KR100486790B1 - 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법 - Google Patents

Abstract

S. 코엘리콜러로부터 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자(sodN)를 클론하는 클로닝 단계 및 S. 리비단스를 상기 클론된 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자로 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(NiSOD)의 제조방법은 의약품 뿐만 아니라 식품 첨가물, 화장품 등에 응용할 수 있는 NiSOD를 과량으로 생산할 수 있다.

Description

니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법

[산업상 이용 분야]

본 발명은 니켈(Ni)을 보조인자(cofactor)로 함유하는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD)(NiSOD)의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)를 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Stereptomyces coelicolor)의 NiSOD 유전자로 형질전환하여 NiSOD를 과량 생산하는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

수퍼옥사이드(superoxide, SO)는 산소 분자에 대한 단일-전자 수송에 의해 생성되는 반응성 산소 종(species)의 하나이다. 이것은 장기 이식, 심장 허혈 등으로 조직의 혈류량이 감소한 후 혈액이 다시 흐르게 되어 산소가 조직에 과다 공급되거나, 매크로파아지 또는 백혈구에 의해 항원 항체 복합체가 생성되는 등의 외적 자극들에 의해 생성된다. 이것은 식세포내에 생성되며 이 식세포는 포식한 이물질을 분해하는 역할을 하므로 병해 미생물 등을 파괴하는 유용한 면을 갖지만, 과다하게 생성되면 식세포 밖으로 분비되어 다른 조직에 장해를 일으키므로 생체에 독성을 미치게 된다. 따라서 생체는 조직 장해를 일으키는 과량의 SO를 분해하는 SOD를 생산하여 조직을 방어하고 있다.

SOD는 SO 음이온의 불균일화 반응을 촉매하여 과산화수소와 산소 분자로 만든다. 이것은 SO 외에 과산화수소, 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 싱글렛 산소(singlet oxygen)와 같은 반응성 산소 종의 세포 독성 효과로부터 생체 세포를 보호하는데 중요한 역할을 한다.

SOD는 금속 보조인자에 따라 세 그룹으로 분류된다; 망간 SOD(MnSOD), 철 SOD(FeSOD) 및 구리 및 아연 SOD(CuZnSOD). 최근 니켈을 보조인자로 함유하는 신규한 형태의 SOD가 몇몇 스트렙토마이세스 spp.에서 발견되었다(대한민국 공개특허공보 제 97-27292 호). MnSOD는 세균 및 진핵 세포들의 미토콘트리아에서 널리 발견되었다. FeSOD는 원핵 세포들, 원시 진핵 세포들 및 일부 녹색 식물들에서 발견되었다. 진핵 세포의 세포질에서 특징적인 SOD인 CuZnSOD는 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 해모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 및 E. 콜라이(Escherichia coli)를 포함한 몇몇 세균들에서도 발견되었다.

S. 코엘리콜러 뮬러(S. coelicolor Muller)는 니켈 또는 철 및 아연을 함유하는 두가지 유형의 SOD(NiSOD 또는 FeZnSOD)를 갖는다. NiSOD는 촉매적 보조인자로서 주요 역할을 담당하는 것으로 제안된 Ni(Ⅲ)의 서브유닛 몰 당 0.74몰의 니켈을 함유하는 13.4kDa의 호모테트라머이다. N-말단 아미노산 서열은 기타 알려진 SOD의 것들과는 상이하다. S. 코엘리콜러에 있는 두 SOD들은 성장 배지에서 니켈 농도에 따라 차별적으로 발현되는 것이 증명되었다. 충분한 Ni²⁺의 존재하에서는 NiSOD가 유도되고 FeZnSOD가 억제된다. 니켈 결핍 조건하에서는 NiSOD가 억제되는 반면 FeZnSOD의 발현이 증가한다. 각 SOD 활성의 변화는 SOD 폴리펩티드의 수준의 변화와 일치하여 Ni²⁺에 의한 조절은 생합성 단계에서 일어남을 가리킨다.

상기한 SOD들은 신장이나 심장의 이식, 심근 경색, 뇌경색 등의 치료 후 재환류 장해 방지, 류마티스성 관절염의 치료, 체외 수정란의 보호, 화상 피부의 치료, 신생아 호흡 궁박 증후군의 치료 등을 위한 의약품 뿐만 아니라 식품 첨가물, 화장품 등에 유용하게 사용될 수 있다. 이를 위해서는 SOD를 과량으로 생산할 수 있는 방법이 개발되는 것이 요구되는 바, 스트렙토마이세스 sp. IMSNU-1(국제기탁 제 KCTC 0188BP 호) 및 스트렙토마이세스 코엘리콜러A(3)2로부터 NiSOD를 추출하는 공정을 포함하는 NiSOD의 생산방법이 알려져 있으나(상기 대한민국 공개특허공보 제 97-27292 호), NiSOD를 엔코드하는 유전자(sodN)의 분리, 그의 발현 및 조절의 분석이 부족하였으며 그 NiSOD의 생산량 또한 미흡한 수준에 불과하다는 문제점이 있었다.

본 발명의 목적은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 S. 리비단스를 S. 코엘리콜러의 NiSOD 유전자로 형질 전환하여 NiSOD를 과량 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 S. 코엘리콜러로부터 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자를 클론하는 클로닝 단계 및 S. 리비단스를 상기 클론된 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자로 형질전환하는 형질전환 단계를 포함하는 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법을 제공한다.

상기 S. 코엘리콜러는 S. 코엘리콜러 뮬러(ATCC 10147)이고, 상기 S. 리비단스는 S. 리비단스 TK24인 것이 바람직하다. 또한 상기 S. 리비단스는 야생형 또는 ΔsodN 돌연변이주인 것이 바람직하다. 상기 클로닝 단계는 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자의 N-말단 14개 아미노산에 해당하는 올리고누클레오티드에 하이브리디제이션(hybridization)되는 S. 코엘리콜러의 1.6kb SalⅠ 단편을 pUC18의 SalⅠ 절단 위치로 클론하여 pEK2를 제조하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 형질전환 단계는 상기 pEK2의 1.57kb SphⅠ단편을 pIJ702의 SphⅠ절단 위치로 클론하여 pIJSODN을 제조하고, S. 리비단스를 상기 pIJSODN으로 형질전환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 클로닝 단계는 S. 코엘리콜러의 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자의 염기 서열로부터 프라이머(primer)를 합성하여 PCR에 의해 상기 유전자를 제조하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 상기 형질전환된 S. 리비단스를 니켈 첨가하에 배양하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하고, 상기 첨가된 니켈은 약 200μM의 NiCl₂인 것이 더욱 바람직하다. 또한 상기 형질전환된 S. 리비단스를 니켈을 첨가하지 않고 배양하여 얻은 세포 추출액에 니켈을 첨가하는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 니켈을 첨가하는 단계는 약 200μM의 NiCl₂를 얼음에서 10시간 이상 반응시키는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 S. 리비단스 TK24의 ΔsodN 돌연변이주에 pIJSODN을 도입한 제 KCTC 0419BP 호로 기탁되어 있는 S. 리비단스 TK24/pSCSODN1을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 기술하면 아래와 같다.

본 발명에서는 S. 코엘리콜러로부터 NiSOD 유전자를 분리하기 위하여 NiSOD의 N-말단 14개 아미노산에 해당하는 변성 41-mer 올리고누클레오티드(SODN1)를 합성한다. 상기 SODN1을 게놈 S. 코엘리콜러 DNA의 서던 분석에서 프로브로 사용하며 이것은 다양한 제한 효소로의 분해 후 하나의 단편에 하이브리디제이션된다. 상기 SODN1에 하이브리디제이션되는 1.6kb SalⅠ 단편을 pUC18로 클론하여 pEK2를 제조한다. 또는 S. 코엘리콜러의 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자의 염기 서열로부터 프라이머를 합성하여 PCR에 의해 상기 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자를 제조한다.

에드만 분해(Edman degradation)에 의해 결정된 정제 NiSOD의 N-말단 아미노산 서열을 함유하는 ORF를 동정함으로써 클론된 유전자 서열에 대해 개시 메티오닌 코돈이 정제 효소로부터 결정된 N-말단 히스티딘의 업스트림에 위치하여, 추정 1차 해독 산물의 14번째 및 15번째 성분들(Ala 및 His 성분들) 사이에 단백질 분해성 절단이 일어남을 알수 있다. N-말단에 히스티딘을 갖는 폴리펩티드의 유추 분자량은 13,201Da으로, 정제된 NiSOD 서브유닛의 측정 크기인 13.4kDa과 잘 일치한다. 전체-길이 폴리펩티드(131 성분들)는 14,703Da으로 측정된다. 유추 ORF의 아미노산 조성은 산 가수분해 및 HPLC 분석에 의해 결정된 정제 NiSOD의 것과 잘 일치한다(결과는 도시하지 않음). sodN의 해독 서열은 GenBank/EMBL/DDBJ 서열 데이터베이스에서 기타 공지의 동정 단백질들에 대해 어떠한 유사성도 나타내지 않는다. 이것은 117개 성분들내에 6개 히스티딘과 2개 시스테인을 함유하는데, 니켈 결합에 대한 리간드들로 작용할 수 있다. 2차 구조는 4개의 가능한 α-나선을 함유하는 것으로 추측된다. 전체-길이 폴리펩티드에서조차 어떤 중요한 소수성 부위도 발견되지 않고, 이는 세포 추출액의 가용성 부분에서 NiSOD가 탐지되는 것와 일치한다.

한편 Ni²⁺는 NiSOD 폴리펩티드의 합성을 조절한다. sodN mRNA의 5' 및 3' 말단의 S1 맵핑으로 Ni²⁺가 모노시스트로닉(monocistronic) sodN mRNA의 수준을 그의 반감기를 변화시키지 않으면서 9배 이상 증가시킴을 알 수 있으며, 따라서 Ni²⁺가 전사를 조절함을 알 수 있다. Ni²⁺가 충분히 존재하지 않는 조건하에서 전구체 및 거의 SOD 활성이 없는 가공된 NiSOD 폴리펩티드가 S. 리비단스내에 클론된 sodN 유전자로부터 제조되며 Ni²⁺ 첨가하에서만 가공된 폴리펩티드로 이루어진 활성 NiSOD가 형성된다.

S. 코엘리콜러에서 두 SOD의 발현이 Ni에 의해 차등적으로 조절되고 이것이 효소 활성 보다 단백질 합성 수준에서 일어나는 것은 공지되어 있다. Ni²⁺는 FeZnSOD 단백질의 양을 감소시킴과 동시에 NiSOD 폴리펩티드의 합성을 증진시킨다. sodN의 분리는 Ni이 그의 조절 기능을 수행하는 단계(들)을 확인할 수 있게 하고 이것이 전사 수준에서 일어남을 보여준다. SodN의 in vivo 가공은 상당히 효율적인 것으로 보이며 SodN이 저-Ni 조건하에서 과량 생산될 때만 전구체 형태를 탐지할 수 있다. Ni이 충분히 존재하면 과량 생산된 전구체는 가공된 형태로 완전히 전환된다. SodN 절단의 Ni 의존성은 가공을 저해하는 킬레이트제를 사용하여 확인된다.

반면 E. 콜라이에서는 전체-길이 sodN 유전자를 발현시키면 Ni²⁺ 존재하에서도 SOD 활성이 전혀 없는 NiSOD 폴리펩티드가 제조된다. 그러나 sodN 유전자로부터 N-말단 14개의 아미노산들을 엔코드하는 누클레오티드들을 결실시키면 E. 콜라이에서도 활성 NiSOD의 생산이 가능하게 되고, 이로부터 N-말단 가공이 활성 NiSOD를 제조하는데 필요함을 알 수 있다. E. 콜라이에서 예비 절단된 sodN 유전자를 과량 생산시키면 고 수준의 생산 단백질에도 불구하고 단지 부분적으로 활성적인 NiSOD를 수득하며 이것은 E. 콜라이에서 낮은 효율의 NiSOD 성숙을 반영하는 것이다. 본 발명에서 사용된 Ni 농도 범위에서 Ni은 비특이적 Mg 수송 체계를 통하여 수송될 수 있으므로 상기 결과는 E. 콜라이 세포들에서 세포내 Ni의 불충분한 양으로부터 기인하는 것으로 보이지는 않는다. 그 보다 Ni 도입 뿐만 아니라 NiSOD 폴리펩티드의 적절한 폴딩 및 가공에 특이적으로 필요한 보조 단백질들의 결여에 기인하는 것으로 보인다. 상기 결과들은 세 상이한 단계들에서 Ni에 의한 sodN 발현의 독특한 조절을 밝힌다; 전사, 단백질 분해성 가공 및 활성 중심의 구성. 또한 S. 코엘리콜러에서 sodN 전사 및 단백질 가공을 제어할 뿐 아니라 촉매 보조인자로써 작용하는 다면화된 조절자로서의 니켈의 특유한 역할을 밝히는 것이다.

본 발명에서는 클론된 sodN 유전자의 발현을 조사하기 위하여 S. 리비단스 TK24 세포를 pIJ702에 sodN 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드(pIJSODN)로 형질전환한다. pIJSODN 또는 모체 pIJ702 플라스미드를 갖는 형질전환체들을 영양 한천 고체 배지에서 성장시키고 하기 실시예에 기술되는 바와 같이 젤상에서 활성 염색으로 세포 추출액에서의 그들의 SOD 활성을 분석한다. S. 리비단스 TK24 세포들은 전기영동 운동성 및 항원성이 S. 코엘리콜러의 NiSOD 및 FeZnSOD와 매우 유사한 2개의 SOD를 생산하고, 2개 SOD의 Ni²⁺에 의한 조절 역시 S. 리비단스에서도 보존된다. pIJSODN을 갖는 TK24 세포들을 니켈을 첨가하지 않고 영양 한천 배지에서 성장시키면 약한 활성을 갖는 NiSOD가 생산된다. 그러나 니켈을 첨가하면 클론된 유전자로부터 활성 NiSOD가 생산된다.

상기 세포 추출액을 NiSOD에 대한 폴리클로날 항체들을 사용하여 웨스턴 블랏팅에 의해 분석한다. pIJSODN을 갖는 TK24 세포들은 내재적 NiSOD가 Ni²⁺에 의해 완전하게 유도된 대조구들 보다 약 20 배 많은 SodN 단백질을 생산한다. 상기 결과는 또한 클론된 sodN 유전자의 발현이 더 이상 니켈 제어하에 있지 않음을 가리킨다. 그 대신 다중 카피의 sodN 유전자를 도입하였을 때 니켈이 첨가되지 않은 경우 상당량의 전구체 SodN 폴리펩티드가 축적됨을 관찰할 수 있다. Ni²⁺을 첨가하면 전구체 단백질은 모두 성숙된 크기의 산물로 가공되므로, Ni이 단백질 분해성 절단에 의해 SodN 성숙에 관여함을 알 수 있다. 상기 세포들을 YEME 액체 배지에서 성장시켰을 때에도 유사한 현상을 관찰할 수 있다. pIJSODN를 갖는 세포들은 대조구들 보다 약 10배 많은 NiSOD 활성을 나타내며, Ni을 첨가하지 않은 경우 SodN의 전구체 형태가 관찰된다(결과는 나타내지 않음). 따라서 Ni의 첨가에 의한 NiSOD 활성의 증진은 단백질 분해성 가공 및 촉매적 보조인자로서 Ni 도입으로부터 기인하는 것이다.

본 발명에서는 그 다음으로 E. 콜라이에서 sodN 유전자를 발현하는 것을 시도하였다. pUC18로 클론된 sodN 유전자(pEK2)를 갖는 E. 콜라이 DH5α 세포들은 SodN 단백질을 전혀 생산하지 않는다. E. 콜라이에서 sodN 유전자를 발현하기 위하여 T7 RNA 폴리머라제를 이용하는 pET 벡터 시스템을 사용한다. 2개의 발현 플라스미드들, 전체-길이 sodN ORF를 함유하는 것(pETSODNMet) 및 N-말단 14개 아미노산이 결핍된 단축 ORF를 함유하는 것(pETSODNHis)을 제작한다. 양 발현 제작물은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석에 의해 탐지되는 예상 크기의 NiSOD 폴리펩티드를 과량 생산한다. 과량 생산된 NiSOD는 가용성 및 불용성 부분들에서 탐지된다(결과는 나타내지 않음). 그러나 천연 폴리아크릴아미드 젤상에서 전기영동 후 세포 추출액을 SOD 활성 염색해 보면 과량 생산된 NiSOD는 비활성적인 것으로 나타난다. 세포들을 1mM까지의 NiCl₂를 제공한 LB 배지에서 성장시켰을 때 NiSOD 활성은 pETSODNHis 클론을 갖는 세포들에서만 나타난다. 따라서 NiSOD 전구체 폴리펩티드의 단백질 분해성 절단은 활성 NiSOD의 생산을 위한 전제 조건이고, E. 콜라이 세포들은 NiSOD 가공에 필요한 특정 프로테아제가 결핍되어 있는 것으로 보인다. 고 수준의 과량 생산된 단백질에도 불구하고, 니켈의 첨가에 의해 부분적 활성만이 유발되며, 이것은 E. 콜라이에서 NiSOD 성숙이 비효율적이라는 것을 반영하는 것이다. 10μM 농도의 NiCl₂는 활성 NiSOD를 생산하는데 충분치 않으며, 이것은 Ni 수송 및/또는 도입이 비효율적임을 암시한다. 1mM 농도의 NiCl₂는 E. 콜라이 세포에 독성을 미치는 것으로 밝혀져 성장 저해 및 단백질 과량 생산의 감소를 초래하게 된다.

실시예

본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 나타내는 본 발명의 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

Ⅰ. 세균 균주 및 배양 조건

S. 코엘리콜러 ATCC 10147(뮬러) 및 S. 리비단스 TK24 세포들(영국, John Innes Center, 홉우드로부터 입수)을 홉우드 등(1985) 및 김 등(1996)의 방법으로 성장시켰다. 액체 배양을 위하여 YEME 배지(1% 포도당, 0.5% 박토-펩톤, 0.3% 말트 추출물, 0.3% 효모 추출물, 10%(w/v) 설탕, 5mM MgCl₂) 및 YEMES 배지(YEME + 0.5% 소이톤)에 진한 포자 현탁액(40∼100ml당 >10⁷ 포자)을 접종시켰고 격렬하게 흔들어주면서 2∼3일간 30℃에서 성장시켰다. 고체 배지상에서의 배양을 위하여, 포자들을 영양 한천 또는 R2YE 배지에 도말하였고 2∼3일간 30℃에서 성장시켰다. pIJ702 또는 그의 유도체들을 갖는 세포들을 선별하여 50μgml^-1의 티오스트렙톤(시그마)의 존재하에서 유지시켰다.

DNA 조작을 위하여 E. 콜라이 DH5α를 숙주로 사용하였다. T7 RNA 폴리머라제-유도성 과량 생산 체계의 숙주로 사용하는 E. 콜라이 BL21(DE3)pLysS를 클로람페니콜을 함유하는 루리아-베르타니(LB) 배지에서 성장시켰다. 플라스미드들(pUC18, pET-3a 및 그들의 유도체들)을 갖는 세포들을 50μgml^-1의 앰피실린을 사용하여 선별하였다.

Ⅱ. 재조합 DNA 방법들

플라스미드 DNA, 제한효소 분해, 리게이션, E. 콜라이 컴피턴트(competent) 세포들, S. 리비단스 프로토플라스트(protoplast)의 제조 및 형질전환을 샘브룩 등 (1989)및 홉우드 등(1985)에 의해 기술된 바와 같이, 표준 방법에 의해 수행하였다.

Ⅲ. 플라스미드 서브라이브러리의 제작 및 sodN 유전자에 대한 스크리닝

S. 코엘리콜러 뮬러 DNA 100μg을 SalⅠ으로 분해시키고 0.8% 아가로스 젤상에서 전기영동에 의해 분리하였다. 1.4∼1.8kb 범위에 있는 DNA 단편들을 6개의 젤 슬라이스로부터 전개에 의해 구분하였고, 진클린 키트 Ⅱ(Geneclean kit Ⅱ, 바이오 101)를 사용하여 정제하였고, SODN1 프로브(5'-CAC GGC GAC CTG/C CCG/C GGC GGC GTG/C TAC GAC CCG/C GCG/C CAG GC-3')로 하이브리디제이션시켰다. 프로브 DNA를 ECL 올리고누클레오티드 라벨링 체계(Amersham)를 이용하여 비방사성 라벨시켰고, 하이브리디제이션 및 탐지는 제조자의 지시에 따라 고 스트린전시(stringency)에서 수행되었다. 프로브에 하이브리다이즈되는 DNA 부분을 pUC18에 리게이트시키고 E. 콜라이 DH5α 세포들로 도입시켰다. 형질전환체들을 샘브룩 등(1989)에 의해 기술된 바와 같이 SODN1 프로브로 콜로니 하이브리디제이션에 의해 스크린하였다. 선별된 플라스미드(pEK2)는 1604bp SalⅠ단편의 삽입을 포함하였다. 그 염기 서열의 일부를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에서는 pUC18에 클로닝한 SalⅠ단편(양 끝의 밑줄 친 GTCGAC 부위)의 총 염기 서열 및 그 일련번호를 나타내었다. 상기 염기 서열상에서 단백질로 해독되는 부분은 굵게 표시하였으며 오른쪽 숫자는 NiSOD의 아미노산 서열상의 일련번호를 나타낸다. 1068bp 위치의 밑줄 친 AGATCT 서열은 sodN 유전자의 파괴 여부를 확인할 때 이용하는 BglⅡ 절단 위치이며(도 5 참조) 1552bp 위치의 GCATGC 서열은 pIJ702에 클로닝할 때 이용하는 SphⅠ 절단 위치이다(도 2 참조).

Ⅳ. SOD 활성의 탐지 및 웨스턴 블랏팅

세포 추출액의 제조, 젤 전기영동 및 SOD의 활성 염색을 김 등(1996)의 방법으로 수행하였다. 젤상에서의 SOD 활성을 니트로블루 테트라졸리움을 환원할 수 있는 SO를 제거하는 능력에 의해 탐지하였다(스타인만, 1985).

이하, 상기한 바와 같은 방법을 기초로 하여 실시한 실시예 및 비교예를 기술한다.

실시예 1. 야생형 S. 리비단스에서의 sodN의 발현

야생형 S. 리비단스에서 sodN 유전자를 발현시키기 위하여, 상기 pEK2 유도체로부터의 1.57kb SphⅠ 단편을 pIJ702의 SphⅠ 절단 위치로 클론하여 sodN과 전체 orfX 서열들을 갖는 pIJSODN을 생성시켰다(도 2). 상기 도 2에서 Tsn^R은 pIJ702의 선별에 사용한 티오스트렙톤 내성 유전자의 위치 및 방향을 나타낸다. 그런 다음 야생형 S. 리비단스 TK24 세포를 상기 pIJSODN으로 형질전환하였다. pIJSODN을 갖는 야생형 S. 리비단스를 NiCl₂를 첨가하지 않거나 200μM의 NiCl₂를 첨가한 영양 한천 배지에서 성장시켜 NiSOD의 활성 및 발현량을 조사하였다. pIJSODN을 갖는 균주 및 모체 pIJ702를 갖는 대조구의 세포 추출액 20μg을 각각 전기영동하여 SOD 활성 염색을 실시하였으며 그 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3에서 NiCl₂를 첨가하지 않은 경우에는 pIJSODN을 갖는 균주 및 모체 pIJ702를 갖는 대조구 사이에 SOD 활성의 차이가 거의 없었으며(도 3, A. NiCl₂ 0μM), NiCl₂를 첨가한 경우에는 pIJSODN을 갖는 균주가 모체 pIJ702를 갖는 대조구 보다 약 20 배 높은 SOD 활성을 보였다(도 3, A. NiCl₂ 200μM). 상기 도 3에서 상기 활성의 대부분은 NiSOD에 의한 것임이 확인되었다. pIJSODN을 갖는 균주의 세포 추출액 1μg 및 대조구 세포 추출액 20μg에 대하여 NiSOD에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 그 결과 NiCl₂를 첨가하지 않고 성장시킨 경우에도 NiCl₂를 첨가한 경우와 거의 동일한 양의 NiSOD가 존재함을 알 수 있었다(도 3, B). 그러나 NiCl₂를 첨가하지 않은 경우에는 생산량의 약 50%가 N-말단의 14개 아미노산이 결실되지 않은 전구체 형태로 존재하였다.

실시예 2. NiSOD를 과량 생산한 세포 추출액의 시험관 내에서의 활성화

상기 실시예 1로부터 제조한 pIJSODN을 갖는 야생형 S. 리비단스를 NiCl₂를 첨가하지 않은채로 성장시켜 세포 추출액을 얻은 후 200μM의 NiCl₂를 첨가하여 얼음에서 10시간 이상 반응시켰다. 그 결과를 도 4에 나타내었으며, NiCl₂ 첨가하에 성장시켜 얻은 세포 추출액과 거의 동일한 수준의 NiSOD 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 3. S. 리비단스 ΔsodN 돌연변이주에서의 sodN의 발현

sodN의 중심부위 180bp를 온도 민감성 플라스미드인 pKC1139에 클로닝하여 이것으로 S. 리비단스를 형질전환하였다. 그런 다음 배양 온도를 37℃로 올려 S. 리비단스 게놈상의 sodN 유전자를 파괴하면서 상기 플라스미드가 도입된 S. 리비단스 ΔsodN 돌연변이주를 선별하였다. 선별한 ΔsodN 돌연변이주를 웨스턴 블랏 분석하여 S. 리비단스의 내재적 NiSOD가 발현되지 않는 것을 확인하였고 BglⅡ 절단 위치를 이용하여 게놈 서던 하이브리디제이션으로 재차 확인하였다. 도 5에서 S. 리비단스 게놈상의 sodN 유전자의 파괴를 나타내었다. 상기 도 5에서 Am^R은 pKC1139의 선별에 이용한 아프라마이신 내성 유전자를 나타낸다.

상기 S. 리비단스 ΔsodN 돌연변이주에 pIJSODN을 도입하여 순수한 S. 코엘리콜러 NiSOD만의 발현을 조사해 보았다. 그 결과를 도 6에 나타내었으며 이것으로부터 야생형 S. 리비단스에 도입했을 경우와 마찬가지로 높은 SOD의 발현량 및 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

한편 상기 S. 리비단스 ΔsodN 돌연변이주에 pIJSODN을 도입하여 제조한 S. 리비단스 pSCSODN1는 한국과학기술원 유전자 은행에 1998년 1월 5일자, 제 KCTC 0419BP 호로 국제기탁되어 있다.

비교예 1. E. coli에서의 sodN의 발현

E. 콜라이에서 sodN 유전자를 발현시키기 위하여 sodN 유전자의 2개의 상이한 N-말단 서열들에 해당하는 돌연변이 유발성 프라이머들 NS1(5'-GGAACGCCATATGCTTTCCCGCC-3') 및 NS2(5'-CACGGTCCATATGCACTGCGACCTGCCC-3')을 합성하였다(NdeⅠ절단 위치 밑줄). PCR을 NS1 또는 NS2 및 pTZ18R 플라스미드에 클론된 sodN 주형으로부터 보편적 프라이머로 수행하였다. PCR 산물을 클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하고 그 다음 NdeⅠ 및 BamHⅠ으로 분해하였다. 예상 크기의 DNA 단편들을 BamHⅠ 및 NdeⅠ으로 분해한 pET-3a(Novagen)에 리게이트하여 pETSODNMet 및 pETSODNHis를 수득하였다. E. 콜라이 BL21(DE3)pLysS 세포들을 pETSODNMet, pETSODNHis 또는 pET-3a로 형질전환하였다. 분리된 콜로니들을 픽크하여 50μml^-1의 앰피실린 및 34μml^-1의 클로람페니콜을 함유하는 3ml의 LB 배지에서 3시간 동안 37℃에서 성장시킨 후, 격렬하게 흔들어 주면서 3시간 동안 0.8mM IPTG로 처리하였다. 그 결과 pETSODNMet 또는 pETSODNHis를 갖는 세포들은 높은 SOD 발현량을 나타내나 SOD 활성을 나타내지는 않았다. 상기 LB 배지에서의 배양 시 1mM의 NiCl₂를 첨가한 경우 pETSODNHis를 갖는 세포들에서만 SOD 활성이 나타났다.

본 발명에 따르면 신장이나 심장의 이식, 심근 경색, 뇌경색 등의 치료 후 재환류 장해 방지, 류마티스성 관절염의 치료, 체외 수정란의 보호, 화상 피부의 치료, 신생아 호흡 궁박 증후군의 치료 등을 위한 의약품 뿐만 아니라 식품 첨가물, 화장품 등에 응용할 수 있는 NiSOD를 과량으로 생산할 수 있다.

참조들

홉우드, D. A. 등 (1985) Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. Norwich: John Innes Foundation.

Kim, E-J. 등 (1996) Differential expression of superoxide dismutase containing Ni and Fe/Zn in Streptomyces coelicolor. Eur J Biochem 241: 178∼185.

샘브룩 등 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

스타인만, H. M. (1985) Bacteriocuprein superoxide dismutases in pseudomonads. J Bacteriol 162: 1255∼1260.

도 1은 S. 코엘리콜러 뮬러로부터 클로닝한 sodN 유전자 및 그 부근의 염기 서열을 나타내는 도면;

도 2는 NiSOD를 과량 생산하기 위한 pIJSODN의 제조를 나타내는 도면;

도 3은 야생형 S. 리비단스에서 pIJSODN에 의한 NiSOD의 과량 생산을 나타내는 도면;

도 4는 NiSOD를 과량 생산한 세포 추출액의 시험관 내에서의 활성화를 나타내는 도면;

도 5는 S. 리비단스의 내재적 sodN 유전자의 파괴를 나타내는 도면;

도 6은 내재적 sodN 유전자를 파괴한 S. 리비단스에서 pIJSODN에 의한 NiSOD의 과량 생산을 나타내는 도면.

Claims (12)

1. 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor)로부터 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자를 클론하는 클로닝 단계; 및

   스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)를 상기 클론된 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자로 형질전환하는 형질전환 단계:

   를 포함하는 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 코엘리콜러는 스트렙토마이세스 코엘리콜러 뮬러(ATCC 10147)인 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 리비단스는 스트렙토마이세스 리비단스 TK24인 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 스트렙토마이세스 리비단스는 야생형 또는 ΔsodN 돌연변이주인 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
5. 제 1 항 내지 제 4항에 있어서, 상기 클로닝 단계는 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자의 N-말단 14개 아미노산에 해당하는 올리고누클레오티드에 하이브리디제이션되는 스트렙토마이세스 코엘리콜러의 1.6kb SalⅠ 단편(도 1에 기재된 염기서열)을 pUC18의 SalⅠ 절단 위치로 클론하여 벡터I를 제조하는 단계를 포함하는 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 형질전환 단계는 상기 벡터I의 1.57kb SphⅠ 단편을 pIJ702의 SphⅠ절단 위치로 클론하여 벡터II을 제조하고, 스트렙토마이세스 리비단스를 상기 벡터II(삭제:pIJSODN)로 형질전환하는 단계를 포함하는 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
7. 제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 클로닝 단계는 스트렙토마이세스 코엘리콜러의 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 유전자의 염기 서열로부터 프라이머를 합성하여 PCR에 의해 상기 유전자를 제조하는 단계를 포함하는 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
8. 제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 형질전환된 스트렙토마이세스 리비단스를 니켈 첨가하에 배양하는 단계를 더욱 포함하는 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 첨가된 니켈은 200 μM의 NiCl2인 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
10. 제 1 항 내지 제 4 항에 있어서, 상기 형질전환된 스트렙토마이세스 리비단스를 니켈을 첨가하지 않고 배양하여 얻은 세포 추출액에 니켈을 첨가하는 단계를 포함하는 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 니켈을 첨가하는 단계는 200μM의 NiCl₂ 를 얼음에서 10시간 이상 반응시키는 것인 니켈 함유 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 제조방법.
12. 스트렙토마이세스 리비단스 TK24의 ΔsodN 돌연변이주에 pIJSODN을 도입한 제 KCTC 0419BP호로 기탁되어 있는 스트렙토마이세스 리비단스 TK24/pSCSODN1.