JP4778740B2 - フィターゼ酵素低活性納豆菌及び長期安定な納豆 - Google Patents
フィターゼ酵素低活性納豆菌及び長期安定な納豆 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4778740B2 JP4778740B2 JP2005201339A JP2005201339A JP4778740B2 JP 4778740 B2 JP4778740 B2 JP 4778740B2 JP 2005201339 A JP2005201339 A JP 2005201339A JP 2005201339 A JP2005201339 A JP 2005201339A JP 4778740 B2 JP4778740 B2 JP 4778740B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- natto
- phytase
- strain
- bacillus
- bacillus subtilis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 title claims description 81
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 title claims description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 17
- 230000007774 longterm Effects 0.000 title description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 77
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 claims description 26
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 17
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 16
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 16
- 101100518639 Caenorhabditis elegans phy-2 gene Proteins 0.000 claims description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 14
- 101150110933 PHY gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101100102806 Dictyostelium discoideum vps37 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100096651 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SRN2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 9
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Diphosphoinositol tetrakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 7
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 6
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 3
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229910052567 struvite Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- MXZRMHIULZDAKC-UHFFFAOYSA-L ammonium magnesium phosphate Chemical compound [NH4+].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O MXZRMHIULZDAKC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CKMXBZGNNVIXHC-UHFFFAOYSA-L ammonium magnesium phosphate hexahydrate Chemical compound [NH4+].O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O CKMXBZGNNVIXHC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N inositol Chemical group OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Beans For Foods Or Fodder (AREA)
- Cereal-Derived Products (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、新規納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された新規納豆に関し、さらに詳細には、フィターゼ酵素低活性納豆菌、及び長期安定な納豆に関する。
納豆は発酵終了後、長期間保存することで納豆菌の二次発酵を促し次に挙げる品質の劣化を引き起こす。即ち、チロシン及びストラバイト（リン酸マグネシウムアンモニウム）などの白色析出物が発生し食感を損ねること、豆色の褐変及び菌膜の喪失により外観を悪化させること、アンモニア発生による不快臭の増大などである。
これまで納豆の品質を長期間安定に保つ為、数々の試みが行われてきた。例えば、納豆の容器を酸素透過性の低い材質にし、脱気後密封することで二次発酵の原因である納豆菌の増殖を抑えること（特許文献１参照）、納豆容器中に酸素吸収剤を入れることで二次発酵の原因である納豆菌の増殖を抑えること（特許文献２参照）、納豆菌接種前の蒸煮大豆中に糊化米粉水溶液を添加すること（特許文献３参照）などである。
ただ、上記解決法を行うには容器の変更や添加物の使用など、納豆製造工程におけるコストの増大は避けることができず、そのため納豆菌の育種により、従来法と何ら変わらない製造法による解決法が切望されていた。
特開平７−２３７２８号公報
特開平１０−１６５１３０号公報
特開２００４−２３６５５７号公報
本発明は、製造工程の追加や添加物の使用などを行わず、従来製造法のままで納豆菌の育種により長期間安定で高品質の納豆を開発し、提供することを目的とした。
上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、納豆品質の劣化原因のひとつである白色析出物の発生を解決する為、その構成成分の中でも特にリンにはじめて着目した。即ち、大豆中に含まれるリンの約８５％がフィチン態を形成している点に着目し、フィチンからのリンの遊離を抑え、白色析出物の原資の供給源を絶つことを試みた。
そこで、フィチンからのリンの遊離はこの納豆菌が生産するフィターゼが主原因であることを想定し、フィターゼをコードするｐｈｙ遺伝子を破壊することでフィターゼ活性を欠損させた納豆菌を構築し、該株を用いて納豆を作成し評価を行った。
保存試験の結果、仮説通りに親株と比較して有為に白色析出物の発生を抑えることができた。また、さらに驚くべきことには、納豆品質の劣化原因である豆色の褐変及び菌膜の喪失といった外観の悪化についても親株と比較して有意に改善されることを確認した。よって、フィターゼ遺伝子を欠損させた納豆菌を用いて納豆を製造することにより、納豆品質が親株のそれと比較して有為に改善できたことを見出し、本発明を完成させた。
即ち、請求項１の発明は、脱リン酸化酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項２の発明は、フィターゼ酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項３の発明は、請求項１または請求項２記載の変異領域がプロモーター領域を含むｐｈｙ遺伝子である納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項４の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が遺伝子組換え法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項５の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異が突然変異法により欠損されたことを特徴とする納豆菌を含むバシラス属の菌についてである。請求項６の発明は、親株のｐｈｙ遺伝子を遺伝子組換え法により欠損させてなる納豆菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７）についてである。請求項７の発明は、突然変異法によりフィターゼ酵素活性を欠失させた納豆菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＶＰＳ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）についてである。
請求項８の発明は、請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆についてである。請求項９の発明は、請求項８記載の納豆がスクロースなどの糖源を添加することで製造されたことを特徴とする納豆についてである。請求項１０の発明は、請求項１〜７のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて発酵されたことを特徴とする大豆加工物又は米糠などの穀類についてである。
本発明により、添加物の使用などの工程を加えることなく、該納豆菌で納豆を製造することにより、長期保存条件において、白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆を提供できる。また、本発明によれば、フィチン酸含有培地（選択培地）を用いてハローの形成の有無を確認することにより目的納豆菌をスクリーニングして育種する方法も提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。
フィターゼとは、フィチンを基質としてイノシトール環からリン酸基を遊離させる酵素である（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ：３．１．３．８）。今回は大豆成分からリンの遊離を抑制する為にフィターゼに着目したが、それ以外の脱リン酸化酵素も対象として使用可能であり、これらを１種又は２種以上を処理対象として併用することも可能である。
フィターゼとは、フィチンを基質としてイノシトール環からリン酸基を遊離させる酵素である（ＥＣ ｎｕｍｂｅｒ：３．１．３．８）。今回は大豆成分からリンの遊離を抑制する為にフィターゼに着目したが、それ以外の脱リン酸化酵素も対象として使用可能であり、これらを１種又は２種以上を処理対象として併用することも可能である。
公知の通り、ｐｈｙ遺伝子がコードするフィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）という酵素によりフィチンからリンが遊離されるが、納豆菌ではその酵素の存在が既に報告されている（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５６（８）， １２６６−１２６９， １９９２）（または、特開平６−３８７４５号公報）ものの、納豆菌が生産する中性フィターゼの特性について言及されているものであり、納豆への応用例などは一切記載されていない。ましてや、ｐｈｙ遺伝子の破壊、欠損による納豆における白色析出物の抑制等の納豆の長期安定化については全く知られていない。
また、納豆菌の近縁種である枯草菌でもその存在が知られており（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５１巻、ｐ．１１０２−１１０８、１９８２年」参照）（例えば、「（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６４巻、ｐ．２０７９−２０８５、１９９８年」参照）（例えば、「（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、２６８巻、ｐ．３６５−３６９、２０００年」参照）、その基質特異性や至適条件など酵素の特性が示されている。
本発明で育種改良に用いる元の納豆菌には特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、及びさらに改良を重ねて得られる優れた納豆菌などを用いるのが望ましい。
納豆菌はその形態や遺伝子相同性から、枯草菌バシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）として分類されたり、枯草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏ或いはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ （ｎａｔｔｏ）などと枯草菌と区別して分類する場合もある。納豆菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ＩＦＯ３００９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがある他、各種の納豆菌が広く使用できる。
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や該株の形質転換効率向上性変異株であるｒ２２株（特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ3株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
本発明では、これら納豆菌のフィターゼ遺伝子を破壊し、該酵素活性を欠損させた納豆菌を育種することにより、フィチンを基質としてリンを遊離しない納豆菌を取得する。
育種方法の一つとして相同組換えを利用した遺伝子改良法が採用可能であるが、本方法の利点は標的遺伝子だけを特異的に欠損させることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利用される微生物においては、他の優れた特性は壊さずに、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異を起こさせて改良することができる。
さらに、スタールらが枯草菌バシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において開発した相同組換え能を利用した遺伝子破壊法（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５８巻、ｐ．４１１−４１８、１９８４年」参照）を納豆菌用に改変した方法も利用可能である。この方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去することができる方法であるため、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならないなどの長所を有している。
また、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、納豆菌を遺伝子導入活性が高くなる状態にするいわゆるコンピテンス法（例えば、「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、１９７１年」参照）が利用可能である。
また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、ファージベクターを利用した形質導入法が既に開発されており（例えば、「（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６３巻、ｐ．４０８３−４０８９、１９９７年」参照）、本発明ではこの方法も利用可能である。
本発明においては、上記の育種方法を用いて、納豆菌の脱リン酸に関与する遺伝子を欠損させることによって目的の長期安定な高品質納豆菌を作製する。なお、本発明においては、遺伝子の欠損には、欠失、改変、破壊等を包含するものである。
尚、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、即ち、既に目的遺伝子が欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、薬剤やＵＶ変異法などによってこれらの遺伝子を変異欠損させるなどの突然変異法など、従来から実施されているような他の方法によっても育種が可能である。
ｐｈｙ遺伝子欠損納豆菌、フィターゼ酵素その他の脱リン酸化酵素の活性を低下又は欠失させた納豆菌をスクリーニングするためには、例えばフィチン酸を含有する選択培地（例、ＬＢＰＨ培地）を用い、ハローを形成しない株を選択すればよく、本発明は、このような納豆菌を選択するための選択培地及びこれを利用する有用納豆菌の育種方法も提供するものである。
このようにして開発されたフィターゼ欠損納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２ Ｋｇ／ｃｍ2・１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって育種改良したフィターゼ欠損納豆菌に代えて使用することによって製造される。
このようにして、フィターゼ欠損納豆菌を用いて生産した納豆と、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた納豆とを比較すると、フィターゼ欠損納豆菌で製造した納豆は長期保存条件下において白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆であることが確認できる。
このような長期保存条件下で高品質な納豆を目指した場合、このフィターゼ欠損納豆菌の能力と相乗効果を狙うために、蒸煮大豆中にスクロースなどの糖源を添加して発酵させることにより揮発アンモニア量を抑制させる製造法の併用も有効である。
また、今回の実施例での最終形態は蒸煮大豆を発酵させた納豆となるが、例えば豆乳や米糠といった穀類などを基質としてその発酵物を得る場合、本技術で得た株を用いることで品質の向上が期待できる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）フィターゼ欠損納豆菌の作製
（１）基本条件
フィターゼ活性を欠損させる親株としては、納豆菌バシラス・サチラスｒ２２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｒ２２）株（以下、ｒ２２株と称する場合もある）（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）を用いた。ｒ２２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌であるＯ−２株を、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した形質転換能を高めた変異株である。また、他には大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α）株（タカラバイオ社製）を用いた。プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）及びｐＣ１９４（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
（１）基本条件
フィターゼ活性を欠損させる親株としては、納豆菌バシラス・サチラスｒ２２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｒ２２）株（以下、ｒ２２株と称する場合もある）（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）を用いた。ｒ２２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌であるＯ−２株を、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した形質転換能を高めた変異株である。また、他には大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α）株（タカラバイオ社製）を用いた。プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）及びｐＣ１９４（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
なお、特に記載しない限り、培養条件、培地及びその他の遺伝子組換え技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、２版（１９９２）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ」の記載に従った。
また、基本的な培養は以下の表１（ＬＢ培地組成）に示すＬＢ培地を用いて行った。
また、基本的な培養は以下の表１（ＬＢ培地組成）に示すＬＢ培地を用いて行った。
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅には、Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、反応条件は、Ｅｘ Ｔａｑに添付のマニュアルに従った。
納豆菌の形質転換等は、以下の方法によった。
即ち、納豆菌の染色体ＤＮＡは、市販のキットを使用して調製し、形質転換は「（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９−２２１、１９７１年」の方法に従った。
納豆菌の胞子は、以下の表２（胞子形成培地組成）に示すＳｔｅｒｌｉｎｉ−Ｍａｄｅｌｓｔａｍ置換培地を用いて調製した。
納豆菌の胞子は、以下の表２（胞子形成培地組成）に示すＳｔｅｒｌｉｎｉ−Ｍａｄｅｌｓｔａｍ置換培地を用いて調製した。
（２）ベクター構築
ベクター構築に用いた各ＤＮＡ断片の作製概略を図１に示した。
ベクター構築に用いた各ＤＮＡ断片の作製概略を図１に示した。
即ち、ｒ２２株のｐｈｙ遺伝子領域を含む約５Ｋｂｐの増幅にはプライマー１（配列表の配列番号１（図４）に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２（図５）に記載）を使用した。
ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の増幅には、プライマー３（配列表の配列番号３（図６）に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４（図７）に記載）を用いた。
ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の増幅には、プライマー３（配列表の配列番号３（図６）に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４（図７）に記載）を用いた。
それぞれのプライマーは、ｐｈｙ遺伝子領域をＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ：ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて塩基配列を決定し設計した。また、ｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列は文献情報（例えば、「（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．）、７７巻、１２号、ｐ．７０７９−７０８３、１９８０年」参照）を参考にして設計した。
即ち、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１（図４）に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２（図５）に記載）を用いｐｈｙ遺伝子領域を含む約５Ｋｂｐを増幅した（ＤＮＡ断片１）（図１）。
さらに、ｐＣ１９４を鋳型にしプライマー３（配列表の配列番号３（図６）に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４（図７）に記載）を用いクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅するとともに制限酵素サイトＳｔｕＩを遺伝子両端に導入した（ＤＮＡ断片２）（図１）。
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いてベクターを構築したが、その概略は図２に示した。即ち、ｐＢＲ３２２のマルチクローニングサイト上のＮｒｕＩサイトにＤＮＡ断片１を導入し、次いでＤＮＡ断片１内のＳｔｕＩサイトで切断した。そのＳｔｕＩサイトへＤＮＡ断片２を導入し、プラスミドｐＢＲＰＣ１を得た（図２）。
（３）形質転換
プラスミドｐＢＲＰＣ１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いｐｈｙ遺伝子領域及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む約６Ｋｂｐを増幅したＤＮＡを用いてｒ２２株へ形質転換した。形質転換株の選択はクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。得られた形質転換株バシラス・サチラスｐｈｙ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２）株（以下、ｐｈｙ２株と称する場合もある）のｐｈｙ遺伝子は、塩基番号６３２のＳｔｕＩサイト内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることが、ＰＣＲ法などによる解析によって確認された（図３）。
プラスミドｐＢＲＰＣ１のプラスミドＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いｐｈｙ遺伝子領域及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む約６Ｋｂｐを増幅したＤＮＡを用いてｒ２２株へ形質転換した。形質転換株の選択はクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。得られた形質転換株バシラス・サチラスｐｈｙ２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２）株（以下、ｐｈｙ２株と称する場合もある）のｐｈｙ遺伝子は、塩基番号６３２のＳｔｕＩサイト内にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることが、ＰＣＲ法などによる解析によって確認された（図３）。
このようにして得た形質転換体は、バシラス・サチラス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｈｙ２と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７として国際寄託した。
（実施例２）納豆試作と品質評価
常法に従い、ｒ２２株、およびｐｈｙ２株の胞子液を調整した。即ち、ｒ２２株またはｐｈｙ２株を表１に示したＬＢ培地に１白菌耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表２に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
常法に従い、ｒ２２株、およびｐｈｙ２株の胞子液を調整した。即ち、ｒ２２株またはｐｈｙ２株を表１に示したＬＢ培地に１白菌耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表２に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。即ち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧１．８ＫＰａで１８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のｒ２２株またはｐｈｙ２株の胞子液を滅菌水で１００倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ種菌し、４０℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間熟成して、納豆を調製した。
ｐｈｙ２株を用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られず、ｐｈｙ２欠損変異が納豆菌の生育に影響を及ぼさないことが分かった。
続いて試作により得られた納豆を、熟練した男女各１０名からなるパネルによる官能検査に供した。
その結果、親株（ｒ２２株）と変異株（ｐｈｙ２株）とで品質上に違いが見られず、ｐｈｙ２株を種菌に用いて作製した納豆が、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
その結果、親株（ｒ２２株）と変異株（ｐｈｙ２株）とで品質上に違いが見られず、ｐｈｙ２株を種菌に用いて作製した納豆が、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
（実施例３）フィターゼ欠損納豆菌のフィターゼ活性
納豆菌のフィターゼ活性の測定は以下の方法に従った。即ち、５ｍｌのＬＢ液体培地で培養し、定常期での培養上澄液を粗酵素液とし、等量の基質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０） ＋ １％ ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ （ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ） ＋ ２ｍＭ ＣａＣｌ2）と混ぜ、３７℃、６０〜１２０分インキュベートした。ブランクとして粗酵素液を５分間煮沸したものを使用した。反応終了後、即座に急冷し、反応液中のリンを定量キット（ホスファＣ−テストワコー（和光純薬工業製））で測定した。１分間あたり１ｐｍｏｌのリンを遊離させる酵素単位を１Ｕとして算出した結果を下記表３（フィターゼ活性）に示した（単位：Ｕ）。
納豆菌のフィターゼ活性の測定は以下の方法に従った。即ち、５ｍｌのＬＢ液体培地で培養し、定常期での培養上澄液を粗酵素液とし、等量の基質溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０） ＋ １％ ｐｈｙｔｉｃ ａｃｉｄ （ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ） ＋ ２ｍＭ ＣａＣｌ2）と混ぜ、３７℃、６０〜１２０分インキュベートした。ブランクとして粗酵素液を５分間煮沸したものを使用した。反応終了後、即座に急冷し、反応液中のリンを定量キット（ホスファＣ−テストワコー（和光純薬工業製））で測定した。１分間あたり１ｐｍｏｌのリンを遊離させる酵素単位を１Ｕとして算出した結果を下記表３（フィターゼ活性）に示した（単位：Ｕ）。
（実施例４）納豆からの白色析出物の抽出
試作により得られた納豆を長期間保存し、既報の抽出法（例えば、「（栄養と食糧）、２６巻、ｐ．４７３−４７８、１９７３年」参照）により白色析出物量を測定した。
試作により得られた納豆を長期間保存し、既報の抽出法（例えば、「（栄養と食糧）、２６巻、ｐ．４７３−４７８、１９７３年」参照）により白色析出物量を測定した。
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）と過酷保存条件（２５℃保存）の２パターンで試験した。測定結果を、それぞれ、表４（通常保存条件（１０℃保存））及び表５（過酷保存条件（２５℃保存））に示した（単位：ｍｇ／１００ｇ）。
（実施例５）豆の色調の変遷
試作により得られた納豆を長期間保存（上記と同様）し、色差計によりＬ値（明度）の変遷を測定した。尚、色差計はＣＯＬＯＲ ＲＥＡＤＥＲ ＣＲ−１３（ＭＩＮＯＬＴＡ製）を使用した。
試作により得られた納豆を長期間保存（上記と同様）し、色差計によりＬ値（明度）の変遷を測定した。尚、色差計はＣＯＬＯＲ ＲＥＡＤＥＲ ＣＲ−１３（ＭＩＮＯＬＴＡ製）を使用した。
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）と過酷保存条件（２５℃保存）、（３７℃保存）の３パターンで試験した。測定結果は、それぞれ、表６（通常保存条件（１０℃保存）、表７（過酷保存条件（２５℃保存）、表８（過酷保存条件（３７℃保存））に示した（単位：Ｌ値）。
（実施例６）納豆菌膜の変遷
試作により得られた納豆を長期間保存（上記と同様）し、菌膜の状態を比較した。表記は○（不快を感じない）、△（不快を感じる）、×（不快を強く感じる）で表した。
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）で試験した。測定結果を表９（通常保存条件（１０℃））に示した。
試作により得られた納豆を長期間保存（上記と同様）し、菌膜の状態を比較した。表記は○（不快を感じない）、△（不快を感じる）、×（不快を強く感じる）で表した。
保存法は、通常保存条件（１０℃保存）で試験した。測定結果を表９（通常保存条件（１０℃））に示した。
（実施例７）納豆菌からのスクリーニング法
前述の遺伝子組換え納豆菌ｐｈｙ２株と同様の野生株をスクリーニングする手段を開発した。即ち、該株を用い以下の表１０に示すＬＢＰＨ培地を用いてハロー法選抜によりスクリーニングするものである。
前述の遺伝子組換え納豆菌ｐｈｙ２株と同様の野生株をスクリーニングする手段を開発した。即ち、該株を用い以下の表１０に示すＬＢＰＨ培地を用いてハロー法選抜によりスクリーニングするものである。
実際に納豆菌ｐｈｙ２株とその親株であるｒ２２株を該培地にて３７℃、一晩培養させたところ、親株は白濁した培地上にそのコロニー周辺に透明なハローを形成したことに対し、ｐｈｙ２株ではハローを形成しなかった。この培地を使用することにより、遺伝子組換え技術を用いない野生株からフィターゼ欠損株をスクリーニングすることが可能である。該方法については、親株を薬剤処理またはＵＶ（紫外線）照射などにより突然変異を誘導させ、スクリーニングを効率化することができる。
薬剤処理法として、例えばニトロソグアニジンを使用する方法がある。即ち、５ｍｌのＬＢ培地に親株を植菌し、３７℃で一晩培養させ、その培養液の２％を１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し３時間培養する。続いて集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）で２回洗浄する。その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）４ｍｌで懸濁し、終濃度２００μｇ／ｍｌのニトロソグアニジン溶液を添加し、３０℃で１時間処理する。続いて集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）５ｍｌ及びＬＢ培地５ｍｌでそれぞれ２回ずつ洗浄し、最後にＬＢ培地５ｍｌを添加し３７℃で３時間培養させ、適量をＬＢＰＨ培地に植菌する。表１０にＬＢＰＨ培地組成を示す。
実際に、親株をＯＵＶ２３４８１株（特許文献 特開２０００−２８７６７６号公報）とした納豆菌から、上記薬剤処理法を用いてスクリーニングを行ったところ、ハローを形成しないコロニーを選抜することができた（ＶＰＳ３７株）。ＶＰＳ３７株のフィターゼ活性、過酷条件での保存試験を行ったところ、遺伝子組換え株である納豆菌ｐｈｙ２株と同様の効果を見出し、組換え株以外でも該スクリーニング法により長期保存条件下において白色析出物の発生抑制、豆色の褐変抑制及び菌膜の維持といった外観の良い高品質納豆を作成できる納豆菌を取得することができた。
このようにして分離して得た突然変異株は、バシラス・サチラス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＰＳ３７と命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６として国際寄託した。
ＶＰＳ３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）のフィターゼ活性を測定し、測定結果を下記表１１に示した（単位：Ｕ）。
ＶＰＳ３７株（突然変異株）の通常保存条件（１０℃）、及び過酷保存条件（２５℃）での白色析出物の発生量（ｍｇ／１００ｇ）の経日変化を、それぞれ、表１２及び表１３に示した。なお、ＯＵＶ２３４８１は親株である。
また、ＶＰＳ３７株の通常保存条件（１０℃）、及び、過酷保存条件（２５℃）において保存した場合の豆の色調の変遷（Ｌ値）（経日変化）を、それぞれ、表１４及び表１５に示した。
更に、ＶＰＳ３７株の通常保存条件（１０℃）での納豆菌膜の変遷を表１６に示した。表中、○は不快を感じない、△は不快を感じる、×は不快を強く感じるを示し、ｄａｙｓは日数を示す。
Claims (9)
- フィターゼ酵素の活性を低下、または欠失させたことを特徴とするバシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されるフィターゼ欠損納豆菌。
- 請求項１に記載の変異領域がプロモーター領域を含むｐｈｙ遺伝子であるバシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されるフィターゼ欠損納豆菌。
- 請求項１又は２に記載の変異が遺伝子組換え法により欠損されたことを特徴とするバシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されるフィターゼ欠損納豆菌。
- 請求項１又は２に記載の変異が突然変異法により欠損されたことを特徴とするバシラス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されるフィターゼ欠損納豆菌。
- 親株のｐｈｙ遺伝子を遺伝子組換え法により欠損させてなる納豆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｙ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３７）。
- 突然変異法によりフィターゼ酵素活性を欠損させた納豆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＶＰＳ３７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３３６）。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とする納豆。
- 請求項７に記載の納豆がスクロースなどの糖源を添加することで製造されたことを特徴とする納豆。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて発酵されたことを特徴とする大豆加工物又は米糠などの穀類。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005201339A JP4778740B2 (ja) | 2005-07-11 | 2005-07-11 | フィターゼ酵素低活性納豆菌及び長期安定な納豆 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005201339A JP4778740B2 (ja) | 2005-07-11 | 2005-07-11 | フィターゼ酵素低活性納豆菌及び長期安定な納豆 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007014298A JP2007014298A (ja) | 2007-01-25 |
| JP4778740B2 true JP4778740B2 (ja) | 2011-09-21 |
Family
ID=37751997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005201339A Active JP4778740B2 (ja) | 2005-07-11 | 2005-07-11 | フィターゼ酵素低活性納豆菌及び長期安定な納豆 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4778740B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4624278B2 (ja) * | 2006-02-13 | 2011-02-02 | タカノフーズ株式会社 | 納豆菌及び納豆の製造方法 |
-
2005
- 2005-07-11 JP JP2005201339A patent/JP4778740B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2007014298A (ja) | 2007-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TW201016855A (en) | Lactate-producing bacteria and method for producing lactate using the same | |
| JP5315600B2 (ja) | γ−グルタミルシステイン生産酵母とその利用 | |
| EP1449913A1 (en) | Gamma-glutamylcysteine-producing yeast | |
| CN100376677C (zh) | 醋酸菌的乙醇脱氢酶基因 | |
| US8465946B2 (en) | Expression system for the antibiotic-free production of polypeptides | |
| JP4657366B2 (ja) | アンモニア低発生性納豆菌、該納豆菌を用いた納豆の製造方法及び納豆 | |
| JP4778740B2 (ja) | フィターゼ酵素低活性納豆菌及び長期安定な納豆 | |
| JP6618792B2 (ja) | 加熱殺菌が可能な納豆 | |
| JP4352877B2 (ja) | γ−グルタミルシステインの製造法 | |
| JP5512177B2 (ja) | 胞子形成能低下納豆菌株および該株を用いて製造した胞子数の少ない納豆 | |
| JP2014064472A (ja) | グルタチオンの製造方法 | |
| JP4228644B2 (ja) | γ−グルタミルシステインの製造法 | |
| JP2003339377A (ja) | 新規バクテリオシン | |
| EP1117799B1 (en) | Novel strains of the bacillus subtilis group for food fermentation | |
| US7410790B2 (en) | Method for producing γ-glutamylcysteine | |
| JP7101362B2 (ja) | １，２－ジヒドロキシ－５－（メチルスルフィニル）ペンタン－３－オンの生成能が低い酵母の作出方法 | |
| JP2006230329A (ja) | 酢酸発酵能が増強された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 | |
| Geisen | Inhibition of food-related pathogenic bacteria by god-transformed Penicillium nalgiovense strains | |
| JP4624278B2 (ja) | 納豆菌及び納豆の製造方法 | |
| JP2010115139A (ja) | 低発芽率胞子形成性納豆菌株および該株を用いて製造した納豆菌胞子の少ない納豆 | |
| JP2005304320A (ja) | γ−アミノ酪酸資化能低下納豆菌、及びγ−アミノ酪酸含有納豆 | |
| Jeong et al. | Improvement of fibrinolytic activity of Bacillus subtilis 168 by integration of a fibrinolytic gene into the chromosome | |
| JP2006115815A (ja) | レバン分解活性低下性納豆菌、及びレバン高含有納豆 | |
| JP4428556B2 (ja) | レバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌、および大豆オリゴ糖高含有納豆 | |
| WO2007013539A1 (ja) | 新規なジグリコシダーゼ及びそれをコードする遺伝子 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080701 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110315 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110510 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110614 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110704 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4778740 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140708 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |