DE69211340T2 - Verfahren zur enzymatischen herstellung von makrolakton - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen herstellung von makrolaktonInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft das Gebiet der Biokonversionen. Insbesondere betrifft sie ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Makrolactonen der Formel (1) aus dem Makrolacton der Formel (2) mit Hilfe eines Mikroorganismus oder eines zellfreien Präparats, das aus diesem Mikroorganismus hervorgegangen ist
- Die Makrolactone der Formel (1) und (2) sind unter verschiedenen Namen als Funktion ihres Ursprungs bekannt (Tabelle). Formel Pristinainycin Mikamycin A Ostreogrycin Streptogramin A Synergistin Al Vernamycin A Virginiamycin
- Diese Moleküle besitzen die allgemeine Struktur von polyungesättigten Makrolactonen, die man in Antibiotika der Familie der Streptogramine antrifft. Diese Antibiotika bestehen in der Tat aus einer synergistischen Assoziation eines polyungesättigten Makrolactons (Verbindung der Gruppe A) und eines Depsipeptids (Verbindung der Gruppe B). Die Wirkweise und die antimikrobielle Aktivität dieser Antibiotika wurden von verschiedenen Autoren untersucht (Tanaka et al., Antibiotics, Bd. III, S. 487, Springer Berlin, 1975; Vasguez et al., Antibiotics, Bd. III, S. 521, Springer Berlin, 1975).
- Aus diesen verschiedenen Untersuchungen folgt insbesondere, daß eine bessere Synergie erhalten wird, wenn man nur das Makrolacton (1) als Verbindung der Gruppe A verwendet.
- Außerdem ist eine Eigenschaft der polyungesättigten Makrolactone der Gruppe A der Streptogramine ihre geringe Löslichkeit in wäßrigem Medium. Dies stellt einen wichtigen Nachteil bei der pharmakologischen Entwicklung dieser Moleküle dar, da ihre Verabreichungswege sehr beschränkt sind.
- Um dieses Problem zu überwinden, wurde eine neue Generation von halbsynthetischen wasserlöslichen Derivaten entwickelt (EP 135 410; EP 191 662; U.S. 4 775 753). Der verwendete semisynthetische Weg besteht im wesentlichen aus der Addition des Thiols an die 2,3-ungesätttigte Bindung von Dehydroprolin der Makrolactone. Jedenfalls kann angesichts der Struktur der Makrolactone nur das Makrolacton (1) bei diesem semisynthetischen Weg verwendet werden.
- In den gegenwärtigen Produktionssystemen werden die Makrolactone der Formel (1) und (2) gleichzeitig von dem Gemisch mit anderen Streptograminverbindungen verwendet.
- Es ist somit wichtig, den Anteil der Verbindung (1), bezogen auf die Verbindung (2), in den Produktionsinedien erhöhen zu können.
- Es ist auch wichtig, die Verbindungen (2), die mit der Verbindung (1) gleichzeitig synthetisiert und aus der Fermentationsbrühe parallel isoliert werden, parallel bewerten zu können.
- Jüngst haben Purvis et al. die Möglichkeit erwogen, daß das Makrolacton (2) ein Biosynthese-Zwischenprodukt des Makrolactons (1) ist (J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 5931). Nichts in dieser Druckschrift beschreibt jedoch diesen Reaktionsmechanismus und auch keine Mittel zu dessen Ausnützung.
- Die Anmelderin hat nun gezeigt, daß es möglich ist, in erhöhten Graden das Makrolacton (2) in das Makrolacton (1) mit einem Mikroorganismus oder einem daraus isolierten zellfreien Präparat umzuwandeln.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der Formel (2) in Gegenwart eines Mikroorganismus oder eines aus diesem Mikroorganismus hervorgegangenen zellfreien Präparats mit der Fähigkeit, die 2,3-Bindung von D-Prolin der polyungesättigten Makrolactone der Gruppe A der Streptogramine in Dehydroprolin zu oxidieren, behandelt.
- Die vorliegende Erfindung kann in vitro und in vivo verwendet werden.
- In vitro erlaubt sie die Synthese von Makrolacton (1) aus Makrolacton (2), das aus der Fermentationsbrühe isoliert wurde, die nicht direkt verwertbar ist. Die Erfindung erlaubt so die Umwandlung von Makrolacton (2) in ein Substrat für semisynthetische Reaktionen mit erhöhten Ausbeuten.
- In vivo erlaubt sie die Erhöhung des Gehalts an Makrolacton (1) auf Kosten von Makrolacton (2) direkt in den aus der Fermentation hervorgegangenen Gemischen. Es ist in der Tat möglich, direkt in das Produktionsmedium der Makrolactone einen Mikroorganismus oder ein aus diesem hervorgegangenes zellfreies Präparat, das Oxidationsaktivität besitzt, einzubringen.
- Gemäß einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird der Mikroorganismus oder das aus ihm hervorgegangene zellfreie Präparat direkt dem Produktionsmedium des Makrolactons (2) zugesetzt.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung (2) mit einem zellfreien Präparat behandelt.
- Die Erfindung erlaubt somit die einfache Gewinnung von Makrolacton (1) mit Umwandlungsgraden der Verbindung (2), die 50% erreichen, unter Verwendung von ganzen Mikroorganismen und die 90% übersteigen, wenn aus diesen Mikroorganismen hervorgegangene zellfreie Präparate verwendet werden.
- Die erfindungsgemäß verwendbaren Mikroorganismen können auf mehrere Arten selektioniert werden. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung einen Test, der die Identifikation von Mikroorganismen erlaubt, die die benötigte enzymatische Aktivität besitzen, und den Erhalt einer quantitativen Abschätzung dieser Aktivität erlaubt. Dieser Test besteht aus der Durchführung der folgenden Stufen:
- - Inkubation einer untersuchten Mikroorganismenkultur oder eines daraus hervorgegangenen zellfreien Präparats in Gegenwart der markierten Verbindung (2),
- - Entnahme von Proben des Kulturmediums im Lauf der Zeit,
- - Abtrennen der Verbindungen (1) und (2),
- - Messen des in die Verbindung (1) eingebauten Markers und Bestimmen des Verhältnisses dieses Markers, bezogen auf den eingebrachten Marker.
- Das so erhaltene Verhältnis erlaubt den Erhalt eines Umwandlungsgrads in der Verbindung (1) und somit eines Niveaus an enzymatischer Aktivität des Mikroorganismus in Kultur. Es ist klar, daß die Selektion der Mikroorganismen nach jedem anderen Verfahren durchgeführt werden kann, das den Nachweis der Anwesenheit der enzymatischen Aktivität erlaubt, und daß die quantitative Annäherung fakultativ ist.
- Unter Verwendung dieses Selektionsverfahrens wurden unterschiedliche Mikroorganismen nachgewiesen, die eine erhöhte enzymatische Aktivität besitzen.
- Vorteilhafterweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der verwendete Mikroorganismus aus Actinomyceten und Pilzen ausgewählt.
- Insbesondere eignen sich Mikroorganismen, die Streptogramine produzieren, allgemein bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Das gilt auch für die Mikroorganismen, die Makrolacton (1) produzieren.
- Darunter kann man insbesondere die folgenden Stämme zitieren:
- Streptomyces pristinaespiralis
- Streptomyces alborectus
- Streptomyces diastaticus
- Streptomyces graminofaciens
- Streptomyces mitakaensis
- Streptomyces loidensis
- Streptomyces olivaceus
- Streptomyces ostreogriseus
- Streptomyces virginae oder
- Micromonospora
- Diese Mikroorganismen können unter Standardbedingungen der aeroben Fermentation gezüchtet werden. Insbesondere besteht das Nährmedium im allgemeinen aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und Mineralsalzen. Als Kohlenstoffquelle können insbesondere Zucker, Öle, organische Säuren, Dextrine, Stärken, Glycerin ... verwendet werden. Als Stickstoffquellen können Aminosäuren, pflanzliche Mehle und Extrakte (Malz, Soja, Baumwollsaat, Tomaten, Mais ...) Innereien, verschiedene Hydrolysate (Casein, Hefe) und industrielle Halbfabrikate, wie "lösliche Destillate", genannt werden. Als Mineralquelle können Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate und Phosphate von Natrium, Kalium, Ammonium oder Calcium oder Spurenelemente, wie Magnesium, Eisen, Kupfer, Zink, Mangan oder Kobalt, verwendet werden.
- Außerdem hat die Anmelderin unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Selektionstests gezeigt, daß die gesuchte enzymatische Aktivität vorübergehend durch die verschiedenen untersuchten Mikroorganismen exprimiert wird. Expressionskinetiken dieser enzymatischen Aktivität wurden durchgeführt, und sie erlauben die Definition der Wachstumsperiode für die untersuchten Mikroorganismen im Verlauf derer die Expression der enzymatischen Aktivität optimal ist. Dies erlaubt somit die beträchtliche Verbesserung der Ausbeuten des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Mikroorganismus oder ein aus einem Mikroorganismus hervorgegangenes zellfreies Präparat in der Phase der optimalen Produktion der Enzymaktivität verwendet.
- Immer noch erfindungsgemäß ist es möglich, nach einer er sten Selektionsstufe die Mikroorganismen zu verwenden, die die benötigte enzymatische Aktivität besitzen, um abgeleitete Stämme herzustellen, die bessere katalytische Potentiale besitzen und/oder eine leistungsfähigere industrielle Ausnutzung erlauben. Derartige Stämme können unter Verwendung unterschiedlicher Mutagenesereagentien, wie insbesondere:
- - physikalische Mittel: Röntgenstrahlen, UV-Strahlen,
- - chemische Mittel: Alkylierungsmittel (Ethylmethansulfonat, Nitrosoguanidin, NQO...), Bialkylantien und interkalierende Mittel,
- - Systeme zu einer Insertionsmutation in die DNA: Transposons, Plasmide, integrative Phagen oder Prophagen...
- oder jede andere einem Fachmann bekannte Technik erhalten werden.
- Noch erfindungsgemäß ist es möglich, aus einer Population von Zellen, die die benötigte enzymatische Aktivität besitzen, diejenigen zu selektionieren, die die bessere enzymatische Aktivität besitzen und/oder die besseren Ausbeuten in dem erfindungsgemäßen Verfahren ergeben.
- Gemäß einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Mikroorganismus, der Streptogramine produziert, oder ein Derivat eines Mikroorganismus, der Streptogramine produziert, verwendet.
- Bevorzugt wird ein Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe:
- S. pristinaespiralis ATCC 25486
- S. ostreogriseus ATCC 27455
- S. mitakaensis ATCC 15297
- S. olivaceus ATCC 12019
- S. loidensis ATCC 11415
- und davon abgeleitete Mikroorganismen verwendet.
- Die enzymatische Konversionsreaktion kann entweder in dem Fermentationsmedium oder in einem gepufferten wäßrigen Medium durchgeführt werden, wobei man einen intakten Mikroorganismus oder ein zellfreies Präparat verwendet, und wobei man direkt in dem Produktionsmedium der Makrolactone oder mit einer aus der Fermentationsbrühe isolierten Verbindung (2) arbeitet.
- Wenn ein zellfreies Präparat verwendet wird, kann es vorteilhaft sein, dem Reaktionsmedium einen oder mehrere enzymatische Cofaktoren zuzusetzen. Insbesondere die folgenden Cofaktoren erlauben die Verbesserung der Reaktionsausbeuten: NAD, NADP, NADH, NADPH, FAD und FMN.
- Die anderen Reaktionsparameter werden von einem Fachmann als Funktion der verwendeten Bedingungen angepaßt.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung sind zellfreie Präparate, die eine enzymatische Aktivität mit der Fähigkeit, die 2,3-Bindung von D-Prolin von polyungesättigten Makrolactonen der Gruppe A der Streptogramine in Dehydroprolin zu oxidieren, besitzen. Diese zellfreien Präparate können nach verschiedenen Arten erhalten werden. Insbesondere können sie durch (a) Aufbrechen der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen und (b) gegebenenfalls Beseitigung der Zelltrümmer erhalten werden.
- Das Aufbrechen der Mikroorganismen kann nach unterschiedlichen Techniken und insbesondere durch physikalische, chemische oder enzymatische Techniken durchgeführt werden. Als Beispiel können als physikalische Techniken Ultraschall, Aufbrechen mit Glaskugeln oder einer "französischen Presse" und als enzymatische Technik die Lyse mit Lysozym genannt werden.
- Das Aufbrechen kann direkt in dem Fermentationsmedium der Zellen durchgeführt werden. Jedenfalls wird bevorzugt in gepuffertem wäßrigen Medium gearbeitet. In dieser Hinsicht ist es möglich, einen anorganischen Puffer (Kaliumphosphat ...) oder einen organischen Puffer (Bis-Tris, Bis-Tris-Propan) zu verwenden. Außerdem wird die Reaktion vorteilhafterweise in Gegenwart eines Reduktionsmittels durchgeführt. Insbesondere wird Dithiothreit verwendet. Je nach dem Ausgangsmikroorganismus und den Bedingungen zum Aufbrechen wird der pH-Wert des zellfreien Präparats zwischen pH 5, und pH 8,0, bevorzugt zwischen 6 und 7, eingestellt.
- Sofern gewünscht, können die Zelltrümmer auf unterschiedliche Arten entfernt werden, wobei es am einfachsten ist, die nach dem Aufbrechen erhaltene Suspension zu zentrifugieren und den Überstand erneut aufzunehmen.
- Um zu bestätigen, daß das zellfreie Präparat gut die gesuchte enzymatische Aktivität besitzt und um das aktivste zellfreie Präparat zu selektionieren, ist es möglich, den vorstehend für die Selektion der Mikroorganismen beschriebenen Test zu verwenden.
- Außerdem ist es zum Erhalt von zellfreien Präparaten mit einer optimalen Aktivität möglich, vor der Stufe des Aufbrechens die Wachstumsphase der ganzen Mikroorganismen, die der maximalen Expression der Enzymaktivität entspricht, zu bestimmen. Man kann insbesondere die mit dem vorstehend beschriebenen Test erhaltenen kinetischen Kurven verwenden.
- Bevorzugt wird bei dem Verfahren zur Gewinnung von zellfreien Präparaten gemäß der Erfindung die Stufe des Aufbrechens an Mikroorganismen in der optimalen Produktionsphase der enzymatischen Aktivität durchgeführt.
- Andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der Lektüre der nachstehenden Beispiele hervor, die nur als Erläuterung und nicht als Beschränkung dienen.
- Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von radioaktiv mit ¹&sup4;C-markiertem Makrolacton (2)
- 750 µCi [U-¹&sup4;C]-L-Prolin werden in einer Erlenmeyer-Kultur von S. pristinaespiralis in dem Produktionsmedium (vergleiche Beispiel 3), das 17 Stunden alt war, zugesetzt. Wenn die Kultur 24 Stunden alt ist, wird sie entnommen, und die Makrolactone (1) und (2) werden gemäß dem folgenden Protokoll extrahiert.
- 55 ml 0,1M Phosphatpuffer pH 2,9 und 25 ml Acetonitril werden zu 30 ml Brühe gegeben, und das Gemisch wird gerührt und anschließend zentrifugiert. Nach teilweiser Verdampfung des Überstands wird dieser 3mal mit einem Dichlormethanvolumen extrahiert, und die 3 Chlormethylenphasen werden regruppiert und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Chloroform mit 2%igem Methanol aufgenommen und anschließend in eine dichtgepackte Kieselgelsäule injiziert, und die Verbindung (2) wird in Chloroform mit 5% Methanol eluiert. Die Verbindung (2) wird dünnschichtchromatographisch auf dichtem Silicagel mit Chloroform mit 8% Methanol als Elutionsmittel gereinigt. Kurz vor Gebrauch wird es erneut mit HPLC mit einer Nukleosil-C8-Säule (System, beschrieben in Beispiel 3) eluiert.
- Für die zellfreien Präparate (vergleiche Figur 1) ist der gewählte Augenblick für das Hinzufügen des markierten Prolins wichtig, um spezifische erhöhte Aktivitäten zu erhalten.
- Dieses Beispiel beschreibt einen Test, der die Selektion von erfindungsgemäßen verwendbaren Mikroorganismen erlaubt. Es erläutert auch, wie das enzymatische Aktivitätsniveau vom Zeitpunkt der Entnahme der Kulturen, bezogen auf den Beginn der Produktion der Streptogramine, abhängig ist.
- Der getestete Mikroorganismus ist eine Kultur von S. olivaceus ATCC 12019, der unter den Bedingungen von Beispiel 6 gezüchtet wurde. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird ein zellfreies Präparat aus Proben dieser Kultur wie folgt hergestellt: 5 g eines Zentrifugations-Bodensatzes, der mit einem 0,1M Phosphatpuffer pH 7,2 mit 10% Vol./Vol. Glycerin gewaschen wurden, werden in 10 ml 100 mM Bis-Tris-Propanpuffer pH 6,8, der 5 mM Dithiothreit und 0,2 mg/l Lysozym enthält, aufgenommen. Die Suspension wird 30 Minuten lang bei 27ºC inkubiert, dann bei 30.000 g 30 Minuten lang zentrifugiert.
- Ein zellfreier Extrakt, der 50 µg Proteine (hervorgegangen aus dem vorstehend erhaltenen Präparat) enthält, wird in einem Gesamtvolumen von 500 µl in einem 50 mM Bis-Tris-Propanpuffer pH 6,8, der 0,25 µmol NADH, 1 nmol FMN und 3,65 µg der mit ¹&sup4;C gemäß Beispiel 1 markierten Verbindung (2) (entspricht 55 nCi) enthält, 1 Stunde lang bei 27ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 µl Acetonitril und 500 µl 0,1N Salzsäure gestoppt.
- Nach Homogenisation und Zentrifugation werden 200 µl des Überstands in eine analytische Nukleosil-C8-5µ-Säule von 15 cm injiziert und mit einem Gemisch aus 34% CH&sub3;CN und 66% 0,1M Phosphatpuffer pH 2,9 mit einer Geschwindigkeit von 0,8 ml/min eluiert. Die Verbindungen (1) und (2) werden durch spektrophotornetrische Detektion bei 206 nm und durch radiochemische Detektion bestimmt.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Figur 1 dargestellt. Sie zeigen an, daß S. olivaceus die gewünschte enzymatische Aktivität besitzt. Sie zeigen auch, daß diese Aktivität vorübergehend exprimiert wird, wobei die Phase der optimalen Produktion bei 21 Stunden Kultur liegt. Sie zeigen schließlich, daß die Aktivität zu Beginn der Produktionsphase der Streptogramine auftritt, aber daß die aktiven zellfreien Extrakte auch vor dem Anlaufen der Produktion der Streptogramine hergestellt werden können.
- Dieses Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren, wenn ein intakter Mikroorganismus verwendet wird.
- 0,5 ml einer Suspension aus Sporen von Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486 werden unter sterilen Bedingungen zu 40 ml Inokulummedium in einen 300 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Das Inokulummedium besteht aus 10 g/l Maisquellwasser, 15 g/l Saccharose, 10 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 1 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 3 g/l NaCl, 0,2 g/l MgSO&sub4;-7H&sub2;O, 1,25 g/l CaCO&sub3;. Der pH-Wert wird durch Kali-Lauge vor der Einbringung von Calciumcarbonat auf 6,9 eingestellt. Der Erlenmeyer-Kolben wird 46 Stunden 30 Minuten lang bei 27ºC auf einem rotierenden Schüttler mit einer Geschwindigkeit von 325 UpM gerührt.
- 2,5 ml der vorstehenden 46 Stunden 30 Minuten alten Kultur werden steril zu 30 ml Produktionsmedium in einen 300 ml- Erlenmeyer-Kolben gegeben. Das Produktionsmedium besteht aus 25 g/l Sojamehl, 7,5 g/l Stärke, 22,5 g/l Glucose, 3,5 g/l Torula-Hefe, 0,5 g/l Zinksulfat und 6 g/l Calciumcarbonat. Der pH-Wert wird mit Salzsäure vor der Zugabe von Calciumcarbonat auf 6 eingestellt. Die Erlenmeyer-Kolben werden 24 Stunden lang bei 27ºC auf einem rotierenden Schütt-1er mit einer Geschwindigkeit von 325 UpM bewegt. 10 mg/ml der mit ¹&sup4;C gemäß Beispiel 1 markierten Verbindung (2) (entspricht 5,2 µCi an ¹&sup4;C pro Erlenmeyer-Kolben) werden zu den Zeitpunkten 0 und 17 Stunden 30. Minuten dem Erlenmeyer- Kolben zugesetzt. Die Reaktion wird bei 24 Stunden durch von 2 Volumina eines Gemisches aus 34% CH&sub3;CN und 66% 0,1M Phosphatpuffer pH 2,9 gestoppt. Nach der Homogenisation und der Zentrifugation werden 200 µl des Überstands in eine Nukleosil-C8-5µ-Säule injiziert und mit einem Gemisch aus 34% CH&sub3;CN 66% 0,1M Phosphatpuffer pH 2,9 eluiert, um die Verbindung (1), die aus der radioaktiven Verbindung (2) gebildet wurde, zu bestimmen. Die Umwandlungsgrade der Verbindung (2) in der Verbindung (1) werden aus der Menge an in der Verbindung (1) aufgefundenen Radioaktivität berechnet und auf die in den Erlenmeyer-Kolben eingebrachte Radioaktivität bezogen (die Erlenmeyer-Kolben werden durch Luftzirkulation geschlossen: Umlauf 1 l/min).
- Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt: Zeitpunkt der Zugabe von Verbindung (2) Umwandlungsgrad Verbleibende Verbindung (2) % 17 Stunden 30 Minuten Beispiel
- Das in Beispiel 3 beschriebene Protokoll wird unter Verwendung einer Suspension von Sporen von Streptomyces ostreogriseus ATCC 27455 wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend angegeben: Zeitpunkt der Zugabe von Verbindung (2) Umwandlungsgrad Verbleibende Verbindung (2) % 17 Stunden 30 Minuten Beispiel
- Das in Beispiel 3 beschriebene Protokoll wird unter Verwendung einer Suspension von Sporen von Streptomyces mitakensis ATCC 15297 wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend angegeben: Zeitpunkt der Zugabe von Verbindung (2) Umwandlungsgrad Verbleibende Verbindung (2) % 17 Stunden 30 Minuten Beispiel
- Das in Beispiel 3 beschriebene Protokoll wird unter Verwendung einer Suspension von Sporen von Streptomyces olivaceus ATCC 12019 wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend angegeben: Zeitpunkt der Zugabe von Verbindung (2) Umwandlungsgrad Verbleibende Verbindung (2) % 17 Stunden 30 Minuten Beispiel
- Das in Beispiel 3 beschriebene Protokoll wird unter Verwendung einer Suspension von Sporen von Streptomyces loidensis ATCC 11415 wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend angegeben: Zeitpunkt der Zugabe von Verbindung (2) Umwandlungsgrad Verbleibende Verbindung (2) % 17 Stunden 30 Minuten Beispiel
- 5 g eines Zentrifugations-Bodensatzes, der mit einem Phosphatpuffer pH 7,2 mit 10% Vol./Vol. Glycerin gewaschen wurde, von einer Kultur von S. olivaceus ATCC 12019, die 22 Stunden 30 Minuten alt war und unter den Bedingungen von Beispiel 6 erhalten wurde, werden in 10 ml 50 mM Bis-Tris- Propanpuffer pH 6,8 aufgenommen.
- 500 µl dieses Präparats werden mit 3,65 µg der mit ¹&sup4;C gemäß Beispiel 1 markierten Verbindung (2) (55 nCi) 2 Stunden lang bei 27ºC inkubiert. 1 ml eines Gemisches aus 66% 0,1M Phosphatpuffer pH 2,9 und 34% Acetonitril werden am Ende der Inkubation zugesetzt. Nach der Homogenisation und der Zentrifugation werden 200 µl des Überstands mittels HPLC (Beispiel 3) analysiert, um die radioaktive Verbindung (1) zu bestimmen.
- Der Umwandlungsgrad der Verbindung (2) in die Verbindung (1) beträgt 30%.
- 5 g eines Zentrifugations-Bodensatzes, der mit einem 0,1 Phosphatpuffer pH 7,2 mit 10% Vol./Vol. Glycerin gewaschen wurde, von einer Kultur von S. loidensis ATCC 11415, die 17 Stunden 30 Minuten alt war und unter den Bedingungen von Beispiel 7 erhalten wurde, werden in 10 ml 50 mM Bis-Tris- Propanpuffer pH 6,8 aufgenommen.
- 500 µl dieses Präparats werden mit 3,65 µg der mit ¹&sup4;C gemäß Beispiel 1 markierten Verbindung (2) (55 nCi) 2 Stunden lang bei 27ºC inkubiert. 1 ml eines Gemisches aus 66% 0, 1M Phosphatpuffer pH 2,9 und 34% Acetonitril werden am Ende der Inkubation zugesetzt. Nach der Homogenisation und der Zentrifugation werden 200 µl des Überstands mittels HPLC (Beispiel 3) analysiert, um die radioaktive Verbindung (1) zu bestimmen.
- Der Umwandlungsgrad der Verbindung (2) in die Verbindung (1) beträgt 53%.
- 5 g eines Zentrifugations-Bodensatzes, der mit einem 0,1M Phosphatpuffer pH 7,2 mit 10% Vol./Vol. Glycerin gewaschen wurde, einer Kultur von S. pristinaespiralis, die 19 Stunden alt war, und unter den Bedingungen von Beispiel 3 erhalten wurde, werden in 10 ml 100 mM Bis-Tris- Propanpuffer pH 6,8, der 5 mM Dithiothreit und 0,2 mg/l Lysozym enthält, aufgenommen. Die Suspension wird 30 Minuten lang bei 27ºC inkubiert, dann bei 30.000 g 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand stellt das zellfreie Präparat dar.
- In einem ersten Versuch werden 207 µl dieses Präparats (1 mg Protein) in einem Gesamtvolumen von 500 µl in einem 50 mM Bis-Tris-Propanpuffer pH 6,8, der 0,25 µmol NADH, 1 nmol FMN und 3,65 µg der mit ¹&sup4;C gemäß Beispiel 1 markierten Verbindung (2) (55 nCi) enthält, 1 Stunde lang bei 27ºC inkubiert.
- In einem zweiten Versuch werden 414 µl des zellfreien Präparats (2 mg Proteine) verwendet.
- Die Reaktionen werden durch Zugabe von 500 µl CH&sub3;CN und 500 µl 0,1N Salzsäure gestoppt. Nach Homogenisation und Zentrifugation werden 200 µl des Überstands in eine Nukleosil-C8- 5µ-Säule injiziert und mit einem Gemisch aus 34% CH&sub3;CN und 66% 0,1N Phosphatpuffer pH 2,9 eluiert, um die Verbindung (1), die aus der radioaktiven Verbindung (2) gebildet wurde, zu bestimmen. Die Umwandlungsgrade der Verbindung (2) in die Verbindung (1) wurden wie in Beispiel 3 berechnet.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend dargestellt. Volumen der Suspension Umwandlungsgrad Verbleibende Verbindung (2) %
- 5 g eines Zentrifugations-Bodensatzes, der mit einem 0,1M Phosphatpuffer pH 7,2 mit 10% Vol./Vol. Glycerin gewaschen wurde, einer Kultur von S. olivaceus ATCC 12019, die 21 Stunden alt war, und unter den Bedingungen von Beispiel 6 erhalten wurde, werden in 10 ml 100 mM Bis-Tris- Propanpuffer pH 6,8, der 5 wM Dithiothreit und 0,2 mg/l Lysozym enthält, aufgenommen. Die Suspension wird 30 Minuten lang bei 27ºC inkubiert, dann bei 30.000 g 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand stellt das zellfreie Präparat dar.
- Ein zellfreier Extrakt (22 µl des vorstehenden Präparats), der 0,1 mg Proteine enthält, wird in einem Gesamtvolumen von 500 µl in einem 50 mM Bis-Tris-Propanpuffer pH 6,8, der 0,25 µmol NADH, 1 nmol FMN und 3,65 µg der gemäß Beispiel 1 mit ¹&sup4;C markierten Verbindung (2) (55 nCi) enthält, 1 Stunde lang bei 27ºC inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 ml CH&sub3;CN und 500 µl 0,1N Salzsäure gestoppt.
- Nach Homogenisation und Zentrifugation werden 200 µl des Überstands mittels HPLC analysiert, um die radioaktive Verbindung (1) zu bestimmen. Der Umwandlungsgrad der Verbindung (2) in die Verbindung (1) beträgt 93%.
- 5 g eines Zentrifugations-Bodensatzes, der mit einem 0,1M Phosphatpuffer pH 7,2 mit 10% Vol./Vol. Glycerin gewaschen wurde, einer Kultur von S. loidensis ATCC 11415, die 17 Stunden 30 Minuten alt war und unter den Bedingungen von Beispiel 7 erhalten wurde, werden in 10 ml 100 mM Bis-Tris- Propanpuffer pH 6,8, der 5 mM Dithiothreit und 0,2 mg/l Lysozym enthält, aufgenommen. Die Suspension wird 30 Minuten lang bei 27ºC inkubiert, dann 30 Minuten lang bei 30.000 g zentrifugiert. Der Überstand stellt das zellfreie Präparat dar.
- 79 µl dieses zellfreien Präparats, entsprechend 0,2 mg Proteine, werden in einem Gesamtvolumen von 500 µl in einem 50 mM Bis-Tris-Propanpuffer pH 6,8, der 0,25 µmol NADH, 1 nmol FMN und 3,65 µg der mit ¹&sup4;C gemäß Beispiel 1 markierten Verbindung (2) (55 nCi) enthält, 1 Stunde lang bei 27ºC inkubiert.
- Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 µl CH&sub3;CN und 500 µl 0,1M Salzsäure gestoppt. Nach der Homogenisation und Zentrifugation werden 200 µl des Überstands mittels HPLC analysiert, um die radioaktive Verbindung (1) zu bestimmen.
- Der Umwandlungsgrad der Verbindung (2) in die Verbindung (1) beträgt 92%.
Claims (10)
1) Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel
(1)
wobei man eine Verbindung der Formel (2)
in Gegenwart eine Mikroorganismus oder eines zellfreien
Präparats dieses Mikroorganismus behandelt, dadurch
gekennseichnet, daß
- der Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der
Streptogramine produziert, oder von einem
Mikroorganismus,
der Streptogramine produziert, abgeleitet
ist, und die 2-3-Bindung von D-Prolin der mehrfach
ungesättigten Makrolaktone der Gruppe A der
Streptogramine in Dehydroprolin oxidieren kann, und
- man die Behandlung der Verbindung (2) in Gegenwart des
Mikroorganismus oder des aus dem Mikroorganismus
hervorgegangenen zellfreien Präparats in der Phase der
optimalen Produktion der Enzymaktivität durchführt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus oder das
daraus hervorgegangene zellfreie Präparat direkt dem
Medium zur Bildung der Verbindung (2) zusetzt.
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Reaktion in einem wäßrigen
gepufferten Medium durchführt.
4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Verbindung der
Formel (2) mit einem zellfreien Präparat behandelt.
5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus aus den
Stämmen Streptomyces Dristinaespiralis, Streptomyces
alborectus, Streptomyces diastaticus, Streptomyces
graminofaciens, Streptomyces mitakaensis, Streptomyces
loidensis, Streptomyces olivaceus, Streptomyces
ostreogriseus, Streptomyces virginiae und Micromonospora
und Derivaten dieser Stämme auswählt.
6) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines
oder mehrere Kofaktoren des Enzyms durchführt.
7) Zellfreies Präparat, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine Enzymaktivität besitzt, die die 2-3-
Bindung von D-Prolin der mehrfach ungesättigten
Makrolaktone der Gruppe A der Streptogramine in
Dehydroprolin oxidieren kann, und daß es von einem
Mikroorganismus abgeleitet ist, der Streptogramine in der
Phase der optimalen Produktion der Enzymaktivität
produziert.
8) Verfahren zur Gewinnung eines zellfreien Präparats
nachanspruch7, dadurchgekenn zeichnet, daß
man die folgenden Stufen durchführt:
(a) man bestimmt die Wachstumsphase des Mikroorganismus,
im Verlauf derer die Expression der Enzymaktivität
optimal ist,
(b) man bricht dem Mikroorganismus in der Phase der
optimalen Produktion der Enzymaktivität auf, und
(c) man beseitigt gegebenenfalls die Zelltrümmer.
9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen durch
physikalische, chemische oder enzymatische Behandlung
aufbricht.
10) Verfahren nach den Ansprüchen 8 oder 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man in wäßrigem, gepuffertem
Medium aufbricht.
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