DE19935115A1 - Elektronendonorsystem für Enzyme - Google Patents
Elektronendonorsystem für EnzymeInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein neuartiges Elektronendonorsystem für Enzyme mit Redoxeigenschaften und dessen Verwendung in enzymkatalysierten Oxidationsreaktionen, wie insbesondere der Herstellung -hydroxylierter Fettsäuren. Die Erfindung betrifft außerdem ein verbessertes Nachweisverfahren für Fettsäuremonoxygenasen, Bioreaktoren sowie Testkits, worin das Elektronendonorsystem vorteilhaft einsetzbar ist.
Description
Die Erfindung betrifft ein neuartiges Elektronendonorsystem für
Enzyme mit Redoxeigenschaften, und dessen Verwendung in enzym
katalysierten Oxidationsreaktionen, wie insbesondere der Her
stellung ω-hydroxylierter Fettsäuren. Die Erfindung betrifft
außerdem ein verbessertes Nachweisverfahren für Fettsäuremo
noxygenasen, Bioreaktoren sowie Testkits, worin das Elektronen
donorsystem vorteilhaft einsetzbar ist.
Die biotechnologische Nutzung von Enzymen mit Redoxeigenschaf
ten, wie z. B. von Monoxygenasen, in zellfreien Reaktionssyste
men ist grundsätzlich mit dem Problem behaftet, daß die Ver
wendung natürlicher Cofaktoren zur Bereitstellung der erforder
lichen Redox-Äquivalente (wie z. B. von NADH oder NADPH) mit
unvertretbar hohen Kosten verbunden ist.
Dies gilt auch für die biotechnologische Nutzung von Cytochrom
P450 haltige Monoxygenasen. Funktionell ist allen P450-Enzymen
gemeinsam, Sauerstoff-Atome auf nicht aktivierte aliphatische
oder aromatische X-H (x = -C, -N, -S) Bindungen zu übertragen.
Darüber hinaus vermögen P450-Enzyme -C=C- Doppelbindung zu
epoxidieren. Für diese Oxygenierungsreaktionen benötigen die
meisten P450-Systeme Cofaktoren, wie NADPH oder NADH, als
Elektronenquelle. Entsprechend der Realisierung dieses e-Trans
fersystems (Reduktasesystems) unterteilt man P450-Systeme in
vier Klassen. Klasse I P450-Enzyme enthalten als Reduktase
eine FAD-Domäne und ein weiteres Fe-S-Protein (zumeist mito
chondriale und bakterielle P450-Enzyme), Klasse II P450-Enzyme
besitzen eine FAD/FMN-Reduktase (meist ER-P450-Enzyme) und
Klasse III P450-Enzyme benötigen keine weiteren Reduktions
äquivalente, sie setzen peroxygenierte Substrate um, die den
Sauerstoff bereits enthalten. Das einzige P450-Enzym der Klasse
IV erhält seine Elektronen direkt ohne Transfersystem von NADH.
Die funktionelle Vielfalt der durch P450-Systeme katalysierten
Monooxygenierungen auf chemischem Wege häufig nur schwer zu
gänglicher Verbindungen bieten ein enormes biotechnologisches,
pharmakologisches und toxikologisches Potential. Eine wichtige
Voraussetzung zur in vitro Nutzung dieser Potentiale ist die
Entwicklung geeigneter Expressions-, Reinigungs- und vor allem
Aktivitätsnachweissysteme, die erlauben, P450-Systeme zu cha
rakterisieren und Enzymvarianten mit "verbesserten" Eigenschaf
ten aufzufinden.
Weitere wichtige Voraussetzung für die Nutzung dieser p450
Monoxygenasen, insbesondere der Klassen I und II, wäre die
Verfügbarkeit eines kostengünstigen Elektronendonorsystems.
Ein NADPH-Cofaktor-Recycling-System wurde von Deffner et al.,
Ann. N. Y. Acad. Sci. (1987) 501, 171 vorgestellt. Dieses stellt
aber bei Anwendung im präparativen Maßstab ein Kostenproblem
dar und gestaltet Reaktionsführungen in Enzym-Membran-Reaktoren
komplizierter. Deshalb wurde nach alternativen
Elektronendonoren gesucht. Ein vielversprechenden Weg stellt
die elektrochemische Reduktion von P450-Enzymen dar. Estabrook
et al. (Methods Enzymol. (1996) 272, 44) konnten mittels eines
Co(III)sepulchrat-Mediatorsystems und Pt-Elektroden für sechs
verschiedene P450-Enzyme Umsätze bestimmen. Die Aktivitäten
waren jedoch etwa 8-fach geringer als beim Reduktionsäquivalent
NADPH. Statt des Mediators wurde in Natriumdithionit (Fang et
al., Drug. Metab. Dispos. (1996) 24 (11): 1282) eine Verbindung
gefunden, die P450-Enzyme direkt reduziert. Im Falle von P450
BM-3 war die Aktivität mit Natriumdithionit gegenüber NADPH um
Faktor 8150 reduziert; vermutlich wird P450 BM-3 durch
Natriumdithionit dreifach reduziert und damit großteils
inaktiviert.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein kostengünstiges,
effizientes, alternatives Elektronendonorsystem für Enzyme mit
Redoxeigenschaften bereitzustellen. Insbesondere sollte dieses
System in biochemischen Umsetzungen verwendbar sein, an welchen
Cytochrom P450-haltige Enzyme beteiligt sind. Außerdem sollte
ein verbessertes Nachweisverfahren für p450-Enzyme
bereitgestellt werden. Eine weitere Aufgabe der Erfindung
bestand in der Bereitstellung eines verbesserten
biotechnologischen Verfahrens zur enzymatischen Übertragung von
Sauerstoff auf organische Moleküle und insbesondere zur
terminalen oder subterminalen Hydroxylierung von Fettsäuren.
Diese Aufgaben wurde überraschenderweise gelöst durch
Bereitstellung eines Elektronendonorsystems für die Übertragung
von Elektronen auf Enzyme mit Redox-Eigenschaften, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß das System eine anorganische, nicht
elektrodengebundene Elektronenquelle und einen Mediator umfaßt,
der zur Übertragung von Elektronen von der Elektronenquelle auf
das Enzym befähigt ist. Dabei können die Komponenten des
Systems einzeln oder im Gemisch, in geträgerter oder
vorzugsweise ungeträgerter Form vorliegen.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte Elektronendonorsystem ist
insbesondere für Cytochrom P450-haltige Enzyme, wie z. B. die in
der großen Familie der Monoxygenasen (E. C. 1.14.-.-)
zusammengefassten Enzyme, anwendbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Elektronendonorsystems
umfaßt dieses einen Mediator mit einem Standard-Normalpotential
im Bereich von weniger als etwa -0,4 V. Nichtlimitierende
Beispiele für Mediatoren sind Kobalt(III)sepulchrat,
Methylviologen, Neutralrot, Riboflavin, Rutheniumtriacetat, FMN
und FAD, wobei Kobalt(III)sepulchrat bevorzugt ist.
Das erfindungsgemäße Elektronendonorsystem umfaßt vorzugsweise
als Elektronenquelle ein Metall mit einem niedrigeren Standard-
Normalpotential als der Mediator. Als nichtlimitierendes
Beispiel für die Elektronenquelle ist metallisches Zink zu
nennen. Das Metall liegt dabei vorzugsweise in einer reaktiven
Form, d. h. mit großer Oberfläche, wie z. B. pulverförmig, vor.
Bevorzugte erfindungsgemäße Elektronendonorsysteme unfassen,
folgende Kombinationen von Elektronenquelle und Mediator:
- - Zn/Kobalt(III)sepulchrat oder
- - Zn/Neutralrot.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren
zur enzymatischen Oxidation von, d. h. Übertragung von
Sauerstoff auf, ein Kohlenwasserstoff-haltiges
Wasserstoffdonor-Molekül, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man das Wasserstoff-Donormolekül in einem Reaktionsmedium,
umfassend das Sauerstoff-übertragenden Enzym und ein
Elektronendonorsystem gemäß obiger Definition, in Gegenwart von
Sauerstoff unter Reaktionsbedingungen inkubiert.
Eine "Oxidation" im Sinne der vorliegenden Erfindung betrifft
enzymkatalysierte Oxidationsreaktionen im weitesten Sinne.
Insbesondere umfaßt der Begriff Oxidationsreaktionen welche
Enzymen aus der Klasse der von Monoxygenasen (E. C.1.14.-.-) und
vor allem von Cytochrom P450-Enzymen katalysiert werden. Diese
Oxidationsreaktionen umfassen:
- a) Kohlenstoff-Oxidationen an gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen oder aromatischen Kohlenstoffatomen
- b) Schwefel-Oxidationen;
- c) Stickstoff-Oxidationen;
- d) oxidative Dealkylierungen; und
- e) oxidative Dehalogenierungen.
Dabei ist das Wasserstoff-Donormolekül vorzugsweise ausgewählt
unter Verbindungen der Formel
R-X
worin
R für einen geradkettigen oder verzweigten, vorzugsweise geradkettigen, Alkylrest mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen, wie z. B. 10 bis 30 Kohlenstoffatomen, steht, und
X für eine polare, zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken befähigte Gruppe, vorzugsweise eine Carboxy-, Amid-, Nitril, Sulfat-, Sulfon-, Amin- oder Hydroxygruppe, steht.
R für einen geradkettigen oder verzweigten, vorzugsweise geradkettigen, Alkylrest mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen, wie z. B. 10 bis 30 Kohlenstoffatomen, steht, und
X für eine polare, zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken befähigte Gruppe, vorzugsweise eine Carboxy-, Amid-, Nitril, Sulfat-, Sulfon-, Amin- oder Hydroxygruppe, steht.
Eine bevorzugte Variante obigen Verfahrens betrifft die
enzymatische Herstellung terminal oder subterminal (d. h. in
Position ω-1 bis ω-4) hydroxylierter Fettsäuren, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man
- a) eine hydroxylierbare Fettsäure oder Fettsäurederivat in Gegenwart eines Elektronendonorsystems gemäß obiger Definition mit einer Cytochrom P-450 Monoxygenase und Sauerstoff umsetzt; und
- b) das (die) hydroxylierte(n) Produkte) isoliert.
Das ω-hydroxylierbare Fettsäurederivat ist erfindungsgemäß
bevorzugt ausgewählt unter terminal gesättigten, verzweigten oder
unverzweigten Fettsäuren mit mehr als 10 Kohlenstoffatomen,
insbesondere C12-C30-Fettsäuren.
In den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet
man bevorzugte als Enzym eine Cytochrom P-450 Monoxygenase, die
ausgewählt ist unter:
- - dem aus Bacillus megaterium (DSM 32T) isolierbaren Wildtypenzym; oder
- - einer durch Aminosäuresubstitution in wenigstens einer der Position 26, 47, 72, 74, 87, 188 und 354 erhältlichen Mutanten des Wildtypenzyms.
Bevorzugt eingesetzte Mutanten umfassen eine Mutation in Position
87 und sind ausgewählt unter den Mutation F87A oder F87V die
gegebenenfalls wenigstens eine weitere der folgenden Mutationen
aufweist: L188K, A74G, R47F und V26T. Besonders bevorzugt ist die
Einfachmutante F87A und die Fünffachmutante F87A, L188K, A74G,
R47F, V26T (Angabe der Aminosäuren im Einbuchstaben-Code;
ursprüngliche Aminosäure links von der Positionsangabe; neue
Aminosäure rechts von der Positionsangabe).
Vorzugsweise werden obige Verfahren unter Verwendung des
Elektronendonorsystem Zink/Co(III)sepulchrat durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens führte man
die Umsetzung in Gegenwart von Chloridionen durchführt.
Außerdem kann die Gegenwart eines Wasserstoffperoxyd-spaltenden
Enzyms vorteilhaft sein.
Eine weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen Bioreaktor
zur Verwendung bei der enzymatischen Übertragung von Sauerstoff
auf ein Kohlenwasserstoff-haltiges Wasserstoffdonor-Molekül, und
insbesondere zur Verwendung bei der Herstellung ω-hydroxylierter
Fettsäuren, der gekennzeichnet ist durch eine irrmobilisierte
Monoxygenase und ein Elektronendonorsystem gemäß obiger
Definition im flüssigen Reaktionsmedium.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein
Nachweisverfahren für Fettsäure-Monoxygenasen, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man
- a) einen Analyten, in dem man Enzymaktivität vermutet, mit einer ω-hydroxylierbaren Fettsäure oder Fettsäurederivat, welche(s) einen terminalen, abspaltbaren Fluorophors oder Chromophor trägt, in Gegenwart eines Elektronendonorsystems gemäß obiger Definition inkubiert; und
- b) die Abspaltung des Fluorophors oder Chromophors qualitativ oder quantitativ bestimmt.
Die Umsetzung führt man dabei bevorzugt in Gegenwart eines
Wasserstoffperoxyd-spaltenden Enzyms und gegebenenfalls in
Gegenwart von Chloridionen durch.
Beispiele für geeignete Fluorophore und Chromophore sind Phenole,
Catechole, Hydroxycoumarine, wie Umbelliferon, Phenoxazine und
insbesondere Resofurin.
Die Einstellung der optimalen Verfahrensparameter ist unter
Berücksichtigung der Anweisungen im folgenden experimentellen
Teil ohne weiteres möglich. So erzielt man z. B., ohne darauf
beschränkt zu sein, eine Cobalt(III)sepulchrat-Konzentration von
mehr als 0,1 mM, wie z. B. 0,5 bis 1,0 mM besonders vorteilhaft;
ebenso wie ein pH-Wert etwa 8 bis 8,5; eine Zink-Konzentration
von mehr als etwa 2 mg/ml wie z. B. etwa 5 bis 50 mg/ml.
Schließlich betrifft die Erfindung als weiteren Gegenstand einen
Testkit, umfassend ein Elektronendonorsystem nach obiger
Definition.
Die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden
Erfindung wird in den folgenden Anschnitten weiter erläutert.
In Organismen dienen Cytochrom P450-Enzyme unter anderem der
Ergosterol-Synthese, der Biosynthese von Insekten- und
Phytohormonen, der Ausbildung von Fruchtreife, Geruch und Farbe
bei Pflanzen, der Biosynthese von Gluko- und Mineralkortikoiden,
der Aromatisierung von Androgenen zu Östrogenen, dem Metabolismus
von Retinoiden zur Regulation von normalem und epithelialem
Wachstum/Differenzierung, Arachidonsäurestoffwechsel zur Bildung
von Prostaglandinen, Leukotrienen und Thromboxanen und der
Bildung vasoaktiver Produkte. Darüber hinaus dienen sie zur
Aktivierung und Detoxifizierung xenobiotischer Stoffe.
P450-Enzyme gehören zu den sogenannten Phase I Enzymen, die
mittels Oxygenierungen wasserunlösliche oder schwer lösliche
Verbindungen zur weiteren Metabolisierung vorbereiten. Dazu
dienen Phase II Enzyme wie Glutathion-Transferasen, N-
Acetyltransferase oder Sulfotransferase, die eine polare Gruppe
an jene hydroxylierten oder epoxidierten Verbindungen addieren.
Dadurch werden diese Metabolite wasserlöslich und somit
bioverfügbar. Die Vielfalt von Reaktionen, die durch Cytochrom
P450-Enzyme katalysiert werden, sind im folgenden zusammengefaßt
und hinsichtlich ihrer wirtschaftlichen und funktionellen
Bedeutung diskutiert. Eine Übersicht, aufgeschlüsselt anhand
ausgewählter Familien findet sich in Tabelle 1.
Die P450-Enzyme der Enzymfamilien CYP1-3 sind hauptverantwortlich
für die Metabolisierung xenobiotischer Stoffe; die dabei
auftretenden oxidativen Reaktionen sind im folgenden unterteilt
in C-, S-, N-Oxidation, Dealkylierung- und Dehalogenierung.
P450-Enzyme hydroxylieren oder epoxidieren nichtaktivierte C-H-
Bindungen und/oder C=C-Doppelbindungen in aliphatischen und
aromatischen Systemen. Die gebildeten Metabolite sind häufig
toxisch, wie das Nervengift 2,5-Hexandion oder karzinogen wie
DNA-alkylierende Epoxide (z. B. Styroloxid). Ferner wirken durch
P450-Enzyme C-oxidierte Nitrosamine und Benzpyrene karzinogen.
Arzneimittel, wie Barbiturate und Phenobarbitale, werden
ebenfalls durch P450-Enzyme in ihre Wirkform überführt. Die
Hydroxylierung nicht aktivierter -C-H Bindungen ist wegen der
seltenen Konkurrenz durch chemische Verfahren eine der
nützlichsten Biotransformationsreaktionen. Im Gegensatz zu
Radikalreaktionen zeigen Bio-Hydroxylierungsreaktionen an C-
Atomen folgende Aktivitätsreihe: sekundär< tertiär< primär.
Bekannte industriell durchgeführte Verfahren sind die
Progesteron-Hydroxylierung an 11α-Position mittels Aspergillus
niger, die etwa die Hälfte der 37 konventionellen Schritte
erübrigte, und die 7β-Hydroxylierung von 3α-Hydroxy-5β-cholsäure
durch Fusarium equiseti. Das Produkt Ursodesoxycholsäure vermag
Cholesterin aufzulösen und wird in der Behandlung von
Gallensteinen eingesetzt. In der asymmetrischen Synthese werden
Biotransformationen unter anderem zur Synthese von β-
Hydroxybuttersäure, einem Ausgangsmaterial für Vitaminsynthesen
(α-Tocopherol), von Geschmacksstoffen, von Antibiotika
(Calcimycin) und von chiralen verzweigten epoxidierten Alkenen
verwendet.
P450-Enzyme hydroxylieren Aryl- und Acetylamine wie Benzidin, 4-
Biphenylamin und 2-Acetaminofluoren und vergleichbare
Heterozyklen, die beim Anbrennen von Nahrungsmitteln entstehen,
am N-Atom. Nach weiterer Acetylierung oder Sulfonierung der
Hydroxygruppen entstehen elektrophile, stark karzinogen wirkende
Substanzen.
Aryl- und Alkylthioether werden durch P450-Monooxygenasen direkt
am S-Atom zu Sulfoxiden oxidiert. Die Oxidation bleibt jedoch
häufig nicht auf der Stufe des Sulfoxids stehen; viele Sulfoxide
werden zu den entsprechenden Sulfonverbindungen weiteroxidiert,
die häufig zelltoxisch wirken. Mikrobielle Oxidationen von
chiralen Dithioacetalen gelingen mit hohem Enatiomerenüberschuß
mit Corynebacterium equi und Helminthosporium sp.
P450-Enzyme katalysieren auch die oxidative O-, N- und S-
Dealkylierung. Beispiele dieser wichtigen Reaktionen sind die O-
Dealkylierung von Codein, Mescalin, Phenacetin, die N-
Dealkylierung von Ephedrin, Methamphetamin, Aminopurin und die S-
Dealkylierung von 6-Methylthiopurin zu 6-Methylpurin.
P450-Enzyme katalysieren auch die oxidative Deaminierung von
Aminen. Diese Reaktion hat primär eine Entgiftungsfunktion für
den Organismus. Histamin, Noradrenalin und Mescalin können unter
anderem auf diese Weise deaminiert werden.
Viele halogenierte Alkane und Alkene bilden nach Hydroxylierung
an einer -C-H Bindung ein instabiles Intermediat, das in ein
Aldehyd oder Keton und H-Hal dissoziert. Beispiele sind die
Oxidation von Ethendibromid zu 2-Bromacetaldehyd und die
Oxidation von Chloroform zu Phosgen. Mono- und dihalogeniertes
Methan bildet im Vergleich zu dreifach halogeniertem Chloroform
nur schwach zelltoxische Metabolite.
Eine mechanistische Beschreibung der vorgestellten P450-
Reaktionstypen findet sich in dem Übersichtsartikel von Koymans
et al., in Xenobiotica, (1993) 23 (6): 633.
Im Gegensatz zur mikrobiellen Biotransformation beschränkt sich
die Verwendung rekombinant exprimierter P450-Monoxygenasen zur
Feinchemikaliensynthese trotz enormer Potentiale auf wenige in
vivo Verfahren wie die Herstellung von Dicarbonsäure als
Zwischenstufen für Geruchsstoffe, Steroiden wie Progesteron und
subterminal hydroxylierter gesättigter und ungesättigter
Fettsäuren als Vorstufen für Riechstoffe (Laktone), Polymere und
Darreichungsformen für Medikamente.
Die Verwendung von P450 Monooxygenaseenzymen in vitro zur
Feinchemikaliensynthese ist bisher noch nicht literaturbekannt.
Um P450-Monoxygenasen zur Feinchemikaliensynthese zu verwenden,
müssen Expressionssysteme vorhanden sein, die es erlauben,
funktionell aktives P450 über Artgrenzen hinweg in hohen
Ausbeuten zu exprimieren. Ferner muß das Enzym eine ausreichend
hohe Aktivität und Stabilität (Temperaturstabilität,
Lösungsmittelstabilität, Oxidationsstabilität) besitzen. Die
produzierten Metabolite sollten für das Protein und den Wirt
nicht toxisch sein. Für Klasse I und Klasse II sollte ferner ein
geeignetes Cofaktor-Recyclingsystem vorhanden sein. Die
vorliegende Erfindung schafft hierzu die Voraussetzungen.
P450 BM-3 (CYP102) wurde erstmals im Jahre 1986 als dritte P450-
Monooxygenase aus Bacillus megaterium in E. coli funktionell
aktiv exprimiert und charakterisiert. Mit einem Molekulargewicht
von 118 kDa war P450 BM-3 das erste bekannte wasserlösliche
natürliche Fusionsprotein, das alle drei Domänen (FAD, FMN, P450)
in einer einzigen Polypetidkette enthält. Im Jahre 1993 gelang
es, die P450-Domäne ohne Substrate (Ravichandran et al., Science
(1993) 261, 731) und im Jahre 1997 mit Substrat (Li et al. Nature
Structural Biology (1997), 4(2): 140) zu kristallisieren, P450
BM-3 dient aufgrund seiner Sequenzhomologie zu eukaryontischen
P450 und mangels eukaryontischer P450-Kristallstrukturen als
bevorzugtes Strukturmodell für diese P450-Enzyme.
P450 BM-3 ist eine Fettsäurehydroxylase, die Carbonsäuren,
Alkohole, Amide, Alkylammoniumverbindungen ab Kettenlänge C12 bis
zu C22 subterminal hydroxyliert. Die Regiospezifität der
Hydroxylierung hängt, wie in Tabelle 2 gezeigt, stark von der
Kettenlänge der Fettsäure ab.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die beiliegenden
Figuren und die folgenden Ausführungsbeispiele, welche die
Anwendung des erfindungsgemäßen Donorsystems auf die
Hydroxylierung von Fettsäuren mit Hilfe von P450 Enzymen
betreffen, näher erläutert. Dabei zeigt
Fig. 1 das P450 BM3-Klonierungsschema am Beispiel von
pCYTEXP1;
Fig. 2 das Prinzip des erfindungsgemäßen spektroskopischen
P450-Nachweises;
Fig. 3 das Absorptionsspektrum für die Reduktion von
Cobalt(III)sepulchrat mit Zn-Pulver in Tris/HCl, 0,2 M,
pH 8,2; gepunktete Linie Co(III)sepulchrat oxidiert;
durchgezogenen Linie Zn/Co(III)sepulchrat reduziert;
Fig. 4 die Absorptionsänderung bei Umsatz von 12-pNCA durch
P450 BM-3 F87A mit Zn/Co(III)sepulchrat in Tris/HCl, 50
mM, pH 8,2, 0,25 M KCl;
Fig. 5 eine Skizze des Elektronentransferwegs von
Zn/Co(III)sepulchrat auf P450 mit "shunt"-Reaktionsweg
und pNCA als Substrat;
Fig. 6 den Umsatz von 12-PCA durch P450 BM-3 F87A und
Zn/Co(III)sepulchrat in Tris/HCl, 50 mM, pH 8,2, 0,25 M
KCl mit und ohne Zugabe von Katalase;
Fig. 7 den Einfluß der Tris/HCl- und Kaliumphosphat-
Puffermischung auf die Reduktion von p-Nitrophenolat in
Gegenwart von P450 BM-3 F87A und Zn/Co(III)sepulchrat;
Fig. 8 (A) 12-pNCA Umsatz durch P450 BM-3 F87A als Funktion
der Co(III)sepulchrat-Konzentration; (B) den Einfluß
von Co(III)sepulchrat auf die Aktivität von P450 BM-3
F87A in Gegenwart von Substrat;
Fig. 9 den 12-pNCA Umsatz als Funktion der eingesetzten
Zinkpulvermenge in Gegenwart von 0,5 mM
Co(III)sepulchrat;
Fig. 10 die P450 BM-3 F87A Restaktivität nach 5 min Inkubation
bei verschiedenen Wasserstoffperoxidkonzentrationen
ohne Substrat.
Das Bakterium Bacillus megaterium wurde bei DSMZ-Stammsammlung
(32T, Braunschweig, Deutschland), die E. coli-Stämme DH5α, JM105
und JM109 bei Clontech (Heidelberg, Deutschland) und XL1-Blue
bei Stratagene (Heidelberg, Deutschland) erworben. Den Stamm
W3110 erhielten wir vom Institut für Bioverfahrenstechnik
(Stuttgart, Deutschland). Der E. coli-Stamm DH5α (supE44,
lacU169 [80lacZ M15] hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1)
wurde, sofern nicht anders erwähnt, für die folgenden
beschriebenen Klonierungsarbeiten verwendet. Als Plasmide
fanden pCYTEXP1 mit dem temperaturindizierbaren PRPL-
Promotorsystem des Bakteriophagen λ (Belev T.N., et al.,
Plasmid (1991) 26: 147) und pASK-IBAICA mit Tetrazyklin-Promotor
(Schmidt, T. G. M., et al., J. Chromatogr. A (1994) 676: 337;
Schmidt, T. G. M. et al., J. Mol. Biol. (1996) 255: 753)
Verwendung. Die im Rahmen dieser Arbeit zur heterologen
Expression von P450 BM-3 verwendeten Stämme und Plasmide sind
in Tabelle 3 zusammengefasst, wobei pT die Herkunft der P450
BM-3 Konstrukte vom pCYTEXP1-Plasmid und pA die Herkunft vom
pASK-1BA1CA-Plasmid kennzeichnet.
Sofern nichts anderes erwähnt ist, wurden alle Chemikalien von
Fluka Chemie (Buchs, Schweiz) und alle Enzyme von New England
Biolabs (Beverly, USA) oder Boehringer Mannheim (Penzberg,
Deutschland) bezogen.
Alle Komplexmedien stammen von Difco (Augsburg, Deutschland).
Peptone | 5,0 g |
Bacto beef | 3,0 g |
Bacto peptone | 5,0 g |
Agar | 15 g (nur für Plattenkultur) |
MnSO4.H2O | 10 mg |
H2O | ad 1000 ml |
AL=L<Glycerinkultur | |
Glycerin (86%) | 500 µl |
Kultur(OD578: = 1,0) | 500 µl |
Tryptone | 10,0 g |
NaCl | 5,0 g |
Yeast extract | 5,0 g |
Agar | 20,0 g (nur für Plattenkultur) |
Ampicillin | 100 g/ml |
H2O | ad 1000 ml |
Die Kultivierung von Bacillus megaterium erfolgte im
Nutrient-Medium bei 30°C, die rekombinanten E. coli-Stämme
(DH5α, JM105, JM109, XL1-Blue, W3110) wurden in LB-Amp
Medium bei 37°C kultiviert. Dazu wurde jeweils eine
Kolonie mittels Impföse von einer Agarplatte in 5 ml LB-
Amp überführt. Nach ca. 18 h Stunden Kultivierung bei 30°C
(Bacillus megaterium) und 37°C (E. coli) bei einer
Schüttelfrequenz von 220 Upm wurden 400 ml Medium in einem
2-l-Kolben mit 4 ml Kultur inokuliert. Die Induktion der
P450-Expression in E. coli erfolgte nach Erreichen eines
OD578-Wertes zwischen 0,8 und 1,0 durch eine drei- bis
vierstündige Hitzeschockinduktion bei 42°C im Falles der
pT-Plasmid-Konstrukte oder durch Zugabe von
Anhydrotetracyclin (Endkonzentration 0,4 mg/l) beim pA-
USC4BM3-Plasmid und einer 14-stündigen Inkubation bei
30°C.
Zur präparativen P450 BM-3 Produktion wurde die
Expressionskassette pT-USC1BM3, der Wirt DH5α und ein
Bioengineering Fermenter Typ LP351 bei einer Belüftung von
3,5 l/min. einer Rührgeschwindigkeit von 300 Upm bei 37°C
in LB-Amp-Medium bei einem Start-pH-Wert von 7,5
eingesetzt. Um Schaumbildung zu vermeiden und Ausbeuten zu
steigern wurden 2,0 ml steriles Contraspum 210 (Z. Schimmer
& Schwarz, Lahnstein, Deutschland) und 0,1 mg/l FeCl3 vor
Inokulation dem LB-Amp-Medium zugegeben (Nishihara et al.
1997). Inokuliert wurde durch Zugabe zweier 400 ml
Schüttelkolben-Kulturen (OD578: = 0,8-1,0; Abschnitt a)).
Nach Erreichen eines OD578-Wertes von 1,0 im Fermenter
erfolgte die P450-Produktion mittels Hitzeschockinduktion
durch Erhöhen der Temperatur für drei bis fünf Stunden von
37°C auf 42°C. P450 BM-3 oder die Mutante F87A wurden in
E. coli DH5α in Ausbeuten von 36 bis 48 mg/l
Fermenterbrühe exprimiert. Die Aufkonzentrierung der E.
coli Kultur von 30 Liter auf 2 Liter wurde durch
Querstromfiltration mit einer Millipore Applikation
(Eschborn, Deutschland) mit einer Filtron (Dreielch,
Deutschland) Centrasette OMEGA (0.3 µm) Membran
durchgeführt. Nach Zentrifugation bei 9200 g für 20 min
wurden die Zellen in Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,5)
oder Tris/HCl-Puffer (50 mM, pH 7,5) resuspendiert, in
zwölf 50 ml Falcon-Tubes (Greiner) aliquotiert und bis
zur weiteren Verwendung bei -20°C eingefroren.
Alle Primer wurden von ARK Scientific GmbH Biosystems
(Düsseldorf, Deutschland) hergestellt. Nur die Primer für die
Punktmutation und für die Isolierung des P450 BM-3 Gens aus der
genomischen Bacillus megaterium DNA waren HPLC gereinigt.
Zur Isolation der genomischen DNA aus Bacillus megaterium
mittels Phenol-Chloroformextraktion wurde das Zellpellet aus
200 ml Kulturüberstand (OD578: = 1,2) in 20 ml Lysozymmix (18 mg
Lysozym, 50 mM EDTA, 50 mM NaCl, 30 mM Tris/HCl, pH 8,0)
resuspendiert und bei 37°C und 30 Minuten lang bei 220 UpM
geschüttelt. Nach Zugabe von 2 ml SDS (10% (m/v)) wurde
weitere 60 Minuten bei 37°C und 220 UpM inkubiert. Zur
Entfernung von Zelltrümmern wurde dreimal mit einer Mischung
aus Chloroform/Isoamylalkohol (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
und einmal mit Phenol extrahiert. Die genomische DNA wird durch
Zugabe von 10% (v/v) 3 M NaAc, pH 4,8 und 60% (v/v)
Isopropanol gefällt, mittels Glasstab aufgerollt, in ein Corex-
Röhrchen überführt und bei 32 570 g zentrifugiert. Nach
dreimaligem Waschen mit 70% Ethanol wird die DNA am
"Hausvakuum" getrocknet und in 3 ml TE-Puffer (10 mM Tris/HCl,
1 mM EDTA, pH 7,5) gelöst. Die Reinheit der DNA wurde
spektroskopisch durch Quotientenbildung von 260 nm zu 280 nm zu
2,2 bestimmt.
Die Isolation der Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte mit dem auf
alkalischer Lyse der Zellen basierenden QIAprep-Spin-Miniprep-
Kit exakt nach den Angaben des Herstellers (Qiagen).
8 µl dNTP-Mix (200 µM), 10 µl Tag-Polymerase-Puffer (10 ×) ohne
MgCl2, 8 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl Primer B1 (0,1 µM), 1 µl Primer
B2 (0,1 µM), 1 µl genomische Bacillus megaterium-DNA, 2,5 U Taq-
Polymerase (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen), ad 100 µl
demineralisiertes Wasser.
Um die Proteinreinigung zu vereinfachen und eine gerichtete
Immobilisierung von P450 BM-3 zu ermöglichen wurde ein jeweils
sechs Aminosäuren langer C-terminaler-Tag an das P450
BM-3 Gen angefügt. Als Templat fungierte genomische Bacillus
megaterium-DNA. Als überhängende Restriktionsenden wurden für
die His-, Arg- und Glu-Tags BamHI und EcoRI gewählt, um
anschließend die modifizierten P450-BM-3-Gene in das Plasmid
pCYTEXP1 zu klonieren. Für den Strep-Tag wurden für das 5'- und
3'-Ende BsaI gewählt; dies ermöglicht eine Klonierung in das
Plasmid pASK-IBAICA. BsaI schneidet erst nach der
Erkennungssequenz, wodurch die überhängenden Restriktionsenden
eine unterschiedliche Sequenz aufweisen und somit eine
gerichtete Ligation erlauben.
Für die PCR-Reaktionen wurden das Standard-PCR Programm und der
Standard-Ansatz verwendet. Im Unterschied zum Standard-Ansatz
wurden für den His6-Tag die Primer H1 und H2, für den Arg6-Tag
die Primer A1 und A2, für den Glu6-Tag die Primer G1 und G2
sowie für den Strep-Tag die Primer S1 und S2 verwendet.
Restriktionsendonukleasen schneiden DNA sequenzspezifisch. Die
Restriktionsspaltung von DNA erfolgte in einem Reaktionsvolumen
von 10 µl in Gegenwart von 2-3 µl nach DNA (Spin-Präp
(Qiagen)), 1-2 U Restriktionsenzym, 1 µl Restriktionspuffer
(10×) und ad 10 µl ddH2O durch ein- bis zweistündige Inkubation
der Reaktionslösung bei 37°C (außer BsaI) entsprechend der
Herstellervorschrift. Die Reinigung der DNA-Fragmente wurde
mittels Agarose-Gelelektrophorese nach der Vorschrift von
(Sambrook et al. 1989) durchgeführt. Abhängig von der Größe der
aufzutrennenden DNA-Fragmente wurden 0,8-2%ige Agarosegele
verwendet. Als Elektrophorese-Puffer diente TAE-Puffer (40 mM
Tris/HCl, 20 mM Essigsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3). Angelegt wurde
aufgrund der Wärmeentwicklung bei bis zu einprozentigen
Agarose-Gelen eine Spannung von 120 V und bei bis zu
zweiprozentigen Agarose-Gelen von 100 V. Interkalierendes
Ethidiumbromid (Endkonzentration 0,25 µM) wurde zur
Visualisierung der DNA im UV-Durchlicht eines Transilluminators
(312 nm) verwendet.
Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen wurde unter
Verwendung des QIAquick Gel Extraktion Kits (Qiagen)
durchgeführt. Dabei wird die DNA durch Binden an eine Silika-
Gel enthaltene Säule immobilisiert und mittels verschiedener
Waschschritte von Verunreinigungen befreit. Durch anschließende
Elution mit demineralisiertem Wasser können mit dieser Methode
bis zu 8 µg DNA (100 bp-10 kb) erhalten werden.
Zur Ligation von DNA wurde die T4-DNA-Ligase (New England
Biolabs, Beverly, USA) verwendet, die die Bildung von
Phosphodiesterbindungen zwischen 5'-Phosphat- und
3'-Hydroxy-Enden der DNA katalysiert und somit zwei lineare
DNA-Moleküle verbindet oder die Zyklisierung eines linearen
Moleküls ermöglicht.
Zur Ligation wurden Agarose-Gel gereinigte Vektor- und
Insertfragmente (vergleiche Punkt 3) im molaren Verhältnis 1
zu 3 bis 1 zu 5 zugunsten des Inserts in ein Eppendorf-
Reaktionsgefäß gegeben. Vor Zugabe von 2 µl Ligase-Puffer (10×)
und 2-10 U T4-DNA-Ligase wurde demineralisiertes Wasser
hinzugefügt (Gesamtvolumen 20 µl). Die Reaktionsansätze wurden
eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 7°C
inkubiert.
Zur Herstellung kompetenter Zellen für die Transformation
wurden 500 µl einer E. coli-Übernachtkultur zum Animpfen eines
250 ml-Schüttelkolbens, der 50 ml LB-Medium enthielt,
verwendet. Nach ca. dreistündiger Inkubation bei 37°C und 220
UpM, wird die Kultur nach Erreichen eines OD600-Wertes zwischen
0,4-0,6 bei 5500 g 3 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das
Zellpellet wird in 2 ml TSS-Puffer (10 g PEG6000, 5 ml DMSO,
0,6 g MgSO4, ad 100 ml LH) resuspendiert, auf Eis inkubiert und
in 200 µl Aliquots aufgeteilt und nach Schockgefrieren in
flüssigem Stickstoff bei -80°C gelagert.
Zur Transformation werden zu 200 µl der kompetenten Zellen 5
bis 25 µl des Ligationsansatzes gegeben. Nach 30-minütiger
Inkubation auf Eis wird der Transformationsansatz 30 s bei 42°C
im Thermomixer inkubiert und 800 µl auf 37°C erwärmtes LB-
Medium zugegeben. Die Ansätze werden eine Stunde lang im
Inkubator bei 37°C geschüttelt. Die Zellen wurden anschließend
bei 5500 g zentrifugiert (3 Minuten), im rücklaufenden Tropfen
LB-Medium aufgenommen und auf LB-Amp-Agarplatten ausplattiert.
Über Nacht wurden die Agarplatten bei 37°C im Brutschrank
inkubiert.
Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung des Applied
Biosystems DNA Sequenzierautomats 373A und des Dye Terminator
Cycle Sequencing-Kits mit AmpliTaq-DNA-Polymerase durchgeführt.
Die Sequenzierung erfolgt nach der Didesoxy-Methode von Sanger,
jedoch werden statt radioaktiv markierter dNTPs, dNTPs mit
Fluoreszenzmarkern eingesetzt, die im Verlauf der
Sequenzierreaktion in die synthetisierten DNA-Fragmente
eingebaut werden.
Die Reaktionsprodukte wurden anschließend mit 100-prozentigem
auf -20°C gekühltem Ethanol gefällt. Nach Trocknung der DNA und
Aufnahme in 4 µl einer 5 : 1-Mischung aus Formamid und 25 mM
EDTA, pH 8,0 erfolgte die Denaturierung eines jeden PCR-
Ansatzes bei 95°C für 5 Minuten und sofortiger Überführung der
Proben auf Eis.
Die mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten DNA-Fragmente
durchlaufen während der Gelelektrophorese einen Laserstrahl.
Das senkrecht zu diesem Strahl emittierte Fluoreszenzlicht wird
von Fotodioden hinter dem Gel gemessen und von der Software in
ein Kurvendiagramm umgewandelt.
8 µl Terminator Ready Reaction Mix; 3,2 µmol Primer; 300-500 ng
Template DNA;
H2O ad 20 µl.
H2O ad 20 µl.
Harnstoff 30 g (Roth); Rotiphorese NF-10x-TBE-Puffer 6 ml
(Roth); Acrylamid/Bis-Lösung 40% (29 : 1) 9 ml (Roth); ddH2O
demineralisiert 23,5 ml.
Die fertige Lösung wird filtriert und entgast. Die
Polymerisation wird durch Zugabe von 24 µl TEMED und 180 µl 10%
(m/v) APS gestartet. Für Einzelheiten dazu, zur Auswertung
der Sequenzdaten und zu den dNTP-Markierungen, sei auf das
Handbuch zum Sequenzierautomaten verwiesen.
Zur Erhöhung des Sensitivität des pNCA-Assaysystems, wurde an
Position 87 die Aminosäure Phenylalanin durch ein Alanin
ersetzt. Um die Punktmutante leichter identifizieren zu können,
wurde, ohne weitere Änderung der Aminosäuresequenz, eine
zusätzliche EaeI-Restriktionsschnittstelle unter Einbeziehung
der Mutationsposition, eingefügt.
Im Gegensatz zum Standard-PCR-Programm erfolgte hierbei nur
eine vierminütige DNA-Denaturierung und der
Sequenzierreaktionsschritt wurde bei einer Annealing-Temperatur
von 52,3°C, und 17-minütigem Elongationsschritt nur 16 Mal
durchlaufen. Auf den dritten Programmschritt wurde verzichtet.
1,2 µl dNTP-Mix (200 µM), 5 µl Pfu-Polymerase-Puffer (10×), 2,5
U Pfu-Polymerase, 2,5 µl Primer F87A1 (5 nM), 2,5 µl Primer
F87A2 (5 nN), 1 µl pT-USC1BM3 (aus Mini-Präparation 1 : 20 mit
demineralisiertem Wasser verdünnt), ad 50 µl demineralisiertes
Wasser.
Die "Annealing"-Temperatur von 52,3°C zeigte nach obiger PCR-
Reaktion auf einem einprozentigen Agarose-Gel eine scharfe
Bande mit erwarteter Fragmentgröße.
Nach Abtrennen des Mineralöls vom Reaktionsgemisch wurde der
PCR-Ansatz mit 1 µl DpnI (10 U/µl) versetzt und die Lösung
vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Es wurde kurz
zentrifugiert und inkubiert bei 37°C für eine Stunde. Während
des Verdaus wurden die ultrakompetenten E. coli XL1-Blue auf
Eis aufgetaut und in 50 µl Aliquots auf 15 ml Falcon-Tubes
verteilt. Nach Zugabe von 1 µl β-Mercaptoethanol, 4 µl Zugabe
des verdauten PCR-Reaktionsansatzes und 30-minütiger Inkubation
auf Eis folgte ein 30 s langer Hitzeschock bei 42°C und eine
zweiminütige Abkühlung auf Eis. Zum Transformationsansatz
wurden 450 µl erwärmtes (Ölbadtemperatur 42°C) NZY-Medium (12
g NZamine, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, pH 7,5) zugegeben. Nach
einstündiger Inkubation bei 37°C und 220 UpM und Zentrifugation
(5500 g, 3 min) wurde das Zellpellet in der Restflüssigkeit
resuspendiert und auf LB-Amp-Platten ausgestrichen.
Zellpellets mit einer Biofeuchtmasse von bis zu 15 g E. coli
DHSa/pT-USC1BM-3 oder DH5α/pT-USC1BM-3F87A wurden auf Eis
aufgetaut und in 25 ml Kaliumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7,5, 1
mM EDTA) oder Tris/HCl Puffer (50 mM, pH 7,5, 1 mM EDTA)
suspendiert. Mittels dreiminütiger Ultraschallbehandlung
(Branson Sonifier W250, (Dietzenbach, Deutschland),
Leistungsabgabe 80 W, Arbeitsintervall 20%) wurde die auf Eis
gekühlte E. coli-Zellsuspension aufgeschlossen. Vor der
Proteinreinigung wurde die Zellsuspension für 20 min bei 32° 500
g zentrifugiert und durch einen 0,22 µm Sterivex-GP-Filter
(Millipore) filtriert. Diese klare Lösung wird im folgenden als
Rohextrakt bezeichnet.
Zur Proteinreinigung wurde ein ÄKTAexplorer System (Amersham
Pharmacia Biotech) mit einer auf Personal-Computern basierenden
OS/2-UNICORN Steuersoftware v2.1 und einem Frac-900
Fraktionssammler verwendet, das die gleichzeitige Messung der
Gesamtproteinelution bei 280 nm und P450 BM-3 Elution bei 417
nm erlaubt.
Alle analytischen P450 BM-3 Proteinreinigungen mittels
Anionenaustauscherchromatographie wurden bei 200 cm/h,
Raumtemperatur und einer Beladung von 6-10 mg P450 BM-3 pro
100 ml Matrix durchgeführt. Alle Chromatographiematerialien
wurden von TosoHaas (Stuttgart, Deutschland) bezogen.
Zur Entwicklung eines P450 BM-3 Reinigungsprotokolls wurden vom
Hersteller gepackte MPD-DEAE 6505 (7,5 mm × 85 mm,
Partikeldurchmesser 35 µm, Af = 1,1, 4100 TP/m) und selbst
gepackte XK16/20 (16 mm × 100 mm, APB) Chromatographiesäulen
verwendet, die Toyopearl DEAE 650M (Af = 1,1, 1610 Tp/m), SuperQ
650M, (Af = 1,2, 1840 Tp/m) und QAE 550M (Af = 1,0, 1780 Tp/m)
mit einem Partikeldurchmesser von 65 µm enthielten.
Für die präparativen Chromatographiereinigungen wurde eine
INDEX200 (APB) Glassäule (20 cm × 19 cm, Af = 1,4, 3800 Tp/m),
sechs Liter Toyopearl DEAE 650M und eine Zahnradpumpe (ISMATEC,
PB, USA) benutzt. Im Gegensatz zu den analytischen P450 BM-3
Chromatographiereinigungen wurde das ÄKTAexplorer System über
einen 1/20 aufgeteilten Fluß als Monitor verwendet, und die
Puffer vor den präparativen Reinigungen manuell hergestellt.
Die Puffer bestanden aus Tris/HCl (0,1 M, pH 7,8) mit 1 mM EDTA
sowie 150 mM NaCl für die erste, 250 mM NaCl für die zweite und
1 M NaCl für die dritte Salzstufe.
Voruntersuchungen auf der Grundlage von Aktivitätsmessungen
über NADPH-Verbrauch ergaben einen geeigneten pH-Bereich
zwischen 6,8 und 8,0 zur P450 BM-3 Reinigung. Spätere
Untersuchungen zur pH-Stabilität mit dem pNCA-Nachweissystem
bestätigten diesen pH-Bereich.
Anionenaustauscherchromatographien mit linearen NaCl-Gradienten
zeigten, daß ein Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,8) mit 1 mM EDTA
einem Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0 bis pH 7,5) mit 1 mM EDTA
in Bezug auf Bindungskapazität und Auflösungsvermögen für P450
BM-3 deutlich überlegen ist. Aus diesen Gründen wurde das
Tris/HCl-Puffersystem für alle weiteren Reinigungsoptimierungen
verwendet.
Zur Immobilisierung von P450 BM-3 F87A wurden in
Vorexperimenten verschiedene adsorptive und kovalente Methoden
untersucht. Für alle Vorexperimente wurden 100 mg
Trägermaterial (Ausnahme: EP-100, 50 mg) und 5 nmol P450 BM-3
F87A (aus Rohextrakt) verwendet.
Zur Auswahl eines geeigneten Trägermaterials wurde bei den
adsorptiven Methoden 5 nmol P450 BM-3 F87A zur KXP04-Puffer-(20
mM, pH 7,5, ad 1600 µl) Trägermaterial-Suspension in ein 2 ml
Eppendorf-Reakionsgefäß gegeben. Die Reaktionsgefäße wurden
nach Anbringen mittels Klebeband an die Außenseite eines 250 ml
Rundkolbens eine Stunde am Rotationsverdampfer langsam zur
Proteinimmobilisation über Kopf gedreht. Zur Bestimmung der
Adsorptionskapazitäten wurden die Immobilisate eine Minute bei
9000 g zentrifugiert und 200 µl des Überstandes zur
Aktivitätsmessung entnommen.
Bis zu 81 nmol eines P450 BM-3 F87A-Rohextrakts oder
Lyophilisats können pro ml sedimentiertem DEAE 650M
Adsorptionsmaterial in 5 ml Tris/HCl-Puffer (pH 7,5)
immobilisiert werden. Bei dem SuperQ 650M Adsorptionsmaterial
sind es bis zu 102 nmol eines P450 BM-3 F87A-Rohextrakts. Zur
Immobilisierung wurde das Lyophilisat in 4 ml dH2O in einem 15
ml Falcon-Reaktionsgefäß aufgenommen und mit einer
Endkonzentration von 0,1 mM 12-pNCA versetzt. Nach
fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde 1 ml der mit
5 ml Wasser zweimal gewaschenen und zentrifugierten (9000 g, 1
min) Absorptionsmatix zugegeben und eine halbe Stunde analog zu
den im vorherigen Abschnitt beschriebenen Eppendorf-
Reaktionsgefäßen über Kopf gedreht. Nach Zentrifugationen und
Abnahme des Überstandes wurde das Immobilisat mit 5 ml
Tris/HCl-Puffer (pH 7,5, 0,02 mM) versetzt, vorsichtig
resuspendiert und erneut zentrifugiert (9000 g, 1 min). Dieser
Waschvorgang wurde zwei Mal wiederholt. Nach Zugabe von
Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,5) auf ein Endvolumen von 2,0 ml
zum Immobilisat wurde dieses resuspendiert und in 200 µl
Aliquots auf 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße verteilt, die
bereits 495 µl dieses Puffers enthielten. Nach Zugabe von 5 µl
12-pNCA (15 mM) und fünfminütiger Inkubationszeit wurde die
Reaktion in einer Eppendorf-Schüttelapparatur (Ika-Vibrax, mit
Janke und Kunkel Aufsatz VX2E) durch Zugabe von 100 µl NADPH (1
mM) gestartet und nach variierten Reaktionszeiten mit 100 µl 6
M KOH gestoppt. Nach Zentrifugation bei 9000 g (1 min) wurde
der Überstand abgenommen und die Absorption bei 410 nm
bestimmt.
Zur kovalenten Immobilisierung von P450 BM-3 F87A mittels
Glutardialdehyd wurde P450 BM-3 F87A in einem 20 mM
Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) aufgeschlossen. 5 g
aminomodifizierter Trisopor-Gläser (Schueller, i 500-800 µm)
wurden bei Raumtemperatur zwischen drei und zwölf Stunden in
einer geschlossenen Apparatur mit Glutardialdehyd bedampft. Die
mit Glutardialdehyd aminomodifizierten Gläser zeigten eine rot
violette Farbe, die auch nach zweimaligem Waschen mit 100 ml
Kaliumcarbonatlösung (50 mM, pH 7,8) über eine Fritte erhalten
bleibt. Zwischen 50-150 mg dieser rot-violetten Gläser wurden
mit 0,5-0,8 nmol P450 BM-3 F87A versetzt und bis zur Entfärbung
der Lösung in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen in der Retsch-
Kugelmühle bei niedrigster Stufe und 6°C eine Stunde lang
geschüttelt.
Zur Überprüfung des Enzym-Membran-Reaktorkonzepts wurden 25
nmol P450 BM-3 F87A auf 4 ml SuperQ 650M immobilisiert und in
das Reaktorreaktionsgefäß zu 200 ml Tris/HCl Puffer (pH 7,8)
gegeben. Nach Zugabe von 1,2 µmol 12-pNCA bei einer
Flußgeschwindigkeit von 40 ml/min wurde die Lösung 20 Minuten
lang ohne Gegendruck auf das Filtrationsmodul durchmischt. Bei
einem Gegendruck von 2 psi wurde durch Zugabe von 2 ml wäßriger
NADPH-Lösung (1 mM) die Reaktion gestartet und der
Reaktionsablauf durch die Bestimmung der Wellenlängen bei 410
nm verfolgt. Während des Reaktionsablaufs wurde NADPH-Lösung in
1 ml Schritten bis zur vollständigen 12-pNCA-Umsetzung
zugegeben.
Alle 1H-NMR-Spektren wurden mit einem 500 MHz-NMR-Gerät, alle
13C-NMR mit einem 125 MHz-NMR-Gerät und CDCl3 als Lösungsmittel
aufgenommen.
Reaktionsschema A zeigt zur direkten PCA-Synthese aus ω-Bromo
carbonsäuren.
Zur in DMF gelösten Bromfettsäure gibt man Phenol und
Kaliumhydroxid. Die Lösung wurde unter Rückfluß 6-7 Stunden
lang auf 160°C erhitzt und die Reaktion mittels
Dünnschichtchromatographie (DC, Laufmittel Petrolether :
Diethylether 1 : 1) verfolgt. Nach Entfernen des Lösungsmittels
wurde der braune Niederschlag in einem Wasser-Diethylether-
Zweiphasensystem (1 : 1) gelöst und mit verdünnter Salzsäure
wurde ein pH-Wert von 2 eingestellt. Nach Extraktion der
wäßrigen Phase mit Diethylether wurden am Rotationsverdampfer
die vereinigten Diethyletherfraktionen vom Lösungsmittel
befreit, in Petrolether : Essigsäureethylester 1 : 1 aufgenommen
und mittels einer DC60-Kieselgelchromatographiesäule (Merck)
und dem gleichen Laufmittelgemisch gereinigt.
ω-Phenoxydodekansäure (12-PCA): Ausbeute: 76%; mp: = 98-99°C
berechnet: C 73,93%, H 9,65%, O 16,41%,
gefunden: C 73,92%, H 9,67%
1H-NMR: δ: = 7,26-7,29 (m, 2H, Phenyl-), 6,88-6,94 (m, 3H, Phenyl), 3,94 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,74-1,80 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,42-1,48 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,29- 1,35 (m, 12 H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-).
13C-NMR: δ: = 180,4 (-COO), 159,3 (C-1'), 129,8 (C-3'), 120,8 (C-4'), 114,7 (C-2'), 68,3 (-O-CH2-), 34,5 (-CH2-COO-), 29,9, 29,8, 29,7, 29,7, 29,5, 29,4, 29,1, 26,5, 25,1 (C-3-C-11).
berechnet: C 73,93%, H 9,65%, O 16,41%,
gefunden: C 73,92%, H 9,67%
1H-NMR: δ: = 7,26-7,29 (m, 2H, Phenyl-), 6,88-6,94 (m, 3H, Phenyl), 3,94 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,74-1,80 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,42-1,48 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,29- 1,35 (m, 12 H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-).
13C-NMR: δ: = 180,4 (-COO), 159,3 (C-1'), 129,8 (C-3'), 120,8 (C-4'), 114,7 (C-2'), 68,3 (-O-CH2-), 34,5 (-CH2-COO-), 29,9, 29,8, 29,7, 29,7, 29,5, 29,4, 29,1, 26,5, 25,1 (C-3-C-11).
ω-Phenoxyundekansäure (11-PCA): Ausbeute: 78%; mp: = 95°C
berechnet: C 73,35, H 9,41%, O 17,24%;
gefunden: C 73,32%, H 9,44%
1H-NMR: δ: = 7,18-7,21 (m, 2H, Phenyl-), 6,81-6,86 (m, 3H, Phenyl), 3,87 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,27 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,67-1,73 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,53-1,57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,35-1,39 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,18- 1,30 (m, 10H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-).
13CNMR: δ: = 180,5 (-COO), 159, 5 (C-1'), 129, 8 (C-3'), 120,7 (C-4'), 114,7 (C-2'), 68,2 (-O-CH2-), 34,5 (-CH2-COO-), 29,9, 29,7, 29,7, 29,7, 29,6, 29,4, 26,4, 25,0 (C-3-C-10).
berechnet: C 73,35, H 9,41%, O 17,24%;
gefunden: C 73,32%, H 9,44%
1H-NMR: δ: = 7,18-7,21 (m, 2H, Phenyl-), 6,81-6,86 (m, 3H, Phenyl), 3,87 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,27 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,67-1,73 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,53-1,57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,35-1,39 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,18- 1,30 (m, 10H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-).
13CNMR: δ: = 180,5 (-COO), 159, 5 (C-1'), 129, 8 (C-3'), 120,7 (C-4'), 114,7 (C-2'), 68,2 (-O-CH2-), 34,5 (-CH2-COO-), 29,9, 29,7, 29,7, 29,7, 29,6, 29,4, 26,4, 25,0 (C-3-C-10).
Im Gegensatz zu den PCA-Synthesen war eine entsprechende
Synthese der pNCA-Verbindungen nicht möglich. Die pNCA-Synthese
gelang erst, nachdem die ω-Bromcarbonsäuren verestert waren und
wasserfrei gearbeitet wurde.
Ausgehend von ω-Bromcarbonsäuren, wurden ω-
Bromcarbonsäuremethylester und ω-Brom-carbonsäureethylester in
Hexan entsprechend einer Standardmethode (Becker et al. 1993)
mit wasserfreier Methanol- oder Ethanollösung, die 1 M HCl
enthält, verestert. Der Reaktionsverlauf wurde mittels DC
(Laufmittel Hexan : Diethylether : Essigsäure 70 : 30 : 1)
verfolgt. Die wäßrige Phase wird zwei Mal mit Diethylether
extrahiert, zwei Mal mit gesättigter
Natriumhydrogencarbonatlösung und einmal mit demineralisiertem
Wasser gewaschen, über Nacht mit wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet, filtriert und chromatographisch aufgereinigt, wobei
als Laufmittel Petrolether : Diethylether im Verhältnis 70 : 30
verwendet wird. Nachdem das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer evaporiert war, wurden die Ester eine
Stunde lang ans Hochvakuum angeschlossen, um die p-NCAester
darzustellen wurde zu 17 mmol ω-Brom-carbonsäureester, die in
100 ml DMSO gelöst wurden, ein geringer Überschuß von 18,5 nmol
p-Nitrophenol gegeben. Die Lösung wurde unter Rückflußkühlung
für zwei bis drei Stunden auf 120°C erhitzt. Nach Abkühlen der
leicht bräunlichen Lösung auf Raumtemperatur wurde tropfenweise
demineralisiertes Wasser zugegeben, um die pNCAester
auszufällen. Das Präzipitat wurde filtriert, mit 1,5 Liter
eiskaltem Wasser zur Entfernung von überschüssigem p-
Nitrophenol gewaschen und in DMSO zu einem weißen Pulver
umkristallisiert. Zur Hydrolyse der pNCAester wurde eine
Lipasemischung, bestehend aus 100 mg Pseudomonas cepacia (PCL)
und 100 mg Candida antarctica Lipase B von Amano (Nagoya,
Japan), zu einer 100 ml Aceton/Wasser Mischung (pH 7,5, 0,2
Kaliumphosphat, bis zu 50% Aceton) zugegeben. Nach Zugabe der
pNCAester (5 mmol) wurde die Suspension bei Raumtemperatur bis
zu 16 h gerührt. Zur Entfernung des Lipaseimmobilisats wurde
die klare Suspension filtriert und die pNCAs durch Evaporierung
von Aceton kristallisiert. Die pNCA-Verbindungen wurden mit
kaltem Wasser gewaschen, in DMSO umkristallisiert und
chromatographisch über Silicagel DC60 (Merck, Darmstadt)
(Petrolether: Essigsäureethylester 1 : 1 bis 1 : 3) gereinigt.
Die angegebenen Ausbeuten der pNCA beziehen sich immer auf die
entsprechenden pNCAester als Edukte, und die Ausbeuten für die
pNCAester beziehen sich immer auf die zugehörigen ω-
Bromcarbonsäuren.
p-Nitrophenoxyhexansäure (6-pNCA): Ausbeute: 81%; mp = 94°C
1H-NMR: δ: = 8,18 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,3 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,06 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,3 Hz), 2,42 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,1 Hz), 1,80-1,92 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,68-1,77 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,49-1,61 (m, 2H, -O-CH2-CH2-).
13C-NMR: δ: = 180,0 (-COOH), 164,1 (C-4'), 141,4 (C-1'), 125,9 (C- 2'), 114,4 (C-3'), 68,5 (-O-CH2-), 33,9 (-CH2-COOH), 28,6, 25,5, 24,3 (C-3, C-5, C-4).
1H-NMR: δ: = 8,18 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,3 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,06 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,3 Hz), 2,42 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,1 Hz), 1,80-1,92 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,68-1,77 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,49-1,61 (m, 2H, -O-CH2-CH2-).
13C-NMR: δ: = 180,0 (-COOH), 164,1 (C-4'), 141,4 (C-1'), 125,9 (C- 2'), 114,4 (C-3'), 68,5 (-O-CH2-), 33,9 (-CH2-COOH), 28,6, 25,5, 24,3 (C-3, C-5, C-4).
p-Nitrophenoxyhexansäureethylester (6-pNCAEt): Ausbeute: 81%
1H-NMR: δ: = 8,09 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,3 Hz), 6,85 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (q, 2H, -COO-CH2-), 3,97 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,4 Hz), 2,26 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,3 Hz), 1,69-1,82 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,57-1,67 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,40-1,50 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,17 (t, 3H, -COOCH2-CH3).
13C-NM: δ:= 173,7 (-COO), 164,3 (C-4'), 141, 5 (C-1'), 126,0 (C-2'), 114,6 (C-3'), 68,7 (-O-CH2-), 60,4 (-COO-CH2-), 34,3 (-CH2-COO-), 28,8, 25,7, 24,8 (C-3, C-5, C-4), 14,4 (-O-CH2-CH3).
1H-NMR: δ: = 8,09 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,3 Hz), 6,85 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (q, 2H, -COO-CH2-), 3,97 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,4 Hz), 2,26 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,3 Hz), 1,69-1,82 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,57-1,67 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,40-1,50 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,17 (t, 3H, -COOCH2-CH3).
13C-NM: δ:= 173,7 (-COO), 164,3 (C-4'), 141, 5 (C-1'), 126,0 (C-2'), 114,6 (C-3'), 68,7 (-O-CH2-), 60,4 (-COO-CH2-), 34,3 (-CH2-COO-), 28,8, 25,7, 24,8 (C-3, C-5, C-4), 14,4 (-O-CH2-CH3).
p-Nitrophenoxyoktansäure (8-pNCA): Ausbeute: 92%; mp: = 98°C
1H-NMR: δ: = 8,11 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,86 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,4 Hz), 2,29 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,4 Hz), 1,69-1,80 (m, 2H, -O-CH2- CH2), 1,56-1,61 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,32-1,43 (m, 6H, -O-CH2- CH2-(CH2)3-CH2-).
13C-NMR: δ: = 180,2 (-COOH), 164,3 (C-4'), 141,4 (C-1'), 125,9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,8 (-O-CH2-), 34,0 (-CH2-COOH), 28,9, 28,9, 28,9, 25,8, 24,6 (C-3-C-7).
1H-NMR: δ: = 8,11 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,86 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,4 Hz), 2,29 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,4 Hz), 1,69-1,80 (m, 2H, -O-CH2- CH2), 1,56-1,61 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,32-1,43 (m, 6H, -O-CH2- CH2-(CH2)3-CH2-).
13C-NMR: δ: = 180,2 (-COOH), 164,3 (C-4'), 141,4 (C-1'), 125,9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,8 (-O-CH2-), 34,0 (-CH2-COOH), 28,9, 28,9, 28,9, 25,8, 24,6 (C-3-C-7).
p-Nitrophenoxyoktansäuremethylester (8-pNCAMe): Ausbeute: 79 %
1H-NMR: δ: = 8,10 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,86 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 3,59 (s, 3H, -COOCH3), 2,24 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,4 Hz), 1,69- 1,77(m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,51-1,59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1, 27-1, 43 (m, 6H, -O-(CH2)2-(CH2)3-).
13C-NMR: δ: = 174,2 (-COO), 164,3 (C-4'), 141,4 (C-1'), 125,9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,8 (-O-CH2-), 51,5 (-COO-CH3), 34,0 (- CH2-COO-), 29,0, 28,9, 28,9, 25,8, 24,9 (C-3-C-7).
p-Nitrophenoxydekansäure (10-pNCA): Ausbeute: 84%; mp: = 101°C 1H-NMR: δ: = 8,18 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,93 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,03 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,4 Hz), 1,75-1,86 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,60-1,63 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,32-1,45 (m, 10H, -O-CH2- CH2-(CH2)5-CH2-).
13C-NMR: b: = 180,4 (-COO), 164,4 (C-4'), 141,5 (C-1'), 126,1 (C-2'), 114,6 (C-3'), 69,1 (-O-CH2-), 34,2 (-CH2-COOH), 29,9, 29,4, 29,4, 29,3, 29,2, 26,3, 26,1, 24,8 (C- 3-C-9).
1H-NMR: δ: = 8,10 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,86 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 3,59 (s, 3H, -COOCH3), 2,24 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,4 Hz), 1,69- 1,77(m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,51-1,59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1, 27-1, 43 (m, 6H, -O-(CH2)2-(CH2)3-).
13C-NMR: δ: = 174,2 (-COO), 164,3 (C-4'), 141,4 (C-1'), 125,9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,8 (-O-CH2-), 51,5 (-COO-CH3), 34,0 (- CH2-COO-), 29,0, 28,9, 28,9, 25,8, 24,9 (C-3-C-7).
p-Nitrophenoxydekansäure (10-pNCA): Ausbeute: 84%; mp: = 101°C 1H-NMR: δ: = 8,18 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,93 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,03 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,4 Hz), 1,75-1,86 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,60-1,63 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,32-1,45 (m, 10H, -O-CH2- CH2-(CH2)5-CH2-).
13C-NMR: b: = 180,4 (-COO), 164,4 (C-4'), 141,5 (C-1'), 126,1 (C-2'), 114,6 (C-3'), 69,1 (-O-CH2-), 34,2 (-CH2-COOH), 29,9, 29,4, 29,4, 29,3, 29,2, 26,3, 26,1, 24,8 (C- 3-C-9).
p-Nitrophenoxydekansäuremethylester (10-pNCAMe): Ausbeute: 73%
1H-NMR: δ: = 8,11 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,86 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 3,59 (s, 3H, -COOCH3), 2,23 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,68- 1,77 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,52-1,57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,22-1,45 (m, 10K, -O-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-).
13C-NMR: δ: = 174,2 (-COO), 164,2 (C-4'), 141,2 (C-1'), 125,8 (C-2'), 114,3 (C-3'), 68,8 (-O-CH2-), 51,3 (-COOCH3), 34,3 (-CH2-COO-), 29,2, 29,1, 29,1, 29,0, 28,9, 25,8, 24,8 (C-3-C-9).
1H-NMR: δ: = 8,11 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,86 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 3,97 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 3,59 (s, 3H, -COOCH3), 2,23 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,68- 1,77 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,52-1,57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,22-1,45 (m, 10K, -O-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-).
13C-NMR: δ: = 174,2 (-COO), 164,2 (C-4'), 141,2 (C-1'), 125,8 (C-2'), 114,3 (C-3'), 68,8 (-O-CH2-), 51,3 (-COOCH3), 34,3 (-CH2-COO-), 29,2, 29,1, 29,1, 29,0, 28,9, 25,8, 24,8 (C-3-C-9).
p-Nitrophenoxyundekansäure (11-pNCA): Ausbeute: 89°s; mp: =
102°C
1H-NMR: δ: = 8,19 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,1 Hz), 4,05 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,6 Hz), 1,79-1,84 (m, 2H, -O-CH2-CH2- ), 1,61-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH2- CH2-CH2-), 1,32-1,45 (m, 10K, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-).
13C-NMR: δ: = 180,12 (-COO), 164,3 (C-4'), 141,3 (C-1'), 125,9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,9 (-O-CH2-), 34,0 (-CH2-COO-), 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,0, 29,0, 25,9, 24,6 (C-3-C-10).
1H-NMR: δ: = 8,19 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,1 Hz), 4,05 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,6 Hz), 1,79-1,84 (m, 2H, -O-CH2-CH2- ), 1,61-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH2- CH2-CH2-), 1,32-1,45 (m, 10K, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-).
13C-NMR: δ: = 180,12 (-COO), 164,3 (C-4'), 141,3 (C-1'), 125,9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,9 (-O-CH2-), 34,0 (-CH2-COO-), 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,0, 29,0, 25,9, 24,6 (C-3-C-10).
p-Nitrophenoxyundekansäuremethylester (11-pNCAMe): Ausbeute: 80 %
1H-NMR: δ: = 8,18 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,3 H2), 6,93 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,2 Hz), 4,03 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 3,66 (s, 3H, -COOCH3), 2,29 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,75- 1,86 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,58-1,64 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,29-1,45 (m, 12H, -O-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-).
13C-NMR: δ: = 174,5 (-COO), 164,4 (C-4'), 141,5 (C-1'), 126,1 (C-2'), 114,6 (C-3'), 69,0 (-O-CH2-), 51,6 (-COOCH3), 34,2 (-CH2-COO-), 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,1, 26,1, 25,1 (C-3- C-10).
1H-NMR: δ: = 8,18 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,3 H2), 6,93 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,2 Hz), 4,03 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 3,66 (s, 3H, -COOCH3), 2,29 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,75- 1,86 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,58-1,64 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,29-1,45 (m, 12H, -O-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-).
13C-NMR: δ: = 174,5 (-COO), 164,4 (C-4'), 141,5 (C-1'), 126,1 (C-2'), 114,6 (C-3'), 69,0 (-O-CH2-), 51,6 (-COOCH3), 34,2 (-CH2-COO-), 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,1, 26,1, 25,1 (C-3- C-10).
p-Nitrophenoxydodekansäure (12-pNCA): Ausbeute: 89%; mp: =
106°C
berechnet: C 64,07% H 8,07% N 4,06%, 0 23,71%,
gefunden: C 63,99°s H 8,18°s N 4,15%
1H-NMR: δ: = 8,19 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,3 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-0-, J = 9,4 Hz), 4,04 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6, 6 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 H2), 1,79-1,84 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,60-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH2-CH2- CH2-), 1,29-1,35 (m, 12H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-)
13C-NMR: δ: = 180,4 (-COO), 164, 3 (C-4'), 141, 3 (C-1'), 125, 9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,9 (-O-CH2-), 34,1 (-CH2-COO-), 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 29,2, 29,0, 29,0, 25,9, 24,7 (C-3-C-11).
berechnet: C 64,07% H 8,07% N 4,06%, 0 23,71%,
gefunden: C 63,99°s H 8,18°s N 4,15%
1H-NMR: δ: = 8,19 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,3 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-0-, J = 9,4 Hz), 4,04 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6, 6 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 H2), 1,79-1,84 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,60-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH2-CH2- CH2-), 1,29-1,35 (m, 12H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-)
13C-NMR: δ: = 180,4 (-COO), 164, 3 (C-4'), 141, 3 (C-1'), 125, 9 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,9 (-O-CH2-), 34,1 (-CH2-COO-), 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 29,2, 29,0, 29,0, 25,9, 24,7 (C-3-C-11).
p-Nitrophenoxydodekansäureethylester (12-pNCAEt): Ausbeute: 73%
1H-NMR: δ: = 8,18 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H,
Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,12 (q, 2H, -COO-CH2-, J = 7,1 Hz) 4,05
(t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J= 6,5 Hz), 2,29 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5
Hz), 1,70-1,87 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,59-1,69 (m, 2H, -CH2-CH2-
COO), 1,32-1,45 (m, 14H, -O-CH2-CH2-(CH2)-CH2-), 1,26 (t, 3H,
-COOCH2-CH3, J = 7, 2 Hz).
13C-NMR: δ: = 174,8 (-COO), 164,4 (C-4'), 141,5 (C-1'), 126,1 (C-2'), 114,6 (C-3'), 69,0 (-O-CH2-), 60,5 (-COO-CH2-), 34,2 (-CH2-COO-), 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,2, 29,1, 26,1, 25,1 (C-3-C-11), 14, 4 (-COO-CH2-CH3).
13C-NMR: δ: = 174,8 (-COO), 164,4 (C-4'), 141,5 (C-1'), 126,1 (C-2'), 114,6 (C-3'), 69,0 (-O-CH2-), 60,5 (-COO-CH2-), 34,2 (-CH2-COO-), 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,2, 29,1, 26,1, 25,1 (C-3-C-11), 14, 4 (-COO-CH2-CH3).
p-Nitrophenoxypentadekansäure (15-pNCA): Ausbeute: 87%; mp: =
115°C
1H-NMR: δ: = 8,19 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,79-1,85 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH2- CH2-CH2-), 1,26-1,35 (m, 18H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)9-CH2-).
13C-NMR: 8: = 180,0 (-COO), 164,3 (C-4'), 141,3 (C-1-), 126,0 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,9 (-O-CH2-), 34,0 (-CH2-COO-), 29,6, 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1, 29,0, 25,9, 24,7 (C-3-C-14).
1H-NMR: δ: = 8,19 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2,35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,79-1,85 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,43-1,49 (m, 2H, -O-CH2- CH2-CH2-), 1,26-1,35 (m, 18H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)9-CH2-).
13C-NMR: 8: = 180,0 (-COO), 164,3 (C-4'), 141,3 (C-1-), 126,0 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,9 (-O-CH2-), 34,0 (-CH2-COO-), 29,6, 29,6, 29,5, 29,4, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1, 29,0, 25,9, 24,7 (C-3-C-14).
p-Nitrophenoxypentadekansäuremethylester (15-pNCAMe): Ausbeute:
75%
1H-NMR: δ: = 8,19 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 3,66 (s, 3H, -COOCH3), 2,26 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,79- 1,85 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,43- 1,49 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,26-1,35 (m, 18H, -O-CH2-CH2-CH2- (CH2)9-CH2-).
13C-NMR: δ: = 174,6 (-COO), 164,3 (C-4'), 141,3 (C-1'), 126,0 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,9 (-O-CH2-), 51,7 (-COOCH3), 34,0 (-CH2- COO-), 29,7, 29,6, 29,5, 29,5, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1, 29,1, 26,1, 25,0 (C-3-C-14).
1H-NMR: δ: = 8,19 (d, 2H, NO2-Phenyl-, J = 9,2 Hz), 6,94 (d, 2H, Phenyl-O-, J = 9,3 Hz), 4,05 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 3,66 (s, 3H, -COOCH3), 2,26 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1,79- 1,85 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,59-1,66 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,43- 1,49 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,26-1,35 (m, 18H, -O-CH2-CH2-CH2- (CH2)9-CH2-).
13C-NMR: δ: = 174,6 (-COO), 164,3 (C-4'), 141,3 (C-1'), 126,0 (C-2'), 114,4 (C-3'), 68,9 (-O-CH2-), 51,7 (-COOCH3), 34,0 (-CH2- COO-), 29,7, 29,6, 29,5, 29,5, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1, 29,1, 26,1, 25,0 (C-3-C-14).
Zur RCA-Synthese wurden die ω-Bromcarbonsäuren, entsprechend
dem Vorgehen bei den pNCA-Verbindungen verestert, mit dem
Natriumresorufinsalz in DMF umgesetzt und mittels einer
PCL/CAL- B-Lipasemischung hydrolysiert.
Ansatz für ω-Resorufinyllaurinsäuremethylester:
0,90 g (3,1 mmol) 12-Bromlaurinsäuremethylester
0,72 g (3,1 mmol) Resorufin
50 ml DMF
0,90 g (3,1 mmol) 12-Bromlaurinsäuremethylester
0,72 g (3,1 mmol) Resorufin
50 ml DMF
Ansatz für ω-Resorufinylundekansäuremethylester:
0,75 g (2,7 mmol) 11-Bromundekansäuremethylester
0,63 g (2,7 mmol) Resorufin
50 ml DMF
0,75 g (2,7 mmol) 11-Bromundekansäuremethylester
0,63 g (2,7 mmol) Resorufin
50 ml DMF
Zur Lösung des Bromfettsäureesters in DMF gibt man Resorufin,
das sich nicht vollständig löst, zu. Die dunkelviolette
Suspension wird unter Rückfluß vier Stunden lang erhitzt und
die Reaktion mittels DC (Laufmittel Petrolether : Diethylether
1 : 1) verfolgt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wird der
braune Niederschlag in Petrolether : Essigsäureethylester 1 : 1
eine halbe Stunde lang gelöst und mittels einer DC60 (Merck)-
Kieselgelchromatographiesäule in dem gleichen
Laufmittelgemisch gereinigt. Die Säule sollte nicht zu groß
gewählt werden, da die Verbindung in geringem Maße auf der
Säule zerfällt.
ω-Resorufinyllaurinsäuremethylester: Ausbeute: 17
1H-NMR: δ: = 7,62 (d, 1H, -H-9', J = 8,89 Hz), 7,35 (d, 1H, -H- 1', J = 9,79 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J8',9' = 8,87 Hz, J8',6' = 2,41 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2', J2',1' = 9,74 Hz, J2',4' = 1,74 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,40 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,74 Hz), 3,98 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,50 Hz), 3,59 (s, 3H, -COO-CH3), 2,23 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,50 Hz), 1,73-1,79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,53-1,56 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,37-1,41 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,22-1,29 (m, 12H, -O-CH2-CH2-CH2- (CH2)6-CH2-).
13C-NMR: δ: = 186,7 (-C-3'), 174,7 (-COO), 163,7, 150,3, 146,1, 145,7 (C-4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,1, 134,5, 131,9, 128, 7, 114, 5, 107, 1, 100, 8 (C-2', C-4', C-1', C-9', C-6', C-8', C-9'), 69,5 (-O-CH2-), 51,9 (-COO-CH3), 34,5 (-CH2-COO-), 30,1, 29,8, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C- 11).
1H-NMR: δ: = 7,62 (d, 1H, -H-9', J = 8,89 Hz), 7,35 (d, 1H, -H- 1', J = 9,79 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J8',9' = 8,87 Hz, J8',6' = 2,41 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2', J2',1' = 9,74 Hz, J2',4' = 1,74 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,40 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,74 Hz), 3,98 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,50 Hz), 3,59 (s, 3H, -COO-CH3), 2,23 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,50 Hz), 1,73-1,79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,53-1,56 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,37-1,41 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,22-1,29 (m, 12H, -O-CH2-CH2-CH2- (CH2)6-CH2-).
13C-NMR: δ: = 186,7 (-C-3'), 174,7 (-COO), 163,7, 150,3, 146,1, 145,7 (C-4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,1, 134,5, 131,9, 128, 7, 114, 5, 107, 1, 100, 8 (C-2', C-4', C-1', C-9', C-6', C-8', C-9'), 69,5 (-O-CH2-), 51,9 (-COO-CH3), 34,5 (-CH2-COO-), 30,1, 29,8, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C- 11).
ω-Resorufinylundekansäuremethylester: Ausbeute: 15%;
1H-NMR: δ: = 7,62 (d, 1H, -H-9', J = 8,91 Hz), 7,35 (d, 1H, -H- 1', J = 9,70 Hz), 6,86 (dd, 1H, -H-8', J8',9' = 8,90 Hz, J8',6' = 2,53 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2', J2',1' = 9,72 Hz, J2',4' = 1,95 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,54 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,94 Hz), 3,98 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,49 Hz), 3,60 (s, 3H, -COO-CH3), 2,23 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,50 Hz), 1,74-1,79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,54-1,57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,35-1,42 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,18-1,29 (m, 10 W, -O-CH2-CH2-CH2- (CH2)5-CH2-).
13C-NMR: δ: = 186,7 (-C-3'), 174,7 (-COO), 163,7, 150,3, 146,1, 145,7 (C-4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,0, 135,0, 132,0, 128,6, 114,5, 107,0, 100,8 (C-2', C-4', C-1', C-9', C-6', C-8', C-9'), 69,5 (-O-CH2-), 51,8 (-COO-CH3), 34,5 (-CH2-COO-), 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-10).
1H-NMR: δ: = 7,62 (d, 1H, -H-9', J = 8,91 Hz), 7,35 (d, 1H, -H- 1', J = 9,70 Hz), 6,86 (dd, 1H, -H-8', J8',9' = 8,90 Hz, J8',6' = 2,53 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2', J2',1' = 9,72 Hz, J2',4' = 1,95 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,54 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,94 Hz), 3,98 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,49 Hz), 3,60 (s, 3H, -COO-CH3), 2,23 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,50 Hz), 1,74-1,79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1,54-1,57 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1,35-1,42 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1,18-1,29 (m, 10 W, -O-CH2-CH2-CH2- (CH2)5-CH2-).
13C-NMR: δ: = 186,7 (-C-3'), 174,7 (-COO), 163,7, 150,3, 146,1, 145,7 (C-4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,0, 135,0, 132,0, 128,6, 114,5, 107,0, 100,8 (C-2', C-4', C-1', C-9', C-6', C-8', C-9'), 69,5 (-O-CH2-), 51,8 (-COO-CH3), 34,5 (-CH2-COO-), 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-10).
Chemische Hydrolyse mittels NaOH führte zur Spaltung des
Esters, jedoch konnte das gewünschte gelb-orange Produkt nur
in Ausbeuten von 10% isoliert werden; die Ursache liegt
darin, daß der Resorufinyl-Aromat in stark alkalischen
Lösungen (pH<12) unter Farbverlust zerfällt. Auf DC-Plättchen
waren fünf Produkte erkennbar. Im alkalischen Medium zeigt der
Resorufinylfettsäureester eine grünliche Färbung. Die Spaltung
mittels Lipasen verlief nach Optimierung der Aufarbeitung
wesentlich erfolgreicher. Zur Wahl einer geeigneten Lipase
wurden folgende Lipasen im Thermomixer bei 40°C über Nacht in
einem 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 mit 10% Aceton als
Lösungvermittler getestet: Candida antarctica Lipase A und B,
Aspergillus niger Lipase und Pseudomonas cepacia Lipase (PCL).
Die Candida antarctica Lipase B und die PCL spalten die
Resorufinylcarbonsäureester, wobei letztendlich die PCL-Lipase
zur präparativen Esterspaltung verwendet wurde.
Ansatz für ω-Resorufinyldodekansäure:
40 mg (94 µmol) ω-Resorufinyldodekansäuremethylester
2 ml Aceton
18 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,3
Spatelspitze PCL-Lipase
40 mg (94 µmol) ω-Resorufinyldodekansäuremethylester
2 ml Aceton
18 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,3
Spatelspitze PCL-Lipase
Ansatz für ω-Resorufinylundekansäure:
36 mg (30 µmol) ω-Resorufinylundekansäuremethylester
2 ml Aceton
18 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,3
Spatelspitze PCL-Lipase
36 mg (30 µmol) ω-Resorufinylundekansäuremethylester
2 ml Aceton
18 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,3
Spatelspitze PCL-Lipase
In einem 50 ml Rundkolben werden die Ester in Aceton gelöst,
nach Zugabe von 9 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,3 wird eine
Spatelspitze PCL zugegeben und bei 40°C über Nacht inkubiert.
Der Reaktionsablauf wird mittels DC (Laufmittel Petrolether :
Diethylether 1 : 1) verfolgt. Nach mehrfacher vorsichtiger
Extraktion mittels Chloroform wird die Chloroformphase zwei
Mal mit demineralisiertem Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
vier Stunden getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer
eingeengt.
ω-Resorufinyllaurinsäure: Ausbeute: 73%
1H-NMR: δ: = 7, 62 (d, 1H, -H-9', J = 8, 9 Hz), 7, 35 (d, 1H, -H- 1', J = 9,8 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J8',9' = 8,87 Hz, J8',6' = 2,4 Hz), 6,76 (dd, 1K, -H-2', J2',1' = 9,7 Hz, J2',4' = 1,7 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,4 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,7 Hz), 3,98 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2.34 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1.73-1.79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.55-1.59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.37-1.41 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.22-1.29 (m, 12H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-).
13C-NMR: δ: = 186,6 (-C-3'), 180,4 (-COO), 163,7, 150,3 146,1, 145,7 (C-4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,1, 134,5, 131,9, 128,7, 114,5, 107,1, 100,8 (C-2', C-4', C-1', C-9', C-6', C-8', C-9'), 69,5 (-O-CH2-), 34,2 (-CH2-COO-), 30,1, 29,8, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-11).
1H-NMR: δ: = 7, 62 (d, 1H, -H-9', J = 8, 9 Hz), 7, 35 (d, 1H, -H- 1', J = 9,8 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J8',9' = 8,87 Hz, J8',6' = 2,4 Hz), 6,76 (dd, 1K, -H-2', J2',1' = 9,7 Hz, J2',4' = 1,7 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,4 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,7 Hz), 3,98 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2.34 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1.73-1.79 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.55-1.59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.37-1.41 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.22-1.29 (m, 12H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)6-CH2-).
13C-NMR: δ: = 186,6 (-C-3'), 180,4 (-COO), 163,7, 150,3 146,1, 145,7 (C-4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,1, 134,5, 131,9, 128,7, 114,5, 107,1, 100,8 (C-2', C-4', C-1', C-9', C-6', C-8', C-9'), 69,5 (-O-CH2-), 34,2 (-CH2-COO-), 30,1, 29,8, 29,7, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-11).
ω-Resorufinylundekansäure: Ausbeute: 78°s
1H-NMR: δ: = 7,63 (d, 1H, -H-9', J = 8,9 Hz), 7,35 (d, 1H, -H- 1', J = 9,7 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J8',9' = 8,9 Hz, J8',6' = 2,53 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2", J2',1' = 9,7 Hz, J2',4' = 1,9 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,5 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,9 Hz), 3,98 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2.35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1.74-1.79 (m, 2K, -O-CH2-CH2-), 1.54-1.59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.35-1.42 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.18-1.29 (m, 10H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-).
13C-NMR: δ: = 186,7 (-C-3'), 180,7 (-COO), 163,7, 150,3, 146,1, 145,7 (C-4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,0, 135,0, 132,0, 128,6, 114,5, 107,0, 100,8 (C-2', C-4', C-1', C-9', C-6', C-S', C-9'), 69,5 (-O-CH2-), 34,1 (-CH2-COO-), 29.9, 29.8, 29.7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-10).
1H-NMR: δ: = 7,63 (d, 1H, -H-9', J = 8,9 Hz), 7,35 (d, 1H, -H- 1', J = 9,7 Hz), 6,85 (dd, 1H, -H-8', J8',9' = 8,9 Hz, J8',6' = 2,53 Hz), 6,76 (dd, 1H, -H-2", J2',1' = 9,7 Hz, J2',4' = 1,9 Hz), 6,73 (d, 1H, -H-6', J = 2,5 Hz), 6,25 (d, 1H, -H-4', J = 1,9 Hz), 3,98 (t, 2H, Phenyl-O-CH2-, J = 6,5 Hz), 2.35 (t, 2H, -CH2-COO, J = 7,5 Hz), 1.74-1.79 (m, 2K, -O-CH2-CH2-), 1.54-1.59 (m, 2H, -CH2-CH2-COO), 1.35-1.42 (m, 2H, -O-CH2-CH2-CH2-), 1.18-1.29 (m, 10H, -O-CH2-CH2-CH2-(CH2)5-CH2-).
13C-NMR: δ: = 186,7 (-C-3'), 180,7 (-COO), 163,7, 150,3, 146,1, 145,7 (C-4a', C-5a', C-9a', C-10a'), 135,0, 135,0, 132,0, 128,6, 114,5, 107,0, 100,8 (C-2', C-4', C-1', C-9', C-6', C-S', C-9'), 69,5 (-O-CH2-), 34,1 (-CH2-COO-), 29.9, 29.8, 29.7, 29,6, 29,5, 29,3, 26,3, 25,3 (C-3-C-10).
Eine Spatelspitze der 11- oder 12-RCA wurden in 0,5 ml Aceton,
Ethanol, THF, Dioxan und 5,5 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5,
0,1 M) gelöst. Zu den als Lösungsvermittler fungierenden
organischen Lösungsmitteln wurde 5 ml Kaliumphosphatpuffer (pH
7,5, 0,1 M) gegeben. Nach Zugabe von 5 nmol P450 wurde 10
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und das P450 BM-3 durch
Zugabe von 200 µl NADPH (50 µM) reduziert. Nach einer Stunde
wurden 200 µl der jeweiligen Reaktionsansätze in eine
Mikrotiterplatte überführt. In der zweiten Reihe sind
zusätzlich entsprechende Blindproben ohne NADPH-Zugabe
pipettiert.
Mittels SDS-PAGE können Proteine nach ihrer Größe aufgetrennt
werden. Gereinigte Proteinproben wurden vor der
Gelelektrophorese 1 : 1 mit SDS-Probenpuffer (Tris/HCl 500 mM,
pH 6,8, Glycerin 10% (v/v), SDS 20% (w/v), Mercaptoethanol 2
(w/v), Bromphenolblau 0,05%) vermischt und 5 min zur
Proteindenaturierung auf 95°C erhitzt. Zur Analyse der
Proteinexpession in E. coli Zellen wurden nach fünfstündiger
Induktionsphase (OD578 = 1,5-2,0) 1 ml der Kultur abpipettiert
und bei 12 000 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 100 µl
des Probenpuffers aufgeschlossen und 1 min bei 12 000 g
zentrifugiert. Nach Abkühlen der Proteinproben auf Eis
erfolgte die Proteinauftrennung im Elektrophoresepuffer (9,0 g
Tris, 43,2 g Glycerin, 3,0 g SDS, ddH2O ad 600 ml) bei 25 mA
pro Gel.
Als Proteinstandards dienten ein Niedermolekulargewichts-
Marker (Phosphorylase B 97,4 kDa, BSA 66,3 kDa, Ovalbumin 45,0
kDa, Carboanhydrase 31,0 kDa, Trypsininhibitor 21,5 kDa,
Lysozym 14,4 kDa) und ein Hochmolekulargewichts-Kit (Myosin
200 kDa, β-Galaktosidase 116,25 kDa, Phosphorylase B 97,4 kDa,
BSA 66,3 kDa, Ovalbumin 45 kDa) von Bio-Rad (Richmond, USA).
Zur Proteintrennung wurde ein 7,5 prozentiges Trenngel (2,5 ml
Tris/HCl (1,5 M, pH 8, 8), 100 µl SDS (10% (m/v), 2,5 ml
Acrylamid : N,N'-Methylenbisacrylamid 30 : 1 (Roth), 50 µl
APS, 5 µl TEMED) und 4 prozentiges Sammelgel (1 ml
Sammelgelpuffer (12,11 g Tris, 0,8 g SDS, ad H2O 200 ml, pH
6,8 mit HCl eingestellt), 0,52 µl Acrylamid : N,N'-Methylen
bisacrylamid 30 : 1 (Roth), 40 µl APS 10% (w/v), 4 µl TEMED
verwendet. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die
aufgetrennten Proteine drei Stunden lang unter langsamem
Schütteln mit Färbelösung (0,1% Coomassie Brilliant Blue
R250, 10% (v/v) Essigsäure, 30% Methanol) blau gefärbt. Die
Inkubation in Entfärbelösung (10% (v/v) Essigsäure, 30
Methanol) erfolgte bis deutliche Proteinbanden sichtbar
wurden. Zur Dokumentation wurde das Gel luftblasenfrei
zwischen ein Cellulose-Filterpapier und eine Kopierfolie
gelegt und zwei Stunden im Geltrockner (Bio-Rad, Model 583)
bei 80°C unter Hausvakuum getrocknet.
Proteinkonzentrationen wurden mittels des Bicinchoninsäure-
(BCA) Protein-Nachweissystems von Pierce (St. Augustin,
Deutschland) spektrometrisch bei 562 nm nach Herstellerangaben
entsprechend dem Standardprotokoll bestimmt. Kalibiergeraden
wurden mit BSA-Verdünnungen aufgenommen.
Alle spektroskopischen UV-Vis Nachweise wurden unter aeroben
Bedingungen in einem Pharmacia Spectrophotometer, Modell
BioChrom4060 (APB, Uppsala, Schweden), mit BioChrom4060
Windows 3.11 Software v2.0 durchgeführt.
P450 BM-3 Konzentrationen wurden mittels der CO-
Differenzspektroskopiemethode (Omura et al. 1964) und einem
Extinktionskoeffizienten von ∈ = 91 mM-1 . cm-1 bei einer
Vorschubgeschwindigkeit von 125 nm/min in 0,1 nm Intervallen
bestimmt. Dazu wurde zu 5 ml phosphatgepuffertem (20 mM, pH
7,3 bis 7,5) P450 BM-3 Rohextrakt eine Spatelspitze
Natriumdithionit und 10 µl einer 0,1 prozentigen (w/v)
wäßrigen Methylviologen-Lösung gegeben. Die abhängig von der
P450 BM-3 Konzentration tiefblaue bis blaugrüne Probe wurde in
zwei Fraktionen aufgeteilt. Eine der beiden Fraktionen wurde
eine Minute lang mit CO begast, wobei Schaumbildung zu
vermeiden ist, die andere dient als Referenz für die
differenzspektroskopische Messung.
Die Messungen wurden bei Raumtemperatur in 0,1 M
Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 durchgeführt, wobei die
Absorptionszunahme bei 550 nm mit g = 8,9 mM-1 (Fulco et al.
1992) gemessen wurde. 1 ml Probe enthielten 50 nmol Cytochrom
c (aus Pfexdeherz), 100 nmol NADPH und eine aus Tabelle 6
ersichtlichen Menge P450 BM-3. Als Referenz diente dieselbe
Probe vor NADPH-Zugabe. Die Lösungen wurden frisch bereitet
und bis zur Benutzung am selben Tag auf Eis gelagert. Zur
Messung der Reduktaseaktivität von P450 BM-3His6 wurde zur
Cytochrome-c-Lösung nach fünfminütiger Inkubation die NADPH-
Lösung gegeben.
Zur Messung der kinetischen Konstanten sowie der pH- und
Temperaturstabilität wurde gereinigtes P450 BM-3 F87A
verwendet. Für alle anderen Bestimmungen wurde zentrifugierter
und filtrierter klarer Rohextrakt verwendet. Für alle
Experimente wurden pro Ansatz 0,05-0,2 nmol P450 BM-3 oder
P450 BM-3 F87A in einem Gesamtvolumen von 1 ml und 8 µl 5-15
mM pNCA-Lösung verwendet. Mit Ausnahme der
Lösungsmittelversuche wurden Charakterisierungsexperimente in
1 ml Einwelt-Plastikküvetten durchgeführt. Sofern nicht anders
beschrieben, wurden die Versuche bei Raumtemperatur
durchgeführt.
Die kinetischen Konstanten wurden nach Zugabe von 792 µl
Tris/HCl (pH 8,2, 0,2 M) und 100 µl P450 BM-3 zu 8 µl DMSO-
Substratlösung unterschiedlicher Substratkonzentration
ermittelt. Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur
wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 µl 1 mM NADPH-Lösung
gestartet.
Die Messung der Lösungsmittelstabilitäten erfolgte in
Glasküvetten (Hellma, Modell 6040) bestimmt, wobei die
Substratlösung statt in DMSO in Aceton, Dioxan, THF und
Ethanol gelöst wurde. Die Bestimmungen wurden entsprechend der
bei den kinetischen Messungen beschriebenen Vorschrift
durchgeführt; jedoch wurde in Unterschied dazu der Anteil des
Puffers entsprechend der verwendeten Lösungsmittelmenge
variiert.
Die Messung der pH-Stabilität wurden bei 30°C im Stratagene
Robocycler (Modell gradient40) in dünnwandigen 0,5 ml PCR-
Reaktionsgefäßen (Stratagene) durchgeführt. Zu 0,1-0,2 nmol
P450 BM-3 wurden 392 µl phosphatgepufferter Lösung (50 mM, pH
4-10) gegeben. Nach dem Inkubationszeitraum wurde die P450 BM-
3 Lösung in eine Küvette überführt und 500 µl Tris/HCl (0,3 M,
pH 8,2) und 8 µl 12-pNCA (6 mM) hinzugegeben. Nach
fünfminütiger Inkubation wurde die Reaktion mittels 100 µl
NADPH-Lösung (1 mM) gestartet. Die Temperaturstabilität wurde
bei einem pH-Wert von 7,5 unter den gleichen Bedingungen wie
die pH-Stabilität untersucht.
Die Auswirkungen dieser Verbindungen auf die P450 BM-3 F87A
Aktivität sind in Analogie zu den kinetischen Untersuchungen
durchgeführt worden, wobei ein variierter Teil des Puffers
durch die im selben Puffersystem gelöste Untersuchungssubstanz
ersetzt wurde.
Für den automatisierten Aktivitätsnachweis von P450 BM-3 F87A
wurden Mikrotiterplatten mit 96 Reaktionskammern (Greiner
Frickenhausen, Deutschland) gewählt. Das
Gesamtreaktionsvolumen betrug 250 µl in einer Tris/HCl-Puffer
(0,1 M, pH 8,2) mit 18 nmol 10- und 11-pNCA, 12 nmol 12-pNCA
oder 10 nmol 15-pNCA, die in 2,2 µl DMSO gelöst waren. Für die
Pipettierarbeiten wurde eine Biomek2000 Pipettierroboter
(Beckman Instruments, Fullerton, USA) verwendet. Nach
fünfminütiger Inkubationszeit mit 0,02 nmol P450 BM-3 F87A
wurde die Reaktion gestartet durch Einspritzen von 25 µl einer
wäßrigen NADPH Lösung (1 mM) in jede Reaktionskammer. In einem
FluoStar-Mikrotiterplattenleser (BMG LabTechnology, Offenburg,
Deutschland) wurde der Reaktionsablauf bei 405 nm absortiv
verfolgt.
Für Aktivitätsuntersuchungen wurde verfahren wie für die
kinetischen Messungen beschrieben, nur daß statt NADPH
variierte wäßrige Wasserstoffperoxidmengen zugegeben wurden.
Bei den Stabilitätsuntersuchungen wurden 0,05-0,1 nmol P450
BM-3 F87A in Abwesenheit von pNCA-Substrat mit variierten
Wasserstoffperoxidmengen fünf Minuten inkubiert. Nach Zugabe
von Katalase (600 U) und einer weiteren fünfminütigen
Inkubationszeit wurden zur Reaktionslösung 60 nmol 12-pNCA-
Substrat pipettiert. Die Reaktion wurde fünf Minuten später
durch Zugabe von 100 µl NADPH (1 mM) gestartet.
Die Reaktionen wurden in einer Schüttelapparatur für
Eppendorf-Reaktionsgefäß-Schüttler (IKA-Labortechnik Vibrax
mit Janke und Kunkel Aufsatz Typ VX2E) durchgeführt. Für
Aktivitätsuntersuchungen wurde verfahren wie für die
kinetischen Messungen beschrieben, nur wurden anstelle von
NADPH variierte Mengen an Zink/Cobalt(III)sepulchrat benutzt.
Nach variierten Zeitintervallen wurden 100 µl Probe der
Reaktionssuspension entnommen und in ein weiteres 1,5 ml
Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert, in dem zum Reaktionsstop
10 µl KOH (6 M) vorgelegt waren. Nach einminütiger
Zentrifugation bei 12000 g wurde der Überstand abgenommen und
die Absorption bei 410 nm gemessen.
Das P450 BM-3 Gen wurde mittels PCR aus der genomischen DNA
von Bacillus megaterium isoliert, mit Tags versehen und wie in
Fig. 1 für die pT-Plasmide gezeigt, in die
Expressionsvektoren pCYTEXPl und pASK-IBAICA kloniert. Zur
Überprüfung der korrekten Insertion des P450 BM-3 Gens, der
mit unterschiedlichen Tags versehen P450 BM-3 Varianten und
zur Überprüfung der P450 BM-3 F87A Punktmutante wurden die
Sequenzierprimer R0_5 bis L7 verwendet. Für die PCR-Reaktionen
nach dem Standard-Protokoll wurden für das Wildtyp-Enzym die
Primer B1 und B2, für die P450 BM-3His6 die Primer H1 und H2,
für P450 BM-3Glu6 die Primer G1 und G2, für P450 BM-3Arg6 die
Primer A1 und A2 und für P450 BM-3Strep die Primer S1 und S2
verwendet. Die Sequenzanalyse ergab keinerlei Mutantionen für
einen aus jeweils drei sequenzierten pT-USCOBM3- und pT-
USC1BM3-Plasmiden. Für pT-USC2BM3 und pT-USC3BM3 wurde nur mit
Primer R7 die korrekte Insertion des Tags überprüft. Der
sequenzierte pA-USC4BM3-Klon zeigte zwei Mutationen im
Reduktaseanteil des P450 BM-3 Proteins. Die Expressionsrate
des mit einem His6-Tag versehen P450 BM-3 in DH5α war mit
Werten von 300 nmol pro Liter Fermenterbrühe um ca. 20% höher
als beim Wildtyp. Aufgrund dieser höheren Expressionsrate
wurde pT-USC1BM3 zur Erhöhung der Sensitivität des pNCA-Tests
an Position 87 durch Austausch eines Phenylalanins gegen
Alanin mit den Stratagene QuikChange-Kit punktmutiert. Durch
die PCR-Reaktion mit den Primern F87A1 und F87A2 enthält pT-
USC1BM3F87A an der Mutationsposition ohne weitere Veränderung
der Proteinsequenz eine zusätzliche EaeI-
Restriktonsschnittstelle, die zur Selektion des zur
Sequenzierung ausgewählten Klons verwendet wurde. Diese
zusätzliche Restriktionsschnittstelle führt nach
Restriktionsspaltung mit EaeI zum Auftreten einer neuen Bande
bei ca. 800 bp in Spur 2 und einer gegenüber dem Wildtyp-
Verdau in Spur 1 deutlich kleineren Bande bei 1,7 kbp. Nach
Plasmidisolation wurden acht Klone mit EaeI verdaut (2 µl
EaeI-Puffer (10×), 1 µl EaeI 3,2 µl pT-USC1BM3, ad 20 µl
ddH2O, 1 h bei 37°C). Ein Klon wurde sequenziert. Das pT-
USC1BM3F87A Plasmid besitzt in der Linker-Region an Position
470 eine zusätzliche Mutation R470C. Auf eine Rückmutation
wurde verzichtet aufgrund der Lokalisation der Mutation R470C
am Ende der Linker-Region, die den P450-Anteil des P450 BM-3
mit dem Reduktaseanteil verbindet und keinerlei Einfluß auf
die P450 BM-3 Aktivität zeigt.
Ziel war es, eine kostengünstige, rasche und im präparativen
Maßstab durchführbare Methode zur Reinigung von P450 BM-3 und
P450 BM-3 F87A zu entwickeln. Dazu wurde ein Arg6-, His6-,
Glu6- und Strep-Tag an das C-terminale Ende von P450 BM-3
angefügt. Auf der Basis des His6- und Strep-Tag sollten
Affinitätsreinigungen und auf Basis des Arg6- und Glu6-Tags
chromatographiesche Reinigungen mit Ionenaustauschern
entwickelt werden. Ein Einfügen eines Tags an das N-terminale
Ende des P450 BM-3 Gens wurde wegen der Lokalisation des
N-Terminus im Bereich des flexiblen Substrateingangskanals
nicht in Betracht gezogen. Eine Modifikation in diesem Bereich
würde mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer Änderung der P450
BM-3 Aktivität und Selektivität führen.
Bei der P450 BM-3His6-Reinigung über
Metallchelatchromatographie binden mehr als 95% der
aufgetragenen 4 mg P450 BM-3 nicht an die 20 ml XK16/20-
Affinitätssäule bei einem linearen 0-0,5 molaren
Imidazolgradienten (10 CV). Die chromatographische Reinigung
mit Zn2+-Ionen wurde nach dem Pharmacia-Standardprotokoll
durchgeführt. Das wenige aufgereinigte P450 BM-3 zeigte im
NADPH-Assay keine Aktivität mehr. Die Ursache dieser
Inhibierung konnte auf den Einfluß von Imidazol zurückgeführt
werden. Imidazol bewirkt ein Ablösen des fünften Cysteinat-
Liganden am katalytischen Häm-Zentrum. Diese Abdissoziation
des fünften Liganden vom Häm-System führt zur sofortigen P450-
Inaktivierung und zeigt sich im CO-Differenzspektrum durch
eine charakteristische Verschiebung des Absorptionsmaximums
von 448 nm nach 420 nm.
Zur Aufreinigung wurden 8,2 mg P450 BM-3Strep verwendet.
Vergleichbar den Ergebnissen der His6-Tag Reinigungen zeigte
P450 BM-3Strep keine Bindung an die Strepavidin-
Affinitätsmatrix bei der Reinigung entsprechend dem READY TO
USE KIT (IBA, Göttingen).
Ein Vergleich der linearen 0-1 M NaCl-Gradienten (12 CV,
Tris/HCl Puffer (0,1 M, pH 8,0)) zeigte für P450 BM-3Glu6 bei
Verwendung von Super 650M- und DEAE 650M-Anionenaustauschern
keine Unterschiede im Elutionsverhalten zum Wildtyp-Enzym.
Die Ergebnisse der Reinigung von P450 BM-3 mit His6-, Glu6- und
Strep-Tag lassen darauf schließen, daß das C-terminale Ende
von P450 BM-3 nicht frei zugänglich an der Proteinoberfläche
liegt und somit nicht für Reinigungszwecke verwendbar ist,
Ferner verursachte im Falle des His6-Tags die Elution mittels
Imidazol eine rasche Proteininaktivierung durch Verdrängung
des fünften Liganden am Porphyrin-System.
Um die Kosten zu minimieren, sollte eine effektive,
kostengünstige und zeitsparende Reinigungsmethode für P450 BM-
3 entwickelt werden, die eine einfache Maßstabsvergrößerung
erlaubt. Als Methoden zur P450 BM-3 Reinigung standen nach den
Ergebnissen der Reinigung von P450 BM-3 mit Tags somit noch
nur HIC-Materialien und Ionenaustauscher zur Verfügung. Die
Entscheidung fiel zugunsten der Anionenaustauscher, die in der
Regel billiger sind und ein einfacheres Handling bieten.
Um eine Anionenaustauschchromatographiemethode zu entwickeln
wurden vier unterschiedlich starke
Anionenaustauschermaterialien DEAE 6505 (35 µm), DEAE 650M (65
µm), SuperQ 650M (65 µm) und QAE 550M (65 µm) auf ihre
Eignung hin untersucht. In ersten Experimenten wurde mit jedem
Säulenmaterial ein 10-Säulen-Volumen (CV) langer linearer 0-1
M NaCl-Gradient zur Reinigung von 6-10 mg P450 BM-3 Rohextrakt
in einem Tris/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,8) aufgenommen. In
allen Fällen betrug die Ausbeute 80-84%. Die höchsten
Proteinanteile im P450 BM-3 Elutionspeak zeigte das DEAE-
Material, dicht gefolgt vom SuperQ- und QAE-Material.
Für die weitere Verbesserung der Auflösung mittels gestufter
Salzgradienten war die Fähigkeit des ÄKTAexplorer-Systems
hilfreich, gleichzeitig Leitfähigkeit und Absorption bei 280
nm und 417 nm aufzuzeichnen. Ein optimierter Zwei-Stufen-
Salzgradient für die DEAE 650M Chromatographiesäule besitzt
eine erste Stufe von 150 mM NaCl und eine zweite mit 250 mM
NaCl. Die P450 BM-3 Elution beginnt, wie aus den
Leitfähigkeitswerten des linearen NaCl-Salzgradienten
ablesbar, bei einer Erhöhung der NaCl-Konzentration von 150 mM
auf 170 mM. Die minimale obere Salzstufe wurde zu 250 mM NaCl
ermittelt; NaCl-Konzentrationen < 230 mM verursachen eine
Verbreiterung des P450 BM-3 Elutionspeaks, und NaCl-
Konzentrationen < 300 mM führen zu einem deutlich schlechteren
Reinigungseffekt. Die Salzstufen wurden für die
Chromatographiematerialien SuperQ 650M und QAE 550M in
vergleichbarer Weise optimiert.
Ein Vergleich des linearen DEAE 650M mit dem gestuften NaCl-
Gradienten führt zu einer Erhöhung des P450 BM-3
Proteinanteils im Elutionspeak von 39% beim linearen, auf 84%
beim gestuften Gradienten. Vergleichbare Ergebnisse wurden
mit dem SuperQ 650M Chromatographiematerial erreicht; das QAE
550M Chromatographiematerial zeigte deutlich schlechtere
Reinigungsergebnisse. Bei den gestuften Reinigungsmethoden
lagen die Ausbeuten in allen Fällen bei < 78%; die höchsten
Ausbeuten von 93% an P450 BM-3 im Elutionspeak wurden mit
DEAE 650S erzielt.
Ziel war es einen spektrometrischen oder fluorimetrischen
Aktivitätsnachweis für P450 BM-3 zu entwickeln. Ein solcher
Aktivitätsnachweis kann im Gegensatz zu Standardmethoden wie
HPLC oder GC einfach automatisiert und somit zum Auffinden von
weiteren P450 BM-3 Enzymvarianten verwendet werden.
Um einen neuen Aktivitätsnachweis für P450 BM-3 zu entwickeln,
wurden verschiedene Verbindungen, die am terminalen C-Atom der
Carbonsäuren das Chromophor tragen, synthetisiert und auf ihre
Eignung untersucht.
Arbeiten von Oliver et al. Biochemistry (1997), 36(7): 1567
zeigten für Laurinsäure und Myristinsäure als Substrat eine
Verschiebung des Hydroxylierungsprofils von P450 BM-3 von
subterminalen Positionen zur terminalen Position, falls
Phenylalanin an Position 87 durch Alanin ersetzt wurde. Zur
Erhöhung der Sensitivität der pNCA-Nachweismethode wurde diese
Punktmutation, wie in Material und Methoden beschrieben,
eingefügt und mittels Sequenzanalyse bestätigt.
Fig. 2 zeigt das Prinzip zu einem spektrometrischen
Aktivitätsnachweis für terminal hydroxylierende
Fettsäurehydroxylasen. Nach terminaler Hydroxylierung entsteht
ein instabiles Halbacetal, das in die w-Oxycarbonsäure und das
spektrometisch detektierbare Chromophor dissoziert.
Die PCA-Verbindungen wurden in einer einstufigen Synthese, wie
in Referenzbeispiel 5 beschrieben, ausgehend von ω-
Bromcarbonsäuren synthetisiert. Die Synthesen gelangen in
Gesamtausbeuten zwischen 76 und 78%. Charakterisiert wurden
die PCAs mittels 1H-NMR, 13C-NMR und Schmelzpunktbestimmung.
Um die Phenolbildung spektroskopisch nachweisen zu können,
bietet es sich an, die Absorption im Wellenlängenbereich
zwischen 250 und 280 nm zu messen (Luchter-Wasylewska 1996).
Der geringe Extinktionskoeffizient am Absorptionsmaxium bei 274
nm von g = 1090 M-1cm-1, das unterschiedliche Absorptionsverhalten
von NADPH und NADP+ in diesem Wellenbereich und die Bildung von
Wasserstoffperoxid in ungekoppelten Reaktionen verhinderten
jedoch eine kontinuierliche spektroskopische Messung der
Phenolbildung. Aus diesen Gründen wurde der Merck-Phenol-
Nachweis Kit, zur Quantifizierung der Produktbildung verwendet.
Mit NADPH als Cofaktor ergaben sich bei Verwendung der P450 BM-
3 Mutante F87A für 12-PCA Umsatzgeschwindigkeiten von 640
eq/min und für 11-PCA von 410 eq/min.
Die pNCA-Verbindungen wurden in einer neuen, dreistufigen
Synthese, wie in Referenzbeispiel 5 beschrieben, ausgehend von
ω-Bromcarbonsäuren durch Veresterung, sich anschließender sn2-
Reaktion mit dem Natrium-p-Nitrophenolat und
lipasekatalysierter Hydrolyse der Ester, synthetisiert. Die
dreistufigen pNCA-Synthesen gelangen in Gesamtausbeuten
zwischen 61 und 69%. Charakterisiert wurden die pNCAs mittels
1H-NMR, 13C-NMR und Schmelzpunktbestimmung.
In Fig. 2 ist das Reaktionsprinzip der Umsetzung von pNCA-
Substraten durch P450 BM-3 und P450 BM-3 F87A beschrieben. Für
die Aktivitätsmessungen mußten pH-Wert und Wellenlänge des
spektroskopischen Nachweissystems optimiert werden. Nur
deprotoniertes p-Nitrophenolat (pKs-Wert 7,1) trägt zur gelben
Farbe bei; für die Nachweisempfindlichkeit wäre somit ein pH-
Wert <9,1 (<99% deprotoniert) empfehlenswert. Die pNCA-
Verbindungen sind in stark alkalischen Lösungen stabil, im
Gegensatz zum P450 BM-3 Protein, das bei pH 10 und 30°C
innerhalb von 5 min 80% seiner Aktivität verliert. Als
Kompromiß zwischen Proteinstabilität und Sensitivität der
Nachweismethode wurde ein pH-Wert von 8,1 bis 8,2 gewählt.
Berechnungen auf der Basis der Henderson-Hasselbach-Gleichung
zeigen, daß in diesem pH-Bereich 90-92% des umgesetzten p-
Nitrophenols deprotoniert sind und zur gelben Farbe beitragen.
Das Absorptionsmaximum von p-Nitrophenolat liegt bei 400 nm.
Bei dieser Wellenlänge absorbieren jedoch auch das Häm-Zentrum
und der Cofaktor NADPH. P450 BM-3 besitzt ein starkes
Absorptionsverhalten zwischen 350 und 450 nm, das in
Abhängigkeit von Substratbindung und Oxidationsstufe des Eisens
im katalytischen Zentrum stark schwankt. Das
Absorptionsspektrum von NADPH begrenzt den Wellenlängenbereich
auf <390 nm. Die Wellenlänge 410 nm wurde aufgrund der
Reproduzierbarkeit letztendlich zur Aktivitätsmessung
ausgewählt. Falls die Sensitivität des Nachweissystems nicht
ausreichend ist, sollte bei Wellenlängen im Bereich von 400 nm
gearbeitet werden. Unter den gewählten Nachweisbedingungen (pH
8,2, 410 nm) wurde der Extinktionskoeffizient bestimmt zu
e = 13 200 M-1cm-1.
pNCAs besitzen nur eine geringe Wasserlöslichkeit, so daß ein
Lösungsvermittler benötigt wird. Dazu kann DMSO ohne
Beeinflussung der P450 BM-3 F87A Aktivität bis zu
Konzentrationen von 1% (v/v) zugegeben werden. 0,8% (v/v)
DMSO wurden deshalb als Lösungsvermittler im
Aktivitätsnachweissystem verwendet.
Der Zeitbedarf des pNCA-Nachweissystems hängt stark von der
verwendeten Enzymmenge ab. Falls nmol-Mengen an P450 BM-3 F87A
im pNCA-Aktivitätsnachweis eingesetzt wurde, war 1 min zum
Aktivitätsnachweis ausreichend.
Für den Einsatz in einer HTS-Um 09472 00070 552 001000280000000200012000285910936100040 0002019935115 00004 09353gebung wurde der pNCA-
Aktivitätsnachweis unter Benutzung einer Biomek2000
Arbeitsstation und eines BMG FluoStar Mikrotiterplattenleser
automatisiert. Unter Verwendung von P450 BM-3 und der Mutante
F87A wurde in jeweils 16 Messungen mit den pNCA-Substraten 10-,
11-, 12- und 15-pNCA die Reproduzierbarkeit des Assaysystems
untersucht. Bei den Gesamtabsorptionen gab es aufgrund von
Pipettierungenauigkeiten Unterschiede um den Faktor zwei bis
vier, die Reaktivitätsunterschiede schwankten jedoch nur
zwischen 2 und 6%. Die beste Reproduzierbarkeit wurde für die
P450 BM-3 F87A Mutante erzielt mit Abweichungen ~2% und die
schlechteste für den Wildtyp und 15-pNCA mit Abweichungen von
bis zu 6% vom Mittelwert aller Messungen. Ursächlich für die
Genauigkeitsunterschiede sind die unterschiedliche Löslichkeit
der pNCA-Substrate und verschiedene Umsätze in Abhängikeit von
der Kettenlänge.
Die F87A Mutante setzt 12-pNCA vollständig um, während das
Wildtyp-Enzym nach 33% stoppt. Die Ursache liegt vermutlich in
subterminal hydroxylierten 12-pNCA-Verbindungen, die nicht mehr
oder nur noch langsam weiter umgesetzt werden. Für P450 BM-3
und P450 BM-3 F87A sind das pNCA-Kettenlängenprofil und der
Umsatz aus w-Hydroxylierung der pNCAs, berechnet aus dem
Quotienten von beobachteten zu gemessener Gelbfärbung der
Lösung in den folgenden Tabellen 4 und 5 zusammengefaßt.
Zusätzlich wurden für P450 F87A die kinetischen Daten aus den
Lineweaver-Burk-Diagrammen ermittelt.
Ein Haupthindernis der industriellen Nutzung von P450-Systemen
sind die Kosten, die der Cofaktor NADPH verursacht. Zur Lösung
des Kostenproblems wurde ein alternatives Cofaktor-Konzept
entwickelt, bei dem NADPH durch Zink und den Mediator
Cobalt(III)sepulchrat ersetzt wurde; Zink dient als
Elektronenquelle und Cobalt(III)sepulchrat als
Elektronentransportsystem vom Zink zum P450 BM-3.
Cobalt(III)sepulchrat besitzt unter Standardbedingungen ein
Normalpotential von -0,54 V gegen eine Kalomel-Elektrode
(Creaser et al., J. Am. Chem. Soc. (1977) 99: 3181). Es läßt
sich, wie in Abb. 48 gezeigt, mittels Zn-Staub in einem
Tris/HCl-Puffer (0,2 M, pH 8,2) innerhalb von Sekunden
reduzieren. In Gegenwart von Luftsauerstoff in wäßrigen
Lösungen wird es innerhalb weniger Minuten wieder zu
Cobalt(III)sepulchrat oxidiert.
Fig. 4 zeigt die Umsetzung von 12-pNCA mittels des
Zn/Cobalt(III)sepulchrat/P450 BM-3 F87A Systems. Bei einem
Absorptionsmaximum von 0,8 nach 8 min zeigt das
Zn/Cobalt(III)sepulchrat/P450 BM-3 F87A System eine gelbe
Farbe, die einem 70%igen Umsatz entspricht. Innerhalb von 20
min verschwindet die durch p-Nitrophenolat verursachte gelbe
Farbe völlig; der Restabsorptionswert von 0,15 stammt vom
Mediator. Kontrollexperimente zeigten, daß Zn-Pulver die
Nitrogruppe von p-Nitrophenolat im Tris/HCl-Puffer (pH 8,2,
50 mM, 0,25 M KCl) reduziert. Weitere Kontrollexperimente
zeigten, daß Wasserstoffperoxid keinen oxidativen Einfluß auf
p-Nitrophenolat und pNCAs hat.
In Fig. 5 sind die beschriebenen Elektronentransferwege von
Zn über den Mediator zum P450 BM-3 und der Substratumsetzung
unter Berücksichtigung des verkürzten Wasserstoffperoxid-
Reaktionswegs ("shunt-pathway") dargestellt.
Aufgrund der Reduktion von p-Nitrophenol durch Zink in einem
Tris/HCl-Puffer wurde 12-pNCA durch 12-PCA ersetzt. Der
Phenolnachweis erfolgte mittels des Merck-Phenolnachweis-Kits
bei 495 nm. Ein direkter photometrischer Phenolnachweis bei
274 nm ist aufgrund des Absorptionsverhaltens des oxidierten
und reduzierten Cobalt(III)sepulchrat nicht möglich. Fig. 6
verdeutlicht für 12-PCA als Substrat eine im Vergleich zu 12-
pNCA langsame Entfärbung (Fig. 4). Als Ursache für die
Absorptionsabnahme konnte Wasserstoffperoxid identifiziert
werden, das durch reduziertes Cobalt(II)sepulchrat in
Nebenreaktionen durch Reduktion von Luftsauerstoff in wäßrigen
Lösungen gebildet wird. Ferner tritt Wasserstoffperoxid-
Bildung bei P450-Systemen infolge von ungekoppelten Reaktionen
als Nebenreaktionsprodukt immer auf. Aus letzterem Grund wurde
eine weitere Optimierung der PCA-Reaktionsbedingungen nicht
weiter verfolgt.
In Gegenwart von 600 U Katalase erfolgt, wie in Fig. 6
gezeigt, die Absorptionsabnahme bei 495 nm deutlich langsamer.
Um die Entfärbung der Lösung durch die Reduktion von p-
Nitrophenolat mittels Zink zu vermeiden, wurde zunächst
erfolglos die KC1-Konzentration und der pH-Wert im Rahmen der
P450 BM-3 F87A Stabilität variiert (6,5-8,5). Erfolgreich, wie
in Fig. 7 gezeigt, kann die Reduktion von p-Nitrophenol durch
Zink mittels Zusätzen an Kaliumphosphat-Puffer verhindert
werden. Ab einem Kaliumphosphatanteil ≧ 10% wird p-
Nitrophenol nur noch in geringem Ausmaß (≦ 10%) durch Zn
reduziert und bei einer 1 : 1 Mischung ist selbst nach 14 h
keine weitere Reduktion mehr feststellbar (nicht abgebildet).
Wie in Fig. 7 gezeigt, verringert sich der Anteil an
reduziertem Co(II)sepulchrat im Mischungsbereich bis zu 20
Kaliumphosphat zunächst deutlich um ca. ~25%, um dann
zwischen 20 und 70% (v/v) Kaliumphosphat-Anteil konstant
zwischen 60 bis 70% zu verharren. Die im Vergleich zum
Tris/HCl-Puffersystem geringere Verfügbarkeit an reduziertem
Cobalt(II)sepulchrat führt zu einem Aktivitätsverlust von ca.
15%.
Aus obigen Ergebnissen wurde für die weiteren Optimierungen
eine 1 : 1 Mischung beider Pufferlösungen verwendet.
Fig. 8A zeigt den Einfluß des Cobalt(III)sepulchrat Mediators
auf die P450 BM-3 Aktivität im NADPH-Assay bei variierten
Mediatorkonzentrationen. Bei Cobalt(III)sepulchrat-
Konzentrationen ≧ 5 mM bildete sich während des
Reaktionsablaufs ein kolloidaler Niederschlag, der vor
Absorptionsmessung mittels Zentrifugation abgetrennt wurde.
Für Umsetzungen mit dem Zink/Cobalt(III)sepulchrat-System ist
eine optimale Cobalt(III)-sepulchrat-Konzentration im Bereich
von 0,5-0,75 mM pro 0,072 nmol P450 BM-3 F87A vorhanden. Wie
in Fig. 8B gezeigt, inhibiert Cobalt(III)sepulchrat bis zu
Konzentrationen ≦ 0,5 mM P450 BM-3 F87A selbst in Abwesenheit
von Substrat nur geringfügig. Der Inhibierungsgrad bleibt bei
variierten Inkubationszeiten konstant und hängt nur vom
Konzentrationsverhältnis Cobalt(III)sepulchrat zu P450 BM-3
F87A ab.
Die Abhängigkeit des Umsatzes von 0,072 nmol P450 BM-3 F87A
von der eingesetzten Zinkpulvermenge ist in Fig. 9 gezeigt.
Ein optimaler Umsatz wurde im Bereich von 20 bis 40 mg Zink
pro Milliliter Reaktionslösung erzielt. Für die
Umsatzrückgänge bei 50 und 100 mg war vermutlich eine
abnehmende Sauerstoffkonzentration in der Reaktionslösung
durch zunehmende mediatorkatalysierte
Wasserstoffperoxidbildung verantwortlich.
Ein Ersatz von Zinkpulver durch Zinkgranalien führte selbst
bei Verwendung von 100fach erhöhten Mengen nur zu sehr
geringen Umsatzgeschwindigkeiten (Faktor <20 geringer).
Um den Anteil den Wasserstoffperoxid über den 'shuntA
Reaktionsweg zur 12-pNCA- Umsetzung durch P450 BM-3 F87A
beiträgt, zu bestimmen, wurden 12-pNCA und P450 BM-3 F87A mit
variierten Wasserstofferperoxid-Konzentrationen inkubiert. Im
Bereich von 8-20 µM Wasserstoffperoxid wird bei vergleichbaren
P450 BM-3 F87A Aktivitäten nach einer Minute bei einem 20-
25%igen Umsatz eine Plateau erreicht, unabhängig von der
Wasserperoxid-konzentration. Die weitere Zugabe von NADPH im
Überschuß (100 µM) zeigt, daß P450 BM-3 F87A durch
Wasserstoffperoxid nicht vollständig inaktiviert wird. Die
Restaktivitäten sind bei geringen Wasserstoffperoxid-
Konzentration hoch und sinken mit zunehmender
Wasserstoffperoxid-Konzentration (nicht gezeigt).
Um die Stabilität von P450 BM-3 gegenüber Wasserstoffperoxid
zu bestimmen, wurde P450 BM-3 F87A in Abwesenheit von Substrat
(12-pNCA) 5 min mit variierten Wasserstoffperoxidmengen
inkubiert. Nach Zugabe von Katalase (600 U) und 60 nmol
Substrat wurden die Umsatzgeschwindigkeiten unter Verwendung
von NADPH als Elektronendonor bestimmt.
Wie in Fig. 10 gezeigt, inhibieren in Abwesenheit von
Substrat bereits Wasserstoffperoxid-Konzentrationen im 5 µM-
Bereich die P450 BM-3 F87A Aktivität deutlich. Als Konsequenz
ergibt sich hieraus für einen P450 BM-3 F87A Enzym-Membran-
Reaktor, bei möglichst hohen Substratkonzentrationen zu
arbeiten und die Wasserstoffperoxidbildung durch Katalase-
oder Anti-Oxidant-Zugabe zu minimieren.
Claims (21)
1. Elektronendonorsystem für die Übertragung von Elektronen
auf Enzyme mit Redox-Eigenschaften, dadurch
gekennzeichnet, daß das System eine anorganische, nicht
elektrodengebundene Elektronenquelle und einen Mediator
umfaßt, der zur Übertragung von Elektronen von der
Elektronenquelle auf das Enzym befähigt ist.
2. Elektronendonorsystem nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym ein Cytochrom P450-haltiges
Enzym ist.
3. Elektronendonorsystem nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym eine Monoxygenase (E. C.
1.14.-.-) ist.
4. Elektronendonorsystem nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mediator ein
Standard-Normalpotential im Bereich von weniger als etwa
-0,4 V besitzt.
5. Elektronendonorsystem nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mediator
ausgewählt ist unter Kobalt(III)sepulchrat,
Methylviologen, Neutralrot, Riboflavin,
Rutheniumtriacetat, FMN und FAD.
6. Elektronendonorsystem nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Elektronenquelle ein Metall mit einem niedrigeren
Standard-Normalpotential als der Mediator ist.
7. Elektronendonorsystem nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die Elektronenquelle metallisches Zink
ist.
8. Elektronendonorsystem, nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, ausgewählt unter den Systemen:
- - Zn/Kobalt(III)sepulchrat und
- - Zn/Neutralrot.
9. Verfahren zur enzymatischen Übertragung von Sauerstoff auf
ein Kohlenwasserstoff-haltiges Wasserstoffdonor-Molekül,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Wasserstoff-
Donormolekül in einem Reaktionsmedium, umfassend das
Sauerstoff-übertragenden Enzym und ein
Elektronendonorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in
Gegenwart von Sauerstoff unter Reaktionsbedingungen
inkubiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das
Wasserstoff-Donormolekül ausgewählt ist unter Verbindungen
der Formel
R-X
worin
R für einen Alkylrest mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen steht, und
X für eine polare, zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken befähigte Gruppe, vorzugsweise eine Carboxy-, Amid-, Nitril-, Sulfat-, Sulfon- Amin- oder Hydroxygruppe, steht.
R-X
worin
R für einen Alkylrest mit 10 oder mehr Kohlenstoffatomen steht, und
X für eine polare, zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken befähigte Gruppe, vorzugsweise eine Carboxy-, Amid-, Nitril-, Sulfat-, Sulfon- Amin- oder Hydroxygruppe, steht.
11. Verfahren zur enzymatischen Herstellung terminal oder
subterminal (Position ω-1 bis -4) hydroxylierter
Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) eine hydroxylierbare Fettsäure oder Fettsäurederivat in Gegenwart eines Elektronendonorsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einer Cytochrom P-450 Monoxygenase und Sauerstoff umsetzt; und
- b) das (die) hydroxylierte(n) Produkte) isoliert.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
das ω-hydroxylierbare Fettsäurederivat ausgewählt ist
unter terminal gesättigten, verzweigten oder unverzweigten
Fettsäuren mit mehr als 10 Kohlenstoffatomen, insbesondere
C12-C30-Fettsäuren.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym eine Cytochrom P-450
Monoxygenase ist, ausgewählt unter:
- a) dem aus Bacillus megaterium (DSM 32T) isolierbaren Wildtypenzym; oder
- b) einer durch Aminosäuresubstitution in wenigstens einer der Position 26, 47, 72, 74, 87, 188 und 354 erhältlichen Mutanten des Wildtypenzyms.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
die Mutante in Position 87 die Mutation F87A oder F87V und
gegebenenfalls wenigstens eine weitere der folgenden
Mutationen aufweist: L188K, A74 G, R47F und V26T.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, daß das Elektronendonorsystem
Zink/Co(III)sepulchrat ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, daß man zumindest Stufe a) in Gegenwart
von Chloridionen durchführt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch
gekennzeichnet, daß man zumindest Stufe a) in Gegenwart
eines Wasserstoffperoxyd-spaltenden Enzyms durchführt.
18. Bioreaktor zur Verwendung bei der Herstellung ω-
hydroxylierter Fettsäuren, gekennzeichnet durch
irrmobilisierte Monoxygenase und ein Elektronendonorsystem
nach einem der Ansprüche 1 bis 8 im flüssigen
Reaktionsmedium.
19. Nachweisverfahren für Fettsäure-Monoxygenasen, dadurch
gekennzeichnet, daß man
- a) einen Analyten, in dem man Enzymaktivität vermutet, mit einer ω-hydroxylierbaren Fettsäure oder Fettsäurederivat, welche(s) einen terminalen, 3 abspaltbaren Chromophor oder Fluorophor trägt, in Gegenwart eines Elektronendonorsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 8 inkubiert; und
- b) die Abspaltung des Chromophors oder Fluorophors qualitativ oder quantitativ bestimmt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Umsetzung in Gegenwart eines Wasserstoffperoxyd
spaltenden Enzyms und gegebenenfalls in Gegenwart von
Chloridionen durchführt.
21. Testkit, umfassend ein Elektronendonorsystem nach einem
der Ansprüche 1 bis 8.
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DE10336540B4 (de) * | 2003-08-05 | 2014-03-13 | Bernd Kastenholz | Verfahren zur Isolierung von Metall-Cofaktoren aus biologisch-organischen Systemen unter Anwendung der präparativen nativen kontinuierlichen Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PNC-PAGE) |
-
1999
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