WO2024004921A1 - ポリペプチド、オキシゲナーゼ及びこれらの応用 - Google Patents

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WO2024004921A1 PCT/JP2023/023517 JP2023023517W WO2024004921A1 WO 2024004921 A1 WO2024004921 A1 WO 2024004921A1 JP 2023023517 W JP2023023517 W JP 2023023517W WO 2024004921 A1 WO2024004921 A1 WO 2024004921A1
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聡 石原
聡 小池田
倫史 亀田
仁善 池部
遥一 来見田
順 小川
良太郎 原
重信 岸野
道樹 竹内
晃規 安藤
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天野エンザイム株式会社
国立研究開発法人産業技術総合研究所
国立大学法人京都大学
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids

Definitions

  • the present invention relates to polypeptides, oxygenases, and their applications. Specifically, the present invention relates to oxygenases modified from cytochrome P450 monooxygenases and their applications.
  • Cytochrome P450 monooxygenase (hereinafter also referred to as P450) is a monooxygenating enzyme possessed by a wide range of biological species ranging from bacteria to plants and mammals.
  • P450 derived from bacteria is known to have higher catalytic activity than P450 derived from eukaryotes.
  • P450cam derived from Pseudomonas aeruginosa and P450-BM3 derived from Bacillus megaterium, which is a type of bacterium belonging to the genus Bacillus, are known.
  • P450 derived from bacteria has high catalytic activity to epoxidize (hydroxylate) substrates such as fatty acids.
  • epoxidize substrates such as fatty acids.
  • P450s are suitable as biocatalysts.
  • wild-type P450 does not necessarily have high catalytic activity in epoxidizing industrially useful hydrocarbon substrates.
  • various mutant P450 types have been proposed (eg, Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Documents 1 to 4).
  • Polyunsaturated fatty acids such as arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid are metabolized in vivo into various compounds and exhibit various physiological effects in each tissue.
  • the cyclooxygenase system, lipoxygenase system, and P450 system are known as arachidonic acid metabolic systems, and arachidonic acid is metabolized into many compounds in these systems.
  • the P450 system involves epoxidation of the double bonds of highly unsaturated fatty acids.
  • polyunsaturated fatty acid metabolites produced by epoxidizing the ⁇ 3 position of highly unsaturated fatty acids are important substances for anti-inflammatory and anti-allergic effects in vivo (Non-Patent Document 5).
  • Non-Patent Document 6 Even in vitro, bacterial-derived P450 catalyzes epoxidation at the ⁇ 3 position by reacting with highly unsaturated fatty acids (Non-Patent Document 6). On the other hand, a method of epoxidizing highly unsaturated fatty acids using a chemical oxidation reaction is also known. In this case, a method of reacting with hydrogen peroxide in the presence of lipase has been reported (Patent Document 4).
  • an object of the present invention is to provide a modified oxygenase that specifically epoxidizes only the ⁇ 3 position of highly unsaturated fatty acids.
  • the present inventors succeeded in epoxidizing only the ⁇ 3 position of polyunsaturated fatty acids by introducing a specific mutation at a predetermined position in the amino acid sequence of oxygenase.
  • the present invention has the following configuration.
  • a polypeptide shown in any of the following (1) to (3) (1) A polypeptide consisting of an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of F87K/I/H, A330V, P25L, and T438M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (2) In the amino acid sequence described in (1) above, one or several amino acid residues are substituted, added, inserted, or deleted, and has a catalytic activity to epoxidize the ⁇ 3 position of ⁇ 3 fatty acids.
  • polypeptide according to [1] or [2], which is an oxygenase [4] An enzyme agent for epoxidizing the ⁇ 3-position of ⁇ 3 fatty acids, comprising the polypeptide according to any one of [1] to [3]. [5] The enzyme for epoxidizing the ⁇ 3 position according to [4], further comprising one or more enzymes selected from the group consisting of a NADPH regenerating enzyme, an enzyme that removes active oxygen, and an enzyme that removes hydrogen peroxide. agent.
  • An expression cassette comprising the DNA according to [6].
  • [8] A recombinant vector comprising the DNA according to [6].
  • a method for producing oxygenase comprising the step of culturing the transformant according to [9].
  • a method for epoxidizing the ⁇ 3 position comprising the step of causing the polypeptide according to any one of [1] to [3] or the enzyme agent for epoxidizing the ⁇ 3 position according to [4] or [5] to act on the ⁇ 3 fatty acid.
  • Method for producing epoxidized fatty acids [12]
  • An ⁇ 3 fatty acid comprising the step of causing the polypeptide according to any one of [1] to [3] or the enzyme agent for epoxidizing the ⁇ 3 position according to [4] or [5] to act on an ⁇ 3 fatty acid.
  • Method for epoxidizing fatty acids [13] A composition containing an ⁇ 3-position epoxidized fatty acid obtained by the production method of [11].
  • the present invention it is possible to obtain a modified oxygenase that specifically epoxidizes only the ⁇ 3 position of highly unsaturated fatty acids. Further, according to the present invention, there are provided a method for producing an ⁇ 3-epoxidized fatty acid in which only the ⁇ 3 position is specifically epoxidized, and an ⁇ 3-epoxidized fatty acid produced from the production method.
  • FIG. 1 shows the detection of 17,18-EpETE (17,18-epoxyeicosatetraenoic acid) produced from the substrate EPA (eicosapentaenoic acid) when using mutant enzymes (F87K, F87I, F87H).
  • FIG. 2 shows the results of HPLC analysis of an epoxidized compound produced from the substrate EPA (eicosapentaenoic acid).
  • FIG. 3 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate EPA (eicosapentaenoic acid).
  • FIG. 4 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate EPA (eicosapentaenoic acid).
  • FIG. 2 shows the results of HPLC analysis of an epoxidized compound produced from the substrate EPA (eicosapentaenoic acid).
  • FIG. 3 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate EPA (eicos
  • FIG. 5 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate EPA (eicosapentaenoic acid).
  • FIG. 6 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate DHA (docosahexaenoic acid).
  • FIG. 7 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate DHA (docosahexaenoic acid).
  • FIG. 8 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate DHA (docosahexaenoic acid).
  • FIG. 9 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate DPA (docosapentaenoic acid).
  • FIG. 10 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate DPA (docosapentaenoic acid).
  • FIG. 11 shows the results of HPLC analysis of the epoxidized compound produced from the substrate DPA (docosapentaenoic acid).
  • glycine (Gly) is G
  • alanine (Ala) is A
  • valine (Val) is V
  • leucine (Leu) is L
  • isoleucine (Ile) is I
  • phenylalanine (Phe) is F
  • tyrosine (Tyr) is Y
  • tryptophan (Trp) is W
  • serine (Ser) is S
  • threonine (Thr) is T
  • cysteine (Cys) is C
  • methionine (Met) is M
  • aspartic acid (Asp) is D
  • glutamic acid (Glu) is E
  • asparagine (Asn) is N
  • glutamine (Gln) is Q
  • lysine (Lys) is K
  • arginine (Arg) is R
  • histidine (His) is H
  • proline (Pro) is P.
  • nonpolar amino acids include alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan.
  • Uncharged amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine.
  • Acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Basic amino acids include lysine, arginine and histidine.
  • substitution refers not only to artificially introduced substitutions of amino acid residues, but also to cases where amino acid residue substitutions are naturally introduced, that is, when amino acid residues are originally different. This also includes cases where In this specification, substitution of amino acid residues may be artificial or natural substitutions, but artificial substitutions are preferred.
  • polypeptide (oxygenase) The present invention relates to a polypeptide shown in any one of (1) to (3) below.
  • P25L indicates that the amino acid residue P at position 25 in SEQ ID NO: 2 is substituted with L
  • T438M indicates that the residue A is substituted with V. This shows that T, the amino acid residue at position 438 in No. 2, is substituted with M.
  • polypeptides (1) to (3) above include not only polypeptides obtained by artificial substitution, but also polypeptides naturally substituted to have such amino acid sequences.
  • amino acid substitutions are defined as a one-letter abbreviation representing the amino acid residue before the substitution, a number representing the position of the amino acid residue where the amino acid substitution occurs (position from the N-terminus in a specific amino acid sequence), and a number after the substitution. It is expressed as a combination of one-letter abbreviations representing the amino acid residues. For example, if phenylalanine at position 87 is substituted with lysine, it is expressed as "F87K.”
  • the amino acid residue after substitution may be any one of a plurality of types, a one-letter abbreviation representing the amino acid residue after substitution is also written using the symbol "/".
  • F87K/I/H means that phenylalanine at position 87 is substituted with lysine, isoleucine, or histidine.
  • the symbol "-" is used when representing a combination (combination) of two or more substitutions.
  • a combination of substitution of phenylalanine at position 87 with lysine and substitution of alanine at position 330 with valine is expressed as "F87K-A330V".
  • the polypeptide shown in any one of (1) to (3) above has a catalytic activity that specifically epoxidizes the ⁇ 3 position of a highly unsaturated fatty acid ( ⁇ 3 fatty acid) than the polypeptide of SEQ ID NO: 2.
  • the present inventors designed the enzyme by molecular reaction simulation of the enzyme-substrate reaction based on molecular dynamics (MD) calculations based on the three-dimensional structure information of P450, and created, cultured, and evaluated mutant recombinant P450 based on the design. As a result, we succeeded in obtaining a modified oxygenase (P450) with improved specificity of epoxidation at the ⁇ 3 position.
  • MD molecular dynamics
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is a cytochrome P450 monooxygenase derived from Bacillus megaterium.
  • the polypeptide of the present invention is preferably a modified oxygenase, more preferably a modified monooxygenase, and even more preferably a modified monooxygenase derived from cytochrome P450 monooxygenase derived from Bacillus megaterium.
  • monooxygenase is an enzyme that has a catalytic action to introduce one atom of oxygen into a compound using an oxygen molecule as a substrate, and uses heme, non-heme iron, or a metal ion as a cofactor.
  • monooxygenase may further have other actions as long as the above action is the main activity.
  • a polypeptide of the invention may be part of an oxygenase, and the polypeptide or oxygenase may be part of a larger protein (eg, a fusion protein).
  • Sequences added in the fusion protein include, for example, sequences useful for purification such as multiple histidine residues, additional sequences that ensure stability during recombinant production, and the like.
  • the polypeptide of the present invention consists of an amino acid sequence containing at least one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of F87K/I/H, A330V, P25L, and T438M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It is.
  • the polypeptide of the present invention preferably contains at least an amino acid substitution of F87K, F87I or F87H, more preferably contains an amino acid substitution of F87K or F87I, and particularly preferably contains an amino acid substitution of F87K.
  • the polypeptide of the present invention includes an amino acid substitution of F87K/I/H in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of A330V, P25L, and T438M. It is preferable that it consists of.
  • a more preferred embodiment is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which includes an amino acid substitution of F87K and includes one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of A330V, P25L, and T438M. .
  • Specific embodiments include a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing an amino acid substitution of F87K-A330V, a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing an amino acid substitution of F87K-P25L, and an amino acid sequence of F87K-T438M in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing a substitution a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing an amino acid substitution of F87K-A330V-P25L, a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing an amino acid substitution of F87K-A330V-T438M, a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing an amino acid substitution of F87K-P25L-T438M, Examples include a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing an amino acid substitution, and a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing the amino acid substitution F87K-A330V-P25L-T438M.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing double amino acid substitutions at least in F87K and A330V in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is preferred.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence containing a triple amino acid substitution that also has a mutation in P25L or T438M is also preferable, particularly an amino acid sequence containing an amino acid substitution of F87K-A330V-T438M.
  • a polypeptide consisting of this sequence is preferable because it tends to exhibit catalytic activity that specifically epoxidizes the ⁇ 3 position.
  • amino acid residues other than the 87th, 330th, 25th, and 438th amino acid residues of SEQ ID NO: 2 are referred to as "arbitrary different sites.” It may also be written.
  • an "arbitrary difference site” is a site where differences are allowed as long as they do not significantly affect the properties of the polypeptide.
  • the catalytic activity for specifically epoxidizing the ⁇ 3 position of ⁇ 3 fatty acids is improved compared to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the polypeptide is referred to as a variant of the polypeptide (1) above.
  • the polypeptides (2) and (3) above are different from the polypeptide (1) above. Further, it is preferable that the different polypeptide has substantially the same properties as the polypeptide of (1) above, although there is a difference in the amino acid sequence at any different site. Note that the fact that the properties of the polypeptides are substantially the same means that the catalytic activity for specifically epoxidizing the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid is equivalent.
  • the amino acid modification introduced at any different site may be one type of modification (for example, only substitution) selected from substitution, addition, insertion, and deletion, or two types of modification may be selected from substitution, addition, insertion, and deletion.
  • the above modifications (for example, substitutions and insertions) may be made.
  • the number of amino acid differences at any difference site may be one or several. Examples of the number of differences include 1 to 80, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10, and 1 to 8. 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2.
  • sequence identity to the amino acid sequence described in (1) above is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and still more preferably 80% or more. It is preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 99% or more.
  • sequence identity with the amino acid sequence described in (1) above is the sequence identity calculated by comparing it with the amino acid sequence described in (1) above.
  • sequence identity herein refers to BLASTPACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCBI)] bl2seq program (Tatiana A. Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 174, p247-250, 1999). The parameters are calculated by setting Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.
  • amino acid substitutions in polypeptides in (2) and (3) above include, for example, if the amino acid before substitution is a non-polar amino acid, substitution with another non-polar amino acid, and even if the amino acid before substitution is a non-charged amino acid. For example, substitution with another uncharged amino acid, substitution with another acidic amino acid if the amino acid before substitution is an acidic amino acid, and substitution with another basic amino acid if the amino acid before substitution is a basic amino acid. Can be mentioned.
  • the 267th position (glutamic acid), the 268th position (threonine), the 264th position (alanine), and the 393rd position (phenylalanine) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Since these amino acids play roles in electron transport and oxygen binding and are considered to be important residues for active catalysts, it is desirable not to introduce substitutions or deletions into these positions.
  • catalytic activity for epoxidizing the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid refers to the ⁇ 3 position epoxidation that can be obtained by epoxidizing only the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid as a substrate. This can be evaluated by detecting converted fatty acids using column chromatography or the like.
  • the production rate of ⁇ 3-position epoxidized fatty acids is increased compared to the case where a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is used, “the ⁇ 3-position of ⁇ 3 fatty acids is It can be said that there is a catalytic activity that increases Furthermore, the production rate of ⁇ 3-epoxidized fatty acids when using the polypeptides (2) and (3) above is equivalent to the production rate of ⁇ 3-epoxidized fatty acids when using the polypeptide (1) above. The above is preferable.
  • the production rate of ⁇ 3-position epoxidized fatty acid is 1 when using the polypeptide in (1) above, and when using the polypeptides in (2) and (3) above,
  • the production rate of the ⁇ 3-position epoxidized fatty acid is preferably 0.8 to 1.2, more preferably 0.9 to 1.1, and even more preferably 0.95 to 1.05. preferable.
  • the production rate of ⁇ 3-position epoxidized fatty acids refers to the mass of ⁇ 3-position epoxidized fatty acids ( molar concentration).
  • the polypeptide (oxygenase) of the present invention has high substrate specificity and specifically epoxidizes the ⁇ 3 position of ⁇ 3 fatty acids. Specifically, when the production rate of epoxidized fatty acids at the ⁇ 3 position is 40% or more when the polypeptides (1) to (3) above are applied to eicosapentaenoic acid (EPA) as a substrate, It can be determined that the ⁇ 3 position of the fatty acid is specifically epoxidized. In addition, the production rate of ⁇ 3-position epoxidized fatty acids when the polypeptides (1) to (3) above are made to act on EPA is preferably 40% or more, and more preferably 50% or more.
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • the production rate of the ⁇ 3-position epoxidized fatty acid when the polypeptides (1) to (3) above are allowed to act on EPA may be 100%.
  • the present invention may also relate to an enzyme agent for epoxidizing the ⁇ 3 position of a highly unsaturated fatty acid ( ⁇ 3 fatty acid), which includes the above-mentioned polypeptide.
  • the enzyme agent for epoxidizing the ⁇ 3 position contains the above-mentioned polypeptide as an active ingredient.
  • the enzyme agent may consist of the polypeptide mentioned above.
  • the content of the polypeptide in the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately set within a range that exhibits the catalytic activity of epoxidizing the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid.
  • the enzyme agent of the present invention may contain other components other than the above-mentioned polypeptide to the extent that the effects of the present invention are not affected.
  • examples of other components include enzymes other than the above-mentioned polypeptide, additives, culture residues produced by the production method described below, and the like.
  • the enzyme agent preferably contains an enzyme other than the above polypeptide, and when epoxidizing the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid, a concomitant enzyme may be used in addition to the above polypeptide.
  • the enzyme agent contains one or more enzymes selected from the group consisting of NADPH regenerating enzymes, enzymes that remove active oxygen, and enzymes that remove hydrogen peroxide. It may be When epoxidizing the ⁇ 3 position of ⁇ 3 fatty acids, the reaction rate can be increased by using the above combined enzyme in addition to the above polypeptide, and the production rate of ⁇ 3 position epoxidized fatty acids can be increased. can.
  • the NADPH regenerating enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of converting the coenzyme NADP to NADPH.
  • NADPH regenerating enzyme reactivates the enzyme by regenerating the coenzyme NADPH that monooxygenase consumes in the reaction. Therefore, when compared at the same reaction time, it has the effect of improving the conversion rate of the substrate.
  • Types of NADPH regenerating enzymes include glucose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, D-lactate dehydrogenase, malate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, and glucose 6-phosphate dehydrogenase.
  • the NADPH regenerating enzyme one type of these NADPH regenerating enzymes may be used, or two or more types may be used in combination.
  • NAD(P)-dependent glucose dehydrogenase glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium.
  • NADPH regenerating enzyme can be prepared by a known method.
  • it when preparing glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium, it can be easily prepared by culturing production bacteria and separating glucose dehydrogenase using known means, or by using genetic recombination technology.
  • a commercially available product may be used as the NADPH regenerating enzyme.
  • Commercially available NADPH regenerating enzymes include glucose dehydrogenase manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd., and ADH, rD-LDH, rMDH, rICDH, and rG6PDH manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.
  • Enzymes that remove active oxygen and hydrogen peroxide are particularly limited if they are enzymes that disproportionate active oxygen into hydrogen peroxide and molecular oxygen, or enzymes that can convert hydrogen peroxide into water. Not done. Enzymes that remove active oxygen and hydrogen peroxide have the effect of protecting enzymes by decomposing active oxygen and hydrogen peroxide produced by monooxygenase reactions. Therefore, it has the effect of preventing deactivation of monooxygenase and improving the conversion rate of substrate.
  • Types of enzymes that remove active oxygen and hydrogen peroxide include catalase, peroxidase, and superoxide dismutase.
  • One type of these enzymes that remove active oxygen and hydrogen peroxide may be used, or two or more types may be used in combination.
  • catalase and superoxide dismutase are preferred from the viewpoint of further enhancing the effect.
  • catalase, peroxidase, and superoxide dismutase derived from animal organs horseradish, Escherichia coli, and the Aspergillus genus can also be used.
  • catalases, peroxidases, and superoxide dismutases animal organ-derived catalases and animal-derived superoxide dismutases are preferred from the viewpoint of further enhancing the effect.
  • Enzymes that remove active oxygen and hydrogen peroxide can be prepared by known methods. For example, when preparing animal-derived catalase, it can be easily prepared by separating catalase from animal organs using known means, or by using genetic recombination technology. Furthermore, commercially available enzymes may be used to remove active oxygen and hydrogen peroxide. Commercially available enzymes that remove active oxygen and hydrogen peroxide include catalase manufactured by Fujifilm Wako, peroxidase manufactured by Fujifilm Wako, superoxide dismutase manufactured by Sigma-Aldrich, and superoxide dismutase manufactured by Toyobo.
  • enzymes that the enzyme agent may contain include amylase ( ⁇ -amylase, ⁇ -amylase, glucoamylase), glucosidase ( ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase), galactosidase ( ⁇ -galactosidase, ⁇ -galactosidase), Protease (acid protease, neutral protease, alkaline protease), peptidase (leucine peptidase, aminopeptidase), lipase, esterase, cellulase, phosphatase (acid phosphatase, alkaline phosphatase), nuclease, deaminase, oxidase, dehydrogenase, glutaminase, pectinase, catalase , dextranase, transglutaminase, protein deamidase, pullulanase, peroxidase, superoxid
  • additives include excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, and the like.
  • Excipients include starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, white sugar, glycerol, and the like.
  • Buffers include phosphates, citrates, acetates, and the like.
  • Stabilizers include propylene glycol, ascorbic acid, and the like.
  • Preservatives include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like.
  • preservatives include ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol, and the like. These additives may be used alone or in combination.
  • Examples of the culture residue include components derived from the medium, contaminant proteins, bacterial body components, and the like.
  • the form of the enzyme preparation of the present invention is not particularly limited, and examples include liquid form, solid form (powder, granules, etc.), immobilization on a carrier, and the like.
  • the present invention relates to DNA shown in any of (1) to (3) below.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO:3 is the cDNA sequence of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the F87K variant shown in SEQ ID NO:4, and the base sequence shown in SEQ ID NO:5 is the cDNA sequence of the gene encoding the F87K and A330V variant shown in SEQ ID NO:6.
  • cDNA sequence of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of a heavy mutant the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 encodes a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the P25L, F87K, and A330V triple mutant shown in SEQ ID NO: 8
  • the cDNA sequence of the gene, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, is the cDNA sequence of the gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of the F87K, A330V, and T438M triple mutant shown in SEQ ID NO: 10.
  • the homology of the DNA in (3) above to the DNA in (1) above is preferably 75% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, and 90% or more. More preferably, it is 95% or more, even more preferably 99% or more. Even if the DNA has a sequence different from the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, 5, 7, or 9, it encodes a polypeptide that has a catalytic activity to specifically epoxidize the ⁇ 3 position of ⁇ 3 fatty acids. If so, it can be said to be equivalent to the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, and 9, and is included in the DNA of the present invention.
  • DNA "homology” is calculated using publicly available or commercially available software with algorithms that compare a reference sequence to a query sequence. Specifically, BLAST, FASTA, GENETYX (manufactured by Software Development Co., Ltd.), etc. can be used, and these can be used by setting default parameters.
  • a base sequence encoding a polypeptide in which one or several amino acid residues are substituted, added, inserted, or deleted at any divergent site of the amino acid sequence may also be used to specifically target the ⁇ 3 position of ⁇ 3 fatty acids.
  • DNA is included in the present invention as long as it encodes a polypeptide having catalytic activity to epoxidize to.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence encoding the above-mentioned polypeptide also specifically epoxidizes the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid.
  • it encodes a polypeptide having catalytic activity it is included in the DNA of the present invention.
  • a stringent condition for example, the nylon membrane on which the DNA is immobilized is heated using 6x SSC (1x SSC is 8.76 g of sodium chloride and 4.41 g of sodium citrate dissolved in 1 liter of water).
  • a DNA library is prepared by connecting DNA obtained from an appropriate gene source to a plasmid or phage vector according to a standard method.
  • This library is introduced into a suitable host, the resulting transformant is cultured on a plate, the grown colonies or plaques are transferred to a nitrocellulose or nylon membrane, and the DNA is fixed to the membrane after denaturation treatment.
  • This membrane is kept warm under the above stringent conditions in a solution having the above composition containing a probe previously labeled with 32P or the like, and hybridization is carried out.
  • a polynucleotide encoding all or part of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 can be used.
  • the DNA of the present invention can also be isolated from a microorganism that produces the above-mentioned predetermined polypeptide.
  • a microorganism that produces the above-mentioned predetermined polypeptide.
  • PCR or hybridization using primers or probes designed taking into account gene degeneracy based on known amino acid sequence information, or primers or probes designed based on known base sequence information.
  • the DNA of interest can be isolated from the genome of the above-mentioned microorganism by the hybridization method.
  • the DNA of the present invention includes various types of DNA derived from codon degeneracy. Artificial production of various types of DNA encoding the same amino acid sequence can be easily performed using known genetic engineering techniques. For example, in the production of a protein by genetic engineering, if the codons used in the original gene encoding the target protein are infrequently used in the host, the amount of protein expressed may be low. There is. In such cases, high expression of the target protein can be achieved by optimizing the codon usage frequency for the host without changing the encoded amino acid sequence.
  • the total host optimal codon usage frequency for each codon may be adopted.
  • the optimal codon is defined as the most frequently used codon among the codons corresponding to the same amino acid.
  • the codon usage frequency is not particularly limited as long as it is optimized for the host, and examples of optimal codons for E. coli include the following.
  • F phenylalanine (ttt), L: leucine (ctg), I: isoleucine (att), M: methionine (atg), V: valine (gtg), Y: tyrosine (tat), stop codon (taa), H: histidine (cat), Q: glutamine (cag), N: asparagine (aat), K: lysine (aaa), D: aspartic acid (gat), E: glutamic acid (gaa), S: serine (agc), P: Proline (ccg), T: threonine (acc), A: alanine (gcg), C: cysteine (tgc), W: tryptophan (tgg), R: arginine (cgc), G: glycine (ggc).
  • Methods for introducing mutations into genes and artificially modifying amino acid sequences include known methods such as the Kunkel method and the Gapped duplex method, and mutation introduction kits using site-directed mutagenesis methods, such as the QuikChangeTM Site.
  • Site-directed mutagenesis methods such as the QuikChangeTM Site.
  • -Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis s System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.: Takara Bio Inc.), etc.
  • Kunkel method and the Gapped duplex method
  • mutation introduction kits using site-directed mutagenesis methods such as the QuikChangeTM Site.
  • Site-directed mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis s System (Mutan
  • Confirmation of the DNA base sequence can be performed by sequencing using a conventional method. For example, it can be carried out by the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463). Furthermore, the sequence can be analyzed using an appropriate DNA sequencer.
  • DNA encoding the polypeptide of interest can be confirmed by comparing the determined base sequence with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence deduced from the determined base sequence can be compared with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. It can also be confirmed by measuring the catalytic activity of the expressed polypeptide (catalytic activity that specifically epoxidizes the ⁇ 3 position of ⁇ 3 fatty acids).
  • the present invention may relate to an expression cassette containing the above-mentioned DNA or a recombinant vector containing the above-mentioned DNA.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present invention can be obtained by linking a promoter and a terminator to the above-mentioned DNA.
  • a recombinant vector can be obtained by inserting the expression cassette of the present invention or the DNA of the present invention into an expression vector.
  • the expression cassette of the present invention or the recombinant vector of the present invention contains transcription elements such as an enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc. as necessary, in addition to a promoter and a terminator, as control elements. It's okay. These control factors only need to be operably linked to the DNA of the present invention. Operably linked means that various control factors that regulate the DNA of the present invention and the DNA of the present invention are linked in a state in which they can operate in a host cell.
  • the expression vector for constructing the recombinant vector of the present invention one constructed for genetic recombination from a phage, plasmid, or virus that can autonomously propagate within a host is suitable.
  • Such expression vectors are known.
  • commercially available expression vectors include pQE-based vectors (QIAGEN Co., Ltd.), pDR540, pRIT2T (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), and pET-based vectors. (Merck Co., Ltd.), pHY300PLK, pBE-S (Takara Bio Co., Ltd.), and the like.
  • Expression vectors may be used by selecting an appropriate combination with a host cell. For example, when using E.
  • coli as a host cell, a combination of a pBAD vector and a DH5 ⁇ E. coli strain, a pET vector and a BL21 (DE3) vector, etc.
  • Examples include a combination of E. coli strains, or a combination of pDR540 vector and JM109 E. coli strain.
  • the DNA and the expression cassette or expression vector are joined using, for example, DNA ligase.
  • the present invention may relate to a transformant having the above-mentioned DNA, the above-mentioned expression cassette, or the above-mentioned recombinant vector. That is, the transformant of the present invention is a transformant obtained by transforming a host with an expression cassette containing the above-mentioned DNA or a recombinant vector containing the above-mentioned DNA.
  • the host used for producing the transformant is not particularly limited as long as it is capable of expressing the characteristics of the gene containing the DNA of the present invention, but any host that can introduce the gene and stably carry out the expression cassette or recombinant vector may be used. It is preferable that it can be maintained and autonomously propagated.
  • Preferred examples of the host include bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida; yeast, etc.
  • other cells such as animal cells, insect cells, and plants may also be used.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing an expression cassette containing the above-mentioned DNA or a recombinant vector containing the above-mentioned DNA into a host.
  • the location where the DNA is introduced is not particularly limited as long as the gene of interest is expressed, and may be on a plasmid or on the genome.
  • Specific methods for introducing the expression cassette or recombinant vector into a host include, for example, the recombinant vector method and the genome editing method.
  • Conditions for introducing the expression cassette or recombinant vector into the host may be appropriately set depending on the type of host and the like. If the host is a bacterium, examples include a method using competent cells treated with calcium ions, an electroporation method, and the like.
  • examples include electroporation, spheroplast method, and lithium acetate method.
  • examples include electroporation method, calcium phosphate method, and lipofection method.
  • examples include the calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method, and the like.
  • examples include electroporation method, Agrobacterium method, particle gun method, and PEG method.
  • Confirmation of whether the expression cassette or recombinant vector has been integrated into the host can be performed by PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method, etc.
  • the genomic DNA, expression cassette or recombinant vector may be isolated and purified from the transformant. Isolation and purification of genomic DNA, expression cassettes, or recombinant vectors is performed, for example, when the host is a bacterium, by lysing the bacterium to obtain a lysate.
  • a lytic enzyme such as lysozyme
  • protease, other enzymes, and a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) are used in combination.
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • Isolation and purification of DNA from a lysate can be carried out, for example, by appropriately combining protein removal treatment using phenol treatment or protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation treatment, and commercially available kits.
  • DNA cleavage can be performed according to a conventional method, for example, using restriction enzyme treatment.
  • restriction enzyme for example, a type II restriction enzyme that acts on a specific nucleotide sequence is used.
  • PCR when confirming whether the expression cassette or recombinant vector has been integrated into the host by PCR method, it is also possible to perform PCR using primers labeled with a fluorescent dye or the like in advance and detect the amplification product. Furthermore, a method of binding the amplification product to a solid phase such as a microplate and confirming the amplification product by fluorescence, enzyme reaction, etc. may also be adopted.
  • the present invention relates to a method for producing oxygenase, which includes the step of culturing the transformant described above.
  • the culture conditions for the step of culturing the transformant may be appropriately set in consideration of the nutritional and physiological properties of the transformant, but preferably liquid culture is used. Furthermore, in the case of industrial production, it is preferable to employ aerated agitation culture.
  • the nutrient source of the medium those necessary for the growth of the transformant are used.
  • the carbon source may be any carbon compound that can be assimilated, and examples thereof include glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, and pyruvic acid.
  • the nitrogen source may be any nitrogen compound that can be assimilated, such as peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, and soybean meal alkaline extract.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, and specific vitamins may be used as necessary. You may.
  • the culture temperature is appropriately set within a range where the transformant can grow and the transformant produces the desired oxygenase.
  • the culture temperature is preferably about 15 to 37°C. Cultivation can be completed at an appropriate time, taking into account the time when the maximum yield of oxygenase is reached, and the cultivation time is usually about 12 to 48 hours.
  • the culture solution is subjected to a method such as centrifugation, and the culture supernatant and/or bacterial cells are collected.
  • the bacterial cells are treated with mechanical methods such as ultrasound or French press, or with lytic enzymes such as lysozyme, and if necessary, by using enzymes such as protease or surfactants such as sodium lauryl sulfate (SDS). Solubilize to obtain a water-soluble fraction containing the desired oxygenase.
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • the water-soluble fraction containing oxygenase obtained as described above may be subjected to purification treatment as it is, or may be subjected to purification treatment after concentrating the oxygenase in the water-soluble fraction.
  • Concentration can be performed, for example, by vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment, fractional precipitation using a hydrophilic organic solvent (eg, methanol, ethanol, and acetone), and the like.
  • the purification treatment can be performed by appropriately combining methods such as gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the purified predetermined oxygenase may be powdered by freeze-drying, vacuum drying, spray drying, or the like, if necessary.
  • the present invention relates to a method for producing an ⁇ 3-position epoxidized fatty acid, which includes a step of allowing the above-mentioned polypeptide or the above-mentioned ⁇ 3-position epoxidation enzyme agent to act on a highly unsaturated fatty acid ( ⁇ 3-based fatty acid).
  • a fatty acid in which only the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid is epoxidized ⁇ 3 position epoxidized fatty acid
  • ⁇ 3 fatty acid by treating the ⁇ 3 fatty acid with the above-mentioned polypeptide (oxygenase), a fatty acid in which only the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid is epoxidized ( ⁇ 3-epoxidized fatty acid) can be obtained.
  • the ⁇ 3-position epoxidized fatty acid obtained by the production method of the present invention is not particularly limited, but examples of the ⁇ 3-position epoxidized fatty acid include 19,20-epoxydocosapentaenoic acid (19,20-EpDPE), Examples include 19,20-epoxy docosatetraenoic acid (19,20-EpDTE) and 17,18-epoxyeicosatetraenoic acid (17,18-EpETE). Among these, the ⁇ 3-position epoxidized fatty acid is preferably 17,18-epoxyeicosatetraenoic acid (17,18-EpETE).
  • omega-3 fatty acids include fish oil, flaxseed oil, perilla oil, fish oil and algae, docosahexaenoic acid extracted from plants, docosapentaenoic acid, eicosapentaenoic acid, arachidonic acid, alpha-linolenic acid, stearidonic acid, 11, Examples include 14,17-eicosatrienoic acid, tetracosapentaenoic acid, and tetracosahexaenoic acid.
  • the omega-3 fatty acid is preferably at least one selected from the group consisting of docosahexaenoic acid, docosapentaenoic acid, eicosapentaenoic acid, arachidonic acid, and alpha-linolenic acid; It is more preferably at least one selected from the group consisting of pentaenoic acid and eicosapentaenoic acid, and even more preferably eicosapentaenoic acid.
  • the ⁇ 3 fatty acids may be in the form of fats and oils containing these fatty acids.
  • the properties of the omega-3 fatty acids are not particularly limited either, but liquid, slurry, and paste are preferred.
  • the amount of polypeptide (oxygenase) used in the method for producing ⁇ 3-position epoxidized fatty acids of the present invention is not particularly limited, it is preferable that the oxygenase enzyme activity per mL of reaction solution is 0.0001 U or more. . From the viewpoint of further enhancing the effect, the oxygenase enzyme activity per mL of reaction solution is more preferably 0.0005 U or more, even more preferably 0.001 U or more, even more preferably 0.005 U or more. , 0.01U or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the oxygenase enzyme activity per mL of reaction solution is not particularly limited, but for example, it is preferably 10 U or less, more preferably 5 U or less, even more preferably 1 U or less, and even more preferably 0.5 U or less. It is even more preferable that the amount is 0.1 U or less.
  • the enzymatic activity of oxygenase can be evaluated using the amount of decrease in the coenzyme NADPH as an index.
  • the amount of NADPH can be quantified by measuring the absorbance of the reaction solution at 360 nm using an absorption photometer.
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • enzymes other than the above-mentioned oxygenase may be used in combination.
  • the enzyme used in combination is preferably one or more enzymes selected from the group consisting of NADPH regenerating enzymes, enzymes that remove active oxygen, and enzymes that remove hydrogen peroxide.
  • the reaction rate can be increased by using the above-mentioned combined enzyme in addition to the above-mentioned oxygenase. can increase the production rate.
  • the order in which each enzyme is acted upon that is, the order in which oxygenase and the combined enzyme are treated
  • is simultaneous treatment is simultaneous treatment.
  • NADPH regenerating enzyme Preferred embodiments of the NADPH regenerating enzyme, the enzyme that removes active oxygen, and the enzyme that removes hydrogen peroxide are as described in the item (enzyme agent) above.
  • the amount of NADPH regenerating enzyme used in the method for producing ⁇ 3-position epoxidized fatty acids of the present invention is not particularly limited, but the enzyme activity per 1 mL of reaction solution is preferably 0.1 U or more. From the viewpoint of further enhancing the effect, the NADPH regenerating enzyme activity per mL of reaction solution is more preferably 0.5 U or more, even more preferably 1.0 U or more, and even more preferably 3.5 U or more. Preferably, it is particularly preferably 7.0U or more.
  • the upper limit of NADPH regenerating enzyme activity per mL of reaction solution is not particularly limited, but for example, it is preferably 500 U or less, more preferably 100 U or less, even more preferably 50 U or less, and 20 U or less. is more preferable, it is even more preferable that it is 15 U or less, and it is particularly preferable that it is 10 U or less.
  • the activity of NADPH regenerating enzyme is calculated by quantifying the amount of NADPH produced from the substrate NADP.
  • NADPH can be quantified by measuring the absorbance of the reaction solution at 360 nm with an absorption photometer. 1 unit is defined as the generation of 1 ⁇ M NADPH (mM) per minute.
  • the amount of enzyme for removing active oxygen and hydrogen peroxide used in the method for producing ⁇ 3-position epoxidized fatty acids of the present invention is not particularly limited, but the enzyme activity per 1 mL of reaction solution is preferably 0.1 U or more. . From the viewpoint of further increasing the effect, the activity of the enzyme that removes active oxygen and hydrogen peroxide per 1 mL of the reaction solution is more preferably 1 U or more, even more preferably 10 U or more, and even more preferably 25 U or more. is more preferable, and particularly preferably 45U or more.
  • the upper limit of the activity of the enzyme that removes active oxygen and hydrogen peroxide per mL of reaction solution is not particularly limited, but for example, it is preferably 5000 U or less, more preferably 3000 U or less, and preferably 1000 U or less. More preferably, it is 100 U or less, even more preferably 75 U or less, and particularly preferably 60 U or less.
  • the activity of catalase decomposes 1.0 ⁇ mol of H 2 O 2 , and during this time, the rate of decrease in the H 2 O 2 concentration is measured using absorbance at 240 nm. It is calculated as follows. 1 unit is defined as 1 ⁇ M H 2 O 2 (mM) consumed per minute. Furthermore, among enzyme activities that remove active oxygen and hydrogen peroxide, peroxidase activity is calculated by generating purpurogallin from pyrogallol and hydrogen peroxide and measuring the amount of color developed. 1 unit is the amount of enzyme that produces 1 mg of purpurogallin in 20 seconds using pyrogallol and hydrogen peroxide as main substrates.
  • the activity of superoxide dismutase is calculated by measuring the amount of superoxide radicals produced by xanthine oxidase using a tetrazolium salt. 1 unit is defined as the amount of enzyme required to disproportion 50% of superoxide radicals.
  • Reaction time for causing oxygenase (if necessary, one or more enzymes selected from the group consisting of NADPH regenerating enzymes, enzymes that remove active oxygen, and enzymes that remove hydrogen peroxide) to act on ⁇ 3 fatty acids.
  • temperature, pH of the reaction solution, etc. are not particularly limited.
  • the reaction temperature is, for example, preferably 20 to 50°C, more preferably 25 to 45°C, even more preferably 30 to 40°C.
  • the pH of the reaction solution is, for example, preferably 5 to 10, more preferably 6 to 9.5, and even more preferably 7 to 9.
  • the reaction time is, for example, preferably 10 minutes to 48 hours, more preferably 1 to 24 hours, even more preferably 2 to 12 hours, and particularly preferably 2 to 6 hours. Under the above reaction conditions, epoxidation of the ⁇ 3 position of the ⁇ 3 fatty acid can proceed more efficiently.
  • These reaction conditions are appropriately selected depending on the target epoxidized fatty acid. Note that the optimal reaction conditions may be determined
  • oxygenase (if necessary, one or more enzymes selected from the group consisting of an NADPH regenerating enzyme, an enzyme that removes active oxygen, and an enzyme that removes hydrogen peroxide) A step of deactivating the enzyme) may be provided.
  • an ⁇ 3-position epoxidized fatty acid or a composition containing an ⁇ 3-position epoxidized fatty acid can be produced. That is, the present invention may relate to an ⁇ 3-epoxidized fatty acid or a composition containing an ⁇ 3-epoxidized fatty acid obtained by the above method for producing an ⁇ 3-epoxidized fatty acid.
  • composition containing an ⁇ 3-position epoxidized fatty acid 80% by mass or more of the fatty acids contained is preferably an ⁇ 3-epoxidized fatty acid, more preferably 90% or more by mass is an ⁇ 3-epoxidized fatty acid, and 95% by mass It is more preferable that % or more of the fatty acids are epoxidized fatty acids at the ⁇ 3 position.
  • the present invention relates to a method for epoxidizing ⁇ 3 fatty acids, which includes a step of allowing the above-mentioned polypeptide or the above-mentioned enzyme agent for epoxidizing the ⁇ 3 position to act on the ⁇ 3 fatty acids.
  • the above-mentioned combined enzymes can also be used in the method for epoxidizing omega-3 fatty acids of the present invention.
  • the reaction conditions in the method for epoxidizing ⁇ 3 fatty acids are the same as those in the step of applying polypeptide (oxygenase) to ⁇ 3 fatty acids in the method for producing epoxidized fatty acids at the ⁇ 3 position described above.
  • Site-directed mutagenesis was performed on each of the seven amino acid residues that received a high score from the above MD calculation. Site-directed mutagenesis refers to the production of mutant enzymes in which selected amino acid residues are replaced with original amino acid residues (wild type) by other amino acid residues (19 types). According to the method described below, 133 types of mutant enzymes with amino acid substitutions were prepared, and a reaction between the enzyme and the substrate (EPA) was performed. The product after the reaction was analyzed by HPLC.
  • mutant enzyme In addition to F87K, a double mutant enzyme was created in which an additional amino acid was substituted. Regarding the amino acid residues selected by the above MD calculation, 57 types of double mutant enzymes were produced. The reaction was carried out under the conditions of ⁇ Condition 1> in ⁇ EPA epoxidation reaction and high performance liquid chromatography (HPLC) analysis> described below, and the product was analyzed by HPLC. As a result, the amount of 17,18-EpETE produced was improved with multiple double mutant enzymes compared to the mutant enzyme (F87K). In particular, the mutant enzyme (F87K-A330V) produced the highest amount of 17,18-EpETE.
  • mutant enzymes (3) As before, site-directed mutagenesis was performed on selected amino acid residues. Fifty-seven types of triple mutant enzymes were produced by PCR, with amino acid substitutions in addition to F87K and A330V. These triple mutant enzymes were reacted with the substrate EPA, and the products were analyzed by HPLC. As a result, the mutant enzyme (P25L-F87K-A330V) and mutant enzyme (F87K-A330V-T438M) had improved epoxidation position specificity and a high production rate of 17,18-EpETE from EPA ( Figure 4 ).
  • mutant enzyme F87K-A330V-T438M
  • mutant enzyme had improved epoxidation position specificity, and the production rate of 17,18-EpETE from EPA was 96% (lower panel of FIG. 4).
  • mutant enzyme P25L-F87K-A330V
  • EPA consumption was improved and product inhibition was resolved.
  • the production rate of 17,18-EpETE was slightly lowered to 85% compared to the case without the combination (upper panel of FIG. 5).
  • the peak production amount was reached at 3 hours, indicating that the enzyme reaction proceeded in a shorter time than when no combination was used (upper panel of FIG. 5).
  • the production rate of 17,18-EpETE was 97%, which was further improved compared to the case without the combination (lower panel of FIG. 5).
  • the peak production amount was at 5 hours, indicating that the enzyme reaction proceeded in a shorter time compared to when no combination was used (lower panel of Figure 5). From the above results, it was found that the combined effect improved the conversion rate of the substrate when compared at the same reaction time.
  • the cells were cultured at 37°C for 18 hours to obtain a preculture solution.
  • the preculture solution was inoculated into 1 mL of TB medium (manufactured by Invitrogen Co., Ltd.) supplemented with kanamycin (final concentration 50 ⁇ g/mL).
  • the cells were cultured at 37° C. for 48 hours (IPTG (final concentration 0.1 mM) was added 24 hours after the start of culture), and the bacterial cells were collected by centrifugation.
  • ⁇ Template plasmid> P450-BM3 expression vector: approximately 50 ng/ ⁇ L ⁇ PCR reaction composition> (total volume 25 ⁇ L) Prime STAR MAX DNA Polymerase (Takara Bio Inc.): 12.5 ⁇ L Template plasmid: 0.5 ⁇ L Each primer (primer combinations were as shown in Table 4): 0.5 ⁇ L x 2 Ultrapure water (Milli Q water): 11 ⁇ L
  • ⁇ PCR conditions> Repeat 10 cycles of reaction at 98°C for 30 seconds, 98°C for 10 seconds, and 68°C for 8 minutes. Leave at 4°C for 10 minutes at 72°C.
  • ⁇ In-fusion reaction> A reaction solution having the following composition was prepared (total volume: 10 ⁇ L) and heated at 50° C. for 15 minutes in a thermal cycler.
  • E. coli BL21 DE3 (Nippon Gene)
  • ⁇ Plasmid purification/sequence confirmation> The grown colonies were inoculated into LB medium (manufactured by Invitrogen Co., Ltd.) supplemented with kanamycin (final concentration 50 ⁇ g/mL). The cells were cultured at 37°C for 18 hours to obtain a bacterial cell culture solution. Bacterial cells were collected by centrifugation, and each plasmid was purified using a plasmid miniprep kit, NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio Inc.). The DNA sequence of the gene was confirmed by Sanger sequencing. The DNA sequences of the mutant enzyme (F87K, F87I, F87H) genes were as shown in SEQ ID NOs: 3, 5, and 7, respectively.
  • mutant recombinant P450-BM3 (F87K, F87H, F87I) 1 ⁇ L of the constructed mutant P450-BM3 expression vector was injected into E. coli. The mixture was mixed with 2 ⁇ L of E. coli BL21 (DE3) (Nippon Gene) and transformed. After recovery culture at 37°C for 20 minutes, the transformation solution was applied to an LB agar medium plate (manufactured by Invitrogen Co., Ltd.) supplemented with kanamycin (final concentration 50 ⁇ g/mL), and cultured at 37°C for 18 hours.
  • E. coli BL21 DE3 (Nippon Gene)
  • the grown colonies were inoculated into LB medium (manufactured by Invitrogen Co., Ltd.) supplemented with kanamycin (final concentration 50 ⁇ g/mL).
  • the cells were cultured at 37°C for 18 hours to obtain a preculture solution.
  • the preculture solution was inoculated into 1 mL of TB medium (manufactured by Invitrogen Co., Ltd.) supplemented with kanamycin (final concentration 50 ⁇ g/mL).
  • the cells were cultured at 37° C. for 48 hours (IPTG (final concentration 0.1 mM) was added 24 hours after the start of culture), and the bacterial cells were collected by centrifugation.
  • IPTG final concentration 0.1 mM
  • Mutant recombinant P450-BM3 (F87K-A330V) was produced in the same manner as described above, except that the mutant P450-BM3 (F87K-A330V) expression vector was used instead of the mutant P450-BM3 expression vector. Bacterial cells expressing this were collected. The amino acid sequence of the obtained mutant recombinant P450-BM3 was as shown in SEQ ID NO: 10.
  • mutant recombinant P450-BM3 (F87K-A330V-T438M) PCR primers for mutation introduction (Table 7) were designed, and the mutant P450-BM3 (F87K-A330V) expression vector was used as a template plasmid. Other than that, PCR etc. were performed under the same conditions as the above-mentioned method to obtain a mutant P450-BM3 (F87K-A330V-T438M) expression vector in which a triple mutation was introduced into the CYP102A1 gene.
  • the DNA sequence of the gene was as shown in SEQ ID NO: 13.
  • Mutant recombinant P450-BM3 (F87K- A330V-T438M) was collected.
  • the amino acid sequence of the obtained mutant recombinant P450-BM3 was as shown in SEQ ID NO: 14.
  • ⁇ Condition 2 Combined use with NADPH regenerating enzyme/hydrogen peroxide removing enzyme> 3.3mM substrate EPA (manufactured by Combi-Blocks, dissolved in ethanol), 0.16M glucose (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 7.7U/mL glucose dehydrogenase (NAD type) (Amano Enzyme Co., Ltd.) ), 0.1M Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) containing 50U/ml catalase (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 3mM NADPH (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was added to P450.
  • EPA manufactured by Combi-Blocks, dissolved in ethanol
  • 0.16M glucose manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 7.7U/mL glucose dehydrogenase NAD type
  • HPLC analysis was performed on epoxidized metabolites generated from the substrate EPA.
  • the conditions for HPLC analysis were as follows.
  • the buffer and program were as follows.
  • the peak areas were quantified and EPA, 17,18-EpETE (17,18-epoxyeicosatetraenoic acid), 14,15-EpETE (14,15-epoxyeicosatetraenoic acid), 19-HEPE (19 -hydroxyleicosapentaenoic acid).
  • the peak positions of 17,18-EpETE and 14,15-EpETE were determined using respective standards (manufactured by Cayman Chemical).
  • the peak of 19-HEPE was collected after HPLC analysis, and the structure was identified by NMR.
  • the peak areas were quantified to determine the amounts of DHA, 19,20-EpDPE (19,20-epoxide cosapentaenoic acid), and 16,17-EpDPE (16,17-epoxide cosapentaenoic acid).
  • 19,20-EpDPE (19,20-epoxide docosapentaenoic acid), 16,17-EpDPE (16,17-epoxide docosapentaenoic acid), acid) was produced.
  • 19,20-EpDPE (19,20-epoxide docosapentaenoic acid) produced by epoxidizing the ⁇ 3 position of DHA has physiological effects similar to 17,18-EpETE and is a useful product.
  • the mutant enzyme (F87K-A330V) was 90%
  • the mutant enzyme (P25L-F87K-A330V) was 88%
  • the mutant enzyme (F87K-A330V-T438M) was 96% ( Figures 6 to 8). This result suggested the possibility of industrial production of 19,20-EpDPE, which was impossible with the wild type.
  • the peak area was quantified and used as the amount of DPA and 19,20-EpDTE (19,20-epoxide docosatetraenoic acid).
  • 19,20-EpDTE (19,20-epoxy docosatetraenoic acid) was produced.
  • 19,20-EpDTE (19,20-epoxide docosatetraenoic acid) produced by epoxidizing the ⁇ 3 position of DPA has physiological effects similar to 17,18-EpETE and is a useful product.
  • the present invention it is possible to obtain a modified oxygenase that specifically epoxidizes only the ⁇ 3 position of highly unsaturated fatty acids. Furthermore, according to the present invention, it is possible to industrially produce ⁇ 3-epoxidized fatty acids in which only the ⁇ 3 position is specifically epoxidized.

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Abstract

本発明は、高度不飽和脂肪酸のω３位のみを特異的にエポキシ化する改変型オキシゲナーゼを提供することを課題とする。本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、並びに、該ポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドに関する。

Description

ポリペプチド、オキシゲナーゼ及びこれらの応用
　本発明は、ポリペプチド、オキシゲナーゼ及びこれらの応用に関する。具体的には、本発明は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを改変したオキシゲナーゼ及びその応用に関する。
　シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（以下、Ｐ４５０ともいう）は、細菌から植物や哺乳動物に至る広範囲の生物種が有する一酸素添加酵素である。細菌由来のＰ４５０は、真核生物由来のＰ４５０に比べて高い触媒活性を持つことが知られている。細菌由来のＰ４５０としては、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＰ４５０ｃａｍや、バチルス属細菌の一種であるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＰ４５０－ＢＭ３等が知られている。
　細菌由来のＰ４５０は、脂肪酸等の基質をエポキシ化（水酸化）する高い触媒活性を備えている。また、水に対する親和性が比較的高いため、取得及び取扱いが容易である。こうした理由から、Ｐ４５０は、バイオ触媒として適している。しかし、野生型のＰ４５０は、工業的に有用な炭化水素系基質をエポキシ化するにあたっては、必ずしも触媒活性が高いわけでない。このため、種々の変異型Ｐ４５０が提案されている（例えば、特許文献１～３、非特許文献１～４）。
　アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸は、生体内で種々の化合物に代謝され、各組織で様々な生理作用を示す。例えば、アラキドン酸の代謝系としては、シクロオキシゲナーゼ系、リポキシゲナーゼ系、Ｐ４５０系が知られており、これらの系でアラキドン酸は数多くの化合物に代謝されている。これらの代謝系のうち、Ｐ４５０系では高度不飽和脂肪酸の二重結合のエポキシ化が行われている。特に、高度不飽和脂肪酸のω３位をエポキシ化することにより生成する高度不飽和脂肪酸代謝物は、生体内での抗炎症作用、抗アレルギー作用に重要な物質である（非特許文献５）。
　細菌由来のＰ４５０は生体外においても、高度不飽和脂肪酸と反応することで、ω３位のエポキシ化を触媒する（非特許文献６）。一方、化学的な酸化反応を利用して、高度不飽和脂肪酸をエポキシ化する方法も知られている。この場合は、リパーゼの存在下、過酸化水素と反応させる手法が報告されている（特許文献４）。
特表２０００－５０８１６３号公報 特表２００３－５１７８１５号公報 特表２００３－５２１８８９号公報 特開平０５－０５９０３２号公報
Advanced Synthesis & Catalysis, 2006, 348.6: 763-772. Drug metabolism and disposition, 2010, 38.5: 732-739. Applied microbiology and biotechnology, 2011, 90.1: 147-157 International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22.21: 11380 J Scientific reports, 2015, 5.1: 1-8. Journal of Biological Chemistry, 1996, 271.37: 22663-22671.
　上記の通り、化学的な酸化反応を利用して、高度不飽和脂肪酸をエポキシ化する方法が知られているが、この手法ではω６位、ω９位の二重結合を特異的にエポキシ化することはできるが、生理的に重要なω３位をエポキシ化した高度不飽和脂肪酸代謝物の製造することができない。
　また、細菌由来のＰ４５０を用いて高度不飽和脂肪酸のω３位をエポキシ化する方法も知られている。しかしながら、本発明者らの検討おいて、野生型の細菌由来Ｐ４５０は反応位置特異性が低く、反応が進むに従ってω３位にとどまらず、それ以外の位置の二重結合のエポキシ化が進み、最終的には脂肪酸が分解されてしまうことが分かった。このように、細菌由来Ｐ４５０を用いた場合においても、生理的に重要なω３位のみを特異的にエポキシ化した高度不飽和脂肪酸代謝物を製造は困難であった。
　そこで本発明は、高度不飽和脂肪酸のω３位のみを特異的にエポキシ化する改変型オキシゲナーゼを提供することを課題とする。
　上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明者らは、オキシゲナーゼのアミノ酸配列において所定の位置に特定の変異を導入することで、高度不飽和脂肪酸のω３位のみがエポキシ化したω３位エポキシ化脂肪酸を生成する改変型オキシゲナーゼを得ることに成功した。
　具体的に、本発明は、以下の構成を有する。
［１］　以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチド；
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）上記（１）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有し、かつ、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換は保持されているポリペプチド；
（３）上記（１）に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有し、かつ、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換は保持されているポリペプチド。
（但し、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈとは、配列番号２における８７位のアミノ酸残基であるＦがＫ、ＩもしくはＨに置換されていることを示し、Ａ３３０Ｖとは、配列番号２における３３０位のアミノ酸残基であるＡがＶに置換されていることを示し、Ｐ２５Ｌとは、配列番号２における２５位のアミノ酸残基であるＰがＬに置換されていることを示し、Ｔ４３８Ｍとは、配列番号２における４３８位のアミノ酸残基であるＴがＭに置換されていることを示す。）
［２］　（３）における配列同一性が９５％以上である［１］に記載のポリペプチド。
［３］　オキシゲナーゼである、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］　［１］～［３］のいずれかに記載のポリペプチドを含む、ω３系脂肪酸のω３位エポキシ化用酵素剤。
［５］　ＮＡＤＰＨ再生酵素、活性酸素を除去する酵素及び過酸化水素を除去する酵素よりなる群から選択される一又は二以上の酵素をさらに含む、［４］に記載のω３位エポキシ化用酵素剤。
［６］　以下の（１）から（３）のいずれかに示すＤＮＡ；
（１）［１］に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（２）配列番号３、５、７及び９のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡ；
（３）配列番号３、５、７及び９のいずれかに示す塩基配列と等価の配列を含み、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［７］　［６］に記載のＤＮＡを含む発現カセット。
［８］　［６］に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
［９］　［６］のＤＮＡ、［７］に記載の発現カセット又は［８］に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
［１０］　［９］に記載の形質転換体を培養する工程を含む、オキシゲナーゼの製造方法。
［１１］　ω３系脂肪酸に、［１］～［３］のいずれかに記載のポリペプチドもしくは［４］又は［５］に記載のω３位エポキシ化用酵素剤を作用させる工程を含む、ω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法。
［１２］　ω３系脂肪酸に、［１］～［３］のいずれかに記載のポリペプチドもしくは［４］又は［５］に記載のω３位エポキシ化用酵素剤を作用させる工程を含む、ω３系脂肪酸のエポキシ化方法。
［１３］　［１１］の製造方法で得られる、ω３位エポキシ化脂肪酸を含む組成物。
　本発明によれば、高度不飽和脂肪酸のω３位のみを特異的にエポキシ化する改変型オキシゲナーゼを得ることができる。また、本発明によれば、ω３位のみを特異的にエポキシ化したω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法や該製造方法から製造されるω３位エポキシ化脂肪酸が提供される。
図１は、変異酵素（Ｆ８７Ｋ、Ｆ８７Ｉ、Ｆ８７Ｈ）を用いた場合に、基質であるＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）から生成する１７，１８－ＥｐＥＴＥ（１７，１８－エポキシエイコサテトラエン酸）の検出量についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図２は、基質であるＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図３は、基質であるＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図４は、基質であるＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図５は、基質であるＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図６は、基質であるＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図７は、基質であるＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図８は、基質であるＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図９は、基質であるＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図１０は、基質であるＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。 図１１は、基質であるＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）から生成するエポキシ化化合物についてＨＰＬＣ分析を行った分析結果を示す。
　以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。
　本明細書において、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。その場合、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。また、本明細書において、表示するアミノ酸配列は、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。
　本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファンが含まれる。「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン及びヒスチジンが含まれる。
　本明細書において、「置換」とは、人為的にアミノ酸残基の置換を導入した場合のみならず、自然にアミノ酸残基の置換が導入された場合、すなわち、もともとアミノ酸残基が相違していた場合も含まれる。本明細書においては、アミノ酸残基の置換は、人為的な置換であってもよく、自然な置換であってもよいが、人為的な置換が好ましい。
（ポリペプチド（オキシゲナーゼ））
　本発明は、以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドに関する。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）上記（１）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有し、かつ、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換は保持されているポリペプチド。
（３）上記（１）に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有し、かつ、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換は保持されているポリペプチド。
　但し、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈとは、配列番号２における８７位のアミノ酸残基であるＦがＫ、ＩもしくはＨに置換されていることを示し、Ａ３３０Ｖとは、配列番号２における３３０位のアミノ酸残基であるＡがＶに置換されていることを示し、Ｐ２５Ｌとは、配列番号２における２５位のアミノ酸残基であるＰがＬに置換されていることを示し、Ｔ４３８Ｍとは、配列番号２における４３８位のアミノ酸残基であるＴがＭに置換されていることを示す。
　なお、上記（１）～（３）のポリペプチドには、人為的に置換して得られるポリペプチドのみならず、そのようなアミノ酸配列を有するように自然置換されたポリペプチドも含まれる。
　本明細書においては、アミノ酸置換を、置換前のアミノ酸残基を表す一文字略記、アミノ酸置換が生じるアミノ酸残基の位置（特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側からの位置）を表す数字、及び置換後のアミノ酸残基を表す一文字略記の組合せで表現する。例えば、８７位のフェニルアラニンがリジンに置換されるのであれば「Ｆ８７Ｋ」と表現される。また、置換後のアミノ酸残基が複数種のうちいずれかであってもよい場合には、置換後のアミノ酸残基を表す一文字略記を記号「／」を用いて併記する。例えば、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈとは８７位のフェニルアラニンがリジン、イソロイシン又はヒスチジンに置換されていることを表す。
　また、二つ以上の置換の組合せ（併用）を表す場合、記号「－」を用いる。例えば、８７位のフェニルアラニンのリジンへの置換と、３３０位のアラニンのバリンへの置換の組合せであれば、「Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ」と表現される。
　上記（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドよりも、高度不飽和脂肪酸（ω３系脂肪酸）のω３位を特異的にエポキシ化する触媒活性を有する。本発明者らは、Ｐ４５０の立体構造情報から分子動力学（ＭＤ）計算に基づく酵素－基質反応の分子反応シミュレーションによる酵素の設計、ならびに設計に基づく変異型組み換えＰ４５０の作製、培養、評価を行った結果、ω３位のエポキシ化の特異性を向上させた改変型オキシゲナーゼ（Ｐ４５０）を得ることに成功した。
　ここで、配列番号２のポリペプチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである。本発明のポリペプチドは改変型オキシゲナーゼであることが好ましく、改変型モノオキシゲナーゼであることがより好ましく、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに由来する改変型モノオキシゲナーゼであることがさらに好ましい。ここで、モノオキシゲナーゼは、酸素分子を基質として酸素１原子を化合物に導入する触媒作用を有し、かつ、ヘムや非ヘム鉄，もしくは金属イオンをコファクターとする酵素である。なお、モノオキシゲナーゼは、上記作用が主活性である限り、他の作用をさらに有していても良い。
　本発明のポリペプチドはオキシゲナーゼの一部であってもよく、さらにポリペプチドもしくはオキシゲナーゼは、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、少なくとも、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるものである。本発明のポリペプチドは、少なくとも、Ｆ８７Ｋ、Ｆ８７Ｉ又はＦ８７Ｈのアミノ酸置換を含むことが好ましく、Ｆ８７Ｋ又はＦ８７Ｉのアミノ酸置換を含むことがより好ましく、Ｆ８７Ｋのアミノ酸置換を含むことが特に好ましい。
　本発明のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈのアミノ酸置換を含み、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるものであることが好ましい。より好ましい態様は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｆ８７Ｋのアミノ酸置換を含み、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドである。具体的態様としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆ８７Ｋ－Ｐ２５Ｌのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆ８７Ｋ－Ｔ４３８Ｍのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｐ２５Ｌのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆ８７Ｋ－Ｐ２５Ｌ－Ｔ４３８Ｍのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｐ２５Ｌ－Ｔ４３８Ｍのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。中でも、配列番号２に示すアミノ酸配列において、少なくともＦ８７ＫとＡ３３０Ｖに二重のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。さらに、Ｆ８７ＫとＡ３３０Ｖの二重変異に加えて、さらに、Ｐ２５ＬもしくはＴ４３８Ｍにも変異を有する三重のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドも好ましく、特にＦ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドはω３位を特異的にエポキシ化する触媒活性が発揮されやすいため好ましい。
　本明細書においては、上記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号２の第８７位、第３３０位、第２５位及び第４３８位のアミノ酸残基以外を「任意相違部位」と表記することもある。本明細書において、「任意相違部位」とは、ポリペプチドの特性に大きく影響しない限り、相違が許容される部位である。そして、任意相違部位においてアミノ酸配列に相違がみられるものの、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに比してω３系脂肪酸のω３位を特異的にエポキシ化する触媒活性が向上しているポリペプチドを、上記（１）のポリペプチドの相違体という。すなわち、上記（２）及び（３）のポリペプチドは、上記（１）のポリペプチドの相違体である。また、ポリペプチドの相違体は、上記（１）のポリペプチドと比較して、任意相違部位においてアミノ酸配列に相違がみられるものの、当該ポリペプチドの特性が実質的に同一であることが好ましい。なお、ポリペプチドの特性が実質的に同一とは、ω３系脂肪酸のω３位を特異的にエポキシ化する触媒活性が同等であることをいう。
　上記（２）のポリペプチドにおいて、任意相違部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入及び欠失から選択される１種類の改変（例えば置換のみ）であってもよく、２種以上の改変（例えば置換と挿入）であってもよい。上記（２）のポリペプチドにおいて、任意相違部位におけるアミノ酸の相違の数は、１個又は数個であればよい。相違の数としては、例えば１～８０個、１～７０個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、もしくは、１～２個である。
　上記（３）のポリペプチドにおいて、上記（１）に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることが一層好ましく、９５％以上であることがより一層好ましく、９７％以上であることが特に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。ここで、上記（３）のポリペプチドにおいて、上記（１）に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性とは、上記（１）に記載のアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。本明細書における「配列同一性」は、ＢＬＡＳＴＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７-２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値である。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定して算定される。
　上記（２）及び（３）のポリペプチドの任意相違部位において、アミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の好適な一態様として保存的置換が挙げられる。上記（２）及び（３）のポリペプチドにおけるアミノ酸置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
　なお、上記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列における第２６７位（グルタミン酸）、第２６８位（トレオニン）、第２６４位（アラニン）、第３９３位（フェニルアラニン）のアミノ酸は、電子の伝達、酸素結合の役割を果たし、活性触媒に重要な残基と考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
　上記（２）及び（３）のポリペプチドにおいて、「ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性」は、基質となるω３系脂肪酸のω３位のみをエポキシ化することで得られるω３位エポキシ化脂肪酸をカラムクロマトグラフィーなどで検出することで評価することができる。具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いた場合と比して、ω３位エポキシ化脂肪酸の生成率が増加している場合に、「ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性」があると言える。また、上記（２）及び（３）のポリペプチドを用いた場合のω３位エポキシ化脂肪酸の生成率は、上記（１）のポリペプチドを用いた場合のω３位エポキシ化脂肪酸の生成率と同等以上であることが好ましく、例えば、上記（１）のポリペプチドを用いた場合のω３位エポキシ化脂肪酸の生成率を１とした場合、上記（２）及び（３）のポリペプチドを用いた場合のω３位エポキシ化脂肪酸の生成率は、０．８～１．２であることが好ましく、０．９～１．１であることがより好ましく、０．９５～１．０５であることがさらに好ましい。なお、ω３位エポキシ化脂肪酸の生成率とは、基質となるω３系脂肪酸にポリペプチド（オキシゲナーゼ）を作用させて得られる生成物の全質量（全モル濃度）に対するω３位エポキシ化脂肪酸の質量（モル濃度）の割合である。
　本発明のポリペプチド（オキシゲナーゼ）の基質特異性は高く、ω３系脂肪酸のω３位を特異的にエポキシ化する。具体的には、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を基質として上記（１）～（３）のポリペプチドを作用させたときのω３位エポキシ化脂肪酸の生成率が４０％以上である場合に、ω３系脂肪酸のω３位を特異的にエポキシ化していると判定できる。なお、ＥＰＡに上記（１）～（３）のポリペプチドを作用させたときのω３位エポキシ化脂肪酸の生成率は、それぞれ４０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、６０％以上であることがさらに好ましく、６５％以上であることが一層好ましく、７０％以上であることがより一層好ましく、８０％以上であることが特に好ましく、８５％以上であることが最も好ましい。また、ＥＰＡに上記（１）～（３）のポリペプチドを作用させたときのω３位エポキシ化脂肪酸の生成率は１００％であってもよい。
（酵素剤）
　本発明は、上述したポリペプチドを含む、高度不飽和脂肪酸（ω３系脂肪酸）のω３位エポキシ化用酵素剤に関するものであってもよい。ω３位エポキシ化用酵素剤は、上述したポリペプチドを有効成分として含む。なお、酵素剤は、上述したポリペプチドからなるものであってもよい。
　本発明の酵素剤における上記ポリペプチドの含有量は特に限定されるものではなく、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性が発揮される範囲で適宜設定することができる。
　本発明の酵素剤は、上記ポリペプチド以外に、本発明の効果に影響を与えない程度に、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、上記ポリペプチド以外の他の酵素、添加剤、後述する製造方法で生じた培養残渣等が挙げられる。中でも、酵素剤は、上記ポリペプチド以外の他の酵素を含むことが好ましく、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する際には、上記ポリペプチドに加えて、併用酵素を用いてもよい。
　具体的には、酵素剤には、上記ポリペプチドに加えて、ＮＡＤＰＨ再生酵素、活性酸素を除去する酵素及び過酸化水素を除去する酵素よりなる群から選択される一又は二以上の酵素が含まれていてもよい。ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する際には、上記ポリペプチドに加えて、上記併用酵素を使用することにより、反応速度を高めることができ、ω３位エポキシ化脂肪酸の生成速度を高めることができる。
　ＮＡＤＰＨ再生酵素としては、補酵素ＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに変換可能な酵素であれば特に限定されない。ＮＡＤＰＨ再生酵素は、モノオキシゲナーゼが反応で消費する補酵素ＮＡＤＰＨを再生することで、酵素の再活性化を実現する。そのため、同じ反応時間で比較すると基質の変換速度を向上させる効果がある。
　ＮＡＤＰＨ再生酵素の種類としては、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、Ｄ－乳酸脱水素酵素、りんご酸脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、グルコース６リン酸脱水素酵素が挙げられる。ＮＡＤＰＨ再生酵素としては、これらのＮＡＤＰＨ再生酵素から１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのＮＡＤＰＨ再生酵素の中でも、効果をより一層高める観点から、好ましくはＮＡＤ（Ｐ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ））が挙げられる。グルコースデヒドロゲナーゼの具体例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに由来するグルコースデヒドロゲナーゼが挙げられる。
　ＮＡＤＰＨ再生酵素は、公知の方法により調製することができる。一例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来グルコースデヒドロゲナーゼを調製する場合、生産菌を培養し、グルコースデヒドロゲナーゼを公知の手段を用いて分離する方法、及び遺伝子組み換え技術を用いる方法等によって容易に調製することができる。また、ＮＡＤＰＨ再生酵素として、市販品を用いてもよい。市販品のＮＡＤＰＨ再生酵素としては、天野エンザイム（株）製グルコースデヒドロゲナーゼ、オリエンタル酵母社製ＡＤＨ、ｒＤ－ＬＤＨ、ｒＭＤＨ、ｒＩＣＤＨ、ｒＧ６ＰＤＨが挙げられる。
　活性酸素を除去する酵素や過酸化水素を除去する酵素としては、活性酸素を過酸化水素と分子状酸素に不均化する酵素、又は過酸化水素を水に変換可能な酵素であれば特に限定されない。活性酸素を除去する酵素や過酸化水素を除去する酵素は、モノオキシゲナーゼが反応で生成する活性酸素や過酸化水素を分解して酵素を保護する効果がある。そのため、モノオキシゲナーゼの失活を防止して基質の変換速度を向上させる効果がある。
　活性酸素を除去する酵素や過酸化水素を除去する酵素の種類としては、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼが挙げられる。これらの活性酸素や過酸化水素を除去する酵素から１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの活性酸素や過酸化水素を除去する酵素の中でも、効果をより一層高める観点から、好ましくはカタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼが挙げられる。
　活性酸素を除去する酵素や過酸化水素を除去する酵素としては、動物臓器、西洋わさび、大腸菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に由来するカタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼを用いることもできる。これらのカタラーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼの中でも、効果をより一層高める観点から、好ましくは動物臓器由来カタラーゼ又は、動物由来スーパーオキシドディスムターゼが挙げられる。
　活性酸素を除去する酵素や過酸化水素を除去する酵素は、公知の方法により調製することができる。例えば、動物由来カタラーゼを調製する場合、動物臓器からカタラーゼを公知の手段を用いて分離する方法や、遺伝子組み換え技術を用いる方法等によって容易に調製することができる。また、活性酸素や過酸化水素を除去する酵素として、市販品を用いてもよい。市販品の活性酸素や過酸化水素を除去する酵素としては、富士フイルム和光社製カタラーゼ、富士フイルム和光社製ペルオキシダーゼ、シグマ―アルドリッチ社製スーパーオキシドディスムターゼ、東洋紡社製スーパーオキシドディスムターゼが挙げられる。
　酵素剤が含み得る他の酵素としては、その他に、アミラーゼ（α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、グルコアミラーゼ）、グルコシダーゼ（α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ）、プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ）、ペプチダーゼ（ロイシンペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ）、リパーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ホスファターゼ（酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ）、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、グルタミナーゼ、ペクチナーゼ、カタラーゼ、デキストラナーゼ、トランスグルタミナーゼ、蛋白質脱アミド酵素、プルラナーゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ等が挙げられる。これらの他の酵素は、１種であってもよく、複数種であってもよい。
　添加剤としては、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ-グルコース、ソルビトール、Ｄ-マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられる。安定剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。これらの添加剤は、１種であってもよく、複数種であってもよい。
　培養残渣としては、培地由来の成分、夾雑タンパク質、菌体成分等が挙げられる。
　本発明の酵素剤の形態としては特に限定されず、例えば、液状、固形状（粉末、顆粒等）、担体への固定等が挙げられる。
（ＤＮＡ）
　本発明は、以下の（１）から（３）のいずれかに示すＤＮＡに関する。
（１）上述したポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（２）配列番号３、５、７及び９のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡ。
（３）配列番号３、５、７及び９のいずれかに示す塩基配列と等価の配列を含み、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
　配列番号３に示される塩基配列は配列番号４に示すＦ８７Ｋ変異体のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡ配列、配列番号５に示される塩基配列は配列番号６に示すＦ８７Ｋ及びＡ３３０Ｖ二重変異体のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡ配列、配列番号７に示される塩基配列は配列番号８に示すＰ２５Ｌ、Ｆ８７Ｋ及びＡ３３０Ｖ三重変異体のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡ配列、配列番号９に示される塩基配列は配列番号１０に示すＦ８７Ｋ、Ａ３３０Ｖ及びＴ４３８Ｍ三重変異体のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡ配列である。
　上記（１）のＤＮＡに対する上記（３）のＤＮＡの相同性は、７５％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることが一層好ましく、９５％以上であることがより一層好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。配列番号３、５、７及び９のいずれかに示す塩基配列と異なる配列を有するＤＮＡであっても、ω３系脂肪酸のω３位を特異的にエポキシ化する触媒活性を有するポリペプチドをコードするものであれば、配列番号３、５、７及び９のいずれかに示す塩基配列と等価であると言うことができ、本発明のＤＮＡに含まれる。
　ＤＮＡの「相同性」は、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることができ、これらはデフォルトパラメーターに設定して使用すればよい。
　また、アミノ酸配列の任意相違部位において１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなるポリペプチドをコードする塩基配列も、それがω３系脂肪酸のω３位を特異的にエポキシ化する触媒活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
　さらに、上述したポリペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがω３系脂肪酸のω３位を特異的にエポキシ化する触媒活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液（本明細書において、「％」は「ｗ／ｖ」を意味する。）中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができる。しかし、この条件に限定されず、当業者であれば、このような緩衝液の塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））等を参照することができる。
　以下に、ハイブリダイゼーションにより本発明のＤＮＡを得る方法の一例を示すが、本発明のＤＮＡを得る方法は以下に限定されない。
　まず、適当な遺伝子源から得たＤＮＡを定法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してＤＮＡライブラリを作製する。このライブラリを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移しとり、変性処理の後にＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ３２Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、配列番号２に記載したアミノ酸配列の全部又は一部をコードするポリヌクレオチドを使用することができる。
　ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィ等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンが単離できるまで繰り返す。最後に、得られたクローンの中から、目的の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。遺伝子の単離は、アルカリ法等の公知のポリヌクレオチド抽出法により実施できる。
　また、本発明のＤＮＡは、上記所定のポリペプチドを産生する微生物から単離することもできる。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのゲノムＤＮＡを鋳型として、既知のアミノ酸配列情報から遺伝子の縮重を考慮して設計したプライマー若しくはプローブ又は既知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーション法により、上記微生物のゲノムから目的のＤＮＡを単離することができる。
　本発明のＤＮＡには、コドンの縮重に由来する多種のＤＮＡが包含される。同じアミノ酸配列をコードする多種のＤＮＡを人為的に作製することは、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に行うことができる。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドン利用頻度を宿主に最適化することにより、目的タンパク質の高発現を図ることができる。
　コドン利用頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン利用頻度の総計を採択すればよい。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち利用頻度が最も高いコドンと定義される。コドン利用頻度は、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌の最適コドンの一例として以下のものが挙げられる。
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
　遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法、及び部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ，Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
　ＤＮＡの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することができる。
　得られたＤＮＡが目的のポリペプチドをコードするＤＮＡであるかどうかの確認は、決定された塩基配列を配列番号１に記載の塩基配列と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して行うことができる。また、発現するポリペプチドの触媒活性（ω３系脂肪酸のω３位を特異的にエポキシ化する触媒活性）を測定することによっても確認することができる。
（発現カセット／組み換えベクター）
　本発明は、上述したＤＮＡを含む発現カセット、もしくは、上述したＤＮＡを含む組み換えベクターに関するものであってもよい。本発明の発現カセットもしくは組み換えベクターは、上述したＤＮＡにプロモーター及びターミネーターを連結することにより得ることができる。また、組み換えベクターは、発現用ベクターに本発明の発現カセットもしくは本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
　本発明の発現カセット、もしくは、本発明の組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターに加えて、必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節する種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　本発明の組換えベクターを構築する発現用ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現用ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現用ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＢＥ－Ｓ（タカラバイオ株式会社）等が挙げられる。発現用ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＢＡＤ系ベクターとＤＨ５α大腸菌株の組み合わせ、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ等が挙げられる。ＤＮＡと発現カセット又は発現用ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
（形質転換体）
　本発明は、上述したＤＮＡ、上述した発現カセット又は上述した組み換えベクターを有する形質転換体に関するものであってもよい。すなわち、本発明の形質転換体は、上述したＤＮＡを含む発現カセット、もしくは、上述したＤＮＡを含む組み換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体である。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、本発明のＤＮＡを含む遺伝子の形質を発現できるものであれば特に制限されないが、遺伝子の導入が可能で、発現カセット又は組換えベクターを安定に保持でき、かつ自律増殖可能なものであることが好ましい。宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。
　本発明の形質転換体は、宿主に上述したＤＮＡを含む発現カセット、もしくは、上述したＤＮＡを含む組み換えベクターを導入することによって得ることができる。当該ＤＮＡが導入される場所は、目的の遺伝子が発現される限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。発現カセット又は組換えベクターを宿主に導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。宿主に発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等が挙げられる。
　発現カセット又は組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
　ＰＣＲ法によって発現カセット又は組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、例えば、形質転換体からゲノムＤＮＡ、発現カセット又は組換えベクターを分離・精製すればよい。ゲノムＤＮＡ、発現カセット又は組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して溶菌物を得ることにより行われる。溶菌を行う場合、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ、及び他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用される。また、溶菌を行う場合、凍結融解及びフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
　分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。なお、ＤＮＡの切断は、常法に従い、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。
　また、ＰＣＲ法によって発現カセット又は組換えベクターが宿主に組み込まれたか否かを確認する場合、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光及び酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
（オキシゲナーゼの製造方法）
　本発明は、上述した形質転換体を培養する工程を含む、オキシゲナーゼの製造方法に関する。
　形質転換体を培養する工程の培養条件は、上記形質転換体の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養を採用することが好ましい。培地の栄養源としては、形質転換体の生育に必要とされるものが使用される。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物が挙げられる。炭素源及び窒素源の他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン及び亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用してもよい。
　培養温度は、上記形質転換体が生育可能であり、かつ上記形質転換体が所定のオキシゲナーゼを産生する範囲で適宜設定する。例えば、培養温度は、１５～３７℃程度であることが好ましい。培養は、オキシゲナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２～４８時間程度となる。
　形質転換体を培養する工程の後には、培養液を遠心分離などの方法に供し、培養上清及び／又は菌体を回収する。菌体には、超音波やフレンチプレスといった機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素による処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、所定のオキシゲナーゼを含む水溶性画分を得る。また、適当な発現カセット又は発現用ベクターと宿主を選択することにより、発現したオキシゲナーゼを培養液中に分泌させることもできる。
　上記のようにして得られたオキシゲナーゼを含む水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、該水溶性画分中のオキシゲナーゼを濃縮した後に精製処理に供してもよい。濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール及びアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。また、精製処理は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。精製された所定のオキシゲナーゼは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
（ω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法）
　本発明は、高度不飽和脂肪酸（ω３系脂肪酸）に、上述したポリペプチドもしくは上述したω３位エポキシ化用酵素剤を作用させる工程を含む、ω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法に関する。上述したポリペプチド（オキシゲナーゼ）をω３系脂肪酸に作用させることで、ω３系脂肪酸のω３位のみがエポキシ化した脂肪酸（ω３位エポキシ化脂肪酸）を得ることができる。換言すれば、ω３系脂肪酸を上述したポリペプチド（オキシゲナーゼ）で処理することで、ω３系脂肪酸のω３位のみがエポキシ化した脂肪酸（ω３位エポキシ化脂肪酸）を得ることができる。
　本発明の製造方法で得られるω３位エポキシ化脂肪酸は特に限定されるものではないが、ω３位エポキシ化脂肪酸の例としては、１９，２０－エポキシドコサペンタエン酸（１９，２０－ＥｐＤＰＥ）、１９，２０－エポキシドコサテトラエン酸（１９，２０－ＥｐＤＴＥ）、１７，１８－エポキシエイコサテトラエン酸（１７，１８－ＥｐＥＴＥ）が挙げられる。中でも、ω３位エポキシ化脂肪酸は、１７，１８－エポキシエイコサテトラエン酸（１７，１８－ＥｐＥＴＥ）であることが好ましい。
　本発明のω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法の原料となるω３系脂肪酸の起源、性状等に特段の制約はない。ω３系脂肪酸の具体例としては、魚油、亜麻仁油、エゴマ油、魚油や藻類、植物から抽出されたドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸、αリノレン酸、ステアリドン酸、１１，１４，１７－エイコサトリエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸等が挙げられる。ω３系脂肪酸としては、これらを単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの原料のなかでも、ω３系脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、アラキドン酸及びαリノレン酸よりなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、ドコサヘキサエン酸、ドコサペンタエン酸及びエイコサペンタエン酸よりなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、エイコサペンタエン酸であることがさらに好ましい。また、ω３系脂肪酸は、これらの脂肪酸を含有する油脂の状態であってもよい。ω３系脂肪酸の性状も特に限定されないが、好ましくは、液状、スラリー状、ペースト状が挙げられる。
　本発明のω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法で使用するポリペプチド（オキシゲナーゼ）の量は特に限定されるものではないが、反応溶液１ｍＬ当たりのオキシゲナーゼ酵素活性は、０．０００１Ｕ以上であることが好ましい。効果をより一層高める観点から、反応溶液１ｍＬ当たりのオキシゲナーゼ酵素活性は、０．０００５Ｕ以上であることがより好ましく、０．００１Ｕ以上であることがさらに好ましく、０．００５Ｕ以上であることが一層好ましく、０．０１Ｕ以上であることが特に好ましい。反応溶液１ｍＬ当たりのオキシゲナーゼ酵素活性の上限値は特に限定されないが、例えば１０Ｕ以下であることが好ましく、５Ｕ以下であることがより好ましく、１Ｕ以下であることがさらに好ましく、０．５Ｕ以下であることが一層好ましく、０．１Ｕ以下であることがより一層好ましい。
　オキシゲナーゼの酵素活性については、補酵素であるＮＡＤＰＨの減少量を指標にして評価可能である。ＮＡＤＰＨ量は、吸光光度計で反応溶液の吸光度３６０ｎｍを測定することで定量可能である。また、オキシゲナーゼの酵素活性の測定方法としては、基質をエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）として、オキシゲナーゼを作用させ、ＥＰＡのエポキシ化生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量する分析法がある。ＨＰＬＣのチャート図から算出されるエリア面積から、基質の消費量、生成物の生成量を定量することが可能である。３．３ｍＭ基質ＥＰＡを基質に用いて３５℃で１時間処理した場合に、１分間に１７，１８－ＥｐＥＴＥを１ｍｇ生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（１Ｕ）とする。
　本発明のω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法においては、上記オキシゲナーゼ以外の他の酵素を併用してもよい。併用する酵素は、ＮＡＤＰＨ再生酵素、活性酸素を除去する酵素及び過酸化水素を除去する酵素よりなる群から選択される一又は二以上の酵素であることが好ましい。ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化し、ω３位エポキシ化脂肪酸を製造する際には、上記オキシゲナーゼに加えて、上記併用酵素を使用することにより、反応速度を高めることができ、ω３位エポキシ化脂肪酸の生成速度を高めることができる。なお、各酵素を作用させる順序（すなわち、オキシゲナーゼと併用酵素の処理の順番）は同時処理とすることが好ましい。
　ＮＡＤＰＨ再生酵素、活性酸素を除去する酵素及び過酸化水素を除去する酵素の好ましい態様は、上述した（酵素剤）の項目に記載のとおりである。
　本発明のω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法で使用するＮＡＤＰＨ再生酵素の量は特に限定されないが、反応溶液１ｍＬ当たりの酵素活性は、０．１Ｕ以上であることが好ましい。効果をより一層高める観点から、反応溶液１ｍＬ当たりのＮＡＤＰＨ再生酵素活性は、０．５Ｕ以上であることがより好ましく、１．０Ｕ以上であることがさらに好ましく、３．５Ｕ以上であることが一層好ましく、７．０Ｕ以上であることが特に好ましい。反応溶液１ｍＬ当たりのＮＡＤＰＨ再生酵素活性の上限値は特に限定されないが、例えば５００Ｕ以下であることが好ましく、１００Ｕ以下であることがより好ましく、５０Ｕ以下であることがさらに好ましく、２０Ｕ以下であることが一層好ましく、１５Ｕ以下であることがより一層好ましく、１０Ｕ以下であることが特に好ましい。
　ＮＡＤＰＨ再生酵素の活性については、基質のＮＡＤＰから生成するＮＡＤＰＨ量を定量することで算定される。ＮＡＤＰＨは吸光光度計で反応溶液の吸光度３６０ｎｍを測定することで、定量可能である。１分当たりに１μＭのＮＡＤＰＨ（ｍＭ）が生成することを１ｕｎｉｔと定義する。
　本発明のω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法で使用する活性酸素や過酸化水素を除去する酵素の量は特に限定されないが、反応溶液１ｍＬ当たりの酵素活性は、０．１Ｕ以上であることが好ましい。効果をより一層高める観点から、反応溶液１ｍＬ当たりの活性酸素や過酸化水素を除去する酵素の活性は、１Ｕ以上であることがより好ましく、１０Ｕ以上であることがさらに好ましく、２５Ｕ以上であることが一層好ましく、４５Ｕ以上であることが特に好ましい。反応溶液１ｍＬ当たりの活性酸素や過酸化水素を除去する酵素の活性の上限値は特に限定されないが、例えば５０００Ｕ以下であることが好ましく、３０００Ｕ以下であることがより好ましく、１０００Ｕ以下であることがさらに好ましく、１００Ｕ以下であることが一層好ましく、７５Ｕ以下であることがより一層好ましく、６０Ｕ以下であることが特に好ましい。
　活性酸素や過酸化水素を除去する酵素活性のうち、カタラーゼの活性は１．０μモルのＨ２Ｏ２を分解し、その間に吸光度２４０ｎｍで測定したＨ２Ｏ２濃度の減少率を測定することで算定される。１分当たりに１μＭのＨ２Ｏ２（ｍＭ）が消費されることを１ｕｎｉｔと定義する。また、活性酸素や過酸化水素を除去する酵素活性のうち、ペルオキシダーゼ活性は、ピロガロールと過酸化水素から、プルプロガリンを生成させてその発色量を測定することで算定される。１ｕｎｉｔはピロガロールと過酸化水素を主基質にして２０秒に１ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量とする。活性酸素や過酸化水素を除去する酵素活性のうち、スーパーオキシドディスムターゼの活性は、テトラゾリウム塩を用いて、キサンチンオキシダーゼにより産生されたスーパーオキシドラジカル量を測定することで算定される。１ｕｎｉｔは、スーパーオキシドラジカルの５０％を不均化するために必要な酵素量と定義する。
　ω３系脂肪酸にオキシゲナーゼ（必要に応じて、ＮＡＤＰＨ再生酵素、活性酸素を除去する酵素及び過酸化水素を除去する酵素よりなる群から選択される一又は二以上の酵素）を作用させるための反応時間、温度、反応溶液のｐＨなどは特に限定されるものではない。反応温度は、例えば２０～５０℃であることが好ましく、２５～４５℃であることがより好ましく、３０～４０℃であることがさらに好ましい。反応溶液のｐＨは、例えば５～１０であることが好ましく、６～９．５であることがより好ましく、７～９であることがさらに好ましい。反応時間は、例えば１０分～４８時間であることが好ましく、１～２４時間であることがより好ましく、２～１２時間であることがさらに好ましく、２～６時間であることが特に好ましい。以上の反応条件によってω３系脂肪酸のω３位のエポキシ化をより効率よく進行させることができる。これらの反応条件は、目的とするエポキシ化脂肪酸に応じて適宜選択される。なお、最適な反応条件は予備実験を通して決定すればよい。
　ω３系脂肪酸にオキシゲナーゼ等を作用させる工程の後には、オキシゲナーゼ（必要に応じて、ＮＡＤＰＨ再生酵素、活性酸素を除去する酵素及び過酸化水素を除去する酵素よりなる群から選択される一又は二以上の酵素）を失活させる工程を設けてもよい。
　本発明のω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法を用いることで、ω３位エポキシ化脂肪酸又はω３位エポキシ化脂肪酸含有組成物を製造することができる。すなわち、本発明は、上記ω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法で得られるω３位エポキシ化脂肪酸もしくはω３位エポキシ化脂肪酸含有組成物に関するものであってもよい。ω３位エポキシ化脂肪酸含有組成物においては、含まれる脂肪酸の８０質量％以上がω３位エポキシ化脂肪酸であることが好ましく、９０％質量以上がω３位エポキシ化脂肪酸であることがより好ましく、９５質量％以上がω３位エポキシ化脂肪酸であることがさらに好ましい。
（ω３系脂肪酸のエポキシ化方法）
　本発明は、ω３系脂肪酸に、上述したポリペプチドもしくは上述したω３位エポキシ化用酵素剤を作用させる工程を含む、ω３系脂肪酸のエポキシ化方法に関する。上述したポリペプチド（オキシゲナーゼ）をω３系脂肪酸に作用させることで、ω３系脂肪酸のω３位のみをエポキシ化することができる。
　本発明のω３系脂肪酸のエポキシ化方法においても上述した併用酵素を用いることができる。また、ω３系脂肪酸のエポキシ化方法における反応条件等は、上述したω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法においてポリペプチド（オキシゲナーゼ）をω３系脂肪酸に作用工程における条件と同様である。
　以下に実施例を挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
（試験方法及び評価）
１．ドッキング構造探索と酵素－基質反応に関わる重要アミノ酸残基の設計（１）
　基質ＥＰＡに対するエポキシ化位置特異性を向上する目的で、酵素－基質の複合構造のドッキングモデル構築とＭＤシミュレーションを実行して、基質のω３位の反応に関わる重要なアミノ酸残基を予測した。Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＰ４５０）の立体構造（ＰＤＢ番号：１ｂｕ７）と基質ＥＰＡを用いて、酵素活性部位周辺の残基側鎖あるいは主鎖も含めた構造変化をシミュレーションする目的で、ＭＤシミュレーションを複数パターン実行した。基質が酵素の活性部位に結合した、エネルギー的に安定なドッキングポーズをとることができる構造変化促進領域の設定について様々な条件を検討した。その結果、ＥＰＡがポケット内で動きやすくなる条件を見出した。さらに計算の収束性を確認するため、初期条件を変えた計算を２回実行した。その結果、２回の独立した結果が同じアミノ酸残基に収束した。ＥＰＡの１７，１８位がヘムとコンタクトする構造と、１４，１５位がヘムとコンタクトする構造を比較して、基質のω３位の反応に関わる重要なアミノ酸残基を予測した。その結果、２回の計算で共通してスコアの高いアミノ酸残基を選定した。
２．変異酵素の活性測定（１）
　上記のＭＤ計算から高スコアとなった７アミノ酸残基について、それぞれの残基に部位特異的変異導入を行った。部位特異的変異導入とは、選定したアミノ酸残基について、本来のアミノ酸残基（野生型）をそれ以外のアミノ酸残基（１９種類）に置換した変異酵素を作製することである。後述する方法に従って、アミノ酸を置換した変異酵素を１３３種類作製して、酵素と基質（ＥＰＡ）の反応を行った。反応後の生成物をＨＰＬＣにより解析した。
　ＨＰＬＣチャート図の分析から、８７番目のフェニルアラニンを置換した変異酵素で反応後の生成物の組成に大きな変化があると分かった。特に、変異酵素（Ｆ８７Ｋ、Ｆ８７Ｉ、Ｆ８７Ｈ）を用いた場合に、副生成物の減少と目的生成物である１７，１８－ＥｐＥＴＥ（１７，１８－エポキシエイコサテトラエン酸）の蓄積が検出された（図１）。さらに、酵素－基質反応をタイムコースで解析した結果、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）は目的生成物である１７，１８－ＥｐＥＴＥの蓄積が起こることが示された（図２下図）。
　また、変異酵素（Ｆ８７Ｋ、Ｆ８７Ｉ、Ｆ８７Ｈ）における１７，１８－ＥｐＥＴＥの生成率と生成ピーク時間は以下の表のとおりであった。
３．ドッキング構造探索と酵素－基質反応に関わる重要アミノ酸残基の設計（２）
　さらなる反応性の向上を目的とし、２回目のＭＤ計算と設計を行った。変異酵素（Ｆ８７Ｋ）は１７，１８－ＥｐＥＴＥがある条件では、ＥＰＡに対するエポキシ化反応が低下し、生成物阻害が生じている可能性が考えられたため、アミノ酸変異Ｆ８７Ｋを導入したＰ４５０－ＢＭ３の構造を用いて、生成物の１７，１８－ＥｐＥＴＥが酵素から離れやすくなるよう設計を行った。具体的には、基質ＥＰＡには影響を与えないが、生成物１７，１８－ＥｐＥＴＥがポケット内にいることを不安定化させるアミノ酸残基の選定を行った。２回の独立した計算の結果、３種類のアミノ酸残基を選定した
４．変異酵素の活性測定（２）
Ｆ８７Ｋに加えてさらにアミノ酸を置換した二重変異酵素を作製した。上記のＭＤ計算により選定したアミノ酸残基に関して、二重変異酵素を５７種類作製した。後述する＜ＥＰＡエポキシ化反応と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析＞の＜条件１＞の条件で反応を行い、生成物をＨＰＬＣで分析した。その結果、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）と比較して、複数の二重変異酵素で１７，１８－ＥｐＥＴＥの生成量が向上した。特に、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）は、最も１７，１８－ＥｐＥＴＥの生成量が多くなった。さらに詳細な解析を行い、野生型、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）について、酵素－基質反応を比較した。１７，１８－ＥｐＥＴＥの位置特異性を計算したところ、野生型ではＥＰＡから１７，１８－ＥｐＥＴＥへの生成率の最大値が４４％であるのに対して、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）は８９％、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）は９３％となった（図２及び図３）。この結果から、野生型では不可能であった１７，１８－ＥｐＥＴＥの工業的製造の可能性が示唆された。
５．ドッキング構造探索と酵素－基質反応に関わる重要アミノ酸残基の設計（３）
　変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）の更なる位置特異性の向上、生成物阻害の解消を目的に３回目のＭＤ計算を行った。アミノ酸変異Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖを導入したＰ４５０－ＢＭ３の立体構造をモデリングで生成した。その構造のＭＤ計算を行い、生成物である１７，１８－ＥｐＥＴＥを維持しながら生成物阻害をする構造を不安定化する変異酵素を予測して、設計した。生成物（エポキシ化した基質）が安定的に結合しない構造を予測して、置換アミノ酸の設計を行った。その結果、３か所のアミノ酸残基が選定された。過去２回の設計では、活性中心であるヘムに近い領域に変異を入れていたのに対して、活性中心から遠い位置にあるアミノ酸残基に変異を導入した。
６．変異酵素の活性測定（３）
　これまでと同様に、選定したアミノ酸残基に対して部位特異的変異導入を行った。ＰＣＲによりＦ８７Ｋ及びＡ３３０Ｖに加えてさらにアミノ酸を置換した三重変異酵素を５７種類作製した。これらの三重変異酵素について基質ＥＰＡと反応を行い、生成物をＨＰＬＣで分析した。その結果、変異酵素（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）と変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）はエポキシ化位置特異性が向上して、ＥＰＡから１７，１８－ＥｐＥＴＥへの生成率が高かった（図４）。特に、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）はエポキシ化位置特異性が向上して、ＥＰＡから１７，１８－ＥｐＥＴＥへの生成率が９６％であった（図４下図）。また、変異酵素（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）では、ＥＰＡの消費量が改善されて生成物阻害の解消が見られた。
７．ＮＡＤＰＨ再生酵素／過酸化水素除去酵素との併用
　他の酵素との併用効果を評価するために、後述する＜条件２：ＮＡＤＰＨ再生酵素／過酸化水素除去酵素との併用＞の条件で、反応を行った。また、グルコースデヒドロゲナーゼの触媒作用に必須なグルコースを含む反応溶液を調製した。変異酵素（Ｆ８７Ｋ）を発現した冷凍大腸菌菌体と変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）を発現した冷凍大腸菌菌体を用いて、１７，１８－ＥｐＥＴＥの生成率と生成量を評価した。その結果、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）においては、併用なしと比較して、１７，１８－ＥｐＥＴＥの生成率は８５％とやや低下した（図５上図）。しかし、生成量のピークは３時間となり、併用なしと比較して短い時間で酵素反応が進むと分かった（図５上図）。さらに、三重変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）においては、併用なしと比較して、１７，１８－ＥｐＥＴＥの生成率は９７％となりさらに向上した（図５下図）。生成量のピークは５時間となり、併用なしと比較して短い時間で酵素反応が進むと分かった（図５下図）。以上の結果から、併用効果により同じ反応時間で比較すると基質の変換速度を向上させる効果が見られた。
（変異酵素の作製方法）
（１）Ｐ４５０－ＢＭ３発現用ベクターの構築
　発現プラスミドｐＥＴ２８ａ（メルク社）のマルチクローニングサイト、ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩに、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのゲノムからＰＣＲで増幅したＣＹＰ１０２Ａ１遺伝子を挿入した。具体的には、ＰＣＲ反応においては、制限酵素サイトを付加したプライマー（表２）と、Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いた。そして、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社）により、ＰＣＲで増幅した遺伝子配列とベクターをライゲーションした。サンガーシーケンスにより遺伝子のＤＮＡ配列を確認した。遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号１のとおりであった。
（２）組み換えＰ４５０－ＢＭ３の調製
　構築したＰ４５０－ＢＭ３発現用ベクター１μＬをＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社）２μＬに混合し、形質転換を行った。３７℃２０分間の回復培養後に、形質転換溶液をカナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地プレート（インビトロジェン（株）製）に塗布して、３７℃で１８時間培養した。生育したコロニーを、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地（インビトロジェン（株）製）に植菌した。３７℃で１８時間培養して前培養液とした。前培養液を、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加したＴＢ培地（インビトロジェン（株）製）１ｍＬに植菌した。３７℃で４８時間培養し（培養開始２４時間の時点でＩＰＴＧ（最終濃度０．１ｍＭ）を添加）、遠心分離で菌体を回収した。
（３）変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ、Ｆ８７Ｈ、Ｆ８７Ｉ）発現用ベクターの構築
　変異導入用ＰＣＲプライマー（表３）を設計し、以下の条件でＰＣＲを行い、ＣＹＰ１０２Ａ１遺伝子に変異を導入した。
＜鋳型プラスミド＞
Ｐ４５０－ＢＭ３発現用ベクター：約５０ｎｇ／μＬ
＜ＰＣＲ反応組成＞（総量２５μＬ）
Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＭＡＸ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）：１２．５μＬ
鋳型プラスミド：０．５μＬ
各プライマー（プライマーの組み合わせは表４のとおりとした）：０．５μＬ×２
超純水（Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水）：１１μＬ
＜ＰＣＲ条件＞
９８℃で３０秒
９８℃で１０秒、６８℃で８分の反応を１０サイクル繰り返し
７２℃で１０分
４℃で放置
＜制限酵素処理・精製＞
　ＰＣＲ反応液　２０μＬに制限酵素ＤｐｎＩ（タカラバイオ（株）製）０．５μＬを添加して３７℃、３時間以上反応した。ＤＮＡ精製キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ（株）製）でＤＮＡを精製した。
＜ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応＞
　以下の組成の反応液を調整し（総量１０μＬ）、サーマルサイクラーで５０℃１５分加温した。
精製済みＰＣＲ溶液：２～５μＬ（５０～２００ｎｇ相当量）
Ｍｉｌｌｉ　Ｑ水：６～３μＬ
５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｒｅｍｉｘ：２μＬ
５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｅｎｚｙｍｅ　ＰｒｅｍｉｘはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R)　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）に含まれる試薬である。
＜大腸菌形質転換＞
　ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応液２μＬをＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社）１８μＬに混合し、形質転換を行った。３７℃２０分間の回復培養後に、形質転換溶液をカナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地プレート（インビトロジェン（株）製）に塗布して、３７℃で１８時間培養した。
＜プラスミド精製・シーケンス確認＞
　生育したコロニーを、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地（インビトロジェン（株）製）に植菌した。３７℃で１８時間培養して菌体培養液とした。遠心分離で菌体を回収して、プラスミドミニプレップキットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ社）でそれぞれのプラスミドを精製した。サンガーシーケンスにより遺伝子のＤＮＡ配列を確認した。変異酵素（Ｆ８７Ｋ、Ｆ８７Ｉ、Ｆ８７Ｈ）遺伝子のＤＮＡ配列はそれぞれ、配列番号３、５、７のとおりであった。
（４）変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ、Ｆ８７Ｈ、Ｆ８７Ｉ）の調製
　構築した変異型Ｐ４５０－ＢＭ３発現用ベクター１μＬをＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社）２μＬに混合し、形質転換を行った。３７℃２０分間の回復培養後に、形質転換溶液をカナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ寒天培地プレート（インビトロジェン（株）製）に塗布して、３７℃で１８時間培養した。生育したコロニーを、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地（インビトロジェン（株）製）に植菌した。３７℃で１８時間培養して前培養液とした。前培養液を、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加したＴＢ培地（インビトロジェン（株）製）１ｍＬに植菌した。３７℃で４８時間培養し（培養開始２４時間の時点でＩＰＴＧ（最終濃度０．１ｍＭ）を添加）、遠心分離で菌体を回収した。得られた変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ、Ｆ８７Ｈ、Ｆ８７Ｉ）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、６、８のとおりであった。
（５）二重変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）の調製
　変異導入用ＰＣＲプライマー（表５）を設計し、鋳型プラスミドとして変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ）発現用ベクターを用いた以外は上述した方法と同様の条件でＰＣＲ等を行い、ＣＹＰ１０２Ａ１遺伝子に二重の変異を導入された変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）発現用ベクターを得た。遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号９のとおりであった。変異型Ｐ４５０－ＢＭ３発現用ベクターに代えて、変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）発現用ベクターを用いた以外は、上述した方法と同様の方法で変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）を発現した菌体を回収した。得られた変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３のアミノ酸配列は、配列番号１０のとおりであった。
（６）三重変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）の調製
　変異導入用ＰＣＲプライマー（表６）を設計し、鋳型プラスミドとして二重変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）発現用ベクターを用いた以外は上述した方法と同様の条件でＰＣＲ等を行い、ＣＹＰ１０２Ａ１遺伝子に三重の変異を導入された変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）発現用ベクターを得た。遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号１１のとおりであった。変異型Ｐ４５０－ＢＭ３発現用ベクターに代えて、変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）発現用ベクターを用いた以外は、上述した方法と同様の方法で変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）を発現した菌体を回収した。得られた変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３のアミノ酸配列は、配列番号１２のとおりであった。
（７）変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）の調製
　変異導入用ＰＣＲプライマー（表７）を設計し、鋳型プラスミドとして変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）発現用ベクターを用いた以外は上述した方法と同様の条件でＰＣＲ等を行い、ＣＹＰ１０２Ａ１遺伝子に３重の変異を導入された変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）発現用ベクターを得た。遺伝子のＤＮＡ配列は配列番号１３のとおりであった。変異型Ｐ４５０－ＢＭ３発現用ベクターに代えて、変異型Ｐ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）発現用ベクターを用いた以外は、上述した方法と同様の方法で変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）を発現した菌体を回収した。得られた変異型組み換えＰ４５０－ＢＭ３のアミノ酸配列は、配列番号１４のとおりであった。
（活性測定方法）
＜ＥＰＡエポキシ化反応と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析＞
＜条件１＞
　３．３ｍＭ基質ＥＰＡ（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ社製・エタノールに溶解）及び３ｍＭのＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母工業（株）製）を含む０．１ＭＴｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、Ｐ４５０－ＢＭ３を発現した冷凍大腸菌菌体もしくは変異型Ｐ４５０－ＢＭ３を発現し冷凍大腸菌菌体に添加してよく混合した。マキシマイザーで混合しながら３５℃で反応を行った。０、１、３、５、２４時間経過時に反応液のサンプリングを行った。サンプリングした反応液を、１００％エタノール（富士フイルム和光純薬工（株）製）で４０倍に希釈した。希釈サンプルをバイアルに移して、ＨＰＬＣ分析を行った。
＜条件２：ＮＡＤＰＨ再生酵素／過酸化水素除去酵素との併用＞
　３．３ｍＭ基質ＥＰＡ（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ社製・エタノールに溶解）、０．１６Ｍグルコース（富士フイルム和光純薬工（株）製）、７．７Ｕ／ｍＬグルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ型）（天野エンザイム（株）製）、５０Ｕ／ｍｌカタラーゼ（富士フイルム和光純薬工（株）製）及び３ｍＭのＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母工業（株）製）を含む０．１ＭＴｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、Ｐ４５０－ＢＭ３を発現した冷凍大腸菌菌体もしくは変異型Ｐ４５０－ＢＭ３を発現した冷凍大腸菌菌体に添加してよく混合した。マキシマイザーで混合しながら３５℃で反応を行った。０、１、３、５、２４時間経過時に反応液のサンプリングを行った。サンプリングした反応液を、１００％エタノール（富士フイルム和光純薬工（株）製）で４００倍に希釈した。希釈サンプルはバイアルに移して、ＨＰＬＣ分析を行った。
　基質ＥＰＡから生成するエポキシ化代謝物についてＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析の条件は以下のとおりとした。
　分析カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８　ＡＲ－ＩＩ　２５０ｘ４．６ｍｍ、５．０μｍ（ナカライテクス（株）製）
　検出器：ＵＶ　２０５ｎｍ
　流速：１．２ｍｌ／分
　カラム温度：３５℃
　バッファーとプログラムは以下のとおりとした。
　ピーク面積を定量して、ＥＰＡ、１７，１８－ＥｐＥＴＥ（１７，１８－エポキシエイコサテトラエン酸）、１４，１５－ＥｐＥＴＥ（１４，１５－エポキシエイコサテトラエン酸）、１９－ＨＥＰＥ（１９－ヒドロキシルエイコサペンタエン酸）の量とした。１７，１８－ＥｐＥＴＥ、１４，１５－ＥｐＥＴＥはそれぞれの標品を利用してピークの位置を決定した（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）。１９－ＨＥＰＥはＨＰＬＣ分析後のピークを分取して、ＮＭＲにより構造を特定した。なお、図２～４において「ｏｔｈｅｒｓ」には、ω３とω６位の両方がエポキシ化された二次代謝物や、未同定の代謝物（基質の複数個所がエポキシ化されたもの、ω３とω６位以外の２重結合がエポキシ化されたもの、１９－ＯＨ以外の二重結合ではない場所に水酸基が付加されたもの等）が含まれている。
　なお、１７，１８－ＥｐＥＴＥの生成率は、以下の式で算出した。
　１７，１８－ＥｐＥＴＥの生成量（％）＝１７，１８－ＥｐＥＴＥのエリア面積／（１７，１８－ＥｐＥＴＥのエリア面積＋１４，１５－ＥｐＥＴＥのエリア面積＋１９－ＯＨのエリア面積＋その他のエリア面積）×１００
＜ＤＨＡエポキシ化反応と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析＞
＜条件３＞
　３．３ｍＭ基質ＤＨＡ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製・エタノールに溶解）及び３ｍＭのＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母工業（株）製）を含む０．１ＭＴｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、Ｐ４５０－ＢＭ３を発現した冷凍大腸菌菌体もしくは変異型Ｐ４５０－ＢＭ３を発現し冷凍大腸菌菌体に添加してよく混合した。マキシマイザーで混合しながら３５℃で反応を行った。０、１、３、５、２４時間経過時に反応液のサンプリングを行った。サンプリングした反応液を、１００％エタノール（富士フイルム和光純薬工（株）製）で４０倍に希釈した。希釈サンプルをバイアルに移して、ＨＰＬＣ分析を行った。なお、ＨＰＬＣ分析の条件は上記と同じ条件で行った。
　ピーク面積を定量して、ＤＨＡ、１９，２０－ＥｐＤＰＥ（１９，２０－エポキシドコサペンタエン酸）、１６，１７－ＥｐＤＰＥ（１６，１７－エポキシドコサペンタエン酸）の量とした。１９，２０－ＥｐＤＰＥ、１６，１７－ＥｐＤＰＥはそれぞれの標品を利用してピークの位置を決定した（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）。「その他」は、未同定ピークのエリア面積を合計した。
　なお、１９，２０－ＥｐＤＰＥの生成率は、以下の式で算出した。
　１９，２０－ＥｐＤＰＥの生成量（％）＝１９，２０－ＥｐＤＰＥのエリア面積／（１９，２０－ＥｐＤＰＥのエリア面積＋１６，１７－ＥｐＤＰＥのエリア面積＋その他エリア面積の合計）×１００
　上記で作製した５種類の変異酵素と基質ＤＨＡと反応を行うことで、１９，２０－ＥｐＤＰＥ（１９，２０－エポキシドコサペンタエン酸）、１６，１７－ＥｐＤＰＥ（１６，１７－エポキシドコサペンタエン酸）が生成した。ＤＨＡのω３位をエポキシ化して生成する１９，２０－ＥｐＤＰＥ（１９，２０－エポキシドコサペンタエン酸）は、生理的に１７，１８－ＥｐＥＴＥと同様の効果があり、有用な生成物である。
　野生型酵素（Ｐ４５０－ＢＭ３）と比較して、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）、変異酵素（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）による変換では、１９，２０－ＥｐＤＰＥの生成量の増加と蓄積が確認された（図６～８）。
　また、１９，２０－ＥｐＤＰＥの位置特異性を計算したところ、野生型ではＤＨＡから１９，２０－ＥｐＤＰＥへの生成率の最大値が４０％であるのに対して、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）は８４％、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）は９０％、変異酵素（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）は８８％、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）は９６％となった（図６～８）。この結果から、野生型では不可能であった１９，２０－ＥｐＤＰＥの工業的製造の可能性が示唆された。
＜ＤＰＡエポキシ化反応と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析＞
＜条件４＞
　３．３ｍＭ基質ＤＰＡ（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製・エタノールに溶解）及び３ｍＭのＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母工業（株）製）を含む０．１ＭＴｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、Ｐ４５０－ＢＭ３を発現した冷凍大腸菌菌体もしくは変異型Ｐ４５０－ＢＭ３を発現し冷凍大腸菌菌体に添加してよく混合した。マキシマイザーで混合しながら３５℃で反応を行った。０、１、３、５、２４時間経過時に反応液のサンプリングを行った。サンプリングした反応液を、１００％エタノール（富士フイルム和光純薬工（株）製）で４０倍に希釈した。希釈サンプルをバイアルに移して、ＨＰＬＣ分析を行った。なお、ＨＰＬＣ分析の条件は上記と同じ条件で行った。
　ピーク面積を定量して、ＤＰＡ、１９，２０－ＥｐＤＴＥ（１９，２０－エポキシドコサテトラエン酸）の量とした。１９，２０－ＥｐＤＴＥは標品を利用してピークの位置を決定した（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）。「その他」は、未同定ピークのエリア面積を合計した。
　なお、１９，２０－ＥｐＤＴＥの生成率は、以下の式で算出した。
　１９，２０－ＥｐＤＴＥの生成量（％）＝１９，２０－ＥｐＤＴＥのエリア面積／（１９，２０－ＥｐＤＴＥのエリア面積＋その他エリア面積の合計）×１００
　上記で作製した５種類の変異酵素と基質ＤＰＡと反応を行うことで、１９，２０－ＥｐＤＴＥ（１９，２０－エポキシドコサテトラエン酸）が生成した。ＤＰＡのω３位をエポキシ化して生成する１９，２０－ＥｐＤＴＥ（１９，２０－エポキシドコサテトラエン酸）は、生理的に１７，１８－ＥｐＥＴＥと同様の効果があり、有用な生成物である。
　野生型酵素（Ｐ４５０－ＢＭ３）と比較して、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）、変異酵素（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）において、１９，２０－ＥｐＤＴＥの生成量の増加と蓄積が確認された（図９～１１）。
　また、１９，２０－ＥｐＤＴＥの位置特異性を計算したところ、野生型ではＤＰＡから１９，２０－ＥｐＤＴＥへの生成率の最大値が５２％であるのに対して、変異酵素（Ｆ８７Ｋ）は７８％、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）は８９％、変異酵素（Ｐ２５Ｌ－Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ）は８９％、変異酵素（Ｆ８７Ｋ－Ａ３３０Ｖ－Ｔ４３８Ｍ）は９４％となった（図９～１１）。この結果から、野生型では不可能であった１９，２０－ＥｐＤＴＥの工業的製造の可能性が示唆された。
　本発明によれば、高度不飽和脂肪酸のω３位のみを特異的にエポキシ化する改変型オキシゲナーゼを得ることができる。また、本発明によれば、ω３位のみが特異的にエポキシ化されたω３位エポキシ化脂肪酸の工業的生産が可能となる。
配列番号１
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Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn  
 
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Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
 
gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt gta 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
 
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Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
 
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Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp    
 
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Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
 
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Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
 
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Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
 
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Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn    
 
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Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
 
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Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
 
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Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
 
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Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr  
 
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Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser  
 
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Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu  
 
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Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu  
  
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Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
 
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Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met  
 
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Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
 
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Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
  
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Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
 
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Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
 
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Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala  
  
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Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
    
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Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
       
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Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
                     
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Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
      
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Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala  
                 
 cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa tac 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
                 
 gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg gct 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
                      
 gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg ctt 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
                           
 gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca atg 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
       
 ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc gaa 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
                
 ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att tct 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
                
 tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc gtt 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
                          
 gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att gcg 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
               
 tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc ttt 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe  
       
 att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa acg 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
            
 ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga ggc 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
              
 ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt gga 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
                
 gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat ctg  
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
              
 tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg ctt 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu  
      
 cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt cag 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
                    
 cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat caa 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
                  
 gga gcg cac ttc tat att tgc gga  gac gga agc caa atg  gca cct gcc 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
                
 gtt gaa  gca acg ctt atg aaa  agc tat gct gac gtt  cac caa gtg 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
           
 agt gaa  gca gac gct cgc tta  tgg ctg cag cag cta  gaa gaa aaa 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys  
                  
 ggc cga  tac gca aaa gac gtg  tgg gct ggg 
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly  
                                    
配列番号２
 Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
 Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly 
配列番号３
aca att aaa gaa atg cct cag cca aaa acg ttt gga gag ctt aaa aat 
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn 
          
 tta ccg tta tta aac aca gat aaa ccg gtt caa gct ttg atg aaa att    
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
     
 gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt gta 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
  
 acg cgc tac tta tca agt cag cgt cta att aaa gaa gca tgc gat gaa 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu  
 
 tca cgc ttt gat aaa aac tta agt caa gcg ctt aaa ttt gta cgt gat 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
  
 ttt gca gga gac ggg tta aag aca agc tgg acg cat gaa aaa aat tgg 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Lys Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp  
      
 aaa aaa gcg cat aat atc tta ctt cca agc ttc agt cag cag gca atg 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
     
 aaa ggc tat cat gcg atg atg gtc gat atc gcc gtg cag ctt gtt caa 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
   
 aag tgg gag cgt cta aat gca gat gag cat att gaa gta ccg gaa gac 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
           
 atg aca cgt tta acg ctt gat aca att ggt ctt tgc ggc ttt aac tat 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
    
 cgc ttt aac agc ttt tac cga gat cag cct cat cca ttt att aca agt 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser  
  
 atg gtc cgt gca ctg gat gaa gca atg aac aag ctg cag cga gca aat 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
        
 cca gac gac cca gct tat gat gaa aac aag cgc cag ttt caa gaa gat 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
          
 atc aag gtg atg aac gac cta gta gat aaa att att gca gat cgc aaa 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
                       
 gca agc ggt gaa caa agc gat gat tta tta acg cat atg cta aac gga 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
      
 aaa gat cca gaa acg ggt gag ccg ctt gat gac gag aac att cgc tat 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
      
 caa att att aca ttc tta att gcg gga cac gaa aca aca agt ggt ctt 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
             
 tta tca ttt gcg ctg tat ttc tta gtg aaa aat cca cat gta tta caa 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
                  
 aaa gca gca gaa gaa gca gca cga gtt cta gta gat cct gtt cca agc 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
                     
 tac aaa caa gtc aaa cag ctt aaa tat gtc ggc atg gtc tta aac gaa 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
      
 gcg ctg cgc tta tgg cca act gct cct gcg ttt tcc cta tat gca aaa 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
               
 gaa gat acg gtg ctt gga gga gaa tat cct tta gaa aaa ggc gac gaa 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
                 
 cta atg gtt ctg att cct cag ctt cac cgt gat aaa aca att tgg gga 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
           
 gac gat gtg gaa gag ttc cgt cca gag cgt ttt gaa aat cca agt gcg 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
               
 att ccg cag cat gcg ttt aaa ccg ttt gga aac ggt cag cgt gcg tgt 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys 
      
 atc ggt cag cag ttc gct ctt cat gaa gca acg ctg gta ctt ggt atg 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
                        
 atg cta aaa cac ttt gac ttt gaa gat cat aca aac tac gag ctg gat 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
              
 att aaa gaa act tta acg tta aaa cct gaa ggc ttt gtg gta aaa gca 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
        
 aaa tcg aaa aaa att ccg ctt ggc ggt att cct tca cct agc act gaa 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
           
 cag tct gct aaa aaa gta cgc aaa aag gca gaa aac gct cat aat acg 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
  
 ccg ctg ctt gtg cta tac ggt tca aat atg gga aca gct gaa gga acg 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
                   
 gcg cgt gat tta gca gat att gca atg agc aaa gga ttt gca ccg cag 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln  
             
 gtc gca acg ctt gat tca cac gcc gga aat ctt ccg cgc gaa gga gct 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
                
 gta tta att gta acg gcg tct tat aac ggt cat ccg cct gat aac gca 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
                  
 aag caa ttt gtc gac tgg tta gac caa gcg tct gct gat gaa gta aaa 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
     
 ggc gtt cgc tac tcc gta ttt gga tgc ggc gat aaa aac tgg gct act 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
             
 acg tat caa aaa gtg cct gct ttt atc gat gaa acg ctt gcc gct aaa 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
             
 ggg gca gaa aac atc gct gac cgc ggt gaa gca gat gca agc gac gac 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
                  
 ttt gaa ggc aca tat gaa gaa tgg cgt gaa cat atg tgg agt gac gta 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
               
 gca gcc tac ttt aac ctc gac att gaa aac agt gaa gat aat aaa tct  
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser  
      
 act ctt tca ctt caa ttt gtc gac agc gcc gcg gat atg ccg ctt gcg 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
              
 aaa atg cac ggt gcg ttt tca acg aac gtc gta gca agc aaa gaa ctt  
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
                
 caa cag cca ggc agt gca cga agc acg cga cat ctt gaa att gaa ctt 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
              
 cca aaa gaa gct tct tat caa gaa gga gat cat tta ggt gtt att cct 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
               
 cgc aac tat gaa gga ata gta aac cgt gta aca gca agg ttc ggc cta 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
         
 gat gca tca cag caa atc cgt ctg gaa gca gaa gaa gaa aaa tta gct 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
                
 cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa tac 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
                     
 gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg gct 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
                 
 gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg ctt 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
                
 gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca atg 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met  
        
 ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc gaa 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
                     
 ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att tct 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
                  
 tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc gtt 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
                    
 gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att gcg 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
                
 tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc ttt 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
    
 att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa acg 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr  
          
 ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga ggc 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
                     
 ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt gga 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly  
                    
 gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat ctg 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
             
 tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg ctt  
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
     
 cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt cag 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln  
          
 cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat caa 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
                  
 gga gcg cac ttc tat att tgc gga  gac gga agc caa atg  gca cct gcc  
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
                
 gtt gaa  gca acg ctt atg aaa  agc tat gct gac gtt  cac caa gtg 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
                   
 agt gaa  gca gac gct cgc tta  tgg ctg cag cag cta  gaa gaa aaa 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys  
               
 ggc cga  tac gca aaa gac gtg  tgg gct ggg      
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly    
 
配列番号４
 Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Lys Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly 
配列番号５
aca att aaa gaa atg cct cag cca aaa acg ttt gga gag ctt aaa aat  
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn  
          
 tta ccg tta tta aac aca gat aaa ccg gtt caa gct ttg atg aaa att 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
                  
 gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt gta 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val  
               
 acg cgc tac tta tca agt cag cgt cta att aaa gaa gca tgc gat gaa 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
                   
 tca cgc ttt gat aaa aac tta agt caa gcg ctt aaa ttt gta cgt gat 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
        
 ttt gca gga gac ggg tta cat aca agc tgg acg cat gaa aaa aat tgg 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu His Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
                
 aaa aaa gcg cat aat atc tta ctt cca agc ttc agt cag cag gca atg 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
                  
 aaa ggc tat cat gcg atg atg gtc gat atc gcc gtg cag ctt gtt caa 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
                      
 aag tgg gag cgt cta aat gca gat gag cat att gaa gta ccg gaa gac 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
                     
 atg aca cgt tta acg ctt gat aca att ggt ctt tgc ggc ttt aac tat 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
       
 cgc ttt aac agc ttt tac cga gat cag cct cat cca ttt att aca agt 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
                   
 atg gtc cgt gca ctg gat gaa gca atg aac aag ctg cag cga gca aat 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
                 
 cca gac gac cca gct tat gat gaa aac aag cgc cag ttt caa gaa gat 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp  
                  
 atc aag gtg atg aac gac cta gta gat aaa att att gca gat cgc aaa 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
                   
 gca agc ggt gaa caa agc gat gat tta tta acg cat atg cta aac gga 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
   
 aaa gat cca gaa acg ggt gag ccg ctt gat gac gag aac att cgc tat 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
            
 caa att att aca ttc tta att gcg gga cac gaa aca aca agt ggt ctt 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
                
 tta tca ttt gcg ctg tat ttc tta gtg aaa aat cca cat gta tta caa  
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
                
 aaa gca gca gaa gaa gca gca cga gtt cta gta gat cct gtt cca agc 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
                         
 tac aaa caa gtc aaa cag ctt aaa tat gtc ggc atg gtc tta aac gaa 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
      
 gcg ctg cgc tta tgg cca act gct cct gcg ttt tcc cta tat gca aaa 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys  
                  
 gaa gat acg gtg ctt gga gga gaa tat cct tta gaa aaa ggc gac gaa 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu  
                    
 cta atg gtt ctg att cct cag ctt cac cgt gat aaa aca att tgg gga 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly  
                        
 gac gat gtg gaa gag ttc cgt cca gag cgt ttt gaa aat cca agt gcg 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
                              
 att ccg cag cat gcg ttt aaa ccg ttt gga aac ggt cag cgt gcg tgt  
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys  
       
 atc ggt cag cag ttc gct ctt cat gaa gca acg ctg gta ctt ggt atg 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
          
 atg cta aaa cac ttt gac ttt gaa gat cat aca aac tac gag ctg gat 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp  
            
 att aaa gaa act tta acg tta aaa cct gaa ggc ttt gtg gta aaa gca 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala  
                            
 aaa tcg aaa aaa att ccg ctt ggc ggt att cct tca cct agc act gaa 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
                       
 cag tct gct aaa aaa gta cgc aaa aag gca gaa aac gct cat aat acg 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
    
 ccg ctg ctt gtg cta tac ggt tca aat atg gga aca gct gaa gga acg 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
              
 gcg cgt gat tta gca gat att gca atg agc aaa gga ttt gca ccg cag 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln  
                     
 gtc gca acg ctt gat tca cac gcc gga aat ctt ccg cgc gaa gga gct 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
                         
 gta tta att gta acg gcg tct tat aac ggt cat ccg cct gat aac gca 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala  
                        
 aag caa ttt gtc gac tgg tta gac caa gcg tct gct gat gaa gta aaa 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
       
 ggc gtt cgc tac tcc gta ttt gga tgc ggc gat aaa aac tgg gct act 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
           
 acg tat caa aaa gtg cct gct ttt atc gat gaa acg ctt gcc gct aaa 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
                     
 ggg gca gaa aac atc gct gac cgc ggt gaa gca gat gca agc gac gac 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
                     
 ttt gaa ggc aca tat gaa gaa tgg cgt gaa cat atg tgg agt gac gta  
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
                        
 gca gcc tac ttt aac ctc gac att gaa aac agt gaa gat aat aaa tct 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
      
 act ctt tca ctt caa ttt gtc gac agc gcc gcg gat atg ccg ctt gcg 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
                   
 aaa atg cac ggt gcg ttt tca acg aac gtc gta gca agc aaa gaa ctt 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
                   
 caa cag cca ggc agt gca cga agc acg cga cat ctt gaa att gaa ctt 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
                
 cca aaa gaa gct tct tat caa gaa gga gat cat tta ggt gtt att cct 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
                      
 cgc aac tat gaa gga ata gta aac cgt gta aca gca agg ttc ggc cta 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
    
 gat gca tca cag caa atc cgt ctg gaa gca gaa gaa gaa aaa tta gct 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
        
 cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa tac 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
                  
 gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg gct 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala  
                    
 gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg ctt 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
                   
 gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca atg 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
      
 ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc gaa 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
           
 ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att tct 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser  
                       
 tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc gtt 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
                        
 gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att gcg 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
                         
 tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc ttt 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe  
 
 att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa acg 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
                  
 ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga ggc 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
               
 ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt gga 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly  
                  
 gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat ctg 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
                    
 tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg ctt 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
         
 cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt cag 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln  
                 
 cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat caa 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln  
                     
 gga gcg cac ttc tat att tgc gga  gac gga agc caa atg  gca cct gcc 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
               
 gtt gaa  gca acg ctt atg aaa  agc tat gct gac gtt  cac caa gtg 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
                   
 agt gaa  gca gac gct cgc tta  tgg ctg cag cag cta  gaa gaa aaa 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys  
                          
 ggc cga  tac gca aaa gac gtg  tgg gct ggg     
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly       
                                     
配列番号６
 Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu His Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly 
配列番号７
aca att aaa gaa atg cct cag cca aaa acg ttt gga gag ctt aaa aat  
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn  
           
 tta ccg tta tta aac aca gat aaa ccg gtt caa gct ttg atg aaa att 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
              
 gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt gta 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
                         
 acg cgc tac tta tca agt cag cgt cta att aaa gaa gca tgc gat gaa  
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
                       
 tca cgc ttt gat aaa aac tta agt caa gcg ctt aaa ttt gta cgt gat  
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
     
 ttt gca gga gac ggg tta atc aca agc tgg acg cat gaa aaa aat tgg 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Ile Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
             
 aaa aaa gcg cat aat atc tta ctt cca agc ttc agt cag cag gca atg 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met  
                
 aaa ggc tat cat gcg atg atg gtc gat atc gcc gtg cag ctt gtt caa 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln  
                     
 aag tgg gag cgt cta aat gca gat gag cat att gaa gta ccg gaa gac 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
                  
 atg aca cgt tta acg ctt gat aca att ggt ctt tgc ggc ttt aac tat 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr  
       
 cgc ttt aac agc ttt tac cga gat cag cct cat cca ttt att aca agt 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
                   
 atg gtc cgt gca ctg gat gaa gca atg aac aag ctg cag cga gca aat 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn  
                
 cca gac gac cca gct tat gat gaa aac aag cgc cag ttt caa gaa gat 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
                     
 atc aag gtg atg aac gac cta gta gat aaa att att gca gat cgc aaa  
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
               
 gca agc ggt gaa caa agc gat gat tta tta acg cat atg cta aac gga 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
      
 aaa gat cca gaa acg ggt gag ccg ctt gat gac gag aac att cgc tat 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
                     
 caa att att aca ttc tta att gcg gga cac gaa aca aca agt ggt ctt  
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu    
                    
 tta tca ttt gcg ctg tat ttc tta gtg aaa aat cca cat gta tta caa 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln    
                    
 aaa gca gca gaa gaa gca gca cga gtt cta gta gat cct gtt cca agc 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
                          
 tac aaa caa gtc aaa cag ctt aaa tat gtc ggc atg gtc tta aac gaa 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
        
 gcg ctg cgc tta tgg cca act gct cct gcg ttt tcc cta tat gca aaa  
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys    
                      
 gaa gat acg gtg ctt gga gga gaa tat cct tta gaa aaa ggc gac gaa 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
              
 cta atg gtt ctg att cct cag ctt cac cgt gat aaa aca att tgg gga 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly  
                    
 gac gat gtg gaa gag ttc cgt cca gag cgt ttt gaa aat cca agt gcg 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala  
                
 att ccg cag cat gcg ttt aaa ccg ttt gga aac ggt cag cgt gcg tgt 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys    
      
 atc ggt cag cag ttc gct ctt cat gaa gca acg ctg gta ctt ggt atg 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
                
 atg cta aaa cac ttt gac ttt gaa gat cat aca aac tac gag ctg gat 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp  
                    
 att aaa gaa act tta acg tta aaa cct gaa ggc ttt gtg gta aaa gca 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala  
                   
 aaa tcg aaa aaa att ccg ctt ggc ggt att cct tca cct agc act gaa 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu  
                       
 cag tct gct aaa aaa gta cgc aaa aag gca gaa aac gct cat aat acg 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr  
     
 ccg ctg ctt gtg cta tac ggt tca aat atg gga aca gct gaa gga acg 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
                 
 gcg cgt gat tta gca gat att gca atg agc aaa gga ttt gca ccg cag 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln 
                
 gtc gca acg ctt gat tca cac gcc gga aat ctt ccg cgc gaa gga gct 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
                       
 gta tta att gta acg gcg tct tat aac ggt cat ccg cct gat aac gca 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
                         
 aag caa ttt gtc gac tgg tta gac caa gcg tct gct gat gaa gta aaa 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
       
 ggc gtt cgc tac tcc gta ttt gga tgc ggc gat aaa aac tgg gct act 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
                
 acg tat caa aaa gtg cct gct ttt atc gat gaa acg ctt gcc gct aaa 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
              
 ggg gca gaa aac atc gct gac cgc ggt gaa gca gat gca agc gac gac 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp   
                        
 ttt gaa ggc aca tat gaa gaa tgg cgt gaa cat atg tgg agt gac gta 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val   
                      
 gca gcc tac ttt aac ctc gac att gaa aac agt gaa gat aat aaa tct 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser  
      
 act ctt tca ctt caa ttt gtc gac agc gcc gcg gat atg ccg ctt gcg 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
                    
 aaa atg cac ggt gcg ttt tca acg aac gtc gta gca agc aaa gaa ctt 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu  
                     
 caa cag cca ggc agt gca cga agc acg cga cat ctt gaa att gaa ctt 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu  
            
 cca aaa gaa gct tct tat caa gaa gga gat cat tta ggt gtt att cct 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
                       
 cgc aac tat gaa gga ata gta aac cgt gta aca gca agg ttc ggc cta 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu  
      
 gat gca tca cag caa atc cgt ctg gaa gca gaa gaa gaa aaa tta gct 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala  
                        
 cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa tac 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
                
 gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg gct 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala    
                            
 gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg ctt 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
                    
 gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca atg 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
 
 ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc gaa 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
                     
 ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att tct 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser  
                   
 tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc gtt 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
                   
 gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att gcg 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala  
                            
 tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc ttt 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
     
 att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa acg 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr  
              
 ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga ggc 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
                    
 ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt gga  
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
                          
 gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat ctg 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
                        
 tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg ctt 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
   
 cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt cag 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
                      
 cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat caa 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
                   
 gga gcg cac ttc tat att tgc gga  gac gga agc caa atg  gca cct gcc 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
                       
 gtt gaa  gca acg ctt atg aaa  agc tat gct gac gtt  cac caa gtg  
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val  
                     
 agt gaa  gca gac gct cgc tta  tgg ctg cag cag cta  gaa gaa aaa  
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
                  
 ggc cga  tac gca aaa gac gtg  tgg gct ggg                
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly         
 
配列番号８
 Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Ile Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly 
配列番号９
aca att aaa gaa atg cct cag cca aaa acg ttt gga gag ctt aaa aat   
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn  
               
 tta ccg tta tta aac aca gat aaa ccg gtt caa gct ttg atg aaa att 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile  
                
 gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt gta 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
                    
 acg cgc tac tta tca agt cag cgt cta att aaa gaa gca tgc gat gaa 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
                        
 tca cgc ttt gat aaa aac tta agt caa gcg ctt aaa ttt gta cgt gat 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
        
 ttt gca gga gac ggg tta aag aca agc tgg acg cat gaa aaa aat tgg 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Lys Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp  
                     
 aaa aaa gcg cat aat atc tta ctt cca agc ttc agt cag cag gca atg  
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
                    
 aaa ggc tat cat gcg atg atg gtc gat atc gcc gtg cag ctt gtt caa 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln  
                  
 aag tgg gag cgt cta aat gca gat gag cat att gaa gta ccg gaa gac  
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
                  
 atg aca cgt tta acg ctt gat aca att ggt ctt tgc ggc ttt aac tat 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
       
 cgc ttt aac agc ttt tac cga gat cag cct cat cca ttt att aca agt 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
                 
 atg gtc cgt gca ctg gat gaa gca atg aac aag ctg cag cga gca aat 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn  
                     
 cca gac gac cca gct tat gat gaa aac aag cgc cag ttt caa gaa gat  
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
                   
 atc aag gtg atg aac gac cta gta gat aaa att att gca gat cgc aaa 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
                        
 gca agc ggt gaa caa agc gat gat tta tta acg cat atg cta aac gga 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly  
        
 aaa gat cca gaa acg ggt gag ccg ctt gat gac gag aac att cgc tat 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
                      
 caa att att aca ttc tta att gcg gga cac gaa aca aca agt ggt ctt 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
                     
 tta tca ttt gcg ctg tat ttc tta gtg aaa aat cca cat gta tta caa 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln  
                     
 aaa gca gca gaa gaa gca gca cga gtt cta gta gat cct gtt cca agc 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
                         
 tac aaa caa gtc aaa cag ctt aaa tat gtc ggc atg gtc tta aac gaa 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
    
 gcg ctg cgc tta tgg cca act gct cct gtt ttt tcc cta tat gca aaa 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Val Phe Ser Leu Tyr Ala Lys  
                     
 gaa gat acg gtg ctt gga gga gaa tat cct tta gaa aaa ggc gac gaa 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu  
                     
 cta atg gtt ctg att cct cag ctt cac cgt gat aaa aca att tgg gga 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
                    
 gac gat gtg gaa gag ttc cgt cca gag cgt ttt gaa aat cca agt gcg 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
                        
 att ccg cag cat gcg ttt aaa ccg ttt gga aac ggt cag cgt gcg tgt 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys  
          
 atc ggt cag cag ttc gct ctt cat gaa gca acg ctg gta ctt ggt atg 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met  
                      
 atg cta aaa cac ttt gac ttt gaa gat cat aca aac tac gag ctg gat  
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp  
                        
 att aaa gaa act tta acg tta aaa cct gaa ggc ttt gtg gta aaa gca 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
                         
 aaa tcg aaa aaa att ccg ctt ggc ggt att cct tca cct agc act gaa 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
                   
 cag tct gct aaa aaa gta cgc aaa aag gca gaa aac gct cat aat acg 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
        
 ccg ctg ctt gtg cta tac ggt tca aat atg gga aca gct gaa gga acg 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
                         
 gcg cgt gat tta gca gat att gca atg agc aaa gga ttt gca ccg cag 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln  
                          
 gtc gca acg ctt gat tca cac gcc gga aat ctt ccg cgc gaa gga gct 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
                     
 gta tta att gta acg gcg tct tat aac ggt cat ccg cct gat aac gca 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala  
                           
 aag caa ttt gtc gac tgg tta gac caa gcg tct gct gat gaa gta aaa 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys  
       
 ggc gtt cgc tac tcc gta ttt gga tgc ggc gat aaa aac tgg gct act 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr  
               
 acg tat caa aaa gtg cct gct ttt atc gat gaa acg ctt gcc gct aaa 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys  
                    
 ggg gca gaa aac atc gct gac cgc ggt gaa gca gat gca agc gac gac 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp  
                    
 ttt gaa ggc aca tat gaa gaa tgg cgt gaa cat atg tgg agt gac gta 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
                 
 gca gcc tac ttt aac ctc gac att gaa aac agt gaa gat aat aaa tct 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
          
 act ctt tca ctt caa ttt gtc gac agc gcc gcg gat atg ccg ctt gcg 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
                       
 aaa atg cac ggt gcg ttt tca acg aac gtc gta gca agc aaa gaa ctt 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu  
                       
 caa cag cca ggc agt gca cga agc acg cga cat ctt gaa att gaa ctt 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
                         
 cca aaa gaa gct tct tat caa gaa gga gat cat tta ggt gtt att cct 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro  
                        
 cgc aac tat gaa gga ata gta aac cgt gta aca gca agg ttc ggc cta 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
          
 gat gca tca cag caa atc cgt ctg gaa gca gaa gaa gaa aaa tta gct 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala  
                            
 cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa tac 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr  
                    
 gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg gct 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala   
                       
 gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg ctt  
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
                          
 gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca atg 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met  
          
 ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc gaa 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
                  
 ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att tct 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
             
 tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc gtt 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
                       
 gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att gcg 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
                    
 tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc ttt 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
   
 att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa acg 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr  
        
 ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga ggc 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
                      
 ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt gga 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly  
                  
 gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat ctg 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu  
                   
 tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg ctt  
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
     
 cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt cag 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
                  
 cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat caa  
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln  
             
 gga gcg cac ttc tat att tgc gga  gac gga agc caa atg  gca cct gcc 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
                    
 gtt gaa  gca acg ctt atg aaa  agc tat gct gac gtt  cac caa gtg 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val  
              
 agt gaa  gca gac gct cgc tta  tgg ctg cag cag cta  gaa gaa aaa  
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
                  
 ggc cga  tac gca aaa gac gtg  tgg gct ggg       
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly   
        
配列番号１０
 Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Lys Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Val Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly 
配列番号１１
aca att aaa gaa atg cct cag cca aaa acg ttt gga gag ctt aaa aat 
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn  
               
 tta ccg tta tta aac aca gat aaa ctt gtt caa gct ttg atg aaa att 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Leu Val Gln Ala Leu Met Lys Ile  
                          
 gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt gta 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val  
                 
 acg cgc tac tta tca agt cag cgt cta att aaa gaa gca tgc gat gaa 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu  
                        
 tca cgc ttt gat aaa aac tta agt caa gcg ctt aaa ttt gta cgt gat 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
     
 ttt gca gga gac ggg tta aag aca agc tgg acg cat gaa aaa aat tgg 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Lys Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp  
                    
 aaa aaa gcg cat aat atc tta ctt cca agc ttc agt cag cag gca atg 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
                            
 aaa ggc tat cat gcg atg atg gtc gat atc gcc gtg cag ctt gtt caa 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln  
                  
 aag tgg gag cgt cta aat gca gat gag cat att gaa gta ccg gaa gac  
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
                             
 atg aca cgt tta acg ctt gat aca att ggt ctt tgc ggc ttt aac tat 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
         
 cgc ttt aac agc ttt tac cga gat cag cct cat cca ttt att aca agt 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
              
 atg gtc cgt gca ctg gat gaa gca atg aac aag ctg cag cga gca aat 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn  
                     
 cca gac gac cca gct tat gat gaa aac aag cgc cag ttt caa gaa gat 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp  
                      
 atc aag gtg atg aac gac cta gta gat aaa att att gca gat cgc aaa 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
                          
 gca agc ggt gaa caa agc gat gat tta tta acg cat atg cta aac gga 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly    
      
 aaa gat cca gaa acg ggt gag ccg ctt gat gac gag aac att cgc tat 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
                      
 caa att att aca ttc tta att gcg gga cac gaa aca aca agt ggt ctt 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
                        
 tta tca ttt gcg ctg tat ttc tta gtg aaa aat cca cat gta tta caa 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
                      
 aaa gca gca gaa gaa gca gca cga gtt cta gta gat cct gtt cca agc 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
                           
 tac aaa caa gtc aaa cag ctt aaa tat gtc ggc atg gtc tta aac gaa 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu   
        
 gcg ctg cgc tta tgg cca act gct cct gtt ttt tcc cta tat gca aaa 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Val Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
             
 gaa gat acg gtg ctt gga gga gaa tat cct tta gaa aaa ggc gac gaa 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
                
 cta atg gtt ctg att cct cag ctt cac cgt gat aaa aca att tgg gga 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
                   
 gac gat gtg gaa gag ttc cgt cca gag cgt ttt gaa aat cca agt gcg 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
                         
 att ccg cag cat gcg ttt aaa ccg ttt gga aac ggt cag cgt gcg tgt      
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys  
         
 atc ggt cag cag ttc gct ctt cat gaa gca acg ctg gta ctt ggt atg 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
                
 atg cta aaa cac ttt gac ttt gaa gat cat aca aac tac gag ctg gat 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
                  
 att aaa gaa act tta acg tta aaa cct gaa ggc ttt gtg gta aaa gca 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
                        
 aaa tcg aaa aaa att ccg ctt ggc ggt att cct tca cct agc act gaa  
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu  
                    
 cag tct gct aaa aaa gta cgc aaa aag gca gaa aac gct cat aat acg 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr  
      
 ccg ctg ctt gtg cta tac ggt tca aat atg gga aca gct gaa gga acg 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr  
               
 gcg cgt gat tta gca gat att gca atg agc aaa gga ttt gca ccg cag 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln  
                    
 gtc gca acg ctt gat tca cac gcc gga aat ctt ccg cgc gaa gga gct 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
                   
 gta tta att gta acg gcg tct tat aac ggt cat ccg cct gat aac gca 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
                        
 aag caa ttt gtc gac tgg tta gac caa gcg tct gct gat gaa gta aaa 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
         
 ggc gtt cgc tac tcc gta ttt gga tgc ggc gat aaa aac tgg gct act 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
                  
 acg tat caa aaa gtg cct gct ttt atc gat gaa acg ctt gcc gct aaa 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys  
                   
 ggg gca gaa aac atc gct gac cgc ggt gaa gca gat gca agc gac gac 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp   
                      
 ttt gaa ggc aca tat gaa gaa tgg cgt gaa cat atg tgg agt gac gta 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
                
 gca gcc tac ttt aac ctc gac att gaa aac agt gaa gat aat aaa tct 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser  
      
 act ctt tca ctt caa ttt gtc gac agc gcc gcg gat atg ccg ctt gcg 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala   
                 
 aaa atg cac ggt gcg ttt tca acg aac gtc gta gca agc aaa gaa ctt 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
                
 caa cag cca ggc agt gca cga agc acg cga cat ctt gaa att gaa ctt  
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
                 
 cca aaa gaa gct tct tat caa gaa gga gat cat tta ggt gtt att cct 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro   
                     
 cgc aac tat gaa gga ata gta aac cgt gta aca gca agg ttc ggc cta 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
       
 gat gca tca cag caa atc cgt ctg gaa gca gaa gaa gaa aaa tta gct 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
                  
 cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa tac 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
                
 gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg gct 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
         
 gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg ctt 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu  
                 
 gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca atg 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met   
       
 ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc gaa 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu  
                 
 ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att tct 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser  
                    
 tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc gtt 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
               
 gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att gcg 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
                     
 tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc ttt 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe  
      
 att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa acg 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
                         
 ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga ggc 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly  
                      
 ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt gga 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly  
                       
 gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat ctg  
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu  
                     
 tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg ctt 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
         
 cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt cag  
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln  
             
 cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat caa 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln  
           
 gga gcg cac ttc tat att tgc gga  gac gga agc caa atg  gca cct gcc 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala  
           
 gtt gaa  gca acg ctt atg aaa  agc tat gct gac gtt  cac caa gtg  
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val  
                    
 agt gaa  gca gac gct cgc tta  tgg ctg cag cag cta  gaa gaa aaa   
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys   
                      
 ggc cga  tac gca aaa gac gtg  tgg gct ggg        
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly            
 
配列番号１２
 Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Leu Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Lys Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Val Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly 
配列番号１３
aca att aaa gaa atg cct cag cca aaa acg ttt gga gag ctt aaa aat  
Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn  
               
 tta ccg tta tta aac aca gat aaa ccg gtt caa gct ttg atg aaa att 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile  
       
 gcg gat gaa tta gga gaa atc ttt aaa ttc gag gcg cct ggt cgt gta 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val  
                    
 acg cgc tac tta tca agt cag cgt cta att aaa gaa gca tgc gat gaa 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
                     
 tca cgc ttt gat aaa aac tta agt caa gcg ctt aaa ttt gta cgt gat 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
         
 ttt gca gga gac ggg tta aag aca agc tgg acg cat gaa aaa aat tgg 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Lys Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp  
              
 aaa aaa gcg cat aat atc tta ctt cca agc ttc agt cag cag gca atg  
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
               
 aaa ggc tat cat gcg atg atg gtc gat atc gcc gtg cag ctt gtt caa 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
                   
 aag tgg gag cgt cta aat gca gat gag cat att gaa gta ccg gaa gac 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
                       
 atg aca cgt tta acg ctt gat aca att ggt ctt tgc ggc ttt aac tat 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr  
         
 cgc ttt aac agc ttt tac cga gat cag cct cat cca ttt att aca agt 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
                 
 atg gtc cgt gca ctg gat gaa gca atg aac aag ctg cag cga gca aat 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn  
                         
 cca gac gac cca gct tat gat gaa aac aag cgc cag ttt caa gaa gat 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp  
                
 atc aag gtg atg aac gac cta gta gat aaa att att gca gat cgc aaa  
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys  
                      
 gca agc ggt gaa caa agc gat gat tta tta acg cat atg cta aac gga  
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly   
      
 aaa gat cca gaa acg ggt gag ccg ctt gat gac gag aac att cgc tat 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr   
                
 caa att att aca ttc tta att gcg gga cac gaa aca aca agt ggt ctt  
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu    
               
 tta tca ttt gcg ctg tat ttc tta gtg aaa aat cca cat gta tta caa  
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln   
                         
 aaa gca gca gaa gaa gca gca cga gtt cta gta gat cct gtt cca agc 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser  
                       
 tac aaa caa gtc aaa cag ctt aaa tat gtc ggc atg gtc tta aac gaa 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu  
    
 gcg ctg cgc tta tgg cca act gct cct gtt ttt tcc cta tat gca aaa 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Val Phe Ser Leu Tyr Ala Lys   
       
 gaa gat acg gtg ctt gga gga gaa tat cct tta gaa aaa ggc gac gaa  
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu  
                
 cta atg gtt ctg att cct cag ctt cac cgt gat aaa aca att tgg gga 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly   
                   
 gac gat gtg gaa gag ttc cgt cca gag cgt ttt gaa aat cca agt gcg 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala  
                    
 att ccg cag cat gcg ttt aaa ccg ttt gga aac ggt cag cgt gcg tgt 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys  
        
 atc ggt cag cag ttc gct ctt cat gaa gca acg ctg gta ctt ggt atg 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met   
                     
 atg cta aaa cac ttt gac ttt gaa gat cat aca aac tac gag ctg gat 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp    
                  
 att aaa gaa act tta atg tta aaa cct gaa ggc ttt gtg gta aaa gca  
Ile Lys Glu Thr Leu Met Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala  
                   
 aaa tcg aaa aaa att ccg ctt ggc ggt att cct tca cct agc act gaa 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu   
                    
 cag tct gct aaa aaa gta cgc aaa aag gca gaa aac gct cat aat acg 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr  
         
 ccg ctg ctt gtg cta tac ggt tca aat atg gga aca gct gaa gga acg 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr  
                
 gcg cgt gat tta gca gat att gca atg agc aaa gga ttt gca ccg cag 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln   
                            
 gtc gca acg ctt gat tca cac gcc gga aat ctt ccg cgc gaa gga gct 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala   
                    
 gta tta att gta acg gcg tct tat aac ggt cat ccg cct gat aac gca 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala  
                           
 aag caa ttt gtc gac tgg tta gac caa gcg tct gct gat gaa gta aaa  
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys  
           
 ggc gtt cgc tac tcc gta ttt gga tgc ggc gat aaa aac tgg gct act 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr    
                      
 acg tat caa aaa gtg cct gct ttt atc gat gaa acg ctt gcc gct aaa 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys   
                        
 ggg gca gaa aac atc gct gac cgc ggt gaa gca gat gca agc gac gac 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp  
                   
 ttt gaa ggc aca tat gaa gaa tgg cgt gaa cat atg tgg agt gac gta 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
                       
 gca gcc tac ttt aac ctc gac att gaa aac agt gaa gat aat aaa tct 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser  
        
 act ctt tca ctt caa ttt gtc gac agc gcc gcg gat atg ccg ctt gcg 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala  
                  
 aaa atg cac ggt gcg ttt tca acg aac gtc gta gca agc aaa gaa ctt 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu  
                       
 caa cag cca ggc agt gca cga agc acg cga cat ctt gaa att gaa ctt 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu  
                  
 cca aaa gaa gct tct tat caa gaa gga gat cat tta ggt gtt att cct 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro  
                      
 cgc aac tat gaa gga ata gta aac cgt gta aca gca agg ttc ggc cta  
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu   
        
 gat gca tca cag caa atc cgt ctg gaa gca gaa gaa gaa aaa tta gct 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala  
                   
 cat ttg cca ctc gct aaa aca gta tcc gta gaa gag ctt ctg caa tac  
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr  
                     
 gtg gag ctt caa gat cct gtt acg cgc acg cag ctt cgc gca atg gct 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala  
                    
 gct aaa acg gtc tgc ccg ccg cat aaa gta gag ctt gaa gcc ttg ctt 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu  
                         
 gaa aag caa gcc tac aaa gaa caa gtg ctg gca aaa cgt tta aca atg 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met  
          
 ctt gaa ctg ctt gaa aaa tac ccg gcg tgt gaa atg aaa ttc agc gaa 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu  
                      
 ttt atc gcc ctt ctg cca agc ata cgc ccg cgc tat tac tcg att tct 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
                       
 tca tca cct cgt gtc gat gaa aaa caa gca agc atc acg gtc agc gtt 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val  
                      
 gtc tca gga gaa gcg tgg agc gga tat gga gaa tat aaa gga att gcg 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
                    
 tcg aac tat ctt gcc gag ctg caa gaa gga gat acg att acg tgc ttt 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
        
 att tcc aca ccg cag tca gaa ttt acg ctg cca aaa gac cct gaa acg 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
                   
 ccg ctt atc atg gtc gga ccg gga aca ggc gtc gcg ccg ttt aga ggc 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly  
                    
 ttt gtg cag gcg cgc aaa cag cta aaa gaa caa gga cag tca ctt gga 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly  
                       
 gaa gca cat tta tac ttc ggc tgc cgt tca cct cat gaa gac tat ctg 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
               
 tat caa gaa gag ctt gaa aac gcc caa agc gaa ggc atc att acg ctt 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
     
 cat acc gct ttt tct cgc atg cca aat cag ccg aaa aca tac gtt cag  
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln  
                        
 cac gta atg gaa caa gac ggc aag aaa ttg att gaa ctt ctt gat caa  
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln  
                      
 gga gcg cac ttc tat att tgc gga  gac gga agc caa atg  gca cct gcc 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala  
                        
 gtt gaa  gca acg ctt atg aaa  agc tat gct gac gtt  cac caa gtg 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val  
                  
 agt gaa  gca gac gct cgc tta  tgg ctg cag cag cta  gaa gaa aaa 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys   
                
 ggc cga  tac gca aaa gac gtg  tgg gct ggg         
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly                                 
 
配列番号１４
 Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys Asn 
Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys Ile 
Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg Val 
Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp Glu 
Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg Asp 
Phe Ala Gly Asp Gly Leu Lys Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn Trp 
Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala Met 
Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val Gln 
Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu Asp 
Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn Tyr 
Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr Ser 
Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala Asn 
Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu Asp 
Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg Lys 
Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn Gly 
Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg Tyr 
Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly Leu 
Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu Gln 
Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro Ser 
Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn Glu 
Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Val Phe Ser Leu Tyr Ala Lys 
Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp Glu 
Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp Gly 
Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser Ala 
Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala Cys 
Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly Met 
Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu Asp 
Ile Lys Glu Thr Leu Met Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys Ala 
Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu 
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr 
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr 
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln 
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala 
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala 
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys 
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr 
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys 
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp 
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val 
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser 
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala 
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu 
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu 
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro 
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu 
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala 
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr 
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala 
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu 
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met 
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu 
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser 
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val 
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala 
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe 
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr 
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly 
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly 
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu 
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu 
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln 
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln 
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly  Asp Gly Ser Gln Met  Ala Pro Ala 
Val Glu  Ala Thr Leu Met Lys  Ser Tyr Ala Asp Val  His Gln Val 
Ser Glu  Ala Asp Ala Arg Leu  Trp Leu Gln Gln Leu  Glu Glu Lys 
Gly Arg  Tyr Ala Lys Asp Val  Trp Ala Gly 
配列番号１５
gggaccatgg gcagcagcca tcatca      
配列番号１６
ggggaattct tacccagccc acacgtc          
配列番号１７
gcaggagacg ggttaaagac aagctggacg catgaaaaaa at  
配列番号１８
gcaggagacg ggttacatac aagctggacg catgaaaaaa at        
配列番号１９
gcaggagacg ggttaatcac aagctggacg catgaaaaaa at    
配列番号２０
taacccgtct cctgcaaaat cacg      
配列番号２１
cgcttatggc caactgctcc tgttttttcc ctatatgcaa aaga  
配列番号２２
agttggccat aagcgcagcg    
配列番２３
ttaaacacag ataaacttgt tcaagctttg atgaaaattg c  
配列番号２４
tttatctgtg tttaataacg gtaaatt        
配列番号２５
gatattaaag aaactttaat gttaaaacct gaaggctttg tggta      
配列番号２６
agtttcttta atatccagct cgtagtt        

Claims (16)

  1. 　以下の（１）から（３）のいずれかに示すポリペプチド；
    （１）配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド；
    （２）上記（１）に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有し、かつ、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換は保持されているポリペプチド；
    （３）上記（１）に記載のアミノ酸配列に対する配列同一性が９０％以上であり、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有し、かつ、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｐ２５Ｌ及びＴ４３８Ｍよりなる群から選択される一又は二以上のアミノ酸置換は保持されているポリペプチド。
    （但し、Ｆ８７Ｋ／Ｉ／Ｈとは、配列番号２における８７位のアミノ酸残基であるＦがＫ、ＩもしくはＨに置換されていることを示し、Ａ３３０Ｖとは、配列番号２における３３０位のアミノ酸残基であるＡがＶに置換されていることを示し、Ｐ２５Ｌとは、配列番号２における２５位のアミノ酸残基であるＰがＬに置換されていることを示し、Ｔ４３８Ｍとは、配列番号２における４３８位のアミノ酸残基であるＴがＭに置換されていることを示す。）
  2. 　前記（３）における配列同一性が９５％以上である請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　オキシゲナーゼである、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ω３系脂肪酸のω３位エポキシ化用酵素剤。
  5. 　ＮＡＤＰＨ再生酵素、活性酸素を除去する酵素及び過酸化水素を除去する酵素よりなる群から選択される一又は二以上の酵素をさらに含む、請求項４に記載のω３位エポキシ化用酵素剤。
  6. 　以下の（１）から（３）のいずれかに示すＤＮＡ；
    （１）請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
    （２）配列番号３、５、７及び９のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡ；
    （３）配列番号３、５、７及び９のいずれかに示す塩基配列と等価の配列を含み、ω３系脂肪酸のω３位をエポキシ化する触媒活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
  7. 　請求項６に記載のＤＮＡを含む発現カセット。
  8. 　請求項６に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
  9. 　請求項６のＤＮＡ、請求項７に記載の発現カセット又は請求項８に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
  10. 　請求項９に記載の形質転換体を培養する工程を含む、オキシゲナーゼの製造方法。
  11. 　ω３系脂肪酸に、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、ω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法。
  12. 　ω３系脂肪酸に、請求項４に記載のω３位エポキシ化用酵素剤を作用させる工程を含む、ω３位エポキシ化脂肪酸の製造方法。
  13. 　ω３系脂肪酸に、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドを作用させる工程を含む、ω３系脂肪酸のエポキシ化方法。
  14. 　ω３系脂肪酸に、請求項４に記載のω３位エポキシ化用酵素剤を作用させる工程を含む、ω３系脂肪酸のエポキシ化方法。
  15. 　請求項１１の製造方法で得られる、ω３位エポキシ化脂肪酸を含む組成物。
  16. 　請求項１２の製造方法で得られる、ω３位エポキシ化脂肪酸を含む組成物。
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