许控制药物动力学、药物释放的定位及生物分布的改善。
所选调节剂也可以直接地偶联放射性同位素,或可以包含可用于偶联放射性金属离子(如在此所描述)的大环螯合剂。在某些实施例中,大环螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N″,N″-四乙酸(DOTA),它可以经由连接子分子附接到抗体。这些连接子分子在本领域中常常为已知的并且描述于德纳多(Denardo)等,1998,《临床癌症研究》(ClinCancer Res.)4:2483;佩特森(Peterson)等,1999,《生物偶联化学》10:553;及泽莫曼(Zimmerman)等,1999,《核医学与生物学》(NuclMed Biol)26:943。
更一般来说,用于将治疗部分或细胞毒性剂偶联到调节剂的技术是众所周知的。如以上所论述,可以通过任何本领域认可的方法,包括但不限于,醛/席夫键联、硫氢基键联、酸不稳定性键联、顺-乌头酰基键联、腙键联、酶可降解键联,将多个部分偶联到调节剂(一般参见加纳特(Garnett),2002,《先进药物传递评论》(Adv Drug Deliv Rev)53:171)。又参见例如,艾蒙(Amon)等,“在癌症疗法中用于药物的免疫靶向的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy)”,《单克隆抗体与癌症疗法》(MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy),瑞斯菲尔德(Reisfeld)等(编),第243-56页(艾伦R.利斯公司(Alan R.Liss,Inc.)1985);希尔斯托(Hellstrom)等,“用于药物传递的抗体(Antibodies For DrugDelivery)”,《药物控制传递》(Controlled Drug Delivery)(第2版),罗宾森(Robinson)等(编),第623-53页(玛西尔戴克公司(Marcel Dekker,Inc.)1987);托普(Thorpe),“癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体评述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review)”,《单克隆抗体第84期:生物和临床应用》(Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications),皮彻阿(Pinchera)等(编),第475-506页(1985);“癌症疗法中放射性标记的抗体的治疗应用的分析、结果及未来展望(Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)”,《用于癌症检测和疗法的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy),博德维(Baldwin)等(编),第303-16页(学术出版社1985);及托普等,1982,《免疫学研究》(Immunol.Rev.)62:119。在优选实施例中,与治疗部分或细胞毒性剂偶联的DLL3调节剂在结合到与细胞表面缔合的DLL3分子之后可以被细胞内化,藉此传递治疗载荷。
C.生物可相容改良剂
在所选实施例中,必要时,本发明的调节剂可以与生物可相容改良剂偶联或以其他方式缔合,这些改良剂可以用于调整、改变、改善或缓和调节剂特征。举例来说,可以通过附接相对较高分子量的聚合物分子(如可商购的聚乙二醇(PEG)或类似的生物可相容聚合物)来产生具有增加的体内半衰期的抗体或融合构建体。本领域的普通技术人员应理解,获得的PEG可以呈许多不同的分子量和分子构象,这些可以经过选择以赋予该抗体特定特性(例如,可以定制半衰期)。PEG可以在存在或不存在多官能连接子情况下,通过PEG与所述抗体或抗体片段的N末端或C末端位点特异性偶联或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基附接到调节剂或抗体片段或衍生物。可以使用使生物活性的损失最少的线性或分支聚合物衍生化。偶联程度可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测以确保PEG分子与抗体的最佳偶联。未反应的PEG可以通过例如尺寸排阻法或离子交换色谱法从抗体-PEG偶联物分离。以一种类似的方式,可以将所披露的调节剂偶联到白蛋白,以便使该抗体或抗体片段在体内更稳定或具有更长的体内半衰期。这些技术是本领域中众所周知的,参见例如,国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137;及欧洲专利号0 413,622。其他生物可相容偶联物对于普通技术人员是显而易见的并且可以容易地根据在此的传授内容鉴别。
D.诊断或检测剂
在其他优选实施例中,将本发明的调节剂,或其片段或衍生物偶联到一种诊断或可检测试剂、标记物或报告子,它可以例如为一种生物分子(例如肽或核苷酸)、小分子、荧光团或放射性同位素。标记的调节剂可以用于监测过度增生性病症的发生或发展,或作为一种临床测试程序的一部分,以确定一种包括所披露的调节剂的特定疗法(即,治疗诊断剂)的功效或确定治疗的未来过程。这些标记物或报告子也可以用于纯化所选调节剂、调节剂分析学(例如表位结合或抗体面元划分)、分开或分离TIC,或用于临床前程序或毒理学研究中。
此类诊断和/或检测可以通过将调节剂与可检测物质偶合实现,这些可检测物质包括但不限于,不同酶,包含例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;辅基,如但不限于,抗生蛋白链菌素生物素和抗生物素蛋白/生物素;荧光材料,如但不限于,伞酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素;发光材料,如但不限于,鲁米诺;生物发光材料,如但不限于,荧光素酶、虫荧光素及水母发光蛋白;放射性材料,如但不限于,碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In及111In)及锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin;以及使用不同正电子发射断层扫描的正电子发射金属、非放射性顺磁性金属离子,及放射性标记或偶联到特定放射性同位素的分子。在这些实施例中,适当的检测方法是本领域中众所周知的并且是容易地从众多商业来源可获得的。
如以上所指示,在其他实施例中,可以将调节剂或其片段与标记物序列或化合物(如肽或荧光团)融合或偶联以促进纯化或诊断或分析程序,如免疫组织化学、生物层干涉法、表面等离子共振、流式细胞术、竞争性ELISA、FAC等。在优选实施例中,该标记物包含一种his标签,如由pQE载体(凯杰公司(Qiagen))等提供的那些,其中有许多是可商购的。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于,血球凝集素“HA”标签,该标签对应于衍生自流感血球凝集素蛋白的表位(威尔森(Wilson)等,1984,《细胞》(Cell)37:767);及“flag”标签(U.S.P.N.4,703,004)。
E.治疗部分
如先前所暗指的,调节剂或其片段或衍生物也可以与“治疗部分”或“药物”,如抗增生剂或抗癌剂偶联、连接或融合,或以其他方式缔合,包括但不限于,细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射性疗法及放射性治疗剂、靶向性抗癌剂、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法及抗转移剂和免疫治疗剂。
优选的示例性抗癌剂包括细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、类美登醇(如DM-1和DM-4(英诺杰公司(Immunogen,Inc.)))、二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星及环磷酰胺,以及其类似物或同系物。其他的可相容细胞毒素包括海兔毒素和奥立抑素,包括单甲基奥立抑素E(MMAE)和单甲基奥立抑素F(MMAF)(赛特基因公司(Seattle Genetics,Inc.));鹅膏菌素,如α-鹅膏菌素、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素或ε-鹅膏菌素(海德伯格制药公司(Heidelberg Pharma AG));DNA小沟结合剂,如倍癌霉素衍生物(信达加公司(Syntarga,B.V.))和改良型吡咯并苯并二氮杂卓二聚物(赛普杰有限公司(Spirogen,Ltd.));剪接抑制剂,如米亚霉素(meayamycin)类似物或衍生物(例如FR901464,如U.S.P.N.7,825,267中所陈述);小管结合剂,如环氧噻唑酮类似物和太平洋紫杉醇;及DNA损伤剂,如卡奇霉素和埃斯培拉霉素。另外,在某些实施例中,本发明的DLL3调节剂可以与抗CD3结合分子缔合以募集细胞毒性T细胞并且使其靶向肿瘤起始细胞(百特技术公司(BiTEtechnology);参见例如,福尔曼S.(Fuhrmann,S.)等,《美国癌症研究学会年会》(Annual Meeting of AACR)摘要,第5625期(2010),通过引用结合于此)。
又另外的可相容抗癌剂包括但不限于,抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷及5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法兰、卡莫司汀(BCNU)及罗莫司汀(CCNU)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链唑霉素及顺二氯二胺络铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)及多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素及安曲霉素(AMC))及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。更广泛的治疗部分清单可以见于PCT公开WO 03/075957和U.S.P.N.2009/0155255,各自通过引用结合于此。
如以上所指示,本发明的所选实施例针对包含吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)作为细胞毒性剂的偶联的DLL3调节剂,如抗DLL3抗体药物偶联物。应理解的是,PBD是烷化剂,烷化剂通过共价结合到小沟中的DNA并抑制核酸合成来发挥抗肿瘤活性。就这一点来说,已经显示PBD具有有效的抗肿瘤特性,同时展现出最少的骨髓抑制。与本发明可相容的PBD可以使用若干类型连接子中的任一种(例如包含一个顺丁烯二酰亚胺基部分并带有一个游离硫氢基的肽基连接子)连接到DLL3调节剂,并且在某些实施例中呈二聚物形式(即,PBD二聚物)。可以偶联到所披露的调节剂的可相容的PBD(和任选的连接子)描述于例如U.S.P.N.s6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、U.S.P.N.2011/0256157以及PCT文件WO2011/130613、WO2011/128650及WO2011/130616,各案通过引用结合于此。因此,在特别优选的实施例中,该调节剂将包含与一种或多种PBD二聚物(即,DLL3-PBD ADC)偶联或缔合的一种抗DLL3抗体。
在特别优选的实施例中,可以与所披露的调节剂偶联的可相容PBD描述于U.S.P.N.2011/0256157中。在这一披露中,PBD二聚物,即,包含两个PBD部分的那些,可以是优选的。因此,本发明的优选的偶联物是具有化学式(AB)或(AC)的那些:
其中:
虚线指示在C1与C2或C2与C3之间任选的存在一个双键;
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR,并且任选地另外选自卤代或二卤代;
其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及卤代;
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及卤代;
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及卤代;
R10为连接到如以上所描述的调节剂或其片段或衍生物的一种连接子;
Q独立地选自O、S及NH;
R11为H或R,或其中Q为O、SO3M,其中M是一种金属阳离子;
R和R’各自独立地选自任选地取代的C1-12烷基、C3-20杂环基及C5-20芳基,并且任选地与基团NRR’有关,R和R’连同它们所连接的氮原子一起形成一个任选地取代的4-、5-、6-或7元杂环状环;并且
其中R2”、R6”、R7”、R9”、X”、Q”及R11”对应地如根据R2、R6、R7、R9、X、Q及R11所定义,并且RC为一个封端基团。
双键
在一个实施例中,在C1与C2和C2与C3之间不存在双键。
在一个实施例中,这些虚线指示了在C2与C3之间任选地存在一个双键,如以下所示:
在一个实施例中,当R2为C5-20芳基或C1-12烷基时,一个双键出现在C2与C3之间。
在一个实施例中,这些虚线指示了在C1与C2之间任选地存在一个双键,如以下所示:
在一个实施例中,当R2为C5-20芳基或C1-12烷基时,一个双键出现在C1与C2之间。
R2
在一个实施例中,R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR,并且任选地另外选自卤代或二卤代;
在一个实施例中,R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR。
在一个实施例中,R2独立地选自H、=O、=CH2、R、=CH-RD及=C(RD)2。
在一个实施例中,R2独立地为H。
在一个实施例中,R2独立地为=O。
在一个实施例中,R2独立地为=CH2。
在一个实施例中,R2独立地为=CH-RD。在该PBD化合物内,基团=CH-RD可以具有以下所示的任一构型:
在一个实施例中,该构型为构型(I)。
在一个实施例中,R2独立地为=C(RD)2。
在一个实施例中,R2独立地为=CF2。
在一个实施例中,R2独立地为R。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的C5-20芳基。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的C1-12烷基。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的C5-20芳基。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的C5-7芳基。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的C8-10芳基。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的苯基。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的萘基。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的吡啶基。
在一个实施例中,R2独立地为任选地取代的喹啉基或异喹啉基。
在一个实施例中,R2带有一个到三个取代基,其中1个和2个为更优选的,并且单取代的基团是最优选的。这些取代可以是任何位置。
在R2为C5-7芳基的情况下,单一取代基优选地在不与到该化合物的其余部分的键相邻的一个环原子上,即,优选地在到该化合物的其余部分的键的β或γ位。因此,在该C5-7芳基为苯基的情况下,该取代基优选地在间位或对位,并且更优选地在对位中。
在一个实施例中,R2选自:
其中星号指示连接点。
在R2为C8-10芳基,例如喹啉基或异喹啉基的情况下,它可以在这些喹啉或异喹啉环的任何位置处带有任何数量的取代基。在一些实施例中,它带有一个、两个或三个取代基,并且这些可以在任一近端和远端环或两者(如果有超过一个取代基)上。
在一个实施例中,在R2任选地被取代的情况下,这些取代基选自以下取代基部分中所给的那些取代基。
在R任选地被取代的情况下,这些取代基优选地选自:
卤代、羟基、醚、甲酰基、酰基、羧基、酯、酰氧基、氨基、酰胺基、酰基酰胺基、氨基羰氧基、脲基、硝基、氰基及硫醚。
在一个实施例中,在R或R2任选地被取代的情况下,这些取代基选自下组,该组由以下各项组成:R、OR、SR、NRR’、NO2、卤代、CO2R、COR、CONH2、CONHR及CONRR’。
在R2为C1-12烷基的情况下,任选的取代基可以另外地包括C3-20杂环基和C5-20芳基。
在R2为C3-20杂环基的情况下,任选的取代基可以另外地包括C1-12烷基和C5-20芳基。
在R2为C5-20芳基的情况下,任选的取代基可以另外地包括C3-20杂环基和C1-12烷基。
应了解的是,术语“烷基”涵盖亚类烯基和炔基以及环烷基。因此,在R2为任选地取代的C1-12烷基的情况下,应了解的是,该烷基任选地含有一个或多个碳-碳双键或三键,这些键可以形成一个共轭系统的一部分。在一个实施例中,该任选地取代的C1-12烷基含有至少一个碳-碳双键或三键,并且这一键与出现在C1与C2或C2与C3之间的双键共轭。在一个实施例中,该C1-12烷基是选自以下各项的一个基团:饱和C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基及C3-12环烷基。
如果在R2上的一个取代基为卤代,那么它优选地为F或Cl,更优选地为Cl。
如果在R2上的一个取代基为醚,那么在一些实施例中,它可以是烷氧基,例如C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基),或在一些实施例中,它可以是C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。
如果在R2上的一个取代基为C1-7烷基,那么它可以优选地为C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
如果在R2上的一个取代基为C3-7杂环基,那么在一些实施例中,它可以是含C6氮的杂环基,例如吗啉基、硫吗啉基、哌啶基、哌嗪基。这些基团可以经由氮原子结合到PBD部分的其余部分。这些基团可以进一步被例如C1-4烷基取代。
如果在R2上的一个取代基为双-氧基-C1-3亚烷基,那么这优选地为双-氧基-亚甲基或双-氧基-亚乙基。
R2的特别优选的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟代、氯代、氰基、双-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉基及甲基-噻吩基。
特别优选的取代的R2基团包括但不限于,4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟代-苯基、4-氯代-苯基、3,4-双氧基亚甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、异喹啉-3-基及异喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。
在一个实施例中,R2为卤代或二卤代。在一个实施例中,R2为-F或-F2,这些取代基在以下对应地以(III)和(IV)说明:
RD
在一个实施例中,RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及卤代。
在一个实施例中,RD独立地为R。
在一个实施例中,RD独立地为卤代。
R6
在一个实施例中,R6独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-及卤代。
在一个实施例中,R6独立地选自H、OH、OR、SH、NH2、NO2及卤代。
在一个实施例中,R6独立地选自H和卤代。
在一个实施例中,R6独立地为H。
在一个实施例中,R6和R7一起形成基团-O-(CH2)p-O-,其中p为1或2。
R7
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及卤代。
在一个实施例中,R7独立地为OR。
在一个实施例中,R7独立地为OR7A,其中R7A独立地为任选地取代的C1-6烷基。
在一个实施例中,R7A独立地为任选地取代的饱和C1-6烷基。
在一个实施例中,R7A独立地为任选地取代的C2-4烯基。
在一个实施例中,R7A独立地为Me。
在一个实施例中,R7A独立地为CH2Ph。
在一个实施例中,R7A独立地为烯丙基。
在一个实施例中,该化合物是一种二聚物,其中每一单体的R7基团一起形成一种具有化学式X-R″-X的二聚物桥,连接这些单体。
R8
在一个实施例中,该化合物是一种二聚物,其中每一单体的R8基团一起形成一种具有化学式X-R″-X的二聚物桥,连接这些单体。
在一个实施例中,R8独立地为OR8A,其中R8A独立地为任选地取代的C1-4烷基。
在一个实施例中,R8A独立地为任选地取代的饱和C1-6烷基或任选地取代的C2-4烯基。
在一个实施例中,R8A独立地为Me。
在一个实施例中,R8A独立地为CH2Ph。
在一个实施例中,R8A独立地为烯丙基。
在一个实施例中,R8和R7一起形成基团-O-(CH2)p-O-,其中p为1或2。
在一个实施例中,R8和R9一起形成基团-O-(CH2)p-O-,其中p为1或2。
R9
在一个实施例中,R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-及卤代。
在一个实施例中,R9独立地为H。
在一个实施例中,R9独立地为R或OR。
R和R’
在一个实施例中,R独立地选自任选地取代的C1-12烷基、C3-20杂环基及C5-20芳基。这些基团各自在以下取代基部分中进行定义。
在一个实施例中,R独立地为任选地取代的C1-12烷基。
在一个实施例中,R独立地为任选地取代的C3-20杂环基。
在一个实施例中,R独立地为任选地取代的C5-20芳基。
在一个实施例中,R独立地为任选地取代的C1-12烷基。
以上关于R2的描述是与优选的烷基和芳基有关的不同实施例以及任选的取代基的身份和数目。适当时,由于R2适用于R,故关于其所陈述的优先选择适用于所有其他R,例如,其中R6、R7、R8或R9为R。
关于R之优先选择也适用于R’。
在本发明的一些实施例中,提供了一种具有取代基-NRR’的化合物。在一个实施例中,R和R’连同它们所连接的氮原子形成任选地取代的4-、5-、6-或7元杂环状环。该环可以含有另外的杂原子,例如N、O或S。
在一个实施例中,该杂环状环本身被基团R取代。在另外的N杂原子存在的情况下,该取代基可以可以在该N杂原子上。
R”
R″为一种C3-12亚烷基,该链可以间杂有一个或多个杂原子,例如O、S、N(H)、NMe;和/或芳香族环,例如苯或吡啶,这些环任选地取代的。
在一个实施例中,R″为一种C3-12亚烷基,该链可以间杂有一个或多个杂原子和/或芳香族环,例如苯或吡啶。
在一个实施例中,该亚烷基任选地间杂有一个或多个选自O、S及NMe之杂原子和/或芳香族环,这些环任选地被取代。
在一个实施例中,该芳香族环为一种C5-20亚芳基,其中亚芳基属于通过从一种芳香族化合物的两个芳香族环原子去除两个氢原子获得的一种二价部分,该部分具有从5到20个环原子。
在一个实施例中,R″为一种C3-12亚烷基,该链可以间杂有一个或多个杂原子,例如O、S、N(H)、NMe;和/或芳香族环,例如苯或吡啶,这些环任选地被NH2取代。
在一个实施例中,R″为一种C3-12亚烷基。
在一个实施例中,R″选自C3、C5、C7、C9及C11亚烷基。
在一个实施例中,R″选自C3、C5及C7亚烷基。
在一个实施例中,R″选自C3和C5亚烷基。
在一个实施例中,R″为一种C3亚烷基。
在一个实施例中,R″为一种C5亚烷基。
以上所列的亚烷基可以任选地间杂有一个或多个杂原子和/或芳香族环,例如苯或吡啶,这些环任选地被取代。
以上所列的亚烷基可以任选地间杂有一个或多个杂原子和/或芳香族环,例如苯或吡啶。
以上所列的亚烷基可以为未取代的线性脂肪族亚烷基。
X
在一个实施例,X选自O、S或N(H)。
优选地,X为O。
R
10
优选地可相容的连接子(如以上所描述的那些)将一种DLL3调节剂(CBA/Ab/M)通过在R10位(即,N10)处的共价键连接到一种PBD药物部分D。该连接子是一种双官能或多官能部分,它可以用于连接一个或多个药物部分(D)和一种调节剂(优选地为一种抗体)连接以形成抗体-药物偶联物(ADC)。该连接子(L)可以是在细胞外部(即,细胞外)稳定的,或它可以是通过酶活性、水解或其他代谢条件可裂解的。抗体-药物偶联物(ADC)可以便利地使用一种对于结合到该药物部分和该抗体具有反应性官能性的连接子来制备。该抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇,或胺(例如,N末端或氨基酸侧链,如赖氨酸)可以与一种连接子或间隔试剂、PBD药物部分(D)或药物-连接子试剂(D-L)的一个官能团形成一个键。
该连接子上附接到PBD部分的N10位的许多官能团可以用于与细胞结合剂反应。举例来说,可以由连接子-PBD药物中间物和细胞结合剂反应而形成酯、硫酯、酰胺、硫酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、醚、硫醚或二硫键。
在另一个实施例中,该连接子可以经多个调节聚集、溶解性或反应性的基团取代。举例来说,取决于用于制备ADC的合成途径,磺酸酯基取代基可以增加该试剂的水溶性并且促进该连接子试剂与该抗体或药物部分的偶合反应,或促进Ab-L与D、或D-L与Ab的偶合反应。
在一个优选的实施例中,R10为以下基团:
其中星号指示与N10位置的连接点,CBA是一种细胞结合剂/调节剂,L1为一种连接子,A为一种将L1连接到该细胞结合剂的连接基团,L2为一个共价键或连同-OC(=O)-一起形成一种自分解型连接子,并且L1或L2是一种可裂解连接子。
L1优选为该可裂解连接子,并且可以被视为用于活化该连接子以进行裂解的引发剂。
如以上连接子章节所论述,L1和L2(当存在时)的性质可以变化极大。这些基团是基于其裂解特征选择,这些特征可以通过传递该偶联物的位点处的条件规定。在酶作用下裂解的那些连接子是优选的,不过也可以使用通过pH值(例如,酸或碱不稳定的)、温度改变或在照射时(例如,光不稳定的)而可裂解的连接子。在还原或氧化条件下可裂解的连接子也可以用于本发明中。
L1可以包含一个连续的氨基酸序列。该氨基酸序列可以是酶裂解的靶底物,藉此允许从N10位置释放R10。
在一个实施例中,L1是通过酶作用可裂解的。在一个实施例中,该酶是一种酯酶或一种肽酶。
在一个实施例中,L2是存在的并且连同-C(=O)O-形成一种自分解型连接子。在一个实施例中,L2为酶活性的一种底物,藉此允许从N10位置释放R10。
在一个实施例中,在L1在酶作用下可裂解并且L2存在的情况下,该酶将L1与L2之间的键裂解。
对于将所选连接子连接到所选PBD来说,基团RC是从某些PBD部分的N10位置可去除的,从而留下N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺,在QR11为OSO3M情况下为亚硫酸氢酯加合物、硫代甲醇胺、取代的硫代甲醇胺或取代的甲醇胺。
在一个实施例中,RC可以是一个保护基,它为可去除的,从而留下N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺,或在QR11为OSO3M情况下为亚硫酸氢酯加合物。在一个实施例中,RC为一个保护基,它为可去除的,从而留下N10-C11亚胺键。
基团RC打算为在与去除基团R10所需的那些相同的条件下可去除的,例如以得到N10-C11亚胺键、甲醇胺等等。封端基团充当在N10位置处的预定官能团的保护基。该封端基团打算对细胞结合剂无反应性。举例来说,RC与RL不同。
具有封端基团的化合物可以在具有亚胺单体的二聚物的合成中用作中间物。作为替代方案,具有封端基团的化合物可以用作偶联物,其中在靶位置处去除该封端基团以得到亚胺、甲醇胺、取代的甲醇胺等等。因此,在这一实施例中,该封端基团可以被视作治疗上可去除的氮保护基,如在WO 00/12507中所定义。
在一个实施例中,基团RC是在使基团R10的连接子RL裂解的条件下可去除的。因此,在一个实施例中,该封端基团是在酶作用下可裂解的。
在一个替代实施例中,该封端基团是在将连接子RL连接到调节剂之前可去除的。在这一实施例中,该封端基团是在不裂解连接子RL的条件下可去除的。
在一种化合物包括官能团G1以与细胞结合剂形成连接的情况下,该封端基团是在添加或暴露G1之前可去除的。
该封端基团可以用作保护基策略的一部分以确保一种二聚物中仅一个单体单元连接到细胞结合剂。
该封端基团可以用作N10-C11亚胺键的遮罩。该封端基团可以在如该化合物中需要亚胺官能团时去除。该封端基团还是甲醇胺、取代的甲醇胺及亚硫酸氢酯加合物(如以上所描述)的遮罩。
在一个实施例中,RC是氨基甲酸酯保护基。
在一个实施例中,该氨基甲酸酯保护基选自:
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz及PNZ。
任选地,该氨基甲酸酯保护基另外选自Moc。
在一个实施例中,RC是缺乏连接到细胞结合剂的官能团的一种连接子基团RL。
这一应用与作为氨基甲酸酯的那些RC基团特别相关。
在一个实施例中,RC为以下基团:
其中星号指示与N10位置的连接点,G2为一个末端基团,L3为一个共价键或一个可裂解连接子L1,L2为一个共价键或连同OC(=O)一起形成自分解型连接子。
在L3和L2都是共价键的情况下,G2和OC(=O)一起形成氨基甲酸酯保护基,如以下所定义。
L1是如以上关于R10所定义。
L2是如以上关于R10所定义。
不同封端基团描述于下,包括基于众所周知的保护基的那些。
在一个实施例中,L3为一种可裂解连接子L1,和L2连同OC(=O)一起形成自分解型连接子。在这一实施例中,G2为Ac(乙酰基)或Moc,或选自以下的氨基甲酸酯保护基:Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz及PNZ。任选地,该氨基甲酸酯保护基另外选自Moc。
在另一个实施例中,G2为酰基-C(=O)G3,其中G3选自烷基(包括环烷基、烯基及炔基)、杂烷基、杂环基及芳基(包括杂芳基及碳芳基(carboaryl))。这些基团可以为任选地取代的。适当时,酰基连同L3或L2的氨基一起可以形成酰胺键。适当时,酰基连同L3或L2的羟基一起可以形成酯键。
在一个实施例中,G3为杂烷基。该杂烷基可以包含聚乙二醇。适当时,该杂烷基可以具有一个如O或N等杂原子,邻近于酰基,藉此在适当时,连同基团L3或L2中存在的杂原子一起形成氨基甲酸酯或碳酸酯基团。
在一个实施例中,G3选自NH2、NHR及NRR’。优选地,G3为NRR’。
在一个实施例中,G2为以下基团:
其中星号指示与L3的连接点,n为0到6,并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2及卤代。基团OH、SH、NH2及NHR被保护。在一个实施例中,n为1到6,并且优选地n为5。在一个实施例中,G4为OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’及NRR’。在一个实施例中,G4为OR、SR及NRR’。优选地,G4选自OR和NRR’,最优选地,G4为OR。最优选地,G4为OMe。
在一个实施例中,基团G2为:
其中星号指示与L3的连接点,并且n和G4如以上所定义。
在一个实施例中,基团G2为:
其中星号指示与L3的连接点,n为0到1,m为0到50,并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2及卤代。在一个优选实施例中,n为1并且m为0到10、1到2,优选地为4到8并且最优选地为4或8。在另一个实施例中,n为1并且m为10到50,优选地为20到40。基团OH、SH、NH2及NHR被保护。在一个实施例中,G4为OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’及NRR’。在一个实施例中,G4为OR、SR及NRR’。优选地,G4选自OR和NRR’,最优选地,G4为OR。优选地,G4为OMe。
在一个实施例中,基团G2为:
其中星号指示与L3的连接点,并且n、m及G4如以上所定义。
在一个实施例中,基团G2为:
其中n为1到-20,m为0-6,并且G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2及卤代。在一个实施例中,n是1-10。在另一个实施例中,n为10到50,优选地为20到40。在一个实施例中,n是1。在一个实施例中,m是1。基团OH、SH、NH2及NHR被保护。在一个实施例中,G4为OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’及NRR’。在一个实施例中,G4为OR、SR及NRR’。优选地,G4选自OR和NRR’,最优选地,G4为OR。优选地,G4为OMe。
在一个实施例中,基团G2为:
其中星号指示与L3的连接点,并且n、m及G4如以上所定义。
在以上每一实施例中,G4可以是OH、SH、NH2及NHR。这些基团优选地为被保护的。
在一个实施例中,OH被Bzl、TBDMS或TBDPS保护。
在一个实施例中,SH被Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me或Trt保护。
在一个实施例中,NH2或NHR被Boc、Moc、Z-Cl、Fmoc、Z或Alloc保护。
在一个实施例中,基团G2与基团L3组合存在,该基团为一种二肽。
该封端基团不打算连接到调节剂。因此,该二聚物中存在的另一个单体用作经由连接子连接到调节剂的连接点。因此,优选该封端基团中存在的官能团不可用于与调节剂反应。因此,优选地避免反应性官能团,如OH、SH、NH2、COOH。然而,如果如以上所描述进行保护,那么此类官能团可以存在于该封端基团中。
因此,根据在此的传授内容,本发明的一个实施例包含一种偶联物,该偶联物包含一种化合物:
其中CBA是一种细胞结合剂/调节剂,并且n为0或1。L1是如先前所定义,并且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在另一个实施例中,该偶联物包含一种化合物:
其中CBA是一种细胞结合剂/调节剂,L1如先前所定义,Ar1和Ar2各自独立地为任选地取代的C5-20芳基,并且n为0或1。
本领域的普通技术人员应理解,其他对称和不对称PBD二聚物和连接子是与本发明可相容的并且可以基于在此的传授内容和现有技术进行选择,无需过多实验。
本发明的另一个方面包括包含放射性同位素的ADC。可以与这些实施例可相容的示例性放射性同位素包括但不限于,碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、铜(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In)、铋(212Bi、213Bi)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、225Ac、76Br及211At。其他放射性核素也可用作诊断和治疗剂,尤其是在60到4,000keV能量范围内的那些。取决于所治疗的病症和希望的治疗特征,本领域的普通技术人员可以容易地选择适当的放射性同位素用于所披露的调节剂。
本发明的DLL3调节剂也可以与改良给定的生物反应的治疗部分或药物(例如,生物反应改良剂或BRM)。也就是说,与本发明可相容的治疗剂或部分不应解释为局限于经典的化学治疗剂。举例来说,在特别优选的实施例中,该药物部分可以是具有一种所希望的生物活性的一种蛋白质或多肽或其片段。这些蛋白质可以包括例如一种毒素,如相思豆毒素、蓖麻毒素A、豹蛙酶(或另一种细胞毒性RNA酶)、绿脓杆菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素;一种蛋白质,如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原活化物、一种细胞凋亡剂(例如TNF-α、TNF-β、AIM I(参见国际公开号WO 97/33899)、AIM II(参见国际公开号WO 97/34911)、Fas配体(高桥(Takahashi)等,1994,《免疫学杂志》(J.Immunol.),6:1567)及VEGI(参见国际公开号WO 99/23105))、一种血栓剂或一种抗血管生成剂(例如,血管抑素或内皮抑素);或一种生物反应改良剂,如例如淋巴因子(例如白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)及粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或一种生长因子(例如,生长激素(“GH”))。如以上所陈述,用于将调节剂与多肽部分融合或偶联的方法是本领域中已知的。除先前所披露的主要参考文献外,参见例如,U.S.P.Ns.5,336,603;5,622,929;5,359,046;5,349,053;5,447,851;及5,112,946;EP 307,434;EP 367,166;PCT公开WO 96/04388和WO91/06570;阿什肯纳兹(Ashkenazi)等,1991,PNAS USA 88:10535;郑(Zheng)等,1995,《免疫学杂志》154:5590;及维尔(Vil)等,1992,PNAS USA 89:11337,各自通过引用结合于此。另外,如以上所陈述,调节剂与这些部分的缔合未必需要是直接的,而是可以通过连接子序列发生。如先前所暗指的,这些连接子分子常为本领域中已知的并且描述于德纳多等,1998,《临床癌症研究》4:2483;佩特森等,1999,《生物偶联化学》10:553;泽莫曼等,1999,《核医学与生物学》26:943;加纳特,2002,《先进药物传递评论》53:171,各自结合于此。
IX.诊断和筛选
A.诊断
在又其他实施例中,本发明提供了用于检测、诊断或监测增生性病症的体外或体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴别肿瘤发生细胞(包括CSC)的方法。这些方法包括鉴别一位患有癌症的个体以治疗或监测癌症的发展,包括使该患者或从患者获得的样品(即,在体内或体外)与如在此所描述的调节剂接触并且检测经结合调节剂或样品中游离靶分子的存在或不存在,或缔合水平。在特别优选的实施例中,该调节剂将包含一种可检测标记或报告子分子,如在此所描述。
在一些实施例中,该调节剂(如抗体)与样品中特定细胞的缔合可能表示,该样品可能含有CSC,藉此指示该患有癌症的个体可以用如在此所描述的调节剂有效地治疗。这些方法可以另外包括将结合水平与对照物相比较。相反地,当该调节剂是一种Fc构建体时,可以利用并监测(直接地或间接地,体内或体外)当与该样品接触时的结合特性以提供所希望的信息。
示例性可相容的检验方法包括放射免疫检验、酶免疫检验、竞争性结合检验、荧光免疫检验、免疫印迹检验、蛋白质印迹分析、流式细胞检验及ELISA检验。如本领域的普通技术人员所知,可相容的体内治疗诊断或诊断可以包括本领域认可的成像或监测技术,如磁共振成像、计算机断层扫描(例如CAT扫描)、正电子断层扫描(例如PET扫描)、放射线照相术、超声波等。
在另一个实施例中,本发明提供了一种在体内分析癌症发展和/或发病机理的方法。在另一个实施例中,癌症发展和/或发病机理的体内分析包括测定肿瘤发展的范围。在另一个实施例中,分析包括肿瘤的鉴别。在另一个实施例中,肿瘤发展的分析是针对原发肿瘤进行的。在另一个实施例中,如本领域的普通技术人员所知,取决于癌症的类型,分析是随时间而进行的。在另一个实施例中,起源于原发肿瘤的转移性细胞的继发肿瘤的进一步分析是在体内分析的。在另一个实施例中,对继发肿瘤的大小和形状进行分析。在一些实施例中,进行了进一步离体分析。
在另一个实施例中,本发明提供了一种在体内分析癌症发展和/或发病机理的方法,包括确定细胞转移或对循环肿瘤细胞的水平进行检测并定量。在又另一个实施例中,细胞转移的分析包括在与原发肿瘤不连续的部位处细胞的进行性生长的测定。在另一个实施例中,细胞转移部位分析包括赘瘤扩散的途径。在一些实施例中,细胞可以经由血管系统、淋巴腺、在体腔内或其组合来分散。在另一个实施例中,细胞转移分析是考虑到细胞迁移、播散、外渗、增殖或其组合来进行的。
因此,在一个特别优选的实施例中,本发明的调节剂可以用于检测并定量患者样品(例如,血浆或血液)中DLL3水平,而这些水平又可以用于检测、诊断或监测DLL3相关病症,包括增生性病症。在相关实施例中,本发明的调节剂可以用于在体内或体外对循环肿瘤细胞进行检测、监测和/或定量(参见例如WO 2012/0128801,通过引用结合于此)。在又其他优选实施例中,循环肿瘤细胞可以包含癌症干细胞。
在某些实例中,可以在疗法或方案之前,使用所披露的调节剂对受试者或来自受试者的样品中肿瘤发生细胞进行评估或表征,以确立一个基线。在其他实例中,该样品衍生自经过治疗的受试者。在一些实例中,在受试者开始或终止治疗之后至少约1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、16、18、20、30、60、90天、6个月、9个月、12个月或>12个月,从该受试者取得样品。在某些实例中,在一定数量的剂量(例如,在2、5、10、20、30或更多剂疗法之后)之后对肿瘤发生细胞进行评估或表征。在其他实例汇总,在接受了一次或多次疗法之后的1周、2周、1个月、2个月、1年、2年、3年、4年或更多年之后对肿瘤发生细胞进行表征或评估。
在另一方面,并且如以下更详细地论述,本发明提供了用于检测、监测或诊断过度增生性病症、鉴别患有此类病症的个体用于可能的治疗或监测患者病症的发展(或消退)的试剂盒,其中该试剂盒包含一种如在此所描述的调节剂,及用于检测该调节剂对样品的影响的试剂。
本发明的又另一个方面包含使用标记的DLL3进行免疫组织化学(IHC)。就这一点来说,DLL3IHC可以被用作一种诊断工具以帮助诊断不同增生性病症并监测对于包括DLL3调节剂疗法在内的治疗的潜在反应。可相容的诊断检验可以对已经化学地固定(包括但不限于:甲醛、戊二醛、四氧化锇、重铬酸钾、乙酸、醇类、锌盐类、氯化汞、四氧化铬及苦味酸)并包埋(包括但不限于:甲基丙烯酸乙二醇酯、石蜡及树脂)或经由冷冻保存的组织进行。如以下更详细地论述,这些检验可以用于指导治疗决定并且确定给药方案及时程。
B.筛选
在某些实施例中,这些调节剂也可以用于对通过与抗原(例如,其基因型或表型组分)相互作用来改变肿瘤发生细胞或其子代的功能或活性的化合物或试剂(例如药物)进行筛选或鉴别。这些化合物和试剂可以是筛选用于治疗例如增生性病症的药物候选物。在一个实施例中,一种系统或方法包括包含DLL3的肿瘤发生细胞和化合物或试剂(例如药物),其中这些细胞和化合物或试剂彼此相接触。在这些实施例中,可能已经使用所披露的调节剂对主题细胞进行鉴别、监测和/或富集。
在又另一个实施例中,一种方法包括使肿瘤发生细胞或其子代与测试剂或化合物直接地或间接地接触,并确定该测试剂或化合物是否调节抗原缔合的肿瘤发生细胞的活性或功能。直接相互作用的一个实例是物理相互作用,而间接相互作用包括组合物对中间分子的作用,而这又作用于参考实体(例如,细胞或细胞培养物)。可以被调节的示例性活性或功能包括细胞形态或活力的变化、标记物的表达、分化或去分化、细胞呼吸、线粒体活性、膜完整性、成熟、增殖、活力、细胞凋亡或细胞死亡。
筛选并鉴别试剂和化合物的方法包括适于高通量筛选的那些,这些包括任选地定位或放置于预先确定的位置或地址处的细胞阵列(例如微阵列)。举例来说,细胞可以定位或放置(预先接种)于培养皿、管、烧瓶、转瓶或板(例如,单个多孔板或器皿,如8、16、32、64、96、384及1536多孔板或器皿)上。高通量机械或人工处理方法可以在较短时间段内探查化学相互作用并且确定许多基因的表达水平。已经开发出利用分子信号(例如经由荧光团)以及以极快速率处理信息的自动分析的技术(参见例如,皮哈索夫(Pinhasov)等,《组合化学与高通量筛选》(Comb.Chem.High Throughput Screen.)7:133(2004))。举例来说,已经广泛地使用微阵列技术一次性探查数千基因的相互作用,同时提供特定基因的信息(参见例如,莫科林(Mocellin)和罗斯(Rossi),《实验医学与生物学研究进展》(Adv.Exp.Med.Biol.)593:19(2007))。
可以筛选的文库包括例如,小分子文库、噬菌体呈现文库、完全人类抗体酵母呈现文库(艾迪玛公司(Adimab,LLC))、siRNA文库及腺病毒转染载体。
X.药物制剂和治疗应用
A.配制物和给药途径
取决于调节剂连同任何任选的偶联物的形式、预定的传递模式、所治疗或监测的疾病及众多其他变量,必要时,可以使用本领域认可的技术对本发明的组合物进行配制。在一些实施例中,本发明的治疗组合物可以纯形式或与极少量另外的组分一起给与,而其他可以任选地配制成含有适合的药学上可接受的载体,这些载体包含本领域众所周知的赋形剂和佐剂(参见例如,杰纳罗(Gennaro),《雷氏制药科学与实践及药物事实与比较:药物事实》(Remington:The Science and Practice ofPharmacywithFacts and Comparisons:Drugfacts Plus),第20版(2003);安赛尔(Ansel)等,《药物剂型与药物传递系统》(PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems),第7版,利平科特威廉姆斯与威尔金斯(Lippencott Williams and Wilkins)(2004);肯博(Kibbe)等,《药物赋形剂手册》(Handbook of PharmaceuticalExcipients),第3版,医药出版社(Pharmaceutical Press)(2000))。不同的药学上可接受的载体,包括媒剂、佐剂及稀释剂,都容易从众多商业来源获得。另外,也可获得药学上可接受的辅助物质的分类,如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂稳定剂、润湿剂等。某些非限制性示例性载体包括生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。
更明确地说,应理解的是,在一些实施例中,本发明的治疗性组合物可以纯形式或与极少量另外的组分一起给与。相反地,本发明的DLL3调节剂可以任选地配制成含有适合的药学上可接受的载体,这些载体包含赋形剂和佐剂,它们使本领域众所周知的并且是相对呈惰性的物质,这些物质有助该调节剂的给与或帮助将活性化合物加工成在药学上经过优化以传递到作用部位的制剂。举例来说,赋形剂可以提供形式或稠度或充当稀释剂以改善调节剂的药物动力学或稳定性。适合的赋形剂或添加剂包括但不限于,稳定剂、润湿剂及乳化剂、用于改变摩尔渗透压浓度的盐、囊封剂、缓冲剂及皮肤渗透增强剂。在某些优选实施例中,提供的这些药物组合物可以呈冻干形式并且在给药之前于例如缓冲生理盐水中复水。
用于全身给药的所披露的调节剂可以被配制用于肠、肠胃外或局部给药。事实上,可以同时使用全部三种类型的配制物来实现活性成分的全身给药。赋形剂以及供肠胃外和非肠胃外药物传递的配制物陈述于《雷氏制药科学与实践》第20版,默克出版公司(Mack Publishing)(2000)中。用于肠胃外给药的适合配制物包括呈水溶性形式(例如水溶性盐)的活性化合物的水溶液。此外,适当时,可以给与用于油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油,例如己基取代的聚(丙交酯)、芝麻油或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酸酯)。水性注射悬浮液可以含有使该悬浮液的粘度增加的物质并且包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。任选地,该悬浮液还可以含有稳定剂。也可以使用脂质体将供传递的试剂囊封于细胞中。
用于肠给药的适合配制物包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、悬浮液、糖浆或吸入剂及其控制释放形式。
总体而言,包含DLL3调节剂的本发明的化合物和组合物可以通过不同途径在体内给与有需要的受试者,包括但不限于,口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌肉内、颅内、心脏内、室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、透皮及胸内,或以其他方式通过植入或吸入给与。主题组合物可以被配制成呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂;包括但不限于,片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、油膏、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂及气雾剂。适合的配制物和给药途径可以根据预定的应用和治疗方案选择。
B.剂量
类似地,特定的剂量方案,即,剂量、时程及重复,将取决于特定的个体和该个体的病史,以及经验考虑,如药物动力学(例如半衰期、清除率等)。给药频率可以在疗法的过程内确定并调整,并且是基于减少增殖性或肿瘤发生细胞的数量、维持这些赘生性细胞的减少、减少赘生性细胞的增殖或延迟转移的发生。在其他实施例中,所给与的剂量可以经过调整或衰减以管理潜在副作用和/或毒性。作为替代方案,主题治疗性组合物的持续的连续释放配制物可以是适当的。
总体而言,本发明的调节剂可以在不同范围内给与。这些包括每剂每千克体重约10μg到每千克体重约100mg;每剂每千克体重约50μg到每千克体重约5mg;每剂每千克体重约100μg到每千克体重约10mg。其他范围包括每剂每千克体重约100μg到每千克体重约20mg,和每剂每千克体重约0.5mg到每千克体重约20mg。在某些实施例中,该剂量为每千克体重至少约100μg、每千克体重至少约250μg、每千克体重至少约750μg、每千克体重至少约3mg、每千克体重至少约5mg、每千克体重至少约10mg。
在所选实施例中,这些调节剂将以每剂每千克体重约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg给与。其他实施例将包含以每剂每千克体重200、300、400、500、600、700、800或900μg给与调节剂。在其他优选实施例中,所披露的调节剂将以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg给与。在又其他实施例中,这些调节剂可以按每剂每千克体重12、14、16、18或20mg给与。在又其他实施例中,这些调节剂将以每剂每千克体重25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg给与。根据在此的传授内容,应理解的是,以上提到的剂量适用于未偶联的调节剂和偶联到细胞毒性剂的调节剂。本领域的普通技术人员可以基于临床前动物研究、临床观察结果以及标准医疗和生物化学技术及测量容易地确定不同偶联和未偶联调节剂的适当剂量。
对于偶联调节剂,特别优选的实施例将包含每剂每千克体重介于约50μg到约5mg之间的剂量。就这一点来说,偶联调节剂可以按每剂每千克体重50、75或100μg,或按0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1mg给与。在其他优选实施例中,本发明的偶联调节剂可以按每剂每千克体重1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75或5mg给与。在特别优选的实施例中,这些偶联调节剂剂量将在一段时间内静脉内给与。另外,这些剂量可以在一段确定的治疗过程内多次给与。
其他给药方案可以根据体表面积(BSA)计算值判定,如U.S.P.N.7,744,877中所披露。如众所周知的,BSA是使用患者的身高和体重进行计算并且提供了如通过他或他的体表面积所表示的受试者的体格的量度。在某些实施例中,这些调节剂可以按从10mg/m2到800mg/m2,从50mg/m2到500mg/m2的剂量并且按100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的剂量给与。
还应理解的是,可以使用本领域认可的并且凭经验的技术来确定偶联的调节剂(即,ADC)的适当剂量。
在任何情形中,DLL3调节剂(偶联和未偶联的)优选地根据需要给与有需要的受试者。给药频率的确定可以由本领域的普通技术人员(如主治医师)基于以下考虑来作出:所治疗的病症、所治疗的受试者的年龄、所治疗的病症的严重程度、所治疗的受试者的一般健康状态等。总体而言,DLL3调节剂的有效剂量给与受试者一次或多次。更明确地说,该调节剂的有效剂量是一个月一次、一个月超过一次或一个月不到一次给与受试者。在某些实施例中,该DLL3调节剂的有效剂量可以给与多次,包括持续至少一个月、至少六个月、至少一年、至少两年的时间或若干年的时间。在又其他实施例中,所披露的调节剂的给药之间可以间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干月(1、2、3、4、5、6、7或8),或甚至一年或若干年。
在某些优选实施例中,涉及偶联调节剂的治疗过程将包含在一段数周或数月时间内多剂所选药品(即ADC)。更具体地说,本发明的偶联调节剂可以每天、每两天、每四天、每周、每十天、每两周、每三周、每个月、每六周、每两个月、每十周或每三个月一次给与。就这一点来说,应理解的是,基于患者反应和临床实践,这些剂量可以变化或该时间间隔可以调整。
对用于已经提供一次或多次给药的个体中所披露的治疗性组合物的剂量和方案也可以凭经验确定。举例来说,可以给个体递增剂量的如在此所描述制造的治疗性组合物。在所选实施例中,对应地基于凭经验确定或观察的副作用或毒性,可以使该剂量逐渐增加或减少或衰减。为了评估所选组合物的功效,可以如先前所描述,跟踪特定疾病、病症或病状的标记物。在个体患有癌症的实施例中,这些包括经由触诊或目测观察来直接测量肿瘤大小、通过x射线或其他成像技术来间接测量肿瘤大小;如通过直接肿瘤活检和肿瘤样品的显微镜检查所评估的改善;间接肿瘤标记物(例如,对于前列腺癌的PSA)根据在此描述的方法鉴别的抗原的测量;疼痛或麻痹的减少;言语、视力、呼吸或与肿瘤相关的其他能力丧失的改善;食欲增加;或如通过公认的测试所测量的生活质量增加或存活期延长。本领域的普通技术人员应显而易见的是,该剂量将取决于个体、赘生性病状的类型、赘生性病状的阶段、该赘生性病状是否已经开始转移到个体中的其他位置以及过去和当前所使用的治疗而变化。
C.组合疗法
组合疗法可以特别适用于减少或抑制不想要的赘生性细胞增殖,减少癌症的发生,减少或预防癌症的复发,或者减少或预防癌症的扩散或转移。在这些情形中,本发明的调节剂可以通过去除CSC而充当敏化剂或化学敏化剂,这些试剂将以其他方式支持并且维持肿块并藉此允许更有效地使用当前的医疗标准减瘤剂或抗癌剂。也就是说,在某些实施例中,所披露的调节剂可以提供一种增强的作用(例如,加和性或协同性),由此加强了另一种给与的治疗剂的作用模式。在本发明的上下文中,“组合疗法”应当在广义上解释并且仅仅是指一种调节剂和一种或多种抗癌剂的给与,这些抗癌剂包括但不限于,细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向性抗癌剂(包括单克隆抗体和小分子实体)、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法以及抗转移剂和免疫治疗剂,包括特异性和非特异性方法。
这些组合的结果无需为当分开地进行每种治疗(例如抗体和抗癌剂)时所观察的作用的加和。尽管至少加和作用一般是所希望的,但超出单一疗法之一的任何增加的抗肿瘤作用都是有益的。另外,本发明不需要组合治疗展现出协同作用。然而,本领域的普通技术人员应理解,在包含优选实施例的某些所选组合情况下,可以观察到协同作用。
在实行组合疗法时,可以向受试者以单一组合物形式或以两种或更多种相异的组合物形式使用相同或不同给药途径同时地给与调节剂和抗癌剂。作为替代方案,该调节剂可以在抗癌剂治疗之前或之后以例如从数分钟到数周范围内的时间间隔给与。每次传递之间的时间段使得该抗癌剂和调节剂能够对该肿瘤发挥组合作用。在至少一个实施例中,抗癌剂与调节剂是彼此间隔在约5分钟到约两周内给与。在又其他实施例中,该调节剂与该抗癌剂的给药之间可以间隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
组合疗法可以给与一次、两次或至少持续一段时间,直到该病状得到治疗、减轻或治愈。在一些实施例中,该组合疗法给与多次,例如从每日三次到每六个月一次。给药可以按时程进行,如每日三次、每日两次、每日一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每个月一次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次,或者可以经由微型泵连续地给与。该组合疗法可以经由如先前所述的任何途径给与。该组合疗法可以在远离肿瘤部位的部位处给与。
在一个实施例中,调节剂是与一种或多种抗癌剂组合给与有需要的受试者,持续一个较短的治疗周期。本发明还涵盖分成若干部分给药的不连续给药或每日剂量。该调节剂和抗癌剂可以在隔日或隔周可互换地给与;或提供了一系列抗体治疗之后可以是一次或多次的抗癌剂疗法治疗。在任何情况下,如本领域的普通技术人员所了解,化学治疗剂的适当剂量一般大约为将在临床疗法中已经采用的那些,其中这些化学治疗剂是单独或与其他化学治疗剂组合给与。
在另一个优选实施例中,本发明的DLL3调节剂可以用于维持疗法中以在该疾病最初出现之后降低或消除肿瘤复发的几率。优选地,该病症将经过治疗并且最初的肿块消除、减小或以其他方式改善,由此该患者是无症状的或得到缓和。此时,可以给与该受试者药学上有效量的所披露的调节剂一次或多次,即使是使用标准诊断程序存在极少或无疾病指征。在一些实施例中,这些调节剂将根据一个有规律的时程经一段时间给与,如每周、每两周、每月、每六周、每两个月、每三个月、每六个月或每年。鉴于在此的传授内容,本领域的普通技术人员可以容易地确定出用以减少疾病复发的可能性的有利剂量和给药方案。另外,取决于患者反应以及临床和诊断参数,这些治疗可以持续一段数周、数月、数年或甚至无限的时间。
在又另一个优选实施例中,本发明的调节剂可以用于预防或作为一种辅助疗法以预防或降低在减瘤程序之后肿瘤转移的可能性。如本披露中所使用,“减瘤程序”是在广义上定义并且应当意谓任何消除、减少、治疗或改善肿瘤或肿瘤增殖的程序、技术或方法。示例性减瘤剂包括但不限于,手术、放射治疗(即,射束放射)、化学疗法、免疫疗法或切除。在本领域的普通技术人员根据本披露容易地确定的适当时间,所披露的调节剂可以如通过临床、诊断或治疗诊断程序所提出来给与,以减少肿瘤转移。这些调节剂可以按如使用标准技术所测定的药学上有效的剂量给与一次或多次。优选地,该给药方案将伴随适当的诊断或监测技术以允许对其进行改良。
本发明的又其他实施例包括向无症状但有发生增生性病症的风险的受试者给与所披露的调节剂。也就是说,本发明的调节剂可以在真正预防意义上使用并且提供给经过检查或测试并且具有一个或多个所述风险因素(例如,染色体组指征、家族史、体内或体外测试结果等)但尚未显现赘瘤的患者。在这些情形中,本领域普通技术人将能够通过凭经验观察或通过公认的临床实践来确定有效的给药方案。
D.抗癌剂
术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意谓可以用于治疗细胞增殖性病症(如癌症)的任何药剂,并且包括但不限于,细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化学治疗剂、放射疗法及放射治疗剂、靶向性抗癌剂、BRM、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法以及抗转移剂和免疫治疗剂。应理解的是,在所选实施例中,如以上所论述,这些抗癌剂可以包含偶联物并且可以在给药之前与调节剂缔合。在某些实施例中,所披露的抗癌剂将与DLL3调节剂连接以提供如在此所陈述的ADC。
如在此所使用,术语“细胞毒性剂”意谓对细胞有毒并且降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的一种物质。典型地,该物质是一种衍生自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于,以下各项的小分子毒素或酶活性毒素:细菌(白喉毒素、绿脓杆菌内毒素和外毒素、葡萄球菌肠毒素A)、真菌(例如,α-帚曲菌素、局限曲菌素)、植物(例如,相思豆毒素、篦麻毒素、葫莲根毒蛋白、槲寄生素、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草毒素、白树毒素、苦瓜毒素、天花粉毒素、大麦毒素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、米特格林(mitegellin)、局限曲菌素、酚霉素、新霉素及单端孢霉烯族毒素)或动物(例如,细胞毒性RNA酶,如细胞外胰腺RNA酶;DNA酶I,包括其片段和/或变体)。
出于本发明的目的,“化学治疗剂”包含非特异性降低或抑制癌症细胞的生长、增殖和/或存活的一种化合物(例如,细胞毒性剂或细胞生长抑制剂)。这些化学试剂经常针对细胞生长或分裂必需的细胞内过程,并且因此针对一般迅速生长并且分裂的细胞特别有效。举例来说,长春新碱使微管蛋白解聚合,并由此抑制细胞进入有丝分裂。总体而言,化学治疗剂可以包括抑制或设计成抑制癌细胞或可能变为癌细胞或产生肿瘤发生子代(例如TIC)的细胞的任何化学试剂。这些试剂例如在如CHOP或FOLFIRI等方案中经常组合给与并且经常是最有效的。又,在所选实施例中,这些化学治疗剂可以偶联到所披露的调节剂。
可以与本发明的调节剂组合(或偶联)使用的抗癌剂的实例包括但不限于:烷化剂、磺酸烷酯、氮丙啶、乙烯亚胺及甲基三聚氰胺、多聚乙酰、喜树碱、苔藓抑素、海绵他汀、CC-1065、念珠藻环肽、海兔毒素、倍癌霉素、伊斯罗宾、水鬼蕉碱、萨克丁特(sarcodictyin)、海绵素、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、达内霉素、双膦酸酯、埃斯波霉素、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、左柔比星;抗代谢物,埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺素、叶酸补充剂(如甲酰四氢叶酸)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯特布斯(bestrabucil)、比生群、伊达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、艾普塞隆、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、罗尼达宁(lonidainine)、类美登醇、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、尼曲瑞林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、比柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸2-乙肼、丙卡巴肼、多糖复合物(JHS自然产品公司(JHS NaturalProducts),俄勒冈州尤金(Eugene,OR))、雷佐生;根瘤菌素;西佐喃;锗螺胺;细交链孢菌酮酸;三亚胺醌;2,2',2"-三氯三乙胺;单端孢霉烯族毒素(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A及蛇形菌素);乌拉坦;长春地辛;达卡巴嗪;甘露莫司汀;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;盖克托辛(gacytosine);阿拉伯糖苷(“Ara-C”);环磷酰胺;塞替派;紫杉烷、苯丁酸氮芥;吉西他宾;6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;甲胺蝶呤;铂类似物、长春花碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞宾;诺消灵;替尼泊苷;依达曲沙;道诺霉素;氨基蝶呤;西罗达;伊班膦酸盐;伊立替康(Camptosar,CPT-11)、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸;视黄醇;卡培他滨;康普瑞汀;亚叶酸;奥沙利铂;PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A的抑制剂,这些抑制剂减少细胞增殖;及以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括用于调控或抑制对于肿瘤的激素作用的抗激素剂,如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂,抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂,这些抑制剂调控肾上腺中雌激素的产生,及抗雄激素;以及曲沙他滨(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸、核糖酶,如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂;疫苗,rIL-2;拓扑异构酶1抑制剂;rmRH;长春瑞宾和埃斯波霉素,及以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在其他实施例中,本发明的调节剂可以与目前临床试验中或可商购的多种抗体(或免疫治疗剂)中的任一种组合使用。为此,所披露的调节剂可以与选自下组的抗体组合使用,该组由以下各项组成:阿巴伏单抗、阿德木单抗、阿托珠单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、阿托昔单抗、马安那莫单抗、阿西莫单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝伐单抗、比伐珠单抗、比纳托单抗、布妥昔单抗、坎妥珠单抗、卡妥索单抗、西妥昔单抗、西他珠单抗、西妥木单抗、利伐珠单抗(clivatuzumab)、坎妥木单抗(conatumumab)、达妥木单抗(daratumumab)、曲兹妥单抗(drozitumab)、杜利妥单抗(duligotumab)、杜昔妥单抗(dusigitumab)、地莫单抗、达西珠单抗、多妥珠单抗(dalotuzumab)、依美昔单抗、艾妥珠单抗(elotuzumab)、恩脱昔单抗(ensituximab)、厄妥索单抗、达珠单抗、法妥珠单抗(farletuzumab)、拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、费妥木单抗(figitumumab)、法伏妥单抗(flanvotumab)、弗妥昔单抗(futuximab)、加尼妥单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗、吉瑞昔单抗、来巴妥单抗(glembatumumab)、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、麦妥珠单抗(imgatuzumab)、印妥昔单抗(indatuximab)、伊珠单抗、英妥木单抗、伊匹单抗、伊妥木单抗、拉贝珠单抗、来沙木单抗、林妥珠单抗、洛伐珠单抗(lorvotuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、曼妥木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗、米妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫妥木单抗(moxetumomab)、那妥单抗(narnatumab)、那莫单抗、尼妥木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗、若莫单抗(nofetumomabn)、卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗、奥拉妥单抗(olaratumab)、昂妥珠单抗(onartuzumab)、奥妥珠单抗(oportuzumab)、瑞戈伏单抗(oregovomab)、盘尼图单抗、帕图珠单抗(parsatuzumab)、帕托单抗(patritumab)、盘图莫单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗、平妥单抗、普托木单抗、拉妥木单抗(racotumomab)、拉图单抗(radretumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗、罗妥木单抗、沙妥莫单抗、昔洛珠单抗、司妥昔单抗、司妥佐单抗(simtuzumab)、索利图单抗(solitomab)、他妥珠单抗(tacatuzumab)、他妥莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替普莫单抗(teprotumumab)、加珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、托卡珠单抗(tucotuzumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃妥珠单抗(vorsetuzumab)、沃图莫单抗(votumumab)、扎鲁木单抗、CC49、3F8及其组合。
又其他特别优选的实施例将包含被批准用于癌症疗法的抗体的使用,包括但不限于,利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、盘尼图单抗、奥法木单抗、伊匹单抗及布妥昔单抗。本领域的普通技术人员将能够容易地鉴别与在此的传授内容可相容的另外的抗癌剂。
E.放射疗法
本发明还提供了调节剂与放射疗法(即,用于在肿瘤细胞内诱导DNA损伤的任何机制,如γ照射、X射线、UV照射、微波、电子发射等)的组合。还涵盖了使用放射性同位素向肿瘤细胞的定向传递的组合疗法,并且该疗法可以与一种靶向性抗癌剂或其他靶向手段联合使用。典型地,放射疗法是以脉冲方式经一段从约1到约2周的时间给与。该放射疗法可以给与患有头颈癌的受试者,持续约6到7周。任选地,该放射疗法可以按单次剂量或按多次连续剂量给与。
XI.适应症
应理解的是,本发明的调节剂可以用于诊断、治疗或抑制任何DLL3相关病症的发生或复发。因此,不管是单独还是与抗癌剂或放射疗法组合给与,本发明的调节剂特别适用于总体上治疗患者或受试者的赘生性病状,这些病状可以包括良性或恶性肿瘤(例如肾上腺、肝、肾、膀胱、乳房、胃、卵巢、结肠直肠、前列腺、胰腺、肺、甲状腺、肝脏、子宫颈、子宫内膜、食道及子宫癌瘤;肉瘤;成胶质细胞瘤;及不同的头颈肿瘤);白血病和淋巴系统恶性疾病;其他病症,如神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑及其他腺体、巨噬细胞、上皮、基质及囊胚腔病症;以及发炎性、血管生成性、免疫性病症和由病原体引起的病症。明确地说,供治疗的关键靶是赘生性病状(包含实体肿瘤),不过血液系统恶性肿瘤在本发明的范围内。优选地,有待治疗的“受试者”或“患者”将为人类,不过如在此所使用,这些术语明确地被视作包含任何哺乳动物物种。
更具体地说,经历根据本发明的治疗的赘生性病状可以选自下组,该组包括但不限于,肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、蜂窝状软部肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌瘤和移行细胞癌瘤)、骨癌(釉质上皮瘤、动脉瘤状骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳癌、颈动脉体瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌瘤、肾透明细胞癌瘤、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维性组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肿瘤(Ewing'stumor)、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维生成不良、骨纤维异常增殖症、胆囊和胆管癌、妊娠滋养细胞病、生殖细胞肿瘤、头颈癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌瘤)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪性肿瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪性肿瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌瘤)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌瘤、腺癌、鳞状细胞癌瘤、大细胞癌瘤等)、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌瘤、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、周围神经鞘膜瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见血液性病症、肾转移性癌、横纹肌样肿瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌瘤、胸腺瘤、甲状腺转移性癌症及子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌瘤及平滑肌瘤)。
在某些优选实施例中,该增生性病症将包含一种实体肿瘤,包括但不限于,肾上腺、肝、肾、膀胱、乳房、胃、卵巢、子宫颈、子宫、食道、结肠直肠、前列腺、胰腺、肺(小细胞和非小细胞)、甲状腺肿瘤、癌瘤、肉瘤、成胶质细胞瘤及不同的头颈肿瘤。在其他优选实施例中,并且如以下实例中所示,所披露的调节剂在治疗小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)(例如鳞状细胞非小细胞肺癌或鳞状细胞小细胞肺癌)方面尤其有效。在一个实施例中,肺癌是难治性、复发性或对基于铂的试剂(例如,卡铂、顺铂、奥沙利铂、拓扑替康)和/或紫杉烷(例如多西他赛、太平洋紫杉醇、洛他赛或卡巴他赛)具有抗性的。另外,在特别优选的实施例中,所披露的调节剂可以呈偶联形式使用以治疗小细胞肺癌。
就小细胞肺癌来说,特别优选的实施例将包含给与偶联的调节剂(ADC)。在所选实施例中,这些偶联的调节剂将给与展现出局限期疾病的患者。在其他实施例中,所披露的调节剂将给与展现出扩散期疾病的患者。在其他优选实施例中,所披露的偶联调节剂将给与难治性患者(即,在完成最初疗程期间或不久之后复发的那些)。又其他实施例包含将所披露的调节剂给与敏感性患者(即,复发在主要疗法之后超过2-3个月的那些)。在每一情形中,应理解的是,取决于所选给药方案和临床症状,可相容调节剂可以呈偶联或未偶联状态。
如以上所论述,所披露的调节剂可以另外用于预防、治疗或诊断具有神经内分泌特征或表型的肿瘤,包括神经内分泌肿瘤。起于弥散性内分泌系统的真性或经典神经内分泌肿瘤(NET)相对罕见,并且每100,000个人有2-5个人发生,但具有高度侵袭性。神经内分泌肿瘤发生于肾、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(髓样甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤和大细胞神经内分泌癌瘤)中。这些肿瘤可以分泌若干激素,包括血清素和/或嗜铬粒蛋白A,这些激素可以引起称为类癌瘤综合症的衰竭性症状。这些肿瘤可以通过阳性免疫组织化学标记物表示,如神经元特异性烯醇化酶(NSE,又称为γ烯醇化酶,基因符号=ENO2)、CD56(或NCAM1)、嗜铬粒蛋白A(CHGA)及突触素(SYP);或通过已知展现升高的表达的基因表示,如ASCL1。不幸的是,传统的化学疗法在治疗NET方面不是特别有效,并且肝转移是一种常见的结果。
尽管所披露的调节剂可以有利地用于治疗神经内分泌肿瘤,但它们也可以用于治疗、预防或诊断假神经内分泌肿瘤(pNET),这些肿瘤在基因型或表型上模拟、类似经典神经内分泌肿瘤或展现与其共同的性状。假神经内分泌肿瘤或具有神经内分泌特征的肿瘤是由弥散神经内分泌系统的细胞或由神经内分泌分化级联已经在癌发生过程期间异常地再活化的细胞引起的肿瘤。这些pNET常常与传统上确定的神经内分泌肿瘤共有某些表型或生物化学特征,包括产生多种生物活性胺、神经递质及肽激素的子集的能力。在组织学上,这些肿瘤(NET和pNET)共有一种共同的外观,经常显示出极少的单纯细胞病理学细胞质和圆形到椭圆形点彩核的密集地连接的小细胞。出于本发明的目的,可以用于确定神经内分泌和假神经内分泌肿瘤的常常表达的组织标记物或遗传标记物包括但不限于,嗜铬粒蛋白A、CD56、突触素、PGP 9.5、ASCL1及神经元特异性烯醇化酶(NSE)。
因此,本发明的调节剂可以有益地用于治疗假神经内分泌肿瘤和经典神经内分泌肿瘤。就这一点来说,这些调节剂可以如在此所描述而用于治疗在肾、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胃肠道(结肠、胃)、甲状腺(髓样甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤和大细胞神经内分泌癌瘤)中发生的神经内分泌肿瘤(NET和pNET)。另外,本发明的调节剂可以用于对表达一种或多种标记物的肿瘤进行治疗,这些标记物选自下组,该组由以下各项组成:NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A、ASCL1及PGP 9.5(UCHL1)。也就是说,本发明可以用于治疗一位罹患肿瘤的受试者,该肿瘤为NSE+或CD56+或PGP 9.5+或ASCL1+或SYP+或CHGA+,或其某一组合。
就血液系统恶性肿瘤来说,还应理解的是,本发明的化合物和方法可以特别有效地治疗多种B细胞淋巴瘤,包括低级别/NHL滤泡细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中等级别/滤泡性NHL、中等级别弥散性NHL、高级别免疫母细胞性NHL、高级别淋巴母细胞性NHL、高级别小型无裂隙细胞NHL、大包块病NHL、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulinemia)、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)(BL)、AIDS相关淋巴瘤、单核细胞性B细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病、小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥散性大细胞淋巴瘤、弥散性小无裂隙细胞淋巴瘤、大细胞免疫母细胞淋巴母细胞瘤、小无裂隙淋巴瘤、伯基特氏和非伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤,主要是大细胞;滤泡性,主要是小无裂隙细胞;及滤泡性、混合小无裂隙细胞和大细胞淋巴瘤。参见加多诺(Gaidono)等,“淋巴瘤(Lymphomas)”,《癌症:肿瘤学原理与实践》(CANCER:PRINCIPLES& PRACTICE OF ONCOLOGY),第2卷:2131-2145(德维塔(DeVita)等编,第5增版1997)。本领域的普通技术人员应当清楚的是,这些淋巴瘤由于分类系统的改变而经常会具有不同的名称,并且患有以不同名称分类的淋巴瘤的患者也可以从本发明的组合治疗方案获益。
本发明还提供了出现良性或癌前肿瘤的受试者的防治性或预防性治疗。除DLL3相关病症外,相信任何特别类型的肿瘤或增生性病症不应当被排除在使用本发明进行的治疗外。然而,肿瘤细胞的类型可能与组合使用第二治疗剂,特别是化学治疗剂和靶向性抗癌剂的本发明相关。
XII.制品
还提供了包括一个或多个容器的药物包装和试剂盒,这些容器包括一次或多次剂量的DLL3调节剂。在某些实施例中,提供了一种单位剂量,其中该单位剂量含有一种预定量的组合物,该组合物包含例如一种抗DLL3抗体,存在或不存在一种或多种另外的药剂。对于其他实施例中,此类单位剂量是供应于一次性使用的注射用预填充注射器中。在又其他实施例中,该单位剂量中所含的组合物可以包含生理盐水、蔗糖等;缓冲液,如磷酸盐等;和/或在一种稳定并且有效的pH范围内配制。作为替代方案,在某些实施例中,提供的组合物可以呈一种冻干粉末形式,该粉末可以在添加适当的液体(例如无菌水)之后复水。在某些优选实施例中,该组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质,包括但不限于,蔗糖和精氨酸。在该一个(多个)容器上或与其相联的任何标记指示,所装的组合物被用于诊断或治疗所选的疾病病状。
本发明还提供了用于制造单次剂量或多次剂量的DLL3调节剂给药单元及任选地一种或多种抗癌剂的试剂盒。该试剂盒包括一个容器及在该容器上或与其相联的标记或药品说明书。适合的容器包括例如,瓶子、小瓶、注射器等。这些容器可以由多种材料形成,如玻璃或塑料,并且含有一种药学有效量的呈偶联或未偶联形式的所披露的调节剂。在其他优选实施例中,该一个(多个)容器包括一种无菌存取口(例如,该容器可以是一种静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。这些试剂盒一般会在一个适合容器中含有DLL3调节剂的药学上可接受的配制物,并且在相同或不同容器中任选地含有一种或多种抗癌剂。这些试剂盒还可以含有其他药学上可接受的配制物,用于诊断或组合疗法。举例来说,除本发明的DLL3调节剂外,这些试剂盒还可以含有多种抗癌剂(如化学治疗剂或放射治疗剂);抗血管生成剂;抗转移剂;靶向性抗癌剂;细胞毒性剂;和/或其他抗癌剂中的任一种或多种。这些试剂盒还可以提供适当的试剂以将DLL3调节剂与抗癌剂或诊断剂偶联(例如参见,U.S.P.N.7,422,739,通过引用以其全文结合于此)。
更具体地说,这些试剂盒可以具有单一容器,该容器含有DLL3调节剂,存在或不存在另外的组分,或它们可以对于每一希望的试剂具有相异的容器。在提供组合治疗剂供偶联的情况下,可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。作为替代方案,该试剂盒中的DLL3调节剂和任何任选的抗癌剂在给与患者之前,可以分开地维持在相异的容器中。这些试剂盒还可以包含第二/第三容器构件用于容纳无菌、药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂(如抑菌性注射用水(BWFI))、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、林格氏溶液及右旋糖溶液。
当该试剂盒的组分是以一种或多种液体溶液形式提供时,该液体溶液优选为一种水溶液,其中无菌水溶液是特别优选的。然而,该试剂盒的组分可以呈干燥粉末形式提供。当以干燥粉末形式提供试剂或组分时,该粉末可以通过添加适合溶剂来复水。预想的是,该溶剂也可以提供于另一个容器中。
如以上简短地指示,这些试剂盒还可以含有一种将该抗体和任何任选的组分给与动物或患者的构件,例如,一个或多个针或注射器,或甚至是眼滴管、移液管或其他此类装置,由该装置,可以将配制物注射或引入动物中或施用到身体的患病区域。本发明的试剂盒还典型地包括一种用于容纳小瓶或此类装置及其他组分的紧密封闭的构件以供商业销售,如例如注射或吹塑的塑料容器,在其中放置并且保持所希望的小瓶和其他装置。任何标记或药品说明书都指示,DLL3调节剂组合物被用于治疗癌症,例如小细胞肺癌。
在其他优选实施例中,本发明的调节剂可以与可用于诊断或治疗增生性病症的诊断或治疗器件联合使用或包含这些诊断或治疗器件。举例来说,在一个优选实施例中,本发明的化合物和组合物可以与某些诊断器件或仪器组合,这些器件或仪器可以用于对涉及增生性病症的病因或表现的细胞或标记化合物进行检测、监测、定量或分型。对于所选实施例,这些标记化合物可以包含NSE、CD56、突触素、嗜铬粒蛋白A及PGP9.5。
在特别优选的实施例中,这些器件可以用于在体内或体外对循环肿瘤细胞进行检测、监测和/或定量(参见例如WO 2012/0128801,通过引用结合于此)。在又其他优选实施例中,并且如以上所论述,这些循环肿瘤细胞可以包含癌症干细胞。
XIII.研究试剂
本发明的其他优选实施例还利用了所披露的调节剂作为一种仪器的特性,该仪器可用于通过如流式细胞术、荧光活化的细胞分选(FACS)、磁活化的细胞分选(MACS)或激光介导的切割等方法对肿瘤起始细胞群或亚群进行鉴别、监测、分离、分组(sectioning)或富集。本领域的普通技术人员应理解,这些调节剂可以用于表征并操作TIC(包括癌症干细胞)的若干可相容的技术(例如参见,U.S.S.Ns.12/686,359、12/669,136及12/757,649,各自通过引用以其全文结合于此)。
XIV.其他
除非在此另外定义,否则结合本发明使用的科技术语应当具有本领域的普通技术人员通常所了解的意义。另外,除非上下文另外需要,否则单数形式的术语应当包括复数形式并且复数形式的术语应当包括单数形式。更具体地说,除非上下文另外清楚地规定,否则如本说明书和所附权利要求中所使用,单数形式“一个(种)”(a/an)和“该”包括复数个参照物。因此,举例来说,提到“一种蛋白质”包括多种蛋白质;提到“一个细胞”包括细胞的混合物等。此外,说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和这些端点之间的所有点。因此,2.0到3.0的范围包括2.0、3.0及2.0与3.0之间的所有点。
总体而言,与在此所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交学结合使用的命名法是本领域中众所周知并且常用的那些。除非另外指示,否则本发明的方法和技术一般是根据本领域中众所周知的常规方法并且如本说明书全篇所引用并且论述的不同通用和更特定的参考文献中所描述来进行。参见例如,阿巴斯等,《细胞与分子免疫学》,第6版,W.B.桑德公司(2010);萨姆布鲁克J.和鲁塞尔D.,《分子克隆实验指南》,第3版,冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港(2000);奥苏贝尔等,《精编分子生物学实验指南:当代分子生物学实验指南的方法概要》,约翰威立公司(2002);哈罗和莱恩(Lane)《抗体技术实验指南》(Using Antibodies:ALaboratory Manual),冷泉港实验室出版社,纽约冷泉港(1998);及柯里根(Coligan)等,《精编蛋白质科学实验指南》(Short Protocolsin Protein Science),约翰威立公司(2003)。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明,如本领域中通常所实现或如在此所描述进行的。与在此所描述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域中众所周知并且常用的那些。另外,在此使用的任何章节标题只是出于组织的目的,而不应解释为限制所描述的主题内容。
XV.DLL3参考文献
本说明书内披露或引用的所有参考文献或文件,包括以下即将陈述的那些,都是(但非限制)通过引用以其全文结合于此。
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XVI.所选本发明的实施例
除在此的披露和实例外,本发明还针对以下立即具体地陈述的所选实施例。
推定的权利要求书:
1.一种分离的DLL3调节剂。
2.如权利要求1所述的分离的DLL3调节剂,其中该DLL3调节剂包含一种DLL3拮抗剂。
3.如权利要求1所述的分离的DLL3调节剂,其中该DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
4.如权利要求3所述的分离的DLL3调节剂,其中该抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的分离的DLL3调节剂,其中该单克隆抗体选自下组,该组由嵌合抗体、人源化抗体及人类抗体组成。
6.如权利要求4所述的分离的DLL3调节剂,其中所述单克隆抗体包含一种中和抗体。
7.如权利要求4所述的分离的DLL3调节剂,其中所述单克隆抗体包含一种耗竭抗体。
8.如权利要求4所述的分离的DLL3调节剂,其中所述单克隆抗体包含一种内化抗体。
9.如权利要求8所述的分离的DLL3调节剂,其中所述单克隆抗体另外包含一种细胞毒性剂。
10.如权利要求4所述的分离的DLL3调节剂,其中所述单克隆抗体包含具有三个互补决定区的一个轻链可变区和具有三个互补决定区的一个重链可变区,其中这些重链和轻链互补决定区包含至少一个在图11A和图11B中所陈述的互补决定区。
11.如权利要求4所述的分离的DLL3调节剂,其中所述单克隆抗体包含一个轻链可变区和一个重链可变区,其中所述轻链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如以下各项中所陈述的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:202,并且其中所述重链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如以下各项中所陈述的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ IDNO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ IDNO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ IDNO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ IDNO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ IDNO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ IDNO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ IDNO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ IDNO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ IDNO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ IDNO:199、SEQ ID NO:201及SEQ ID NO:203。
12.一种分离的DLL3调节剂,包含来自权利要求11中所陈述的重链或轻链可变区中的任一种的一个CDR。
13.一种分离的DLL3调节剂,包含一种竞争抗体,其中所述竞争抗体使如权利要求10或11所述的分离的DLL3调节剂与DLL3的结合抑制至少约40%。
14.一种核酸,编码如权利要求11所述的氨基酸序列重链可变区或氨基酸序列轻链可变区。
15.一种载体,包含如权利要求14所述的核酸。
16.如权利要求1所述的分离的DLL3调节剂,包含一个如SEQ ID NO:3中所陈述的氨基酸序列或其一个片段。
17.如权利要求16所述的分离的DLL3调节剂,其中该DLL3调节剂另外包含一个免疫球蛋白恒定区的至少一部分。
18.如权利要求1所述的分离的DLL3调节剂,其中所述调节剂在给与一位对其有需要的受试者之后,使肿瘤起始细胞的频率降低。
19.如权利要求18所述的分离的DLL3调节剂,其中该频率的降低是使用已知肿瘤起始细胞富集的肿瘤细胞表面标记物的流式细胞分析来测定。
20.如权利要求18所述的分离的DLL3调节剂,其中该频率的降低是使用已知肿瘤起始细胞富集的肿瘤细胞表面标记物的免疫组织化学检测来测定。
21.如权利要求18所述的分离的DLL3调节剂,其中所述肿瘤起始细胞包含肿瘤保持细胞。
22.如权利要求1所述的分离的DLL3调节剂,另外包含一种细胞毒性剂。
23.一种药物组合物,包含如权利要求1所述的分离的DLL3调节剂。
24.如权利要求23所述的药物组合物,其中所述分离的DLL3调节剂包含一种单克隆抗体。
25.如权利要求24所述的药物组合物,其中所述单克隆抗体包含一种人源化抗体。
26.如权利要求25所述的药物组合物,其中所述人源化抗体包含一种细胞毒性剂。
27.如权利要求26所述的药物组合物,其中所述细胞毒性剂包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
28.一种治疗DLL3相关病症的方法,包括对一位对其有需要的受试者给与一种治疗有效量的DLL3调节剂。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种DLL3拮抗剂。
30.如权利要求28所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
31.如权利要求30所述的方法,其中该抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
32.如权利要求31所述的方法,其中该单克隆抗体选自下组,该组由嵌合抗体、人源化抗体及人类抗体组成。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述单克隆抗体包含一个轻链可变区和一个重链可变区,其中所述轻链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如以下各项中所陈述的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ IDNO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ IDNO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:146、SEQ IDNO:148、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:162、SEQ IDNO:164、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:170、SEQ IDNO:172、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ IDNO:180、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:186、SEQ IDNO:188、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:194、SEQ IDNO:196、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:200及SEQ ID NO:202,并且其中所述重链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如以下各项中所陈述的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201及SEQ ID NO:203。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述单克隆抗体是一种人源化抗体。
35.如权利要求31所述的方法,其中所述单克隆抗体包含一种中和抗体。
36.如权利要求31所述的方法,其中所述单克隆抗体包含一种内化抗体。
37.如权利要求36所述的方法,其中所述内化抗体包含一种细胞毒性剂。
38.如权利要求37所述的方法,其中所述细胞毒性剂包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述DLL3相关病症包含一种赘生性病症。
40.如权利要求39所述的方法,其中所述赘生性病症包含一种展现神经内分泌特征的肿瘤。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述展现神经内分泌特征的肿瘤包含一种神经内分泌肿瘤。
42.如权利要求39所述的方法,其中所述赘生性病症包含一种血液系统恶性肿瘤。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述血液系统恶性肿瘤包含白血病或淋巴瘤。
44.如权利要求39所述的方法,其中罹患所述赘生性病症的该受试者展现了包含肿瘤起始细胞的肿瘤。
45.如权利要求44所述的方法,另外包括使所述受试者体内肿瘤起始细胞的频率降低的步骤。
46.如权利要求45所述的方法,其中该频率的降低是使用已知肿瘤起始细胞富集的肿瘤细胞表面标记物的流式细胞分析或已知肿瘤起始细胞富集的肿瘤细胞表面标记物的免疫组织化学检测来测定的。
47.如权利要求45所述的方法,其中该频率的降低是使用体外或体内限制性稀释分析来测定的。
48.如权利要求47所述的方法,其中该频率的降低是使用体内限制性稀释分析测定的,该分析包括将活的人类肿瘤细胞移植到免疫功能低下的小鼠中。
49.如权利要求48所述的方法,其中使用体内限制性稀释分析测定的该频率的降低包括使用泊松分布统计学对肿瘤起始细胞频率进行定量。
50.如权利要求47所述的方法,其中该频率的降低是使用体外限制性稀释分析测定的,该分析包括将活的人类肿瘤细胞限制性稀释沉积于体外集落支持条件中。
51.如权利要求50所述的方法,其中使用体外限制性稀释分析测定的该频率的降低包括使用泊松分布统计学对肿瘤起始细胞频率进行定量。
52.如权利要求28所述的方法,另外包括给与一种抗癌剂的步骤。
53.如权利要求28所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含来自SEQID NOS:20到203中任一种的一个或多个CDR。
54.如权利要求28所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种全DLL调节剂。
55.一种降低有对其需要的受试者的肿瘤起始细胞的频率的方法,包括向所述受试者给与一种DLL3调节剂的步骤。
56.如权利要求55所述的方法,其中这些肿瘤起始细胞包含肿瘤保持细胞。
57.如权利要求56所述的方法,其中所述肿瘤保持细胞是CD324+或CD46+细胞。
58.如权利要求55所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体。
59.如权利要求58所述的方法,其中所述抗体包含一种单克隆抗体。
60.如权利要求59所述的方法,其中所述单克隆抗体另外包含一种细胞毒性剂。
61.如权利要求55所述的方法,其中该受试者罹患一种选自下组的赘生性病症,该组由以下各项组成:肾上腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌及乳癌。
62.如权利要求55所述的方法,其中肿瘤起始细胞的频率降低至少10%。
63.如权利要求55所述的方法,其中该频率的降低是使用已知肿瘤起始细胞富集的肿瘤细胞表面标记物的流式细胞分析或已知肿瘤起始细胞富集的肿瘤细胞表面标记物的免疫组织化学检测来测定的。
64.一种治疗罹患血液系统恶性肿瘤的受试者的方法,包括向所述受试者给与一种DLL3调节剂的步骤。
65.如权利要求64所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种单克隆抗体。
66.一种使受试者体内的肿瘤敏感用于用抗癌剂进行治疗的方法,该方法包括向所述受试者给与一种DLL3调节剂的步骤。
67.如权利要求66所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体。
68.如权利要求66所述的方法,其中所述肿瘤是一种实体肿瘤。
69.如权利要求66所述的方法,其中所述抗癌剂包含一种化学治疗剂。
70.如权利要求66所述的方法,其中所述抗癌剂包含一种免疫治疗剂。
71.一种对有需要的受试者的增生性病症进行诊断的方法,包括以下步骤:
a.从所述受试者获得一份组织样品;
b.使该组织样品与至少一种DLL3调节剂接触;并且
c.对与该样品缔合的DLL3调节剂进行检测或定量。
72.如权利要求71所述的方法,其中该DLL3调节剂包含一种单克隆抗体。
73.如权利要求72所述的方法,其中所述抗体与一种报告子可操作地缔合。
74.一种可用于诊断或治疗DLL3相关病症的制品,该制品包括一个容器,该容器包含一种DLL3调节剂及有关使用所述DLL3调节剂治疗或诊断该DLL3相关病症的指导材料。
75.如权利要求74所述的制品,其中所述DLL3调节剂是一种单克隆抗体。
76.如权利要求74所述的制品,其中该容器包括一个可读取板。
77.一种治疗罹患赘生性病症的受试者的方法,包括给与治疗有效量的至少一种内化性DLL3调节剂的步骤。
78.如权利要求77所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体。
79.如权利要求78所述的方法,其中所述抗体包含一种单克隆抗体。
80.如权利要求79所述的方法,其中该单克隆抗体另外包含一种细胞毒性剂。
81.如权利要求80所述的方法,另外包括给与一种抗癌剂的步骤。
82.一种治疗罹患赘生性病症的受试者的方法,包括给与治疗有效量的至少一种中和性DLL3调节剂的步骤。
83.如权利要求82所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体。
84.如权利要求83所述的方法,其中所述抗体包含一种单克隆抗体。
85.如权利要求84所述的方法,其中所述单克隆抗体包含一种人源化抗体。
86.如权利要求85所述的方法,其中所述人源化抗体另外包含一种细胞毒性剂。
87.如权利要求82所述的方法,其中该赘生性病症包含一种展现神经内分泌特征的肿瘤。
88.一种对肿瘤起始细胞群进行鉴别、分离、分组(sectioning)或富集的方法,包括使所述肿瘤起始细胞与一种DLL3调节剂接触的步骤。
89.如权利要求88所述的方法,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体。
90.一种DLL3调节剂,包含一种人源化抗体,其中所述人源化抗体包含一个轻链可变区和一个重链可变区,其中所述轻链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ IDNO:210及SEQ ID NO:212中所陈述的氨基酸序列组成,并且其中所述重链可变区包含与选自下组的一个氨基酸序列具有至少60%的一致性的一个氨基酸序列,该组由如SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:207、SEQ IDNO:209、SEQ ID NO:211及SEQ ID NO:213中所陈述的氨基酸序列组成。
91.一种抑制或预防对其有需要的受试者的转移的方法,包括给与一种药学上有效的量的DLL3调节剂的步骤。
92.如权利要求91所述的方法,其中该受试者在给与该DLL3调节剂之前或之后经历一种减瘤程序。
93.如权利要求92所述的方法,其中所述减瘤程序包括给与至少一种抗癌剂。
94.一种对有需要的受试者进行维持疗法的方法,包括给与一种药学上有效的量的DLL3调节剂的步骤。
95.如权利要求94所述的方法,其中在给与该DLL3调节剂之前,对所述受试者的一种赘生性病症进行治疗。
96.一种对罹患增生性病症的受试者体内的肿瘤起始细胞进行耗竭的方法,包括给与一种DLL3调节剂的步骤。
97.一种在体内对有需要的受试者的DLL3相关病症进行诊断、检测或监测的方法,包括给与一种DLL3调节剂的步骤。
98.一种对有需要的受试者的DLL3相关病症进行诊断、检测或监测的方法,包括使循环的肿瘤细胞与一种DLL3调节剂接触的步骤。
99.如权利要求98所述的方法,其中所述接触步骤在体内发生。
100.如权利要求98所述的方法,其中所述接触步骤在体外发生。
101.一种对有需要的患者体内展现神经内分泌特征的肿瘤进行治疗的方法,包括给与一种治疗有效量的DLL3调节剂的步骤。
102.如权利要求101所述的方法,其中所述展现神经内分泌特征的肿瘤是一种神经内分泌肿瘤。
103.一种DLL3调节剂,衍生自选自下组的抗体,该组由以下各项组成:SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.39、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。
104.一种分离的DLL3调节剂,该调节剂结合到与DLL3的EGF1结构域缔合的一个表位。
105.如权利要求104所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
106.如权利要求105所述的DLL3调节剂,其中所述抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
107.如权利要求106所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种ADC。
108.如权利要求107所述的DLL3调节剂,其中所述ADC包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
109.如权利要求108所述的DLL3调节剂,另外包含一种连接子。
110.一种分离的DLL3调节剂,该调节剂结合到与DLL3的EGF2结构域缔合的一个表位。
111.如权利要求110所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
112.如权利要求111所述的DLL3调节剂,其中所述抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
113.如权利要求112所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种ADC。
114.如权利要求113所述的DLL3调节剂,其中所述ADC包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
115.如权利要求114所述的DLL3调节剂,另外包含一种连接子。
116.一种分离的DLL3调节剂,该调节剂结合到与DLL3的EGF3结构域缔合的一个表位。
117.如权利要求116所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
118.如权利要求117所述的DLL3调节剂,其中所述抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
119.如权利要求118所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种ADC。
120.如权利要求119所述的DLL3调节剂,其中所述ADC包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
121.如权利要求120所述的DLL3调节剂,另外包含一种连接子。
122.一种分离的DLL3调节剂,该调节剂结合到与DLL3的EGF4结构域缔合的一个表位。
123.如权利要求122所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
124.如权利要求123所述的DLL3调节剂,其中所述抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
125.如权利要求124所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种ADC。
126.如权利要求125所述的DLL3调节剂,其中所述ADC包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
127.如权利要求126所述的DLL3调节剂,另外包含一种连接子。
128.一种分离的DLL3调节剂,该调节剂结合到与DLL3的EGF5结构域缔合的一个表位。
129.如权利要求128所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
130.如权利要求129所述的DLL3调节剂,其中所述抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
131.如权利要求130所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种ADC。
132.如权利要求131所述的DLL3调节剂,其中所述ADC包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
133.如权利要求132所述的DLL3调节剂,另外包含一种连接子。
134.一种分离的DLL3调节剂,该调节剂结合到与DLL3的EGF6结构域缔合的一个表位。
135.如权利要求134所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
136.如权利要求135所述的DLL3调节剂,其中所述抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
137.如权利要求136所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种ADC。
138.如权利要求137所述的DLL3调节剂,其中所述ADC包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
139.如权利要求138所述的DLL3调节剂,另外包含一种连接子。
140.一种分离的DLL3调节剂,该调节剂结合到与DLL3的DSL结构域缔合的一个表位。
141.如权利要求140所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
142.如权利要求141所述的DLL3调节剂,其中所述抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
143.如权利要求142所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种ADC。
144.如权利要求143所述的DLL3调节剂,其中所述ADC包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
145.如权利要求144所述的DLL3调节剂,另外包含一种连接子。
146.一种分离的DLL3调节剂,该调节剂结合到与DLL3的N末端结构域缔合的一个表位。
147.如权利要求146所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
148.如权利要求147所述的DLL3调节剂,其中所述抗体或其免疫反应性片段包含一种单克隆抗体。
149.如权利要求148所述的DLL3调节剂,其中所述DLL3调节剂包含一种ADC。
150.如权利要求149所述的DLL3调节剂,其中所述ADC包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
151.如权利要求150所述的DLL3调节剂,另外包含一种连接子。
152.一种驻留在面元中的分离的DLL3调节剂,该面元选自下组,该组由以下各项组成:面元A、面元B、面元C、面元D、面元E、面元F、面元G、面元H及面元I。
153.一种驻留在由参考抗体界定的面元中的分离的DLL3调节剂,该参考抗体选自下组,该组由以下各项组成:SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.39、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。
154.一种具有以下公式的抗体药物偶联物:
M-[L-D]n
或一种其药学上可接受的盐其中
a)M包含一种DLL3调节剂;
b)L包含一种任选的连接子;
c)D是一种抗增殖剂;并且
d)n是从约1到约20的一个整数。
155.如权利要求154所述的抗体药物偶联物,其中所述DLL3调节剂包含一种抗体或其免疫反应性片段。
156.如权利要求155所述的抗体药物偶联物,其中所述抗体包含一种单克隆抗体。
157.如权利要求156所述的抗体药物偶联物,其中所述抗体衍生自选自下组的一种抗体,该组由以下各项组成:SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.39、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150。
158.如权利要求157所述的抗体药物偶联物,其中所述抗体是人源化的。
159.如权利要求154所述的抗体药物偶联物,其中该连接子包含一种可裂解连接子。
160.如权利要求159所述的抗体药物偶联物,其中该可裂解连接子包含一种肽基连接子。
161.如权利要求154所述的抗体药物偶联物,其中所述抗增殖剂包含一种细胞毒性剂。
162.如权利要求161所述的抗体药物偶联物,其中所述细胞毒性剂包含一种吡咯并苯并二氮杂卓。
163.如权利要求162所述的抗体药物偶联物,其中所述吡咯并苯并二氮杂卓包含一种吡咯并苯并二氮杂卓二聚物。
164.一种DLL3调节剂,包含来自SEQ ID NOS:20-203中的任一种的一个CDR。
165.如权利要求164所述的DLL3调节剂,其中所述调节剂包含来自SEQ ID NOS:20-203中任一种的多个CDR。
166.一种DLL3抗体调节剂,该调节剂与一种参考抗体竞争结合到一种DLL3蛋白,该参考抗体选自下组,该组由以下各项组成:SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.39、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150,其中该DLL3抗体调节剂与该DLL3蛋白的结合被抑制至少30%。
167.一种DLL3调节剂,该调节剂结合到包含氨基酸Q93、P94、G95、A96及P97的一个DLL3蛋白表位(SEQ ID NO:9)。
168.一种DLL3调节剂,该调节剂结合到包含氨基酸G203、R205及P206的一个DLL3蛋白表位(SEQ ID NO:10)。
实例
通过参照以下实例将更容易地了解由此以上总体上描述的本发明,这些实例是借助说明而提供并且不打算作为本发明的限制。这些实例不打算表示以下实验是所进行的全部或唯一实验。除非另外指示,否则份数是重量份,分子量是重量平均分子量,温度是摄氏度,并且压力是在大气压或接近大气压下。
实例1
具有神经内分泌特征的所选肿瘤中标记物表达的分析
起于弥散性内分泌系统的神经内分泌肿瘤(NET)较为罕见,并且每100,000个人中有2-5个人发生,但具有高度侵袭性。神经内分泌肿瘤发生于肾上腺、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宫颈及子宫内膜)、胰腺、胃肠道(胃和结肠)、甲状腺(髓样甲状腺癌)及肺(小细胞肺癌瘤、大细胞神经内分泌癌瘤及类癌瘤)中。这些肿瘤可以分泌若干激素,包括血清素和/或嗜铬粒蛋白A,这些激素可以引起称为类癌瘤综合症的衰竭性症状。这些肿瘤可以通过阳性免疫组织化学标记物表示,如神经元特异性烯醇化酶(NSE,又称为γ烯醇化酶,基因符号=ENO2)、CD56/NCAM1及突触素。传统的化学疗法在治疗ENT方面不成功,并且由转移性扩散引起的死亡是一种常见的结果。不幸的是,在大多数情形中,手术是唯一可能有疗效的治疗,不过它是在早期检测及肿瘤转移之前发生。在这一情形中,采取了工作来鉴别与包含神经内分泌特征的肿瘤相关的新颖治疗靶。
为了鉴别并表征存在于癌症患者中的那些肿瘤,使用本领域认可的技术开发并维持了一个大型非传统异种移植(NTX)肿瘤库。该NTX肿瘤库(包含相当多的离散的肿瘤细胞系)是在免疫功能低下的小鼠中通过最初从罹患多种实体肿瘤恶性疾病的多个癌症患者获得的异种肿瘤细胞多次传代来繁殖。(应注意,在此的一些实例和附图中,测试样品的传代次数是由p0-p#外加样品名称指示,其中p0指示直接地从患者肿瘤获得的未传代样品,并且p#指示在测试之前已经通过小鼠对肿瘤进行传代的次数。)具有充分确定的谱系的大量离散早期子代NTX肿瘤细胞系的持续活力极大地促进了从这些细胞系纯化的细胞的鉴别和表征。在此类工作中,使用最少传代的NTX细胞系简化了体内实验并且提供了容易地可验证的结果。另外,早期子代NTX肿瘤对如伊立替康(即)和顺铂/依托泊苷方案等治疗剂起反应,这提供了对于驱动肿瘤生长、当前疗法抗性及肿瘤复发的潜在机制的临床上相关的了解。
当确立了NTX肿瘤细胞系时,以不同方式对其表型进行表征以检查全基因表达。为了鉴别该库中何种NTX株可能是NET,通过全转录组测序和/或微阵列分析来产生基因表达谱。具体地说,检查数据以对高水平表达已知在NET中升高或用作神经内分泌分化的组织化学标记物(例如ASCL1、NCAM1、CHGA)的特定基因的肿瘤,以及具有了指示NOTCH信号传导抑制的NOTCH路径基因变化(例如,NOTCH受体水平降低及配体和效应分子改变)的肿瘤进行鉴别。
更明确地说,如在严重免疫功能低下的小鼠中针对人类肿瘤常常进行的,在建立不同NTX肿瘤细胞系之后,这些肿瘤在达到800-2,000mm3之后被割除,并且使用本领域认可的酶消化技术,使细胞解离并将其分散到悬浮液中(参见例如,U.S.P.N.2007/0292414,该案结合于此)。然后,使来自这些NTX株的解离的细胞制剂耗竭鼠类细胞,并且然后,通过荧光活化的细胞分选进一步分离人类肿瘤细胞亚群,并在RLTplusRNA溶解缓冲液(凯杰公司)中进行溶解。然后,将这些溶解产物储存于-80℃下待用。解冻之后,遵循厂商的说明书,使用RNeasy分离试剂盒(凯杰公司)来提取总RNA,并在纳诺普分光光度计(Nanodropspectrophotometer)(赛默飞科技公司(Thermo Scientific))和生物分析仪(Bioanalyzer)2100(安捷伦技术公司(AgilentTechnologies))上,再次使用制造商的方案和推荐的仪器设置进行定量。所得总RNA制剂适用于遗传测序和基因表达分析。
使用应用生物系统(ABI)SOLiD(通过寡核苷酸连接/检测来测序)4.5或SOLiD 5500xl新一代测序系统(生命技术公司(LifeTechnologies))对来自NTX株的RNA样品进行全转录组测序。使用来自ABI的设计用于低输入总RNA的改良型全转录组(WT)方案或OvationRNA-Seq System V2TM(纽杰技术公司(NuGEN Technologies Inc.)),由总RNA样品产生cDNA。改良型低输入WT方案使用了1.0ng的总RNA在3’端处扩增mRNA,导致定位的基因表达的严重3’偏移,而纽杰的系统允许在整个转录物内更一致地扩增,并且包括使用随机六聚体进行的mRNA和非聚腺苷酸化转录物cDNA的扩增。将cDNA文库片段化,并且添加条形码适体以允许汇集来自不同样品的片段文库。
ABI的SOLiD 4.5和SOLiD 5500xl新一代测序平台使得能对来自多个NTX株和分选的群体的转录组进行平行测序。由每一RNA样品构建cDNA文库,将其片段化并加条形码。每一片段文库上的条形码允许汇集相等浓度的多个样品,并且混合在一起,同时确保样品的特异性。使用ABI的SOLiDTMEZ BeadTM机器人系统使这些样品通过乳液PCR,该系统确保了样品的一致性。对于在该池中存在的单个珠粒上的每个克隆地扩增的片段,末端配对测序产生了在5’到3’方向上读取的50个碱基以及在3’到5’方向上读取的25个碱基。在该5500xl平台的情形中,对于按以上提到的方法汇集的每组8个样品,将珠粒均匀地存放在单个芯片上的6个单一通道中。对于这8个样品中的每一个,平均起来,这将产生超过5000万个50碱基读取和5000万个25碱基读取,并且在肿瘤细胞中产生极其准确的mRNA转录物水平表示。由SOLiD平台所产生的数据定位于如使用NCBI hg19.2版的公开的人类基因组进行的47版参考序列(RefSeq)所注释的34,609个基因,并且提供了大多数样品中RNA水平的可验证的测量。
SOLiD平台仅仅基于读取覆盖(独特地定位于先前未注释的基因组位置的读取)就能够不仅捕获表达,而且还有SNP、已知和未知的替代性剪接事件、小的非编码RNA及潜在地新的外显子发现。因此,使用与专有数据分析和可视化软件配对的这种新一代测序平台由此允许发现有差别的转录物表达以及所表达的mRNA转录物的特定剪接变体的差异和/或优先选择。使用度量标准RPM(每百万条的读数)和RPKM(每百万条中每千碱基的读数),将由SOLiD平台得到的测序数据标称地表示为转录物表达值,使得基础差别表达分析能够作为标准实践。
四个小细胞肺癌(SCLC)肿瘤(LU73、LU64、LU86及LU95)、一个卵巢肿瘤(OV26)及一个大细胞神经内分泌癌瘤(LCNEC;LU37)的全转录组测序测定了NET中常见的基因表达模式(图4A)。更具体地说,这些肿瘤具有较高的若干NET标记物(ASCL1、NCAM1、CHGA)表达,以及水平降低的Notch受体和效应分子(例如,HES1、HEY1)和升高的Notch抑制标记物(例如,DLL3和HES6)。相比之下,4个正常肺样品、3个肺腺癌肿瘤(LU137、LU146及LU153)及3个鳞状细胞肺癌瘤(LU49、LU70及LU76)都具有不同的Notch受体和效应分子表达,并且不显示升高的Notch抑制物(如HES6和DLL3)表达。
在鉴别出肿瘤库中何种NTX为NET之后,各自使用全转录组测序数据进行分析,以找出当与非NET(包括LU_SCC、LU_Ad及正常肺)相比较时在NET中上调的潜在治疗靶。与正常肺、正常卵巢、其他OV NTX、LU_Ad及LU_SCC NTX株中表达较小或不存在相比较,在NET NTX肿瘤(包括SCLC、LCNEC及OV26)中发现较高的DLL3表达(图4B)。相对于多种正常组织类型,NET中较高的DLL3表达是特别值得关注的,因为已知DLL3是Notch信号传导的抑制物。据此并且鉴于所产生的数据,选择DLL3作为潜在的免疫治疗靶用于进一步分析。
在发现DLL3可以证实为用于某些增生性病症的调节和治疗的可行性靶的情况下,采取工作来测定DLL3变体的表达模式和水平。如以上所论述,DLL3编码蛋白存在两种已知的剪接变体,这些变体的差别仅在于同功异型物1具有一个延长的细胞内C末端(图1E)。更具体地说,同功异型物2是由mRNA变体2(图1B;SEQ ID NO:2)编码的一种587个氨基酸的蛋白质(图1D;SEQ ID NO:4),它含有外显子8a和8c,而同功异型物1是由mRNA变体1(图1A;SEQ ID NO:1)编码的一种618个氨基酸的蛋白质(图1C;SEQ ID NO:3),它含有外显子8b。图1F中提供了图解同功异型物1和同功异型物2的一致细胞外结构域(ECD)的示意图。
再次,使用如以上所描述而获得的全转录组数据,对所选NET肿瘤进行检查以确定以上提到的外显子的表达模式,进而言之,它提供了两种同功异型物的表达比率。如图5中所示,发现尽管两种同功异型物之间的特定表达比率可能略有变化,但同功异型物1的表达在每一肿瘤中都占优势。就这一点来说,重要的是注意到,如以上所描述,每一所测试的肿瘤中的累积DLL3表达量(两种同功异型物)相对于正常组织有所升高。因此,尽管同功异型物比率可以指示某些肿瘤类型并且与基因型调节剂选择有关,但它不像表型调节剂策略那么重要。也就是说,由于两种DLL3同功异型物的ECD区是一致的,故预期针对ECD区的本发明的表型调节剂(例如,抗DLL3抗体)将与任一同功异型物反应。因此,关于这些策略的有效性,DLL3ECD(不管同功异型物如何)的绝对表达水平才是决定性的。
实例2
具有神经内分泌特征的所选NTX肿瘤中基因表达的微阵列和RT-PCR分析
为了对以上提到的NTX库中超出存在SOLiD全转录组数据的那些的另外的NET进行鉴别,使用微阵列分析对更大的一组NTX株进行检查。具体地说,使用微阵列平台(费兰斯生物技术集团(PhalanxBiotech Group))对衍生自46个NTX株的完整肿瘤或衍生自2个正常组织的2-6μg总RNA样品进行分析,该微阵列平台含有了针对人类基因组中的19,380个基因而设计的29,187个探针。更具体地说,从四十六名患者衍生的完整NTX肿瘤获得(如实例1中所描述)RNA样品,这些肿瘤包含结肠直肠(CR)癌、黑素瘤(SK)、肾(KD)癌、肺(LU)癌、卵巢(OV)癌、子宫内膜(EM)癌、乳(BR)癌、肝(LIV)癌或胰腺(PA)癌。正常的结肠直肠(NormCR)和正常的胰腺(NormPA)组织被用作对照物。又更具体地说,将肺肿瘤进一步细分类为小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)或大细胞神经内分泌癌瘤(LCNEC)。使用制造商的方案,一式三份执行RNA样品,并且使用标准工业实践对所获得的每一样品中主题基因的强度测量值进行正规化并且转化来对所得数据进行分析。使用R/BioConductor软件包(称为hclust.2)中的无偏差皮尔逊斯皮尔曼分层群集算法来创建这48个样品的标准微阵列树状图。如本领域中所知,R/BioConductor是在学术界、金融及制药行业中广泛用于数据分析的一种开放源码的统计程序语言。总体而言,基于基因表达模式、表达强度等对这些肿瘤进行安排并且群集。
如图6A中所示,衍生自这48个样品并且跨越全部19380个基因的树状图基于肿瘤类型或起源组织将NTX株群集在一起。典型地与神经内分泌表型相关的若干肿瘤在以(1)表示的分支上群集在一起;这些包括皮肤癌、众多肺癌及其他NET。有趣的是,以(2)表示的小分支显示,具有神经内分泌特征的两种大细胞肺癌(LU50.LCNEC和LU37.LCNEC)和一种小细胞肺癌(LU102.SCLC)与卵巢(OV26)和肾(KD66)肿瘤群集在一起(群集C),表明后面的这些肿瘤也具有神经内分泌表型。另外,图6A示出了群集D,它由3种另外的SCLC肿瘤组成,并且在其右侧是含有一种另外的SCLC NTX(LU100)和一种神经内分泌子宫内膜肿瘤(EM6)的一个较小群集,预期都具有某些神经内分泌特征,与从文献和诊所中的病理学经验一般所了解的相同。可以在图6A的树状图的一个完全不同的分支上发现包含肺鳞状细胞癌瘤的群集G的事实指示,该群集不是仅仅由肿瘤起源器官所驱动。
对于与NET相关的基因标记物集合的更密切的观察(图6B)显示,它们在构成群集C和D的肿瘤中较强地表达,而它们在群集G(肺鳞状细胞癌瘤)中的肿瘤中极少地表达,表明群集C和D代表了具有神经内分泌表型的NET或肿瘤。更具体地说,群集C NET高水平表达ASCL1、CALCA、CHGA、SST及NKX2-1,而群集D NET高水平表达CHGA、ENO2及NCAM1,并且这些神经内分泌表型基因的表达部分负责了这些肿瘤的群集。一个值得关注的特征是群集D中KIT的强表达,该基因偶尔报导与神经内分泌肿瘤相关,但在其他情形中明显与癌发生关联。这与群集G中缺乏这些基因中任一种的强表达的SCC肿瘤形成对比(图6B)。
就Notch信号传导来说,群集C中的肿瘤显示出与Notch信号传导减少相符的表型:缺乏任何Notch受体的表达、相对缺乏JAG1和HES1的表达及较强的ASCL1表达水平(图6C)。有趣的是,群集D显示出较高的HES6表达,这是可以通过形成异二聚物拮抗HES1活性来支持ASCL1活性的一种转录因子。最重要的是,这些微阵列数据显示在群集C和D中的肿瘤中有较高水平的DLL3转录(相对于群集G),表明在这些肿瘤类型中,DLL3提供了治疗NET的一种引人注目的治疗靶。
鉴于以上提到的结果,根据制造商的方案,使用应用生物系统(Applied Biosystems)7900HT机器(生命技术公司)进行塔克曼(Taqman)实时定量RT-PCR(qRT-PCR),对来自不同NTX株和正常组织的HES6的mRNA表达进行检查。如以上所描述来分离RNA并且进行查核以确保质量适于基因表达分析。来自正常组织的RNA是购买的(安捷伦技术公司和生命技术公司)。使用200ng RNA来进行使用cDNA档案试剂盒(生命技术公司)的cDNA合成。cDNA被用于在塔克曼低密度阵列(TLDA;生命技术公司)上进行qRT-PCR分析,该阵列含有了用于测量HES6的mRNA水平的HES6塔克曼测定。
在针对内源对照物进行正规化之后,显示每一NTX株或正常组织样品(曲线上的单个点)的HES6mRNA水平。将归一化的值相对于毒性相关正常组织(NormTox)中的平均表达量作图。这一技术允许通过测量HES6和其他相关标记物对来自NTX肿瘤库的多种具有神经内分泌特征的肿瘤进行快速鉴别并表征。图6D图解了HES6在具有神经内分泌特征的取样的肿瘤(例如,LU-SCLC、LU-LCNEC)中相较于正常组织、乳房肿瘤、结肠肿瘤、肝肿瘤及其他所选肿瘤总体上过度表达。值得注意的是,这些微阵列和qPCR数据显示,至少一些子宫内膜、肾及卵巢肿瘤可能展现出神经内分泌肿瘤特征(图6A和6D)。
实例3
具有神经内分泌特征的肿瘤中DLL3的RT-PCR分析
为了确定所产生的SOLiD和微阵列数据并且将该分析扩展到另外的NTX样品,使用来自不同NTX株、初步活检品及正常组织的RNA样品,通过qRT-PCR对DLL3mRNA的表达进行分析。实质上如以上刚刚所描述,再次使用应用生物系统7900HT机器(生命技术公司)进行该分析,但针对DLL3检测进行了优化。DLL3表达量是相对于正常组织中的平均表达量进行显示并且针对内源对照基因ALAS1的表达进行归一化。如图7中所见,基因表达的qRT-PCR询问显示,DLL3mRNA在NET群中相比正常组织中升高超过10,000,000倍。在这一实例中,取样的肿瘤包括超出先前所测试的那些的另外的SCLC NTX株以及多种衍生自初步活检物(p0)的RNA样品。总体而言,已知在初步活检样品中见到相同的模式,并且所观察到的上调并非小鼠中生长的人类肿瘤的人为结果,故这些数据证实,DLL3基因表达在展现神经内分泌特征的肿瘤中明显上调。
此外,图7中还呈现了如通过临床病理学所确定的三种NSCLC亚型:LU25是一种梭形细胞肺癌瘤,LU50是一种大细胞神经内分泌癌瘤(LCNEC),并且LU85是一种鳞状细胞癌瘤(SCC)。在LCNEC肿瘤LU50中见到最高DLL3表达,不过在SCC和梭形细胞肿瘤中也注意到升高的水平。KDY66和OV26(对应地为肾肿瘤和卵巢肿瘤)群集在具有SCLC和LCNEC肿瘤的微阵列上(图6A),表明它们包含展现神经内分泌特征的肿瘤(即,NET或pNET)。此种结论通过在两种肿瘤样品中所见的高DLL3mRNA水平确证(图7)。尽管所有的肿瘤相对于正常组织都呈现DLL3mRNA的急剧上调(图7),但在图6A和7上发现的肿瘤的比较显示,图7中所测量的DLL3mRNA表达量的微小差异对应于图6A中的有差别群集;例如,群集C含有KD66、LU50、OV26及LU102,如图7上所示,它们在较高DLL3表达量端,而LU85和LU100(各自从图6A中的群集C和D中分开群集)在所测量的肿瘤样品的更低DLL3表达端中。图6A中群集D中的小细胞肺癌肿瘤(例如LU86、LU64及LU95)显示中间水平的DLL3mRNA表达,并且可能特别易于受本发明调节剂治疗的影响。
实例4
不同肿瘤试样中DLL3mRNA和蛋白质的表达
为了将DLL3表达分析扩展到一个更广泛肿瘤试样阵列,实质上如先前实例中所描述,在TissueScanTMqPCR(奥杰技术公司(OrigeneTechnologies))384孔阵列上进行塔克曼qRT-PCR。这一阵列能够在18种不同实体肿瘤类型内用每一肿瘤类型及来自正常相邻组织的多个患者衍生的样品进行基因表达的比较。
就这一点来说,图8A和8B对应地显示了来自具有十八种不同实体肿瘤类型之一的患者的完整肿瘤试样(灰白色点)或正常相邻组织(NAT;白色点)中DLL3的相对和绝对基因表达水平。数据在图8A中针对所分析的每一肿瘤类型的NAT中的平均基因表达进行归一化。未检测到DLL3的试样分配为Ct值50,它代表了实验方案中的最后一个扩增循环。每个点代表单个组织试样,其中几何平均值以黑色线表示。使用这一奥杰TissueScan阵列,在一小组肾上腺、乳房、子宫颈、子宫内膜、肺、卵巢、胰腺、甲状腺及膀胱癌中见到DLL3的过表达,其中有许多可以代表NET或具有不良分化的神经内分泌表型的肿瘤。一小组肺肿瘤显示出最多的DLL3过表达。在该阵列上的2种LCNEC肿瘤中见到最高表达。如图8B中的绝对基因表达所示,正常睾丸是具有高DLL3表达的唯一正常组织。这表明,NET和其他肿瘤发生细胞中DLL3表达可能在众多肿瘤的肿瘤发生和/或肿瘤发展中起到作用。
已知升高的DLL3转录物水平与不同肿瘤有关,故采取了工作来证实DLL3蛋白在NET中的表达相对于其他肿瘤相应的增加。为此,使用MSD发现平台(MSD Discovery Platform)(米索斯卡发现公司(MesoScale Discovery,LLC))开展DLL3夹心ELISA以对所选NTX肿瘤样品中DLL3的表达进行检测并定量。简单地说,将NTX肿瘤样品溶解并且使用基于电化学发光检测的夹心ELISA型式来测量溶解产物中的总蛋白质浓度以及DLL3蛋白浓度。更具体地说,使用由纯化的重组蛋白产生的标准曲线,由电化学发光值内插样品中的DLL3浓度,并在图8C中以每毫克总蛋白质DLL3的纳克数来表示。
更具体地说,从小鼠中切除NTX肿瘤并在干冰/乙醇上进行急速冷冻。将蛋白质提取缓冲液(博城有限公司(Biochain Institute,Inc.))添加到解冻的肿瘤片中并使用Tissue Lyser系统(凯杰公司)将肿瘤粉碎。通过离心(20,000g,20分钟,4℃)使溶解产物变澄清,并且使用二辛可宁酸(BCA)对蛋白质进行定量。蛋白质溶解产物在-80℃下储存,直到检验。
在4℃下,用30μl含2μg/ml SC16.34抗体(如以下实例7中所陈述来获得)的PBS涂布MSD标准板(米索斯卡发现公司)过夜。在PBST中洗涤板并且在150μl MSD 3%阻断剂A溶液中阻断1小时。再在PBST中洗涤板。将25μl SC16.4抗体(如以下实例7中所陈述来获得)偶联到MSD磺基-标签并且在MSD 1%阻断剂A中以0.5μg/ml添加到经过洗涤的板中。还向这些孔中添加25μl在MSD 1%阻断剂A中10x稀释的溶解产物或在含有10%蛋白质提取缓冲液的MSD 1%阻断剂A中连续稀释的重组DLL3标准品,并且孵育2小时。在PBST中洗涤板。在水中将含表面活性剂的MSD读取缓冲液T稀释到1X并且向每一孔中添加150μl。在MSD扇形成像仪(MSD Sector Imager)2400上使用积分软件分析程序读取板,以经由内插法得到NTX样品中DLL3的浓度。然后,用值除以总蛋白质浓度,得到每毫克总溶解产物蛋白质DLL3的纳克数。所得浓度陈述于图8C中,其中每个点代表了衍生自单个NTX肿瘤株的浓度。尽管每个点是衍生自单个NTX株,但在大多数情形中,对来自同一NTX株的多个生物样品进行测试并对多个值求平均值以提供数据点。
在任何情况下,图8C显示,在SCLC、LCNEC以及其他神经内分泌肿瘤(包括所选肾样品和单个卵巢肿瘤)中发现最高的DLL3表达。图8C还证实,某些黑素瘤NTX株展现出升高的DLL3蛋白表达,这是特别值得关注的,因为这些NTX株也在实例4中进行的微阵列分析中群集在NET NTX株附近(图6A)。
这些数据,结合以上陈述的有关DLL3表达的转录数据,有力地加强了以下提议:DLL3决定子为治疗干预提供了多个引人注目的靶。
实例5
所选NTX肿瘤株的细胞表面上NOTCH受体和δ样配体的表达
为了进一步扩展由以上实例1和2得到的观察结果,使用流式细胞术对从群集C和D中发现的若干NTX肿瘤(KDY66、OV26、LU64;图6A)以及通过SOLiD测序或qRT-PCR确定具有高DLL3表达的SCLC肿瘤(LU73,图4和7)分离的细胞进行分析,以测定不同Notch受体和其他DLL家族成员的蛋白质表达水平。总体而言,使用FACSCanto II(BD生物科技公司(BD Biosciences)),遵照制造商的说明书来产生基于流式细胞术的蛋白质表达数据。图9中的数据显示了以直方图呈现的个别肿瘤细胞,其中同型对照抗体的背景染色是以灰色、实心直方图显示,并且如使用可商购的抗体测定的所关注蛋白质的表达是以粗体黑色线呈现。
如图9中以图形可见,如相对于荧光补偿(FMO)同型对照染色细胞所测定,在这些肿瘤的任一种中观察到极少到无任何Notch受体(例如NOTCH1-4)的表达。这是通过直方图以图形指示,以及在每一测量值所报导的平均荧光强度(MFI)中以数字指示。类似地,两种肺癌衍生的NTX细胞未显示出DLL1或DLL4的表达。对于这些肿瘤中的两种,可以观察到单独DLL4(OV26)或DLL1和DLL4(KDY66)的微小表达。总体而言,这些观察结果确定了以上实例1和2中所获得并且提供的结果,这些肿瘤类型显示极少到无Notch信号传导路径组分的表达,与NET或具有神经内分泌表型的不良分化的肿瘤中Notch信号传导丧失相符。
实例6
抗DLL3调节剂的产生
根据在此的传授内容,在两个独立的免疫接种活动中,通过用重组人类DLL3-Fc或用人类DLL3-His(各自包含图1C中所陈述的DLL3的成熟ECD;SEQ ID NO:3)接种来产生呈鼠类抗体形式的DLL3调节剂。就这一点来说,用人类重组DLL3接种三个小鼠品系(Balb/c、CD-1及FVB)以提供多个分泌高亲和力鼠类单克隆抗体调节剂的杂交瘤。
从艾迪珀国际公司(Adipogen International)(目录号AG-40A-0113)获得hDLL3-Fc融合构建体,其中已经如制造商的产品数据表中所描述,从过表达DLL3-Fc的HEK 293细胞的上清液中将其纯化出来。从工程改造成过表达hDLL3-His的CHOK1细胞的上清液纯化出重组hDLL3-His蛋白。将10μg的hDLL3-Fc或hDLL3-His免疫原用等体积的Gold(赛瑞克公司(CytRx Corporation))或明矾佐剂乳化,并用于对每只小鼠进行免疫接种。然后,将所得乳液经由足垫途径注射到三只雌性小鼠(以下各1只:Balb/c、CD-1及FVB)中。
使用固相ELISA检验,针对人类DLL3特异性小鼠IgG抗体来筛选小鼠血清。超过背景的阳性信号指示了DLL3特异性抗体。简单地说,用含0.5μg/ml重组DLL3-His的ELISA涂布缓冲液涂布96孔板(VWR国际公司(VWR International),目录号610744)过夜。用含有0.02%(v/v)吐温(Tween)20的PBS洗涤之后,在室温(RT)下,用200微升/孔含3%(w/v)BSA的PBS阻断这些孔1小时。对小鼠血清进行滴定(1:100、1:200、1:400及1:800)并将其以50微升/孔添加到DLL3涂布的板中,并在RT下孵育1小时。洗涤这些板,并且然后在RT下,将其与50微升/孔在3%BSA-PBS或含2%FCS的PBS中以1:10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG一起孵育1小时。再对这些板进行洗涤,并且在RT下,添加40微升/孔TMB底物溶液(赛默科技公司(Thermo Scientific)34028),保持15分钟。显影之后,添加等体积的2N H2SO4以停止底物显影并且通过分光光度计在OD 450下分析这些板。
将血清阳性的经过免疫接种的小鼠处死,并且解剖出引流淋巴结(腿弯部和腹股沟,并且如果放大的话,髂骨肌)并且将其用作抗体产生细胞的来源。通过电融合将B细胞的单细胞悬浮液(228.9×106个细胞)与非分泌型P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC#CRL-1580)以1:1比率融合。电融合是使用BTX HybrimmuneTM系统(BTX哈佛装置公司(BTXHarvard Apparatus)),遵照制造商的指导进行的。在融合程序之后,将细胞再悬浮于补充有重氮丝氨酸(西格玛公司(Sigma)#A9666)的杂交瘤选择培养基,即,含有15%Fetal Clone I血清(海可隆公司(Hyclone)))、10%BM Condimed(罗氏应用科技公司(Roche AppliedSciences))、4mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素及50μM 2-巯基乙醇的含丙酮酸钠的高葡萄糖DMEM培养基(赛格公司(Cellgro)目录号15-017-CM)中,并且然后以每个烧瓶90mL选择培养基将其接种于三个T225烧瓶中。然后将这些烧瓶放入一个含有5%CO2和95%空气的潮湿的37℃恒温箱中,保持6-7天。
生长六到七天之后,使用Aria I细胞分选仪,将由在T225中大量生长的细胞组成的文库以每孔1个细胞接种于飞康(Falcon)96孔U型底板中。然后,使所选杂交瘤在含有15%Fetal Clone I血清(海可隆公司)、10%BM-Condimed(罗氏应用科技公司)、1mM丙酮酸钠、4mM L-谷氨酰胺、100IU青霉素-链霉素、50μM 2-巯基乙醇及100μM次黄嘌呤的200μL培养基中生长。将任何残留的未使用的杂交瘤文库细胞冷冻以供未来文库测试。生长十到十一天之后,通过ELISA和FACS检验,关于对DLL3具有反应性的抗体对来自接种有细胞的每个孔的上清液进行检验。
对于通过ELISA筛选,在4℃下,用含变性的人类DLL3或过表达人类DLL3的293细胞的细胞溶解产物(如以上所论述来获得)的碳酸钠缓冲液涂布96孔板过夜。洗涤这些板并且用含3%BSA的PBS/吐温在37℃下阻断一小时,并且立即使用或保持在4℃下。在RT下,在这些板上将未稀释的杂交瘤上清液孵育一小时。洗涤这些板并且在RT下,用在3%BSA-PBS中以1:10,000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG探查一小时。然后,如以上所描述,将这些板用底物溶液孵育,并且在OD450下读取。对含有优先结合人类DLL3(如通过超过背景的信号所确定)的免疫球蛋白的孔进行转移并扩增。
也使用基于流式细胞术的检验,用工程改造成过表达人类DLL3(h293-hDLL3)、食蟹猕猴DLL3(h293-cDLL3)、大鼠(h293-rDLL3)或鼠类DLL3(h293-mDLL3)蛋白的293细胞,针对人类DLL3特异性以及食蟹猕猴、大鼠及鼠类DLL3交叉反应性对分泌鼠类免疫球蛋白的生长阳性杂交瘤孔进行筛选。通过使用由表达hDLL3和GFP标记物的商购的双顺反子慢病毒载体(奥普生物系统公司(Open Biosystems))制造的慢病毒转导293T细胞来制备h293-hDLL3细胞。通过使用一种表达mDLL3和RFP标记物的双顺反子慢病毒载体(如下构建)转导293T细胞来制备h293-mDLL3细胞。通过由商购的鼠类DLL3构建体(奥杰公司)进行PCR扩增来获得一个编码成熟鼠类DLL3蛋白(图10B;SEQ ID NO:6)的DNA片段(图10A;SEQ ID NO:5)并且使用标准分子克隆技术,将其亚克隆到预先工程改造于pCDH-EF1-MCS-IRES-RFP(系统生物科技公司(System Biosciences))的多克隆位点上游的IgG K信号肽序列的下游。类似地,通过使用一种表达大鼠DLL3和GFP标记物的双顺反子慢病毒载体转导293T细胞来制备h293-rDLL3细胞,该载体是通过使用标准分子克隆技术,将包含编码成熟大鼠DLL3蛋白(登录号NP_446118.1,残基25-589)的密码子优化的序列的合成DNA片段(基因维兹公司(GeneWiz))克隆到预先工程改造于pCDH-EF1-MCS-IRES-GFP(系统生物科技公司)的多克隆位点上游的IgK信号肽序列的下游来构建。最后,将人类DLL3序列用于针对公开可用的食蟹猴(Macacafascicularis)全基因组鸟枪法重叠群的BLAST,并且假定物种间维持该基因外显子结构来组装食蟹猕猴(Cynomolgus)基因的外显子序列,由此推断食蟹猕猴(例如食蟹猴)的DLL3(cDLL3)序列。使用来自食蟹猕猴基因组DNA(亚杰公司(Zyagen))的个别外显子2-7进行的PCR扩增和直接测序来确定所推断的序列在该蛋白质的ECD区域内是正确的。以合成方式制造(基因维兹公司)编码cDLL3蛋白(图10D;SEQ IDNO:8)的cDLL3DNA序列(图10C;SEQ ID NO:7)并且使用标准分子克隆技术,将其亚克隆到预先工程改造于pCDH-EF1-MCS-IRES-GFP(系统生物科技公司)的多克隆位点上游的IgG K信号肽序列下游。用这一载体转导293T细胞得到h293-cDLL3细胞。
对于流式细胞术检验,将对应地用人类、食蟹猕猴、大鼠或鼠类DLL3转导的50×104个h293细胞与25-100μL杂交瘤上清液一起孵育30分钟。用PBS、2%FCS洗涤细胞两次,并且然后将其与在PBS/2%FCS中以1:200稀释的50μL偶联到DyLight 649的山羊抗小鼠IgG Fc片段特异性二次抗体一起孵育。孵育15分钟之后,用PBS/2%FCS洗涤细胞两次,并且将其再悬浮于含DAPI的PBS/2%FCS中,并遵照制造商的说明书,使用FACSCanto II通过流式细胞术进行分析。对含有优先地结合DLL3+GFP+细胞的免疫球蛋白的孔进行转移并扩增。在CS-10冷冻介质(生命解决方案公司(Biolife Solutions))中低温保存所得hDLL3特异性克隆杂交瘤并在液氮中储存。结合h293-hDLL3、h293-cDLL3、h293-rDLL3及/或h293-mDLL3细胞的抗体标注为交叉反应性的(参见图12)。基于这一检验,与鼠类抗原交叉反应的所有所选调节剂也与大鼠抗原交叉反应。
ELISA和流式细胞分析确定,来自大多数或所有这些杂交瘤的纯化的抗体都以浓度依赖性方式结合DLL3。每次免疫接种活动进行一次融合并且将其接种于64个板(6144个孔,约60%-70%的克隆效率)中。hDLL3-Fc免疫接种活动和筛选得到约90种人类DLL3特异性鼠类抗体,其中有若干种与鼠类DLL3交叉反应。hDLL3-His免疫接种活动得到50种另外的人类DLL3特异性鼠类抗体,其中有许多与鼠类DLL3交叉反应。
实例7
鼠类DLL3调节剂的测序
基于前述,选出以明显较高亲和力结合固定的人类DLL3或h293-hDLL3细胞的多种示例性的相异的单克隆抗体用于测序并进一步分析。如图11A和11B中以表格形式显示,对来自实例6中产生的所选单克隆抗体的轻链可变区(图11A)和重链可变区(图11B)的序列分析确定,有许多具有新颖的互补决定区并且经常呈现出新颖的VDJ安排。应注意,图11A和11B中陈述的互补决定区是遵照查赛(Chothia)等,同上文所定义。
作为对示例性调节剂进行测序的第一个步骤,将所选杂交瘤细胞溶解于试剂(Trizol Plus RNA纯化系统(Trizol Plus RNAPurification System),生命技术公司)中以制备RNA。就这一点来说,将介于104与105个之间的细胞再悬浮于1mL Trizol中并且在添加了200μL氯仿之后剧烈振荡。然后,在4℃下将样品离心10分钟,并且将水相转移到一个添加了等体积的异丙醇的新鲜的微量离心管中。再次剧烈振荡这些管,并且使其在RT下孵育10分钟,之后在4℃下离心10分钟。用1mL的70%乙醇洗涤所得RNA团粒一次,并且在RT下简短地干燥,之后将其再悬浮于40μL DEPC处理的水中。通过以3μL在1%琼脂糖凝胶中进行分级分离来测定RNA制剂的质量,之后在-80℃下储存待用。
使用了包含三十二种被设计成靶向完整小鼠VH谱系的小鼠特异性前导序列引物的5’引物混合物,以及对所有小鼠Ig同型具有特异性的3'小鼠Cγ引物来对每个杂交瘤的Ig重链的可变区进行扩增。使用相同的PCR引物,从两端对VH的400bp PCR片段进行测序。类似地,使用三十二种被设计成扩增每个Vκ小鼠家族的5'Vκ前导序列引物组合对小鼠κ恒定区具有特异性的单个反向引物的混合物来对κ轻链进行扩增并测序。使用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)由100ng总RNA对VH和VL转录物进行扩增。
对每个杂交瘤执行总计八次RT-PCR反应:四次针对Vκ轻链并且四次针对Vγ重链(γ1)。使用单步骤RT-PCR试剂盒(One Step RT-PCRkit)进行扩增(凯杰公司)。该试剂盒提供了Sensiscript和Omniscript反转录酶、HotStarTaq DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲剂及Q-Solution(能够高效地扩增“困难”(例如富含GC)的模板的一种新颖添加剂)的掺合物。制备反应混合物,这些反应混合物包括3μL RNA、0.5的100μM重链或κ轻链引物(通过IDT定制合成)、5μL的5×RT-PCR缓冲液、1μL dNTP、1μL含有反转录酶和DNA聚合酶的酶混合物及0.4μL核糖核酸酶抑制剂RNasin(1个单位)。该反应混合物含有反转录和PCR所需的所有试剂。热循环仪程序设置为RT步骤50℃下30分钟,95℃下15分钟,随后是30个循环的PCR(95℃下30秒,48℃下30秒,72℃下一分钟)。然后在72℃下最后孵育10分钟。
为了制备用于直接DNA测序的PCR产物,根据制造商的方案,使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(凯杰公司)对其进行纯化。使用50μL无菌水从离心柱中洗脱出DNA,并且然后直接地从两条链进行测序。使用特定V区引物直接地对所提取的PCR产物进行测序。使用IMGT对核苷酸序列进行分析以鉴别出具有最高序列同源性的生殖系V、D及J基因成员。使用V-BASE2(瑞特等,同上文)并且通过将VH和VL基因与小鼠生殖系数据库相比对,来比较所衍生的序列与已知的生殖系Ig V区和Ig J区DNA序列,从而提供图11A和11B中所陈述的注释的序列。
更具体地说,图11A描绘了来自抗DLL3抗体的九十二种新颖鼠类轻链可变区(SEQ ID NOS:20-202,偶数)和衍生自代表性鼠类轻链的五种人源化轻链可变区(SEQ ID NOS:204-212,偶数)的连续氨基酸序列。类似地,图11B描绘了来自相同的抗DLL3抗体的九十二种新颖鼠类重链可变区(SEQ ID NOS:21-203,奇数)和来自提供人源化轻链的相同鼠类抗体的五种人源化重链可变区(SEQ ID NOS:205-213,奇数)的连续氨基酸序列。因此,图11A与11B合起来提供了九十二种可操作的鼠类抗DLL3抗体(称为SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150)和五种人源化抗体(称为hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56)的注释序列。应注意,这些名称可以指产生主题抗体的克隆,并且因此,任何特定名称的使用应当在周围披露的上下文中解释。
出于本申请的目的,每个特定抗体的SEQ ID NOS是连续的。因此,mAb SC16.3包含的SEQ ID NOS:20和21对应地为轻链和重链可变区。就这一点来说,SC16.4包含SEQ ID NOS:22和23,SC16.5包含SEQ IDNOS:24和25等。另外,图11A和11B中每个抗体氨基酸序列的相应核酸序列附于本申请中与其一起提交的序列表中。在主题序列表中,所包括的核酸序列包含的SEQ ID NOS比相应的氨基酸序列(轻链或重链)长两百个。因此,编码mAb SC16.3轻链和重链可变区氨基酸序列的核酸序列(即,SEQ ID NOS:20和21)包含序列表中的SEQ ID NOS:220和221。就这一点来说,编码所有所披露的轻链和重链可变区氨基酸序列的核酸序列(包括编码人源化构建体的那些)是类似地编号并且包含SEQ ID NOS:220-413。
实例8
DLL3调节剂的人源化
如以上所暗指的,使用互补决定区(CDR)移植,使来自实例7的五种鼠类抗体人源化。基于关于功能性人类生殖系基因的序列和结构相似性来选择重链和轻链的人类构架。就这一点来说,通过将小鼠经典CDR结构与具有相同经典结构的人类候选物相比较来评价结构相似性,如查赛等(同上文)中所描述。
更明确地说,使用计算机辅助的CDR移植法(阿拜斯数据库(AbysisDatabase),UCL商业公司(UCL Business Plc.)和标准分子工程技术使鼠类抗体SC16.13、SC16.15、SC16.25、SC16.34及SC16.56人源化以提供hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56调节剂。基于与主题小鼠构架序列的最高序列同源性和其经典结构对可变区的人类构架区进行选择。出于人源化分析的目的,将氨基酸分配到每个CDR结构域是根据卡贝特等的编号(同上文)。
分子工程改造程序是使用本领域认可的技术进行。为此,从杂交瘤提取总mRNA并且如以上实例7刚刚陈述的进行扩增。
从核苷酸序列信息,获得有关主题鼠类抗体的重链和轻链的V、D及J基因区段的数据。基于这些序列数据,设计出对这些抗体的Ig VH和VK轻链的前导序列具有特异性的新引物集进行重组单克隆抗体的克隆。随后,将V-(D)-J序列与小鼠Ig生殖系序列相比对。所得到的该五种人源化构建体中每一种的基因安排显示于下表1中。
表1
表1中描绘的序列对应于图11A和11B中关于主题克隆所陈述的注释的重链和轻链序列。更具体地说,上表1中的条目对应于SEQ ID NOS:204和205(hSC16.13)、SEQ ID NOS:206和207(hSC16.15)、SEQ IDNOS:208和209(hSC16.25)、SEQ ID NOS:210和211(hSC16.34)以及SEQ ID NOS:212和213(hSC16.56)所陈述的连续可变区序列。另外,表1显示,维持这些结合调节剂的有利特性需要极少的构架变化。就这一点来说,在重链可变区中不存在构架变化或回复突变,并且在轻链可变区中仅采取两个构架修饰(即,hSC16.15和hSC16.34中的87F)。
在通过CDR移植使所有所选抗体人源化之后,对所得轻链和重链可变区氨基酸序列进行分析以确定它们关于鼠类供体和人类受体轻链和重链可变区的同源性。下表2中显示的结果揭露,这些人源化构建体关于人类受体序列始终展现出比鼠类供体序列更高的同源性。更明确地说,与人源化抗体和供体杂交瘤蛋白质序列的同源性(74%-83%)相比较,鼠类重链和轻链可变区显示与最紧密匹配的人类生殖系基因类似的总体同源性百分比(85%-93%)。
表2
在测试时,并且如以下将更详细地论述,这些人源化构建体各自展现出与鼠类亲本抗体所显示的那些大致相当的有利的结合特征。
不管是人源化的还是鼠类,一旦确定了可变区的核酸序列,就可以使用本领域认可的技术对本发明的抗体进行表达并分离。为此,将所选重链(人源化或鼠类的)可变区的合成DNA片段克隆到人类IgG1表达载体中。类似地,将可变区轻链DNA片段(也为人源化或鼠类的)克隆到人类轻链表达载体中。然后,通过将所衍生的重链和轻链核酸构建体共转染到CHO细胞中来表达所选抗体。
更明确地说,一种可相容的抗体制备方法包括将鼠类或人源化可变区基因(使用PCR扩增)定向克隆到所选人类免疫球蛋白表达载体中。Ig基因特异性PCR中使用的所有引物都包括限制性位点,这些位点允许直接克隆到含有人类IgG1重链和轻链恒定区的表达载体中。简单地说,用Qiaquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司)纯化PCR产物,随后对应地用AgeI和XhoI(对于重链)及XmaI和DraIII(对于轻链)进行消化。对消化的PCR产物进行纯化,之后连接到表达载体中。连接反应是用200U T4-DNA连接酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、7.5μL消化并且纯化的基因特异性PCR产物及25ng线性化载体DNA进行,总体积10μL。经由在42℃下热休克,用3μL连接产物对感受态大肠杆菌DH10B细菌(生命技术公司)进行转化,并且将其接种到氨比西林板(100μg/mL)上。然后,将VH区的AgeI-EcoRI片段插入pEE6.4HuIgG1表达载体的相同位点,同时将合成XmaI-DraIII VK插入物克隆到对应的pEE12.4Hu-κ表达载体的XmaI-DraIII位点中。
通过使用293fectin,用适当质粒转染HEK 293细胞来产生多个产生所选抗体的细胞。就这一点来说,用QIAprep离心柱(凯杰公司)纯化质粒DNA。在150mm板(飞康,贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson))中,在标准条件下于补充有10%热灭活FCS、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素G(都来自生命技术公司)的杜贝卡氏改良型伊格氏培养基(DMEM)中培养人胚肾(HEK)293T(ATCC编号CRL-11268)细胞。
对于瞬时转染,使细胞生长到80%汇合。将等量的IgH和相应IgL链载体DNA(各12.5μg)添加到1.5mL Opti-MEM中,在1.5mL opti-MEM中混有50μL HEK 293转染试剂。该混合物在室温下孵育30分钟,并且均匀地分布到培养板上。转染之后三天,收集上清液,用20mL补充有10%FBS的新鲜DMEM更换,并且在转染之后6天时再次收集。通过以800×g离心10分钟来清除培养物上清液中的细胞碎片并在4℃下储存。用蛋白质G珠粒(GE医疗集团)纯化重组嵌合和人源化抗体,并且在适当条件下储存。
实例9
DLL3调节剂的特征
使用不同方法对如以上所陈述而产生的所选DLL3调节剂的结合和免疫化学特征进行分析。具体地说,通过本领域认可的方法(包括流式细胞术)针对亲和力、动力学、面元划分、结合位置及关于人类、食蟹猕猴、大鼠及小鼠抗原识别的交叉反应性(即,使用来自实例6的细胞和构建体)对多种抗体调节剂进行表征。使用在ForteBio RED(福特生物有限公司)上进行的生物层干涉分析或使用Biacore 2000进行的表面等离子共振,各自根据制造商的说明书来测量所选调节剂的亲和力及动力学常数kon和koff。
表征结果以表格形式陈述于图12中,其中可以看出,所选调节剂一般展现在纳摩尔浓度范围内的相对较高亲和力并且在许多情形中具有交叉反应性。图12另外列出了凭经验确定的调节剂面元(bin),以及如使用酵母介导的抗原片段表达(如以下实例10更详细地描述)测定的主题调节剂所结合的DLL3结构域。另外地,图12另外包括如以下实例12中所陈述而测定的调节剂介导细胞毒性诱导的NTX肾肿瘤株的细胞杀灭的能力(活细胞的%)。总体而言,这些数据证实了所披露的调节剂的变化的结合特性以及它们用于药物环境中的潜力。
对于抗体面元划分,遵照制造商的说明书,使用ForteBio RED来鉴别结合到相同或不同面元的竞争抗体。简单地说,将参考抗体(Ab1)捕获到抗小鼠捕获芯片上,然后使用高浓度非结合抗体来阻断该芯片并且收集基线值。然后,通过特定抗体(Ab1)捕获单体、重组人类DLL3-Flag(艾迪珀国际公司)并且将尖端浸入一个具有与对照物相同的抗体(Ab1)的孔中或浸入一个具有不同测试抗体(Ab2)的孔中。如果用一种新的抗体观察到另外的结合,那么确定Ab1和Ab2在不同的面元中。如果如通过将结合水平与对照Ab1相比较所测定,未发生另外的结合,那么确定Ab2是在相同面元中。如本领域中所知,这一方法可以扩大到使用在96孔板中代表独特面元的一整行抗体来筛选较大的独特抗体文库。在该情形中,这一面元划分方法显示所筛选的抗体结合到DLL3蛋白上至少九个不同的面元(在图12中命名为面元A到I)。基于DLL3抗原的表观大小(其中ECD为约56kD)和所采用的面元划分方法的解决方案,相信这九个所鉴别的面元代表了DLL3细胞外抗原上存在的大多数面元。
除对如以上所陈述的示例性调节剂进行评价外,还进行流式细胞术以便确定所选SC16抗体调节剂可以与人类DLL3免疫特异性缔合并且确定这些调节剂是否与食蟹猕猴、大鼠和/或鼠类DLL3交叉反应。更明确地说,实质上如以上实例6中所描述,通过流式细胞术,使用FACSCanto II及过表达鼠类、大鼠、食蟹猕猴或人类DLL3(即,表达GFP的h293-hDLL3、h293-cDLL3、h293-rDLL3及h293-mDLL3)的293细胞来分析示例性鼠类调节剂。在一些情形中,使用柯克伦(Cochran)等(《免疫方法杂志》287(1-2):147-158(2004))所描述的方法,通过流式细胞术,使用FACSCanto II和呈现食蟹猕猴DLL3的酵母细胞来分析示例性鼠类调节剂。
基于流式细胞术,发现所有的所选抗体调节剂都结合到在293细胞上过表达的人类DLL3(数据未示出),同时发现许多测试抗体与食蟹猕猴和/或鼠类DLL3交叉反应(与小鼠反应的所有抗体也与大鼠反应)。就这一点来说,并且如图12中所列,发现与人类DLL3免疫特异性反应的十三种调节剂中有八种也与鼠类(或大鼠)DLL3反应。具体地说,发现mAb SC16.4、SC16.8、SC16.15、SC16.34、SC16.39、SC16.46、SC16.51及SC16.56在一种更高或更低的程度上与鼠类DLL3交叉反应,而mAbSC16.7、SC16.10、SC16.13、SC16.25及SC16.65与鼠类DLL3没有可感知地缔合。这些结果是在意料之中的,因为鼠类DLL3与人类DLL3的同功异型物2约83%同源(参见图2B)。应理解的是,这一交叉反应性可以通过使用动物模型而在本发明的情形中有利地用于药物发现和开发。
除以上提到的检验外,对来自实例8的人源化构建体hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56进行分析以确定CDR移植法是否可感知地改变了其结合特征。就这一点来说,将人源化构建体(CDR移植的)与“传统的”嵌合抗体相比较,这些嵌合抗体包含鼠类亲本(或供体)重链和轻链可变结构域以及与人源化构建体中所用的恒定区实质上相同的人类恒定区。用这些构建体,使用Biacore 2000(GE医疗集团)进行表面等离子共振(SPR)以鉴别由人源化过程所引起的速率常数的任何微小变化。
测试调节剂之一(SC16.15)的示例性结果以及人源化和嵌合构建体各自结果的表格概述示于图13A-13C中。基于25和12.5nM人类DLL3抗原的浓度系列(产生图13A和13B中关于SC16.15的从顶部到底部的曲线)并且使用1:1的朗缪尔结合模型,估算出SC16.15抗体结合到人类DLL3抗原的KD为0.2nM。然后,用其他人源化构建体和嵌合构建体执行类似实验(数据未示出)以提供图13C中陈述的亲和力值。这些结果指示,人源化过程不会在本质上影响调节剂的亲和力。
实例10
DLL3调节剂的结构域和表位定位
为了对所披露的DLL3抗体调节剂所缔合或结合的表位进行表征并定位,使用柯克伦等,2004(同上文)所描述的方案的改良方案进行结构域水平的表位定位。简单地说,在酵母表面上对包含特定氨基酸序列的DLL3的个别结构域进行表达并且通过流式细胞术测定每一DLL3抗体的结合。
更具体地说,产生酵母呈现质粒构建体以表达以下构建体:DLL3细胞外结构域(氨基酸27-466);DLL1-DLL3嵌合体,它由DLL1的N末端区和DSL结构域(氨基酸22-225)与DLL3的EGF样结构域1到6(氨基酸220-466)的融合物组成;DLL3-DLL1嵌合体,它由DLL3的N末端区和DSL结构域(氨基酸27-214)与DLL1的EGF样结构域1到8(氨基酸222-518)的融合物组成;EGF样结构域1(氨基酸215-249);EGF样结构域2(氨基酸274-310);EGF样结构域1和2(氨基酸215-310);EGF样结构域3(氨基酸312-351);EGF样结构域4(氨基酸353-389);EGF样结构域5(氨基酸391-427);及EGF样结构域6(氨基酸429-465)。(有关结构域信息,一般参见UniProtKB/Swiss-Prot数据库条目Q9NYJ7,通过引用结合于此。应注意,氨基酸编号是通过参照具有如SEQID NO.3中所陈述的前导序列的未加工DLL3蛋白进行。)对于作为整体分析N末端区或EGF结构域,如与片段相对,使用了具有家族成员DLL1(DLL1-DLL3和DLL3-DLL1)的嵌合体来使蛋白质折叠的潜在问题最少。先前已经显示,结构域定位的抗体不与DLL1交叉反应,指示与这些构建体的任何结合都是通过与该构建体的DLL3部分的缔合发生。将这些质粒转化到酵母中,然后,如柯克伦等中所描述,使其生长并进行诱导。
为了测试与特定构建体的结合,在PBS+1mg/mL BSA(PBSA)中洗涤200,000个表达所希望的构建体的经过诱导的酵母细胞两次,并且在50μL PBSA中以0.1μg/mL与生物素化抗HA克隆3F10(罗氏诊断试剂公司(Roche Diagnostics))以及50nM纯化的抗体或来自培养7天的杂交瘤的未纯化上清液的1:2稀释液一起孵育。在冰上,将细胞孵育90分钟,随后在PBSA中洗涤2次。然后,将细胞在50μL PBSA中与适当二次抗体一起孵育:对于鼠类抗体,Alexa 488偶联的抗生蛋白链菌素和Alexa 647偶联的山羊抗小鼠(都来自生命技术公司)各自以1μg/mL添加,并且对于人源化或嵌合抗体,Alexa 647偶联的抗生蛋白链菌素(生命技术公司)和R-藻红素偶联的山羊抗人类(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))各自以1μg/mL添加。在冰上孵育二十分钟之后,用PBSA洗涤细胞两次并且在FACS Canto II上进行分析。结合到DLL3-DLL1嵌合体的抗体指定为结合到N末端区+DSL。特异性结合到特定EGF样结构域上存在的表位的抗体指定为结合到其对应结构域(图14A)。
为了将表位分类为构象(例如,不连续的)或线性的,在80℃下对呈现DLL3细胞外结构域的酵母进行热处理,持续30分钟,然后在冰冷的PBSA中洗涤两次。然后,使呈现变性抗原的酵母(变性的酵母)经历与以上所描述相同的染色方案和流式细胞分析。结合到变性的和天然的酵母的抗体被分类为结合到一个线性表位,而结合天然酵母但不结合变性酵母的抗体被分类为构象特异性的。
测试抗体的结构域水平表位定位的示意性概述提供于图14A中,其中结合一个线性表位的抗体加下划线,并且在测定时,所述的相应面元以括号表示。图14A的评述显示,大多数调节剂倾向于将所发现的表位定位在DLL3的N末端/DSL区,或第二EGF样结构域。如先前所暗指的,图12以一种表格形式提供了有关多种所选调节剂的面元确定和结构域定位的类似数据。
为了证明所披露的调节剂有效地消除肿瘤发生细胞的能力,尽管结合到不同的DLL3区域,但杀灭数据仍与结构域结合相关。更明确地说,图14B示出了针对所选调节剂的结构域作图的调节剂介导的KDY66PDX株体外杀灭作用(如以下实例12中所述得到)。这些数据显示,如使用这一体外杀灭检验测量时,结构域特异性调节剂杀灭作用略有变化。然而,对于有效调节剂,出现一种值得关注的趋势,其中在每个结构域中的最大杀灭作用随着表位向一级序列的N末端移动而增加。明确地说,最大杀灭效率从EGF6到EGF2改善,并且横过N末端结构域、EGF1及EGF2达到稳定状态。另外地,在这一检验中所测试的抗体中,最高百分比的有效抗体结合于N末端结构域处。这表明,与DLL3的DSL结构域或N末端区缔合或结合的调节剂可以证明作为药物或作为细胞毒性剂的靶部分特别有效。
使用两种方法之一对所选抗体进一步进行精细的表位定位。第一种方法采用了Ph.D.-12噬菌体呈现肽文库试剂盒(新英格兰生物实验室E8110S),该试剂盒是根据制造商的说明书使用的。简单地说,将用于表位定位的抗体在3mL 0.1M碳酸氢钠溶液(pH 8)中以50μg/mL涂布到纽克(Nunc)MaxiSorp管(纽克公司)上过夜。用含3%BSA溶液的碳酸氢盐溶液阻断该管。然后,使含1011个输入噬菌体的PBS+0.1%吐温20结合,随后以0.1%吐温20连续洗涤,以洗掉未结合的噬菌体。室温下,在轻柔搅动下用1mL 0.2M甘氨酸洗脱残留噬菌体10分钟,随后用150μL 1M Tris-HCl(pH 9)中和。对洗脱的噬菌体进行扩增并再次用1011个输入噬菌体进行淘选,在洗涤步骤期间,使用0.5%吐温20以增加选择严格度。使用Qiaprep M13离心试剂盒(凯杰公司)对来自第二轮的洗脱的噬菌体的24个斑块的DNA进行分离,并测序。使用ELISA检验来确定克隆噬菌体的结合,其中将定位的抗体或对照抗体涂布到ELISA板上,阻断并暴露于每个噬菌体克隆。使用辣根过氧化酶偶联的抗M13抗体(GE医疗集团),以及1-Step Turbo TMB ELISA溶液(皮尔斯公司(Pierce))检测噬菌体结合。使用针对抗原ECD肽序列的载体NTI(生命技术公司)对来自特异性结合的噬菌体的噬菌体肽序列进行比对以确定结合的表位。
作为替代方案,使用一种酵母呈现方法(朝(Chao)等,《自然实验手册》(Nat Protoc.)1(2):755-768,2007)对所选抗体进行表位定位。简单地说,用易错PCR,使用核苷酸类似物8-氧代-2’脱氧鸟苷-5’-三磷酸和2’-脱氧-p-核苷-5’三磷酸(都来自曲林克生物公司(TriLink Bio))产生DLL3ECD突变体文库以达到每个克隆一个氨基酸突变的靶诱变率。将这些转化到酵母呈现型式中。使用以上关于结构域水平定位所描述的技术,针对HA和50nM抗体结合对该文库进行染色。使用FACS Aria(BD),分选出相较于野生型DLL3ECD展现出结合损失的克隆。使这些克隆再生长,并且针对与靶抗体结合的损失来经历另一轮的FACS分选。使用Zymoprep酵母质粒微型制备试剂盒(泽莫研究公司(Zymo Research)),对个别ECD克隆进行分离并测序。必要时,使用Quikchange定点诱变试剂盒(安捷伦公司)将突变型式重新转换为单突变ECD克隆。
接下来,对个别ECD克隆进行筛选以确定结合损失是否由表位中的突变或引起错误折叠的突变所致。由于错误折叠突变的可能性较高,故将涉及半胱氨酸、脯氨酸及终止密码子的突变自动地丢弃。然后,针对与非竞争、构象特异性抗体的结合,对残留ECD克隆进行筛选。失去与非竞争、构象特异性抗体的结合的ECD克隆被断定为含有错误折叠突变,而保持与野生型DLL3ECD相当的结合的ECD克隆被断定是适当地折叠的。后一组中的ECD克隆的突变被断定是在表位中。结果列于下表3中。
表3
抗体克隆 |
表位 |
SEQ ID NO: |
SC16.23 |
Q93、P94、G95、A96、P97 |
9 |
SC16.34 |
G203、R205、P206 |
10 |
SC16.56 |
G203、R205、P206 |
10 |
更明确地说,表3中列出了具有衍生的表位的所选抗体的概述,这些表位包含涉及抗体结合的氨基酸残基。就这一点来说,抗体SC16.34和SC16.56明显地与常见氨基酸残基相互作用,这与图14A中所示的面元划分信息和结构域定位结果相符。另外,SC16.23被发现与相异的连续表位相互作用并且发现它不与SC16.34或SC16.56进行面元划分。应注意,出于所附序列表的目的,SEQ ID NO:10将在204位处包含一个占位氨基酸。
实例11
细胞表面上DLL3的基于流式细胞术的检测及肿瘤中DLL3的免疫组织化学染色
为了确定所披露的调节剂的免疫特异性,使用流式细胞术对示例性SC16抗体调节剂进行测试以确定它们选择性识别在表面上表达DLL3蛋白的工程改造的293细胞系的能力。就这一点来说,实质上如实例6中所描述来产生表达DLL3的细胞,使其暴露于所选调节剂并如在此所描述,通过流式细胞术进行检查。采用同型染色并且荧光补偿(FMO)对照来确定染色特异性。如通过图15中关于SC16.56调节剂所示的代表性数据所证实,一些SC16抗体(例如SC16.56)对于293-hDLL3细胞(图15B)和293-mDLL3细胞(图15C)呈强染色,但对于非DLL3表达性亲本293细胞不染色(图15A)。经由流式细胞术,这些数据证实,所披露的调节剂免疫特异性识别人类DLL3,并且在SC16.56的情况下也识别鼠类DLL3。
为了确定这些发现并且证实可以在人类肿瘤细胞上检测到DLL3表达,使用若干示例性SC16抗体,通过流式细胞术来评估所选NTX肿瘤的表面上DLL3蛋白的表达。就这一点来说,有关这些抗体之一,即SC16.56,以及OV26、KDY66及LU37三种特定肿瘤的数据陈述于图16中。更具体地说,收集NTX肿瘤,将其解离并且用可商购的抗小鼠CD45、抗小鼠H-2Kd、抗人类EpCAM及以上所描述的抗人类/小鼠DLL3(SC16.56)抗体进行共染色。类似于以上所描述的293染色实验,采用同型染色并且荧光补偿(FMO)对照来确定非特异性染色的缺乏。如图16中所见,对于卵巢OV26NTX(图16A)、肾KDY66NTX(图16B)及肺LU37NTX(图16C)肿瘤细胞系,如通过荧光曲线移位到右侧,并且通过平均荧光强度(MFI)值所指示,抗DLL3染色在一部分人类NTX肿瘤细胞中更高。以一种相同的方式也对SCLC NTX肿瘤进行染色并且类似地证实了DLL3的阳性表达(数据未示出)。这些数据表明,DLL3蛋白是在不同NTX肿瘤的表面上表达,并且因此适用于使用抗DLL3抗体型调节剂进行的调节。
为了进一步确证DLL3蛋白的存在并且将其定位于肿瘤架构中,对人类患者肿瘤衍生的NTX肿瘤、正常人类组织及原发SCLC肿瘤进行免疫组织化学(IHC)检验。更具体地说,使用间接检测方法,包括针对DLL3的鼠类单克隆一次抗体(SC16.65)、小鼠特异性生物素偶联的二次抗体、与辣根过氧化酶偶合的抗生物素蛋白/生物素复合物、酪胺信号扩增及DAB检测(纳肯PK(Nakene PK)1968;16:557-60),对福尔马林固定并且石蜡包埋(FFPE)的组织切片进行IHC。当对人类患者肿瘤衍生的NTX肿瘤进行染色时,使用了小鼠IgG阻断步骤来减少由非特异性结合引起的背景。首先,通过在过表达DLL3的293细胞中显示特异性染色,而在不表达DLL3的亲本293细胞中则无,来验证并确定SC16.65适于IHC,并且该染色在用DLL3靶向性发夹处理的细胞中减弱(参见以下实例14,数据未示出),这些发夹被设计并验证DLL3RNA和蛋白质的表达敲除。对一组异种移植NTX肿瘤进行的IHC显示,DLL3位于先前测试对DLL3mRNA呈阳性的许多SCLC NTX和NET肿瘤的膜上和细胞质中(图16D)。从无染色(-)到高表达(+++)对染色强度进行评分,其中也标出阳性细胞百分比。正常人类组织的染色显示出不可检测DLL3的表达(图16E)。值得注意的是,原发SCLC肿瘤样品的染色确定,36/43个肿瘤对DLL3呈阳性(图16F)。还进行了嗜铬粒蛋白A(CHGA)染色来确定肿瘤事实上为SCLC肿瘤。缺乏DLL3的大多数肿瘤也缺乏CHGA染色,指示这些切片可能不含肿瘤组织或该组织在加工期间受损。测试对DLL3呈阳性但对CHGA呈阴性的两种肿瘤都是晚期(IIIa)SCLC肿瘤。这一数据表明,DLL3提供了一种有效的治疗靶,因为它一般不在正常人类组织表达,而是存在于大多数SCLC肿瘤中。
实例12
DLL3调节剂促进细胞毒性剂的传递
为了确定本发明的DLL3抗体调节剂是否能够介导细胞毒性剂向活细胞的传递,使用随机选择的DLL3抗体调节剂进行体外细胞杀灭检验。
具体地说,在添加抗体和毒素之前一天,将2,500个细胞/孔的人类KDY66(一种表达内源DLL3的NET NTX)解离到单细胞悬浮液中,并且接种于BD PrimariaTM板(BD生物科技公司)上补充有生长因子的无血清培养基(如本领域中所知)中。向这些培养物中添加不同浓度的纯化的DLL3调节剂(如实例6和7中所描述的那些),及固定浓度的共价连接到皂草毒素(现代靶向系统公司(Advanced Targeting Systems),#IT-48)的4nM抗小鼠IgG Fab片段,保持七天。就针对293-hDLL3的杀灭作用来说,在添加抗体和毒素之前一天,将500个细胞/孔接种到单细胞悬浮液中并且将其接种于BD组织培养板上含10%FBS的DMEM中。向这些培养物中添加两种浓度的不同DLL3调节剂和一种固定浓度的共价连接到皂草毒素的2nM抗小鼠IgG Fab片段,保持三天。通过使用Cell Titer(普洛麦格公司(Promega)),遵照制造商的说明书对活细胞数量进行计数,来测定皂草毒素复合物内化并杀灭细胞的能力。使用了含具有皂草毒素Fab片段的细胞的培养物进行的原始发光计数设为100%参考值并且由此计算所有其他计数(称为“归一化的RLU”)。使用这一检验,证实一小组所测试的DLL3抗体在500和50pM下杀灭KDY66细胞,并且一小组测试抗体在250和25pM下对过表达的hDLL3的293细胞进行杀灭(图17A)。如在曲线左侧处的IgG2a、IgG2b及MOPC柱形所示,同型对照不影响细胞计数(图17A)。
以稀释液形式测试在以上所描述的第一检验中显示出有效杀灭的一小组DLL3调节剂以测定活性的EC50值。图17B中示出了两种此类代表性抗体SC16.34和SC16.15,其中测定SC16.15出对OV26(一种卵巢NET NTX肿瘤)显示有效的杀灭作用,并且相对于SC16.34所示的杀灭特征(例如5.7pM),具有亚皮摩尔浓度的EC50(例如,0.14pM)。由于皂草毒素仅在吸收到细胞质中(其中它使核糖体失活)之后才杀灭细胞,故这一检验也证实,在DLL3特异性抗体结合到细胞表面之后,可能发生内化,无需另外的交联或二聚化。
最后,用偶联到ADC1的人源化SC16.15或用人源化IgG1对照ADC1(遵照以下实例13进行偶联)处理LU37。具体地说,在添加偶联抗体之前一天,将2,500个LU37NTX细胞接种于BD PrimariaTM板(BD生物科技公司)上每个孔中的补充有生长因子的无血清培养基(如本领域中所知)中。向这些培养物中添加不同浓度的huIgG1-ADC1或hSC16.15-ADC,保持七天,并且通过对细胞数量计数来测定细胞毒性剂的杀灭能力(如以上所描述)。使用这一检验,证实了hSC16.15-ADC1有效地杀灭LU37。相比于杀灭50%的LU37需要>1,000ng/ml的对照ADC,<10ng/ml的hSC16.15-ADC1就杀灭50%的LU37(图17C)。
实例13
DLL3抗体-药物偶联物的制备
基于前述用皂草毒素得到的结果并且为了进一步证实本发明的多用性,使用共价连接的细胞毒性剂来制备抗DLL3抗体药物偶联物(DLL3-ADC)。更具体地说,制备出包含如在此或以下参考文献中所描述的连接子,及所选吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚物的DLL3-ADC,这些二聚物共价附接到所披露的调节剂(参见例如,U.S.P.Ns.2011/0256157和2012/0078028及U.S.P.N 6,214,345,各自通过引用以其全文结合于此)。
根据所引用的参考文献,使用本领域认可的技术对PBD药物-连接子组合进行合成并纯化。尽管采用了不同PBD二聚物和连接子来制造所选药物-连接子组合,但每个连接子单元包含具有游离硫氢基的末端顺丁烯二酰亚胺基部分。使用这些连接子,经由用三(2-羧乙基)-膦(TCEP)部分地还原mAb,随后使还原的Cys残基与顺丁烯二酰亚胺基-连接子载荷反应来制备偶联物。
更明确地说,在37℃下,在25mM Tris HCl pH 7.5和5mM EDTA缓冲液中,用1.3mol TCEP/mol mAb还原所选DLL3抗体调节剂,持续2小时。使该反应冷却到15℃并且以2.7mol/mol mAb的比率添加含连接子载荷的DMSO,随后再添加一定量的DMSO直到最终浓度为6%(v/v)。使该反应进行1小时。通过添加过量的N-乙酰基半胱氨酸对未反应的药物-连接子进行封端。然后,通过离子交换柱,使用AKTA Explorer FPLC系统(G.E.医疗集团)对DLL3-ADC(或SC16-ADC)进行纯化以去除聚集的高分子量抗体、共溶剂及小分子。然后,通过切向流过滤(TFF)到配制物缓冲液中,随后调整浓度并添加清洁剂来对洗脱的ADC进行缓冲液更换。针对蛋白质浓度(通过测量UV)、聚集(SEC)、药物与抗体比率(DAR)(通过反相(RP)HPLC)、未偶联抗体的存在(通过疏水相互作用色谱(HIC)HPLC)、非蛋白质材料(通过RP HPLC)及体外细胞毒性(使用DLL3表达细胞系)对最终ADC进行分析。
使用以上提到的程序,或实质上类似的方法,产生多个包含不同DLL3调节剂和PBD二聚物的ADC(即,M-[L-D]n),并且在多种体内和体外模型中进行测试。出于这些实例和本披露的目的,这些ADC一般可以称为DLL3-ADC或SC16-ADC。离散的ADC将根据抗体(例如SC16.13)和特定连接子-细胞毒性剂名称ADC1、ADC2等进行命名。因此,与本发明可相容的示例性调节剂可以包含SC16.13-ADC1或SC16.67-ADC2,其中ADC1和ADC2代表个别PBD二聚物细胞毒性剂(及任选地一个连接子)。
实例14
抗DLL3抗体-药物偶联物介导的毒性的特异性
为了证实来自抗DLL3抗体-药物偶联物的毒性对表达内源DLL3的细胞具有特异性,进行多项实验以显示当通过使用短发夹RNA(shRNA)敲除DLL3mRNA和蛋白质的表达来抑制DLL3的表达时,SC16-ADC在体外不再杀灭已知具有内源DLL3表达的肿瘤细胞。
KDY66是一种来自乳头状肾细胞癌瘤的患者衍生的异种移植物,该癌瘤展现神经内分泌特征并且表达DLL3mRNA和蛋白质(例如参见图7和图16B)。在KDY66细胞中,通过用含有抗DLL3shRNA的GIPZ慢病毒人类DLL3靶向性shRNA(赛默飞科技公司)进行转导来减少DLL3的表达。更具体地说,通过在病毒包装质粒存在下,用表达抗DLL3shRNA(DLL3HP2)或对照非沉默性shRNA(DLL3NSHP)的双顺反子慢病毒质粒转染293T细胞来产生慢病毒载体。对所得到的含于上清液中的慢病毒粒子进行浓缩,并通过超速离心进行收集。然后,使用这些粒子转导KDY66细胞培养物并且引入shRNA(即,DLL3HP2或NSHP),其中该抗DLL3shRNA结合内源DLL3mRNA并且靶向其以达成破坏,藉此防止翻译成DLL3蛋白。两种载体构建体含有一种独立的GFP表达模块,用于成功转导的确证和转导细胞的选择。
转导之后,通过流式细胞术评价DLL3的表达。简单地说,用偶联到Alexa Fluor 647(生命技术公司)的DLL3调节剂(SC16.34)对DLL3HP2转导的细胞的解离的单细胞悬浮液样品进行标记,并且在FACS Canto II流式细胞仪上,在标准条件下进行分析。为了证实在DLL3HP2转导的细胞的表面上DLL3蛋白表达减少,对类似地制备的用非反应性对照抗体(647-IgG1)染色的KDY66DLL3NSHP细胞与用647-DLL3染色的KDY66DLL3NSHP细胞的样品的荧光强度进行比较。发现DLL3NSHP.KDY66细胞展现出与天然KDY66细胞实质上相当的DLL3蛋白表达(数据未示出)。如图18A中所见,与用相同AlexaFluor-647标记的抗体染色的天然细胞相比较,在用DLL3HP2转导的细胞中,DLL3蛋白的表面表达减少。
为了检查DLL3表达对肿瘤生长的影响,将DLL3HP2转导的细胞(DLL3-)和天然KDY66细胞(DLL3+)移植到免疫缺陷小鼠中。从如以上描述所制备的样品中分选出活人类GFP+细胞,以收集含有抗DLL3shRNA的细胞。对具有五个小鼠的组(140个细胞/小鼠)注射DLL3HP2或天然KDY66细胞,并且每周监测肿瘤生长。来自每个组的五个接受者中有两个生长肿瘤。在两个DLL3HP2.KDY66接受者中的肿瘤形成落后于两个天然KDY66接受者中的肿瘤形成约22天(图18B)。所观察到的这一生长延迟表明,由于DLL3的基因敲除影响了肿瘤生长,故DLL3的表达可能关系到肿瘤形成的增加或加速。
当它们达到供随机分组的适当体积(约160mm3)时,从接受者小鼠收集DLL3HP2KDY66肿瘤和天然KDY66肿瘤,并且将其分散于单细胞悬浮液中。通过对单个肿瘤细胞的悬浮液进行如以上所描述的流式细胞术确定,DLL3HP2细胞中DLL3的表达持续减少(即,在体内生长期间,不诱导DLL3表达)。就这一点来说,图18C显示,在体外生长的DLL3HP2转导的细胞当与在类似条件中生长的天然细胞相比较时,显示减少的DLL3蛋白表达。
使用标准生物化学技术,将天然KDY66细胞或DLL3HP2KDY66细胞接种于96孔板中并且使其在无血清培养基中生长。一式三份,向细胞中添加如以上所陈述而制备的人源化hSC16.56-ADC1(SC16-ADC1)或人源化抗半抗原IgG-ADC1(作为对照物)抗体-药物偶联物的连续稀释液。暴露于抗体-药物偶联物7天之后,实质上如实例12中所陈述,用一种基于发光的ATP检测来测量在每个孔的细胞溶解产物中活细胞的数量(Cell Titer Glo,普洛麦格公司)。
相对较低剂量的13.27pM SC16-ADC杀灭了50%的天然KDY66细胞,而任何剂量的SC16-ADC1都不能杀灭即使20%的DLL3HP2.KDY66细胞(图18D和18E)。应注意的是,内源DLL3蛋白表达的损失使得SC16-ADC1的体外杀灭作用完全损失。这证实了hSC16-ADC1细胞毒性特异性靶向DLL3表达细胞,并且具有极低(如果有的话)的非特异性毒性。
实例15
偶联的DLL3调节剂抑制肿瘤生长
基于以上提到的结果,采取了工作来证实,本发明的偶联的DLL3调节剂在体内缩小表达DLL3的人类肿瘤并抑制其生长。就这一点来说,将多种所选鼠类抗体调节剂与PBD细胞毒性剂共价缔合,并且对所得ADC进行测试以证实它们抑制免疫缺陷小鼠中人类NTX肿瘤生长的能力。
为此,使用本领域认可的技术,使患者衍生的NTX肿瘤在雌性NOD/SCID接受者小鼠的侧腹部中皮下生长。每周两次监测肿瘤体积和小鼠体重。当肿瘤体积达到150-250mm3时,将小鼠随机分配到治疗组中并且经由腹膜内注射对其注射指定剂量的SC16-ADC2或抗半抗原对照IgG1-ADC2(各自实质上如以上实例13中所描述,使用PBD二聚物ADC2产生)。对小鼠给与三次同等注射,在七天内均匀地间隔。治疗之后,监测肿瘤体积和小鼠体重,直到肿瘤超过800mm3或小鼠变得不适。对于所有测试,治疗的小鼠未展现超出典型地在带有肿瘤的免疫缺陷NOD/SCID小鼠中见到的那些的不良健康影响。
图19示出了所披露的ADC对带有展现神经内分泌特征的不同肺肿瘤(两种小细胞肺癌和一种大细胞肺癌,具有神经内分泌特征)的小鼠中肿瘤生长的影响。就这一点来说,用偶联到ADC2的三种示例性调节剂(SC16.13、SC16.46及SC16.67)治疗LU37(一种大细胞神经内分泌肺癌瘤)在SC16.13-ADC2和SC16.67-ADC2情形中引起的肿瘤生长抑制作用持续长达20天(图19A);相反地,尽管SC16.46适度地降低肿瘤生长,但它展现的活性比其他所测试的调节剂更低。类似地,用四种示例性调节剂(SC16.4、SC16.13、SC16.15及SC16.46)治疗LU73(一种小细胞肺癌瘤)产生持久的缓解,在一些情形中,在治疗后持续超过120天(图19B)。然而,如同针对LU37所测试的抗体一样,针对LU73的测试抗体在肿瘤消退的持续时间方面略有变化。最后,用两种偶联调节剂(SC16.46-ADC2和SC16.67-ADC2)治疗LU86(另一种小细胞肺癌瘤)在一种情形中产生肿瘤收缩,并且进展时间达40天(SC16.67-ADC2;图19C)。应注意,在图19C中,有两个曲线实质上重叠(mIgG1-ADC2和SC16.46-ADC2)并且很难区分。
多种偶联调节剂在延长的时期内明显地延迟或抑制体内肿瘤生长的意外能力进一步验证了DLL3作为治疗靶用于治疗增生性病症的用途。
实例16
人源化的DLL3-ADC调节剂抑制肿瘤生长
已知DLL3-ADC2提供的令人印象深刻的结果,进行另外的实验来证实示例性人源化ADC调节剂在体内治疗不同类型肿瘤(包括卵巢、肺及肾癌)方面的功效。具体地说,如以上所描述,将所选人源化抗DLL3抗体(如以上实例8中所陈述而产生的hSC16.13、hSC16.15、hSC16.34及hSC16.56)与两个离散的PBD细胞毒性剂(ADC1和ADC2)偶联(经由连接子单元),并且与对照物一起,给与植入了NTX肿瘤的免疫缺陷小鼠,如前一实例中所陈述。在每一研究中,监测对照动物的肿瘤体积和小鼠体重,直到肿瘤超过800mm3或小鼠变得不适。这些实验的结果提供于图20A到20F中。
图20A-20F的评述显示,在用1mg/kg hSC16-ADC治疗之后,在不同肿瘤类型(一些展现神经内分泌特征)中实现肿瘤体积减小和持久缓解。举例来说,治疗方案(其中给药是通过主题附图中的垂直线描绘)在具有神经内分泌特征的卵巢癌瘤(OV26,hSC16.15-ADC2,图20A)、具有神经内分泌特征的乳头状肾细胞癌瘤(KDY66,hSC16.34-ADC1,图20E)及三种小细胞肺癌瘤(LU86,hSC16.13-ADC1,图20B),(LU64,hSC16.13-ADC1,图20C;LU64,hSC16.13-ADC2+hSC16.13-ADC1,图20D)中产生完全并持久的肿块消除。在所有这些情形中,在治疗后超过100天里,并且在一些情形中超过225天观察到不存在肿瘤复发,其中跟踪小鼠一段较长的时间段。另外地,用所披露的调节剂,使用0.5mg/kg的更低剂量进行治疗在展现高DLL3水平的透明细胞肾细胞癌瘤异种移植物中产生肿瘤体积减小和生长抑制(KDY27,hSC16.56-ADC1,图20F)。
最后,应当注意的是,某些复发性肿瘤保持对hSC16-ADC毒性的敏感性。用SC16.13-ADC2初始治疗之后八十天,在LU64中观察到复发(图20D)。用hSC16.13-ADC1治疗复发性肿瘤引起可观察的肿块消除,这在第二次治疗之后持续超过100天。
这些结果再次证实了本发明的调节剂在治疗多种增生性病症方面的意外的多用性和适用性。
实例17
通过DLL3抗体-药物偶联物降低癌症干细胞频率
如先前实例中所示,所披露的调节剂,特别是ADC形式在抑制肿瘤生长方面极为有效。另外,如以上所证实,DLL3表达与一般已知具有药物抗性并且为肿瘤复发和转移提供燃料的癌症干细胞相关。因此,为了证实用DLL3-ADC治疗使NTX株的复发潜力降低,进行体内限制性稀释检验(LDA)以测定在用hSC16.13-ADC1(在图21中标为SC16-ADC)治疗之后小细胞肺癌肿瘤中肿瘤起始细胞(TIC)的频率。
使患者衍生的小细胞肺癌异种移植肿瘤(LU95和LU64)在免疫缺陷宿主小鼠中皮下生长。当肿瘤体积平均为150mm3-250mm3时,将小鼠随机分到具有七只小鼠的两个组中。经由腹膜内注射,在第0、4及7天(图21A和21D,虚线垂直线)对小鼠注射作为负对照的人类IgG1-ADC1(1mg/kg;n=7只小鼠)或hSC16.13-ADC1(1mg/kg;n=7只小鼠)。第8天时,对来自每个组的两只代表性小鼠实施安乐死并且收集其肿瘤并将其分散到单细胞悬浮液中。如图21A和21D中所示,用hIgG1-ADC1(IgG1-ADC)治疗的肿瘤在其余五只小鼠中继续生长,而用hSC16.13-ADC1(SC16-ADC)治疗的肿瘤的体积在其余五只小鼠中减小到零或接近于零。
使用标准流式细胞术技术和标记的抗DLL3抗体,确定从两个治疗组中每一个收集的两个肿瘤具有类似的阳性DLL3表达。然后,将来自每个对应的治疗组的细胞汇集起来并且通过FACS,使用FACSAria III(贝克顿迪金森公司),根据制造商的说明书和本领域认可的技术来分离活人类细胞。简单地说,用FITC偶联的抗鼠类H2Kd和抗鼠类CD45抗体(均为生物传奇公司(BioLegend,Inc.))对这些细胞进行标记,并且然后将其再悬浮于1μg/ml DAPI中。然后,在标准条件下,对所得悬浮液进行分选,其中收集DAPI-、mH2Kd-及mCD45-人类细胞并且丢弃鼠类细胞。
然后,对具有五只接受者小鼠的多个组移植2000、500、120或30个从用hSC16.13-ADC1治疗的肿瘤分选的活人类细胞。为进行比较,对具有五只接受者小鼠的多个组移植1000、250、60或15个从用对照IgG1-ADC1治疗的肿瘤分选的活人类细胞。每周对接受者小鼠中的肿瘤进行测量,并且在肿瘤达到1500mm3之前对个别小鼠实施安乐死。在肿瘤生长起始之后,在连续四周之后结束该研究,在任何另外的小鼠中未出现新的肿瘤。此时,将接受者小鼠评为对肿瘤生长呈阳性或阴性,其中阳性生长具有超过100mm3的体积。
在所有注射的细胞剂量中,用hSC16.13-ADC1治疗的LU95细胞接受者仅产生一个肿瘤,与用IgG1-ADC1治疗的LU95细胞接受者中的十二个形成比较(图21B)。类似地,用SC16.13-ADC1治疗的LU64细胞接受者产生三个肿瘤,与用IgG1-ADC1治疗的LU64细胞接受者中的13个肿瘤形成比较(图21E)。
使用泊松分布统计学(L-Calc软件,干细胞技术公司(StemcellTechnologies)),使用移植后18周时具有和不具有肿瘤的接受者注射的细胞剂量来计算每个群体中肿瘤起始细胞的频率。在LU95中每10,000个活人类细胞的TIC数量减少超过100倍,从用IgG1-ADC治疗的肿瘤中的78.1到用hSC16.13-ADC1治疗的肿瘤中的0.769(图21C,从对照治疗组中的1:128个细胞到调节剂治疗组中的1:12,998)。在LU64中,TIC的数量减少16.6倍,从用IgG1-ADC1或hSC16.13-ADC1治疗的肿瘤中每10,000个活人类细胞对应地47.4个TIC到2.86个TIC(图21F,从对照治疗组中的1:211个细胞到调节剂治疗组中的1:3,500个细胞)。TIC(例如癌症干细胞)频率的这一显著降低证实,除如先前所证实的减小肿瘤体积外,本发明的调节剂还显著地并且特异性地减少癌症干细胞群,并且进而言之,减少肿瘤的复发、转移及再生长潜力。复发和再生长潜力的这一减小通过在前述实例中所观察到的显著无肿瘤存活得到有力证实。
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