DE2746209A1

DE2746209A1 - Neues antibiotikum und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE2746209A1
Application number: DE19772746209
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Asai; Eiji Higashide; Seiichi Tanida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-10-14
Publication date: 1978-10-19
Also published as: NL188102B; YU178582A; DE2746209C2; DK458877A; IE46064B1; PL122289B1; GR66051B; CS214749B2; IE46064L; HU178359B; PH13381A; SE7711542L; SE8302517D0; NL188102C; PT67854B; SE442873B; NL7711274A; ES472230A1; YU245377A; IT7821818A0

Description

VON KREISLER SCHÖNWALD MEYER FUES VON KREISLER KELLER

EISHOLD SEL

M6209

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler "fr" 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln

5 KÖLN 1 13. Okt. 1977/Fu

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan

Neues Antibiotikum und Verfahren zu dessen Herstellung Telefon: (0221) 2345 41 - 4 · Telex; (

lopo d ' Telenrmni

im: Dompolenl Köln

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum, nämlich das Antibiotikum C-15003, auf ein Verfahren zur Herstellung desselben und auf ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten des besagten Antibiotikums.

Es wurden verschiedene Bodenproben und andere Proben gesammelt und die daraus isolierten Mikroorganismen gesichtet. Dabei wurde festgestellt, dass diese Mikroorganismen teilweise ein neues Antibiotikum zu erzeugen vermögen, dass solche Mikroorganismen der Gattung Nocardia angehören und dass durch die Züchtung solcher Mikroorganismen in einem geeigneten Medium in der Kulturbrühe das besagte Antibiotikum angereichert werden kann. Es wurde ferner festgestellt, dass aus diesem Antibiotikum Derivate hergestellt werden können. Diese Feststellungen haben zur vorliegenden Erfindung geführt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf: (1) das Antibiotikum C-15003, welches der folgenden allgemeinen Formel entspricht:

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-tr- >

(ΐ)

,/^CH3

worin R -CO-CH , -CO-CH₂-CH₂-CH oder -CO-CH₂-CH

CH

bedeutet,

(2) ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums σ-15ΟΟ3_ϊ welches darin besteht, dass man einen das Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stamm der Gattung Nocardia in einem Medium züchtet, um den Stamm in der Kulturbrühe zur Bildung und Anreicherung des Antibiotikums C-15003 zu bringen, und das besagte Antibiotikum C-15003 aus der besagten Brühe gewinnt, und

(3) ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der folgenden Formel:

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(ID

CH-,

welches darin besteht, dass man das Antibiotikum C-15003 der folgenden allgemeinen Formel:

CH-

worin R -CO-CH , -CO-CH₂-CH₂-CH₃ oder -CO-CH₂-CH

CH.

CH. CH,

bedeutet, hydrolysiert.

In der vorliegenden Beschreibung bedeutet die Bezeichnung "Antibiotikum C-15003" generell die drei Verbindungen der oben erwähnten allgemeinen Formel I als

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Gruppe oder eine Mischung von zwei oder drei der besagten Verbindungen oder letzten Endes eine beliebige dieser Verbindungen. Mit Bezug auf die allgemeine Formel I wird die Verbindung, in welcher R den Rest

.GH,

-CO-CH

CH,

darstellt, in der vorliegenden Beschreibung als "Antibiotikum C-15003 P-3" oder nur "C-I5OO3 P-3" bezeichnet. Die Verbindung, in welcher R den Rest" -CO-CHp-CHp-CH, darstellt, wird als "Antibiotikum C-15003 P-3'" oder nur "C-15003 P-3"' bezeichnet. Die Verbindung, in welcher R den Rest

-CO-CH₂-CH

CH,

OH,

darstellt, wird in der vorliegenden Beschreibung als "Antibiotikum C-15003 P-V oder nur "C-15003 P-V bezeichnet und die Verbindung, in welcher R das Wasserstoffatom ist (womit diese Verbindung der allgemeinen Formel II entspricht), wird nachstehend als "Antibiotikum C-15003 P-O" oder nur "C-15003 P-O" bezeichnet.

Als Beispiel eines das Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stammes eines Mikroorganismus kann man einen Actinomycetenstamm Nr. C-15003 bezeichnen, welcher aus dem Boden oder anderen Proben bei der Sichtung von ein Antibio-

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/0

tikum erzeugenden Mikroorganismen isoliert worden ist.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden in analoger Weise, wie dies von Schirling & Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology lj>, 313-340 (1966)] vorgeschlagen wurde, erforscht. Die Resultate dieser Beobachtungen bei 28 ⁰C in einer Zeitspanne von 21 Tagen finden sich nachfolgend.

1) Morphologische Eigenschaften

Das vegetative Mycel dehnt sich gut aus und entwickelt sich zu Verzweigungen und dies sowohl auf Agar als auch im flüssigen Medium, Manche der Hyphen haben einen Durchmesser von 0,8 bis 1,2 um und können sich in gewissen Fällen unter Bildung von Bruchstücken teilen, welche Stäbchenbakterien oder verzweigten kurzen Hyphen ähneln. Der Stamm zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen taxonomischen Medien, wobei auf dem vegetativen Mycel sich ein Luftmycel anlagert. Häufig bilden sich auch coremiaähnliche Körper (50-200 χ 200 - 1000 /im), auf welchen weiteres Luftmycel wächst. Manche der Luftinycele sind gewunden, wobei hin und wieder auch gerade oder weite spiralähnliche Konfigurationen auftreten können. Die mikroskopische Untersu-, chung von älteren Kulturen zeigt, dass nur in wenigen Fällen die conidienartigen Zellen in Ketten vorliegen,

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während die aus den Oberflächen solcher Kulturen erhaltenen Zellsuspensionen bei der Betrachtung unter dem Mikroskop verschiedentlich verlängerte, ellipsoidale (0,8-1,2 ^m χ 4,8-6,8 ^m) und ellipsoidale (0,8-1,2 ^m χ 1,0-2,0 /im) Körper, welche Arthrosporen ähneln, enthielten.

Beobachtungen unter dem Elektronenmikroskop ergaben, dass diese Körper glatte Oberflächen haben.

2) Zellenzusammensetzung

Der Stamm wurde in einem modifizierten ISP No. 1-Medium während 66 bis 90 Stunden bei 28 ⁰C unter Schütteln gezüchtet, worauf man die Zellen sammelte und spülte. Nach der Methode von B. Becker et al. [Applied Microbiology !12, 421 (196*0] und der Methode nach M.P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine 73., 93¹I (1968)] wurden die so erhaltenen, ganzen Zellen auf ihren Gehalt an Diaminopimelinsäure und Zuckerzusammensetzung untersucht. Die Säure lag in der meso-Form vor, während Stellen beobachtet werden konnten, welche auf Galactose und Arabinose

20 deuteten.

3) Eigenschaften auf taxonomischen Medien Der Stamm zeigte ein verhältnismässig gutes

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Al

Wachstum auf verschiedenen Medien, wobei das vegetative Mycel in den Anfangsphasen der Züchtung farblos bis blassgelb und in den letzteren Phasen hellgelblich-lohfarben bis gelblichlohfarben war. Der Stamm erzeugte lösliche Pigmente, welche in verschiedenen taxonomischen Medien gelb bis gelblichlohfarben waren. Das Luftmycel war pulvrig und zeigte im. allgemeinen ein massiges Wachstum bei weisser bis gelber oder hellgelblichlohfarbener Färbung. Die Eigenschaften des Stammes in verschiedenen taxonomisehen Medien finden sich in der folgenden Tabelle I.

Tabelle I

Züchtungseigenschaften des Stammes No. C-15003 auf taxonomischen Medien

(A) Saccharosenitrat-Agar:

Wachstum (G): üppig, leuchtendmelonengelb (3 ia)

bis bernsteinlohfarben (3 Ic) , Bildung von coremiaähnlichen Gebilden Luftmycel (AM): spärlich, weiss Lösliches Pigment (SP): keines oder blass gelblichlohfarben

(B) Glycerinnitrat-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von coremiaähnlichen Gebilden

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43

AM: massig, weiss SP: kein

(C) Glucose-Asparagin-Agar:

-if

G : massig, hellringelblumenfarbig (3 pa) bis leuchte
5 tendgelb (2 pa) .

AM: spärlich, weiss SP: leuchtendgelb (2 pa)

(D) Glycerin-Asparagin-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) , Bildung von 10 coremiaähnlichen Körpern

AM: spärlich, weiss SP: kein

(E) Stärkeagar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellwei-15 zenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen

Körpern

AM: reichlich, elfenbeinfarbig (2 ca) SP: kein

(F) Nähragar:

20 G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis khakigelb

(2 ga)*, Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, weiss
SP: kein

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(G) Calciummaleat-Agar:

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellweizenfarbig (2 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: massig, v/eiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)

SP: kein (H) Hefeextrakt-Malζextrakt-Agar:

G : massig, bernsteinfarbig (3 lc) bis leuchtend gelb (3 la) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)

SP: kein (I) Hafermehl-Agar:

■Y-

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) " bis khakigelb

j* (2 ga) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern AM: spärlich, v/eiss bis hellgelb

SP: kein

(J) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar: G : massig, khakigelb (2 ga) AM: kein SP: khakigelb (2 ga)*

(K) Tyrosin-Agar;

G : massig, hellelfenbeinfarbig (2 ca) bis hellmelonengelb (3 ea) , Bildung von coremiaähnlichen Körpern ^d^ AM: massig, weiss bis hellelfenbeinfarbig (2 ca)

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λ /4b /·ν

SP: kamelfarben (3 ie)

Farbcode nach "Color Harmony Manual", Ί. Auflage (Container Corporation of America, 1958)

¹O Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes finden sich in der folgenden Tabelle II. Der Temperaturbereich für das Wachstum lag bei 12 bis 38 ⁰C Der Temperaturbereich, in welchem ein gutes Wachstum des Luftmycel auf Agar (ISP No. 2) eintrat, lag bei 20 bis 35 ⁰C.

Tabelle II

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 waren die folgenden:

Temperaturbereich für das Wachstum: 12 bis 38 ⁰C

Temperaturbereich für das Wachstum des Luftmycels: 20 bis 35 ⁰C

Verflüssigung von Gelatine: positiv

Hydrolyse von Stärke: positiv

Reduktion von Nitraten: positiv

Peptonisierung von Milch: positiv

Coagulierung von Milch: negativ

Zersetzung von Casein: positiv

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Herstellung von Melanoid-Pigmenten: negativ (Pepton-

Hefeextrakt-Eisen-Agar),

positiv (Tyrosin-Agar)

Zersetzung von Tyrosin: positiv

Zersetzung von Xanthin: negativ

Zersetzung von Hypoxanthin: negativ

Toleranz in bezug auf Lysozym: positiv

Toleranz in bezug auf Natriumchlorid: 2 %

5) Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen

Die Verwendung von verschiedenen Kohlenstoffquellen wurde unter Verwendung eines Mediums, wie es in Pridham und Gottlieb [Journal of Bacteriology 5£, 107 (1918)] beschrieben ist, und eines Grundmediums gleicher Zusammensetzung plus 0,1 % Hefeextrakt untersucht. Dabei liessen sich die in der folgenden Tabelle III wiedergegebenen Werte eruieren.

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27462C9

Tabelle III

Verwendung von Kohlenstoffquellen durch den Stamm No.C-15003

Wachstum Kohlenstoffquellen Wachstum

+ ++ Raffinose + +

+ + Melibiose ' + +

++ ++ i-Inositol - -

+ + D-Sorbitol - -

D-Mannitol ++ ++

Glycerin - +_

lösliche Stärke + +

Blindversuch - -

Kohlenstoffquelle D-Xylose L-Arabinose D-Glucose D-Galactose D-Fructose L-Rhamnose D-Mannose Saccharose Lactose - -

Maltose + +

Trehalose + ++

Grundmedium bei Zusatz von 0,1 % Hefeextrakt

Anmerkung: +.++; üppiges Wachstum

+-+: gutes Wachstum

+: Wachstum

+_: schlechtes Wachstum

-: kein Wachstum

6) Andere Eigenschaften

Die Zellen wurden nach der weiter oben unter 2) wiedergegebenen Methode gesammelt und DNA nach einer analogen Methode jener von J. Marmur et al. [Journal of Molecular

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-W-

Biology, 3_> ²⁰^> !9^1] hergestellt. Der G-C(Guanin-Cytosin)-Gehalt des DNA betrug ungefähr 71 MoI-*.

Die Gramfärbung des vegetativen Mycels dieses Stammes war positiv.
Die obigen Eigenschaften des Stammes No. C-15003 wurden mit den Angaben in S.A. Waksman's· "The Actinomycetes" Bd. 2 [The Williams and Wilkins Co., I96I]; R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bac^ teriology, 8. Ausgabe, 197¹J"; und anderen Literaturstellen verglichen.

Es wurde angenommen, dass dieser Stamm zur Gruppe III der Gattung Nocardia gehören würde. Es konnte aber unter den bekannten Stämmen keine Art gefunden werden, welche die beschriebenen Eigenschaften aufwies. Daraus ist zu ¹^ schliessen, dass die- „ Stamm eine neue Art von Mikroorganismen darstellt.

Der besagte Stamm No₁ C-15003 ist beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (PERM)" unter der Nummer 3992, beim "Institute for Fermentation, Osaka, (IFO)" unter der Nummer IFO 13726 und bei "The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, U.S.A." unter der Nummer 3128I registriert worden.

Während der Stamm No. C-15003, wie soeben er-

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B_-

wähnt, eine neue Art der Gattung Nocardia ist, kann er, wie dies Mikroorganismen im allgemeinen tun, Variationen und Mutationen eingehen, und dies entweder spontan oder unter dem Einfluss eines Mutagens. So sollten beispielsweise die verschiedenen Varianten des Stammes, welche durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, ultraviolettem Licht usw., durch.Monozellen-Isolierung, durch Züchtung auf verschiedene Chemikalien enthaltenden Medien oder durch eine beliebige andere mutagene Behandlung erhältlich sind, sowie die Mutanten, die sich spontan aus dem Stamm ableiten, im wesentlichen nicht als Vertreter einer anderen bestimmten Art betrachtet werden. Irgendwelche die Antibiotika C-15003 P-3, P-3¹ und/oder P-4 zu bilden vermögende Varianten und Mutanten lassen sich für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwenden.

So liefert beispielsweise der Stamm No. C-15003 durch verschiedene mutagene Behandlungen Mutanten, welche sozusagen keine löslichen Pigmente erzeugen, Mutanten mit Substratmycelien, welche farblos, gelblichgrün, rötlichlohfarben oder orangerot sind, Mutanten, deren Hyphen sich leicht in bazillenartige Elemente oder verzweigte, kurze Hyphen aufteilen lassen, und Mutanten mit reichlichen, weissen Luft mycelien oder im wesentlichen ohne Luftmycelien. Das Medium, welches für die Züchtung

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eines ein Antibiotikum C-15003 erzeugenden Stammes verwendet wird, kann ein beliebiges flüssiges oder festes Medium sein, vorausgesetzt, dass es durch den Stamm verwertbare Nährstoffe enthält. Vorzugsweise wird man aber zur Erzielung einer hohen Produktion ein flüssiges Medium verwenden. Das Medium kann Kohlenstoff- und Stickstof fquellen, welche durch den Stamm No. C-15003 assimiliert und verdaut werden, anorganische Stoffe, Spurennährmittel usw. enthalten. Als Beispiele von in Frage kommenden Kohlenstoffquellen kann man Glucose, Lactose, Saccharose, Maltose, Dextrin, Stärke, Glycerin, Mannitol, Sorbitol usw., Fette und OeIe, z.B. Sojabohnenöl, Specköl, Hühneröl usw., und dergl. nennen. Als Stickstoffquellen seien beispielsweise Fleischextrakt, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeit, Pepton, Baumwollsamenmehl, behandelte Melassen, Harnstoff, Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat usw., und dergl. verwendet werden. Das Medium kann ferner Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesiumsalze usv/,, Eisen-¹, Magnesium--, Zink-, Kobalt-, Nickelsalze usw., Salze der Phosphorsäure, Borsäure usw. und organische Salze, z.B. Acetate und Propionate, enthalten. Ferner kann das Medium zusätzlich verschiedene Aminosäuren, wie z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, Glycin, Lysin, Methionin. Prolin etc.. Peptide,z.B. Dipeptide, Tripeptide

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etc., Vitamine, z.B. die Vitamine B₁, B₃, Nicotinsäure, B C, E etc., Nucleinsäuren, z.B. Purin, Pyriraidin und Derivate davon, enthalten. Zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann man auch eine anorganische oder organisehe Säure, ein Alkali, ein Puffermittel oder dergl. verwenden. Geeignete Mengen an Oelen, Fetten, oberflächenaktiven Mitteln usw. können ebenfalls als schaumverhindernde Mittel zugesetzt werden.

Die Züchtung kann unter beliebigen stationären Bedingungen, unter Schütteln, unter submersen aeroben Bedingungen oder unter anderen Züchtungsbedingungen erfolgen. Urn eine hohe Ausbeute zu erhalten, wird man vorzugsweise eine submerse, aerobe Züchtung vornehmen. Die Züchtungsbedingungen hängen selbstverständlich vom Zustande und von der Zusammensetzung des Mediums, des Stammes, der Züchtungsmethode und.anderen Faktoren ab. Normalerweise erfolgt sie bei 20 bis 35 ⁰C bei einem anfänglichen pH-Wert von ungefähr 7,0. Vorzugsweise wird man als Züchtungstemperatur eine - solche von 23 bis 30 ⁰C bei einem anfänglichen pH-Wert von 6,5 bis 7,5-anwenden. Auch die Inkubationsdauer schwankt je nach den oben erwähnten Faktoren, wobei man die Inkubation so lange fortsetzt, bis der Titer des gewünschten antibiotischeh Produktes einen Maximalwert erreicht hat. Im Falle von Schüttelkulturen oder aerob submersen Kulturen

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in einem flüssigen Medium liegt die normalerweise erforderliche Zeitdauer bei ungefähr 48 bis Ikk Stunden.

Das Wirkungsvermögen des Antibiotikums wurde mit Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus getestet. Dabei wurde der oben erwähnte !Mikroorganismus auf einem Testmedium [20 g Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt (Difco), 2 g Glucose, 1000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarer Phosphatpuffer (pH 7,0)] bei 28 ⁰C während Μ bis Ί8 Stunden wachsen gelassen, worauf man das Wirkungsvermögen des Antibiotikums durch die Reihenverdünnungsmethode unter

Beobachtung der Wachstumstrübung durch Asζites-Tumor-Zellen und durch Dünnschichtchromatographie, abgekürzt TLC, nach den weiter unten beschriebenen Angaben bestimmt.

Die neuen Antibiotica C-15003 P-3, P-3¹ und/oder P-I wurden sowohl extrazellulär als auch intrazellulär in der erzielten Kulturbrühe erhalten und angereichert.

Diese Substanzen sind auch durch TLC festgestellt worden. Die Fermentierungsbrühe wurde somit durch Filtrieren oder Zentrifugieren in Zellen und Filtrat aufgeteilt und das Filtrat mit dem gleichen Volumen Aethylacetat extrahiert. Dann wurde den Zellen die gleiche Menge an 70 %-igem wässrigen Aceton wie die Menge des Filtrates zu-

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η ^. ^v 2 ζ c 9

gegeben, worauf man nach 1-stündigem Rühren bei 20 ⁰C die Suspension filtrierte. Das Aceton wurde aus dem Filtrat entfernt und das erhaltene wässrige Filtrat mit Aethylacetat extrahiert. Jeder dieser Extrakte wurde dm Volumenverhältnis 1:100 eingeengt und über einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Deutsche Bundesrepublik, Kieselgel 60 FpcZjj °>²5 mm,-20 χ 20) (Lösungsmittelsystem: Chloroform und Methanol in einem Mischungsverhältnis von 9:1) der Dünnschichtchromatographie unterworfen. Das Wirkungsvermögen wurde auf Grund der Intensitat der bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 2537 beobachteten Stellen bestimmt.

Die auf diese Weise in der Kulturbrühe er-

zeugten C-15003 P-3, P~3^f und/oder P-4 sind lipophyle und neutrale Substanzen, welche sich durch bei der Gewinnung solcher mikrobiellen Metabolite normalerweise übliche Trenn- und Reinigungsmethoden isolieren lassen. So kann man beispielsweise so arbeiten, dass man sich die Unterschiede zwischen dem Antibiotikum und den Verunreinigungen bezüglich der Löslichkeit zu nutze macht. Man kann'aber auch die fraktionierte Adsorptionsaffinität verschiedener Adsorptionsmittel, wie z.B. Aktivkohle, makroporöser, nichtionogener Harze, Kieselgel, Aluminiumoxyd usw. zur Anwendung bringen, Ferner kann man auch die Verunreinigungen mit Hilfe von Ionenaustauschharzen beseitigen.

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G_-

Man kann aber schliesslich auch andere Methoden oder aber die vorgenannten Methoden in geeigneter Kombination oder aber wiederholt anwenden.

Da, wie oben erwähnt, C-15003 P~3, P-3¹ und Ρ-Ί sowohl im Filtrat als auch in den Zellen vorhanden sind, wird man die Antibiotika mit Hilfe eines solchen Adsorptionsmittels, sofern ein solches verwendet wird, entweder direkt oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle eines Filtrates oder nach erfolgter Extraktion mit einem Lösungsmittel im Falle von mikrobiellen Zellen trennen und reinigen. Die Extraktion mit einem Lösungsmittel kann nach einer beliebigen folgenden Methode oder mit Hilfe einer anderen Methode, beispielsweise (1) durch Lösungsmittelextraktion aus der Kulturbrühe vor dem Abtrennen der Zellen und (2) durch Lösungsmittelextraktion der Zellen und des durch Filtrieren gewonnenen Filtrates, Zentrifugieren oder in anderer Weise, durchgeführt werden. Um das Filtrat und die Zellen unabhängig voneinander zu extrahieren, wird man mit Vorteil die folgende Methode anwenden.

Für die Extraktion des Filtrates geeignete Lösungsmittel sind mit Wasser nicht mischbare, organische Lösungsmittel, wie z.B. Fettsäureester, wie Aethylacetat oder Amylacetat, Alkohole, wie Butanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, und Ketone,

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z.B. Methylisobutylketon. Die Extraktion erfolgt bei einem dem neutralen pH-Wert nahen pH-Wert und vorzugsweise wird die zuvor auf einen pH-Wert von 7 eingestellte Kulturflüssigkeit mittels Aethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf wird das Konzentrat mit einem nichtpolaren Lösungsmittel, z.B. Petroläther oder Hexan, versetzt und das rohe Produkt I, welches die wirksame Verbindung enthält, gewonnen Da bei der Dünnschichtchromatographie zusätzlich zum Antibiotikum C-15003 eine gewisse Zahl von Stellen festgestellt werden, wird das Produkt I anschliessend den folgenden Reinigungs verfahren unterzogen. Dabei zeigt sich, dass eine routinemässige Reinigungsmethode, insbesondere die Adsorptionschromatographie, wertvoll ist, wobei für diesen Zweck eines der üblichen Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Aluminiumoxyd, ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz usw., verwendet werden kann. Zur Reinigung des rohen Produktes I ist Kieselgel besonders wertvoll. Die Entwicklung kann beispielsweise, ausgehend von Petroläther und Hexan, erfolgen, während die Eluierung des Antibiotikums . ~"^ C-15003 durch Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie Aethylacetat, Aceton, Aethanol oder Methanol, erfolgt. Gemäss einem typischen Verfahren verwendet man Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05 bis 0,2 mm) -als Trägermittel und führt die Säulenchromato-

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graphie mit einer Mischung von Hexan und Aethylacetat durch, wobei der Hexananteil nacheinander zunimmt. Das Eluat wird gesammelt und durch TLC geprüft, wobei man die das Antibiotikum C-15003 enthaltenden Fraktionen sammelt und unter vermindertem Druck einengt. Hierauf versetzt man das Konzentrat mit Petroläther oder Hexan, wodurch das rohe Produkt II erhalten wird. Da dieses Produkt immer noch Verunreinigungen enthält, wird es in der nachstehend beschriebenen Weise weiter gereinigt. So kann man das Produkt II beispielsweise mit Hilfe einer zweiten Kieselgelsäule unter Verwendung eines andersartigen Lösungsmittelsystems reinigen. Das für diesen Zweck verwendete Entwicklungssystem kann aus einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z.B. Dichlormethan oder Chloroform, bei Zugabe eines polaren Lösungsmittels, wie einem Alkohol, z.B. Aethanol oder Methanol, einem Keton, z.B. Aceton oder Methyläthylketon, oder dergl. bestehen. Auf diese Weise lässt sich das Antibiotikum C-15003 isolieren. Die Rei- , henfolge der Lösungssysteme für diese erste und die zweite Kieselgel säulen kann auch umgekehrt werden, wobei man überdies nötigenfalls auch übliche organische Lösungsmittel in Verbindung mit den obigen Systemen verwenden kann.

Verwendet man für das Reinigen des rohen Produktes II ein makroporöses Adsorptionsharz, so erfolgt '25 die Eluierunß des Antibiotikum C-15003

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mit einer Mischung von Wasser mit einem niederen Alkohol, einem niederen Keton oder einem Ester. Als niederer Alkohol kann man beispielsweise Methanol, Aethanol, Propanol oder Butanol und als niederes Keton beispielsweise Aceton oder Methyläthylketon verwenden. Der Ester kann beispielsweise Aethylacetat sein. Gemäss einer typischen Arbeitsweise löst man das rohe Produkt II in 60 % wässrigem Methanol und adsorbiert auf einer Säule von Diaion HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.). Diese Säule wird anschließend mit 70 %-igem wässrigem Methanol gewaschen und mit 90 55-igem wässrigem Methanol eluiert. Auf diese Weise wird das Antibiotikum C-15003 aus der Säule

eluiert.

Bei jeder der vorgenannten Methoden werden die das Antibiotikum C-15003 enthaltenden Fraktionen gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das getrocknete Produkt wird dann mit dem 5" bis 8-fachen Volumen Aethylacetat versetzt und das Gemisch stehengelassen, worauf sich Kristalle des Antibiotikums C-15003 ausscheiden. Diese Kristalle enthalten C-15003 P-3, P-3^f und P-4. Diese Verbindungen werden dann mit Hilfe eines Adsorptionsmittels beispielsweise der oben genannten Art voneinander getrennt. Verwendet man somit Kieselgel oder ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz und die oben erwähnten Lösungsmittel, so können die gewünschten Verbindungen fraktioniert

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eluiert werden. Verwendet man beispielsweise Kieselgel, so erfolgt die Entwicklung mittels Hexan, Aethylacetat oder einer Mischung von Chloroform und Methanol, wodurch C-15OO3-P-J4, P-3¹ und P-3 in der erwähnten Reihenfolge erhalten werden. Nach erfolgter Dünnschichtchromatographie werden die C-15003-P-^, P-3¹ und P-3 entsprechenden Fraktionen unter vermindertem Druck eingeengt und Aethylacetat den Konzentraten zugegeben. Auf diese Weise erhält man die entsprechenden Verbindungen in Form von Kristallen. Verwendet man ein makroporöses, nichtionogenes Adsorptionsharz, so kann man eine stufenmässige Eluierung mit schv/ankenden Verhältnissen an Alkohol, Keton oder Ester in bezug auf das Wasser anwenden. Bei Anwendung der stufenweisen Eluierungsmethode unter Verwendung von 60 #-igem wässrigem Methanol und 95 #-igem wässrigem Methanol unter Zugabe von 5 % Natriumchlorid erhält man in der vorgenannten Reihenfolge C-15003 P-3, P-3¹ und p-l|. Nachdem man durch Dünnschichtchromatographie behandelt hat, wird jede Gruppe der aktiven Fraktionen unter vermindertem Druck eingeengt und aus Aethylacetat zum Auskristallisieren gebracht, Die isolierten Kristalle enthalten Aethylacetat als Kristallisierungslösungsmittel und zeigen nach dem Trock nen über Phosphorpentoxyd während 8 Stunden bei 70 ⁰C die nachstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften.

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Tabelle 4

	Antibiotikum C-15003	P - 3 C, -H₂₁, ClN-O_n = 6 35.169	P - 3¹ C₃₂H₄₃C1N₂O₉=635,169	P - 4 0,,H₁₁₁-ClN-O₀ = 64 9 196 33 45 2 9 '
	190 - 192 ⁰C	182 - 185 ⁰C	177 - 180 ⁰C
Schmelzpunkt (⁰C)	-136° + 10°· (c=0,375 CHCl₃)	-134° + 10° (c=0,11 CHCl₃)	-142° + 10° (c=0,522 CHCl₃)
Spezifische 22° Drehung [a]_ß	C 60,06	60,09	60,65
Elementaranalyse	H 7,04	7,02	7,05
Gef.: {%)	N 4,33	4,34	4,25
	Cl 5,37	5,99	5,23
	C 60,51	60,51	61,05
Elementaranalyse	H 6,82	6,82	6,99
Ber.: (?)	N 4,4l	4,41	4,32
	Cl 5,58	5,58	5,46

Antibiotikum C-15003

P - 3 P - 3

P - 4

Ultraviolettabsorptionsspektrum nm(£)
(in Methanol)

233(30250) 24o(sh 28450) 252(27640) 280(5750) 288(5700)

233(30155) 24o(sh 28250)
252(27600) 280(5750)
288(5700)

233(29900) 24O(sh 28240) 252(27590) 280(5712) 288(5680)

Infrarotabsorptionsspektrum
(cm"¹)KBr

1740, 1730, 1670, 1580,

1445, 1385, 1340, 1255,

1180, 1150, 1100, 1080,

1038

1740, 1730, 1670, I58O,

1445, 1385, 1340, 1255,

1180, 1150, 1100, 1080,

1740, 1730, I67O, 1580,

1445, 1385, 13^0, 1255,

1180, 1150, 1100, 1080,

IO38

magnetische Kernresonanzspektren
(ppm)
lOOMHz in CDCl,

l,27(d) (3H)
l,28(d) (3H)

l,06(t) (3H)

l,03(d) (6H)

Kassenspektren(m/e)

573, 485, 470, 450 573, 485, 470, 450

587, 485, 470, 450

Löslichkeit

Im Petroläther, Hexan und Wasser unlöslich, in Benzol und Aether spärlich löslich, in Chloroform, Aethylacetat, Aceton, Aethanol, Methanol, Pyridin, Tetrahydrofuran und Dirnethylsulfoxyd löslich unlöslich in Petroläther,
Hexan und Wasser, spärlich löslich in Benzol
und Aether, löslich in .
Chloroform, Aethylacetat,
Aceton, Aethanol, Methanol, Pyridin, Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxyd

unlöslich in Petroläther, Hexan und Wasser. Spärlich löslich in Benzol und Aether. Löslich in Chloroform, Aethylacetat, Aceton, Aethanol, Methanol, Pyridin, Tetrahydrofuran und Dimethylsulfoxyd

Farbreaktionen

Dragendorff: positiv Beilstein: positiv Dragendorff: positiv
Beilstein: positiv

Dragendorff: positiv Beilstein: positiv

34

Auf Grund der obigen Molekularformel und der nachstehend wiedergegebenen antimikrobiellen und tumorverhindernden Wirksamkeitswerte wurde das neue Antibiotikum mit den bekannten Gruppen von Antibiotika verglichen. In der Literatur liess sich keine dem Antibiotikum C-15003 ähnliche Gruppe feststellen, Forschungen in bezug auf Substanzen, welche ähnliche Ultraviolettabsorptionswerte wie das vorliegende Antibiotikum liefern könnten und pflanzlichen oder natürlichen, organischen Ursprungs wären, führten zu den Maytanacingruppen. Insbesondere auf Grund der in Frage kommenden Molekularformeln wurde vermutet, dass das Antibiotikum zur Maytanacingruppe von Verbindungen, welche 2 Stickstoffatome enthalten, gehört. Maytanacin wurde als eine Pflanzenkomponente erhalten. Hierüber wird in Journal of American Chemical Society 97., 5294

(1975) berichtet. Das Massenspektrum für Maytanacin ist das folgende:

M⁺-Ca) M⁺-(a+b) 485-CH 485-Cl 545 485 470 450

20 (a)=H₂0 + HNCO 0

(b)=R-C-OH

Die Werte m/e 485, 470 und 450 für C-15003 P-3, P-3¹ und P-4 führen zur Ueberzeugung, dass diese Verbindungen eine identische Skelettstruktur mit jener von Maytanacin haben mit dem Unterschied in der in 3-Stellung vorhandenen

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10

Acylgruppe. Es ergibt sich daraus eindeutig, dass das Antibiotikum C-15003 eine neue Verbindung darstellt. Werden C-15003 P-3, P-3¹ und P-*J mit einem Alkali behandelt und durch Gaschromatographie in bezug auf die in Freiheit gesetzten Carbonsäuren analysiert, so wird festgestellt, dass Isobuttersäure, Buttersäure und Isovaleriansäure aus C-15003 P-3, C-15003 P-3¹ bzw. C-15003 P-¹I erhältlich sind. Die Fig. 1 zeigt die Strukturen auf Grund der obigen Daten für C-15003 P-3, P-3¹ und Ρ-Ί.

Fig. 1

P-3 -CO-CH

CH,

P-3¹ -CO-CH₂-CH₂-CH₃

P-4 -CO-CH₂-CH

Biologische Wirkung:

A) Antimikrobielle Wirksamkeit:

Mit Trypticase-Soja-Agar (BBL) als Versuchsmedium wurden die Hemmkonzentrationen gegenüber den weiter unten erwähnten Mikroorganismen mit Hilfe der Papierscheibenmethode festgestellt.Die Filterpapierscheiben(Toyo Seisakushcrdünner Ty

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mit einem Durchmesser von 8 mm wurden jeweils mit 0,02 ml einer 300 jug/ml Lösung von C-15003 P-3, P-3' oder P-H imprägniert, worauf man diese Scheiben auf Platten anordnete, welche mit. den weiter unten genannten Mikroorganismen beimpft waren, um die minimalen Hemmkonzentrationen festzustellen. Di erzielten Resultate zeigen, dass die Antibiotika in bezug auf die folgenden. Mikroorganismen wirkungslos waren, nämlich Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Mycobacterium avium.

Andererseits wurde mit Agar-Platten, welche als Versuchsmedium 3,5 g Dinatriumhydrogenphosphat, 0,5 g Monokaliumdihydrogenphosphat, 5 g Hefeextrakt (Difco), 10 g Glucose, 15 g Agar und 1.000 ml destilliertes V/asser bei einem pH-Wert von 7,0 enthielten, die Wachstumsverhinderung gegenüber Talaromyces avellaneus getestet. Bei diesem Testversuch lagen die minimalen Hemmkonzentrationen bei 3 ^ug/ml für C-15003 P-3 und P-3¹ und 1,5 /ig/ml für C-15003 P-I. Ferner wurde der wilde Stamm von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus auf einem Testmedium, bestehend aus 20 g Proteose-Pepton (Difco), 1 g Hefeextrakt, 2 g Glucose, 1.000 ml destilliertem Wasser und 10 ml 1-molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0, bei 28 ⁰C während Ί1 bis HQ Stunden gezüchtet und hierauf die Hemmwirkung auf

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das Wachstum der antibiotischen Verbindungen in bezug auf diesen speziellen Mikroorganismus durch die Serienverdünnungsmethode bestimmt. Die Wachstumsinhibition trat bei 1 /Jg/ml für C-15003 P-3 und P-3' und bei 0,5 /ig/ml für C-15003 P-H ein.

Die fungizide bzw. fungistatische Wirksamkeit findet sich in d Tabelle V.Wie aus dieser Tabelle V hervorgeht,besitzt das Antibiotikum C-15003 eine Hemmwirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen, welche Pflanzenkrankheiten verursachen. Die mit 0,02 ml einer 1.000 jig/ml Lösung von C-15003 imprägnierten Filterpapierscheiben wurden auf mit den in der Tabelle V erwähnten Mikroorganismen inokulierte Platten gebracht.

Tabelle V

Antimikrobiell Spektren Testorganismen

IFO- Medium Nummer

Alterr.aria
kik-uchiaxta

Fusicladiuin lovieri

Helminthosporium
sicmoideuin var.
irreguläre

Pyricularia oryzae
Elsinoo fawc ,tti

7515
6477

5273

8417

PSA* PSA*

Stunden Inhibitionsdurchrnesser

48 90

38 68

53 55

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sr

TestOrganismus	IFO- Nummer	9170	6189	~	6188	0907	Medium	Stunden ι	Inhib durch
Fusarium oxysporuin f, cucumerinum	-	885O	9253	4066	Saccharomyces cerevieiae • 0209	5467	PSA*	48	20
Guignardia laricina	7888	Sclerotinia sclerotiorum 9395	Pythium aphanidermatum 7O3O	Penicillium chrysogenum 4626	Rhodotorula rubra	7522	PSA*	48	12
Cochlioborus miyabeanus 5277	Venturia piriria	Botrytis cinerea	Rhizopus nigricans	Trichophyton rubrum	0583	PSA*	48	60
Diaporthe citri	Pellicularia sasakii	Aspergillus niger	Trichophyton in ant agr ophyt e s	0619	PSA*	48	55
Gibberella zeae "	Candida albicans	0410	PSA*	48	37
Candida utilis	PSA*	90	65
Cryptococcus neoformans	PSA*	48	50
PSA·*	48	50
PSA*	48	58
PSA*	48	48
PSA*	48	0
PSA*	48	35
PSA*	48	25
PSA*	48	0
PSA*	48	28
* * GB	48	38
GB**	48	38
GB**	48	0
GB**	48	0
GB**	48	43

* PSA: Kartoffel-Saccharose-Agarmedium ** GB : Glucose-Nähragarmedium

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B) Cytostatische Wirkung:

Die therapeutischen Wirkungen von C-15003 P-3, p-3' und P-I, nach einer 9-tägigen, intraperitonealen Dosierung in bezug auf P 388-Leukämie bei Mäusen (1 χ 10 Zellen/Tiere, nämlich Mäusen, v/urden bestimmt. Die Resultate haben gezeigt, dass bezüglich des 1-ebensverlängernden Verlaufes diese Verbindungen eine cytostatische Wirkung aufwiesen, welche, verglichen mit einer Dosismenge von 0,00625 mg/kg/Tag, einem Wert von 200 % entsprachen.

C) Toxizität

Bei einem akuten Toxizitätstest mit Mäusen als Testtiere, denen man intraperitoneal C-15003 P-3j P-3¹ und P-4 injizierte, ergaben sich mit diesen Antibiotika ein LD,_₀-Wert von mehr als 0,313 mg/kg.

Wie bereits erwähnt, zeichnet sich das Antibiotikum C-15003 durch eine starke Hemmwirkung gegenüber Fungi und Protozoen aus und ist daher als funqizides bzw.fungistatisches Mittel oder als Antiprotozoenmittel sehr wertvoll.Da dar überhinaus das Antibiotikum C-15003 bei mit Tumoren behafteten Säugetieren, z.B. Mäusen, eine lebensverlängernde Wirkung ausübt, darf man auch annehmen, dass diese Verbindung als Cytostatikum wertvoll sein wird.

Das Antibiotikum C-15OO3 kann als fungizides Mittel und als Antiprotozoenmittel mit Vorteil auch im Zusam-

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menhang mit der bakteriellen Oekologie im Boden, in aktiven Schlämmen, in der tierischen Körperflüssigkeit oder dergl. verwendet werden. Wünscht man daher wertvolle Bakterien aus einer Bodenprobe zu isolieren oder will man die Wirkungen von Bakterien unabhängig von jenen von Pilzen und Protozoen bei der Bearbeitung und Analyse von aktiven Schlammsystemen, v/ie sie bei der Behandlung von Abwässern Verwendung finden, einschätzen, so kann man das neue Antibiotikum dazu einsetzen, um ein selektives Wachsen der bakteriellen Flora zu fördern, ohne ein gleichzeitiges Wachsen der Pilze und Protozoen zu begünstigen. Gemäss einem besonderen Beispiel kann man eine Probe einem flüssigen oder festen Medium und überdies 0,1 ml einer 10 bis 100 ^ig/ml-Lösung des Antibiotikums in einer 1 55-igen wässrigen Methanollösung pro ml des Mediums zusetzen, worauf man eine Inkubation einleitet.

Das erfindungsgemässe Antibiotikum C-15003 kann man auch als antimikrobielles Mittel für die Behandlung von Pflanzenkrankheiten, welche durch die in der obigen Tabelle V erwähnten Mikroorganismen verursacht werden, einsetzen.

Gemäss einer typischen Applikationsmethode wird das Antibiotikum C-15003 in Form einer l-i?igen methanolischen, wässrigen Lösung, welche 0,5 ^g/ml bis 5 /ig/ml des Antibiotikums enthält, verwendet. So kann man beispielsweise das Antibiotikum C-15003 zum Bekämpfen der rötlichbraunen

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**. 274620a

ν*

Blattscheidenfäule, der Brusonekrankheit, der durch HeI-minthosporium verursachten Blattfleckenkrankheit und des Blattscheidenbrandes von Reispflanzen verwenden.

Es ergibt sich daher, dass C-15003 P-3, P-3¹ und P-¹* neue Verbindungen darstellen, welche die gleiche Skelettstruktur haben und überdies als Zwischenprodukte für die Herstellung von anderen pharmazeutisch wertvollen Verbindungen verwendet werden können. So kann man beispielsweise aus dem erfindungsgemässen Antibiotikum durch Desacylierungsreaktion P-15OO3 P-O (Maytansinol) mit einer Hydroxylgruppe in der 3-Stellung erhalten. Da sich die Acylgruppe in (3-Stellung zur Carbonylgruppe befindet, kann man sich der üblichen reduktiven Hydrolysereaktion bedienen. Man kann daher mit Hilfe eines komplexen Metallhydrids, z.B. Lithium-Aluminiumhydrid (LiAlHj.)_} bei niedriger Temperatur von beispielsweise -20 ⁰C bis 0 ⁰C die O-Esterbindung in der 3-Stellung hydrolytisch spalten, ohne aber andere funktionelle Gruppen, z.B. die Carbonyl-, Epoxy-, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen usw., zu beeinträchtigen, um auf diese V/eise zu Maytansinol zu gelangen. Die physikalischen und chemischen Daten, welche man mit einer derweise erhaltenen Maytansinolprobe erzielt, sind in guter Uebereinstimmung mit den Daten, welche man gemäss Kupchan et al, The Journal of American Chemical Society 3]_, 5294-5215

(1975) erzielt.

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Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Teile sind jeweils Gew,-Teile, sofern nichts anderes ausgesagt wird. Das Verhältnis zwischen Teilen und Vol.-Teilen entspricht jenen zwischen g und ml. Der Ausdruck "%" bezieht sich auf "Gew./VoI", sofern nichts anderes ausgesagt wird.

Beispiel 1

Nocardia No.C-15003 (IFO 13726; FERM 3992; ATCC 31281), welcher auf einem Medium (Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar) gezüchtet worden war, wurde verwendet, um einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher ¹JO Vol.-Teile eines Samenkulturmediums (2 % Glucose, 3 % lösliche Stärke, 1 % rohes Sojabohnenmehl, 1 % Maisquellflüssigkeit, 0,5 $ Polypepton, 0,3 % NaCl, 0,5 % CaCO,, pH 7,0) enthielt, zu beimpfen. Das geimpfte Medium wurde während *»8 Stunden bei 28 ⁰C inkubiert, um ein Inokulum zu erhalten. 0,5 Vol.-Teile des so erhaltenen Inokulums wurden in einen 200 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter, welcher *10 Vol.-Teile eines Fermentiermediums enthielt, welches aus 5 % Dextrin, 3 % Maisquellflüssigkeit, 0,1 % Polypepton und 0,5 % Calciumcarbonat (pH 7,0) bestand, enthielt, eingebracht und während 90 Stunden bei 28 ⁰C ge-

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züchtet, um auf diese Weise ein Inokulum (Samenkultur) zu erhalten.

Wie nach der Reihenverdünnungsmethode unter Verwendung von Tetrahymena pyriformis W als Testorganismus und C-15003 P-3 als Standardprobe festgestellt werden konnte, wies die obige Kultur einen Titer von 25 /ig/ml auf.

Beispiel 2

10 Vol."Teile des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Inokulums (Impfmaterial) wurden einem 2000 Vol.-Teile fassenden Fermentierbehälter zugesetzt, welcher 500 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums gleicher Zusammensetzung wie oben enthielt, worauf man während Ί8 Stunden bei 28 ⁰C brütete, 500 Vol.-Teile der so erhaltenen Kultur wurden in einen 50.000 Vol.-Teile fassenden Tank aus rostfreiem Stahl eingetragen, welcher 30.000 VoI.-Teile Samenkulturmedium enthielt, worauf man die Züchtung unter Belüftung (30.000 Vol.-Teile/Minute) bei 28 ⁰C züchtete und bei einem Innendruck von 1 kg/cm bei 280 Umdrehungen pro Minute (1/2 DT) rührte, um auf diese V/eise eine Samenkultur zu erhalten. Diese Kultur wurde zum Animpfen eines aus rostfreiem Stahl bestehenden Tanks mit einem Fassungsvermögen von 200.000 Vol.-Teilen verwendet, welcher 100.000 Vol.-Teile eines

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Permentationsmediums ähnlicher Zusammensetzung wie im obigen Beispiel 1 enthielt, wobei eine Impfrate von 10 % eingehalten wurde. Das angeimpfte Medium wurde unter Belüftung (100.000 Vol.-Teile/Minute) bei 28 ⁰C inkubiert und bei einem Innendruck von 1 kg/cm während 90 Stunden bei 200 Umdrehu' gen pro Minute (1/2 DT) gerührt. Bei der Bestimmung des Titers in gleicher Weise wie in Beispiel 1 konnte man feststellen, dass die so erhaltene Kultur einen Titer von 25 ^ig/ml aufwies.

Beispiel 3

95.000 Vol.-Teile der nach den Angaben in Beispiel ; erhaltenen Kultur wurden mit 2000 Teilen Hyflo-supercer^ (Johnes and Manville Products, U.S.A.) versetzt und das Gemisch nach gründlichem Mischen über einem Druckfilter filtriert, wobei 85.OOO Vol.-Teile Filtrat und 32000 Teile feuchte Zellen erhalten wurden. Das Filtrat (85.000 VoI.-Teile) wurde gerührt und mit 30.000 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Diese Massnahme wurde ein weiteres Mal wiederholt. Die Aethylacetatschichten wurden gesammelt, zweimal mit jeweils 30.000 Vol.rTeilen V/asser gewaschen, durch Zugabe von 500 Teilen wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 200 Vol.-Teile eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren

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gev/onnen (53 Teile). Dieses rohe Produkt I wurde mit 100 Vol.-Teilen Aethylacetat verrührt, worauf die unlöslichen Bestandteile abfiltriert wurden. Das Filtrat wurde mit 10 Teilen Kieselgel (Merck, Deutsche Bundesrepublik, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt und das Aethylacetat unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Kieselgelsäule (¹JOO Vol.-Teile) zugegeben. Dann wurde mit 500 Vol.· Teilen Hexan, 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 3:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 1:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Hexan und Aethylacetat (Mischungsverhältnis 1:3), 500 Vol.-Teilen Aethylacetat und 1000 Vol.-Teilen einer Mischung von Aethylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 50:1) eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 100 Vol.-Teilen gesammelt wurde.

1 Vol.-Teil einer jeden Fraktion wurde zur Trockne eingeengt, worauf man dem Konzentrat 0,1 Vol.-Teil Aethylacetat hinzugab. Dann wurde das Gemisch auf eine 2,5 cm über dem unteren Rand einer Kieselgel-Glasplatte (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 60 F ₂₍-h, 0,25 mm, 20 χ 20) liegende Stelle aufgebracht und in einer Länge von ungefähr 17 cm mit einem Lösungsmittelsystem aus Aethylacetat und Methanol (Mischungsverhältnis 19:1) entwickelt. Nach er-

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27Λ6209

folgter Entwicklung wurde mit ultraviolettem Licht (2537Ä) das gewünschte Produkt festgestellt.

Die aktiven Fraktionen No. 23-28 mit Rf 0,6-0,65 wurden gesammelt und unter vermindertem Druck jeweils auf ungefähr 20 Vol.-Teile eingeengt. Diese Konzentrate wurden jeweils mit 150 Vol.-Teile Petroläther versetzt, wobei man 15 Teü eines rohen Produktes II erhielt.

Beispiel *t

32.000 Teile der gernäss Beispiel 3 erhaltenen feuchtei Zellen wurden unter Rühren mit 50.000 Vol.-Teilen 70 55-igem wässrigem Aceton während 3 Stunden extrahiert und hierauf auf einem Druckfilter filtriert. Die Extraktion mittels 50.000 Vol.-Teilen 70 jS-igem wässrigem Aceton und die anschliessende Filtrierung wurden einmal mehr wiederholt. Die Filtrate wurden gesammelt und das Aceton durch Einengen unter vermindertem Druck entfernt. Das entstandene, wässrige System wurde durch eine Säule von 5.000 Vol.-Teilen Diaion HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.) hindurchgeleitet. Die Säule wurde mit 20.000 Vol.-Teilen Wasser und 50 ί-igem wässrigem Methanol gewaschen und anschliessend mit 15.000 Vol.-Teilen 90 ?-igem wässrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf 3.000 Vol.-Teile eingeengt und mit 3.000 Vol.-Teilen V/asser und 3.000 Vol.-Teilen

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27462Ö9

Aethylacetat geschüttelt, Diese Arbeitsweise wurde einmal mehr wiederholt. Die Aethylacetatschichten wurden vereinigt, mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 200 Teilen eingeengt. Dann wurde Petroläther hinzugegeben und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gesammelt. Dieses Produkt wurde mittels einer Kie- ! selgelsäure gereinigt, wobei man 8,0 Teile rohes Produkt II erhielt.

Beispiel 5

In 10 Vol.-Teilen Aethylacetat wurden 1,5 Teile des nach dem obigen Beispiel 3 erhaltenen rohen Produktes II gelöst und die Lösung gründlich mit 1 Teilen Kieselgel (Merck, Bundesrepublik Deutschland, 0,05 bis 0,2 mm) gerührt. Das Aethylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde oben auf eine Säule von 300 VoI.-Teilen Kieselgel eingeführt und die Säule zuerst mit 500 Vol.-Teilen Chloroform gewaschen und hierauf mit 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 50:1), 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (Mischungsverhältnis 20:1) und 500 Vol.-Teilen einer Mischung von Chloroform und Methanol (10:1) eluiert. Diese Eluate v/urden in Fraktionen von

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25 Vol.-Teilen gesammelt.

Jeweils 0,5 Vol.-Teile einer jeden Fraktion wurden unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 0,05 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch der Dünnschichtchromatographie (Entwicklungssystem:

Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis 9:1) unterworfen.

Die bei 2537 8 absorbierenden Fraktionen Nr. 39 und 40 der Zone von RF 0,50 - 0,60 wurden

gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde hierauf mit 2 Vol.-Teilen Aethylacetat versetzt und das Gemisch stehen gelassen, worauf man 0,150 Teile Antibiotikum C-15OO3 in Form von Kristallen erhielt.

Die obigen Kristalle des Antibiotikums C-15OO3 (0,150 Teile) wurden in 15 Vol.-Teilen Methanol gelöst und dann mit 0,300 Teilen Natriumchlorid und 15 VoI.-Teilen Wasser versetzt. Eine mit 200 Vol.-Teilen Diaion HP-IO (Mitsubishi Kasei K.K.) gefüllte Säule wurde mit 6OO Vol.-Teilen 50 *-igem wässrigem Methanol, enthaltend 5 % Natriumchlorid, beschickt. Die so hergestellte Lösung wurde durch eine Säule geführt und eine Gradienten-Eluierung unter Verwendung von 1500 Vol.-Teilen 60 #-igem wässrigem Methanol, enthaltend 5 % Natriumchlorid, und 1500 Vol.-Teilen 95 *-igem wässrigem Methanol durchgeführt.

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Das Eluat wurde in verschiedenen Fraktionen von jeweils 15 Vol.-Teilen gesammelt und jede Fraktion mittels Kieselgel durch Dünnschichtchromatographie geprüft. Die Fraktionen 1^5 bis 153 enthielten C-15003 P-3, die Fraktionen 167 bis 180 enthielten C-15003 P-3' und P-Jl und die Fraktionen 185 bis 190 enthielten C-15003 P-¹J.

Jede Gruppe der Fraktionen wurde eingeengt und durch Zugabe von 50 Vol.Teilen Wasser und 100 Vol.Teilen Aethylacetat gelöst. Die Lösung wurde in einem Scheidetrichte¹ geschüttelt und die wässrige Schicht abgetrennt. Mach zweimaligem Waschen mit jeweils 50 Vol.Teilen Wasser wurde die Aethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und stehen gelassen. Auf diese Weise erhielt man in jeder Gruppe der Fraktionen Kristalle. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet.

C-15003 P-3 0,070 Teile

C-15003 P-3¹, P-4 0,018 Teile C-15003 P-I 0,015 Teile

Die gemischten Kristalle von C-15003 P-3¹ und P-4

<!0,0l8 Teile) wurden in 0,3 Vol.-Teilen Aethylacetat gelöst und auf einer Linie in einem Abstand von 2,5 cm über dem unteren Rande einer Kieselgelglasplatte (Merck, Deutsche Bundesrepublik, Kieselgel 60 Fp^₁. 0,25 mm, 20 χ 20) aufgetragen, worauf man mit einer Mischung von Aethylacetat

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und Methanol (Mischungsverhältnis 19:1) entwickelte. Nach dieser Entwicklung auf ungefähr 18 cm wurde die Absorptionsbande bei Rf 0,68 (P-4) und Rf 0,65 (P-3^f) abgeschabt und jede Bande unabhängig zweimal mit jeweils wenig Wasser enthaltendem Aethylacetat extrahiert. Der entstandene Aethylacetatextrakt wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt und stehen gelassen.

0,010 Teile der Kristalle von C-15003 P-¹J und 0,003 Teile der Kristalle von C-15003 P-3' wurden aus den Fraktionen mit Rf 0,68 bzw. Rf 0,65 erhalten.

Beispiel 6

1000 Vol.-Teile der Kultur gemäss Beispiel 2 wurden in einem Tank aus rostfreiem Stahl, welcher ein Passungsverinögen von 200.000 Vol.-Teilen aufwies und 100.000 Vol.-Teile eines Samenkulturmediums enthielt,geimpft und das angeimpfte Medium unter Belüftung (100.000 Vol.-Teile/ Minute) und unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute während Ί8 Stunden bei 28 ⁰C bebrütet, um eine Samenkultur zu erhalten. Diese Samenkultur wurde in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 2.000.000 VoI.-Teilen, welcher 1.000.000 Vol.-Teile eines Fermentiermediums gleicher Zusammensetzung wie in Beispiel 1 enthielt, bei einer Transplantationsrate von 10 % eingetragen. Die Züchtung erfolgte unter Belüftung (1.000.000 VoI.-Teile/Mi-

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nuten) bei 28 ⁰C während 90 Stunden unter Rühren bei 120 Umdrehungen pro Minute (1/3 DT) und bei einem Innendruck

2
von 1 kg/cm . Die so entstandene Kultur wies beim Testen gemäss der Methode nach Beispiel 1 einen Titer von 20 jig/ml auf.ygOO.OOO Vol.-Teile der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden mit 900.000 Vol.-Teilen Aceton versetzt und nach 1-stündigem Rühren mit 20.000 Teilen Hyflo-Supercel (Johnes & Manville, U.S.A.) versetzt. Dieses Gemisch wurde weiter gerührt und in einer Druckfiltermaschine filtriert. 71.700.000 Vol.-Teile des so erhaltenen Filtrates wurden mit 500.000 Vol.-Teilen V/asser versetzt und das Gemisch in einer Podbielniak-Vorrichtung (Podbielniak, Inc., U.S.A.) mit 1.000.000 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Die Aethylacetat schicht v/urde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Petroläther versetzt und der entstandene Niederschlag durch Filtrieren gewonnen und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 68 Teile des rohen Produktes I. Hierauf v/urde dieses rohe Produkt nach den Angaben, wie sie in den Beispielen 3,^ und 5 gemacht worden sind, gereinigt. Auf diese Weise erhielt man. 9,5 Teile C-15OO3 P-3, 0,300 Teile C-I5OO3 P-3¹ und 2,5 Teile C-15003 Ρ-Ί.

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Beispiel 7

In 1 Vol.-Teil Tetrahydrofuran wurden 0,015 Teile des Antibiotikums C-15003 in Form der gemäss Beispiel 5

erhaltenen Kristalle gelöst, worauf man auf -5 ⁰C kühlte und 0,012 Teile Lithiumaluminiumhydrid hinzugab. Die Mischung wurde 2 Stunden stehen gelassen, nach der Zugabe von 0,5 Vol.-Teilen einer 1 ?-igen wässrigen Schwefelsäurelösung wurde das Reaktionsgemisch mit 2 Vol.-Teilen Aethylacetat extrahiert. Die Aethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Hierauf erfolgte eine präparative Dünnschichtchromatographie mit Kieselgel, worauf die Zone mit Rf 0,25 bis 0,3 abgeschabt wurde. Dann wurde mit wenig Wasser enthaltendem Aethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit V/asser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf sich Kristalle ausschieden. Diese Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 0,010 Teile P-15OO3 P-O vom Schmelzpunkt 17¹* ⁰C Elementaranalyse für C₂₈H₅₇ClN₂O₈ :

Berechnet: C = 59,52; H = 6,60; N = 4,96; Cl = 6,27; Gefunden : C = 59,65; H = 6,58; N = 5,02; Cl = 6,51. IR: 1715, 1670, 1580(Cm"¹)

UV(nm): 232(32750), 2UH(sh, 30850), 252(31650), 281(5750),

288(5700).

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Bezüglich der Eigenschaften war dieses Produkt mit Maytansinol identisch.

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Claims

Patentansprüche

Antibiotikum C-15003 der folgenden allge-

meinen Formel:

Cl

¹T¹¹J?

(D

worin R den Rest

-CO-CH ³, -CO-CH₂-CH₂-CH₃ oder -CO-CH₂-CH

CH

CH-

CH-

darstellt,

2) Antibiotikum gemäss Anspruch 1, worin R den

Rest

-CO-CH

darstellt.

3) Antibiotikum ge'mäss Anspruch 1, worin R den

Rest -CO-CH₂-CH₂-CH₃ bedeutet.

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-2-

*0 Antibiotikum gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R den Rest

■CH,

-CO-CH₂-CH

CH-

bedeutet.

5) Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums C-15003, dadurch gekennzeichnet, dass man einen der Gattung Nocardia angehörenden Mikroorganismus, welcher das Antibiotikum C-.I5OO3 zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoffquellen und verdaubare Stickstoffquelien enthält, so lange züchtet, bis das Antibiotikum darin im wesentlichen angereichert ist, worauf man das Antibiotikum C-15003 isoliert.

6) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus Nocardia No. C-15003 (ATCC 31281; IFO 13726; FERM 3992) eingesetzt wird.

7) Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der folgenden Formel:

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dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum C-15003 der folgenden allgemeinen Formel:

worin R den Rest CH₃

'3

-CD-GH: , -CO-CH₂-CH₂-CH₃ oder -CO-CH₂-CH 'CH

CH.

bedeutet, einer reduktiven Hydrolyse unterwirft.

8) Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die reduktive Hydrolyse durch Verwendung eines

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komplexen Metallhydrids geschieht.

9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als komplexes Metallhydrid Lithiumaluminiumhydrid eingesetzt wird.

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