JPH11155579A

JPH11155579A - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法

Info

Publication number: JPH11155579A
Application number: JP9338267A
Authority: JP
Inventors: Ryoichi Sakagami; 了一阪上; Taiji Koyama; 泰二小山; Masaru Suzuki; 勝鈴木
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1997-11-25
Filing date: 1997-11-25
Publication date: 1999-06-15

Abstract

(57)【要約】【解決手段】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子、 (a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有す
るタンパク質該遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮ
Ａ、該遺伝子を含む形質転換体または形質導入体及び該
形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物か
らフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを採取することか
らなるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法。【効果】本発明によれば、フルクトシルアミノ酸オキ
シダーゼを安価に効率よく生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及び
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】イミノ２酢酸及びその誘導体（アマドリ
化合物）を酸化してグリオキシ酸又はα−ケトアルデヒ
ド、α−アミノ酸及び過酸化水素を生成する反応を触媒
する酵素は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと呼称
されている。堀内等は、コリネバクテリウム属細菌より
分離したフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをアマドリ
化合物に作用させ、その反応による酸素の消費量又は過
酸化水素の発生量を測定することにより、食品や生体内
に生成されるアマドリ化合物を測定する分析法を提案し
た（特公平5-33997号公報、特公平6-65300号公報）。ま
た、他の細菌、真菌由来の同様の活性を持つ酵素による
分析法も提案された（特開平2-195900号公報、特開平3-
155780号公報、特開平4-4874号公報、特開平5-192193号
公報、特開平6-46846号公報）。従来、フルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼは、例えば、コリネバクテリウム・
エスピー(Corynebacterium sp.)No.2-3-1(FERM BP-６１
８３)を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼを採取することにより製造されている。
（特公平6-65300号公報）

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
コリネバクテリウム属細菌由来フルクトシルアミノ酸オ
キシダーゼの製造法によるときには、その生産量が低
く、また精製法が複雑になることから、製造コストが高
価になる等の欠点があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、上
記欠点に鑑み種々検討した結果、コリネバクテリウム・
エスピーNo.2-3-1起源のフルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼ遺伝子を単離及び構造決定することに成功し、更に
また、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする
遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを
得、この組み換え体をエッシェリシア(Escherichia)属
に属する菌株に含ませたフルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼ生産能を有する菌株を培地に培養すると、効率よく
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが生産されること等
を見出し、本発明を完成した。

【０００５】即ち、第１の発明は、以下の(a)又は(b)の
タンパク質をコードするフルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼ遺伝子であり、 (a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有す
るタンパク質また第２の発明は、上記のフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴と
する新規な組み換え体ＤＮＡであり、また第３の発明
は、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質
導入体であり、また更に第４の発明は、上記の形質転換
体または形質導入体を培地に培養し、培養物からフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼを採取することを特徴とす
るフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造法である。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子は、
例えば、次のようにして得ることができる。先ず、元株
であるコリネバクテリウム・エスピーNo.2-3-1を、例え
ば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY I
ntersciense,1989)記載の方法等により培養し、得られ
た菌株から染色体ＤＮＡを抽出する。

【０００７】遺伝子をハイブリダイゼーションするため
のプローブは、例えば、次のようにして得ることができ
る。先ず、元株であるコリネバクテリウム・エスピーN
o.2-3-1を、例えば、堀内等の方法〔アグリカルチュラ
ル・バイオロジー・アンド・ケミストリー(Agricultura
l Biology and Chemistry)、第５３巻、第１０３〜１１
０頁(1989年)〕により培養し、精製してフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼタンパク質を得る。これをそのまま
実施例に示す４７３ＡProtein Sequencer（アプライド
バイオシステム社製）によりアミノ末端のアミノ酸配列
の決定に用いることができる。また更にこれを、例え
ば、リジルエンドペプチダーゼ等のプロテアーゼで消化
し、実施例に示すＣ１８カラム（資生堂社製）を用いた
ＨＰＬＣによりペプチド断片を分取し、同様に実施例に
示す４７３ＡProtein Sequencerによりタンパク質内部
のアミノ酸配列を決定することができる。このようにし
て得られたアミノ酸配列を基に合成ＤＮＡを設計し、そ
のままプローブとするか、ＰＣＲにより増幅した断片を
プローブとすることができる。

【０００８】上記で得られた染色体ＤＮＡを、例えば、
Sau3AI等の制限酵素で部分消化、又はSacI等で完全消化
し、常法に従いベクターＤＮＡに組み込む。用いられる
ベクターＤＮＡとしては、例えば、pUC119(宝酒造社
製)、pBR322(宝酒造社製)、pBluescript II KS+(Strata
gene社製)、pMAL-C2(NEW England Labs社製)等のプラス
ミドＤＮＡ、λENBL3(Stratagene社製)、λDASH II（フ
ナコシ社製）等のバクテリオファージＤＮＡ等が挙げら
れる。得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大
腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM109、DH5α（東洋紡社
製）、XL1-Blue（フナコシ社製）等を形質転換または形
質導入して夫々の形質転換体または形質導入体を得る。

【０００９】形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法
(Method in Enzymology,68,326-331,1979)により行なう
ことができる。また、形質導入は、例えば、B.Hohnの方
法(Method in Enzymology,68,299-309,1979)により行な
うことができる。

【００１０】上記形質転換体または形質導入体より純化
された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、上
記により得られたプローブを用いたサザンハイブリダイ
ゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等により
得ることができる。

【００１１】更に、上記フルクトシルアミノ酸オキシダ
ーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを用い、実施例に示す３７
０ＤＮＡSequencing System（アプライドバイオシステ
ム社製）を使用してフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
遺伝子の全塩基配列の解析を行ない（配列番号２参
照）、次いで、前記塩基配列を有する遺伝子によって翻
訳されるポリペプチドのアミノ酸の一次配列を確定す
る。（配列番号１参照）

【００１２】なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列
において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もし
くは付加されおり、かつ、フルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ活性をもたらすアミノ酸配列をコードするフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子は、全て本発明に含
まれる。

【００１３】そして、配列番号１に示されるアミノ酸配
列において、１もしくは複数、好ましくは、数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、フル
クトシルアミノ酸オキシダーゼ活性をもたらすアミノ酸
配列をコードするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺
伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例えば、遺伝
子に点変異または欠失変異を生じさせるための周知技術
である部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、
次いで、選択されたヌクレオチドを除去または付加し、
遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法
等が挙げられる。

【００１４】上記のようにして得られたフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼ生産能を有する形質転換体または形
質導入体、例えば、エッシェリシア属に属する菌株を用
いてフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを生産するに
は、下記のようにして行なうことができる。上記微生物
を培養するには、通常の固体培養法で培養してもよい
が、なるべく液体培養法を採用して培養するのが好まし
い。

【００１５】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液
等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン
酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。

【００１６】なお、培地の初発ｐＨは、７〜９に調整す
るのが適当である。また培養は、25〜42℃、好ましくは
37℃前後で６〜２４時間、通気撹拌深部培養、振とう培
養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了
後、該培養物よりフラクトシルアミノ酸オキシダーゼを
採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができ
る。

【００１７】培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の
操作により菌体を分離し、洗菌する。そして、この菌体
からフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを採取すること
が好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもで
きるが、凍結融解法、超音波破砕機、フレンチプレス、
ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する
方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細
胞壁を溶解する方法、トリトンＸ-100等の界面活性剤を
用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを採取するのが好ま
しい。

【００１８】このようにして得られた粗酵素液からフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼを単離するには、通常の
酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安
塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ
法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ
法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行なうのが好まし
い。

【００１９】本発明により得られるフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼは、以下の性質を有する。 (a)作用：糖化アミノ酸を酸化して、グルコソン、アミ
ノ酸及び過酸化水素を生成する。 (b)基質特異性：フルクトシルグリシン、フルクトシル
バリンに作用するが、ε−フルクトシルリジンには全く
作用しない。 (c)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは、８．０〜
８．５近辺であり、安定ｐＨ範囲は、４０℃、１０分間
の処理で、ｐＨ８．０〜１０．０である。 (d)作用適温の範囲：作用適温の範囲は、３５〜４５℃
近辺である。 (e)分子量：約８８，０００（ゲル濾過法）。約４４，
０００(SDS-PAGE)。

【００２０】(f)力価の測定法：フルクトシルアミノ酸
オキシダーゼの力価の測定は、下記の方法で行ない、フ
ルクトシルグリシン(以下、FGと呼称する。)より１分間
に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１単位
（Ｕ）とした。

【００２１】（発色試薬、ペルオキシダーゼ溶液、基質
溶液の調製）Ａ液；発色試薬４−アミノアンチピリン５０ｍｇを適当量の０．１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解後、２，４
−ジクロロフェノールスルフォネート（２％）７．５ｍ
ｌを加え、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）で１Ｌに定容する。Ｂ液；ペルオキシダーゼ溶液ペルオキシダーゼ（１１０Ｕ／ｍｇ；東洋紡社製）を２
０％グリセロールに１０ｍｇ／ｍｌになるように溶解す
る。Ｃ液；基質溶液フルクトシルグリシン(MW 237)３．１ｇをイオン交換水
に溶解し、２０ｍｌに定容する。

【００２２】（測定手順）前記したＡ液２．７ｍｌ、
Ｂ液０．０１ｍｌ、Ｃ液０．２ｍｌを混合し、３７
℃にて５分間プレインキュベーションした後、該プレイ
ンキュベーションした液と０．０２〜０．２５Ｕ／ｍｌ
付近に調製した酵素液０．１ｍｌを混合し、３７℃にお
いて５分間正確に反応させ、分光光度計（Ｕ−２０００
Ａ、日立社製）で５１０ｎｍにおけるサンプルの吸光度
を測定した。なお、ブランク値は、Ｃ液の代わりにイオ
ン交換水を用いたものを測定した。

【００２３】（力価の計算）前記の測定法で求めたサン
プル吸光度、ブランク吸光度の各値から、下式によって
力価を求めた。Ｕ／ｍｌ＝(サンプル吸光度−ブランク吸光度)／３．７
５×希釈倍率

【００２４】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。（実施例）

【００２５】(1)元株の染色体の調製コリネバクテリウム・エスピーNo.2-3-1(FERM BP-６１
８３)をＴＹ培地（１％バクトトリプトン、0.5 ％バク
トイースト・エキストラクト、0.5 ％塩化ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）１００ｍｌに接種して、３０℃で１
２時間振とう培養し培養物を得た。この培養物を７００
０ｒ.ｐ.ｍ.で５分間遠心分離することにより集菌して
菌体を得た。この菌体よりCurrent Protocols in Molec
ular Biology(WILEY Intersciense,1989)記載の方法に
従い、染色体ＤＮＡ１．４ｍｇを得た。

【００２６】(2)精製酵素の内部アミノ酸配列の決定前記の堀内等の方法により調製されたフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼ酵素サンプルをＣ１８カラム（資生堂
社製）でSDS-PAGEのクマシーブルーによる染色で単一バ
ンドになるまで精製し、473A Peptide Sequencer（アプ
ライドバイオシステム社製）により、Ｎ末端アミノ酸配
列を配列番号３に示すとおり２８残基決定した。また、
単一バンドに精製したフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼ酵素サンプルをLysylendpeptidase〔和光純薬(株)
製〕及びEndoproteinase Asp-N（宝酒造社製）で分解
し、POROS R1（ベーリンガー・マンハイム・山之内社
製）で分離した。これらのペプチド断片から473A Pepti
de Sequencer（アプライドバイオシステム社製）により
配列番号４、５、６及び７に示す４種の部分アミノ酸配
列が得られた。

【００２７】(3)プローブの設計とサザンハイブリダイ
ゼーション上記で得られた部分アミノ酸配列のうち、コドンの縮重
が少ない配列番号５及び６を選びハイブリダイゼーショ
ンで用いるプローブ２種類（配列番号８及び９）を作製
した。サザンハイブリダイゼーションの膜は、染色体Ｄ
ＮＡをBamHI、EcoRI、HindIII、PvuII及びSacI等で完全
消化したものを０．８％アガロースゲル電気泳動で分離
し、これをHybond-N+（アマシャム社製）に転写して作
製した。プローブは、T4 Polynucleotide kinase（宝酒
造社製）を用いたリン酸化反応により[γ-³²P]ATPで標
識し、ゲル濾過により未反応の[γ-³²P]ATPを除いた。
サザンハイブリダイゼーションは、常法に従い、Rapid
hybridization buffer（アマシャム社製）を用い、プレ
ハイブリダイゼーションを５５℃で３０分間、ハイブリ
ダイゼーションを５５℃で２時間行ない、6×SSCでの洗
浄は６０℃で１５分間を３回行なった。これをBAS1000
（フジフィルム社製）のシステムで検出したところ、
染色体ＤＮＡをSacIで処理したもので２つのプローブに
共通して約１．１ｋｂｐのバンドが検出された。

【００２８】アガロースゲルより１．１ｋｂｐ付近のＤ
ＮＡ断片を回収し、pBluescriptIISK+(Stratagene社製)
のSacIサイトに組み込んだものを９６０株作製し、コロ
ニーをHybond-N+に転写し、コロニーハイブリダイゼー
ションを上記サザンハイブリダイゼーションと同様の条
件で行なったところ、４株がポジティブであった。これ
らからプラスミドを回収し370DNA Sequencing System
（アプライドバイオシステム社製）を用いて塩基配列の
決定を行なったところ、塩基配列から予想されるアミノ
酸配列は、先にプローブとして用いた部分アミノ酸配列
を含んでいた。よってここで得られたプラスミドｐＦＡ
１は、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードする
遺伝子のＮ末端部分を含むことが判った。そこでこの配
列をプローブとして、遺伝子のＣ末端部分を取得するこ
とにした。上記の遺伝子断片は、内部にEcoRI,PvuIIサ
イトを持つことが判ったので、遺伝子をEcoRIで処理し
２つに分け、夫々をプローブとしたサザンハイブリダ
イゼーションを行なった。プローブは、Random Primer
DNA labeling Kit Ver.2(宝酒造社製)により[α-³²P]dC
TPで標識した。すると、染色体ＤＮＡをEcoRI,PvuIIで
処理したものでは、２つのプローブで検出されるバンド
の大きさが異なっていた。これは、遺伝子断片が内部に
夫々の制限酵素サイトを含むことで説明が付き、Ｃ末端
側に対応したプローブで得られたバンドはフルクトシル
アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を終端まで有していること
が判った。そこで上記で得られた遺伝子断片のうちＣ末
端側に対応した部分をプローブとしたサザンハイブリダ
イゼーションでPvuIIで処理したもので得られた６．０
ｋｂｐ付近に検出されたバンド付近のＤＮＡを回収して
pBluescriptII SK+のSmaIサイトに組み込んだライブラ
リーを約１５００株作製した。これに対しＣ末端側に対
応したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーショ
ンを行なったところ１２株がポジティブであり、これら
を含むプラスミドについて370DNA Sequencing Systemを
用いて塩基配列の決定を行なったところ、前記の約１．
１ｋｂｐの遺伝子断片の一部と一致していたので、本配
列がフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのＣ末端側をコ
ードしていると判断し、このプラスミドをｐＦＡ２と命
名した。

【００２９】(4)遺伝子の連結フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのＮ末端側をコード
するｐＦＡ１及びＣ末端側をコードするｐＦＡ２に分け
て遺伝子が取得されたので両者を連結することにした。
ｐＦＡ１をEcoRIで消化した際に得られる２つのＤＮＡ
断片の内で大きな断片と、ｐＦＡ２をEcoRIで消化した
際に得られる２つのＤＮＡ断片の内で小さな断片とを連
結した。更にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子
の下流をXhoIサイトまで削除し、できたプラスミドをｐ
ＦＡ５と命名した。得られたプラスミドｐＦＡ５を用い
大腸菌DH5α(東洋紡社製)を前記D.M.Morrisonの方法に
より形質転換し、形質転換体、大腸菌DH5α(ｐＦＡ５)
を得た。なお、大腸菌DH5α(ｐＦＡ５)は、工業技術院
生命工学工業技術研究所にFERM BP-６１８２として寄託
されている。

【００３０】(5)活性の確認大腸菌(E.coli)DH5α(ｐＦＡ５)を５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＴＹ培地（１％バクトトリプトン、
０．５％バクトイースト・エキストラクト、０．５％塩
化ナトリウム、ｐＨ７．０）１０ｍｌにて３７℃、２０
時間振とう培養した後、培養液を超音波処理にて破砕、
遠心分離後、その上清について前述した酵素活性測定法
によりフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を測定し
たところ、約０．２Ｕ／ｍｌであった。

【００３１】(6)フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺
伝子の解析大腸菌(E.coli)DH5α(ｐＦＡ５)の活性が確認されたの
で、ｐＦＡ５の挿入断片がフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼ遺伝子を含むことが明らかとなった。上記で決定
した塩基配列を配列番号２に、また、該ＤＮＡ配列から
翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１に
夫々示した。フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子
は、１１１６ｂｐのコーディング領域をもち、３７２個
のアミノ酸残基をコードしているものであった。

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、フルクトシルアミノ酸
オキシダーゼを安価に効率よく生産することができる。

【００３３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３７２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Met Ser Ser Thr Ala Thr Lys His Val Ala Val Ile Gly Gly Gly 5 10 15 Ile Leu Gly Val Ser Thr Ala Val His Leu Leu Arg Gln Gly Ala 20 25 30 Thr Val Thr Leu Leu Thr Glu Gln Gly Leu Ala Ser Glu Ala Thr 35 40 45 Gly Arg Ser Leu Ser Trp Leu Asn Ser Ala Gly Glu Arg Ser Thr 50 55 60 Pro Tyr His Gln Leu Arg Ile Ala Gly Val Asp Arg Tyr Arg Thr 65 70 75 Leu Phe Ala Ala Asp Pro Ser Arg Glu Trp Leu Gln Phe Gly Gly 80 85 90 Gly Leu Met Trp Asn Ala Ala Gly Glu Ser Glu Val Thr Lys Ala 95 100 105 Arg His Ala Tyr Glu Lys Ser Ile Gly Tyr Asp Ser Gln Leu Leu 110 115 120 Ala Pro Glu Glu Ile Gly Ser Val Thr Pro Gly Ile Asp Ala Ser 125 130 135 Ala Val Pro Glu Asn Ala Ile Phe Asn Pro Gly Glu Gly Trp Val 140 145 150 Ser Leu Pro Asp Leu Val Asn Phe Leu Met Glu Glu Phe His Ala 155 160 165 Leu Gly Gly Gln Leu Val Leu Asn Ala Gly Lys Ala Ser Val Met 170 175 180 Val Glu Gly Gly Arg Ala Thr Ala Val Glu Thr Ala Thr Gly Glu 185 190 195 Thr Tyr Pro Ala Asp Ala Val Leu Val Ala Cys Gly Ala Ala Thr 200 205 210 Pro Ala Val Val Lys Pro Leu Gly Val Glu Ile Pro Asn Gly Ser 215 220 225 Pro Val Ser Met Leu Val Val Thr Lys Pro Val Glu His Gln Val 230 235 240 Ala Ala Val Met Asn Thr Pro Arg Ala Ala Val Arg Pro Asn Pro 245 250 255 Gly Asn Thr Phe Ala Leu Asp His Asp Trp Tyr Glu Gly His Ile 260 265 270 Thr Glu His Ala Asp Gly Ser Phe Thr Ile Pro Asp Asp Val Val 275 280 285 Gln Glu Leu Ala Asp Glu Ser Ser Lys Leu Ile Ala Gly Asn Pro 290 295 300 Glu Leu Lys Pro Ala Ser Trp Lys Ile Gly Tyr Lys Pro Ile Pro 305 310 315 Gly Asp Gly Glu Pro Val Phe Gly Glu Leu Gly Arg Val Pro Gly 320 325 330 Cys Phe Val Ala Phe Thr His Ser Gly Ala Thr Leu Gly Leu Ile 335 340 345 Ala Gly Glu Leu Leu Ser Gly Glu Ile Leu Thr Gly Asp Lys His 350 355 360 Pro Met Phe Ala Thr Phe Arg Pro Gly Arg Phe Ser 365 370

【００３４】配列番号：２配列の長さ：１１１６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：染色体ＤＮＡ起源：コリネバクテリウム・エスピーNo.2-3-1 菌名：FERM BP-６１８３配列： ATG TCC TCC ACC GCT ACC AAG CAT GTC GCC GTC ATT GGC GGC GGC ATC 48 CTG GGC GTC TCC ACC GCC GTC CAC CTG CTC CGC CAA GGC GCA ACA GTC 96 ACC CTC TTG ACC GAA CAG GGC CTC GCC AGC GAA GCC ACG GGC CGG TCC 144 TTG TCC TGG CTC AAC TCC GCC GGG GAA CGC TCC ACT CCC TAT CAC CAG 192 CTG CGC ATC GCT GGC GTT GAC CGG TAC CGC ACG CTG TTC GCC GCC GAT 240 CCC AGC CGG GAA TGG TTG CAG TTC GGG GGC GGG CTC ATG TGG AAC GCC 288 GCC GGG GAA AGT GAG GTC ACC AAA GCC CGG CAC GCC TAC GAG AAG TCC 336 ATC GGC TAC GAC TCC CAA CTG CTG GCC CCT GAA GAA ATC GGC TCG GTC 384 ACG CCA GGC ATC GAC GCC AGT GCC GTC CCG GAG AAC GCA ATC TTC AAT 432 CCT GGC GAG GGC TGG GTC AGC CTG CCG GAC CTG GTG AAC TTC CTG ATG 480 GAG GAA TTC CAC GCC CTG GGC GGC CAG TTG GTC CTC AAC GCA GGT AAA 528 GCC TCG GTG ATG GTC GAG GGC GGC CGG GCT ACC GCG GTC GAA ACC GCC 576 ACC GGT GAA ACC TAC CCC GCG GAC GCC GTT CTC GTA GCC TGC GGT GCC 624 GCG ACG CCG GCC GTC GTA AAA CCG CTC GGG GTC GAG ATA CCG AAC GGT 672 TCC CCG GTC TCC ATG CTG GTT GTT ACC AAG CCC GTG GAG CAC CAG GTC 720 GCG GCA GTG ATG AAT ACG CCG CGC GCT GCC GTG CGA CCC AAT CCG GGT 768 AAC ACT TTT GCC TTG GAT CAC GAC TGG TAT GAA GGG CAC ATC ACT GAG 816 CAC GCG GAC GGT TCG TTC ACC ATC CCG GAT GAT GTC GTC CAG GAA TTG 864 GCA GAC GAG TCA TCC AAG CTG ATC GCA GGA AAC CCC GAG CTC AAG CCG 912 GCA TCG TGG AAG ATC GGT TAC AAG CCG ATC CCG GGC GAC GGC GAA CCA 960 GTC TTC GGG GAA CTC GGC CGA GTA CCG GGC TGC TTC GTG GCT TTC ACC 1008 CAC TCA GGT GCC ACC CTG GGC CTC ATC GCA GGC GAA TTG CTC TCC GGG 1056 GAG ATC CTG ACG GGG GAC AAG CAC CCC ATG TTC GCC ACG TTC CGG CCG 1104 GGC CGG TTC TCC 1116

【００３５】配列番号：３配列の長さ：２８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列： Thr Ala Thr Lys His Val Ala Val Ile Gly Gly Gly Ile Leu Gly 5 10 15 Val Ser Thr Ala Val His Leu Leu Arg Gln Gly Ala Thr 20 25

【００３６】配列番号：４配列の長さ：２５配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列： Glu Glu Phe His Ala Leu Gly Gly Gln Leu Val Leu Asn Ala Gly 5 10 15 Lys Ala Ser Val Met Val Glu Gly Gly Arg 20 25

【００３７】配列番号：５配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状

【００３８】配列番号：６配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状

【００３９】配列番号：７配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状

【００４０】配列番号：８配列の長さ：３３配列の型：核酸トポロジー：一本鎖配列： NGC RTG YTC NGT DAT RTG NCC RCC RTA NCC RTC 33

【００４１】配列番号：９配列の長さ：３３配列の型：核酸トポロジー：一本鎖配列： RTT CAT NAC NGC NGC NAC YTG RTG YTC NAC NGG 33

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコー
ドするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子。 (a)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有す
るタンパク質
【請求項２】請求項１記載のフルクトシルアミノ酸
オキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを
特徴とする新規な組み換え体ＤＮＡ。
【請求項３】請求項２記載の組み換え体ＤＮＡを含
む形質転換体または形質導入体。
【請求項４】請求項３記載の形質転換体または形質
導入体を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼを採取することを特徴とするフルクトシ
ルアミノ酸オキシダーゼの製造法。