KR0149181B1

KR0149181B1 - 형질전환된 미생물에 의한 멜라닌의 제조방법

Info

Publication number: KR0149181B1
Application number: KR1019920703432A
Authority: KR
Inventors: 델라-시오파 구이; 제이. 가거 쥬니어 스테펜; 스버로우 게나디 지; 에이치. 터펜 토마스; 케이. 그릴 로렌스; 알. 체데켈 마일즈; 에이치. 쿠마가이 몬토
Original assignee: 데이비드 알, 맥지; 바이오소스 제네틱스 코포레이션
Priority date: 1990-06-29
Filing date: 1991-06-28
Publication date: 1998-08-17
Also published as: EP0547065A4; ATE204902T1; DE69132709D1; KR930701589A; ES2162789T3; EP0547065B1; AU3010695A; JPH06500011A; DE69132709T2; WO1992000373A1; AU695044B2; CA2086417C; EP0547065A1; AU8295491A; CA2086417A1

Abstract

본 발명은 멜라닌의 제조방법, 활성디로시나제의 제조방법에 관한 것으로써,

본 발명에 따른 멜라닌제조방법은 멜라닌제조효소를 코딩하는 제1DNA씨퀀스와 활성제를 코딩하는 제2DNA씨퀀스인, 멜라닌을 생성하는데 유용한 둘이상의 DNA씨퀀스를 함유하도록 미생물을 형질전환시켜서 멜라닌을 생성하도록 되어있고, 상기 제1DNA씨퀀스가 티로시나제를 코딩하며, 이것은 진균, 세균, 인간, 동물 또는 식물에서 얻도록 되어 있다.

또한 본 발명에 따른 활성티로시나제의 제조방법은 E. Coli세포를 티로신을 코딩하는 씨퀀스를 함유하는 DNA단편과 활성제단백질을 코딩하는 씨퀀스를 함유하는 DNA단편에 형질전환시키고, 형질전환된 E. Coli세포를 적당한 배지에서 배양하는 것으로 되어 있다.

Description

[발명의 명칭]

형질전환된 미생물에 의한 멜라닌 제조방법

[발명 배경]

바이오폴리머인 멜라닌

생물학적 폴리머 멜라닌의 생성 즉, 멜라노제네시스는 진균으로부터 포유류까지 대부분의 파이론에서 일어나는 자연에서 널리퍼진 현상이다. 티로시나제(e.c.1.14.18.1)는 멜라닌 형성에 촉매작용이 미치는 것으로 알려져 있고 세균, 진균, 나자식물, 피자식물, 절지동물 및 척색동물에 존재한다.

날개, 머리, 눈, 곤충큐티클, 과일 및 씨에서 발견되는 검정, 갈색, 황갈색 및 틴달-블루색소는 보통 멜라닌이며 티로시나제의 작용으로부터 기인하는 것으로 추측된다. 효소는 보편적인 것이 아니다; 즉 그것은 원핵세포에서 비교적 드물게 일어나고 다양한 고등식물에서는 없으며 고등동물의 피부의 특정세포에 일반적으로 국한되지만 흑질, 눈 및 속귀와 같은 내부조직에서 일어날 수 있다. 멜라닌은 피부에서 광보호 역할을 하도록 되어 있고, 눈과 속귀에서의 멜라닌 기능은 아직 알려져 있지 않다.

포유류의 멜라닌은 두 개의 화합물 분류로 나누어진다. : 즉, 유멜라닌(3,4-디하이드록시페닐알라닌(도파) 산화 생성물로부터 유도되는 갈색에서 검정색까지의 색소) 및 피오멜라닌(시스테이닐도파 산화 생성물로부터 유도되는 빨강에서 노랑까지의 색소)로 나누어진다. 이러한 색소들의 다루기 어려운 성질 때문에 그 특정화 및 정량화를 실험적으로 하는 것이 어렵다.

인간에게는 유멜라닌과 피오멜라닌이 친한 혼합물로 존재하며 피오멜라닌에 대한 유멜라닌의 비율은 유전학적으로 결정된다.

멜라닌의 단계별 생합성이 제1도에 도시되어 있다. 유- 및 피오멜라닌 생성의 첫 두단계는 티로시나제의 티로신 하이드록실라제(TH) 및 도파옥시다제(DO) 활성에 의해 촉매화 된다. 유- 및 피오멜라닌 생성은 도파퀴논에 대한 경로와 동일하게 진행한다. 설프히드릴 화합물이 없으면 유멜라닌이 생성된다. 도파퀴논 및 그 다음의 사이클화된 중간체는 일련의 비효소단계를 통하여 유멜라닌으로부터 형성할 수 있다. 도파퀴논으로의 반응디스탈은 실온에서 저절로 진행되며 존질적으로 조절되지 않는 것으로 생각되어 졌다. 유멜라닌으로 가는 이러한 포스트-도파퀴논 반응경로의 몇몇에 대한 속도상수(K)는 다음과 같이 보고 되었다.

멜라닌 생성의 화학적 조절은 반응배지에 대해 고유한 뉴클레오필 및 일렉트로필에 의한 일반적인 산염기의 촉매 또는 정전기적 촉매현상의 결과로 생각되어 진다. 더 현저하게로는 반응배지의 이온강도의 변화는 멜라닌 생성 전구체 및 중간체의 극성에 영향을 미침으로서 촉매작용을 조절한다. 반응배지 그 자체는 영구 또는 유도다이폴에 영향을 미치는 용매-용질 상호작용을 야기시킬 수 있다. pH의 변화가 반응물 또는 배지의 이온화도를 변화시킬 때 조절도 역시 명백해 진다.

최종적으로 반응물 또는 배지 사이의 수소결합, 다이머화 또는 이온쌍 형성과 같은 분자상호작용이 멜라닌 생성을 조절할 수 있다.

멜라닌 폴리머를 한정, 특정화 또는 정량화하려고 할 때 멜라닌의 특성에 관한 하기내용을 염두에 두어야 한다.

1.멜라닌 생성은 멜라닌을 생성할 뿐만 아니라 5,6-디히드록시인돌, 시스테이닐도파스 및 트리코크롬과 같은 많은 멜라노크롬도 생성한다. 2.멜라닌은 더욱 바람직하기로는 멜라노프로테인이라고 언급되며 크로모포에 친숙히 결합된 단백질 단편으로 구성되어 있다. 3.멜라닌은 본질적으로 입자로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 분리프로토콜이 멜라닌 입자의 성질을 비가역적으로 변화시킬 수 있다는 것이 입증되어 있다. 4.멜라닌을 알칼리 퍼옥사이드 처리하면 멜라닌이 없는 산(MFA)로 명명되는 용해된멜라닌을 얻는다. 5.100℃이상으로 가열되면 멜라닌은 이산화탄소를 쉽게 배출한다(이 과정은 폴리머에 존재하는 아릴카르복실잔기가 탈카르복실화 되는 것이다). 6.멜라닌은 색소의 생물학적 기능을 위한 중요성을 가지는 것으로 가정 되어온 이온교환 특성을 나타낸다.

동·식물계에서 분리된 멜라닌의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성에 관한 보고서가 문헌에 많이 있다. 그러나 분리 기술에 관해서는 별로 좋은 것이 없으며 그것들은 화학적으로 정립이 안되어 있고 멜라닌의 고유한 반응성을 거의 고려하지 않았다. 다음 세 가지 예를 문헌에서 보통 언급되는 프로토콜을 묘사한다.

A.…멜라소좀은 HP 멜라노마로부터 채취되며 그 다음 멜라닌이 불순물을 추출하기 위해 테트라하이드로퓨란(THF)로 광범위하게 세척된다. 이 단계에서, THF는 노란색으로 착색되었다. 그 다음 샘플을 건조시키고 예를 들어, 에틸렌디아민 수용액(30/100 부피비) 및/또는 1N의 NH₄OH 수용액과 같은 알칼리 수용액에 용해하였다. 과량의 12N HC1 수용액을 이 멜라닌 수용액에 붓고 30시간 동안 끓인 후 그대로 두었다. 침전된 멜라닌을 채취하고 반복하여 세척하고 투석하고 건조시켰다. 최종적으로 멜라닌을 THF가 무색으로 될 때까지 THF로 반복적으로 세척한 후 건조하였다. 이상 멜라닌의 화학-물리적 특성(II)으로부터 발췌한 것임. B.…원심 분리에 의해 채집된 검정색 침전물을 실온에서 7일 동안 진한 HC1에 두었다. 원심 분리 후 멜라닌을 1% HC1, 증류수 및 최종적으로 아세톤으로 완전히 세척하였다. 이상 멜라닌의 구조 및 멜라닌 생성(II)에서 발췌함. C.홍채, 속눈썹, 맥락막 및 망막 색소 표피를 분리하기 위해 눈을 절개하였다.

이 단편들을 같이 모아 증류수에 현탁시키고 균질화시켰다. 이 균질화물을 4개의 거즈층을 통해 여과하고 여과액을 동일 부피의 진한 염산과 혼합하여 6N HC1의 최종 농축액을 얻었다. 혼합물을 24시간 동안 교반했다; 침전물을 원심 분리에 의해 제거하고 6N HC1에 재현탁시키며 48시간 동안 환류시킨다. 침전물을 물로4-6차례 세척하고 물에서 현탁한다. 이상 청색 및 갈색 인간눈의 멜라닌이 다른가? Menon, I.A.et al. Pigment Cell 1981, Proceedings of XI international Pigment Cell Cell Conference Sendai, Japan, pp.17-22(1981)으로부터 발췌한 것임.

하기에 그려진 멜라닌의 가상 구조는 지난 오십년간 걸쳐 무수한 그룹들의 작업을 구체화한다. 재검토하기 위해, Swan, G.A. Fortschritte의 Chem.Org. Naturst. XXXI, 552(1974) ; Proto, G. Medical Research Reviews 8,525(1988) ; 및 Ito, S. Biochim. Biophys. Acta 883,155(1986)을 참조.

멜라닌의 연구는 무수한 생합성 경로의 발견 및 멜라닌에 관련된 다양한 화학 물질에 이르렀다. 진균에 의하여 생긴 멜라닌은 웰-바운드(wall-bound) 멜라닌 및 세포의 멜라닌으로 생긴다. 멜라닌화된 진균의 대부분의 균사, 분생포자기 및 공막벽은 두 개의 떨어진 층을 가진다 ; 전자 반투명인 내부막 및 전자-치밀한 입자들을 함유하는 외부막이 그것이다. 수집된 증거를 보면, 상기 입자들이 멜라닌이라는 것을 보여준다. Wheeler, M.H.et al. Exp. Mycol. 3,340(1979)참조. 세포외 멜라닌은 세포벽과 떨어져 합성된다.

세포외 멜라닌들은 두 가지 메카니즘에 의해 페놀로부터 유도된다 : (a)배지로 분비된 페놀옥시다아제(종종 페닐옥시다아제라고 불림)에 의한 페놀 화합물의 산화 및 (b)자동산화나 자가분해시 방출된 효소에 의해 배지로 분비되는 페놀의 산화. Wheeler, M.H.et al., Can J.Microbiol. 24,289(1978)을 참조.

티로시나제를 분비하는 진균이나 세균은 주변 배지의 변색을 야기시킨다. 상기 변색이 배지에 티로신을 첨가함에 의해 두드러질 수 있다 ; Hollis, J.P., Phytopathology 42,273(1952) ; Nurudeen, T.A.et al., J. Clin. Microbiol. 10,724(1979)를 참조. 세포외 멜라닌들은 방사균, 세균 및 진규에서 관찰된다. 세포외 티로신 생성 또는 분비를 조절하는 유전자가 Streptomyces scabies 및 Rhizobium Phaseoli 스트레인1233의 플라스미드에서 일어난다. 각각 Gregory, K.F.et al., J.Bacteriol. 87,1287(1964), 및 Beynon, J.L.et al., J.Gen. Microbiol. 120,421(1980)참조. Vibrio cholerae의 티로시나제 유전자는 크로모좀에 위치한다. Bell, A.A.et al., Ann.Rev. Phytopathol. 24,411(1986)참조.

멜라닌 경로중 하나에서, 유멜라닌의 합성은 일반적으로 생합성내에서 처음 두개의 단계를 촉매 화시키는 티로시나아제에 의해 조정된다. 초기 반응은 티로신의 히드록시화를 포함한다. 산소 원자는 티로신의 히드록실기에 인접하여 결합하여 3,4-디히드록시페닐알라닌(도파)을 제조한다. 티로시나제는 그후 도파가 도파퀴논으로 전환하는 것을 촉매화한다. 형성된 도파퀴논은 생리적 pH에서 안정하지 않다. 측쇄의 아미노기는 사이클 화하여 시클로도파를 형성하고 그후 재빨리 적색 화합물인 도파크롬으로 산화된다. 다음 단계는 5,6-디히드록시인돌(DHI)를 제조하기 위해 재배열 및 탈 카르복시화시키거나 탈 카르복시화 없이 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산(DHICA)을 제조하는 것이다. 유멜라닌은 도파퀴논, 도파크롬, DHI 및 DHICA 또는 이들의 결합물을 중합하여 형성된다. 이것들은 동물내 갈색 색소를 형성한다. Mason, H.S., J.Biol. Chem. 172,83(1948) ; 및 Pawelek, J.M.et al. Am. Sci. 70,136(1982)을 참조. Crippa et all., The Alkaloids 36,253(1988), Academic Press N.Y., N.Y.를 참조하라.

적색 색소, 갈색 색소 및 황색 색소인 피오멜라닌은 혼합된 시스테인 및 티로신으로부터 유도되는 혼합된 시스테이닐도파의 중합체이다. Fitzpatrick, T.B. et al., in Biology and Diseases of Dermal Pigmentation p.3, Univ. Tokyo Press, Tokyo.를 참조하라.

트리코크롬 또한 황색, 적색 및 자색염료이고 티로신의 산화로부터 유도되기 때문에 멜라닌으로 분류된다. 극히 소량 또는 전혀 질소를 함유하지 않은 알로멜라닌은 페놀전구체, 1차 카테콜 및 1,8-디히드록시나프탈렌으로부터 형성된다.

티로시나제가 유일한 멜라닌 생성 효소는 아니다. 진균의 외부 벽에서 발견되는 효소인 라크효소는 도파의 산화에 책임이 있고, 라크효소는 쉽게 티로신을 산화시키지 않는다. Simon, L.T.et al., J.Bacteriol. 137,537(1979)를 참조. 색소생성 생물 체내에 존재하는 다른 효소들은로는 식물들의 카테콜옥시다아제 및 다른 폴리페놀옥시다아제 뿐 아니라 Cryptococcus neoformans의 페닐옥시다아제도 있다. Mayer, A.M.et al., Phytochem. 18,193(1979)를 참조.

γ-글루타미닐-3,4-히드록시벤젠(GDHB)멜라닌이 Agaricus bisporus 내티로시나제의 작용에 의해 γ-글루타미닐-4-히드록시벤젠(GHB)으로부터 합성된다. Hegnauer, H.et al., Exp.Mycol. 9,221을 참조. Ustilago maydis는 카테놀을 멜라닌으로 동화시킨다고 한다. U.maydis의 유성포자는 O_SO₄으로 고정될 적에 매우 전자가 치밀한 멜라닌을 만든다. Patgieter, H.J.et al., J.Bacteriol, 91,1526(1966)을 참조.

1,8-디히드록시나프탈렌(DHN)멜라닌의 생합성은 펜타케타이드로부터 제조된다. 다양한 중간체는 1,3,6,8-테트라-히드록시나프탈렌, 스시탈론, 1,3,8-트리히드록실-나프탈렌, 베르멜론, 디히드록시나프탈렌, 디히드록시나프탈렌 1,1-다이머 및 디히드록시나프탈렌 2,2-다이머이다. 변성블럭을 제거하는 환원 효소 또는 탈수 효소 및 트리사이클라졸과 같은 효소 억제제는 많은 수의 션트 생성물을 발생시킨다. Wheeler, M.H.et al., Arch. Microbiol. 142,234(1985) ; 및 Stipanovic, R.D.et al., Pestic. Biochem. Physiol. 13,198(1980)을 참조.

다른 미생물들은 배양 조건이 다르다. 몇 가지 미생물 내에서 세포외 멜라닌의 생성은 티로신 농도가 포화점인 0.1%까지 증가될 적에 증가한다고 한다. 상기 퍼센티지는 티로신내에서 과포화인 것으로 알려져 있다. Hollis, J.P.(1952), Supra 참조. 이스트 자가분해 및 카제인 가수분해는 0.1%티로신을 함유하는 배지내 Streptomyces scabies에 의한 멜라닌 색소생성을 자극한다고 알려져 있다. Hollis, J.P.(1952), supra.를 참조.

멜라닌 제조가 여러 가지 탄소원에 의해 억제된다는 것을 또한 알 수 있고 특정한 탄소원은 미생물에 따라 다르다. Nurudeen, T.A.et al. (1979), supra는 배지에서 글루코스농도가 증가되면 Cryptococcus neoformans의 모든 세로타입의 색소 생성을 감소시킨다는 것을 기술한다. 이 진균은 페닐옥시다아제 효소의 개재를 통해 디페놀 및 아미노페놀을 가진 멜라닌-유사 색소를 생성한다. C. neoformans의 페닐옥시다아제는 기질로서 티로신을 사용할 수 없다.

Cryptococcus의 대사와 대조하여, 색소 생성 세균인 Gluconobacter oxydans는 글루코스 및 티로신 존재하에 멜라닌을 생성하지만 탄소원으로서 수크로스, 프락토스, 소르비톨, 만니톨 또는 글리세롤을 함유하는 배지 내에서는 멜라닌을 생성하지 않는다. Pavlenko, G.V.et al., Microbiology USSR 50,539(1981)을 참조.

몇가지 진균은 세포의 이종 멜라닌을 제조하는 것으로 알려져 있다.

이러한 상기 멜라닌들은 여러 가지 페놀, 아미노산, 단백질, 탄수화물 및 지질로부터 유도된다. 합성은 배지로 티로시나제를 분비시키는 것이 필요하다.

Streptomyces 속의 많은 종은 mel 우전자 로커스로부터 티로시나제의 발현에 기인해 어두운 멜라닌 색소를 형성할 수 있다. S. antibioticus의 mel 로커스가 클론되고 씨퀀스되며 (Katz, E.et al., J.Gen. Microbiol. 123,270(1983) ; Bernan, V.et al., Gene 37,101(1985)를 참조. 추정의 ORF 438 단백질(Mr=14,754) 및 티로시나제(Mr=30,612)를 코딩하는 두 개의 오픈리딩프레임(ORF'S)을 함유하는 것이 알려져 있다. ORF 438 및 티로시나제는 S.antibioticus내의 동일한 프로모터로부터 전사된다고 알려져 있으며 이 두 가지 유전자 모두 멜라닌 제조에 필요하다. Bernan, V.et al., (1985), Supra를 참조. 유전적 증거에 기초하여, ORF 438 단백질은 티로시나제의 트랜스-활성제로서 작용한다는 것을 알 수 있다. Lee, Y.H.W.et al. Gene 65, 71(1988)을 참조. ORF 438 단백질이 티로시나제 분비에 관련되거나 구리를 아포티로시나제로 운반하는 메탈로티오네인-유사 단백질로 작용할 수 있다. Bernan, V.et al., (1985), supra ; Lee, Y.-H.W.et al., (1988), Supra를 참조. S. glaucescens의 mel로커스는 유사한 작용을 하는 티로시나제의 위쪽 방향의 거의 동일한 ORF 씨퀀스를 갖는다. Huber, M.et al., Biochemistry 24,6038(1985) ; Huber, M.et al. Nucleic Acids Res, 15,8106(1987)을 참조. ORF 438 단백질의 존재는 그러나, 결코 생체내에서는 확인되지 않는다.

자연에서 생기는 E.coli는 티로시나제 유전자를 가지지 않고 멜라닌을 제조하지 않는다. Streptomyces lividans의 티로시나이제 유전자를 코딩하는 플라스미드 pIJ703의 BclI 단편은 BamHI 위치에서 플라스미드 YEp13으로 클론되고 E.coli HB101로 형질 전환된다. 티로시나제의 검출 가능한 발현 또는 멜라닌의 검출 가능한 발현은 없다. Nayak, K.et al. Indian Journal of Biochemistry Biophysics 25,515(1988)을 참조.

Kwon에 간행된 미합중국 특허 제4,898,814호는 인간 티로시나제의 cDNA 클론을 기술하고 E.coli 내 cDNA를 발현함에 의해 인간 티로시나제를 제조하는 방법을 청구하고 있다. G(-)마린 세균인 Shewanella colwelliana에서 멜라닌 제조는 조야한 추출물내 L-도파 합성을 측정함에 의해 분석된다. 멜라닌 합성을 코딩하는 영역이 지도로 나타내지고 씨퀀싱 된다. 한쌍의 오픈리딩프레임(ORF)이 발견되었다. 하나의 ORF가 티로시나제 유전자와 관련하여 발견된다. ORF의 하부 방향은 기능이 알려지지 않은 폴리펩티드를 코딩한다. ORF하부 방향의 제거는 티로시나제 유전자에 형질 전환된 E. Coli내의 색소침착에 아무런 영향을 주지 않는 것으로 알려졌다. Fuqua, W.et al., Abstract, American Society for Microbiology Washington, D.C. Branch of George Mason University (1990).

[발명의 요약]

본 발명은 이하에 일반적으로 멜라닌으로서 기술하는 멜라닌과 그 전구체 및 그 동족 색소의 제조에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 멜라닌은 성장 배지 ℓ당 건조 중량으로 0.2g 이상 생산된다. 이 증가된 멜라닌 생성은 성장 배지의 성분 조작, 그리고/또는 완화된 발효 조건 그리고/또는 유전자공학에 의해 생산한 미생물 그리고/또는 돌연변이 유발에 의해 달성된다. 멜라닌을 생산하는 미생물은 일반적으로 그것이 유도된 미생물 기술에서 알려져 있는 여러 배양체에서 증식된다. 그렇지만 배양체는 멜라닌 생산에 부정적 영향을 주는 인자의 제거에 의해 그리고/또는 멜라닌의 생산을 증가시키거나, 멜라닌전구체나 그 유도체의 생산을 지배하기 위해 특별한 인자를 첨가함으로써 강화시킬 수 있다.

미생물에 의해 생산되는 멜라닌의 조성은 성장 배지에 넣어준 전구체에 의해 제어될 수 있다.

적절한 종래 기술에 의한 미생물은 돌연변이 유발 그리고/또는 여러 형질 전환 방법에 의해 생산될 수 있고, 돌연변이 유발은 예를 들어 돌연 변이성 화학 물질에 노출시키거나 방사선에 의한 방법 등에 의해 실행될 수 있다. 숙주 내에서 형질 발현을 위한 적당한 프로모터나 멜라닌전구체의 전환을 촉진시키는 효소를 코딩하는 유전자를 갖는 벡터들은 멜라닌을 생산하지 않거나 상업적으로 충분하지 못한 양의 멜라닌을 생산하는 미생물에 대한 형질 전환을 위해 쓰인다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 멜라닌 생합성에 대한 단계적 도면, 제2도는 ORF 438 + 티로시나제(pBGC 620.3)와 티로시나제(pBGC 619)를 포함하는 E.Coli 발현 플라스미드를 나타내는 도면. 엠피실린 내성 유전자(AMP)의 위치, T7 프로모터(T7), 그리고 리보좀 결합 위치(RBS1 그리고 2)가 박스내에 나타나 있다. RBS1(밑줄부)으로부터 티로시나제(pBGC619)의 처음 일곱 코돈(윗쪽)이나 ORF 438(pBGC 620.3)까지의 벡터 씨퀀스는 5'atatacatATGGCTAGAATTGCCATGGCC3'이다. RBS2(밑줄부)로부터 티로시나제(pBGC 620.3)의 ATG 스타트 코돈까지의 S. antibioticus의 씨퀀스는 5'cacccgcacATG-3'이다. 제3도는 ORF 438 단백질이 있거나 또는 없는 상태에서 티로시나제를 생산하는 E.coli 세포내의 SDS-PAGE를 나타내는 도면. (A)리팜피신이 있는 생체내에서 합성된 단백질의 [³⁵S]메티오닌 방사선사진(1행, pBGC 619 ; 2행, pT7-7 벡터콘트롤 ; 3행, pBGC 620.2 ; 4행, pBGC 620.3, 필름은 2hr 노출.) (B)쿠마시 (Coomassie)로 스테인된 젤 (1행, pT7-7 벡터콘트롤 ; 2행, pBGC 619 ; 3행, pBGC 620.2 ; 4행, pBGC 620.3) 분자량 마커(kD)의 위치는 왼쪽, 티로시나제(tyr)와 ORF 438(orf)의 위치는 오른쪽에 나타낸다. 제4도는 플라스미드 pBS1012.7에 대한 유전자구조 프로토콜(protocol)을 나타내는 도면, 제5도는 pBS1018의 플라스미드지도, 제6도는 pBS1018과 pBS1012.7의 플라스미드유도체(pBS1022, pBS1024, pBS1025, pBS1026)에 대한 유전자구조 프로토콜(protocol), 제7도는 티로시나제와 ORF 438을 생성하는 형질변환된 E.coli 세포의 SDS-PAGE를 나타내는 도면, 제8도는 형질 변환된 E.coli 세포내의 멜라닌 생성을 나타내는 도면, 제9도는 pBS1055의 플라스미드 지도, 제10도는 pBS1057의 플라스미드 지도, 제11도는 pBS115의 구조를 나타내는 도면, 제12도는 pBS130의 구조를 나타내는 도면, 제13도는 pBS634의 구조를 나타내는 도면, 제14도는 pBS634의 플라스미드 지도, 제15도는 pBS635의 플라스미드 지도, 제16도는 pBS623의 플라스미드 지도, 제17도는 pBS636의 플라스미드 지도를 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 이하 멜라닌으로 총칭하는 멜라닌, 그 전구체 그리고 그 유도체의 생산 공정에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 멜라닌은 성장 배지 ℓ당 건조 중량 0.2g보다 많은 양이 생산된다. 이러한 멜라닌 생산의 증대는 성장 배지의 성분 조작 그리고/또는 발효 조건의 완화 그리고/또는 유전자 조작된 미생물 그리고/또는 돌연변이 유발에 의해 달성된다. 본 발명은 (a) 티로시나제 그리고/또는 멜라닌을 생산하는 능력 또는 강화된 능력을 가진 미생물을 생산하도록, 미생물의 형질은 변환할 수 있는 유전자, 프로모터시그날 씨퀀스나 조절 씨퀀스 (b) 멜라닌 생산 능력이나 강화된 능력을 가진 미생물 (c) 미생물로부터 멜라닌을 생산하는 공정 (d) 미생물 배양액으로부터 멜라닌을 분리시키는 방법 (e) 성장 배지 단위 ℓ당 건조 중량 0.2g 이상의 멜라닌이 생산될 수 있는 성장 배지나 배양액의 조건에 관한 것이다.

이 분야에서 명세서와 청구 범위를 이해하는데 명백함과 일관성을 주기 위해 다음과 같은 정의를 한다.

멜라닌 : 멜라닌은 반응성 중간체의 중합에 의행 생산된 폴리머이다. 중합 반응의 메카니즘은, 한정되지는 않지만, 자동산화, 효소 촉매에 의한 산화, 자유관능기에 의한 중합을 포함한다. 반응성 중간체는 전구체들로부터 화학적 또는 효소 적으로 생산된다. 적정한 효소는, 한정되지는 않지만, 퍼록시다아제와 카탈라아제, 폴리페놀 옥시다아제, 티로시나제, 티로신하이드록실라제 또는 라크효소를 포함한다. 반응성 중간체로 전환된 전구체는 수산화된 방향성 화합물이다. 적절한 수산화된 방향된 화합물은, 제한되지는 않지만, 1) 페놀, 폴리페놀, 아미노페놀과 방향성이나 폴리사이클릭방향족 탄화수소의 티오페놀를 포함하고, 또한, 제한되지는 않지만, 페놀, 티로신, 피로가롤, 3-아미노티로신, 티오페톨과 α-나프톨 ; 2) 제한되지는 않지만, 2-히도록시피롤, 4-히드록시-1, 2-피라졸, 4-히드록시피리딘, 8-히드록시퀴놀린과 4,5-디히드록시벤조티아졸과 같은 방향족헤테로사이클릭 또는 헤테로폴리사이클릭탄화수소의 티오페놀, 페놀, 폴리페놀, 아미노페놀을 포함한다.

활성 제단 백질 : 효소 그리고/또는 멜라닌 생성의 활성을 변형시키거나 활성화시키거나 강화시키는 유전자 생성물. 그것은 전이-활성제로서 작용하거나, 아포효소에 이온을 전달하는 메탈로티오네인과 같은 단백질로서 작용할 수 있고, 또한 세포로부터 효소의 분비에도 작용할 수 있다. 예를 들면 ORF438 유전자와 티로시나제에 대한 ORF(S) 3' 코딩 씨퀀스는 기술된 모든 방법으로 멜라닌 생성을 증가시키는 활성계 단백질들을 코딩한다.

멜라닌을 생성하는 미생물은 자연에 넓게 분포되어 있다. 예를 들면, 여기에 한정되지는 않지만, Streptomyces, Rhizobium, Agaricus, Ustilago, Cryptococcus, Gluconobacter, Pseudomonas, Xanthomonas, Cochliobolus, Pleospora, Alternaria, Aurobasidium, Botrytis, Cladosporium, Diplodia, Sclerotium, Verticillium, Eurotium, Aspergillus, Stachybotrys, Hendersonula, Streptoverticillium 및 Micromonospora들을 포함한다.

몇몇 미생물들은 멜라닌들을 생산하는 것을 가능하게 하도록 유전적으로 처리될 수 있다. Streptomyces, Escherichia, Bacillus, Streptococcus, Salmonella, Staphylococcus 및 Vibrio등이 바로 그것이다. 미생물에서 산업적 색소 생산을 세포의 멜라닌과 그들의 유도체 및 전구체들이 합성된 배지로부터 쉽게 제거될 수 있기 때문에 이제는 가능하다.

멜라닌 또는 동족 멜라닌을 생성하는 미생물들은 변형에 의해 증가될 수 있다. 일반적인 변형은 플라스미드삽입과 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 다양한 종래 기술에 의해 성취될 수 있다. 이 미생물은 자외선 또는 감마 방출, 변이유발 화학물 등에 노출될 수 있다.

앞서 기술된 바와 같이, 본 발명은 배지 1리터당 약 0.2 그램보다 큰 양, 특히 약 0.5그램보다 더큰 양, 바람직하게 약 1.0그램보다 더큰 양, 가장 바람직하게는 약 2.0그램보다 더큰 양으로 생성의 증가를 가져오게 된다. 그 증가는 배지 성분이나 완화된 발효 조건과 같은 미생물의 성장 조건, 유전적 처리 돌연변이 유발 등에 의해 성취될 수 있다.

A.성장 조건

사용된 배지의 기본 조성은 수많은 고찰에 의존한다. 배지는 멜라닌 생산을 위해 배양되는 것과 유사한 미생물을 배양시키기 위해 종래 기술에서 알려진 것들로부터 일반적으로 선택된다. 다양한 탄소와 질소원이 이용될 수 있고 서로 교횐될 수 있다. 성장을 증가시키기 위해, 미생물의 특정할 필요가 고려되고 있다. 예컨대 미생물은 현존하고 있는 아미노산을 요구할 수 있다. 모든 미생물들은 철과 망간과 같은 그런 금속이 이온들을 요구하지만 필요로 하는 농도는 서로 다르다. 특정 미생물들은 특정 대사물의 존재에 의해 억제되며 이러한 억제는 미생물마다 폭넓게 다르다.

미생물의 대사적 요구에 부가하여, 멜라닌 생산의 증가를 위해 유용한 기질이 고려되어져야 한다. 전구체의 존재는 생산을 증가할 수 있고 생산된 멜라닌의 조성을 변형할 수 있으며, 그러므로써 색과 분자량이 변경되고 또 다른 바람직한 생성물들의 생성을 가져올 수 있다. 티로시나제는 구리를 필요로 한다. 그러므로 미량 금속들은 배지에 독성을 미치지 않고 효소를 위한 조인자 처럼 활동하도록 충분한 농축된 양으로 존재 되어야 한다.

발효 배지의 온도는 미생물의 최적 성장에 임계적이다. 전형적인 토양 미생물들은 약 26∼30℃에서 잘 성장하는 반면, E. Coli는 37℃에서 가장 잘 성장하고, 호열성 미생물들은 약 50℃ 이상에서 잘 성장한다.

배지의 pH는 6.8과 7.2 사이에서 보통 유지된다. 미생물의 요구를 만족하는 완충제가 또한 종종 선택된다. 인산염 완충제는 배지의 pH를 유지하는 것을 도와주기 위해 자주 사용된다.

산화성 미생물들은 공기 주입을 요구한다. 작은 용기에서는, 교반 또는 진탕이면 충분하고, 더큰 발효 용기들에서 산소는 계내로 살포되며, 추진기는 최적 분해된 산소레벨을 제공하기에 충분한 비율로 배지를 교반한다. 이것은 몇몇 미생물들에 대해 약 20∼90%로 될 수 있다.

멜라닌들의 생성을 증가하기 위한 한가지 수단은 성장 배지의 변형에 의한 것이다. 출원인은 몇몇 인자들이 멜라닌들의 엄청난 생산 증가를 가져오도록 변경될 수 있다는 것을 알아냈다.

한가지 요소는 발효 조건을 완화시키는 것이다. 이것은 배양된 미생물들에게 하이레벨의 산소 이용을 유지하므로써 성취된다. 만약 저레벨의 산소가 이용되거나 낮은 에어레이션이 제공된다면, 멜라닌의 수율은 감소한다. 두 번째 요소는 예를 들어 티로신을 함유하고 있는 카세인 가수분해물 또는 카세인 펩톤 등의 적당한 기질들의 존재이다. 이 기질중 어느 것도 멜라닌 생산을 위해 카사미노산 보다 더 좋다는 것을 알아냈다. 세 번째 요소는 전구체들의 존재이다. 티로신농도 1.6 g/ℓ에서 수율이 가장 좋다는 것을 알아냈다. 네 번째 요소는 억제물로서 작용하는 배지 탄수화물 또는 억제물로서 작용하는 다른 물질들을 없애는 것이다. 멜라닌 생산을 증가하고 조절하는 두 번째 수단은 티로시나제 유전자의 3' 조절씨퀀스들과 같은 활성제 또는 다른 조절 DNA 씨퀀스들을 포함하는 것이다. 아래 기술되는 바와 같이 pIJ 702의 mel 로커스는 활성제 코딩 씨퀀스와 티로시나제 코딩 씨퀀스를 포함하고 있다. 3' 조절씨퀀스들은 S. antibioticus로부터 mel영역을 포함하는 E.coli에서 멜라닌 생성을 조절하는데 또한 유용하다.

대체로 미생물의 배양액은 원하는 수준의 멜라닌을 생산하기 위해 위에 상기한 되고 선택된 배지에서 배양된다. 멜라닌 생성은 여러 시간 주기에서 40nm(OD400)으로 세포자유 배지의 최적밀도(OD)를 측정하므로써 관찰된다. OD₄₀₀은 멜라닌 생산에 정비례한다. OD₄₀₀은 모니터되고 배양액은 OD가 평행이 유지될 때 수확된다. 멜라닌을 생산하는 E. Coli 배양액에서 OD는 600 nm로 판독되었다. S. lividans TK 64 (pIJ 702)는 성장되는 배지를 변경하므로써 멜라닌 생산의 엄청난 증가가 성취될 수 있다. 멜라닌 경로의 신진대사 억제물이 결핍된 배지를 발명하므로서, 멜라닌 생성은 일정한 부피의 바이오반응기에서 ℓ당 약 100 mg에서부터 ℓ당 약 4.0 이상으로 증가될 수 있는 것이 장점으로 발견되었다. 유전학적으로 변형된 E.coli를 사용하는 멜라닌 생성 레벨은 동등하다.

본 발명은 하나 이상의 멜라닌 전구체들에서 풍부한 질소원을 갖으며 글루코스가 결핍된 성장 배지를 구비하고 있다. 더 많은 멜라닌 생성은 카세인 가수분해물 또는 카사미노산보다 카세인 펩톤을 사용하여서 성취된다는 것을 알아냈다. 또한 티로시나제 생성은 배지로부터 글루코스를 제거하므로써 Streptomyces lividans에서 증가된다는 것도 알아냈다. 이 결과에 대해 적어도 두 가지 설명이 가능하다. 글루코스는 S.lividans에 대해 바람직한 탄소원과 에너지원이 될 수 있다. 가능한 설명은 글루코스가 멜라닌의 생산을 위해 생화학 경로에서 티로시나제 또는 다른 몇 가지 효소의 대사 억제제라는 것이다. Streptomyces 속을 사용하여 멜라닌을 생성하기 위해, ㎖ 당 약 10³∼ 10⁷의 바람직하게는 약 10⁴∼ 10⁶의 포자를 가지는 접종원이 고수율의 멜라닌을 생산한다. 덧붙여서 약 24∼48 시간된 미드로그(midlog)단계 있는 스타터 배양액은 발효 용기에 약 10%양까지 추가될 수 있다. 한천표시 플레이트에서 멜라닌 생성을 위해 (표시기 플레이트들은 CuSO₄, ·5H₂0 (0.2mM)과 L-티로신(0.3g/ℓ)이 보충되었고, 군체들은 30℃에서 밤새 배양되었고, 다음에 42℃로 한시간 동안, 그리고 가시적인 색소 형성을 위해 30℃에서 3시간 내지 하룻밤 추가 배양되었다. 액체 배양액에서의 멜라닌 생성을 위해, 밤새 배양(30℃)은 신선한 LB로 1:50로 희석되어, 30℃에서 5시간 동안 배양되었고, 42℃로 변경되어 30분 동안 수욕에서 진탕하고 다음에 30℃로 돌아와서 밤새 배양이 계속된다. 액체 배양액에서의 멜라닌 생성은 또한 CuSO₄,·5H₂O와 L-티로신의 추가가 요구된다.

동족 멜라닌을 포함하는, 멜라닌 생성에 추가하여 미생물의 배양은 티로시나제와 관련된 ORF들의 단백질 생성물들을 생성한다. 배양된 미생물에 의존하여, 티로시나제는 세포 또는 페리플라즈믹 공간내에서 발견될 수 있고 또는 배지로 분비될 수 있다. 티로시나제의 생성은 티로시나제와 연관된 ORF 생산물 자체 또는 효소 바이오리액터나 세포 바이오리액터와 같은 그런 바이오 반응기에서의 사용을 위한 티로시나제와 연관된 ORF 생산물을 포함하는 미생물 특히 E.coli의 회복을 가능하게 한다. 다음에 다른 유용한 것들을 발견할 수 있는 멜라닌 전구체들로부터 반응성 중간체를 생성하는 것이 가능해질 수 있다.

멜라닌들의 조성은 멜라닌과 동족 멜라닌들이 생성되도록 성장 배지에 여러 가지 다른 전구체들을 첨가해서 변경할 수 있다. 동족 멜라닌들은 외생적인 전구체들이 배지에 더해질 때 생성된다.

연구자들은, 한정되지는 않지만, 하기의 것이 적합한 전구체라는 것을 발견하였다.

이들 전구체들의 사용으로서, 한정되지는 않지만, 적색, 청색, 녹색, 갈색, 오렌지색, 보라색 및 노란색등 멜라닌의 색뿐만 아니라 멜라닌의 화학 특성을 변경하는 것이 가능하다. 또한 멜라닌의 다른 색은 예를 들어 배양 배지(배양액)에 금속 이온을 첨가하는 것에 의해 생성될 수 있다.

B.유전자 조작

본 발명의 키메라 유전자 및 벡터는 하기의 종래의 기술을 사용하여 제조되고 미생물의 형질 전환에 사용되게 된다. 적합한 기술들은 Maniatis, T.et al., Moleular cloning, 1st Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982) ; Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989) ; Methods in Enzymology, Vols. 68 (1979), 100(1983), 101(1983) 118(1986) Vols. 152-154(1987) ; DNA cloning, Glover, D.M., Ed., IRL Press, Oxford(1985) ; Plant Molecular Biology : Manual, Gelvin, S.B. etal., Eds., Klurwer Academic Publishers, Dodrecht(1988)등이 있다.

배지 조성은 상술한 참고문헌 외에, Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1972)에 기재되어 있다. Hopewood, D.A.et al., Genetic Manipulation of Streptomyces : A Laboratory manual, The John Innes Foundation, Norwich, England(1985)참조.

DNA 씨퀀스의 제조

종래 기술의 어떤 여러 가지 방법에 의해서 어떠한 소오스로부터도 DNA 단편이 분리되어 준비될 수 있다. 예를 들면, DNA 씨퀀스는 제놈 클론의 유전자 뱅크나 또는 분리된 염색체 DNA로부터 직접 분리될 수 있다. 제한 효소는 조절되고 위치 특정된 및 예견 할 수 있는 방법으로 DNA를 소화, 분석 및 재구성하기 때문에 사용될 수 있다. 예를들어 EcpRI에 의한 소화에서 얻어진 DNA 씨퀀스는 플라스미드 DNA의 EcoRI 인식 위치에서 오프닝에 적합하다. 컴플리멘터리 (스틱키) 끝부는 T4 DNA 라이가제에 의해 접합될 수 있다.

소화된 DNA는 폴리아크릴아미드 또는 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분자량을 기초로 해서 분해될 수 있다. 전기 영동 겔에서 분리된 DNA 단편들은 종래 기술에서 잘 알려진 많은 방법에 의해 동정할 수 있다. 이것들은 단백질이나 또는 RNA에 한정되며 전기 영동에 의해 확인되 될 수 있다. 이것들은 겔에서 셀룰로즈 질산염 여과지로 올려진 후에 RNA 또는 DNA에 의해 푸루브되어도 된다. RNA 또는 DNA 프루브는 방사성 종 또는 검출할 수 있는 효소를 운반한다. 이러한 내용은 Smith, G. et al., Anal. Biochem. 109,123(1980) ; 및 Southern, E.M.J.Mol. Biol. 98,503(1975)에 기재되어 있다. 합성 올리고뉴클레오티드 DNA 프루브는 통상적으로 12b 이상이다. DNA 또는 RNA 샘플의 씨퀀스가 알려지면, 정확한 프루브는 합성 되어도 된다. 이러한 내용은 Lathe, R., j.Mol. Biol. 183, 1(1985)에 기재되어 있다. 닉 번역에 의해 생선된₃₂P 표시된 DNA 프루브는 한천 겔상에서 분리되어 셀룰로즈 질산염상에 블로팅되어 DNA 단편으로 교배시킬 수 있다. 이 처리는 써던 블로팅 하이브리드화로 잘 알려져 있다. Wahl. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76,3683(1979)참조. 또한 DNA 씨퀀스는 역전사 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.

DNA 씨퀀스는 멜라닌 생성에 촉매작용을 하는 효소의 아미노산 씨퀀스가 잘 알려져 있으면 화학적으로 합성될 수 있다. 몇 가지 종래 기술의 방법들은 효소의 아미노산 씨퀀스를 결정하는데 이용될 수 있다. 아미노산 씨퀀스의 일부는 역전 사를 위한 프라이머를 준비하도록 결정해서 사용될 수 있다. DNA 씨퀀스는 효소의 특정한 아미노산 씨퀀스를 코딩할 수 있다. 또한 DNA 씨퀀스는 효소의 일부나 또는 전부를 코딩하는 씨퀀스를 함유할 수 있다. 예를 들면, DNA 씨퀀스는 티로시나제의 전체 아미노산 씨퀀스를 코딩할 수 있고, 또는 티로시나제의 아미노산 씨퀀스의 실질적인 부분을 코딩할 수 있다. 또한, DNA 씨퀀스는 효소를 코딩하는 것과는 다른 아미노산을 함유한 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 티로시나제 유전자는 Streptomyces antibioticus의 DNA를 BclI으로 소화시켜서 클론되었다. DNA 단편은 Bc1I - 잘려진 pIJ 37 또는 BamHI - 소화된 pIJ 41에 연결되어 진다. 다음에, 연결된 혼합물은 Streptomyces lividans 1326의 프로토플라스트를 형질전환하는데 사용된다. Katz, E. et al., (1983), Supra 참조. 또한, 티로시나제 유전자는 멜라닌을 생성하는 어떤 유기물로부터 분리될 수 있다. 이 때문에, 이 유전자는 다른 것 중에서는 인간헤어 폴리클, 멜라노시트(melanocytes) 또는 멜라노마스(melamomas), 커틀피쉬(cuttlefish), 레드루스터(red rooster), 세균 및 진균에서 분리시킬 수 있다. 예를들면, 인간의 티로시나제 유전자는 미합중국 특허제4,898,814호에 기술된 바와같이 얻어질 수 있다.

형질변환벡터

본 발명의 벡터는 멜라닌 생성에 촉매작용을 하는 효소를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터이다. DNA는 의도된 숙주 또는 외부 DNA에 대하여 선천적이어도 좋다. 외부 DNA는 형질변환될 미생물에 대해 외부 발생적이거나 또는 상기 미생물에서 본질적으로 발견되지 않는 DNA이다. 그것은 숙주 유기물을 형질 전환하도록 클로닝 벡터에 삽입될수 있다. 본 발명의 외부 DNA는 자연적으로 멜라닌을 생성하는 유기물의 DNA로부터 유도 되거나 이들의 DNA와 실질적인 씨퀀스 상동관계를 가진다. 본 발명의 벡터는 표준적 기술에 의행 생성된다. 출발물질로 이용될 수 있는 적합한 벡터는 이 기술 분야에서 공지 되어 있다.

벡터는 생성은 적합한 숙주. 예를 들어 E. Coli에서 수행될 수 있다. 멜라닌의 형성에 촉매작용을 하는 효소를 코딩하는 DNA 씨퀀스는 통상의 방법으로 얻어지며 미생물의 형질 변환에 적합한 어떤 벡터로 삽입된다.

효소 또는 그 일부를 코딩하는 DNA 씨퀀스는 효소가 정확하게 발현기에 적합한 방식으로 정확한 벡터에 삽입된다. 즉, DNA 씨퀀스는 적합한 방향 및 리딩프레임에 위치되어서 정확한 아미노산 씨퀀스가 숙주에 있는 DNA 씨퀀스의 발현되도록 생성된다. 종래의 기술에 따라 특정 호스트 미생물에서 작동할 수 있는 프로모터 및 원하는 효소를 코딩하는 DNA 씨퀀스를 포함하는 키메라 DNA 씨퀀스가 일반적으로 형성된다. 키메라 DNA 씨퀀스는 또한 숙주에서 작동할 수 있는 3' 비코딩 씨퀀스를 포함한다. 키메라 DNA 씨퀀스는 효소를 코딩하는 DNA 씨퀀스를 알려진 형질 변환벡터의 제한 위치로 삽입함으로써 적합한 벡터내의 제 위치에서 제조될 수 있다. 또한 키메라 유전자가 처음 제조되고 그후 벡터에 삽입되어 형질 전환 벡터가 생성된다. 벡터는 인헨서 씨퀀스 그리고/또는 강력한 촉진제를 사용하여서 더욱 변형될 수 있고, 이렇게 해서 효소의 생성이 증대된다.

전형적인 벡터는 항생제 저항성을 나타내는 하나 이상의 마커 유전자, 복제 근원 및 제한 단편의 클로닝과 써브클로닝에 유용한 다양한 제한 위치를 갖는 플라스미드이다. Streptomyces와 E.Coli에 한정되는 것이 아니라 많은 형질전환 미생물에 유용한 많은 벡터가 예를 들어 Cloning Vectors, Pouwels, P.H. et at. ed. Elsevier Science Publishers Amsterdam(1985) 등에 기재되어 있다.

많은 자연발생적인 Streptomyces 플라스미드가 기재되어 있다. 그러한 분리물중 2개인 SLP 1.2와 pIJ 101은 유용한 일련의 플라스미드 벡터를 기초로 해서 형성된다. Thompson, C.J.et at., Gene 20, 51 (1982). SLP 1.2가 가장 많이 검출되는 성분인 SLP 1과 (family)의 플라스미드는 S. coelicolor A3(2)와 상호 특이적으로 결합한 후 S. lividans 66에 자가 복제되어서 발견된다. SLP 1 리플리콘은 S.coelicolor 제놈에 융합되지만 S.lividans에서 자율증식 되도록 근접 DNA의 다양한 길이로 삭제된다. SLP 1 플라스미드는 S.lividans에서 염색체 당 4-5의 복제수로 안정하게 존재하고 좁은 숙주 범위를 갖는다. 8.9kb플라스미드 pIJ101은 S.lividans ISP 5434에서 발견되지만 (Kieser, T. et at., Mol. Gen. Genet. 185,223 (1982)) Streptomyces 속의 다양한 야생형과 접합 전이될수 있다. 유도체(pIJ 102)는 유사한 특성을 갖는 좀더 작은 플라스미드로부터 분리되었다. Kieser, T. et at.(1982), supra. 플라스미드 pIJ 101은 2.1kb이하의 최소 리플리콘과 대부분의 숙주에서 크로모좀 당량당 100∼300의 카피수를 갖는다. 약물 내성 결정기를 갖는 유도체는 벡터로 작용하도록 구조를 갖추고 있으며 E.Coli와 Streptomyces 사이의 셔틀 벡터로서 사용될 수 있는 키메라 플라스미드가 이용될 수 있다.

온화 파아지 øC31는 위치 특성 통합 이벤트를 통해서 Streptomyces와 lysogenizes S. coelicoloyA3(2)내에서 광범위한 숙주범위를 가진다. Lomovshaya,, M. et al., Bacteriol Rev. 44,206(1980). 생활력이 있는 파아지입자내에서 DNA의 42.4kb까지 패키지될 수 있지만, DNA의 단지 32kb만이 플라크 형성에 필수적인 유전적인 정보를 포함한다. 삭제를 포함하는 øC31의 유도체는 벡터로 사용될 수 있고, 그리고 재결합제파아지는 용균적으로 배양되는지 적당한 Streptomyces균을 용원 하기 위해 (lysogenizotion)사용될 수 있다.

여러 가지의 Streptomycetes로부터 클론된 한정된 수의 유전자는 벡터를 구성하는데 중요한 역할을 한다. 티오스트렙톤저항(tsr)을 부여하는 S. fradiae로부터 나온 아미노글리코사이드 포스포트란스퍼라제유전자, S. fradiae로부터 나온 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 유전자, (aac)그리고 S. azureus로부터 나온 γRNA메틸라제는 삽입 불활성화를 허용하는 벡터를 배양하기 위해 쌍을 이루는 결합으로 사용되어진다. 생성물이 티로신으로부터 갈색 멜라닌색소의 합성을 억제하는 티로시나제유전자 mel은 S. Antibioticus로부터 클론되고 그리고 재결합제의 가시적인 인식을 허용하는 벡터를 구성하기 위해 사용되어진다. Katz, E. et al., (1983), supra.)

플라스미드벡터 pIJ702는 Streptomyces의 넓은 범위 DNA 클로닝을 일반화시키는데 사용되어서 재결합제 플라스미드를 포함하고 있는 형질전환된 콜로니의 가식적인식을 허용한다. 벡터 pIJ702는 유전선택용의 티오스트렙톤 저항결정체(tsr)와 완제품이 티로신으로부터 갈색 멜라닌색소의 합성을 행하는 티로시나제유전자멜라닌을 포함한다. mel유전자의 삽입 불활성은 비멜라닌 생성 형질전환체를 유도하는 반면, 완전한 mel 로커스는 진한 갈색 콜로니를 생성시킨다. BglII, SacI 및 SphI용의 특정한 위치는 mel 유전자에 존재한다. 벡터는 비록 재결합의 인식이 쉽지는 않지만 KpnI나 PstI에 의해 생성된 DNA 단편을 클론하는데도 사용될 수 있다. BamHI와 XhoI용의 독특한 제한위치는 클론에는 이용할 수 없고, 독특한 ClaI 위치에서의 삽입은 tsr유전자를 불활성화시켜서 유전자선택을 제거시킨다. 벡터의 복제수는 40∼300이다.

pIJ702벡터는 tsr유전자(Thompson et al.(1982), Supra)를 포함하는 S. azureuz로부터 얻은 1.1kb BclI 단편, S. Lividans pIJ102(Kieser, T. et al. (1982), (Supra)로부터 얻은 3.0kb BclI 단편, 그리고 멜라닌유전자를 포함하는 S. Antibioticus로부터 얻은 1.55kb의 BclI 단편으로 구성되어 있다.

pBR322에서 유도된 플라스미드는 E. Coli천이에서 매우 일반적으로 사용된다.

이것들은 Escherichia clil가 계속적으로 천이될 때 항생제저항성을 부여하는 한쌍의 항생제저항유전자를 소유하고 있다. 전형적으로 DNA세그먼트가 삽입 되어지면 항생제저항유전자의 어느 하나는 불활성화되게 된다. 이때 선택은 제2의 유전자에 의해 부여된 항생저항을 나타내는 E. Coli용의 선택에 의해 수행되어지게 된다. (Bolivar, F. et al., Gene 2, 95 (1977) ; 및 Sutcliff, J., Porc. Natl. Acad, Sci., USA75, 3737(1978)참조.

벡터를 천이시키는 또다른 예로는 박테리오 파아지가 있다. M13시리즈는 단일의 스트레인의 환상DNA를 포함하고 있는 변형된 필라멘트 E. Coli 박테리오 파아지이다. M13시리즈는 β-칼락토시다제용 1acZ 유전자를 운반하고, 그리고 청색을 생성시키기 위해 갈락토스 유사체 Xgal을 동화시키게 된다. lacZ유전자의 아미노말단에 위치된 폴리링커씨퀀스에 클로닝하여 삽입시키면 유전자가 불활성으로 된다. 불활성으로 된 1acZ(클론된 삽입을 나타냄)와 함께 M13을 운반하는 미생물은 활성1acZ 유전자와 함께 M13을 운반하는 미생물과 청색이 없으므로 구별되어진다. Messing, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,USA 74,3642 (1977) ; 및 Messing J., Methods in Enzymology, Vol 101,20 (1983).

다른 형질전환 벡터들은 pUC 시리즈의 플라스미드이다. 이것들은 pBR322로부터 나온 벡제 개시점과 암피실린 내성유전자와 그리고 E. Coli의 lacZ 유전자의 부분을 포함한다. lac 영역은 M13시리즈에 있는 것과 동일한 제한 효소 인식 위치의 폴리링커씨퀀스를 포함한다. pUC시리즈는 그들이 클로람페니콜에 의해 증폭될 수 있는 잇점을 가지고 있다. DNA 단편이 lac영역속으로 클론될 때 1ac유전자는 불활성화 되어진다.불활성화될 lacZ유전자와 함께 pUC플라스미드를 포함하고 있는 E. Coli가 이소프로필티오 갈락토시드(IPTG)와 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴β-D-갈락토피라노시드(X gal)의 존재하에서 배양되어질 때 콜로니는 백색이다. 그것이 만약 활성lacZ유전자와 함께 pUC플라스미드를 운반하면 그것의 콜로니는 청색이다. Vieira, J. et al., Gene 19,259 (1982)참조. 세균은 종래의 기술에 의해 형질전환되어진다.

[미생물의 형질전환]

Streptomyces속은 Actinomycetales 목에 속하는 세가지 호기성세균류의 하나이다. Streptomyces는 G(+), 균사형, 포자형성 세균이다. 몇가지 천연으로 발생되는 Streptomyces 플라스미드들이 기술되어져 있다. S. lividans TK64는 어떠한 티로시나제 유전자도 가지고 있지 않고 멜라닌을 생성하지 않는다. 플라스미드pIJ702는 티로시나제 유전자를 갖으며 복제수가 많은 플라스미드이다. 이러한 결과 염색체에 티로시나제 유전자를 가지고 있는 종류보다 티로시나제 생성이 3배이상 증가되게 된다. 플라스미드 pIJ702는 세포외 멜라닌생성을 위해 Streptomyces lividans TK64를 고단위까지 형질전환시키는데 사용되어진다. 형질전환은 표준방법에 의해 행해진다. 유사하게 티로시나제유전자는 여러 가지의 숙주 미생물을 형질전환시키는데 유용한 벡터속에 삽입시킨후 여러 가지의 미생물을 형질전화시키는데 사용될수 있다.

블루스크립트(Stratahene, Lajolla, CA에서 얻은것임)는 β-갈락토시다제색상지시기와 lac촉진제를 가지고 있는 pUC 유도체이다. 블루스크립트 플라스미드는 티로시나제 유전자를 삽입시키는 것에 의해 변경되어진다.

이렇게 변경된 프라스미드는 색소를 띤 콜로니를 형성한 E. Coli를 계속적으로 형질전환 시키는데 사용되어졌다.

E. Coli에서 고레벨의 멜라닌 생성는 S. Antibioticus의 mel 로커스부터 나온 ORF5'를 가진 티로시나제 유전자의 상호발현을 요구한다. pIJ702에서 mel 로커스는 ORF와 지정된ORF 438 및 티로시나제 유전자를 포함한다. S. Antibioticus ATCC 8663의 mel 로커스는 S. Antibioticus IMRU 3720의 mel 로커스에 대한 상당한 정도의 동족관계를 가진다. S. Antibioticus ATCC 8663는 pIJ702를 생성시키기 위해 사용되는 S. Antibioticus IMRU 3720 스트레인과 다른 스트레인이다. S. Antibioticus ATCC 8633으로부터 나온 티로시나제 유전자의 시퀀싱은 S. Antibioticus IMRU 3720과 여러 가지의 뉴클리오티드 차이점을 노출시켰다. 티로시나제 코딩영역에 대한 새로운 상기하지 않은 씨퀀스 3'가 동정되고 클론되어 씨퀀스되어진다. 3'씨퀀스의 부분은 티로시나제 활성제로 작동한다. 새로운 3'씨퀀스는 멜라닌생성에 포함되어 있는 단백질을 코딩시키는 가정의 오프리딩프레임을 포함한다.

I7/E. Coli 티로시나제 발현시스템은 S. Antibioticus ATCC 8633 티로시나제 유전자 영역을 클론하고 동정하는데 사용되어졌다.

T7/E. Coli 티로시나제 발현시스템은 Streptomyces플라스미드 클로닝보다 더 많은 잇점 즉, 고속의 형질전환, 신속한 멜라닌 검출, 연속적이고 쉬운 DNA 추출, 그리고 써브클로닝, 지도조작 및 DNA 시퀀싱의 조작 등을 포함하는 잇점을 제공한다.

T7/E. 콜리 티로시나제 발현시스템은 T7 RUN 폴리머라제를 생성하는 이.콜리의 숙주 스트레인에 클론된 유전자의 선택적인 복사를 지시하며 T7 RAN폴리머라제를 생성하는 박테리오파아제 T7 프로모우터벡터를 사용하는 두 개의 플라스미드 T7 프로모우터/T7 폴리머라제 시스템이다(Tabor, S. et al., Porc. Nat'1. Acad. Sci, USA, 82, 1074(1985)참조).

유도된 티로시나제 유전자를 포함하고 있는 재결합 E. Coli세포는 구리와 티로신이 보충될 때 한천플레이트와 액체배양액에서 멜라닌색소를 생성시켰다. 그러나, ORF 438의 발현이 E. Coli에서 고레벨의 멜라닌 생성용으로 요구된다는 것이 발견되었다. 부가적으로, 3'조정 씨퀀스의 존재는 또 멜라닌 생성을 향상시켰다.

E.Coli K38(pGP1-2)에 형질전환된, 예를들어 플라스미드 pBGC 620.3은 ORF 438의 전사를 위해 박테리오파아지 T7 리보솜결합위치(RBS1)를 사용하고 그리고 티로시나제의 전사를 위해 진짜의 S. Antibioticus RBS2를 사용하는 키메라, 바이시스트로닉전사를 제공한다. pGP1-2는 P1 촉진제에 의해 유도되는 T7 RNA 폴리머라제를 코딩한다. 촉진제가 42℃의 열충격에 의해 활성될 때 유도된 T7 RNA 폴리머라제는 T7 프로모터뒤의 Pt7-7에서 클론된 유전자를 선택적으로 발현시킨다. pGP1-2는 또 선택가능한 마커로서 카나마이신 내성유전자를 포함하고 있다. 양쪽 플라스미드를 잠적시키는 이중 형질전환제는 암피실린과 카나마이신을 각각 100㎕/㎖ 포함하고 있는 30℃ 루리아브로스(LB) 한천배지에서 선택되어졌다.

또한 E.coli에서의 멜라닌 생성은 T7 프로모터 및 리보좀 결합위치 및 ORF 438 등의 ORF의 제어하에, 제17도에 도시된 바와같이 리보좀 결합위치 및 분리된 T7 프로모터의 제어하에 티로시나제 유전자를 위치시킴으로써 증가될 수 있다는 것을 알았다. 상기의 배열에서는 멜라닌의 생성은 제4도에 도시된 전술한 배열을 가지는 pBGC 620.3의 멜라닌 생성보다 적어도 4배 증가되며 10내지 15배까지 증가될 수도 있다.

T7/E.coli 티로시나제 발현 시스템을 사용하여 상기에 열거된 것과 같은 기타의 전구체 화합물을 멜라닌 색소안으로 합체시키기 위해 스크리닝(screening)하는 것이 가능하다. 생성되는 멜라닌 동족물들은 고유한 색상 및 기타 화학적 특성에 대해 선택된다. 증가된 멜라닌 생성을 위해 E. coli의 아미노산 생합성 경로에서 과생성 변이체를 확인하기 위해 부가된 전구체의 존재없이 스크리닝 하는 것이 가능할 수도 있다. 재조합형 E.coli 세포에서의 멜라닌 표현형을 스크리닝할 수 있는 능력은 신규한 멜라닌의 생성과 촉매작용 성질이 변경된 티로시나제의 단백질 엔지니어링에 대한 새로운 기회를 제공한다.

[변이발생]

변이는 멜라닌을 생성할 수 있는 미생물에서 발생될 수 있다. 변이에 의해서 멜라닌의 생성은 감소하거나, 증가하거나 또는 변화되지 않는다. 변이는 멜라닌의 생성이 증가되도록 선택된다. 변이는 에티듐 브로마이드 및 에틸메탄 설포네이트 등의 화학적 변이원 외에 자외선 또는 감마 방사선 등의 방사선을 포함하는 공지 기술에 의해 발생될 수 있다.

C.멜라닌의 정제

멜라닌은 세균 세로포부터 상온 및 100℃에서 0.5N NaOH로 정제 되어진다. 색소를 띤 부분은 (1) 산 및 염기에서 용해가능 (2) 에틸알콜 및 염기에서 용해가능 (3) 염기에서만 용해가능함이 발견되었다. (Pavlenko, G.V. at al. (1981), Supra.)

용해 가능한 멜라닌은 배지로부터 추출되고 정제될 수 있다. 이는 먼저 여과 또는 원심분리등으로 세포 및 미립자 물질을 제거하여 수행된다. 여과가 사용되는 경우에는 유리솜을 통한 여과를 포함하는 여러 가지 여과 방법이 공지되어 있다. 원심분리가 사용되는 경우에는 보통 중력의 5,000배이면 충분하다.

다음 멜라닌은 pH 2-4, 바람직하게는 pH3에서 침전된다. 침전된 멜라닌은 여과 또는 원심분리하여 제거된다. 계속해서 멜라닌은 고 pH, 즉 약 7.0 내지 약 9.0, 바람직하게는 약 pH 8.0에서 용해하고 저 pH에서 침전한 다음 여과 또는 원심분리하여 수세된다. 멜라닌은 또한 역삼투와 같은 분자량 여과를 사용하여 농축될 수도 있다. 저 pH의 멜라닌 침전에는 염침전이 효과적일 수 있다.

본 발명은 제한적이 아닌 다음의 실시예들에 의해 설명된다.

티로시나제의 정제

티로시나제는 Streptomyces 배양액에서 성장 배지안으로 분비된다. 티로시나제는 E.coli에서 세포내로 유지된다. 세포내의 티로시나제는 문헌. Sambrook et al. Molecular Cloning (1989)에 잘 설명된 표준과정에 의해 E.coli로부터 정제될 수 있다.

ORE 438 단백질의 정제

ORE 438 단백질은 E.coli에서 세포내에 유지되며 포준프로토콜에 따라 정제된다. 또한 정제는 패스트 프로테인 리퀴드 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography)(FPLC)를 통해 수행된다.

[실시예1]

멜라닌의 정제

다음의 실시예에서 생성된 멜라닌은 다음의 과정에 의해 성장 배지로부터 정제된다.

배양은 균사를 제거하기 위해 유리솜을 통해 여과된다. 한편 미립자 물질과 세포는 중력의 5,000배로 원심분리하여 성장배지로부터 제거된다. 배지를 함유한 멜라닌의 pH는 HC1로 약 3.0으로 낮우어진다. 침전된 멜라닌은 중력의 6,800배로 원심분리하여 제거된다. 침전물이 제거되며 pH 8.0에서 용해된다. 용해된 멜라닌은 용액 2배양인 멸균 정제수로 수세된다. 침전, 제거, 용해 및 수세의 과정은 비침전성 불순물을 실질적으로 제거하기 위하여 4번 반복된다. 생성물은 경우에 따라 완성을 위해 200℃에서 48시간 동안 오븐에서 건조될 수도 있다.

[실시예2]

종래의 멜라닌 제조기술

실시예2는 종래의 멜라닌 제조기술을 나타내기 위한 것이다. 방법은 Hopwood, D.A 등의 Genetic Manipulation of Streptomyces : A Laboratory Manual The John Innes Foundation (1985)에 의한 것이다.

Streptomyces Lividans TK 64 ( pIJ 702 )에 의한 멜라닌 생성.

배양 배지의 제조

MMT 배지은 후술되는 바와같이 다음의 성분으로부터 만들어진다.

상기 성분들이 물에 용해되고, NaOH로 pH 7.0 - 7.2로 조절되고, 100㎖를 취해 500㎖ 플라스크에 옮겨지고, 20분 동안 오토클레이브된다.

다음의 멸균의 스톡이 준비된다.

* 상기의 스톡은 모두 배지를 만들기 전에 오토클레이브됨.

다음의 성분들이 MMT 배지를 만들기 위해 결합된다.

100 ㎖ MM 배지

2 ㎖ 카사미노산

2 ㎖ 글루코스

750 μ ℓ 타이거 밀크

티로신과 멜라닌 생성을 위해 다음의 성분이 또한 포함된다.

100 ㎕ CuSO₄· 5H₂0

3 ㎖ 티로시나제 유도제

TK 64 (pIJ 702)의 접종 및 배양

소량의 세균이 플레이트의 상단으로부터 스크랩되며 10㎖의 멸균수에 옮겨져서 혼합되고 피펫을 사용하여 100㎖의 MMT를 함유하는 6개의 500㎖ 플라스크에 옮겨진다. 배양액은 30℃, 120rpm으로 3일간 배양된다.

결과

멜라닌은 실시예1에서 설명된 바와같이 추출된다. 멜라닌의 수율은 습윤 질량으로 약 0.5 g/ℓ이다.

[실시예3]

질소원의 변형에 의한 증가된 멜라닌 생성

성장 배지 제조

0.5 g/ℓ K₂HPO₄, 0.2 g/ℓ MgSO₄·H₂0, 0.01 g/ℓ FeSO₄, 8 g/ℓ 카제인 가수분해물, 0.3 g/ℓ 티로신 10 g/ℓ 글루코스, 0.0005% CuSO4 및 0.1 g/ℓ L-메티오닌을 함유하는 배지를 제조했다.

TK 64 ( pIJ 702 )의 접종 및 배양

11 ℓ의 배지가 333㎖의 성장배지를 함유하는 1ℓ 플라스크에서 1.4 x 10₄spores/ ㎖ S. Lividans TK64 (pIJ 702)로 접종된다. 배양액은 150 rpm으로 교반하면서 310℃로 3일간 배양된다.

결과

멜라닌은 실시예1에서 기술된 바와같이 정제되었다. ℓ당 1.58그램의 전체 습윤중량이 얻어졌다.

[실시예4]

탄수화물억제제의 제거에 의한 증가된 멜라닌생성

성장배지의 제조

글루코스가 탄소공급원으로서 제거된 점을 제외하고는 실시예3의 배지 준비가 반복되었다.

TK64(pIJ702)의 접종 및 배양

1리터 플라스크에 들어있는 250㎖의 배지가 S. lividans TK64 pIJ702 5.8 × 10₃spores/㎖로 접종되었으며, 3일동안 170rpm의 진탕하면서 30℃에서 배양이 진행되었다.

결과

멜라닌이 실시예1에서 기술된 바와같이 정제되었으며, 습윤중량 9g/ℓ의 멜라닌이 얻어졌다.

[실시예5]

카세인 펩톤배지에 의한 멜라닌생성의 향상

성장배지의 제조

카세인 가수분해물(시그마 케미칼로부터 얻어짐)이 카세인 펩톤과 동일한 양으로 교체되었으며 L-메티오닌이 제거된 점을 제외하고는 실시예4의 배지제조가 반복되었다.

TK64(pIJ702)의 접종 및 배양

배양액 250㎖를 수용한 각각의 1리터용량의 플라스크에 S. lividans TK64(pIJ702) 5.8×10³spores/㎖로 접종되었다. 그리고 150 rpm의 진탕하면서 30℃로 90시간동안 배양이 되었다.

결과

멜라닌은 실시예1에서 기술된 바와같이 정제되었으며, ℓ당 12그램 습윤중량의 멜라닌이 얻어졌다.

[실시예6]

티로신에 의한 멜라닌생성의 향상

성장배지의 제조

카세인 가수분해물의 양이 첨가된 티로신의 양을 변화시키는 카세인펩톤에 의해 교체된 점을 제외하고는 실시예5의 배지준비가 반복되었다. 다른 플라스크들에서의 티로신의 농도는 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 및 1.5 g/ℓ이었다.

TK64(pIJ702)의 접종 및 배양

배양액 250㎖를 수용한 각각의 1리터용량의 플라스크에 S. lividans TK64(pIJ702) 5.8×10³spores/㎖가 접종되었으며, 150rpm 진탕하면서 30℃로 90.5 시간동안 배양되었다.

결과

플라스크에서 성장액의 400nm에서의 광학밀도(OD₄₀₀)는 간헐적으로 나타났다. 90.5시간의 배양후에 평균광학밀도는 다음과 같았다 :

멜라닌은 실시예1에서 기술된 바와같이 정제되었으며, 멜라닌의 수율은 티로신의 농도가 1.5g/ℓ인 플라스크에서 배지ℓ당 26그램 습윤중량이었다.

[실시예7]

바이오리반응기에서의 멜라닌의 생성

성장배지의 준비

실시예5에서와 같이 성장배지가 준비되었으며, 배지는 리터당 1.5그램의 티로신을 포함하고 있다. 이배지는 아미노산을 제외하고는 어떠한 글루코스 또는 다른 탄소공급원을 포함하지 않는다.

TK64(pIJ702)의 접종 및 배양

S. lividans TK64(pIJ702)의 포자체가 물로 1:10으로 희석되었으며, 출발배양이 1리터용량의 플라스크에 수용된 250㎖의 성장배지에 50㎕의 희석된 포자체를 첨가함으로써 이루어졌다. 출발배양은 미드로그 상에 도달할때까지 진탕하면서 30℃에서 배양되었다.

그 다음에 출발배양은 20리터의 성장배지를 포함하는 30리터의 발효제로 형질 전환되었다. 배지의 최대 광학밀도가 400nm(OD₄₀₀)에서 얻어질때까지 225rpm의 일정하기 진탕하면서 30℃에서 배양이 되었다. 발효동안의 공기 주입은 처음 40시간동안은 1ℓ/min의 일정한 공기유동율로, 그리고 40∼60시간 동안은 2.5ℓ/min의 공기유동율로, 다음에 나머지 60∼120시간 동안은 3.0ℓ/min의 공기유동율로 이루어졌다.

결과

멜라닌은 실시예1에서 기술된 바와같이 정제되었으며, 멜라닌의 수율은 약 1.7g/ℓ건조 중량이었다.

[실시예8]

바이오리반응기에서의 멜라닌의 생성

성장배지의 준비

성장배지는 실시예5에서와 같이 준비되었으며, 배지는 1.5g/ℓ의 티로신을 함유하였다. 이 배지는 아미노산을 제외하고는 어떠한 글루코스 또는 다른 탄소공급원을 포함하지 않았다.

TK64(pIJ702)의 접종 및 배양

S. lividans TK64(pIJ702)의 포자체가 물로 1:10으로 희석되었으며, 출발배양이 1리터용량의 플라스크에 수용된 250㎖의 성장액에 50㎕의 희석된 포자체를 첨가함으로써 이루어졌다. 출발배양은 미드로그 상에 도달할 때까지 진탕하면서 30℃에서 배양되었다. 그 다음에 출발배양은 35리터의 성장배지를 포함하는 42리터의 발효제로 형질 전환되었다. 배지의 최대 광학 밀도가 400nm(OD₄₀₀)에서 얻어질때까지 225rpm의 일정한 혼합으로 30℃에서 배양이 되었다. 발효동안의 공기주입은 처음 36시간 동안은 1.5ℓ/min의 일정한 공기유동율로, 그리고 36∼48시간 동안은 4.0ℓ/min의 공기유동율로, 다음에 나머지 48∼120시간 동안은 5.0ℓ/min의 공기 유동율로 이루어졌다. 그리고 거품방지제가 48시간 후에 매일 첨가되었다.

결과

멜라닌은 실시예1에서 기술된 바와같이 정제되었으며, 멜라닌의 수율은 약 2.0g/ℓ건조 중량이었다.

[실시예9]

멜라닌생성에 대한 E. Coli의 형질전환

플라스미드 구조

플라스미드 pIJ702를 운반하는 Streptomyces lividans가 American Type Culture Collection으로부터 얻어졌으며, 그것은 ATCC35287을 운반하게 된다.

S. antibioticus IMRU3720의 mel로커스로부터의 티로시나제 유전자 및 ORF438 유전자가 플라스미드 pIJ702에서의 1291 bp Sph1/Bcll에 단편상에 포함되었다. Bernan, V.et al., (1985). Supra ORF438 및 티로신이 플라스미드 pT7-7(S. Tabor로부터 얻어짐)으로 클론되어서 pBGC620.3으로 되었다. 제2도를 참조.

플라스미드 pT7-7은 pT7-5의 유도체이다. Tabor, S. 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1074(1985). 플라스미드 pT7-7은 T7박테리오파지프로모터와 폴리링커의 상류방향의 강한 리보솜 결합위치를 가지고 있다. 그것은 E coRl위치가 채워진 것이 사용될때 N-말단에서 4개의 여분의 아미노산을 포함하는 융합단백질을 제공하게 된다.

ORF438의 출발코돈에서의 Sph1위치는 녹두 뉴클리아제로 소화되어 Ncol링커(5'-DCAAGCTTG-3')에 연결되었다. 티로시나제의 TCA말단 코돈에서의 Bcll 위치는 Klenow를 사용하여 충전되어 HindIII링커(5'-dCAAGCTTG-3')에 연결되었다. pT7-7은 EcoRl로 절단되어, Klenow로 충전되며, Ncol링커(5'-dCAAGCTTG-3')에 연결되며, HindIII로 절단되었다. ORF438단백질과 티로시나제를 코딩하는 1307bp Ncol/HindIII단편은 pT7-7에 연결되어 pBGC620.3으로 되었다. 따라서, Ncol링커를 가진 ORF438은 N-말단(NH₂-Met-Ala-Arg-Ile-Ala-ORF38-COOH)에서 5개의 여분의 아미노산을 가진 융합단백질로서 발현된다.

플라스미드 pBGC 619는 다음과 같이 pT7-7로 클론된 티로시나제(ORF438 없음)을 포함한다. Ncol 위치는 플라스미드 pMa/mel #3에 있는 티로시나제의 ATG스타트 코돈에서 올리고 뉴클레오티드 변이에 의해 처리된다(M. Kumagai 비공개됨). 티로시나제 코딩영역은 변형된 Ncol/Hind Ⅲ pT7-7벡터(전술한 바와같음)안으로 NCol/Hind Ⅲ 단편으로서 재연결되어 pBGC 619가 얻어진다(제2도 참조). 그래서, 티로시나제는 N-말단(NH₂-Met-Ala-Arg-Ile-Ala-tyrosinase-COOH)에서 5개의 추가아미노산을 갖는 pBGC619에서의 융합 단백질으로 발현된다.

플라스미드 pBGC620.2는 ORF438코딩 씨퀀스에서의 리딩프레임 변이를 제외하고는 pBGC620.3과 동일하다. 이러한 모든 클론에서의 리딩 프레임 할당부는 제3A도에 도시된 바와같이 생체내에서 동일한 해독생성물과 일치된다.

발현

플라스미드 pBGC619, pBGC620.2 및 pBGC620.3는 플라스미드 pGP1-2정착 E.coli K38로 형질전환되었다(Tabor etal. Supra). pGB1-2는 PL프로모토유전자에 의해 유도된 T7 RNA폴리머라제를 코딩한다(Tabor et al. supra). 프로모터가 활성화 될때 (42℃의 열충격으로), 유도된 T7 RNA폴리머라제는 T7프로모터 뒤에 있는 pT7-7에 클론된 유전자를 선택적으로 발현시킨다. pGB1-2는 선택가능한 마커(marker)로서 카나마이신내성 유전자를 포함한다. 양쪽 플라스미드에 정착한 이중 혈질전환체는 30℃에서 루리아 브로스(LB) 한천 플레이트(각각 100㎕/㎖에서의 앰피실린 및 카나마이신)상에 선택된다. 한천지시 플레이트상의 멜라닌 생성용으로는 (지시플레이트는 CuSO₄,·5H₂O (0.2mM) 및 L-티로신(0.3g/ℓ)로 보충됨), 콜로니는 30℃에서 밤새도록, 다음에 42℃에서 1시간 배양되고, 이어서 30℃에서 3시간 내지 밤새도록 추가성장을 하여 가시성 색소를 형성케 한다. 액체 배양액에서의 멜라닌생성용으로는, 한밤 배양(30℃)은 신선한 LB로 1:50의 희석이 되며 30℃에서 5시간동안 성장하고 진탕 수조에 30분간 전사된 후 연속적인 한밤 배양을 하기위해 30℃를 다시 유지시킨다. 또한, 액체배양액에서 멜라닌 생성은 추가의 CuSO₄·5H₂O 및 L-티로신의 첨가를 필요로 한다. 겔은 50% 메타놀/10%아세트산의 코오마시 브릴리언트블루 R(0.25%)에서 2시간 동안 배양되고 30%메타놀/10%아세트산에서 밤새도록 탈색된다.

멜라닌 생성물의 정량

PT7-7, pBGC619, pBGC620.2 및 pBGC620.3이 정착된 E. coli K38/pGPl-2의 한밤배양은 50㎖의 신선한 LB브로쓰로 희석되고 30℃에서 5시간동안 배양된다. 그 배양액은 42℃의 진탕 수조에 30분동안 접합전달된다. 그 배양액을 30℃로 온도를 낮춘다. CuSO₄,·5H₂0 (0.2mM)와 L-티로신 1.5g/ℓ)이 그 배지에 첨가된다. 그 배양액은 24시간 동안 배양된다.

24시간 배양액은 물로 1:10 희석되고 pT7-7벡타콘트룰을 블랭크로해서 DMS200 바리안(Varian) 스캐닝 분광광도계로 해독된다. E. coli/pBGC620.3의 배양액은 검은 색소를 나타낸다. 검은 색소를 나타내는 희석된 배양액은 모든 샘플에서 거의 동일하게 400-700nm사이의 넓은 흡수 프로파일을 나타낸다. 정량은 670nm에서 측정했다.

티로시나제의 정량분석

한밤 배양액(전술한것과 같은)은 50㎖의 신선한 LB브로쓰에 1:50으로 희석되고 30℃에서 5시간 동안 배양된다. 다음에 그 배양액은 42℃의 진통수조에 30분동안 접합전달되고 30℃에서 90분동안 재생된다. 그 배양액의 부분표본(20㎖)이 5분동안 6000g에서의 원심분리해서 얻어진다.

E.coli내의 티로시나제의 분석을 위해, 100mg 습윤중량의 세포는 세척되고 1㎖의 50mM Hepes-KOH완충제(pH6.8), 1㎖의 페닐메틸-설포닐 플루오라이드 및 1㎖의 디티오트레이톨에 재현탁된다. 그세포는 Choudary Anal, Biochem. 138, 425(1984)로 부터 변형된 바와같이 100㎕톨루엔 : 에탄올(1:4, v/v)를 첨가한 후에 30초 동안 와류(vortexing)에 의해 침투시킨다. 다음에 세포의 부분표본(50㎕)이 1㎖의 50mM Hepes-KOH(pH6.8), CuSO₄·5H₂0(0.2mM) 및 과량의 포화된 L-도파(18mM)로 실내온도에서 분석된다. L-도파를 도파크롬으로 산화시키는 것이 정합 석영 큐벳에서 10분이상 475nm에서 스펙트로포토메트리로(DMS 200, Varian)모니터된다. 기준 큐벳은 pT7-7벡터 온리(vector-only)세포와 함께 완전 효소혼합물을 포함한다. 그 효소 활성량은 3600의 도파크롬 몰 소멸계수를 이용하여 구배에서의 초기 상향변화로부터 계산된다. [Lerch, K.et al., Eur. J. Biochem 31 427(1972)]. 고유 활성도는 1분에 1㎖세포를 산화시키는 L-도파의 μmol로 주어진다. pBGC 620.3를 포함하는 E.coli는 8.55의 고유 활성도를 갖는다. pBS1012.7을 포함하는 E.coli는 13.9의 고유활성도를 갖는다. pBS1024를 포함하는 E.coli는 20.01의 고유활성도를 갖는다.

E.coli 세포의 라이소자임/세제용해

E.coli의 세포펠릿은 3-5부피 아이스 콜드 10mM Tris-HC ℓ(pH7.4), 1mM디티오트레이톨(DTT), 0.1mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF), 및 2mg/㎖라이소자임에서 현탁되고 아이스에 2분간 배양된다. 다음에 그 현탁 세포는 0.5%소듐 디옥시콜레이트 및 0.1mg/㎖ DNase I로 조절되고 아이스에 30분간 배양된다. 다음에 현탁세포는 0.2%프로타민설페이트로 조절되고 천천히 교반 되면서 4℃에서 20분간 배양된다. 세포부스러기는 15분동안 15000g에서의 원심분리에 의해 제거된다. 그 상징액은 암모늄 설페이트로 60%포화상태로 조절된다(4℃에서 천천히 교반하면서 1시간동안). 침전된 단백질은 15분 동안 15000g에서의 원심분리에 의해서 제거된다. 단백질 펠릿은 작은 양의 완층제에서 현탁되고 부분표본은 기질로서 L-도파를 사용하여 티로시나제 효소분석을 위해 취해진다. 60%암모늄 설페이트 분설(fraction)에서 고유활성도는 분당단백질 1mg을 산화시키는 L-도파의 양으로 1.73μmol이다.

제3a도는 T7 RNA 전사(리팜피신이 존재, T7 RNA 폴리머라제만이 활성화된 채로 남아있음)로부터 생체에서 합성된 단백질의 SDS-PAGE 오토라디오 그래피를 나타낸다. pBGC 619에서 단일 프로테인 밴드는 티로시나제의 기대사이즈에 일치하는 -30KD에서 관측된다. (제3a도, 레인1). 벡타온리콘트롤은 겔상에 표시된 단백질을 생성하지 않는다. (제3a도, 레인2).

클론 pBGC620.2 및 pBGC620.3에 대해서, 동일한 티로시나제 밴드는 각각의 경우 ∼30KD에서 관측된다(제3a도 레인3,4). 이러한 양쪽 클론에서의 티로시나제에 대한 실험은 pBGC619에 비해 크게 감소되고, 그 차이는 박테리아파아지 T7로부터의 RBS1대 S.antibioticus로부터의 RBS2의 해독(translation)효율에 영향을 미친다. 또한, 제3a도는 ORF438(레인3)의 ∼12KD아우트-오브-프레임 해독과 클론 pBGC620.2 및 pBGC620.3으로부터의 -15KD(레인4)의 전체길이 (full-length) ORF438프로테인을 각각 나타낸다. -15KD의 정확한 사이즈, 전체길이 ORF438프로테인을 생성하는 클론 pBGC620.3은 우수한 멜라닌 생성제이라는 것을 알았고 시험관에서 최고 레벨의 티로시나제 활성도를 나타낸다. (아래를 참조). 추가의 클론 pBS623은 티로시나제 없이 ORF438프로테인을 코딩한다. ORF438프로테인은 pBGC620.3 또는 pBS623이 정착된 E.coli형질전환체에서의 총세포 프로테인의 대략 5%까지 발현된다.

코오마시 염색된 겔에서, 벡터-온리 콘트롤에 비해 티로시나제의 증가된 레벨은 어떠한 유전자 구조에 대해서도 검출되지 않는다(제3b도). 이것은 겔상의 높은 백그라운드를 생성하는 E.coli에서의 다른 내생 단백질에 일부 기인한 것이다. 그러나 클론 pBGC620.3에서 염색가능한 주 단백질밴더는 전체길이 ORF438단백질에 상응한 ∼15KD에서 관측된다(제3b도 레인4). pBGC620.3으로부터 발현된 유도 ORF438단백질은 정량적으로 세포내의 주 단백질이다.

높은 레벨의 멜라닌 색소는 클론 pBGC620.3을 포함하는 플레이트상에서만이 축적되고, 상기 오토라디오그래피에서 나타낸 바와 같이, 이것은 티로시나제 및 전체길이 ORF438 단백질을 생성하는 유일한 클론이다. 또한 물론 pBGC620.2는 한밤배양후의 소량의 멜라닌을 생성하지만 그 레벨은 pBGC620.3에 비하면 크게 작은 것이다. pBG619 및 벡터-온리콘트롤의 클론은 한천 플레이트상에서의 한밤 배양후의 어떤 멜라닌 착색도 나타내지 않는다. 클론 pBGC620.3으로부터의 멜라닌 생성은 한천 플레이트상의 구리 및 L-티로신의 첨가에 의존된다.

열유도에 따른 한밤 배양의 비교는 L-티로신 (A), N-아세틸-L-티로신(B), 및 L-티로신 에틸 에스테르(C)를 갖는 클론 pBGC620.3을 위해 수행된다. 양쪽의 티로신 동족은 황색으로부터 갈색까지의 다양한 색상의 범위내의 강력한 착색이 이루어진다. 또한, 클론 pBGC620.3내의 L-티로신으로부터의 짙은 검은 멜라닌 색소의 증가는 한천 플레이트에 Fe⁺⁺⁺이온(FeC1₃)을 첨가함으로써 크게 자극된다.

시험된 각각의 기질에 의해서, 멜라닌 색소는 E.coli콜로니 및 주위 한천 배지내에서 가시적이다. 기능적인 티로사나제 유전자가 결핍된 E.coli콘트롤은 어떠한 색소도 생성하지 않는다.

또한, pBGC620.3의 액체배양액에서 구리 및 L-티로신 존재하에 열이 유도되고 30℃에서 한밤배양될때 강력한 멜라닌의 착색을 나타낸다. pBGC620.3의 액체 배양액에서의 멜라닌의 형성은 최대의 색소 생성을 위해 열유도에 따른 배양시간은 24-48시간을 필요로 한다. E.coli벡터 온리 콘트롤은 같은 배지에서의 하룻밤동안의 배양과 유도후에도 어떤 비저블 멜라닌을 결코 나타내지 않았다.

상기 세개의 다른 유전자 구조들이 정착된 E.콜리배양액에서 생성된 멜라니양 또한 측정된다. 클론 pBGC620.3은 액체 배양액(표1)에서의 하룻밤 동안의 배양과 열 유도 후에는 훨씬 더 우수한 멜라닌 생성제였다. 이러한 배양액은 강렬한 검정색 멜라닌 표현형을 나타냈고, 벡터조절을 한후에 OD670nm의 3.82흡수단위를 생성했다. 670nm에서의 그 멜라닌 흡수의 대부분은 성장배지에서 세포외적으로 배치된다. 멜라닌 생성은 와일드 타입의 티로시나제(pBGC620.2)로 아웃-오브-프레임 ORF438단백질을 만든 액체 배양액에서 두드러지게 감소된다. (8%의 pBGC620.3레벨까지).

우리는 상기 ORF438씨퀀스(pBGC619 : 표1)없이 티로시나제 융합 프로테인을 생성한 하룻밤 동안의 배양에서 어떤 멜라닌 흡수도 검출할 수 없다. 그러나 더 긴시간의 pBGC619의 배양액들은 벡터 백그라운드(데이타에는 나타나 있지않음)위에 있었던 약한 멜라닌 염색(72시간 이상 유도후)을 정말로 보여주었다.

세포내적인 티로시나제 활성은 E.coli의 열유도 액체 배양액으로부터 세포펠릿에서 측정된다. 상기 가장 높은 효소 활성은 클론 pBGC620.2와 pBGC620.3(표2)로부터 세포펠릿에서 발견된다. 그러나 이러한 클론들에서 상대적 레벨의 티로시나제 활성은 상기 최종 멜라닌 수율에 비례하지 않는다(표1).

그러므로 이러한 두 클론들 사이의 불균형은 기능적인 ORF438단백질의 존재 또는 부재에 기인한다. 단지 매우 낮은 레벨의 티로시나제 활성은 pBGC619클론에서 검출되며 (표2), 하룻밤 동안의 배양후에 한천 플레이트 상 또는 액체배양액에서 멜라닌 표현형을 나타내지 않는다(표2). 우리는 상기 효소 분석의 타임코스에 대한 PT7-7벡터 조절세포들에서 어떤 백그라운드 티로시나제활성을 발견할 수 없었다. 추가로 상기 유도된 배양액중 어떤것도 검출할 수 있는 세포 외적인 티로시나제 활성을 가지고 있지 않다. 티로시나제는 효소 활동이 가장 높을때 열 유도 두시간후에 측정된다.

배양액은 물에 1:10으로 희석되며, 상기 pT7-7벡터콘트롤을 블랭크로해서 측정했다.

펠릿세포 1㎖당 1분에 산화된 L-도파의 μ mol.

E coli에서의 멜라닌 수율은 건조중량으로 0.2∼3.0g/ℓ였다.

[실시예10]

S. antibioticus ATCC 8663은 NZ 아미노배지 (Katz, E.Goss, W.A.Biochem J. 73 : 458(1959)참조)에서 배양된다. 총 헥산은 Hopwood, D.A. etal., supra 실시예2, (1985)의 방법에 의해 분리되었다. S. anti-bioticus 8663 DNA는 상기 pIJ702티로시나제 유전자(1.5Kb bC1I 단편)와 함께 프루브된다. 써던 블로팅 분석은 많은 제한 위치들과 DNA단편 크기들은 S.antibioticus 티로시나제 유전자들 사이에서 보존된다는 것을 밝혔다. 또한 써던 블로팅 데이타는 6-8 Kb SacI/BamHI 단편이 상기 S.antibioticus 8663 제놈으로부터 클로닝 될 수 있음을 나타내었다. 그리고 이 단편은 ORF438 유사 씨퀀스의 3'말단, 완전한 8663 티로시나제 코딩 씨퀀스 및 상기 티로시나제 코팅 씨퀀스에 6Kb의 DNA(3')를 포함하고 있음을 나타내었다.

pBS620.3(전에 명명된 pBGC620.3)는 티로시나제(pIJ702)유전자의 3'말단근처 BclI사이트를 삽입함으로써 pBS1012.7을 만들기 위해 변형되어졌다. 제4도를 보면, ORF438의 3'말단과 완전한 pIJ702티로시나제를 포함하는 pBS1012.7로부터 890 bp SacI/BclI단편이 제거되어졌다.

S. antibioticus 8663 염색체 DNA는 SacI/BamHI으로 소화되어 지고 6-8Kb DNA단편은 마침내 저 용융 한천으로부터 회수되었다. 상기 SacI/BamHI 단편은 상기 890 bp단편이 제거 되어진 pBS1012.7에 연결되고 E. coli K38(pGP1-2)에 형질전환 되었다. 형질전환된 E.coil C-600의 플라스미드 DNA가 E.coil K38(pGP1-2)에(형질전환되었다. 형질전환된 E.coli는 플레이팅되고 30℃에서 하룻밤동안 배양되고 1시간 동안 42℃에서 열충격되었고, 그후 30℃에서 배양되었다.

멜라닌을 생성한 클론은 S.antibioticus ATCC 8663의 ORF438유사 씨퀀스와 S. antibioticus IMRV 3720의 ORF438사이에 하이브리드를 포함하는 pBS1018을 나타내고 있다. pBS1018(제 4, 5도)의 플라스미드 지도는 상기 8663티로시나제 유전자는 상기 PIJ702티로시나제와는 다르다는 것을 나타낸다. (상기 BclI 위치부터 SalI위치 85bp의 손실과 스톱코돈) 또한 상기 티로시나제 유전자에 DNA 3'의 6kb는 언급된 것처럼 클로닝 되어 있다. pBS1018(제6도)의 몇가지 삭제 유도체나 서브브클론들(pBS1022, 1024, 1025, 1026)은 티로시나제 3' DNA의 여러 길이들은 멜라닌 생성과 티로시나제 발현에 미치게 될 영향들을 연구하기 위해 준비되어져 있다.

pBS1012.7, pBS620.3, pBS1018, pBS1022, pBS1024, pBS1024 또는 pBS1026을 정착시킨 E.coli K38/pGP1-2의 액체배양액은 42℃에서 열충격(유도)되고 [³⁵S]메티오닌으로 펄스 라벨되어 있다. 제7도는 ∼30KD와 -15KD에서 단백질 밴드들의 존재와 티로시나제의 예상된 크기의 pBS1012.7, pBS1018, pBS1022. pBS1024, pBS1025 및 pBS1026각각으로부터 각각의 ORF438단백질을 도시하고 있다.

열유도된 액채배양액에서 멜라닌 침착은 OD670nm에서 결정되어진다. pBS1024는 우수한 멜라닌 생성제로 결정되어진다. pBS620.3은 콘트롤로서 사용되어진다. 제8도를 보면 pBS1024에서의 멜라닌생성은 사용된 전구체에 따라 건조중량으로 0.2∼3.0g/ℓ의 범위에 있다.

[실시예11]

E.coli K38 (pGP1-2)/PBS1024 또는 pBGC620.3)은 N-아세틸-L-티로신으로 보충된 액체배양액에서 배양되었다. 핑크색소는 배양배치로부터 분리 되어 있다.

[실시예12]

E.coli K38 (pGP1-2)/pBGC620.3 또는 pBS1024는 L-티로신에틸에스테르로 보충된 액배지내에서 배양되었다. 노란색소가 성장배지로부터 분리되어 있다.

[실시예13]

E.coli K 38 (pGP1-2)/pBGC620.3 또는 pBS1024는 N-아세틸-L-티로신으로 보충된 액체배상액에서 성장되었다.

[실시예14]

pBS 636 준비

플라스미드 pBS130은 제11도 및 12도에 도시된 바와같이 준비되어 있다. 간단하게, pIJ702는 pIJ702 + BR322를 생성하기 위하여 pBR322에 클론된다. 이 플라스미드는 Sac I 및 PvuⅡ로 소화되고 mel유전자를 포함한 단편은 분리된다. pBluescript KS(-)는 Sac Ⅰ 및 Eco RV로 소화되고, 이 큰 단편은 pBS110을 생성하기 위하여 pIJ702+pBR322의 Sac I/Pvu II 단편에 연결된다. mel 유전자를 포함하는 Sacl/Pvu II단편은 pBS110로부터 분리되고 pUC19로부터 큰 Sac I/Pvu II 단편에 연결되어 pBS115를 생성한다. mel-유전자를 함유하는 Hind III/EcoRI 단편 pBS115로부터 분리되고 pBluescript KS (+)로부터 큰 Hind III/Eco RI 단편에 연결되어 pBS120을 생성한다. mel-유전자를 함유한 Xho I/Sma I 단편은 pBS120으로부터 분리되고, Xho I 링커가 더해지고 Xho I로 소화되고 pBluescript KS (+)의 Xho I위치로 클론되어 pBS130을 생성한다.

플라스미드 pBS620.3은 티로시나제 활성을 파괴하기 위하여 구역 954-1221을 제거하도록 Sal I 부분적으로 소화된다. 단편은 제16도와 같이 pBS623을 생성하기 위하여 분리되어 재연결된다. mel 플라스미드 pBS623을 함유한 E.coli 스트레인은 와일드형 티로시나제보다 더 짧은 69아미노산인 절단형 불활성 티로시나제를 생성한다.

플라스미드 pBS634는 제13도에 도시되어 있는 바와같이 준비되어 있다. 간단하게, mel-유전자를 함유한 pBS130으로부터의 EcoRI 단편(ORF438/pIJ702의 티로시나제)은 pMac5-8 및 pMc5-8의 EcoRI위치에 클론된다. Nde I 위치는 Meth. Enzvmol. 154,350, 크라머 및 프리츠의 프로토콜에 따른 올리고뉴클레오티드형 돌연변이 유발을 사용한 티로시나제의 출발코돈에서 조작되어 플라스미드 pMc/mel NdeI #2를 생성한다. pBS623이 Hind III으로 소화되고 Klenow 단편으로 채워지고 Sac I와 다이제스트되어 Sac I/Hind III 단편을 제거한 후 티로시나제의 출발코돈에서 Nde I위치와 mel-유전자를 함유한 pMc/mel Nde I #2의 Sac I/EcoRV 단편은 pBS623으로 클론된다.

결과적인 벡터는 pBS634와 동일하고 그 지도는 제14도에 도시되어 있다.

ORF-티로시나제 유전자를 함유한 pBS634로부터 Ndel I/Bcl I 단편은 제15도에 도시된 pBS635를 생성하기 위하여 분리되어 pT7-7으로 클론된다. 티로시나제 코딩씨퀀스는 pBS635에서 유전자 10리보좀 결합 위치(RBS) 및 T7 프로모터뒤에 선택적으로 위치한다. 새로이 제조된 T7프로모터/RBS/티로시나제 코딩 씨퀀스를 함유한 pBS635로부터의 Bgl II/Bcl I단편은 pBS623의 Bgl II위치로 클론되어 제17도에 도시된 pBS636을 생성한다. 제17도에 도시한 바와같이, pBS636은 ORF 438 및 티로시나제 유전자를 독립적으로 움직이는 2개의 T7 프로모터를 가진다. 각각의 유전자는 그 고유의 리보좀 결합 위치 대신에 T7리보좀 결합 위치를 이용하도록 제조된다.

[실시예15]

E.coli. K38(pGP1-2)/pBS620.3 또는 pBS636은 실시예9에 설명된 바와같이 배양하고 멜라닌 생성을 위해 분석된다. 멜라닌 제조에서 적어도 4개의 폴드(fold)증가는 pBS620.3과 비교해 볼 때 pBS 636와 함께 보인다.

본 발명은 바람직한 실시예의 상세한 설명을 참조하여 개시하였지만, 그 개시는 권리를 제한하는 것이 아니라 예시적인 것이며, 본 발명의 기술적 사상 및 청구범위 내에서 본 발명의 숙련자가 쉽게 변형할 수 있을 것이다.

Claims

완화된 발효조건에서 배지의 멜라닌 농도가 건조중량으로 1ℓ 당 적어도 0.2g이 될 때까지 멜라닌 생성미생물을 배양한 후 성장배지로부터 멜라닌을 추출하는 멜라닌제조방법에 있어서, 상기 미생물이 멜라닌 생성 효소를 코딩하고 있는 제 1 DNA 서열, 세포로부터의 효소의 분비과정에 또는 아포효소(apoenzyme)에 이온을 전달하는 메탈로치오네인(metallothionein)유사 단백질인 트랜스 활성제(trans-activator)로 작용하는 활성제를 코딩하는 염기서열로서, 상기 염기서열이 멜라닌 생성 스트렙토마이세스의 티로시나제 유전자의 멜로커스(mel locus)에 위치한 ORF를 코딩하는 서열로부터 선택되는 제2 DNA 염기서열과, 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스의 티로시나제의 ORF3의 멜로커스(mel locus)로부터의 707bp BcII-SphI 단편(fragment)으로 구성된 제3 DNA 염기서열을 구비한 벡터(vector)로 형질전환된 미생물인 것을 특지으로 하는 멜라니제조방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물이 세균(bacterium) 또는 진균(fungus)인 것을 특징으로 하는 멜라닌 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 세균이 스트렙토마이세스속균 또는 대장균속균인 것을 특징으로 하는 멜리닌 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스속균은 스트렙토마이세스 리비단스 TK64 또는 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스 중에서 선택되고, 대장균속균은 대장균인 것을 특징으로 하는 멜라닌 제조방법.
제1항 내지 제4항중 어느 한항에 있어서, 상기 제1 DNA 염기서열이 산화환원효소(oxidorejuctase), 티로신가수효소(tyrosin hydroxylase), 티로시나제(tryosinase), 라크효소(laccase), 및 폴리페닐옥시디아제(polyphenyloxidase) 중에서 선택된 하나의 생성물을 코딩하는 것을 특징으로 한는 메라닌 제조방법.
제1항 내지 제4항중 어는 한항에 있어서, 상기 제2 DNA 염기서열이 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스계 IMRU 3720의 멜로 커스(mel locus)로부터의 ORF438 또는 스트렙코마이세스 안티바이오티쿠스계 IMRU 3720의 멜로커스(mel locus)로부터의 ORF438 유전자와 스트렙토마이세스 안티바이오티쿠스계 ATCC 8663의 멜로커스(mel locus)로부터의 ORF438 유전자의 융합(fusion) 유전자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 멜라닌 제조방법.
제1항 내지 제4항중 어는 한항에 있어서, 성장배지에서 탄수화물을 제외한 것을 특징으로 하는 멜라닌 제조방법.
제1항 내지 제4항중 어는 한항에 있어서, 성장배지가 하나 또는 하나이상의 멜라닌 전구체를 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 멜라닌 전구체가 카제인하이드로라이세이트(casein hydrolysate) 또는 카제인펩톤인 것을 특징으로 하는 멜리닌 제조방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, (a) 상기 전구체가 1-시스테인에틸에스테르, 3-니트로-L-티로신, 3-플루오로-DL-티로신, 3-메톡시-L-티로신, L-프롤린, (±)-시네프린, DL-m-티로신, 3-아이오도-L-티로신, 3,4-디히드록시-시남산, 글리실-L-티로신, L-B-3, 4-도파 메틸에스테르, DL-옥토파민, 4-히드록시인돌, 티라민, L-시스테인, L-메티오닌, 5,6-디메톡시이돌, (-)-아테레놀, 5-하이드록시-D-도파, D-도파, 5-히드록시트립타민, L-티로신에틸에스테르, L-티로신 및 L-도파로 구성된 그룹에서 선택되거나; 또는 (b) 한 전구체는 티로신이고 또 한나 또는 그 이상의 전구체가 1-시르테인에틸에스테르, 3-니트로-L-티로신, 3-플루오로-이-티로신, 3-메톡시-L-티로신, L-프로린,(±)-시네프린, DL-m-티로신, 3-아이오드-L-티로신, 3, 4-디히드록시-시남산, 글리실-L-티로신, L-B-3, 4-도파 메틸에스테르, DL-옥토파민, 4-하드록시인돌, 티라민, L-시스테인,L-메티오닌 5,6-디메톡시인돌, (-)-아테레놀, 5-하이드록시-D-도파로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 멜라닌 제조방법.
제1항 내지 제4항중 어느 한항에 있어서, 상기 성장배지가 CuSO₄5H₂O를 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 제조방법.
제1항 내지 제4항중 어는 한항에 있어서, 상기 생성된 멜라니을 pH 2-4에서 침선시키거나 또는 역삼투에 의해 추출하는 것을 특징으로 한는 멜라닌제조방법.
제1항 내지 제4항중 어는 한항에 있어서, 상기 벡터가 포로모터(promotor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 제조방법.