DE3587883T2 - Synthetische Prosthetogene und ihre Verwendung in Enzymkopplungstests. - Google Patents

Synthetische Prosthetogene und ihre Verwendung in Enzymkopplungstests.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweisen von Analyten in Probemedien mittels enzymatischer Reaktionen. Sie betrifft insbesondere aber nicht ausschließlich den Nachweis von Polynukleotidanalyten. Die Anmeldung ist eine Ausscheidung aus der europäischen Anmeldung 8502045.1 (EP-A-0156641).
  • EP 27036 schlägt ein Assaysystem unter Verwendung eines Konjugats zwischen einer Sonde und einem Enzym vor, wobei das Enzym dann an einer primären Reaktion teilnimmt, in der ein "Modulator" für ein sekundäres Reaktionssystem entsteht oder entfernt wird; der Modulator ist eine Substanz, die zu einem katalytischen Ereignis im sekundären Reaktionssystem führt, von der aber während des katalytischen Ereignisses kein Nettoverbrauch festzustellen ist. Dies führt daher zu einem Verstärkungsfaktor zwischen dem primären und dem sekundären Reaktionssystem. Der Modulator kann ein Enzymaktivator oder -inhibitor oder ein zyklisch regenerierbares Substrat für das sekundäre System sein.
  • Assaysysteme unter Verwendung von sekundären Reaktionen zur Erzielung einer Verstärkung sind ebenfalls in WO 81/00725 (bezieht sich auf die Verwendung von ringschließenden Substraten) und in EP 49606 geoffenbart (bezieht sich auf die primäre Reaktion, die zur Entstehung eines "Verstärkers" führt, der die Rate der sekundären Reaktion verbessert).
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine synthetische Prothetogenverbindung, die durch ein Enzym spaltbar ist, um einen Bestandteil zu erzeugen, der für die katalytische Wirkung eines anderen Enzyms wesentlich ist, oder einen Vorläufer dafür. Beispielsweise kann das Prosthetogen eine Pyrimidin 3'-Phosphodiesterverbindung der Formel R-X sein, worin R ein Pyrimidinnukleosid 3'-Phosphat und X eine ausscheidende Gruppe ist, die über die 3'-Phosphatgruppe mit R verbunden ist und davon enzymatisch abspaltbar ist, um eine wesentliche Komponente eines weiteren Enzyms oder Vorläufers davon zu erzeugen, worin das Produkt der ausscheidenden Gruppe der enzymatischen Spaltungsreaktion aus Riboflavin, Thiamin, Pyridoxal, Pyridoxin und Pyridioxinphosphat ausgewählt ist.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein enzymgebundenes Assayverfahren, worin ein primäres Enzym, dessen Konzentration mit dem Vorhandensein von zu ermittelnden Analyten in Beziehung steht, eine primäre enzymatische Reaktion katalysiert, die zu einem nachweisbaren Produkt führt; dadurch gekennzeichnet, daß ein Substrat für das primäre Enzym eine synthetische Prosthetogenverbindung ist, die durch das primäre Enzym gespalten wird, um direkt oder über eine oder mehrere weitere Reaktionen einen Bestandteil zu erzeugen, der für die katalytische Wirkung eines anderen Enzyms wesentlich ist, das dadurch aktiviert wird, um eine sekundäre enzymatische Reaktion zu katalysieren, die zu einem nachweisbaren Ergebnis führt.
  • Die vorliegende Erfindung wendet somit das Prinzip eines enzymgebundenen Nachweissystems an, doch eine Verbesserung der Empfindlichkeit um viele Größenordnungen wird durch die Verwendung eines primären Katalysators erreicht, um direkt oder indirekt ein Coenzym oder eine prosthetische Gruppe zu erzeugen, die Teil eines weiteren und unterschiedlichen katalytischen Zentrums ist, das ein Enzym verwendet, das zur katalytischen Aktivität absolut vom genannten Coenzym oder der genannten prosthetischen Gruppe abhängt. Die primäre enzymatische Reaktion kann daher direkt ein Coenzym oder eine prosthetische Gruppe herstellen oder einen Vorläufer, der dann z. B. auf enzymatische Weise in das Coenzym oder die prosthetischen Gruppe umgewandelt wird. Das Coenzym oder die prostethische Gruppe (ob direkt oder indirekt hergestellt) wird anschließend mit einem geeigneten Apoenzym kombiniert, um ein Holoenzym herzustellen, dessen Menge bestimmt werden kann, und indem Holoenzym verwendet wird, um ein zweites Reaktionssystem zu katalysieren, das zu einem nachweisbaren Ergebnis führt, z. B. zur Bildung eines Farbstoffes.
  • Eine bevorzugte Assay-Verfahrensweise ist in nachstehendem Schema 1 dargestellt. Schema 1 Analyten Sonde Hybridisierung ERKENNUNG Komponente hybrisisierte Sonde Enzym PRIMÄRE REAKTIONEN EMPFINDLICHKEITSVERBESSERUNG (nachgewiesenes Proukt) NACHWEIS
  • Alle Katalysatoren sind eingerahmt und oberhalb eines Pfeiles angeführt, der die katalysierte Reaktion anzeigt. Das primäre Enzym ist E&sub0; und das nachweisende aktive Holoenzym E2aX'.
  • Die Sonde wird solcherart an eine Komponente A&sub1; angefügt, daß sie die Hybridisierung nicht beeinträchtigt, vorzugsweise an einem der freien Enden der Sonde durch eine geeignete Abstandsgruppe, wobei beispielsweise die in Nucleic Acid Research, Bd.11 (1983) S. 659-669 beschriebenen Verfahren zum Einsatz kommen. Nach der Hybridisierung unter Bedingungen geeigneter Strenge ergibt die Zugabe von A&sub2; eine enzymatisch aktive Spezies, A&sub1;A&sub2;, die als E&sub0; in Schema 1 bezeichnet und an der Sonde befestigt ist. Dies ist die Erkennungsphase der Erfindung. Dieses primäre Enzym E&sub0; wirkt katalytisch, während es auf einem Posthetogensubstrat R-X zur Ziel-DNA immobilisiert wird, um den Vorläufer des Coenzyms oder der prosthetischen Gruppe X-OH freizusetzen, der sich seinerseits nach der allfälligen Umwandlung in die aktive Form des Coenzyms X' in einem durch das Enzym E&sub1; katalysierten Vorgang mit einem inaktiven Apoenzym E2i kombiniert, um das enzymatisch aktive Nachweisholoenzym E2aX' zu ergeben. In einigen Fällen führt die E&sub0;-katalysierte Reaktion zur direkten Entstehung eines Coenzyms oder einer prostethischen Gruppe, wobei in diesem Fall kein Umwandlungsschritt unter Verwendung des Enzyms E&sub1; erfolgt. Die Verbesserung der Empfindlichkeit ergibt sich aus der Tatsache, daß im Prinzip jedes hergestellte Molekül von X' zu einem-aktiven Molekül von E2aX' führen kann, und daß die Anzahl der hergestellten Moleküle von E2aX' jene von E&sub0; deutlich übersteigen, das an der Sonde angebracht ist. In der vorliegenden Erfindung ist X' Teil des katalytischen Zentrums von Enzym E2aX' und kein allosterischer Aktivator des Substrats. Es ist für die katalytische Aktivität absolut erforderlich und es ist kein bloßer Ratenverbesserer für eine bestehende enzymatische Reaktion, wie dies bei einigen Vorschlägen des Stands der Technik der Fall ist. Enzym E2aX' katalysiert die Bildung eines leicht nachgewiesenen Produkts P aus einem Substrat S.
  • Ein Beispiel der Erfindung sieht die Verwendung von S-Peptid (Spep) und S-Protein (Spr) jeweils als A&sub1; und A&sub2;-Fragmente vor, die aus Rinder-Bauchspeicheldrüsen-Ribonuklease (EC 3.1.27.5) durch proteolytisches Spalten mit Subtilisin (EC 3.4.21.14) gewonnen werden. Es ist bekannt, daß sich das enzymatisch inaktive S-Peptid und S-Protein mit sehr hoher Affinität kombinieren können, um Ribonuklease S zu erzeugen, die volle Ribonuklease-A-Enzymaktivät aufweist.
  • Der aktive hybridisierte Sonden-A&sub1;-A&sub2;-Komplex (hybridisiertes Sondenenzym E&sub0;) wirkt auf das Prosthetogensubstrat R-X, das beispielsweise die Form CpX oder UpX aufweist, worin S über eine 3'-Phospodiesterbindung (p) mit Cytidin- (C) oder Uridin- (U) Nukleosid verbunden wäre. Die "ausscheidende" Gruppe X-OH ist eine prosthetische Gruppe oder ein Coenzymvorläufer, wie Thiamin, Riboflavin, Pyridoxal oder Pyridoxin.
  • Es ist bekannt, daß Rinderbauchspeicheldrüse-Ribonuklease A die folgenden Reaktionen katalysiert:
  • CpX → Cytidin 2',3'-zyklisches Phosphat + X-OH
  • UpX → Uridin 2',3'-zyklisches Phosphat + X-OH
  • worin, obwohl X-OH ein primärer Alkohol sein muß, wenige andere Beschränkungen bezüglich seiner Struktur bestehen, um als geeignete ausscheidende Gruppe in der Ribonukleas-katalysierten Reaktion zu wirken. (Ein Überblick befindet sich in F.R.Richards und H.W.Wyckoff, in "The Enzymes", Bd. 3, 3.Ausgabe, 1971, Hg. P.D. Boyer, S. 647-806).
  • Einige Beispiele der Beschaffenheit der verschiedenen Komponenten, die im Schema eingesetzt werden können, sind in Tabelle 1 veranschaulicht. TABELLE 1 Riboflavin Riboflavinkinase Flavinmononukleotid Riboflavin Riboflavinkinase Flavinadenindinukleotid FMN Adenyltransferase Thiamin Thiaminpyrophosphokinase Thiamindiphosphat Pyridoxal Pyridoxalkinase Pyridoxal 5-phosphat Pyridoxin Pyridoxin 4-dehydrogenase Pyridoxal 5-phosphat Pyridoxalkinase Pyridoxinphosphat Pyridoxin 4-dehydrogenase Pyridoxal 5-phosphat
  • Geeignete Apoenzyme zur Herstellung von Enzym E2aX' aus X' sind Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt; das gleiche gilt für Systeme für den Nachweis von P durch Farbherstellung, Fluoreszenz oder Lumineszenz (siehe beispielsweise H.Harris und D.A. Hopkinson, Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics, 1976, North Holland Publishing Co.).
  • Die Erfindung wird anhand der folgenden ausführlicheren und beispielhaften Beschreibung näher erläutert, die nicht so ausgelegt werden sollte, daß sie den erfindungsgemäßen Schutzbereich einschränkt.
    • A - DIE SONDEN
  • Oligonukleotidsonden mit den erforderlichen Basensequenzen zum Hybridisieren mit Polynukleotidanalyten können durch das Festphasen-Phosphotriesterverfahren auf einem Kieselgur-Polydimethylacrylamid-Träger synthetisiert werden, wie die ausführlich durch Gait et al (M.J.Gait et al 1982) beschrieben wird.
  • Das Nachweissystem kann auch in anderen Verfahrensweisen als jenen zum Einsatz kommen, bei denen Gensonden beteiligt sind. Im Prinzip könnte eine Antigen- Antikörper-Wechselwirkung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung somit mit höherer Empfindlichkeit überwacht werden als durch derzeitige nichtradioaktive Verfahren.
    • B- SYNTHESE VON SONDEN-S-PEPTIDDERIVATEN
  • Herkömmliche und routinemäßige Verfahren können zum Binden von S-Peptid an Sondenmoleküle verwendet werden. Solche Verfahrensweisen werden in EP-A 62277 besprochen. Diese Offenbarung bezieht sich ebenfalls auf die Anwendung von Modifikationen oder Analogen von Spep-Spr-Subtilisin-Abspaltungsprodukten von Ribonuklease A und auch auf andere spaltbare Enzyme. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch solche Varianten.
  • Verfahren zur Herstellung von Rnase S und zur Trennung in S-Peptid und S-Protein wurden jeweils durch Doscher (1969) und Chavers & Scheraga (1980) beschrieben.
  • Die Reaktion des bifunktionalen Reagens SPDP (n-Succinimidyl 3-(2- Pyridyldithio)propionat) mit dem S-Peptid ergibt eine Derivat, das ein Mol Reagens pro Mol Peptid enthält. Die Substitution an der α-Aminogruppe des N-terminalen Lysins ist eine bevorzugte Position, da dieser Rest nicht wesentlich zur S-Peptid-S-Protein- Wechselwirkung beiträgt.
  • Dieses Derivat (I) ist gegenüber Thiolreagenzien reaktiv und kann daher verwendet werden, um ein Oligonukleotid zu kuppeln, das durch das Verfahren von Roychoudhury et al (1976) "G-tailed und mit N-acetyl-N' (p-Glyoxybenzoyl)cysteamin gemäß der Verfahren von Cheng et al (1983) umgesetzt worden war. Das Reaktionsschema ist wie folgt. Sonde Zugabe Dithiothreitol Verbindung
  • Die Verwendung von Verbindung II zum Nachweis der Gegenwart von DNA- enthaltenden und zu jenen in der Sonde komplementären Sequenzen kann wie folgt dargestellt werden. Dithiothreitol Verstärkungs- und Nachweissystem
  • worin die gezackten Linien die komplementären Sequenzen der Sonde und die Zielsequenzen in der DNA darstellen.
  • Die Reaktion (ii) kann als wahlweise angesehen werden, kann jedoch insofern Vorteile bieten, als das s-Peptidfragment nur die relativ kleine β-Mercaptopropionylgruppe trägt, welche die enzymatische Aktivität weniger wahrscheinlich verringert als der große Sonden-DNA-Komplex. Dieser Schritt bietet den zusätzlichen Vorteil, daß der 5-Protein- S-Peptid-Komplex von der Matrix befreit wäre, an der die DNA immobilisiert worden ist.
    • C- ENZYMATISCHE NACHWEISSYSTEME FÜR DAS SONDEN-S-PEPTIDDERIVAT
  • Ein Nachweissystem, das eine gefärbte Lösung oder einen gefärbten Fleck auf einer Trägermatrix ergibt, ist vorzuziehen, da dies die Anwendung dieser Technologie vereinfacht oder daher erweitert. Eine größere Empfindlichkeit kann jedoch durch die Verwendung von Spezialinstrumenten wie Lumineszenzmonitoren, Fluorometern oder Spektrophotometern erreicht werden.
  • Eine allgemeine Reaktionssequenz für das System ist wie folgt: (primärer Katalysator) modifizierendes Enzym
  • worin: P-Spep: Sonden-S-Peptidderivat.
  • Spr: das aus Rnase abgeleitete S-Protein.
  • S&sub1;C&sub1;: ein Phosphodiestersubstrat für RNase, welches das Coenzym oder den Coenzymvorläufer C&sub1;' als ausscheidende Gruppe enthält.
  • Modifizierende Enzyme: aktive Enzyme, welche die Form des für die Kombination
  • mit Apo 1 erforderlichen Coenzyms herstellen.
  • Apo 1: das enzymatisch inaktive Apoenzym, für das C&sub1; das Coenzym ist.
  • Holo 1: das aktive Holoenzym, das durch Kombination von Apo 1 mit dem Coenzym C&sub1; gebildet wird.
  • S&sub2;: das Substrat für Holo 1, welches das gefärbte Produkt P* ergibt.
  • Enzymatisch aktive Komponenten sind, wie auf dem Schema ersichtlich, in Rechtecke eingerahmt und mit punktierten Pfeilen versehen, die zu den katalysierten Reaktionen zeigen.
  • Die S-Peptid-S-Protein-Wechselwirkung
  • Das System macht sich die enge und spezifische Bindung des S-Peptids an das S-Protein zunutze. Diese Wechselwirkung ist von so hoher Affinität, daß es sich als unmöglich herausstellte, einen Wert für die Dissoziationskonstante (Kdiss) zu bestimmen; es wurde jedoch durch Richards & Vithayathil (1959 a,b) eine Obergrenze von Kdiss bei 5·10&sup9; M angesetzt. Bei einer Konzentration des S-Proteinkatalysators von 10&sup7; M oder weniger würden somit 95% zu einem primären Katalysator umgewandelt werden. Rnase S weist Enzymaktivitäten auf, die jenen von nativer Rnase A ähneln (Takahashi et al (1969)).
  • In der folgenden Darstellung werden spezifische Vorschläge hinsichtlich der Beschaffenheit des Kuppelcoenzyms C&sub1; und des Endnachweissystems (S&sub2;→P*) gemacht. Es gibt jedoch eine hohe Anzahl an alternativ möglichen Verfahren auf der Grundlage anderer Kupplungscoenzyme und anderer Visualisationsverfahren.
    • Das Nachweissystem mit Riboflavin als Kuppelcoenzym
  • In diesem Fall würde das Substrat für die Enzymwirkung durch den Sonden-S-Peptid-S- Proteinkomplex den folgenden Typ (III) aufweisen. Cytidine 2'3'Phosphat + Riboflavin
  • worin C Cytosin (oder eine andere Pyrimidinbase).
    • Synthese von Substrat III (Cp Riboflavin)
  • Das Substrat Cp Riboflavin kann hergestellt werden, indem man sich die Umkehrbarkeit des ersten Schritts der Ribonuklease A-Wirkung zunutze macht, um ein Substrat III zu synthetisieren, das aus Cytidin besteht, das über eine 3'-Phosphatgruppe mit dem endständigen Hydroxylrest der Ribitylseitenkette von Riboflavin verbunden ist. Nase Formamid äthylendiamin pH-Wert 6,50 Riboflavin Flavin
  • Aufgrund der hohen hydrolytischen Aktivität von Rnase A könnte man nur geringe Substratausbeuten erwarten, wenn die Reaktion in wässeriger Lösung erfolgte. Daher erfolgte die Reaktion in 50% Formamid bei -20ºC, wobei die höchstmögliche Konzentration von Riboflavin als Angriffsgruppe und die erforderliche primäre alkoholische Gruppe als Nukleophil vorhanden war.
    • Versuchsteil I. Enzymkatalysierte Herstellung von Cp-Riboflavin
  • Die Reaktion erfolgte bei -20ºC mit 600 mg Cytidin 2',3'-zyklischem Phosphat, 1 g Riboflavin und 1 mg/ml Ribonuklease A in einem Gesamtvolumen von 11 30 ml 50%v/v Formamid/Puffer mit einem pH-Wert von 6,50.
  • (Die Reaktionsmischung muß vor Licht geschützt und auf der sauren Seite der Neutralität gehalten werden, um den Abbau von Riboflavin zu Lumiflavin zu vermeiden.)
  • Der Reaktionsfortgang wurde mittels Dünnschichtchromatographie überwacht. Aliquote (100 ul) wurden in regelmäßigen Abständen (5 Tagen) entnommen und auf Whatman (Warenzeichen) PLK Sf Silikagelplatten gegen Standards, (5 ug), von Riboflavin, Cytidin 2',3'-zyklischem Phosphat und Cytidinadenosinphosphodiester (CpA) chromatographiert (Fig. 1).
  • Das verwendete Lösungsmittel war H&sub2;O, 40: Pyridin, 10: Eisessig, 1; pH-Wert 5,80.
  • Das Produkt begann nach 11 Tagen Inkubation auf den Chromatographen als Fleck mit einem Rf-Wert von 0,87 im Vergleich zu den Rf-Werten von 0,79 für Riboflavin, 0,95 für Cytidin 2',3'-zyklischem Phosphat und 0,89 für CpA sichtbar zu werden. Die Reaktion wurde nach 31 Tagen abgebrochen, als der vorherrschende Fleck auf den Chromatographen jener bei Rf 0,87 war.
    • II. Abbruch der Reaktion
  • Es war zu diesem Zeitpunkt wesentlich, die Ribonuklease in der Inkubationsmischung zu inaktivieren, da ein Ausgesetztsein des Produkts gegenüber einem Enzym in einer wässerigen Umgebung zu seinem Abbau zu Cytidin 3'-Phosphat und Riboflavin führen würde.
  • Daher wurde Ribonuklease durch Phenolextraktion des Inkubats bei einem pH-Wert von 5,40 entfernt.
  • Das Inkubat wurde dreimal mit Phenol extrahiert, und die kombinierten wässerigen Phasen wurden einmal mit Chloroform extrahiert. Dieses Verfahrensweise wies den zusätzlichen Vorteil auf, daß sie die Entfernung eines großen Prozentsatzes des in der Reaktionsmischung vorhandenen Formamids erleichterte.
  • Die kombinierten wässerigen Phasen wurden durch Rotationsverdampfung bei 55ºC vor dem Abtrennen des Produkts von nicht umgesetztem Riboflavin und Cytidin 2',3'- zyklischem Phosphat auf Silikagelsäulen volumsreduziert.
    • III. Abtrennung des Produkts von nicht umgesetzten Bestandteilen (Flash- Chromatographie)
  • Die Abtrennung des Produkts von nicht umgesetztem Riboflavin und Cytidin 2',3'- zyklischem Phosphat erfolgte mittels Zwischendruckchromatographie (Still et al, 1978).
  • Ein Aliquot des Phenols und des chloroform-extrahierten Inkubats aus Stufe II (10 ml) wurde auf eine Silikagelsäule aufgetragen (Merck Silikagel 60) und mit H&sub2;O,40 Pyridin, 10 : Eisessig, 1, unter einem positiven Druck von sauerstofffreiem Stickstoff 15 Pfund/Quadratzoll (1,05 kg/cm²) eluiert (Fig. 2).
  • Fraktionen wurden vereinigt und durch Dünnschichtchromatographie analysiert, wie dies bereits beschrieben wurde (Fig. 3).
  • Fraktion A (Fig. 2 und Spur 4 Fig. 3) wurden als ein Substrat für Ribonuklease geprüft, indem ein Aliquot (100 ul) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in einer Mischung inkubiert wurde, die 2 mg Ribonuklease in einem Endvolumen von ml 0,1 M Äthylendiaminpuffer mit einem pH-Wert von 6,50 enthielt. Das resultierende Chromatogramm zeigte, daß der Fleck bei Rf 0,87 in 2 Flecke von Rf 0,79 (Riboflavin) und 0,96 (Cytidin 3'-Phosphat) aufgelöst war, was anzeigte, daß das Produkt durch RNase in seine Bestandteile hydrolisiert wurde (Fig. 4).
  • Fraktion A (Fig. 2) wurde vereinigt und bei 55ºC rotationsverdampft, um einen Feststoff zu erhalten. Es verblieb jedoch ein Restvolumen Formamid, das während des Phenolextraktionsprotokolls nicht entfernt worden war und sich mit der mobilen Phase während der Zwischendruckchromatographie bewegte. Die Entfernung des Formamids liefert das Substrat in fester Form.
    • Primäre Reaktionen
  • Die erwünschte aktive Form des Coenzyms FMN wird durch das Einwirken von Riboflavinkinase (Flavokinase: EC 2.7.1.26), eines leicht herzustellenden Enzyms, erreicht.
  • Es gibt viele Kandidaten für das Nachweisenzym, das FMN als Coenzym einsetzt, darunter Glycolatoxidase (EC 1.1.3.1. Schuman & Massey (1971), aus der FMN durch Dialyse gegen 1 M Kbr entfernt werden kann (Massey & Curti (1966)); L-Hydroxysäur& Oxidase (EC 1.1;3.15, Nakano et al (1968)) und Orotatreductase aus Zoroticum (EC 1.3.1.14, Swell et al (1960)), doch ein besonders bevorzugtes ist pneumococcale L- Lactatoxidase (EC 1.13.12.4, Udaka et al (1959)).
  • Dieses Enzym katalysiert die Reaktion (i):
  • Lactat + O2&sub2; → Acetat + CO&sub2; + H&sub2;O (i)
  • die für Assay-Zwecke ungeeignet ist. In der Gegenwart von Catalase wird die Reaktion (Udaka et al (1959)):
  • Lactat + ½O&sub2; → Pyruvat + H&sub2;O (ii)
  • Die Enzymreaktion ist somit:
  • Lactat + O&sub2; → Pyruvat + H&sub2;O&sub2; (iii)
  • Dies bietet die Möglichkeit des Koppelns der Reaktion mit einem der raschen und empfindlichen Verfahren zum Nachweis von H&sub2;O&sub2;, z. B. die Reaktion mit chromogenen Substraten, 5-Aminosalicylsäure oder Dianisidin, katalysiert durch Meerrettich- Peroxidase (Kas & Cerna (1980)).
  • Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Herstellung von FMN mit der Herstellung von Flavodoxin zu koppeln. Apoflavodoxin ist ein gut dokumentiertes Nachweismittel für FMN oder FAD in einem System, in dem das Ausmaß der Veränderung der Fluoreszenz des Flavinnukleotids bei Kombination mit dem Apoprotein dazu dient, die Menge des Nukleotids in einer unbekannten Lösung zu bestimmen (Mayhew & Wassink (1980): a & b). Das Fluoreszenzverfahren wäre jedoch für die erfindungsgemäßen Zwecke nicht ausreichend empfindlich. Daher kann ein mit enzymgebundener Assay angewendet werden, z. B. die durch Flavodoxin vermittelte Reduktion von Cytochrom c durch das durch die gereinigte Reductase katalysierte NADPH (Shin (1971)).
  • Obwohl FMN-gekuppelte Enzyme für die oben beschriebenen Coenzymkupplungsassays vorgeschlagen werden, kann man den Bereich der geeigneten Enzyme auf jene ausdehnen, die FAD als Coenzym verwenden. Dies würde die zusätzliche, durch FMN-Adenyltransferase katalysierte Reaktion nach sich ziehen: (Gibson et al (1955) und Schrecker & Kornberg (1950))
  • FMN + ATP FAD + PP (iv)
  • worin FMN aus der Flavokinasereaktion entstanden wäre.
  • Dadurch könnte z. B. D-Aminosäureoxidase als Kuppelenzym verwendet werden. Das Apoenzym aus dieser Oxidase wird problemlos durch das KBr-Dialyseverfahren (Massey & Curti (1966)) hergestellt und ist im Falle der Lagerung bei -20ºC zumindest mehrere Monate lang stabil. Der Assay von D-Aminosäureoxidase durch Kuppeln mit einer Peroxidase-katalysierten Reaktion ist vielfach dokumentiert und bietet die Möglichkeit einer chromogenen Sichtbarmachung des Enzyms (Tsuge & Nakanishi (1980)).
  • Andere FAD-Enzyme wie Glukoseoxidase, L-Aminosäureoxidase und Xanthinoxidase (Tsuge & Nakanishi (1980)) könnten in ähnlicher Weise verwendet werden. Es ist noch nicht eindeutig geklärt, welches System das günstigste ist, doch jedes dieser Enzyme ist problemlos verfügbar und kann behandelt werden, um stabile Apoenzyme zu ergeben.
    • Das Nachweissystem unter Verwendung von Pyridoxalphosphat als Kuppelcoenzym
  • Aspartataminotransferase (EC 2.6.1.1.) katalysiert die Reaktion von α-Oxoglutarat (αOG) min (S)-Asparat (Asp), um Oxalessigsäure (OAA) und (S)-Glutamat (Glu) zu bilden. Das Enzym enthält Pyridoxalphosphat als Coenzym, und das Holoenzym kann problemlos und reversibel in freies Coenzym und Apoenzym aufgelöst werden (Martinez-Carrion et al 1970). Ein empfindlicher Assay für das Holoenzym (nanomolare Konzentrationen) wurde auf der Grundlage eines gefärbten reduzierten Netotetrazoliumderivats INT*RoT, das mit der durch Glutamatdehydrogenase katalysierten Reaktion gekuppelt ist, durch Raj (1982) beschrieben.
  • Eine Verfahrensweise für den Sonden-S-Peptidnachweis mittels Aspartataminotransferase als Holo 1 ist wie folgt primärer Katalysator Apotransaminas Holotransaminase GLUTAMAT-DEHYDROGENASE DIAPHORASE
  • worin S&sub1;C&sub1; ein Cytidin 3'-Phosphodiester mit Pyridoxal (Py), Pyrodoxamin oder Pyridoxal als die C&sub1;-Gruppe ist.
  • Ein mögliches Substrat (S&sub1;C&sub1;) für die RNase-Wirkung, die Pyridoxal als eines der Produkte ergibt, ist Verbindung IV, die wie folgt hydrolysiert wird:
  • Verbindung IV kann durch eine ähnliche Verfahrensweise synthetisiert werden, wie sie für Cp-Benzyl veröffentlicht wurde (Bernard & Witzel 1961). Pyridoxal, das als das Hydrat dargestellt ist, das durch die obige Reaktion gebildet wird, wird zu Pyridoxalphosphat umgewandelt, das bei der durch Pyridoxalkinase katalysierten Reaktion erforderlich ist (EC 2.7.1.35).
  • Andere mögliche Substrate enthalten Verbindungen V - VII:
  • worin Cp Cytidin 3'-Phosphoryl darstellt und R entweder H- oder -O-P(OH)&sub2; ist.
  • Verbindung V würde bei Hydrolyse durch RNase S Pyridoxol ergeben, das unter Verwendung von Pyridoxoloxidase (EC 1.4.3.5.) im Assaysystem als zusätzlichem Schritt vor der Kinase-katalysierten Reaktion zu Pyridoxal umgewandelt wird. Wenn Verbindung VI, die phosphorylierte Form von Verbindung V, als Substrat für RNase S verwendet wird, würde Pyridoxalphosphat direkt durch das Wirken der Oxidase entstehen. Verbindung VII, in der die Cytidin 3'-Phosphorylgruppe in einer Phosphodiesterbindung am Phenolsauerstoff von Pyridoxal vorliegt, würde bei RNasekatalysierter Hydrolyse ebenfalls direkt Pyridoxalphosphat ergeben. Es ist jedoch bekannt, daß die enzymatische Spezifität solcherart ist, daß sterisch voluminöse Substituenten auf dem Sauerstoffatom der ausscheidenden Gruppe nur schlecht toleriert werden, wodurch dieses Substrat möglicherweise weniger bevorzugt ist.
  • Verbindungen V und VI können unter Verwendung von RNase enzymatisch hergestellt werden, um die Kondensationsreaktion in Formamid/Wasser oder anderen aprotischen Lösungsmittel/Wassermischungen zu katalyiseren (Findlay, Mathias & Rabin (1962)). Die chemische Synthese unter Verwendung eines auf Phosphotriester beruhenden Ansatzes mit geeignet geschützten Reaktanden kann dazu dienen, Verbindung VII sowie Verbindungen V und VI zu synthetisieren.
  • Die Herstellung des Apoenzyms apo Glutamin-asparagintransaminase (Apo 1) wurde beschrieben (Martinez-Carrion (1970), Arrio-Dupont M. (1972)) und erfolgt am besten in Stufen: zunächst das Ersetzen des Pyridoxalphosphats durch das weniger affine Pyridoxaminphosphat und dann das Entfernen des letzteren durch Gelchromatographie.
  • Das Apoenzym ist über lange Zeiträume stabil. Die Entfernung des gesamten Pyridoxalphosphats ist für ein gutes Signal/Rauschen-Verhältnis wesentlich, doch dieses wird durch einen Hemmschritt sichergestellt, der die Behandlung mit einer Ketosäure und anschließend mit NaBH&sub4; vorsieht, was jegliche enzymatische Restaktivität bei der Herstellung des Apoenzyms inaktiviert.
  • Die Rekonstituierung von Holotransaminase aus Pyridoxalphosphat und dem Apoenzym wurde in einem sehr eleganten Beitrag von M.Arrio-Dupont (1972) beschrieben. Typischerweise ist die Konzentration von Apotransaminase 0,1 uM oder höher. Diese Konzentration ist ausreichend, um im wesentlichen stoichiometrische Umwandlung zu Holotransaminase jeder beliebigen niedrigen Konzentration von im System gebildetem Pyridoxalphosphat zu gewährleisten.
    • EIN DOPPELTES VERSTÄRKUNGSSYSTEM MITTELS DOPPELCOENZYMKUPPLUNG
  • Es ist klar, daß im Prinzip "Kaskaden" aufgebaut werden können, um den Assaysystemen die erforderliche Empfindlichkeit zu verleihen.
  • Ein potentiell sehr empfindliches System ist weiter unten beschrieben. Die Doppelverstärkung entsteht aus dem primären Katalysator, der ein Coenzym (letzten Endes FAD) freisetzt, das sich mit einer Apooxidase kombiniert, um ein zweites Coenzym, Pyridoxalphosphat, zu erzeugen, das seinerseits das zweite Apoenzym aktiviert. S&sub1;-Flavin KINASE ADENYLTRANSFERASE Pyridoxoloxidase Holopyridoxaloxidase Apo Aspartat + Pyridoxal Transaminase Holoaspartatetransaminase GLUTAMAT DIAPHORASE
    • SONDEN-ENZYMSPALTUNG
  • Wie bereits angeführt, besteht ein Aspekt der erfindungsgemäßen Verfahrensweise in der Möglichkeit, das primäre Enzym (E&sub0; in Schema 1) vor dem Durchführen der primären enzymatischen Reaktion aus dem Nachweissystem zu entfernen. Der Vorteil liegt darin, daß die primären Reaktionen, die Verbesserung der Empfindlichkeit und der Nachweis in freier Lösung weg vom Polynukleotidanalyten und der Oligonukleotidsonde erfolgen können. Diese Spaltung der Sonden- Enzymfraktionsbindung kann vor dem Konjugieren der größeren Enzymfraktion zur Vervollständigung des Enzyms oder nach der Konjugation, jedoch vor der Zugabe des Substrats, erfolgen. Wenn der Analyt beispielsweise ein Polynukleotid ist, ist die Sonde ein damit hybridisierbares Oligonukleotid, und die kleinere Enzymfraktion ist mit dem Oligonukleotid über eine Disulfidbindung verbundenes; S-Peptid; diese Bindung kann mittels herkömmlicher Reduktionsmittel wie Dithiothreitol oder β-Mercaptoäthanol abgespalten werden, um das S-Peptid nochmals freizusetzen. Somit kann die Spep- Sonde zur Probe hinzugefügt und die nicht gebundene Spep-Sonde durch Waschen entfernt werden. Dann wird das S-Peptid von der Sonde abgespalten und mit überschüssigem S-Protein umgesetzt, um das Enzymkonjugat zu bilden; das S-Protein kann auch vor dem Spalten des Konjugats aus der Sonde zur Spep-Sonde hinzugefügt werden. Ein konkretes Beispiel würde folgendes umfassen: (i) das Immobilisieren des Analyten auf einem Träger wie einem polymeren oder saugfähigen Feststoff; (ii) das Umsetzen des immobilisierten Analyten mit überschüssiger Spep-Sonde in Lösung; (iii) das Entfernen des Trägers mit seinem gebundenem Analyten-Spep-Sondenkomplex aus der Lösung und das Waschen zur Entfernung jeglicher nicht gebundener Spep-Sonde; (iv) das Eintauchen des Trägers in eine Lösung eines Spaltungsmittels, das Spep vom Träger spaltet, so daß er/es in Lösung geht; (v) das Hinzufügen von S-Protein zur Lösung zur Bildung des Enzymkonjugats und das Durchführen der Enzymreaktionen, um das nachweisbare Ergebnis zu erzielen. Schritt (v) könnte die einmalige Zugabe aller anderer Reagentien sowie des S-Proteins zur Lösung umfassen, um die Assayreaktionen abzuschließen. Als Alternative könnte das S-Peptid anfänglich auf einem Träger immobilisiert werden, so daß der nachfolgende Spaltungsschritt den Analyten und die Sonde entfernt, wobei das S-Protein somit mit dem S-Peptid auf dem Träger konjugieren kann. Auf diese Weise können die primäre enzymatische Reaktion und möglicherweise nachfolgende Reaktionen auf dem Träger stattfinden, was zur Identifizierung des nachweisbaren Ergebnisses der Reaktionen leichter und empfindlicher wäre.
  • Die Trennung des primären Enzyms von der Sonde vor dem Durchführen der durch das Primärenzym katalysierten Reaktion könnte insofern vorteilhaft sein, als die Sonde und der Analyt dann die Aktivität des Enzyms nicht beeinträchtigen würden. Ebenso verhindert das Abspalten der kleinen Enzymfraktion (Spep) von der Sonde vor ihrem Konjugieren mit der größeren Fraktion (Spr), daß die Sonde oder der Analyt die Konjugierung beeinträchtigen.
    • Prosthetogene
  • Das Konzept synthetischer Prosthetogene kann allgemeiner als in den oben angeführten konkreten Beispielen angewendet werden. Beispielsweise kann man Ribonuklease (RNase) als ein primäres Enzym verwenden, das z. B. durch eine Biotin-Adivin-Bindung indirekt mit der Sonde verbunden ist, wie dies in GB-A 2019408 beschrieben ist. Die RNase kann dann auf das neuartige, oben beschriebene Prosthetogen R-X-Substrat einwirken, um einen Coenzymvorläufer zu ergeben, was letzten Endes über die sekundäre enzymatische Reaktion zu einem nachweisbaren Ergebnis führt.
  • Außerdem muß das primäre Enzym für die Prosthetogenreaktion nicht RNase sein. Ausgehend von einem geeigneten Coenzym oder einer geeigneten prosthetischen Gruppe für die sekundäre Reaktion wird ein Reaktionsschema formuliert, dessen primäre Reaktion die enzymatisch katalysierte Spaltung eines synthetischen Ausgangsmaterials (des neuartigen Prostetogens) ist. Das Prosthetogen kann beispielsweise ein acyliertes Coenzym und das primäre Enzym eine Esterase sein, welche die Acylgruppe vom Coenzym abspaltet. Wenn die Esterase in inaktives Peptid und Proteinfragmente spaltbar ist, kann sie so verwendet werden, wie dies bereits für RNase Spep/Spr beschrieben wurde. Wenn sie auf diese Weise nicht spaltbar ist, kann sie als ganzes an die Sonde gebunden werden, z. B. direkt oder durch Biotin/Avidin, doch vorzugsweise durch RNase Spep/Spr. In diesem letzteren Verfahren wird Spep wie bereits beschrieben an die Sonde gebunden und Spr an das Enzym gebunden.
  • Allgemeine Verfahren zum Verbinden von Proteinen sind auf dem Gebit wohlbekannt und können zum Binden des Spr-Fragments an das Enzym herangezogen werden. Diese Verfahrensweise, in der S-Protein als Träger für andere Enzyme wirkt, kann wie folgt dargestellt werden: modifizierendes Enzym
    • Schlüssel
  • Spr - Ex: S-Protein, das ein kovalent gebundenes Enzym, Ex, enthält. Andere Spezien sind mit den bereits beschriebenen identisch.
  • Die folgende Beschreibung betrifft Verfahrensweisen, die Pyridoxalphosphat und Flavin- Coenzyme einsetzen; man kann jedoch jeden geeigneten Cofaktor verwenden, um andere Nachweissysteme zu erzeugen.
    • Systeme mit Pyridoxal als Kuppelcoenzym
  • Bei dieser Verfahrensweise wäre das endgültige Nachweissystem mit dem zuvor beschriebenen identisch. Der am S-Protein befestigte primäre Katalysator könnte jeder beliebige, aus einer Vielzahl hydrolytischer Enzyme ausgewählte Katalysator sein, z. B. Proteasen, Peptidasen, Amidasen oder Esterasen und insbesondere Thrombin oder eine der anderen spezifischen Proteasen des Blutgerinnungssystems. Mit Thrombin als primärem Katalysator (Ex) könnte das synthetische Prosthetogen-erzeugende Substrat S&sub1;C&sub1; Verbindungen wie VIII - X darstellen
  • worin R&sub2; entweder H- oder -PO.(OH)&sub2; und R&sub1; eine Acylgruppe ist, die im Lichte der bekannten Spezifität von Thrombin konstruiert ist, um aus der Verbindung ein gutes Substrat zur Thrombineinwirkung zu machen (Magnusson (1971) und dort angeführte Quellenangaben). Die Hydrolyse von VIII ergibt Pyridoxamin (phosphat), und IX und X setzen beide Pyridoxal oder Pyridoxalphosphat frei. Wenn die Aldehyd(hydrat)gruppe in IX und X durch eine -CH&sub2;OH-Gruppe ersetzt wird und die Kupplung durch Pyridoxaloxidase erfolgt, sollte sich dies als weniger hemmend und weniger oxidationsanfällig herausstellen.
  • Verbindungen VIII - X können durch unkomplizierte Verfahren wie die durch Harrison & Harrison (1971) beschriebenen aus R&sub1;COOH und dem Pyridoxalderivat synthetisiert werden. Die Herstellung von geeigneten R&sub1;COOH-Derivaten würde nach Liem & Scheraga (1974) erfolgen.
  • Strukturen von Coenzym-erzeugenden Substraten für Cholinesterase und Verbindungen XI und XII:
  • Substrate XI und XII können unter Verwendung der üblichen Veresterungsverfahren (Harrison & Harrison (1971)) nach dem Schutz der geeigneten Gruppen in Pyroxidal synthetisiert werden. Um jegliche Reaktionen der Aldehydgruppe von Pyroxidal (oben als Hydrat dargestellt) mit einer Gruppe in der aktiven Stelle von Cholinesterase zu vermeiden, kann Pyridoxol die ausscheidende Gruppe sein und Pyridoxoloxidase und die Kinase als modifizierende Enzyme verwendet werden, wie dies zuvor beschrieben wurde.
    • Systeme mit Flavinderivaten als Kuppelcoenzyme
  • Solche Systeme würden die Endnachweiser für die zuvor beschriebenen Flavingekuppelten Assays und die im vorigen Abschnitt beschriebenen primären Katalysatoren verwenden. Die eingesetzten Substrattypen (S&sub1;C&sub1;) würden für die Thrombinwirkung die Struktur XIV und für den Fall, daß Cholinesterase der primäre Katalysator ist, XV aufweisen: Peptidfragment
  • Die chemischen Synthesen der Ester XIV und XV erfolgen durch eines der durch Harrison & Harrison (1971) beschriebenen Verfahren, beispielsweise durch die carbodiimid-vermittelte Veresterung von Flavin mit der Karbonsäure R&sub1;COOH und Reinigung des Substrats durch HPLC.
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Claims (6)

1. Synthetische Prosthetogenverbindung, die durch ein Enzym spaltbar ist, um einen Bestandteil zu erzeugen, der für die katalytische Wirkung eines anderen Enzyms wesentlich ist, oder einen Vorläufer dafür.
2. Verbindung nach Anspruch 1, die eine Pyrimidin-3'-Phosphodiesterverbindung der Formel R-X ist, worin R ein Pyrimidinnukleosid-3'-phosphat ist und X eine ausscheidende Gruppe ist, die über die 3'-Phosphatgruppe mit R verbunden ist und davon abspaltbar ist, um einen wesentlichen Bestandteil eines Enzyms zu erzeugen, oder einen Vorlaufer dafür, worin das Produkt der ausscheidenden Gruppe der enzymatischen Spaltungsreaktion aus Riboflavin, Thiamin, Pyridoxal, Pyridoxin und Pyridoxinphosphat ausgewählt ist.
3. R-X-Verbindung nach Anspruch 2, worin das genannte Produkt der ausscheidenden Gruppe in ein Coenzym oder eine prosthetische Gruppe umwandelbar ist, das/die aus Flavinmononukleotid, Flavinadenindinukleotid, Thiamindiphosphat und Pyridoxal-5-phosphat ausgewählt ist.
4. Mit Enzym verbundenes Assayverfahren, bei dem ein primäres Enzym, dessen Konzentration mit dem Vorhandensein von zu ermittelndem Analyten in Beziehung steht, eine primäre enzymatische Reaktion katalysiert, die zu einem nachweisbaren Produkt führt; dadurch gekennzeichnet, daß ein Substrat für das primäre Enzym eine synthetische Prosthetogenverbindung ist, die durch das primäre Enzym gespalten wird, um direkt oder übel eine oder mehrere weitere Reaktionen einen Bestandteil zu erzeugen, der für die katalytische Wirkung eines anderen Enzyms wesentlich ist, das dadurch aktiviert wird, um eine sekundäre enzymatische Reaktion zu katalysieren, die zu einem nachweisbaren Ergebnis führt.
5. Synthetisches Prosthetogen nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 zur Verwendung in einem mit Enzym verbundenen Assayverfahren nach Anspruch 4.
6. Kombination aus Bestandteilen zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 4, umfassend:
(i) das genannte Substrat für das genannte primäre Enzym,
(ii) Bestandteile für die andere Enzymreaktion, die durch das Produkt der primären enzymatischen Reaktion zu aktivieren ist, und
(iii) ein signalerzeugendes System, das durch die genannte sekundäre enzymatische Reaktion aktivierbar ist, um ein nachweisbares Ergebnis zu erzeugen.
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