JP2003521889A - 新規のシトクロムｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び有機化合物の酸化のためのその使用 - Google Patents

新規のシトクロムｐ４５０モノオキシゲナーゼ及び有機化合物の酸化のためのその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は改変された基質特異性を有する新規のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、それをコードするヌクレオチド配列、その配列を有する発現構築物及びベクター、それによって形質転換された微生物、種々の有機基質の微生物的な酸化のための方法、例えばインジゴ及びインジルビンの製造のための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は有機基質、例えばＮ−複素環式芳香族化合物の酸化を可能にする改変
された基質特異性を有する新規のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、それ
らをコードするヌクレオチド配列、この配列を有する発現構築物及びベクター、
これによって形質転換された微生物、種々の有機基質、例えばＮ−複素環式の芳
香族化合物の微生物学的酸化のための方法並びに、特にインジゴ及びインジルビ
ンの製造のための方法に関する。
【０００２】 新規の機能及び特性を有する酵素は天然試料のスクリーニングによるか、公知
の酵素のタンパク質工学によっても調製できる。後者の方法は場合によっては、
天然の分泌経路においては生じ得ない特性を誘発するために適当な方法であるこ
とがある。酵素のエンジニアリングのための多大な苦労にもかかわらず、今まで
は規定の基質に関する酵素変異体の触媒活性の促進のための研究は殆ど成功が得
られなかった（１〜１０）。前記の公知の場合において、その基質は構造的にそ
れぞれの酵素の本来の基質と密に関連している。今までは、改変によって酵素の
本来の基質とは構造的に全く異なる化合物の変換を触媒する酵素のエンジニアリ
ングによる成功の報告はない。
【０００３】 細菌のバシラス メガテリウムから単離されたシトクロムＰ４５０モノオキシ
ゲナーゼは通常、長鎖の飽和酸及び相応のアミド及びそのアルコールの末端近く
のヒドロキシル化又は不飽和の長鎖脂肪酸又は中鎖長を有する飽和脂肪酸のエポ
キシ化を触媒する（１１〜１３）。飽和脂肪酸の最適な鎖長は１４〜１６個の炭
素原子である。１２未満の鎖長を有する脂肪酸はヒドロキシル化されない（１１
）。
【０００４】 Ｐ４５０ ＢＭ−３のヘムドメインの構造は、Ｘ線構造分析によって規定され
た（１４〜１６）。基質結合部位は長いトンネル状の開口の形で存在し、該開口
は分子表面からヘム−分子にまで達し、ほとんど主に疎水性アミノ酸残基によっ
て定義づけられている。ヘムドメインの表面上の唯一の帯電した残基は残基Ａｒ
ｇ４７及びＴｙｒ５１である。これらの残基は水素架橋結合の形成による基質と
カルボキシレート基との結合に関与していると考えられている（１４）。Ａｒｇ
４７のＧｌｕへの突然変異はアラキドン酸のための酵素の不活性化を引き起こす
（１３）が、Ｃ１２〜Ｃ１４−アルキルトリメチルアンモニウム化合物に対する
活性は高まる（１７）。芳香族化合物、特に一核、二核又は多核の、場合により
複素環式の芳香族化合物、アルカン、アルケン、シクロアルカン及びシクロアル
ケンのための基質の使用は該酵素に関しては記載されていない。従って、今まで
はこの専門分野において従来に記載された別の有機基質として、例えばインドー
ルはＰ４５０ ＢＭ−３の本来の基質との明らかな構造的な差異に基づいて、特
に前記の残基が基質ポケットに結合できる機能的な基の欠如に基づいて基質では
ないと考えられている。
【０００５】 従って本発明の課題は改変された基質特異性又は改変された基質プロフィール
を有する新規のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを広範に調製することで
ある。特に、変異していない野生型の酵素と比較して構造的に明らかに別の基質
と酵素活性を有するモノオキシゲナーゼ突然変異体を調製すべきである。
【０００６】 “改変された基質プロフィール”は本発明による突然変異体に関して野生型の
酵素と比較して観察されるべきである。それぞれの突然変異体に関しては、特に
反応性の改善、例えば特異的活性の増大（ナノモルでの変換される基質／分／ナ
ノモルのＰ４５０−酵素として表される）、及び／又はａ）ないしｄ）の群に定
義される酸化可能な化合物の少なくとも１つの変換におけるＫｃａｔ、Ｋｍ及び
Ｋｃａｔ／Ｋｍ（例えば少なくとも１％だけ、例えば１０〜１０００％、１０〜
５００％、又は１０〜１００％）から選択される少なくとも１つのキネティック
パラメーターの改善が観察される。本発明による酸化反応は少なくとも１つの外
生の（すなわち反応媒体に添加される）又は内生の（すなわち反応媒体に既に存
在する）有機基質の酵素触媒される酸化を含む。特に本発明による酸化反応は、
脂肪族又は芳香族のＣＨ−基のモノヒドロキシル化及び／又はポリヒドロキシル
化、例えばモノヒドロキシル化及び／又はジヒドロキシル化、又は有利には非芳
香族のＣ＝Ｃ−基のエポキシ化を含む。また前記の反応の組合せも考えられる。
直接の反応生成物を更に非酵素的な副反応又は二次反応の範囲において再び変換
できる。そのような酵素的及び非酵素的なプロセスの組合せも同様に本発明の対
象である。
【０００７】 前記課題は意想外にも、Ｎ−複素環式の二核又は多核の芳香族化合物の酸化を
可能にする新規のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによって解決されるこ
とが判明した。
【０００８】 特に本発明の対象は基質結合部位が部位特異的突然変異誘発によって新規の、
例えばＮ−複素環式の基質の機能的な受容を可能にするようなモノオキシゲナー
ゼである。
【０００９】 本発明の有利な実施形においては、新規のモノオキシゲナーゼは可溶性である
、すなわち膜に結合していない形で存在し、その形で酵素的に活性である。
【００１０】 本発明によるモノオキシゲナーゼは、有利には細菌起源のシトクロムＰ４５０
モノオキシゲナーゼに由来し、特に配列番号２によるアミノ酸配列を有し、少な
くとも１つの機能的な、すなわち新規の有機基質（特に以下の化合物の群ａ）な
いしｄ）を参照のこと）、例えばＮ−複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化
合物の酸化を促進する突然変異を１７２〜２２４（Ｆ／Ｇ−ループ領域）、３９
〜４３（β−ストランド１）、４８〜５２（β−ストランド２）、６７〜７０（
β−ストランド３）、３３０〜３３５（β−ストランド５）、３５２〜３５６（
β−ストランド８）、７３〜８２（ヘリックス５）及び８６〜８８（ヘリックス
６）のアミノ酸配列領域の１つに有するバシラス メガテリウムからのシトクロ
ムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３に由来する。
【００１１】 本発明により調製されるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ突然変異体は
、有利には以下の反応： ａ）置換されていてよいＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核又
は多核の芳香族化合物の酸化； ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物の酸化； ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケンの酸化； ｄ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケンの酸化 の少なくとも１つを可能にする。
【００１２】 有利なモノオキシゲナーゼ突然変異体は、配列領域７３〜８２、８６〜８８及
び１７２〜２２４の少なくとも１つに少なくとも１つの機能的突然変異、特にア
ミノ酸置換を有する。このようにＰｈｅ８７は脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例
えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、特にＶａｌによって置換されていてよく、Ｌｅｕ
１８８はアミド側鎖を有するアミノ酸、例えばＡｓｎ又は特にＧｌｎによって置
換されていてよく、かつＡｌａ７４は脂肪族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば
Ｖａｌ、特にＧｌｙによって置換されていてよい。
【００１３】 前記の型の特に有利なモノオキシゲナーゼ突然変異体は、以下の１つ以上のア
ミノ酸置換： ａ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ； ｂ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ；又は ｃ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ、Ａｌａ７４Ｇｌｙ を有することを特徴とし、並びにそれらの機能的な等価物である。数値はこの場
合には突然変異の位置を与え、数値の前で起源のアミノ酸を、数値の後で新規に
挿入されたアミノ酸を与えている。
【００１４】 “機能的な等価物”又は具体的に開示された突然変異体の類似体はその関連に
おいて、更に前記の酸化反応ａ）ないしｄ）の少なくとも１つの範囲内で、従っ
て例えば複素環式の芳香族化合物に対して所望の基質特異性を有し、かつ例えば
インドールをヒドロキシル化するか、又は更に所望の、野生型の酵素に対して“
改変された基質プロフィール”を示す種々の突然変異体である。
【００１５】 “機能的な等価物”とは本発明によれば、前記の配列位置の少なくとも１つに
おいて、具体的に挙げたアミノ酸置換とは別であるが、それにもかかわらず具体
的に挙げた突然変異体と同様に野生型の酵素に対して“改変された基質プロフィ
ール”を示し、前記の酸化反応の少なくとも１つを触媒する突然変異体も意味す
る。機能的な等価物は、特に基質プロフィールにおける改変が質的に一致してい
る、すなわち例えば同じ基質を種々の速度で変換する場合に見なされている。
【００１６】 “機能的な等価物”は、具体的に挙げたＰ４５０ ＢＭ３突然変異体と同様に
別の生物からのＰ４５０酵素の突然変異によって得られるＰ４５０−モノオキシ
ゲナーゼ突然変異体も含む。例えば相同配列領域の配列比較によって規定するこ
とができる。最近の分子モデリングの方法によって、本発明の具体的な規定値に
依存して等価な反応パターンに影響を及ぼす突然変異を実施できる。
【００１７】 “機能的な等価物”は同様に１つ以上の付加的なアミノ酸付加、アミノ酸置換
、アミノ酸欠失及び／又はアミノ酸逆位によって得られる突然変異体も含み、そ
の際、挙げられる付加的な改変は、前記の範囲での改変された基質プロフィール
を有する突然変異体に至るかぎりは、それぞれの配列位置において生じうる。
【００１８】 本発明により酸化可能な群ａ）の基質は置換されていてよい複素環式の一核、
二核又は多核の芳香族化合物、特定の酸化可能又はヒドロキシル化可能なＮ−複
素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物で
ある。これらは、有利には２員又は３員の、特に２員、４員ないし７員の、特に
６員又は５員の縮合環を含み、その際、少なくとも１つの、有利には全ての環は
芳香族性を有し、その芳香環の少なくとも１つは１〜３個の、有利には１つのＮ
−ヘテロ原子、Ｏ−ヘテロ原子又はＳ−ヘテロ原子を環中に有する。全体の環構
造中に、場合により１又は２つの更なる同一又は異なるヘテロ原子を有していて
よい。芳香族化合物は更に１〜５個の置換基を環−炭素原子又はヘテロ原子に有
してよい。適当な置換基のための例は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、例えばメチル、
エチル、ｎ−プロピル又はｉ−プロピル又はｎ−ブチル、ｉ−ブチル又はｔ−ブ
チル又はＣ２〜Ｃ４−アルケニル、例えばエテニル、１−プロペニル、２−プロ
ペニル、１−ブテニル、２−ブテニル又は３−ブテニル、ヒドロキシル及びハロ
ゲン、例えばＦ、Ｃｌ及びＢｒである。前記のアルキル置換基又はアルケニル置
換基は、場合によりケト基又はアルデヒド基を有していてよく、このための例は
プロパン−２−オン−３−イル、ブタン−２−オン−４−イル、３−ブテン−２
−オン−４−イルである。適当な複素環式の基質のための限定されない例は、特
に二核の複素環、例えばインドール、Ｎ−メチルインドール及び１〜３個の前記
に定義した置換基によって炭素原子で置換されたその類似体、例えば５−クロロ
−インドール又は５−ブロモ−インドール、並びにキノリン及びキノリン誘導体
、例えば８−メチルキノリン、６−メチルキノリン及びキナルジン、及びベンゾ
チオフェン及び１〜３個の前記に定義した炭化水素における置換基で置換された
その類似体である。更に三核の複素芳香族は、例えばアクリジン及び１〜３個の
前記に定義された置換基によって炭素原子で置換されたその類似体であるとみな
される。
【００１９】 本発明により酸化可能な群ｂ）の基質は、置換されていてよい一核又は多核の
、特に一核又は二核の芳香族化合物、例えばベンゼン及びナフタレンである。こ
れらの芳香族化合物は、場合により一置換又は多置換されていてよく、例えば１
〜５個の置換基を環−炭素原子に有していてよい。適当な置換基のための例はＣ １ 〜Ｃ４−アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル又はｉ−プロピル又
はｎ−ブチル、ｉ−ブチル又はｔ−ブチル、又はＣ２〜Ｃ４−アルケニル、例え
ばエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル又
は３−ブテニル、ヒドロキシル及びハロゲン、例えばＦ、Ｃｌ、及びＢｒである
。前記のアルキル置換基又はアルケニル置換基は、場合によりケト基又はアルデ
ヒド基を有していてよく、そのための例は、プロパン−２−オン−３−イル、ブ
タン−２−オン−４−イル、３−ブテン−２−オン−４−イルである。この芳香
族化合物は、場合により４員ないし７員の、非芳香族環と縮合していてよい。非
芳香族環は場合により１又は２個のＣ＝Ｃ−二重結合を有してよく、前記の置換
基で一置換又は多置換されていてよく、かつ場合により１又は２個の環ヘテロ原
子を有していてよい。特に使用可能な芳香族化合物のための例は一核の芳香族化
合物、例えばクメン並びに二核の置換基、例えばインデン及びナフタレン、並び
に１又は３個の前記に定義した置換基によって炭素原子において置換されたその
類似体である。
【００２０】 本発明により酸化可能な群ｃ）の置換基は、４〜１５個の、有利には６〜１２
個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルカン又はアルケンである。例と
しては、ｎ−ブタン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタ
ン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン及びｎ−ドデカン、並びに前記の
化合物の１回以上分枝した類似体、例えば１〜３個のメチル側基を有する類似の
化合物、又は前記のアルカンの一不飽和以上、例えば一不飽和の類似体である。
【００２１】 本発明により酸化可能な群ｄ）の基質は、置換されていてよい４〜８個の環−
Ｃ−原子を有するシクロアルカン及びシクロアルケンである。このための例は、
シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、シクロヘ
プタン及びシクロヘプテンである。環構造は、この場合群ａ）及びｂ）の化合物
に関しての前記の定義のような１つ以上、例えば１〜５個の置換基を有してよい
。このための限定されない例は、イオノン、例えばα−イオノン、β−イオノン
及びγ−イオノン、並びに相応のメチルイオノン及びイソメチルイオノンである
。α−イオノン及びβ−イオノンが特に有利である。
【００２２】 本発明の対象は、本発明によるモノオキシゲナーゼをコードする核酸配列であ
る。有利な核酸配列は配列番号１に由来し、これらは前記の官能性アミノ酸突然
変異に導く少なくとも１つの核酸置換を有する。更に本発明の対象は単一又は複
数のヌクレオチドの付加、置換、挿入及び／又は欠失によって得られる核酸の機
能的類似体であり、これらは更に所望の基質特異性、例えばインドール酸化活性
を有するモノオキシダーゼをコードする。
【００２３】 本発明によれば、いわゆるサイレント突然変異を有するか、又は特定の起源生
物又は宿主生物のコドン利用に相応して具体的に挙げられた配列と比較して改変
されているような核酸と同様に天然に存在するその突然変異体も含まれる。本発
明によれば更に遺伝子的なコドンの縮重（すなわち一致するアミノ酸配列の変更
なく）又は保存的核酸置換（すなわち一致するアミノ酸は同じ荷電、サイズ、極
性及び／又は溶解度の他のアミノ酸によって置換される）によって得られる核酸
配列の変更と同様にヌクレオチド付加、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド逆位又
はヌクレオチド欠失によって改変された、“改変された基質プロフィール”を有
する本発明によるモノオキシゲナーゼをコードする配列並びに相応の相補配列も
含まれる。
【００２４】 更に本発明の対象は調節核酸配列の遺伝子的コントロール下に少なくとも１つ
の、本発明による突然変異体をコードする核酸配列を含む発現構築物並びにこれ
らの発現構築物の少なくとも１つを含むベクターである。
【００２５】 有利には本発明による構築物はそれぞれのコーディング配列の５′−上流にプ
ロモーターを、かつ３′下流にターミネーター配列、場合により他の慣用の調節
エレメントを有し、特にそれぞれはコーディング配列と構成的に結合している。
構成的な結合とはプロモーター、コーディング配列、ターミネーター及び場合に
より他の調節エレメントの配列的な配置が、調節エレメントのそれぞれがその機
能をコーディング配列の発現において規定のように満たすことができることを意
味する。構成的に結合可能な配列のための例は、ターゲティング配列並びに翻訳
強化因子、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。他の調節エレメ
ントは選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製起点などである。
【００２６】 人工的な調節配列の他に、天然の調節配列を本来の構造遺伝子の前になおも存
在していてよい。遺伝子的変更によって、この天然の調節を場合によりオフにし
、かつ遺伝子の発現を増大又は低下させてもよい。しかしながら、該遺伝子構築
物は容易に合成できる、つまり付加的な調節シグナルは構造遺伝子の前に挿入さ
れず、その調節を有する天然のプロモーターを排除しない。その代わりに、天然
の調節配列はもはや調節を行わず、かつ遺伝子発現を増大又は低下させるように
突然変異させる。核酸配列は、遺伝子構築物に１つ以上のコピーで含まれていて
よい。
【００２７】 使用可能なプロモーターのための例は：ｃｏｓ−プロモーター、ｔａｃ−プロ
モーター、ｔｒｐ−プロモーター、ｔｅｔ−プロモーター、ｔｒｐ−ｔｅｔ−プ
ロモーター、ｌｐｐ−プロモーター、ｌａｃ−プロモーター、ｌｐｐ−ｌａｃ−
プロモーター、ｌａｃＩｑ−プロモーター、Ｔ７−プロモーター、Ｔ５−プロモ
ーター、Ｔ３−プロモーター、ｇａｌ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、
ａｒａ−プロモーター、ＳＰ６−プロモーター、ｌ−ＲＰ−プロモーター又はｌ
−ＰＬ（これらは有利にはグラム陰性細菌で使用が見受けられる）並びにグラム
陽性プロモーターのａｍｙ及びＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、
ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ又は植物プロモーターのＣａＭＶ／３５
Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ又はユビ
キチンプロモーター又はファゼオリンプロモーターである。特に有利には、誘導
可能なプロモーター、例えば光、特に温度で誘導可能なプロモーター、例えばＰ ｒ Ｐｌ−プロモーターの使用である。
【００２８】 原則的に、それらの調節配列を有する全ての天然プロモーターを使用できる。
また更に合成プロモーターを有利に使用できる。
【００２９】 挙げられたレギュレーター的な配列は、核酸配列の意図的な発現及びタンパク
質発現を可能にすべきである。このことは、例えば宿主生物に応じて、遺伝子が
誘導の後に発現又は過剰発現されるか、又は直ちに発現及び／又は過剰発現され
ることを意味している。
【００３０】 レギュレーター的な配列もしくは因子は、この場合、有利には発現にポジティ
ブな影響を及ぼし、かつそれによって発現は増大又は低下される。このようにレ
ギュレーター的なエレメントの強化は有利には転写レベルで、強力な転写シグナ
ル、例えばプロモーター及び／又は“エンハンサー”を使用することによって実
施する。その他に、しかしながら転写の強化を、例えばｍＲＮＡの安定性を改善
することによっても可能である。
【００３１】 発現カセットの製造は、適当なプロモーターと適当なモノオキシゲナーゼ−ヌ
クレオチド配列並びにターミネーター又はポリアデニル化シグナルの融合によっ
て実施する。このために、T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, Cold S
pring Habor, NY(1989) 並びに T.J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquis
t, Experiments with Gene Gusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sp
ring Harbor, NY(1984) 及び Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in M
olecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience(1987)
に記載されているような通常の組み換え技術及びクローニング技術を使用する。
【００３２】 組み換え核酸構築物もしくは遺伝子構築物は、適当な宿主生物における発現の
ために、有利には宿主中で最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的なベクター
に挿入する。これらのベクターは当業者によく知られており、例えば“クローニ
ングベクター”（Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York
-Oxford, 1985）から引用できる。ベクターとは、プラスミドの他にファージ、
ウイルス、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュウロウイルス及びアデノウイルス、
トランスポゾン、ＩＳ−エレメント、ファズミド、コスミド及び直鎖状のＤＮＡ
又は環状のＤＮＡのような当業者に公知の全ての別のベクターを意味する。これ
らのベクターは宿主生物中で自律的に複製され、又は染色体により複製されうる
。
【００３３】 本発明によるベクターを使用して、例えば少なくとも１つの本発明よるベクタ
ーで形質転換され、突然変異体の作成のために使用できる組み換え微生物を製造
できる。有利には前記の本発明による組み換え構築物を適当な宿主系に導入し、
発現させる。この場合、有利には当業者に公知のよく知られたクローニング法及
びトランスフェクション法を使用して、前記の核酸をそれぞれの発現系に発現の
ために導入する。適当な系は、例えばMolecular Biology, F. Ausubel et al.,
Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997の最近のプロトコールに記載されて
いる。
【００３４】 宿主生物として、原則的に本発明による核酸、それらのアレル変異体、それら
の機能的な等価物又は誘導体の発現を可能にする全ての生物である。宿主生物と
は、例えば細菌、菌類、酵母、植物細胞又は動物細胞を意味するべきである。有
利な生物は、微生物、例えば属エシェリキア、例えばエシェリキア コリ、スト
レプトマイセス、バシラス又はシュードモナス、真核の微生物、例えばサッカロ
マイセス セレビシエ、アスペルギルス、より高等な動物又は植物からの真核細
胞、例えばＳｆ９又はＣＨＯ細胞である。
【００３５】 所望であれば、遺伝子構築物はトランスジェニック生物、例えばトランスジェ
ニック動物、例えばマウス、ヒツジ又はトランスジェニック植物において発現さ
せてもよい。トランスジェニック生物は、いわゆるノックアウト動物又は植物で
あり、これらにおいては該当する内在性の遺伝子を、例えば突然変異又は部分的
もしくは完全な欠失によってオフにしている。
【００３６】 効果的に形質転換された生物の選択は同様にベクター又は発現カセット中に含
まれているマーカー遺伝子によって実施できる。かかるマーカー遺伝子のための
例は抗生物質耐性及び形質転換された細胞の着色に作用する呈色反応を触媒する
酵素のための遺伝子である。これらはその際、自動的な細胞選別によって実施で
きる。効果的にベクターで形質転換された、相応の抗生物質耐性遺伝子（例えば
Ｇ４１８又はハイグロマイシン）を有する微生物は相応の抗生物質含有培地又は
培養基によって選択できる。細胞表面に現れるマーカータンパク質はアフィニテ
ィークロマトグラフィーによる選択のために使用できる。
【００３７】 宿主生物及びその生物に適当なベクター、例えばプラスミド、ウイルス又はフ
ァージ、例えばＲＮＡ−ポリメラーゼ／プロモーター系、ファージλ、μ又は別
の溶原ファージ又はトランスポゾン及び／又は他の有利なレギュレーター的な配
列からなる組合せは発現系を形成する。例えば、概念“発現系”とはホニュウ類
細胞、例えばＣＨＯ細胞及びホニュウ類細胞に適当なベクター、例えばｐｃＤＮ
Ａ３ｎｅｏベクターからなる組合せを意味する。
【００３８】 前記のように、遺伝子産物は有利にはトランスジェニック動物、例えばマウス
、ヒツジ又はトランスジェニック植物において発現される。同様に、核酸に由来
するＲＮＡを有する細胞不含の転写系を計画することができる。
【００３９】 本発明の対象は、更に本発明のモノオキシゲナーゼを、モノオキシゲナーゼ産
生微生物を培養し、場合によりモノオキシゲナーゼの発現を誘導し、かつモノオ
キシゲナーゼを培養から単離して製造するための方法である。本発明によるモノ
オキシゲナーゼは、所望であれば大工業的な規模で製造できる。
【００４０】 微生物は、公知の方法で培養及び発酵させることができる。細菌は、例えばＴ
Ｂ培地又はＬＢ培地中で、温度２０〜４０℃、ｐＨ値６〜９で増殖させることが
できる。詳細には適当な培養条件は、例えばT. Maniatis, E. F. Fritsch and J
. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L
aboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989)に記載されている。
【００４１】 これらの細胞は、モノオキシゲナーゼを培養培地中で分泌しない場合には、溶
解され、モノオキシゲナーゼは公知のタンパク質単離法によって溶解物から得ら
れる。これらの細胞は選択的に高周波の超音波によって、高圧によって、例えば
フレンチプレスセル中で、浸透圧溶解（Osmolyse）によって、デタージェント、
溶解酵素又は有機溶剤の作用によって、ホモジェネーターによって、又は挙げら
れた複数の方法の組合せによって溶解させることができる。モノオキシゲナーゼ
の精製は公知のクロマトグラフィー法、例えばモレキュラーシーブ−クロマトグ
ラフィー（ゲル濾過）、例えばＱ−セファロース−クロマトグラフィー、イオン
交換−クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィー並びに別の通常の方法
、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析及び本来のゲル電気泳動によって達成で
きる。適当な方法は、例えばCooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, V
erlag Walter de Gruyter, Berlin, New York又はScopes, R., Protein Purific
ation, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【００４２】 特に有利には、組み換えタンパク質の単離のために、ｃＤＮＡを規定のヌクレ
オチド配列に関して伸張させ、それによって改変された容易な精製のために役立
つポリペプチド又は融合タンパク質をコードするベクター系又はオリゴヌクレオ
チドを使用する。そのような適当な改変は、例えばアンカーとしての役割を果た
すいわゆる“タグ”、例えばヘキサ−ヒスチジン−アンカーとして公知の改変又
は抗体の抗原として認識できるエピトープ（例えばHarlow, E. and Lane, D., 1
988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Pressに
記載されている）である。これらのアンカーは、タンパク質の固体担体、例えば
ポリマーマトリクスへの付着のために役立ち、これは例えばクロマトグラフィー
カラム中に充填できるか、又はマイクロタイタープレートもしくは通常の支持体
上で使用できる。
【００４３】 同時にこれらのアンカーはタンパク質の認識のために使用できる。タンパク質
の認識のために、更に通常のマーカー、例えば蛍光色素、基質との反応の後に検
出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー又は放射性マーカーを単独又はタン
パク質の誘導体化のためのアンカーと組み合わせて使用できる。
【００４４】 本発明は、更に有機化合物、例えば前記の定義のようなＮ−複素環式の一核、
二核又は多核の芳香族化合物の微生物的な酸化のための方法において、 ａ１）前記の定義のような組み換え微生物を培養培地中で外生の（外部から添加
された）又は中間形成する本発明によるモノオキシゲナーゼにより酸化可能な基
質の存在下に、有利には酸素（すなわち好気的）の存在下に培養するか、又は ａ２）基質を有する反応媒体を本発明による酵素で、有利には酸素及び電子供与
体の存在下にインキュベートし、かつ ｂ）形成した酸化生成物又はその副生成物を培地から単離する ことを特徴とする方法に関する。
【００４５】 変換のために必要な酸素は、周囲空気から反応媒体中に獲得されるか、又は必
要であれば自体公知の方法で添加できる。
【００４６】 有利には酸化可能な基質は、 ａ）置換されていてよいＮ−複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物、 ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物、 ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケン； ｄ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケン から選択される。
【００４７】 有利な変法は、インジゴ／インジルビンの形成に向けられ、これは基質が培地
中で中間形成したインドールであり、培養培地から生じる、中間形成したヒドロ
キシインドールの酸化によって生産され生じるインジゴ及び／又はインジルビン
を単離することを特徴としている。
【００４８】 本発明による酸化を組み換え微生物によって実施するのであれば、有利にはま
ず微生物の培養を酸素及び天然培地、例えばＴＢ培地又はＬＢ培地の存在下に約
２０〜４０℃の培養温度及び約６〜９のｐＨ値において、十分な細胞密度が達成
されるまで実施する。外生のインドールの添加は通常は必要ない。それというの
もこれは微生物によって中間形成されるからである。別の基質の変換においては
、それに対して外生の基質の添加を必要とすることがある。酸化反応をより良好
に制御するために、有利には誘導可能な、特に温度誘導可能なプロモーターが使
用される。この場合に、温度を必要な誘導温度、例えばＰｒＰｌプロモーターで
は４２℃に高め、これを十分な時間にわたり、例えば１〜１０又は５〜６時間の
間、モノオキシゲナーゼ活性の発現のために保持し、引き続き温度を約３０〜４
０℃の値に再び低下させる。培養は、酸素の存在下に１２時間〜３日間継続する
。特にインドール−酸化の場合にはｐＨ値はＮａＯＨの添加によって、例えば９
〜１０に高め、それによってインジゴ形成もしくはインジルビン形成を酵素によ
って形成した酸化生成物である２−ヒドロキシインドール及び３−ヒドロキシイ
ンドールの空気酸化を付加的に必要とする。
【００４９】 本発明によるインジゴ／インジルビン形成を以下の反応式によって具体的に示
す：
【００５０】
【化１】
【００５１】 本発明による酸化をそれに対して精製された又は濃縮された酵素変異体によっ
て実施するのであれば、本発明による酵素は外生の基質を含む、例えばインドー
ルを含む培地（約０．０１〜１０ｍＭ、又は０．０５〜５ｍＭ）中に溶解し、変
換を、有利には酸素の存在下に、約１０〜５０℃、例えば３０〜４０℃の温度及
び約６〜９（例えば１００〜２００ｍＭのリン酸バッファー又はトリスバッファ
ーによって調整する）のｐＨ値において、かつ還元剤の存在下に実施し、その際
基質含有培地を更に酸化されるべき基質に対して約１〜１００倍、又は１０〜１
００倍の還元当量のモル過剰で含有する。有利な還元剤はＮＡＤＰＨである。還
元剤の添加は必要であれば少しずつ実施してよい。
【００５２】 類似のように、酸化可能な基質として有利には、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン
、ｎ−デカン、ｎ−ドデカン、クメン、１−メチルインドール、５−Ｃｌ−イン
ドール又は５−Ｂｒ−インドール、インデン、ベンゾチオフェン、α−イオノン
、β−イオノン及びγ−イオノン、アクリジン、ナフタレン、６−メチルキノリ
ン又は８−メチルキノリン、キノリン及びキナルジンが使用される。
【００５３】 例えば本発明による酵素酸化反応は以下の条件下に実施できる： 基質濃度：０．０１〜２０ｍＭ 酵素濃度：０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ 反応温度：１０〜５０℃ ｐＨ：６〜８ バッファー：０．０５〜０．２Ｍのリン酸カリウム又はトリス／ＨＣｌ 電子供与体：これを少しずつ添加する（出発濃度は約０．１〜２ｍｇ／ｍｌ） 例えば電子供与体（例えばＮＡＤＰＨ）の添加による反応の開始の前に、短時
間（１〜５分間）、前インキュベートしてよい（約２０〜４０℃で）。この変換
は好気的に実施し、場合により付加的な酸素の導入において実施する。
【００５４】 本発明による基質酸化プロセスにおいては、反応培地に含有する、又は添加さ
れる酸素を還元的に酵素により分解する。必要な還元当量は、添加される還元剤
（電子供与体）から提供される。
【００５５】 形成された酸化生成物は、通常の方法で、例えば抽出又はクロマトグラフィー
によって培地から分離及び精製できる。
【００５６】 本発明の他の対象は、本発明による酵素又は本発明による組み換え微生物を固
定された形で含有するバイオリアクターに関する。
【００５７】 本発明の最後の対象は、本発明によるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ
又は本発明によるベクター又は微生物を群ａ）ないしｄ）からの基質、特にＮ−
複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物の微生物的な酸化のため、並びに
有利にはインジゴ及び／又はインジルビンの形成のために使用することに関する
。
【００５８】 本発明をなおも以下の実施例に関してより詳細に記載する。
【００５９】 例１：Ｐ４５０ ＢＭ−３の特定のコドンの無作為化 この実験は実質的に（１９）に記載のように実施した。３つの位置（Ｐｈｅ８
７、Ｌｅｕ１８８及びＡｌａ７４）は部位特異的突然変異誘発を使用してストラ
タジーンのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット（La Jolla, CA, USA）の使用下に無
作為化した。以下のＰＣＲプライマーを個々の位置に関して使用した： Ｐｈｅ８７： ５′−ｇｃａｇｇａｇａｃｇｇｇｔｔｇｎｎｎａｃａａｇｃｔｇｇａｃｇ−３′
（配列番号３）、 ５′−ｃｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｔｎｎｎｃａａｃｃｃｇｔｃｔｃｃｔｇｃ−３′
（配列番号４） Ｌｅｕ１８８： ５′−ｇａａｇｃａａｔｇａａｃａａｇｎｎｎｃａｇｃｇａｇｃａａａｔｃｃａ
ｇ−３′（配列番号５）、 ５′−ｃｔｇｇａｔｔｔｇｃｔｃｇｃｔｇｎｎｎｃｔｔｇｔｔｃａｔｔｇｃｔｔ
ｃ−３′（配列番号６）、 Ａｌａ７４： ５′−ｇｃｔｔｔｇａｔａａａａａｃｔｔａａａｇｔｃａａｎｎｎｃｔｔａａａ
ｔｔｔｇｔａｃｇ−３′（配列番号７）、 ５′−ｃｇｔａｃａａａｔｔｔａａｇｎｎｎｔｔｇａｃｔｔａａｇｔｔｔｔｔａ
ｔｃａａａｇｃ−３′（配列番号８） ＰＣＲのための条件は全ての３つの位置に関して同一であった。特に、５０μ
ｌの反応容量あたり１７．５ピコモルのそれぞれのプライマー、２０ピコモルの
テンプレートプラスミドＤＮＡ、３ＵのＰｆｕポリメラーゼ及び３．２５ナノモ
ルのそれぞれのｄＮＴＰを使用した。ＰＣＲ反応は９４℃／１分間で開始し、次
いで以下の温度サイクルを２０回実施した：９４℃ １分間；４６℃ ２．５分
間；７２℃ １７分間。２０サイクルの後に、反応を７２℃で１５分間継続した
。ＰＣＲの後に、テンプレートＤＮＡを２０ＵのＤｐｎＩで３７℃において３時
間消化した。引き続きＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換された
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ
アガープレート上にプレーティングした。引き続き３７℃で１８時間インキュベ
ートした。
【００６０】 例２： Ｐ４５０ ＢＭ−３の発現及び精製並びにその突然変異体及び青色顔料の製造 Ｐ４５０ ＢＭ−３遺伝子及びその突然変異体を強力な温度誘導可能なプラス
ミドｐＣＹＴＥＸＰ１のプロモーターＰＲＰＬ−プロモーターのコントロール下
にＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αで既に記載したように（２０）発現させた。コロニー
を滅菌ようじで採取し、それぞれの窪みに２００μｌのＴＢ培地及び１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含有する９６個の窪みを有するマイクロタイタープレー
トに移した。引き続き３７℃でオーバーナイトでインキュベートした。それぞれ
の窪みの細胞培養の４０μｌを引き続き、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有
する２ｍｌのＴＢ培地を含有する培養チューブに移した。引き続き３７℃で２時
間培養した。次いで温度を誘導のために６時間４２℃に高めた。次いで培養を３
７℃でオーバーナイトで継続し、その際、青色顔料が製造された。
【００６１】 酵素又は青色顔料の調製用の製造を３００ｍｌの細胞培養（ＯＤ５７８ｎｍ＝
０．８〜１．０）から出発して実施した。酵素の単離のために、細胞を４０００
ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．１ＭのＫｘＰＯ４バッファー（ｐＨ７．４）
中に再懸濁した。氷冷した細胞をＢｒａｎｓｏｎの超音波発生器Ｗ２５（Dietze
nbach, Deutschland）を使用して８０Ｗのエネルギー出力において２分間の超音
波負荷を３回実施することによって慎重に溶解させた。懸濁液を３２５７０×ｇ
で２０分間遠心分離した。粗抽出物を活性測定もしくは酵素精製のために使用し
た。酵素精製は、（２１）に既に記載したように実施し、これをもって引用され
たものとする。精製された酵素の濃度を、４５０及び４９０ｎｍでの吸光度の差
異によって、（１１）で既に記載したように９１ｍＭ- １ｃｍ- １の吸光係数εの
使用下に測定した。
【００６２】 例３： 大量の青色顔料を製造する突然変異体の単離 それぞれ１００個のコロニーをそれぞれの位置の、相応の位置のコドンのラン
ダム突然変異誘発によって生じた突然変異体から単離した。これらのコロニーを
培養チューブ中で青色顔料の製造のために培養した。細胞を水で洗浄して、緩慢
な遠心分離工程（５００ｒｐｍ）を複数回行った後に、青色顔料をジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）で抽出した。青色顔料の溶解度はＤＭＳＯ中で最も高かっ
た。抽出物の吸光は６７７ｎｍで測定した。規定の位置の全ての突然変異体によ
って青色顔料を大量に製造するそれぞれの突然変異体をＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ
ＤＮＡシーケンシング−キット；ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ３７７ ＤＮＡシーケ
ンサー）のために使用し、更に部位特異的なランダム突然変異誘発のためのテン
プレートとして使用した。
【００６３】 例４： インドール−ヒドロキシル化のための活性試験 インドール−ヒドロキシル化活性をＤＭＳＯ中の１０〜５００ｍＭのインドー
ル溶液８μｌ、８５０μｌのトリス−ＨＣｌバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．２
）及び０．６ナノモルのＰ４５０ ＢＭ−３野生型又は突然変異体を１ｍｌの最
終容量で含有する溶液中で試験した。この混合物を９分間、前インキュベートし
、次いで反応を５０μｌのＮＡＤＰＨの１ｍＭ水溶液の添加によって開始させた
。反応を２０秒後に６０μｌの１．２ＭのＫＯＨの添加によって停止させた。５
〜３０秒（好気的条件下に）以内に、酵素生成物は完全にインジゴ（［Δ２，２ ′ −ビインドリン］−３，３′−ジオン）及びインジルビン（［Δ２，３′−ビ
インドリン］−２′，３−ジオン）に変換された。インジゴ生成をその６７０ｎ
ｍでの吸光によって測定した。純粋なインジゴによる検定曲線は３．９ｍＭ- １
ｃｍ- １の吸光係数を波長で示した。インジゴ生成に関して４０秒の反応時間で
０．６ナノモルの野生型もしくはＰ４５０ ＢＭ−３突然変異体及び０．０５〜
５．０ｍＭのインドールの使用下に線形の曲線経過が得られた。インジルビンは
６７０ｎｍで弱い吸光を示し、形成されたインジルビン量は形成されたインジゴ
量よりもかなり低かった。インジルビンの形成は、キネティックパラメーターの
測定において無視した。ＮＡＤＰＨ消費は３４０ｎｍで測定し、６．２ｍＭ- １
ｃｍ- １の吸光係数を使用して（１７）のようにして計算した。
【００６４】 例５： インジゴ及びインジルビンの精製 細胞を水で洗浄し、繰り返し５００ｇで遠心分離した後に、形成された青色ペ
レットをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で抽出した。抽出物をほぼ乾燥するまで
蒸発させ、赤色顔料を５０ｍｌの無水エタノールで複数回抽出した。残留する青
色の固体をＴＨＦ中に溶解させ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分
析した。エタノール溶液を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（DC 60, M
erck, Darmstadt, Deutschland;２ｃｍ×３０ｃｍ）によって精製し、次いでこ
れらをＴＨＦ及び石油エーテルによって１：２の比で洗浄した。得られた赤色溶
液を蒸発させ、その純度をＴＬＣによって測定した。青色及び赤色の顔料の吸収
スペクトルをＵｌｔｒａｓｐｅｃ３０００分光光度計（ファルマシア、Uppsala,
Sweden）を使用して４００〜８００ｎｍの範囲内で測定した。更に青色及び赤
色の色素を質量分析計及び１Ｈ−ＮＭＲ分光器によって分析した。
【００６５】 実験結果 １．Ｐ４５０ ＢＭ−３突然変異誘発による青色顔料についての生産性の向上 ネイティブのＰ４５０ ＢＭ−３は青色のインジゴ含有顔料もしくは２−ヒド
ロキシインドールもしくは３−ヒドロキシインドールの前駆物質の製造のための
能力を有さない。十分な量の青色顔料を製造しうるために、Ｐ４５０ ＢＭ３を
意図的な進化（Evolution）に曝した。青色顔料を製造する全ての突然変異体の
配列決定を実施した。以下の３つの位置の少なくとも１つに突然変異を有するこ
とが保証された：Ｐｈｅ８７、Ｌｅｕ１８８及びＡｌａ７４。従ってこれらの３
つの位置が青色顔料の製造においてＰ４５０ ＢＭ−３の活性に役割を果たすこ
とが想定される。パルミトレイン酸と錯形成したシトクロム−Ｐ４５０−ＢＭ３
のヘムドメイン構造から、Ｐｈｅ８７がヘム基における基質の接近を妨げること
が解った（１４）。突然変異体Ｐｈｅ８７Ｖａｌは（１４Ｓ，１５Ｒ）アラキド
ン酸（１３）のエポキシ化における高いレジオ選択性及び立体選択性を示し、突
然変異体Ｐｈｅ８７Ａｌａはヒドロキシル化位置ω−１、ω−２及びω−３をシ
フトさせる（２２）。位置８７は従ってＰＣＲによる部位特異的なランダム突然
変異誘発のための最初の位置として選択される。チューブ培養において、僅かな
量の青色顔料が誘導の後に生じる７個のコロニーが得られた。最も大量の青色顔
料を産生するコロニーをＤＮＡ配列決定のために選択した。配列データからＰｈ
ｅ８７のＶａｌによる置換が判明した。突然変異体Ｐｈｅ８７Ｖａｌを引き続き
位置Ｌｅｕ１８８での第２のサイクルの部位特異的なランダム突然変異誘発のた
めのテンプレートとして使用した。パルミトレイン酸と錯形成したヘムドメイン
の構造は、Ｆ−ヘリックス及びＧ−ヘリックスの再配置が残基Ｌｅｕ１８８を基
質と直接接触させることを示している（１４）。この位置は従って基質結合又は
基質配向において重要な役割を果たすことがある。第２のスクリーニング過程の
後に、青色顔料を産生する３１個のクローンが観察された。最も大量の顔料を産
生する突然変異体は置換Ｐｈｅ８７Ｖａｌ及びＬｅｕ１８８Ｇｌｎを有する。こ
の突然変異体を引き続き位置Ａｌａ７４において第３の部位特異的なランダム突
然変異誘発の過程で突然変異させた。この場合、複数ｍｇの青色顔料を３００ｍ
ｌのＴＢ培地を含有する２リットルのフラスコ中で産生する３重の突然変異体Ｆ
８７Ｌ１８８Ａ７４（Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ及びＡｌａ７４Ｇ
ｌｙ）が得られた。この量は青色顔料の単離及び特徴付けのために十分である。
【００６６】 ２．青色顔料の単離及び同定 細胞の洗浄の後に、残留した青色のペレットをＴＨＦで抽出し、ＴＬＣ分析し
た。青色顔料は迅速に移動する青色成分と緩慢に移動する赤色顔料に分離された
。両者の成分は市販のインジゴ試料の成分と全く同じ移動度パラメーターを示し
た。
【００６７】 精製の後に、両者の成分のＤＭＳＯ中での吸収スペクトルを測定した。この青
色成分は市販のインジゴ試料と同じスペクトルを示した。精製された青色及び赤
色の成分をそれぞれ質量分析によって分析した。両者の顔料の質量スペクトルは
ｍ／ｚ＝２６２での強力な分子イオンピーク及び２つのｍ／ｚ＝２３４及び２０
５での２つの断片ピーク（相対強度 それぞれ１０％）を示す。このパターンは
インジゴイド化合物に典型的である。これらのイオンの元素組成は高分解能の質
量分析器によってＣ１６Ｈ１０Ｎ２Ｏ２、Ｃ１５Ｈ１０Ｎ２ＯもしくはＣ１４Ｈ ９ Ｎ２と測定された。これはインジゴ型の構造に関して同様に特徴的である。従
って青色顔料はインジゴとして、かつ赤色顔料はインジルビンとして規定された
。構造の確認のために両者の顔料の５００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＤ
ＭＳＯ−Ｄ６−溶液において実施した。結果は文献のデータ（２３）と一致した
。
【００６８】 ３．単離された酵素によるインジゴの製造 インジゴが微生物の形質転換によって得られることは公知である（２４〜２６
）。しかしながらこれらの微生物系のいずれもＰ４５０モノオキシゲナーゼを有
さない。本発明によればまずインドールのための精製酵素の触媒活性を測定した
。突然変異体Ｆ８７Ｌ１８８Ａ７４をインドールと混合した。いかなる呈色反応
も観察されなかった。反応混合物にＮＡＤＰＨを添加した後に初めて約２０分後
に青色顔料が形成された。反応混合物のｐＨ値をＮＡＤＰＨの添加の３０秒後に
約１１に調整することによって、数秒以内に青色の着色が見られる。ネイティブ
のＰ４５０ ＢＭ−３を使用するコントロール試験は、酵素、インドール及びＮ
ＡＤＰＨの高められた濃度の使用下でさえも常に陰性であった。青色顔料を酢酸
エチルで抽出し、ＴＬＣによって分析した。青色顔料を迅速に移動する青色成分
と緩慢に移動する赤色成分に分離した。Ｒｆ値及び吸収スペクトルは発酵ブロス
からの抽出物の値と同じであった。Ｐ４５０ ＢＭ−３のＦ８７Ｌ１８８Ａ７４
突然変異体は従ってインドールヒドロキシラーゼである。
【００６９】 今まではインドールのインジゴへの酵素による転換は２つの過程が述べられて
きた。一方の過程はジオキシゲナーゼによって、他方ではスチレンモノオキシゲ
ナーゼによって触媒される（２４，２５）。ＮＡＤＰＨ化学量論比は両者の場合
において２である。従ってジオキシゲナーゼに対して本発明による突然変異体Ｆ
８７Ｌ１８８Ａ７４はインドールを１つだけの位置でヒドロキシル化して、オキ
シインドール（２−ヒドロキシインドール）又はインドキシル（３−ヒドロキシ
インドール）を形成すると想定される。
【００７０】 ４．インドールヒドロキシル化のキネティックパラメーター 野生型酵素Ｐ４５０ ＢＭ−３及び突然変異体Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ、Ｐｈｅ８
７Ｖａｌ、Ｆ８７Ｌ１８８及びＦ８７Ｌ１８８Ａ７４の純粋な試料をインドール
ヒドロキシル化のキネティックパラメーターの測定のために使用した。結果を以
下の第１表にまとめる。
【００７１】 第１表：インドール−ヒドロキシル化のためのＰ４５０ ＢＭ−３突然変異体
のキネティックパラメーター
【００７２】
【表１】
【００７３】 過剰の精製酵素及び高められたインドール濃度でさえも、野生型はインドール
を酸化できない。突然変異体Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎは僅かな活性を示している。突
然変異体Ｐｈｅ８７Ｖａｌは１１９Ｍ- １ｓ- １のインドールヒドロキシル化のた
めの触媒作用を示している。２重の突然変異体Ｆ８７Ｌ１８８（Ｐｈｅ８７Ｖａ
ｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ）の触媒効率は５４３Ｍ- １ｓ- １に高まり、更なる置換
Ａｌａ７４Ｇｌｙの導入によって１３６５Ｍ- １ｓ- １に高まった。Ｋｃａｔ値は
Ｐｈｅ８７Ｖａｌから３重の突然変異体に向かって全体で３５％だけ高まり、一
方でＫｍ値は約７倍だけ減少した。このことは、Ａｌａ７４Ｇｌｙ及びＬｅｕ１
８８Ｇｌｎが主に基質結合に関与していることを示している。
【００７４】 インドール−転換速度（Ｋｃａｔ＝２．７３ｓ- １）は３重の突然変異体Ｆ８
７Ｌ１８８Ａ７４に関しては少なくともＰ４５０−酵素よりも１０倍以上高かっ
た（１８）。
【００７５】 例６： 改変されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによるｎ−オクタンヒドロ
キシル化 これらの変換は以下の突然変異を有するＰ４５０ ＢＭ−３−モノオキシゲナ
ーゼ突然変異体によって実施した：Ｐｈｅ８７Ｖａｌ Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ Ａ
ｌａ７４Ｇｌｙ。
【００７６】 基質としてはｎ−オクタンを選択した。ｎ−オクタンのヒドロキシル化のため
に、以下の好気的な反応バッチを使用した： Ｐ４５０ ＢＭ−３突然変異体： １７．５ｍｇ（凍結乾燥物） 反応バッファー： ９．１ｍｌ（リン酸カリウムバッファー ５０ｍＭ、ｐＨ
７．５） 基質： ６０ｍＭの溶液（アセトン中）の５０μｌ 温度： ２５℃ 酵素凍結乾燥物を５００μｌの反応バッファー中に溶解し、まず基質及び反応
バッファーを一緒に室温で５分間インキュベートした。引き続き３００μｌのＮ
ＡＤＰＨ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）の添加を実施した。ＮＡＤＰＨの添加を更に２回
繰り返した。反応の進行を３４０ｎｍの吸収測定によって追跡し、その際、ＮＡ
ＤＰＨの低下が観察されることがある。その場合、ＮＡＤＰＨを３００μｌずつ
添加する。それというのも反応溶液中での高すぎるＮＡＤＰＨ濃度は酵素の不活
性化を導くからである。生成物の単離のために、引き続き反応溶液を５ｍｌのジ
エチルエーテルで３回抽出した。合した有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮
した。引き続き生成物をＤＣ、ＧＣ／ＭＳ及びＮＭＲによって特徴付けした。
【００７７】 反応混合物のＧＣ／ＭＳ分析によって以下の結果が得られた： 化合物 Ｒｔ［分］１） 変換率［％
］ ４−オクタノール １３．５１ ３７ ３−オクタノール １４．０８ ４７ ２−オクタノール １４．２６ １６ １） 温度プログラム：４０℃ １分間 等温 ／ ３℃／分 ９５℃ ／
１０℃／分 ２７５℃；装置：Finnigan MAT 95；ＧＣ：HP 5890 Series II Spl
it Injector；カラム：HP-5MS（メチルシロキサン）30m x 0.25mm；キャリヤー
ガス：０．０６５ｍｌ／分のＨｅ。
【００７８】 出発材料はもはや見いだされなかった。
【００７９】 例７： 芳香族化合物、複素芳香族化合物及びトリメチルシクロヘキセニル化合物のヒ
ドロキシル化 ａ）例６を繰り返すが、基質としてｎ−オクタンの代わりにナフタレンを使用
した。生成物として１−ナフトール及びシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−
ジヒドロナフタレンが同定された。使用されたナフタレンのうち８８％が変換さ
れた。
【００８０】 ナフタレンによる変換のための分析 ＧＣ： 装置：Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160 on Column Injector；カラ
ム：ＤＢ５ ３０ｍ×０．２ｍｍ；材料：５％のジフェニル−９５％のジメチル
ポリシロキサン；キャリヤーガス：０．５バールのＨ２； 温度プログラム：４０℃ １分間 等温 ／ １０℃／分〜３００℃ Ｒｔ（１−ナフトール）＝１６．６８ ＮＭＲ： １Ｈ−ＮＭＲにおいて、１−ナフトール及びシス−１，２−ジヒドロキシ−１
，２−ジヒドロナフタレンを同定できた。
【００８１】 ｂ）例６を繰り返すが、基質としてｎ−オクタンのかわりに８−メチルキノリ
ンを使用した。主生成物として５−ヒドロキシ−８−メチルキノリンが更なる誘
導体の他に同定された（生成物比５：１）。使用された出発生成物のうち３５％
が変換された。
【００８２】 ｃ）例６を繰り返すが、基質としてｎ−オクタンの代わりにα−イオノンを使
用した。主生成物として、３−ヒドロキシ−α−イオノンが更なる誘導体の他に
同定された（生成物比７６：２４）。使用された出発材料のうち６０％が変換さ
れた。
【００８３】 ｄ）例６を繰り返すが、基質としてｎ−オクタンの代わりにクメン（ｉ−プロ
ピルベンゼン）を使用した。５種のモノヒドロキシ生成物及び１種のジヒドロキ
シ生成物が同定された。使用された出発材料のうち７０％が変換された。
【００８４】 文献
【００８５】
【外１】
【００８６】
【外２】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 １００ １４ ０８５．８ (32)優先日 平成12年３月22日(2000．3．22) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 ウルリヒ シュヴァーネベルク ドイツ連邦共和国 ヴァイプリンゲン ウ ーラントシュトラーセ 15 (72)発明者 ユッタ シュミット ドイツ連邦共和国 シュツツトガルト フ ッガーシュトラーセ 19 (72)発明者 マルクス フィッシャー ドイツ連邦共和国 ルートヴィヒスブルク ウーラントシュトラーセ 14 (72)発明者 ロルフ シュミット ドイツ連邦共和国 シュツツトガルト ジ ルヴァーナーヴェーク ６ (72)発明者 キン−シャン リー 京都市左京区北白川追分町 （番地なし) (72)発明者 ザビーネ ルッツ−ヴァール ドイツ連邦共和国 シュツットガルト ボ ーゲンシュトラーセ 41 (72)発明者 ダニエル アペル ドイツ連邦共和国 ラウフェン アウグス ト−レムレ−ヴェーク ５ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 4B029 AA21 BB02 CC03 4B050 CC01 CC03 DD02 LL05 4B064 AE48 CA02 CA21 CA31 CB12 4B065 AA17Y AA26X AB01 AC14 BA02 BB13 CA18 CA28

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の反応： ａ）置換されていてよいＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核又
    は多核の芳香族化合物の酸化； ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物の酸化； ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケンの酸化； ｄ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケンの酸化 の少なくとも１つが可能なシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ。
  2. 【請求項２】 細菌起源のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに由来す
    る、請求項１記載のモノオキシゲナーゼ。
  3. 【請求項３】 配列番号２によるアミノ酸配列を有し、アミノ酸配列領域１
    ７２〜２２４、３９〜４３、４８〜５２、６７〜７０、３３０〜３３５、３５２
    〜３５６、７３〜８２及び８６〜８８の少なくとも１つに少なくとも１つの機能
    的な突然変異を有するバシラス メガテリウムからのシトクロムＰ４５０モノオ
    キシゲナーゼＢＭ−３に由来する、請求項２記載のモノオキシゲナーゼ。
  4. 【請求項４】 配列領域７３〜８２、８６〜８８及び１７２〜２２４の少な
    くとも１つに少なくとも１つの機能的な突然変異を有する、請求項３記載のモノ
    オキシゲナーゼ。
  5. 【請求項５】 以下の１つ以上のアミノ酸置換： ａ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ； ｂ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ；又は ｃ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ、Ａｌａ７４Ｇｌｙ を有する、請求項４記載のモノオキシゲナーゼ並びにその機能的な等価物。
  6. 【請求項６】 請求項１から５までのいずれか１項記載のモノオキシゲナー
    ゼをコードする核酸配列。
  7. 【請求項７】 調節核酸配列の遺伝子的なコントロール下に、請求項６記載
    の核酸配列を有するコーディング配列を有する発現構築物。
  8. 【請求項８】 請求項７記載の少なくとも１つの発現構築物を有するベクタ
    ー。
  9. 【請求項９】 請求項８記載の少なくとも１つのベクターで形質転換された
    組み換え微生物。
  10. 【請求項１０】 属エシェリキアの細菌から選択される、請求項９記載の微
    生物。
  11. 【請求項１１】 請求項１記載の定義による化合物の微生物学的酸化のため
    の方法において、 ａ１）請求項９又は１０に記載の組み換え微生物を培養培地中で外生の基質又は
    中間形成した基質の存在下に培養するか、又は ａ２）基質を含有する反応培地を請求項１から５までのいずれか１項記載の酵素
    と一緒にインキュベートし、かつ ｂ）形成した酸化生成物又はその副生成物を培地から単離する ことを特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】 外生の基質又は中間形成した基質が、 ａ）置換されていてよいＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核又
    は多核の芳香族化合物； ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物； ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケン； ｄ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケン から選択されている、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 基質が中間形成したインドールであり、中間形成したイン
    ドールの酸化によって生産され生じるインジゴ及び／又はインジルビンを培地か
    ら単離する、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 インドール酸化を酸素の存在下での微生物の培養によって
    約２０〜４０℃の培養温度及び約６〜９のｐＨ値において実施する、請求項１３
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 外生の基質として、前記で定義された化合物の群ａ）ない
    しｄ）から選択される少なくとも１つの化合物を培地に添加し、基質含有培地を
    約２０〜４０℃の温度及び約６〜９のｐＨ値において酸素の存在下に酵素反応に
    よって酸化を実施し、その際、基質含有培地が基質に対して更に約１０ないし１
    ００倍のモル過剰の還元当量を有する、請求項１１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 外生の基質として、インドール、ｎ−ヘキサン、ｎ−オク
    タン、ｎ−デカン、ｎ−ドデカン、クメン、１−メチルインドール、５−Ｃｌ−
    インドール又は５−Ｂｒ−インドール、インデン、ベンゾチオフェン、α−イオ
    ノン、β−イオノン及びγ−イオノン、アクリジン、ナフタレン、６−メチルキ
    ノリン又は８−メチルキノリン、キノリン及びキナルジンから選択される化合物
    を使用する、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１から５までのいずれか１項記載の酵素又は請求項
    ９又は１０記載の組み換え微生物を固定化された形で含むバイオリアクター。
  18. 【請求項１８】 請求項１から５までのいずれか１項記載のシトクロムＰ４
    ５０モノオキシゲナーゼ、請求項８記載のベクター又は請求項９又は１０記載の
    微生物の、 ａ）置換されていてよいＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核又
    は多核の芳香族化合物； ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物； ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケン；及び／又は ｄ）置換されいてよいシクロアルカン及びシクロアルケン の微生物学的な酸化のための使用。
  19. 【請求項１９】 インジゴ及び／又はインジルビンの製造のための、請求項
    １８記載の使用。
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